ES2251244T3 - Dispositivo de medida y metodo de medida para la lectura paralela de sensores spr. - Google Patents

Abstract

Dispositivo de medida para mediciones de SPR (SPR: resonancia de plasmones superficiales), que comprende: Un conjunto guíaondas (10), que comprende una multiplicidad de guíaondas planares (13), en los cuales es guiada luz en al menos una dimensión a través de un lado de entrada de la luz y de un lado de salida de la luz, y los cuales presentan respectivamente al menos dos superficies límite paralelas, correspondiendo las distancias de los guíaondas individuales (13) a una retícula homogénea de dos dimensiones y estando provisto cada guíaondas individual (13) de una región sensora (16) apta para la SPR, una fuente luminosa (3), un grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda y un sistema óptico, (L2, L3), que están subordinados a la fuente luminosa (3), estando configurado el sistema óptico (L2, L3) de manera que los lados de entrada de la luz de los guíaondas (13) del conjunto guíaondas (10) son iluminados con luz paralela, estando configurado el grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda para ajustar la longitud de onda de la luz a una longitud de onda luminosa predeterminada, una óptica de reproducción (L4; L6, L7) y un chip CCD (20), que están configurados de manera que la luz que sale de los lados de salida de la luz de los guíaondas (13) del conjunto guíaondas (10) es reproducida sobre el chip CCD, y la luz que proviene de cada guíaondas de luz individual (13) es registrada por en cada caso varios pixels de CCD adyacentes del chip CCD (20), y un ordenador (30) con software de procesamiento de imágenes, que está configurado de manera que se calcula un valor de intensidad luminosa de la luz que proviene de cada guíaondas de luz individual (13), y tras el almacenamiento de datos de valor de intensidad, longitud de onda ajustada y coordenadas en el conjunto guíaondas (10) mediante un circuito de mando (31) se realiza una regulación del grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda a otra longitud de onda luminosa, con la finalidad del registrode un espectro de intensidad.

Description

Dispositivo de medida y método de medida para la lectura paralela de sensores SPR.

El invento se refiere a un dispositivo de medida para la lectura paralela de sensores SPR (SPR: Surface Plasmon Resonance, resonancia de plasmones superficiales).

En la búsqueda de nuevas sustancias activas la química combinatoria es un método prometedor para encontrar ligandos adecuados a una molécula receptora. Para el ensayo de un número lo mayor posible de ligandos la miniaturización y la automatización de los desarrollos de la síntesis así como su paralelización son una importante condición previa. Debido a las pequeñas cantidades de material ligando obtenidas en ello las mismas exigencias (miniaturización, automatización y paralelización) son válidas asimismo para la comprobación del enlace ligando-receptor.

Para esta comprobación se puede utilizar como método muy sensitivo la espectroscopia de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Con ella se detecta la luz reflejada en una delgada capa de oro. Con condición de resonancia apropiada (ángulo de incidencia y longitud de onda de la luz y espesor de capa de la capa de oro) disminuye la intensidad de la luz reflejada. La energía luminosa es transformada entonces en ondas de densidad de carga del gas electrónico en la capa de oro. Estas ondas de densidad de carga se denominan plasmones.

Para observar la resonancia hay dos preparaciones metódicas. O se utiliza luz monocromática y se registra la intensidad de la luz reflejada con dependencia del ángulo de incidencia, o se mantiene el ángulo de incidencia constante y se varía la longitud de onda de la luz. En ambos casos la posición de la resonancia se desplaza cuando se modifica el índice de refracción del medio, que se encuentra en el lado de la capa de oro que mira en sentido opuesto a la incidencia de la luz.

Este efecto se utiliza en la analítica bioquímica. El receptor o ligando es inmovilizado sobre la superficie de oro. Tras la añadidura del ligando o receptor con la adición de las moléculas se modifica la condición de resonancia.

El dispositivo más sencillo para la medición de este efecto es un prisma de cristal, que es iluminado con un haz luminoso y cuyo ángulo de incidencia se varía (véase por ejemplo "Biospecific interaction analysis using biosensor technology", Malmqvist, M., Nature 361 (1993) 186-187).

Un método mejorado es la detección paralela de varios ángulos. En ello la superficie de oro se ilumina con un haz monocromático ligeramente divergente (ángulo de abertura \sim10º) y la luz reflejada se dirige sobre un detector de luz que determina la situación. De este modo se produce una asociación inequívoca entre el ángulo de reflexión y la posición en el detector. Este tipo constructivo tiene la ventaja de registrar la zona angular que interesa sin elementos de construcción móviles. Por eso se utiliza este género de detección en algunos aparatos comerciales, como por ejemplo según el documento WO 90/05295 A1 o EP 797 091 A1. Un inconveniente de estos dispositivos consiste en que en cada caso sólo pueden ser examinados simultáneamente un campo sensor de oro preparado (detector unidimensional) o unos pocos campos sensores dispuestos a lo largo de una fila (con un detector de dos dimensiones). La medición simultánea de un dispositivo de dos dimensiones de superficies sensoras no es posible sin embargo con este método de detección angular. El equilibrado térmico tras la incorporación de la capa de oro preparada en semejantes aparatos dura sin embargo algunos minutos (al menos 15 min); la propia medición dura luego al menos hasta que la adición molecular queda en equilibrio, esto puede llevar también algunos minutos. Por eso tales aparatos son poco apropiados para la detección del enlace de un número grande de ligandos diferentes, puesto que el tiempo de medición y el trabajo para el cambio de las muestras resultan relativamente grandes.

Una preparación paralela para el análisis de un conjunto de muestras la representa la microscopía de SPR (SPM) (véanse: el documento EP 388 874 A2 o M. Zizisperger, W. Knoll, Progr. Colloid Polym. Sci. 1998, 109, páginas 244-253). Aquí la superficie de oro aplicada sobre un prisma se recubre en distintas zonas con distintas muestras y se genera sobre un chip CCD una imagen de la superficie de oro bajo el ángulo de SPR. Durante el proceso de medición el ángulo se modifica con un dispositivo mecánico de escaneado. Este método sin embargo está limitado a diámetros de objeto pequeños.

Un método de SPR más reciente es dado a conocer en el documento WO 94/16312 A1. Aquí se realiza la detección del enlace de pequeñas cantidades de material por medio de fibras ópticas, que están recubiertas parcialmente con una capa de oro. Pero también aquí el problema está en la construcción de un aparato que según este principio tiene que examinar muchas muestras en paralelo. Un conjunto semejante de fibras revestidas de oro es por una parte caro y muy delicado frente a tensiones mecánicas, y por otra parte la fabricación paralela del conjunto según la propuesta hecha allí es técnicamente sólo difícilmente realizable.

Las fibras ópticas también se emplean en el documento WO 98/32002 A1. Para la protección contra daño mecánico el cable de fibra se encuentra en una pipeta. Para la realización de un conjunto se propone la yuxtaposición de tales pipetas. Una miniaturización sin embargo es difícil de realizar, especialmente en la medición paralela de muchas muestras distintas.

Por el documento DE 196 15 366 A1 es conocido un procedimiento y una instalación para la comprobación simultánea de reacciones físicas, biológicas o bioquímicas e interacciones en o dentro de la superficie de muestras. Todas las muestras son irradiadas simultáneamente con luz de una longitud de onda, y la luz reflejada es alimentada a un conjunto receptor, por ejemplo a una matriz CCD o a una videocámara. Las muestras pueden estar dispuestas en forma de matriz con las superficies sensoras en un plano sobre una placa de substrato, que a su vez se encuentra sobre una placa portadora transparente, la cual se ilumina. Las señales eléctricas del conjunto receptor son alimentadas a un dispositivo evaluador. Tras la evaluación de las muestras con una longitud de onda, ésta puede ajustarse a otro valor.

Por el documento WO 95/22754 es conocida una instalación de análisis en la cual una multiplicidad de cubetas de análisis de SPR están dispuestas en forma de matriz y pueden ser medidas simultáneamente. Las superficies sensoras de las cubetas de análisis se encuentran paralelas en un plano.

Por el documento WO 97/15819 es conocido un elemento de medición de SPR, que está configurado como guíaondas planar. En un lado del guíaondas está prevista una superficie sensora de SPR, en la cual se refleja la luz dirigida en el guíaondas. Según el principio de medición del documento WO 97/15819 luz policromática sobre un intervalo grande del ángulo de incidencia se acopla en una superficie extrema del guíaondas, y en la salida se produce una multiplicidad de bandas de reflexión, las cuales respectivamente contienen información de SPR. Las bandas corresponden en cada caso a un intervalo pequeño del ángulo de incidencia.

Por el documento US 5.485.277 es conocido un dispositivo de SPR en el cual varias superficies sensoras, que están previstas en un guíaondas, son irradiadas por el guíaondas. La luz modulada por SPR se controla por medio de un conjunto CCD.

Sirve de base al invento el problema de especificar un dispositivo de medida para la lectura simultánea de una multiplicidad de sensores de SPR, en particular más de cien o mil, en el cual el proceso de lectura debe estar finalizado dentro de un tiempo de medición de menos de treinta minutos.

Este problema es solucionado por el dispositivo de medida y el procedimiento de medida de las reivindicaciones independientes. Configuraciones ventajosas son objeto de las reivindicaciones subordinadas.

Para solucionar el problema se emplea un conjunto especialmente configurado en un dispositivo con métodos suministradores de imágenes, para posibilitar una lectura simultánea. El conjunto empleado comprende una multiplicidad de guíaondas, debiendo entenderse bajo el concepto guíaondas en el marco del invento un medio óptico en el cual la luz es dirigida en al menos una dimensión y el cual posee al menos dos superficies límite paralelas.

El invento debe ser explicado en detalle a continuación con ayuda de ejemplos de realización esquemáticos. Muestran:

La Figura 1 una posibilidad de realización de una parte de un conjunto guíaondas empleado,

la Figura 2 la asignación de un elemento sensor individual apto para la SPR a los pixels de un conjunto CCD,

la Figura 3 una primera posibilidad de realización de un dispositivo de medida según el presente invento,

la Figura 4 un dispositivo de medida que no pertenece al invento,

la Figura 5 otra posibilidad de realización de un dispositivo de medida según el presente invento,

la Figura 6 a y b dos distintos desarrollos ópticos de radiación a través de la región sensora apta para la SPR,

la Figura 7 una imagen de CCD de un conjunto guíaondas de SPR,

la Figura 8 el desarrollo de intensidad de un guíaondas individual apto para la SPR,

la Figura 9 el desplazamiento de un desarrollo de intensidad con diferente concentración de muestras y

la Figura 10 a y b la diferencia entre la iluminación del conjunto guíaondas 10 con luz divergente según una forma de realización de acuerdo con la Figura 4 y con luz paralela según la Figura 3 y la Figura 5.

En el marco del invento se emplea ventajosamente un sensor de SPR planar 1, que puede fabricarse por medio de tecnologías de semiconductores de silicio conocidas y está dispuesto formando un conjunto guíaondas. En la Figura 1 está representada una parte de un conjunto guíaondas semejante. Una oblea de silicio 11 se provee de una capa 12 de SiO_{2}, que sirve como amortiguador óptico frente a la capa 13 conductora de ondas y el material base de silicio 11. El guíaondas se compone de una capa 13 de nitruro de óxido de silicio (SiON), que presenta un espesor de hasta unas 10 \mum para abajo. La capa 13 de nitruro de óxido de silicio se estructura por un proceso de ataque en seco de manera que se forman tiras paralelas 14 con anchos entre 10 \mum hasta 2000 \mum y distancias entre 10 \mum y 5000 \mum. Tras la estructuración de las tiras guíaondas 14 la oblea completa se protege mediante una cubierta no representada salvo las zonas que en un proceso posterior deben llevar la capa metálica 16 apta para la SPR. A continuación las zonas libres del guíaondas no protegidas en el paso de proceso precedente se recubren con una capa metálica, que en su espesor está adaptada a las exigencias de la medición de SPR. La restante cubierta de la oblea se retira. Según la tecnología empleada para producir las escotaduras 15 en forma de peine en el cuerpo de soporte, estas escotaduras pueden formarse antes o después de la aplicación de la mencionada capa metálica.

La tecnología descrita permite colocar varias disposiciones paralelas de estructuras guíaondas sobre una oblea. Por medio del ataque del silicio o mediante corte con sierra de la oblea de silicio se separan las múltiples disposiciones paralelas de estructuras guíaondas existentes. La separación espacial de los guíaondas individuales entre sí en el extremo en el que se encuentra el sensor de SPR puede realizarse mediante ataque químico del silicio por vía húmeda o mediante un proceso de serrado. Otra variante de la fabricación de guíaondas consiste en la posibilidad de fabricar polímeros en capas delgadas por ejemplo por centrifugado sobre un substrato. Los polímeros existentes en forma disuelta o no curada (por ejemplo PMMA, policarbonato, adhesivos de endurecimiento por UV o polímeros con contenido en silicio (Cyclotene u ORMOCERE)) se centrifugan o se cuelan sobre un material de soporte. El índice de refracción del material de soporte debe ser menor que el del polímero a aplicar, que más tarde representa el guíaondas. En caso de empleo de polímeros de endurecimiento por UV se efectúa tras la aplicación de capa homogénea una eliminación de las zonas no expuestas a la luz, de manera que sobre el soporte quedan conservadas estrechas tiras paralelas de polímero.

Otros polímeros pueden ponerse en forma de tiras mediante estampado u otras técnicas de replicación, debiendo estar dimensionado adecuadamente fino el material que permanece en los puntos a los que no debe dirigirse luz ninguna. Tras la estructuración de las tiras guíaondas aquí también se protege mediante una cubierta la oblea completa, salvo las zonas que deben llevar la capa metálica apta para la SPR. En el siguiente paso estas zonas al descubierto se recubren con la capa metálica 16 apta para la SPR y acto seguido las restantes regiones cubiertas se liberan de la capa de protección.

Las posibilidades descritas permiten construir en paralelo muchísimos guíaondas sobre una oblea. Tras la fabricación de los guíaondas con las regiones sensoras de SPR, mediante procedimientos de separación, por ejemplo corte por sierra, se preparan a partir de las obleas procesadas tiras individuales, compuestas de muchos guíaondas paralelos. Mediante el proceso de separación se forman nuevas superficies frontales 17, que se preparan de manera que allí sea posible un acoplamiento o desacoplamiento de la luz.

Con las posibilidades descritas da buen resultado construir en forma planar muchísimos sensores de SPR dispuestos en una fila. Para la realización de un conjunto de sensores varias de estas tiras se disponen apiladas unas tras otras según la Figura 1. Un conjunto semejante tras el montaje puede ser moldeado en un polímero en una zona por fuera de las capas metálicas aptas para la SPR, para dar consistencia adicional al conjunto guíaondas de SPR. La disposición y la distancia de los sensores individuales aptos para la SPR pueden efectuarse en correspondencia a la disposición y la distancia de las cavidades de una placa microtiter 60 colocada delante (véase la Figura 3). En un caso semejante el conjunto guíaondas de SPR para mediciones o para el recubrimiento de las capas 16 aptas para la SPR es puesto en contacto con la placa microtiter 60, que soporta las muestras 61 a caracterizar. En ello el conjunto guíaondas de SPR es introducido en la placa microtiter 60 hasta el punto que las zonas metálicas aptas para la SPR de las muestras 61 queden mojadas por completo. Los guíaondas individuales dispuestos en vertical pueden disponerse en las horizontales a una distancia de un formato de microtiter a voluntad.

Un conjunto guíaondas del género descrito se emplea en un primer dispositivo posible descrito a continuación con ayuda de la Figura 3. De la luz blanca de una lámpara de halógeno 3 tras el paso a través de una óptica de ajuste de radiación apropiada (L1), de un filtro de IR 4 empleado en el ejemplo para la protección de los elementos de construcción ópticos y de un monocromador 5 se transmite sólo luz de un ancho de banda de unos 0,5 a 5 nm. Alternativamente la selección de longitudes de onda también puede realizarse con una rueda de filtros, siendo necesario un correspondiente número de filtros con ancho de banda similar. Después de esto mediante un polarizador 6 para ondas TM en el ejemplo se efectúa una selección de la dirección de polarización con respecto a las capas 16 aptas para la SPR del guíaondas de luz 13 empleado. Una óptica (L2, L3) de ensanchamiento del haz proporciona una iluminación paralela del conjunto guíaondas completo, en el ejemplo mediante un espejo deflector 7, que está colocado de manera que la luz incide en el guíaondas 13 en un ángulo de 70º a 90º con respecto a las normales de la capa de oro del guíaondas, pues sólo luz en este intervalo angular puede excitar la resonancia de plasmones. El empleo de un espejo deflector sirve aquí únicamente para una construcción más compacta del dispositivo de medida. Alternativamente también podría ser irradiado directamente con este ángulo. Una máscara de agujeros múltiples 8 prevista en el ejemplo según la Figura 3, que puede realizarse de formas diversas, ensombrece la zona detrás de la cual no se encuentra ningún guíaondas, para evitar de antemano la luz dispersa que por cualesquiera caminos indeseados pudiera llegar a un detector además previsto. Si está prevista otra clase, técnicamente más costosa, de colocación y fijación paralela ordenada de una multiplicidad de guíaondas, por ejemplo comercialmente disponibles con un diámetro de núcleo de aproximadamente 200 \mum, por ejemplo mediante un alojamiento de secciones de guíaondas individuales en un soporte común, lo que asimismo se encuentra en el marco del invento, para el material de soporte empleado puede estar aplicado un material no transparente o un material provisto de un recubrimiento no transparente, por lo que la máscara de agujeros múltiples 8 antes mencionada puede quedar suprimida. Los propios guíaondas se encuentran con su zona sensitiva en un líquido que puede sustituirse para realizar mediciones de referencia en diferentes soluciones, para intercambiar las moléculas blanco o para efectuar procesos de lavado. En el extremo de los guíaondas apartado de la zona sensitiva del guíaondas la luz sale en el ángulo de la misma magnitud en el que fue irradiada desde el otro extremo (compárese la Figura 6). En el marco del invento está asignado además a las secciones de guíaondas del lado de salida de la luz un medio 9, que produce una dispersión de la luz que sale de los guíaondas. Esto puede estar realizado por ejemplo mediante un disco de dispersión que puede colocarse por separado, un recubrimiento apropiado o similares. Mediante este medio dispersor 9 la luz se dispersa difusa. Esta luz fuertemente divergente es reproducida directamente con el objetivo L4 sobre un chip CCD 20. El objetivo L4 está diseñado de manera que abarca el conjunto guíaondas completo, pudiendo comprobarse sin embargo sólo una pequeña parte de la luz emitida por un conductor luminoso. Para detectar estas pequeñas cantidades de luz se emplea en el ejemplo una cámara CCD refrigerada 20 de alta sensibilidad. El tiempo de iluminación necesario en ello puede alcanzar hasta algunos segundos.

En el marco del invento está previsto que la luz que sale de un guíaondas individual sea reproducida simultáneamente sobre varios pixels de CCD, lo que lleva a un aumento de la exactitud de comprobación. Así en el ejemplo está prevista la reproducción sobre varios pixels de cámara, porque un chip CCD posee un número de pixels muchísimo mayor que el que presenta el conjunto guíaondas aquí propuesto en guíaondas individuales. En el marco del invento se emplea un software de procesamiento de imagen que proporciona una asignación de la zona de varios pixels de CCD a un guíaondas individual. Esto está indicado esquemáticamente en la Figura 2, por ejemplo al guíaondas 2,2 le está asignada la zona de pixels {(11,12), (11,13), ..., (14,13)}, es decir, la zona del chip CCD 20 sobre la cual se efectúa la reproducción del guíaondas 2,2 comprende 12 pixels. Esta asignación se almacena en un ordenador 30 y permanece conservada durante la siguiente medición completa, porque el conjunto ya no se mueve más. Un algoritmo de programa rápido suma sobre estas zonas de pixels de cámara asignadas respectivamente a un guíaondas, de manera que para cada guíaondas se obtiene y se almacena un valor de intensidad individual. Después de esto la longitud de onda de la luz en el ejemplo irradiada desde abajo se desplaza en aproximadamente 1 nm por medio del monocromador 5 controlado por el ordenador 30 y se obtiene el siguiente valor de intensidad para todos los guíaondas. De este modo para cada guíaondas se obtiene un espectro de intensidad específico. Para optimizar el tiempo de medición para el registro de un espectro semejante la iluminación de la cámara CCD se inicia de nuevo inmediatamente después de que los datos en la última longitud de onda hayan llegado a la memoria del ordenador y mediante el circuito de mando 31 esté ajustada una nueva longitud de onda en un monocromador 5 controlable por un motor paso a paso. La sumación del ordenador sobre las zonas de pixels puede realizarse entonces durante el tiempo de iluminación para la nueva longitud de onda. Con tiempo de iluminación suficientemente largo el tiempo para la sumación puede despreciarse. Para cada longitud de onda el tiempo invertido está dado en esencia por el tiempo de iluminación, que en el ejemplo asciende a unos 5 segundos. Para un espectro de 200 nm se requieren de este modo 16 minutos. Para una determinación de las moléculas acumuladas en el respectivo sensor de SPR de los guíaondas individuales no es ahora necesario el espectro de intensidad absoluto de una medición individual, sino la diferencia de los mínimos de los espectros de intensidad en una medición en solución tampón pura con respecto a una segunda medición en presencia de la molécula blanco. Tan sólo este desplazamiento de la longitud de onda permite llegar a una conclusión sobre la acumulación de moléculas. La secuencia de medición de referencia y medición de muestras sería según ello posible en el intervalo de 32 minutos para todos los sensores guíaondas iluminados.

Otro dispositivo que no pertenece al invento, y que reduce los tiempos de medición requeridos, está representado esquemáticamente en la Figura 4. Puesto que el factor limitador del tiempo es el tiempo de iluminación, mediante cantidades de luz mayores en los guíaondas puede ser acortado el tiempo de medición. Para ello por una parte puede emplearse por ejemplo una fuente luminosa 3 más intensa, como por ejemplo una lámpara de arco de Xe. Como en el dispositivo descrito según la Figura 3 la luz pasa en primer lugar a través de un filtro de IR 4, un monocromador 5 y un polarizador 6. Una óptica L2, L3 de ensanchamiento del haz proporciona luego una iluminación paralela del conjunto guíaondas 10, al cual sin embargo en esta forma de realización están previamente colocadas lentes esféricas o de gradiente L5. Para iluminar por completo todos los guíaondas, en el ejemplo representado según la Figura 4 son necesarios sin embargo varios nuevos posicionados del conjunto guíaondas 10 con respecto a las lentes L5 previstas. Se encuentra asimismo no obstante dentro del marco del invento asignar a cada guíaondas una lente por separado, que por ejemplo también puede ser parte integrante constructiva de los respectivos fondos 62 de la placa
microtiter.

La luz paralela es luego enfocada por las lentes L5 en los guíaondas recubiertos por ejemplo con oro de tal manera que en la zona sensitiva del guíaondas los rayos divergentes inciden en el recubrimiento metálico previsto del guíaondas bajo otros ángulos, también bajo el ángulo que posibilita la comprobación de la SPR. Con las lentes L5 previstas en el ejemplo se acopla en el guíaondas con respecto a la iluminación descrita en la Figura 3 unas cien veces la intensidad de luz. Las ventanas de entrada 17 de los guíaondas están situadas en el ejemplo en el foco de las lentes, es decir, a una distancia de unas 100 \mum.

Además de nuevo debe llamarse la atención sobre que ninguna luz por delante del guíaondas, por ejemplo a través de algunos espacios intermedios o zonas transparentes, penetre en el espacio de la salida de la luz fuera de los guíaondas. Esto puede evitarse también aquí mediante la previsión de medios arriba descritos, por ejemplo de una máscara de agujeros múltiples 8. En el extremo del lado de salida de la luz de los guíaondas la luz abandona de nuevo divergente los guíaondas de luz y con ayuda de un medio dispersor 9 y con un objetivo L4 es asimismo reproducida sobre un chip CCD 20.

La ulterior asignación y evaluación de las intensidades de luz que están asignadas a un guíaondas individual se efectúan de nuevo como se ha descrito con respecto a la Figura 3. Para una longitud de onda individual el tiempo invertido, debido a la más fuerte intensidad de luz, puede ser reducido aproximadamente a 1 segundo. Si se limita por ejemplo a un espectro de sesenta longitudes de onda, se necesita para todos los espectros medidos en paralelo en el ejemplo un minuto. De este modo es posible por ejemplo realizar simultáneamente estudios de enlaces cinéticos con un número grande de ligandos.

La diferencia entre la iluminación del conjunto guíaondas 10 con luz divergente según la Figura 4 y luz paralela según la Figura 3 debe ser demostrada mediante la Figura 10a y la Figura 10b. Aquí están representados los haces marginales tras el paso a través de la máscara de agujeros múltiples 8 delante del fondo de una línea de sensores. En el caso divergente (Figura 10a) los haces marginales cubren varias zonas de medición, de manera que después de la salida el haz marginal ya no puede ser asignado a una zona de medición individual. Por eso en la iluminación con luz divergente deben introducirse al menos en el borde de la región sensora superficies límite 40, que garantizan una reflexión total. En la iluminación con luz paralela (Figura 10b) no se hacen necesarias estas superficies límite. El haz luminoso es conducido aquí sólo por reflexión total a la superficie sensora y a la superficie límite opuesta. El haz luminoso penetra aquí en los guíaondas ya desde un principio en un ángulo apropiado para la resonancia SPR. Si tiene éxito ahora reproducir la luz total que sale paralela sobre un detector CCD, puede obtenerse asimismo un aumento de intensidad y con ello una reducción del tiempo de medición. Aquí sin embargo al contrario que en la Figura 3 el ángulo de la luz irradiada está definido fijo.

Una forma de realización más costosa, que trabaja según este principio con trayecto de rayos totalmente paralelo y adicionalmente presenta resultados de reproducción mejorados (menor ensombrecimiento de bordes, menor susceptibilidad a la luz dispersa) está representada en la Figura 5. Aquí la luz es conducida por una fibra óptica 50 a través de un sistema de reproducción óptico L1, L1' hacia el monocromador 5 y por otra fibra óptica 51 hacia una óptica L2, L3 de ensanchamiento del haz. Esto tiene la ventaja de que el guiado del haz de iluminación puede ajustarse independientemente del acoplamiento y desacoplamiento de la luz en el monocromador 5. La iluminación del conjunto guíaondas 10 se efectúa asimismo como se ha descrito según la Figura 3 con un haz de rayos paralelo ensanchado en un ángulo bajo el cual se espera la resonancia de plasmones. Además opcionalmente puede estar empleada como en la Figura 3 una máscara de agujeros no representada en la Figura 5. Al salir la luz fuera del sensor ésta sale o desplazada en paralelo (en caso de un número par de reflexiones, compárese la Figura 6b) y por lo tanto con el ángulo \alpha con el cual ha entrado. En caso de un número impar de reflexiones (Figura 6a) la luz sale con el ángulo -\alpha. La longitud L y el ancho B del guíaondas apto para la SPR están especialmente dimensionados en el ejemplo según la Figura 5 de manera que el número de reflexiones sea impar y por lo tanto la luz sale exclusivamente en dirección de un segundo espejo deflector 71. En contraposición a la Figura 3, en la cual la reproducción está realizada con una capa de dispersión sobre una cámara CCD, aquí el paralelismo de la luz que sale se utiliza para prácticamente invertir la trayectoria de luz de la iluminación: mediante una lente convergente acromática L6 de gran distancia focal (por ejemplo f = 1000 mm) de gran diámetro y un objetivo L7 apropiado (por ejemplo f = 100 mm) la superficie del conjunto sensor es reproducida en forma telescópica sobre el chip CCD. Puesto que la superficie del conjunto sensor 10 a reproducir no está situada perpendicular al eje óptico del dispositivo, con una cámara convencional, en la cual el objetivo está situado paralelo al chip CCD, debido a la no suficiente profundidad de campo sólo sería reproducida nítidamente una línea del objeto. Por eso el chip CCD 20 en el lado de la imagen asimismo tiene que estar inclinado con respecto al eje óptico, como está indicado en la Figura 5, para garantizar una reproducción nítida a través de la superficie total del conjunto sensor 10. Esto puede realizarse siendo ajustada la cámara CCD con respecto al objetivo con un goniómetro no
representado.

Otra ventaja de la reproducción telescópica es la pequeña susceptibilidad a la luz dispersa, porque sobre el chip CCD sólo es reproducida luz que sale del plano del objeto con el ángulo de detección.

La Figura 7 muestra una reproducción nítida de un conjunto sensor 10, producida por un guiado del haz de acuerdo con la Figura 5. Para cada longitud de onda se detecta una imagen semejante y en el ordenador 30, como se ha descrito con respecto a la Figura 2, se forma la integral de intensidad sobre una zona de sensores. Para cada sensor individual de esta manera se detecta en el espectro una caída de intensidad que se produce en la resonancia de plasmones superficiales, como está mostrado como ejemplo para uno individual en la Figura 8. La curva de trazos y puntos en la imagen parcial superior de la Figura 8 muestra el espectro en el cual la superficie sensora se encuentra en aire. En esencia éste corresponde al plegado matemático de espectro de lámpara y transmisión de monocromador. La línea de trazo lleno corresponde a la medición en presencia de un tampón; a este espectro está superpuesta la resonancia de plasmones superficiales. Mediante normalizado sobre el espectro en aire se obtiene el espectro de resonancia superficial puro, como está representado en la imagen parcial inferior de la
Figura 8.

Para comprobar que en el caso de la caída detectada en el espectro se trata de la resonancia de plasmones superficiales, se varía el índice de refracción de la solución, midiéndose en diferentes concentraciones de sacarosa. La imagen parcial superior de la Figura 9 muestra cómo la caída en el espectro se desplaza con concentración creciente de sacarosa, como se espera. Un ajuste de los datos de medición con una función de Gauss suministra valores numéricos para la posición de los mínimos de los espectros. Con el índice de refracción de la solución conocido puede obtenerse de ello una curva de calibrado, como la que puede observarse en la imagen parcial inferior de la Figura 9. Para un intervalo del índice de refracción suficientemente pequeño se admite aquí aproximadamente una relación lineal. En el presente ejemplo se obtiene un desplazamiento de 1,4 nm para una variación del índice de refracción de 10^{-3}. Da buen resultado determinar el mínimo con una precisión de unos 0,3 nm, un valor típico para una curva de resonancia de unos 50 nm de valor del intervalo medio. De este modo pueden comprobarse variaciones del índice de refracción de 2\cdot10^{-4}. Esto demuestra la sensibilidad del método en la medición paralela de varios cientos o miles de muestras en el intervalo de pocos minutos.

Lista de símbolos de referencia

1 -	Sensor planar de SPR
10 -	Conjunto guíaondas
11 -	Oblea de silicio
12 -	Capa de SiO_{2}
13 -	Guíaondas de luz
14 -	Tiras de guíaondas
15 -	Escotaduras en forma de peine
16 -	Capa apta para la SPR
17 -	Superficie frontal (ventana de entrada) del guíaondas de luz 13
20 -	Chip (cámara) CCD
3 -	Fuente luminosa
4 -	Filtro de IR
5 -	Grupo constructivo selectivo de longitudes de onda
6 -	Polarizador
7 -	Espejo deflector
71 -	Segundo espejo deflector
8 -	Máscara de agujeros múltiples
9 -	Medios dispersores de la luz
30 -	Ordenador
31 -	Circuito de mando
40 -	Superficies límite reflectantes
50, 51 -	Fibra óptica
60 -	Placa microtiter
61 -	Muestra en una cavidad de la placa microtiter 60
62 -	Fondo de cavidades
B -	Ancho del guíaondas apto para la SPR
L -	Longitud del guíaondas apto para la SPR
\alpha -	Ángulo de entrada y de salida de la luz
L1, L1', L2, L3, L4, L6, L7 -	Sistema de reproducción óptico
L5 -	Lentes

Claims (22)

1. Dispositivo de medida para mediciones de SPR (SPR: resonancia de plasmones superficiales), que comprende:

Un conjunto guíaondas (10), que comprende una multiplicidad de guíaondas planares (13), en los cuales es guiada luz en al menos una dimensión a través de un lado de entrada de la luz y de un lado de salida de la luz, y los cuales presentan respectivamente al menos dos superficies límite paralelas, correspondiendo las distancias de los guíaondas individuales (13) a una retícula homogénea de dos dimensiones y estando provisto cada guíaondas individual (13) de una región sensora (16) apta para la SPR,

una fuente luminosa (3),

un grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda y un sistema óptico, (L2, L3), que están subordinados a la fuente luminosa (3), estando configurado el sistema óptico (L2, L3) de manera que los lados de entrada de la luz de los guíaondas (13) del conjunto guíaondas (10) son iluminados con luz paralela, estando configurado el grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda para ajustar la longitud de onda de la luz a una longitud de onda luminosa predeterminada,

una óptica de reproducción (L4; L6, L7) y un chip CCD (20), que están configurados de manera que la luz que sale de los lados de salida de la luz de los guíaondas (13) del conjunto guíaondas (10) es reproducida sobre el chip CCD, y la luz que proviene de cada guíaondas de luz individual (13) es registrada por en cada caso varios pixels de CCD adyacentes del chip CCD (20), y

un ordenador (30) con software de procesamiento de imágenes, que está configurado de manera que se calcula un valor de intensidad luminosa de la luz que proviene de cada guíaondas de luz individual (13), y tras el almacenamiento de datos de valor de intensidad, longitud de onda ajustada y coordenadas en el conjunto guíaondas (10) mediante un circuito de mando (31) se realiza una regulación del grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda a otra longitud de onda luminosa, con la finalidad del registro de un espectro de intensidad.

2. Dispositivo de medida según la reivindicación 1, caracterizado porque al grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda está subordinado un polarizador (6).

3. Dispositivo de medida según la reivindicación 1, caracterizado porque los guíaondas (13) están configurados en forma de peine de tal manera que las regiones sensoras (16) aptas para la SPR pueden introducirse en las cavidades de una placa microtiter (60).

4. Dispositivo de medida según la reivindicación 1 o 3, caracterizado porque a la cara del lado de salida de la luz del conjunto guíaondas (10) están asignados medios (9) dispersores de la luz.

5. Dispositivo de medida según la reivindicación 1, 3 o 4, caracterizado porque a la cara del lado de entrada de la luz del conjunto guíaondas (10) están asignados medios de enmascaramiento y/o de absorción, para garantizar que únicamente luz que sale de los guíaondas llega al chip CCD (20).

6. Dispositivo de medida según la reivindicación 5, caracterizado porque a la cara del lado de entrada de la luz del conjunto guíaondas (10) están asignados medios de enmascaramiento en forma de una máscara de agujeros múltiples (8).

7. Dispositivo de medida según la reivindicación 3 o 5, caracterizado porque los medios de enmascaramiento y/o de absorción están asignados de tal manera que exclusivamente se produce una entrada de luz en las zonas de fondo (62) de las cavidades de una placa microtiter (60), en las cuales están dispuestos los sensores aptos para la SPR.

8. Dispositivo de medida según la reivindicación 3 o 5, caracterizado porque los medios de absorción asignados a la cara del lado de entrada de la luz del conjunto guíaondas (10) están configurados en forma de una placa microtiter, cuyas paredes del lado de las cavidades están fabricadas de un material absorbente de la luz.

9. Dispositivo de medida según la reivindicación 5, caracterizado porque los medios de absorción asignados a la cara del lado de entrada de la luz del conjunto guíaondas (10) están configurados en forma de un relleno absorbente de la luz, que separa unos de otros los guíaondas (13).

10. Dispositivo de medida según la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda está formado por un monocromador regulable paso a paso y al sistema de reproducción óptico (L2, L3) está subordinado un espejo deflector (7), el cual garantiza una iluminación de los lados de entrada de la luz de los guíaondas (13) con luz paralela bajo un ángulo apropiado.

11. Dispositivo de medida según la reivindicación 10, caracterizado porque adicionalmente al extremo del lado de salida de la luz del conjunto guíaondas (10) está subordinado directamente otro espejo deflector (71), que garantiza la reproducción del conjunto guíaondas (10) sobre un chip CCD (20) inclinado con respecto al eje óptico.

12. Procedimiento de medida para mediciones de SPR (SPR: resonancia de plasmones superficiales), que comprende:

El empleo de un conjunto guíaondas (10), que comprende una multiplicidad de guíaondas planares (13), en los cuales es guiada luz en al menos una dimensión a través de un lado de entrada de la luz y de un lado de salida de la luz, y los cuales presentan respectivamente al menos dos superficies límite paralelas, correspondiendo las distancias de los guíaondas individuales (13) a una retícula homogénea de dos dimensiones y estando provisto cada guíaondas individual (13) de una región sensora (16) apta para la SPR,

la iluminación de los lados de entrada de la luz de los guíaondas (13) del conjunto guíaondas (10) con luz paralela, con una fuente luminosa (3), un grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda y un sistema óptico (L2, L3), ajustando el grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda la longitud de onda de la luz a una longitud de onda luminosa predeterminada,

la reproducción de la luz que sale de los lados de salida de la luz de los guíaondas (13) del conjunto guíaondas (10) sobre un chip CCD (20) con una óptica de reproducción (L4; L6, L7), y el registro de la luz que proviene de cada guíaondas de luz individual (13) por en cada caso varios pixels de CCD adyacentes del chip CCD (20), y

el cálculo de un valor de intensidad luminosa de la luz que proviene de cada guíaondas de luz individual (13) con un ordenador (30) con software de procesamiento de imágenes, y tras el almacenamiento de datos de valor de intensidad, longitud de onda ajustada y coordenadas en el conjunto guíaondas (10), regulación del grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda a otra longitud de onda luminosa, con la finalidad del registro de un espectro de intensidad.

13. Procedimiento de medida según la reivindicación 12, caracterizado porque al grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda está subordinado un polarizador (6).

14. Procedimiento de medida según la reivindicación 12, caracterizado porque los guíaondas (13) están configurados en forma de peine de tal manera que las regiones sensoras (16) aptas para la SPR pueden introducirse en las cavidades de una placa microtiter (60).

15. Procedimiento de medida según la reivindicación 12 o 14, caracterizado porque la luz en la cara del lado de salida de la luz del conjunto guíaondas (10) es dispersada con medios (9) dispersores de la luz.

16. Procedimiento de medida según la reivindicación 12, 14 o 15, caracterizado porque en la cara del lado de entrada de la luz del conjunto guíaondas (10) la luz es enmascarada con medios de enmascaramiento y/o de absorción, para garantizar que únicamente luz que sale de los guíaondas llega al chip CCD (20).

17. Procedimiento de medida según la reivindicación 16, caracterizado porque a la cara del lado de entrada de la luz del conjunto guíaondas (10) están asignados medios de enmascaramiento en forma de una máscara de agujeros múltiples (8).

18. Procedimiento de medida según la reivindicación 14 o 16, caracterizado porque los medios de enmascaramiento y/o de absorción están asignados de tal manera que exclusivamente se produce una entrada de la luz en las zonas de fondo (62) de las cavidades de una placa microtiter (60), en las cuales están dispuestos los sensores aptos para la SPR.

19. Procedimiento de medida según la reivindicación 14 o 16, caracterizado porque los medios de absorción asignados a la cara del lado de entrada de luz del conjunto guíaondas (10) están configurados en forma de una placa microtiter, cuyas paredes del lado de las cavidades están fabricadas de un material absorbente de la luz.

20. Procedimiento de medida según la reivindicación 16, caracterizado porque los medios de absorción asignados a la cara del lado de entrada de luz del conjunto guíaondas (10) están configurados en forma de un relleno absorbente de la luz, que separa unos de otros los guíaondas (13).

21. Procedimiento de medida según la reivindicación 12, caracterizado porque el grupo constructivo (5) selectivo de longitudes de onda está formado por un monocromador regulable paso a paso y al sistema de reproducción óptico (L2, L3) está subordinado un espejo deflector (7), para garantizar una iluminación de los lados de entrada de la luz de los guíaondas (13) con luz paralela bajo un ángulo apropiado.

22. Procedimiento de medida según la reivindicación 20, caracterizado porque adicionalmente al extremo del lado de salida de la luz del conjunto guíaondas (10) está subordinado directamente otro espejo deflector (71), para garantizar la reproducción del conjunto guíaondas (10) sobre un chip CCD (20) inclinado con respecto al eje óptico.