WO2005022131A1

WO2005022131A1 - 表面プラズモン共鳴装置

Info

Publication number: WO2005022131A1
Application number: PCT/JP2004/012337
Authority: WO
Inventors: Takashi Nakajima; Motoki Kyo; Kazuki Inamori; Hiroaki Uematsu
Original assignee: Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2005-03-10

Abstract

本発明は、金属薄膜面の裏側に斜めからｐ波偏光した平行光束を照射する投光手段と、金属薄膜の表側に被測定物質を２次元に接触させる接液手段と、金属薄膜面の裏面からの反射光強度を２次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、前記受光手段の中に、２次元の歪みを低減する光学レンズを有することを特徴とする２次元表面プラズモン共鳴装置に関する。また、本発明は、表面プラズモン共鳴装置のセンサー表面部分内にアスペクト比０．５以上の長方形もしくは正方形の測定領域を取り、該測定領域を均等に縦１０個×横１０個の分割測定領域に分け、該分割測定領域の中心に分割領域の短辺の４０％に相当する直径を持つ円形の注目領域を設けた際に、水をベースラインとして、１％エタノール水溶液をセンサー表面と接触させて測定した場合、該１００個の注目領域から得られるシグナルのばらつき（ＣＶ）を１５％以下とすることができる測定領域の面積が７０ｍｍ２以上であることを特徴とする表面プラズモン共鳴装置に関する。さらに、本発明は、チップ上の２５ｍｍ２以上の正方形領域からの反射像の歪みが４％以下である２次元表面プラズモン共鳴装置に関する。

Description

明細書

表面プラズモン共鳴装置

技術分野

本発明は、光学測定分野の中で、金属薄膜の表面プラズモン現象を利用した測定装置で、さらに詳しくは 2次元表面プラズモン共鳴装置の性能向上技術に関する。

また、本発明は、金属薄層に照射する偏光光束の照度ムラが少ないために、シグナルのばらつきの低減された表面プラズモン共鳴装置に関する。

さらに本発明は、歪みおよびディストーションの低減され、マスク操作の容易な 2次元. 表面プラズモン共鳴装置に関する。

背景技術

近年、生理活性物質間の相互作用を評価する試みが数多くなされている。その多くは一方の分子を固相に固定化し、その分子と分析対象物質 (アナライト）に蛍光やラジオァイソトープなどのラベル物質を結合させ、ラベル物質を検出することで生体分子あるいは分子集合体間の相互作用を評価する方法が取られている。一般的な DNAチップは蛍光などのラベル物質を用いて相互作用をスクリーニングする。しかし、ラベル操作は非常に煩雑であるとともに定量性に欠ける。また、相互作用をリアルタイムで観察するのは非常に困難である。

そこで、ラベルが不要でかつ定量性があり、リアルタイムで評価可能な分析方法として、表面プラズモン共鳴 (SPR)センサーが注目を集めている。 SPRは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を、共鳴角もしくは反射光強度の変化で測定する方法である。

一般的な SPRセンサーにおいては、 EP0341 927AIにみられるように単一波長であるレーザー光を光源として用いる。レーザー光は直進性に優れておリ、光学研究には非常に使い易い光源である。しかし、光は一点に集中したビームであり、光の当たる部分の面積は非常に小さい。よって、相互作用を評価できる物質は基本的に一つであり、 D NAチップのように複数の物質をスクリーニングすることは非常に難しい。

この問題を解決する手段として、 Nelsonらは SPRの光源としてハロゲンランプを採用し、その光源を凸レンズやピンホールを組み合わせた空間フィルタで平行光にして、偏光板を通したのち、 SPRに適当な角度で入射させて、 1 8 X 1 8mmの金蒸着スライドに照射し、さらにその反射光を波長フィルタに通してから CCDカメラで撮影した、いわゆる 2次元表面プラズモン共鳴装置で複数の物質の同時測定を実現した（Nelsonら、 Anal. Chem.、71巻、 3928— 3934頁、 1 999年）。

ここで示されているデータは、センサー表面上の 6mm X 4mm = 24mm²の領域に 2 4個のスポットに関してのみである。 24個のデータに関しては、ほとんどばらつきがないことが示されているものの、それ以上の広い範囲にわたってスポットを設けても均一なシグナルを得るのは困難であるのが現状である。

広い範囲にわたって均一なシグナルを得る手段としては、均一な照度を得るのが必要である。照度の均一性を高める手段として、ピンホールの穴を小さくする方法があるものの、十分な照度が得られず、逆にシグナルの均一性が低下することもある上、検出に高価な高感度 CCDカメラが必要となる問題点があった。

さらに従来使用されているカメラ用レンズは、一般の CCTVレンズや凸レンズ 1枚の単レンズ構成であるため、 2次元撮影自体は可能であるが、レンズ収差に伴う球面収差、ディストーション、像面湾曲などによる歪みやピントずれ、さらには金属薄膜面を斜めから撮影していることも相まっての、いわゆる遠近効果による画像の台形上歪みやピントずれが発生するなど、目的の 2次元 SPR画像は歪みが大きぐ不鮮明である。

またこのような 2次元表面プラズモン共鳴装置では、観察したい物質と相互作用を有している物質をそれぞれ金薄膜上の予め決められた領域に固定（以下スポット)されているので、各 SPRシグナルを測定する場合は測定前に撮影した画像を基に、被測定物質ごとに観察したい領域を指定する、いわゆるマスク作業を行う必要がある。通常各スポッ卜は同一形状、同一面積で、等間隔で配置されることが多いが、前記のように従来の技術では撮影された画像は歪みが大きく、原型を忠実に再現できていない。そのためマスク作業は等間隔処理による一括指定ができず、すべての領域をひとつひとつ指定していく必要があり、スポット数が多い場合は非常に煩雑であった。のみならずピン卜ずれが発生することで、 SPRシグナルのバラツキが大きくなる問題があり、精度確保のためにはある程度のスポット面積を必要とするため、スポット面積を小さくし、高密度にすることが困難である。

本発明の 1つの目的は、 2次元表面プラズモン共鳴装置において、画像歪みを低減し、かつピントずれが小さい鮮明な画像を得ることで、マスク処理の等分割一括指定による簡便化、 SPRシグナルのバラツキ低減、高密度な SPR同時測定などを可能にすることである。

本発明の他の目的は、照度ムラの低減された光束を得ることで多数のサンプルを再現性良ぐまた、バラツキが少なく測定できる性能が高い SPRを提供する。

本発明のさらに他の目的は、 2次元表面プラズモン共鳴装置において、画像歪みを低減することで、マスク操作の等分割一括指定による簡便化、 SPRシグナルのバラツキ低減、高密度な SPR同時測定などを可能にすることである。

図面の簡単な説明

図 1：実施例'比較例で用いた 1 00穴フォトマスク

図 2：実施例■比較例で用いた 4象現型フォトマスク

図 3 : 2次元表面プラズモン共鳴装置の概観図。図 3において、符号は以下を表す。 1 正方形フィラメント型ハロゲンランプ

2 CCDカメラ

3 CCTVレンズ

4 フローセル

5 ピンホール

6 近赤外偏光フィルター

7 干渉フィルター（830nm)

8 60度プリズム

9 平凸レンズ

1 0 平凸レンズ

図 4 :実施例 1における観察画像 1

図 5：歪みおよびディストーションを計算する際の計測場所

図 6：実施例 1における等間隔マスク処理

図 7 :実施例 1における観察画像 2

図 8：実施例 1おける観察画像拡大図

図 9 :実施例 2における 1 %エタノールによる SPRシグナルの変化

図 1 0：比較例における観察画像 1

図 1 1：比較例における等間隔マスク処理図 1 2 :比較例における観察画像 2

図 1 3：比較例における拡大画像

図 1 4 :比較例における 1 %エタノールによる SPRシグナルの変化

発明の開示

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。

1 . 金属薄膜面の裏側に斜めから P波偏光した平行光束を照射する投光手段と、金属薄膜の表側に被測定物質を 2次元に接触させる接液手段と、金属薄膜面の裏面からの反射光強度を 2次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、前記受光手段の中に、 2次元の歪みを低減する光学レンズを有することを特徴とする 2次元表面プラズモン共鳴装置。

2. 前記光学レンズが、テレセントリックレンズを使用したことを特徴とする請求項 1記

3. チップ上の金属薄膜面からの反射光を 2次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、反射像の歪みが 4%以下となる領域を、少なくとも、チップ上で連続して 25mm²以上有することを特徴とする 2次元表面ブラズモン共鳴装置。

4. 縦方向のディストーションと横方向のディストーションの絶対値がどちらも 0. 5% 以下である請求項 1記載の装置。

5. チップ上の同時測定可能なサンプル数が 25以上である請求項 1または 2に記載

6. 項 1〜5のいずれかに記載の 2次元表面プラズモン共鳴装置を用いて、チップ上の 25点以上のスポットを同時に測定することを特徴とする測定方法。

7. 表面プラズモン共鳴装置のセンサー表面部分内にアスペクト比 0. 5以上の長方形もしま正方形の測定領域を取り、該測定領域を均等に縦 1 0個 X横 1 0個の分割測定領域に分け、該分割測定領域の中心に分割領域の短辺の 40%に相当する直径を持つ円形の注目領域を設けた際に、水をベースラインとして、 1 %エタノール水溶液をセンサー表面と接触させて測定した場合、該 1 00個の注目領域から得られるシグナルのばらつき（CV)を 1 5%以下とすることができる測定領域の面積が 25mm²以上であることを特徴とする表面プラズモン共鳴装置。

8. 光源の均一化に用いるピンホールの穴の径が 50 i m以上 300 j« m未満である請求項 7記載の装置

9. 正方形フィラメント型ハロゲンランプを用いることを特徴とする請求項 7に記載の本発明により、画像歪みが低減され、かつ鮮明な画質で、性能が高い 2次元表面ブラズモン共鳴装置を実現した。今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待する。

発明を実施するための最良の形態 .

以下に本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。図 3に示すように、 2次元プラズモン共鳴装置を構成するものとして、まず p波変調した平行光束を入射する手段であるが、この平行光の平行精度および光束内照度の均一性は SPRの性能において非常に重要である。そのためハロゲンランプを光源として、途中に凸レンズとピンホールを使用した、いわゆる空間フィルタを使用して生成する方式が好ましい。

次に金属薄膜面と被測定物質を 2次元で接触させる手段であるが、光学プリズムと、金属薄膜がコートされた前記光学プリズムと同一の屈折率を有する光学スライドガラスを、それらと同一の屈折率を有するマッチングオイルを介して、金属薄膜面とは反対側と接合し、さらに 2次元の液空間が金属薄膜面との間に設けられるような凹部を有し、かつその液空間に接続された入出力ポートを有しているフローセルと、光学スライドガラスを接合する方式が好ましい。

本発明で使用する 2次元の反射光強度を測定する手段としては、テレビカメラが好まし《さらにはカメラの種類としては、単色を 2次元に撮影できるものであれば、撮像管、 C CD、 CMOSカメラのいずれでもよいが、経済性と性能の両面から CCDカメラがより好ましい。カメラサイズや画素数は、レンズを含めた解像力が目的の金属薄膜面の解像度以上になるようにすれば、特に限定されるものではない。

本発明の好ましい 1つの実施形態において、本発明における SPR装置では、光は分子の固定される金属面の背後から照射される。 CCDカメラも金属面の背後から撮影するために、撮影される像は反転することになる。また、チップの置く方向、 CCDカメラの設置方向によって、像は回転する。そこで、 CCDカメラによって撮影した画像をコンビユータ演算によって、上下反転及び/または左右反転及びまたは回転させて表示及びまたは演算することが好ましい。その結果、チップ上の形成したパターンがそのまま映しだされるため、好ましい。

回転操作を行う場合、回転角は特に限定されるものではないが、通常は 90° 、 1 8 0° 、 270° の中から選択される。

本発明では反転'回転処理された映像は、そのまま表示されてもよ演算処理に用いられてもよい。演算処理は特に限定されるものではないが、通常はコンストラクト調整、明るさ調整、画像の減算などが行われる。また、画像はライブ画像でも、以前に映した画像であってもよい。

こうしてチップ上と全く同じ方向、パターンで映し出されることで、チップ上のスポットの場所を特定することが容易となる。また、自動スポッターを用いて、チップ上にアレイを形成した場合、チップ上のパターンとスポットした位置のずれが存在する場合がある。その場合、ずれの方向を容易に知ることができるため、次にアレイを作製する場合に、自動スポッターのスポットする位置を修正して、パターン通りにアレイを作製することが容易でめる。

本発明の 1つの好ましい実施形態において、本発明の対象となるアレイは、多数のスポットからなるアレイである。スポット数は、少なくとも一方の辺が 5個以上、好ましくは 6 個以上、より好ましくは 7個以上である。また、スポットの少ない辺であってもスポット数は 4個以上、好ましくは 5個以上、より好ましくは 6個以上である。

本発明のアレイは、通常測定領域において 25mm²程度以上の面積を有する。 25m m²程度とは、例えば約 5mm X約 5mmの大きさを想定している。アレイ上の 1つのスポッ卜の大きさを 0. 3~0. 5mmと仮定し、その間隔も 0. 3〜0. 5mmとすると、 25mm² 程度の測定領域上に 25個（5個 X 5個；スポット 0. 5mm、間隔 0. 5mm)〜50個程度以上（7個 X 7個〜 8個 X 8個；スポット 0. 5mm、間隔 0. 5mm)のスポットにおいて測定が可能になる。このように多くのスポットを同時測定する場合、反射像の歪みが 4<½以下であれば、等間隔のマスク化及びそれによる処理の容易化を実現することができる。図 3に示すように、 2次元プラズモン共鳴装置を構成するものとして、まず p波変調した平行光束を入射する手段であるが、この平行光の平行精度および光束内照度の均一性は SPRの性能において重要である。そのためハロゲンランプを光源として、途中に凸レンズとピンホールを使用した、いわゆる空間フィルタを使用して生成する方式が好ましい。

次に金属薄膜面と被測定物質を 2次元で接触させる手段であるが、光学プリズムと、金属薄膜がコートされた前記光学プリズムと同一の屈折率を有する光学スライドガラスを、それらと同一の屈折率を有するマッチングオイルを介して、金薄膜面とは反対側と接合し、さらに 2次元の液空間が金属薄膜面との間に設けられるような凹部を有し、かつその液空間に接続された入出力ポートを有しているフローセルと、光学スライドガラスを接合する方式（Kretschmann配置）が好ましい。ただし、回折格子を金属表面に有しプリズムゃマッチングオイルを必要としない方式 (Wood配置）、プリズム底面と金属表面との間に空隙を設ける方式 (Otto配置)も可能である。

本発明で使用する 2次元の反射光強度を測定する手段としては、テレビカメラが好まし《さらにはカメラの種類としては、単色を 2次元に撮影できるものであれば、撮像管、 CCD, CMOSカメラのいずれでもよいが、経済性と性能の両面から CCDカメラがより好ましい。カメラサイズや画素数は、レンズを含めた解像力が目的の金属薄膜面の解像度以上になるようにすれば、特に限定されるものではない。

本発明における、二次元の反射光すなわち反射像の歪みは 4%以下であることが好ましぐさらには 3%以下、特には 2%以下が好ましい。歪みが少ない方がマスク操作は容易となるためである。歪みはチップ上の 25mm²以上の正方形領域からの反射像を図 5に示す場所の距離を測定することで計算される。

歪み（％) = ( I L_b— L_u I ZL_b) X 1 00 式（1 )

L_u：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ

L_{b :}最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ

チップ上の反射像の歪みが 4%以下となる領域が 25mm²未満であると、アレイとしてスポットを並べる領域が狭くなリ、一度に多くのサンプルを測定することができるという 2 次元表面プラズモン共鳴測定のメリットが生かしきれない場合がある。光学系においては SPR現象を起こす入射角が必要であるため、反射像の撮影はチップの正面ではなく、斜め方向から行われる。その結果、像は長方形に近い形状となる力そのアスペクト比は本発明では限定されない。 4%以下の歪みの意味を、計算を容易にするため、 1 Omm X 1 0mmの領域の場合を例として以下に説明する。

歪みが 4%以上ある場合は、 1 0mmと 1 0mmの領域（100mm²)を想定すると、上辺が 1 0mm、下辺が 9. 6mm (またはその逆）となる。この場合 0. 4mmのずれが生じることになる。

チップ上のスポット 1つの大きさを直径 0. 5mmまたは 1辺 0. 5mmであると仮定すると（これ以上スポットが大きい場合、チップ上に十分な測定可能なスポット数が得られにくし、）、歪みによリスポットの中心が 0. 2mmずれると、スポットのオーバーラップする部分は 0. 3mmになり、測定可能な限界であり、非常に小さいマスクを使用して初めて測定可能になる。

チップ上の 1つのスポットの大きさ、スポットの間隔、歪みの対称性などにより、許容される歪みの割合が代わるが、反射像の歪みは 4%以下であれば、多数のスポットを同時に測定可能であり、歪みが 3%以下、さらに 2<½以下であれば、スポットの大きさ、スポット間隔、スポットの数などの種々の条件にかかわらず高精度に 2次元表面ブラズモン共鳴測定を行うことが可能である。一般にチップ上のスポットの大きさ、スポット間の間隔が小さくなればなるほど、歪みを小さくする必要がある。

反射像の歪みが 4%以下となる領域は、好ましくは少なくとも 45mm²以上、さらに好ましくは 70mm²以上、特に好ましくは 1 00mm²以上である。

また、当該領域はチップ上で長方形または正方形であることが好ましぐアスペクト比が 0. 5以上、さらには 0. 6以上、特には 0. 7以上が好ましい。

さらに、該領域の面積の上限は特に定めるものではないが、 1 OOOOmm² (100mm X 100mm)、さらには 2500mm² (50mm x 50mm)である。

本発明において、縦方向のディストーションと横方向のディストーションの絶対値はどちらも 0. 5%以下である。これらのディストーションは図 5に示したパラメータから計算される。

縦方向ディストーション（％)

= ((H_m- (Η,+Η_Γ) /-2)/Ή„) x 1 00 式（2)

Η, :最左列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ

Η 最右列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ H_{m :}中央列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ（中央列がない場合は、中央に最も近い左右二つの列を選択し、平均を中央列とする）

横方向ディストーション (％)

= ( (L_m— (L_u+L_b) Z2) ZL_m) x l 00 式（3)

L_b：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ

L_{m :}中央段の最左スポット左端から最右スポットお端までの長さ（中央段がない場合は、中央に最も近い上下 2つの段を選択し、平均を中央段とする）

ディストーションが 0. 50/0より大きい場合、歪みが少なくても、スポットの一部がマスクからずれ、正確な測定ができなくなるか、別途、手作業でマスク操作をする手間が必要になり好ましくない。

従来、 2次元 SPRでアレイの測定を行う場合、せいぜい数個のサンプル処理を同時に行う程度であったので、歪みないしディストーションが本発明の範囲外であっても、測定に問題がな《単に見栄えの問題で歪みがない方がよいといった認識であった。一方、本発明のように多サンプル（多スポット）の系で 2次元 SPRによる同時測定を行う場合、歪み、ディストーションなどの数値が所定の範囲内にあることが決定的に重要である。本発明を実現する手段として、カメラ用レンズに焦点距離の長いレンズを用し、、遠くから撮像する場合、あおりレンズを用いる場合、等も挙げられるが、

ここでいぅテレセントリックレンズとは、焦点位置に絞りを設けることで、主光線が光軸と平行になるようなレンズをし、い、その中でも物体側テレセントリック性能を有するものである。像側テレセントリック性能を有するレンズもあるが、本発明ではその効果は無関係であるため、その有無は問わない。また通常のカメラレンズである CCTVレンズであっても、物体側テレセン卜リック性能を有するものは、これに該当する。

本発明ではカメラ用レンズとして 2次元の歪みを低減する光学レンズを使用する。 2次元の歪みを低減する光学レンズとは、レンズを通して撮像した場合に、通常は遠くの対象物は小さ近くの対象物は大きく写るが、このような現象を低減することの出来るレンズである。具体的な例としてはテレセントリックレンズ、あおり（シフト）レンズ等が挙げられる力テレセントリックレンズが最も好ましい。振動に対する影響の少なさ、光軸ずれなどに対する安定性、レンズのコンパクトさ、画像の明るさ、被写界深度の深さの観点からも、テレセンドリックレンズが最も好ましい。

テレセントリックレンズの作動距離 (WD)は、長ければ画像の歪み率は小さぐまた被写界深度が大きい、良質な画像が得られるが、反面装置の寸法が大きくなるデメリットがある。そのため WDは特に限定するものではないが、 50~200mmの範囲が好ましい。

また、被写界深度は、金属薄膜面の傾斜による距離差よりも大きいことが特に好ましいが、 WDが大きくなるデメリットもあるため、最低でも前記距離差の半分以上であることが好ましい。

CCDカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。

本発明における表面プラズモン共鳴装置は、画像歪みが 4%以下と少なぐディスト一シヨンの絶対値は 0. 5%以下であり、かつ鮮明な画像が得られる、非常に性能の高い装置である。

本発明は、スポットの大きさ 0. 5mm、スポット間距離 0. 5mmの条件下において歪み、ディストーションに要求される範囲を明らかにした。これにより、さらに小さいスポットの大きさ、スポット間距離を有するアレイの解析を行うことも可能になる。

本発明の好ましい 1つの実施形態において、本発明の SPR機器では広い範囲の SPR シグナル変化を解析するために、チップの広い範囲に、十分な照度を有し照度ムラのない偏光光束を照射できることが特徴である。

ここで言う広い範囲とはチップ表面上の領域で 25mm²以上、好ましま 45mm²以上、特に 70mm²以上である。すなわち、レーザ一光を狭い領域に照射する手段や、光源を集光してセンサー上の点、もしくは線に照射する手段は含まれない。 70mm²未満、さらには 45mm²未満、特に 25mm²未満であると面積が十分でなぐスクリーニングテストの n数の確保、モルホロジー観察が困難となる

本発明の SPR装置のシグナルムラを定量的に測定する方法として、テス卜チップを装置にセットして、屈折率の異なる二種類の液を順番に流し、観察領域を分割した各部位のシグナル変化のばらつきを定量する方法が好ましい。偏光光束の照度ムラを直接的に測定するのは SPRの性能を反映しているとは言えず好ましくなし、。ただ単に反射像の照度のばらつきを計測する方法は、チップの微小な汚れなどを照度ばらつきと区別できないため好ましくない。

屈折率の異なる二種類の液としては水と 1 %エタノール水溶液が容易に入手できるため好ましい。測定領域としてはテストチップの表面に換算して 25mm²以上、好ましくは 4 5mm²以上、より好ましくは 70mm²以上の広い領域であり、特に 80mm²以上である。測定領域としてはアスペクト比 0. 5超の長方形もしくは正方形であることが好ましい。アスペクト比としては、より好ましくは 0. 6超、さらに好ましくは 0. 7超である。アスペクト比が 0. 5より低くなると、測定領域が細長くなりすぎ、実質的に使いに《なる。なお、ここでアスペクト比が 0. 5超とは、数値が 0. 5より大きいことを言う。

70mm²未満さらには 45mm²未満、特に 25mm²未満の場合は、多くのサンプルを一度に正確に評価することが困難となる。狭い領域のばらつきが少なくても、広い領域でばらつきがあれば意味がないからである。

測定領域のシグナルの変化のバラツキは以下の通り測定する。

該測定領域を縦 1 0個、横 1 0個に均等に分割し、それぞれを分割領域とする。さらに分割測定領域の中心に測定を行う円形の測定点 (注目領域)を設け、この領域のシグナルを SPRで測定する。注目領域の直径は、分割測定領域の縦、横の辺の短い方の辺の長さの 40%に相当するものとする。それぞれの注目領域でシグナルを検出し、水と 1 %エタノール水溶液とでそのシグナルの差を求め、さらに、この 1 00箇所の注目領域でのシグナルの変化の平均値及び標準偏差を求める。

こうして、水と 1 %エタノールによって得られるシグナル変化のばらつきは CVで示される。 CVとは標準偏差を平均値で割った値であり、 CV値は 1 5%以下であることが好ましく、 1 0%以下であるとさらに好ましい。

このような CV値の測定領域がセンサー表面上に 70mm²以上存在する SPR測定機を用いることにより、多くのサンプルを同時に、また、正確に測定することができる。

テストチップとしては透明基板に金力《コ一ティングされたものが好ましい。金の厚みは 3 0から 1 0Onmが好ましぐ特に 40から 60nmが好ましい。金の剥離を防ぐため、金と透明基板の間にクロムまたはチタンが 1から 1 Onmコーティングされていてもよい。金属のコーティング方法としては特に限定されるものではなぐ真空蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが挙げられる。実際に用いる場合は、金表面にアルカンチォ一ルを単分子でコーティングすると、チップ表面が汚れないため好ましい。アルカンチォ一ルとしては OH基をもつ 1 1一メルカプトゥンデカノールや、 COOH基をもつ 1 1—メルカプトゥンデカン酸などを選択すると好ましい。

透明基板としては特に限定されるものではなぐガラスやプラスチック類などが挙げられる。平面基板もしくは回折格子基板なども含まれる。

一般的な安価な光源はフィラメント部を有しており、光の明暗ムラが存在する。光源の光をそのまま照射すれば、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングゃモルホロジ一変化を評価するのが困難となる。チップに均一に照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。

ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。

ピンホールの形状は円、楕円、四角形やそれ以上の多角形、不定形等、形状にこだわるものではないが、円形が好ましい。

ピンホールの穴の大きさは径が 50 / m以上 300 ;W m未満が好ましい。さらには 1 00 μ以上が好ましい。 50 m未満であると照度を十分に確保できないため好ましくない。

300 U m以上のピンホールを用いる、もしまピンホールを用いない場合は、光束の照度ムラが生じ、 SPR機器としては正確なイメージング解析ができない場合があり好ましくなし、。なお、ここで径とはピンホールが円形の場合は直径を表し、楕円の場合は長軸の直径、多角形の場合は対角線で最長の値をとるものである。

ピンホール内で交差し、通過した光は集光レンズ（凸レンズ)を用いて再度平行光とし、偏光板を透過させた後に、センサー表面に照射されることが好ましい。

本発明で用いる光源は安価なハロゲンランプが好ましい。中でも、正方形フィラメントを有するハロゲンランプは照度ムラが低減されており、非常に好ましい。ランプの寿命は 1 500時間以上の寿命であることが好ましぐランプの明るさを表す全光束は 300ルーメン以上であることが好ましい。光を導く方法として、光ファイバ一を用いる方法も可能である。

このように、例えば小さな直径のピンホールを用し、、フィラメント形状が正方形であるハロゲンランプを用いることで照度のばらつきを低減させた表面プラズモン共鳴装置を実現することができる。

その結果得られる偏光光束の照度は 20ルクス以上が好ましい。 20ルクス以上であると、 SPRの反射像が波長フィルタ一を透過した後でも、市販の一般的な CCDカメラで撮影可能である。しかし、光源として装置が簡易でかつ安価な白色光源を用いることと、均 —に偏光光束を照射するために光をピンホールに通すため、照度を高くすることは高価であり、 500ルクス以下が好ましい。

チップからの反射光は波長フィルターに通した後に CCDカメラで撮影され、特定の波長近辺の光のみが観察される。波長フィルターの中心波長は特に限定されるものではないが、 SPRの感度が高い 650nm— l OOOnmが選択される。中心波長 750— 950η mが選択されると、さらに感度の高い SPRとなる。波長フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さいほうが波長の分布がシャープとなり好ましい。具体的には半値巾 50nm以下が好ましぐ半値巾 1 5nm以下が特に好ましい。

本発明における表面プラズモン共鳴機器は、照度ムラの少なぐ非常に性能の高いセンサ一であり、各種の解析に好適に用いられる。

発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例 1

(1 )スライドに照射される偏光平行光束光源には正方形フィラメント型ハロゲンランプ (細渕電球社製)を用いた。このランプは 30W、全光束は 440ルーメンと高輝度であるにもかかわらず、平均寿命は 2000時間であり、分析機器にも用いることが可能である。

光源から 50mmの位置に直径 30mm ø、焦点距離 50mmの球面平凸レンズ（シグマ光機社製 SLSQ30— 50P)をレンズの平面側をランプに向けて設置し、光源からの光を平行光とした。前記球面平凸レンズからさらに 35mm離して、さらにもう一つ直径 3 Omm 0、焦点距離 50mmの球面平凸レンズ (シグマ光機社製 SLSQ30— 50P)の球面側を光源に向けて設置した。この球面平凸レンズによってレンズから 50mmの位置に集光され、その位置に直径 200 mのピンホール (シグマ光機社製 PA— 200)を置いて光束をピンホールに通し、球面ァロマティックレンズ (シグマ光機製 DLB— 30— 50 PM)によって平行光とした後、有効径 24mm 0の近赤外偏光フィルタ一 (シグマ光機社製 SPFN— 30C— 26)によって 24mm φの偏光平行光束を得た。

この偏光平行光束の断面面積は 452mm²であり、広範囲の領域を照射可能である。その明るさは感光部 1 Omm 0であるァズワン株式会社デジタル照度計 LM— 331で測定した場合、 60ルクスと本発明に必要な明るさを示していた。

(2)テスト用チップ

1 8mm四方で厚さ 2mmの Lak1 0スライド（n_D= 1 . 720、松浪硝子工業社製）に 3n mクロムと 45nmの金を蒸着した。末端官能基がチオール基である 4armPEGチオール (日本油脂製 SUNBRIGHT PTE—1 OOSH)を 1 mMの濃度で 7mlのエタノール：水 = 6 : 1の混合溶液に溶解させた溶液を調製し、金蒸着スライドを 3時間浸潰し、金基板全体に 4armPEGチオールを結合させた。

4armPEGの分子量は 1 0， 000であり、 PEGの 4つの末端はすべてチオール基となつておリ、金に対する金属結合性を示す。

このスライドの上に図 1に示すフォトマスクを載せ、 500W超高圧水銀ランプ（ゥシォ電機製）で 2時間照射し、 UV照射部の 4armPEGチオールを除去した。フォトマスクは透明な水晶上にクロムがパターン化されており、直径 0· 5mmのクロムの貫通孔が 1 00 個あいておリ、穴があいている部分で UV光が透過してスライドに照射される。次に、 7—カルポキシヘプタンチオール（7— CHT:同仁化学研究所）の I mMェタノ一ル溶液を調製し、前記金蒸着スライドを浸潰し、 UV照射部に 7— CHTを吸着させ、バターン化チップを得た。このパターン化チップをテスト用チップ 1として以下に用いた。 (3)歪みの測定

5 テスト用チップ 1のガラス面にマッチングオイル (カーギル社製 Mシリーズ、 n_D= 1 . 72 0)をつけ、一辺 25mmの 60° 分散プリズム（Oriel社製 461 06)と接触させ、本発明の SPR装置の偏光平行光束を導入した。テスト用チップの金蒸着面には水を接触させた。

金からの反射光束を 830nmの光干渉フィルタ（シグマ光機社製 VPF— 25C— 1 0— 10 45— 83000)によって 830nm近傍の波長光を取り出し、亍レセントリック系 CCTVレンズ (モリテックス社製 MTE— 55)により、完全な平行光のみを取り出してから、白黒 CC Dカメラ (東京電子工業社製 CS8330B)で撮影した。装置の概要は図 3に示す。

観察した 2次元表面プラズモン共鳴画像を図 4に示す。また、図 4における遠近効果による歪み、縦方向ディストーション、横方向ディストーションを以下の表 1に示す。

15 表 1

カメラを 90° 回転して設置しているため、画像も 90° 回転して撮影されており、画像上が金薄膜面では遠方側に相当する。そこで画面の上部のスポット間隔と画面下部のスポット間隔を比較すると、遠近効果による像の歪みを計算でき、その値は 0. 00%となリ、前記遠近効果では歪みの生じない像が得られ、歪みは 4<½以下であった。ここで歪 20 み計算は以下の計算式を使用した。各パラメータの計測地点は図 5に示す。図 5の上図がチップ上のスポット位置に対応し、下図が画面上に映ったときの位置に対応する。歪み（％) = ( I L_b— L_u | /L_b) X 1 00 式（1 )

L_u:最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ

L_b:最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ

25 さらにレンズ収差によるディストーション (歪曲）を計算するため、画面縦方向、および画面横方向それぞれについて、端部の間隔の平均と、中心部の間隔を比較すると、縦方向は一 0. 12%、横方向は + 0. 250/0と、中心部分の変形が ±0. 3%以内に収まり、ほとんど歪んでいない像が得られた。ここで歪みの計算は以下の計算式を使用した。縦方向ディストーション（％)

= ((H_m-(H, + H_r)/2)/H_m) X 100 式（2)

H_l:最左列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ

H_r:最右列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ

H_m:中央列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ（中央列がない場合は、中央に最も近い左右二つの列を選択し、平均を中央列とする）

横方向デイストーション（％)

=((L_m—（L_u+L_b) 2)ノ LJ X100 式（3)

L_m:中央段の最左スポット左端から最ぉスポット右端までの長さ（中央段がない場合は、中央に最も近い上下 2つの段を選択し、平均を中央段とする）

得られた画像の左上端スポットと、左下端スポットと、右上端スポットの 3箇所を指定して、その間は縦および横を 9等分に分割するように、マスク設定した画像を図 6に示す。これにより、 10X 10の 100点スポッ卜におし、ても、わず力、 3点の位置キ旨定で、 100点すベてのマスクが位置ずれ無く指定することができた。これらを総合すると、画像の歪みがほとんど生じない、そのためマスク指定も非常に簡便な 2次元表面プラズモン共鳴装置を実現できた。

さらに画像の鮮明度や分解能を調査した結果を以下に示す。ここでは、図 2に示す 4象現型フォトマスクを用いてパターン化したチップを用いた。つまり右上四半域に上下とも空隙力《200〃 mで 200〃 m四方の貫通孔を、左上四半域に上下とも空隙が 150〃 m で 150 jUm四方の貫通孔を、左下四半域に上下とも空隙が 100 mで 100 im四方の貫通孔を、右下四半域に上下とも空隙が 50 mで 50 j«m四方の貫通子 Lを有するフオトマスクを使用して作製した。このパターン化チップをテスト用チップ 2として以下に用いた。

図 7力《テスト用チップ 2の SPR像である。その左下四半域を拡大したものを図 8に示す。図 8の全域に渡り各スポットが鮮明であることから、 100 m四方のスポットの光量識別が可能である 2次元表面プラズモン共鳴装置を実現できた。 1 0mm四方全体に、上下とも空隙が 1 00 mで 1 00 m四方のスポットを作成した場合は、スポット数が 2500個になり、高密度な 2次元表面プラズモン共鳴装置が実現できたことになる。

こうして得られたパターン化チップを SPRイメージング装置 (東洋紡績製)に装着し、ミリ Q水を流し、 SPR像の観察を行った。何も処理していない画像を図 2に示す。この画像では文字と数字の方向は正しい方向ではない。

なお、コンピュータ演算により、画像を回転し、さらに画像を左右反転した場合の画像を図 6〜1 2に示す。チップ面のパターンがそのまま映し出されている。

チップ面のパターンをそのまま映し出すことにより、 SPRチップの場所の特定が容易となるだけではなぐチップ上のスポットのずれ方向も容易に判断することが可能となる。実施例 2

「（1 )スライドに照射される偏光平行光束」は実施例 1と同様であり、「(2)テス卜用チップ Jとして以下のものを使用してシグナルのばらつきを評価した。

(2)テスト用チップ

1 8mm四方で厚さ 1 mmの Lak1 0スライド（n_D= 1 . 720、松浪硝子工業社製）に 3n mクロムと 45nmの金が蒸着されている金表面に、 1 1—メルカプトゥンデカノールの自己組織化単分子層（SAMs)を形成したスライドをテスト用チップとして用いた。テスト用チップのガラス面にマッチングオイル（カーギル社製 Mシリーズ、 nD = 1 . 720)をつけ、一辺 25mmの 60° 分散プリズム（Oriel社製 461 06)と接触させ、本発明の SPR装置の偏光平行光束を導入した。テスト用チップの SAMs面には水を接触させた。

(3)シグナルのばらつきの測定

金からの反射光束を 830nmの光干渉フィルター (シグマ光機社製 VPF— 25C— 1 0 — 45— 83000)によって 830nm近傍の波長光を取り出し、 CCTVレンズ (モリテックス社製 MTE— 55)により、完全な平行光のみを取り出してから、白黒 CCDカメラ (東京電子工業社製 CS8330B)で撮影した。装置の概要は図 3に示す。この CCDカメラは比較的安価であり、最低被写体照度は 0. 3ルクスである。 SPR測定にて像を検出することが可能であった。

シグナルのばらつきを評価するために、テストチップの SAMs面に水を 1 00 l/min の速度で流し、約 5秒おきに画像を撮影した。撮影を継続したまま、 1 %エタノール水溶液を SAMs表面に導入し、再度水を流した場合の屈折率変化による SPRシグナル変化を観察した。観察は SAMs面のほぼ中心付近 1 0mm四方（= 1 00mm²)の領域に相当する部分 (測定領域）に関して行った。領域を 1 00等分（1 0 X 1 0)し、分割した各分割測定領域の中心に約直径 400 ju mに相当する注目領域を 1 00個作成し、シグナルの変化を計測した。各点における 1 %エタノールによるシグナル変化を図 9に示す。

1 00個の注目領域における水と 1 %エタノールによるシグナルの平均は 1 6. 9、標準偏差は 1 . 26であり、 CVは 7. 5%であった。シグナルばらつきが低減された SPR装置を得ることができた。

比較例 1

従来の方法の 1例として、投光手段および接液手段は実施例と同様の構成で、受光手段のカメラレンズをテレセントリックレンズの代わりに、球面ァロマティック凸レンズ (ダブレット凸レンズ)の単レンズ構成のレンズを使用したときの結果を示す。

前記実施例 1と同様に、テストチップ 1を観察した 2次元表面プラズモン共鳴画像を図 1 0に示す。また、図 1 0における遠近効果による歪み、縦方向ディストーション、横方向デイス! ^一シヨンを以下の表 2に示す。

同様に画面の上部のスポット間隔と画面下部のスポット間隔を比較すると、遠近効果による像の歪みを計算でき、その値は 4. 8<½となり、画面上つまり遠方側が小さくなつてし、る台形上の大きな歪みが生じていることが判る。

さらに実施例 1と同様に、レンズ収差によるディストーション (歪曲）を計算するため、画面縦方向、および画面横方向それぞれについて、端部の間隔の平均と、中心部の間隔を比較すると、縦方向は 1 . 42%、横方向は 0. 76%と、中心部分の変形が ± 1 <½以上になり、大きく歪んでいることが判る。ここで横方向のディストーション計算時には、一旦前記遠近効果による歪み 4. 8%を考慮して、長さ B (中央段の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ）は、 +2. 4%、長さ A (最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ）は + 4. 8%の補正を実施してから計算した。また、得られた画像の左上端スポットと、左下端スポットと、右下端スポットの 3箇所を指定して、その間は縦および横を 9等分に分割するように、マスク設定した画像を図 1 1 に示す。これにより、等間隔による簡易の 3箇所スポット設定では大きくマスクがずれ、実用できないことが判る。

さらに実施例 1と同様に、画像の鮮明度や分解能を調査した結果を以下に示す。図 1 2 がテスト用チップ 2の SPR像である。その左下四半域を拡大したものを図 1 3に示す。図 1 3を見ると周辺において著しくピントずれが発生し、各スポットが変形や重畳して、その大きさでのスポット認識能がないことが判る。また画質も非常に不鮮明であることも判る [比較例 2]

光源には汎用ハロゲンランプ (フィリップス社製 1 3078)を用し、た。このランプは 20W である。このランプを用い、上記実施例の装置のピンホールを直径 300 m (シグマ光機社製 PA— 300)に交換して同様の測定を行った。測定の結果を図 1 4に示す。 1 00 個の注目領域のシグナル平均は" 1 5. 8であり、実施例と同等であつたが、標準偏差は 2. 95であり、 CVは 1 8. 7%と非常に悪い結果であった。さらに測定領域を狭めたが、 CV 値が 1 50/0以下とできる領域を 70mm²以上で確保することはできなかった。

産業上の利用可能性

本発明の効果により、画像歪みが低減され、かつ鮮明な画質で、性能が高い 2次元表面プラズモン共鳴装置を実現した。

また、照度の高ぐ照度のムラがない偏光光束を得ることで、安価でかつ、シグナルのばらつきの少ない SPR装置を実現した。

今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待され、産業界に寄与すること大である。

Claims

請求の範囲

5. チップ上の同時測定可能なサンプル数が 25以上である請求項 1または 2に記載の装置。

6. 請求項 1 ~ 5のいずれかに記載の 2次元表面プラズモン共鳴装置を用いて、チップ上の 25点以上のスポットを同時に測定することを特徴とする測定方法。

7. 表面プラズモン共鳴装置のセンサー表面部分内にアスペクト比 0. 5以上の長方形も IXは正方形の測定領域を取り、該測定領域を均等に縦 1 0個 X横 1 0個の分割測定領域に分け、該分割測定領域の中心に分割領域の短辺の 40%に相当する直径を持つ円形の注目領域を設けた際に、水をベースラインとして、 1 %エタノール水溶液をセンサー表面と接触させて測定した場合、該 1 00個の注目領域から得られるシグナルのばらつき (CV)を 1 5%以下とすることができる測定領域の面積が 25mm²以上であることを特徴とする表面プラズモン共鳴装置。

8. 光源の均一化に用いるピンホールの穴の径が 50 U m以上 300 μ m未満である

9. 正方形フィラメント型ハロゲンランプを用いることを特徴とする請求項 7に記載の