ES2237971T3

ES2237971T3 - Procedimiento de reticulacion de polisacaridos carboxilados.

Info

Publication number: ES2237971T3
Application number: ES99971819T
Authority: ES
Inventors: Rolando Barbucci; Giancarlo Sportoletti
Original assignee: Farmila Thea Farmaceutici SpA
Current assignee: Farmila Thea Farmaceutici SpA
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2019-11-09
Also published as: EP1137670B1; HUP0104075A3; JP2002529549A; CN1325409A; HK1041010A1; PT1137670E; HK1041010B; AU1380300A; DK1137670T3; ZA200103800B; KR20010101002A; BR9915238A; CN1144818C; HU227731B1; IL143064A0; DE69924407D1; KR100685454B1; NZ511308A; WO2000027886A1; NO20012316D0

Abstract

Un procedimiento para la preparación de polisacáridos reticulados que contienen grupos carboxi, que consiste en: a) la activación de los grupos carboxi del polisacárido mediante reacción con grupos de activación carboxi seleccionados entre carbonildiimidazol, carboniltriazol, yoduro de clorometilpiridilio (CMP-J), hidroxibenzotriazol, p -nitrofenol, p-nitrofenoltrifluoroacetato, N-hidroxisuccinimida, en disolvente aprótico anhidro; b) la reacción del polisacárido carboxi-activado con una poliamina; c) hemisuccinilación o sulfatación opcional de los grupos hidroxi libres.

Description

Procedimiento de reticulación de polisacáridos carboxilados.

La presente invención se refiere a un procedimiento de reticulación de polisacáridos carboxilados.

El procedimiento de la invención proporciona un alto grado de reproducibilidad de los productos obtenidos, en términos de grado de reticulación, de homogeneidad de la distribución de las cadenas de reticulación, y las características químico-físicas de los productos y las características tecnológicas de los artículos obtenidos a partir de ellos.

La reproducibilidad es particularmente importante para las aplicaciones en los campos médicos, farmacéuticos y dermo-cosméticos.

La invención se refiere además a los productos obtenibles mediante dicho procedimiento y sus aplicaciones en el campo médico, farmacéutico y dermo-cosmético.

Fundamentos de la invención

El uso de macromoléculas en el campo médico/farmacéutico y, más recientemente, en el campo dermatológico-cosmético, está bien establecido. Las macromoléculas se usan en la preparación de formulaciones farmacéuticas como agentes espesantes, lubricantes, agentes de recubrimiento de películas gastro-resistentes, particularmente en la preparación de cápsulas, geles, coloides y diferentes dispositivos (p.ej., lentes de contacto, gasas, etc.). Igualmente, las macromoléculas se usan en la preparación de formulaciones de liberación controlada de ingredientes activos.

Las revisiones de sus características y usos farmacéuticos están recogidas en:

1) C. Hansch y otros, Editores: Comprehensive Medical Chemistry, Pergamon Press, Oxford, (1990), vol. 1-6;

2) A. Wade y P.J. Wellers Editores: Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Ed. 1994), The Pharmaceutical Press.

Dichas macromoléculas pertenecen a diferentes familias químicas y pueden ser sintéticas, naturales o semi-sintéticas.

Los ejemplos de macromoléculas sintéticas incluyen polivinilpirrolidona, éteres de polioxietilenoalquilo, alcoholes polivinílicos, polimetacrilatos. Los ejemplos de macromoléculas naturales incluyen ácido hialurónico (HY) nativo y celulosa.

Los ejemplos de macromoléculas semi-sintéticas incluyen carboxialquilcelulosa, ampliamente usadas en las industrias alimenticia y de cuidado personal. Estas macromoléculas se caracterizan por una estructura lineal o pobremente ramificada.

Una modificación muy importante para incrementar la resistencia química, enzimática y mecánica está proporcionada por la reticulación, la cual puede llevarse a cabo tanto sobre polímeros sintéticos como naturales (más o menos previamente modificados).

Los ejemplos de polímeros reticulados incluyen polímeros usados para la gastro-protección de comprimidos o cápsulas (polimetacrilatos), así como polímeros usados como emulsificadores, agentes de suspensión, endurecedores de comprimidos (Carbopol), ácidos hialurónicos reticulados, expuestos aquí más adelante.

Para las aplicaciones consideradas, y particularmente para la preparación de dispositivos médicos invasivos que han de administrarse parenteralmente, dichos polímeros deben cumplir un cierto número de requisitos, de tipo técnico y reglamentario.

Los requisitos técnicos incluyen:

1) alta biocompatibilidad;

2) resistencia a sistemas enzimáticos, tanto tisular como plasmáticos (para composiciones inyectables) y gastro-intestinales (para composiciones orales). En algunos casos, puede ser deseable una degradación gradual, por ejemplo para la liberación controlada de un medicamento. Esta resistencia es particularmente importante cuando la macromolécula está presente en composiciones/artículos que deben durar durante un tiempo prolongado, p. ej., substitutos del líquido sinovial, películas, esponjas o geles como antiadhesivos tisulares en diferentes tipos de cirugía; en ingeniería tisular (órganos artificiales); pieles artificiales, en el tratamiento de quemaduras y, de manera general, en cirugía estética;

3) moldeabilidad en formas diferentes (geles, películas, esponjas, etc.);

4) posibilidad de ser esterilizados químicamente o físicamente sin cambios en la estructura del producto.

De acuerdo con los requisitos reglamentarios, la composición de los diferentes lotes de producción debe mantenerse constante dentro de límites muy estrechos; esto implica que los procedimientos de producción estén estandarizados y que los componentes base tengan una variabilidad intrínseca muy baja.

Una causa posible de la falta de homogeneidad de las macromoléculas procede de la dispersión de los pesos moleculares. Dicha falta de homogeneidad llega a ser incluso más alta como una consecuencia de la reticulación. Esto puede ser un serio inconveniente dependiendo del campo de uso y los fines de aplicación del producto final.

El Documento EP-A-566118 (Kimberley-Clark) describe polisacáridos reticulados para usar como super-absorbentes para pañales y artículos semejantes.

El procedimiento descrito en él se basa en la reticulación de celulosa mediante la formación de amidas, ésteres o éteres intermoleculares entre poliaminas, polioles o mezclas de los mismos y el grupo carboxi de los polisacáridos.

La reacción se lleva a cabo calentando a aproximadamente 80ºC la mezcla del polisacárido con el poliol y/o la poliamina. Este procedimiento es indudablemente económico y adecuado para la producción a gran escala en la cual los requisitos de reproducibilidad son menos restrictivos.

La Patente de EE.UU. 5.465.055 describe polisacáridos reticulados (ácido hialurónico y ácido algínico) obtenidos por la esterificación de los COOH del polisacárido y los grupos OH de otras moléculas, sin inserción de ramas de reticulación.

La WO 91/9119 describe microcápsulas para islotes de Langerhans como órganos biohíbridos, que consisten en ácido algínico reticulado con iones bario.

La WO 98/08897 describe copolímeros que consisten en unidades polisacáridas policarboxiladas conectadas al menos a una unidad policarboxílica no sacárida mediante un ligador diamina que forma uniones amida con los grupos carboxílicos respectivos presentes en cada unidad.

La EP 190215 describe la reticulación de diferentes polímeros (almidones carboxilados, dextrano, celulosas) con epóxidos di- o poli-funcionales.

Para ácidos hialurónicos se han propuestos los agentes de reticulación siguientes:

epóxidos polifuncionales descritos en las Patentes de EE.UU. 4.716.224, 4.772.419, 4.716.154;

polialcoholes descritos en la Patente de EE.UU 4.957.744;

divinilsulfona descrita en las Patentes de EE.UU. 4.605.691, 4.636.524;

aldehídos descritos en las Patentes de EE.UU. 4.713.448 y 4.582.865;

carboxamidas descritas en la Patente de EE.UU. 5.356.833;

ácidos policarboxílicos descritos en el Documento EP-A-718312.

Descripción de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de polisacáridos reticulados que contienen grupos carboxi, el cual permite el completo control del grado de reticulación así como una alta reproducibilidad en términos de características constantes del producto final.

El procedimiento de la invención consiste en:

a) la activación de los grupos carboxi del polisacárido mediante reacción con agentes de activación carboxi adecuados en disolvente aprótico anhidro;

b) la reacción del polisacárido carboxi-activado con una poliamina.

Si se desea, el polisacárido reticulado obtenido puede someterse a sulfonación o hemisuccinilación de los grupos hidroxi libres.

Los productos obtenibles mediante el procedimiento de la invención pueden igualmente acomplejarse con iones metálicos tales como iones cinc, cobre o hierro.

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El polisacárido que contiene grupos carboxi, el cual puede usarse de acuerdo con la invención, puede ser de origen natural, sintético o semi-sintético. Los ejemplos de dichos polisacáridos incluyen ácidos hialurónicos (obtenidos a partir de tejidos o bacterias), carboximetildextrano, carboximetilcelulosa, carboximetilalmidón, ácidos algínicos, ácido celulósico, N-carboximetil o butil glucanos o quitosanos; heparinas con diferentes pesos moleculares, opcionalmente desulfatadas y succiniladas, sulfatos de dermatan, sulfatos de condroitina, sulfatos de heparan, ácidos
poliacrílicos.

Los ácidos hialurónicos, carboximetilcelulosa, heparinas, ácidos algínicos y ácidos poliacrílicos son los particularmente preferidos.

Dichos polímeros reticulados, obtenidos por diferentes procedimientos, son conocidos y han sido propuestos para diversos usos (véanse, por ejemplo, EP 566118, WO 91/9119, Patente de EE.UU. 5.465.055, EP 190215, EP 718312, Patente de EE.UU. 4.716.224, expuestas anteriormente).

Los agentes de activación carboxi son usualmente los usados en la química de péptidos; los ejemplos de agentes adecuados incluyen carbonildiimidazol, carboniltriazol, yoduro de clorometilpiridilio (CMP-J), hidroxibenzotriazol, p-nitrofenol, p-nitrofeniltrifluoroacetato, N-hidroxisuccinimida y similares. El uso de yoduro de clorometilpiridilio es el particularmente preferido.

Las poliaminas tienen preferiblemente la fórmula general siguiente:

R_{1}-NH-A-NH-R_{2}

en la que R_{1} y R_{2}, los cuales son el mismo o diferentes, son hidrógeno, grupos alquilo de C_{1}-C_{6}, fenilo o bencilo, A es una cadena alquileno de C_{2}-C_{10}, preferiblemente una cadena alquileno de C_{2}-C_{6}, opcionalmente substituida por grupos hidroxi, carboxi, halógeno, alcoxi, amino; una cadena polioxialquileno de fórmula:

[(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{n}]_{m}

en la que n es 2 ó 3 y m es un número entero de desde 2 hasta 10; un grupo cicloalquilo de C_{5}-C_{7}; un grupo arilo o heteroarilo, preferiblemente benceno 1,3 ó 1,4-disubstituido. A es, preferiblemente, una cadena alquileno lineal de C_{2}-C_{6} o una cadena de fórmula:

[(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{n}]_{m}.

La reacción de reticulación se lleva a cabo, preferiblemente, en un disolvente seleccionado entre tetrahidrofurano, dimetilformamida o sulfóxido de dimetilo, y el polisacárido, preferiblemente, se salinifica con un catión lipofílico, por ejemplo tetraalquilamonio u otras bases orgánicas lipofílicas.

La transformación de sales inorgánicas, tales como sales de sodio, en sales lipofílicas orgánicas adecuadas puede llevarse a cabo mediante procedimientos de intercambio de iones conocidos en fase homogénea o mediante precipitación del componente ácido, seguido de recuperación de este último y salinificación con la base orgánica adecuada.

La reacción de activación de los grupos carboxi se lleva a cabo en fase homogénea y en disolvente aprótico polar anhidro.

La poliamina diluida en el mismo disolvente anhidro, se agrega a la solución del éster activado, manteniéndose la temperatura desde 0ºC hasta 30ºC. Los tiempos de reacción de reticulación varían desde 1 hasta 22 horas, dependiendo, igualmente, de la presencia opcional de substancias básicas adecuadas (p. ej., trietilamina).

Generalmente, el producto final se recupera mediante precipitación de la sal orgánica agregando un disolvente diferente al disolvente de la reacción o mediante evaporación de éste último, seguido de centrifugación, lavado con agua destilada, dispersiones repetidas en las soluciones del álcali deseado (por ejemplo, sodio, potasio), posterior lavado con agua y secado final de la sal alcalina bajo vacío o mediannte liofilización.

El grado de reticulación (C.L.D) puede variar dentro de amplios límites y puede ajustarse cambiando la cantidad de los agentes de activación carboxi, puesto que la activación y la reacción de reticulación son substancialmente cuantitativas.

Los polisacáridos reticulados obtenidos de acuerdo con la invención, pueden someterse a una reacción de sulfatación de los grupos hidroxi posiblemente presentes, usualmente mediante reacción con el complejo piridina-trióxido de azufre en dimetilformamida.

La reacción se lleva a cabo en fase heterogénea a una temperatura de 0-10ºC durante tiempos que varían desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 6 horas.

El grado de sulfatación obtenido está comprendido dentro de amplios límites con respecto al total de los grupos hidroxi y puede ajustarse cambiando la temperatura y los tiempos de reacción. Generalmente, el grado de sulfatación (definido como equivalentes de grupos sulfato/g) puede variar desde 1x10^{-6} hasta 6x10^{-6}, preferiblemente es de 2x10^{-6} eq/g para un grado de reticulación de 0,5.

Los polímeros reticulados obtenidos de acuerdo con la invención, opcionalmente sulfatados, son capaces de acomplejar iones metálicos tales como iones cinc, cobre o hierro.

Dichos complejos pueden obtenerse disolviendo o dispersando hasta completo hinchamiento el producto en agua y agregando bajo agitación, preferiblemente a temperatura ambiente, una solución concentrada de una sal metálica orgánica o inorgánica, p. ej., CuCl_{2}, ZnCl_{2}, Fe_{2}(SO)_{4}; después de agitación durante 12-24 horas, el complejo se recupera por centrifugación o por precipitación, seguido de la adición de un disolvente diferente (por ejemplo, etanol o acetona) o evaporación bajo vacío; el producto bruto recuperado se lava intensamente con agua destilada con el fin de eliminar los iones en exceso. A continuación, el complejo se liofiliza. El contenido de iones metálicos varía dependiendo de las condiciones operativas usadas, particularmente las relaciones molares de polímero a ión; la concentración y pH de las soluciones; los tiempos de reacción y, particularmente, el grado de reticulación.

El procedimiento de la invención, mediante el adecuado ajuste del grado de reticulación y/o sulfatación, permite la preparación de polisacáridos carboxilados reticulados en una amplia variedad de formas, caracterizados por diferentes propiedades tales como viscoelasticidad, grado de hidratación, capacidad de acomplejamiento frente a iones metálicos, capacidad de formar hidrogeles, moldeabilidad en forma de películas o esponjas, resistencia mecánica de los materiales finales.

Esto permite su uso en muchos campos médicos, en el campo humano y en el veterinario, y en dermo-cosmetología.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1 Gel de carboximetilcelulosa reticulado al 100% con 1,3-diaminopropano

Se disolvieron 1,2x10^{-3} moles, con respecto a la unidad disacárida de sal TBA de carboximetilcelulosa, en 20 ml de DMF bajo N_{2} y con agitación. Se agregaron a la solución gota a gota, mantenida a una temperatura de 0ºC con hielo, 0,32 g de yoduro de clorometilpiridilio (1,2x10^{-3} moles) disueltos en 2 ml de DMF.

La relación molar fue de 1 a 1 ya que la carboximetilcelulosa tiene un grupo funcional carboxílico por unidad disacárida. Después 20 minutos, se agregaron a la solución 2 ml de 1,3-diaminopropano reticulante (0,006 moles), e inmediatamente después se agregó igualmente 0,5 ml de trietilamina. Se formó un producto de tipo jalea, sólido, el cual se lavó con DMF y, a continuación, se dejó en H_{2}O para completar el hinchamiento.

A continuación, se llevaron a cabo lavados alternativos con EtOH y H_{2}O. Después del último lavado con EtOH, el producto se criodesecó.

- IR (película; cm^{-1}): 1650 (-CO-NH-); sin plegamiento -COO^{-} a 1.400 aproximadamente;

- SD (Grado de Hinchamiento, en agua a temp. amb., después de 15 min; determinación gravimétrica; calculada de acuerdo con:

SD = \frac{W_{s} - W_{d}}{W_{d}} x 100,

en donde

W_{s}= peso de gel hidratado; W_{d}= peso del gel seco): 7.000;

- SEM (Microscopía electrónica de escaneado): la estructura parece compacta, con poros de 15-35 \mu.

- La superficie del producto, mediante exposición a PRP (plasma rico en plaquetas) de conejo, muestra una presencia muy reducida de plaquetas o agregados en comparación con el producto equivalente obtenido mediante polipropileno de baja densidad (Referencia estándar EC).

Ejemplo 2 Gel de carboximetilcelulosa reticulado al 50% con 1,3-diaminopropano

Se disolvieron 1,2x10^{-3} moles, con respecto a la unidad disacárida de carboximetilcelulosa, en 30 ml de DMF bajo N_{2} y con agitación. Se agregaron a la solución gota a gota, mantenida a una temperatura de 0ºC con hielo, 0,24 g de yoduro de clorometilpiridilio (1,2x10^{-3} moles) disueltos en 2 ml de DMF. La relación molar fue de 1/2.

Después 20 minutos, se agregaron a la solución 2 ml de 1,3-diaminopropano reticulante (3x10^{-3} moles), e inmediatamente después se agregó igualmente 0,5 ml de trietilamina. Se formó un producto de tipo jalea, sólido, el cual se lavó con DMF y, a continuación, se dejó en H_{2}O para completar el hinchamiento.

- SD: 8.000;

- SEM: presencia de poros de 15-35 \mu.

- Adhesión de plaquetas: tal como se ha informado en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Gel de ácido algínico reticulado al 50% (100% con referencia a las unidades disacáridas) con 1,3-diaminopropano

La sal TBA de ácido algínico se preparó a partir de la sal sódica mediante intercambio iónico sobre resina catiónica fuerte (Dovex) en forma H^{+} (es decir, en forma ácida), seguido de neutralización con hidróxido de tetrabutilamonio (TBA-OH) y liofilización final.

Se disolvieron 1,2x10^{-3} moles, con respecto a la unidad mosacárida, en 30 ml de DMF bajo N_{2} y con agitación. Se agregaron a la solución gota a gota, mantenida a una temperatura de 0ºC con hielo, 0,36 g de yoduro de clorometilpiridilio (1,2x10^{-3} moles) disueltos en 2 ml de DMF. La relación molar fue de 1/1.

Después 20 minutos, se agregaron a la solución 6x10^{-3} moles de 1,3-diaminopropano reticulante (0,024 moles), e inmediatamente después se agregó igualmente 0,5 ml de trietilamina. Se formó un producto de tipo jalea, sólido, el cual se lavó con DMF y, a continuación, se dejó en H_{2}O para completar el hinchamiento.

- IR (película; cm^{-1}): 1635 (ancha) (-CO-NH-); 1.400, aproximadamente (-COO^{-});

- SD: 5.000;

- SEM: la estructura parece compacta y sin poros.

Ejemplo 4 Preparación de ácido hialurónico reticulado con C.L.D.= 0,05 (5% de grupos carboxi disponibles). Agente reticulante 1,3-diaminopropano

La sal sódica del ácido hialurónico (1x10^{-3} mol, con respecto a la unidad disacárida) se transformó en la sal TBA, de acuerdo con uno de los procedimientos siguientes:

a) La solución acuosa al 1% de hialuronato sódico se transformó en la forma H^{+} mediante resina fuerte catiónica (Amberlite IR 129); la solución final se trató con una solución al 0,5% de TBA-OH hasta aproximadamente pH 9.

b) La solución acuosa al 1% de hialuronato sódico se transformó en la forma de sal TBA mediante tratamiento con una resina débil catiónica en forma TBA^{+} (Amberlite IRD 50).

En ambos casos, las soluciones finales se liofilizaron. A continuación, la sal TBA se disolvió en 15 ml de DMF anhidro, bajo N_{2}, y a -0ºC. Se agregaron gota a gota a la solución almacenada de sal TBA 0,02 g de yoduro de clorometilpiridilio (CMPJ) en 2 ml de DMF.

A continuación, a la mezcla de reacción se agregó 0,1 ml de trietilamina y, a continuación, gota a gota, una solución de 1,3-diaminopropano (d= 0,88, en gran exceso, con el fin de obtener la reticulación más fácilmente de los grupos carboxi activados) en 2 ml de DMF anhidro. Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se agitó durante al menos 30 minutos y, a continuación, se eliminó el disolvente bajo presión reducida, el residuo se recogió en DMF, el cual posteriormente se eliminó por destilación; a continuación, el residuo se trató con etanol, etanol-agua y, finalmente, con agua.

A continuación, el producto se liofilizó y el residuo se sometió a análisis.

- IR (película; cm^{-1}): 1630 (-CO-NH-); 1740 (-COOH, polisacárido); 3.200 (-NH-);

- SD (Grado de Hinchamiento, en agua y temp. amb., después de 15 min; determinación gravimétrica; calculada de acuerdo con:

SD = \frac{W_{s} - W_{d}}{W_{d}} x 100,

en donde

W_{s}= peso de gel hidratado; W_{d}= peso del gel seco): 31.000;

- Grado de reticulación: 0,05 (5% de los grupos carboxi inicialmente disponibles).

Ejemplo 5 Preparación de ácido hialurónico reticulado con C.L.D.= 0,05 (5% de grupos carboxi disponibles). Agente reticulante 1,6-diaminohexano. Activador yoduro de clorometilpiridilio

De acuerdo con el procedimiento y las condiciones indicadas en el Ejemplo 4, usando el mismo ácido hialurónico (HY) y el mismo activador, pero 1,6-diaminohexano en lugar de 1,3-diaminopropano, se obtuvo el derivado reticulado.

- IR (película; cm^{-1}): 1630 (-CO-NH-); 1740 (-COOH, polisacárido); 3.200 (-NH-).

Ejemplo 6 Preparación de ácido hialurónico reticulado con C.L.D.= 0,05 (5% de grupos carboxi disponibles). Agente reticulante O,O'-bis-(2-aminopropil)PEG500. Activador yoduro de clorometilpiridilio

De acuerdo con el procedimiento y las condiciones indicadas en el Ejemplo 4, usando el mismo ácido hialurónico y el mismo activador, pero O,O'-bis-(2-aminopropil)PEG500 en lugar de 1,3-diaminopropano, se obtuvo el derivado reticulado.

- SD: 31.000.

Ejemplo 7 Preparación de ácido hialurónico reticulado con C.L.D.= 0,3 (30% de grupos carboxi disponibles). Agente reticulante 1,3-diaminopropano. Activador yoduro de clorometilpiridilio

Se disolvieron 0,6 g de sal tributilamonio de ácido hialurónico (1x10^{-3} mol, con respecto a la unidad disacárida), bajo agitación, en 30 ml de DMF bajo nitrógeno. Se agregaron gota a gota a la solución agitada, mantenida a 0ºC, 0,08 g de yoduro de clorometilpiridilio (3,5x10^{-4} moles) en 2 ml de DMF. La relación molar fue, de acuerdo con ello, de 3/1.

Después 20 minutos, se agregaron 2 ml de 1,3-diaminopropano (0,024 moles), seguido inmediatamente de 0,5 ml de trietilamina. Se obtuvo un producto gelatinoso, sólido; a continuación, el producto se hinchó con agua y se lavó nuevamente con etanol.

El producto final, después de liofilización, muestra al microscopio de escaneado un patrón irregular con zonas lisas alternadas con zonas esponjosas.

El grado de reticulación fue de 0,3 (30% de los grupos carboxi inicialmente disponibles).

- IR (película; cm^{-1}): 1740 (-COOH); 1630 (-CO-NH-); 1610 (-COO^{-}); 1560 (-CO-NH-).

Ejemplo 8 Preparación de ácido hialurónico reticulado con C.L.D.= 0,5 (50% de grupos carboxi disponibles). Agente reticulante 1,3-diaminopropano. Activador yoduro de clorometilpiridilio

Se disolvieron 0,6 g de sal tributilamonio de ácido hialurónico (HY.TBA) (1x10^{-3} mol, con respecto a la unidad disacárida), bajo agitación, en 30 ml de DMF bajo nitrógeno. Se agregaron gota a gota a la solución, mantenida a 0ºC, 0,15 g de yoduro de clorometilpiridilio (CMPJ) (6x10^{-6} moles) en 2 ml de DMF. La relación molar fue de HY.TBA:CMPJ, 2/1. Después de 20 minutos, se agregaron a la solución 2 ml de 1,3-diaminopropano (0,024 moles).

A continuación, se agregaron 0,5 ml de trietilamina.

Se obtuvo un producto de tipo gelatina, sólido, el cual se lavó intensamente con DMF.

Después de evaporación de la DMF, el producto se hinchó en agua y se lavó con etanol antes de liofilización.

El producto obtenido tenía un grado de reticulación de 0,5 y mostraba al microscopio de escaneado un aspecto granuloso espaciado con grandes mallas. Observado a mayores magnitudes, las dos morfologías parecen idénticas y muestran protusiones de forma redondeada de unos pocos micrones de diámetro.

Los geles se sometieron a hinchamiento en PBS y se valoró la capacidad de hinchamiento máxima.

- SD: 23.500.

- NMR = (13 C; ppm): 29,3 y 39,8 (-CH_{2}-C_{\cdot }H_{2}-C_{\cdot }H_{2}- enlace propanodiamina); 172,5 (-C^{\cdot }O-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-).

Las propiedades reológicas evaluadas sobre un reómetro Bohlin VOR, a la temperatura de 23\pm0,1ºC, muestran que el módulo elástico dinámico G' (100 Pa a 10Hz) idéntico a las dos concentraciones consideradas (10 y 20 mg/ml) es siempre mayor que el módulo viscoso dinámico (G'' 40 Pa para 20 mg a 10Hz y 20 Pa para 10 mg a 10Hz).

Ejemplos 9-12

De acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores, los derivados de ácido hialurónico reticulados que tienen las características resumidas en la Tabla 1 siguiente, se obtuvieron partiendo de 1x10^{-3} mol (0,6 g) de sal tributilamonio de ácido hialurónico.

Los derivados obtenidos tenían las propiedades siguientes:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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Ejemplo 13 Sulfatación de ácido hialurónico (HY) reticulado al 50%

El derivado obtenido en el Ejemplo 8 se dispersó en 5 ml de DMF bajo fuerte agitación y atmósfera de nitrógeno.

Se agregó, a 0ºC, una solución de 1 g de SO_{3}/piridina en un mol de DMF y se agitó durante 3 horas. La reacción se bloqueó mediante la adición de un exceso de H_{2}O (50 ml) y el pH se ajustó a 9 con NaOH 0,1 M.

El producto se lavó intensamente con etanol y H_{2}O y, a continuación, se liofilizó.

El espectro de IR muestra, además de las bandas del producto de partida, un pico a 1260 cm^{-1} y una banda más fuerte a 1025 cm^{-1}.

El gel se hinchó en PBS con una SD = 33.000. El espectro de ^{13}C NMR de alta resolución muestra las señales en H_{2}O a 37ºC indicadas en la Tabla 2. La intensidad de las señales de NMR a 29,3 y 38,8 pp (-CH_{2}-) y la señal a 172,5 ppm (CONH) confirman un grado de reticulación de aproximadamente el 50%.

Las propiedades reológicas se caracterizan por módulos elásticos dinámicos G' (2500 Pa con 20 mg y 1000 Pa con 10 mg a 10Hz) que son siempre mayores que los módulos viscosos dinámicos G'' (600 Pa con 20 mg y 150 Pa con 10 mg a 10Hz) y mucho mayores que los valores correspondientes obtenidos con ácido hialurónico (HY) no sulfatado (13 al 50%, Ejemplo 5). Este compuesto tiene un tiempo de trombina (TT) mayor (61\pm5 seg.) que el del control (14,0 seg.) y que el correspondiente no reticulado (14,6 seg.).

El compuesto se mostró igualmente activo en el ensayo PRP usando conejo estresado.

TABLA 2 Tabla: desplazamiento químico con ^{13}C

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2

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Ejemplo 14 Sulfatación de gel de ácido algínico

El producto reticulado después de tratamiento con EtOH se criodesecó con el fin de eliminar completamente la humedad y someter a sulfatación los grupos alcohol.

Cien mg de producto reticulado dispersado en 5 ml de DMF se agregaron a una solución de SO_{3}/piridina (800 mg en 2 ml de DMF). La reacción suele llevarse a cabo a 0ºC, bajo nitrógeno con agitación constante durante 2 horas.

Es obligatorio que el producto no absorba humedad, puesto que esta inhibe la reacción.

Después de 2 horas, se agregó H_{2}O y el pH se ajustó a 9 mediante una solución 1 M de NaOH, liberándole, de esta forma de piridina.

El producto así sulfatado se purificó en EtOH.

El análisis de los productos purificados muestra:

- IR (película; cm^{-1}) 1263 (estiramiento SO);

- Equivalentes de grupos SO_{3}/g de gel (mediante complejos de toluidina):

gel reticulado al 5%:	6x10^{-5}
gel reticulado al 50%:	2x10^{-5}
gel reticulado al 100%:	3x10^{-5}

- SD:

gel reticulado al 5%:	19x10^{3}
gel reticulado al 50%:	9x10^{-3}
gel reticulado al 100%:	7x10^{-3}

Ejemplo 15

Usando la misma metodología, se sintetizaron los derivados sulfatados de productos reticulados al 50% de acuerdo con los Ejemplos 10, 11 y 12.

Las características colorimétricas de los productos sulfatados se reproducen en la Tabla 3, conjuntamente con las de los productos derivados de los Ejemplos 8 y 13.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

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Ejemplo 16 Sulfatación de gel de carboximetilcelulosa (CMC)

Siguiendo el procedimiento y condiciones indicados en el Ejemplo 14, se obtuvo el derivado sulfatado:

- Equivalentes de grupos SO_{3}/g:

a)	CMC reticulada al 5%:	8x10^{-6}
b)	CMC reticulada al 50%:	7x10^{-6}
c)	CMC reticulada al 100%:	4x10^{-6}

- SD:

a):	20x10^{3}
b):	12x10^{-3}
c):	9x10^{-3}.

Claims

1. Un procedimiento para la preparación de polisacáridos reticulados que contienen grupos carboxi, que consiste en:

a) la activación de los grupos carboxi del polisacárido mediante reacción con grupos de activación carboxi seleccionados entre carbonildiimidazol, carboniltriazol, yoduro de clorometilpiridilio (CMP-J), hidroxibenzotriazol, p-nitrofenol, p-nitrofenoltrifluoroacetato, N-hidroxisuccinimida, en disolvente aprótico anhidro;

b) la reacción del polisacárido carboxi-activado con una poliamina;

c) hemisuccinilación o sulfatación opcional de los grupos hidroxi libres.

2. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que elpolisacárido está seleccionado entre ácidos hialurónicos (obtenidos a partir de tejidos o bacterias), carboximetildextrano, carboximetilcelulosa, carboximetilalmidón, ácidos algínicos, ácido celulósico, N-carboximetil o butil glucanos o quitosanos; heparinas con diferentes pesos moleculares, opcionalmente desulfatadas y succiniladas, sulfatos de dermatan, sulfatos de condroitina, sulfatos de heparan.

3. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2, en el que las poliaminas tienen la fórmula general siguiente:

R_{1}-NH-A-NH-R_{2}

[(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{n}]_{m}

en la que n es 2 ó 3 y m es un número entero de desde 2 hasta 10; un grupo cicloalquilo de C_{5}-C_{7}; un grupo arilo o heteroarilo, preferiblemente benceno 1,3- o 1,4-disubstituido.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones1 a 3, en el que el polisacárido se salinifica con cationes lipofílicos.

5. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que el catión lipofílico es tributil o tetraalquil amonio.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en el que la reacción de reticulación se lleva a cabo en dimetilformamida o tetrahidrofurano anhidro.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en el que el polisacárido reticulado obtenido se somete adicionalmente a sulfatación de los grupos hidroxi mediante reacción con el complejo piridina/trióxido de azufre.

8. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que la reacción de sulfatación se lleva a cabo en dimetilformamida en fase heterogénea a 0-10ºC, durante tiempos que varían desde aproximadamente 0,5 horas hasta aproximadamente 6 horas.

9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que el polisacárido reticulado, opcionalmente sulfatado, se somete adicionalmente a una reacción de acomplejamiento con soluciones acuosas de iones de cobre, cinc o hierro.

10. Polisacáridos reticulados obtenidos mediante el procedimiento de las Reivindicaciones 1 a 9.