ES2854712T3 - Método para la producción de hidrogeles a base de quitosano y polielectrolitos cargados negativamente y material poroso alveolar obtenido a partir de dicho hidrogel - Google Patents

Método para la producción de hidrogeles a base de quitosano y polielectrolitos cargados negativamente y material poroso alveolar obtenido a partir de dicho hidrogel Download PDF

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Abstract

Un método de fabricación de un hidrogel, caracterizado por que comprende las siguientes etapas en sucesión: - una primera etapa (i) que consiste en proporcionar al menos un polvo de un polímero aniónico (A) y al menos un polvo de quitosano (B) que comprende funciones amina (-NH2); - una segunda etapa (ii) que consiste en mezclar en seco al menos los polvos (A) y (B) de la primera etapa para formar una mezcla de polvos; - una tercera etapa (iii) que consiste en suspender la mezcla de polvos obtenida a partir de la segunda etapa en un medio acuoso con un pH que pueda permitir la disolución del polímero aniónico (A) sin disolver el quitosano (B) - una cuarta etapa (iv) de adición de un ácido a la suspensión obtenida en la tercera etapa para formar el hidrogel; o las etapas tercera (iii) y cuarta (iv) se sustituyen por una quinta etapa de mezcla (v), que comprende mezclar un medio acuoso acidificado que incluye al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C), con dicha mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B) obtenidos de la segunda etapa (ii).

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la producción de hidrogeles a base de quitosano y polielectrolitos cargados negativamente y material poroso alveolar obtenido a partir de dicho hidrogel
Sector de la técnica
La presente invención se refiere al campo técnico de los métodos de fabricación de hidrogeles, en particular de hidrogeles implantables, así como al campo técnico de los métodos de fabricación de materiales alveolares obtenidos mediante dichos hidrogeles, en particular en lo que se refiere al campo técnico de los métodos de fabricación de hidrogeles físicos.
La presente invención también se refiere al campo técnico de los hidrogeles, los materiales alveolares (en particular las esponjas) derivados de dichos hidrogeles, y los dispositivos médicos que comprenden dichos hidrogeles o materiales alveolares.
Estado de la técnica
Los hidrogeles o geles macromoleculares compuestos mayoritariamente por agua, son matrices poliméricas hinchadas por una gran cantidad de agua. Las macromoléculas están interconectadas, formando una red que constituye un andamio que le confiere al gel las propiedades de un material con propiedades viscoelásticas.
Los enlaces entre cadenas de polímeros pueden ser de dos formas: permanentes o reversibles. Cuando son permanentes, se observa la presencia de enlaces covalentes, se habla entonces de hidrogeles químicos. Cuando los enlaces entre cadenas son reversibles, las macromoléculas interactúan a través de enlaces no covalentes de tipo hidrógeno, iónico o hidrófobo, dipolo-dipolo hablamos entonces de hidrogeles físicos.
Los hidrogeles pueden utilizarse como biomateriales, es decir, como dispositivos médicos, especialmente implantables. Dichos hidrogeles pueden comprender una red polimérica basada en polisacáridos naturales (por ejemplo, almidón, celulosa, carragenanos, alginatos, etc.), proteínas (gelatina), o a base de polímeros sintéticos como poliacrilamidas, poliacrilatos ("carbómeros"), formando redes macromoleculares tridimensionales entrelazadas y estabilizadas por enlaces covalentes (geles químicos irreversibles o permanentes) o por enlaces de hidrógeno, hidrófobos, dipolares (dipolo-dipolo) o electrostáticos (geles físicos reversibles).
El quitosano (CHT), perteneciente a la familia de los polisacáridos disponibles en la naturaleza, es el único polímero catiónico de origen natural conocido hasta la fecha (polielectrolito con carga positiva, denominado PE+), se produce por desacetilación de la quitina, o se extrae directamente de los hongos. El quitosano es un copolímero compuesto por la distribución aleatoria de D-glucosamina unida en p-1,4 y N-acetil-D-glucosamina. Un quitosano se caracteriza por su grado de desacetilación, que representa el porcentaje de unidades de repetición de glucosamina en su cadena macromolecular.
La quitina es el componente del exoesqueleto de los artrópodos (crustáceos) o del endoesqueleto de los cefalópodos. El quitosano se caracteriza por su alto contenido en funciones amina (del orden de 5 milimoles (mmol) por gramo, dependiendo de su grado de desacetilación (normalmente entre el 60 % y el 90 %). El CHT se utiliza ampliamente en aplicaciones biomédicas por su biocompatibilidad, biorreabsorción, hemocompatibilidad, propiedades cicatrizantes y por su acción contra el desarrollo de cepas bacterianas.
El quitosano es un polímero disponible en forma de polvo o de copos de diferente tamaño de partícula. Es el único aminopolímero natural que se presenta en forma de polvo, insoluble en agua pura, pero soluble al acidificar el agua con al menos un 1 % (vol/vol) de ácido acético concentrado. Existen otras poliaminas con funciones amina primaria (-NH2), como la polivinilamina, la polialilamina y la polietilenimina, pero solo están disponibles en forma de soluciones acuosas concentradas, o sólidas en forma de goma (ya que son muy higroscópicas) y no constituyen polvos que presenten fluidez o flujo libre.
La reticulación iónica del CHT para obtener un hidrogel es un método suave y sencillo, ya que se produce de forma espontánea, sin calentamiento ni catalizador. Los agentes reticulantes aniónicos se utilizan con sulfatos, citratos, fosfatos o polifosfatos, polioxianiones o sales de calcio. El método consiste en sumergir el "objeto" de CHT (película, monolito, etc.) en una solución acuosa que contiene el agente reticulante, que se difunde en el interior del "objeto" junto con el agua que hace que se hinche y forme un gel. Alternativamente, el agente reticulante se añade a la solución acuosa de quitosano previamente disuelta en una solución diluida de ácido acético (a menudo al menos al 0,5 % de ácido acético, por ejemplo), o a la inversa, la solución de CHT se añade gota a gota a la solución de agente reticulante, utilizando una jeringa, por ejemplo (J. Berger et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57 (2004) 19-34).
Las ciclodextrinas, también pertenecientes a la familia de los polisacáridos, son moléculas en forma de jaula capaces de formar complejos de inclusión reversibles con numerosos principios activos, especialmente lipófilos. Las ciclodextrinas son polisacáridos cíclicos resultantes de una degradación enzimática del almidón. Están formadas por una cadena de seis a ocho unidades de gluco-piranosa, unidas entre sí por enlaces a-(1,4) formando un macrociclo cuya periferia es rica en funciones hidroxilo que proporcionan solubilidad en el agua, mientras que el interior forma una cavidad apolar e hidrófoba que confiere a las ciclodextrinas propiedades de complejación con principios activos lipófilos formando complejos de inclusión. Se conocen geles químicos (no reversibles) a base de ciclodextrinas que se obtienen mediante la reticulación de una ciclodextrina con epiclorhidrina, un diepóxido, un diisocianato, dianhídrido piromelítico, trimetafosfato de sodio o EDTA utilizados como agentes de reticulación. Estos polímeros de ciclodextrina reticulados o "hiperramificados" forman geles macroscópicos insolubles o nanogeles solubles que presentan propiedades de atrapamiento y vectorización de moléculas orgánicas, incluidos los agentes terapéuticos (Progress in Polymer Science, Volumen 38, Número 2, febrero de 2013, Páginas 344-368, Advanced Drug Delivery Review 65 (2013) 1188-1203; Belstein Journal of Organic Chemistry, 2014, 10, 2586-2593).
Se han publicado trabajos anteriores que combinan ciclodextrina y quitosano. Sin embargo, en este trabajo no se obtuvo un gel físico macroscópico a partir de la mezcla de un polímero de ciclodextrina y quitosano. Por ejemplo, Auzely (C.R. Chimie 14 (2011) 167-177) realizó un injerto covalente de ciclodextrina (CD) en quitosano (= c Ht -Cd ) por un lado, y el injerto de adamantano (ada) en quitosano (= CHT-ada) por otro. Estos dos polímeros una vez mezclados en solución forman un gel macroscópico supramolecular por la formación de una red formada por estos dos tipos de polímeros, causada por la formación espontánea de complejos de inclusión entre las ciclodextrinas y el adamantano, formando un hidrogel estabilizado por interacciones de tipo supramolecular entre las redes interpenetrantes de CHT-ada y CHT-CD. Además, la gran estabilidad del complejo CD-ada no permite en las mezclas la inclusión de una tercera molécula, como un agente terapéutico, en las cavidades de ciclodextrina si la estequiometría (o relación molar) CD/ada es inferior a 1, quedando todas las cavidades complejadas irreversiblemente por un grupo adamantano.
La mayoría de los geles comercializados como dispositivos médicos están listos para su uso, es decir, ya hidratados, y contienen una carga mineral, por ejemplo fosfato de calcio o beta-trifosfato de calcio, o una molécula terapéuticamente activa. Algunos ejemplos son In'oss™, que es un gel inyectable a base de HPMC (hidroxipropilmetilcelulosa) que contiene hidroxiapatita para el relleno óseo; Periochip® o Atridox®, a base de gelatina y polímero PLA (ácido poliláctico), respectivamente, que contienen un principio activo para su aplicación en periodoncia. También existen geles para rellenar arrugas a base de ácido hialurónico o colágeno, o recubrimientos de gel sobre un panel textil a base de CMC (carboximetilcelulosa), opcionalmente cargados con un principio activo, utilizados para la fabricación de apósitos cuya función es mantener la hidratación de la herida o liberar un principio activo. La empresa Biom'Up comercializa un material de relleno óseo (Matribone®) en forma de esponja a base de colágeno que incluye una carga de polvo de beta-trifosfato de calcio.
También existen hidrogeles físicos formados por un complejo iónico resultante de las interacciones entre un polielectrolito negativo y un polielectrolito positivo. La publicación del "International Journal of Biological Macromolecules" titulada "Recent development of chitosan-based polyelectrolyte complexes with natural polysaccharides for drug delivery" cuyos autores son Yangchao Luo y Qin Wang, 64 (2014) 353-367, enumera los distintos trabajos que se han realizado con quitosano en los últimos diez años para formar dichos complejos iónicos. Los polianiones mezclados con el quitosano son el ácido hialurónico (AH), la pectina, el carragenano, la goma xantana, la goma gelana, la goma de anacardo, la goma arábiga, la carboximetilcelulosa, el glucomanano y la goma de kondagogu.
Los hidrogeles formados a partir de estos complejos de polielectrolitos también adquieren su forma de hidrogel a través de interacciones físicas de menor energía, como la asociación dipolo-dipolo, los enlaces de Van der Waals y los hidrógenos. En comparación con los hidrogeles obtenidos por reticulación química, los hidrogeles formados a partir de complejos iónicos tienen la ventaja de que no son tóxicos, son bien tolerados por los organismos vivos y son biocompatibles. De hecho, los reticulantes químicos pueden inducir cierta toxicidad por los grupos funcionales reactivos que soportan. Por lo tanto, para eliminar sus rastros en el gel, son necesarias etapas de purificación para geles implantables o para uso médico en general, mediante el lavado en agua o en disolventes para los hidrogeles químicamente reticulados. Sin embargo, estas etapas pueden degradar la estructura de estos hidrogeles. Además, cuando estos hidrogeles reticulados químicamente contienen un principio activo, estas etapas de purificación de los hidrogeles formados pueden provocar la pérdida del principio activo por difusión en el medio que se ha utilizado para extraer los restos de agente reticulante.
Los geles físicos (reversibles) pueden ser destruidos por un aumento de la temperatura, un aumento de la fuerza iónica, un cambio en la polaridad del disolvente o un cambio en el pH, mientras que los geles químicos se estabilizan permanentemente mediante enlaces covalentes.
La publicación titulada "Chitosan/cyclodextrin nanoparticles as macromolecular drug delivery system", de A.H. Krauland y M.J. Alonso, International Journal of Pharmaceutics 340 (2007) 134-142 describe la síntesis de nanopartículas presentadas como nanogeles a base de quitosano y un monómero de p-ciclodextrina carboximetilada que permite la liberación lenta de moléculas encapsuladas. En este caso se obtuvieron nanogeles, no geles en estado macroscópico. Un nanogel puede definirse como un "objeto" globular altamente hidratado, a menudo de entre 20 y varios cientos de nm de tamaño.
La publicación "Chemically cross-linked and grafted cyclodextrin hydrogels: from nanostructures to drug-eluting medical devices", de A. Concheiro, C. Álvarez-Lorenzo, Advanced Drug Reviews 65 (2013) 1188-1203, describe la fabricación de hidrogeles de ciclodextrina que se injertan químicamente en macromoléculas preformadas (a menudo de tipo poli(acrílico)), obtenidas por polimerización de monómeros portadores de ciclodextrina, o reticuladas por agentes reticulantes como un diepóxido, un diisocianato, el dianhídrido piromelítico, el trimetafosfato de sodio o el EDTA.
La publicación "Chitosan derivatives bearing cyclodextrin cavities as novel adsorbent matrices", de M. Prabaharan y J.F. Mano, de Carbohydrate Polymers 63 (2006) 153-156 describe la síntesis de macromoléculas de quitosano a las que se injertan ciclodextrinas mediante enlaces amida.
Los agentes activos incorporados en los hidrogeles físicos son moléculas de alto peso molecular (proteínas, péptidos, ADN...) cuyo suministro controlado es posible gracias a su lenta difusión a través de las redes de macromoléculas de los complejos polielectrolíticos. El suministro de estos agentes activos también está directamente relacionado con la tasa de erosión o biorresorción de la matriz de hidrogel.
Por otro lado, las moléculas de bajo peso molecular se difunden rápidamente a través de la red polimérica del gel. En efecto, si las moléculas bioactivas no presentan ninguna interacción particular con el polímero o polímeros que forman la arquitectura del gel, su escaso impedimento estérico les permite difundirse libremente a través de las mallas de estas redes macromoleculares muy abiertas (un hidrogel compuesto principalmente por agua), por lo que la cinética de liberación de estas moléculas pequeñas no estará controlada por la velocidad de difusión, ni por la velocidad de erosión del hidrogel y será muy rápida.
Los hidrogeles físicos conocidos y sus correspondientes materiales alveolares se desintegran en un corto plazo de tiempo (al cabo de unas horas) o incluso de forma espontánea cuando se sumergen en el agua, especialmente cuando ésta está cargada de sales, como es el caso de todos los fluidos fisiológicos. Esta última característica es importante en el caso de los hidrogeles destinados a ser implantados en el cuerpo para que conserven sus estructuras durante un periodo de tiempo determinado con el fin no solo de asegurar su función de relleno y/o refuerzo sino también de permitir una liberación controlada y dirigida de uno o más principios activos.
Por último, actualmente no existe ningún hidrogel capaz de secuestrar o contener una carga mineral en un lugar de implantación (por ejemplo, un defecto óseo), debido a la degradación demasiado rápida de la estructura del hidrogel, que provoca la liberación a corto plazo de la carga mineral de la matriz del hidrogel. La carga mineral se selecciona entre los materiales de relleno óseo que contienen fosfatos de calcio en diversas formas (polvos, monolitos, gránulos, etc.), hidroxiapatita o fosfato de calcio de constitución similar al constituyente mineral principal del hueso. En efecto, la incorporación de una cantidad suficiente de carga mineral en un hidrogel y su mantenimiento en el lugar de implantación durante un tiempo suficientemente largo son necesarios en muchas aplicaciones en el ámbito de la cirugía dental, maxilofacial u ortopédica. La incorporación de una gran cantidad de carga mineral en un hidrogel físicamente reticulado desestabiliza y facilita la desintegración de este último.
También se conocen los documentos US 2010/0221303 A1 y WO 2012/028620 para la formación de un material alveolar a partir de un polímero de polisacáridos.
La presente invención pretende ofrecer un hidrogel, en particular un hidrogel físicamente reticulado, resultante de un complejo de al menos un polielectrolito negativo y de al menos un polielectrolito positivo que permite la complejación de moléculas terapéuticas de bajo peso molecular (inferior o igual a unos 250 g/mol), asegurando entonces su liberación prolongada.
La presente invención también pretende proporcionar un hidrogel para encapsular, y controlar la liberación de, uno o más componentes de alto peso molecular, en particular superior a unos 250 g/mol.
La presente invención también pretende proporcionar un hidrogel compacto, moldeable, homogéneo y tixotrópico (para que sea inyectable).
La presente invención pretende además proporcionar un hidrogel y un material celular derivado de dicho hidrogel que sean estables y no se desintegren espontáneamente cuando se sumergen en agua o en un medio fisiológico, incluso si contienen una cantidad significativa de una carga mineral.
La presente invención pretende proponer un hidrogel así como un material celular derivado de dicho hidrogel que sean capaces de comprender una cantidad significativa de carga mineral, en particular que represente hasta el 90 % de la masa del dispositivo, conservando al mismo tiempo una excelente consistencia, una buena maleabilidad y excelentes propiedades de absorción de fluidos biológicos (sangre) que permitan iniciar el método biológico de diferenciación celular que conduzca a la génesis de células osteoblásticas.
Objeto de la invención
La presente invención supera los problemas mencionados anteriormente, ya que tiene por objeto, según un primer aspecto, un método para la fabricación de un hidrogel que comprende ventajosamente las siguientes etapas sucesivas:
- una primera etapa (i) de suministro de al menos un polvo de un polímero aniónico (A) y de al menos un polvo de quitosano (B) que comprende funciones amina (-NH2);
- una segunda etapa (ii) en la que se mezclan en seco al menos los polvos (A) y (B) de la primera etapa para formar una mezcla de polvos;
- una tercera etapa (iii) que consiste en suspender la mezcla de polvo obtenida al final de la segunda etapa en un medio acuoso, en particular con agitación, que tenga un pH que permita solubilizar el polímero aniónico (A) sin solubilizar el quitosano, preferentemente a un pH superior o igual a 4, y aún más preferentemente a un pH superior o igual a 4,5, particularmente superior o igual a 5; preferentemente el medio acuoso es agua (por ejemplo, agua destilada o agua ultrapura) o una suspensión acuosa de al menos una célula viva, como células humanas o animales, en particular células madre, cuyo pH es aproximadamente 7 (+/- 0,5), correspondiente al pH de un medio de cultivo o líquido fisiológico;
- una cuarta etapa (iv) que consiste en añadir un ácido a la suspensión obtenida al final de la tercera etapa para formar el hidrogel;
o bien las etapas tercera (iii) y cuarta (iv) se sustituyen por una quinta etapa de mezcla (v) que comprende la mezcla de un medio acuoso acidificado que comprende al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C), con dicha mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B) obtenidos al final de la segunda etapa (ii).
Los inventores descubrieron que el método de gelificación está estrictamente relacionado con la naturaleza química de los dos polímeros (A) y (B), y la forma particular en que se utilizan.
El quitosano en polvo (compuesto por unidades monoméricas de glusosamina y N-acetilglucosamina) es insoluble en un medio acuoso con un pH superior o igual a 4, preferentemente superior o igual a 4,5, particularmente superior o igual a 5. Por otro lado, el quitosano se solubiliza en un medio acuoso si contiene un ácido diluido como el ácido clorhídrico, el ácido acético o el ácido láctico. En una solución acuosa suficientemente ácida, las funciones amina -NH2 del quitosano se protonan a funciones amonio -NH3+, y debido a esta propiedad el quitosano se considera en el marco de la presente invención como un policatión (polielectrolito: PE+).
La publicación "Chitin and chitosan: Properties and applications", Sra. Rinaudo, Prog. Polym. Sci. 31 (2006) 603-632, describe la solubilización del quitosano, que depende en particular de su grado de desacetilación, de su masa molar y del pH del medio acuoso en el que se solubiliza el quitosano.
Cabe señalar que a un pH inferior o igual a 5 y superior o igual a 4, las funciones amina del quitosano (B) estarán parcialmente protonadas pero en cantidad insuficiente para obtener la solubilización del quitosano (B). Rinaudo informa que la solubilización del quitosano se produce generalmente a un grado de ionización de las unidades de glucosamina superior a 0,5 (o 50 %).
La proporción de unidades de glucosamina ionizada (correspondiente al grado de ionización del quitosano) puede evaluarse mediante un ensayo ácido-base o mediante una valoración coloidal convencional bien conocida por el experto.
La suspensión de la mezcla de polvos que comprende los polvos (A) y (B) en un medio acuoso hace que el pH de este medio descienda cuando el polianión (A) comprende funciones ácidas (por ejemplo, funciones ácido carboxílico -COOH), y a continuación el pH vuelve a subir y se estabiliza. Sin embargo, se ha observado que cuando el pH del medio acuoso, antes de la adición de la mezcla en polvo, es superior o igual a 4, preferentemente superior o igual a 4,5, e incluso preferentemente superior o igual a 5, la posible caída del pH tras la adición de la mezcla en polvo no es suficiente para provocar la solubilización del quitosano. Solo la adición del ácido en la cuarta etapa provoca un descenso suficiente del pH para solubilizar el quitosano.
El polímero aniónico según la invención, o polianión, es soluble a un pH superior o igual a 4, en particular superior o igual a 4,5, en particular superior o igual a 5, y lleva funciones, en particular funciones sulfato ácidas (-O-S(=O)2-OH o -SO4H) y/o sus sales, o funciones ácido sulfónico (-S(=O)2-OH o -SO3H) y/o sus sales, y/o funciones ácido fosfórico (-O-P(=O)2-OH o -PO4H) y/o sus sales, y/o funciones ácido carboxílico (-COOH) y/o sus sales, capaces de formar funciones aniónicas en un medio acuoso, en particular mediante la liberación de un protón H+ con respecto a las funciones ácido sulfónico, sulfato ácido, ácido fosfórico o ácido carboxílico, para la formación de funciones carboxilato (-COO-) y/o sulfato -SO4' y/o sulfonato -SO3' y/o fosfonato -PO4'.
Las macromoléculas que llevan las funciones ácidas definidas anteriormente y las funciones amina son ionizables y se denominan polielectrolitos. Los polielectrolitos fuertes se distinguen de los débiles en función de la propensión de estas funciones a ionizarse en solución acuosa, que depende del pKa de cada polielectrolito. La constante de equilibrio Ka es del tipo (AH) -> <-(A‘) (H+), (las flechas en sentido contrario indican una reacción de equilibrio), tal que Ka = ([A-]x [H+])/[H+]; así se define el pKa = - log (Ka) que permite evaluar la ionización de un ácido en función del pH del medio. Así, el "Polymer Handbook", 2 volumes Set, 4a Edición, clasifica los polielectrolitos en polielectrolitos fuertes y débiles, según el pKa de las funciones ionizables que llevan. Los grupos sulfato ácido, ácido sulfónico y ácido fosfórico son polielectrolitos fuertes, es decir, que se ionizan a un pH bajo (inferior a 2), mientras que los polielectrolitos que llevan grupos carboxílicos son polianiones clasificados como polielectrolitos débiles (porque se ionizan a un pH a menudo superior a 4). Los polielectrolitos que llevan aminas primarias, secundarias y terciarias son policationes clasificados como polielectrolitos débiles, porque se ionizan a un pH inferior a 5 (aproximadamente).
La formación de un complejo polielectrolítico se produce mediante interacciones electrostáticas entre las funciones iónicas ácidas y básicas. Así, las condiciones de pH más favorables para la formación de un complejo polielectrolítico son aquellas en las que el pH de la solución está por encima del pKa del polianión y por debajo del pKa de las funciones del policatión.
A los efectos de la presente invención, se entiende por polímero aniónico o polianión cualquier polímero en forma de polvo que contenga funciones aniónicas o que sea capaz de formar funciones aniónicas una vez solubilizado en un medio acuoso, en particular a un pH superior o igual a 4, más particularmente a un pH superior o igual a 4,5, en particular a un pH superior o igual a 5.
En la segunda etapa, se mezclan íntimamente los polvos de quitosano (B) (PE+) y de polímero aniónico (PE-) (A). De este modo, las partículas PE+ se combinan con las partículas PE- por interacción electrostática. Estas interacciones electrostáticas pueden explicarse por el hecho de que el quitosano y el polímero aniónico tienen potenciales zeta de signos opuestos.
Preferentemente, el potencial zeta del quitosano es del orden de 20 mV a 50 mV, y el potencial zeta del polímero de ciclodextrina preferido (A1) según la invención, descrito a continuación, es del orden de -30 mV.
Ventajosamente, durante la tercera etapa (iii), el quitosano, al no ser solubilizado, permanece en suspensión en el medio acuoso gracias a la presencia del PE- altamente hidrófilo que permanece adsorbido en su superficie por interacciones electrostáticas, formando una capa hidrófila que permite mantener una suspensión homogénea.
Por "suspensión homogénea" se entiende una suspensión que no se sedimenta rápidamente cuando la agitación se ralentiza o se detiene.
Por "polvo" se entiende cualquier sustancia sólida reducida a pequeños granos a temperatura ambiente.
Por "temperatura ambiente" se entiende una temperatura entre 10 °C y 35 °C, en particular entre 15 °C y 25 °C.
Los valores de pH indicados en este texto se miden con un medidor de pH a temperatura ambiente.
A los efectos de la presente invención, se entiende por "polímero", en particular para designar el polímero aniónico y el polímero catiónico según la invención (quitosano (B)), un oligómero o un polímero que puede ser un homopolímero o un copolímero (es decir, que comprende al menos dos unidades de repetición diferentes).
"Sin solubilizar el quitosano" significa que ninguna o un número insuficiente de funciones amina del quitosano se protonan en el medio acuoso para provocar la disolución del polvo de quitosano. Preferentemente, la solubilización del quitosano (B) se obtiene con un grado de alfa-ionización de al menos 0,5, es decir, al menos el 50 % en número de las unidades de glucosa-amina del quitosano (B) en relación con el número total de unidades de glucosa-amina del quitosano (B) se ionizan a unidades de glucosamonio.
El grado de protonación necesario para lograr la solubilización también depende de la masa molar y del grado de desacetilación (GDA) del quitosano: si el GDA es bajo, habrá que protonar más funciones amínicas que si es alto.
Preferentemente, el grado de desacetilación del quitosano (B) según la invención es superior o igual al 60 %, aún más preferentemente superior o igual al 75 %, más preferentemente inferior o igual al 95 %, más particularmente inferior o igual al 90 %, en particular inferior o igual al 85 %.
El ácido añadido en la cuarta etapa (iv) o en la etapa (v) del método según la invención es diferente del polianión.
Cuando se añade el ácido, el pH de la suspensión disminuye, particularmente a un pH inferior o igual a 5, más particularmente inferior o igual a 4,5, en particular inferior o igual a 4, lo que provoca la solubilización del quitosano por protonación de sus aminas (-NH2) en funciones amonio (-NH3+), con el grupo acetato (CHaCOO') o cloruro (Cl-) como contraión si el ácido añadido es ácido acético y ácido clorhídrico respectivamente. Las macromoléculas de quitosano se despliegan bajo el efecto de la repulsión electrostática intramolecular entre los grupos de amonio formados (las cargas electrostáticas del mismo signo se repelen entre sí), y alcanzan una conformación denominada "en bola" que ocupa entonces todo el volumen del medio acuoso. Al mismo tiempo, se forman enlaces iónicos entre los grupos amónicos del quitosano (-NH3+) y las funciones aniónicas (COO‘) del polímero aniónico.
A continuación, una vez protonadas las funciones amina protonada, el pH del hidrogel vuelve a subir para estabilizarse, preferentemente a un pH superior o igual a 4, aún más preferentemente a un pH superior o igual a 4,5, en particular a un pH superior o igual a 5.
Dicho polímero aniónico se dispersa así en la red de quitosano. Estas interacciones iónicas provocan la reticulación física del gel y la fijación de la dispersión acuosa.
Ventajosamente, el hidrogel según la invención es un gel macroscópico que tiene las características de un material viscoelástico con forma propia.
Preferentemente, las características de pH del medio acuoso acidificado tras la cuarta etapa (iv) también se aplican al medio acuoso de la etapa (v) (que comprende un compuesto (C) como se define en el presente documento).
A los efectos de la presente invención, preferentemente se entiende por "hidrogel" un material sólido viscoelástico que tiene forma propia, es decir, que conserva las dimensiones y la forma del recipiente en el que se formó cuando se saca de ese recipiente (durante unas horas o unos días, según las condiciones en que se ponga).
Preferentemente, la primera etapa y/o la segunda etapa y/o la tercera etapa y/o la cuarta etapa y/o la quinta etapa (v) según la invención se realizan a temperatura ambiente.
Se ha observado que la adición del ácido después de la suspensión en la tercera etapa es muy importante, ya que este método da lugar a un hidrogel muy firme y estable, que es capaz de permanecer en una zona específica sin fluir durante varias horas a temperatura ambiente o a unos 37 °C, en particular durante al menos 48 horas.
Además, el hidrogel según la invención conserva su forma e integridad en un medio acuoso, en particular a temperatura ambiente o a unos 37 °C durante varias horas, al menos durante 24 horas, preferentemente al menos durante 48 horas.
En el estado de la técnica, los hidrogeles físicos a base de quitosano se fabrican mezclando la solución acuosa ácida de quitosano con la solución acuosa del polianión o espolvoreando el polianión, por ejemplo, carboximetilcelulosa, sobre la solución acuosa ácida de quitosano (pH en el rango de 2-3). En ambos casos, los hidrogeles obtenidos no son tan firmes y estables como el hidrogel según la invención.
El papel del quitosano en el hidrogel según la invención es asegurar la arquitectura del gel, y conferirle sus propiedades reológicas requeridas.
Preferentemente, la relación entre la masa total de agua (g) en el hidrogel y la masa total del hidrogel es superior o igual al 50 %, incluso preferentemente superior o igual al 60 %, más preferentemente superior o igual al 70 %, en particular superior o igual al 80 %, aún más preferentemente superior o igual al 85 %, en especial superior o igual al 90 %.
Ventajosamente, el hidrogel según la invención es capaz de satisfacer una o más propiedades, incluyendo las siguientes: ser biocompatible, ser inyectable por medio de una jeringa, ser capaz de retener una forma dada impartida por el moldeado durante al menos unas horas y/o no fluir para permanecer en su lugar en la zona a la que se ha aplicado, y ser capaz de liberar una o más sustancias activas.
El hidrogel según la invención es ventajosamente tixotrópico lo que le permite ser inyectable. Así, el hidrogel tiene un comportamiento reofluidificante: el polímero se vuelve fluido cuando se expone a una tensión mecánica de cizallamiento, y recupera su estado de gel en reposo libre de cualquier tensión. Cuando el hidrogel se pone en el cuerpo de la jeringa, se fluidifica bajo el efecto de la tensión de cizallamiento aplicada a través del émbolo para fluir a través del orificio de salida de la jeringa, a continuación en la aguja, y posiblemente en el catéter, y finalmente recupera su forma de hidrogel cerrado una vez libre de tensión en la zona en la que se ha aplicado.
A modo de ejemplo, una aguja convencional en conexión fluida con el puerto de salida de una jeringa tiene un diámetro entre 0,1 mm y 0,5 mm.
Los hidrogeles según la invención pueden utilizarse en muchas aplicaciones médicas, y en particular como material de relleno en cirugía reconstructiva, estética, urológica, dental, oftalmológica, ortopédica, maxilofacial, con el fin de evitar adherencias tisulares y/o promover la generación de hueso o diversos tejidos blandos y/o liberar una o más sustancias activas en la zona a la que se aplican.
Cuando los hidrogeles según la invención comprenden al menos un agente funcional y/o células vivas, contribuyen, por ejemplo, a la cicatrización, al tratamiento de una enfermedad (cáncer), a la reducción del dolor (efecto anestésico), a la reducción de la inflamación o a la prevención o control de una infección.
El medio acuoso de la tercera etapa (iii) también puede comprender al menos un compuesto (C) que comprenda al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C).
A efectos de este texto, un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa significa cualquier compuesto (C) que comprende al menos una unidad de la fórmula empírica C6H12O6 o derivada de dicha fórmula empírica. Puede tratarse, por ejemplo, de una hexosa, o de una primera hexosa unida mediante un enlace glucosídico a una segunda hexosa, idéntica o diferente a la primera (en el caso de al menos una unidad derivada de una hexosa).
Preferentemente, dicho compuesto que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa se selecciona de la lista que comprende la glucosa (forma L o D), la maltosa (forma L o D), la sacarosa, la manosa (forma L o D), la fructosa (forma L o D), la lactosa (forma L o D), o una de sus mezclas; además, preferentemente dicho compuesto es la glucosa (forma L o D).
A efectos del presente texto, se entiende por fosfato del compuesto (C) cualquier compuesto que comprenda al menos una unidad de fórmula empírica C6H12O6 o derivada de dicha fórmula empírica que lleve en al menos uno de sus carbonos un grupo fosfato (por ejemplo el grupo fosforilo (PO32-)). Puede ser, por ejemplo, una hexosa fosfato, o una primera hexosa (fosfato) unida mediante un enlace glucosídico a una segunda hexosa (fosfato) idéntica o diferente a la primera hexosa (fosfato) (siendo una unidad derivada de una hexosa (fosfato)).
En particular, los fosfatos del compuesto (C) son hexosa-n-fosfatos o derivados de hexosa-n-fosfatos (con n que es uno de los átomos de carbono numerados de 1 a 6 de la unidad de hexosa o del derivado de la unidad de hexosa que lleva un grupo fosfato).
Un fosfato del compuesto (C) se selecciona preferentemente entre glucosa-n-fosfato (forma L o D), en particular glucosa-6-fosfato o glucosa-1-fosfato; maltosa-n-fosfato; sacarosa-n-fosfato; manosa-n-fosfato; fructosa-n-fosfato, lactosa-n-fosfato, o una de sus mezclas; además, preferentemente dicho compuesto es glucosa-n-fosfato (forma L o D).
Preferentemente, el compuesto (C) o el fosfato de dicho compuesto (C) comprende como máximo 10 unidades de hexosas o unidades derivadas de hexosas, en particular como máximo 5 unidades de hexosas o unidades derivadas de hexosas, en particular una o dos unidades de hexosas o derivadas de hexosas.
Sorprendentemente, se ha observado que es posible mezclar la mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B) obtenidos al final de la etapa (ii) con un medio acuoso acidificado sin que sea necesario pasar por la etapa de suspensión (iii) cuando dicho medio acuoso acidificado comprende al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa y/o un fosfato de dicho compuesto (C).
Esta disposición permite la formación de un hidrogel firme y estable, incluso una hora después de la inyección en un medio de cultivo como DMEM.
También se ha observado que la presencia del componente a base de hexosas (C) en el medio acuoso, y por tanto en última instancia en el hidrogel, aumenta significativamente el pH del medio acuoso, especialmente a un pH cercano a 6, y por tanto mejora significativamente la citocompatibilidad medida in vitro.
Los inventores descubrieron sorprendentemente que un compuesto a base de hexosa o fosfato de hexosa en el medio acuoso acidificado mejora la formación de un gel de quitosano y de un polianión. El uso de fosfato de glucosa es conocido como un agente gelificante para mejorar la estabilidad de las soluciones basadas en quitosano, pero no en la mejora de la formación de hidrogeles iónicos basados en quitosano (véase European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 88 (2014) 361-373).
Según un modo de realización, la suspensión de la mezcla de polvos obtenida al final de la tercera etapa se vierte o inyecta en un molde, y a continuación se añade el ácido para moldear y formar el hidrogel.
Según un modo de realización, la segunda etapa de mezcla de los polvos (A) y (B) se realiza con un dispositivo de mezcla de polvos, en particular un agitador planetario, en particular sin trituración (es decir, sin reducir significativamente el tamaño de las partículas sólidas que constituyen el polvo).
En una realización alternativa, el medio acuoso, ya sea en la etapa (iii) o en la etapa (v), comprende al menos un 0,1 % en masa, preferentemente al menos un 0,5 % en masa, más preferentemente al menos un 1 % en masa, más preferentemente al menos un 2 % en masa, más preferentemente al menos un 3 % en masa, aún más particularmente, al menos un 4 % en masa, en particular al menos un 5 % en masa, de al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o de al menos un fosfato de dicho compuesto (C), con respecto al volumen total de dicho medio acuoso.
En una alternativa, el polvo (A) y/o el polvo (B) en la primera etapa y/o la mezcla de polvos que comprende al menos los polvos (A) y (B) en la segunda etapa se tamizan en un tamiz que tiene un tamaño de malla inferior o igual a 500 |jm, preferentemente inferior o igual a 300 jm , incluso preferentemente inferior o igual a 200 jm , en particular inferior o igual a 150 jm , más particularmente inferior o igual a 125 jm .
Preferentemente, la distribución del tamaño de las partículas del polvo (A) y/o del polvo (B) o de la mezcla de polvos (A) y (B) se ha medido con un Mastersizer S (Malvern Instruments, Orsay, Francia) utilizando una lente de 300 mm. La muestra se dispersó en seco con aire comprimido a 4 bares.
Preferentemente, el polvo (A) y/o el polvo (B) y/o la mezcla de los polvos (A) y (B), opcionalmente en combinación con al menos un polvo diferente de los polvos (A) y (B), como por ejemplo, al menos una carga mineral, se tamizan en el dispositivo de tamizado que tiene la siguiente referencia: un tamiz de plástico, Nylon DIN 41p5, Nr: 948414 W: 0,125 jm , comercializado por Bioblock Scientific.
El respeto de un determinado tamaño para las partículas de policationes y polianiones es importante porque permite la formación de un gel homogéneo, es decir, la ausencia de grumos, y con las propiedades viscoelásticas esperadas.
El polvo (A) y el polvo (B) también se pueden tamizar con una tamizadora vibratoria, por ejemplo, las comercializadas por Fristch.
Preferentemente, en la primera etapa, el polvo (A) y/o el polvo (B) se muelen por separado antes de pasar por un tamiz, preferentemente utilizando un dispositivo Pulverisette 14® comercializado por la empresa Fritsch y equipado con una rejilla de 200 jm .
En una variante, la mezcla de la segunda etapa se lleva a cabo mediante la molienda conjunta en seco de al menos los polvos (A) y (B).
Preferentemente, los polvos (A) y (B) se muelen conjuntamente en seco en un mortero a mano.
Los polvos (A) y (B) también se pueden moler conjuntamente en un molino de bolas, en particular en un micro-molino planetario de pulverización como los comercializados por la empresa Fritsch.
La molienda permite reducir el tamaño de las partículas sólidas a fragmentos más pequeños. El término molienda conjunta se refiere a la molienda simultánea de al menos dos polvos diferentes (A) y (B). En las variantes anteriores, se ha observado que la molienda conjunta y/o la molienda seguida de mezcla tiene la ventaja de reducir el tamaño de las partículas sólidas de los polvos, pero también asegura una mezcla íntima entre los polvos (A) y (B) y, por tanto, una mejor superficie de contacto entre el polímero aniónico y el quitosano. Esta disposición favorece la homogeneidad de la dispersión acuosa que comprende estos polvos en la tercera etapa. La reproducibilidad en la formación del hidrogel también aumenta, así como la reactividad entre el polímero aniónico y el quitosano, en particular para la fijación del hidrogel.
En una variante, el polímero aniónico comprende funciones sulfato ácidas (-O-S(=O)2-OH o -SO4H) y/o sales conocidas como funciones sulfato ácidas, y/o funciones ácido sulfónico (-S(=O)2-OH o -SO3H) y/o sales conocidas como funciones ácido sulfónico, y/o funciones ácido fosfórico (-O-P(=O)2-OH o -PO4H) y/o sales de dichas funciones ácido fosfórico, y/o funciones ácido carboxílico (-COOH) y/o sales de dichas funciones ácido carboxílico, preferentemente funciones ácido fosfórico y/o sales de dichas funciones ácido fosfórico; y/o funciones ácido carboxílico (-COOH) y/o sales de dichas funciones ácido carboxílico, más preferentemente funciones ácido carboxílico (-COOH) y/o sales de dichas funciones ácido carboxílico, particularmente funciones ácido carboxílico (-COOH).
Las sales de los ácidos sulfónicos (sales de sulfonato -SO3X), de los sulfatos ácidos (sales de sulfato -SO4X), de los ácidos fosfóricos (sales de fosfonato -PO4X) y de los ácidos carboxílicos (sales de carboxilato -COOX) son monovalentes, por lo que dichas sales comprenden al menos un grupo -OX (que sustituye al grupo OH presente en los ácidos) en el que X se selecciona preferentemente entre sodio, potasio, litio y plata, incluso preferentemente es potasio o sodio.
En una alternativa, el polímero aniónico se selecciona de la lista que comprende: un polímero de ciclodextrina, ácido hialurónico, carboximetilcelulosa, heparina, una sal de heparinato, incluido el heparinato de sodio, ácido poliacrílico, poliacrilato de sodio, una sal de ácido poliacrílico, pectina, ácido algínico, alginato de sodio, carragenano, goma xantana, goma gelana (sal de ácido carboxílico), glucomanano, goma de kondagogu, goma arábiga, goma de anacardo, más preferentemente de la lista que consiste en un polímero de ciclodextrina, ácido hialurónico, carboximetilcelulosa, heparina, pectina, ácido algínico, alginato de sodio, ácido acrílico y una sal de ácido acrílico, más preferentemente un polímero de ciclodextrina, ácido acrílico, pectina y alginato de sodio.
La heparina, una sal de heparinato, y el carragenano incluyen funciones sulfato ácidas o sales de funciones sulfato básicas.
El ácido hialurónico, pectina, polímero de ácido acrílico o su sal, carboximetilcelulosa, ácido algínico, goma xantana, goma gelana, glucomanano, goma de kondagogu, goma arábiga, goma de anacardo y el polímero de ciclodextrina (según su vía de síntesis) comprenden funciones ácido carboxílico (-COOH) o sales de dichas funciones ácido carboxílico (cuyas sales ya se han definido en este texto en el párrafo anterior con referencia al polímero aniónico).
En una alternativa, el polímero aniónico (A) es un polímero de ciclodextrina obtenido por la reacción de polimerización de una mezcla que comprende al menos una ciclodextrina y/o al menos un derivado de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión derivado de ciclodextrina, con
- al menos un ácido (poli)carboxílico y/o su correspondiente anhídrido de ácido (poli)carboxílico (lista A1); o - al menos un pirofosfato (lista A2); o
- al menos epiclorhidrina, el polímero obtenido se somete a una etapa de carboxialquilación, en particular de carboximetilación, para injertar funciones ácido carboxílico (-COOH) (lista A3).
Ventajosamente, la red hidrófila del polímero de ciclodextrina aumenta la biocompatibilidad y garantiza la cohesión del hidrogel, que no puede disolverse espontáneamente en el entorno fisiológico y migrar. La red hidrófila también proporciona una estabilización del complejo de inclusión entre el huésped y la cavidad de ciclodextrina. La ciclodextrina también contribuye a la estabilidad del gel al mejorar sus propiedades de adsorción (llamadas propiedades de depósito) reguladas por la afinidad del huésped, y haciendo que la liberación de este último sea más o menos lenta.
El hidrogel puede comprender un polímero de ciclodextrina soluble o un polímero de ciclodextrina insoluble o una de sus mezclas, preferentemente un polímero de ciclodextrina soluble, más particularmente perteneciente a la familia (A1).
El polímero aniónico de ciclodextrina asegura tanto la reticulación del quitosano por interacciones iónicas, y permite la complejación de moléculas terapéuticas de bajo peso molecular (menos de unos 250 g/mol), mediante la formación de complejos de inclusión, y a continuación asegura su liberación prolongada.
El polímero de ciclodextrina según la invención, en particular reticulado o hiperramificado, en particular de la lista (A1), puede existir en forma soluble o insoluble. El polímero soluble consiste en geles de dimensiones nanométricas (es decir, que tienen dimensiones inferiores o iguales a unos 100 nm) (véase la publicación Green Chemistry, 2015, 17, 2444-2454 que representa fotos de nanogeles globulares basados en un polímero de ciclodextrina), que forman soluciones claras en agua. El polímero insoluble corresponde a partículas micrométricas (es decir, dimensiones superiores a 1 pm), milimétricas y mayores, que forman sistemas bifásicos en el agua, por lo que las soluciones son turbias y no claras.
Preferentemente, el polímero de ciclodextrina es el perteneciente a la lista (A1). Esta familia de polímeros (A1) tiene la ventaja de ser más fácil de suspender en un medio acuoso, ya que estos polímeros son altamente hidrófilos. Esto facilita la formación de un hidrogel homogéneo y firme.
Ventajosamente, el polímero de ciclodextrina, en particular los pertenecientes a la lista (A1), conserva su función de retención y liberación controlada de moléculas, en particular de pequeñas moléculas, cosa que no es posible con el quitosano. El quitosano es complementario, ya que las moléculas grandes pueden ser retenidas dentro de su red macromolecular tridimensional y a continuación son liberadas de forma más o menos prolongada.
Existen otros polímeros de ciclodextrina además de los de la lista (A1) definida anteriormente, pero estos últimos son muy específicos porque sus niveles muy altos de funciones carboxilato (al menos 3 moles de grupos COOH por gramo, en particular al menos unos 3-5 mmol de grupos COOH por gramo) no son alcanzables por las otras rutas de polimerización o modificación química de los polímeros de ciclodextrina. La familia de polímeros de la lista (A1) definida anteriormente permite así obtener hidrogeles con una forma limpia, es decir, aptos para ser moldeados, cortados, con una textura firme, homogénea y duradera.
Preferentemente, el polímero de ciclodextrina, en particular perteneciente a la lista (A1), se obtiene a partir de una mezcla base en la que la proporción del peso (g) de ciclodextrina(s) y/o derivado(s) de ciclodextrina y/o complejo(s) de inclusión (derivado(s)) de ciclodextrina respecto al peso total (g) de dicha mezcla base es superior o igual al 40 %, preferentemente inferior o igual al 65 %.
Por "ciclodextrina" se entiende cualquier ciclodextrina nativa, en particular la a-ciclodextrina o la p-ciclodextrina o la gamma-ciclodextrina.
Por "derivado de ciclodextrina" se entiende cualquier ciclodextrina nativa, en particular la a-ciclodextrina o la pciclodextrina o la gamma-ciclodextrina, en la que al menos un grupo hidroxilo, preferentemente al menos la mitad de los grupos hidroxilo, está(n) sustituido(s), en particular amino(s), en particular mediante una función amina (-NH2), esterificado(s), eterificado(s), alquilado(s), hidroxialquilado(s), carboxialquilado(s), en particular carboximetilado(s), sulfoalquilado(s), en particular sulfobutilado(s), y sus mezclas.
Dicho al menos un grupo hidroxilo de la ciclodextrina puede estar sustituido por una cadena alquílica lineal y/o ramificada, insaturada o no, sustituida o no, que comprenda de 1 a 10 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, más preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono, en particular un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo isopropilo, un grupo n-butilo, un grupo isobutilo, un grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo, estando cada uno de dichos grupos opcional, e independientemente uno del otro, sustituido por uno o más grupos hidroxilo (-OH); y/o sustituido por uno o más grupos ácido carboxílico (-COOH); y/o sustituido por uno o más grupos ácido sulfónico y/o una o más sales de dichas funciones ácido sulfónico. Dicho al menos un grupo hidroxilo de la ciclodextrina así puede estar sustituido por un grupo hidroxipropilo o por un grupo carboximetilo.
Por "complejo de inclusión de ciclodextrina" o "complejo de inclusión derivado de ciclodextrina" se entiende cualquier ciclodextrina o derivado de ciclodextrina en el sentido de la presente invención que forme un complejo con un agente funcional como se define en el presente documento, o que forme un complejo con una célula viva como se define en el presente documento.
El experto selecciona una o más ciclodextrinas y/o uno o más derivados de ciclodextrina y/o uno o más complejos de inclusión de ciclodextrina capaces de reaccionar con el agente reticulante. En particular, con respecto a la lista A1 de polímeros de ciclodextrina, si se utilizan derivados de ciclodextrina, deben tener suficientes grupos hidroxilos (-OH) para poder llevar a cabo una reacción de policondensación con los correspondientes ácidos (poli)carboxílicos y/o sus anhídridos correspondientes.
El documento EP 1 165 621 B1 describe la síntesis de polímeros de ciclodextrina obtenidos por reacciones de policondensación entre ácidos (poli)carboxílicos y ciclodextrinas nativas (alfa, beta, gamma) o derivadas (metil, hidroxipropil ciclodextrinas) adecuadas para la aplicación de la invención. El polímero obtenido es soluble en agua, o insoluble según el progreso de la reacción de policondensación. Se caracteriza por un alto contenido de ciclodextrina, entre el 40 % y el 65 % en peso, y por su riqueza en funciones ácido carboxílico, del orden de 3-5 mmol por gramo de polímero de ciclodextrina.
A efectos de la presente invención, "ácido carboxílico" significa un ácido que contiene una función -COOH, "ácido policarboxílico" significa un ácido que contiene al menos dos funciones -COOH, y "su anhídrido correspondiente" significa un ácido que contiene al menos una función -CO-O-CO-.
Se entiende por "pirofosfato" cualquier compuesto que comprenda un enlace P-O-P, en particular que comprenda la siguiente función -O-PO(OH)-O-p O(OH)-O-.
Según un modo de realización, el polímero de ciclodextrina obtenido mediante la reacción con epiclorhidrina no comprende funciones ácido carboxílico, por lo que se somete a una reacción de carboxialquilación, en particular a una reacción de carboximetilación con ácido cloroacético para injertar grupos -CH2COOH en dicho polímero.
La carboxialquilación se realiza preferentemente con un ácido (poli)carboxílico sustituido por al menos un átomo de cloro, bromo o yodo en su cadena alquílica. La cadena alquílica es preferentemente lineal y/o ramificada, insaturada o no, sustituida o no sustituida, que comprende de 1 a 10 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, incluso preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono, en particular un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo isopropilo, un grupo n-butilo, un grupo isobutilo, un grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo.
En una alternativa, el pirofosfato (A2) es metatrifosfato de sodio.
En una alternativa, el ácido (poli)carboxílico o su correspondiente anhídrido ácido se selecciona de la lista que comprende: ácidos (poli)carboxílicos saturados o insaturados o aromáticos, lineales o ramificados o cíclicos y ácidos hidroxipoli(carboxílicos), preferentemente de la lista que comprende: ácido cítrico, ácido poliacrílico, ácido poli(metacrílico), ácido 1,2,3,4-butanotetracarboxílico (BTCA), ácido maleico, ácido citracónico, ácido itacónico, ácido 1,2,3-propanotricaboxílico, ácido trans-aconítico, ácido todo-cis-1,2,3,4-ciclopentanotetracarboxílico, ácido melítico, el ácido piromelítico, el ácido edítico (ácido etilendiamino tetraacético o EDTA), el ácido oxidisuccínico, el ácido tiodisuccínico o entre los anhídridos ácidos de los citados ácidos (poli)carboxílicos, como el dianhídrido piromelítico, y sus mezclas, preferentemente el ácido cítrico y el BTCA.
Preferentemente, el ácido (poli)carboxílico se selecciona entre los ácidos acíclicos, incluso preferentemente sin funciones amina (-NH2), más particularmente entre los ácidos sin nitrógeno. Los polímeros de ciclodextrina obtenidos con estos ácidos son más hidrófilos que los obtenidos con ácidos cíclicos y son sintetizables por vía acuosa, a diferencia, por ejemplo, de los polímeros obtenidos con dianhídrido piromelítico, cuya síntesis debe realizarse en DMF (dimetilformamida).
En una alternativa, el ácido que se añade a la suspensión en la cuarta etapa o que se utiliza para acidificar el medio acuoso en la etapa (v) del método según la invención se selecciona de la lista que comprende: ácido acético, en particular el ácido acético glacial, el ácido fórmico, el ácido tartárico, el ácido salicílico, el ácido glutámico, el ácido propanoico, el ácido clorhídrico, el ácido cítrico, el ácido láctico y sus mezclas; preferentemente el ácido acético, el ácido clorhídrico, el ácido láctico y sus mezclas, más preferentemente el ácido acético y el ácido clorhídrico.
Preferentemente, dicho ácido acético está concentrado al menos al 50 %, incluso preferentemente al menos al 80 %, más preferentemente al 95 %, en particular al 99 % (ácido acético "puro" denominado "glacial").
En general, preferentemente se añade al menos el 0,5 %, más preferentemente al menos el 1 % en volumen de un ácido al medio acuoso en la etapa (iii) o en la etapa (v) en relación con el volumen total de dicho medio acuoso.
En una subvariante, el ácido añadido a la suspensión en la cuarta etapa (iv) o en la etapa (v) del método según la invención se selecciona entre el ácido clorhídrico, el ácido acético y el ácido láctico, más preferentemente entre el ácido láctico y el ácido clorhídrico, en particular el ácido láctico.
Se ha observado que la firmeza y estabilidad de la perla de hidrogel inyectada es mejor con estos ácidos, especialmente con el ácido láctico.
Además, los ácidos clorhídrico y láctico tienen la ventaja de ser inodoros en comparación con el ácido acético.
Ventajosamente, también se ha observado que el ácido clorhídrico, el ácido acético y el ácido láctico, en particular el ácido láctico, especialmente cuando se combinan con al menos un compuesto que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa en el medio acuoso, permiten obtener buenos resultados en términos de citocompatibilidad in vitro (ensayo de células MC3T3).
Preferentemente, el ácido láctico añadido es una solución acuosa que comprende al menos un 85 % en peso de ácido láctico puro basado en el volumen de dicha solución acuosa.
En una alternativa, el polímero de ciclodextrina aniónica (A) comprende al menos 2 mmol/g de funciones ácido carboxílico (-COOH), preferentemente al menos 3 mmol/g de funciones ácido carboxílico (-COOH), e incluso preferentemente al menos 3,5 mmol/g de funciones ácido carboxílico (-COOH).
La cantidad de funciones carboxílicas por g de polímero de ciclodextrina puede medirse por valoración ácido-base en presencia de indicadores coloreados.
El método de medición consiste en disolver una cantidad determinada de un polímero de ciclodextrina en un volumen dado de agua en presencia de un indicador coloreado, por ejemplo, fenolftaleína (unas gotas), y a continuación añadirlo gradualmente (gota a gota), en particular, con la ayuda de una bureta graduada, una solución de sosa de 0,1 mol/litro a dicha solución mientras se agita (con la ayuda de una varilla magnética, por ejemplo) hasta obtener un cambio de color de la solución que contiene el indicador coloreado. El número de moles de sosa añadidos corresponde, por tanto, al número de moles de funciones ácido carboxílico (-COOH) neutralizados.
En una alternativa, la relación entre la masa (g) de dicho al menos un polvo de quitosano (B) y la masa total (g) del hidrogel al final de la cuarta etapa (iv) o al final de la quinta etapa (v) es superior o igual al 1 %, preferentemente inferior o igual al 8 %, aún más preferentemente inferior o igual al 5 %, más preferentemente inferior o igual al 4 %.
En una alternativa, la relación entre el peso (g) de dicho al menos un polvo del polímero aniónico (A) y el peso total (g) del hidrogel al final de la cuarta etapa (iv) o al final de la quinta etapa (v) es superior o igual al 1 %, preferentemente inferior o igual al 20 %, aún más preferentemente inferior o igual al 15 %, más preferentemente inferior o igual al 10 %, particularmente inferior o igual al 6 %.
En una alternativa, la relación entre la masa (g) del polvo de quitosano (B) y la masa (g) del polvo de polianiones (A) está comprendida entre 0,6 y 1,4, aún más preferentemente entre 0,8 y 1,2, más preferentemente entre 0,9 y 1,1.
En una alternativa, el método de fabricación de un hidrogel según la invención comprende la adición de al menos una carga mineral en polvo a la mezcla de polvos producida en la segunda etapa, preferentemente la proporción de la masa (g) de carga mineral con respecto a la masa total (g) de la mezcla de polvos es superior o igual al 30 %. Por tanto, dicha al menos una carga mineral está mezclada íntimamente con los polvos (A) y (B).
Preferentemente, dicha carga mineral se tamiza y/o muele conjuntamente de acuerdo con las variantes de realización definidas anteriormente para los polvos (A) y (B), en particular con respecto al tamaño de las partículas tamizadas.
En una alternativa, dicha al menos una carga mineral se selecciona de la lista que comprende: biocerámicas, en particular fosfatos de calcio, como hidroxiapatita de calcio y beta-trifosfato de calcio, carbonato de calcio, alúmina (AbO3), circonio (ZrO2), vidrios, ionómeros de vidrio, dióxido de titanio y una de sus mezclas (para la reconstrucción ósea).
En una alternativa, el medio acuoso de la etapa (iii) o de la etapa (v) comprende al menos un agente funcional y/o al menos una célula viva.
Dicho agente funcional es, en particular, un agente bioactivo, más concretamente una molécula, una macromolécula o un microorganismo que presenta una actividad terapéutica. Esta definición también se aplica en el resto del texto.
Ventajosamente, dicho agente funcional se selecciona de una primera lista (I) que comprende anticoagulantes, antitrombógenos, agentes antimitóticos, agentes antiproliferación, agentes antiadhesión, agentes antimigración, promotores de la adhesión celular, factores de crecimiento, moléculas antiparasitarias, agentes antiinflamatorios, vitaminas, hormonas, proteínas, antifúngicos, moléculas antimicrobianas, antisépticos, antibióticos (incluyendo la ciprofloxacina y la clorhexidina), nicotina, uno o más aceites esenciales y sus mezclas; y dicha al menos una célula viva se selecciona de una segunda lista (II) que comprende células animales y/o humanas y/o vegetales.
Preferentemente, las células vivas incluyen células procariotas, células eucariotas, bacterias, levaduras, células vegetales, células animales, como células endoteliales, células nerviosas, linfoblastos, fibroblastos, osteoblastos, hepatocitos, células madre, células embrionarias, adipocitos, etc.; y células diseñadas para expresar una molécula particular.
La presente invención también tiene por objeto, según un segundo aspecto, un método de fabricación de un material alveolar, en particular de un material esponjoso, como una esponja, que comprende un método de fabricación de un hidrogel descrito según una cualquiera de las variantes de realización precedentes con referencia a un primer aspecto de la invención, con el fin de obtener el hidrogel, y que comprende además una etapa de liofilización realizada sobre el hidrogel obtenido al final de la cuarta etapa (iv) o de la etapa (v) con el fin de formar un material alveolar.
Preferentemente, la etapa de liofilización es una etapa que permite la desecación de un compuesto hidratado por congelación y a continuación sublimación del hielo en una atmósfera reducida.
En una alternativa, se añade un agente formador de poros en forma de polvo a la mezcla de polvo en la segunda etapa (ii) del método de fabricación del hidrogel.
Dicho agente formador de poros puede ser cualquier agente capaz de convertirse en un gas en condiciones ácidas, con un pH inferior o igual a 5, con los poros que se forman por las moléculas de dióxido de carbono que escapan del hidrogel. Dichos agentes formadores de poros pueden ser carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de calcio y sus mezclas. La proporción en peso del agente formador de poros está entre el 1 % y el 15 % del peso total de la mezcla de polvo en la segunda etapa. Estos compuestos están disponibles en Sigma-Aldrich.
En el estado de la técnica, el material alveolar se denomina "andamio poroso".
La concentración del agente formador de poros afecta al tamaño de los poros en el material alveolar. El tamaño medio de los poros en el material alveolar es preferentemente superior o igual a 1 pm e inferior o igual a 1000 pm, más preferentemente entre 100-500 pm. La densidad de los poros está entre el 4 % y el 75 %.
Preferentemente, el material alveolar poroso es blando y elástico, es decir, puede comprimirse o estirarse manualmente en cualquier dirección sin dañarse (en particular, sin desgarrarse) y tiende a volver a sus dimensiones originales (o a unas dimensiones cercanas a las originales) después de liberar la compresión o el estiramiento.
Preferentemente, el material alveolar comprende poros cerrados.
Preferentemente, el material alveolar tiene una estructura esponjosa, como una espuma.
Esta etapa de liofilización puede realizarse con cualquier equipo de última generación. La liofilización se realiza durante el tiempo suficiente para eliminar al menos el 98 % de agua, al menos el 99 % de agua, preferentemente al menos el 99,5 % de agua.
Ventajosamente, esta etapa de liofilización se lleva a cabo después de haber dado al hidrogel una forma específica, por ejemplo, disponiendo dicho hidrogel en un molde y sometiéndolo después a una etapa preliminar de congelación.
En una alternativa, el método de fabricación de un material alveolar comprende una etapa de tratamiento térmico de dicho material alveolar a una temperatura superior o igual a 100 °C durante al menos 5 minutos, en particular durante al menos 60 minutos, preferentemente a una temperatura superior o igual a 120 °C durante al menos 5 minutos, en particular durante al menos 30 minutos, más preferentemente a una temperatura superior o igual a 140 °C durante al menos 5 minutos.
Esta etapa de tratamiento térmico se lleva a cabo en el material alveolar resultante, especialmente después de la etapa de liofilización.
Esta disposición mejora muy significativamente las propiedades mecánicas del material alveolar, así como su elasticidad y resistencia en medios acuosos, en particular al reducir su velocidad de solubilización.
Ventajosamente, se ha observado que la resistencia a la compresión también mejora. El material alveolar se comprime bajo una tensión de compresión manual, pero tiende a recuperar rápidamente su tamaño y forma originales tras liberarse de esta tensión. Esta cualidad se observó en el material alveolar seco, pero también tras la impregnación de dicho material alveolar en agua.
En una alternativa, dicho método comprende una etapa de impregnación del material alveolar en una solución que comprende al menos un agente funcional y/o al menos una célula viva.
Dicho agente funcional es en particular un agente bioactivo.
Ventajosamente, dicho agente funcional se selecciona de una primera lista (I) que comprende anticoagulantes, antitrombógenos, agentes antimitóticos, agentes antiproliferación, agentes antiadhesión, agentes antimigración, promotores de la adhesión celular, factores de crecimiento, moléculas antiparasitarias, agentes antiinflamatorios, vitaminas, hormonas, proteínas, antifúngicos, moléculas antimicrobianas, antisépticos, antibióticos (incluyendo la ciprofloxacina y la clorhexidina), nicotina, uno o más aceites esenciales y sus mezclas; y dicha al menos una célula viva se selecciona de una segunda lista (II) que comprende células animales y/o humanas y/o vegetales.
Preferentemente, las células vivas incluyen células procariotas, células eucariotas, bacterias, levaduras, células vegetales, células animales, como células endoteliales, células nerviosas, linfoblastos, fibroblastos, osteoblastos, hepatocitos, células madre, células embrionarias, adipocitos, etc.; y células diseñadas para expresar una molécula particular.
La presente invención tiene por objeto, según un tercer aspecto, un dispositivo para absorber y drenar y/o liberar un agente funcional y/o de soporte de al menos una célula viva que comprende:
- el hidrogel obtenido mediante la realización del método descrito según una cualquiera de las variantes de realización con referencia al primer aspecto según la invención; o
- que comprende el material alveolar obtenido al realizar el método descrito según cualquiera de las variantes de realización con referencia al segundo aspecto según la invención.
Ventajosamente, dicho dispositivo se selecciona entre: una jeringa que comprende al menos un depósito que recibe un volumen determinado de hidrogel para ser inyectado; un apósito capaz de suministrar al menos un agente funcional y/o capaz de drenar una herida, y un parche capaz de suministrar al menos un agente funcional, como la nicotina.
Dicho agente funcional es en particular un agente bioactivo.
La presente invención tiene por objeto, según un cuarto aspecto, un dispositivo que permite la puesta en práctica del método según una cualquiera de las variantes según un primer aspecto de la invención para la fabricación de un hidrogel, que comprende una primera jeringa que recibe la mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B) obtenidos al final de la etapa (ii) y una segunda jeringa que recibe un volumen determinado de un medio acuoso acidificado que comprende al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C), dicho dispositivo que comprende un miembro de conexión fluida entre la primera y la segunda jeringas dispuesto de forma que permita mezclar el medio acuoso acidificado que comprende al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C) con dicha mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B).
Dicho miembro de conexión fluida está unido de forma desmontable o no a la primera jeringa y a la segunda jeringa, preferentemente es un miembro desmontable.
Ventajosamente, la primera y la segunda jeringas están en conexión fluida en sus extremos de inyección a través de un miembro de conexión fluida (por ejemplo, conectores tipo Lueur) que permite introducir, con la ayuda del émbolo de la segunda jeringa, el medio acuoso acidificado que comprende al menos el compuesto (C) en la primera jeringa, y viceversa a través del émbolo de la primera jeringa.
Los pistones se accionan múltiples veces hasta que se forma un hidrogel, el cizallamiento generado promueve la disolución del polvo de quitosano y las interacciones iónicas con el polímero aniónico para provocar la formación de un hidrogel estable y firme.
La presente invención tiene por objeto, según un quinto aspecto, un hidrogel que puede obtenerse implementando el método de fabricación según cualquiera de las variantes de realización con referencia al primer aspecto según la invención, que comprende ventajosamente:
- un polímero de ciclodextrina (A) obtenido mediante la reacción de polimerización de una mezcla que comprende al menos una ciclodextrina y/o al menos un derivado de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión derivado de ciclodextrina, con
- al menos un ácido (poli)carboxílico y/o su correspondiente anhídrido de ácido (poli)carboxílico (A1); o
- al menos un pirofosfato (A2); o
- al menos epiclorhidrina, el polímero obtenido se somete entonces a una etapa de carboximetilación para injertar funciones ácido carboxílico (-COOH) (A3), y
- quitosano (B) con funciones amina (NH2).
Preferentemente, el polímero de ciclodextrina pertenece a la familia (A1).
En una alternativa, el polímero aniónico (A) contiene funciones ácido carboxílico (-COOH).
En una alternativa, el polímero aniónico (A) comprende al menos 3 mmol/g de funciones ácido carboxílico (COOH).
Preferentemente, las variantes de realización y las definiciones descritas anteriormente con referencia a cualquiera de los aspectos uno a cuatro que caracterizan al hidrogel se aplican independientemente al hidrogel según un quinto aspecto de la invención.
Descripción detallada de las figuras
- Las Figuras 1A y 1B representan un hidrogel que se ha obtenido por un método diferente al método de fabricación de un hidrogel según la invención;
- Las Figuras 2A y 2B representan un hidrogel obtenido por el método de fabricación;
- La Figura 3 muestra las curvas de los módulos elásticos G' de los materiales alveolares según la invención; - La Figura 4 es un histograma que representa en la ordenada la cantidad de ciprofloxacina (CFX) absorbida en mg por g de diferentes materiales alveolares;
- La Figura 5 es un gráfico que representa las curvas de liberación de ciprofloxacina frente al tiempo de diferentes materiales alveolares correspondientes a los referidos en la Figura 4;
- La Figura 6 muestra los gráficos de la evolución de los módulos elásticos y viscosos G' y G" de un ejemplo de hidrogel según la invención frente al tiempo (minutos) y de dos tensiones A y B aplicadas alternativamente; - Las Figuras 7 y 8 son fotografías que representan los hidrogeles según la invención 1 hora y 24 horas después de su formación, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se entenderá mejor leyendo los ejemplos de realización que se describen a continuación y que se citan sin limitación.
Se utilizan los siguientes compuestos:
- Quitosano en polvo (CHT1): "Chitosan - Medium molecular weight" (Mw medio: 431.000 g/mol) vendido por Sigma Aldrich, número de caso: 9012-76-4, en forma de polvo, la viscosidad es de 563,00 cps a una concentración del 1 % en ácido acético al 1 %, el grado de desacetilación es superior o igual al 75 %, en particular alrededor del 75 %.
- Quitosano en polvo (CHT2): "Chitosan - Low molecular weight" (Mw bajo: 39.000 g/mol) vendido por Sigma Aldrich, número de caso: 9012-76-4, en forma de polvo y/o gránulos, la viscosidad es de 96 cps a una concentración del 1 % en ácido acético al 1 %, el grado de desacetilación es superior o igual al 75 %.
- Quitosano en polvo (CHT3): "Chitosan - High molecular weight" (Mw alto: 1.250.000 g/mol) vendido por BioResources, número de caso: 9012-76-4, en polvo y/o granulado, el grado de desacetilación es superior o igual al 75 %.
- Polímero de ciclodextrina: el polímero se sintetiza de la siguiente manera: 400 g de p-ciclodextrina (Kleptose®, Roquette Fréres, Lestrem, Francia), 400 g de ácido cítrico CAS 77-92-9, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia), y 120 g de hipofosfito de sodio (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) se disuelven en 2 litros de una solución acuosa (agua destilada). A continuación, el agua de esta solución acuosa se evapora en seco al vacío a 60 °C bajo 58 mm de mercurio en un evaporador rotatorio durante un tiempo suficiente para obtener una mezcla sólida. A continuación, el residuo sólido de la evaporación se calienta al vacío a 140 °C durante 120 minutos. A continuación, la mezcla sólida se suspende en 2 litros de agua destilada. Esta suspensión se filtra a través de un vidrio sinterizado. El polímero insoluble se recupera en el filtro, que se lava abundantemente con agua y se seca a temperatura ambiente durante una semana (también podría secarse, por ejemplo, en un horno ventilado a 60 °C durante 24 horas). El filtrado que contiene el polímero soluble se dializa en una membrana de 6000-8000 Dalton durante 5 días, y a continuación la solución de diálisis se concentra utilizando un evaporador rotatorio. El filtrado purificado se congela y a continuación se liofiliza, en este caso utilizando un liofilizador Christ modelo Alpha 1-2/LD, a una temperatura de -63 °C, bajo vacío a 0,06 mbar, durante el tiempo suficiente para obtener un sólido en forma de polvo. Como alternativa a la liofilización, el filtrado purificado también puede atomizarse, por ejemplo, con el atomizador Büchi B-290.
El resultado es 71 g de polímero de ciclodextrina soluble (CDs1) y 320 g de polímero de ciclodextrina insoluble (Cdi1).
- Ácido poli(acrílico) (PAA): Código de producto (323667-250G) Mw = 1800 y Mw = 450.000 suministrado por Sigma Aldrich®.
- Alginato de sodio: código de producto (180947-500G), lote (09611DD), Sigma Aldrich®.
- Pectina de manzana (éster metílico del ácido D-galacturónico): código de producto (75282-500G), lote (BCBG 4396V), Sigma Aldrich®.
- Ácido láctico: Número de caso 50-21-5, que comprende entre el 85 % y el 90 % en masa de ácido láctico en relación con el volumen total de la solución, grado de reactivo ACS, Sigma Aldrich®.
I - Descripción del procedimiento de dosificación de la CII (capacidad de intercambio iónico) del polímero de ciclodextrina (Cds1 o Cdi1), es decir, la medición del número de funciones ácido carboxílico (-COOH) en milimoles por gramo de polímero de ciclodextrina:
Se disuelven 100 mg de polímero (CDs1 o Cdi1) en 100 ml de solución de NaCl 0,1 M y se determinan con una solución convencional de hidróxido de sodio 0,1 M en presencia de fenolftaleína como indicador de color. La CII actual es de unos 4 mmol por gramo de polímero (CDs1 o Cdi1); esta cifra se aproxima bastante a la del quitosano, que tiene unos 5 mmol de funciones amínicas por gramo (para un grado de desacetilación de aproximadamente el 80 %). El fenómeno de gelificación está vinculado a la proximidad de las CII del quitosano y del polímero de ciclodextrina (según la familia A1), y está relacionado con las proporciones de quitosano y de polímero de ciclodextrina reunidas para formar el gel.
II - Ejemplos de preparación de hidrogeles según la invención y ejemplos comparativos
Las proporciones indicadas en p/p representan la relación entre la masa del componente añadido y la masa total del hidrogel, es decir, al final de la cuarta etapa o etapa (v) del método según la invención.
Ejemplo 1: 0,04 g de quitosano (CHT1) (2 % en p/p) y 0,05 g (2,5 % en p/p) del polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,89 g de agua ultrapura y se mezcló en un vórtex durante 15 segundos (el pH instantáneo de la solución fue de 3,5, con un aumento hasta 4,1). A continuación, se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético glacial a la suspensión (el pH baja con la adición del ácido hasta 3,2 y a continuación sube por encima de 5) que se mezclará con el vórtex durante 20 segundos. Se obtiene un gel compacto desde los primeros segundos durante la agitación. El hidrogel obtenido comprende un 89 % de agua.
Ejemplo 2: 0,04 g (2 % en p/p) de quitosano (CHT1) y 0,06 g (3 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,88 g de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. Se obtiene un gel compacto desde los primeros segundos durante la agitación. El hidrogel obtenido comprende un 72 % de agua. Ejemplo 3: 0,04 g (2 % en p/p) de quitosano (CHT1) y 0,20 g (10 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,74 g de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. Se obtiene un gel compacto desde los primeros segundos durante la agitación. El hidrogel obtenido comprende un 60 % de agua. Ejemplo 4: 0,05 g (2,5 % en p/p) de quitosano (CHT1) y 0,06 g (3 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,87 g de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. Se obtiene un gel compacto desde los primeros segundos durante la agitación. El hidrogel obtenido está compuesto por un 93 % de agua.
Ejemplo 5: 0,02 g (1 % en p/p) de quitosano (CHT1) y 0,04 g (2 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,92 g de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético al 1 % a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. El gel obtenido no es compacto y tiene tendencia a gotear lentamente.
Ejemplo 6: 0,06 g (3 % en p/p) de quitosano (CHT1) y 0,04 g (2 % en p/p) de copolímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,88 g de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético al 1 % a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. El gel que se obtiene durante los primeros segundos de agitación es muy compacto, no gotea y se puede moldear.
Ejemplo 7: 0,04 g (2 % en p/p) de quitosano (CHT1) y 0,02 g (1 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,92 g de agua ultrapura y se mezcló con el vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético al 1 % a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. El gel obtenido tiende a gotear.
Ejemplo 8: 0,06 g de quitosano (CHT1) (3 % en p/p) y 0,06 g (3 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,86 g de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 20 segundos. Desde los primeros segundos se forma un gel compacto durante la agitación, homogéneo y que no gotea por gravedad.
Ejemplo 9: 0,06 g de quitosano (CHT1) (3 % en p/p) y 0,1 g (5 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. El polvo resultante se suspendió en 1,82 g de agua ultrapura y se mezcló en el vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,02 g de una solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezcló en el vórtex durante 20 segundos. Desde los primeros segundos se forma un gel compacto durante la agitación, homogéneo y que no gotea por gravedad.
Ejemplo 10: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el quitosano es el de la referencia CHT2.
Ejemplo 11: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el quitosano es el mismo que el CHT3. En los Ejemplos 10 y 11, el hidrogel resultante es firme, compacto y homogéneo. No gotea si el recipiente se pone boca abajo.
Ejemplo 12: Igual que el Ejemplo 8 con la diferencia de que la cantidad de quitosano es del 3 % en p/p y la cantidad de polímero de ciclodextrina (CDs1) es del 10 % en p/p. El hidrogel obtenido es firme y compacto, pero más viscoso y espeso que los otros hidrogeles ejemplificados según la invención.
Ejemplo comparativo 13: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el polímero de ciclodextrina (CDs1) se sustituye por un monómero comercial de sal sódica de carboximetil-p-ciclodextrina (Aldrich, referencia 21906). El hidrogel obtenido gotea si el envase se pone boca abajo y no es firme.
Ejemplo 14: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el polímero de ciclodextrina (CDs1) se sustituye por un polímero de ácido poliacrílico de Mw 1800 (referenciado anteriormente).
Ejemplo 14A: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el polímero de ciclodextrina (CDs1) se sustituye por pectina (referenciada anteriormente).
Ejemplo 14B: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el polímero de ciclodextrina (CDs1) se sustituye por alginato de sodio (referenciado anteriormente).
La Figura 7 muestra los hidrogeles de los Ejemplos 8, 14, 14A y 14B, una hora después de su formación.
La Figura 8 muestra los hidrogeles de los Ejemplos 8, 14, 14A y 14B después de 24 horas. Se puede observar que los hidrogeles formados a partir de estos polianiones son firmes y no gotean ni siquiera 24 horas después de su formación.
Ejemplo 15: Igual que el Ejemplo 8, salvo que el polímero de quitosano se sustituye por un polímero de ácido poliacrílico de alto peso molecular (Mw: 450.000, referido anteriormente). Los hidrogeles de los Ejemplos 14 y 15 obtenidos son firmes y no gotean.
Ejemplo 16 de control: idéntico al Ejemplo 8, salvo que el polímero de ciclodextrina utilizado se sintetiza sustituyendo la p-ciclodextrina por maltodextrina (de índice de equivalencia de dextrosa D19 (19 unidades de repetición), que se comercializa bajo la marca Glucidex® D19 de Roquette, cuya estructura molecular lineal no forma una cavidad). El gel formado es firme y no gotea.
Ejemplo 17 de comparación: 0,3 g de quitosano (CHT1) (3 % en p/p), triturado y tamizado en un tamiz con orificios de 125 |jm, se solubiliza en un volumen de 9,3 ml de agua ultrapura (93 % en p/p) al que se le añaden 0,1 ml de ácido acético glacial (1 % en p/p), el conjunto se mezcla a aproximadamente 10.000 rpm utilizando un homogeneizador tipo ultra turrax® durante un minuto. A continuación, se añaden 0,3 g del polímero de ciclodextrina (CDs1 (3 % en p/p)), también molido y tamizado en un tamiz con orificios de 125 jm , a la solución ácida de quitosano (CHT1), y se mezcla la solución a aproximadamente 10.000 rpm utilizando un homogeneizador de tipo ultra-turrax® durante 1 minuto. El tiempo de gelificación medido a partir de los valores de G' y G" es superior a 5 días. El gel formado es "líquido", tiene grumos, no es homogéneo y no es apto para el moldeo (gotea por la acción de la gravedad). Por tanto, la adición del polímero aniónico (CDs1) a una solución ácida de quitosano no da lugar a un hidrogel limpio, firme y compacto. El hidrogel resultante se muestra en las Figuras 1A y 1B. Se puede observar que en el frasco en el que se sintetizó en la Figura 1A, el hidrogel gotea por las paredes, por lo que no es firme. En la Figura 1B, el hidrogel no conserva la forma de perla que se le dio cuando se depositó sobre una superficie horizontal con una jeringa.
Ejemplo comparativo 18: 0,3 g de polvo de quitosano (CHT1) (3 % en p/p), sin tamizar y sin moler, y 0,3 g de polvo de polímero de ciclodextrina (CDs1), sin tamizar y sin moler, se someten a una molienda conjunta en seco para reducir el tamaño de sus partículas y mezclarlos. La mezcla de polvo molida conjuntamente se añade a 9,3 ml de agua ultrapura (93 % en p/p), la solución acuosa resultante se mezcla en vórtex durante 20 segundos, y a continuación se añaden 0,1 ml (1 % en v/v) de una solución de ácido acético glacial. El tiempo de gelificación medido a partir de los valores de G' y G" es superior a 2,5 horas. La firmeza del hidrogel es correcta pero tiene grumos.
Ejemplo comparativo 19: 0,3 g de polvo de quitosano (CHT1) (3 % en p/p), molido y tamizado en un tamiz con orificios de 125 jm , y 0,3 g de polvo de copolímero de ciclodextrina (CDs1) (3 % en p/p), molido y tamizado en un tamiz con orificios de 125 jm , se muelen conjuntamente en seco. La mezcla de polvo molida conjuntamente se suspende en 9,3 ml de agua ultrapura (93 % en p/p) bajo agitación a unas 10.000 rpm utilizando un homogeneizador tipo ultra-turrax® durante 20 segundos. A continuación, se añadieron 0,1 ml (1 % en v/v) de una solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezclará bajo agitación a aproximadamente 10.000 rpm utilizando un ultra-turrax® durante 20 segundos. El tiempo de gelificación medido a partir de los valores de G' y G" es superior a 2,5 horas. El gel formado tiene una buena textura, es liso, homogéneo y firme, es decir, no gotea bajo la acción de la gravedad y será adecuado para moldearlo en una forma determinada. Este hidrogel se muestra en las Figuras 2A y 2B. En la Figura 2A se puede observar que el hidrogel no gotea en las paredes del frasco en el que se hizo, una vez que se ha volcado y está firme. En la Figura 2B, se puede observar que el hidrogel conserva su forma de cordón, que le fue impartida al salir de la jeringa. También se nota que es homogéneo, liso y no gotea.
Los tiempos de gelificación medidos para los Ejemplos 17, 18 y 19 se obtienen de las curvas de los módulos elásticos y viscosos G' y G" establecidas frente al tiempo, con una tensión del 100 %, una amplitud gamma del 100 % y una frecuencia angular omega de 10 s-1 a una temperatura de 25 °C utilizando un espectrómetro mecánico dinámico, como los comercializados por Anton Paar. Ejemplo 20: 0,3 g de quitosano (CHT1) (3 % en p/p), 0,3 g (3 % en p/p) de polímero de ciclodextrina (CDs1) y 0,3 g de hidroxiapatita (3 % en p/p), es decir, el 33,3 % del peso total de la mezcla de polvo seco, se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. La mezcla de polvo resultante se suspendió en 9 ml de agua ultrapura y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,01 ml (0,1 % en p/p) de solución de ácido acético glacial a la suspensión, que se mezcló con el vórtex durante 45 segundos. Se obtiene un gel compacto y homogéneo que no gotea por efecto de la gravedad.
Ejemplos con un medio acuoso que incluya glucosa
Ejemplo 27: 0,3 g de quitosano (CHT1) (3 % en p/p), 0,3 g (3 % en p/p) del polímero de ciclodextrina (CDs1) y 0,3 g de hidroxiapatita (3 % en p/p), es decir, el 33,3 % del peso total de la mezcla de polvo seco, se molieron conjuntamente en un mortero durante 1 minuto. La mezcla de polvo obtenida se suspendió en 9 ml de un medio acuoso que contenía un 5 % en peso de glucosa sobre el volumen de dicho medio acuoso y se mezcló con un vórtex durante 15 segundos. A continuación se añadieron 0,1 ml de una solución de ácido láctico concentrada entre el 85 % y el 90 % a la suspensión que se mezcló con un vórtex durante 45 segundos. El gel se inyecta como una perla utilizando una jeringa en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) y PBS. El cordón formado es firme (se puede manipular con una espátula) y estable (hasta una hora después de la formación).
Ejemplo 28: Se trata del mismo ejemplo que el Ejemplo 27, con la diferencia de que la mezcla de los polvos se realiza con el medio acuoso que comprende un 5 % en peso de glucosa en relación con el volumen de dicho medio, que ya está acidificado con ácido láctico, utilizando un dispositivo que comprende una primera jeringa que recibe la mezcla de los polvos y una segunda jeringa que comprende dicho volumen del medio acuoso acidificado que comprende glucosa y un miembro para poner en conexión fluida dichas primera y segunda jeringas. Dichas primera y segunda jeringas están en conexión fluida, permitiendo así que el medio acuoso acidificado pase a través de la mezcla de polvos y viceversa. Esta disposición genera un cizallamiento durante la mezcla de los polvos y el medio acuoso, promoviendo así la formación de un hidrogel. A continuación, el gel formado se inyecta en forma de perla con la ayuda de dicho dispositivo (manteniendo solo la primera o segunda jeringa) en medio DMEM y en un medio fisiológico de tipo PBS. La firmeza y la estabilidad del cordón han mejorado en comparación con el Ejemplo 27.
Ejemplo 29: Se trata del mismo ejemplo que el Ejemplo 28, con la diferencia de que el ácido láctico se sustituye por ácido clorhídrico (0,036 M). A continuación, el gel formado se inyecta en forma de cordón utilizando dicho dispositivo en un medio DMEM y en un medio fisiológico como el PBS. La firmeza y la estabilidad del cordón mejoran en comparación con el Ejemplo 27, pero son menores que las obtenidas en el Ejemplo 28.
III - Fabricación de un material alveolar según la invención
Ejemplo 21: El hidrogel del Ejemplo 8 se sometió a una etapa de liofilización para formar un material alveolar esponjoso, como una espuma, utilizando un liofilizador Christ modelo Alpha 1-2/LD a una temperatura de -63 °C, bajo vacío a 0,06 mbar, durante al menos 24 horas. La tasa de hinchamiento es del 1739,0 % en agua a temperatura ambiente después de 6 horas y del 445,0 % en PBS (tampón fosfato salino, pH 7,4, 0,1 M) a temperatura ambiente después de 6 horas ([(peso húmedo - peso seco)/peso seco] x 100).
Ejemplo 22: El hidrogel del Ejemplo 9 se ha sometido a una etapa de liofilización para formar un material alveolar utilizando un liofilizador Christ modelo Alpha 1-2/LD a una temperatura de -63 °C, bajo vacío a 0,06 mbar, durante al menos 24 horas. La tasa de hinchamiento es del 262,0 % en agua a temperatura ambiente después de 6 horas y del 336,0 % en PBS (tampón fosfato salino, pH 7,4, 0,3 M) a temperatura ambiente después de 6 horas ([(peso húmedo - peso seco)/peso seco] x 100).
Ejemplo 23: El material alveolar del Ejemplo 21 se trata térmicamente colocándolo en una cámara a 140 °C durante 1 hora. Este tratamiento térmico reticula el material alveolar transformando los enlaces iónicos en enlaces covalentes, en particular en enlaces amida. Se observa entonces que la resistencia a la compresión, es decir, la resistencia al aplastamiento, del material alveolar mejora muy significativamente. Esto puede observarse visualmente cuando al apretar el material alveolar del Ejemplo 23 entre dos dedos, el material alveolar recupera casi instantáneamente su forma tras la eliminación de la deformación en contraste con el material alveolar de los Ejemplos 21 o 22. La Figura 3, que muestra las curvas del módulo elástico G' de los Ejemplos 22 y 21, muestra que el módulo elástico tratado térmicamente G' del Ejemplo 23 es significativamente mayor que el módulo elástico G' del Ejemplo 21.
Ejemplo 24: Igual que el Ejemplo 21, salvo que el hidrogel se sintetizó con un 10 % (p/p) del polímero de ciclodextrina (CDs1).
Ejemplo 25 de control: El hidrogel del Ejemplo 16 se ha sometido a una etapa de liofilización para formar un material alveolar.
Ejemplo 26: El hidrogel del Ejemplo 20 se liofilizó utilizando un liofilizador Christ modelo Alpha 1-2/LD a una temperatura de -63 °C, bajo vacío a 0,06 mbar, durante al menos 24 horas para formar un material alveolar que contiene hidroxiapatita (33,3 % en p/p).
IV - Medición de la citocompatibilidad
La citocompatibilidad del hidrogel del Ejemplo 8 y de los materiales alveolares de los Ejemplos 21 y 22 se ha analizado según la norma ISO 10993-5:2009 - Evaluación biológica de dispositivos médicos -- Parte 5: Ensayos de citotoxicidad in vitro. El método de viabilidad celular se realiza por el método azul alamar - prueba de extracción - células L132 (ATCC-CCL5).
La viabilidad medida para el Ejemplo 8 es del 80 % después de 1 hora y es del 84 % después de enjuagar durante 1 hora en PBS (tampón fosfato salino, pH 7,4, 0,1 M). La viabilidad medida para el Ejemplo 21 es del 91 % y es del 85 % para el Ejemplo 24 después de 1 hora.
La citotoxicidad se midió según la misma norma descrita anteriormente con las células MC3T3, el control es TCPS (poliestireno para el cultivo de tejidos). Se obtiene un valor para el Ejemplo 28 de alrededor del 90 %, mientras que este valor cae por debajo del 60 % (alrededor del 55 %) cuando el medio acuoso no incluye glucosa. Ventajosamente, cuando el medio acuoso incluye glucosa, la citotoxicidad mejora claramente.
V - Impregnación de materiales alveolares
40 mg de los materiales alveolares de los Ejemplos 21, 22, 24 y 25 se impregnan en una solución acuosa de 2 mg/ml de ciprofloxacina a temperatura ambiente con agitación a 250 rpm durante 4 horas.
Los materiales alveolares así tratados se ponen durante 24 horas en una solución de sosa 0,1N a 37 °C para extraer la ciprofloxacina adsorbida. Las soluciones resultantes se valoran con un espectrofotómetro UV a una longitud de onda de 271 nm para medir la cantidad de ciprofloxacina absorbida (mg/g) para cada uno de los materiales alveolares. Las curvas de absorción obtenidas se muestran en la Figura 4. Las barras verticales de cada histograma representan las desviaciones típicas. Se puede observar que la desviación típica del Ejemplo 25, basado en maltodextrina, es superior que la medida para los otros ejemplos basados en ciclodextrinas. Esto demuestra que la tasa de carga del principio activo es más aleatoria si la dextrina utilizada no tiene una cavidad hidrófoba, y por lo tanto no forma un complejo de inclusión. Los Ejemplos 21,22 y 24 indican que la capacidad de adsorción de los hidrogeles obtenidos a partir de polímeros de ciclodextrina varía en función de los parámetros de preparación del hidrogel, aunque las diferencias no son significativas.
Se estudian las condiciones de liberación de la ciprofloxacina en un circuito cerrado inyectando una corriente de PBS a una temperatura de 37 °C a 30 ml/min desde un depósito de 500 ml de PBS en 30 mg de material alveolar impregnado de ciprofloxacina. El flujo de PBS que sale del material alveolar se hace pasar por un espectrofotómetro UV (longitud de onda de 271 nm) que mide la cantidad de ciprofloxacina liberada, dicho flujo que a continuación se redirige al depósito de PBS. La tasa de liberación de ciprofloxacina (%) se mide en relación con la tasa de absorción medida previamente y se muestra en la Figura 4. Las curvas de la tasa de liberación de ciprofloxacina, mostradas en la Figura 5, muestran una diferencia muy significativa en el perfil de liberación de la ciprofloxacina, que es muy rápido para el polímero a base de maltodextrina (Ejemplo 25), y más lento para los materiales alveolares de los Ejemplos 21, 22 y 24.
VI - Propiedades reofluidificantes del hidrogel según la invención (Ejemplo 8)
Especificaciones del instrumento de medición utilizado: Reómetro (MCR301-Anton-Paar):
Tabla 1
Figure imgf000019_0001
El gráfico de la Figura 6 muestra la evolución de los módulos elástico y viscoso G' y G" del hidrogel del Ejemplo 8 sometido a dos ciclos de tensiones A y B; a t0, G' (230 Pa) > G" (130 Pa) y la tensión A aplicada durante 45 minutos provoca una disminución de G' hasta que su valor vuelve a unirse al de G". La detención de la tensión A seguida de la aplicación inmediata de la tensión B provoca un aumento instantáneo de G' que vuelve a un valor cercano al del inicio del experimento (200 Pa). Después 5 minutos de tensión B, se vuelve a aplicar la tensión A y G' vuelve a su valor mínimo. La alternancia de las tensiones A y B a lo largo de 5 minutos durante 3 ciclos sucesivos muestra una variación reversible del módulo G', lo que indica que el hidrogel presenta un comportamiento viscoso o elástico en función de la tensión aplicada. Esta característica es la de un material que presenta un comportamiento reofluyente (y por tanto tixotrópico). Mediante esta medida, se demuestra que el hidrogel tiene las propiedades necesarias para ser considerado inyectable, es decir, aplicable mediante una jeringa: al empujar el émbolo de la jeringa, el gel se fluidifica en la aguja o el catéter por la acción de las fuerzas de cizallamiento, y una vez en el lugar de su implantación (defecto óseo, por ejemplo), el hidrogel se congela de nuevo y recupera la cohesión suficiente para permanecer en su sitio.
VII - Análisis mecánico termodinámico (AMTD) del material alveolar de los Ejemplos 21 y 23
Especificaciones del instrumento: Reómetro (MCR301-Anton-Paar).
Tabla 2
Figure imgf000020_0001
Características de la muestra analizada por AMTD y resultados del AMTD:
Tabla 3
Figure imgf000020_0002
La Tabla 3 anterior muestra los resultados viscoelásticos de los materiales alveolares (como las esponjas) de los Ejemplos 21 y 23. Tras 20 minutos de análisis a 25 °C, se observa sistemáticamente que el módulo elástico (G') es mayor que el módulo viscoso (G''), demostrando así que los materiales alveolares de los Ejemplos 21 y 23 presentan un comportamiento elástico. También puede verse que los valores de ambos módulos G' y G" en el Ejemplo 23 son significativamente mayores que los del Ejemplo 21. El tratamiento térmico aplicado en el Ejemplo 23 mejora así el rendimiento mecánico del material alveolar. Por lo tanto, se puede concluir que durante esta etapa de tratamiento térmico se ha modificado el comportamiento intramolecular, probablemente debido a transformaciones de enlaces iónicos en enlaces covalentes, lo que da al material alveolar del Ejemplo 23 cierta rigidez.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método de fabricación de un hidrogel, caracterizado por que comprende las siguientes etapas en sucesión:
- una primera etapa (i) que consiste en proporcionar al menos un polvo de un polímero aniónico (A) y al menos un polvo de quitosano (B) que comprende funciones amina (-NH2);
- una segunda etapa (ii) que consiste en mezclar en seco al menos los polvos (A) y (B) de la primera etapa para formar una mezcla de polvos;
- una tercera etapa (iii) que consiste en suspender la mezcla de polvos obtenida a partir de la segunda etapa en un medio acuoso con un pH que pueda permitir la disolución del polímero aniónico (A) sin disolver el quitosano (B) - una cuarta etapa (iv) de adición de un ácido a la suspensión obtenida en la tercera etapa para formar el hidrogel; o
las etapas tercera (iii) y cuarta (iv) se sustituyen por una quinta etapa de mezcla (v), que comprende mezclar un medio acuoso acidificado que incluye al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C), con dicha mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B) obtenidos de la segunda etapa (ii).
2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado por que el polvo (A) y/o el polvo (B) de la primera etapa y/o la mezcla de polvos que comprende al menos los polvos (A) y (B) de la segunda etapa se tamiza(n) sobre un tamiz con una malla inferior o igual a 500 |jm, en particular inferior o igual a 150 |jm.
3. Un método según la reivindicación 1 y la reivindicación 2, caracterizado por que la mezcla de la segunda etapa se lleva a cabo mediante la molienda conjunta en seco de al menos los polvos (A) y (B).
4. Un método según cualquier reivindicación anterior, caracterizado por que el polímero aniónico comprende funciones sulfato ácidas (-O-S(=O)2-OH o -SO4H) y/o sales de dichas funciones sulfato ácidas, y/o funciones ácido sulfónico (-S(=O)2-OH o -SO3H) y/o sales de dichas funciones ácido sulfónico, y/o funciones ácido fosfórico (-O-P(=O)2-OH o -PO4H) y/o sales de dichas funciones ácido fosfórico, y/o funciones ácido carboxílico (-COOH) y/o sales de dichas funciones ácido carboxílico.
5. Un método según cualquier reivindicación anterior, caracterizado por que el polímero aniónico (A) es un polímero de ciclodextrina obtenido por una reacción de polimerización de una mezcla que comprende al menos una ciclodextrina y/o al menos un derivado de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión de un derivado de ciclodextrina, con
- al menos un ácido (poli)carboxílico y/o su correspondiente anhídrido de ácido (poli)carboxílico (A1); o
- al menos un pirofosfato (A2); o
- al menos una epiclorhidrina, sometiendo el polímero obtenido a una etapa de carboxialquilación de manera que se injerten funciones ácido carboxílico (A3).
6. Un método según cualquier reivindicación anterior, caracterizado por que el medio acuoso en la etapa (iii) o en la etapa (v) comprende al menos un 1 % en peso, preferentemente al menos un 4 % en peso, de al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa, y/o de al menos un fosfato de dicho compuesto (C), en relación con el volumen total de dicho medio acuoso.
7. Un método según cualquier reivindicación anterior, caracterizado por que comprende añadir al menos una carga mineral en forma de polvo a la mezcla de polvos producida durante la segunda etapa, siendo la proporción del peso (g) de la cara(s) mineral(es) con respecto al peso total de la mezcla de polvos preferentemente del 30 % o más.
8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado por que dicha carga mineral se selecciona de la lista que comprende: biocerámicos, en particular fosfatos de calcio como hidroxiapatita, beta-trifosfato de calcio, carbonato de calcio; alúmina (AbO3), circonio (ZrO2), vidrios, ionómero de vidrio, dióxido de titanio, y sus mezclas.
9. Un método de fabricación de un material alveolar, caracterizado por que comprende un método de fabricación de un hidrogel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para obtener el hidrogel y por que comprende además una etapa de liofilización realizada sobre el hidrogel obtenido a partir de la cuarta etapa (iv) o de la quinta etapa (v) para formar un material alveolar.
10. Un método de fabricación de un material alveolar según la reivindicación 9, caracterizado por que se añade un agente formador de poros en forma de polvo a la mezcla de polvos durante la segunda etapa (ii) del método de fabricación del hidrogel.
11. Un método de fabricación de un material alveolar según la reivindicación 9 y la reivindicación 10, caracterizado por que incluye una etapa de tratamiento térmico que consiste en tratar el material alveolar a una temperatura superior o igual a 100 °C, durante al menos 5 minutos.
12. Un método de fabricación de un material alveolar según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado por que comprende una etapa de impregnación del material alveolar en una solución que comprende al menos un agente funcional y/o al menos una célula viva, y por que dicho agente funcional se selecciona de una primera lista (I) que comprende anticoagulantes, antitrombóticos, antimitóticos, agentes antiproliferación, agentes antiadhesión, agentes antimigración, promotores de la adhesión celular, factores de crecimiento, moléculas antiparasitarias, agentes antiinflamatorios, vitaminas, hormonas, proteínas, antifúngicos, moléculas antimicrobianas, antisépticos, antibióticos, en particular ciprofloxacina, nicotina, uno o más aceites esenciales, y una de sus mezclas; y dicha al menos una célula viva se selecciona de una segunda lista (II) que comprende células humanas, animales y vegetales.
13. Un dispositivo para absorber y drenar y/o para liberar un agente funcional y/o para soportar células vivas, que comprende el hidrogel obtenido mediante la realización del método descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o el material alveolar obtenido mediante la realización del método descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado por que dicho dispositivo es un dispositivo seleccionado entre: una jeringa que comprende al menos un depósito que recibe un volumen predeterminado de hidrogel; un apósito que es capaz de suministrar al menos un agente funcional y/o capaz de drenar una herida; un parche que es capaz de suministrar al menos un agente funcional como la nicotina.
14. Un dispositivo para llevar a cabo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un hidrogel, que comprende una primera jeringa, dicha primera jeringa que comprende la mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B) obtenidos de la etapa (ii) y una segunda jeringa que comprende un volumen predeterminado de un medio acuoso acidificado que comprende al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C), dicho dispositivo que comprende un medio para poner la primera y la segunda jeringas en comunicación fluida, de manera que se permita que la mezcla acuosa acidificada que comprende al menos un compuesto (C) que comprende al menos una unidad de una hexosa o una unidad derivada de una hexosa y/o al menos un fosfato de dicho compuesto (C) se combine con dicha mezcla que comprende al menos los polvos (A) y (B).
15. Un hidrogel que se puede obtener realizando el método de fabricación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que comprende
- un polímero de ciclodextrina (A) obtenido por una reacción de polimerización de una mezcla que comprende al menos una ciclodextrina y/o al menos un derivado de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión de ciclodextrina y/o al menos un complejo de inclusión de un derivado de ciclodextrina, con
- al menos un ácido (poli)carboxílico y/o su correspondiente anhídrido de ácido (poli)carboxílico (A1); o
- al menos un pirofosfato (A2); o
- al menos una epiclorhidrina, sometiendo el polímero obtenido a una etapa de carboxialquilación de manera que se injerten funciones ácido carboxílico (-COOH) (A3); y
- un polímero de quitosano (B) que comprende funciones amina (NH2).
ES16750922T 2015-07-02 2016-07-01 Método para la producción de hidrogeles a base de quitosano y polielectrolitos cargados negativamente y material poroso alveolar obtenido a partir de dicho hidrogel Active ES2854712T3 (es)

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