ES2229421T3 - Dispositivo y procedimiento para obtener relacion de analitos clinicamente significativas. - Google Patents
Dispositivo y procedimiento para obtener relacion de analitos clinicamente significativas.Info
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Abstract
SE EXPONE UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION DE UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE FLUIDO CORPORAL. EL PROCEDIMIENTO REPRESENTA PONER EN CONTACTO LA MUESTRA DE FLUIDO CORPORAL CON UNA TIRA DE ENSAYO QUE CONTIENE UN COADYUVANTE DE FIJACION ESPECIFICO, MARCADO Y MOVIL DEL ANALITO, A TRAVES DE CUYA TIRA PUEDEN FLUIR POR CAPILARIDAD EL FLUIDO DE ENSAYO, EL ANALITO Y CUALQUIER COMPLEJO FORMADO POR INTERACCION DEL ANALITO Y EL COADYUVANTE DE FIJACION ESPECIFICO Y MARCADO. LA TIRA CONTIENE AL MENOS UNA ZONA PARA CAPTAR EL COADYUVANTE ESPECIFICO DE FIJACION MARCADO Y AL MENOS UNA ZONA SEPARADA PARA LA RETENCION DEL COMPLEJO DE COADYUVANTE DE FIJACION ESPECIFICO MARCADO/ANALITO. A TRAVES DE LA DETERMINACION DE LA MAGNITUD DE LA SEÑAL PROCEDENTE DE LA MARCA DETECTABLE EN LA ZONA O ZONAS DE CAPTURA Y LA ZONA O ZONAS DE RETENCION, Y LA DETERMINACION DE LA SEÑAL FINAL DE RESPUESTA, POR CORRELACION DE LAS SEÑALES CON EL USO DE UN ALGORITMO Y EL NUMERO DE ZONAS ELEGIDAS DE MANERA QUE PROPORCIONELA SEÑAL FINAL DE RESPUESTA MAS ADECUADA AL ENSAYO CONCRETO, SE PUEDE DETERMINAR CON MAYOR PRECISION LA CONCENTRACION DEL ANALITO.
Description
Dispositivo y procedimiento para obtener
relaciones de analitos clínicamente significativas.
Los formatos de tira inmunocromatográfica se han
hecho crecientemente populares para ensayos cualitativos y
semicualitativos que usan esquemas de detección visual. Este tipo
de inmunoensayos implica la aplicación de una muestra de ensayo
líquida sospechosa de contener un analito a detectadar para una
zona de aplicación de una tira de ensayo inmunocromatográfica. La
tira está compuesta por un material de matriz a través del cual el
fluido y analito de ensayo suspendidos o disueltos en él pueden
fluir por capilaridad desde la zona de aplicación a una zona de
captura donde una señal detectable, o la ausencia de tal, revela la
presencia del analito. Típicamente, la tira incluirá medios para
ensayar inmunoespecíficamente el analito a detectar con su agente de
unión específico que lleva el marcador detectable. En un esquema
como tal, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº
4.446.232; la tira contiene una enzima marcada, agente de unión
móvil para el analito que está en una zona hacia abajo de la zona
de aplicación de la muestra. Si está presente el analito en la
muestra de ensayo, se combinará con su agente de unión marcado para
formar un complejo que fluirá a lo largo de la tira hasta una zona
de detección que contiene un sustrato para el marcador de la enzima
que es capaz de proporcionar una respuesta coloreada en presencia
del marcador enzimático. La tira puede contener una zona en la que
el analito se inmoviliza, de manera que el agente de unión marcado
que no se combina con el analito, debido a la ausencia de analito
en la muestra, será capturado y por lo tanto impedido de alcanzar
la zona de detección. Se han publicado diversas modificaciones de
esta técnica, todas las cuales implican algún sistema de unión
específica competitiva en la que la presencia o ausencia de analito
en la muestra de ensayo se determina mediante la detección o
carencia del mismo del agente de unión marcado en la zona de
captura.
Una alternativa al ensayo inmunométrico descrito
anteriormente que detecta el anticuerpo marcado libre es el llamado
formato sándwich en el que la zona de captura contiene anticuerpos
inmovilizados contra un epitope del analito que es diferente del
epitope para el que es específico el anticuerpo marcado. En este
formato, se forma un sándwich del analito entre los anticuerpos
inmovilizados y marcados y por lo tanto es un ensayo inmunométrico
que detecta la especie de anticuerpo marcada unida.
No todos los esquemas para inmunocromatografía
dependen de un sub - sustrato de agente de unión marcado
enzimáticamente/enzima para proporcionar la señal para la detección
del analito. En la patente de Estados Unidos Nº 4.806.311 se
describe un dispositivo de ensayo multizona para la determinación
del ensayo de unión específica de un analito y un agente de unión
inmovilizado por lo tanto junto con una zona de captura para
recibir el reactivo marcado que migra a él desde la zona de
reactivo. La zona de captura contiene una forma inmovilizada de una
sustancia de unión para el reactivo marcado. El reactivo marcado
lleva un grupo químico que tiene una propiedad física detectable
que es detectable basándose en sus propias propiedades físicas, de
manera que no requieran una reacción química con otra sustancia. Los
ejemplos de tales grupos son especies coloreadas con fluorescentes,
moléculas fosforescentes, radioisótopos y restos
electroactivos.
La patente de Estados Unidos Nº 4.703.017
describe el uso de marcadores particulados visibles para el
receptor. Se mencionan diversos marcadores particulados tales como
liposomas que contienen partículas sólidas de oro y tintes
visibles.
En el documento WO-96/34271 se
describe un dispositivo para determinar un analito diana y
creatinina en una muestra de ensayo de fluido dicho dispositivo
tiene una tira de ensayo para la detección de creatinina y una
segunda tira de ensayo para la detección del analito diana. La
concentración de creatinina se puede determinar colorimétricamente
o mediante la captura específica de agentes de unión a creatinina
marcados. La concentración del analito diana se corrige basándose en
la concentración de creatinina de la muestra, dicha corrección se
puede hacer bien manualmente o por medio de un analizador de
reflectancia programado apropiadamente.
El documento EP 0 462 376 A_{2} describe un
procedimiento inmunocromatográfico en el que la señal en el sitio
de captura y el sitio de recuperación conjugado de la tira se
detectan y la concentración de analitos se determina mediante la
intensidad de la señal en el sitio de captura con relación a la
señal en el sitio de recuperación conjugado. También de interés a
este respecto es la patente de Estados Unidos Nº 5.569.608.
Los formatos de tira inmunocromatografica
proporcionan un sistema visible para la determinación de diversos
analitos (si son antígenos o anticuerpos) pero sufren de la
limitación de que producen resultados que son como mucho semi -
cuantitativos cuando, para algunos analitos, más precisos, se
requieren resultados cuantitativos. De acuerdo a lo anterior, sería
deseable y es un objeto de la presente invención proporcionar un
medio para cuantificar los resultados de los análisis llevados a
cabo mediante el uso de formatos de tira inmunocromatográfica.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la determinación de un analito en una muestra de
fluido corporal que comprende las etapas de:
- a)
- proporcionar una tira de ensayo que comprende una matriz a través de la cual la muestra de fluido puede fluir por capilaridad, dicha tira teniendo una primera región que contiene un agente de unión más específico móvil para el analito dicho agente de unión lleva un marcador detectable y puede reaccionar con el analito para formar un complejo analito/agente de unión marcado, al menos una segunda región que contiene analito inmovilizado o un agente de unión inmovilizado que es específico para un epitope del analito diferente al que el agente de unión marcado es específico, al menos una tercera región que contiene medios para capturar el complejo analito/agente de unión específico marcado que no se une en la segunda región y una cuarta región que contiene medios para producir una señal detectable la intensidad de la cual corresponde al nivel de un segundo analito cuya concentración está cínicamente relacionada con la del analito cuya concentración en el fluido corporal se está determinando;
- b)
- revelar la matriz mediante la aplicación de una muestra de un fluido corporal sospechoso de contener el primer y segundo analitos en ella por lo tanto permitiéndola que se ponga en contacto con el agente de unión específico marcado de manera que el analito presente en la muestra de fluido se una al agente de unión específico marcado para formar un complejo mientras que deja el agente de unión específico marcado sin reaccionar, en exceso, libre para reaccionar posteriormente mediante lo cual la muestra de fluido transporta el complejo analito/agente marcado y el agente de unión marcado sin reaccionar a lo largo de la matriz por capilaridad a la segunda región que contiene el analito inmovilizado en cuya región el agente de unión marcado sin reaccionar se une al analito inmovilizado en relación inversa a la concentración del primer analito en la muestra de ensayo de fluido o se une al agente de unión específico inmovilizado en relación directa a la concentración de analito en la muestra de ensayo del fluido; y el agente de unión específico marcado que no se unió a la segunda región se transporta por capilaridad a la primera región donde se captura mediante los medios de captura;
- c)
- leer la segunda zona de la matriz revelada sobre un instrumento que tiene un detector capaz de medir la señal del marcador detectable para determinar la concentración del agente de unión marcado en la segunda zona y leer la tercera zona de la tira revelada de una manera similar para determinar la señal del agente de unión marcado en la tercera zona de la matriz;
- d)
- determinar una señal de respuesta final repartiendo proporcionalmente las señales del agente de unión marcado inmovilizado en la segunda región y el agente de unión marcado capturado en la tercera región;
- e)
- determinar la concentración del primer analito en la muestra de fluido comparando la señal de respuesta final determinada en al etapa (d) con las señales de la respuesta final determinadas de una manera similar para las muestras de fluidos que contienen concentraciones conocidas del primer analito; y
- f)
- corregir la concentración del primer analito determinado en la etapa (e) determinando la concentración del segundo analito en la muestra de ensayo del fluido midiendo la intensidad de la señal en la cuarta región de la matriz y convirtiendo ésta en un valor de concentración del segundo analito y después determinar la relación del segundo analito al primer analito cuya concentración cuantitativa se está buscando.
La presente invención se pone en práctica
proporcionando primero la matriz de ensayo a través de la cual la
muestra de ensayo del fluido puede fluir por capilaridad.
Típicamente, la matriz estará en la forma de una tira a través de la
cual el fluido de ensayo fluye horizontalmente. Mientras la matriz
se puede disponer en un formato de capas a través del cual el
fluido de ensayo podría fluir verticalmente desde la parte superior
a la parte inferior o viceversa, la siguiente descripción se centra
sobre el formato de tira preferido.
La tira se puede preparar a partir de cualquier
material de matriz a través del cual el fluido de ensayo y el
analito contenido en él pueden fluir por capilaridad y puede ser de
un material que sea capaz de soportar el flujo lateral no
absorbente. Este tipo de flujo se describe en la patente de Estados
Unidos Nº 4.943.522 en forma de un flujo líquido en el que todos
los componentes disueltos o dispersados del líquido se transportan
a través de la matriz a velocidades sustancialmente iguales y con
flujo relativamente inalterado, en contraste a la retención
preferencial de uno o más componentes como sería el caso si el
material de la matriz fuera capaz de absorber o embeber uno o más de
los componentes. Un ejemplo de tal material de matriz es el
material laminado de polietileno de alta densidad o de peso
molecular ultra alto de Porex Technologies. Igualmente adecuado para
uso como matriz a partir de la cual las tiras cromatográficas se
pueden fabricar son materiales absorbentes tales como papel,
nitrocelulosa y nylon.
Son adecuados para uso diversos formatos de tira
inmunocromatográfica para uso junto con la presente invención. Un
formato particularmente adecuado es el que se describe en la
patente de Estados Unidos Nº 4.446.232 en la que se describe un
dispositivo para la determinación de la presencia de antígenos,
dicho dispositivo comprende una tira de material de matriz que
tiene una primera zona en la que se proporcionan anticuerpos unidos
a analitos inmovilizados y anticuerpos unidos a enzimas específicos
para el analito que se va a determinar. Los anticuerpos marcados
pueden fluir a una segunda zona cuando reaccionan con el analito
introducido en la primera zona mediante la muestra de ensayo pero
no fluirá así en ausencia del analito en el fluido de ensayo debido
a que están unidos en la primera región mediante interacción con el
analito inmovilizado. El analito es típicamente antígeno, aunque el
formato se puede diseñar para que detecte la presencia de
anticuerpos como analito. Las modificaciones a este formato se
describen en la patente de Estados Unidos Nº 4.868.108. En otra
modificación, el sustrato de enzimas se dispone en la región de un
segundo anticuerpo inmovilizado para, por lo tanto, capturar el
complejo formado entre el agente de unión marcado con enzimas y el
analito. Este tipo de formato es particularmente adecuado para la
adaptación a la presente invención, aunque se puede usar como
marcador cualquier generador de señales físicamente detectables ya
que la presente invención necesita no estar limitada a la
interacción de una enzima y su sustrato para proporcionar la señal
detectable. Así pues, inmovilizando el conjugado en una zona de
detección discreta localizada hacia abajo de la tira a partir de la
zona en la que se captura el agente de unión marcado para el
analito, se proporcionan dos regiones a partir de las que la
propiedad físicamente detectable del marcador se puede medir para
determinar su concentración. Midiendo la señal del marcador
detectable en la segunda región de la matriz (algunas veces
denominada la zona de captura) y la señal de la propiedad
físicamente detectable del marcador en la tercera región (algunas
veces denominada la zona de detección), en la que un anticuerpo
inmovilizado contra el agente de unión marcado (por ejemplo, anti -
ratón IgG cuando el agente de unión marcado es un anticuerpo) es el
medio de captura, y determinando la relación de estas señales, se
puede aumentar la precisión del ensayo para la concentración de
analito. La precisión aumenta debido a que esta técnica corrige las
inexactitudes en la deposición del conjugado marcado y/o el flujo no
uniforme a través de la matriz. Más particularmente, ya que las
inexactitudes anteriormente mencionadas de deposición del conjugado
marcado y/o el flujo no uniforme son usualmente de magnitud pequeña
pero significativa, sustancialmente no perturban el equilibrio de
unión. Por lo tanto la relación de las señales en las dos regiones
de unión es una medida más exacta de la concentración de analito
que la de la propia señal de cualquier otra región. Este principio
se aplica con igual fuerza cuando se usa el formato de sándwich
descrito previamente.
La segunda y tercera zonas de la matriz usada en
la presente invención puede cada una estar dividida en dos o más
bandas conteniendo la segunda región preferiblemente 1 a 3 bandas
discretas y la tercera región teniendo 1 a 2 bandas. Dividiendo
estas regiones en bandas es posible incrementar el intervalo
dinámico y/o la precisión del ensayo debido a la no linealidad de
la reflectancia para el número de agentes de unión marcados
detectados. Puede ser deseable dividir estas regiones en bandas
discretas debido a que la medición de cambios pequeños en el agente
de unión marcado detectado es más fuerte a valores más altos de
reflectancia que a valores bajos. El número de bandas de captura y/o
recogida que son deseables dependerá del ensayo particular para el
que se diseña la tira ya que dividiendo las zonas de captura y
recogida en 2 o más bandas discretas se incrementará el intervalo
dinámico de ciertos ensayos pero no de otros. El intervalo dinámico
se refiere al hecho de que la señal global se puede aumentar si uno
se centra sobre más de una sola banda de captura o detección en una
zona. Así pues, cuando el marcador detectable es uno que es
detectable por un medidor de reflectancia, puede haber una gran no
linealidad de reflectancia y el error asociado al medidor de
reflectancia usado. Por ejemplo, la diferencia entre 70%R y 75%R
representa una cantidad medianamente pequeña de marcador detectado
mientras que la diferencia entre 30%R y 35%R representa un alto
porcentaje de marcador detectado. Con el uso de ciertos medidores
de reflectancia, el error en la lectura de reflectancia permanece
constante o se incrementa a medida que el valor de reflectancia
disminuye. Así pues, puede ser ventajoso usar una o más bandas de
captura o detección adicionales si esto sucede la lectura de
reflectancia a un valor más alto cuando es más sensible a la
concentración de partículas. En aquellos ensayos en los que no es
necesario un amplio intervalo dinámico, simplemente la lectura y
reparto proporcional de una región de captura individual y una de
detección individual puede proporcionar buenos resultados
cuantitativos. Esto se ilustra mediante el siguiente ejemplo 1 en el
que la desoxipiridinolina es el primer analito, la zona de captura
se divide en 3 bandas (P_{1}, P_{2} y P_{3}) mientras que la
zona de detección es una banda individual (P_{4}) y el algoritmo
descifrado para el ensayo DPD es T/P_{n} donde T es la suma de la
señal de las cuatro bandas. Los algoritmos que usan estos valores
de reflectancia de bandas reactivas se construyen de tal manera que
se maximiza la señal para la relación de ruido y por lo tanto
incrementan la cuantificación del ensayo reduciendo los
coeficientes de variación (CV). El algoritmo particular elegido
dependerá del número de bandas reactivas sobre la banda de ensayo
particular que se está usando y de la sensibilidad y/o precisión
del ensayo. Una vez que se ha elegido el algoritmo apropiado, se
determina y se ajusta la relación entre el valor del algoritmo y la
concentración de analito a una función de regresión lineal. El
propósito de tal ajuste es minimizar el error que relaciona el
valor del algoritmo elegido con el de la concentración del analito.
La función de regresión se usa con el fin de determinar una curva
de calibración que se usa para relacionar el valor del algoritmo
determinado con el de la concentración de analito. Una vez que se
ha establecido esta relación, la curva de calibración, que se puede
almacenar en forma de una ecuación en el instrumento de
reflectancia, se usa para calcular la concentración de analito.
Ya que los cambios de reflectancia de las zonas
de captura y detección están opuestas unas a otras, es decir,
cuando mayor es la señal de la zona de captura menor es la señal de
la zona de detección, el uso de múltiples bandas de captura y/o
detección se diseña para alterar este intervalo de valores de
reflectancia. El mecanismo mediante el cual la concentración de
analito cambia la reflectancia de las bandas es una función de la
química de un ensayo particular. Para los ensayos de sándwich, con
concentración creciente de analito, la reflectancia de la banda de
captura se incrementa y la reflectancia de la banda de detección
disminuye. Para ensayos de competición, la reflectancia de la banda
de captura disminuye y la reflectancia de la banda de detección
aumenta con cantidades crecientes de analito en la muestra de
ensayo del fluido.
La necesidad de bandas de captura y/o detección
adicionales depende de si los cambios en una banda adicional son
significativamente mayores en una región de analito dada en
cualquiera de las otras bandas. Dependiendo de la concentración del
marcador (es decir oro sólido), bandas de captura adicionales
también reducirán los cambios de señal en la zona de detección. En
ciertos ensayos, una segunda zona de captura simplemente refleja la
primera banda de captura pero con cambios de señal reducidos, y, en
tales casos, necesita ser cuestionado. Sin embargo, en aquellos
ensayos en los que la zona de detección es demasiado oscura debido
a baja reflectancia, la adición de las bandas de captura puede
reducir la señal en esta zona.
En general, el punto esencial de la presente
invención implica la elección de un algoritmo particular y bandas
adicionales de captura y/o detección de manera que altere la señal
de tal forma que se pueda leer con mayor precisión mediante un
medidor de reflectancia.
Existen dos etapas implicadas en el desarrollo de
un algoritmo apropiado. La primera es incrementar la señal para la
relación de ruido hasta un nivel tal alto como sea posible. La
segunda es definir un algoritmo que se ajuste fácilmente a una
ecuación de manera que se puedan obtener los valores exactos para
cualquier concentración de analito. Esto se demuestra mediante el
siguiente estudio que implica una tira que contiene tres bandas (2
bandas de captura y una banda de detección). Las dos bandas de
captura tienen diferentes concentraciones de reactivos de captura,
la primera banda de captura teniendo una concentración de reactivos
de captura 10 veces menor que la segunda. Este formato demuestra
que se pueden usar diferentes combinaciones y concentraciones de
bandas de captura y recogida dependiendo de las propiedades únicas
de cada ensayo. Los datos se tomaron (representando N = 18 para
cada nivel de analito) usando 3 medidores de reflectancia CLINITEK®
50 durante un período de 2 días. La tabla 1 muestra las diferencias
de la figura de mérito (FOM) entre los niveles de DPD de los
diversos cambios de la reflectancia de banda y el uso de diversos
cambios de reflectancia y el uso de diversos algoritmos. La FOM se
calcula como (Med1 - Med2) / (DT1 + DT2) donde Med1 y Med2 son los
valores medos medidos para el nivel 1 de analito y el nivel 2 de
analito y DT1 y DT2 son las desviaciones típicas de los valores
medios para el nivel 1 del analito y el nivel 2 del analito.
En la tabla 1, la captura 1 son los datos de
reflectancia corregidos de IR para la banda1 de captura, la banda 1
de detección son los datos de reflectancia corregidos de IR para la
banda 2 de detección, Cap1/Det1 son los datos transformados de K / S
de la captura 1 dividida por la detección 1 y Algor 1 es:
- C / {banda 2 de captura / \Sigma bandas de captura) * ABS (2 – C)}
- donde C = 100 * (1 + \Sigma (bandas de detección / \Sigma) bandas de reactivos)) y
- Total / Cap 1 como:
- \Sigma (todas las bandas) / Captura 1
donde ABS representa el valor absoluto del
número. En esta ilustración, el comportamiento de la banda de
detección disminuye a medida que la concentración de DPD disminuye,
mientras que los cambios de señal mayores se indican para la banda
de captura. Para cualquier algoritmo, el objetivo es ponderar los
valores de reflectancia de manera que la señal para la relación de
ruido en la región más crítica para ensayo se maximice. Esto se
puede lograr mediante el uso de análisis de FOM y el Algor 1 se
diseña para ponderar las diferencias de las dos bandas de captura
mayores a concentraciones bajas de analito donde esta diferencia es
la mayor con la ponderación de la banda de colección sobre el total
en las concentraciones de analito más altas. El otro objetivo de
Algor 1 es situar esta ponderación de manera que permita el ajuste a
un ajuste común de cuatro parámetros usado en muchos
inmunoensayos.
La segunda etapa en el desarrollo del algoritmo
es usar una ecuación que se pueda ajustar fácilmente y proporcione
concentraciones exactas de analito entre valores. Aunque que la FOM
es un buen procedimiento para distinguir entre dos niveles discretos
de analito, no proporciona información sobre la forma de la curva.
El mejor planteamiento es a menudo uno que usa un análisis que
imita la química del ensayo particular. Para inmunoensayos éste es a
menudo una ecuación de ajuste de cuatro parámetros. El ensayo para
cualquier ecuación y algoritmo ajustado es el uso de muestras
aleatorias con diversas concentraciones de analito y el cálculo del
error (% de CV) y sesgo. El objetivo es buscar el menor % de CV con
un sesgo mínimo a lo largo del intervalo esperado del ensayo. Una
comparación de los resultados de DPD 0 - 250 nM/mM en orina para dos
tipos de análisis se muestra en las tablas 2 y 3 para las tres
inmunotiras de banda en esta ilustración.
A partir de los datos de las tablas 2 y 3, se
puede determinar que para este análisis particular, el primer
algoritmo tiene menos error, como se mide mediante el % de CV, en
todos los valores de DPD. Este ejemplo ilustra el procedimiento algo
empírico para encontrar un algoritmo correcto. El algoritmo elegido
será uno que tiene el menor error asociado a él para una
formulación y formato de tira dado y un intervalo clínico dado para
el analito.
Después el valor para el que se ha obtenido el
analito diana, el instrumento usa el valor de reflectancia en una o
más longitudes de onda de la capa reactiva para el segundo analito
con el fin de determinar la concentración de este analito en la
muestra de ensayo del fluido. En el caso en que la DPD sea el
analito diana y la creatinina sea el segundo analito, la precisión
(o la reducción de señal a ruido) es crítica para el ensayo de
ambos analitos. Ausente un alto nivel de precisión, el error
resultante producirá un ensayo que tiene poca significación médica
ya que se produce un incremento tan pequeño como dos veces en la
relación DPD/creatinina entre los estados normales y de
osteoporosis. El segundo analito se selecciona entre los materiales
en el fluido corporal que están clínicamente relacionados con el
primer analito. El ejemplo más notable de un segundo analito es
creatinina, el metabolito final cuando la creatina se vuelve fosfato
de creatina que se usa como una fuente de energía para la
contracción de músculo. Los glomérulos renales filtran la
creatinina producida y después se excreta en la orina sin
reabsorción. Con el fin de incrementar la sensibilidad de los
ensayos urinarios y minimizar el problema de altos caudales de
urinaria que dan como resultado dilución de orina, las relaciones
analito / creatinina se usan en los ensayos de proteína en la orina
para normalizar la concentración de orina. Los ensayos comunes de
creatinina incluyen los procedimientos alcalinos de Jaffe y Benedict
- Behre que se llevan a cabo a un pH alto, típicamente en el
intervalo 11,5 a 12,5. Más recientemente, se ha llevado a cabo un
ensayo de creatinina en el que la muestra de orina se pone en
contacto con iones cúpricos en presencia de citrato, un
hidroperóxido y un tinte oxidable que proporciona una respuesta
coloreada en presencia de radicales exentos de oxígeno y un
pseupoperóxido. Este procedimiento se describe más completamente en
la patente de Estados Unidos Nº 5.374.561. La cuantificación de
creatinina también se puede llevar a cabo inmunológicamente como se
describe en el documento WO - 96/34271. Aquellos segundos analitos
cuya concentración en la muestra de fluido corporal está
clínicamente relacionada con la concentración del analito diana no
se limitan a la creatinina en orina ni es orina el único fluido
corporal que se puede ensayar mediante el procedimiento de la
presente invención. Así pues, por ejemplo, el fluido corporal
ensayado puede ser sangre entera, el primer analito (diana) puede
ser HbA_{1c} y el segundo analito puede ser hemoglobina total ya
que la concentración aparente de HbA_{1c} se puede ajustar a la
concentración de hemoglobina total de sangre entera para el factor
fuera de sesgo en el ensayo de HbA_{1c}. La inulina, administrada
por vía intravenosa, es, probablemente creatinina, un indicador de
flujo renal. En los ensayos basados en serología el primer analito
puede ser antígeno específico de próstata total y el segundo analito
antígeno específico de próstata libre. Otro par de analitos cuyas
concentraciones están clínicamente relacionadas son alanina
aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) que están
ampliamente distribuidas en los tejidos humanos. Tanto AST como ALT
están normalmente presentes en el plasma humano, bilis y saliva. En
la hepatitis viral y otras formas de enfermedad hepática, los
niveles de AST y ALT están elevados incluso antes de que aparezcan
los signos clínicos de enfermedad, tal como ictericia. En la
hepatitis tóxica o viral, la ALT es característicamente tan alta o
más que la ALT y la relación ALT/AST, que es normalmente < 1, se
aproxima a o llega a ser mayor que la unidad. Además, las
concentraciones de la AST se incrementan después del infarto de
miocardio por lo tanto cambiando la relación de estas dos enzimas y
su actividad. Así pues, se pueden obtener resultados clínicamente
significativos determinando la relación de estos dos analitos en
suero.
Muchos analitos diana clínicamente significativos
están presentes en orina y se pueden determinar mediante la
presente invención. Entre estos analitos están la desoxipiridinolina
(DPD), albúmina sérica humana, fármacos que crean adicción tales
como anfetaminas/barbitúricos/cocaína, marcadores de proteínas
clínicamente importantes tales como antígeno específico de
próstata, proteínas de enfermedades renales tales como lactato
deshidrogenasa,
N-acetil-B-D-glucosaminidasa,
hormonas asociadas a embarazo o fertilidad tales como gonadotropina
coriónica humana, hormona estimulante de folículos y hormona
luteinizante, marcadores de la infección del tracto urinario tales
como proteína de Tamm - Horsfall, o lipopolisacárido,
beta-2-microglobulina, amilasa y LPS
clamidial. La determinación de la relación de IgA/IgG para
determinar la infección se puede lograr mediante la presente
invención. La corrección de sus concentraciones absolutas para
variaciones en flujo renal repartiendo proporcionalmente estas
concentraciones a las concentraciones de creatinina observadas
incrementa la precisión y exactitud de las mediciones.
Aunque los medios para detectar la señal a partir
de la tira revelada dependerán del marcador detectable unido al
agente de unión marcado, el uso de un medidor de reflectancia es
típico cuando la propiedad física detectable del marcador es la
reflectancia de luz a una longitud de onda predeterminada en la
región visible o infrarroja del espectro. En una realización
preferida, se proporciona un medidor de reflectancia con medios para
mover la tira o el elemento detector del medidor con relación uno
al otro tal como mediante el uso de una tabla de muestra para la
tira que se puede mover lateralmente bajo la cabeza lectora del
detector. Esta técnica ayudará a proporcionar cuantificación exacta
de las regiones de la tira que no se pueden localizar con precisión
con respecto a los medios de detección del medidor de reflectancia.
Más específicamente, la localización de la tira con relación al
detector puede estar bajo control del microprocesador, de manera que
la reflectancia de la segunda, tercera o cuarta regiones de la
tira, y las bandas individuales dentro de estas regiones, se puedan
determinar individualmente.
El procedimiento de poner en práctica la presente
invención se ilustra más completamente mediante los siguientes
ejemplos:
Una tira de ensayo para la determinación de
creatinina y desoxipiridinolina (DPD) conteniendo seis áreas
distintas ensambladas juntas en un soporte de poliestireno de 101,6
mm (4 pulgadas) de longitud y 5,0 mm (0,2 pulgadas) de anchura se
ilustra en la figura 1. Con relación a la figura 1, el área 1 es la
capa de creatinina (la cuarta región que contiene medios para
producir una señal detectable de la intensidad que corresponde al
nivel de un segundo analito cuya concentración está clínicamente
relacionada con la del primer analito cuya concentración se está
determinando) con un tamaño de 5 mm x 5 mm (0,2 x 0,2 pulgadas). La
capa de creatinina se preparó como sigue para hacerla adecuada para
la determinación colorimétrica de creatinina: papel de filtro
Whatman de 30 mm se trató primero sumergiéndola primero a una
profundidad de 5 mm (0,2 mm) en una solución que contenía sulfato
de cobre 30 mM, citrato 50 mM,
glicerol-2-fosfato 750 mM, ácido
hexanosulfónico al 0,2%, ácido fítico 50 mM y dodecilsulfonato
sódico (SDS) al 0,2% a pH 6,94. Después de secar, la tira se
sumergió en una solución que conetnía
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina 33 mM,
diisopropilbenceno dihidroperóxido 73 mM, borato de
trisiisopropanolamina 63 mM, plasonde al 0,5% y naranja de etilo al
0,032%. La intensidad de la respuesta coloreada producida cuando
la tira se pone en contacto con un medio acuoso que contiene
creatinina se reparte proporcionalmente para la concentración de
creatinina. El área 2 es la capa de tampón, preparada mediante
impregnación de fibra de vidrio Whatman F075-07 con
glicina 0,5 a 1 M y urea 175 a 350 mM y teniendo un tamaño de 5 mm
x 12,7 mm (0,2 x 0,5 pulgadas). La capa de tampón sirve para el
propósito de tamponar el pH de las muestras de orina al valor
deseado. Por ejemplo, el pH de la orina puede variar entre 4,5 y 8
y se puede usar una capa tampón para mantener las muestras a un pH
> 7 para favorecer la reacción de unión antígeno/anticuerpo.
Existe un hueco de 2,5 mm (0,1 pulgada) entre la capa de creatinina
y la capa tampón 2 para propósitos de aislamiento del reactivo de
creatinina del reactivo de la capa de tampón. El área 3 es una capa
de anticuerpo oro sólido - DPD (primera región conteniendo un agente
de unión marcado específico para el analito). Las áreas 4 y 5 son
el área de revelado inmunocromatográfico donde los reactivos de
captura y detección están depositados en una pieza de nitrocelulosa
que tiene un tamaño de 5 mm x 31,75 mm (0,2 x 1,25 pulgadas). El
área 4 contiene tres bandas de captura (la segunda región
conteniendo analito inmovilizado) con DPD inmovilizada a
polietilenglicol terminado en carboxilo con una anchura de banda de
aproximadamente 1,5 mm (0,059 pulgadas) por banda y un espacio de 5
mm (0,2 pulgadas) entre las bandas (entre centros). A 5 mm (0,2
pulgadas) del centro de la tercera banda de captura está el área 5
constituida por una banda de recogida anti - IgG (tercera región
para inmovilizar el complejo analito/agente de unión marcado) con
una anchura de banda de aproximadamente 1,5 mm (0,059). A 5 mm (0,2
pulgadas) por encima de la banda de recogida está la capa
absorbente 6 que sirve para absorber el líquido que migra desde el
área de nitrocelulosa de la tira que tiene un tamaño de 5 mm x 12,7
mm (0,2 pulgadas x 0,5 pulgadas).
Para realizar el ensayo se sumerge la tira en la
solución de ensayo, es decir, una muestra de orina conteniendo el
analito de DPD a determinar, durante 3 segundos a una profundidad
tal que solamente la zona de creatinina y capa tampón estén debajo
de la superficie de la solución de ensayo que permite que la
solución de ensayo fluya hacia arriba de la tira por capilaridad a
través de las bandas de captura de la región de captura, la banda
individuad de la región de detección y a la capa de absorbente. Al
final de la inmersión de 3 segundos la tira se coloca en la tabla
de lectura de un espectrómetro de reflectancia CLINITEK® 50 y se
presiona el botón de arranque del dispositivo. La reflectancia de
la capa de creatinina se registra a los 3 minutos y la reflectancia
de la tira inmuno DPD (las 4 bandas) se midió y se registró a los 3
minutos. Las señales de reflectancia para el ensayo de DPD se
midieron con filtros de IR y verde mientras la reflectancia para el
ensayo de creatinina se midió usando filtros rojo y verde. El
dispositivo proporciona una respuesta en los valores descodificados
que se deriva de las ecuaciones 1 a 5.
Ecuación
1
Descodificación \ para \
creatinina \ =
\frac{[R]_{verde}}{[R]_{rojo}}
donde [R]_{verde} es la
reflectancia medida con el filtro verde, [R]_{rojo} es la
reflectancia medida con el filtro
rojo.
Para el ensayo de la DPD, las señales de
respuesta de las bandas se designan como se indica en la tabla
4.
| Nº de Banda | Tipos | Denominación |
| 1 | Banda 1 de captura | P1 |
| 2 | Banda 2 de captura | P2 |
| 3 | Banda 3 de captura | P3 |
| 4 | Banda 1 de recogida | P4 |
La reflectancia con el filtro verde se reparte
proporcionalmente a la reflectancia con el filtro IR para reducir
el error de las variaciones entre las tiras tales como variaciones
de altura y superficie. La reflectancia a la longitud de onda IR
permanece casi constante independientemente de la intensidad de la
banda de oro sólido. La reflectancia corregida, [Rn], se calcula
según la ecuación 2.
Ecuación
2
[Rn] =
\frac{[Rn]_{verde} \ x \
65}{[Rn]_{IR}}
donde n es el número de banda 1, 2,
3, ó 4, [Rn]_{verde} es la reflectancia de la banda n con
el filtro verde, [Rn]_{IR} es la reflectancia de la banda n
con el filtro IR. El número 65 es el valor de referencia corregido
asignado ya que el % de reflectancia con el filtro IR es
aproximadamente
65%.
El valor de reflectancia corregido de IR, [Rn],
se convierte después en K/S según la ecuación 3 para proporcionar
la señal de respuesta de banda para cada banda:
\newpage
Ecuación
3
Señal \ de \
banda \ = \ Pn \ = \frac{(1 -[Rn])^{2}}{2 x
[Rn]}
donde la señal de banda, Pn, es el
valor de reflectancia de la transformación K/S,
[Rn].
La descodificación de la respuesta de cada banda
finalmente se computa según la ecuación 4.
Ecuación
4
Descodificación \ para \ el \
ensayo \ de \ DPD \ =
\frac{T}{P_{1}}
donde T es la suma de la señal de
la banda para todas las bandas (ecuación
5).
Ecuación
5
T = \sum
Pn
n = 1 a
N
donde N es el número total de
bandas de captura y las bandas de recogida que es 4 en el presente
ejemplo, Pn es la señal de banda n y n es 1, 2, 3, ó
4.
Las curvas patrón para DPD y creatinina se
generaron usando calibradores que contenían seis niveles de
concentraciones de analito. Los ejemplos de las curvas patrones se
muestran en la figura 2 para el ensayo de DPD y la figura 3 para el
ensayo de creatinina. Las concentraciones de DPD y creatinina para
la muestra de ensayo de orina se calcularon a partir de las curvas
patrones de DPD y creatinina respectivamente. Después se calculó la
relación DPD/creatinina en nM/mM para la muestra A de orina según el
siguiente cálculo:
La concentración de DPD se calculó a partir de la
curva patrón de DPD = 123 nM
La concentración de creatinina calculada a partir
de la curva patrón de creatinina = 10,2 mM.
La relación DPD/creatinina = 123 nM/10,2 mM =
12,1 nM/mM.
El corte para la determinación de un estado de
alta resorción ósea es una relación DPD/creatinina de 7,4 nM/mM.
Por debajo de 7,4 es normal y mayor que 7,4 es el estado de alta
resorción ósea. Por lo tanto en este ejemplo, el resultado indica un
estado de alta resorción ósea. Una segunda muestra de orina se
analizó de una manera similar y proporcionó los siguientes
resultados:
Concentración de DPD = 123 nM
Concentración de creatinina = 20,5 mM
Relación DPD/creatinina = 6,0 nM/mM.
Aunque la concentración de DPD es la misma, la
relación de DPD a creatinina indica un estado de baja resorción
ósea.
Se realizaron cinco desarrollos usando el
procedimiento anterior con muestras de orina que contenían
cantidades variables de DPD y creatinina. Las relaciones esperadas
y observadas así como las desviaciones típicas, % de coeficiente de
variación y sesgos positivos/negativos se establecen en la tabla 5.
A partir de la tabla 5 se puede determinar que se obtuvo una
precisión inferior a 12% de CV en los tres niveles, 4,52, 7,54 y
12,07 nM/mM de DPD a
creatinina.
creatinina.
Aunque los anticuerpos marcados con oro sólido
son observables visualmente en las zonas de captura y recogida de
la tira, los resultados clínicamente significativos se pueden
obtener solamente mediante el uso de un medidor de reflectancia.
Este es el caso debido al uso de múltiples bandas a lo largo de la
longitud entera de la tira. Además, las señales de banda requieren
medición de reflectancia a diferentes longitudes de onda (IR,
verde y rojo) usando un instrumento con la capacidad de medir y
registrar la reflectancia de estas longitudes de onda. Las
mediciones de reflectancia se reparten proporcionalmente basándose
en un algoritmo predeterminado usando el software del instrumento.
Además, las concentraciones de analito se determinan usando curvas
patrones almacenadas en el instrumento y la relación DPD/creatinina
se computa usando el software establecido en el instrumento.
En el ejemplo anterior, la señal de respuesta
final (descodificación) para el ensayo de DPD se determinó usando
la descodificación del algoritmo = [T/Pn] donde T es la suma de la
señal de las cuatro bandas y Pn es la señal de la banda de la banda
1. El uso de este algoritmo potencia la exactitud del ensayo debido
a que el reparto proporcional de la señal de banda minimiza el
error sistemático tal como el error introducido por la variación
entre instrumentos. Se pueden usar otros algoritmos para determinar
la señal de la respuesta final. La señal de la respuesta en este
ejemplo se determinó como sigue:
Señal de
respuesta = [T/Banda 1 de captura] o
[T/P_{1}]
donde todas las señales de banda
son valores de reflectancia de la transformación K/S y T es la suma
de las bandas de captura y bandas de
detección.
Las ventajas de usar el reparto proporcional de
bandas se demuestra mediante los datos de las tablas 6 y 7 a partir
de las cuales se puede determinar que la precisión con la que la
tira puede determinar la concentración de DPD es mucho mayor que la
que se puede obtener cuando se usa solamente la señal de la zona de
captura.
Como alternativa, la señal de respuesta final se
puede calcular como sigue:
Señal de
respuesta = [Banda de detección/banda de
captura]
donde todas las señales de la banda
son valores de reflectancia de transformación K/S. Como
alternativa, cuando la tira contiene múltiples bandas de captura y
bandas de detección, la señal de respuesta final se puede calcular
como
sigue:
[Banda 1 de
captura/ banda 1 de
detección]
donde todas las señales son valores
de reflectancia de transformación K/S. Otro procedimiento de
cálculo de la señal de respuesta implica el uso del
algoritmo:
Señal de
respuesta = [W_{cap} * banda 1 de captura/W_{det} * banda de
detección]
donde todas las señales de banda
son valores de reflectancia y W_{cap} y W_{det} son funciones
ponderadas que ponderan las bandas de captura y las bandas de
detección diferentemente. Así pues, se pueden usar numerosos
algoritmos para determinar la señal de respuesta
final.
El cálculo de la señal de respuesta mediante
reparto proporcional de las señales del agente de unión marcado
inmovilizado en la segunda región (captura) de la tira y el agente
de unión marcado inmovilizado en la tercera región (detección) es
crítico para aumentar la precisión del ensayo reduciendo la señal
para la relación de ruido. Esta precisión potenciada es necesaria
para que el ensayo tenga la significación clínica ya que se produce
solamente un incremento de dos veces en la relación DPD/creatinina
entre el estado normal y patológico que indica estados de
osteoporosis.
La evidencia adicional de la mejora en los
resultados analíticos que se puede lograr mediante la presente
invención se presenta en las tablas 8 - 10. Estas tablas se
prepararon usando los mismos datos establecidos pero se comparan 3
algoritmos diferentes ([T/P_{1}]) con reparto proporcional de
bandas, % de reflectancia de la primera banda de captura sin
corrección de IR y sin reparto proporcional de bandas y % de
reflectancia de la primera banda de captura sin reparto
proporcional de bandas pero con corrección de IR).
Claims (13)
1. Un procedimiento para determinar la
concentración de un analito en una muestra de fluido corporal que
comprende las etapas de:
- a)
- proporcionar una matriz de ensayo través de la cual la muestra de fluido puede fluir por capilaridad, dicha tira teniendo una primera región que contiene un agente de unión específico móvil para un primer analito dicho agente de unión lleva un marcador detectable y puede reaccionar con el primer analito para formar un complejo analito/agente de unión marcado, al menos una segunda región que contiene un agente de unión inmovilizado que es específico para un epitope del primer analito diferente al que el agente de unión marcado es específico, al menos una tercera región que contiene medios para capturar el complejo analito/agente de unión específico marcado que no se une en la segunda región y una cuarta región que contiene medios para producir una señal detectable la intensidad de la cual corresponde al nivel de un segundo analito cuya concentración está cínicamente relacionada con la del primer analito cuya concentración en el fluido corporal se está determinando;
- b)
- revelar la matriz mediante la aplicación de una muestra de un fluido corporal sospechoso de contener el primer y segundo analito en ella por lo tanto permitiéndola que se ponga en contacto con el agente de unión específico marcado de manera que el primer analito presente en la muestra de fluido se una al agente de unión específico marcado para formar un complejo mientras que deja el agente de unión específico marcado sin reaccionar, en exceso, libre para reaccionar posteriormente mediante lo cual la muestra de fluido transporta el complejo analito/agente de unión marcado y el agente de unión marcado sin reaccionar a lo largo de la matriz por capilaridad a la segunda región en la que el complejo analito/agente de unión marcado se une al agente de unión específico en una relación directa a la concentración del primer analito en la muestra de ensayo del fluido; y el agente de unión específico marcado que no se unió a la segunda región se transporta por capilaridad a la primera región donde se inmoviliza mediante los medios de inmovilización;
- c)
- leer la segunda zona de la matriz revelada sobre un instrumento que tiene un detector capaz de medir la señal del marcador detectable para determinar la concentración del agente de unión marcado en la segunda zona y leer la tercera zona de la tira revelada de una manera similar para determinar la señal del agente de unión marcado en la tercera zona de la matriz;
- d)
- determinar la señal de respuesta final mediante reparto proporcional, basándose en un algoritmo predeterminado, de las señales del agente de unión marcado capturado en la segunda región y el agente de unión marcado inmovilizado en la tercera región;
- e)
- determinar la concentración del primer analito en la muestra de fluido comparando la señal de la respuesta final determinada en al etapa d con las señales de la respuesta final determinadas de una manera similar para las muestras de fluido que contienen concentraciones conocidas del primer analito; y
- f)
- corregir la concentración del primer analito como se ha determinado en la etapa e determinando la concentración del segundo analito en la muestra de ensayo del fluido midiendo la intensidad de la señal en la cuarta región de la tira y después determinar la relación del segundo analito al primer analito cuya concentración cuantitativa se está buscando.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el fluido corporal es orina, sangre entera, plasma, suero,
sudor o saliva.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el fluido corporal es sangre entera, el primer analito es
HbA_{1c} y el segundo analito es hemoglobina total.
4. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el fluido corporal es suero, el primer analito es transferrina
y el segundo analito es capacidad de unión transferrina -
hierro.
5. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el fluido corporal es orina, el primer analito es una sustancia
transportada en la orina y el segundo analito es un material cuya
concentración es una medida de eliminación renal.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el segundo analito es creatinina o inulina.
7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el
que el primer analito es desoxipiridinolina, albúmina sérica
humana, anfetaminas, barbitúricos, cocaína, antígeno específico de
próstata, lactato deshidrogenasa,
N-acetil-B-D-
glucosaminidasa, gonadotropina coriónica humana, hormona estimulante
de folículos, hormona luteinizante, proteína de Tamm - Horsfall,
lipopolisacárido,
beta-2-microglobulina, amilasa y LPS
clamidial.
8. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el fluido corporal es sangre entera o suero, el primer analito
es antígeno específico de próstata total y el segundo analito es
antígeno específico de próstata libre.
9. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el primer analito es alanina aminotransferasa y el segundo
analito es aspartato aminotransferasa.
10. El procedimiento de una de las
reivindicaciones 1 a 9 en el que la matriz está en la forma de una
tira a través de la cual la muestra de fluido fluye
horizontalmente.
11. El procedimiento de una de las
reivindicaciones 1 a 10 en el que la segunda región de la matriz
está dividida en 3 bandas discretas, la tercera región es una banda
individual y la señal de respuesta final se determina resolviendo la
ecuación:
Señal de
respuesta =
[T/P_{1}]
donde T es el sumatorio de la señal
de las cuatro bandas y P_{1} es la primera banda de la segunda
región.
12. El procedimiento de una de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que la segunda y tercera regiones de
la matriz de ensayo están divididas en múltiples bandas de captura y
detección respectivamente y la señal de respuesta final se determina
resolviendo la ecuación:
Señal de
respuesta = Banda 1 de captura/ banda 1 de
detección
donde la banda 1 de captura es la
señal de la primera banda de la segunda región y la banda 1 de
detección es la señal de la primera banda de la tercera
región.
13. El procedimiento de una de las
reivindicaciones 1 a 12 en el que la tira se lee mediante el uso de
un medidor de reflectancia que está equipado con un software que
está programado previamente con el algoritmo apropiado para la
determinación de la señal de la respuesta final a partir de las
señales de reflectancia recibidas desde la segunda y tercera
regiones y para la determinación de la concentración del segundo
analito de la señal de reflectancia recibida desde la cuarta región
y para la determinación de la relación de la concentración del
segundo analito en la muestra del fluido corporal a la concentración
del primer analito para determinar la concentración corregida del
primer analito.
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