JP2004108783A - 固体分析媒体 - Google Patents

Abstract

【課題】補強材料を必要とせず、取り扱いが容易で、媒体にあらかじめ固定すべき高価な反応物を、反応及び検出に必要な量だけ用いて、分析結果の判断を迅速、かつ、容易に行うことが可能な分析媒体を提供すること。
【解決手段】分析対象成分が含まれる疑いのある被分析溶液中の分析対象成分と反応して、想定生成物を形成する反応物が、その表面に幅０．１ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下の線状に固定されてなる、液体浸透性をもたず、かつ、気体浸透性をもたない固体分析媒体。
【選択図】　図１１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被分析溶液中に分析対象成分が存在するか否かを定性的又は定量的に判定するのに用いる固体分析媒体に関する。
本発明の分析媒体は、医療診断、健康診断、環境分析、食品分析等に好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
本発明の一応用分野であるところの免疫学的分析分野では、患者から採取した体液中の抗原の存在を判定するための抗原の特異的結合対である抗体を、ニトロセルロース等の素材からなる液体浸透性及び気体浸透性をもつ微多孔質の膜に固定しておき、ニトロセルロース膜の微多孔性を利用した体液の毛管現象流れにより、体液を前記抗体が固定された領域に輸送し、抗原抗体反応が生じた場合は、体液中に被分析物、すなわち、抗原が存在すると判断し、抗原抗体反応が生じなかった場合は、体液中に被分析物、すなわち、抗原が存在しないと判断する、いわゆるイムノクロマトグラフィーの分析手段が商品として知られている。
【０００３】
非特許文献１に開示されているように、イムノクロマトグラフィーに用いられるニトロセルロース等の素材からなる液体浸透性及び気体浸透性をもつ微多孔質の膜は、一般には１００〜２００μｍの厚みを持つ。この膜は、曲げ、ねじり等の機械的外力に対する強度が極めて低く、ポリエステルシート等の補強材料により裏打ちすることが必須である。そして、抗原抗体反応の有無は、一般に、標識された発色材料による発色又は変色を、目視又は光学的な検出手段により判定するが、実際に、この判定に寄与する領域は、表面より高々１０μｍ程度の深さ領域のみである。それよりも厚み方向に深い、残りの９０〜９５％の領域は、反応に寄与するか否かにかかわらず、判定には全く寄与しないのが現実である。
【０００４】
このようなニトロセルロース等の素材からなる液体浸透性及び気体浸透性をもつ微多孔質の膜に、「分析対象成分が含まれる疑いのある被分析溶液」（以下、本明細書において、「」内を、被分析溶液、と略す）中の分析対象成分と反応して、想定生成物を形成する反応物を固定する場合は、その素材の持つ液体浸透性により、判定に必要な表面領域にだけ、「被分析溶液中の分析対象成分と反応して、想定生成物を形成する反応物」（以下、本明細書において、「」内を、反応物、と略す）を固定することは、事実上不可能である。そのため、ニトロセルロース等の素材からなる液体浸透性及び気体浸透性をもつ微多孔質の膜の厚み方向全体にわたって固定せざるを得なかった。
【０００５】
一般に、反応物は、価格が高く、分析結果に反映しない領域にまで固定することはコスト面でかなりの無駄を強いられることとなっていた。
一方、被分析溶液中の分析対象成分が複数の種類である場合、その判定のためには、反応物を、想定される種類だけ分析媒体に固定しておく必要があるが、前記の例のようなイムノクロマトグラフィー技術の場合、反応物は、被分析溶液の毛管現象流れに対して直交するように固定されているため、仮に、被分析溶液中の各種分析対象成分と反応して、想定生成物を個別に形成する反応物を、想定される種類だけ、被分析溶液の毛管現象流れに対して直交するように固定したとしても、被分析溶液中の各種の分析対象成分と反応物との反応は、反応物が固定されたニトロセルロース等の素材からなる液体浸透性及び気体浸透性をもつ微多孔質膜中の、被分析溶液の毛管現象流れ速度に制御された逐次的な反応となり、被分析溶液中の分析対象成分が反応物と反応する時点での、被分析溶液の濃度及び容量が不安定になり、正確な判定結果が得られないという問題点があった。
【０００６】
他方、この免疫学的分析分野では、例えば、特許文献１に開示されているように、ＬＳＩの製造等に用いられるシリコン基板上に、光学活性又は光学活性層が固定された分析対象成分が容易に固定されない非特異吸着面と、分析対象成分の特異的結合対である受容物質を持たせることにより、被分析溶液を基板上に供給し、基板上で分析対象成分と受容物質を反応させ、特異的結合が発生した場合に光学活性支持体が入射光に応じて発色する、いわゆる、光学的免疫分析の技術が存在する。この技術の場合、前記のような、液体浸透性及び気体浸透性をもつ微多孔質の膜を使用することなく、その基材を分析媒体として用いている。したがって、被分析溶液と反応物との反応は、前記のような被分析溶液の毛管現象流れの中で発生する動的反応ではなく、被分析溶液を反応物に固定して反応させる静的反応である。そのため分析の感度は高いものである。
【０００７】
この技術の場合、反応物は、分析媒体の全面又は分析媒体の活性面にスポット状に固定されており、その固定された位置、すなわち、分析結果を目視又は光学的に検出すべき位置及び形状が媒体個々により異なり、分析結果の判断が迅速に行えないと言う問題点があった。また、被分析溶液中の分析対象成分が複数の種類である場合、その判定のためには、反応物を、想定される種類だけ分析媒体に固定しておく必要がある。この場合も、反応物を、想定される種類だけスポット状に固定することが可能であるが、その固定されるべき位置及び形状はスポット毎に異なり、媒体個々によっても異なり、やはり分析結果の判断が迅速に行えないばかりか、複数の反応を判断することは実質的に不可能であるという問題点があった。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ　Ｓｈｏｒｔ　Ｇｕｉｄｅ　Ｆｏｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ
Ｔｅｓｔ　Ｓｔｒｉｐｓ　（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ発行）
【特許文献１】
特許第３１９３３７３号明細書
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、被分析溶液中に分析対象成分が存在するか否かを、定性的又は定量的に判断するために、前記被分析溶液中に分析対象成分が存在した場合は、反応により想定生成物が形成され、逆に前記被分析溶液中に分析対象成分が存在しなかった場合は、想定生成物が形成されないことを、あらかじめ、反応物を固定した分析媒体を用いて判断する分析技術分野における、上記既存技術の欠点を解消するものである、すなわち、補強材料を必要とせず、取り扱いが容易で、媒体にあらかじめ固定すべき高価な反応物を、反応及び検出に必要な量だけ固定することによりコスト問題も解消し、分析結果の判断を迅速、かつ、容易に行うことが可能であり、被分析溶液中の分析対象成分が複数の種類である場合の分析結果の判断を、迅速、かつ、容易に行うことが可能な分析媒体を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、分析対象成分が含まれる疑いのある被分析溶液中の分析対象成分と反応して、想定生成物を形成する反応物が、その表面に幅０．１ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下の線状に固定されてなる、液体浸透性及びをもたず、かつ、気体浸透性をもたない固体分析媒体である。
【００１１】
本発明において、被分析溶液とは、分析対象成分が含まれる疑いのある被分析溶液である。したがって、被分析液中に分析対象成分が含まれているか否かが不明である被分析溶液、及び分析対象成分が含まれていることが既知の被分析溶液が、本発明の対象となる。
被分析溶液としては、唾液、喀痰、鼻汁、鼻腔液、血液、血清、涙液、便、尿等の、人体又は動物から採取された体液、雨、河川、上下水、冷却水、排水等の環境から採取された液、飲料水、ジュース等の飲み物、調味料等の食品及び食品を抽出した溶液、微生物、細菌、ウイルス、薬品、薬物、動植物の細胞、組織が溶け込んだ溶液等があげられる。
【００１２】
本発明において、分析対象成分は、抗原、抗体、タンパク質、酵素、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、微生物、細菌、ウイルス、薬品・薬物等の化合物等があげられるが、本発明では、これらのうち、これらの物質それぞれに対して特異的に結合しうる試薬を見いだしうるものが好ましい。
本発明において、反応物とは、被分析溶液中の分析対象成分と反応して、想定生成物を形成する物質である。反応物としては、分析対象成分と特異的に結合しうる試薬が好ましく用いられる。
【００１３】
本発明において、反応物は、基体上に、幅０．１ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下の線状に固定されている。幅が０．１ｍｍ未満の場合は、反応物を基体に線状に安定して固定することが極めて困難なため実用に供しえないばかりか、分析結果を目視で確認する場合に判断が困難になる。幅が３．０ｍｍを越えると、分析媒体そのものが大きくなり、場合によっては、高価な想定生成物を形成する反応物を必要以上に固定することとなり、分析媒体が高価なものとなる。
【００１４】
線と線の間隙が０．１ｍｍ未満の場合は、反応物を線状に安定して固定することが困難な場合がある。場合によっては、隣接する異種の反応物が混合し、正常な分析結果を得られないことが生じる。また、分析結果を目視で確認する場合に、判断が困難になることもある。間隔が３．０ｍｍを越えると、分析媒体そのものが大きくなり、製造、輸送、保管等のコスト面で問題が発生する場合がある。
複数の分析対象成分を含む被分析溶液に対して、各々の被分析対象成分と特異的に反応して、各々の分析対象成分に対応した想定生成物を形成する反応物を二種類以上線状に固定することにより同時に複数の分析対象成分を検出することが可能となる。
【００１５】
本発明における分析対象成分である抗原、抗体、タンパク質、酵素、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、微生物、細菌、ウイルス、薬品・薬物等の化合物は、本発明における分析対象成分が含まれる疑いのある被分析溶液である、唾液、喀痰、鼻汁、鼻腔液、血液、血清、涙液、便、尿等の人体及び動物から採取された体液、雨、河川、上下水、冷却水、排水等の環境から採取された液、飲料水、ジュース等の飲み物、調味料等の食品及び食品を抽出した溶液、微生物、細菌、ウイルス、薬品、薬物、動植物の細胞、組織が溶け込んだ溶液等の中に複数種類存在する場合が多いため、実際の分析では同一被分析溶液から同時に複数の分析対象成分を検出することが可能となることが市場要求としてある。本発明者らは、請求項１記載の反応物が固定された線が、該線と線の間隙が０．１ｍｍ以上、３ｍｍ以下となるように請求項１記載の分析媒体上に二本以上固定されていることを特徴とする請求項１記載の固体分析媒体を採用することによりこの市場要求を実現することが可能であることを見いだした。
【００１６】
本発明に用いられる、液体浸透性をもたず、かつ、気体浸透性をもたない基体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタアクリレート等のプラスチック成型板、シリコン、シリコン化合物、ガラス、石英等の無機素材からなる基板、鉄、アルミ、ステンレス等の金属板等が挙げられる。中でも、表面の平滑性、品質の安定性及びコスト面から、ＬＳＩ製造に用いられるシリコンウエハーが実用的に好ましい。
本発明の基体の上に、反応物の固定を容易にするための媒体を、反応物の固定面に膜状に保持することにより、基体と反応物の結合を強固にすることも可能である。
【００１７】
基体として、例えば、特表平２００１−５０３８６２号公報に開示されている、ダイヤモンド状炭素のような炭素、酸化珪素、窒化珪素、炭化窒化珪素のような珪素化合物が好ましい。このような炭素及び含珪素化合物は、スパッタリング、イオンビーム堆積法、化学気相堆積法等の薄膜製造技術領域における公知技術により作成することが可能である。また、基体として、水素化珪素化合物、シロキサン化合物等も好ましく用いることができる。このような化合物は、スピンコート法、デッピング法、ドクターブレード法等の薄膜製造技術領域における公知技術により作成することが可能である。
【００１８】
基体上で、分析対象成分と反応物との反応による変化を検出する手段として、光学的に読み取る手段が好ましい。分析結果を光学的に読みとる手段としては、ＣＣＤカメラを用いた、色相読みとり、白色光の反射成分をフィルターにより分光し、波長解析を行う手段、検査結果が想定反応物の堆積等により厚み変化を伴う場合は、特公平４−７８１２２号公報に開示されたエリプソメトリーといった手段が好ましい。これらの手段を用いることにより、本発明の分析媒体を定量分析用媒体として用いることが可能となる。
本発明が極めて有効に利用される一例は、特許第２８３４９５０号明細書に開示されているように、シリコンウエハー上に反応物の固定を容易にするための媒体を反応物の固定面に保持し、分析結果をエリプソメトリーを利用して読みとる、いわゆる、光学的免疫分析分野である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【００２０】
【実施例１】
窒化珪素で表面を被覆した厚さ０．６ｍｍの４インチのシリコンウエハーに対し、分岐構造を持つアミノアルキルポリジメチルシロキサンを被覆したものを、図９に示す基体４として用いた。
反応物を基体４に線状に固定するために、図１〜８に示す冶具１０を作製した。図１は、冶具の表面からの見取り図、図２は、裏面からの見取り図、図３は、平面図、図４は、裏面図、図５は、図３のＡ−Ａ’における断面図、図６は、図３のＢ−Ｂ’における断面図、図７は、図３のＣ−Ｃ’における断面図、図８は、図３のＤ−Ｄ’における断面図である。この冶具は、ポリメチルメタアクリレートからなり、長さ７５ｍｍ、幅１ｍｍの一本の溝２と、溝と連結された５００μリットルのリザーバー部１を備えている。図１〜８では、一つの冶具にリザーバー部１及び溝２を各々４つ有しているが、本実施例では、各々一つのものを用いた。
【００２１】
基体４上にポリメチルメタアクリレートからなる治具１０を配置した。本実施例では、図１０に示すように、４つの冶具を配置した。
治具１０のリザーバー部に、反応物である１０ｕｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトトランスフェリン抗体（ロックランド社、米国ギルバーツビル、ＰＡ）を含む０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）　を添加した。４℃で、一昼夜、静置することによって、冶具の溝２に充填された溶液中の反応物を、基体表面に吸着させた。次いで、基体及び冶具を水洗後、風乾して、治具１０の溝２が接触していた位置が中心にくるように、９×９ｍｍに切り出し、図１１に示す、反応物６が線状に吸着した本発明の固体分析媒体５を作製した。図１１では４本の線状に固定された反応物が模式的に示されているが、本実施例では１本である。
【００２２】
分析対象物であるヒトトランスフェリン（ＯＥＭ社、米国トムスリバー、ＮＪ）１００ｎｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ、という）からなる被分析溶液２５ｕｌを、固体分析媒体５上に添加し、３分間放置して反応物と分析対象物を反応させた。反応の結果、想定生成物が形成されているか否かを確認するために、５％の１００−２００Ｋデキストラン（シグマ社、米国セント・ルイス、ＭＯ）、５０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトトランスフェリン抗体ＨＲＰコンジュゲート（ＩＣＮ社、米国オーロラ、ＯＨ）を含む０．１Ｍ　ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．５）を２５ｕｌ添加し１０分放置した。この後、６００ｕｌの洗浄液１（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ　ＴＲＩＺＭＡ　ｐＨ　８．０）、３００ｕｌの洗浄液２（０．１Ｍ　ＴＲＩＺＭＡ　ｐＨ　８．０）を滴下し、洗浄した。残った液はろ紙に吸収除去した。更に、固体分析媒体５上にＴＭＢ膜用基質システム溶液（シグマ社、米国セント・ルイス、ＭＯ）６０ｕｌを添加し、３分間後、３００ｕｌの洗浄液３（０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ５．０）を滴下洗浄した。残った液をろ紙に吸収除去したところ、図１２に模式的に示すように、冶具１０の溝の位置に相当する固体分析媒体５の表面が幅約１ｍｍの線状に青く発色した。図１２では模式的に４本の発色部３が記されているが、本実施例での発色部は１本である。これにより、反応物であるウサギ抗ヒトトランスフェリン抗体を基体４に線状に固定したことにより、分析対象物であるヒトトランスフェリンが被分析溶液中に存在していたことが判断できた。
【００２３】
【実施例２】
実施例１で作成した基体４及び治具１０を準備した。実施例１と同様に治具１０を基体４の上に置き、反応物を固定するために、治具１０のリザーバー部に反応物であるウサギ抗Ａ群溶連菌抗体（バイロスタット社、米国）２０ｕｇ／ｍｌを含有する０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を投入し、実施例１と同様に抗体を固定し、治具１０の溝部が接触していた位置が中心にくるように９×９ｍｍに切り出し固体分析媒体５とした。
一方、分析対象物として、１．３×１０^７個／ｍｌの　Ａ群溶連菌を含む溶液１０ｕｌに５ｕｌの８Ｍ　亜硝酸ナトリウム溶液と０．３５Ｍの酢酸水溶液５ｕｌを加え、１分間放置して抗原を抽出した後、０．５Ｍ　ＭＯＰＳＯ緩衝液ｐＨ７．０を１０ｕｌ加えて中和し、被分析溶液とした。被分析溶液２５ｕｌを固体分析媒体５上に添加し、５分間反応させた。反応の結果、想定生成物が形成されているか否かを確認するために、ＨＲＰ標識ウサギ抗Ａ群溶連菌抗体（バイロスタット社、米国）１００ｎｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ　ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．５）を２５ｕｌ添加し１０分放置した。実施例１と同様に洗浄、ＴＭＢ溶液と反応させたところ、冶具１０の溝２の位置に相当する固体分析媒体５の表面が幅約１ｍｍの線状に青く発色した。これにより、反応物であるウサギ抗Ａ群溶連菌抗体を基体４に線状に固定したことにより、分析対象物であるＡ群溶連菌が被分析溶液中に存在していたことが判断できた。
【００２４】
【実施例３】
長さ７５ｍｍ、幅１ｍｍ、溝と溝を隔てる隔壁の幅１ｍｍの二本の溝と、溝とおのおの単独で連結された５００μリットルのリザーバー部を二つ持つポリメチルメタアクリレートからなる治具を作成した。この治具を用いて反応物溶液を二つのリザーバーに入れて反応物を固定した以外は実施例１と同様の分析を行ったところ、冶具の溝の位置に相当する固体分析媒体の表面が、線間約１ｍｍ、線幅約１ｍｍの青い線状の発色部が二本確認された。
【００２５】
【実施例４】
実施例１と同様に、固体分析媒体を準備した。被分析溶液として、ＰＢＳ　２５ｕｌを固体分析媒体上に添加し、３分間放置した。実施例１と同様の反応の結果、想定生成物が形成されているか否かを確認するために５％の１００−２００Ｋデキストラン、５０ｎｇ／ｍｌ抗ヒトトランスフェリン抗体ＨＲＰコンジュゲートを含む０．１Ｍ　ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．５）を２５ｕｌ添加し１０分放置した。
その後、実施例１と同様に洗浄し、ＴＭＢ溶液と反応させたところ、固体分析媒体上には発色部は確認されず、切り出したときとほぼ同じ状態の表面が確認された。これにより、反応物であるウサギ抗ヒトトランスフェリン抗体を基体に線状に固定したことにより、分析対象物であるヒトトランスフェリンが被分析溶液中に存在していなかったことが判断できた。
【００２６】
【実施例５】
長さ７５ｍｍ、幅０．８ｍｍ、溝と溝を隔てる隔壁の幅０．８ｍｍの４本の溝２と、溝とおのおの単独で連結された５００μリットルのリザーバー部を四つ持つポリメチルメタアクリレートからなる治具１０を作成した。この治具は図１〜図８に示すものである。この治具１０を用いて反応物溶液を四つのリザーバーに入れて反応物を固定した以外は実施例１と同様の分析を行った。
ここで用いた固体分析媒体５は、図１１に模式的に示すものである。冶具１０の溝の位置に相当する固体分析媒体５の表面が図１２に示すように、線間約０．８ｍｍ、線幅約０．８ｍｍの青い線状の発色部３が四本確認された。
【００２７】
【実施例６】
実施例２と同様に固体分析媒体を準備した。被分析溶液として５ｕｌの８Ｍ　亜硝酸ナトリウム溶液と０．３５Ｍの酢酸水溶液５ｕｌを加えたものに、０．５Ｍ　ＭＯＰＳＯ緩衝液ｐＨ７．０を１０ｕｌ加えて中和したものを準備した。
被分析溶液２５ｕｌを固体分析媒体５上に添加し、５分間静置した。実施例２と同様の反応の結果、想定生成物が形成されているか否かを確認するために、ＨＲＰ標識ウサギ抗Ａ群溶連菌抗体（バイロスタット社、米国）１００ｎｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ　ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．５）を２５ｕｌ添加し１０分放置した。実施例２と同様に洗浄、ＴＭＢ溶液と反応させたところ、固体分析媒体５上には発色部は確認されず切り出したときとほぼ同じ状態の表面が確認された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によると、反応物を、その表面に幅０．１ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下の線状に固定されてなる、液体浸透性をもたず、かつ、気体浸透性をもたない固体分析媒体を用いることにより、材料が本質的に剛性を持つため、曲げ、ねじり等の機械的外力に対する強度が高く、製品の組み立て加工が容易となり、加工精度の向上がはかられる。
また、微多孔質の分析媒体を用いる場合、分析結果の判定に寄与する領域にのみ判定に必要な反応物を固定することが本質的に不可能なため、価格が高い反応物を用いた場合にコスト面で不利であるが、液体浸透性をもたず、かつ、気体浸透性ももたない固体分析媒体を用いることにより、分析結果の判定に寄与する領域にのみ判定に必要な反応物を固定することが可能となり、コストの無駄を省くことができる。
複数の反応物を固定して複数の反応を分析する場合も、反応物が線状に固定されているため、分析対象成分の定性的又は定量的分析がが迅速、かつ、容易になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】冶具の表面からの見取り図。
【図２】冶具の裏面からの見取り図。
【図３】冶具の平面図。
【図４】冶具の裏面図。
【図５】図３のＡ−Ａ’における断面図。
【図６】図３のＢ−Ｂ’における断面図。
【図７】図３のＣ−Ｃ’における断面図。
【図８】図３のＤ−Ｄ’における断面図。
【図９】基体の平面図。
【図１０】冶具が配置された基体の平面図。
【図１１】本発明の分析媒体。
【図１２】分析完了後の分析媒体。

Claims (3)

1. 分析対象成分が含まれる疑いのある被分析溶液中の分析対象成分と反応して、想定生成物を形成する反応物が、その表面に幅０．１ｍｍ以上、３．０ｍｍ以下の線状に固定されてなる、液体浸透性をもたず、かつ、気体浸透性をもたない固体分析媒体。
2. 想定生成物を形成する反応物が、被分析対象成分の特異的結合対である請求項１記載の固体分析媒体。
3. 想定生成物を形成する反応物が、基体上に、０．１ｍｍ以上、３ｍｍ以下の間隔で、線状に二本以上固定されている請求項１記載の固体分析媒体。

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