DE69121021T2

DE69121021T2 - Bindungsnachweisverfahren mit Konjugatrückgewinnung

Info

Publication number: DE69121021T2
Application number: DE69121021T
Authority: DE
Inventors: Shanfun Ching; Julian Gordon; Tsung-Hui K Jou
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-05-09
Filing date: 1991-04-24
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2011-04-25
Also published as: AU7598691A; ATE140794T1; KR920005766A; AU637489B2; EP0462376B1; EP0462376A2; CA2041782A1; DE69121021D1; ES2092523T3; JPH04230857A; EP0462376A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge von Analyt in einer Testprobe mittels eines Bindungsassays. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren, bei denen ein doppeltes Ablesesystem mit instrumentellen Mitteln verwendet wird, um das Konjugat an einer Einfangstelle und/oder an einer Konjugatrückgewinnungsstelle nachzuweisen.

2. Verwandte Technik

Verschiedene analytische Verfahren und Vorrichtungen werden geläufigerweise bei Assays eingesetzt, um die Anwesenheit und/oder Menge von interessierenden Substanzen oder von Substanzen mit klinischer Bedeutung zu bestimmen, die in biologischen oder nichtbiologischen Flüssigkeiten vorhanden sein können. Solche Substanzen werden üblicherweise als "Analyten" bezeichnet und können Antikörper, Antigene, Drogen, Hormone usw. umfassen.
Die Fähigkeit zur Verwendung von Materialien, die spezifisch an einen interessierenden Analyten binden, hat zu einem dynamischen Markt für diagnostische Vorrichtungen geführt, die auf der Verwendung von Bindungsassays beruhen. Bindungsassays umfassen spezifische Bindungsglieder, typischerweise Antikörper und Antigen als Immunreaktanten, wobei ein Glied des spezifischen Bindungspaares mit einer signalerzeugenden Verbindung (z. B. ein Antikörper, der mit einem Enzym, einer fluoreszenten Verbindung, einer chemilumineszenten Verbindung, einem radioaktiven Isotop, einer direkten sichtbaren Markierung usw.) markiert ist. Z. B. kann in einem Bindungsassay die Testprobe, von der vermutet wird, daß sie Analyt enthält, mit einem markierten anti-Analytantikörper, das heißt mit Konjugat, vermischt werden, und sie kann inkubiert werden, damit die Immunreaktion eintritt. Die Reaktionsmischung wird darauf analysiert, um entweder die Markierung nachzuweisen, die im Zusammenhang mit einem Antikörper/Analytkomplex (gebundenem Konjugat) auftritt, oder den markierten Antikörper, der nicht mit dem Analyt (freies Konjugat) komplexiert ist, so daß die Menge an Markierung bei einer Spezies zu der Menge an Analyt in der Testprobe in Beziehung gesetzt werden kann.
Das Festphasenassay ist ein geläufig verwendetes Bindungsassayverfahren. Es gibt eine Anzahl von Assayvorrichtungen und -verfahren, bei denen die Anwesenheit eines Analyten mittels der Bindung des Analyten an ein Konjugat und/oder an ein immobilisiertes komplementäres Bindungsglied angezeigt wird, das an eine feste Phase, wie etwa ein Stauchstäbchen, einen Teststreifen, einen Durchflußbausch, Papier, eine Fasermatrix oder an ein anderes Festphasenmaterial gebunden ist. Das Bindungsassay führt zu einer Aufteilung des Konjugates in dasjenige, das auf der festen Phase immobilisiert ist, und dasjenige, das frei bleibt. Typischerweise wird die Anwesenheit oder Menge an Analyt in einer Testprobe durch das Ausmaß angezeigt, zu dem das Konjugat an der festen Phase immobilisiert wird.
Die Verwendung von mit Reagenzien getränkten Teststreifen bei spezifischen Bindungsassays ist ebenfalls gut bekannt. Bei solchen Verfahren wird eine Testprobe auf einen Bereich des Teststreifens aufgegeben, und sie wird durch das Streifenmaterial hindurchwandern lassen, oder sie vermag es zu durchtränken. Auf diese Weise tritt der nachzuweisende oder zu messende Analyt durch das Material hindurch, üblicherweise mit Hilfe eines eluierenden Lösungsmittels, das die Testprobe selbst sein kann, oder mittels eines getrennt zugegebenen Lösungsmittels. Der Analyt wandert in eine Nachweiszone auf dem Streifen hinein, wo ein komplementäres Bindungsglied, an das der Analyt zu binden vermag, immobilisiert ist. Das Ausmaß, zu dem der Analyt in der Nachweiszone gebunden wird, kann mit Hilfe des Konjugates bestimmt werden, das ebenfalls in den Teststreifen eingebaut sein kann, oder das getrennt aufgegeben werden kann.
Beispiele für Vorrichtungen, die auf diesen Prinzipien beruhen, umfassen die folgenden Patente und Patentanmeldungen. Eine Teststreifenvorrichtung wird von Deutsch et al. in den U. S. Patenten mit den Nrn. 4 094 647, 4 235 601 und 4 361 537 beschrieben. Im allgemeinen umfaßt die Vorrichtung ein Material, das zum Lösungstransport mittels Kapillarwirkung, d. h. Dochtwirkung fähig ist. Verschiedene Bereiche oder Zonen auf dem Streifen enthalten die Reagenzien, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signales benötigt werden, wenn der Analyt zu diesen Zonen hin oder durch diese hindurch transportiert wird. Die Vorrichtung ist sowohl für chemische Assays als auch für Bindungsassays geeignet, und sie verwendet eine Entwicklerlösung, um den Analyten entlang des Streifens zu transportieren.
Tom et al. (U. S. Patent Nr. 4 366 241) offenbart einen saugfähigen Träger mit einer immunosorbierenden Zone, wo Testprobe aufgegeben wird, und wo das Assayergebnis abgelesen wird. Weng et al. (U. S. Patent Nr. 4 740 468) offenbart einen Teststreifen, worin die Bindung eines markierten spezifischen Bindungspaargliedes an ein unbewegliches zweites spezifisches Bindungspaarglied an einer kleinen Stelle auf einem saugfähigen Streifen die Beobachtung eines nachweisbaren Signals an der kleinen Stelle erlaubt, unter dem Vorbehalt, daß wenn das unbewegliche zweite spezifische Bindungspaarglied direkt das markierte spezifische Bindungspaarglied zu binden vermag, dann ein Analytanalogon, das zur Bindung des markierten spezifischen Bindungspaargliedes befähigt ist, ebenfalls auf dem Streifen vorhanden ist, um freies oder ungebundenes Konjugat zu entfernen, bevor es die Nachweisstelle an dem kleinen Ort erreicht. Greenquist (U. S. Patent Nr. 4 806 311) offenbart eine Vorrichtung mit vielen Bereichen oder vielen Schichten, die eine Nachweiszone und eine Reagenzzone, die freie monovalente markierte Bindungsglieder aus dem Testmedium entfernt, aufweist.
Weng et al. (U. S. Patent Nr. 4 740 468) offenbart eine Vorrichtung zur Verwendung mit einer Testlösung einschließlich Probe, von der vermutet wird, daß sie Analyt enthält, und ein erstes spezifisches Bindungsglied, das an den Analyten bindet, und das markiert ist. Die Vorrichtung ist ein Teststreifen, der ein zweites spezifisches Bindungsglied aufweist, das an einer kleinen Nachweisstelle immobilisiert ist, und das an den markierten Analyten bindet. Der Streifen umfaßt ebenfalls ein Analytanalogon, um jedwedes erste spezifisch bindende Glied zu binden, das zur Bindung des zweiten spezifischen Bindungsgliedes in Abwesenheit von Analyt in der Lage ist.
Andere Beschreibungen von Teststreifen, die von Interesse sind, sind vorgestellt im U. S. Patent Nr. 4 861 711, in EP 282 232, veröffentlicht am 28. September 1988, in WO 88/08534, veröffentlicht am 3. November 1988, in WO 88/08536, veröffentlicht am 3. November 1988 und in EP 286 371, veröffentlicht am 12. November 1988. Ebenfalls von Interesse ist die Offenbarung von Mickelson et al, die ein Verfahren und eine Testvorrichtung zum Abtrennen von markiertem Reagenz durch Bindung freien markierten Reagenzes an Mikropartikel vorstellt, die nicht durch eine Festphasenvorrichtung hinduchtreten. (EP 297 292).
Von weiterem Interesse ist EP 201 339, das eine Vorrichtung offenbart, die eine Reaktionskammer umfaßt, welche nicht-überlappende erste und zweite Reaktionsoberflächen aufweist, wobei auf der ersten Reaktionsoberfläche ein Analytbindungspartner immobilisiert ist, an den ein Analytkonjugat (ein markierter Analyt) auf reversible Weise gebunden ist, und eine zweite Reaktionsoberfläche, an der ein Bindungspartner für das Analytkonjugat immobilisiert ist. Das Signal wird an der zweiten Reaktionsoberfläche nachgewiesen.
Es tritt eine verstärkte Aktivität der Hersteller auf dem Gebiet der Teststreifen auf, weil es ein wachsende Nachfrage nach Vorrichtungen gibt, die wenige oder keine Handgriffe zur Durchführung des Assays verlangen, die von nicht geschultem Personal verwendet werden können, und die Ergebnisse liefern, die minimal durch Änderungen bei der Durchführungsweise des Assays beeinflußt werden. Weitere Betrachtungen sind die Leichtigkeit, mit der das beobachtete Signal nachgewiesen werden kann, wie auch die Leichtigkeit, mit der Konjugat, das an der Nachweisstelle immobilisiert wird, von dem Konjugat unterschieden werden kann, das durch die Nachweisstelle hindurchgewandert ist. Zusätzlich besteht ein Bedarf für ein Assayformat, das eine geringe Abnahme an nachweisbarem Signal in eine leichter nachweisbare Erscheinungsform des Signals überführt, und das den Nachweis beider solcher Signale ermöglicht. Ein solches Format würde ebenfalls die Empfindlichkeit des Assays verstärken, d. h. geringere Mengen an Analyt könnten nachgewiesen werden. Demgemäß verbleibt ein Bedarf an neuen Vorrichtungen, die leicht zu verwenden sind, die genau und schnell sind, und die selbst-durchführende Assaykontrollen umfassen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung der Menge an Analyt in einer Testprobe zur Verfügung. Die Vorrichtungen zum Durchführen der Verfahren der Erfindung umfassen ein Festphasenmaterial, durch das der Analyt und ein Konjugat (z. B. eine Markierung, die an ein Bindungsglied angebunden ist, das für den Analyten spezifisch ist) zu wandern vermögen. Die feste Phase umfaßt wenigstens zwei definierte und markierte Nachweisstellen, die nacheinander in Kontakt mit der Flüssigkeit gelangen, für die Immobilisierung und die vergleichende Anzeige von Konjugat oder von Komplexen davon. Die erste Nachweisstelle umfaßt eine Einfangsstelle, an der ein immobilisiertes Fangreagenz angebracht ist, das zur Konkurrenz mit dem Analyten um die Bindung an das Konjugat befähigt ist. Alternativ umfaßt die Einfangstelle ein Fangreagenz, an das der Analyt und das Konjugat konkurrierend binden. Eine zweite Nachweisstelle umfaßt eine Konjugatrückgewinnungsstelle, an der ein Konjugatrückgewinnungsreagenz angebracht ist, das von dem Fangreagenz verschieden ist und das zur Bindung sowohl des Konjugates als auch eines Komplexes davon befähigt ist. Die Konjugatrückgewinnungsstelle erhält und bindet diejenigen Analyt/Konjugat-Komplexe, die durch die Einfangstelle hindurchwandern. Wenn die Menge an Analyt in der Testprobe zunimmt, werden umso mehr Bindungsstellen des Konjugates von Analytmolekülen belegt, und umso weniger Konjugat verbleibt frei, um an das Fangreagenz zu binden. Statt dessen wandern die Analyt/Konjugat-Komplexe durch die Einfangstelle hindurch und wandern zu der Konjugatrückgewinnungsstelle, wo die Komplexe durch das Konjugatrückgewinnungsreagenz immobilisiert werden. Daher nimmt, wenn die Analytkonzentration ansteigt, das Konjugat, das an der Einfangstelle immobilisiert ist ab, und das Konjugat, das an der Rückgewinnungsstelle immobilisiert ist, nimmt zu.
Die vorliegende Erfindung bezieht ihre wesentlichen Vorteile aus der Verwendung des Konjugates und/oder der Verwendung des doppelten Ableseformats. Das Konjugat kann ein spezifisches Bindungsglied umfassen, das an eine nachweisbare Markierung konjugiert ist, wobei das Bindungsglied gleichzeitig mehr als einen Analyten zu binden vermag. Wahlweise kann das Konjugat mehr als ein spezifisches Bindungsglied umfassen, das an eine nachweisbare Markierung gebunden ist. Bei beiden Beispielen werden im wesentlichen alle Bindungsstellen auf dem Konjugat durch Analyt belegt, bevor das Konjugat durch die Einfangsstelle hindurchwandert, ohne an das Einfangreagenz zu binden.
Das doppelte Ableseformat verwendet mindestens zwei definierte Stellen für die vergleichende Anzeige von demjenigen Konjugat, das innerhalb der Stellen immobilisiert wird, z. B. wird ein markiertes Antikörperkonjugat, das nach der Reaktion mit dem Analyt der Probe nicht belegte Bindungsstellen aufweist, an der Einfangstelle für das Analytanalogon immobilisiert, während Konjugat, das im wesentlichen keine unbelegten Bindungsstellen nach der Reaktion mit der Probe aufweist, durch die Einfangstelle hindurchwandert und an der Konjugatrückgewinnungsstelle immobilisiert wird, wo das immobilisierte Reagenz zur Bindung der Markierung oder des spezifisch bindenden Gliedes des Konjugates, zur Bindung eines für das Konjugat besonderen Epitopes, zur Bindung des Analyten oder zur Bindung eines spezifisch bindenden Hilfsgliedes befähigt ist. Es wird keine unreaktive wanderungsfähige Spezies erzeugt, und die Verwendung von zwei Bindungsstellen für eine vergleichende Anzeige der beiden unterschiedlichen Reaktionskomplexe führt zu einem hochempfindlichen Bindungsassay, der gegenüber dem Stand der Technik nicht nahe ist.
Bei einer alternativen Ausführungsform umfaßt das Konjugat eine Markierung, die an ein spezifisch bindendes Glied gebunden ist, das eine Bindungsstelle aufweist, die für den Analyten spezifisch ist, wie auch eine Bindungsstelle, die für das Fangreagenz spezifisch ist, wobei die Bindung des Analyten an das Konjugat die Bindung des Fangreagenzes an das Konjugat hemmt, und wobei die Bindung des Konjugates an das Fangreagenz die Bindung des Analyten an das Konjugat hemmt. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Markierung sein, die an einen Antikörper geknüpft ist, wobei der Analyt für einen konstanten Bereich des Antikörpers spezifisch ist, und wobei das Fangreagenz für einen variablen Bereich des Antikörpers spezifisch ist, und wobei sowohl der Analyt als auch das Fangreagenz daran gehindert sind, gleichzeitig an das Konjugat zu binden. In der festen Phase sind wenigstens zwei definierte und - wahlweise markierte Nachweisstellen eingebaut, die nacheinander in Kontakt mit dem Flüssigkeitsfluß gelangen, und die der Immobilisierung und derr vergleichenden Anzeige des Konjugates oder eines Komplexes davon dienen, und die Konjugatrückgewinnungsstelle umfaßt ein Fangreagenz, das zur Bindung der Analyt/Konjugat-Komplexe befähigt ist, die durch die Einfangstelle hindurchwandern.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Vorrichtungen Durchflußbäusche oder geschichtete Vorrichtungen wie auch Teststreifen umfassen, die aus einem oder mehreren verschiedenen Materialien hergestellt sind. Abwandlungen der Vorrichtungen umfassen den Einbau von Aufgabebäuschen oder Schichten für die Testprobe, von Filtern, von Flußsteuerungsschichten, von Blockierungsschichten und von Aufsaugebäuschen&sub4; Das Konjugat kann in oder auf der Vorrichtung an einer Stelle, die sich stromaufwärts der Einfangstelle befindet enthalten sein, es kann reversibel an das Fangreagenz gebunden sein, oder es kann einzeln mit der Vorrichtung in Kontakt gebracht werden oder als Testlösung, wenn es mit der Testprobe vermischt wird. Auf ähnliche Weise können alle zusätzlichen signalerzeugenden Bestandteile, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals benötigt werden, auf oder in der Vorrichtung enthalten sein oder einzeln zugegeben werden.
Die Assayverfahren umfassen das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, mit einer Festphasenvorrichtung, wie oben beschrieben, wobei der Testprobe erlaubt wird, durch die Festphase hindurchzuwandern, und nacheinander in Kontakt mit der Einfangstelle und der Konjugatrückgewinnungsstelle zu gelangen. Es werden nachweisbare Komplexe aus dem Analyten, dem Konjugat, dem Einfangreagenz und dem Konjugatrückgewinnungsreagenz und wahlweise aus spezifisch bindenden Hilfsgliedern gebildet. Diese Komplexe werden dann sowohl an der Einfangsstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle durch instrumentelle Mittel nachgewiesen. Die vergleichenden Signale von den Stellen werden dann verwendet, um die Menge an Analyt in der Testprobe zu bestimmen. Bei Verfahren, bei denen das Konjugat zuvor an das Einfangreagenz komplexiert wird, verdrängt der Analyt, der in der Testprobe vorhanden ist, das Konjugat, das seinerseits von dem Konjugatrückgewinnungsreagenz an der Konjugatrückgewinnungsstelle zurückgefangen wird.
Die vorteilhafte Verwendung des Konjugats und der vergleichenden Bindungsstellen zum Nachweis der Menge an Analyt in der Testprobe stellt einen großen dynamischen Assaybereich zur Verfügung, es werden geringe Mengen an Analyt leichter nachgewiesen, und Proben, die große Mengen an Analyt enthalten, können einem Assay unterzogen werden, ohne daß ein Bedarf an zusätzlichen Verdünnungsschritten besteht. Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung bei einem Multianalyt-Assayverfahren eingesetzt werden, und sie liefert Kontrollen für das Assayverfahren, um die Verschlechterung einer Testprobe nachzuweisen.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie in größerem Detail nachfolgend beschrieben wird, umfassen die Assayvorrichtungen, die verwendet werden, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen, wenigstens eine Einfangstelle und wenigstens eine Konjugatrückgewinnungsstelle, an der nachweisbare Signale erzeugt werden. Die Einfangstelle und die Konjugatrückgewinnungsstelle weisen jeweils ein immobilisiertes Reagenz auf, das33 nicht unlöslich gemacht werden kann, oder das nicht anders von der Stelle entfernt werden kann. Im allgemeinen konkurriert das Einfangreagenz an der Einfangstelle mit dem Analyt der Testprobe um die Bindung an ein Konjugat, d. h. an ein markiertes spezifisch bindendes Glied. Vorzugsweise liefert das Konjugat mehrere Stellen zur Bindung an den Analyten. Wenn im wesentlichen alle Bindungsstellen des Konjugates durch den Analyten belegt sind, ist der Analyt/Konjugat-Komplex in der Lage, durch die Einfangstelle hindurchzuwandern, ohne daß das Konjugat an das Fangreagenz bindet, und ohne daß der Analyt/Konjugat-Komplex durch das Einfangreagenz immobilisiert wird. Das Reagenz der Konjugatrückgewinnungsstelle bindet und immobilisiert dann allen Analyt/Konjugat-Komplex, der durch die Einfangstelle hindurchgewandert ist. Eine vergleichende Analyse oder Messung der Mengen an Markierung an jeder Stelle zeigt die Menge an Analyt in der Testprobe an. Beide Stellen liefern ebenfalls vorteilhafte Assaykontrollfunkionen, die hier unten im Detail beschrieben werden.
Bevor mit der Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung begonnen wird, wird eine Anzahl von Bezeichnungen, die hierin verwendet werden, definiert.
"Testprobe" bezeichnet ein Material, das im Verdacht steht, den Analyten zu enthalten, und das direkt, wie es von der Quelle erhalten wurde oder nach Vorbehandlung, so daß sein Charakter verändert wird, verwendet wird. Die Testprobe kann aus jedweder Quelle erhalten werden, wie etwa einer physiologischen Flüssigkeit, einschließlich Blut, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit, Schweiß, Urin, Milch, Ascitesflüssigkeit, Schleim, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Fruchtwasser oder dergleichen. Die Flüssigkeit kann vor der Verwendung vorbehandelt werden, wie etwa bei der Herstellung von Plasma aus Blut, bei der verdünnung viskoser Flüssigkeiten oder dergleichen; die Verfahren der Behandlung können die Filtration, die Destillation, die Konzentration, die Inaktivierung interferierender Bestandteile und die Zugabe von Reagenzien umfassen. Neben physiologischen Flüssigkeiten können andere flüssige Proben wie etwa Wasser, Nahrungsprodukte und dergleichen für die Durchführung - von umwelttechnischen oder Nahrungsmittelsproduktionsassays wie auch von diagnostischen Assays verwendet werden. Zusätzlich kann ein festes Material, von dem vermutet wird, das es den Analyten enthält, als die Testprobe verwendet werden, sobald es so verändert wurde, daß es ein flüssiges Medium ausbildet, oder daß es den Analyten frei gibt.
"Spezifisch bindendes Glied" bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, d. h. von zwei unterschiedlichen Molekülen, bei denen eines der Moleküle spezifisch an das zweite Molekül über chemische oder physikalische Mittel bindet. Zusätzlich zu Antigenen und Antikörpern als Gliedern des spezifisch bindenden Paares umfassen weitere spezifisch bindende Paare beispielsweise, ohne Einschräkung: Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nukleotidsequenzen, komplementäre Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzymkofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme, eine Peptidsequenz und einen Antikörper, der für die Sequenz oder das gesamte Protein spezifisch ist, polymere Säuren und Basen, Farbstoffe und Proteinbinder, Peptide und spezifische Proteinbinder (z. B. Ribonuklease S-Peptid und Ribonuklease S- Protein), und dergleichen. Darüber hinaus können spezifische Bindungspaare Glieder umfassen, die Analoga der ursprünglichen spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analytanalogon oder ein spezifisch bindendes Glied, das mittels rekombinanter Verfahren gewonnen wurde. Wenn das spezifisch bindende Glied ein Immunreaktant ist, kann es z. B. ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten oder ein Komplex davon sein, und wenn ein Antikörper verwendet wird, kann er ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein rekombinantes Protein oder ein rekombinanter Antikörper, eine Mischung oder Mischungen oder ein Fragment oder Fragmente davon sein, wie auch eine Mischung eines Antikörpers und eines anderen spezifischen Bindungsgliedes. Die Details der Herstellung solcher Antikörper und deren Eignung zur Verwendung als spezifisch bindende Glieder sind dem Fachman gut bekannt.
"Analyt" oder "interessierender Analyt" bezeichnet die Verbindung oder die Zusammensetzung, die nachgewiesen oder gemessen werden soll, welche wenigstens ein Epitop oder eine Bindungsstelle aufweist. Der Analyt kann jedwede Substanz sein, für die ein natürlich vorkommendes Analyt-spezifisches bindendes Glied existiert, oder für die ein Analyt-spzifisches bindendes Gied hergestellt werden kann. Die Analyte umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Toxine, organische Verbindungen, Proteine, Peptide, Mikroorganismen, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Hormone, Steroide, Vitamine, Wirkstoffe (einschließlich solchen, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden, als auch solche, die für illegitime Zwecke verabreicht werden) und Metaboliten von oder Antikörper gegen jedwede der oben genannten Substanzen. Der Ausdruck "Analyt" umfaßt ebenfalls jedwede antigenische Substanzen, Haptene, Antikörper, Makromoleküle und Kombinationen davon.
"Analytanalogon" bezeichnet eine Substanz, die mit dem analytspezifischen Bindungsglied kreuzreagiert, auch wenn sie dies zu einem größeren oder geringeren Ausmaß als der Analyt selbst vermag. Das Analytanalogon kann einen abgewandelten Analyten wie auch einen fragmentierten oder synthetischen Anteil des Analytmoleküls umfassen, sofern das Analytanalogon wenigstens eine epitopische Stelle mit dem interessierenden Analyten gemein hat. Ein Beispiel für ein Analytanalogon ist eine synthetische Peptidsequenz, die wenigstens ein Epitop des Vollmolekül-Analyten wiederholt, so daß das Analytanalogon an das Analyt-spezifische Bindungsglied zu binden vermag.
"Konjugat" bezeichnet eine Substanz, die eine nachweisbare Markierung umfaßt, die kovalent oder nicht-kovalent an ein spezifisch bindendes Glied gebunden ist. Das Verfahren der Anbindung ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Die Markierung erlaubt dem Konjugat, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das direkt oder indirekt mit der Menge an Analyt in der Testprobe in Beziehung steht. Der Bestandteil des Konjugates, der das spezifisch bindende Glied darstellt, ist so gewählt, daß er direkt an den Analyten bindet, oder daß er indirekt mittels eines spezifisch bindenden Hilfsgliedes, das weiter unten im Detail beschrieben ist, an den Analyten bindet. Das Konjugat kann in den Teststreifen oder in die Vorrichtung an einer Stelle, die sich stromaufwärts der Einfangstelle befindet, eingebaut sein, es kann mit der Testprobe unter Ausbildung einer Testlösung vereinigt werden, es kann zu dem Teststreifen oder der Testvorrichtung separat von der Testprobe zugegeben werden, oder aber es kann an der Einfangstelle zuvor abgeschieden worden sein oder dort auf reversible Weise immobilisiert.
"Markierung" bezeichnet jedwede Substanz, die zur Erzeugung eines Signals befähigt ist, das mittels instrumenteller Mittel nachweisbar ist. Verschiedene Markierungen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Markierungen, die Signale entweder durch chemische oder physikalische Mittel erzeugen können, und sie können Enzyme und Substrate, Chromogene, Katalysatoren, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Markierungen, direkt sichtbare Markierungen einschließlich kollloidaler metallischer Partikel wie etwa Gold, kolloidaler nichtmetallischer Partikel wie etwa Selen, farbiger oder gefärbter Partikel wie etwa farbigem Kunstharz oder einem angefärbten Mikroorganismus, organischen Polymerlatexpartikeln und Liposomen oder anderen Vesikeln, die direkt sichtbare Substanzen enthalten, und dergleichen.
Die Auswahl einer besonderen Markierung ist nicht kritisch, aber die Markierung muß entweder selbst zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals fähig sein, wie etwa eine sichtbar nachweisbare farbige organische Polymerlatexpartikel oder eine instrumentell nachweisbare fluoreszierende Verbindung, oder sie muß zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals in Zusammenspiel mit ein oder mehreren zusätzlichen signalerzeugenden Bestandteilen in der Lage sein, wie etwa ein Enzym/Substrat- Signalerzeugungssystem. Eine Vielzahl von verschiedenen Konjugaten kann ausgebildet werden, indem entweder die Markierung oder das spezifisch bindende Glied abgeändert werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die Auswahl die Betrachtung des nachzuweisenden Analyten und das gewünschte Nachweismittel mit einbezieht.
"Signalerzeugender Bestandteil" bezeichnet jedwede Substanz, die zur Reaktion mit einem anderen Assayreagenz oder mit dem Analyten in der Lage ist, wobei ein Reaktionsprodukt oder ein Signal erzeugt wird, das die Anwesenheit des Analyten anzeigt, und das mittels instrumenteller Vorrichtungen nachweisbar ist. "Signalerzeugendes System", wie es hierin verwendet wird, bezeichnet die Gruppe von Assayreagenzien, die benötigt werden, um das gewünschte Reaktionsprodukt oder Signal zu erzeugen. Zum Beispiel können einer oder mehrere signalerzeugende Bestandteile mit der Markierung umgesetzt werden, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, zum Beispiel wird, wenn die Markierung ein Enzym ist, eine Verstärkung des nachweisbaren Signales erhalten, indem das Enzym mit einem oderer mehreren Substraten oder zusätzlichen Enzymen unter Erzeugung eines nachweisbaren Reaktionsproduktes umgesetzt wird.
Eine große Anzahl von Enzymen, die zur Verwendung als Markierung geeignet sind, sind im U. S. Paten Nr. 4 275 149 in den Spalten 19-23 offenbart. Ein Beispiel für ein signalerzeugendes System aus Enzym/Substrat, das bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ist das Enzym alkalische Phosphatase, bei dem das verwendete Substrat Nitro-blautetrazolium-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat oder ein Derivat oder Analogon davon ist.
Bei einem alternativen signalerzeugenden System kann die Markierung eine fluoreszente Verbindung sein, bei der keine enzymatische Behandlung der Markierung erforderlich ist, um das nachweisbare Signal zu erzeugen. Fluoreszente Moleküle, wie etwa Fluorescein, Phycobiliprotein, Rhodamin und deren Derivate und Analoga sind zur Verwendung als Markierungen in einem solchen System geeignet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine sichtbar nachweisbare Partikel als die Markierungskomponente des Konjugates verwendet, wobei eine instrumentelle Ablesung der Konzentration des Analyten ohne den Bedarf an zusätzlichen signalerzeugenden Bestandteilen an den reaktiven Ablesestellen ermöglicht wird. Materialien zur Verwendung als Partikel/Markierungen sind kolloidale Metalle wie etwa Gold und Farbstoffpartikel, wie etwa solche, die in den U. S. Patenten Nrn. 4 313 734 und 4 373 932 offenbart sind.
Die Herstellung und die Verwendung von nichtmetallischen Kolbiden, wie etwa kolloidalen Selenpartikeln, sind in der EP 298 368, veröffentlicht am 11 Januar 1989, des gleichen Anmelders offenbart. Die Verwendung von Markierungen aus kolloidalen Partikeln mit Teststreifen ist in der EP 299 428, veröffentlicht am 18 Januar 1989, des gleichen Anmelders offenbart. Organische Polymerlatexpartikel zur Verwendung als Markierungen sind in der EP 360 088, veröffentlicht am 28 März 1990, des gleichen Anmelders offenbart.
"Feste Phase" bezeichnet jedwedes geeignete chromatographische saugfähige poröse isotrope oder kapillare Material, das die Grundlage der Testvorrichtung bildet. Die Assayvorrichtung, die hierin offenbart ist, kann mehrere Anordnungen einnehmen, von denen viele von dem Material abhängig sind, das für die feste Phase ausgewählt wurde. Zum Beispiel kann die Assayvorrichtung ein Festphasenmaterial umfassen, das zur Verwendung in einer Durchflußassayvorrichtung, einer chromatographischen Säule, einem Tauchstäbchen oder einem Teststreifen ausgebildet ist. Es ist für den Fachmann unmittelbar verständlich, daß eine Teststreifenvorrichtung aus mehr als einem Material hergestellt sein kann (z. B. können unterschiedliche Bereiche oder Stellen aus unterschiedlichen Materialien hergestellt sein), und eine Durchflußvorrichtung kann mehr als eine Schicht aufweisen, wobei verschiedene Schichten aus verschiedenen Materialien hergestellt sein können, so lange die vielen Materialien oder Schichten sich miteinander in Flüssigkeitsflußkontakt befinden, wodurch der Durchgang der Testprobe zwischen den Materialien oder Schichten erlaubt wird. Der Flüssigkeitskontakt erlaubt den Durchgang wenigstens einer Bestandteile der Testprobe, zum Beispiel des Analyten zwischen den Bereichen oder Schichten der Vorrichtung, und der Durchgang ist vorzugsweise entlang der Kontaktstelle zwischen den Flüssigkeitsflußzonen oder Schichten einheitlich. Bei einer Durchflußvorrichtung, wie sie hierin offenbart ist, kann zwischen der Einfangstelle und der Konjugatrückgewinnungsstelle eine Blockierungsschicht vorhanden sein, derart daß die Anwesenheit oder Menge an Markierung, die an jeder Stelle immobilisiert wird, getrennt nachgewiesen und/oder gemessen werden kann, ohne daß das Signal von der anderen Stelle interferiert. Es ist ebenfalls von Vorteil, daß diese Bereiche oder Schichten der Vorrichtung, die ein Assayreagenz enthalten, durch Bereiche oder Schichten voneinander getrennt sein können, die keine Reagenzien enthalten, solange wie die Bereiche, Schichten oder Reagenzstellen in fortwährendem Flüssigkeitsflußkontakt miteinander sind; dies wird als indirekter Flüssigkeitsflußkontakt von reagenzenthaltenden Bereichen oder Schichten bezeichnet. Um die nachfolgende Offenbarung zu vereinfachen, wird die Testvorrichtung im wesentlichen als eine Teststreifenstruktur umfassend beschrieben, die wenigstens die immobilisierten Bindungsreagenzien enthält, die für die Durchführung des doppelten Ablesesystems notwendig sind.
"Einfangreagenz" bezeichnet ein spezifisch bindendes Glied, das an einen Anteil der festen Phase angebunden ist, oder an dieser nicht-diffundierbar angebracht, wobei eine "Einfangstelle" gebildet wird. Das Verfahren der Anbindung ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Das Einfangreagenz ist so ausgewählt, daß es das Konjugat oder einen Komplex davon bindet. Im allgemeinen konkurriert das Einfangreagenz mit dem Analyten um die Bindung an das Konjugat. Alternativ können der Analyt und das markierte Reagenz (z. B. der markierte Analyt) um die Bindung an das Einfangreagenz (z. B. den Analyt-spezifischen Antikörper) konkurrieren. Das Einfangreagenz kann so ausgewählt sein, daß es direkt das Konjugat bindet, oder daß es das Konjugat indirekt bindet, indem es an ein spezifisch bindendes Hilfsglied bindet, das an das Konjugat gebunden wird.
Die Einfangstelle ist ein begrenzter oder definierter Teil der festen Phase, so daß die spezifische Bindungsreaktion des Fangreagenzes und des Analyten oder Konjugates lokalisiert oder konzentriert stattfindet, um den Nachweis der Markierung, die an der Einfangstelle immobilisiert ist, zu erleichtern, im Gegensatz zu anderen Teilen der festen Phase. Das Einfangreagenz kann auf die feste Phase durch Tauchen, Beschriften mit einem Stift, Abgeben durch ein Kapillarrohr oder durch die Verwendung von Tintenstrahldrucktechnik für Reagenzien aufgebracht werden, wie dies in der EP 268 237, veröffentlicht am 25 Mai 1988, des gleichen Anmelders beschrieben ist.
Zusätzlich kann die Einfangstelle zum Beispiel mit einem Farbstoff markiert sein, so daß die Position der Einfangstelle auf der festen Phase visuell oder instrumentell bestimmt werden kann, selbst wenn keine Markierung an der Stelle immobilisiert ist. Das Fangreagenz ist auf der Vorrichtung in einer Menge vorhanden, die ausreichend ist, um im wesentlichen das ganze Konjugat in Abwesenheit von Analyt zu binden oder zurückzuhalten.
"Konjugatrückgewinnungsreagenz" bezeichnet ein spezifisches Bindungsglied, das auf oder innerhalb eines Teils des Teststreifens stromabwärts in Bezug auf die Einfangstelle angebracht ist, wobei es eine "Konjugatrückgewinnungsstelle" ausbildet, d. h. die Konjugatrückgewinnungsstelle, ist ein Bereich der festen Phase, an der Konjugat, das an der Einfangstelle nicht immobilisiert wurde, aus der wandernden Flüssigkeit oder der wandernden Testprobe zurückgewonnen wird. Die Konjugatrückgewinnungsstelle ist in direktem oder indirektem Flüssigkeitsflußkontakt mit der Einfangstelle, derart, daß die Testprobe durch die Einfangstelle hindurch diffundieren, oder in sie eintreten kann, und nachfolgend in die Konjugatrückgewinnungsstelle hineinwandern. Das Verfahren zur Anbindung des Konjugatrückgewinnungsreagenzes an die feste Phase ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch.
Das Konjugatrückgewinnungsreagenz ist ausgewählt, um das Konjugat oder Komplexe davon zu binden und dadurch zu immobilisieren. Zum Beispiel kann das Konjugatrückgewinnungsreagenz so ausgewählt sein, daß es den Markierungsanteil des Konjugates, den Anteil des Konjugates, der das spezifisch bindende Glied ausmacht, oder ein Epitop bindet, das durch die Konjugation der Markierung und des spezifisch bindenden Gliedes ausgebildet wurde, wie auch einen Komplex aus Konjugat und spezifisch bindendem Hilfsglied oder einen Konjugat/Analyt- Komplex. Ähnlich wie die Einfangsstelle, ist die Konjugatrückgewinnungsstelle der vorliegenden Erfindung ein begrenzter oder definierter Anteil der festen Phase, derart daß die spezifische Bindungsreaktion lokalisiert oder konzentriert ist, um den Nachweis der Markierung, die an der Stelle im Gegensatz zu den anderen Anteilen der festen Phase immobilisiert wird, zu erleichtern. Die Konjugatrückgewinnungsstelle kann derart markiert sein, daß die Stelle auf der festen Phase visuell oder instrumentell bestimmt werden kann, auch wenn keine Markierung an der Stelle immobilisiert ist. Das Konjugatrückgewinnungsreagenz kann auf die feste Phase mittels Verfahren aufgebracht werden, die denjenigen ähnlich sind, die oben für das Einfangreagenz beschrieben worden sind. Vorzugsweise ist das Konjugatrückgewinnungsreagenz auf der Vorrichtung in einer Menge vorhanden, die ausreichend ist, um im wesentlichen das gesamte Konjugat, das von der Einfangstelle verdrängt wird oder durch diese hindurchwandert, zu binden oder zurückzuhalten, d. h. die Menge ist allgemein wenigstens gleich der Menge an Analyt, von der normalerweise angenommen wird, daß sie in einer Testprobe vorhanden ist. Alternativ kann das Konjugatrückgewinnungsreagenz an der Rückgewinnungsstelle in einer Menge vorhanden sein, die die Menge an Analyt übersteigt, von der man erwartet, daß sie in der Probe vorhanden ist. Es können alternative Verfahren verwendet werden, um den Abtrennungsschritt durchzuführen, wie etwa das Anbinden eines Bindungsgliedes an die feste Phase, welches für das mobile Konjugatrückgewinnungsreagenz spezifisch ist, oder das Anbinden an die feste Phase eines reaktiven Agens, wie etwa einer geladenen Substanz, die eine entgegengesetzt geladene Substanz, die an ein mobiles Konjugatrückgewinnungsreagenz gebunden wurde, anzieht und bindet, wie es in der EP 326 100, veröffentlicht am 2 August 1989, des gleichen Anmelders offenbart ist.
"Spezifisch bindendes Hilfsglied" bezeichnet jedwedes Glied eines spezifischen Bindungspaares, das bei dem Assay zusätzlich zu den spezifisch bindenden Gliedern des Konjugates, des Einfangreagenzes oder des Konjugatrückgewinnungsreagenzes verwendet wird. Eines oder mehrere spezifisch bindende Hilfsglieder können in einem Assay verwendet werden. Z. B. kann ein spezifisch bindendes Hilfsglied zur Bindung des Konjugates an den interessierenden Analyten fähig sein, in den Fällen, in denen der Analyt selbst nicht direkt an das Konjugat angebunden werden kann, oder das spezifisch bindende Hilfsglied kann verwendet werden, um die Menge an Konjugat zu erhöhen, die mit dem Analyten in einer Bindungsreaktion Komplexe zu bilden vermag. Das spezifisch bindende Hilfsglied kann in die Assayvorrichtung eingebaut sein, oder es kann zu der Vorrichtung als getrennte Reagenzlösung zugegeben werden.
"Analytderivat" bezeichnet jedwede Substanz, deren Konzentration in der Testprobe oder in der Assayreaktionsmischung direkt zu der Analytkonzentration proportional ist. Z. B. kann das Derivat ein Komplex aus dem Analyten und einem spezifisch bindenden Hilfsglied sein, welcher seinerseits an ein angebundenes Glied bindet. Als weiteres Beispiel kann das Derivat ein Reaktionsprodukt sein, daß in stöchiometrischem Verhältnis zur Analytkonzentration ausgebildet wird, wobei das Reaktionsprodukt an ein angebundenes Glied bindet. Daher ist ein Analytderivat jedwede Substanz, die in quantitativer Beziehung zur Analytkonzentration steht.

Assayverfahren

Ein Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem zuerst die Testprobe und ein Konjugat, wie etwa ein markiertes, den Analyten spezifisch bindendes Glied zusammengegeben werden, wodurch eine Testlösung ausgebildet wird. Die Testlösung wird mit einer Festphasenvorrichtung in Kontakt gebracht, wie etwa mit einem Teststreifen. Der Streifen umfaßt folgendes: eine Aufgabestelle, mit der die Testlösung in Kontakt gebracht wird, eine Einfangstelle, an der ein Einfangreagenz angebunden ist (z. B. ein Analytanalogon), das zur Konkurrenz mit dem Analyten um die Bindung an das Konjugat befähigt ist, und eine Konjugatrückgewinnungsstelle, stromabwärts in Bezug auf die Einfangstelle, an der ein Konjugatrückgewinnungsreagenz angebunden ist, das zur Immobilisierung allen Konjugats fähig ist, das durch die Einfangstelle hindurchgewandert ist. Die nachweisbaren Signale werden sowohl an der Einfangstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle beobachtet, um das Assayergebnis zu bestimmen. Bei diesem Assay gilt, daß je mehr Analyt in der Testprobe vorhanden ist, um so weniger Konjugat an der Einfangstelle immobilisiert und um so mehr Konjugat an der Konjugatrückgewinnungsstelle immobilisiert wird. Die doppelten Nachweisstellen erlauben, daß beide Ergebnisse beobachtet und quantitativ bestimmt werden können. Der Vergleich des Ergebnisses an der Einfangstelle mit demjenigen an der Konjugatrückgewinnungsstelle sorgt für eine erhöhte Assayempfindlichkeit, da relativ geringe Abnahmen des Signals an der Einfangsstelle als relativ große Zunahmen des Signals an der Konjugatrückgewinnungsstelle auftauchen, wo zuvor kein Signal vorhanden war. Wenn man zusätzlich von einer bekannten Menge an Konjugat ausgeht, können die Verhältnisse des Konjugats, das an den beiden Nachweisstellen immobilisiert ist, verglichen werden, wobei ein Verhältnis erhalten wird, das verwendet werden kann, um quantitativ oder semi-quantitativ die Menge an Analyt, der in der Testprobe vorhanden ist, zu bestimmen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein polyvalentes Konjugat verwendet. Das polyvalente Konjugat ist zur gleichzeitigen Bindung an mehr als ein Analytmolekül in der Lage. Z. B. kann der Bestandteil des Konjugates, der das spezifisch bindende Glied ausmacht, polyvalent sein, wie etwa ein Antikörper, der mehrere Bindungsstellen aufweist, die zur Bindung mehrerer Analytmoleküle in der Lage sind. Alternativ kann die Markierung an mehr als ein monovalentes oder polyvalentes spezifisch bindendes Glied konjugiert sein, z. B. eine direkt sichtbare kolloidale Partikel an die mehrerere monovalente Antikörper gebunden sind, von denen jeder an Analytmolekül bindet.
Im wesentlichen müssen alle der Analytbindungsstellen auf dem polyvalenten Konjugat durch ein Analytmolekül aus der Testprobe besetzt werden, oder das Konjugat wird an der Einfangstelle immobilisiert, wo zum Beispiel das Konjugat an ein Fangreagenz bindet, das ein Analytanalogon ist. Daher muß bei dem polyvalenten Konjugat der vorliegenden Erfindung eine vorbestimmte Schwellenmenge an Analyt in der Testprobe vorhanden sein, bevor irgendein Konjugat durch die Einfangstelle hindurchwandert und zu der Konjugatrückgewinnungsstelle übertritt.
Die Verwendung eines polyvalenten Konjugates trägt ebenfalls zu der Verbreiterung des dynamischen Bereiches des Assayverfahrens bei. Ein bevorzugtes polyvalentes Konjugat umfaßt eine Markierung aus einer kolbidalen Partikel, an die eine Anzahl spezifisch bindender Gieder angebunden ist. Bei diesem polyvalenten Konjugat wird der dynamische Bereich des Assays durch die Anzahl der spezifisch bindenden Gieder festgelegt, die an die kolloidale Partikel gebunden sind. Ein solches Konjugat kann verwendet werden, um den dynamischen Bereich des Assays zu modulieren, indem sowohl die Größe der kolbidalen Partikel dahingehend gesteuert wird, mehr spezifisch bindendes Glied aufzunehmen, als auch die Anzahl der spezifisch bindenden Glieder pro kolloidaler Partikel. Wenn es viele Bindungsstellen auf dem Konjugat gibt, die der Analyt sättigen muß, wird proportional mehr Analyt gebraucht, um das Konjugat von der Einfangstelle zu verdrängen, oder um das Konjugat daran zu hindern, an der Einfangstelle gebunden zu werden, und dann gibt es einen vergrößerten Bereich, innerhalb dessen ein Wettbewerb zwischen dem Analyten und dem Analytanalogon um das Konjugat stattfindet.
Bei Abwandlungen der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Testprobe und das Konjugat einzeln mit der feste Phase in Kontakt gebracht werden, oder sie können kombiniert werden, wobei sie eine Testlösung ausbilden, die mit der feste Phase in Kontakt gebracht wird. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Konjugat in die Festphasentestvorrichtung eingebaut, so daß das Assay im wesentlichen eines ist, das sich von selbst durchführt, sobald es mit der Testprobe in Kontakt gebracht wurde. Die Aufgabestelle auf der festen Phase kann ein Anteil der Vorrichtung sein, auf der kein Reagenz vorhanden ist, oder die Aufgabestelle kann die Einfangstelle sein oder eine Stelle, an der mobiles Konjugat vorhanden ist. Bei Verfahren, die eine Markierung verwenden, die von sich aus nicht nachweisbar ist, wird die Phase mit jedwedem der verbleibenden Glieder eines signalerzeugenden Systems in Kontakt gebracht, die nicht in der Testlösung vorhanden waren, oder die nicht auf der festen Phase vorhanden waren. Alternativ können die Einfang- und die Konjugatrückgewinnungsstellen einzeln mit jedweder verbleibenden Signal-erzeugenden Komponente in Kontakt gebracht werden.
Jede der Ausführungsformen der Erfindung kann ebenfalls die Verwendung von spezifisch bindenden Hilfsgliedern miteinbeziehen. Eines oder mehrere spezifisch bindende Hilfsglieder können an geeigneten Stellen in oder auf der Vorrichtung plaziert werden oder dieser getrennt zugegeben werden, um die Bindung des Analyten, des Konjugats oder des Analyt/Konjugat-Komplexes an der Einfangstelle und/oder an der Konjugatrückgewinnungsstelle zu vervollständigen. Die spezifisch bindenden Hilfsglieder können Komplexe umfassen, die aus zwei oder mehr spezifisch bindenden Gliedern ausgebildet sind. Zusätzlich können die spezifisch bindenden Hilfsglieder verwendet werden, um indirekt die Anzahl der Bindungsstellen auf einem Analyten zu erhöhen, wie etwa derart, daß eine größere Menge an Konjugat an diesen binaet. Zum Beispiel kann ein Antikörper/Biotin-Komplex verwendet werden (d. h. ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das einen Antikörper umfaßt, der an mehrere Biotinmoleküle gebunden ist), um einen monovalenten Analyten (z. B. ein Antigen, das eine einzelne Bindungsstelle aufweist) an eine Mehrzahl von Konjugatmoleküle zu binden, die markierte Antibiotinantikörper umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet ein Konjugatverdrängungs-/wiedereinfang-Format. Zum Beispiel kann die Einfangstelle ein Einfangreagenz enthalten, das ein Analytanalogon ist, an welches ein Konjugat auf reversible Weise komplexiert wurde. Wenn sich kein Analyt in der Testprobe befindet, gibt es nur dann ein nachweisbares Signal an der Einfangstelle, weil kein Analyt vorhanden war, um konkurrierend an das Konjugat zu binden und dadurch das Konjugat von der Einfangstelle zu verdrängen. Wenn Analyt in der Testprobe vorhanden ist, dann wird jedoch das Konjugat von der Einfangstelle verdrängt, es bindet an den Analyten und wandert danach zur Konjugatrückgewinnungsstelle weiter, die ein spezifisch bindendes Glied enthält, das zur direkten oder indirekten Bindung an das Konjugat oder an einen Komplex davon fähig ist. Daher gilt, daß je größer die Menge an Analyt, der in der Testprobe vorhanden ist, die Menge an Konjugat, die von der Einfangstelle verdrängt wird, um so größer ist, und um so größer ist auch das nachweisbare Signal an der Konjugatrückgewinnungsstelle verglichen mit dem nachweisbaren Signal an der Einfangstelle. Die Verwendung des zuvor abgeschiedenen Konjugates, das reversiebel an der Einfangstelle gebunden ist, sorgt für die Sicherheit, daß die Abnahme des Signals an der Einfangstelle nicht einfach eine Folge einer nicht-spezifischen Inhibition des Konjugat-Einfangsvorganges an der Einfangsstelle ist. In den Beispielen für alternative Verdrängungs-/Wiederrücksgewinnungs-Formate kann die Einfangstelle ein Analyt-spezifisches bindendes Glied als Fangreagenz enthalten, an das das Konjugat, zum Beispiel ein markiertes Analytanalogon, zuvor ankomplexiert worden ist, oder die Einfangstelle kann einen Analyten oder ein Analytanalogon enthalten, an das das Konjugat, z. B. ein markiertes Analytspezifisches bindendes Glied reversibel komplexiert worden ist.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet das Verdrängungs-/Rückgewinnungsformat zusammen mit einem Konjugat, das eine direkt sichtbare Markierung umfaßt, die an ein spezifisch bindendes Glied angebunden ist. Die Verwendung direkt sichtbarer Markierungen ermöglicht den Nachweis von Signaländerungen sowohl an der Einfang- als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle, ohne daß Bedarf an der Zugabe von zusätzlichen signalerzeugenden Reagenzien besteht.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Konjugat eine Markierung, die an ein spezifisch bindendes Glied angebunden ist, wobei das bindende Glied sowohl Bindungsstelle,n aufweist, die für den Analyten spezifisch sind, als auch getrennte Bindungsstellen, die für das Einfangreagenz spezifisch sind. Das Fangreagenz kann ausgewählt sein, um eine Stelle auf dem Anteil des Konjugates, der das spezifisch bindende Glied ausmacht, zu binden, die von der Analyt-bindenden Stelle auf dem Anteil des Konjugates, die das spezifisch bindende Glied ausmacht, verschieden ist, und die Bindung des Fangreagenzes verhindert oder inhibiert die Bindung von Analyt an das Konjugat. Alternativ verhindert oder inhibiert die Bindung des Analyten die Bindung des Fangreagenzes an das Konjugat. Bei dieser Ausführungsform ist das Einfangreagenz weder ein Analyt, ein Analytanalogon noch ein Analytderivat. Eine Erklärung für diese Konkurrenz bei der konkurrierenden Bindung ist die sterische Hinderung. Zum Beispiel kann in einem Assay für den rheumatoiden Faktor (IgM) das Konjugat ein markierter Antibiotin-Antikörper (markierter-IgG) sein, und das Fangreagenz kann Biotin sein, wobei der Analyt und das Fangreagenz um die Bindung an den Antikörperbestandteil des Konjugates zu konkurrieren vermögen. Der Konjugatantikörper hat einen konstanten Bereich oder eine konstante Domäne (isotypes Fragment), an das gewisse spezifisch bindende Glieder binden, und er weist wenigstens eine variable Region oder eine variable Domäne (ein idiotypes Fragment) auf, an das andere spezifisch bindende Glieder binden. In diesem Beispiel bindet der IgM- Analyt, der ein Anti-IgG-Antikörper ist, an einen isotypischen Epitopbereich des IgG-Moleküls, während das Biotineinfangreagenz an das idiotypische Epitop auf dem IgG-Molekül bindet. Die Bindung des Analyten an das Konjugat beeinflußt das IgG-Molekül derart, daß das Molekül nicht in der Lage ist, gleichzeitig das Fangreagenz zu binden. Der genaue Grund für eine solche Bindungsinterferenz ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, der Fachmann kann empirisch bestimmen, ob die Bindung eines Analyten an ein Konjugat die nachfolgende Bindung des Konjugates an ein Fangreagenz inhibiert.
Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt ebenfalls die Durchführung eines kombinierten Konkurrenz/Sandwichassays auf den Vorrichtungen mit doppelter Ablesung. In dem Beispiel mit dem rheumatoiden Faktor kann das Konjugatrückgewinnungsreagenz ein Analyt-spezifisches Bindungsglied sein, das direkt an den Analytanteil des Analyt/Konjugat- Komplexes bindet, der durch die Fangstelle hindurchwandert, wobei ein Sandwich aus Fangreagenz/Analyt/Konjugat ausgebildet wird.
Die Konjugate und das doppelte Ableseformat sind ebenfalls bei der Durchführung von Assays zum Nachweis der Menge mehr als eines Analyten in der Testprobe von Vorteil. Zum Beispiel kann bei einem Mehrfachwirkstoff-Screening- Assayverfahren und einer -Vorrichtung eine Fangstelle für jeden verschiedenen Analyten, der nachgewiesen werden soll, vorhanden sein; eine Fangstelle kann ein Kokain-Analytenanalogon enthalten, eine zweite kann ein Opiat-Analytenanalogon enthalten und eine dritte kann ein Amphetamin-Analytenanalogon enthalten. Ein Konjugat, das eine Markierung und ein geeignetes Analyt- spezifisches bindendes Glied umfaßt, kann reversibel an das Analytanalogon an jeder Fangstelle komplexiert werden. Die Konjugatrückgewinnungsstelle kann ein spezifisch bindendes Glied umfassen, das alle Konjugat/Analyt-Komplexe, die in Anwesenheit von Analyt gebildet wetden, und die durch die Einfangstellen hindurchwandern und zu der Rückgewinnungsstelle hinwandern, immobilisiert. Das doppelte Anzeigesystem der vorliegenden Erfindung zeigt die Anwesenheit eines Wirkstoffes oder von Wirkstoffen über die Abnahme der Markierung an einer oder mehreren Einfangstellen und über die Zunahme der Markierung an der Konjugatrückgewinnungsstelle an. Eine Abwandlung des Multianalytenassays kann die Verwendung von mehrfachen Konjugatrückgewinnungsstellen umfassen. Wenn es notwendig ist, zu wissen, welcher Wirkstoff in der Testprobe vorhanden ist, kann ein verschiedenes Konjugatrückgewinnungsreagenz an getrennten Konjugatrückgewinnungsstelle für jeden Analyten verwendet werden, derart daß ein gegebener Analyt sowohl durch ein abnehmendes als auch durch ein zunehmendes Signal nachgewiesen werden kann. Wenn es alternativ nur notwendig ist, zu wissen, ob irgendeiner der Wirkstoffe vorhanden ist, kann ein einzelnes Konjugatrückgewinnungsreagenz (ein "allgemeines" Konjugatrückge-winnungsreagenz, in dem der Bestandteil, der das spezifisch bindende Glied ausmacht, an alle verwendeten Konjugate bindet) an mehreren Stellen verwendet werden, wobei eine Leiter-artige Konfiguration ausgebildet wird, die eingehender hier unten beschrieben ist, wobei die Menge an Analyten oder einer kombinierten Menge von Analyten in der Testprobe umso größer ist, je größer die Anzahl der Rückgewinnungsstellen ist, an der die Markierung nachweisbar ist.
Die neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung erhöhen die Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit des Assays, indem sie den Nachweis und/oder die Messung von abnehmenden und zunehmenden Signalen an zwei verschiedenen Stellen für einen einzelnen Analyten erlauben. Der Nachweis der Assayergebnisse an den beiden Stellen wird mittels eines Ableseinstrumentes durchgeführt. Die Beobachtung des Signals sowohl an der Einfangstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle liefert eine doppelte Kontrolle im Hinblick auf die Gültigkeit des Assayergebnisses.
Durch Anwendung des Verfahrens mit geeignet eingestellten Mengen an Konjugat, Fangreagenz und Konjugatrückgewinnungsreagenz, kann ein ausgedehnter Genauigkeitsbereich für einen quantitativen oder halb-quantitativen Assay erhalten werden. Wenn das Konjugatverdrängunqs/Rückgewinnungsformat bei niedrigen Analytkonzentrationen angewendet wird, existiert an der Einfangstelle nur eine geringe Signalabnahme, aber es tritt eine höhere Empfindlichkeit an der Konjugatrückgewinnungsstelle auf, wo das Erscheinen selbst eines schwachen Signals einfacher beobachtet werden kann. Bei hohen Analytkonzentrationen tritt eine größere Empfindlichkeit an der Einfangstelle ein, da die Abnahme des Signals groß ist, und das zunehmende Signal an der Konjugatrückgewinnungsstelle kann einfach nachgewiesen werden und dient der Gültigkeitsuntersuchung der quantitativen Ergebnisse. Es wird für den Fachmann erkenntlich, daß bei einer geeigneten Auswahl der Reagenzkonzentrationen die Vorrichtung derart ausgelegt werden kann, daß die beiden Nachweisstellen optimale nicht-überlappende Empfindlichkeiten aufweisen.
Ein weiterer vorteilhafter Aspekt des doppelten Ablesesystems ist die Fähigkeit zum Nachweis der Veränderung von Testproben, was besonders auf dem Gebiet der Drogenmißbrauchs eine vorteilhafte Assaykontrolle darstellt. Wenn bei herkömmlichen Immunoassayverfahren eine Urintestprobe mit einer Substanz wie etwa einer Bleiche, einem Haushaltreinigungsmittel, einer Säure oder einer Base verändert wird, ist die Immunreaktion gehemmt, und ein falsches negatives Ergebnis wird an der Nachweisstelle bei einem Sandwichassayformat beobachtet. Die Veränderung hemmt nämlich die Bindungsreaktion, und die Hemmung tritt als Assayergebnis zutage, das die Abwesenheit des Analyten anzeigt. Bei dem doppelten Ablesesystem jedoch, führt die Veränderung der Testprobe zur Abwesenheit von Signal sowohl an der Einfangstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle, wodurch die Veränderung sofort offensichtlich wird.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung im Hinblick auf die Assaykontrolle wird durch das doppelte Ableseformat im Vergleich zur einzigen Nachweisstelle der Vorrichtungen gemäß dem Stand der Technik zur Verfügung gestellt. Bei den zuvor bekannten Vorrichtungen zeigt die Einfangstelle kein nachweisbares Signal, wenn die Testprobe eine abnormal hohe Menge an Analyt enthält, zum Beispiel wenn der Analyt die zur Verfügung stehenden Konjugatbindungsstellen überbelädt, so daß kein Konjugat mehr zur Bindung an der Einfangstelle befähigt ist. Bei der vorliegenden Erfindung wird jedoch Konjugat, dessen Bindungsstellen völlig durch Analyt besetzt sind, noch an der Konjugatrückgewinnungsstelle immobilisiert. Daher weisen die hierin offenbarten Vorrichtungen die Anwesenheit oder Menge an Analyt selbst dann noch nach, wenn die Testprobe eine abnormal hohe Menge an Analyt enthält.

Assayvorrichtung

Die hierin offenbarte Assayvorrichtung kann jedwedes geeignete absorbierende, poröse, isotrope oder Kapillaren besitzende Material sein, durch das eine Lösung oder eine Flüssigkeit, die den Analyten enthält, hindurchwandern kann. Die Lösung kann durch die feste Phase durch absaugende, hydraulische, pneumatische, hygroskopische oder kapillare Kräfte hindurchgezogen oder hindurchgedrückt werden, oder durch eine Kombination davon. Mögliche Assayvorrichtungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine herkömmliche chromatographische Säule, einen ausgedehnten Materialstreifen, in dem der Flüssigkeitsfluß im wesentlichen linear ist, und ein Bogen worin der Flüssigkeitsfluß linear oder radial ist. Wenn eine Durchflußvorrichtung hergestellt wird, ist wie oben beschrieben eine blockierende Schicht allgemein zwischen der Einfangstelle und der Konjugatrückgewinnungsstelle vorhanden, so daß die Anwesenheit oder Menge von Markierung, die an jeder Stelle immobilisiert wird, getrennt nachgwiesen und/oder gemessen werden kann, ohne daß ein interferierendes Signal auftritt. Zum Beispiel kann ein geeigneter Bestandteil für eine blockierende Schicht zur Verwendung mit chromogenen Markierungen oder Markierungen aus kolbidalen Partikeln jedwedes matt machende Material umfassen, das verhindert, daß das Signal der einen Stelle an der anderen Ablesestelle oder den anderen Ablesestellen ablesbar ist.
Natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Festphasenmaterialien, die synthetisch abgewandelt sind, können verwendet werden und umfassen folgendes: Papiere (faserige) oder Membranen (mikroporöse) aus Zellulosematerialien, wie etwa Papier, Zellulose und Zellulosederivaten, wie etwa Zelluloseacetat und Nitrozellulose, Glasfaser, Stoff, sowohl natürlich vorkommender (z. B. Baumwolle) als auch synthetischer (z. B. Nylon), poröse Gele, wie etwa Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine, poröse Fasermatrizen, auf Stärke basierende Materialien, wie etwa kreuzvernetzte Dextranketten der Marke Sephadex , keramische Materialien, olefinische oder thermoplastische Materialien einschließlich Filmen aus Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polyvinylacetat, Polyamid, Polycarbonat, Polystyrol, Copolymere aus Vinylacetat und Vinylchlorid und Kombinationen aus Polyvinylchlorid-Silica, und dergleichen. Das Festphasenmaterial sollte mit der Erzeugung eines nachweisbaren Signals nicht interferieren. Wenn ein Streifen oder Bogen verwendet wird, sollte das Material eine vernünftige ihm innewohnende Festigkeit aufweisen, oder aber die Festigkeit kann mittels eines zusätzlichen Trägers zur Verfügung gestellt werden.
Ein bevorzugtes Festphasenmaterial ist Nitrozellulose. Besonders wenn ein membranartiges Festphasenmaterial verwendet wird, können die Testprobe und das Konjugat vor dem Beginn des Flüssigkeitsdurchflusses durch die feste Phase vermischt werden, um eine gesteuerte reproduzierbare Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und dem Konjugat zu erhalten. Alternativ kann die Testvorrichtung desweiteren einen Vorvermischungs-Aufgabebausch umfassen, der das Konjugat enthält. Eine solche Vorrichtung ist in der EP 323 605, veröffentlicht am 12 Juni 1989, des gleichen Anmelders offenbart.
Das Material des Aufgabebausches sollte aufgrund seiner Fähigkeit, die Testprobe mit dem Konjugat vorzuvermischen, ausgewählt werden. Wenn Nitrozellulose als die feste Phase verwendet wird, ist eine Polyethylenfritte aus hydrophilem Porex oder Glasfaserfilterpapier das geeignete Material für den Aufgabebausch. Wenn alternativ ein Festphasenmaterial wie etwa ein Glasfaserfilterpapier verwendet wird, kann das Konjugat reversibel auf dem Streifen entweder an der Probenaufgabestelle oder an einer anderen Stelle stromaufwärts der Einfangstelle immobilisiert werden. Bei noch weiteren alternativen Vorrichtungen und Verfahren kann das Konjugat zu der Vorrichtung als separate Reagenzlösung zugegeben werden, entweder nach oder gleichzeitig mit der Testprobe.
Ein Aufgabebausch kann aus jedwedem Material hergestellt sein, aus dem die Testprobe in den Teststreifen hinüberzutreten vermag. Materialien, die zur Verwendung bei Aufgabebäuschen bevorzugt sind, umfassen poröse Polyethylenfritten oder -bäusche und Glasfaserbäusche oder Filterpapier. Das Material muß ebenfalls aufgrund seiner Kompatibilität mit dem Analyten und den Assayreagenzien ausgewählt sein.
Zusätzlich kann der Aufgabebausch eines oder mehrere Assayreagenzien enthalten, die entweder diffusiv oder nicht- diffusiv an diesen angebunden sind. Die Reagenzien, die in dem Aufgabebausch enthalten sein können, umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, das Konjugat, spezifisch bindende Hilfsglieder, Reagenzien zur Vorbehandlung der Testprobe und signalerzeugende Bestandteile. Die Isolierung der Assayreagenzien auf dem Aufgabebäusch sorgt ebenfalls dafür, daß miteinander wechselwirkende Reagenzien voneinander getrennt bleiben, und sie erleichtert das Verfahren der Herstellung.
Die besonderen Abmessungen der festen Phase sind eine Frage der Eignung und hängen von der Größe der verwendeten Testprobe, der Assayvorschrift, dem Mittel zum Nachweisen und Messen des Signals und dergleichen ab. Zum Beispiel können die Abmessungen derart ausgewählt sein, daß sie die Geschwindigkeit der Flüssigkeitswanderung wie auch die Menge der Testprobe regulieren, mit der die feste Phase durchtränkt wird.
Die Einfang- und/oder die Konjugatrückgewinnungsstelle kann ausgebildet werden, indem ein geeignetes spezifisch bindendes Glied direkt oder indirekt an den Teststreifen angebunden wird. Die direkten Anbindungsverfahren umfassen die Adsorption oder die kovalente Bindung wie etwa durch Verwendung von (i) einem Cyanogenhalogenid, z. B. Cyanogenbromid oder (ii) Glutaraldehyd. Wenn der Teststreifen aus Nitrozellulose besteht, ist es bevorzugenswert, das gewünschte Reagenz direkt auf dem Teststreifen mittels Adsorption zu immobilisieren.
Es ist nicht notwendig, daß das Einfangreagenz und das Konjugatrückgewinnungsreagenz direkt an die feste Phase gebunden sind. Das spezifisch bindende Glied kann an ein weiteres Material angebunden sein, wobei dieses Material physikalisch innerhalb der festen Phase durch physikalische, chemische oder biochemische Mittel eingefangen oder zurückgehalten und immobilisiert ist. Zum Beispiel kann das spezifisch bindende Glied an unlösliche Mikropartikel angebunden sein, die ihrerseits an der festen Phase angebracht sind. Das Mittel zur Anbindung eines Reagenzes an die Mikropartikel umfaßt sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Mittel. Es wird allgemein bevorzugt, daß das Einfangreagenz und das Konjugatrückgewinnungsreagenz an die Mikropartikel mittels kovalenter Mittel angebunden sind. Mit "zurückgehalten und immobilisiert" ist gemeint, daß die Partikel, wenn sie einmal auf dem Teststreifen sind, sich nicht wesentlich an Stellen anderswo innerhalb des Materials hin bewegen können. Die Partikel können vom Fachmann aus jedweder Sorte von teilchenförmigem Material ausgewählt werden, einschließlich Materialien, die aus Polystyrol, Polymethylacrylat, Polyacrylamid, Polypropylen, Latex, Polytetrafluorethylen, Polyacrylnitryl, Polycarbonat, Glas oder ähnlichen Materialien bestehen. Die Größe der Partikel ist nicht kritisch, obwohl allgemein bevorzugt wird, daß der mittlere Durchmesser der Partikel kleiner als der mittlere Porendurchmesser oder die Kapillargröße der festen Phase ist.
Die Größe der Partikel kann sowohl von dem Typ des verwendeten Festphasenmaterials wie auch von dem Typ dem Materails abhängen, aus der die Partikel besteht. Z. B. sollten bei einer Assayvorrichtung aus Glasfaser die Glas- und Polystyrolpartikel von einer ausreichenden Größe sein, um in den Poren des Festphasenmaterials eingefangen oder immobilisiert zu werden, und um sich nicht zu bewegen, wenn sie mit der wandernden Flüssigkeit konfrontiert werden. In der gleichen Glasfasermatrix können wesentlich kleinere Latexpartikel verwendet werden, weil sich die Latexpartikel in unerwarteter Weise mittels unbekannter Mechanismen an die Glasfaser anheften, siehe EP 389 003, veriffentlicht am. 29. September 1990, des gleichen Anmelders. Ebenfalls sind, anders als die porengrößenabhängigen Glas- und Kunstharzpartikel, die Latexpartikel nicht von der Porengröße abhängig, so daß chargenbedingte Variationen der Porengröße des Festphasenmaterials die Leistung der Vorrichung nicht schmälern.
Vorbestimmte Mengen von signalerzeugenden Bestandteilen und spezifisch bindenden Hilfsgliedern können innerhalb der Vorrichtung eingebaut sein, wodurch der Bedarf an zusätzlichen Durchführungsschritten oder Reagenzzugaben verhindert wird. Daher liegt es innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung, mehr als ein Reagenz an die Mikropartikel, die innerhalb des Teststreifens immobilisiert werden sollen, anzubinden. Zum Beispiel kann das Substrat innerhalb des Teststreifens immobilisiert werden, um die Diffusion des nachweisbaren Reaktionsproduktes in einem Enzym/Substratsignalerzeugenden System zu verlangsamen oder zu verhindern. Das Substrat kann durch direkte Anbindung an den Teststreifen mittels in der Technik gut bekannter Verfahren immobilisiert werden, oder das Substrat kann immobilisiert werden, indem es kovalent an unlösliche Mikropartikel gebunden wird, die in oder auf dem Teststreifen abgeschieden worden sind.
Das Fangreagenz und das Konjugatrückgewinnungsreagenz können einzeln oder in verschiedenen Kombination auf oder in den Teststreifen in einer Vielzahl von Konfigurationen aufgebracht werden, wobei unterschiedliche Nachweis- oder Meßformate erzeugt werden. Zum Beispiel können das Fangreagenz und das Konjugatrückgewinnungsreagenz aufgebracht werden, indem diskrete Bindungsstellen ausgebildet werden, die im wesentlichen kleiner als die Fläche des gesamten Teststreifens sind.
Alternativ können die Reagenzien über große Anteile des Teststreifens in im wesentlichen einheitlicher Weise verteilt werden, wobei Einfang- und Konjugatrückgewinnungsstellen ausgebildet werden. Das Ausmaß der Signalerzeugung entlang der Ausdehnung der Einfang- und Konjugatrückgewinnungsstellen steht zu der Menge an Analyt in der Testprobe in Beziehung. Die Menge an Analyt kann durch einen Vergleich der Länge oder der Distanz der resultierenden Signale mit denjenigen, die bei geeichten Analytstandards oder bei einer anderen Eichskala beobachtet werden, die zusammen mit der Vorrichtung vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird.
Alternative Ausführungsformen umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein: das Verteilen der Reagenzien gemäß einem Gradientenmuster, d.h. eine geringere Menge an Reagenz am stromabwärtigen Ende als am stromaufwärtigen Ende, sowohl an der Einfang- als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle, das Anordnen der geeigneten Assay- und Kontrollreagenzien zur Ausbildung von Mustern einschließlich Zahlen, Buchstaben, Punkten und Symbolen, wie etwa "+/-", "%" oder dergleichen; oder das Anordnen der Reagenzien als eine Abfolge von parallelen Streifen, die sich ungefähr in einem Abstand zum proximalen Ende befinden, d.h. vom Probenaufgabenende des Streifens bis ungefähr zum distalen Ende hin, wobei eine leiterarige Einfangstellen- und/oder Konjugatrückgewinnungsstellenanordnung erzeugt wird, oder das Anordnen der Reagenzien als aufeinanderabfolgende Ringe, die eine zentrale Testproben- oder Testlösungsaufgabestelle auf einer blattartigen Vorrichtung umgeben. Solche Reagenzverteilungen sind in der EP 299 428, veröffentlicht am 18. Januar 1989. und in der EP 389 003, veröffentlicht am 29. September 1990, des gleichen Anmelders offenbart.
Die verschiedenen Signalanzeigeformate oder -muster, die oben beschrieben sind, können ebenfalls Assaykontrollen zur Bestätigung der Wirksamkeit der Assayreagenzien oder der -vorrichtung, der Vervollständigung des Assays oder der richtigen Reihenfolge der Assayschritte umfassen. Es liegt ebenfalls innerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung, daß es am distalen Ende des Teststreifens ein Reagenz gibt, das die Vervollständigung eines Bindungsassays anzeigt (d. h. einen Indikator für das Assayende). Zum Beispiel kann das Ende des Assays durch die wechselnde Farbe des Indikators bei Kontakt mit der Testlösung, der Durchtränkungslösung oder einer signalerzeugenden Komponente angezeigt werden. Reagenzien, deren Farbe sich bei Kontakt mit einer wässerigen Testlösung ändert, umfassen die dehydratisierten Übergangsmetallsalze, wie etwa CuSO&sub4;, Co(NO&sub3;)&sub2; und dergleichen. Es können ebenfalls pH- Indikatorfarbstoffe ausgewählt werden die auf den pH der gepufferten Durchtränkungslösung ansprechen. Zum Beispiel wechselt Phenolphthalein bei Kontakt mit einer Durchtränkungslösung mit einem pH im Bereich zwischen 8,0 und 10,0 von farblos zu intensiv rosa.
Eine Testprobe kann mit dem Teststreifen in Kontakt gebracht werden, indem die Testprobe auf eine Aufgabestelle aufgebracht wird, oder indem die Aufgabestelle in die Testprobe eingetaucht wird. Bei einer blattartigen Vorrichtung, die radiale Einfang- und Konjugatrückgewinnungsstellen aufweist, wird die Probe auf eine zentrale Aufgabestelle aufgegeben. Bei einem Teststreifen oder einer Säule kann die Probe auf jedweden Teil des Streifens aufgegeben werden, der sich stromaufwärts der Einfangstelle befindet, oder die Aufgabestelle kann die Einfangstelle sein. Bevor die Probe mit der festen Phase in Kontakt gebracht wird, kann die Probe ebenfalls mit zusätzlichen Reagenzien wie etwa mit dem Konjugat, Puffern oder durchtränkenden Reagenzien (d. h. Reagenzien, die die Wanderung der Testprobe durch die feste Phase erleichtern, vermischt werden). Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Testprobe auf einen Anteil des Teststreifens stromaufwärts der Einfangstelle aufgebracht werden, wobei eines oder mehrere zusätzliche Reagenzien auf noch einen weiteren Bereich des Teststreifens stromaufwärts der Testprobenaufgabenstelle aufgebracht worden sind.
Die Vorrichtung kann des weiteren durch die Zugabe einer Filtrationsvorrichtung abgewandelt werden. Das Filtrationsmittel kann ein separates Material sein, das über die Aufgabestelle oder über den Aufgabebausch gelegt wird, oder das sich zwischen dem Aufgabebausch und dem Teststreifen befindet. Alternativ kann das Material der Aufgabestelle oder des Aufgabebausches aufgrund seiner Filtrationsfähigkeiten ausgewählt sein. Das Filtrationsmittel kann jedwede Filter- oder Wegfangvorrichtung umfassen, die verwendet werden kann, um Partikel überhalb einer gewissen Größe aus der Testprobe zu entfernen. Zum Beispiel kann die Filtervorrichtung verwendet werden, um rote Blutzellen aus einer Vollblutprobe zu entfernen, so daß die Flüssigkeit, die auf den Teststreifen übertragen wird, Plasma ist. Solche Filtermittel sind in dem U. S. Patent Nr. 4 477 575 und in der WO Anmeldung Nr. 86/02192, veröffentlicht am 23. April 1987 offenbart. Wahlweise kann das Filtermittel ein Reagenz oder Reagenzien umfassen, um die Partikel oder die interferierenden Stoffe aus der Testprobe zu entfernen.
Eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung bezieht die Verwendung eines zusätzlichen Bereiches, einer zusätzlichen Schicht oder von Schichten aus Material mit ein, die sich zwischen der Aufgabestelle oder dem Aufgabebausch und dem verbleibenden Teststreifen befinden, um die Geschwindigkeit des Flusses der Testprobe von der Aufgabestelle oder dem Bausch zu dem Teststreifen hin zu steuern. Eine solche Regulierung des Durchflusses wird bevorzugt, wenn eine ausgedehnte Inkubationsperiode für die Reaktion der Testprobe und der Reagenzien an der Aufgabestelle oder auf dem Aufgabebausch gewünscht ist. Alternativ kann ein solcher Bereich oder eine solche Schicht zusätzliches Assayreagenz (zusätzliche Assayreagenzien) enthalten, das/die vorzusweise von den Reagenzien der Aufgabestelle oder des Aufgabebausches isoliert ist/sind, bis die Testprobe zugegeben wird, oder er kann dazu dienen, um zu verhindern, daß nicht abreagierte Probe oder nicht abreagierte Assayreagenzien zu dem Teststreifen hinübertreten.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann die Vorrichtung ein absorbierendes Material stromabwärts von der Konjugatrückgewinnungsstelle umfassen. Es ist erkenntlich, daß absorbierende Material der Erhöhung der Menge an Testprobe und Konjugat dienen kann, die durch die Einfang- und Konjugatrückgewinnungsstellen auf der festen Phase hindurchtritt.
Wenn geringe Mengen nicht-wässeriger oder viskoser Testlösungen auf die Vorrichtung aufgegeben werden, kann es notwendig sein, eine Durchtränkungslösung, vorzugsweise eine gepufferte Durchtränkungslösung zu verwenden, um die Wanderung des Reagenzes (oder der Reagenzien) und der Testprobe durch die Vorrichtung zu erleichtern. Wenn eine wässerige Testprobe verwendet wird, ist eine Durchtränkungslösung im allgemeinen nicht notwendig, aber sie kann verwendet werden, um die Flußeigenschaften zu verbessern, oder um den pH der Testprobe einzustellen. Bei Immunoassays hat die Durchtränkungslösung typischserweise einen pH-Bereich von etwa 5,5 bis ungefähr 10,5 und bevorzugterweise von ungefähr 6,5 bis ungefähr 9,5. Der pH ist so ausgewählt, daß ein signifikantes Ausmaß an Bindungsaffinität zwischen den spezifisch bindenden Gliedern erhalten bleibt. Wenn der Markierungsbestandteil des Konjugates ein Enzym ist, muß jedoch der pH ebenfalls so ausgewählt sein, daß eine signifikante Enzymaktivität für die Farbentwicklung bei enzymatischen signalerzeugenden Systemen vorhanden bleibt. Beispielhafte Puffer umfassen Phosphat, Carbonat, Barbital, Diethylamin, tris(Hydroxymethyl)aminomethan (Tris), 2-Amino-2- methyl-i-propanol und dergleichen. Die Durchtränkungslösung und die Testlösung können vor dem In-Kontakt-Bringen mit dem Aufgabebausch kombiniert werden, oder sie können nacheinander mit dem Aufgabebausch in Kontakt gebracht werden.
Die Assayreagenzien wie etwa das Konjugat können direkt zu der Vorrichtung während der Durchführung des Assays zugegeben werden. Die bevorzugte Ausführungsform umfaßt jedoch den Einbau aller notwendigen Assayreagenzien in die Assayvorichtung, so daß nur eine flüssige Testprobe mit der Vorrichtung in Kontakt gebracht werden muß.
Die Vorrichtung kann in Kits zur Verfügung gestellt werden, um die Bindungsassays der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Z. B. kann ein Kit die Assayvorrichtung mit ihren eingebauten Reagenzien umfassen, und es kann wahlweise eine Durchtränkungslösung und/oder Reagenzien zur Vorbehandlung der Testprobe wie oben beschrieben umfassen. Andere Assaybestandteile, die dem Fachmann bekannt sind, wie etwa Puffer, Stabilisatoren, Detergentien, nicht-spezifisch bindende Inhibitoren, Bakterien-inhibierende Wirkstoffe und dergleichen können ebenfalls in der Assayvorrichtung und der Durchtränkungslösung vorhanden sein.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden nur aus Gründen der Anschauung angegeben, und sie sollen nicht als den Gedanken oder den Schutzumfang der Erfindung, so wie sie auf dieser Offenbarung beruht, ausgelegt werden. Viele Abwandlungen der folgenden Erfindung sind für den Fachmann offensichtlich.

Beispiel 1

Opiatassay

a. Konjugatherstellung

Ein Konjugat, das einen monoklonalen Antikörper umfaßte, der an eine direkt sichtbare Markierung angebunden war, wurde gemäß dem folgendem Verfahren hergestellt. 0,03%iges kolleidales Selen (5ml, Partikelgröße ungefähr 160-170nm, pH mit 2,0%ig Kaliumcarbonat auf 6,5 eingestellt) wurde mit einem monoklonalen anti-Morphiumantikörper der Maus (56µg, gezüchtet gegen 3-β-D- Glucuronidmorphium-Napfschnecken ["keyhole limpet"]-Hämocyanin) zehn Minuten lang umgesetzt. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 10%ig Poly(ethylenglykol) (50µl, PEG-20 000) gestoppt. Nach 5-minütigem Rühren wurde das Konjugat mit einem Verdünner vermischt (4,0ml, enthaltend 4% Saccharose, 2% Casein, 1% Pluronic-104 [BASF, Parsippany, NJ] und 50mM Tris bei pH 7,6). Das Konjugat wurde dann unter Verwendung eines 0,2 Mikron- Filters filtriert.

b. Teststreifenherstellung

Die Teststreifen wurden gemäß dem folgendem Verfahren hergestellt. Ein Fangreagenz aus 3-β-D-Glucuronid- Morphiumrinderserumalbumin [1,0mg/ml, in 0,1M MES (2-[N- Morpholino]ethansulfonsäure)puffer mit 20% Glyzerin und 2,0% Saccharose bei pH 5,0] wurde 10 Millimeter von einem Rand (d. h. am proximalen Ende) eines Nitrozellulosebogens (5 Mikron Porengröße, Schleicher und Schuell, Keene, NH) in einer horizontalen Linie aufgebracht. Das Fangreagenz war zur Konkurrenz mit dem Analyten in der Testprobe um die Bindung an das Konjugat befähigt. Ein Konjugatrückgewinnungsreagenz aus Ziegen-anti-Maus-IgG (0,5mg/ml, 0,1M Tris Puffer mit 20% Glyzerin, 2,0% Saccharose und 1% Rinderserumalbumin [BSA] bei pH 8,0) wurde fünfzehn Millimeter von dem gleichen Rand des Bogens aufgebracht. Das Konjugatrückgewinnungsreagenz war zur Bindung und dadurch zur Immobilisierung des Konjugates fähig, das durch die Einfangstelle hindurchtrat. Der Bogen wurde luftgetrocknet und in Streifen (3 x 60mm) geschnitten, so daß die Einfangstelle und die Konjugat-rückgewinnungsstelle sich über die Breite der Streifen erstreckten und sich jeweils zehn und fünfzehn Millimeter von dem proximalen Ende der Streifen entfernt befanden.

c. Assayvorschrift

Die Probe (10µl) und das Konjugat (10µl) wurden in einer Vertiefung vereinigt, wobei eine Testlösung ausgebildet wurde. Das proximale Ende eines Teststreifens wurde in die Vertiefung eingetragen, so daß die Testlösung durch den Streifen hindurch zu der Einfangstelle und zu der Konjugatrückgewinnungsstelle wanderte. Als die Testmischung das weit entfernte Ende des Streifens erreichte, wurde der Streifen entfernt und luftgetrocknet. Der Streifen wurde dann bei 540 Nanometer mit einem Reflektionsscanner (Camag TLC Scanner II, Multenz, Schweiz) abgetastet.
Je geringer die Menge an Analyt in der Testprobe ist, umso größer ist die Menge an Konjugat, die von dem Analytanalogon an der Einfangstelle eingefangen wird, und daher ist das Signal an der Einfangstelle relativ zum Signal an der Konjugatrückgewinnungsstelle um so größer. Je mehr die Menge an Analyt in der Probe zunahm, um so größer war die Menge an ausgebildetem Analyt/Konjugat-Komplex, und daher trat um so mehr Konjugat durch die Einfangstelle hindurch, um an der Konjugatrückgewinnungsstelle gebunden zu werden, die dann ein erhöhtes Signal aufwies. Die Menge an Opiat, die in der Probe vorhanden war, wurde durch Beobachtung entweder der Einfangstelle oder der Konjugatrückgewinnungsstelle nachgewiesen, wenn die Opiatkonzentration unter 1 000 Nanogramm/Millimeter lag. Zusätzlich erlaubte das Format der Vorrichtung, in Abhängigkeit voh der Analytkonzentration die Beobachtung des Signals sowohl an der Einfang- als auch an der Rückgewinnungsstelle und lieferte daher eine hochgradig genaue Abschätzung der Analytkonzentration. Wenn die Opiatkonzentration höher als 1 000 Nanogramm/Milliliter war, wurde ein viel stärkeres Signal an der Konjugatrückgewinnungsstelle als an der Einfangstelle nachgewiesen. In diesen Fällen wurde die Probe verdünnt und neu getestet, um ihre Konzentration abzuschätzen. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse des Assays für verschiedene Probenkonzentrationen an Opiatanalyt. Tabelle 1 Opiat-Streifenassay

Beispiel 2

Benzodiazepinassay

a. Konjugatherstellung

Ein Konjugat, das einen Antikörper umfaßte, der an eine direkt sichtbare Markierung angebunden war, wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. 0,03%iges kolbidales Selen (5,0ml, Partikelgröße ungefähr 160-170nm, pH mit 2%ig Kaliumcarbonat auf 7,7 eingestellt) wurden mit deionisiertem Wasser (5,0ml) verdünnt und mit einem affinitätsgereinigten Schaf-anti-Benzodiazepin-Antikörper (70µg, gezüchtet gegen 1- Carbomethyl-7-chlorbenzodiazepinthyroglobulin) ungefähr zehn Minuten lang vermischt. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 5%ig BSA (100µl, 0,1M Tris bei pH 8,2) gestoppt. Nach zehn Minuten wurde das Konjugat erneut mit 2,0%ig Kaliumcarbonat auf pH 7,7 eingestellt. Das Konjugat wurde dann unter Verwendung eines 0,2µm Filters filtriert und bei 4º C bis zur Verwendung gelagert.

b. Teststreifenherstellung

Die Teststreifen wurden im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren hergestellt, das oben in Beispiel 1 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß 1-Carbomethyl- 7-chlorbenzodiazepin-Rinderserumalbumin (1,0mg/ml MES Puffer) verwendet wurde, um eine Analytanalogoneinfangstelle auszubilden, und daß ein Esel-anti-Schaf-IgG-Antikörper (1,0mg/ml Tris-Puffer) zur Ausbildung der Konjugatrückgewinnungsstelle verwendet wurde.

c. Assayvorschrift

Die Probe (10µl), Konjugat (10µl) und Phosphat-gepufferte Salzlösung (10µl, enthaltend 2,0% Casein, Q,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat [20] und 0,05% Natriumazid bei pH 7,4) wurden in einer Reaktionsvertiefung unter Ausbildung einer Testlösung vereinigt. Das proximale Ende eines Streifens wurde in die Vertiefung eingebracht, so daß die Testlösung durch den Streifen hindurch zu der Einfangstelle und zu der Konjugatrückgewinnungsstelle zu wandern vermochte. Als die Testmischung das ferne Ende, des Streifens erreichte, wurde der Streifen entfernt und luftgetrocknet. Der Streifen wurde dann abgelesen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Unterschiede bei den relativen Signalen an der Einfangstelle und der Konjugatrückgewinnungsstelle für eine Vielzahl von Benzodiazepinkonzentrationen (Analyt) sind in Tabelle 2 gezeigt. Als die Analytkonzentration gesteigert wurde, wurde weniger Konjugat an der Einfangstelle und mehr Konjugat an der Konjugatrückgewinnungsstelle immobilisiert. Tabelle 2 Benzodiazepinassay

Beispiel 3

Theophyllinassay

a. Konjugatherstellung

Ein Konjugat, das einen monoklonalten Antikörper umfaßte, der an eine direkt sichtbare Markierung angebunden war, wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. 0,03%iges kolbidales Selen (5,0ml, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, pH mit 2,0%ig Kaliumcarbonat auf 6,9 eingestellt) wurde mit deionisiertem Wasser (5,0ml) und mit einem monoklonalen anti-Theophyllin- Antikörper (20µg, Mäuseantikörper, der gegen 8-Theophyllinrinderserumalbumin gezüchtet worden war) ungefähr zehn Minuten lang vermischt. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 5%ig Casein (100µl, in 0,1M Natriumphosphat bei pH 7,15) gestoppt. Nach fünf Minuten wurde das Konjugat unter Verwendung eines 0,2µm Filters filtriert und bei 4º C bis zur Verwendung gelagert.

b. Teststreifenherstellung

Die Teststreifen wurden im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt, mit der Ausnahme daß 8-(3'-Carbopropyl)-1,3- dimethyl-xanthin-BSA (0,5mg/ml in 0,1M Natriumphosphatpuffer mit 20%ig Glyzerin und 2,0% Saccharose bei pH 5,0) verwendet wurde, um die Analytananlogoneinfangstelle auszubilden, und daß ein Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper (0,3mg/ml in 0,1M Tris Puffer mit 20% Glyzerin, 2,0% Saccharose und 1,0% BSA bei pH 8,0) verwendet wurde, um die Konjugatrückgewinnungsstelle auszubilden. Die Stellen wurden durch Auftüpfeln von Reagenzlinien mit der Hand auf einen Nitrozellulosestreifen mit einer Automikropipette ausgebildet.

c. Assayvorschrift

Die Assayvorschrift wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit der Vorschrift, die oben in Beispiel 2 beschrieben ist, ausgeführt. Die Unterschiede bei den relativen Signalen an der Einfangstelle und an der Konjugatrückgewinnungsstelle für eine Vielzahl von Theophyllinkonzentrationen (Analyt) sind in Tabelle 3 gezeigt. Als die Analytkonzentration anstieg, wurde weniger Konjugat an der Einfangstelle und mehr an der Konjugat an der Konjugatrückgewinnungsstelle immobilisiert. Tabelle 3 Theophyllinassay

Beispiel 4

Kokainassay

Für ein Kokainassay wurden ein Konjugat aus markiertem anti-Kokain-Antikörper und ein Teststreifen im wesentlichen in Übereinstimmung mit den Verfahren hergestellt, wie sie jeweils in den Beispielen 1a und 1b beschrieben sind. Der Teststreifen umfaßte eine Einfangstelle, die ein Analytanalogon- Einfangreagenz enthielt, und eine Konjugatrückgewinnungsstelle, die ein anti-Antikörper-, Konjugateinfangsreagenz enthielt. Die Assayversuchsvorschrift wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit der Vorschrift durchgeführt, die in Beispiel 1c beschrieben ist, unter Verwendung von Testproben, die 1,0 bis 250µg/ml Benzoylecgonin enthielten. Das Signal wurde gemessen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.

Beispiel 5

Sandwichassay für rheumatoiden Faktor

a. Konjugatherstelleung

Ein Konjugat, das einen Kaninchen-Antibiotin-Antikörper und eine direkt sichtbare Markierung umfaßte, wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. Eine 1%ige Goldchloridlösung wurde in destilliertem Wasser hergestellt. Fünfhundert Milliliter destilliertes Wasser wurden dann zu zehn Millilitern der Lösung zugegeben. Die resultierende Lösung wurde zum Kochen erhitzt, und 1%ig Natriumzitrat (8,0ml) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde erhitzt und gerührt, bis die Lösung eine rötlich -purpur'ne Farbe annahm. Das kolloidale Gold wurde dann gekühlt und bei 4º C bis zur Verwendung gelagert.
Kaninchen-Antibiotin-Antikörper (100µl, 1mg/ml) wurde mit einer 10%igen BSA-Lösung (100µl) vermischt. Das kolloidale Gold (20ml) wurde mit 150mM Boratpuffer (2,0ml, pH 8,08) vermischt. Das gepufferte kolloidale Gold wurde dann zu der Antibiotin- Antikörper/BSA-Lösung zugegeben und bei Raumtemperatur zehn Minuten lang vermischt. Eine 10%ige BSA-Lösung (600µl) wurde zugegeben, um die Reaktionsmischung zu löschen. Die Mischung wurde bei 10 000 Umdrehungen (upm) pro Minute fünf Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und der Niederschlag wurde 1:1 mit 15mM Borat resuspendiert, das 0,2%ig PEG enthielt, wobei sich das kolloidale Gold/Kaninchen- Antibiotin-Antikörperkonjugat ausbildete. Die Konjugatendkonzentration betrug 80µg/ml. Das Konjugat wurde dann in einem 1:15-Verhältnis mit einem Tris-gepufferten Verdünner aus physiologischer Kochsalzlösung (TBS, 0,1mM Tris[Hydroxymethyl]aminomethanacetat [0,9%ige Kochsalzlösung, pH 7,8] enthaltend 3,0% Casein) vermischt.

b. Herstellung des Teststreifens

Die Teststreifen wurden gemäß den folgenden Verfahren hergestellt.
Die Einfangstelle enthielt ein biotinyliertes Kaninchen- Serumalbumin-Einfangreagenz (Biotin-RSA, "Biotin-rabbit serum albumin"), das spezifisch ausgewählt war, um die Antibiotin- Antikörper-Komponente des Konjugats zu binden. Das Biotin-RSA wurde hergestellt, indem eine 2%ige RSA-Lösung in boratgepufferter Kochsalzlösung (pH 8,0) hergestellt wurde. N- Hydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin, 53,3mg) wurde in Dimethylformamid (1,0ml) gelöst und 100µl der Lösung wurden zu den 2% RSA (1,0ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur zwei Stunden lang vermischt. Die Mischung wurde über Nacht gegen 0,9%ige Kochsalzlösung dialysiert, die Kochsalzlösung wurde dann ausgetauscht, und die Mischung wurde weitere zwei Stunden lang dialysiert. Die Mischung wurde dann drei Stunden lang gegen 200mM Borat (pH 8,4) dialysiert. Das resultierende Biotin-RSA-Einfangreagenz wurde dann mit einem TBS-Verdünner (0,5mg/ml, enthaltend 0,1% BSA, 1,0% Saccharose und 0,003% Phenolrot) vermischt.
Die Konjugatrückgewinnungsstelle enthielt human-IgG (HIgG, Sigma, St. Louis, MO), als das Konjugatrückgewinnungsreagenz, das ausgewählt worden war, um das Konjugat indirekt durch die Bindung des Analyten und jedweden Konjugates, das daran gebunden war, zu immobilisieren. Das Konjugatrückgewinnungsreagenz wurde mit dem gleichen Verdünner vermischt, wie das Einfangreagenz.
Es wurde ein Reagenzstrahl verwendet, um das Einfangreagenz und das Konjugatrückgewinnungsreagenz auf eine Nitrozellulosebogen aufzubringen. Das Einfangreagenz (Biotin- RSA, 0,5mg/ml) wurde auf einmal aufgegeben, zehn Millimeter von einem Rand (d. h. am proximalen Ende) des Nitrozellulosebogens entfernt, in einer horizontalen Linie (0,03 Inch breit). Der IgM-rheumatoide-Faktor, der den Analyten darstellte (ein anti- IgG-Antikörper) aus der Testprobe konkurrierte mit dem Biotineinfangreagenz um die Bindung an das Konjugat. Drei Konjugatrückgewinnungsstellen mit HIgG (5,0mg/ml) wurden als horizontale Linien (0,03 Inch breit) in Abständen von 12,5, 15 und 17,5 Millimetern vom gleichen Rand des Bogens aufgegeben. Die erste Konjugatrückgewinnungsstelle wurde in einem doppelten Durchgang aufgebracht, und die zweite und dritte Stelle wurden in einem einfachen Durchgang aufgebracht. Das HIgG Konjugatrückgewinnungsreagenz war zur Bindung des Analyten und dadurch zur Immobilisierung des Analyt-gebundenen Konjugates fähig, das durch die Einfangstelle hindurchwanderte. Der Bogen wurde luftgetrocknet und in Streifen (4 x 50mm) geschnitten, so daß die Einfangstelle und die drei Konjugatrückgewinnungsstellen oder Balken die Breite der Streifen durchquerten. Die Streifen wurden mit Trockenmittel bis zur Verwendung gelagert.

c. Herstellung der bindenden Hilfsglieder

Ein biotinyliertes bindendes HIgG-Hilfsglied wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt. Eine HIgG-Lösung (1,0ml, 1,0mg/ml in destilliertem Wasser) wurde mit einer NHS- Biotinlösung (100µl, 10mg/ml in destilliertem Wasser) vermischt. Die Reaktionsmischung wurde zwei Stunden lang bei 4º C vermischt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von TBS (110µl, 100mM Tris, 200mM NaCl, pH 9,0) gelöscht. Die Mischung wurde über Nacht gegen TBS (20mM Tris, 200mM NaCl, pH 8,08) bei 4º C dialysiert. Das resultierende bindende Biotin-HIgG-Hilfsglied wurde dann in einem 1:25-Verhältnis mit einem TBS-Verdünner (enthaltend 1% PEG) bis zu einer Endkonzentration von einem Mikrogramm/Milliliter vermischt. Das "bindende Hilfsglied wurde bei dem Assay verwendet, um die Menge an Biotin, das in der Bindungsreaktion vorhanden war, zu erhöhen und um dadurch die Menge an Konjugat zu steigern, das indirekt an den Analyten gebunden wird, d. h. der Analyt bindet an den HIgG-Anteil des bindenden Hilfsgliedes, und eine Vielzahl von Konjugatsstrukturen binden an den Biotin-Bestandteil des bindenden Hilfsgliedes.
Der Analyt konkurriert mit dem Einfangreagenz um die Bindung an das Konjugat. Obwohl der Analyt und das Einfangreagenz nicht an der gleichen Stelle an den Konjugat- Antikörper binden, beeinflußt die Bindung des Analyten an den Kaninchen-Antibiotin-Antikörperanteil des Konjugates den anti- Biotin-Antikörper derart, daß er unfähig ist, auch das Biotin des spezifisch bindende Hilfsgliedes oder der Einfangstelle zu binden.
Als kein Analyt in der Testprobe vorhanden war, wurden sowohl der Komplex aus Konjugat und spezifisch bindendem Hilfsglied als auch das freie Konjugat an der Einfangstelle über die Bindung zwischen Biotin und Antibiotin immobilisiert. Wenn Analyt in der Testprobe vorhanden ist, befinden sich ein Konjugat/spezifisch bindendes Hilfsglied-Komplex, ein Konjugat/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex, ein Konjugat/Analyt-Komplex und freies Konjugat in der Reaktionsmischung. Wenn die Analytkonzentration ansteigt, steigen die Konzentrationen des Konjugat/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplexes und des Konjugat/Analyt-Komplexes an, und diese Komplexe wandern durch die Einfangstelle hindurch und binden über den Analyten an das HIgG der Konjugatrückgewinnungsstellen.

b. Assayvorschrift

Probe (15µl), Konjugat (7,5µl) und spezifisch bindendes Glied (7,5µl) wurden in einer Vertiefung unter Ausbildung einer Testlösung vereinigt, und das proximale Ende eines Streifens wurde in die Vertiefung eingebracht, so daß die Testlösung durch den Streifen hindurchwanderte, wobei sie die Einfang- und die Rückgewinnungsstellen erreichte. Nach acht Minuten wurde der Streifen entfernt und luftgetrocknet. Die Testproben umfaßten eine Probe, die in Bezug auf rheumatoiden Faktor (RF) negativ war, und fünf Proben, die in Bezug auf RF positiv waren. Der Streifen wurde dann bei 540 Nanometern auf einem Reflektionsscanner abgetastet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Assayergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Die Ergebnisse zeigen an, daß die Menge an Konjugat, das an der Einfangstelle eingefangen wird, um so größer ist, je geringer die Menge an Analyt in der Probe ist, und daß daher das Signal an der Einfangsstelle relativ zu dem Signal an den Konjugatrückgewinnungsstellen um so größer ist. Daher wies nur die Einfangstelle auf dem Streifen, mit dem die RF-negative Probe getestet wurde, ein nachweisbares Signal auf. Wenn die Menge an Analyt in der Probe zunahm, wurden die Mengen an Konjugat/bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex und Konjugat/Analyt-Komplex, die sich ausbildeten, um so größer, und daher wanderte mehr gebundenes Konjugat durch die Einfangstelle hindurch, um an den Konjugatrückgewinnungsstellen immobilisiert zu werden, die einen Anstieg des nachweisbaren Signals aufwiesen. Wie in Tabelle 4 aufgezeigt, ist die Anzahl der Konjugatrückgewinnungsstellen, die ein nachweisbares Signal aufweisen und/oder das Signal an jeder Stelle, um so größer, je größer die Menge an Analyt ist, die in der Probe vorhanden ist. Tabelle 4 Assay für rheumatioiden Faktor
Das doppelte Ablesesystem der vorliegenden Erfindung wie auch die wahlweise polyvalenten Konjugate sind bei verschiedenen Typen von Festphasenbindungsassays anwendbar. Es ist jedoch offensichtlich, daß der Fachmann andere Festphasenmaterialien und andere Analyten als Antigene oder Antikörper in Betracht ziehen kann, auf die die vorliegende Erfindung angewendet zu werden vermag. Die Ausführungsformen, die beschrieben sind, und die alternativen Ausführungsformen, die vorgestellt sind, sind als Beispiele und nicht etwa als Einschränkungen zu verstehen. Daher dient die eingehende Beschreibung der Erfindung nicht der Beschränkung der Erfindung auf die besonderen offenbarten Ausführungsformen, sondern sie dient der Erfassung aller Äquivalente und des Erfindungsgegenstandes im Rahmen des Schutzumfanges der Erfindung, wie sie oben beschrieben ist, und wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines interessierenden Analyten in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:

a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einer festen Phase, durch die der Analyt und ein Konjugat zu wandern vermögen, wobei das Konjugat ein spezifisch bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung gebunden ist, wobei in der festen Phase wenigstens zwei definierte Nachweisstellen eingebaut sind, die nacheinander mit dem Flüssigkeitsfluß in Kontakt gelangen, und die der Immobilisierung und der vergleichenden Anzeige eines Gliedes dienen, das aus dem Konjugat und dessen Komplexen gewählt ist, wobei die Nachweisstellen folgendes umfassen:

i) eine Einfangstelle, die ein immobilisiertes Einfangreagenz umfaßt, daß zur Konkurrenz mit dem Analyten um die Bindung an das Konjugat befähigt ist, und

ii) eine Konjugatrückgewinnungsstelle, die ein immobilisiertes Konjugatrückgewinnungsreagenz umfaßt, das von dem Einfangreagenz verschieden ist, und das zur Bindung eines Gliedes befähigt ist, das aus dem Konjugat und dessen Komplexen gewählt ist, wobei die Konjugatrückgewinnungsstelle das Konjugat oder die Konjugatkomplexe aufnimmtund bindet, das/die durch die Einfangstelle hindurchwandert/n;

b) der Testprobe zu erlauben, durch die Nachweisstellen hindurchzuwandern; und

c) das Nachweisen des immobilisierten Konjugates sowohl an der Einfangstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle durch instrumentelle Mittel, um die Menge des interessierenden Analyten quantitativ zu bestimmen.

2. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines interessierenden Analyten in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:

a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einer festen Phase, durch die der Analyt und ein Konjugat hindurchzuwandern vermögen, wobei das Konjugat ein spezifisch bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung gebunden ist, wobei in der festen Phase wenigstens zwei definierte Nachweisstellen eingebaut sind, die nacheinander mit dem Flüssigkeitsfluß in Kontakt gelangen, und die der Immobilisierung und der vergleichenden Anzeige eines Gliedes dienen, das aus dem Konjugat und dessen Komplexen gewählt ist, wobei die Nachweisstellen folgendes umfassen:

i) Eine Einfangstelle, die ein immobilisiertes Einfangreagenz umfaßt, an das der Analyt und das Konjugat konkurrierend binden, und

ii) eine Konjugatrückgewinnungsstelle, die ein immobilisiertes Konjugatrückgewinnungsreagenz umfaßt, das von dem Einfangreagenz verschieden ist, und das zur Bindung eines Gliedes befähigt ist, das aus der Markierung, einem Epitop, das für das Konjugat eigentümlich ist, und einem spezifisch bindenden Hilfsglied gewählt ist, wobei die Konjugatrückgewinnungsstelle das Konjugat oder die Konjugatkomplexe aufnimmt und bindet, das/die durch die Einfangstelle hindurchwandert/n;

b) der Testprobe zu erlauben, durch die Nachweisstellen hindurchzuwandern; und

c) das Nachweisen des immobilisierten Konjugates sowohl an der Einfangsstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle mittels instrumenteller Mittel, um die Menge des interessierenden Analyten quantitativ zu bestimmen.

3. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines interessierenden Analyten in einer Testprobe, das die folgenden Schritte umfaßt:

a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einer Festphasenvorrichtung, durch die der Analyt und ein Konjugat hindurchzuwandern vermögen, wobei in der festen Phase wenigstens zwei definierte Nachweisstellen eingebaut sind, die nacheinander in Kontakt mit dem Flüssigkeitsfluß gelangen, zur Immobilisierung und zur vergleichenden Anzeige eines Gliedes, das aus dem Konjugat und dessen Komplexen gewählt ist, wobei die Nachweisstellen folgendes umfassen:

i) eine Einfangstelle, die ein immobilisiertes Einfangreagenz umfaßt, das zur Konkurrenz mit dem Analyten um die Bindung an das Konjugat befähigt ist, und

ii) eine Konjugatrückgewinnungsstelle, die ein immobilisiertes Konjugatrückgewinnungsreagenz umfaßt, das von dem Einfangreagenz verschieden ist, und das zur Bindung eines Gliedes befähigt ist, das aus dem Analyten, den Analytkomplexen und Analyt-spezifischen bindenden Hilfsgliedern gewählt ist,

wobei die Konjugatrückgewinnungsstelle das Konjugat und die Konjugatkomplexe, das/die durch die Einfangsstelle hindurchwandert/n, aufnimmt und bindet, und

wobei das Konjugat eine Markierung umfaßt, die an ein spezifisch bindendes Glied gebunden ist, das eine Bindungsstelle aufweist, die für den Analyten spezifisch ist, und eine Bindungsstelle, die für das Einfangreagenz spezifisch ist, und wobei die Bindung des Analyten und des Konjugates die Bindung des Einfangreagenzes und des Konjugates hemmt, und wobei die Bindung des Konjugates und des Einfangreagenzes die Bindung des Analyten und des Konjugates hemmt;

b) der Testprobe zu erlauben, durch die feste Phase hindurchzuwandern; und

c) das Nachweisen des immobilisierten Konjugates sowohl an der Einfangsstelle als auch an der Konjugatrückgewinnungsstelle durch instrumentelle Mittel, um die Menge eines interessierenden Analyten in einer Testprobe quantitativ zu bestimmen.