ES2309353T3 - Metodo para la eliminacion de interferencias en analisis inmunocromatograficos. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la cantidad de un analito en una muestra fluida de prueba que contiene anticuerpos heterofílicos que se enlazan en forma no específica a los anticuerpos utilizados para capturar e inmovilizar anticuerpos anti-analito marcados y provocar una señal falsa y que comprende: (a) proveer una matriz de prueba que contiene: (1) una primera región para recibir dicha muestra y enlazar dicho analito con un primer anticuerpo antianalito que tiene una marca detectable y una fracción que es una parte de un par específico de enlazamiento; (2) una segunda región para recibir dicha muestra de (1) y capturar e inmovilizar dicho anticuerpo antianalito enlazado a dicho analito, dicha segunda región conteniendo un segundo anticuerpo anti-analito inmovilizado que es específico para un epítopo diferente de dicho analito que el anticuerpo de (1); (3) una tercera región para recibir a dicha muestra de (2) atrapando la porción de dicho anticuerpo marcado de (1) no enlazado a dicho analito, dicha tercera región conteniendo una segunda parte inmovilizada de dicho par de enlazamiento específico de (1); (b) aplicar dicha muestra fluida de prueba e inmunoglobulina específica sin analito añadido a partir de la misma fuente animal que dicho primer anticuerpo anti-analito en una cantidad suficiente para prevenir enlazamiento no específico de dichos anticuerpos heterofílicos a dicha segunda región y permitiendo que dicha muestra de prueba y la inmunoglobulina añadida fluyan a través de las regiones de dicha matriz de prueba; (c) medir la cantidad de la marca detectable en la segunda y la tercera regiones de la matriz, y (d) utilizar las señales determinadas en (c) para calcular la concentración del analito en la muestra fluida de prueba.
Description
Método para la eliminación de interferencias en
análisis inmunocromatográficos.
Esta invención se relaciona generalmente con el
análisis de fluidos biológicos tales como sangre, orina, y
similares, más particularmente con inmunoensayos que emplean
anticuerpos para detectar antígenos.
Los formatos inmunocromatográficos en tiras son
cada vez más populares para análisis cualitativos y
semicuantitativos, particularmente aquellos que utilizan esquemas
de detección visual. Este tipo de inmunoensayo involucra la
aplicación de una muestra líquida para el ensayo que se sospecha que
contiene un analito a una zona de aplicación de una tira
inmunocromatográfica. La presencia del analito es típicamente
indicada por un color que se desarrolla en una región particular de
la tira. Por ejemplo, las pruebas de embarazo en las cuales el
analito es gonadotropina coriónica humana (hCG).
Generalmente, se pone en contacto una muestra
con un anticuerpo para el analito (esto es, un anticuerpo
anti-analito) que se une al analito, estando el
anticuerpo marcado con una fracción detectable la cual, después de
separar lo unido y liberar porciones del anticuerpo, es utilizado
para indicar la cantidad del analito presente. Con el propósito de
recolectar el analito enlazado al anticuerpo, se puede inmovilizar
un segundo anticuerpo anti-analito a un segundo
epítopo del analito sobre una tira de prueba par capturar al analito
enlazado al primer anticuerpo. Si el segundo anticuerpo
anti-analito no está inmovilizado sobre una tira de
prueba, se pueden utilizar un par de compañeros de enlazamiento,
típicamente una sustancia y su anticuerpo, para recolectar al
segundo anticuerpo anti-analito. La primera parte
del par de enlazamiento se une al segundo anticuerpo
anti-analito y la segunda parte del par de
enlazamiento se inmoviliza en una ubicación específica en una tira
de prueba para unirse a la primera parte del par, inmovilizando así
al analito enlazado al primer anticuerpo
anti-analito marcado para que pueda ser medido.
Usualmente, una tira de prueba consta de un
material de matriz a través del cual el fluido de prueba, que puede
tener al analito suspendido o disuelto allí, puede fluir por
capilaridad desde la zona de aplicación hasta la zona de detección
donde una señal detectable, o ausencia de la misma, revela la
presencia del analito. Típicamente, la tira incluirá un medio para
enlazar en forma inmunoespecífica al analito que va a ser detectado
con su compañero de enlazamiento específico que produce una marca
detectable. En uno de tales esquemas como se divulga en la patente
estadounidense No. 4.446.232, la tira contiene, un compañero de
enlazamiento móvil marcado con una enzima para el analito que está
en una zona corriente debajo de la zona de aplicación de la
muestra. Si el analito está presente en la muestra de prueba, se
combinará con su compañero de enlazamiento marcado para formar un
complejo que puede fluir a lo largo de la tira hasta una zona de
detección que contiene un sustrato para el marcador de la enzima
capaz de producir una respuesta coloreada en presencia del marcador
de la enzima. La tira también contiene una zona en la cual se ha
inmovilizado el analito, de tal manera que el compañero de
enlazamiento marcado que no se combine con el analito, debido a la
ausencia de analito en la muestra, será capturado y por lo tanto se
evita que alcance la zona de detección. Se han publicado varias
modificaciones de esta técnica, todas las cuales involucran algún
sistema específico de enlazamiento en la cual se determina la
presencia o la ausencia de analito en la muestra de prueba por medio
de la detección o la ausencia del mismo del compañero de
enlazamiento marcado en la zona de detección. En la patente
estadounidense No. 4.868.108 se divulga un esquema similar con la
adición de un reactivo de captura inmovilizado por el compañero de
enlazamiento marcado de la enzima en la zona de detección para
concentrar la enzima marcada y mejorar su capacidad para reaccionar
con el sustrato de la enzima para volver así al ensayo más
sensible.
No todos los esquemas para inmunocromatografía
cuentan con un compañero de enlazamiento marcado con la
enzima/sustrato de enzima para proveer la señal para detección del
analito. En la patente estadounidense No. 4.806.311 se divulga un
dispositivo de análisis de multizona para la determinación
específica del ensayo de enlazamiento de un analito y un compañero
de enlazamiento inmovilizado por lo tanto junto con una zona de
detección para recibir al reactivo marcado que migra allí desde la
zona del reactivo. La zona de detección contiene una forma
inmovilizada de una sustancia de enlazamiento para el reactivo
marcado. El reactivo marcado soporta un grupo químico que tiene una
propiedad física detectable, así que no requiere de una reacción
química con otra sustancia. Un ejemplo de tales grupos son las
especies coloreadas, fluorescentes, moléculas fosforescentes,
radioisótopos y fracciones electroactivas. La patente
estadounidense No. 4.313.734 describe el uso de soluciones de oro
como marcadores para anticuerpos que son detectables sin un cambio
químico.
Un artículo de Madersbacher y colaboradores
describe una validación de una prueba de varilla indicadora para
psa específico del suero (Madersbacher, 1996, European Urology, 30,
446 - 450). Un artículo de Graves describe un método para control
del ruido en inmunoensayos en fase sólida (Graves, 1988, J. Immunol.
Methods, 111, 167 - 178). EP 1 046 913 divulga un dispositivo para
llevar a cabo un ensayo para un analito en una muestra fluida de
prueba por medio de inmunocromatografía. El dispositivo involucra
una tira que tiene una pieza receptora no porosa de un material
hidrófobo en comunicación fluida directa con una región reactiva de
un material absorbente a través el cual la muestra la muestra
fluida de prueba puede fluir por capilaridad. EP 1 197 754 divulga
un dispositivo que incluye un soporte sólido que tiene zonas de
reacción múltiples que contienen anticuerpos de captura dirigidos
al antígeno. La patente estadounidense No. 6.146.836 divulga métodos
de inmunoensayo que utilizan anticuerpos monoclonales
anti-alotípicos como reactivos de captura para
enlazamiento primario específico para los analitos de interés.
La presente invención se relaciona con un método
de vencer la interferencia con los resultados de los inmunoensayos
por medio de enlazamiento no específico de anticuerpos heterofílicos
en la muestra al anticuerpo marcado. Se encontró que se presentaron
resultados de falsos positivos debido a que un anticuerpo marcado no
enlazado estaba siendo retenido en la región de detección donde se
esperaba que únicamente aquellos anticuerpos marcados que se habían
enlazado al antígeno objetivo (esto es, el analito) serían
encontrados. Esto es, la medición de la cantidad del anticuerpo
enlazado por medio del uso del marcador indicó la presencia del
antígeno, cuando ninguno estaba presente. Fue posible el
desplazamiento del enlazamiento no específico de los anticuerpos
heterofílicos, pero esto creó otra dificultad, que fue superada por
los actuales inventores, como se apreciará en la descripción que
viene a continuación.
La invención se relaciona con un método para
llevar a cabo inmunoensayos y con dispositivos que utilizan el
método. La interferencia causada por enlazamiento no específico por
un anticuerpo heterofílico en la muestra a un anticuerpo marcado
que no está unido a un analito en la zona de detección es superada
por medio de la adición de inmunoglobulina no específica para el
analito a partir de la misma fuente animal que el anticuerpo
marcado. La recuperación y medición del anticuerpo marcado no
enlazado se logró por medio de la unión de una fracción que es una
parte de un par de enlazamiento específico al anticuerpo marcado e
inmovilizando la segunda parte del par de enlazamiento a una región
corriente debajo de la zona de detección. El anticuerpo marcado
enlazado al analito es inmovilizado en la zona de detección (o
captura) y el anticuerpo marcado libre de analito es enlazado en la
región secuencia abajo, haciendo posible determinar la proporción
del anticuerpo enlazada al analito para el anticuerpo libre de
analito.
En una modalidad, el dispositivo incluye tres
regiones. La primera región recibe la muestra y la inmunoglobulina
específica añadida sin analito. Un primer anticuerpo
anti-analito que porta una marca detectable y la
primera parte de un par de enlazamiento se enlazan al analito en la
muestra, ya sea en la primera región o antes de que la muestra sea
aplicada a la primera región. La segunda región, por ejemplo la zona
de detección (o captura), recibe la muestra de la primera región e
inmoviliza al analito enlazado al anticuerpo a través de un segundo
anticuerpo anti-analito que es específico para un
epítopo diferente (esto es, un sitio para la unión de un anticuerpo
a un antígeno) del analito. La cantidad del analito se puede
determinar midiendo la marca detectable en la segunda región. La
tercera región recibe la muestra restante de la segunda región y
atrapa la porción del primer anticuerpo marcado que no estaba
enlazado al analito por medio de la segunda parte inmovilizada del
par de enlazamiento. La muestra restante pasa luego a una zona
absorbente.
En un ejemplo de tal modalidad, el primer
anticuerpo anti-analito es anticuerpo
anti-analito policlonal de cabra y el segundo
anticuerpo anti-analito es anticuerpo
anti-analito monoclonal de ratón. La marca son
partículas coloreadas de látex. La inmunoglobulina añadida a o con
la muestra es IgG de cabra. La primera parte del par de
enlazamiento es preferiblemente biotina y la segunda parte
avidina.
En una segunda modalidad, el dispositivo también
incluye tres regiones, la primera región recibe la muestra. El
analito en la muestra está enlazado a un primer anticuerpo
anti-analito que porta una marca detectable y la
primera parte de un primer par de enlazamiento y a un segundo
anticuerpo anti-analito que enlaza al analito en un
epítopo diferente para crear un "sándwich" de analito enlazado
a dos anticuerpos diferentes. El segundo anticuerpo
anti-analito cuenta con la primera parte de un
segundo par de enlazamiento, que es distinto del primer par de
enlazamiento. Los anticuerpos anti-analito y la
inmunoglobulina se pueden colocar en la primera región o ser
añadidos a la muestra antes de ser aplicados a la primera región. La
segunda región recibe la muestra de la primera región y captura al
segundo anticuerpo anti-analito con una segunda
parte inmovilizada del segundo par de enlazamiento sobre el segundo
anticuerpo anti-analito. La tercera región recibe la
muestra restante de la segunda región y atrapa la porción del
primer anticuerpo anti-analito que no se enlazó al
analito, utilizando una segunda porción inmovilizada del primer par
específico de enlazamiento sobre el primer anticuerpo de analito.
La muestra restante pasa luego dentro de una zona absorbente.
En un ejemplo de la segunda modalidad, el primer
anticuerpo anti-analito es anticuerpo
anti-analito policlonal de cabra y el segundo
anticuerpo anti-analito es anticuerpo
anti-analito monoclonal de ratón. La marca sobre el
anticuerpo anti-analito policlonal de cabra es de
partículas coloreadas de látex. La primera parte del primer par de
enlazamiento sobre el primer anticuerpo anti-analito
es biotina y la segunda parte avidina. La primera parte del segundo
par de enlazamiento para el segundo anticuerpo
anti-analito es fluoresceína y la segunda parte del
par de enlazamiento es anti-fluoresceína. La
inmunoglobulina añadida a o con la muestra es IgG de cabra.
En el método de la invención la primera región
contiene tanto los anticuerpos anti-analito
necesarios como la inmunoglobulina en un formato seco para recibir
la muestra fluida, o la primera región puede estar libre de los
anticuerpos anti-analito en cuyo caso se sumerge la
primera región en una mezcla de fluido de la muestra a la cual se
le han añadido anticuerpo e inmunoglobulina.
La Figura 1 ilustra un tipo de tira para
análisis utilizada para inmunoensayos.
La Figura 2 ilustra un segundo tipo de tira para
análisis utilizada para inmunoensayos.
En esta descripción de la invención, los
términos "antígeno" y "anticuerpo" pueden ser utilizados
para referirse respectivamente a una sustancia (por ejemplo
antígeno) a la cual responde un animal formando otra sustancia (un
anticuerpo) que se une a la primera sustancia. Estos términos son
comúnmente utilizados en conexión con respecto a un sistema inmune
de animal. En un inmunoensayo un antígeno, que puede ser considerado
un "analito" (esto es, la sustancia que va a ser detectada),
se enlaza a un anticuerpo que ha sido marcado. Los anticuerpos se
desarrollan en animales en respuesta a la introducción de antígenos
(analitos) que son detectados en un inmunoensayo. De este modo, los
anticuerpos desarrollados en respuesta a los analitos pueden ser
llamados "anticuerpos anti-analito", esto es,
que ellos se enlazarán al analito cuando es encontrado en un fluido
de una muestra. Otros anticuerpos, que pueden ser llamados
"anticuerpos anti-IgG específicos de una
especie" son anticuerpos que se enlazarán a inmunoglobulinas
(por ejemplo IgG) de un animal diferente. Un ejemplo de este último
tipo de anticuerpo es uno desarrollado en conejos en respuesta a IgG
de cabras. El anticuerpo derivado de conejo específico para IgG de
cabras capturará anticuerpos desarrollados a partir de cabras y en
algunos inmunoensayos es utilizado para recuperar anticuerpos de
cabra que no están enlazados al analito encontrado en un fluido de
una muestra.
En un inmunoensayo típico, se captura al
anticuerpo marcado enlazado a un analito para separarlo del
anticuerpo marcado restante que no está enlazado al analito (la
porción libre). Se mide la cantidad del marcador sobre la porción
enlazada capturada del anticuerpo marcado para indicar la cantidad
de analito presente en la muestra. Con el propósito de obtener
buena exactitud cuantitativa, tanto el anticuerpo marcado enlazado
como el anticuerpo marcado libre deben ser atrapados separadamente
de tal manera que se pueda obtener una proporción del marcador
asociado con el anticuerpo enlazado con el marcador asociado con el
anticuerpo no enlazado (ver la patente estadounidense No.
5.569.608). Generalmente, el analito enlazado al anticuerpo marcado
es capturado en una primera región de una tira de prueba (esto es,
la zona de detección), con el anticuerpo sin tener analito unido
pasando con el fluido de la muestra hasta una segunda región o
región de control donde es atrapado y puede ser medido. Esta
segunda región, que es importante para obtener resultados exactos,
se encontró que presenta un problema que fue resuelto por medio de
la presente invención.
La mayoría de loa análisis inmunocromatográficos
en tira se estructuran para que los componentes libres y enlazados
del inmunoensayo puedan ser separados en dos zonas. Con un ensayo
tipo "sándwich" esto se logra usualmente inmovilizando un
anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anticuerpo
anti-analito de cabra) en una primera zona y un
anticuerpo anti-IgG específico de la especie (por
ejemplo, anticuerpo IgG anti-cabra de conejo) en
una segunda zona. El analito en la muestra se enlaza a un anticuerpo
anti-analito marcado no inmovilizado y el complejo
se enlaza posteriormente al anticuerpo anti-analito
inmovilizado en la primera zona, creando un "sándwich", esto
es, un solo analito (por ejemplo antígeno) enlazado a dos
anticuerpos. El anticuerpo de la segunda zona es específico para el
IgG de la especie en la cual se elevó el anticuerpo
anti-analito marcado, y se enlazará al anticuerpo
anti-analito libre marcado. Con este esquema, el
anticuerpo anti-analito marcado que no se enlaza al
analito (esto es, el componente libre del inmunoensayo) no se
enlazará en la primera zona, pero es enlazado en la segunda
zona.
Las tiras que utilizan este formato de
separación son mostradas en la Figura 1. El anticuerpo
anti-analito marcado es colocado ya sea sobre la
zona (3) o puede ser utilizado como una suspensión líquida a la cual
se le añade la muestra que contiene el analito. Después de que se
ha dado un tiempo suficiente para que se forme el complejo entre el
anticuerpo marcado y el analito, se coloca la zona 3 de la tira en
la mezcla de anticuerpo marcado/de la muestra hasta una profundidad
tal que el líquido no hará contacto con ninguna zona de anticuerpos
inmovilizados (5 y 7). Si el anticuerpo marcado es aplicado y secado
sobre la zona 3 y se aplica la muestra sobre la zona 3, los
componentes de la mezcla fluirán entonces a lo largo de la tira
hasta hacer contacto con la primera zona (5) en la cual se ha
inmovilizado otro anticuerpo anti-analito, que es
específico para un epítopo diferente del analito que se enlaza al
primer anticuerpo anti-analito. El primer anticuerpo
anti-analito que se ha acomplejado con el analito
será enlazado en la zona 5 por el segundo anticuerpo
anti-analito. Los componentes restantes de la
mezcla fluirán a lo largo de la tira y harán contacto con el
anti-IgG específico inmovilizado de la especie en
la segunda zona (7) donde el anticuerpo libre de analito será
enlazado. Esta segunda banda es denominada algunas veces como una
banda de control debido a que una de las funciones para la que
sirve es la de promover una señal detectable para informar al
usuario que el ensayo ha operado correctamente. Sin embargo,
captura todo el conjugado no enlazado y es valioso para el uso en
cálculos cuantitativos. El material absorbente en la última zona
(9) sirve como un sumidero para el fluido y atraerá a la muestra
completa a través de la tira con el propósito de maximizar la
cantidad de anticuerpo enlazado en las zonas 3 y 5.
Otro formato estrechamente relacionado puede ser
descrito también en términos de la Figura 1. En este formato el
primer anticuerpo anti-analito marcado es idéntico a
aquel descrito anteriormente. Sin embargo, en vez de inmovilizar al
segundo anticuerpo anti-analito en la zona 5, se une
a una fracción diferente que produce una señal no detectable, pero
para la cual hay disponible un compañero de enlazamiento específico.
Esto es llamado un "par de enlazamiento". En este sistema el
compañero de enlazamiento específico para esa fracción diferente es
inmovilizado en la primera banda (5) y la segunda banda (7) es
idéntica a aquella descrita anteriormente. Por ejemplo, cuando se
utiliza fluoresceína como la fracción unida al segundo anticuerpo
anti-analito, se inmoviliza el anticuerpo
anti-fluoresceína monoclonal de ratón en la zona
(5). El primer anticuerpo anti-analito marcado en
forma detectable y el segundo anticuerpo
anti-analito marcado en forma no detectable pueden
ser utilizados en este formato como una suspensión líquida a la
cual se le añade la muestra que contiene al analito. Después de que
se ha dado un tiempo suficiente para que se forme el complejo tipo
"sándwich" entre los dos anticuerpos y el analito, se coloca
la sección inferior (3) de la tira en la Figura 1 en la mezcla de
anticuerpos marcados/de la muestra hasta una profundidad tal que el
líquido no hará contacto ni con la zona (5) ni con la zona (7) de
los anticuerpo inmovilizados y se desarrolla la tira en forma
idéntica como se describió anteriormente. Alternativamente, los dos
conjugados anti-analito se pueden depositar y secar
en la zona 3 y aplicar la muestra a la zona 3. Con este formato
todo el segundo anticuerpo anti-analito y el analito
enlazado en un sándwich entre los dos anticuerpos se enlazan en la
primera zona (5) y el primer anticuerpo anti-analito
marcado libre de analito se enlaza en la segunda zona (7). Este
último formato permite más tiempo para que tenga lugar la formación
completa del sándwich.
Se descubrió que un análisis para el antígeno
prostático específico (PSA) preparado por medio del método del
último tipo de ensayo utilizando anticuerpo anti-PSA
policlonal de cabra marcado con partículas de látex azul y
anticuerpo anti-PSA monoclonal de ratón con
fluoresceína unida produjo resultados positivos falsos para algunas
muestras de suero. El sándwich de analito fue atrapado por medio de
anticuerpo anti-fluoresceína inmovilizado en la
primera banda (5). Aproximadamente un tercio del suero de los
donantes hembra normales (que no debería contener PSA) provocó una
indicación positiva en la primera zona (5) de la tira. Se cree que
los compuestos heterofílicos en la muestra no se enlazaron en forma
específica al anticuerpo anti-PSA marcado. En
efecto, los anticuerpos heterofílicos provocaron que los
anticuerpos anti-PSA marcados fueran atrapados y
fueran leídos como si contuvieran PSA, aunque ninguno estaba
presente. El mecanismo que provoca esta interferencia es
desconocido, pero un posible mecanismo involucra aglutinación de las
partículas marcadas lo que resulta en impedimento estérico del
aglutinado provocando que ellas sean incapaces de fluir a través de
la zona del anticuerpo anti-fluoresceína
inmovilizado. Se encontró que este problema podría ser resuelto por
medio de la adición de IgG de cabra normal (esto es, de cabras no
inmunizadas con PSA) a la muestra de prueba antes de su aplicación
a la tira de análisis. Sin embargo, ya que la IgG
anti-cabra derivada de conejo utilizada en la
segunda banda (7) enlazó IgG de cabra de todas las fuentes, la IgG
de cabra normal añadida a la muestra de prueba para eliminar la
interferencia resultó en la pérdida de la señal de la zona 7. Con el
propósito de obtener la mejor cuantificación, es necesario tener
todos los conjugados marcados (tanto enlazados como libres)
enlazados en la banda apropiada, a fin de que las cantidades de
ambos puedan ser medidos y utilizados en cálculos como se describe
en la patente estadounidense No. 5.569.608. Nuestra invención evita
la desaparición de la señal de esta segunda banda mientras remueve
aún la interferencia de las muestras de suero que interfieren.
El problema fue resuelto por medio de biotina
como un segundo ligando de enlazamiento por afinidad a la partícula
coloreada de látex que ya tenía al anticuerpo
anti-PSA de cabra unido a él e inmovilizando a su
compañero de enlazamiento por afinidad (avidina) en la zona de
recolección 7. Esto es, un segundo par de enlazamiento fue
biotina/avidina. El segundo ligando de enlazamiento por afinidad
podría ser también, por ejemplo, glucosa oxidasa, dinitrofenol,
digoxina o proteína de enlazamiento de maltosa. Cualquier ligando
por afinidad que se enlace con su compañero de enlazamiento por
afinidad, independientemente del analito que está siendo buscado y
esté presente en concentraciones despreciables en las muestras que
contienen al analito, es adecuado para uso en la presente
invención. Para los ligandos por afinidad mencionados anteriormente,
sus compañeros de enlazamiento por afinidad serían,
respectivamente, anti-glucosa oxidasa,
anti-dinitrofenol, anti-digoxina o
anti-proteína de enlazamiento de maltosa.
En el caso de biotina como el ligando por
afinidad, el acoplamiento de la partícula se puede lograr ya sea
por biotinilación del anticuerpo específico para el analito seguido
por acoplamiento a la partícula portadora o por acoplamiento de
biotina unida a una proteína inerte, tal como
BSA-biotina, que está acoplada junto con el
anticuerpo específico del analito a la partícula portadora. La
partícula portadora es usualmente coloreada y sirve como una marca
detectable. Este método podría ser utilizado también con marcadores
que no son en partículas tales como marcadores enzimáticos u otros
marcadores detectables solubles.
El sistema descrito anteriormente utiliza una
mezcla de anticuerpo anti-analito marcado/en la
muestra en fase líquida. Sin embargo, los mismos ensayos
inmunocromatográficos se pueden llevar a cabo con un sistema en fase
completamente seca en el cual los conjugados
anti-analito marcados son secados en el material en
fase sólida sin inmovilizarlos y se colocan porciones de este
material en el área 6, entre el área 3 y el área 5 de la Figura 2.
En este caso se puede añadir la mezcla al material que contiene los
conjugados anti-analito marcados o a un área 3 de
blanco que la precede. El desarrollo del ensayo procede luego como
se describió anteriormente.
En los siguientes ejemplos se ilustra la
invención, utilizando un ensayo para antígeno específico prostático
(PSA).
Los dos métodos de añadir biotina y partículas
de látex azul a un anticuerpo fueron demostrados de la siguiente
manera:
Se sustituyó el amortiguador de la IgG
anti-PSA (Bayer) (2 mg) en fosfato de sodio 0,1 M
(pH 7,0). La solución resultante fue concentrada luego hasta 0,5 -
1,0 mL. Se disolvió NHS biotina
(N-hidroxisuccinimidil biotina) (2,0 mg) (Pierce)
en 0,2 mL de agua y se añadieron 7,0 \muL de esta solución a la
solución de anticuerpo y se incubó durante 1 hora @ 30ºC. Se pasó
la solución a través de una columna de resina de Sefadex
G-25 y a lo largo de un detector UV que detectó el
material acoplado (conjugado). Se llevó a cabo un ensayo dot blot
en el cual se aplicaron 2 \muL del conjugado a una pieza de
nitrocelulosa junto con IgG anti-PSA nativa en una
mancha diferente. Se secó la nitrocelulosa a 85ºC durante ½ hora y
luego se bloqueó con bloqueador de caseína al 1% (p/v) durante 15
minutos seguido por tres lavados con PBS (Sigma) para remover el
material no enlazado. Se aplicó una solución de 1 \mug/mL de
Peroxidasa de Rábano - Avidina) (2 \muL) a las manchas de
proteína seca seguido por 3 lavados con PBS. Se secaron las
membranas a 85ºC durante ½ hora después de lo cual se aplicó una
gota de una solución de TMB (tetrametil bencidina) en 1 etapa a cada
mancha para detectar HRP. Se observó que el material acoplado se
volvió azul mientras que la IgG no acoplada permaneció incolora. Se
acopló luego el anticuerpo biotinilado al látex azul de la siguiente
manera:
Látex azul oscuro, 1 mL de una solución al 10%
(p/v) en agua (Bang Laboratories, lote # CAB 540, 310 nm de
diámetro) fue centrifugada a 12.000 rpm durante 15 minutos. Se
removió el sobrenadante y se resuspendieron las partículas de látex
en 10 mL de carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,6. Se centrifugó
nuevamente la suspensión de látex a 12.00 rpm y se repitió la etapa
de lavado tres veces más después de lo cual se resuspendieron las
partículas de látex en 1,0 mL de KH_{2}PO_{4} 0,02 M luego de lo
cual se añadieron 2 mL de EDAC al 2,0% (p/v) (clorhidrato de
1-etil-3-[3-dimetil
amino propil] carbodiimida). Se agitó la mezcla de reacción durante
90 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó y se resuspendió en
10 mL de NaCl 0,17 M. Se centrifugó nuevamente la suspensión y se
decantó el sobrenadante después de lo cual se resuspendió el
precipitado de látex en 1,25 mL de borato 50 mM (pH 8,5) y se
mezcló bien. Se añadió gota a gota anticuerpo policlonal de cabra
anti-PSA biotinilado (0,325 mg en 1 mL de PBS) y se
continuó la agitación durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se
añadió etanolamina 1 molar (10 \muL) seguido por una agitación
adicional durante 30 minutos. Se añadió albúmina de suero bovino
("BSA") (5% p/v - 100 \muL) seguido por otros 30 minutos de
agitación. Se centrifugó la mezcla de látex y se resuspendió en 10
mL de amortiguador de resuspensión (2 mg/mL de BSA, Triton
X-100 al 0,05% (p/v) en glicina 0,1 M -
amortiguador de NaCl 0,17 M, pH 8,2 que contiene azida de sodio al
0,2% (p/v)). La mezcla fue nuevamente centrifugada y se removió el
sobrenadante después de lo cual se resuspendió el látex en 7,5 mL
de amortiguador de resuspensión y la solución de látex fue sonicada
con una sonda durante 30 segundos. El anticuerpo acoplado a látex
fue almacenado a 4ºC.
1,0 mL de partículas de Carboxy Dark Blue Latex,
fueron lavadas 3 veces con 10 mL de amortiguador de carbonato de
sodio 0,1 M a pH 9,6. El látex fue suspendido en 1 mL de
KH_{2}PO_{4} 0,02 M y luego fue activado por medio de la
adición de 2 mL de una solución de EDAC al 2% (p/v) y se incubó
durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se lavó el látex con NaCl
0,17 M y se resuspendió con 1,25 mL de amortiguador de borato 50 mM
(pH 8,5).
Se ajustó la IgG de cabra
anti-PSA (2 mg) hasta un volumen final de 1,25 mL
con borato 50 mM (pH 8,5) en un tubo de ensayo y se añadieron 150
\mug de BSA-biotina a la solución que fue luego
agitada en un agitador tipo vórtice. Se añadió luego esta solución
gota a gota a los 1,25 mL de solución activada de látex y se agitó
durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 10 \muL de
etanolamina 1 M seguido por agitación durante 30 minutos para
detener la reacción y la adición de 100 \muL de BSA al 5% (p/v)
con agitación adicional durante 30 minutos para bloquear cualquiera
de los sitios de enlazamiento no enlazados. Se lavó la solución de
látex acoplada 2 veces con amortiguador de resuspensión (2 mg/mL de
BSA, Triton X-100 al 0,05% (p/v), glicina 0,17 M,
azida al 0,2% (pH 8,2) y se la almacenó en 15 mL de amortiguador de
resuspensión a 4ºC. La suspensión final fue sonicada con una sonda
durante 30 segundos.
Para comparación con los anticuerpos descritos
bajo 1 y 2 anteriores, se preparó anticuerpo libre de biotina. 1,0
mL de partículas de Carboxy Dark Blue Latex, fueron lavadas 3 veces
con 10 mL de amortiguador de carbonato 0,1 M a pH 9,6. El látex fue
suspendido en 1 mL de KH_{2}PO_{4} 0,02 M y luego fue activado
por medio de la adición de 2 mL de una solución de EDAC al 2% (p/v)
y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se lavó el
látex con NaCl 0,17 M y se resuspendió con 1,25 mL de amortiguador
de borato 50 mM (pH 8,5).
Se ajustó la IgG de cabra
anti-PSA (2 mg) hasta un volumen final de 1,25 mL
con borato 50 mM (pH 8,5) en un tubo de ensayo. Esta solución fue
añadida gota a gota a los 1,25 mL de solución activada de látex y se
agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 10
\muL de etanolamina 1 M seguido por agitación durante 30 minutos
para detener la reacción y la adición de 100 \muL de BSA al 5%
(p/v) con agitación adicional durante 30 minutos para bloquear
cualquiera de los sitios de enlazamiento no enlazados. Se lavó la
solución acoplada de látex con amortiguador de resuspensión (2
mg/mL de BSA, Triton X-100 al 0,05% (p/v), glicina
0,17 M, NaCl 0,17 M, azida al 0,2% (pH 8,2) y se la almacenó en 15
mL de amortiguador de resuspensión a 4ºC. La suspensión final fue
sonicada con una sonda durante 30 segundos.
Se mezcló caseína [456 \muL, 1% (p/v)] con 60
\mul de Triton X-100 al 10% (p/v) y 60 \muL de
solución acoplada de látex; se sonicó la mezcla durante 4 segundos.
Se añadió luego anticuerpo monoclonal de ratón
anti-PSA con fluoresceína unida (Bayer) y se agitó
por medio de agitación tipo vórtice. Cuando se añade esta mezcla a
una muestra de suero es capaz de formar un "sándwich" en el
cual PSA está unido tanto al anticuerpo anti-PSA
derivado de cabra marcado con látex como al anticuerpo
anti-PSA derivado de ratón con fluoresceína
unida.
Se formaron tiras del anticuerpo monoclonal de
ratón marcado con anti-fluoresceína y anticuerpo IgG
anti-cabra derivado de conejo como bandas separadas
sobre nitrocelulosa utilizando un hacedor de tiras IVEK con una
velocidad de tabla de 30 mm/s, velocidad de dispensación = 1,2
\muL/cm, concentración anti-FITC = 1,5 mg/mL,
concentración de IgG anti-cabra de conejo = 1,1
mg/mL. En el primer conjunto de ensayos que se describen más abajo,
se utilizó el conjugado de látex de 3. Este conjugado no contenía
biotina, para ilustrar el problema con enlazamiento no específico.
En el segundo conjunto de ensayos se utilizó el conjugado de látex
de 2 y una concentración de NeutrAvidin (Pierce) = 1 mg/mL
reemplazó a la IgG anti-cabra de conejo (esto es,
tiras formadas sobre la nitrocelulosa) para ilustrar una modalidad
de la invención. La nitrocelulosa (25 mm de ancho) fue luego montada
en el borde inferior de una lámina de material de poliestireno de
108 mm y una tira de 32 mm de papel desecante (Drikette de
Multisorb) que se superpone a la nitrocelulosa rayada en 1 mm fue
montada sobre el poliestireno. Se cortaron tiras de 7,5 mm de ancho
perpendiculares al borde inferior.
Se mezclaron en forma separada mezclas de ensayo
de látex (30 \muL) de las preparaciones 2 (Tabla 2) ó 3 (Tabla 1)
con 15 \muL de una muestra de suero sanguíneo en un tubo de ensayo
pequeño. Se añadió la tira de nitrocelulosa y se le permitió que se
cultivara verticalmente durante 10 minutos. Se midió la respuesta
de cada banda sobre un fotómetro de reflectancia configurado para
detectar bandas estrechas.
A. Se utilizó látex configurado únicamente con
anticuerpo anti-PSA de cabra (preparación 3) en un
formato conjugado anti-analito/muestra en fase
líquida junto con la construcción de la tira mostrada en la Figura
1 en la cual la banda de recolección (7) inmovilizó anticuerpo IgG
anti-cabra de conejo. Los sueros que no contenían
PSA y que o bien interfirieron o no interfirieron con el
enlazamiento en la banda de captura fueron utilizados como
muestras. El suero que no interfirió fue utilizado tanto con como
sin ajustar hasta una concentración de PSA de 15,7 ng/mL con
ACT-PSA (Scripps Laboratories). Adicionalmente, cada
una de las muestras fue analizada con y sin 1,45 mg/mL de IgG de
cabra normal en la mezcla del ensayo. Los datos resultantes están
expuestos en la Tabla 1.
Los datos de la Tabla 1 muestran una alta
reflectancia en la banda de captura en ausencia de PSA cuando se
utiliza un suero que interfiere como muestra, dando así una lectura
positiva falsa aunque el suero no contenía PSA. Se elimina la
interferencia por medio de la adición de IgG de cabra normal, pero
la reflectancia en la banda de recolección está perdida también,
indicando que el anticuerpo anti-PSA de cabra no
enlazado no estaba siendo recuperado en la banda de recolección.
Cuando se analizó suero que no interfiere se puede observar que la
banda de captura, como se esperaba, no mostró PSA enlazado, pero la
banda de recolección recuperó al anticuerpo
anti-PSA de cabra no enlazado. Sin embargo, la
adición de IgG de cabra evita su recuperación. La adición de
ACT-PSA produjo una respuesta normal tanto en las
bandas de captura como de recolección, pero la adición de IgG de
cabra bloqueó la recuperación de anticuerpos no enlazados. Con el
propósito de evitar la interferencia del enlazamiento no específico
se concluyó que la adición de IgG de cabra a la muestra de suero
fue importante. Sin embargo, se perdió la habilidad para medir los
anticuerpos anti-PSA derivados de cabra no
enlazados.
B. Se utilizó látex conjugado tanto con
anticuerpo anti-PSA como BSA biotinilado
(preparación 2) en los formatos conjugados
anti-analito marcado/muestra en fase líquida junto
con la construcción de la tira mostrada en la Figura 1 en la cual
la banda recolectora (7) fue NeutrAvidin inmovilizado. Los sueros
que o bien interfirieron o no interfirieron con el enlazamiento en
la banda de captura fueron utilizados como muestras nuevamente, y
el suero que no interfirió fue utilizado tanto con como sin ajustar
hasta una concentración de PSA de 15,7 ng/mL con
ACT-PSA como anteriormente. Cada una de las muestras
fue analizada con y sin 1,45 mg/mL de IgG de cabra normal como en
la Tabla 1. Los datos de estos experimentos están expuestos en la
Tabla 2.
Los datos de la Tabla 2 demuestran alta
reflectancia en la banda de captura en ausencia de PSA cuando se
utiliza un suero que interfiere como la muestra. Se elimina la
interferencia por medio de la adición de IgG de cabra normal, y, a
diferencia del caso en el cual el látex está conjugado únicamente
con anti-PSA de cabra (esto es, estaba ausente la
biotina), la reflectancia en la banda de recolección permaneció
constante. La interferencia es sustancial en ausencia de IgG de
cabra añadida, suministrando un positivo claramente falso. Cuando se
añade IgG de cabra, se remueve la interferencia, pero la banda de
recolección que contiene NeutrAvidin es efectiva, mientras que en
la Tabla 1 la banda de recolección no dio lectura. El suero que no
interfiere dio una lectura pequeña para PSA capturado, pero se
considera que este resultado es una señal de fondo de bajo nivel.
Sin embargo, cuando se añadió ACT-PSA, el efecto de
la adición de IgG de cabra no fue significativo. Por lo tanto, la
marcación del anticuerpo de cabra anti-PSA marcado
con látex con biotina, hizo posible enlazar los anticuerpos que no
están enlazados a PSA en la banda de recolección y permitió el
cálculo de la proporción de anticuerpos enlazados a PSA en la
muestra a anticuerpos no enlazados.
Se repite la preparación # 2 del Ejemplo 1 para
elaborar un anticuerpo de cabra anti-PSA marcado con
látex, estando también el látex acoplado a BSA - biotina. Esta
suspensión se mezcla con caseína y se mezcla con una muestra de
suero como se describe en el Ejemplo 1.
En vez de añadir un anticuerpo monoclonal de
ratón anti-PSA marcado con fluoresceína a la muestra
de suero para crear un "sándwich" antes de sumergir la tira de
prueba, se coloca el anticuerpo de ratón anti-PSA
sobre la tira de prueba como una primera banda. Se forma luego el
"sándwich" cuando el analito PSA se enlaza al anticuerpo de
cabra anti-PSA marcado con látex y al anticuerpo de
ratón anti-PSA en la primera banda o banda de
captura.
Se prepara la tira de prueba como en el Ejemplo
1excepto porque la primera banda contiene anticuerpo de ratón
anti-PSA inmovilizado. Como en el Ejemplo 1, la
segunda banda o banda de recolección contiene NeutrAvidin.
Cuando la tira de prueba es parcialmente
sumergida en una muestra a la cual se le ha añadido anticuerpo de
cabra anti-PSA marcado con látex, se encontró que la
interferencia de sueros puede ser removida por medio de la adición
de IgG de cabra, pero la banda de recolección puede recuperar
anticuerpos de cabra anti-PSA marcados con látex no
enlazados por medio de la inclusión de NeutrAvidin en la banda de
recolección.
Se repite el procedimiento del Ejemplo 2,
excepto porque el anticuerpo de cabra anti-PSA
marcado con látex y la IgG de cabra se secan sobre la tira de
prueba en forma que pueden ser resuspendidos antes de la primera
banda que contiene anticuerpo monoclonal de ratón
anti-PSA inmovilizado. Cuando se sumerge
parcialmente la tira en la muestra de suero, ocurre la reacción
entre el PSA en la muestra y el anticuerpo de cabra
anti-PSA sobre la tira. La muestra migra luego a
través de la banda de captura donde el anticuerpo de cabra
anti-PSA enlazado marcado con partículas de látex
se enlaza también al anticuerpo de ratón anti-PSA.
Después de eso la muestra migra hasta la segunda banda de
recolección donde el anticuerpo restante de cabra
anti-PSA no enlazado marcado con partículas de
látex es recuperado por la biotina sobre el látex enlazándose a
NeutrAvidin inmovilizado sobre la segunda banda.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet US 4446232 A [0004]
- \bullet EP 1046913 A [0006]
- \bullet US 4868108 A [0004]
- \bullet EP 1197754 A [0006]
- \bullet US 4806311 A [0005]
- \bullet US 6146836 A [0006]
- \bullet US 4313734 A [0005]
- \bullet US 5569608 A [0016] [0020]
\bulletMADERSBACHER. European
Urology, 1996, vol. 30, 446-450
[0006]
\bulletGRAVES. J. Immunol.
Methods, 1988, vol. 111, 167-178
[0006].
Claims (30)
1. Un método para determinar la cantidad de un
analito en una muestra fluida de prueba que contiene anticuerpos
heterofílicos que se enlazan en forma no específica a los
anticuerpos utilizados para capturar e inmovilizar anticuerpos
anti-analito marcados y provocar una señal falsa y
que comprende:
- (a)
- proveer una matriz de prueba que contiene:
- (1)
- una primera región para recibir dicha muestra y enlazar dicho analito con un primer anticuerpo anti-analito que tiene una marca detectable y una fracción que es una parte de un par específico de enlazamiento;
- (2)
- una segunda región para recibir dicha muestra de (1) y capturar e inmovilizar dicho anticuerpo anti-analito enlazado a dicho analito, dicha segunda región conteniendo un segundo anticuerpo anti-analito inmovilizado que es específico para un epítopo diferente de dicho analito que el anticuerpo de (1);
- (3)
- una tercera región para recibir a dicha muestra de (2) atrapando la porción de dicho anticuerpo marcado de (1) no enlazado a dicho analito, dicha tercera región conteniendo una segunda parte inmovilizada de dicho par de enlazamiento específico de (1);
- (b)
- aplicar dicha muestra fluida de prueba e inmunoglobulina específica sin analito añadido a partir de la misma fuente animal que dicho primer anticuerpo anti-analito en una cantidad suficiente para prevenir enlazamiento no específico de dichos anticuerpos heterofílicos a dicha segunda región y permitiendo que dicha muestra de prueba y la inmunoglobulina añadida fluyan a través de las regiones de dicha matriz de prueba;
- (c)
- medir la cantidad de la marca detectable en la segunda y la tercera regiones de la matriz, y
- (d)
- utilizar las señales determinadas en (c) para calcular la concentración del analito en la muestra fluida de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de la Reivindicación 1 en donde
dicho primer anticuerpo anti-analito es anticuerpo
anti-analito policlonal de cabra y dicho segundo
anticuerpo anti-analito es anticuerpo
anti-analito monoclonal de ratón.
3. Un método de la Reivindicación 1 en donde
dicha marca se selecciona del grupo que consiste de partículas
coloreadas de látex, soluciones metálicas, y enzimas.
4. Un método de la Reivindicación 1 en donde
dicha inmunoglobulina específica sin analito es IgG.
5. Un método de la Reivindicación 1 en donde
cada parte de dicho par de enlazamiento específico de (a) (1) tiene
una concentración despreciable en dicha muestra de prueba.
6. Un método de la Reivindicación 5 en donde
dicho par de enlazamiento específico de (a) (1) se selecciona del
grupo que consiste de
fluoresceína/anti-fluoresceína, biotina/avidina,
glucosa oxidasa/anti-glucosa oxidasa,
dinitrofenol/anti-dinitrofenol,
digoxina/anti-digoxina, y proteína de enlazamiento
de maltosa/proteína de enlazamiento
anti-maltosa.
7. Un método de la Reivindicación 6 en donde
dicha parte de un par de enlazamiento específico de (a) (1) es
biotina y dicha segunda parte del par de enlazamiento específico de
(a) (3) es avidina.
8. Un método de la Reivindicación 5 en donde
dicha parte de un par de enlazamiento específico de (a) (1) es
fluoresceína y la segunda parte del par de enlazamiento específico
de (a) (3) es anti-fluoresceína.
9. Un método para determinar la cantidad de un
analito en una muestra fluida de prueba que contiene anticuerpos
heterofílicos que se enlazan en forma no específica a anticuerpos
utilizados para capturar e inmovilizar anticuerpos
anti-analito marcados y comprende:
- (a)
- proveer una matriz de prueba que contiene:
- (1)
- una primera región para recibir dicha muestra y enlazar dicho analito con un primer anticuerpo anti-analito que tiene una marca detectable y una fracción que es una parte de un primer par específico de enlazamiento y un segundo anticuerpo anti-analito que es específico para un epítopo diferente de dicho analito al primer anticuerpo anti-analito y suministrado con la primera parte de un segundo par de enlazamiento que es distinto del primer par de enlazamiento;
- (2)
- una segunda región para recibir dicha muestra de (1) y capturar e inmovilizar dicho segundo anticuerpo anti-analito con la segunda parte del segundo par de enlazamiento, dicha segunda región conteniendo una porción inmovilizada de dicha segunda parte de dicho segundo par de enlazamiento de (1);
- (3)
- una tercera región para recibir a dicha muestra de (2) y atrapar la porción de dicho primer anticuerpo anti-analito marcado de (1) no enlazado a dicho analito a través de dicha segunda parte del primer par de enlazamiento sobre el primer anticuerpo anti-analito o su marca, dicha tercera región conteniendo una segunda parte inmovilizada de dicho primer par de enlazamiento de (1);
- (b)
- aplicar dicha muestra fluida de prueba e inmunoglobulina específica sin analito añadido a partir de la misma fuente animal que dicho primer anticuerpo anti-analito en una cantidad suficiente para prevenir enlazamiento no específico de dichos anticuerpos heterofílicos a dicha segunda región y permitiendo que dicha muestra de prueba y la inmunoglobulina añadida fluyan a través de las regiones de dicha matriz de prueba;
- (c)
- medir la cantidad de la marca detectable en la segunda y la tercera regiones de la matriz, y
- (d)
- utilizar las señales determinadas en (c) para calcular la concentración del analito en la muestra fluida de prueba.
10. Un método de la Reivindicación 9 en donde
dicho primer anticuerpo anti-analito es
anti-analito policlonal de cabra y dicho segundo
anticuerpo anti-analito es
anti-analito monoclonal de ratón.
11. Un método de la Reivindicación 9 en donde
dicha marca se selecciona del grupo que consiste de partículas
coloreadas de látex, soluciones de metal, y enzimas.
12. Un método de la Reivindicación 9 en donde
dicha inmunoglobulina es IgG.
13. Un método de la Reivindicación 9 en donde
cada parte de dicho primero y segundo pares de enlazamiento tiene
una concentración despreciable en dicha muestra.
14. Un método de la Reivindicación 13 en donde
dichos pares de enlazamiento se seleccionan del grupo que consiste
de fluoresceína/anti-fluoresceína, biotina/avidina,
glucosa oxidasa/anti-glucosa oxidasa,
dinitrofenol/anti-dinitrofenol,
digoxina/anti-digoxina, y proteína de enlazamiento
de maltosa/proteína de enlazamiento
anti-maltosa.
15. Un método de la Reivindicación 14 en donde
dichos pares de enlazamiento son
fluoresceína/anti-fluoresceína y
biotina/avidina.
16. Un método de la Reivindicación 9 en donde
dicha parte del primer par de enlazamiento específico de (a) (1) es
biotina y dicha segunda parte del primer par de enlazamiento
específico de (a) (3) es avidina y una parte del segundo par de
enlazamiento específico de (a) (2) es fluoresceína y la segunda
parte del segundo par de enlazamiento específico de (a) (3) es
anti-fluoresceína.
17. Un dispositivo para determinar la cantidad
de una analito en una muestra fluida de prueba que contiene
anticuerpos heterofílicos que se enlazan en forma no específica a
anticuerpos utilizados para capturar e inmovilizar anticuerpos
marcados, dicho dispositivo comprendiendo una matriz de prueba que
tiene:
- (a)
- una primera región para recibir dicha muestra, dicha primera región conteniendo un primer anticuerpo anti-analito que tiene una marca detectable y una fracción que es una parte de un par de enlazamiento específico y una cantidad de una inmunoglobulina de la misma fuente animal que dicho primer anticuerpo anti-analito suficiente para prevenir el enlazamiento no específico de dichos anticuerpos heterofílicos en la segunda región;
- (b)
- una segunda región para recibir dicha muestra de dicha primera región y capturar e inmovilizar a dicho primer anti-analito enlazado a un analito en dicha muestra, dicha segunda región conteniendo un segundo anticuerpo anti-analito inmovilizado que es específico para un epítopo diferente de dicho analito que dicho primer anticuerpo anti-analito;
- (c)
- una tercera región para recibir a dicha muestra de dicha segunda región y atrapar la porción de dicho primer anticuerpo anti-analito no enlazada a dicho analito, dicha tercera región conteniendo una segunda parte inmovilizada de dicho par de enlazamiento específico de dicha primera región; y
- (d)
- una región absorbente para recibir dicha muestra de dicha tercera región.
18. Un dispositivo de la Reivindicación 17 en
donde dicho primer anticuerpo anti-analito es
anti-analito policlonal de cabra y dicho segundo
anticuerpo anti-analito es
anti-analito monoclonal de ratón.
\newpage
19. Un dispositivo de la Reivindicación 17 en
donde dicha marca se selecciona del grupo que consiste de partículas
coloreadas de látex, soluciones metálicas y enzimas.
20. Un dispositivo de la Reivindicación 17 en
donde dicha inmunoglobulina es IgG.
21. Un dispositivo de la Reivindicación 17 en
donde cada parte de dicho par de enlazamiento tiene una
concentración despreciable en dicha muestra.
22. Un dispositivo de la Reivindicación 21 en
donde dicho par de enlazamiento es solicitado del grupo que consiste
de fluoresceína/anti-fluoresceína, biotina/avidina,
glucosa oxidasa/anti-glucosa oxidasa,
dinitrofenol/anti-dinitrofenol,
digoxina/anti-digoxina, y proteína de enlazamiento
de maltosa/proteína de enlazamiento
anti-maltosa.
23. Un dispositivo de la Reivindicación 22 en
donde dicha parte de un par de enlazamiento específico de (a) (1)
es biotina y dicha segunda parte del par de enlazamiento específico
de (a) (3) es avidina.
24. Un dispositivo de la Reivindicación 22 en
donde dicha parte de un par de enlazamiento específico de (a) (1)
es fluoresceína y dicha segunda parte del par de enlazamiento
específico de (a) (3) es anti-fluoresceína.
25. Un dispositivo para determinar la cantidad
de una analito en una muestra fluida de prueba que contiene
anticuerpos heterofílicos que se enlazan en forma no específica a
anticuerpos utilizados para capturar e inmovilizar anticuerpos
marcados, dicho dispositivo comprendiendo una matriz de prueba que
tiene:
- (a)
- una primera región para recibir dicha muestra, dicha primera región conteniendo (i) un primer anticuerpo anti-analito que tiene una marca detectable y una fracción que es una parte de un primer par de enlazamiento específico, (ii) un segundo anticuerpo anti-analito que es específico para un epítopo diferente de un analito en dicha muestra que el primer anticuerpo anti-analito y suministrada con la primera parte de un segundo par de enlazamiento que es distinto del primer par de enlazamiento, y (iii) una cantidad de una inmunoglobulina de la misma fuente animal que dicho primer anticuerpo anti-analito suficiente para prevenir el enlazamiento no específico de dichos anticuerpos heterofílicos en la segunda región;
- (b)
- una segunda región para recibir dicha muestra de dicha primera región y capturar e inmovilizar a dicho segundo anticuerpo anti-analito, dicha segunda región conteniendo una porción inmovilizada de dicha segunda parte de dicho segundo par de enlazamiento;
- (c)
- una tercera región para recibir a dicha muestra de dicha segunda región y atrapar la porción de dicho primer anticuerpo anti-analito no enlazada a dicho analito a través de dicha segunda parte de dicho primer par de enlazamiento, dicha tercera región conteniendo una segunda parte inmovilizada de dicho primer par de enlazamiento; y
- (d)
- una región absorbente para recibir dicha muestra de dicha tercera región.
26. Un dispositivo de la Reivindicación 25 en
donde dicho primer anticuerpo anti-analito es
anti-analito policlonal de cabra y dicho segundo
anticuerpo anti-analito es
anti-analito monoclonal de ratón.
27. Un dispositivo de la Reivindicación 25 en
donde cada parte de dichos pares de enlazamiento tiene una
concentración despreciable en dicha muestra.
28. Un dispositivo de la Reivindicación 27 en
donde dichos pares de enlazamiento se seleccionan del grupo que
consiste de fluoresceína/anti-fluoresceína,
biotina/avidina, glucosa oxidasa/anti-glucosa
oxidasa, dinitrofenol/anti-dinitrofenol,
digoxina/anti-digoxina, y proteína de enlazamiento
de maltosa/proteína de enlazamiento
anti-maltosa.
29. Un dispositivo de la Reivindicación 28 en
donde dichos pares de enlazamiento son
fluoresceína/anti-fluoresceína y
biotina/avidina.
30. Un dispositivo de la Reivindicación 25 en
donde dicha inmunoglobulina es IgG.
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