JP2628421B2 - 診断試験用キットおよびこれを用いる方法 - Google Patents
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Description
ardic)の原因によるか評価し、さらに患者の胸痛の初期
兆候において不安定狭心症(アンギナ)と心筋梗塞
(「MI」)とを識別するための正確、簡単、迅速、か
つ携帯可能な診断方法として用いられる、パネル形態の
新規な一段診断試験に関する。特に、パネル試験は、酵
素免疫サンドイッチ乾燥化学フォーマット(enzyme immu
noassay sandwich dry chemistry format)を用いて、羅
患中あるいは羅患痕の血清または血漿中に見出される3
種のマーカーの血清または血漿レベルを同時に評価す
る。本発明の具体例としては、マーカーをクレアチンキ
ナーゼ(CK)、ミオグロビンおよびミオシンL鎖(M
LC)としている。 【0002】 【従来の技術】心筋梗塞の早期診断は、医師の診断能力
と、患者の症状、例えば、腕から頸に広がることもある
胸痛や胸部圧迫感、疲労感、死の恐怖、息切れ、蒼白、
冷感、抹消チアノーゼまたは細脈(rapid thready puls
e) のような患者の症状とに頼っている。 【0003】北米では胸痛を感じた患者のほとんどが、
胸痛の発症後6時間内に医師または緊急病院に出向いて
いる。それ故、MIの初期段階において効果的な診断を
行なうことが重要である。各種の心試験(cardiac test)
がMIの診断に用いられている。これらの試験として
は、ECG、SGOT/AST、LDH、CK−MB免
疫検定、NAラテックス ミオグロビン粒子強化検定(L
atex Myoglobin Particle Enhanced Assay)が挙げられ
る。しかし、救急班の医師が心臓由来の胸痛か否かを特
定することができる単一の酵素心試験(enzyme cardiac
test) は存在しない。また、心筋梗塞が確認されはじめ
て血栓阻止治療を開始することができる。治療の開始が
早ければ早いほど、患者の全快の可能性が高く、少なく
とも心筋障害を最小に止めることができる。このため
に、医師にとって胸痛が心臓由来か否かを特定すること
が重要である。 【0004】MIの診断に心電図(ECG)を用いるこ
とができる。しかしECGでは、心臓が著しい障害を受
けるまで診断ができない。胸痛の初期段階におけるEC
Gの診断特定率は僅か51%にすぎない。したがって、E
CGはMIの初期診断には不適当である。血清グルタミ
ンオキサルトランスアミナーゼ/アスパラギン酸トラン
スフェラーゼ(SGOT/AST)は心筋中に高濃度で
見出される特徴的な酵素である。SGOTのレベルを測
定する血清試験を心筋梗塞の診断に用いることができ
る。しかし、SGOTのレベルは、胸痛の発症から8〜
10時間後にはじめて上昇し始め、24〜36時間で最高値と
なり、5〜7日後に平常値に戻る。胸痛の初期段階の緊
急時においては、心筋梗塞の診断にSGOTはあまり有
用でない。また、SGOTは心筋に特異的でない。SG
OTは骨格筋や肝臓、腎臓などの多くの組織に存在し、
筋肉注射やショックにより放出され、肝臓疾患や肝性う
っ血の羅患中にも放出される。このため、特定の心臓組
織の損傷の診断には有用性が少ない。 【0005】乳酸脱水素酵素(LDH)は心臓や骨格
筋、肝臓などの多くの組織中に高濃度で見出される酵素
である。血清中のLDHの存在を検出する試験は心筋梗
塞の診断に用いられている。LDHには5つのコモンイ
ソタイプがあり、心臓には主としてLDH1およびLD
H2が含まれている。LDHレベルは、胸痛の発症後24
〜36時間で上昇し始め、48〜72時間後に最高値となり、
4〜8日後に正常値に戻る。それ故、LDHは患者の胸
痛の早期段階におけるMIの指示例としては有用でな
い。更に、LDHは心臓障害に特異的でなく、肺動脈塞
栓症、ヘモリシス(haemolysis)、肝性うっ血、腎疾病お
よび骨格筋損傷により放出される。このように心臓に特
異的でないので、LDHの有用性が低くなる。 【0006】クレアチンキナーゼ(CK)は筋肉組織中
に見出される酵素である。CKは、クレアチンとアデノ
シン三リン酸(ATP)をホスホクレアチンとアデノシ
ン二リン酸(ADP)に転化する触媒作用を有する。数
種のCKイソエンザイムのうちCK−MBが心臓組織に
おいて見出される。CK−MBは、障害を受けた心筋組
織から放出されるので、心筋梗塞の診断に敏感なマーカ
ーである。CK−MBは放出された患者の血清中に残存
する。図1は時間に関する患者血清中のCK濃度を示し
ている(リーT.H.氏ほか「Ann. Intern. Med. 」10
5 , 221 〜 233(1986) ) 。 【0007】CK−MB免疫検定は心筋梗塞の標準的な
診断試験法である。CK−MBを用いた診断方法は「C
K−MM心筋梗塞免疫検定」と題する米国特許第4,900,
662号明細書に開示されている。上記米国特許第4,900,6
62 号明細書には心筋梗塞後の患者血清中のCK−MM
−a、CK−MMのイソフォーム、およびCK−MM−
aおよびCK−MM−bの初期の濃度レベル上昇を同時
に測定する方法が開示されている。この方法によると、
梗塞発症時点を正確に評価することができる。血清中の
CK−MM−aとCK−MM−bの混合濃度、およびC
K−MM−aの濃度を測定することにより心筋梗塞の急
性期の時点が測定できる。試薬として、CK−MBやC
K−MM−b、CK−MM−cとほとんど結合しないC
K−MM−aの新規な多クローン性および単クローン性
抗体;CK−MBやCK−MM−a、CK−MM−cと
ほとんど結合しないアンチ−CK−MM−b抗体;CK
−MM−aとCK−MM−bには結合するが、CK−M
BまたはCK−MM−cとはほとんど結合しないアンチ
−CK−MM−a+b抗体;これらの抗体の標識誘導
体;これらの抗体を付着する不溶性支持体;および1ま
たは2種以上の上記の試薬からなるキットが挙げられて
いる。酵素標識および放射性標識(radiolabelled) され
たCK試薬が特に有用である。 【0008】 【発明が解決しようとする課題】CK−MBを単独で診
断マーカーとして用いるには問題がある。第1に、CK
−MBの血清レベルは心筋梗塞発症後6〜8時間まで上
昇せず、最高値となるのは12時間後である。このため初
期の緊急診断、治療を行なうことができない。第2に、
CK−MB試験は熟練した研究技術者によって研究室に
て行なわれる必要がある。郊外では早急に試験を行い結
果を判読することが困難であり、診断の遅れや受診を待
つ患者のための医療費の増大を招いている。 【0009】第3に、CK−MBは通常の骨格筋組織中
にも存在する。したがって、試験は心臓に特異的でな
く、診断は確かでない。ミオグロビンは骨格筋または心
筋細胞膜の近くに存在する他のタンパク質である。細胞
膜が異常に浸透性を増したとき、例えば、心筋虚血羅患
中に可逆状態となったとき、ミオグロビンは細胞から容
易に放出される。ミオグロビンは、胸痛の発症から1.5
時間以内で血清中に検出できる。ミオグロビンは心筋壊
死により放出されるので、心筋損傷の初期マーカーとし
て有用であると、医学研究団体は考えている。図2は時
間に対する血清中のミオグロビンの濃度を示している
(グレナディアーE氏ほか「Am. Heart J.」104 , 408
〜416 (1981);セグインJ.氏ほか「J. Thorac. Cardi
ovasc. Surg.」95 , 294〜297 (1988) )。 【0010】胸痛の原因を診断する場合、血清ミオグロ
ビンの増加が胸痛の発症後2〜3時間のうちに検出され
ない場合には、心筋梗塞は否定できる。NAラテックス
ミオグロビン粒子強化検定はミオグロビンの検定用の
一般に入手しうる検定キットである。検定は、ヒト体液
に存在する抗原とポリスチレン粒子に共有結合したアン
チミオグロビン抗体との反応に基づく。試料、Nミオグ
ロビン試薬、非特異性反応を除去する溶液およびN反応
緩衝液をピペットでキュベットに自動的に移す。12時間
温めた後、光散乱を比濁手段で測定し、ミオグロビン濃
度を検量線から算出する。 【0011】また、ミオグロビンは放射線免疫検定を用
いて検定することもできるが、酵素結合免疫吸着剤検定
(ELISA)フォーマットはまだ利用されていない。
診断マーカーとしてミオグロビンを単独で用いるには問
題がある。ミオグロビンによっては心筋梗塞などの心筋
損傷のタイプを特定できない。ミオグロビンはまた、シ
ョックや腎疾病、横絞筋融解症、ミオパシーなどの種々
の条件で放出される。更に、血清や血漿中のミオグロビ
ン濃度は、一般に年令や性別によって異なり、通常健康
人でも広範囲にわたって変化する。健康人では一般に90
μg/lの血清中濃度が上限とされている。従って、あ
る個人について通常のレベルが他の個人については容易
ならぬ事態を示唆しているかもしれず、所望の診断精度
が得られない。 【0012】ミオシンL鎖(MLC)はミオシン筋原線
維の一部分であるが、この機能は、まだ明らかでない。
MLCは緩急の心房および心室の筋肉に存在する。ML
Cは心筋虚血に対して極めて敏感であることが知られて
いる。MLCは血清中に速やかに生じ、そのレベルは心
筋壊死後10日までの間、高いレベルで残留する。図3は
時間に対する患者血清中のMLCの濃度を示している
(ワングJ氏ほか「Clin. Chimica. Acta 」181 , 325
〜 336 (1989) ;ヤコワスキーG氏およびシメスJ.C
氏ほか「Circulation Suppl.」 1180 , 355 (1989) )。
また、MLCは血栓治療の測定の予後値を示す。MLC
の高い値は悪い予後を指示し、また著しい梗塞に相当す
る。数日にわたるレベルの降下は患者の回復傾向を指示
するのに対して、スパイキングまたはスタジコパターン
は梗塞傾向を示し治療(intervention) の必要性を指示
する。 【0013】MLCには主にMLC1とMLC2として
知られる2つの主要タイプがある。これらは、梗塞細胞
の細胞形質中の可溶性プール (soluble pool) として存
在し、またミオシン筋原線維と一体化している。心室筋
中では、MLC2、そしておそらくはMLC1も緩骨格
筋中にあるイソタイプと同一である。MLC1は胸痛を
覚えた患者の80〜85%で上昇が見られる。MLC1は不
安定狭心症や虚血性心臓疾患に極めて敏感な指示剤であ
る。 【0014】他の心マーカー (cardiac markers)として
は、低分子量心タンパク質(LMWCP)がある。この
心マーカーの例としては、収縮性器官の成分、すなわ
ち、トロポニン、トロポニン−T、トロポニン−Iおよ
びトロポニン−C、トロオースPイソメラーゼ等のミト
コンドリア酵素、心臓から放出されやすい低分子量ポリ
ペプチド、並びに虚血発症後すぐに放出される筋細胞膜
タンパク質またはタンパク質フラグメント、特に心特異
性の15 kd 筋細胞タンパク質および100 kd複合糖タンパ
ク質を挙げることができる。 【0015】心イソタイプ(cardiac isotype) トロポニ
ン−Iは、心筋の収縮間の休止期間中、アクチン分子と
ミオシン分子との相互反応を抑制する。トロポニン−I
はMI発症後4〜6時間で患者の血清中に現れ、7〜8
日にわたり高い割合で残留する。図4は時間に対するト
ロポニン−Iの濃度を示している(クミンスB.;アウ
クランドM.L.;およびクミンスP.氏「Am. Heart
J.」 113 , 1333 〜1344 (1987) )。トロポニン−Iは
心特異性であり、心筋損傷が骨格筋損傷かを鑑定するう
えで他のマーカーに比べ極めて敏感である。 【0016】トロポニン−Tは細いフィラメントのトロ
ポニン−トロポミオシン複合体の一部であり、トロポミ
オシン骨格とトロポニン−I−トロポニン−C複合体と
の間の結合剤として作用する。トロポニン−Tは塩基性
タンパク質であり、心筋、および緩急の骨格筋中にイソ
タイプがある。トロポニン−TはMI後血清中に3時間
のうちに生じ、少なくとも10日にわたって高い割合で残
留する。図5は時間に対するトロポニン−Tの濃度を示
している(カツH.A氏ほか「J. Mol. Cell Cardiol.
」 21 , 1349〜1353 (1989) ) 。トロポニン−Tは二
相放出パターン (biphasic release pattern) に従う。
トロポニン−Tは心特異性で、MIに極めて敏感であ
る。 【0017】ミオシンH鎖(MHC)およびトロポミオ
シンは心マーカーとして用いられる高分子量タンパク質
である。MHCは筋肉の主要な収縮性タンパク質の一つ
である。MHCのフラグメントは、心筋細胞壊死やその
後の不可逆性膜の損傷により心室から血清中に放出され
る。MHCフラグメントは心筋細胞壊死直後には血清中
に出現しないが、MHCはMI発症後少なくとも10日
間は高濃度で残留する。MHCの最高値はMI発症後4
日後に観察される。図6は時間に対するMHC濃度を示
している。(レガ−J.O.C.氏ほか「Eur.J.
of Chin.Invet.」15,422〜429
(1985);セグウインJ.R.氏ほか「J.Tho
rac.Cardiovasc.Surg.」98,3
97〜401(1989))。MHC放出曲線下の面積
は心筋細胞の損傷の広まりと極めてよく相関する。しか
し、MHCのレベルはMIの進行中にはあまり臨床的に
有用でない。 【0018】トロポミオシンは、筋収縮における調整シ
ステムの部分である2種のポリペプチドから形成した二
量体である。トロポミオシンは、心筋梗塞後、約7〜8
時間で血清中に検出され、CK−MBと同様、心筋梗塞
に極めて敏感である。図7は時間に対するトロポミオシ
ン濃度を示している(クミンスP氏ほか「Clin.S
ci.」60,251〜259(1981))。しかし
ながら、トロポミオシンは骨格筋損傷でも高値を示し特
異的ではない。 【0019】現在の標準的な心筋梗塞診断方法には限界
がある。胸痛の発症後すぐに、例えば救急車や病院で実
施できる高感度で正確、迅速、簡単な診断試験は開発さ
れていない。本発明は、胸痛の発症後早期に患者の血液
や血漿中に現れる、少なくとも3種の異なる心筋損傷マ
ーカーを組合わせ測定することにより、不安定狭心症と
MIの早期段階において使用できる心筋梗塞の改良診断
方法を提供するものである。 【0020】 【課題を解決するための手段】本発明は従来技術の欠点
を解決するために、患者の血清中の少なくとも3種の心
筋損傷により摘出されるマーカーを検出する、緊急時に
用いる一段階で、正確、迅速かつ携帯できるパネル診断
試験を提供するものである。試験結果から、患者が不安
定狭心症にかかっているか否か、または心筋梗塞か否か
を鑑別できる。MIの早期診断は血栓阻止治療を早期に
始めることを可能とする。それ故、心臓損傷を最小に止
めることができ、患者の生存率を高めることができる。
パネル試験の結果により、初期症状から数日後でも、不
安定狭心症と心筋梗塞とを識別することができる。パネ
ル試験は酵素免疫検定サンドイッチドライケミストリー
以下乾燥化学という)フォーマットを利用する。パネル
による一連の測定により、医師は、心筋損傷の範囲およ
び血栓阻止の成功に関する予後を知ることができる。本
発明の具体例としては、3種のマーカーはクレアチンキ
ナーゼ(CK)、ミオグロビンおよびミオシンL鎖(M
LC)である。 【0021】本発明を利用することにより、心筋梗塞を
患者の胸痛の早期兆候において検出する診断試験用キッ
トが得られる。試験用キットは、血液または血清を保持
する容器と、試料に連結する検出手段とからなる。検出
手段は、キャリヤーに担持されている少なくとも3種の
単クローン性抗体または多クローン性抗体であって、各
々が心筋梗塞の初期段階に心筋により放出される異なる
タンパク質に相補(以下合致という)する抗体と、合致
タンパク質と反応する各抗体に各々応答する対応試薬と
を含んでいる。 【0022】 【実施例】次に、本発明を添付図面に基づいて説明す
る。本発明の概要を図8に示す。好適例では、本発明の
キットはパネルフォーマット1からなる。パネルフォー
マットとしては公知の市販のものを用いることができ
る。このパネルフォーマットは妊娠試験に一般に用いら
れているフォーマットと似たもので、商標登録「BIO
SIGN」として一般に入手できる。 【0023】パネルは正面パネル10および裏面パネル12
を有するポリプロピレン カードからなる。図9に示す
ように、正面パネル10は各心マーカーについての表示ウ
インドー14および試料ウインドー16を有している。正面
パネル10の下には露出乾燥化学膜18があり、この膜18は
正面パネル10の背後に適当な手段で固定されている。裏
面パネル12にはリップ20が設けられている。このリップ
20は正面パネル10をスナップ止めできるように裏面パネ
ル12の周辺に延在し、これにより膜18を正面パネルと裏
面パネルとの間にシールしている。 【0024】正面パネルおよび裏面パネルは共にスナッ
プ止めするように記載しているが、当業技術者に知られ
ている両パネルを接合する他の多くの適当な方法を用い
ることができる。正面パネル10には患者の氏名や身元を
記載するための領域13を設けることもできる。更に試験
結果を記載できるスペースもある。図10に示すように、
膜18は単クローン性または多クローン性抗体のキャリヤ
ーである。好適例においては、血液または血漿は一端か
ら他端に矢印で示すように流れる。端部22は試料ウイン
ドー16と一列に並んでいる。固定捕捉された抗体24は抗
体−酵素抱合体26と積層または結合されている。この抱
合体26は抗体24により認識される以外の抗原の異なるエ
ピトープに対して選ばれる。抗体24はミオシン タンパ
ク質に合致(complementary) する。同様に、抗体28は対
応試薬30に積層されている。抗体28はCK−MBに合致
する。同様に、抗体32は試薬34に積層されている。抗体
32はミオシンL鎖に合致する。抗体36は正常な血清また
は血液に見出されるいかなるタンパク質にも合致する。
抗体36は試薬38に積層されている。 【0025】単クローン性および多クローン性抗体は、
多クローン性抗体の生成に用いられる任意の哺乳動物を
用いた通常の方法によって生成することができる。好適
例では、標識試薬を用いる。抗体試薬は標識化され、ま
たは識別可能なモイエティー(moiety)と化学的に結合さ
れる。モイエティーは、血清や血液中または乾燥化学膜
上の抗体の存在を確認し定量するために観測・計量でき
るものである。診断具として用いられる本発明の抗体と
結合するリガンドや基は、それらと結合する抗体から識
別できるような物理的化学的性質を有する元素、化合物
または生物学的物質を含んでいる。 【0026】各心マーカー毎に、モノ/ポリ、ウサギ/
ポリ、ヤギ/ポリの少なくとも2種の抗体が必要であ
る。抗体をその特異的心免疫原に対して親和精製 (affi
nity purified)し、次いで非関連種に対して交差吸収す
ることにより更に精製して、非特異的免疫グロブリンを
除去する。使用の際には、診断医、例えば医師や救急技
師、看護婦が患者の血清または血液を3滴または100 ml
以下試料ウインドウ16に加える。試料は、毛細管現象に
より膜18に沿って移動し、抗体と試薬の対24と26、28と
30、32と34、36と38に順次接触する。 【0027】特定のマーカーが試料中に存在する場合、
そのマーカーは膜に固定された抗体に結合する。また、
対応試薬にも反応し、試薬の色の変化によって視覚化さ
れる。色の変化は試料におけるマーカーの濃度に比例す
る。それ故、試験用キットを時間をおいて用いる場合に
は、マーカー濃度の増減を測定することができ、診断に
用いることができる。試験は3〜5分内で完了する 【0028】好適例では、試料中に存在する各心マーカ
ーを青色バンドによって示す。バンドの色の強度は反射
計によって定量できる。これにより色の強度と特定マー
カーの濃度レベルとを対応付ける。反射計にはマイクロ
プロセッサーを設け、パネル中の各心マーカーの定量結
果を患者別に各マーカーの濃度としてプリントアウトす
ることができる。 【0029】試験は、3滴または100 μl 未満の血清ま
たは血漿を用い、試験間の精度計数の変化と試料間の精
度計数の変化が15%以下で、0.5 ng/ml〜25ng/mlのマ
ーカー濃度に敏感となるようにすることが好ましい。マ
ーカーの特性によって試験に用いられる心マーカーが選
ばれる。好適例では、図8に示すように、ミオグロビ
ン、MLCおよびCK−MBを有するパネルが用いられ
ている。 【0030】ミオグロビンは心筋細胞から極めて容易に
放出され、心特異的ではないが、心筋梗塞つまり心筋壊
死に極めて高い敏感さを有しており、壊死が起こらない
程度の酸素欠乏によっては放出されない。MLCは心特
異的であり、胸痛が心臓由来か否かの識別を可能とし、
容易に放出される。しかし、ミオグロビンほど容易に放
出されない。CK−MBは心筋梗塞と狭心症とを識別で
きるが、胸痛の発症後約6時間経過しないと検出でき
ず、このために緊急診断試験として、単独で用いること
ができない。 【0031】図1,2および3に示すように、使用する
心マーカーがCK−MB、ミオグロビンおよびMLCで
ある場合には、以下の試験結果の解釈により診断でき
る。パネル試験結果がMLCについてポジティブであり
ミオグロビンおよびCK−MBについてネガティブであ
る場合、患者の胸痛が心臓由来のものであり不安定狭心
症が原因であることを示唆する。 【0032】ミオグロビンおよびMLCがポジティブで
あり、CK−MBがネガティブである場合には、初期の
心筋梗塞の進行を示唆し、治療を開始することができ
る。3種のマーカーすべてがポジティブである場合に
は、心筋梗塞を示唆する。 【0033】MLCおよびCK−MBがポジティブで、
ミオグロビンがネガティブである場合には、心筋梗塞を
示唆する。ミオグロビンおよびCK−MBがポジティブ
でありMLCがネガティブである場合には、患者は骨格
筋損傷を有する(偽陽性)が心筋梗塞に羅患している。 【0034】MLC放出曲線が時々僅かな下降を有して
いるため、患者が僅かな心内膜下梗塞を有している場合
であっても「下降(dip) 」時に試験された可能性がある
ので、この場合試験は偽陽性と「僅かな」心筋梗塞とを
識別することができない。梗塞が僅かな場合には、「下
降」はほとんど正常レベルにまで下がり、それ故、患者
はMLCについてネガティブを示すことがある。CK−
MBの存在によってポジティブ診断を行うこととなる。 【0035】患者が著しい心筋梗塞を有する場合には、
MLCレベルにおける「下降」は正常レベルにまで下が
るほど大きくはなく、それ故MLCはそのまま検出され
る。他の実施例では、試験パネルとして同様のフォーマ
ットで異なる抗体の組み合わせを用い、異なる心マーカ
ーを評価することができる。パネル試験により、患者の
胸痛の初期段階における心臓組織の損傷を検出できるよ
うにするため、CK、ミオシンL鎖またはミオグロビン
のような心筋損害の初期段階において多量に摘出される
マーカーに対応する少なくとも1種の抗体を用いる必要
がある。また、CK、ミオシンL鎖またはミオグロビン
の特質および特性を有する低分子量心タンパク質をキッ
トに用いることもできる。 【0036】適当なタンパク質および酵素としては、ト
ロポニン、トロポニン−I、トロポニ−C、トロポニン
−Tおよび筋線繊維タンパク質、トリオースホスフェー
ト(以下P−という)イソメラーゼ、またはクレアチン
キナーゼ、ミオグロビンまたはミオシンL鎖の特質およ
び特性を有する任意の高分子量心タンパク質から選択す
ることができる。また、トロポミオシンおよびミオシン
H鎖のような他のタンパク質をキットに加えることがで
きる。この場合、胸痛から長時間を経過したMIの後期
段階であってもキットをMIの診断に用いることができ
る。 【0037】第2実施例では、膜18に補促された抗体
124と対応試薬126の層を設けることができる。同
様に、各マーカーを検出することができるように、抗体
と対応試薬の対128と130、132と134、およ
び対照対136と138を設ける。使用の際には、上述
のように試料を各対に接触させてその結果を読み取る。 【0038】乾燥化学膜118は吸収性材120により
支持することもできる。吸収材120により膜を通る血
清の摘出が向上する。試験キットの他の実験例として、
一般に用いられている血液試料管が用いられる。管の内
壁を単クローン性および多クローン性抗体と試薬の支持
体として用いることができる。試験者が単に管を振るだ
けで抗体と血液とを反応させることができる。血液中に
心臓性タンパク質がある場合、上述のように色の変化が
生じる。 【0039】上述において、本発明の好適例を記載した
が、本発明はこれらの具体例に限定されるものではな
い。本明細書および特許請求の範囲に記載された発明の
本旨を逸脱しない限り、様々な変更を行なうことができ
る。
フである。 【図2】時間に対する血清中のミオグロビンのレベルを
示すグラフである。 【図3】時間に対する血清中のMLCのレベルを示すグ
ラフである。 【図4】時間に対する血清中のトロポニン−Iのレベル
を示すグラフである。 【図5】時間に対する血清中のトロポニン−Tのレベル
を示すグラフである。 【図6】時間に対する血清中のMHCのレベルを示すグ
ラフである。 【図7】時間に対する血清中のトロポミオシンのレベル
を示すグラフである。 【図8】本発明の診断試験用キットの1例構造を示す表
面図である。 【図9】図8に示す構造の分解図である。 【図10】図8に示すキット構造の膜の斜視図である。 【図11】図10に示す膜の変形構造の斜視図である。 【符号の説明】 1 パネル フォーマット 10 正面パネル 12 裏面パネル 14 表示ウインドー 16 試料ウインドー 18 膜 20 リップ 22 端部 24 固定捕捉抗体 26 抗体−酵素抱合体(試薬) 28, 32, 36, 128, 132 抗体 30, 34, 38, 126, 134 試薬 118 膜 120 吸収性材料 136, 138 対照対
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 不安定狭心症と心筋梗塞症との間の鑑別
診断をするための診断用キットにおいて、 (i) 血液または血清試料を保持する容器と、 (ii) 該容器に連結する検知手段であって、a)互
いに所定の位置にある固体単体上に別々に支持された3
以上の単クローン性抗体または多クローン性抗体で、各
々の抗体は心筋の損傷に際し心筋から放出される夫々異
なったマーカータンパク質に合致する抗体であり、かつ
試料に接触し得る各々の抗体は、少なくとも1つの抗体
が狭心症に特異的なマーカータンパク質に合致し、また
少なくとも別の1つの抗体が心筋梗塞に特異的なマーカ
ータンパク質に合致し、而もb)抗体/タンパク質結合
体が生成した場合夫々に独立して反応性があり、かつ不
安定狭心症または心筋梗塞のいずれであるかを指示する
応答をひとまてめにして提示するに必要な試薬とを有す
る不安定狭心症と心筋梗塞との間の鑑別診断をするため
の診断用キット。 【請求項2】 合致するタンパク質と反応する各抗体に
応じて該試薬によりもたらされる応答が可視色変化示さ
れる請求項1記載の診断用キット。 【請求項3】 容器および検出手段が抗体と試薬とを乾
燥化学品の形で含む一体化構造である請求項1または2
記載の診断用キット。 【請求項4】 試料を受け入れる試料ウインドーおよび
試薬を表示するための表示ウインドーを有する正面パネ
ル、裏面パネルおよび検出手段を正面パネルと裏面パネ
ルとの間に挟んで一体化ユニットを形成する正面パネル
と裏面パネルとを保護するための封入手段を有し、カー
ド形態の請求項3記載の診断用キット。 【請求項5】 抗体のキャリヤーが乾燥化学膜である請
求項4記載の診断用キット。 【請求項6】 膜が検出手段への試料の摘出を高めるた
めの吸収材により支持されている請求項5記載の診断用
キット。 【請求項7】 膜が試料ウインドーから表示ウインドー
へ延在しており、抗体と対応試薬とが表示ウインドー内
の試料ウインドーから隔てられた位置に配置されている
請求項6記載の診断用キット。 【請求項8】 正面パネルが、タンパク質抗体反応の位
置を表示するためにマークを施されたものである請求項
4ないし7記載の診断用キット。 【請求項9】 正面パネルにさらに試料中のタンパク質
濃度を定量するための反射計を設けた請求項8記載の診
断用キット。 【請求項10】 容器が封止可能な透明容器であり、そ
して検出手段が容器の側面に設置されている請求項3記
載の診断用キット。 【請求項11】 検出手段(ii)はa)3以上の第1
の抗体が固体キャリヤー上の異なった位置に固相化され
ており、かつ夫々は心筋梗塞の発作に際し心筋から放出
される別個のマーカータンパク質に合致するものであ
り、b)これに相応して、3以上の第2の抗体で夫々検
出し得る標識を有しており、そして夫々は該マーカータ
ンパク質上の別個のエピトープに合致するものであり、
従って結合したマーカータンパク質に結合する能力を有
しており、それによって結合したタンパク質の存在を夫
々の標識を経て表示する、請求項1ないし10記載の診
断用キット。 【請求項12】 第2の標識抗体が検出し得る標識と
して活性酵素を有する抗体−酵素抱合体であり、そして
検出手段が適当な酵素基質であり、基質の存在下酵素の
活性を検出する請求項11記載の診断用キット。 【請求項13】 該抗体がつぎの3以上のタンパク質
または酵素、即ちクレアチンキナーゼ、ミオグロビン、
ミオシンL鎖タンパク質、ミオシンH鎖タンパク質、ト
ロポミオシン、トロポニン、トロポニン−I、トロポニ
ン−C、トロポニン−T、筋線維膜タンパク質、トリオ
ースP−イソメラーゼ、またはクレアチンキナーゼ、ミ
オグロビンもしくはミオシンL鎖タンパク質の特徴およ
び特性を有する低分子量心タンパク質であって、一方は
ミオグロビンに合致し、他方はミオシンL鎖に合致する
ものである、請求項1ないし12記載の診断用キット。 【請求項14】 3つの抗体がクレアチンキナーゼ、ミ
オグロビンおよびミオシンL鎖タンパク質のいずれかに
夫々合致するものである、請求項13記載の診断用キッ
ト。 【請求項15】 検出手段が血清中に通常見い出される
タンパク質と合致する対照抗体、および合致するタンパ
ク質と反応する対照抗体に反応する試薬に対応し、それ
によって試験が機能していることを示しているものであ
る請求項1ないし14記載の診断用キット。 【請求項16】 対照抗体および相当するタンパク質
が、テストの実質的な終了を示すために試料ウインドー
から最も遠く離れているキャリヤー上に位置している請
求項4、5および6に従属した請求項15記載の診断用
キット。 【請求項17】 100μ未満の試料を用い、試験間の
精度計数の変化と試料間の精度係数の変化が15%以下
で、0.5ng/ml〜25ng/mlのマーカー濃度
に感受性である請求項1ないし16記載の診断用キッ
ト。 【 請求項18】 互いに所定の位置にあるキャリヤー上
またはキャリヤー内に支持された複数の単クローン性抗
体または多クローン性抗体を含有し、各々の抗体が心筋
の損傷時に心筋から放出する少なくとも3つのマーカー
タンパク質の異なった1つに合致するものである診断検
出手段に、血液または血清試料を接触させ、次にそれら
タンパク質の夫々がそれらタンパク質に対する夫々の抗
体と結合する場合に、少なくともそれら抗体の1つが狭
心症に特異的なマーカータンパク質に合致する抗体であ
り、また別の抗体の少なくとも1つが心筋梗塞に特異的
なマーカータンパク質に合致する抗体であるようにし、
抗体と結合するか否かを検出する方法。 【請求項19】 マーカータンパク質と、それらの抗体
との結合が可視的に検出される請求項18記載の方法。 【請求項20】 単クローン性抗体または多クローン性
抗体の夫々が、夫々のマーカータンパク質と夫々の抗体
との結合を可視的に検出するための検出システムとキャ
リヤー内またはキャリヤー上で結合する際、該検出シス
テムの夫々が夫々のマーカータンパク質上の異なったエ
ピトープに合致する第2の単クローン性抗体または多ク
ローン性抗体を有し、該第2の各抗体は可視的に検出さ
れ得る標識で標識されている、請求項19記載の方法。 【請求項21】 標識が酵素標識であり、検出システム
がキャリヤー内またはキャリヤー上に既に取り込まれて
いる結合標識の可視的検出を可能にするに必要な試薬で
ある請求項20記載の方法。 【請求項22】 キャリヤーが乾燥ストリップキャリヤ
ーであって、その上に第一の単クローン性または多クロ
ーン性抗体を3つ以上の別々の位置に、しかも第2の抗
体上に結合した標識を可視的に検出するに必要な試薬と
共に固定してあり、標識された上記第2の抗体は乾燥ス
トリップキャリヤーの内部または上であって、夫々の固
定化された抗体から離れた而もキャリヤーに対しては移
動性の領域に組入れられており、それらの配置は、血清
または血液試料が診断検出手段と接触するや否や、先づ
試料と、可動性で且つ標識抗体を有する領域とを接触さ
せて、最初に夫々のマーカータンパク質と結合させ、そ
の結合体を血液または血清試料と共に隣接領域に移動さ
せ、当該隣接領域には夫々の固定化抗体および、その固
定化抗体とサンドイッチ複合体を形成して標識の検出を
可能ならしめるに必要な試薬を含有させておく請求項2
1記載の方法。 【請求項23】 複数の単クローン性抗体または多クロ
ーン性抗体に合致するマーカータンパク質がクレアチン
キナーゼ、ミオグロビン、ミオシンL鎖タンパク質、ミ
オシンH鎖タンパク質、トロポミオシン、トロポニン−
I、トロポニン−C、トロポニン−T)筋線維膜タンパ
ク質、トリオースP−イソメラーゼ、またはクレアチン
キナーゼ、ミオグロビンあるいミオシンL鎖タンパク質
の特質および特性を有する低分子量心筋タンパク質の少
なくとも3つのを含有し、その少なくとも1つはミオグ
ロビンであり、他の1つはミオソンL鎖である請求項1
8ないし22記載の方法。 【請求項24】 3つのマーカータンパク質がクレアチ
ンキナーゼ、ミオグロビンおよびミオシンL鎖である請
求項23記載の方法。 【請求項25】 請求項1に記載の診断用キットを使用
する請求項18ないし24記載の方法。 【請求項26】 不安定狭心症と心筋梗塞との間の鑑
別診断のための診断用キットであって、該キットは、血
清または血漿の試料を受け取る試料ウインドーおよび表
示ウインドーを有する正面パネルと、裏面パネルと、少
なくとも上記表示ウインドー内で表示のために設置され
た、しかも正面パネルと裏面パネルとの間に封止された
乾燥化学膜とを有し、該膜は試料領域と対照領域とを有
し、試料領域は試料ウインドーから試料を受け入れる位
置にあり、少なくとも3つの抗体対が試料領域と対照領
域との間にある膜に添って分離した位置に配置され、該
抗体対は抗体試薬部と固定捕捉抗体部とを有し、各捕捉
抗体部は相当する抗体試薬部よりも対照領域に近い膜上
に配置され、各抗体対は各抗体対の抗体試薬部にラベル
されたか、化学的に結合されている測定可能ないし観察
可能なモイエティーを有し、抗体対は単クローン性また
は多クローン性であって、ミオグロビンに特異的に結合
する第1の抗体対、ミオシンL鎖に特異的に結合する第
2の抗体組、およびCK−MB、トロポニン−Iおよび
トロポニン−Tからなる群より選ばれた少なくとも1つ
のタンパク質に特異的に結合する第3の抗体対を有し、
試料を試料ウインドーに加えると、試料中に存在し且つ
抗体対に合致する検体が対照領域に向って移動し、検体
の夫々と抗体対とを結合させ試料中に存在する各検体に
比例して色変化を生じさせることを特徴とする診断用キ
ット。 【請求項27】 請求項26記載の診断用キットを用い
る方法であって、診断用キットの試料ウインドー中に血
清または血漿試料を貯留し、次に対照領域に移動させ、
該領域内で抗体対に合致し、夫々の抗体対に結合して試
料中に存在する検体の各濃度に比例した色変化を生成さ
せ、その色変化を視覚化または測定する方法。
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