JP4600787B2 - クロマトデバイス - Google Patents

Description

本発明は、検体中に含まれる被検出物質を定量するクロマトデバイスに関する。

クレアチニンは、クレアチン経路の最終代謝物であり、生体内では筋肉、神経内でクレアチンリン酸から直接、或いは、クレアチンの脱水によって生成される。このクレアチニンは、血中〜腎臓糸球体を経て尿中に***される。
尿中***量は成人では体重当たりほぼ一定で、食事や生理的変動因子の影響を受けず、主として筋肉のクレアチン総量に比例する。
従って、クレアチニンの尿中濃度は、筋肉疾患や腎機能障害の指標に用いられている。

特許文献１には、展開層を支持するための支持体を有し、この支持体上に３，４−ジニトロ安息香酸を含む試薬層が設けられ、この試薬層上に強アルカリ性物質を含む展開層が設けられた体液中のクレアチニン測定用試験片が記載してある。

当該試験片を使用する際には、展開層の上に、検体である尿等の試料を滴下して、試薬層の色変化を分光色差計等の装置を用いて読み取る。装置を用いて定量分析する場合には、検体を試験片の展開層へ滴下した後、クレアチニンと３，４−ジニトロ安息香酸の縮合物の吸収波長（５５０ｎｍ）における反射率の変化速度を測定する。そして、あらかじめ既知濃度系列のクレアチニン溶液を滴下して測定しておいた結果から作成した検量線を用いて、前記変化速度から濃度を算出する。

特許文献１に記載の試験片では、試験片に試料液を吸収させたときに、試料液中のｐＨを高く維持することができ、試料中に含まれるクレアチニンと３，４−ジニトロ安息香酸との縮合反応による呈色を安定化させることができる。その結果、非希釈尿のような緩衝作用の強い体液であっても、簡便に精度よくクレアチニンを定量することができる。

特許文献２には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびメデイエーターをｐＨ７〜８．５の緩衝液中に溶解させた試薬溶液を、電極などの基板上で乾燥させることによって固定化させたバイオセンサが記載してある。

特許文献２のバイオセンサは、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼの各酵素とともに、緩衝剤が固形状態で電極上に配置されている。このため、測定時において酵素を安定化させるための緩衝液を調製することなく、測定試料をそのまま用いることができる。また煩雑な操作を必要とすることなくクレアチニンの測定を行うことが可能となる。

特許第３５１６００２号 特開２００６−３４９４１２号公報

一般に、尿中の成分濃度は食事、水分摂取、発汗などの影響を受ける。そのため、尿の濃さによって成分濃度が大きく異なるため、随時尿の基準値は存在しない。従って、尿中の成分濃度を検査する場合は、１日の蓄尿によって評価することが望まれる。
しかし、尿検査に際して例えば外来診療では蓄尿することは困難である。そこで、このような尿の濃度を補正する手段として、別に測定したクレアチニン値で割って算出された比を求めるクレアチニン補正が行われている。

上述したように、尿中に***されるクレアチニンは生理的変動因子の影響を受けず、１日の***量は筋肉のクレアチン総量に比例する。例えば成人の１日のクレアチニン***量を１ｇとすれば、随時尿中のクレアチニンの濃度が判明すれば、クレアチニン補正することで１日の蓄尿量を推定することができる。

当該クレアチニン補正値を得るためには、検体である尿の成分測定とは別異にクレアチニンを測定する必要があるため、手間を要していた。

従って、本発明の目的は、簡便にクレアチニン補正値を得ることができるクロマトデバイスを提供することにある。

上記目的を達成するための本発明に係るクロマトデバイスの第一特徴構成は、尿検体中に含まれる被検出物質を定量するため、基板上に、前記検体を導入する検体導入部と、クレアチニンを検出するクレアチニン検出試薬をするクレアチニン検出部、および、前記検体中の被検出物質を検出する被検出物質検出試薬を担持する被検出物質検出部を備えた展開手段と、吸水部とを、この順に設け、前記クレアチニン検出部は、クレアチニナーゼ・クレアチナーゼ・ザルコシンオキシダーゼを有する第１試薬部と、ペルオキシダーゼを有する第２試薬部とを備え、発色基質を有する検出試薬部を、前記検体導入部および前記展開手段の何れか一方に備え、前記検出試薬部を前記第２試薬部の上流に設けた点にある。

クロマトデバイスであるクロマトグラフィーは、固定相である展開手段の表面あるいは内部を、被検出物質を含んだ移動相（液体など）が通過する過程で被検出物質が分離されていく。このようにクロマトデバイスでは、検体中の被検出物質を分離・精製することで被検出物質が定量できる。

本構成のクロマトデバイスでは、展開手段においてクレアチニン検出部および被検出物質検出部を備える。このため、クレアチニンの測定を行なうことができると同時に被検出物質の定量を行なうことができ、測定の手間が省けて簡便にクレアチニン補正値を得ることができる。
また、本構成のクロマトデバイスでは、試薬が予め展開手段に担持されているため、検体の定量に際して試薬の調整が不要であるため検査の迅速性が達成でき、携帯性および保管性にも優れている。さらに、患者の身辺での検査であるポイント・オブ・ケア診断においても容易に適応できるデバイスとなる。

前記クレアチニン検出部は、クレアチニナーゼ・クレアチナーゼ・ザルコシンオキシダーゼを有する第１試薬部と、ペルオキシダーゼを有する第２試薬部とを備え、発色基質を有する検出試薬部を、前記検体導入部および前記展開手段の何れか一方に備え、前記検出試薬部を前記第２試薬部の上流に設けた点にある。

検体を検体導入部にスポットした後、移動相が下流に流下するに従い、尿検体に含まれるクレアチニンが検出試薬部、第１試薬部、第２試薬部を通過する。このとき、以下の一連の反応が起こる。
即ち、クレアチニンは、クレアチニナーゼによる酵素反応によってクレアチンを生成する。このとき生成したクレアチンは、クレアチナーゼによる酵素反応によってザルコシンを生成する。このザルコシンは、ザルコシンオキシダーゼによる酵素反応によってグリシンおよび過酸化水素を生成する。このとき生成した過酸化水素がペルオキシダーゼに作用して、発色基質を発色させる。

本構成のように、検出試薬部が第２試薬部の上流に設けてあれば、検出試薬部に含まれる発色基質が、検体に含まれるクレアチニンと共に流下するため、クレアチニン検出部を通過する際に起こる酵素反応の結果生じた生成物質がペルオキシダーゼに作用したときに、速やかに発色基質を発色させることができる。

以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
臨床検査において様々な検査法が利用されてきているが、その検査法のうち、ドライケミストリー法が公知である。ドライケミストリー法では、フィルムや試験紙のような展開マトリクスに乾燥状態で担持させた試薬に対して、液体状の検体をスポットして、検体中の被検査物質を測定する。このように、ドライケミストリー法は、液体法のような酵素反応液の調製や配管系が不要なため、操作や保守が容易である。

本発明のクロマトデバイスは、例えば単層の展開マトリクス（展開手段）に試薬を担持させた免疫クロマトグラフィーである。
当該クロマトデバイスは、検体中に含まれる被検出物質を定量するため、固定相である展開手段の表面あるいは内部を、被検出物質を含んだ移動相（液体など）が通過することで被検出物質を分離する。
本実施形態では検体はクレアチニンが含まれる尿検体を使用する。

図１に示したように、クロマトデバイスＸは、基板４０上に、検体を導入する検体導入部１０と、クレアチニンを検出するクレアチニン検出試薬を担持するクレアチニン検出部２１、および、検体中の被検出物質を検出する被検出物質検出試薬を担持する被検出物質検出部２２を備えた展開手段２０と、吸水部３０とを、この順に設けてある。

（基板）
基板４０は、検体導入部１０・展開手段２０・吸水部３０を載置できるものであれば、どのような態様であってもよいが、吸水部３０の吸水性を阻害しない材質を選択する必要がある。簡便に携行するため、例えば薄板状のプラスチック板が好ましい。基板４０は、例えば６０ｍｍ ×５ｍｍ ×０．３ｍｍ程度の大きさで形成してある。

（検体導入部）
検体導入部１０は、検体をスポットする部位である。本実施形態では、ガラスフィルター（日本ミリポア株式会社製）を例示するが、これに限られない。毛管現象により、下流側に移動相が流下する態様であればよい。

（展開手段）
展開手段２０には、固相の担体上に、クレアチニンを検出するクレアチニン検出試薬を担持するクレアチニン検出部２１、および、前記検体中の被検出物質を検出する被検出物質検出試薬を担持する被検出物質検出部２２が備えてある。
免疫クロマトグラフィー法とは、抗原抗体反応と毛管現象を利用した検査法である。そのため、展開手段２０は、毛管現象により移動相が流下する態様であればよく、例えばニトロセルロースメンブレン（日本ミリポア株式会社製）等が使用できる。当該展開手段２０は、一方の端部を、検体導入部１０の下流側と接触させるかオーバーラップさせるように配置し、他方の端部を、吸水部３０の上流側と接触させるかオーバーラップさせるように配置する。

被検査物質の定量の際には、検体導入部１０に被検出物質（抗原）を含んだ検体を添加し、当該検体を展開手段２０に毛細管現象により展開させ、例えばサンドイッチ型の抗原抗体反応（サンドイッチ法）を利用して反応部位を発色させることにより、抗原の同定、存在の有無、または抗原量を測定する。
抗原抗体反応の形態は、サンドイッチ法に限らず、競合型の抗原抗体反応（競合法）を利用してもよい。例えば、被検出物質の分子量が大きい場合にサンドイッチ法を利用し、被検出物質の分子量が小さい場合に競合法を利用する。

本発明のクロマトデバイスＸでは、クレアチニン検出部２１および被検出物質検出部２２が備えてあるため、検体中のクレアチニン測定と検体の成分測定とが同時に行なえ、測定の手間が省けて簡便にクレアチニン補正値を得ることができる。

クレアチニン検出部２１は、クレアチニナーゼ・クレアチナーゼ・ザルコシンオキシダーゼを有する第１試薬部Ｒ１と、ペルオキシダーゼを有する第２試薬部Ｒ２とを備える。さらに、発色基質を有する検出試薬部Ｒ３を、検体導入部１０および展開手段２０の何れか一方に備える。本実施形態では、検体導入部１０の下流端付近に検出試薬部Ｒ３を備える場合を例示する。
３つの試薬部Ｒ１〜Ｒ３には、各試薬が乾燥状態で担持してある。
本実施形態では、検出試薬部Ｒ３は第２試薬部Ｒ２の上流に設けてある。

本実施形態では、検出試薬部Ｒ３が含有する発色基質を、ＤＡＢ（四塩化３，３'−ジアミノベンジジン：３，３'−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）とする場合を例示するが、これに限られるものではない。その他の検出試薬としては、例えば金コロイド・ラテックス等のコロイド物質、量子ドット、ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)等の蛍光色素、アルカリフォスファターゼ・ガラクトシダーゼ等の酵素基質等を用いることができる。

第１試薬部Ｒ１が含有する各酵素の濃度は、例えばクレアチニナーゼが０．１〜１００Ｕ/μＬ、クレアチナーゼが０．１〜１００Ｕ/μＬ、ザルコシンオキシダーゼが０．１〜１００Ｕ/μｇの濃度範囲であれば、過剰な酵素を担持せずに検体中に含まれるクレアチニンを迅速に定量することができるため、各酵素にかかるコストを抑えることができる。
これら酵素の濃度範囲は、展開手段２０の材質、移動相の流速等を考慮して、適宜設定する。例えば、移動相の流速が早くなる材質で展開手段２０を構成した場合、或いは、移動相の流速が遅くなる材質で展開手段２０を構成した場合に応じて、検出試薬が十分に発色し得る最適な濃度範囲を設定する。

検体を検体導入部１０にスポットした後、移動相が下流に流下するに従い、尿検体に含まれるクレアチニンが検出試薬部Ｒ３、第１試薬部Ｒ１、第２試薬部Ｒ２を通過する。このとき、以下の一連の反応が起こる。
即ち、クレアチニンは、クレアチニナーゼによる酵素反応によってクレアチンを生成する。このとき生成したクレアチンは、クレアチナーゼによる酵素反応によってザルコシンを生成する。このザルコシンは、ザルコシンオキシダーゼによる酵素反応によってグリシンおよび過酸化水素を生成する。このとき生成した過酸化水素がペルオキシダーゼに作用して、ＤＡＢを発色させる。
上記反応では、クレアチニンの量に対応した過酸化水素が生成するため、過酸化水素の生成量に応じたＤＡＢが発色する。

本構成のように、検出試薬部Ｒ３が第２試薬部Ｒ２の上流に設けてあれば、検出試薬部Ｒ３に含まれる発色基質が、検体に含まれるクレアチニンと共に流下するため、クレアチニン検出部２１を通過する際に起こる酵素反応の結果生じた生成物質（過酸化水素）がペルオキシダーゼに作用したときに、速やかに発色基質を発色させることができる。
そのため、検出試薬部Ｒ３は、第２試薬部Ｒ２の上流側或いは下流側の何れに配置してもかまわない。

被検出物質検出部２２には、固定化された第１抗体および第２抗体が、それぞれ異なる位置、即ち、第１捕捉部Ｒ４・第２捕捉部Ｒ５にて乾燥状態で担持してある。第１捕捉部Ｒ４・第２捕捉部Ｒ５は、上流側からこの順に配置すれば、クレアチニン検出部２１の第１試薬部Ｒ１および第２試薬部Ｒ２より上流側に配置してもよい。

展開手段２０においては、測定の完了や特定成分の有無を判定するため、免疫抗体・免疫抗体の捕捉物質・尿成分と反応する物質を担持してもよい。

（吸水部）
吸水部３０は、隣接する展開手段２０に存在する移動相である液体を吸水する。当該吸水部３０が展開手段２０の液体を吸水することで、検体導入部１０にスポットした検体を、下流側に流下させることができる。
本実施形態では、吸水部３０を適当な大きさに切断した濾紙（日本ミリポア株式会社製）を、展開手段２０の下流側に接触させるかオーバーラップさせるように配置する。

（検体）
本明細書に記載の「検体」とは、定量を行なうべき対象となる被検出物質を含む、或いは、含む可能性のある液体サンプルのことを指す。検体はどのような起源由来のものであってもよいが、特に生検試料等から得た尿のように、クレアチニンを含有し、クレアチニン濃度を指標として濃度の補正を行う検体が例示される。

検体に含まれる「被検出物質」は、この被検出物質と特異的結合体を形成しうる結合性物質との結合により捕捉される。特異的複合体は、結合対アッセイを行った結果生じるものであり、上述したように、抗原抗体反応の結果生じる免疫化学的複合体や、相補的な核酸同士のハイブリダイゼーションの結果生じる複合体等が好適に例示される。被検出物質は、化学物質・タンパク質等の高分子・ＤＮＡ断片・インターロイキン・微生物又はウィルスおよびその断片・ホルモン・脂質由来***微量物質等、あらゆる物質が対象となりうる。

（クレアチニンの定量）
クロマトデバイスＸを用いてクレアチニンの定量を行うため、まず、クレアチニン検出部２１（第１試薬部Ｒ１，第２試薬部Ｒ２）に以下の試薬を担持させた。このとき、被検出物質検出部２２には、試薬は担持させなかった。
第１試薬部Ｒ１にはクレアチニナーゼ（キッコーマン株式会社製）１０Ｕ/μＬ、クレアチナーゼ（キッコーマン株式会社製）１０Ｕ/μＬ、ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製）１Ｕ/μｇを混合した後、塗布して乾燥させた。
第２試薬部Ｒ２には、ペルオキシダーゼ（ナカライテスク株式会社製）１００μｇ/μＬを塗布して乾燥させた。
検体導入部１０の検出試薬部Ｒ３にはＤＡＢ（株式会社同仁化学研究所製）１ｍｇ/ｍＬを塗布して乾燥させた。

表１に示した試薬を調製して人工尿を作製した。当該人工尿にはクレアチニンは含まれていない。

表１に示した成分を有する人工尿にクレアチニン（和光純薬工業株式会社製）を添加し、公知の光学的な発色量測定装置にて発色量を測定した。
クレアチニンは、０．１〜１００ｍｇ/Ｌの範囲で複数の濃度を設定して、それぞれの発色量を測定した。光の吸収量をフォトダイオードで検出して得られた電圧値を発色濃度（ｍＶ）とした。この測定結果に基づき、検量線を作成した（図２）。
また、図２の結果より、クレアチニンをクロマトデバイスＸによって良好に測定できるものと認められた。

（インターロイキン６（ＩＬ−６）の定量）
本発明のクロマトデバイスＸを用いて、ＩＬ−６の定量を行なった。定量はサンドイッチ法による抗原抗体反応を利用して行なった。
実施例１で作製したクロマトデバイスＸの展開手段２０において、被検出物質検出部２２に、以下の試薬を担持させた。
第２試薬部Ｒ２の上流側に被検出物質検出部２２にとして第１捕捉部Ｒ４、および、下流側に被検出物質検出部２２にとして第２捕捉部Ｒ５を形成した。
第１捕捉部Ｒ４には、ウサギ由来抗humanＩＬ−６抗体（ＳＣＢ（Santa Cruz Biotechnology, Inc）社製）２００μｇ/ｍＬを塗布して乾燥させた。
第２捕捉部Ｒ５には、抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma Aldrich, Inc.）１ｍｇ/ｍＬ塗布して乾燥させた。

実施例１で作製した人工尿１ｍＬに、５μＬのウサギ由来抗humanＩＬ−６抗体（ＳＣＢ社製）２００μｇ/ｍＬを混合し、さらにヒトＩＬ−６（ＰＴＩ（Pepro Tech Ec, Inc.）社製）を添加したものをクロマトデバイスＸの検体導入部１０に滴下した。
次に、アルカリフォスファターゼ修飾ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc）を燐酸緩衝液（ｐＨ９．５）によって１μｇ/ｍＬに調整したものを検体導入部１０に滴下した。
さらに、ＢＣＩＰ/ＮＢＴ（ナカライテスク株式会社製）を適量滴下し、前記発色量測定装置にて発色量を測定した。この測定結果に基づき、検量線を作成した（図３）。

（クレアチニン補正を行ったＩＬ−６）
実施例１で作製した人工尿に、５〜５０ｍｇ/Ｌの濃度範囲の何れかでクレアチニンを混合し、１０〜１００ｐｇ/Ｌの濃度範囲の何れかのＩＬ−６を混合したものを作製した（サンプル１〜６）。各サンプルのクレアチニン濃度およびＩＬ−６濃度を表２に示した。

これらサンプル１ｍＬのそれぞれに、５μＬのウサギ由来抗humanＩＬ−６抗体（ＳＣＢ社製）２００μｇ/ｍＬを混合し、実施例２で作製したクロマトデバイスＸの検体導入部１０に滴下し、反応させた。
次に、アルカリフォスファターゼ修飾ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc）を燐酸緩衝液（ｐＨ９．５）によって１μｇ/ｍＬに調整したものを検体導入部１０に滴下した。
さらに、ＢＣＩＰ/ＮＢＴ（ナカライテスク株式会社製）を適量滴下し、前記発色量測定装置にて発色量を測定した。結果を表３に示した。尚、Ａ/Ｂ（ｍＶ/ｍＶ）は、「第１捕捉部Ｒ４における電圧値/第２捕捉部Ｒ５における電圧値」を示したものである。

図２および図３に示した検量線に基づき、クレアチニン濃度およびＩＬ−６濃度を算出した。結果を表４に示した。

表４の結果より、クレアチニン補正したＩＬ−６濃度を算出し、その結果を表５に示した。例えばサンプル１では、クレアチニン補正ＩＬ−６濃度の算出は、５．３/８．６＝０．６（ｐｇ/ｍｇ）となる。
本実施例３では、クレアチニンおよびＩＬ−６共に濃度は既知であるため、予めクレアチニン補正した値を算出できる。そのため、比較データとして、表５の最下段に予め算出したクレアチニン補正値を示した。

表５に示した結果を検証するため、クレアチニン補正した値をグラフ化した（図４）。
この結果、検量線から算出したクレアチニン補正値と、既知の濃度から算出したクレアチニン補正値（比較値）とでは相関があると判断できる。これより、本発明のクロマトデバイスＸを用いてクレアチニン補正値を算出した値は、有効であると認められる。

本発明のクロマトデバイスの概略図 発色濃度とクレアチニン濃度との関係を示したグラフを示した図 定量したＩＬ−６の濃度の結果に基づき作製した検量線を示した図 検量線から算出したクレアチニン補正値と、既知の濃度から算出したクレアチニン補正値（比較値）との関係を示した図

符号の説明

Ｘ クロマトデバイス
１０ 検体導入部
２０ 展開手段
２１ クレアチニン検出部
２２ 被検出物質検出部
３０ 吸水部
４０ 基板

Claims (1)

1. 尿検体中に含まれる被検出物質を定量するため、基板上に、
   前記検体を導入する検体導入部と、
   クレアチニンを検出するクレアチニン検出試薬を担持するクレアチニン検出部、および、前記検体中の被検出物質を検出する被検出物質検出試薬を担持する被検出物質検出部を備えた展開手段と、
   吸水部とを、この順に設け、
   前記クレアチニン検出部は、クレアチニナーゼ・クレアチナーゼ・ザルコシンオキシダーゼを有する第１試薬部と、ペルオキシダーゼを有する第２試薬部とを備え、
   発色基質を有する検出試薬部を、前記検体導入部および前記展開手段の何れか一方に備え、前記検出試薬部を前記第２試薬部の上流に設けてあるクロマトデバイス。

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