ES2216000T3 - Citoquinas que unen el receptor hek de la superficie celular. - Google Patents

Abstract

POLIPEPTIDOS DE UN LIGANDO HEK (HEK IAS DE ADN, VECTORES Y CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS UTILES PARA LA FORMACION DE HEK EPTIDOS SE ENLAZAN A UN RECEPTOR EXPRESADO EN LA SUPERFICIE CELULAR (HEK) QUE ES UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE RECEPTORES DE CINASA DE TIROSINA. EL HEK SE EXPRESA EN CELULAS QUE INCLUYEN CIERTAS LINEAS CELULARES TUMORALES. LOS HEK TAMBIEN SE ENLAZAN A UN ELK CONOCIDO DE RECEPTORES DISTINTO DE CINASA DE TIROSINA.

Description

Citoquinas que unen el receptor Hek de la superficie celular.

Antecedentes de la invención

Las proteínas conocidas como receptores tirosina quinasas tienen una actividad quinasa intrínseca que se activa después de la unión del ligando. Esta clase de proteínas se caracteriza por unos motivos estructurales conservados dentro de los dominios catalíticos (Hanks y col., Science, 242:42,1988) y puede subdividirse en familias en base a las características estructurales de las regiones 5' del dominio catalítico.

Boyd y col. (J. Biol. Chem., 267:3262, 1992) purificaron una glucoproteína de la superficie celular que muestra actividad tirosina quinasa. La secuencia de aminoácidos N-terminal identificó esta proteína como miembro de la familia eph/elk, y de este modo la proteína se designó hek (quinasa humana semejante a eph/elk). Se usó un anticuerpo monoclonal inmunorreactivo frente a hek para estudiar la expresión de hek en diversos tipos celulares humanos (Boyd y col., supra). El antígeno hek se detectó en la línea celular humana de células pre-B de leucemia LK63 (la línea celular se empleo como inmunógeno frente al cual se produjo el anticuerpo) y en la línea celular humana de células T de leucemia JM. La línea celular del linfoma B Raji muestra una expresión débil del antígeno hek, y las líneas celulares remanentes analizadas (tanto líneas normales como tumorales, entre las cuales había líneas celulares hematopoyéticas que incluyen líneas de células T y de células pre-B) fueron consistentemente negativas. De las muestras de biopsia de tejido normal y tumoral que también se analizaron para la expresión del antígeno hek, ninguno de los tejidos normales fue positivo y únicamente una proporción muy baja de tumores hematopoyéticos fue positiva.

Se ha demostrado mediante análisis de transferencia de ARN la expresión de los transcritos de hek en las líneas celulares JM y LK63 anteriormente descritas, así como en la línea celular humana de leucemia de células T HSB-2 (Wicks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un clon aislado de ADNc de hek se muestra en Wicks y col., supra.

La proteína hek está estrechamente relacionada con otros diversos receptores tirosina quinasas, incluyendo elk (Letwin y col., Oncogen 3:621, 1998 y Lhotak y col., Mol. Cell. Biol. 11.2496, 1991); los homólogos de hek mek4 y cek4 (Sajjadi y col. New Biol. 3:769, 1991), eck (Chan y col. Oncogene 6:1057, 1991); erk (Chan y col., supra), eck (Lindberg y col. Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E. B. Cell Regulation 2:523, 1991); y eph (Hirai y col. Science 238:1717, 1987). Las proteínas de esta subfamilia están relacionadas no sólo respecto a sus dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios extracelulares, que son idénticos en el 41% al 68%. De modo interesante, la distribución en los tejidos de estos diversos receptores es variada. Por ejemplo, se ha publicado que la expresión del ARNm de elk estaba limitada a los testículos y el cerebro (Lhotak y col., supra), mientras que eck no se encuentra sólo en estos mismos dos tejidos sino también en el pulmón, intestino, riñón, bazo, ovario y piel.

Los ligandos de las tirosina quinasas receptoras son un grupo diverso de proteínas que afectan al crecimiento, diferenciación y supervivencia de las células que expresan los receptores. Hasta la fecha, no se ha descubierto ningún ligando para hek. La identificación de un ligando o ligandos putativos de hek sería útil en la investigación de la naturaleza de los procesos celulares regulados por la proteína hek.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona citoquinas novedosas designadas ligandos de hek (hek-L) que se unen al receptor de la superficie celular conocido como hek. La presente invención también proporciona ADN aislado que codifica las proteínas hek-L, vectores de expresión que comprenden el ADN aislado, y un método para la producción de hek-L mediante el cultivo de células hospedadoras que contienen los vectores de expresión en condiciones apropiadas para la expresión de la proteína hek-L. Se describen también anticuerpos dirigidos contra las proteínas hek-L o contra fragmentos inmunogénicos de las mismas.

Descripción detallada de la invención

Se han aislado los ADNc que codifican los ligandos proteínicos novedosos que se unen a la proteína de superficie celular conocida como hek de acuerdo con la presente invención. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden el ADNc del ligando de hek (hek-L) y métodos para la producción de polipéptidos recombinantes de hek-L mediante el cultivo de células hospedadoras que contienen los vectores de expresión en condiciones apropiadas para la expresión de hek-L y la recuperación del hek-L expresado. La presente invención también abarca la proteína hek-L purificada, incluyendo formas solubles en la proteína.

La presente invención también proporciona hek-L o fragmentos antigénicos del mismo que pueden actuar como inmunógenos para generar anticuerpos específicos frente a los inmunógenos hek-L. De este modo se pueden preparar anticuerpos monoclonales específicos frente a hek-L o frente a fragmentos antigénicos del mismo.

Las citoquinas novedosas descritas en el presente documento son ligandos de hek, un receptor de la superficie celular que es miembro de la familia de receptores tirosina quinasa. Una aplicación de los ligandos de hek de la presente intención es como herramientas de investigación para el estudio del papel que hek-L, junto con hek, puede jugar en el crecimiento o diferenciación de las células que llevan el receptor hek. Se pueden investigar las señales biológicas que pueden iniciarse tras la unión del hek-L a hek en la célula. Se ha sugerido la posibilidad de que hek juegue un papel en la tumorogénesis (Boyd y col., supra). Los ligados de hek proporcionados en el presente documento son útiles para el estudio del efecto de la unión de hek-L al receptor afín puede tener en la tumorogénesis.

Los polipéptidos hek-L de la presente invención también pueden ser empleados en ensayos in vitro para la detección de hek o hek-L o las interacciones de los mismos. Ya que se ha detectado el antígeno hek en ciertas líneas celulares de leucemias, hek-L puede emplearse como vehículo para administrar agentes diagnósticos o citotóxicos a tales células. Estos y otros usos de los ligandos de hek se discuten adicionalmente más adelante.

Se ha encontrado que las proteínas hek-L de la presente invención se unen al receptor tirosina quinasa conocido como elk. Elk ha sido descrito por Letwin y col., Oncogene 3:621, 1998 y por Lhotak y col., Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991. El análisis de Scatchard revela un patrón bifásico de la unión de elk por ambas proteínas hek-L, como se describe en el ejemplo 5. De este modo, las proteínas hek-L descritas en el presente documento también pueden emplearse para unir elk, por ejemplo, en diversos procedimientos de ensayos. Sin embargo, de un modo general la proteína ligando de elk (elk-L) descrita en el ejemplo 5 sería preferible para tales usos en vista de la mayor afinidad de elk-L por elk.

Los estudios de unión descritos en el ejemplo 5 también revelan que el ligando de elk (elk-L) se une a hek (patrón de unión bifásico). Se encontró que la proteína relacionada conocida como B61 (Holzman y col., Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990) se une tanto a hek (patrón lineal) como a elk (patrón bifásico). Las afinidades relativas se muestran en las tablas I y II del ejemplo 5.

Para identificar las células adecuadas para el uso como fuentes de ácidos nucleicos en la tentativa de clonar el ADN de hek-L, se analizó en diferentes tipos de células la capacidad de unión a hek (en la forma de proteína de fusión que comprende hek humano y un polipéptido Fc de anticuerpo). Una línea celular humana de células T de leucemia fue positiva en la unión de hek/Fc, y se derivó de ellas una genoteca de ADNc. Se aislaron satisfactoriamente dos clones de ADNc distintos que codifican hek-L humano por selección de clones que expresan la proteína de unión hek/Fc, como se describe en el ejemplo 3. Se indican la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos codificada de un clon de ADNc humano de hek-L en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Se presentan las secuencias de ADN y de aminoácidos codificada de un segundo clon de hek-L humano en SEQ ID:3 y SEQ ID NO:4. La comparación de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificadas de los clones de ADNc de hek-L humano con las bases de datos Genbank y Swisspro muestra que las secuencias de los ligandos de hek fueron únicas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de unión a hek codificadas por los dos clones son idénticas en el 38%.

El ADNc de hek-L humano se aisló a partir del primer clon positivo y se insertó en el sitio Bam HI (en la región de múltiple clonación) del vector de clonación pBLUESCRIPT® SK (-), suministrado por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA. El vector recombinante resultante, designado A2/pBS, en células DH5\alpha de E. coli, se depositó en la American Type Culture Collection el 11 de agosto de 1993, y se le asignó el número de acceso ATCC 69384. El ADNc de hek-L humano se aisló a partir de un segundo clon positivo y se insertó en el sitio Bam HI de pBLUESCRIPT® SK (-). El vector recombinante resultante, designado C6/pBS, en células DH5\alpha de E. coli, se depositó en la American Type Culture Collection el 25 de agosto de 1993, y se le asignó el número de acceso ATCC 69395. Ambos depósitos se hicieron en los términos del tratado de Budapest.

El hek-L de SEQ ID NO:2 (codificado por el ADNc del clon A2) comprende un péptido señal N-terminal (aminoácidos -19 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 202), y una región hidrófoba C-terminal que comienza en el aminoácido 203. El hek-L de SEQ ID NO:4 (codificado por el ADNc del clon C6) comprende un péptido señal N-terminal (aminoácidos -22 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1 a 160), y una región hidrófoba en C-terminal que comienza con el aminoácido 161.

Se demostró que las proteínas hek-L expresadas por los clones A2 y C6 están ancladas en la superficie celular a través de un enlace con glucosil-fosfatidilinositol (GPI). Los anclajes de membrana a GPI, incluyendo la estructura química y el procesamiento de los mismos, se describen por Ferguson, M. y A. Williams, Ann. Rev. Biochem., 57:285, 1988 (incorporado al presente documento por referencia). Cuando se expresan inicialmente, ciertas proteínas comprenden un dominio hidrófobo C-terminal que contiene señales para el anclaje a GPI. Se localiza un sitio de corte cadena arriba, a menudo alrededor de los aminoácidos 10-12 cadena arriba del extremo N-terminal del dominio hidrófobo. El procesamiento postraduccional incluye la ruptura de la proteína en este sitio de corte. El anclaje a GPI se acopla a los nuevos aminoácidos C-terminales expuestos de proteína madura procesada. Así, cuando las proteínas hek-L se expresan en células que reconocen las señales de anclaje a GPI en el dominio hidrófobo, las secuencias de aminoácidos completas de SEQ ID NO:2 y 4 representan formas de precursores de las proteínas.

En base a las secuencias consenso derivadas de otras proteínas que se anclan a GPI, sitios de corte probables en las proteínas hek-L de la presente invención están entre los aminoácidos 194 y 195 de la SEQ ID NO:2 y entre los 148 y 149 de SEQ ID NO:4. Después de la ruptura de la proteína, se acopla un resto del GPI al resto de serina que está ahora en el extremo C-terminal de la proteína procesada (aminoácido 194 de SEQ ID NO:2 y aminoácido 148 de SEQ ID NO:4). Es posible que la ruptura suceda en otra parte cadena arriba de la región hidrófoba en las proteínas hek-L.

El término "hek-L" como se usa en el presente documento se refiere al género de polipéptidos que son capaces de unir hek y mostrar homología (preferiblemente siendo, al menos, 80% homólogos) con la proteína hek-L de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. El hek-L humano está dentro del alcance de la presente invención, ya que son proteínas hek-L derivadas de otras especies de mamíferos incluyendo pero no limitadas a ratón, rata, bovino, porcino o diversas especies de primates. Tal como se usa en el presente documento, el término "hek-L" incluye tanto las formas unidas a la membrana como las formas solubles (secretadas) de la proteína. Las proteínas truncadas que retienen la propiedad de unión a hek están incluidas en la presente invención. Tales proteínas truncadas incluyen, por ejemplo, hek-L soluble que comprende sólo el dominio extracelular (de unión al receptor) pero le falta el dominio hidrófobo.

El ADNc humano de hek-L se puede marcar radiactivamente y usarse como sonda para aislar otros ADNc de hek-L de mamíferos mediante hibridación entre especies. Por ejemplo, se pueden rastrear una genoteca de ADNc preparada a partir de líneas de células T leucémicas de otras especies de mamíferos con ADNc humano de hek-L marcado radiactivamente para aislar un clon positivo. Alternativamente, los ARNm aislados a partir de diversas líneas celulares se pueden analizar mediante hibridación por transferencia de ARN para determinar una fuente adecuada de ARNm de hek-L de mamífero para usar en la clonación del gen de hek-L.

Aunque se empleó una proteína de fusión hek/Fc en los procedimientos de relación descritos más adelante en los ejemplos 2 y 3, hek se puede usar para seleccionar clones y líneas celulares candidatas para la expresión de las proteínas hek-L. La proteína de fusión hek/Fc, sin embargo, ofrece la ventaja de ser fácilmente purificada. Además, los puentes disulfuro entre las regiones Fc de dos cadenas de proteínas de fusión de fusión separadas, crean dímeros.

Se puede sustituir la región Fc de IgG1 humana mutada descrita en el ejemplo 1 por otras regiones Fc de anticuerpos. Las otras regiones Fc adecuadas son aquellas que pueden unirse con elevada afinidad a la proteína A o a la proteína G, e incluyen la región Fc de IgG1 murina o fragmentos de la región Fc de IgG1 humana, por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la región visagra para que se formen fuentes disulfuro intercatenarios.

Una realización de la presente invención proporciona polipéptidos hek-L solubles. Los polipéptidos hek-L solubles comprenden todo o parte del dominio extracelular del hek-L natural pero les falta la región hidrófoba que contiene señales que provocarían la retención del polipéptido en la membrana celular. Ventajosamente, los polipéptidos hek-L solubles comprenden el péptido señal natural (o un heterólogo) cuando se sintetizan inicialmente para promover la secreción, pero el péptido señal se corta después de la secreción de hek-L de la célula. Los polipéptidos hek-L solubles que pueden ser empleados retienen la capacidad de unión al receptor hek. El hek-L soluble podría incluir parte de la región hidrófoba con la condición de que la proteína hek-L soluble sea capaz de ser secretada.

El hek-L soluble puede identificarse (y distinguirse de su equivalente unido a la membrana no soluble) mediante la separación de células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y analizando en el medio (sobrenadante) en la presencia de la proteína deseada. La presencia de hek-L en el medio indica que la proteína se secretó de las células y de esta forma es la forma soluble de la proteína deseada. El hek-L soluble puede ser una forma natural de esta proteína, por ejemplo, el que surge por procesamiento natural. Además, el hek-L unido a GPI puede ser liberado o mudado de la superficie celular al medio de cultivo, por ejemplo, mediante la acción de una proteasa u otra enzima.

El uso de las formas solubles de hek-L es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de las proteínas a partir de las células hospedadoras recombinantes, ya que las proteínas solubles se secretan a partir de las células. Además, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.

Los ejemplos de polipéptidos de hek-L solubles incluyen aquellos que comprenden el dominio extracelular entero de una proteína hek-L natural. Una de tales proteínas hek-L solubles comprende del aminoácido 1 al 202 de la SEQ ID NO:2, y otra comprende del aminoácido 1 al 160 de la SEQ ID NO:4. Cuando se expresa inicialmente dentro de la célula hospedadora, la proteína soluble puede comprender adicionalmente uno de los péptidos señal heterólogos descritos más adelante que son funcionales dentro de las células hospedadoras empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender inicialmente contener el péptido señal, de tal forma que hek-L comprende del aminoácido-19 al 202 de la SEQ ID NO:2 o del aminoácido -22 al 160 de la SEQ ID NO:4. Las proteínas hek-L solubles pueden estar truncadas al suprimir el extremo C-terminal hasta e incluyendo el aminoácido que sirve como sitio de anclaje a GPI. Los ejemplos incluyen proteínas que comprenden los aminoácidos 1-193 de la SEQ ID NO:2 o los aminoácidos 1-147 de la SEQ ID NO:4, como se discute anteriormente. Aunque el sitio de anclaje a GPI puede ser suprimido, la supresión del dominio hidrófobo se cree que es suficiente para impedir el anclaje a GPI de la proteína en la membrana celular. En realizaciones adicionales, las proteínas pueden estar truncadas en el extremo C-terminal de tal forma que el aminoácido C-terminal es cualquier aminoácido entre los aminoácidos 193 y 202 de la SEQ ID NO:2, o entre los aminoácidos 147 y 160 de la SEQ ID NO:4. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas hek-L solubles se incluyen en la presente invención.

El hek-L truncado, incluyendo polipéptidos solubles, se podría preparar mediante cualquiera de las diversas técnicas ordinarias. Se puede sintetizar químicamente una secuencia de ADN deseada usando técnicas conocidas. También se pueden producir fragmentos de ADN mediante digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia completa de ADN clonado, y aislando mediante electroforesis en geles de agarosa. Se pueden sintetizar oligonucleótidos que reconstruyen los extremos 5' y 3' de un fragmento de ADN en un punto deseado. El oligonucleótido puede contener un sitio de corte por endonucleasas de restricción cadena arriba de la secuencia codificante deseada y posicionar un codón de iniciación (ATG) en el extremo 5' de la secuencia codificante. El procedimiento bien conocido de la reacción en cadena de la polimerasa también se puede emplear para aislar una secuencia de ADN que codifique un fragmento de proteína deseado. Como alternativa adicional, se pueden emplear técnicas conocidas de mutagénesis para insertar un codón de parada en un punto deseado, por ejemplo, inmediatamente cadena abajo del codón para el último aminoácido del dominio extracelular.

Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por los nucleótidos 83-796 (región codificante entera), 83-745 (que codifica el péptido señal y el dominio extracelular), 140-796 (que codifica la proteína sin el péptido señal) y 140-745 (que codifica el dominio extracelular) de la SEQ ID NO:1. También se proporciona el ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por los nucleótidos 28-630 (región codificante entera), 28-573 (que codifica el péptido señal y el dominio extracelular), 94-630 (que codifica la proteína sin el péptido señal), y 94-573 (que codifica el dominio a extracelular) de la SEQ ID NO:3. También se proporciona ADN que codifica fragmentos biológicamente activos de las proteínas SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, incluyendo pero no limitándose al ADN que codifica las proteínas hek-L truncadas en el extremo C-terminal descritas anteriormente.

El ADN de hek-L de la presente invención incluye ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado mediante PCR, ADN genómico y combinaciones de los mismos. El ADN genómico de hek-L se puede aislar mediante hibridación con el ADNc de los clones A2 o C6, utilizando técnicas estándar.

La presente invención proporciona polipéptidos de hek-L purificados, tanto recombinantes como no recombinantes. Variantes y derivados de las proteínas hek-L naturales que retienen la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de unirse a hek) están también dentro del alcance de la presente invención. En una realización de la presente invención, la proteína hek-L madura se caracteriza por la secuencia de aminoácidos N-terminal es Leu-Leu-Ala-Gln-Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Asn. En otra realización, la proteína hek-L madura se caracteriza por la secuencia de aminoácidos N-terminal es Gly-Ser-Ser-Leu-Arg-His-Val-Val-Tyr-Trp-Asn-Ser.

Por ejemplo se pueden obtener variantes de hek-L mediante mutaciones de las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de hek-L naturales. Una variante de hek-L, como se refiere en lo sucesivo, es un polipéptido sustancialmente homólogo al hek-L natural, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la del hek-L natural (humano, murino o de otras especies de mamíferos) debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Tales variantes que se unen a hek son equivalentes a las proteínas naturales que se une a hek que tienen las secuencias de aminoácidos presentes en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.

La variante de ADN y las secuencias de aminoácidos de la presente invención son preferiblemente, al menos, idénticas en el 80%, más preferiblemente, al menos, idénticas en el 90%, a una secuencia de hek-L natural tal es como las secuencias naturales de las SEQ ID NO:1-4. Para los fragmentos, el porcentaje de identidad se calcula para la porción de una secuencia natural que está presente en el fragmento. Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan polipéptidos de hek-L que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en el 80% a una secuencia seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos 1-194, 1-202 y 1-219 de SEQ ID NO:2 y los aminoácidos 1-148, 1-160 y 1-179 de SEQ ID NO:4.

Se pueden llevar a cabo alteraciones de la secuencia de aminoácidos natural mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas. Las mutaciones se pueden introducir en loci particulares mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutada, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción del aminoácido deseado.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio y dirigida con oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, deleción o inserción requerida. Métodos de ejemplo para hacer las alteraciones indicadas anteriormente se describen en Walder y col.(Gene 42:133, 1986); Bauer y col.(Gene 37:73, 1985); Craik (Biotechniques, Enero 1985, 12-19); Smith y col. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel y col. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y en las patente de Estados Unidos Nº 4.518.584 y 4.737.462, que se incorporan aquí por referencia.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservativamente, lo que significa que un resto de aminoácido dado se sustituye por un resto que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservativas, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similar, son bien conocidas.

El hek-L también puede modificarse para crear derivados de hek-L mediante la formación de conjugados covalentes o agregados con otros grupos químicos, tal como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, acetilo y similares. Los derivados covalentes de hek-L se pueden preparar mediante la unión de grupos químicos a grupos funcionales de las cadenas de aminoácidos laterales de hek-L o a los extremos N-terminal o C-terminal de un polipéptido de hek-L o al dominio extracelular del mismo. Otros derivados de hek-L dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregados de hek-L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivos recombinantes en forma de fusiones N-terminales o C-terminales.

Cuando se expresa inicialmente el ligando de hek en un sistema recombinante puede comprender una secuencia señal o líder (natural o heteróloga) en el extremo N-terminal de un polipéptido de hek-L. El péptido señal o líder dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a un sitio fuera de la membrana celular o de la pared celular, y separa mediante corte de la proteína madura durante el proceso de secreción. Los ejemplos de péptidos señal heterólogos adecuados, que se eligen generalmente de acuerdo al sistema de expresión que se empleará, se describe más adelante.

Los polipéptidos de fusión de hek-L pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de hek-L. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénicos descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.011.912 y por Hopp y col., BioTechnology 6:1204, 1988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG® , Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), que es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Las proteínas de fusión que terminan con este péptido también son resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Un hibridoma murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido DYKDDDDK en presencia de ciertos cationes divalentes de metal (como se describe en la patente de Estados Unidos 5.011.912, que se incorpora en el presente documento como referencia) y ha sido depositado en la American Types Culture Collection con el número de acceso HB 9259.

La presente invención incluye adicionalmente polipéptidos de hek-L con o sin patrones naturales de glicosilación asociados. El hek-L expresado en los sistemas de expresión de levadura o mamífero (por ejemplo, células COS-7) pueden ser similar o significativamente diferente del polipéptido hek-L natural tanto en peso molecular como en el patrón de glucosilación, dependiendo del sistema de expresión elegido. La expresión de los polipéptidos de hek-L en los sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporcionan moléculas sin glucosilar.

Se pueden preparar construcciones de ADN que codifican diversas adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias internos o terminales no necesarios para la actividad biológica o para la unión. Por ejemplo, se pueden modificar los sitios de N-glucosilación en el dominio extracelular de hek-L para excluir la glucosilación, permitiendo la expresión de un análogo más homogéneo, con contenido de carbohidratos reducido en sistemas de expresión de mamífero y levadura. Los sitios de N-glucosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las modificaciones apropiadas de la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete darán como resultado sustituciones, adiciones o deleciones que impiden la unión de restos de carbohidratos a la cadena de Asn. La alteración de un único nucleótido elegida para que la Asn se sustituya por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glucosilación. Los procedimientos conocidos para la inactivación de sitios de N-glucosilación en proteínas incluyen los descritos en la patente Estados Unidos 5.071.972 y en el documento EP 276.846, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Se encuentran tres sitios de N-glucosilación en el hek-L codificado por el clon A2, en los aminoácidos 19-21, 48-50 y 81-83 de la SEQ ID NO:2. Se encuentra un sitio de N-glucosilación en el hek-L codificado por el clon C6, en los aminoácidos 11-13 de la SEQ ID NO:4.

En otro ejemplo, se pueden alterar las secuencias que codifican restos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica provocando que los restos de Cys sean eliminados o sustituidos por otros aminoácidos, lo que previene la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de la renaturalización. Otras variantes se preparan mediante modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en los sistemas de levadura en los que está presente la actividad de la proteasa KEX2. El documento EP 212.914 describe el uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar el procesamiento de sitios en la proteína por la proteasa KEX2. El procesamiento de sitios por la proteasa KEX2 se inactiva por eliminación, adición o sustitución de restos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la existencia de estos restos básicos adyacentes. El apareamiento Lys-Lys es considerablemente menos susceptible de ser cortado por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa una táctica conservativa y preferida para inactivar los sitios KEX2. Los sitios de procesamiento por la proteasa KEX2 se encuentran en el hek-L de la SEQ ID NO:2 en los aminoácidos 26-27, 87-88 y 199-200. El hek-L de la SEQ ID NO:4 comprende los sitios de procesamiento por la proteasa KEX2 en los aminoácidos 73-74 y 134-135.

Las variantes de hek-L que aparecen de forma natural también se incluyen en la presente invención. Los ejemplos de tales variantes son proteínas que surgen como resultado de sucesos de procesamiento alternativo del ARNm o de la ruptura proteolítica de la proteína hek-L, en la se mantiene la propiedad de unión de hek. El procesamiento alternativo del ARNm puede proporcionar una proteína hek-L truncada pero biológicamente activa, tal como sucede en la forma soluble natural de la proteína, por ejemplo. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en el extremo N- o C-terminal después de la expresión en diferentes tipos de células hospedadoras, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína hek-L (generalmente de los aminoácidos terminales 1-5). Los péptidos señal pueden cortarse en diferentes posiciones en una proteína determinada, dando como resultado variaciones del aminoácido N-terminal de la proteína madura.

En un sistema de expresión, el aminoácido N-terminal de una proteína hek-L codificada por el clon C6 fue el aminoácido 4 (Leu) de la SEQ ID NO:4. Una preparación de la proteína de fusión hek-L soluble/Fc derivada del clon A2 comprende una mezcla de proteínas de fusión que tienen el aminoácido 12 (Asn) de la SEQ ID NO:2 como aminoácido N-terminal (aproximadamente el 60%) y proteínas de fusión en las cuales el aminoácido 1 (Leu) de la SEQ ID NO:2 fue el aminoácido N-terminal. De este modo ciertas realizaciones de la presente invención se dirigen a proteínas (solubles o unidas a membrana) en las cuales el aminoácido N-terminal es cualquiera de los aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 4, o cualquiera de los aminoácidos 1-12 de la SEQ ID NO:2.

Debido a la degeneración conocida del código genético en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar entre las presentes en la SEQ ID NO:1 ó 3, y todavía codificar una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 ó 4. Tales secuencias de ADN variantes, pueden dar como resultado mutaciones silenciosas (por ejemplo, las que suceden durante la amplificación por PCR), y pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia natural.

De este modo la presente invención proporciona secuencias aisladas de ADN que codifican hek-L biológicamente activo, seleccionado entre: (a) ADN derivado de la región codificante del gen natural de mamífero de hek-L (por ejemplo, ADNc que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos presente en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3); y (b) ADN que está degenerado como resultado del código genético en forma de un ADN definido en (a) y que codifica hek-L biológicamente activo. Las proteínas hek-L codificadas por tales secuencias de ADN están incluidas en la presente invención.

El ADN de hek-L de la presente invención incluye ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado mediante PCR, ADN genómico, y combinaciones de los mismos. El ADN genómico de hek-L puede aislarse mediante hibridación con el ADNc de los clones A2 o C6, usando técnicas estándar.

Ensayos de actividad biológica

Las variantes que poseen la capacidad de unión a hek pueden identificarse mediante cualquier ensayo adecuado. Las técnicas ordinarias de ensayo también son útiles para analizar la actividad de unión a hek de la proteína natural hek-L. La actividad biológica de hek-L puede determinarse, por ejemplo, mediante competición de la unión por el dominio de unión al ligando de hek (es decir, ensayos de unión competitiva).

Un tipo de ensayo de unión competitiva para el polipéptido hek-L utiliza un marcaje radiactivo, hek-L humano soluble y células intactas que expresan hek en la superficie celular. En lugar de las células intactas, se podría sustituir hek soluble (tal como una proteína de fusión hek/Fc) unido a una fase sólida a través de la interacción de la Proteína A o Proteína G con la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza hek soluble marcado radiactivamente tal como la proteína de fusión hek/Fc, y células intactas que expresan hek-L. Alternativamente, hek-L soluble podrían unirse a una fase sólida.

Los ensayos de unión competitiva pueden llevarse a cabo utilizando una metodología estándar. Por ejemplo, hek-L marcado radiactivamente puede usarse para competir con un homólogo de hek-L putativo para ensayar la actividad de unión frente a hek unido a la superficie. Se pueden obtener resultados cualitativos mediante ensayos de unión competitiva en placas de autorradiografía, o pueden utilizar representaciones de Scatchard para generar resultados cuantitativos.

Alternativamente, hek soluble puede unirse a la fase sólida tal como una matriz de una columna de cromatografía o un sustrato similar adecuado para analizar la presencia de un resto detectable tal como un hek-L marcado con I^{125}. La unión a una fase sólida se puede realizar, por ejemplo, mediante la unión de la proteína de fusión hek/Fc a una matriz que contiene proteína A o proteína G.

Las características de la unión de hek-L (incluyendo las variantes) también pueden determinarse utilizando hek soluble marcado (por ejemplo, ^{125}I-hek/Fc) en ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. En este caso, sin embargo, se usan las células intactas que expresan hek-L, o hek-L soluble unido a un sustrato sólido, para medir la extensión con la que una muestra que contiene una variante de hek putativa compite por la unión a hek-L de un hek soluble marcado.

Un ensayo preferido para la detección de la actividad de unión a hek de un hek-L unido a la membrana es como sigue. Se ideó un ensayo de unión indirecto modificado, usando la proteína de fusión hek/Fc preparada en el ejemplo 1 y el anticuerpo de ratón anti-Fc de la IgG humana marcado con ^{125}I descrito en el ejemplo 3 para evitar la detección radiactiva directa de hek/Fc. Las células que expresan hek-L endógeno (por ejemplo, la línea celular CCRF-HSB-2 descrita en el ejemplo 2) se exponen a varias concentraciones de hek/Fc, seguido de una concentración saturante constante de anticuerpo marcado con ^{125}I como sigue.

Las células CCRF-HSB-2 se cultivan en cultivos en suspensión en placas de cultivo de 96 pocillos. Las células (2x10^{6} células/pocillo) se incuban en presencia o ausencia de diversas concentraciones de hek/Fc en medio de unión (medio RPMI 1640, seroalbúmina bovina 1%, azida sódica 0.2% y Hepes 20 mM, pH 7.2) durante una hora a 37ºC. Seguidamente las células se lavan una vez con PBS y se incuban con el anticuerpo de ratón anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I (40 ng/ml) en medio de unión con agitación suave durante una hora a 37ºC. Las células y el anticuerpo marcado con ^{125}I sin unir se separan por el método de separación del aceite de ftalato, esencialmente como se describe por Dower y col., J. Immunol. 132:751 (1984).

Puede utilizarse un ensayo para la unión de hek/Fc a células que expresan hek-L recombinante unido a la membrana como se describe en el ejemplo 5. Se empleó un ensayo de unión indirecto.

Un ensayo preferido para el análisis de la actividad de unión a hek de hek-L soluble es como sigue. El ensayo detecta la capacidad de hek-L soluble de inhibir la unión de la proteína de fusión hek/Fc a la línea celular CCRF-HBS-2 que expresa hek-L endógeno, como se describe en el ejemplo 2.

El sobrenadante condicionado (medio de cultivo) de las células CV-1/EBNA transfectadas con un vector de expresión que expresa un hek-L soluble se valora en placas de 96 pocillos. Se añade una cantidad constante de hek/Fc (1 \mug/ml) a cada pocillo, seguido por 1-2x10^{6} células CCRF-HSB-2 por pocillo, en medio de unión. Se incuba la placa a 37ºC durante una hora. Las células se lavan dos veces con PBS, y seguidamente se precipitan por centrifugación. Se añade el anticuerpo de ratón anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I a cada pocillo a una concentración constante, y la placa se incuba durante otra hora a 37ºC. El anticuerpo de ratón anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I se une a hek/Fc que se une a las células CCRF-HSB-2. Después de la incubación final, las células se recogen en tubos que contienen aceite de ftalato para separar el anticuerpo de ratón anti-Fc de IgG humana marcado con ^{125}I unido y libre. La radiactividad se cuantifica utilizando un contador gamma.

Usos de hek-L

El hek-L de la presente invención se puede usar en un ensayo de unión para detectar células que expresan hek. Por ejemplo, hek-L o el dominio extracelular o un fragmento de los mismos se pueden conjugar a un grupo detectable como el ^{125}I. En marcaje radiactivo con ^{125}I se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los diversos métodos estándar que proporcionan una molécula hek-L-^{125}I funcional marcada con una elevada actividad específica. Alternativamente, se puede usar otro grupo detectable tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que se analizan para la expresión de hek se pueden poner en contacto con hek-L marcado. Después de la incubación, el hek-L marcado sin unir se retira y la unión se mide usando el grupo detectable.

Las proteínas ligando de hek descritas en el presente documento también se pueden emplear para medir la actividad biológica de la proteína hek en términos de afinidad de unión por hek-L. Como ilustración, hek-L se puede emplear en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de la proteína hek que se ha almacenado a diferentes temperaturas, o se ha producido en diferentes tipos celulares. De este modo la actividad biológica de la proteína hek puede determinarse antes de ser usada en un estudio de investigación, por ejemplo.

Las proteínas hek-L encuentran uso como reactivos que pueden emplearse por los que realizan estudios de "garantía de calidad", por ejemplo, para comprobar la semivida y la estabilidad de la proteína hek en diferentes condiciones. Los ligandos de hek se pueden usar para determinar si la actividad biológica se mantiene después de la modificación de una proteína hek (por ejemplo, modificación química, truncamiento, mutación, etc). La afinidad de unión por un hek-L de la proteína hek modificada se compara con la de una proteína hek sin modificar para detectar cualquier impacto adverso de la modificación sobre la actividad biológica de hek.

Un uso diferente del ligando de hek es como reactivo en procedimientos de purificación de proteínas. El hek-L o las proteínas de fusión hek/Fc se pueden unir a un material de soporte sólido mediante técnicas ordinarias y usarse para purificar hek mediante cromatografía de afinidad.

Los polipéptidos hek-L también encuentran uso como vehículos para administrar agentes unidos a ellos en células que llevan el antígeno hek de superficie celular. La expresión del antígeno hek se ha descrito en ciertas líneas celulares leucémicas, incluyendo la línea celular humana de leucemia de células T llamada JM y HSB-2 y la línea celular humana de células pre-B de leucemia llamada LK63 (Boyd y col., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992, y Wicks y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las proteínas hek se pueden usar para administrar agentes terapéuticos o diagnósticos a estas células (o a otros tipos celulares que expresen hek sobre la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Un ejemplo de tal uso es la exposición de una línea celular leucémica hek^{+} al conjugado de agente terapéutico/hek-L para valorar si el agente muestra citotoxicidad hacia las células de leucemia. Se pueden incluir diversos agentes terapéuticos diferentes unidos a hek-L en un ensayo para detectar y comparar el efecto citotóxico de los agentes sobre las células de leucemia. Los conjugados de hek-L/agente diagnóstico se pueden emplear para detectar la presencia de células hek^{+} in vitro e in vivo.

Los agentes diagnósticos y terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido hek-L incluyen, pero no se limitan a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, componentes fluorescentes, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, con el agente particular elegido de acuerdo con la aplicación deseada. Los ejemplos de fármacos incluyen los usados en el tratamiento de diversas formas de cáncer, por ejemplo, mecloretaminas tal como melfalán o ciclofosfamida, agentes intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo, alcaloides de la dominica tales como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, y derivados de los mismos. Entre las toxinas están la ricina, abrina, toxina diptérica, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras ribosómicas, micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas únicas) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para el uso diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Los radionúclidos adecuados para el uso terapéutico incluyen, pero no se limitan a, ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.

Tales agentes se pueden unir a hek-L mediante cualquier procedimiento ordinario adecuado. El hek-L, siendo una proteína, comprende grupos funcionales sobre las cadenas de aminoácidos que pueden reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para formar uniones covalentes, por ejemplo. Alternativamente, se pueden constituir derivados de la proteína o agente para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La constitución de derivados puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para la unión de diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen diversas técnicas para el marcaje radiactivo de las proteínas. Por ejemplo, los radionúclidos de metales se pueden unir a hek-L mediante la utilización de agentes quelantes bifuncionales adecuados.

De este modo se preparan los conjugados que comprenden hek-L y un agente diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente, unido covalentemente). Los conjugados se administran o se emplean de otro modo en una cantidad apropiada para una aplicación particular.

Como se describe en el ejemplo 5, las proteínas hek-L proporcionadas en el presente documento también son capaces de unirse a un receptor conocido como elk. De este modo, hek tiene usos adicionales derivados de las propiedades de unión a elk, análogos a aquellos usos descritos anteriormente que derivan de las propiedades de unión a hek. El hek-L se puede usar para detectar elk en diversos ensayos. Se puede emplear un anticuerpo que se une a hek en un ensayo, si conviene, para bloquear la unión de hek a hek-L mientras que se permite la unión de elk a hek-L. Los ligandos de hek se pueden emplear en la valoración de la actividad biológica de las proteínas elk en términos de afinidad de unión por un hek-L de una proteína elk o variante de la misma. Las proteínas hek-L también encuentran uso en la purificación de proteínas elk mediante cromatografía de afinidad.

Oligómeros de hek-L

La presente invención abarca polipéptidos hek-L en la forma de oligómeros, tales como dímeros o trímeros. Los oligómeros se pueden formar mediante puentes disulfuro entre restos de cisteína de diferentes polipéptidos de hek-L. En una realización de la invención, se crea un dímero hek-L mediante la fusión de hek-L a la región Fc de un anticuerpo (IgG1) de manera que no interfiera con la unión de hek-L al dominio de unión del ligando de hek. El término "polipéptido Fc" incluye formas naturales y mutadas, al igual que polipéptidos Fc truncados que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Preferiblemente el polipéptido Fc se fusiona al extremo C-terminal de un hek-L soluble (que comprende sólo el dominio extracelular). Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenazi y col. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn y col. (Nature 344:677, 1990), incorporados en el presente documento como referencia.

Se puede preparar una fusión de un hek-L a un Fc o a un polipéptido mutado de Fc mediante procedimientos análogos a los descritos en el ejemplo 1 para la preparación de una fusión hek/Fc mutado. Se inserta un gen de fusión que codifica la proteína de fusión hek-L/Fc en un vector de expresión apropiado y transfectan a células hospedadoras. Se permite que las proteínas de fusión hek-L/Fc expresadas se ensamblen virtualmente como moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman puentes disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos Fc, proporcionándose hek-L divalentes. Alternativamente, se puede emplear el polipéptido Fc natural del cual se derivó el mutado.

Si las proteínas de fusión se hacen tanto con cadenas pesadas y como con ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero hek-L con tantas como las cuatro regiones extracelulares de hek-L. Alternativamente, se pueden unir dos dominios solubles de hek-L con un péptido de unión tal como aquellos descritos en la patente de Estados Unidos 5.073.627.

En realizaciones particulares de la presente invención, el ADN de hek-L que codifica los aminoácidos del -19 al 202 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos del -22 al 157 de la SEQ ID NO: 3 se fusionaron al extremo 5' del ADN que codifica el Fc mutado descrito en el ejemplo 1, y se insertó en el vector de expresión pDC410 (descrito en el ejemplo 3). Las células CV1-EBNA-1 transfectadas con el vector de expresión recombinante resultante se cultivaron para expresar la proteína de fusión soluble hek/Fc.

La presente invención proporciona oligómeros de los dominios extracelulares de hek-L o fragmentos de los mismos, unidos mediante interacciones disulfuro, o expresados como polímeros de fusión con o sin grupos de unión de aminoácidos espaciadores. Por ejemplo, un dímero del dominio extracelular de hek-L se puede unir a través de un grupo de unión de la región Fc de IgG.

Sistemas de expresión

La presente invención proporciona vectores de expresión recombinantes para la expresión de hek-L, y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión. Se puede emplear cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen una secuencia de ADN de hek-L operativamente unida a secuencias de nucleótidos de regulación transcripcional o traduccional adecuadas, tales como las derivadas de genes de mamífero, microbianos, víricos o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores o intensificadores, sitios de unión a ribosomas de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos están operativamente unidas cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADN de hek-L. De este modo, una secuencia de nucleótidos del promotor esta operativamente unida a la secuencia de ADN de hek-L si la secuencia de nucleótidos del promotor controla la transcripción de la secuencia de ADN de hek-L. La capacidad de replicarse en las células hospedadoras deseadas, generalmente se confiere por un origen de replicación, y se puede incorporar adicionalmente un gen de selección por el cual se identifican los transformantes, en el vector de expresión.

Además, las secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no son naturales del gen de hek-L se pueden incorporar en los vectores de expresión. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretora) en fase respecto a la secuencia de hek-L de tal forma que hek-L se traduce inicialmente como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células hospedadoras destinadas a intensificar la secreción extracelular del polipéptido de hek-L. El péptido señal se separa mediante corte del polipéptido de hek-L después de la secreción de hek-L desde la célula.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de los polipéptidos de hek-L incluyen células procariotas, levaduras o eucariotas superiores. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usar con células hospedadoras bacterianas, fúngicas, de levaduras y de mamífero se describen, por ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir polipéptidos de hek-L utilizando ARN derivado de las construcciones de ADN descritas en el presente documento.

Los procariotas incluyen organismos grampositivos o gramnegativos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células procariotas hospedadoras adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y otras diversas especies dentro los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula hospedadora procariotas, tal como E. coli, el polipéptido de hek-L puede incluir un resto de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariota. La Met N-terminal se puede separar por corte del polipéptido recombinante de hek-L expresado.

Los vectores de expresión para uso en las células hospedadoras procariotas comprenden, generalmente, uno o más genes marcadores seleccionables por fenotipo. Un gen marcador seleccionable por fenotipo es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que proporciona un requerimiento autotrófico. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para las células hospedadoras procariotas incluyen aquellos derivados de las plásmidos suministrados comercialmente tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes de resistencia frente a la ampicilina y tetraciclina y de este modo proporciona una manera simple de identificar células transformadas. Se inserta un promotor apropiado y la secuencia de ADN de hek-L en el vector pBR322. Otros vectores suministrados comercialmente incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

Las secuencias de promotores utilizadas comúnmente en los vectores de expresión recombinantes de células hospedadoras procariotas incluyen la \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema del promotor de lactosa (Chang y col., Nature 275:615, 1978; y Goedel y col., Nature 281:544, 1979), sistema del promotor de triptófano (trp) (Goedel y col., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de células hospedadoras procariotas particularmente útil emplea un promotor P_{L} del fago \lambda y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos suministrados por la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor P_{L} del fago \lambda incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Alternativamente, hek-L se puede expresar en células hospedadoras de levadura, preferiblemente, del genero Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También se puede emplear otro género de levadura, tal como Pichia o Kluyveromyces. Frecuentemente los vectores de levadura contienen una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2\mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la determinación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias de promotores adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073,1980) y otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17:4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, documento EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 que se reprime por glucosa descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y por Beier y col. (Nature 300:724, 1982). Los vectores de transferencia que se pueden replicar tanto en levaduras como en E. coli se pueden construir mediante la inserción de secuencias de ADN del pBR322 para la selección y replicación en E. coli (el gen Amp^{r} y el origen de replicación) en los vectores de levadura escritos anteriormente.

La secuencia líder del factor-\alpha de levadura se emplea para dirigir la secreción del polipéptido de hek-L. La secuencia líder del factor-\alpha se inserta, a menudo, entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen estructural. véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30:933, 1982; Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; patente de Estados Unidos 4.546.082; y documento EP 324.274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de las levaduras hospedadoras se conocen por los expertos en la técnica. Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los protocolos de transformación de levaduras se conocen por los expertos en la técnica. Uno de tales protocolos se describe por Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y col. selecciona transformantes Trp+ en un medio selectivo, en el que el medio selectivo está constituido por nitrógeno base de levadura 0.67%, ácidos casamino 0,5%, glucosa 2%, adenina 10 \mug/ml y uracilo 20 \mug/ml.

Las células hospedadoras de levadura transformadas con vectores que contienen la secuencia del promotor ADH2 se pueden dejar crecer mediante la inducción de la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de medio rico es uno que está constituido por extracto de levadura 1%, peptona 2% y glucosa 1% complementado con adenina 80 \mug/ml y uracilo 80 \mug/ml. La desrepresión del promotor ADH2 sucede cuando se agota la glucosa del medio.

Los sistemas de cultivo de células hospedadoras de insectos o de mamíferos también se pueden emplear para expresar polipéptidos recombinantes de hek-L. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisaron por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Las líneas celulares establecidas de origen mamífero también se pueden emplear. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y BHK (ATCC CRL 10) y línea celular CV-1/EBNA-1 derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan y col. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las secuencias de control transcripcional y traduccional para los vectores de expresión de células hospedadoras de mamífero se pueden extraer de genomas virales. Las secuencias de promotores y de intensificadores utilizadas comúnmente derivan del virus polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN que derivan del genoma vírico del SV40, por ejemplo, origen promotores tempranos y tardíos, intensificadores, sitios de procesamiento y sitios de poliadenilación del SV40 se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de la secuencia del gen estructural en la célula hospedadora de mamífero. Los promotores víricos tempranos y tardíos son particularmente útiles ya que ambos se obtienen fácilmente del genoma vírico en forma de un fragmento que también puede contener un origen de replicación vírico (Fiers y col., Nature 273:113, 1978). Los fragmentos de SV40 más pequeños o mayores también se pueden usar, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BgII localizado en el sitio del origen de replicación vírica de SV40.

Los vectores de expresión de ejemplo para usar en células hospedadoras de mamífero se pueden construir como se describe en Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para la expresión estable a elevados niveles de ADNc de mamífero en células epiteliales de mama de ratón C127 se puede construir sustancialmente como se describe en Cosman y col. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Se ha depositado un vector de elevada expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312:768, 1984 como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero útiles y adicionales se describen en el documento EP-A-0367566 y en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, incorporados en el presente documento por referencia. Los vectores pueden derivar de retrovirus.

En lugar del ADN que codifica de la secuencia señal natural, el vector puede contener el ADN que codifica una secuencia señal heteróloga. Los ejemplos incluyen la secuencia señal de la interleuquina 7 (IL-7) descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal del receptor de la interleuquina 2 descrita por Cosman y col., Nature 312:768 (1984); el péptido señal de la interleuquina 4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor de tipo I de la interleuquina 1 descrito en la patente de Estados Unidos 4.968.607; y el péptido señal del receptor de tipo II de la interleuquina 1 descrito en el documento EP 460.846.

Purificación de la proteína

La presente invención proporciona proteína hek-l sustancialmente homogénea, que puede producirse mediante sistemas de expresión recombinantes como se describe anteriormente o purificarse a partir de células que se presentan de forma natural. El hek-L se purifica hasta una homogeneidad sustancial, como se indica por una única banda después del análisis por electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Un procedimiento para la producción de proteína hek-L comprende el cultivo de células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica hek-L en condiciones en las que hek-L se expresa. Seguidamente la proteína hek-L se recupera del medio de cultivo o de los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como reconocerán los expertos en la técnica, los procedimientos para la purificación del hek-L recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células hospedadoras empleadas y si hek-L se secreta o no al medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, un Amicon o una unidad de ultrafiltración Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, se pueden emplear uno o más pasos de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) empleando medio hidrófobo de RP-HPLC, (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes) para purificar hek-L adicionalmente. Se pueden emplear algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

Es también posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión al ligando de hek para purificar por afinidad polipéptidos de hek-L expresados. Los polipéptidos de hek-L se pueden recuperar de la columna de afinidad en un tampón de elución muy salino y, seguidamente, dializar en un tampón poco salino. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que se une a hek-L. En alternativa adicional, la columna de afinidad comprender una proteína de fusión hek/Fc unida a una columna de proteína A.

La proteína recombinante producida en cultivos bacterianos se aísla generalmente, rompiendo inicialmente las células hospedadoras, centrifugando, extrayendo los sedimentos celulares si el polipéptido es insoluble, o el sobrenadante líquido si el polipéptido es soluble, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación con adición de sal, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión de tamaño. Finalmente, se puede emplear RP-HPLC en las etapas de purificación final. Las células microbianas se pueden romper mediante cualquier método que convenga, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes de lisis de células.

Las células hospedadoras recombinantes de levadura se pueden emplear para expresar hek-L como un polipéptido secretado. El polipéptido recombinante secretado de la fermentación de células hospedadoras de levadura se puede purificar mediante métodos análogos a los descritos por Urdal y col. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y col. describen dos etapas secuenciales de HPLC de fase inversa para la purificación de IL-2 recombinante humana en una columna preparativa de HPLC.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de hek-L y un vehículo, diluyente o excipiente aceptables fisiológicamente. Tales composiciones pueden comprender tampones, antioxidantes tales como el ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de, aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa, o dextrinas, agentes quelantes tales como el EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina neutra o la solución salina mezclada con seroalbúmina de la misma especie son ejemplos de diluyentes apropiados.

Fragmentos de ácidos nucleicos

La presente invención proporciona adicionalmente fragmentos de secuencias de nucleótidos de hek-L presentadas en el presente documento. Deseablemente, tales fragmentos comprenden, al menos, aproximadamente 30 nucleótidos de la secuencia presentada en la SEQ ID NO:1 ó 3. Se proporcionan el ADN y ARN complementarios de dichos fragmentos, junto con las formas de cadena simple y doble cadena del ADN de hek-L.

Entre los usos de tales fragmentos de ácidos nucleicos de hek-L está el uso como sonda. Tales sondas se pueden emplear en procedimientos de hibridación entre especies para aislar ADN de hek-L de especies de mamífero adicionales. Como ejemplo, se puede emplear una sonda correspondiente al dominio extracelular de hek-L. Las sondas también encuentran su uso en la detección de la presencia de ácidos nucleicos de hek-L en ensayos in vitro y en los procedimientos como Transferencia de ARN o ADN. Se pueden identificar tipos celulares que expresan hek-L. Tales procedimientos son bien conocidos, y los expertos en la técnica pueden elegir una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular deseada.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de hek-L son los oligonucleótidos sentido y antisentido que comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena simple (o bien ARN o ADN) capaz de unirse a las secuencias de ARNm diana de hek-L (sentido) o las de ADN de hek-L (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido y sentido, de acuerdo con la presente invención, pueden comprender un fragmento de la región codificante del ADNc de hek-L mostrado en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 o el ADN o ARN complementario de los mismos. Tales fragmentos comprenden generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente de 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótidos antisentido o sentido, basado en la secuencia de ADNc para de proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 y van der Krol y col., BioTechniques 6:958, 1988.

La unión de los oligonucleótidos antisentido o sentido a las secuencias de ácidos nucleicos diana da como resultado la formación de dúplices que bloquean la traducción (ARN) o transcripción (ADN) por varios motivos, incluyendo la intensificación de la degradación de los dúplices, la prematura terminación de la transcripción o la traducción, o por otros motivos. De este modo los oligonucleótidos antisentido se pueden usar para bloquear la expresión de las proteínas hek-L. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden adicionalmente oligonucleótidos que tienen una cadena principal de azúcares-fosfodiéster modificados (u otros enlaces de azúcares, tales como los descritos en el documento WO 91/06629) y en los que tales enlaces de azúcares son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcares resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a la secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que están unidos covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad de los oligonucleótidos por la secuencia de aminoácidos diana, tales como poli-(L-lisina). Adicionalmente aún pueden unirse, agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes de alquilación o complejos de metal a los oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar la especificidad de unión de los oligonucleótidos antisentido o sentido a una secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido se pueden introducir en las células que contienen las secuencias de aminoácidos diana mediante cualquier método de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia génica tales como el virus Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen, preferiblemente, en una célula que contenga la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante inserción del oligonucleótido antisentido o sentido en un vector retrovírico adecuado, seguidamente poniéndose en contacto célula con el vector de retrovírico que contiene la secuencia insertada, o bien in vivo o bien ex vivo. Los vectores retrovíricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, el retrovirus bovino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado del M-MuLV), o los vectores de doble copia llamados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver la solicitación PCT de Estados Unidos 90/02656).

Los oligonucleótidos sentido o antisentido también se pueden introducir en una célula que contenga la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión al ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, y otros ligandos que se unen a receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente, con la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada a la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido se puede introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o antisentido con el líquido se disocia, preferiblemente, dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones particulares y no para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de la proteína de fusión soluble hek/Fc

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión soluble hek/Fc, para uso en el aislamiento de clones de ADNc que codifican un ligando de hek (hek-L). Se presenta un ADN y la secuencia de aminoácidos que codifica de un ADNc de hek humano en Wicks y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89.1611, 1992), incorporado en el presente documento como referencia. Esta proteína hek comprende (desde el extremo N- al extremo C-terminal) un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplas-
mático.

Se aislaron dos fragmentos de ADN, uno que codifica un fragmento N-terminal del dominio extracelular de hek y el otro que codifica un fragmento C-terminal del dominio extracelular de hek mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) llevada a cabo en condiciones estándar, usando oligonucleótidos cebadores basados en la secuencia de nucleótidos de hek publicada por Wicks y col., supra. El molde para la PCR fue un ADNc preparado a partir de ARNm aislado de una línea celular humana de células T leucémicas llamada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1). Los productos de PCR que contienen el extremo 5' del ADN de hek se digirieron con SpeI y HindIII para aislar un fragmento de ADN que se extiende desde el extremo 5' de la secuencia de hek humano maduro (es decir, le falta el ADN que codifica la secuencia señal) hasta el sitio HindIII que se encuentra en el gen de hek. Los productos de PCR que contienen el extremo 3' del ADN del dominio extracelular se digirieron con HindIII y ClaI para aislar un fragmento que se extiende desde el sitio interno HindIII al sitio ClaI exactamente cadena abajo del extremo 3' de la secuencia que codifica el dominio extracelular de hek. El sitio ClaI está en un sitio de clonación múltiple (mcs) introducido exactamente cadena abajo del dominio extracelular.

Se aisló el ADN que codifica un mutante de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Este ADN mutado de Fc y el polipéptido codificado de este modo se describen en la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/097.827, titulada "Novel cytokine which is a ligand for OX40" presentada el 23 de julio de 1993, cuya solicitud está incorporada en el presente documento como referencia. El ADN mutado se hizo derivar del ADN que codifica el polipéptido Fc natural por mutagénesis específica de sitio esencialmente como se describe en Deng y Nickoloff, Anal. Biochem. 200:81 (1992). La secuencia de aminoácidos del polipéptido Fc mutado es idéntica a la del polipéptido Fc natural descrita en la solicitud PCT WO 93/10151, excepto en que el aminoácido 19 se cambió de Leu a Ala, el aminoácido 20 se cambió de Leu a Glu y el aminoácido 22 se cambió de Gly a Ala. Este Fc mutado presenta una afinidad reducida por los receptores de inmunoglobulinas.

Se cortó un vector recombinante que contiene el ADN del Fc mutado con ClaI y NotI, las cuales cortan el vector en una región de multiclonado inmediatamente cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, del inserto de ADN del Fc mutado. Se aisló el fragmento que codifica el Fc mutado deseado.

El polipéptido de Fc mutado se extiende desde la región bisagra N-terminal al C-terminal natural, es decir, es una región Fc del anticuerpo esencialmente de longitud completa. Los fragmentos de las regiones Fc, por ejemplo, los que están truncados en el extremo C-terminal, también se pueden emplear. Los fragmentos que, preferiblemente, contienen restos de cisteína múltiple (al menos los restos de cisteína en la reacción bisagra) permiten que se formen puentes disulfuro intercatenarios entre las porciones del polipéptido de Fc de dos proteínas de fusión hek/Fc separadas, creando dímeros.

Los vectores de expresión de mamífero llamados SMAG4 se cortaron con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una secuencia que codifica el péptido señal de la interleuquina 7 murina (descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195) insertada en el vector de alta expresión de mamíferos pDC201 (descrito en Sims y col., Science 241:585, 1988, y en la solicitud PCT WO 89/03884), que es capaz de replicarse en E. coli. SpeI corta el vector inmediatamente cadena abajo de la secuencia que codifica el péptido señal de IL-7. NotI corta aproximadamente 155pb cadena abajo del sitio SpeI en un sitio de multiclonado del vector. Se aisló el fragmento mayor SpeI/NotI que contiene las secuencias del vector y el ADN que codifica el péptido señal de la IL-7.

Se realizó una ligación de cuatro etapas para insertar los dos fragmentos de ADN que codifican hek y el fragmento de ADN que codifica el Fc mutado descritos anteriormente en el vector de expresión SMAG4 cortado con SpeI/NotI. Las células de E. coli se transfectaron con la mezcla de ligación y el vector recombinante deseado se aisló de ellas. El vector aislado codifica una proteína de fusión que comprende (desde el extremo N-terminal al C-terminal) el péptido seña de IL-7 murina, el dominio extracelular de hek, cuatro aminoácidos que codifican para el mcs introducido, y el Fc mutado.

Seguidamente, se cotransfectaron células CV1/EBNA con el vector de expresión y el plásmido pSV3.NEO. La línea celular CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñón de mono como se describe en McMahan y co. (EMBO J., 10:2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa el antígeno T de SV40, que no se produce por las células hospedadoras. El vector pSV3.NEO es similar al pSV3 (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), pero, adicionalmente, contiene un gen de resistencia a neomicina. Las células transformadas se cultivaron para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secreta en el medio de cultivo por medio del péptido señal murino de IL-7. La proteína de fusión se purificó sobre una columna de proteína A-Sepharosa, se eluyó y se utilizó para seleccionar las células según su capacidad de unión a la proteína hek/Fc, como se describe en los ejemplos 2 y 3.

Ejemplo 2 Selección de las células para la unión a hek/Fc

Se seleccionaron diversos tipos celulares en su capacidad de unión a hek/Fc, para identificar tipos celulares candidatos útiles como fuentes de ácidos nucleicos en una tentativa de clonar un ligando de hek. Las células se incubaron con la proteína hek/Fc preparada en el ejemplo 1, seguido de un anticuerpo de ratón anti-Fc humano biotinilado y seguido de estreptavidina-ficoeritrina (Becton Dickinson). Las células se lavaron entre las etapas para retirar los reactivos sin unir. El anticuerpo biotinilado fue suministrado por Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA. Este anticuerpo muestra una unión mínima a las proteínas Fc unidas al receptor Fc\gamma. La estreptavidina se une a la molécula de biotina unida al anticuerpo anti-Fc humano que, a su vez, se une a la porción Fc de la proteína de fusión hek/Fc. La ficoeritrina es una ficobiliproteína fluorescente que sirve como marca detectable. El nivel de la señal de fluorescencia se midió para cada tipo celular usando un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson).

La línea celular humana de células T de leucemia llamada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1) fue positiva para la unión de hek/Fc. Las células CCRF-HSB-2 se clasificaron cuatro veces mediante FACS (clasificación de células activadas con fluorescencia) para derivar células que expresen niveles elevados de proteína de unión a hek/
Fc.

Ejemplo 3 Aislamiento del ADNc del ligando de hek

Se aisló ARNm de las células CCRF-HSB-2 clasificadas cuatro veces y se sintetizó ADNc de doble cadena sobre el molde de ARNm mediante técnicas estándar. Se preparó una genoteca de ADNc mediante ligación del ADNc en el sitio BgIII de pDC410 mediante un método adaptado similar al que se describe por Haymerle y col. (Nucl. Acids Res. 14:8615, 1986). El pDC410 es un plásmido de expresión similar a pDC406 (McMahan y col., EMBO J. 10:2821, 1991). En pDC410, el origen de replicación de EBV de pDC406 se sustituye por ADN que codifica el antígeno T mayor de SV40 (controlado por un promotor de SV40). El sitio de multiclonado (mcs) de pDC410 difiere del pDC406 en que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada fase de lectura). Un promotor de la polimerasa T7 cadena arriba facilita del mcs la secuenciación de ADN insertado.

Se sembraron células de una cepa de E. coli DH5\alpha con una genoteca de ADNc en pDC410 para proporcionar, aproximadamente, 2000 colonias por placa. Las colonias se rasparon de cada placa, se juntaron y se preparó el ADN plasmídico de cada grupo. El ADN juntado que representa, aproximadamente, 2000 colonias se utilizó seguidamente para transfectar una capa de células subconfluentes CV1/EBNA-1 (descritas en el ejemplo 1). Antes de la transfección, las células CV1/EBNA-1 se mantuvieron en medio completo (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero fetal de ternera 10% (volumen/volumen) (FCS), penicilina 50 U/ml, 5 estreptomicina 50 U/ml, glutamina 2mM) y se sembraron a una densidad de 2 x 10^{5} células/pocillo sobre portaobjetos de único pocillo (Lab-Tek). La transfección implica DEAE-dextrano seguido de un tratamiento con cloroquina, similar al procedimiento descrito por Luthman y col., Hucl. Acids. Res. 11:1295, 1983 y McCutchan y col., J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986). Brevemente, los portaobjetos se trataron previamente con 1 ml de fibronectina humana (10 \mug/ml en PBS) durante 30 minutos seguido de un lavado con PBS. El medio se retiró de la capa de células adherentes y se sustituyó por 1,5 ml de medio completo que contiene sulfato de cloroquina 66,6 \muM. Seguidamente se añadieron 0,2 ml de solución de ADN (2 \mug de ADN, DEAE-dextrano 0,5 mg/ml en medio completo que contiene cloroquina) a las células y se incubaron durante 5 horas. Después de la incubación, el medio se retiró y las células se impactaron mediante la adición de medio completo que contiene DMSO 10% durante 2,5 a 20 minutos seguido de sustitución de la solución por medio completo recién preparado. Las células se cultivaron durante 2 a 3 días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas.

Las monocapas transfectadas de células CV1/EBNA-1 se analizaron para la expresión de hek-L mediante el procedimiento de autorradiografía en el porta de Gearing y col. (EMBO J. 8:3667, 1989), como sigue. El anticuerpo de ratón anti-Fc humano (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) se marcó radiactivamente con yodo mediante el método de la cloramina-T para usar en el ensayo. Brevemente, se preparó una columna P6 de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En un tubo de microcentrífuga, se disolvieron 10 \mug del anticuerpo en 10 \mul de PBS. Se añadieron 2000 \muCi de Na^{125}I sin vehículo y la solución se mezcló bien. Se añadieron 15 \mul de solución de cloramina-T recién preparada (32 \mug/ml en 0,05 M de tampón de fosfato sódico (pH 7,2) y, seguidamente, la mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se aplicó inmediatamente a la columna P6. Seguidamente, se eluyó el anticuerpo marcado radiactivamente de la columna recogiendo fracciones de 100-150 \mul de eluido. El medio de unión (RPMI 1640 que contiene de seroalbúmina bovina 25 \mug/ml, azida sódica 2 \mug/ml, Hepes 20 mM, pH 7,2) se añadió a las fracciones del pico para llevar el volumen total de cada fracción hasta 2 ml. El marcaje radiactivo con yodo proporcionó actividades específicas en el intervalo de 5-10 x 10^{5} cpm/mmol por proteína.

La autorradiografía de los portaobjetos se realizó como sigue. Las células transfectadas CV1/EBNA-1 (adheridas a las cámaras de los portaobjetos) se lavaron una vez con medio de unión con leche en polvo desnatada (BM-NFDM) (medio RPMI 1640 que contiene seroalbúmina bovina 25 \mug/ml (BSA), azida sódica 2 \mug/ml, Hepes 20 mM, pH 7,2 y leche en polvo desnatada 50 mg/ml). Seguidamente las células se incubaron con hek/Fc (preparado en el ejemplo 1) en BM-NFDM (1 \mug/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las monocapas de células en los portaobjetos con cámara se lavaron tres veces con BM-NFDM para retirar la proteína de fusión hek/Fc sin unir y seguidamente, se incubaron con 40 ng/ml de anticuerpo de ratón anti-Fc humano marcado con ^{125}I (una dilución 1:50) durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con BM-NFDM, seguido de dos lavados con tampón fosfato salino (PBS) para retirar el anticuerpo de ratón anti-Fc humano marcado con ^{125}I sin unir. Las células se fijaron mediante la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente en glutaraldehído 2.5% en PBS, pH 7,3, se lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Los portaobjetos que contienen células en la cámara se expusieron en un Phosphorimager (Molecular Dynamics) toda la noche, seguidamente se sumergieron en una emulsión fotográfica de Kodak GTNB-2 (dilución 6X en agua) y se expusieron en oscuridad durante 3-5 días a 4ºC en una caja a prueba de luz. Seguidamente los portaobjetos se revelaron durante aproximadamente 4 minutos en un revelador de Kodak D19 (40 g/500 ml de agua), se enjuagaron en agua y se fijaron en el fijador de AGFA G433C. Los portaobjetos se examinaron individualmente con un microscopio a un aumento de 25-40x y las células positivas que expresan hek-L se identificaron por la presencia en la autorradiografía de granos de plata frente al fondo de luz.

Se seleccionaron aproximadamente 300.000 ADNc en grupos de aproximadamente 2.000 ADNc para identificar grupos de transfectantes que muestran múltiples células positivas para la unión de hek/Fc. Seguidamente, un grupo positivo se fraccionó en grupos de 500 y de nuevo seleccionados mediante autorradiografía en los portaobjetos. Se identificó un grupo positivo, se sometió a partición en grupos de 100, y se seleccionó mediante el mismo procedimiento. Se seleccionaron las colonias individuales de un grupo positivo y hasta que se identificó una única colonia (clon #A2) que dirige la síntesis de una proteína de superficie con actividad de unión detectable a hek/Fc. Se aisló un segundo clon, llamado C6, de un grupo positivo diferente. Los insertos de ADNc de ambos clones se secuenciaron.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región codificante del ADNc del clon A2 del ligando de hek humano se presentan en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. La proteína comprende un péptido señal en el extremo N-terminal (aminoácidos -19 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1-202) y un dominio C-terminal que contiene una región hidrófoba (aminoácidos 203-219).

El ADNc del hek-L humano se escindió del clon A2 mediante la digestión con Bgl II. El ADNc separado se clonó en el sitio BamHI (en el sitio de clonación múltiple) de pBLUESCRIPT® SK (-) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). El vector resultante (designado A2/pBS) en células DH5\alpha de E. coli se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) el 11 de agosto de 1993 y se le asignó el número de acceso ATCC 69384. El depósito de hizo en los términos del tratado de Budapest.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región codificante del ADNc del ligando humano de hek del clon C6 se presenta en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4. La proteína comprende un péptido señal en N-terminal (aminoácidos-22 a -1), un dominio extracelular (aminoácidos 1-160) y un dominio C-terminal que contiene una región hidrófoba (aminoácidos 161-179).

El ADNc del hek-L humano se escindió del clon C6 mediante digestión con BglI y se insertó en el sitio BamHI de pBLUESCRIPT® SK(-). El vector resultante (designado C6/pBS) en células DH5\alpha de E. coli se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) el 25 de agosto de 1993 y se le asignó el número de acceso ATCC 69395. El depósito se hizo en los términos del tratado de Budapest.

Los límites descritos anteriormente de los dominios de las proteínas hek-L son aproximados, cómo apreciarán los expertos en la técnica. Por ejemplo, en lo referente al hek-L codificado por el clon A2, lo más probable es que el péptido señal comprenda los aminoácidos -19 a -1, pero es posible que los aminoácidos -19 a 3 constituyan el péptido señal. De este modo, la ruptura del péptido señal puede ocurrir entre los aminoácidos -1 y 1 o entre los aminoácidos 3 y 4, o en ambas posiciones. Los términos "péptido señal" y "proteína madura" como se usan aquí en referencia al hek-L codificado por el clon A2 se entiende que incluyen ambas alternativas, al igual que otras alternativas descritas en el presente documento para polipéptidos de hek-L codificados por el clon A2 o C6.

Se ha encontrado que las proteínas hek-L codificadas por los clones A2 y C6 se unen a la membrana celular a través de grupos glucosil-fosfatidilinositol (GPI). Así se cree que los dominios hidrófobos contienen señales para el anclaje a GPI. El procesamiento de las proteínas para efectuar el anclaje a GPI, que incluye la ruptura de secuencias C-terminales se describe anteriormente.

Ejemplo 4 Anticuerpos monoclonales frente a hek-L

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales frente a hek-L. Hek-L se expresa en células hospedadoras de mamífero tales como COS-7 o CV-1/EBNA-1 y se purifica usando cromatografía de afinidad a hek/Fc. El hek-L purificado (o un fragmento del mismo tal como fragmentos del dominio extracelular o de péptidos inmunógenos del mismos) se puede usar para generar anticuerpos monoclonales frente a hek-L utilizando técnicas ordinarias, por ejemplo, las técnicas descritas en la patente de Estados Unidos 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con hek-L como un inmunógeno emulsionado en adyuvante completo de Freund, y se inyecta en cantidades que varían de 10-100 \mug subcutáneamente o intraperitonealmente. Diez o veinte días más tarde, los animales inmunizados son estimulados con hek-L adicional emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Subsecuentemente, los ratones son periódicamente estimulados según un protocolo de inmunización semanal o bi-semanalmente. Las muestras de sueros son periódicamente recogidas mediante sangrado retro-orbital o mediante escisión en la punta del rabo para analizar mediante un ensayo de transferencia de manchas o ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas), en busca de anticuerpos frente a hek-L.

Después de la detección de una valoración de anticuerpo apropiada, a los animales positivos se les proporciona una última inyección intravenosa de hek-L en solución salina. Tres o cuatro días más tarde, los animales se sacrifican, se recogen las células del bazo, y las células del bazo se fusionan a una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1 o, preferiblemente, P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las células de hibridoma generadas por fusión, se siembran en placas de microvaloración múltiple en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma y células híbridas de bazo.

Las células de hibridoma se seleccionan mediante ELISA en busca de reactividad frente a hek-L purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y col., Immunochem. 8:871, 1971 y en la patente de Estados Unidos 4.703.004. Una técnica de selección preferida es la técnica de captura del anticuerpo descrita en Beckmann y col., (J. Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones singénicos BALB/c para producir ascitis que contengan elevadas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-hek-L. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden dejar crecer in vitro en frascos o botellas de agitación por rodillo mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis de ratones se pueden purificar mediante precipitación en sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también se puede usar la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a una proteína A o proteína G, así como la cromatografía de afinidad basada en la unión a hek-L.

Ejemplo 5 Estudios de unión

Se determinó la afinidad de los ligados de hek de la presente invención hek. Se encontró que los ligandos de hek también se unen a un receptor tirosina quinasa conocido como elk, el cual es distinto de hek. También se investigó la capacidad de otras proteínas para unirse a hek o elk. Estos estudios se desarrollaron como sigue.

a) Unión a hek

Se transfectaron células CV-1 EBNA-1 (descritas en el ejemplo 1) en placas de 12 pocillos (2,5 x 10^{5} células/pocillo) con el clon A2 o C6 (ADNc del clon A2 o ADNc del clon C6 en el vector de expresión pDC410, como se describe en el ejemplo 3). Las células transfectadas se cultivaron durante dos días para permitir la expresión de las proteínas hek-L, que se retienen en la membrana celular. Seguidamente, las células se lavan con BM-NFDM (véase el ejemplo 3) y se incuban con varias concentraciones de la proteína de fusión humana hek/Fc preparada en el ejemplo 1, durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavan y se incuban con el anticuerpo de ratón anti-IgG humano marcado con ^{125}I preparado en el ejemplo 3 (40 ng/ml) en medio de unión con agitación suave durante una hora a 37ºC. Seguidamente, las células se recogen mediante tripsinización. En todos los ensayos, la unión no específica del anticuerpo marcado con ^{125}I se ensayó en ausencia de hek/Fc al igual que en presencia de hek/Fc y un exceso molar de 200 veces del anticuerpo de ratón anti-IgG humano sin marcar. El anticuerpo marcado con ^{125}I unido a la membrana y libre se cuantificó en un contador Autogamma Packard. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci 51:660, 1949) se generaron en un desarrollo RS/1 (BBN Software, Boston, MA) en una computadora Microwax. Las células CV1-EBNA-1 transfectadas con un vector pDC410 "vacío" se incluyeron en el mismo estudio de unión como control.

La unión de hek/Fc a las células CV1-EBNA-1 que expresan dos proteínas recombinantes diferentes, elk-L humana y B61 humana, también se analizó en el experimento descrito anteriormente. Las células se transfectaron con el ligando de elk (elk-L) o el ADNc de B61 en el vector pDC410. Las proteínas expresadas se unen a la membrana celular.

El elk-L se une al receptor conocido como elk, que, como hek, es un miembro de la familia eph/elk de receptores tirosina quinasas (véase "Antecedentes de la invención", sección anterior). El elk-L se incluye en este estudio para investigar si se podría o no unir a un receptor diferente de la misma familia (es decir, hek). Se ha identificado a la proteína conocida como B61 como el producto de un nuevo gen de respuesta inmediata-temprana inducible por TNF en células humanas endoteliales de cordón umbilical (Holzman y col., Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990). B61 se incluyó en este estudio por su grado de homología con elk-L (33% de identidad al nivel de aminoácidos).

La secuencia de nucleótidos del ADNc aislado de B61 y la secuencia de aminoácidos codificados se presenta en Holzman y col., supra, que se incorpora en su totalidad en este documento como referencia. También se describen los métodos para la producción y recuperación de B61, junto con ciertas características estructurales y propiedades de la proteína. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que codifican el ADNc de elk-L se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos en tramitación junto con la presente US nº 07/977.693, presentada el 13 de noviembre de 1992 y se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia. También se describen la producción y purificación de elk-L, y se identifican ciertos dominios funcionales de la proteína. Las células DH5\alpha de E. coli transformadas con ADNc humano de elk-L insertado en el sitio SmaI (en el mcs) del vector de clonación pBLUESCRIPT® SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) se depositaron como ATCC 69085 el 9 de octubre de 1992.

Los resultados del estudio fueron los siguientes:

TABLA I

	Afinidad de unión por hek/Fc (K_{a})
PDC410	- - -
B61	5,5 x 10^{7} M^{-1}
elk-L	2,3 x 10^{7} M^{-1}; 2,9 x 10^{6} M^{-1}
hek-L A2	2,0 x 10^{8} M^{-1}
hek-L C6	2,0 x 10^{8} M^{-1}

El vector vacío se mostró una unión detectable a hek/Fc. Hek/Fc se unió a B61 con una afinidad relativamente moderada, mostrando una clase de afinidad de unión simple. La unión de hek/Fc a elk-L dio como resultado un patrón bifásico, indicando dos componentes de unión con afinidad más baja (constantes de afinidad 2,3 x 10^{7} M^{-1} y 2,9 x 10^{6} M^{-1}). Las afinidades de las dos proteínas de hek-L por hek/Fc fueron equivalentes y relativamente altas.

b) Unión de elk

El ensayo de unión descrito anteriormente se repitió, sustituyendo una proteína de fusión soluble elk/Fc de rata por la proteína de fusión hek/Fc. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que codifican el elk de rata se presentan en Lhotak y col. (Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991). La proteína de fusión elk/Fc comprende el dominio extracelular de elk fusionado a la región polipeptídica del Fc natural derivado de un anticuerpo IgG1 humano. El ensayo indirecto (usando elk/Fc sin marcar y anticuerpo de ratón anti-IgG humano marcado radiactivamente con yodo) se empleó ya que el marcaje radiactivo directo de elk/Fc inactiva la especificidad de unión de los mismos.

Los resultados del estudio fueron los siguientes:

TABLA II

	Afinidad de unión por elk/Fc (K_{a})
B61	2,3 x 10^{8} M^{-1}; 7,0 x 10^{7} M^{-1}
elk-L	1,08 x 10^{9} M^{-1}
hek-L A2	2,7 x 10^{8} M^{-1}; 3,5 x 10^{7} M^{-1}
hek-L C6	1,3 x 10^{8} M^{-1}; 5,4 x 10^{7} M^{-1}

Se observó un patrón de unión bifásico de elk/Fc para B61 con Ka de 2,3 x 10^{8} M^{-1} y 7,0 x 10^{7} M^{-1}. La constante de afinidad (Ka) mostrada para la unión de elk/Fc a las células transfectadas que expresan elk-L se ajustan bien con las observadas para la unión de elk/Fc al ligando natural expresado en diversas líneas celulares neuronales de rata. Se ve un patrón de unión de elk/Fc bifásico para ambos ligandos de hek.

Ejemplo 6 Homología

Se presenta la homología de las proteínas humanas de longitud completa elk-L, B61, ligando de hek A2 y ligando de hek C6 (descritas en el ejemplo 5) entre cada una de ellas al nivel de aminoácido en la tabla III:

TABLA III

	% de identidad de aminoácidos
% de similitud		elk-L	B61	A2	C6
de aminoácidos	elk-L	- -	33	28	32
	B61	51	- -	40	37
	A2	48	63	- -	38
	C6	50	55	57	- -

El porcentaje de identidad de las secuencias de ADN se muestra en la tabla IV.

TABLA IV

	% de identidad del ADN
	elk-L	B61	A2	C6
elk-L		44,0	40,7	43,7
B61			48,9	51,5
A2				47,3
C6

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(I)

SOLICITANTE: BECKMAN, M.P.; CERRETTI, DOUGLAS P.

\vskip0.666000\baselineskip

(II)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CITOQUINA QUE UNE EL RECEPTOR HEK A LA SUPERFICIE DE LA CELULA

\vskip0.666000\baselineskip

(III)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.666000\baselineskip

(IV)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

A.

DESTINATARIO: IMMUNEX CORPORATION

B.

CALLE: 51 UNIVERSITY STREET

C.

CIUDAD: SEATTLE

D.

ESTADO: WASHINGTON

E.

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

F.

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101

\vskip0.666000\baselineskip

(V)

FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE:

A.

SOPORTE INFORMÁTICO: disquete

B.

ORDENADOR: Apple Macintosh

C.

SISTEMA OPERATIVO: apple system 7.1

D.

PROGRAMA: Microsoft word for apple, version 5.1a

\vskip0.666000\baselineskip

(VI)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

A.

NÚMERO DE SOLICITUD:

B.

FECHA DE PRESENTACIÓN: 17 DE AGOSTO DE 1994

C.

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(VII)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

A.

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/240.124

B.

FECHA DE PRESENTACIÓN: 9 DE MAYO DE 1994

\vskip0.666000\baselineskip

(VII)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

A.

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/161.132

B.

FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 DE DICIEMBRE DE 1993

\vskip0.666000\baselineskip

(VII)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

A.

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/114.426

B.

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 DE AGOSTO DE 1993

\vskip0.666000\baselineskip

(VII)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

A.

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/109.745

B.

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE AGOSTO DE 1993

\vskip0.666000\baselineskip

(VIII)

INFORMACIÓN DEL EXPEDIENTE DEL AGENTE:

A.

NOMBRE: SEESE, KATHRYN A.

B.

NÚMERO DE REGISTRO: 32.172

C.

NÚMERO DE EXPEDIENTE DE REFERENCIA: 2814-WO

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:

A.

TELÉFONO: (206) 587-0430

B.

TELEFAX: (206) 233-0644

C.

TELEX: 756.822

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1.

\vskip0.666000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

A.

LONGITUD: 1037 pares de bases

B.

TIPO: ácido nucleico

C.

CADENA: simple

D.

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(II)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.666000\baselineskip

(III)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(IV)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(VII)

FUENTE INMEDIATA:

B.

CLON: hek-L A2

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

CARACTERÍSTICA:

A.

NOMBRE / CLAVE: CDS

B.

LOCALIZACIÓN: 83...799

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

CARACTERÍSTICA:

A.

NOMBRE / CLAVE: sig_péptido

B.

LOCALIZACIÓN: 83...139

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

CARACTERÍSTICA:

A.

NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

B.

LOCALIZACIÓN: 140...796

\vskip0.666000\baselineskip

(XI)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2.

\vskip0.666000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

A.

LONGITUD: 238 aminoácidos

B.

TIPO: aminoacídica

C.

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(III)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(XI)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2.

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3.

\vskip0.666000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

A.

LONGITUD: 636 pares de bases

B.

TIPO: ácido nucleico

C.

CADENA: única

D.

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(IV)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.666000\baselineskip

(III)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(IV)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(VII)

FUENTE INMEDIATA:

B.

CLON: hek-L C6

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

CARACTERÍSTICA:

A.

NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

B.

LOCALIZACIÓN: 94...630

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

CARACTERÍSTICA:

A.

NOMBRE / CLAVE: CDS

B.

LOCALIZACIÓN: 28...633

\vskip0.666000\baselineskip

(IX)

CARACTERÍSTICA:

A.

NOMBRE PARA CLAVE: sig_péptido

B.

LOCALIZACIÓN: 28...93

\vskip0.666000\baselineskip

(XI)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4.

\vskip0.666000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

C.

LONGITUD: 201 aminoácidos

D.

TIPO: aminoacídica

E.

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(V)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(XI)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4.

6

7

Claims (24)

1. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de ligando de hek (hek-L) capaz de unirse a hek, en el dicho hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos 1-129 de la SEQ ID NO: 2.

2. Un ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de hek-L comprende la secuencia de aminoácidos de o bien restos 1-202 o bien restos 1-219 de la SEQ ID NO: 2.

3. Un ADN aislado que codifica el polipéptido de hek-L capaz de unirse hek, en el que dicho hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos 1-179 de la SEQ ID
NO:4.

4. Un ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido de hek-L comprende la secuencia de aminoácidos de o bien los restos 1-160 o bien los restos 1-179 de la SEQ ID NO: 4.

5. Un ADN aislado que codifica un polipéptido de hek-L, en el que dicho polipéptido de hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que son los:

a)

aminoácidos z hasta x de la SEQ ID NO:2, en los que z es un aminoácido en las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO:2 y x es un aminoácido en las posiciones 193 a 219 de la SEQ ID NO:2; o

b)

aminoácidos z' hasta y de la SEQ ID NO: 4, en los que z' es un aminoácido en las posiciones 1 a 4 de la SEQ ID NO: 4 e y es un aminoácido en las posiciones 147 a 179 de la SEQ ID NO: 4.

6. Un ADN aislado que es:

a)

un ADN que codifica un fragmento del polipéptido de hek-L de la SEQ ID NO:2, o

b)

un ADN que codifica un fragmento del polipéptido de hek-L de la SEQ ID NO:4,

en

el que dicho fragmento es capaz de unirse a hek.

7. Un vector de expresión que comprende un ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido de hek-L, que comprende cultivar células hospedadoras transformadas con un vector de acuerdo con la reivindicación 7, en condiciones que promueven la expresión del polipéptido de hek-L y recuperar el polipéptido de hek-L del cultivo.

9. Un ADN aislado que codifica una proteína de fusión que comprende un hek-L soluble capaz de unirse a hek y un polipéptido Fc, en el que dicho hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, idéntica en el 80% a una secuencia que o bien son los aminoácidos 1-202 de la SEQ ID NO: 2 o bien los aminoácidos 1-160 de la SEQ ID NO: 4.

10. Un vector de expresión que comprende un ADN de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Un procedimiento para la preparación de una proteína de fusión hek-L/Fc, que comprende cultivar células hospedadoras transformadas con un vector de acuerdo con la reivindicación 10, en condiciones que promueven la expresión de la proteína de fusión hek-L/Fc y recuperar la proteína de fusión hek-L/Fc del cultivo.

12. Un polipéptido de hek-L purificado capaz de unirse a hek, en el que dicho hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos 1-219 de la SEQ ID NO: 2.

13. Un hek-L de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho hek-L comprende la secuencia de aminoácidos o bien de los restos 1-202 o bien de los restos 1-219 de la SEQ ID NO: 2.

14. Un polipéptido de hek-L purificado capaz de unirse a hek, en el que dicho hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, idéntica en el 80% a la secuencia de restos 1-179 de la SEQ ID NO:4.

15. Un hek-L de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho hek-L comprende la secuencia de aminoácidos o bien los restos 1-160 o bien los restos 1-179 de la SEQ ID NO: 4.

16. Un polipéptido de hek-L purificado, en el que dicho polipéptido hek-L comprende una secuencia de aminoácidos que son los:

a)

aminoácidos z hasta x de la SEQ ID NO:2, en los que z es un aminoácido en las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO:2 y x es un aminoácido en las posiciones 193 a 219 de la SEQ ID NO:2; o

b)

aminoácidos z' hasta y de la SEQ ID NO: 4, en los que z' es un aminoácido en las posiciones 1 a 4 de la SEQ ID NO: 4 e y es un aminoácido en las posiciones 147 a 179 de la SEQ ID NO: 4.

17. Un polipéptido de hek-L purificado que es:

a)

un polipéptido de hek-L que comprende los restos 1-219 de la SEQ ID NO:2;

b)

un polipéptido de hek-L que comprende los restos 1-179 de la SEQ ID NO:4, o

c)

un fragmento de un polipéptido hek-L de (a) o (b), en el que dicho fragmento es capaz de unirse a hek.

18. Una proteína hek-L codificada por el inserto de ADNc de hek-L del vector recombinante contenido en las células transformadas que o bien son células transformadas depositadas como ATCC 69384 o bien células transformadas depositadas como ATCC 69395.

19. Una proteína de fusión codificada por un ADN de acuerdo con la reivindicación 9.

20. Un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de hek-L de acuerdo con la reivindicación 13 ó 15, o con un fragmento inmunogénico de dicho hek-L.

21. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

22. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de, al menos, 30 nucleótidos de la región codificante de la secuencia de ADN o bien la SEQ ID NO: 1, o el ADN o ARN complementarios de la misma o bien la SEQ ID NO: 3, o el ADN o ARN complementarios de la misma.

23. Un oligómero que comprende de dos a cuatro polipéptidos solubles de hek-L capaces de unirse a hek, en el que dichos polipéptidos solubles de hek-L comprenden cada uno de ellos una secuencia de aminoácidos que es, al menos, idéntica en el 80% a una secuencia que o bien son los aminoácidos 1-202 de la SEQ ID NO: 2 o bien los aminoácidos 1-160 de la SEQ ID NO: 4.

24. Un oligómero que comprende de dos a cuatro polipéptidos solubles de hek-L capaces de unirse a hek, en el que dichos polipéptidos solubles de hek-L comprenden cada una de ellos una secuencia de aminoácidos que son los:

a)

aminoácidos z hasta x' de la SEQ ID NO: 2, en los que z es un aminoácido en las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO: 2 y x' es un aminoácido en las posiciones 193 a 202 de la SEQ ID NO: 2, o

b)

aminoácidos z' hasta y' de la SEQ ID NO: 4, en los que z' es un aminoácido en las posiciones 1 a 4 de la SEQ ID NO: 4 e y' es un aminoácido en las posiciones 147 a 160 de la SEQ ID NO: 4.