DE69433552T2

DE69433552T2 - An den zelloberflächenrezeptor hek bindendes cytokin

Info

Publication number: DE69433552T2
Application number: DE69433552T
Authority: DE
Inventors: M. Patricia Beckmann; Douglas P. Cerretti
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1993-08-20
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2014-08-18
Also published as: JP3699477B2; US5738844A; EP0804482B1; JPH09502174A; PT804482E; US20020010325A1; KR960704038A; CA2169851A1; US5516658A; FI960743A0; EP0804482A4; EP0804482A1; US6274117B1; US6949366B2; ATE259377T1; DK0804482T3; US5969110A; WO1995006065A1; NO960652D0; NO960652L

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteine, die als Rezeptor-Tyrosinkinasen bekannt sind, weisen eine intrinsische Kinaseaktivität auf, die bei Ligandenbindung aktiviert wird. Diese Klasse von Proteinen ist durch konservierte strukturelle Motive innerhalb der katalytischen Domänen (Hanks et al., Science 242: 42, 1988) gekennzeichnet und kann basierend auf strukturellen Merkmalen der Regionen, die 5' zur katalytischen Domäne sind, in Familien unterteilt werden.
Boyd et al. (J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992) reinigten ein Zelloberflächenglycoprotein, das Tyrosinkinase-Aktivität aufwies. Die N-terminale Aminosäuresequenz identifizierte dieses Protein als ein Mitglied der eph/elk-Familie, so dass das Protein als hek (humane eph/elk-ähnliche Kinase) bezeichnet wurde. Ein mit hek immunreaktiver monoklonaler Antikörper wurde verwendet, um die hek-Expression auf einer Reihe von humanen Zelltypen zu untersuchen (Boyd et al., supra). Auf der humanen pre-B-Zellen-Leukämiezelllinie LK63 (die Zelllinie, die als Immunogen verwendet wurde, gegen das der Antikörper gezüchtet wurde) und der humanen T-Zellen-Leukämiezelllinie JM wurde hek-Antigen gefunden. Die Raji-B-Lymphomazelllinie zeigte eine schwache hek-Antigenexpression, während die restlichen getesteten Zelllinien (sowohl normale als auch Tumorzelllinien, unter denen sich hämopoetische Zelllinien befanden, die pre-B- und T-Zelllinien einschlossen) einheitlich negativ waren. Von den normalen und Tumorgewebebiopsieproben, die ebenfalls auf hek-Antigen-Expression getestet wurden, war keines von den normalen Geweben positiv und nur ein sehr geringer Anteil der hämopoetischen Tumore positiv.
Die Expression von hek-Transkripten auf den oben beschriebenen LK63- und JM-Zelllinien, sowie der humanen T-Zellen-Leukämiezelllinie HSB-2, wurde durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen (Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1611, 1992). Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für einen isolierten hek-cDNA-Klon werden in Wicks et al., supra präsentiert.
Das hek-Protein ist sehr eng mit einer Reihe von anderen Rezeptor-Tyrosinkinasen verwandt, einschließlich elk (Letwin et al., Oncogene 3: 621, 1988 und Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991), der hek-Homologe mek4 und cek4 (Sajjadi et al., New Biol. 3: 769, 1991); eek (Chan et al. Oncogene 6: 1057, 19991); erk (Chan et al. supra.), eck (Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 10: 6316, 1990); cek5 (Pasquale, E. B. Cell Regulation 2: 523, 1991); und eph (Hirai et al. Science 238: 1717, 1987). Die Proteine dieser Unterfamilie sind nicht nur in ihren cytoplasmatischen Domänen, sondern auch in ihren extrazellulären Domänen verwandt, die zu 41 bis 68% identisch sind. Interessanterweise sind die Gewebeverteilungen dieser verschiedenen Rezeptoren unterschiedlich. So wurde zum Beispiel berichtet, dass die Expression von elk-mRNA auf Hoden und Hirn beschränkt ist (Lhotak et al., supra), während eck nicht nur in denselben zwei Geweben, sondern auch in der Lunge, im Darm, den Nieren, der Milz, dem Eierstock und der Haut gefunden wird.
Liganden für die Rezeptor-Tyrosinkinasen sind eine vielfältige Gruppe von Proteinen, welche das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Zellen beeinflussen, die die Rezeptoren exprimieren. Bis dato wurde kein Ligand für hek entdeckt. Die Identifikation des putativen Liganden oder von putativen Liganden, welche hek binden, würde sich bei der Erforschung der Natur von zellulären Verfahren, die durch das hek-Protein reguliert werden, als nützlich erweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Cytokine bereit, die als hek-Liganden (hek-L) bezeichnet werden und an den Zelloberflächenrezeptor binden, der als hek bekannt ist. Ferner stellt die vorliegende Erfindung isolierte DNA bereit, welche die hek-L-Proteine codiert, Expressionsvektoren, welche die isolierte DNA enthalten, und ein Verfahren zum Erzeugen von hek-L durch Kultivieren von Wirtszellen, welche die Expressionsvektoren enthalten, unter Bedingungen, die für die Expression des hek-L-Proteins geeignet sind. Darüber hinaus werden Antikörper, die gegen hek-L-Proteine oder ein immunogenes Fragment davon gerichtet sind, offenbart.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurden cDNAs, die neuartige Proteinliganden codieren, die an das Zelloberflächenprotein binden, das als hek bekannt ist, gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert. Ferner werden Expressionsvektoren bereitgestellt, welche die hek-Ligand (hek-L)-cDNA aufweisen, sowie Verfahren zur Herstellung von rekombinanten hek-L-Polypeptiden durch Kultivieren von Wirtszellen, welche die Expressionsvektoren enthalten, unter Bedingungen, die für die Expression von hek-L geeignet sind, und zum Wiedergewinnen des exprimierten hek-L geschaffen. Gereinigtes hek-L-Protein wird ebenfalls durch die vorliegende Erfindung erfasst, einschließlich löslicher Formen des Proteins.
Die vorliegende Erfindung stellt auch hek-L oder antigene Fragmente davon bereit, die als Immunogene wirken können, um Antikörper zu erzeugen, die für die hek-L-Immunogene spezifisch sind. Somit können monoklonale Antikörper, die für hek-L oder antigene Fragmente davon spezifisch sind, zubereitet werden.
Die neuartigen Cytokine, die hierin offenbart werden, sind Liganden für hek, einen Zelloberflächenrezeptor, der ein Mitglied der Rezeptor-Tyrosinkinase-Familie ist. Eine Verwendung der hek-Liganden der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung als Forschungswerkzeuge für das Untersuchen der Rolle, die hek-L, in Verbindung mit hek, beim Wachstum oder der Differenzierung von Zellen spielen kann, welche den hek-Rezeptor tragen. Biologische Signale, die durch das Binden eines hek-L an hek auf einer Zelle ausgelöst werden können, können untersucht werden. Es wurde die Vermutung geäußert, dass hek eine Rolle bei der Tumorgenese spielt (Boyd et al., supra). Die hierin bereitgestellten hek-Liganden sind nützlich, wenn es darum geht, zu untersuchen, welche Auswirkung das Binden von hek-L an den kognaten Rezeptor auf die Tumorgenese haben könnte.
Die hek-L-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch bei in-vitro-Tests zum Erfassen von hek oder hek-L oder den Wechselwirkungen davon verwendet werden. Da das hek-Antigen auf bestimmten leukämischen Zelllinien festgestellt worden ist, kann hek-L als Träger verwendet werden, um diagnostische oder cytotoxische Wirkstoffe zu solchen Zellen zu transportieren. Diese und andere Verwendungen von hek-Liganden werden unten näher besprochen.
Es wurde festgestellt, dass die hek-L-Proteine der vorliegenden Erfindung an die Rezeptor-Tyrosinkinase binden, die als elk bekannt ist. elk wurde von Letwin et al., Oncogene 3: 621, 1988 und Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991, beschrieben. Eine Scatchard-Analyse ergab ein Zweiphasen-Muster der elk-Bindung für beide hek-L-Proteine, wie in Beispiel 5 beschrieben. Somit können die hierin offenbarten hek-L-Proteine auch verwendet werden, um an elk zu binden, z. B. in verschiedenen Testverfahren. Dennoch würde angesichts der höheren Affinität von elk-L für elk das in Beispiel 5 beschriebene elk-Ligand (elk-L)-Protein im Allgemeinen für solche Verwendungen bevorzugt werden.
Die Bindungsuntersuchungen, die in Beispiel 5 beschrieben werden, zeigten auch, dass der elk-Ligand (elk-L) hek bindet (Zweiphasen-Bindungsmuster). Es wurde festgestellt, dass ein verwandtes Protein, das als B61 bekannt ist (Holzman et al., Mol. Cell. Biol. 10: 5830, 1990), sowohl an hek (lineares Muster) als auch an elk bindet (Zweiphasen-Muster). Die relativen Affinitäten sind in Tabelle I und II von Beispiel 5 dargestellt.
Um Zellen zu identifizieren, die für die Verwendung als Nukleinsäurequellen beim Versuch hek-L-DNA zu klonen, geeignet sind, wurden verschiedene Zelltypen auf die Fähigkeit hin untersucht, an hek zu binden (in der Form eines Fusionsproteins, das humanes hek und ein Antikörper-Fc-Polypeptid aufweist). Eine humane T-Zellen-Leukämiezelllinie war für hek/Fc-Bindung positiv, wobei eine cDNA-Expressionsbibliothek daraus gewonnen wurde. Zwei unterschiedliche cDNA-Klone, welche humanen hek-L codieren, wurden erfolgreich durch Screenen von Klonen auf die Expression eines hek-/Fc-Bindungsproteins isoliert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die DNA-Sequenz und die codierte Aminosäuresequenz eines humanen hek-L-cDNA-Klons werden in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angeführt. Die DNA-Sequenz und die codierte Aminosäuresequenz eines zweiten humanen hek-L-Klons sind in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellt. Ein Vergleich des Nukleotids und der codierten Aminosäuresequenzen der humanen hek-L-cDNA-Klone mit der Genbank und den Swisspro-Datenbanken zeigte, dass die Sequenzen der hek-Liganden einzigartig waren. Die Aminosäuresequenzen der hek-Bindungsproteine, die durch die zwei Klone codiert werden, sind zu 38% identisch.
Humane hek-L-cDNA wurde vom ersten positiven Klon isoliert und in die Bam-HI-Stelle (in der Mehrfachklonierungsstellen-Region) des Klonierungsvektors pBLUESCRIPT^® SK(-), erhältlich bei Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, eingefügt. Der als A2/pBS bezeichnete, resultierende rekombinante Vektor in E. coli DH5α-Zellen wurde bei der American Type Culture Collection am 11. August 1993 hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ATCC 69384. Humane hek-L-cDNA wurde von dem zweiten positiven Klon isoliert und in die Bam-HI-Stelle von pBLUESCRIPT^® SK(-) eingefügt. Der als C6/pBS bezeichnete resultierende, rekombinante Vektor in E. coli DH5α-Zellen wurde am 25. August 1993 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ATCC 69395. Beide Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags.
Der hek-L von SEQ ID NO: 2 (codiert durch die cDNA von Klon A2) weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –19 bis –1), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1 bis 202) und eine C-terminale, hydrophobe Region auf, die mit Aminosäure 203 beginnt. Der hek-L von SEQ ID NO: 4 (durch die cDNA von Klon C6 codiert) weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –22 bis –1), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1 bis 160) und eine C-terminale, hydrophobe Region auf, die mit Aminosäure 161 beginnt.
Die hek-L-Proteine, die durch die Klone A2 und C6 exprimiert werden, waren an der Zelloberfläche durch Glycosyl-Phosphatidylinositol(GPI)-Kopplung verankert. GPI-Membrananker, einschließlich der chemischen Struktur und Verarbeitung davon, werden in Ferguson, M. und A. Williams, Ann. Rev. Biochem., 57: 285, 1988 beschrieben (wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Wenn sie anfangs exprimiert werden, weisen bestimmte Proteine eine C-terminale, hydrophobe Domäne auf, welche Signale für das GPI-Verankern enthält. Eine Spaltstelle befindet sich stromaufwärts, oft ungefähr 10 bis 12 Aminosäuren stromaufwärts von dem N-Terminus der hydrophoben Domäne. Post-translationale Verarbeitung schließt das Spalten des Proteins bei dieser Spaltstelle ein. Ein GPI-Anker haftet an der neu exponierten C-terminalen Aminosäure des verarbeiteten, reifen Proteins. Somit stellen, wenn die hek-L-Proteine in Zellen exprimiert sind, welche die GPI- Verankerungssignale in der hydrophoben Domäne erkennen, die Aminosäuresequenzen voller Länge von SEQ ID NO: 2 und 4 Vorläuferformen der Proteine dar.
Auf der Grundlage von Konsenssequenzen, die von anderen GPI-verankerten Proteinen abgeleitet wurden, befinden sich wahrscheinliche Spaltstellen in den hek-L-Proteinen der vorliegenden Erfindung zwischen den Aminosäuren 194 und 195 von SEQ ID NO: 2 und zwischen den Aminosäuren 148 und 149 von SEQ ID NO: 4. Nach dem Spalten des Proteins heftet sich ein GPI-Anteil an den Serinrest, der nun der C-Terminus des verarbeiteten Proteins ist (Aminosäure 194 von SEQ ID NO: 2 und Aminosäure 148 von SEQ ID NO: 4). Es ist möglich, dass an anderer Stelle, stromaufwärts von der hydrophoben Region, in den hek-L-Proteinen ein Spalten auftritt.
Der Begriff „hek-L", so wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Gattung von Polypeptiden, die imstande sind, hek zu binden, und Homologie (wobei sie vorzugsweise zu mindestens 80% homolog sind) zum hek-L-Protein von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 zeigen. Der humane hek-L liegt innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung, genauso wie hek-L-Proteine, die von anderen Säugetierspezies abgeleitet werden, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – Mäuse, Ratten, Rinder, Schweine oder verschiedene Primatenarten. So wie hierin verwendet, schließt der Begriff „hek-L" sowohl membrangebundene als auch lösliche (abgesonderte) Formen des Proteins ein. Gestutzte Proteine, welche die hek-bindende Eigenschaft beibehalten, werden durch die vorliegende Erfindung miterfasst. Diese gestutzten Proteine schließen zum Beispiel löslichen hek-L ein, der nur die extrazelluläre (Rezeptor-bindende) Domäne aufweist, dem aber die hydrophobe Domäne fehlt.
Die humane hek-L-cDNA kann radioaktiv markiert und als Sonde verwendet werden, um andere Säugetier-hek-L-cDNAs durch Kreuz-Spezies-Hybridisierung zu isolieren. Zum Beispiel kann eine cDNA-Bibliothek, die aus T-Zellen-Leukämie-Zelllinien von anderen Säugetierspezies hergestellt wurde, mit radioaktiv markierter, humaner hek-L-cDNA gescreent werden, um einen positiven Klon zu isolieren. Alternativ dazu können mRNAs, die aus verschiedenen Zelllinien isoliert werden, durch Northern-Hybridisierung gescreent werden, um eine geeignete Quelle von Säugetierhek-L-mRNA zur Verwendung beim Klonieren eines hek-L-Gens zu bestimmen.
Obwohl ein hek-/Fc-Fusionsprotein in den in Beispiel 2 und 3 unten beschriebenen Screening-Verfahren verwendet wurde, kann hek verwendet werden, um Klone und Kandidaten-Zelllinien für die Expression von hek-L-Proteinen zu screenen. Das hek-/Fc-Fusionsprotein bietet jedoch den Vorteil, dass es leicht gereinigt werden kann. Außerdem bilden sich Disulfidbindungen zwischen den Fc-Regionen von zwei getrennten Fusionsproteinketten, wodurch Dimere entstehen.
Andere Antikörper-Fc-Regionen können durch das humane IgG1-Fc-Region-Mutein ersetzt werden, das in Beispiel 1 beschrieben wird. Andere geeignete Fc-Regionen sind solche, die mit hoher Affinität an Protein A oder Protein G binden können und schließen die Fc-Region von murinem IgG1 oder Fragmente der Fc-Region des humanen IgG1 ein, z. B. Fragmente, welche mindestens die Gelenkregion aufweisen, so dass sich Zwischenkettendisulfidbindungen bilden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt lösliche hek-L-Polypeptide bereit. Lösliche hek-L-Polypeptide enthalten die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Domäne eines nativen hek-L, es fehlt ihnen aber die hydrophobe Region, welche Signale enthält, die eine Retention des Polypeptids auf einer Zellmembran auslösen würden. Lösliche hek-L-Polypeptide weisen vorteilhafterweise das native (oder ein heterologes) Signalpeptid auf, wenn sie anfänglich synthetisiert werden, um die Absonderung zu fördern, wobei das Signalpeptid jedoch bei Absonderung von hek-L aus der Zelle gespaltet wird. Die löslichen hek-L-Polypeptide, die verwendet werden können, behalten die Fähigkeit, an den hek-Rezeptor zu binden. Löslicher hek-L kann auch einen Teil der hydrophoben Region einschließen, vorausgesetzt, dass das lösliche hek-L-Protein abgesondert werden kann.
Löslicher hek-L kann identifiziert (und von seinen nicht-löslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden) werden, indem intakte Zellen, welche das gewünschte Protein exprimieren, vom Kulturmedium z. B. durch Zentrifugation getrennt werden und das Medium (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Proteins untersucht wird. Die Gegenwart von hek-L im Medium zeigt an, dass das Protein von den Zellen abgesondert wurde und somit eine lösliche Form des gewünschten Proteins ist. Löslicher hek-L kann eine natürlich vorkommende Form dieses Proteins sein, die z. B. aus dem alternativen Spleißen hervorgeht. Ferner kann GPI-gekoppelter hek-L von der Zelloberfläche in das Kulturmedium z. B. durch die Wirkung einer Protease oder eines anderen Enzyms freigesetzt oder abgestreift werden.
Die Verwendung löslicher Formen von hek-L ist für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Proteine aus rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Proteine aus den Zellen abgesondert werden. Ferner sind lösliche Proteine im Allgemeinen besser für eine intravenöse Verabreichung geeignet.
Beispiele löslicher hek-L-Polypeptide schließen jene ein, welche die gesamte extrazelluläre Domäne eines nativen hek-L-Proteins aufweisen. Ein solches lösliches hek-L-Protein enthält Aminosäuren 1 bis 202 von SEQ ID NO: 2 und ein anderes Aminosäuren 1 bis 160 von SEQ ID NO: 4. Wenn es anfänglich innerhalb einer Wirtszelle exprimiert wird, kann das lösliche Protein zusätzlich eines der heterologen Signalpeptide enthalten, die unten beschrieben werden und die innerhalb der verwendeten Wirtszellen funktionell sind. Alternativ dazu kann das Protein anfänglich das native Signalpeptid enthalten, so dass der hek-L Aminosäuren –19 bis 202 von SEQ ID NO: 2 oder Aminosäuren –22 bis 160 von SEQ ID NO: 4 aufweist. Lösliche hek-L-Proteine können gestutzt werden, um den C-Terminus bis und einschließlich jener Aminosäure zu streichen, die als eine GPI-Anheftungsstelle dient. Beispiele schließen Proteine ein, die Aminosäuren 1 bis 193 von SEQ ID NO: 2 oder Aminosäuren 1 bis 147 von SEQ ID NO: 4 enthalten, wie oben besprochen. Obwohl die GPI-Anheftungsstelle gestrichen werden kann, nimmt man an, dass das Streichen der hydrophoben Domäne ausreicht, um ein GPI-Verankern des Proteins an der Zellmembran zu verhindern. In weiteren Ausführungsformen können die Proteine an dem C-Terminus gestutzt werden, so dass die C-terminale Aminosäure eine beliebige Aminosäure zwischen den Aminosäuren 193 und 202 von SEQ ID NO: 2 oder zwischen den Aminosäuren 147 und 160 von SE ID NO: 4 ist. Die DNA-Sequenzen, welche lösliche hek-L-Proteine codieren, werden durch die vorliegende Erfindung erfasst.
Gestutztes hek, einschließlich löslicher Polypeptide, kann durch eine beliebige aus einer Reihe von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine erwünschte DNA-Sequenz kann chemisch unter Anwendung bekannter Techniken synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch Restriktions-Endonukleaseaufschließen einer klonierten DNA-Sequenz voller Länge hergestellt und durch Elektrophorese auf Agarose-Gels isoliert werden. Oligonukleotide, die den 5'- oder 3'-Terminus eines DNA-Fragmentes zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, können synthetisiert werden. Das Oligonukleotid kann eine Restriktionsendonuklease-Spaltstelle stromaufwärts von der erwünschten codierenden Sequenz enthalten und ein Startcodon (ATG) am 5'-Ende der codierenden Sequenz anordnen. Das wohl bekannte Polymerasekettenreaktionsverfahren kann ebenfalls angewendet werden, um eine DNA-Sequenz zu isolieren, die ein erwünschtes Proteinfragment codiert. Als weitere Alternative können bekannte Mutagenese-Techniken verwendet werden, um ein Stopp-Codon an einem erwünschten Punkt einzufügen, z. B. unmittelbar stromabwärts des Codons für die letzte Aminosäure der extrazellulären Domäne.
Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen isolierte DNA bereit, die eine Nukleotidsequenz enthält, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Nukleotiden 83 bis 796 (gesamte codierende Region), 83 bis 745 (die das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne codieren), 140 bis 796 (die das Protein ohne das Signalpeptid codieren) und 140 bis 745 (welche die extrazelluläre Domäne codieren) von SEQ ID NO: 1 besteht. Ebenfalls bereitgestellt wird eine isolierte DNA, die eine Nukleotidsequenz enthält, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Nukleotiden 28 bis 630 (gesamte codierende Region), 28 bis 573 (welche das Signalpeptid und die extrazelluläre Domäne codieren), 94 bis 630 (welche das Protein ohne das Signalpeptid codieren) und 94 bis 573 (welche die extrazelluläre Domäne codieren) von SEQ ID NO: 3 besteht. DNAs, welche biologisch aktive Fragmente der Proteine von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 codieren, werden ebenfalls bereitgestellt, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – DNA, welche die oben beschriebenen hek-L-Proteine codiert, die an dem C-Terminus gestutzt sind.
Die hek-L-DNA der vorliegenden Erfindung schließt cDNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR isolierte DNA, genomische DNA und Kombinationen davon ein. Genomische hek-L-DNA kann durch Hybridisierung an der cDNA der Klone A2 oder C6 unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte, rekombinante und nicht-rekombinante hek-L-Polypeptide bereit. Varianten und Derivate von nativen hek-L-Proteinen, welche die erwünschte biologische Aktivität beibehalten (z. B. die Fähigkeit, an hek zu binden), liegen ebenfalls innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist reifes hek-L-Protein durch die N-terminale Aminosäuresequenz Leu-Leu-Ala-Gln-Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Asn gekennzeichnet. In einer anderen Ausführungsform ist reifes hek-L-Protein durch die N- terminale Aminosäuresequenz Gly-Ser-Ser-Leu-Arg-His-Val-Val-Tyr-Trp-Asn-Ser gekennzeichnet.
hek-L-Varianten können durch Mutationen von Nukleotidsequenzen erhalten werden, die zum Beispiel für native hek-L-Polypeptide codieren. Ein hek-L-Variant, so wie hierin verwendet, ist ein Polypeptid, das im Wesentlichen zu einem nativen hek-L homolog ist, das aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die von jener eines nativen hek-L (eines Menschen, einer Maus oder einer anderen Säugetierspezies) aufgrund von einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterschiedlich ist. Solche Varianten, die an hek binden, sind Äquivalente der nativen hek-bindenden Proteine, welche die Aminosäuresequenzen aufweisen, die in SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 dargestellt sind.
Variante DNA- und Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise zu mindestens 80%, am bevorzugtesten zu mindestens 90% mit einer nativen hek-L-Sequenz wie den nativen Sequenzen von SEQ ID NO: 1 bis 4 identisch. Für Fragmente wird die prozentuelle Identität für jenen Abschnitt einer nativen Sequenz berechnet, der im Fragment vorhanden ist. Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen hek-L-Polypeptide bereit, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens zu 80% mit einer Sequenz identisch ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Aminosäuren 1 bis 194, 1 bis 202 und 1 bis 219 von SEQ ID NO: 2 und Aminosäuren 1 bis 148, 1 bis 160 und 1 bis 179 von SEQ ID NO: 4 besteht.
Änderungen der nativen Aminosäuresequenz können durch eine beliebige einer Reihe von bekannten Techniken erfolgen. Mutationen können an bestimmten Loci durch Synthetisieren von Oligonukleotiden eingefügt werden, welche eine mutierte Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Im Anschluss an die Ligation codiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analog, das die erwünschte Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion aufweist.
Alternativ dazu können oligonukleotidgerichtete stellenspezifische Mutagenese-Verfahren angewendet werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, das bestimmte Codons aufweist, die gemäß der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion geändert wurden. Beispielhafte Verfahren für die Durchführung der oben erwähnten Änderungen werden von Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); und den US-Patentschriften Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbart, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Varianten können konservativ substituierte Sequenzen aufweisen, das heißt, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest mit ähnlichen physiochemischen Eigenschaften ersetzt wird. Beispiele konservativer Substitutionen schließen die Substitution von einem aliphatischen Rest gegen einen anderen, wie zum Beispiel von Ile, Val, Leu oder Ala gegen einander, oder Substitutionen von einem polaren Rest gegen einen anderen ein, wie zum Beispiel zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn. Andere solche konservative Substitutionen, zum Beispiel Substitutionen gesamter Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften, sind wohl bekannt.
hek-L kann auch modifiziert werden, um hek-L-Derivate durch Bilden kovalenter oder aggregierender Konjugate mit anderen chemischen Anteilen wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen zu bilden. Kovalente Derivate von hek-L können hergestellt werden, indem die chemischen Anteile an funktionelle Gruppen auf hek-L-Aminosäure-Seitenketten oder an den N-Terminus oder den C-Terminus eines hek-L-Polypeptids oder der extrazellulären Domäne davon gekoppelt werden. Andere Derivate von hek-L, die innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung liegen, schließen kovalente oder aggregierende Konjugate von hek-L oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen.
Wenn anfänglich in einem rekombinantem System exprimiert, kann ein hek-Ligand eine Signal- oder Leader-Sequenz (nativ oder heterolog) an dem N-Terminus eines hek-L-Polypeptids aufweisen. Das Signal- oder Leader-Peptid richtet den Transfer des Proteins co-translational oder post-translational von seiner Synthesestelle zu einer Stelle außerhalb der Zellmembran oder Zellwand und wird vom reifen Protein während des Absonderungsverfahrens gespaltet. Beispiele geeigneter, heterologer Signalpeptide, die im Allgemeinen gemäß des zu verwendenden Expressionssystems ausgewählt werden, werden unten beschrieben.
hek-L-Polypeptid-Fusionen können Peptide enthalten, die hinzugefügt werden, um die Reinigung und Identifikation von hek-L zu erleichtern. Zu solchen Peptiden gehören zum Beispiel poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide, die in der US-Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988 beschrieben werden. Ein solches Peptid ist das FLAG^®-Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), das hoch antigen ist und ein Epitop bereitstellt, das durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel gebunden ist, wodurch ein schnelles Testen und einfaches Reinigen von exprimiertem, rekombinantem Protein ermöglicht wird. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid als Kappe versehen werden, können auch gegenüber intrazellulärem Abbau in E. coli resistent sein. Ein Mäuse-Hybridom, das als 4E11 bezeichnet wird, erzeugt einen monoklonalen Antikörper, der das Peptid DYKDDDDK in der Gegenwart bestimmter zweiwertiger Metallkationen (wie in der US-Patentschrift 5,011,912 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird) bindet und bei der American Type Culture Collection unter der Zugriffsnummer HB 9259 hinterlegt wurde.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner hek-L-Polypeptide mit oder ohne assoziierte Nativ-Muster-Glycosylierung ein. hek-L, der in Hefe oder Säugetier-Expressionssystemen (z. B. COS-7-Zellen) exprimiert ist, kann einem nativen hek-L-Polypeptid in Bezug auf das Molekulargewicht und das Glycosylierungsmuster ähnlich sein oder sich von diesem diesbezüglich deutlich unterscheiden, je nach Wahl des Expressionssystems. Die Expression von hek-L-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen wie E. coli stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit.
Es können DNA-Konstrukte hergestellt werden, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder -sequenzen oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen codieren, die nicht für biologische Aktivität oder Bindung benötigt werden. Zum Beispiel können N-Glycosylierungsstellen in der hek-L extrazellulären Domäne geändert werden, um Glycosylierung auszuschließen, wodurch die Expression eines homogeneren, reduzierten Kohlenhydratanalogs in Säugetier- und Hefe-Expressionssystemen ermöglicht wird. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden werden durch eine Aminosäure-Dreiergruppe Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Pro und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Modifikationen an der Nukleotidsequenz, welche diese Dreiergruppe codiert, werden zu Substitutionen, Additionen oder Deletionen führen, die ein Anheften von Kohlenhydratresten an der Asn-Seitenkette verhindern. Eine Änderung eines einzelnen Nukleotids, die so gewählt wird, dass zum Beispiel Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist ausreichend, um eine N-Glycosylierungsstelle zu deaktivieren. Bekannte Verfahren für das Deaktivieren von N-Glycosylierungsstellen in Proteinen schließen jene ein, die in der US-Patentschrift 5,071,972 und in EP 276,846 beschrieben werden, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Drei N-Glycosylierungsstellen werden in dem hek-L, der durch Klon A2 codiert wird, bei Aminosäuren 19 bis 21, 48 bis 50 und 81 bis 83 von SEQ ID NO: 2 gefunden. Eine Glycosylierungsstelle wird in dem hek-L, der durch Klon C6 codiert wird, bei Aminosäuren 11 bis 13 von SEQ ID NO: 4 gefunden.
In einem anderen Beispiel können Sequenzen, die Cys-Reste codieren, die nicht für biologische Aktivität erforderlich sind, geändert werden, um dafür zu sorgen, dass die Cys-Reste gestrichen oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wodurch die Bildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei Renaturierung verhindert wird. Andere Varianten werden durch Modifikation von benachbarten zweibasischen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. EP 212,914 offenbart die Verwendung von stellenspezifischer Mutagenese, um KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen in einem Protein zu deaktivieren. KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen werden durch Streichen, Addieren oder Substituieren von Resten deaktiviert, um Arg-Arg, Arg-Lys und Lys-Arg-Paare zu ändern, um das Auftreten dieser benachbarten basischen Reste zu beseitigen. Lys-Lys-Paare sind für KEX2-Spalten wesentlich weniger empfänglich, und die Konversion von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Deaktivieren von KEX2-Stellen dar. KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen werden im hek-L von SEQ ID NO: 2 bei Aminosäuren 26 bis 27, 87 bis 88 und 199 bis 200 gefunden. Der hek-L von SEQ ID NO: 4 weist KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen bei Aminosäuren 73 bis 74 und 134 bis 135 auf.
Natürlich vorkommende hek-L-Varianten werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung erfasst. Beispiele solcher Varianten sind Proteine, die aus alternativen mRNA-Spleißereignissen oder aus proteolytischem Spalten des hek-L-Proteins resultieren, wobei die Eigenschaft der hek-Bindung aufrechterhalten bleibt. Alternatives Spleißen von mRNA kann zu einem gestutzten, aber biologisch aktiven hek-L-Protein führen, wie zum Beispiel einer natürlich vorkommenden, löslichen Form des Proteins. Variationen, die auf Proteolyse zurückzuführen sind, schließen zum Beispiel Unterschiede in den N- oder C-Termini bei Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen aufgrund von proteolytischem Entfernen von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren aus dem hek-L-Protein ein (im Allgemeinen von 1 bis 5 terminale Aminosäuren). Signalpeptide können an unterschiedlichen Stellen in einem bestimmten Protein gespaltet werden, was zu Variationen der N-terminalen Aminosäure des reifen Proteins führt.
In einem Expressionssystem war die N-terminale Aminosäure eines hek-L-Proteins, das durch den Klon C6 codiert wird, Aminosäure 4 (Leu) von SEQ ID NO: 4. Eine Zubereitung eines löslichen hek-L-/Fc-Fusionsproteins, das aus Klon A2 gewonnen wurde, enthielt ein Gemisch aus Fusionsproteinen, welche die Aminosäure 12 (Asn) von SEQ ID NO: 2 als die N-terminale Aminosäure (ungefähr 60%) aufwiesen, und aus Fusionsproteinen, in denen die Aminosäure 1 (Leu) von SEQ ID NO: 2 die N-terminale Aminosäure war. Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind somit auf Proteine (lösliche oder membrangebundene) ausgerichtet, in denen die N-terminale Aminosäure eine beliebige der Aminosäuren 1 bis 4 von SEQ ID NO: 4 oder eine beliebige der Aminosäuren 1 bis 12 von SEQ ID NO: 2 ist.
Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes, wobei mehr als ein Codon dieselbe Aminosäure codieren kann, kann eine DNA-Sequenz von jener, die in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellt wird, abweichen und dennoch ein hek-L-Protein codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 aufweist. Solche varianten DNA-Sequenzen können aus stummen Mutationen (z. B. solchen, die während der PCR-Amplifizierung auftreten) resultieren und können das Produkt von absichtlicher Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
Die vorliegende Erfindung stellt somit isolierte DNA-Sequenzen bereit, die biologisch aktiven hek-L codieren, der ausgewählt wird aus: (a) DNA, die aus der codierenden Region eines nativen Säugetier-hek-L-Gens gewonnen wurde (z. B. cDNA, welche die codierende Region der Nukleotidsequenz enthält, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellt ist); und (b) DNA, welche als Folge des genetischen Codes zu einer DNA degeneriert ist, die in (a) definiert ist und die biologisch aktiven hek-L codiert. Die hek-L-Proteine, die durch diese DNA-Sequenzen codiert werden, werden durch die vorliegende Erfindung erfasst.
Die hek-L-DNA der vorliegenden Erfindung schließt cDNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR isolierte DNA, genomische DNA und Kombinationen davon ein. Genomische hek-L-DNA kann durch Hybridisierung an die cDNA von Klon A2 oder C6 unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden.
Überprüfung auf biologische Aktivität
Varianten, welche die Fähigkeit besitzen, an hek zu binden, können durch eine beliebige, geeignete Analyse identifiziert werden. Herkömmliche Überprüfungstechniken sind auch für die Analyse der hek-Bindungsaktivität eines nativen hek-L-Proteins nützlich. Die biologische Aktivität von hek-L kann zum Beispiel durch Konkurrenz in Bezug auf die Bindung an die ligandenbindende Domäne von hek (d. h. durch kompetitive Bindungsanalyse) bestimmt werden.
Eine An einer kompetitiven Bindungsanalyse für hek-L-Polypeptid verwendet einen radioaktiv markierten, löslichen humanen hek-L und intakte Zellen, welche Zellenoberflächen-hek exprimieren. Anstatt intakter Zellen könnte man lösliches hek (wie ein hek/Fc-Fusionsprotein), das an eine feste Phase durch eine Protein-A- oder Protein-G-Wechselwirkung gebunden ist, durch die Fc-Region des Fusionsproteins ersetzen. Eine andere Art der kompetitiven Bindungsanalyse verwendet radioaktiv markiertes, lösliches hek wie ein hek/Fc-Fusionsprotein und intakte Zellen, welche hek-L exprimieren. Alternativ dazu könnte löslicher hek-L an eine feste Phase gebunden werden.
Kompetitive Bindungsanalysen können mit Hilfe von Standardverfahren ausgeführt werden. Zum Beispiel kann radioaktiv markierter hek-L verwendet werden, um mit einem putativen hek-L-Homolog zu konkurrieren, um eine Prüfung in Bezug auf die Bindungsaktivität gegen oberflächengebundenes hek durchzuführen. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsanalysen erzielt werden, oder es können Scatchard-Plots verwendet werden, um quantitative Ergebnisse zu erhalten.
Alternativ dazu kann lösliches hek an eine feste Phase wie eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnliches Substrat gebunden werden, das für eine Analyse in Bezug auf die Gegenwart eines detektierbaren Anteils, wie ¹²⁵I-markierter hek-L, geeignet ist. Die Bindung an eine feste Phase kann zum Beispiel durch Binden eines hek/Fc-Fusionsproteins an eine Protein A oder Protein G enthaltende Matrix durchgeführt werden.
Die Bindungseigenschaften von hek-L (einschließlich Varianten) können ebenfalls mit Hilfe von markiertem, löslichem hek (zum Beispiel ¹²⁵I-hek/Fc) in Konkurrenzanalysen bestimmt werden, die den oben beschriebenen ähneln. In diesem Fall werden jedoch intakte Zellen, welche hek-L oder löslichen hek-L, der an ein festes Substrat gebunden ist, verwendet, um das Ausmaß zu messen, in dem eine Probe, die einen putativen hek-Varianten enthält, um die Bindung eines markierten, löslichen heks an hek-L konkurriert.
Eine bevorzugte Analyse zum Nachweis von hek-Bindungsaktivität eines membrangebundenen hek-L lautet wie folgt. Eine modifizierte, indirekte Bindungsanalyse wurde unter Verwendung des hek/Fc-Fusionsproteins, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, und des ¹²⁵I-markierten Maus-Antihuman-IgG-Fc-Antikörpers, der in Beispiel 3 beschrieben ist, entworfen, um direkte radioaktive Markierung von hek/Fc zu vermeiden. Zellen, die endogenen hek-L exprimieren (z. B. die CCRF-HSB-2-Zelllinie, die in Beispiel 2 beschrieben wird), werden unterschiedlichen Konzentrationen an hek/Fc ausgesetzt, gefolgt von einer konstanten sättigenden Konzentration des ¹²⁵I-Antikörpers wie folgt.
CCRF-HSB-2-Zellen werden in Suspensionskultur in 96 Vertiefungen aufweisenden Kulturplatten kultiviert. Die Zellen (2 × 10⁶ Zellen/Vertiefung) werden in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an hek/Fc in einem Bindungsmedium (RPMI 1640 Medium, 1% Rinderserumalbumin, 0,2% Natriumazid und 20 mM Hepes, pH-Wert 7,2) eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Danach werden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit ¹²⁵I-Maus-Antihuman-IgG-Fc (40 ng/ml) im Bindungsmedium bei leichtem Umrühren eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen und der ungebundene ¹²⁵I-Antikörper werden durch das Pthalatöltrennverfahren getrennt, im Wesentlichen so wie von Dower et al., J. Immunol. 132: 751 (1984) beschrieben.
Eine Analyse bezüglich hek/Fc-Bindung an Zellen, die rekombinanten, membrangebundenen hek-L exprimieren, kann wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt werden. Eine indirekte Bindungsanalyse wurde angewendet.
Eine bevorzugte Analyse zum Analysieren der hek-Bindungsaktivität von löslichem hek-L lautet wie folgt. Die Analyse ermittelt die Fähigkeit eines löslichen hek-L die Bindung eines hek/Fc-Fusionsproteins an die CCRF-HSB-2-Zelllinie zu hemmen, welche endogenen hek-L exprimiert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Konditionierter Überstand (Kulturmedium) aus CV-1/EBNA-Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der einen löslichen hek-L exprimiert, wird in einer 96-Vertiefungen-Platte titriert. Eine konstante Menge an hek/Fc (1 μg/Vertiefung) wird jeder Vertiefung hinzugefügt, gefolgt von 1–2 × 10⁶ CCRF-HSB-2-Zellen pro Vertiefung, im Bindungsmedium. Die Platte wird eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen, danach durch Zentrifugation pelletiert. ¹²⁵I-Maus-Antihuman-IgG-Fc wird jeder Vertiefung mit konstanter Konzentration hinzugefügt und die Platte eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. ¹²⁵I-Maus-Antihuman-IgG-Fc bindet an hek/Fc, das an die CCRF-HSB-2-Zellen band. Nach der letzten Inkubation werden die Zellen über Röhren geerntet, die Phthalatöl enthalten, um das gebundene und freie ¹²⁵I-Maus-Antihuman-IgG-Fc zu trennen. Die Radioaktivität wird unter Verwendung eines Gammazählers quantifiziert.
Verwendungen von hek-L
Der hek-L der vorliegenden Erfindung kann in einer Bindungsanalyse verwendet werden, um Zellen nachzuweisen, die hek exprimieren. Zum Beispiel kann hek-L oder die extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon zu einem nachweisbaren Anteil wie ¹²⁵I konjugiert werden. Die radioaktive Markierung mit ¹²⁵I kann durch ein beliebiges von mehreren Standardverfahren durchgeführt werden, welche ein funktionelles ¹²⁵I- hek-L-Molekül ergeben, das auf hohe spezifische Aktivität markiert ist. Alternativ dazu kann ein weiterer nachweisbarer Anteil, wie ein Enzym, das eine colorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren kann, Biotin oder Avidin verwendet werden. Zellen, die auf hek-Expression überprüft werden sollen, können mit markiertem hek-L in Kontakt gebracht werden. Nach der Inkubation wird ungebundener, markierter hek-L entfernt und das Binden unter Verwendung des nachweisbaren Anteils gemessen.
Die hierin offenbarten Liganden-Proteine können auch verwendet werden, um die biologische Aktivität von hek-Protein in Bezug auf die Bindungsaffinität für hek-L zu messen. Um dies zu veranschaulichen, kann hek-L in einer Bindungsaffinitätsstudie verwendet werden, um die biologische Aktivität eines hek-Proteins zu messen, das bei verschiedenen Temperaturen gelagert oder in unterschiedlichen Zelltypen erzeugt wurde. Somit kann die biologische Aktivität eines hek-Proteins bestimmt werden, bevor es zum Beispiel in einer Forschungsstudie verwendet wird.
hek-L-Proteine finden als Reagens Anwendung, das von den Verantwortlichen für „Qualitätssicherungsstudien" eingesetzt werden kann, z. B. um die Haltbarkeit und Stabilität des hek-Proteins unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. hek-Liganden können verwendet werden, um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach der Modifikation eines hek-Proteins aufrechterhalten wird (z. B. chemische Modifikation, Stutzen, Mutation usw.). Die Bindungsaffinität des modifizierten hek-Proteins für einen hek-L wird mit jener eines unmodifizierten hek-Proteins verglichen, um etwaige negative Auswirkungen der Modifikationen auf die biologische Aktivität von hek festzustellen.
Eine andere Verwendung eines hek-Liganden ist die als Reagens in Proteinreinigungsverfahren. hek-L oder hek-L/Fc-Fusionsproteine können mit Hilfe herkömmlicher Techniken an ein festes Trägermaterial geheftet und dazu verwendet werden, hek durch Affinitätschromatographie zu reinigen.
hek-L-Polypeptide finden auch als Träger Anwendung, um Wirkstoffe, die daran angeheftet sind, an Zellen abzugeben, die das hek-Zelloberflächen-Antigen tragen. Die Expression von hek-Antigen wurde bei bestimmten leukämischen Zelllinien beobachtet, einschließlich der humanen T-Zell-Leukämiezelllinien, die als JM und HSB-2 bezeichnet werden, und der humanen pre-B-Zell-Leukämiezelllinie, die als LK63 bezeichnet ist (Boyd et al., J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992, und Wicks et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89: 1611, 1992). hek-L-Proteine können somit verwendet werden, um diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe im Rahmen von in vitro oder in vivo Verfahren an diese Zellen abzugeben (oder an andere Zelltypen, bei denen festgestellt wurde, dass sie hek an der Zelloberfläche exprimieren).
Ein Beispiel einer solchen Verwendung besteht darin, eine hek⁺ leukämische Zelllinie einem therapeutischen Wirkstoff/hek-L-Konjugat auszusetzen, um festzustellen, ob der Wirkstoff gegenüber den Leukämiezellen Cytotoxizität aufweist. Eine Reihe von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen, die an hek-L angeheftet sind, können in einen Test aufgenommen werden, um den cytotoxischen Effekt der Wirkstoffe auf die Leukämiezellen nachzuweisen und zu vergleichen. hek-L-/Diagnosewirkstoff-Konjugate können verwendet werden, um die Gegenwart von hek⁺-Zellen in vitro oder in vivo zu erfassen.
Diagnostische und therapeutische Wirkstoffe, die an ein hek-L-Polypeptid angeheftet werden können, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Medikamente, Toxine, Radionuklide, Chromophore, fluoreszierende Verbindungen, Enzyme, die eine colorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren, und dergleichen ein, wobei der jeweilige Wirkstoff gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt wird. Beispiele für Medikamente sind solche, die in der Behandlung von verschiedenen Krebsformen verwendet werden, z. B. Stickstoffloste wie L-Phenylalaninstickstofflost oder Cyclophosphamid, interkalierende Wirkstoffe wie cis-Diaminodichloroplatinum, Antimetabolite wie 5-Fluoruracil, Vinca-Alkaloide wie Vincristine und Antibiotika wie Bleomycin, Doxorubicin, Daunorubicin und Derivate davon. Zu den Toxinen zählen Ricin, Abrin, Diphtheria-Toxin, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, ribosomale deaktivierende Proteine, Mycotoxine wie Trichothecene und Derivate und Fragmente (z. B. einzelne Ketten) davon. Zu den Radionukliden, die für eine diagnostische Verwendung geeignet sind, zählen – ohne darauf beschränkt zu sein – ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Radionuklide, die für eine therapeutische Verwendung geeignet sind, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu ein.
Solche Wirkstoffe können an hek-L mit Hilfe eines beliebigen, herkömmlichen Verfahrens angeheftet werden. Da es sich bei hek-L um ein Protein handelt, enthält es funktionelle Gruppen auf Aminosäure-Seitenketten, die mit funktionellen Gruppen auf einem gewünschten Wirkstoff zum Reagieren gebracht werden können, um zum Beispiel kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ dazu können das Protein oder der Wirkstoff derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive funktionelle Gruppe zu erzeugen oder anzuheften. Die Derivatisierung kann das Anheften von einem der bifunktionellen Kopplungsreagenzien einschließen, die für das Heften verschiedener Moleküle an die Proteine zur Verfügung stehen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Es sind eine Reihe von Techniken für die radioaktive Markierung von Proteinen bekannt. Radionuklidmetalle können zum Beispiel durch einen geeigneten bifunktionellen chelatisierenden Wirkstoff an hek-L geheftet werden.
Somit werden Konjugate, die hek-L und einen geeigneten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff (vorzugsweise kovalent gekoppelt) enthalten, zubereitet. Die Konjugate werden in einer Menge verabreicht oder auf andere Weise verwendet, die für die jeweilige Anwendung geeignet ist.
Wie in Beispiel 5 beschrieben, sind die hierin bereitgestellten hek-L-Proteine auch imstande, an einen Rezeptor zu binden, der als elk bekannt ist. Somit hat der hek-L zusätzliche Verwendungsmöglichkeiten, die von der elk-Bindungseigenschaft herrühren, analog zu jenen Verwendungen, die oben beschrieben wurden und von der hek-Bindungseigenschaft herrühren. hek-L kann verwendet werden, um elk in verschiedenen Analysen nachzuweisen. Ein Antikörper, der an hek bindet, kann – falls angebracht – in einer Analyse verwendet werden, um die Bindung von hek an hek-L zu blockieren, während er die Bindung von elk an hek-L erlaubt. hek-Liganden können verwendet werden, um die biologische Aktivität von elk-Proteinen in Bezug auf die Bindungsaffinität eines elk-Proteins oder eines Varianten davon für einen hek-L zu bewerten. hek-L-Proteine finden auch beim Reinigen von elk-Proteinen durch Affinitätschromatographie Anwendung.
hek-L-Oligomere
Die vorliegende Erfindung umfasst hek-L-Polypeptide in Form von Oligomeren wie Dimeren oder Trimeren. Oligomere können durch Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen hek-L-Polypeptiden gebildet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein hek-L-Dimer erzeugt, indem hek-L an die Fc- Region eines Antikörpers in einer Weise fusioniert wird, die das Binden von hek-L an die hek-Liganden-Bindungsdomäne nicht beeinträchtigt. Der Begriff „Fc-Polypeptid" schließt native und Mutein-Formen sowie gestutzte Fc-Polypeptide ein, welche die Hingeregion enthalten, welche Dimerisierung fördert. Das Fc-Polypeptid wird vorzugsweise an den C-Terminus eines löslichen hek-L (der nur die extrazelluläre Domäne enthält) fusioniert. Die Zubereitung von Fusionsproteinen, welche heterologe Polypeptide aufweisen, die an verschiedene Abschnitte von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert werden, wurden z. B. von Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991) und Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990) beschrieben, die hiermit zur Bezugnahme aufgenommen werden.
Eine Fusion des hek-L an ein Fc- oder Fc-Mutein-Polypeptid kann durch Verfahren hergestellt werden, die zu den Verfahren, die in Beispiel 1 für die Herstellung einer hek/Fc-Mutein-Fusion beschrieben werden, analog sind. Eine Genfusion, welche das hek-L/Fc-Fusionsprotein codiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt und in Wirtszellen transfiziert. Den exprimierten hek-L/Fc-Fusionsproteinen wird ermöglicht, sich zu assemblieren, ganz ähnlich wie Antikörpermoleküle, woraufhin sich Zwischenkettendisulfidbindungen zwischen Fc-Polypeptiden bilden, wodurch sich zweiwertiger hek-L ergibt. Alternativ dazu kann das native Fc-Polypeptid, aus welchem das Mutein abgeleitet ist, verwendet werden.
Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein hek-L-Oligomer mit bis zu vier hek-L extrazellulären Regionen zu bilden. Alternativ dazu können zwei lösliche hek-L-Domänen mit einem Peptidlinker wie jenen, die in der US-Patentschrift 5,073,627 beschrieben sind, gekoppelt werden.
In speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurde hek-L-DNA, die Aminosäuren –19 bis 202 von SEQ ID NO: 1 oder Aminosäuren –22 bis 157 von SEQ ID NO: 3 codiert, an das 5'-Ende der DNA fusioniert, welche das in Beispiel 1 beschriebene Fc-Mutein codiert, und in den Expressionsvektor pDC410 (in Beispiel 3 beschrieben) eingefügt. CV1-EBNA-1-Ze11en, die mit dem resultierenden, rekombinanten Expressionsvektor transfiziert sind, wurden kultiviert, um das lösliche hek-L/Fc-Fusionsprotein zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt Oligomere von hek-L extrazellulären Domänen oder Fragmenten davon bereit, die durch Disulfid-Wechselwirkungen gekoppelt sind oder als Fusionspolymere mit oder ohne Spacer-Aminosäurekopplungsgruppen exprimiert werden. Zum Beispiel kann ein Dimer der hek-L extrazellulären Domäne durch eine IgG-Fc-Region-Kopplungsgruppe verbunden werden.
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren für die Expression von hek-L und Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert werden, bereit. Es kann jedes beliebige geeignete Expressionssystem verwendet werden. Die Vektoren schließen eine hek-L-DNA-Sequenz ein, die wirkungsmäßig mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulatorischen Nukleotidsequenzen, wie jenen, die aus einem Säugetiergen, mikrobiellen, viralen oder Insekten-Gen gewonnen werden, verbunden ist. Beispiele für regulatorische Sequenzen schließen transkriptionale Promotoren, Operatoren oder Verstärker, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle und geeignete Sequenzen ein, welche den Start und das Ende von Transkription und Translation steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn die regulatorische Sequenz funktionell mit der hek-L-DNA in Beziehung steht. Somit ist eine Promotor-Nukleotidsequenz mit einer hek-L-DNA-Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der hek-L-DNA-Sequenz steuert. Die Fähigkeit, in den gewünschten Wirtszellen zu replizieren, die für gewöhnlich durch einen Replikationsursprung und ein Auswahl-Gen, durch welches Transformanten identifiziert werden, übertragen wird, kann zusätzlich in den Expressionsvektor aufgenommen werden.
Außerdem können Sequenzen, welche geeignete Signalpeptide codieren, die zum hek-L-Gen nicht nativ sind, in Expressionsvektoren aufgenommen werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) im Rahmen an die hek-L-Sequenz fusioniert werden, so dass der hek-L anfänglich als ein Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid enthält. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen funktionell ist, verstärkt die extrazelluläre Ausscheidung des hek-L-Polypeptids. Das Signalpeptid wird bei Ausscheiden von hek-L aus der Zelle aus dem hek-L-Polypeptid gespaltet.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von hek-L-Polypeptiden schließen Prokaryote, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen ein. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit zellulären bakteriellen, fungalen, Hefe- und Säugetierwirten werden zum Beispiel in Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um hek-L-Polypeptide unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet werden.
Zu den Prokaryoten zählen grammnegative und grammpositive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation schließen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen von Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie E. Coli kann ein hek-L-Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann aus dem exprimierten rekombinanten hek-L-Polypeptid abgespaltet werden.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen eines oder mehrere phänotypische selektierbare Markierungsgene auf. Ein phänotypisches selektierbares Markierungsgen ist zum Beispiel ein Gen, das ein Protein codiert, das antibiotische Resistenz überträgt oder das ein autotrophes Erfordernis bereitstellt. Beispiele nützlicher Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen schließen jene ein, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden gewonnen werden, wie der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit einfache Mittel für die Identifikation von transformierten Zellen bereit. Ein geeigneter Promotor und eine hek-L-DNA-Sequenz werden in den pBR322-Vektor eingefügt. Andere im Handel erhältliche Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein.
Promotorensequenzen, die häufig für rekombinante prokaryotische Wirtszellen-Expressionsvektoren verwendet werden, schließen β-Lactamase (Penicillinase), Lactosepromotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978: und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EP-A-36776) und tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982) ein. Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellenexpressionssystem verwendet einen Phagen-λP_L-Promotor und eine cI857ts thermolabile Repressorsequenz. Plasmidvektoren, die bei der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des λP_L-Promotors aufnehmen, schließen Plasmid pHUB2 (resident im E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (resident in E. coli RR1 (ATCC 53082)) ein.
hek-L kann alternativ dazu in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise aus der Gattung der Saccharomyces (z. B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen wie Pichia oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden oft einen Ursprung einer Replikationssequenz von einem 2 μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für eine Polyadenylisierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein selektierbares Markierungsgen enthalten. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden ferner in Hitzeman, EPA-73,657 beschrieben. Eine weitere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature, 300: 724, 1982) beschrieben wird. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können konstruiert werden, indem DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r Gen und Replikationsursprung) in die oben beschriebenen Hefevektoren eingefügt werden.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann verwendet werden, um die Sekretion des hek-L-Polypeptids zu leiten. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz eingefügt. Siehe z. B. Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984; US-Patentschrift 4,546,082 und EP 324,274 . Andere Leadersequenzen, die zur Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leadersequenz kann in der Nähe ihres 3'-Endes modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies erleichtert die Fusion der Leadersequenz an das strukturelle Gen.
Hefetransformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll wählt für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch Vektoren transformiert werden, welche eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können gezüchtet werden, um die Expression in einem „reichen" Medium herbeizuführen. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist ein Medium, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, ergänzt durch 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, besteht. Die De-Repression des ADH2-Promotors tritt ein, wenn Glucose aus dem Medium erschöpft ist.
Es könnten auch Säugetier- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme verwendet werden, um rekombinante hek-L-Polypeptide zu exprimieren. Baculovirussysteme zur Erzeugung heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) untersucht. Etablierte Zelllinien mit Säugetierursprung können auch verwendet werden. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), chinesische Hamstereierstockzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10)-Zelllinien sowie die CV-1/EBNA-1-Zelllinie ein, die aus der afrikanischen Grünaffennierenzelllinie CVI (ATCC CCL 70) gewonnen wird, so wie von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben.
Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen für Säugetierwirtszellen-Expressionsvektoren können aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Verstärkersequenzen werden aus dem Polyomavirus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalovirus gewonnen. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40-Viralgenom gewonnen werden, zum Beispiel der SV40- Ursprung, der frühe und späte Promotor, Verstärker, Spleiß- und Polyadenylisierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Sequenz eines strukturellen Gens in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zur BglI-Stelle erstreckt, die sich in der SV40 viralen Replikationsursprungsstelle befindet, ist enthalten.
Beispielhafte Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierwirtszellen können so konstruiert werden wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart. Ein nützliches System für stabile Hochexpression von Säugetier-cDNAs in C127 Mäuse-Mamma-Epithelzellen kann im Wesentlichen so wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, wurde als ATCC39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetierexpressionsvektoren werden in EP-A-0367566 und in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/701,415, eingereicht am 16. Mai 1991, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben. Die Vektoren können aus Retroviren gewonnen werden.
Anstelle der DNA, welche die native Signalsequenz codiert, kann der Vektor eine DNA enthalten, die eine heterologe Signalsequenz codiert. Beispiele schließen die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195; die Signalsequenz für Interleukin-2-Rezeptor, beschrieben in Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); das Interleukin-4-Signalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in der US-Patentschrift 4,968,607, und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 460,846 , ein.
Proteinreinigung
Die vorliegende Erfindung stellt im Wesentlichen homogenes hek-L-Protein bereit, das durch rekombinante Expressionssysteme wie oben beschrieben hergestellt oder aus natürlich vorkommenden Zellen gereinigt werden kann. Der hek-L wird auf wirkliche Homogenität gereinigt, wie durch ein Einzelproteinband bei Analyse mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) angezeigt.
Ein Verfahren zur Herstellung des hek-L-Proteins weist das Züchten einer Wirtszelle auf, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz enthält, welche hek-L unter Bedingungen codiert, unter denen hek-L exprimiert wird. Das hek-L-Protein wird dann in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionssystem aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten wiedergewonnen. Der Fachmann wird erkennen, dass Verfahren zur Reinigung des rekombinanten hek-L in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Typ der verwendeten Wirtszellen und in Abhängigkeit davon, ob der hek-L in das Kulturmedium ausgeschieden wird oder nicht, variieren werden.
Wenn zum Beispiel Expressionssysteme verwendet werden, welche das rekombinante Protein ausscheiden, kann das Kulturmedium zuerst mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrierungseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie ein Gelfiltrierungsmedium aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit überhängenden Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere, bei der Proteinreinigung häufig verwendete Arten sein. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt durchgeführt werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrixen ein, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Schritte unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z. B. Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um hek-L weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorhergehenden Reinigungsschritte können in unterschiedlichen Kombinationen durchgeführt werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, welche die ligandenbindende Domäne von hek enthält, um exprimierte hek-L-Polypeptide einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. hek-L-Polypeptide können aus einer Affinitätssäule in einem hohen Salz-Eluierungspuffer gewonnen und danach in einen niedrigeren Salzpuffer zur Verwendung dialysiert werden. Alternativ dazu kann die Affinitätssäule einen Antikörper aufweisen, der hek-L bindet. In einer weiteren Alternative weist eine Affinitätssäule ein hek/Fc-Fusionsprotein auf, das an eine Protein-A-Säule gebunden ist.
Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur erzeugt wird, wird für gewöhnlich durch anfängliches Zerreißen der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zellpellets, im Fall eines unlöslichen Polypeptids, oder aus der überstehenden Flüssigkeit, im Fall eines löslichen Polypeptids, isoliert, gefolgt von einer oder mehreren Schritten der Konzentration, des Aussalzens, Ionenaustauschs, der Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie. Schließlich kann die RP-HPLC für endgültige Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch ein beliebiges, geeignetes Verfahren zerrissen werden, einschließlich eines Gefrier-Auftau-Zyklus, einer Beschallung, mechanischen Zerreißens oder der Verwendung von Zelllysiermitteln.
Transformierte Hefe-Wirtszellen können verwendet werden, um hek-L als ein abgesondertes Polypeptid zu exprimierten. Abgesondertes, rekombinantes Polypeptid aus einer Hefe-Wirtszellenfermentation kann durch Verfahren gereinigt werden, die zu jenen analog sind, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart werden. Urdal et al. beschreiben zwei sequentielle, Umkehrphasen-HPLC-Schritte für die Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein hek-L-Polypeptid und einen physiologisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneimittelträger aufweisen. Solche Zusammensetzungen können Puffer, Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Sucrose oder Dextrine, chelatisierende Wirkstoffe wie EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Arzneimittelträger enthalten. Neutrale, gepufferte Salzlösung oder Salzlösung, die mit konspezifischem Serumalbumin gemischt ist, sind beispielhafte, geeignete Verdünnungsmittel.
Nukleinsäurefragmente
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Fragmente der hek-L-Nukleotidsequenzen, die hierin vorgestellt werden, bereit. Solche Fragmente enthalten wünschenswerter Weise mindestens ungefähr 30 Nukleotide der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellt wird. DNA- und RNA-Komplemente dieser Fragmente werden hierin gemeinsam mit Einzelstrang- und Doppelstrangformen der hek-L-DNA bereitgestellt.
Zu den Verwendungen dieser hek-L-Nukleinsäurefragmenten gehört die Verwendung als Sonde. Solche Sonden können in Kreuzspezies-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um hek-L-DNA von zusätzlichen Säugetier-Spezien zu isolieren. Als ein Beispiel kann eine Sonde, die der extrazellulären Domäne von hek-L entspricht, verwendet werden. Die Sonden werden auch für das Nachweisen der Gegenwart von hek-L-Nukleinsäuren im Rahmen von in-vitro-Analysen und in Verfahren wie Northern und Southern Blots verwendet. Zelltypen, welche den hek-L exprimieren, können identifiziert werden. Solche Verfahren sind wohl bekannt, und der Fachmann kann eine Sonde geeigneter Länge in Abhängigkeit von der speziellen, beabsichtigten Anwendung auswählen.
Andere, nützliche Fragmente der hek-L-Nukleinsäuren sind Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide, die eine Einzelstrang-Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die an Ziel-hek-L-mRNA- (Sinn) oder hek-L-DNA (Gegensinn)-Sequenzen binden kann. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung können ein Fragment der codierenden Region der hek-L-cDNA, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigt wird, oder das DNA- oder RNA-Komplement davon enthalten. Ein solches Fragment weist im Allgemeinen mindestens ungefähr 14 Nukleotide auf, vorzugsweise von ungefähr 14 bis ungefähr 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA- Sequenz für ein bestimmtes Protein zu schaffen, wird zum Beispiel in Stein und Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 und van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988 beschrieben.
Das Binden von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Doppelsträngen, welche die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) durch eines von mehreren Mitteln blockieren, einschließlich verstärktem Abbau der Doppelstränge, verfrühter Termination der Transkription oder Translation oder durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können daher verwendet werden, um die Expression von hek-L-Proteinen zu blockieren. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen ferner Oligonukleotide auf, welche modifizierte Zuckerphosphodiester-Backbones (oder andere Zuckerverbindungen wie die in W091/06629 beschriebenen) aufweisen, und wobei die Zuckerverbindungen endogenen Nukleasen gegenüber resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerverbindungen sind in vivo stabil (d. h. imstande, enzymatischem Abbau zu widerstehen), behalten aber die Sequenzspezifizität, um an Ziel-Nukleotidsequenzen binden zu können. Andere Beispiele von Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotiden schließen jene Oligonukleotide ein, die kovalent mit organischen Anteilen wie jenen, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und anderen Anteilen verbunden sind, welche die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, wie Poly-(L-Lysin) erhöhen. Außerdem können interkalierende Wirkstoffe wie Ellipticin und alkylierende Wirkstoffe oder Metallkomplexe an Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide angeheftet werden, um die Bindungsspezifizitäten des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids für die Ziel-Nukleotidsequenz zu ändern.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch ein beliebiges Gentransferverfahren eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren wie dem Epstein-Barr-Virus. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, vorzugsweise durch Einfügen des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt, wobei danach die Zelle mit dem Retrovirusvektor, der die eingefügte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo in Kontakt gebracht wird. Geeignete retrovirale Vektoren schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – jene ein, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, N2 (einem aus M-MuLV gewonnenem Retrovirus) oder den Doppelkopievektoren gewonnen werden, die mit DCTSA, DCTSB und DCTSC bezeichnet sind (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656).
Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, auch durch Bilden eines Konjugats mit einem ligandbindenden Molekül eingeführt werden, wie in WO 91/04753 beschrieben. Geeignete ligandbindende Moleküle schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden ein, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise führt die Konjugation des ligandbindenden Moleküls zu keiner wesentlichen Beeinträchtigung der Fähigkeit des ligandbindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ dazu kann ein Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes eingeführt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die folgenden Beispiele sind zur Illustration bestimmter Ausführungsformen vorgesehen und stellen keine Einschränkung des Erfindungsumfangs dar.
BEISPIEL 1: Herstellung von löslichem hek/Fc-Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein lösliches hek/Fc-Fusionsprotein codiert, zur Verwendung beim Isolieren von cDNA-Klonen, die einen hek-Liganden (hek-L) codieren. Eine DNA und codierte Aminosäuresequenz für humane hek-cDNA werden in Wicks et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1611, 1992) präsentiert, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Dieses hek-Protein weist (vom N- zum C-Terminus) eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne auf.
Zwei DNA-Fragmente, von denen eines ein N-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von hek und das andere ein C-terminales Fragment der extrazellulären hek-Domäne codiert, wurden durch Polymerasekettenreaktionen (PCR) isoliert, die unter Standardbedingungen durchgeführt worden sind, wobei Oligonukleotidprimer verwendet wurden, die auf der hek-Nukleotidsequenz beruhen, die von Wicks et al., supra, veröffentlicht wurde. Die Matrize für die PCR war cDNA, die aus der mRNA hergestellt wurde, die aus einer humanen T-Zell-Leukämiezelllinie isoliert wurde, die als CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) bezeichnet ist. Die PCR-Produkte, welche das 5'-Ende der hek-DNA enthalten, wurden mit SpeI und HindIII aufgeschlossen, um ein DNA-Fragment zu isolieren, das sich von dem 5'-Ende der reifen humanen hek-Sequenz (d. h. jener, der DNA fehlt, die die Signalsequenz codiert) bis zu einer HindIII-Stelle erstreckt, die in dem hek-Gen vorhanden ist. Die PCR-Produkte, welche das 3'-Ende der DNA der extrazellulären Domäne von hek enthalten, wurden mit HindIII und ClaI aufgeschlossen, um ein Fragment zu isolieren, das sich von der internen HindIII-Stelle zu einer ClaI-Stelle unmittelbar stromabwärts von dem 3'-Ende der Sequenz erstreckt, welche die extrazelluläre Domäne von hek codiert. Die ClaI-Stelle befindet sich in einer Mehrfachklonierungsstelle (mcs), die unmittelbar stromabwärts der extrazellulären Domäne eingefügt ist.
DNA, welche ein Mutein der Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers codiert, wurde isoliert. Diese Fc-Mutein-DNA und das dadurch codierte Polypeptid werden in der US-Patentschrift mit der Seriennummer 08/097,827 mit dem Titel „Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40", eingereicht am 23. Juli, 1993, beschrieben, wobei diese Anmeldung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Mutein-DNA wurde von einer DNA, die natives Fc-Polypeptid codiert, durch stellengerichtete Mutagenese abgeleitet, die im Wesentlichen so durchgeführt wurde wie von Deng und Nickoloff, Anal. Biochem. 200: 81 (1992) beschrieben. Die Aminosäuresequenz des Fc-Muteinpolypeptids ist mit jener des nativen Fc-Polypeptids identisch, das in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben ist, außer, dass die Aminosäure 19 von Leu zu Ala geändert, die Aminosäure 20 von Leu zu Glu und Aminosäure 22 von Gly zu Ala geändert wurde. Dieses Mutein-Fc weist reduzierte Affinität für Immunglobulin-Rezeptoren auf.
Ein rekombinanter Vektor, der die Fc-Mutein-DNA enthält, wurde mit ClaI und NotI gespaltet, welche den Vektor in einer Polylinkerregion unmittelbar stromaufwärts bzw. stromabwärts des Fc-Mutein-DNA-Inserts spalten. Das erwünschte FC-Mutein-codierende Fragment wurde isoliert.
Das Mutein-Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Hingeregion zum nativen C-Terminus, d. h. ist eine im Wesentlichen Volllängen-Antikörper-Fc-Region. Fragmente der Fc-Regionen, z. B. jene, die an dem C-terminalen Ende gestutzt sind, können ebenfalls verwendet werden. Die Fragmente enthalten vorzugsweise Mehrfachcysteinreste (mindestens die Cysteinreste in der Hingereaktion), um die Bildung von Zwischenkettendisulfidbindungen zwischen den Fc-Polypeptidabschnitten von zwei getrennten hek/Fc-Fusionsproteinen zu ermöglichen, wodurch Dimere geschaffen werden.
Ein Säugetier-Expressionsvektor, der als SMAG4 bezeichnet ist, wurde mit SpeI und NotI gespaltet. Der SMAG4-Vektor enthält eine Sequenz, die murines Interleukin-7-Signalpeptid codiert (beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195), wobei diese Sequenz in den Säugetier-Hochexpressionsvektor pDC201 (beschrieben in Sims et al., Science 241: 585, 1988 und in der PCT-Anmeldung WO 89/03884) eingefügt ist, welcher auch imstande ist, in E. coli zu replizieren. SpeI spaltet den Vektor unmittelbar stromabwärts der Sequenz, welche das IL-7-Signalpeptid codiert. NotI spaltet ungefähr 155 bp stromabwärts der SpeI-Stelle in einer Mehrfachklonierungsstelle des Vektors. Das große SpeI/NotI-Fragment, das die Vektorsequenzen und die IL-7-Signalpeptid-codierende DNA enthält, wurde isoliert.
Eine Vier-Wege-Ligation wurde durchgeführt, um die zwei hek-codierenden DNA-Fragmente und das Fc-Mutein-codierende DNA-Fragment, die oben beschrieben wurden, in den SpeI/NotI gespalteten SMAG4-Expressionsvektor einzufügen. E. coli-Zellen wurden mit dem Ligationsgemisch transfiziert und der gewünschte rekombinante Vektor daraus isoliert. Der isolierte Vektor codiert ein Fusionsprotein, welches (vom N-zum C-Terminus) das Maus-IL-7-Signalpeptid, die extrazelluläre hek-Domäne, vier durch die eingefügte mcs codierte Aminosäuren und das Fc-Mutein aufweist.
Der Expressionsvektor wurde danach mit Plasmid pSV3.NEO in CV1/EBNA-Zellen co-transfiziert. Die CV1/EBNA-Zelllinie (ATCC CRL 10478) wurde von einer Affennierenzellinie abgeleitet, so wie in McMahan et al. (EMBO J., 10: 2821, 191) beschrieben. Der Vektor pSV3.NEO exprimiert das SV40 T-Antigen, das nicht durch die Wirtszellen erzeugt wird. Der pSV3.NEO-Vektor ist ähnlich dem pSV3 (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981), aber enthält zusätzlich ein Neomycinresistenzgen. Die transformierten Zellen wurden gezüchtet, um eine transiente Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das in das Kulturmedium über das Maus-IL-7-Signalpeptid ausgeschieden wird. Das Fusionsprotein wurde auf einer Protein-A Sepharosesäule gereinigt, eluiert und verwendet, um Zellen auf ihre Fähigkeit, das hek/Fc-Protein zu binden, zu prüfen, so wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben.
BEISPIEL 2: Überprüfen von Zellen auf hek/Fc-Bindung
Verschiedene Zelltypen wurden auf die Fähigkeit, hek/Fc zu binden, untersucht, um Kandidaten-Zelltypen zu identifizieren, die als Nukleinsäurequellen bei einem Versuch, einen hek-Liganden zu klonieren, nützlich sind. Zellen wurden mit dem hek/Fc-Protein inkubiert, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, gefolgt von einem biotinyliertem Maus-Antihuman-Fc-Antikörper, gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin (Becton Dickinson). Die Zellen wurden zwischen den Schritten gewaschen, um ungebundene Reagenzien zu entfernen. Der biotinylierte Antikörper wurde bei Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, gekauft. Dieser Antikörper zeigte minimale Bindung an Fc-Proteine, die an den Fcγ-Rezeptor gebunden sind. Streptavidin bindet an das Biotinmolekül, das an den Antihuman-Fc-Antikörper geheftet ist, der wiederum an den Fc-Abschnitt des hek/Fc-Fusionsproteins bindet. Phycoerythrin ist ein fluoreszierendes Phycobiliprotein, welches als nachweisbare Markierung dient. Der Pegel des Fluoreszenzsignals wurde für jede Zellart unter Verwendung eines FACScan^®-Flusscytometers (Becton Dickinson) gemessen.
Eine humane T-Zell-Leukämiezelllinie, die als CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1) bezeichnet ist, war für hek/Fc-Bindung positiv. CCRF-HSB-2-Zellen wurden vier Mal durch FACS (fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren) sortiert, um Zellen zu gewinnen, die höhere Pegel an hek/Fc-Bindungsprotein exprimieren.
BEISPIEL 3: Isolation von hek-Ligand-cDNA
mRNA wurde von den vier Mal sortierten CCRF-HSB-2-Zellen isoliert, und Doppelstrang-cDNA wurde auf dem mRNA-Modell mit Hilfe standardmäßiger Techniken synthetisiert. Eine cDNA-Bibliothek wurde durch Verbinden der cDNA mit der BglII-Stelle von pDC410 mittels eines Adapter-Verfahrens hergestellt, das dem von Hymerle et al. (Nucl. Acids Res. 14: 8615, 1986) ähnlich ist. pDC410 ist ein Expressionsvektor, der pDC406 (McMahan et al., EMBO J., 10: 2821, 1991) ähnlich ist. In pDC410 wird der EBV-Replikationsursprung von pDC406 durch eine DNA ersetzt, welche das SV40 große T-Antigen (aus einem SV40-Promotor getrieben) ersetzt. Die pDC410-Mehrfachklonierungsstelle (mcs) unterscheidet sich von jener von pDC406 insofern, als sie zusätzliche Restriktionsstellen und drei Stoppcodone (einen in jedem Leserahmen) enthält. Ein T7-Polymerasepromotor stromabwärts der mcs erleichtert das Sequenzieren von DNA, die in die mcs eingefügt ist.
E. coli-Stamm-DH5α-Zellen, die mit der cDNA-Bibliothek in pDC410 transfiziert wurden, wurden auf Platten ausgestrichen, um ungefähr 2000 Kolonien pro Platte bereitzustellen. Die Kolonien wurden von jeder Platte gekratzt, zu einem Pool zusammengefasst, wobei von jedem Pool Plasmid-DNA hergestellt wurde. Die zu einem Pool zusammengefasste DNA, die ungefähr 2000 Kolonien darstellt, wurde danach verwendet, um eine sub-konfluente Schicht von CV1/EBNA-1-Zellen (in Beispiel 1 beschrieben) zu transfizieren. Vor der Transfektion wurden die CV1/EBNA-1-Zellen in vollständigem Medium gehalten (Dulbeccos modifizierte Eagle-Medien (DMEM), die 10% (v/v) fötales Kalbserum (FCS), 50 U/ml Penicillin, 50 U/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin enthalten) und mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung auf Einzel-Vertiefungs-Kammern-Objektträger (Lab-Tek) ausgestrichen. Die Transfektion umfasste DEAE-Dextran, gefolgt von Chloroquin-Behandlung, ähnlich dem Verfahren, das von Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11: 1295, 1983) und McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1986) beschrieben wird. Kurz gesagt, es wurden Objektträger mit 1 ml humanem Fibronectin (10 μg/ml in PBS) 30 Minuten lang vorbehandelt, gefolgt von 1 Waschung mit PBS. Die Medien wurden von der haftenden Zellschicht entfernt und mit 1,5 ml vollständigem Medium ersetzt, das 66,6 μM Chloroquinsulfat enthielt. 0,2 ml DNA-Lösung (2 μg DNA, 0,5 mg/ml DEAE-Dextran in vollständigem Medium, das Chloroquin enthält) wurden danach zu den Zellen hinzugefügt und 5 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Medien entfernt und die Zellen durch Zugabe von vollständigem Medium, das 10% DMSO enthielt, 2,5 bis 20 Minuten lang geschockt, gefolgt von Ersetzen der Lösung mit frischem, vollständigem Medium. Die Zellen wurden 2 bis 3 Tage lang kultiviert, um transiente Expression der eingefügten Sequenzen zu ermöglichen.
Transfizierte Monoschichten von CV1/EBNA-1-Zellen wurden auf Expression von hek-L durch das Objektträger-Autoradiographieverfahren von Gering et al. (EMBO J. 8.3667, 1989) wie folgt analysiert. Maus-Antihuman-Fc-Antikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) wurde durch das Chloramin-T-Verfahren zur Verwendung in der Analyse radiojodiert. Kurz gesagt, es wurde eine P6-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. In einem Microfuge-Röhrchen wurden 10 μg Antikörper in 10 μl PBS aufgelöst. 2000 μCi von trägerfreiem Na ¹²⁵I wurden hinzugefügt, und die Lösung wurde gut gemischt. 15 μl einer frisch zubereiteten Lösung von Chloramin-T (32 μg/ml in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2) wurden danach hinzugefügt und das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde unverzüglich auf die P6-Säule aufgebracht. Der radioaktiv markierte Antikörper wurde danach aus der Säule durch Sammeln von 100–150 μl-Fraktionen des Eluats eluiert. Bindungsmedien (RPMI 1640 mit 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes, pH-Wert 7,2) wurden zu Spitzenfraktionen hinzugefügt, um das Gesamtvolumen jeder Fraktion auf 2 ml zu bringen. Radiojodierung ergab spezifische Aktivitäten im Bereich von 5–10 × 10¹⁵ cpm/mmol Protein.
Objektträger-Autoradiographie wurde wie folgt ausgeführt. Transfizierte CV1/EBNA-1-Zellen (an Kammer-Objektträgern angeheftet) wurden einmal mit Bindungsmedium mit fettfreier Trockenmilch (BM-NFDM) (RPMI-Medium 1640 mit 25 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM HEPES, pH-Wert 7,2 und 50 mg/ml fettfreier Trockenmilch) gewaschen. Danach wurden die Zellen mit hek/Fc (in Beispiel 1 hergestellt) in BM-NFDM (1 μg/ml) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zell-Monoschichten in den Kammer-Objektträgern drei Mal mit BM-NFDM gewaschen, um ungebundenes hek/Fc- Protein zu entfernen, und danach mit 40 ng/ml ¹²⁵I-Maus-Antihuman-Fc-Antikörper (eine 1 : 50 Verdünnung) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden drei Mal mit BM-NFDM gewaschen, gefolgt von 2 Waschungen mit phosphatgepufferter Salzlösung, um ungebundenen ¹²⁵I-Maus-Antihuman-Fc-Antikörper zu entfernen. Die Zellen wurden durch 30 Minuten langes Inkubieren bei Raumtemperatur in 2,5% Glutaraldehyd in PBS, pH-Wert 7,3, fixiert, zwei Mal in PBS gewaschen und luftgetrocknet. Die Kammer-Objektträger, welche die Zellen enthalten, wurden auf einem Phophor-Imager (Molecular Dynamics) über Nacht exponiert, danach in Kodak GTNB-2 fotografischer Emulsion (6 × Verdünnung in Wasser) eingetaucht und 3 bis 5 Tage lang im Dunkeln bei 4°C in einer lichtgeschützten Kiste exponiert. Die Objektträger wurden danach ungefähr 4 Minuten in Kodak-D19-Entwickler (40 g/500 ml Wasser) entwickelt, in Wasser gespült und in Agfa G433C-Fixer fixiert. Die Objektträger wurden danach einzeln mit einem Mikroskop bei 25 bis 40-facher Vergrößerung überprüft, und positive Zellen, welche hek-L exprimieren, wurden durch die Gegenwart von autoradiographischen Silberkörnern vor einem hellen Hintergrund identifiziert.
Ungefähr 300.000 cDNAs wurden in Pools von ungefähr 2.000 cDNAs untersucht, um transfizierende Pools zu identifizieren, welche Mehrfachzellen aufweisen, die für hek/Fc-Bindung positiv sind. Ein positiver Pool wurde danach in Pools von 500 aufgeteilt und wiederum durch Objektträger-Autoradiographie untersucht. Ein positiver Pool wurde identifiziert, in Pools von 100 unterteilt und durch dasselbe Verfahren untersucht. Einzelne Kolonien von einem positiven Pool wurden untersucht, bis ein Einzelklon (Klon #A2), der Synthese eines Oberflächenproteins mit nachweisbarer hek/Fc-Bindungsaktivität ausrichtete, identifiziert wurde. Ein zweiter Klon, der als C6 bezeichnet wird, wurde von einem anderen, positiven Pool isoliert. Die cDNA-Inserts beider Klone wurden sequenziert.
Die Nukleotid- und codierten Aminosäuresequenzen der codierenden Region der Human-hek-Ligand-cDNA von Klon A2 sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellt. Das Protein weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –19 bis –1), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1–202) und eine C-terminale Domäne auf, welche eine hydrophobe Region (Aminosäuren 203–219) enthält.
Human-hek-L-cDNA wurde aus Klon A2 durch Aufschließen mit BglII ausgeschnitten. Die ausgeschnittene cDNA wurde in die BamHI-Stelle (in der Mehrfachklonierungsstelle) von pBLUESCRIPT^® SK(-)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) kloniert. Der resultierende Vektor (als A2/pBS bezeichnet) in E. coli-DH5α-Zellen wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) am 11. August 1993 hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ATCC 69384. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens.
Die Nukleotid- und codierten Aminosäuresequenzen der codierenden Region der Human-hek-Ligand-cDNA von Klon C6 werden in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellt. Das Protein weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –22 bis –1), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1 bis 160) und eine C-terminale Domäne auf, die eine hydrophobe Region (Aminosäuren 161 bis 179) enthält.
Human-hek-L-cDNA wurde aus Klon C6 durch Aufschließen mit BglII ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle von pBLUESCRIPT^® SK(-) eingefügt. Der resultierende Vektor (als C6/pBS bezeichnet) in den E. coli-DH5α-Zellen wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) am 25. August 1993 hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer ATCC 69395. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens.
Die oben beschriebenen Grenzen der Domänen der hek-L-Proteine sind annähernd, wie von Fachleuten anerkannt werden wird. Zum Beispiel weist das Signalpeptid in Bezug auf den hek-L, der durch Klon A2 codiert wird, höchstwahrscheinlich Aminosäuren –19 bis –1 auf, aber es ist möglich, dass Aminosäuren –19 bis 3 das Signalpeptid ausmachen. Somit kann Spalten des Signalpeptids zwischen Aminosäure –1 und 1 oder zwischen Aminosäuren 3 und 4 oder an beiden Positionen erfolgen. Die Begriffe „Signalpeptid" und „reifes Protein", so wie hierin in Bezug auf den vom Klon A2 codierten hek-L verwendet, sind so zu verstehen, dass sie beide Alternativen umfassen, sowie andere Alternativen, die hierin für hek-L-Polypeptide beschrieben werden, die von Klon A2 oder C6 codiert sind.
Es hat sich herausgestellt, dass die hek-L-Proteine, die durch Klon A2 und Klon C6 codiert werden, über Glycosyl-Phosphatidylinositol (GPI)-Gruppen an der Zellmembran haften. Somit wird angenommen, dass die hydrophoben Domänen Signale für GPI-Verankerung enthalten. Die Verarbeitung von Proteinen zur Durchführung von GPI-Verankerung, welche das Spalten von C-terminalen Sequenzen einschließt, ist oben beschrieben.
BEISPIEL 4: monoklonale Antikörper zu hek-L
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von monoklonalen Antikörpern zu hek-L. hek-L wird in Säugetier-Wirtszellen wie COS-7- oder CV-1/EBNA-1-Zellen exprimiert und unter Verwendung von hek/Fc-Affinitätschromatographie gereinigt. Gereinigter hek-L (oder ein Fragment davon, wie die extrazelluläre Domäne oder immunogene Peptidfragmente davon) können verwendet werden, um monoklonale Antikörper gegen Hk-L unter Anwendung herkömmlicher Techniken, zum Beispiel jener Techniken, die in der US-Patentschrift 4,411,993 beschrieben werden, zu erzeugen. Kurz gesagt, Mäuse werden mit hek-L als Immunogen immunisiert, der in komplettem Freund-Adjuvans emulgiert ist und in Mengen von 10 bis 100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert wird. Zehn bis zwölf Tage später erhalten die immunisierten Tiere eine Auffrischungsinjektion mit zusätzlichem hek-L, der in unvollständigem Freund-Adjuvans emulgiert ist. Danach erhalten die Mäuse im Rahmen eines wöchentlichen bis zweiwöchentlichen Immunisierungsplans periodische Auffrischungsinjektionen. Serumproben werden periodisch durch retro-orbitales Bluten oder Schwanzspitzenschneiden zur Überprüfung mittels Dot-Blot-Test oder ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) auf hek-L Antikörper untersucht.
Nach dem Entdecken eines geeigneten Antikörper-Titers erhalten positive Tiere eine letzte intravenöse Injektion von hek-L in Salzlösung. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, Milzzellen geerntet, wobei die Milzzellen an eine Maus-Myeloma-Zelllinie fusioniert werden, z. B. NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Die Fusionen erzeugen Hybridomazellen, die in Mehrfach-Microtiterplatten in einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) selektiven Medium plattiert werden, um die Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomahybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomazellen werden mit Hilfe von ELISA auf Reaktivität gegen gereinigtes hek-L durch Anpassungen der in Engvall et al., Immunochem. 8: 871, 1971 und in der US-Patentschrift 4,703,004 offenbarten Techniken untersucht. Eine bevorzugte Untersuchungstechnik ist die Antikörper-Fangtechnik, die in Beckmann et al., (J. Immunol. 144: 4212, 1990) beschrieben wird. Positive Hybridomazellen können intraperitoneal in gen-identische BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Asciten zu erzeugen, die hohe Konzentrationen an Anti-hek-L monoklonalen Antikörpern enthalten. Alternativ dazu können Hybridomazellen in vitro in Glaskolben oder sich drehenden Flaschen durch verschiedene Techniken gezüchtet werden. Monoklonale Antikörper, die in Maus-Asciten produziert werden, können durch Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von einer Gel-Ausschlusschromatographie, gereinigt werden. Alternativ dazu kann auch eine Affinitätschromatographie auf der Basis des Bindens von Antikörper gegenüber Protein A oder Protein G verwendet werden, ebenso wie eine Affinitätschromatographie auf der Basis des Bindens an hek-L.
BEISPIEL 5: Bindungsstudien
Die Affinität der hek-Liganden der vorliegenden Erfindung für hek wurde bestimmt. Es stellte sich auch heraus, dass die hek-Liganden an eine Rezeptor-Tyrosinkinase binden, die als elk bekannt ist und die sich von hek unterscheidet. Die Fähigkeit bestimmter anderer Proteine, an hek oder elk zu binden, wurde ebenfalls untersucht. Diese Untersuchungen wurden wie folgt durchgeführt.
a) hek-Bindung
CV1-EBNA-1-Zellen (in Beispiel 1 beschrieben) in 12-Vertiefungen-Platten (2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) wurden mit Klon A2 oder C6 transfiziert (Klon A2 cDNA oder Klon C6 cDNA in Expressionsvektor pDC410, wie in Beispiel 3 beschrieben). Die transfizierten Zellen wurden zwei Tage lang kultiviert, um die Expression der hek-L-Proteine zu ermöglichen, die auf der Zellmembran zurückgehalten wurden. Danach wurden die Zellen mit BM-NFDM (siehe Beispiel 3) gewaschen und mit verschiedenen Konzentrationen des Human-hek/Fc-Fusionsproteins, das in Beispiel 1 hergestellt wird, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und mit dem ¹²⁵I-markierten Maus-Antihuman-IgG-Antikörper, hergestellt in Beispiel 3 (40 ng/ml), in einem Bindungsmedium unter leichtem Umrühren 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Trypsinierung geerntet. In allen Analysen wurde nicht-spezifisches Binden des ¹²⁵I-Antikörpers in Abwesenheit von hek/Fc sowie in Gegenwart von hek/Fc und einem 200-fachen molaren Überschuss von unmarkiertem, Maus-Antihuman-IgG-Antikörper untersucht. Freier und zellgebundener ¹²⁵I-Antikörper wurden auf einem Packard-Autogamma-Zähler quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) wurden auf RS/1 (BBN Software, Boston, MA)-Lauf auf einem Microvax-Computer erzeugt. CV1-EBNA-1-Zellen, die mit einem „leeren" pDC410-Vektor transfiziert sind, wurden in derselben Bindungsstudie als Kontrolle aufgenommen.
hek-/Fc-Bindung an CV1-EBNA-1-Ze11en, welche zwei unterschiedliche rekombinante Proteine, Human-elk-L und Human-B61, exprimieren, wurde ebenfalls in dem oben beschriebenen Experiment analysiert. Die Zellen wurden mit elk-Ligand (elk-L) oder B61-cDNA im Vektor pDC410 transfiziert. Die exprimierten Proteine waren zellmembrangebunden.
Elk-L bindet an einen Rezeptor, der als elk bekannt ist und der, wie hek, ein Mitglied der eph/elk-Familie von Rezeptor-Tyrosinkinasen ist (siehe „Hintergrund der Erfindung" Abschnitt, oben). elk-L wurde in diese Studie aufgenommen, um zu untersuchen, ob er an einen anderen Rezeptor derselben Familie (d. h. hek) binden würde oder nicht. Das als B61 bekannte Protein wurde als das Produkt eines neuartigen Sofort-Früh-Reaktionsgens identifiziert, das durch TNF in humanen Nabelvenen-Endothelzellen (Holzman et al., Mol. Cell. Biol. 10: 5830, 1990) herbeigeführt wurde. B61 wurde aufgrund des Homologiegrads in Bezug auf elk-L (33% Identität auf Aminosäure-Ebene) in die Studie aufgenommen.
Die Nukleotidsequenz von isolierter B61-cDNA und die Aminosäuresequenz, die dadurch codiert wird, sind in Holzman et al., supra, präsentiert, das hiermit zur Gänze durch Bezugnahme aufgenommen wird. Verfahren zur Herstellung und Wiedergewinnung von B61 werden ebenfalls gemeinsam mit bestimmten Struktureigenschaften und Proteineigenschaften beschrieben. Nukleotid- und codierte Aminosäuresequenzen für elk-L-cDNA werden in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/977,693, eingereicht am 13. November 1992 beschrieben, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Herstellung und Reinigung von elk-L werden ebenfalls beschrieben, und bestimmte funktionelle Domänen des Proteins werden identifiziert. E. coli-DH5α- Zellen, die mit Human-elk-L-cDNA transformiert wurden, die in die SmaI-Stelle (in der mcs) des Klonierungsvektors pBLUESCRIPT^®SK (Stragene, La Jolla, CA) eingefügt ist, wurden am 9. Oktober 1992 als ATCC 69085 hinterlegt.
Die Ergebnisse der Studie lauteten wie folgt:
TABELLE I
Der leere Vektor wies keine nachweisbare hek/Fc-Bindung auf. B61 band hek/Fc mit relativ moderater Affinität und wies eine einzelne Affinitätsbindungsklasse auf. Das Binden von hek/Fc an elk-L führte zu einem zweiphasischen Muster, wodurch zwei Niedrigaffinitäts-Bindungskomponenten angezeigt wurden (Affinitätskonstanten 2,3 × 10⁷ M^–1 und 2,9 × 10⁶ M^–1). Die Affinitäten der zwei hek-L-Proteine für hek/Fc waren äquivalent und relativ hoch.
b) elk-Bindung
Die oben beschriebene Bindungsanalyse wurde wiederholt, wobei ein lösliches Ratten-elk/Fc-Fusionsprotein gegen das hek/Fc-Fusionsprotein ausgetauscht wurde. Nukleotid- und codierte Aminosäuresequenzen für Ratten-elk werden in Lhotak et al. präsentiert (Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991). Das elk/Fc-Fusionsprotein wies die extrazelluläre Domäne des elks, das an ein Polypeptid einer nativen Fc-Region, die von einem Human-IgG1-Antikörper gewonnen wurde, fusioniert war, auf. Die indirekte Analyse (unter Verwendung von unmarkiertem elk/Fc und radiojodiertem Maus- Antihuman-IgG-Antikörper) wurde verwendet, weil direkte radioaktive Markierung von elk/Fc dessen Bindungsspezifizität deaktivierte.
Die Ergebnisse der Studie waren wie folgt:
TABELLE II
Ein zweiphasisches elk/Fc-Bindungsmuster wurde für B61 mit K_as von 2,3 × 10⁸ M^–1 und 7,0 × 10⁷ M^–1 beobachtet. Die Affinitätskonstante (K_a), die für elk/Fc-Bindung an transfizierte Zellen, die elk-L exprimieren, gezeigt wird, passt gut zu jenen, die für das Binden von elk/Fc an den nativen Liganden beobachtet wurden, der auf verschiedenen Ratten-Neuralzelllinien exprimiert wird. Ein zweiphasisches Muster von elk/Fc-Bindung lässt sich für beide hek-Liganden feststellen.
BEISPIEL 6: Homologie
Die auf die Aminosäure-Ebene bezogene Homologie des humanen elk-L voller Länge, B61, hek-Liganden A2 und der hek-Liganden-C6-Proteine (in Beispiel 5 beschrieben) untereinander sind in Tabelle III dargestellt:
TABELLE III % Aminosäure-Identität
Die prozentuelle Identität der DNA-Sequenzen werden in Tabelle IV dargestellt:
TABELLE IV % DNA-Identität
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, welche ein Hek-Liganden-(Hek-L)-Polypeptid codiert, das imstande ist, an Hek zu binden, wobei der Hek-L eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 80% mit der Sequenz der Reste 1–219 von SEQ ID NO: 2 identisch ist.
Isolierte DNA nach Anspruch 1, wobei das Hek-L-Polypeptid entweder die Aminosäuresequenz der Reste 1–202 oder der Reste 1–219 von SEQ ID NO: 2 enthält.
Isolierte DNA, welche ein Hek-L-Polypeptid codiert, das imstande ist, an Hek zu binden, wobei der Hek-L eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mindestens zu 80% mit der Sequenz der Reste 1–179 von SEQ ID NO: 4 identisch ist.
Isolierte DNA nach Anspruch 3, wobei das Hek-L-Polypeptid entweder die Aminosäuresequenz der Reste 1–160 oder der Reste 1–179 von SEQ ID NO: 4 enthält.
Isolierte DNA, welche ein Hek-L-Polypeptid codiert, wobei das Hek-L-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die a) aus Aminosäuren z bis x von SEQ ID NO: 2 besteht, wobei z eine Aminosäure an den Positionen 1 bis 12 von SEQ ID NO: 2 und x eine Aminosäure an den Positionen 193 bis 219 von SEQ ID NO: 2 ist; oder b) aus Aminosäuren z' bis y von SEQ ID NO: 4 besteht, wobei z' eine Aminosäure an den Positionen 1 bis 4 von SEQ ID NO: 4 und y eine Aminosäure an den Positionen 147 bis 179 der SEQ ID NO: 4 ist.
Isolierte DNA, welche a) eine DNA ist, die ein Fragment des Hek-L-Polypeptids von SEQ ID NO: 2 codiert, oder b) eine DNA ist, die ein Fragment des Hek-L-Polypeptids von SEQ ID NO: 4 codiert, wobei das Fragment imstande ist, an Hek zu binden.
Expressionsvektor, der eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Hek-L-Polypeptids, welches das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 7 unter Bedingungen transformiert ist, welche die Expression des Hek-L-Polypeptids fördern, und das Rückgewinnen des Hek-L-Polypeptids aus der Kultur aufweist.
Isolierte DNA, welche ein Fusionsprotein codiert, das einen löslichen Hek-L, der imstande ist, an Hek zu binden, und ein Fc-Polypeptid aufweist, wobei der Hek-L eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens zu 80% mit einer Sequenz identisch ist, die entweder aus den Aminosäuren 1–202 von SEQ ID NO: 2 oder den Aminosäuren 1–160 von SEQ ID NO: 4 besteht.
Expressionsvektor, der eine DNA nach Anspruch 9 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Hek-L/Fc-Fusionsproteins, welches das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 10 unter Bedingungen transformiert ist, welche die Expression des Hek-L/Fc-Fusionsproteins fördern, und das Rückgewinnen des Hek-L/Fc-Fusionsproteins aus der Kultur aufweist.
Gereinigtes Hek-L-Polypeptid, das imstande ist, an Hek zu binden, wobei der Hek-L eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 80% mit der Sequenz der Reste 1–219 von SEQ ID NO: 2 identisch ist.
Hek-L nach Anspruch 12, wobei der Hek-L entweder die Aminosäuresequenz der Reste 1–202 oder der Reste 1–219 von SEQ ID NO: 2 enthält.
Gereinigtes Hek-L-Polypeptid, das imstande ist, an Hek zu binden, wobei der Hek-L eine Aminosäuresequenz enthält, welche mindestens zu 80% mit der Sequenz der Reste 1–179 von SEQ ID NO: 4 identisch ist.
Hek-L nach Anspruch 14, wobei der Hek-L entweder die Aminosäuresequenz der Reste 1–160 oder der Reste 1–179 von SEQ ID NO: 4 enthält.
Gereinigtes Hek-L-Polypeptid, wobei das Hek-L-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die a) aus Aminosäuren z bis x von SEQ ID NO: 2 besteht, wobei z eine Aminosäure an den Positionen 1 bis 12 von SEQ ID NO: 2 und x eine Aminosäure an den Positionen 193 bis 219 von SEQ ID NO: 2 ist; oder b) aus Aminosäuren z' bis y von SEQ ID NO: 4 besteht, wobei z' eine Aminosäure an den Positionen 1 bis 4 von SEQ ID NO: 4 und y eine Aminosäure an den Positionen 147 bis 179 von SEQ ID NO: 4 ist.
Gereinigtes Hek-L-Polypeptid, welches a) ein Hek-L-Polypeptid ist, das Reste 1–219 von SEQ ID NO: 2 aufweist, b) ein Hek-L-Polypeptid ist, welches Reste 1–179 von SEQ ID NO: 4 aufweist, oder c) ein Fragment eines Hek-L-Polypeptids von (a) oder (b) ist, wobei das Fragment imstande ist, an Hek zu binden.
Hek-L-Protein, das durch das Hek-L-cDNA-Insert des rekombinanten Vektors, der in den transformierten Zellen enthalten ist, welche entweder als ATCC 69384 hinterlegte transformierte Zellen oder als ATCC 69395 hinterlegte transformierte Zellen sind.
Fusionsprotein, das durch eine DNA nach Anspruch 9 codiert ist.
Antikörper, der mit einem Hek-L-Polypeptid nach Anspruch 13 oder 15 oder mit einem immunogenen Fragment des Hek-L immunoreaktiv ist.
Antikörper nach Anspruch 20, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz von mindestens 30 Nukleotiden der codierenden Region der DNA-Sequenz entweder von SEQ ID NO: 1 oder der DNA oder des RNA-Komplements davon oder von SEQ ID NO: 3 oder der DNA oder des RNA-Komplements davon enthält.
Oligomer, das zwei bis vier lösliche Hek-L-Polypeptide enthält, die imstande sind, an Hek zu binden, wobei die löslichen Hek-L-Polypeptide jeweils eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens zu 80% mit einer Sequenz identisch ist, die entweder aus Aminosäuren 1–202 von SEQ ID NO: 2 oder aus Aminosäuren 1–160 von SEQ ID NO: 4 besteht.
Oligomer, das zwei bis vier lösliche Hek-L-Polypeptide enthält, die imstande sind, an Hek zu binden, wobei die löslichen Hek-L-Polypeptide jeweils eine Aminosäuresequenz aufweisen, die a) aus Aminosäuren z bis x' von SEQ ID NO: 2 besteht, wobei z eine Aminosäure an den Positionen 1 bis 12 von SEQ ID NO: 2 und x' eine Aminosäure an den Positionen 193 bis 202 von SEQ ID NO: 2 ist, oder b) aus Aminosäuren z' bis y' von SEQ ID NO: 4 besteht, wobei z' eine Aminosäure an den Positionen 1 bis 4 von SEQ ID NO. 4 und y' eine Aminosäure an den Positionen 147 bis 160 von SEQ ID NO: 4 ist.