ES2273438T3 - Citoquina denominada lerk-6. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de DNA aislada seleccionada del grupo que consiste en: a) DNA que codifica un polipéptido que se une a la tirosina quinasa receptora hek/elk y que comprende los aminoácidos 1 a 184 del Nº ID SEC: 10; b) DNA humano que es el complemento de DNA humano que se hibrida bajo condiciones altamente restrictivas al DNA de (a), en donde el DNA humano que es el complemento codifica un polipéptido que se une a hek/elk; c) DNA que, debido a la degeneración del código genético, codifica un poli- péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el DNA de (a) o (b).
Description
Citoquina denominada LERK-6.
La presente invención se refiere a polipéptidos
de citoquina denominados LERK-6 que se unen al
receptor hek o elk, los ácidos nucleicos que codifican tales
polipéptidos, a procedimientos para la producción de polipéptidos de
LERK-6 recombinantes y a composiciones farmacéuticas
que contienen tales polipéptidos.
Las proteínas conocidas como las tirosina
quinasas receptoras tienen una actividad de quinasa
intrínseca que se activa al unirse a ligandos. Esta clase de
proteínas se caracteriza por motivos estructurales conservados
dentro de los dominios catalíticos (Hanks y otros, Science,
242:42, 1988) y pueden subdividirse en familias basándose en
las características estructurales de las regiones
N-terminales del dominio catalítico.
Boyd y otros (J. Biol. Chem.,
267:3262, 1992) purificaron una glicoproteína de la
superficie celular que exhibía actividad de tirosina quinasa. La
secuencia de aminoácidos identificaba a esta proteína como un
miembro de la familia eph/elk y la proteína se denominó así
hek (quinasa similar a eph/elk humana). Un anticuerpo
monoclonal inmunorreactivo con hek se usó para estudiar la expresión
de hek sobre un número de tipos de células humanas (Boyd y otros,
anteriormente). El antígeno para hek se detectó en la línea celular
de pre-leucemia de células B humana LK63 (la línea
celular empleada como el inmunógeno contra el que se producía el
anticuerpo) y la línea celular de leucemia de células T humana, JM.
La línea celular de linfoma B de Raji mostraba una débil expresión
del antígeno de hek y las restantes líneas celulares probadas
(líneas celulares tanto normales como tumorales, entre las que
estaban líneas celulares hemopoyéticas que incluían líneas celulares
pre-B y T) eran consecuentemente negativas. De los
especímenes de biopsias de tejidos normales y tumorales que también
se probaban con respecto a la expresión del antígeno de hek, ninguno
de los tejidos normales era positivo y solo una proporción muy baja
de los tumores hemopoyéticos era positiva.
La expresión de transcritos de hek en las líneas
celulares LK63 y JM descritas anteriormente, así como la línea
celular de leucemia de células T humana HSB-2, se ha
demostrado mediante análisis de transferencia Northern (Wicks y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos para un clon de cDNA de hek
aislado se presentan en Wicks y otros, anteriormente.
La proteína de la superficie celular denominada
elk es otro miembro de la familia de proteínas receptora de
tirosina quinasas relacionadas con eph. Un clon parcial de elk se
descubrió en primer lugar en la biblioteca de expresión de cDNA de
cerebro de rata que se rastreaba con respecto a proteínas que
expresaban actividad de tirosina quinasa (Letwin y otros,
Oncogene 3:621, 1988). Más tarde, una secuencia
compuesta que abarcaba toda la región de codificación de elk se
derivó de clones parciales aislados de una biblioteca de cDNA de
cerebro de rata y una biblioteca de cerebro cerebelar de rata usando
el clon parcial como una sonda (Lhotak y otros, Mol. Cell.
Biol. 11:2496,
1991).
1991).
Las proteínas hek y elk están estrechamente
relacionadas con un número de otras tirosina quinasas receptoras,
incluyendo los homólogos de hek (Sajjadi y otros. New Biol.
3:769, 1991); eek (Chan y otros, Oncogene
6:1057, 1991); erk (Chan y otros, anteriormente), eck
(Lindberg y otros, Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990);
cek5 (Pasquale, E. B., Cell Regulation 2:523, 1991) y
eph (Hirai y otros, Science 238:1717, 1987). Las
proteínas de esta subfamilia están relacionadas no solo en sus
dominios citoplásmicos, sino también en sus dominios
extracelulares, que son de 41 a 68% idénticos. De forma interesante,
las distribuciones en los tejidos de estos varios receptores son
diversas. Por ejemplo, se ha presentado que la expresión de mRNA de
elk está limitada a los testículos y el cerebro (Lhotak y otros,
anteriormente), mientras que eck se encuentra no solo en estos dos
mismos tejidos sino también en pulmón, intestino, riñón, bazo,
ovario y piel. Además, la mayoría de los receptores relacionados
con eph se expresan principalmente en el cerebro. Debido a la
homología de los receptores en la familia eph, un ligando dado para
un receptor específico también puede unirse a otros receptores.
Los ligandos que se han identificado para las
tirosina quinasas receptoras son un grupo diverso de proteínas que
afectan al crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de
células que expresan los receptores. Se han aislado ligandos para
hek y elk, según se analiza con más detalle posteriormente.
WO 96/10911 se refiere a polipéptidos de
citoquina murinos de LERK-6 que se unen al receptor
hek o elk y ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos.
La identificación de ligandos adicionales para
hek y elk que puede existir resultaría útil para investigar la
naturaleza de procesos celulares regulados por la señalización a
través de estos receptores. Si se desea una potenciación o una
inhibición de una señal biológica particular mediada a través de
estos receptores, es ventajoso identificar cada una de las
proteínas que representan un papel en la transducción de tales
señales. Por otra parte, se sabe que ciertas proteínas pueden
unirse a receptores sin iniciar la transducción de la señal,
incluyendo proteína antagonista de receptor de
interleuquina-1 (Eisenberg y otros, Nature
343:341, 1990; Hannum y otros, Nature 343:336,
1990 y Carter y otros, Nature 344:633, 1990). La
identificación de proteínas adicionales que se unen a hek o elk
también es deseable para determinar si tales proteínas funcionan
como antagonistas.
La presente invención trata de
LERK-6 de mamífero como una proteína aislada u
homogénea. Además, la invención se dirige a DNAs aislados que
codifican LERK-6 de mamífero y a vectores de
expresión que comprenden un cDNA que codifica
LERK-6 de mamífero. Dentro del alcance de esta
invención están células huésped que se han transfectado o
transformado con vectores de expresión que comprenden un cDNA que
codifica LERK-6, y procedimientos para producir
LERK-6 cultivando tales células huésped bajo
condiciones que conducen a la expresión de
LERK-6.
Además, LERK-6 puede unirse a
una matriz en fase sólida o usarse para purificar por afinidad o
separar células que expresan hek o elk sobre su superficie celular.
La invención abarca separar células que tienen el receptor de hek o
elk sobre la superficie de las mismas y una mezcla de células en
solución, comprendiendo poner en contacto las células en la mezcla
con una superficie de contacto que tiene una molécula de
LERK-6 sobre la misma, y separar la superficie de
contacto y la solución.
Para comparación, un cDNA que codifica
LERK-6 murino se ha aislado y se describe en el Nº
ID SEC: 1. Un exón del LERK-6 humano se ha aislado
y se describe en el Nº ID SEC: 7. DNA que codifica un
LERK-6 humano de longitud completa se ha aislado y
se describe en el Nº ID SEC: 9. Este descubrimiento de un cDNA que
codifica LERK-6 permite la construcción de vectores
de expresión que comprenden cDNAs que codifican
LERK-6; células huésped transfectadas o
transformadas con los vectores de expresión; LERK-6
biológicamente activo como proteínas homogéneas; y anticuerpos
inmunorreactivos con LERK-6.
El LERK-6 puede ser útil en la
potenciación, la estimulación, la proliferación o el crecimiento de
células que expresan el receptor hek o elk. Puesto que el receptor
hek o elk se encuentra en el tejido del cerebro y los testículos,
es posible el tratamiento de una variedad de estados asociados con
el daño tisular de los mismos. Por otra parte, el complejo de
ligando y receptor puede estar implicado en el crecimiento, el
desarrollo y/o el mantenimiento neural. Aunque no se limita a
estos, usos particulares del LERK-6 se describen
posteriormente.
Según se usa aquí, el término
"LERK-6" se refiere a un género de polipéptidos
que se unen y se complejan independientemente con receptor hek o
elk encontrado en células T y células cerebrales. El término
"LERK-6" abarca polipéptidos que tienen la
secuencia de aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 2 que
se proporciona para comparación, proteínas que son codificadas por
ácidos nucleicos que contienen la secuencia de ácido nucleico del Nº
ID SEC: 7 y polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos
1-184 del Nº ID SEC: 10. Además,
LERK-6 abarca polipéptidos que tienen un alto grado
de similitud o un alto grado de identidad con la secuencia de
aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 2 que se
proporciona para comparación, la secuencia de aminoácidos del Nº ID
SEC: 8 y los aminoácidos 1-184 del Nº ID SEC: 10, y
cuyos polipéptidos son biológicamente activos y se unen al receptor
hek o elk. Además, el término "LERK-6 murino"
se refiere a productos génicos biológicamente activos del DNA del Nº
ID SEC: 1 y el término "LERK-6 humano" se
refiere a productos génicos biológicamente activos del DNA del Nº ID
SEC: 9. También son abarcadas por el término
"LERK-6" proteínas conectadas a GPI (que
incluyen una región extracelular y una región hidrófoba
C-terminal) y proteínas solubles o truncadas que
comprenden principalmente la porción que se une al receptor de la
proteína, retienen actividad biológica y son capaces de secretarse.
Ejemplos específicos de tales proteínas solubles son los que
comprenden la secuencia de aminoácidos 1 (Ala)-145
(Asn) del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación y los
que comprenden la secuencia de aminoácidos 1-145 del
Nº ID SEC: 10.
El término "hek/elk" significa hek o elk o
tanto hek como elk. Por ejemplo, el término "anticuerpos
anti-hek/elk" se refiere a anticuerpos contra
hek o elk. El término "células que expresan hek/elk" se refiere
a células que expresan el receptor hek o el receptor elk, o células
que expresan los receptores tanto hek como elk.
El término "biológicamente activo", según
se refiere a LERK-6, significa que el
LERK-6 es capaz de unirse a hek/elk.
"Aislado" significa que el
LERK-6 está libre de asociación con otras proteínas
o polipéptidos, por ejemplo como un producto de purificación de un
cultivo de células huésped recombinantes o como un extracto
purificado.
Una "variante de LERK-6",
según se menciona aquí, significa un polipéptido substancialmente
homólogo a LERK-6 natural, pero que tiene una
secuencia de aminoácidos diferente de la de LERK-6
natural (humano, murino u otras especies de mamífero) debido a una
o más deleciones, inserciones o substituciones. La secuencia de
aminoácidos de la variante preferiblemente es al menos 80% idéntica
a una secuencia de aminoácidos de LERK-6 natural,
lo más preferiblemente al menos 90% idéntica. El porcentaje de
identidad puede determinarse, por ejemplo, comparando la
información de secuencias usando el programa informático GAP,
versión 6.0, descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res.
12:387, 1984) y disponible de the University of Wisconsin Genetics
Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para
el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria
(que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no
identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada
de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986,
según se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein
Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,
pp. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para
cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo
en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos terminales. Las
variantes pueden comprender secuencias substituidas
conservativamente, significando que un residuo de aminoácido dado se
reemplaza por un residuo que tiene características fisicoquímicas
similares. Ejemplos de substituciones conservativas incluyen la
substitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val,
Leu o Ala por otro, o substituciones de un residuo polar por otro,
tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp o Gln y Asn. Otras de tales
substituciones conservativas, por ejemplo substituciones de
regiones enteras que tienen características de hidrofobia similares,
son bien conocidas. Las variantes o los alelos de
LERK-6 presentes en la naturaleza también son
abarcados por la invención. Ejemplos de tales variantes son
proteínas que resultan de episodios de reparación de mRNA alternos o
de segmentación proteolítica de la proteína LERK-6,
en donde la propiedad de unión de LERK-6 se retiene.
La reparación alterna de mRNA puede dar una proteína
LERK-6 truncada pero biológicamente activa, tal como
una forma de la proteína soluble presente en la naturaleza, por
ejemplo. Variaciones atribuibles a proteolisis incluyen, por
ejemplo, diferencias en los extremos N o C durante la expresión en
diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada
proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína
LERK-6 (generalmente de 1-5
aminoácidos terminales).
Se predice que LERK-6 está
anclado en la superficie celular a través de conexión de
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Los anclajes a la membrana de
GPI, incluyendo la estructura química y el procesamiento de los
mismos, se describen en Ferguson, M. y Williams, A., Ann. Rev.
Biochem., 57:285, 1988 (incorporado aquí mediante
referencia). Cuando se expresan inicialmente, ciertas proteínas
comprenden un dominio hidrófobo C-terminal que
contienen señales para el anclaje de GPI. Un sitio de segmentación
está situado aguas arriba, a menudo aproximadamente
10-12 aminoácidos aguas arriba del extremo N del
dominio hidrófobo. El procesamiento postraduccional incluye la
segmentación de la proteína en este sitio de segmentación. Un
anclaje de GPI se liga al aminoácido C-terminal de
la proteína madura procesada recientemente expuesto. Así, cuando se
expresan proteínas LERK-6 en células que reconocen
señales de anclaje de GPI en el dominio hidrófobo, la secuencia de
aminoácidos de longitud completa del Nº ID SEC: 2, que se
proporciona para comparación, y el Nº ID SEC: 10 representa formas
precursoras de las proteínas.
Basándose en secuencias de consenso derivadas de
otras proteínas ancladas a GPI, la región hidrófoba en
LERK-6 de la presente invención probablemente está
entre e incluye los aminoácidos 170 (Leu) y 184 (Ser) del Nº ID
SEC: 10. Para comparación, se proporciona la región probablemente
hidrófoba en el Nº ID SEC: 2, que está entre e incluye los
aminoácidos 170 (Leu) y 184 (Ser). Entre el dominio hidrófobo y el
dominio que se une al receptor, hay una región espaciadora de
aproximadamente 22 a 25 aminoácidos de longitud. La región
espaciadora se extiende desde aproximadamente el aminoácido 145
(Asn), 146 (Glu) o 147 (Thr) hasta aproximadamente el aminoácido 169
(His) del Nº ID SEC: 10. Para comparación, se proporciona la región
espaciadora del Nº ID SEC: 2, que también se extiende desde
aproximadamente los aminoácidos 145 (Asn), 146 (Glu) o 147 (Thr)
hasta aproximadamente el aminoácido 164 (His).
El Ejemplo 3 describe la construcción de una
nueva proteína de fusión hek:Fc que puede utilizarse en el rastreo
de LERK-6. Otras regiones Fc de anticuerpo pueden
substituir a la región Fc de IgG1 humana descrita en el Ejemplo.
Otras regiones Fc adecuadas son aquellas que pueden unirse con alta
afinidad a proteína A o proteína G e incluyen la región Fc de IgG1
humana o fragmentos de la región Fc de IgG1 humana o murina, por
ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la región de bisagra de
modo que se formarán enlaces disulfuro intercatenarios. La proteína
de fusión hek:Fc ofrece la ventaja de purificarse fácilmente.
Además, los enlaces disulfuro se forman entre las regiones Fc de
dos cadenas de la proteína de fusión separadas, creando dímeros.
Según se describe anteriormente, un aspecto de
la invención son los polipéptidos LERK-6 solubles.
Los polipéptidos LERK-6 solubles comprenden la
totalidad o parte del dominio extracelular de un
LERK-6 natural pero carecen de la señal de GPI que
provocaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular.
Polipéptidos de LERK-6 solubles comprenden
ventajosamente el péptido de señal natural (o un heterólogo) cuando
se sintetizan inicialmente para promover la secreción, pero el
péptido de señal se segmenta durante la secreción de
LERK-6 desde la célula. Los polipéptidos
LERK-6 solubles abarcados por la invención retienen
la capacidad para unirse al receptor hek o elk. En efecto, el
LERK-6 soluble también puede incluir parte de la
señal de GPI o parte del dominio citoplásmico u otras secuencias,
con tal de que la proteína LERK-6 soluble pueda
secretarse.
El LERK-6 soluble puede
identificarse (y distinguirse de sus homólogos unidos a la membrana
no solubles) separando células intactas que expresan la proteína
deseada del medio de cultivo, por ejemplo mediante centrifugación,
y ensayando el medio (sobrenadante) con respecto a la presencia de
la proteína deseada. La presencia de LERK-6 en el
medio indica que la proteína se secretaba de las células y así es
una forma soluble de la proteína deseada.
Las formas solubles de LERK-6
poseen muchas ventajas sobre la proteína LERK-6
unida natural. La purificación de las proteínas a partir de células
huésped recombinantes es factible, ya que las proteínas solubles se
secretan de las células. Por otra parte, las proteínas solubles son
generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.
Ejemplos de polipéptidos LERK-6
solubles incluyen los que comprenden una porción substancial del
dominio extracelular de una proteína LERK-6
natural. Un ejemplo de una proteína LERK-6 murina
comprende los aminoácidos 1-145 del Nº ID SEC: 2
que se proporciona para comparación y los aminoácidos
1-145 del Nº ID SEC: 10. Además, proteínas
LERK-6 solubles truncadas que comprenden menos de
todo el dominio extracelular se incluyen en la invención. Cuando se
expresa inicialmente dentro de una célula huésped, el
LERK-6 soluble puede comprender adicionalmente uno
de los péptidos de señal heterólogos descritos posteriormente que es
funcional dentro de las células huésped empleadas.
Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido de señal
natural. En una modalidad de la invención, LERK-6
soluble puede expresarse como una proteína de fusión que comprende
(desde el extremo N al C) el péptido de señal de factor \alpha de
levadura, un péptido FLAG® descrito posteriormente y en la Patente
de EE.UU. Nº 5.011.912 y LERK-6 soluble que consiste
en los aminoácidos 1-134 del Nº ID SEC: 10 o, para
comparación, los aminoácidos 1-134 del Nº ID SEC: 2
en lugar de los aminoácidos 1-134 del Nº ID SEC:
10. Esta proteína de fusión recombinante se expresa en y se secreta
de células de levadura. El péptido FLAG® facilita la purificación
de la proteína y subsiguientemente puede segmentarse del
LERK-6 soluble usando enteroquinasa mucosal bovina.
Secuencias de DNA aisladas que codifican proteínas
LERK-6 solubles son abarcadas por la invención.
LERK-6 truncado, incluyendo
polipéptidos solubles, puede prepararse mediante cualquiera de un
número de técnicas convencionales. Una secuencia de DNA deseada
puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas de por
sí. También pueden producirse fragmentos de DNA mediante digestión
con endonucleasas de restricción y una secuencia de DNA clonada de
longitud completa, y aislarse mediante electroforesis en geles de
agarosa. Conectores que contienen un sitio o sitios de segmentación
con endonucleasas de restricción pueden emplearse para insertar el
fragmento de DNA deseado en un vector de expresión, o el fragmento
puede digerirse en sitios de segmentación presentes naturalmente en
el mismo. El procedimiento bien conocido de la reacción en cadena
de la polimerasa también puede emplearse para amplificar una
secuencia de DNA que codifica un fragmento proteínico deseado. Como
una alternativa adicional, pueden emplearse técnicas de mutagénesis
conocidas para insertar un codón de parada en un punto deseado, por
ejemplo inmediatamente aguas abajo del codón para el último
aminoácido del dominio que se une al receptor.
Según se indica anteriormente, la invención
proporciona polipéptidos LERK-6 aislados u
homogéneos, tanto recombinantes como no recombinantes. Variantes y
derivados de proteínas LERK-6 naturales que retienen
la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad para
unirse a hek/elk) pueden obtenerse mediante mutaciones de secuencias
de nucleótidos que codifican para polipéptidos
LERK-6 naturales. Alteraciones de la secuencia de
aminoácidos natural pueden efectuarse mediante cualquiera de un
número de métodos convencionales. Pueden introducirse mutaciones en
loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una
secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que
permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después
de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un
análogo que tiene la inserción, substitución o deleción de
aminoácidos deseada.
Alternativamente, pueden emplearse
procedimientos de mutagénesis específicos para el sitio dirigidos a
oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en el que
codones predeterminados pueden alterarse mediante substitución,
deleción o inserción. Métodos ejemplares para producir las
alteraciones indicadas anteriormente son descritos por Walder y
otros (Gene 42:133, 1986); Bauer y otros (Gene
37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985,
12-19); Smith y otros (Genetic Engineering:
Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel y otros (Methods
in Enzymol 154:367, 1987) y las Patentes de EE.UU. Nº
4.518.584 y 4.737.462.
El LERK-6 puede modificarse para
crear derivados de LERK-6 formando conjugados
covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como
grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares.
Derivados covalentes de LERK-6 pueden prepararse
conectando los restos químicos a grupos funcionales sobre cadenas
laterales de aminoácidos LERK-6 o en el extremo N o
el extremo C de un polipéptido LERK-6 o el dominio
extracelular del mismo. Otros derivados de LERK-6
dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes
o agregativos de LERK-6 o sus fragmentos con otras
proteínas o polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivo
recombinante como fusiones N-terminales o
C-terminales. Por ejemplo, el conjugado puede
comprender una secuencia polipeptídica de señal o líder (por
ejemplo el líder del factor \alpha de Saccharomyces) en el
extremo C de un polipéptido LERK-6. El péptido de
señal o líder dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la
transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis hasta un
sitio dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.
Fusiones de polipéptidos LERK-6
pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación y
la identificación de LERK-6. Tales polipéptidos
incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de
identificación antigénicos descritos en la Patente de EE.UU. Nº
5.011.912 y en Hopp y otros, Bio/Technology 6:1204,
1988.
La invención incluye además polipéptidos
LERK-6 con o sin glicosilación de patrón natural
asociada. LERK-6 expresado en sistemas de expresión
de levadura o mamífero (por ejemplo, células COS-7)
puede ser similar a o diferente de un polipéptido
LERK-6 natural en peso molecular y patrón de
glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión.
La expresión de polipéptidos LERK-6 en sistemas de
expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona
moléculas no glicosiladas.
Constructos de DNA equivalentes que codifican
diversas adiciones o substituciones de residuos o secuencias de
aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias terminales o
internos no necesarios para la actividad biológica o la unión son
abarcados por la invención. Por ejemplo, sitios de
N-glicosilación en el dominio extracelular de
LERK-6 pueden modificarse para impedir la
glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de
carbohidrato reducido en sistemas de expresión de mamíferos y
levaduras. Los sitios de N-glicosilación en
polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de
aminoácidos Asn-X-Y en el que X es
cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. La proteína
LERK-6 murina que se proporciona para comparación y
LERK-6 humana comprenden tres de tales tripletes,
en los aminoácidos 13-15, 145-147 y
159-161 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para
comparación y el Nº ID SEC: 10, respectivamente. Substituciones,
adiciones o deleciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos
que codifica estos tripletes darán como resultado la prevención del
empalme de los residuos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn.
La alteración de un solo nucleótido, elegido de modo que Asn se
reemplace por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente
para inactivar un sitio de N-glicosilación.
Procedimientos conocidos para inactivar sitios de
N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos
en la Patente de EE.UU. Nº 5.071.972 y EP 276.846.
En otro ejemplo, secuencias que codifican
residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica
pueden alterarse para hacer que los residuos de Cys sufran deleción
o se reemplacen por otros aminoácidos, evitando la formación de
puentes de disulfuro intramoleculares incorrectos durante la
renaturalización. Otros equivalentes se preparan mediante la
modificación de residuos de aminoácido dibásicos adyacentes para
potenciar la expresión en sistemas de levadura en los que está
presente actividad de proteasa KEX2. EP 212.914 describe el uso de
mutagénesis específica para el sitio para inactivar sitios de
procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de
procesamiento de proteasa KEX2 se inactivan sometiendo a deleción,
añadiendo o substituyendo residuos para alterar los pares
Arg-Arg, Arg-Lys y
Lys-Arg para eliminar la presencia de estos
residuos básicos adyacentes. Los apareamientos
Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a
la segmentación con KEX2 y la conversión de Arg-Lys
o Lys-Arg en Lys-Lys representa un
sistema conservativo y preferido para inactivar sitios KEX2. El
LERK-6 murino que se proporciona para comparación y
el LERK-6 humano contienen un sitio de
procesamiento de proteasa KEX2 en los aminoácidos
81-82 del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para
comparación y el Nº ID SEC: 10, respectivamente.
Secuencias de ácido nucleico dentro del alcance
de la invención incluyen secuencias de DNA y RNA humanos que se
hibridan a las secuencias de nucleótidos de LERK-6
descritas aquí bajo condiciones de restricción moderada o intensa,
y que codifican LERK-6 biológicamente activo. Las
condiciones de restricción moderada, según se define por Sambrook y
otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1,
pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989), incluyen el uso de una solución de prelavado de 5 X SSC, SDS
al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de
aproximadamente 55ºC, 5 X SSC, durante la noche. Las condiciones de
restricción intensa incluyen temperaturas de hibridación y lavado
superiores. El experto reconocerá que la temperatura y la
concentración salina de la solución de lavado pueden ajustarse según
sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la
molécula de ácido nucleico.
Debido a la degeneración conocida del código
genético en la que más de un codón puede codificar el mismo
aminoácido, una secuencia de DNA puede variar desde la mostrada en
el Nº ID SEC: 1 que se proporciona para comparación, el Nº ID SEC:
7 que se proporciona para comparación y el Nº ID SEC: 9 y todavía
codifica una proteína LERK-6 que tiene la secuencia
de aminoácidos del Nº ID SEC: 2 que se proporciona para comparación,
el Nº ID SEC: 8 que se proporciona para comparación o el Nº ID SEC:
10, respectivamente. Tales secuencias de DNA variantes pueden
resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que se producen
durante la amplificación por PCR) o pueden ser el producto de
mutagénesis deliberada de una secuencia natural.
La invención proporciona secuencias de DNA
aisladas equivalentes que codifican LERK-6
biológicamente activo, seleccionadas de: (a) cDNA que comprende la
secuencia de nucleótidos presentada en el Nº ID SEC: 9; (b) DNA
humano capaz de hibridación a un DNA de (a) bajo condiciones
moderadamente restrictivas y que codifica LERK-6
biológicamente activo; y (c) DNA que está degenerado como resultado
del código genético hasta un DNA definido en (a) o (b) y que
codifica LERK-6 biológicamente activo. Proteínas
LERK-6 codificadas por tales secuencias
equivalentes de DNA son abarcadas por la invención. Para
comparación, se proporciona cDNA que comprende la secuencia de
nucleótidos presentada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 7.
DNAs que son equivalentes a la secuencia de DNA
del Nº ID SEC: 1 que se proporciona para comparación y el Nº ID
SEC: 2 que se proporciona para comparación o el Nº ID SEC: 9 se
hibridarán bajo condiciones moderadamente e intensamente
restrictivas a secuencias de DNA que codifican polipéptidos que
comprenden los aminoácidos 1-148 del Nº ID SEC: 2
que se proporciona para comparación, el Nº ID SEC: 8 que se
proporciona para comparación o los aminoácidos
1-148 del Nº ID SEC: 10. Ejemplos de proteínas
LERK-6 codificadas con tal DNA incluyen, pero no se
limitan a, fragmentos de LERK-6 (solubles o
conectados por GPI) y proteínas LERK-6 que
comprenden un sitio o sitios de N-glicosilación
inactivados, un sitio o sitios de procesamiento de proteasa KEX2
inactivados o una substitución o substituciones de aminoácidos
conservativas, según se describe anteriormente. Las proteínas
LERK-6 codificadas por DNA derivadas de otras
especies de mamíferos, en donde el DNA se hibridará al cDNA del Nº
ID SEC: 1, el Nº ID SEC: 7 o el Nº ID SEC: 9 también se proporcionan
para comparación.
Variantes que poseen la actividad requerida para
unirse a receptor hek/elk pueden identificarse mediante cualquier
ensayo adecuado. La actividad biológica de LERK-6
puede determinarse, por ejemplo, mediante competición con respecto
a la unión al dominio de unión a ligandos del receptor hek/elk (es
decir, ensayos de unión competitiva).
Un tipo de un ensayo de unión competitiva para
un polipéptido LERK-6 usa un LERK-6
soluble radiomarcado y células que expresan hek/elk intactas. En
lugar de células intactas, proteínas de fusión hek/elk:Fc (tales
como una proteína de fusión hek:Fc o elk:Fc) solubles unidas a una
fase sólida a través de la interacción de una Proteína A, Proteína
G o un anticuerpo con las porciones hek, elk o Fc de la molécula
podrían substituirse por la región Fc de la proteína de fusión.
Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza receptores hek o
elk solubles radiomarcados, tales como proteínas de fusión hek:Fc o
elk:Fc, y células intactas que expresan LERK-6.
Los ensayos de unión competitiva pueden
realizarse siguiendo una metodología convencional. Por ejemplo,
puede usarse LERK-6 radiomarcado para competir con
un homólogo de LERK-6 putativo para ensayar con
respecto a la actividad de unión frente a hek/elk unido a la
superficie. Pueden obtenerse resultados cualitativos mediante
ensayos competitivos de unión a placas autorradiográficas o pueden
utilizarse representaciones de Scatchard para generar resultados
cuantitativos.
Alternativamente, proteínas que se unen a
hek/elk, tales como LERK-6 y anticuerpos
anti-hek/elk, pueden unirse a una fase sólida tal
como una matriz de cromatografía en columna o un substrato similar
adecuado para identificar, separar o purificar células que expresan
hek/elk sobre su superficie. La unión de una proteína que se une a
hek/elk a una superficie de contacto en fase sólida puede efectuarse
mediante cualquier medio, por ejemplo, construyendo una proteína de
fusión LERK-6:Fc y uniendo esta a la fase sólida a
través de la interacción de Proteína A o Proteína G. Varios otros
medios para fijar proteínas a una fase sólida son bien conocidos en
la especialidad y son adecuados para usar en la presente invención.
Por ejemplo, microesferas magnéticas pueden revestirse con
LERK-6 y mantenerse en el recipiente de incubación a
través de un campo magnético. Suspensiones de mezclas de células
que contienen células que expresan hek/elk se ponen en contacto con
la fase sólida que tiene polipéptido LERK-6 sobre
la misma. Las células que tienen hek/elk sobre su superficie se unen
al LERK-6 fijado y las células no unidas se separan
por lavado a continuación. Este método de unión por afinidad es
útil para purificar, rastrear o separar tales células que expresan
hek/elk de la solución. Métodos para liberar células seleccionadas
positivamente de la fase sólida son conocidos en la especialidad y
abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas
preferiblemente no son tóxicas y no son perjudiciales para las
células y preferiblemente se dirigen a segmentar el socio de unión
a la superficie celular. En el caso de interacciones
hek/elk:LERK-6, la enzima preferiblemente
segmentaría el receptor hek/elk, librando de ese modo la suspensión
celular resultante del material de LERK-6
"extraño". La población de células purificadas, especialmente
si se obtienen de tejido fetal, puede usarse a continuación para
repoblar tejidos maduros (adultos). Por ejemplo, tales células
neurales purificadas pueden administrarse a un paciente que tiene un
trastorno neurodegenerativo, tal como enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Lou Gehrig, etc.
Alternativamente, mezclas de células que se
sospecha que contienen células hek/elk^{+} pueden incubarse en
primer lugar con LERK-6 biotinilado. Los períodos de
incubación son típicamente al menos de una hora de duración para
asegurar una unión suficiente a hek/elk. La mezcla resultante se
hace pasar a continuación a través de una columna rellena con
cuentas revestidas con avidina, con lo que la alta afinidad de la
biotina para la avidina proporciona la unión de la célula a las
cuentas. El uso de cuentas revestidas con avidina se conoce en la
especialidad. Véase Berenson, y otros, J Cell. Biochem.,
10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la
liberación de las células unidas se realizan usando métodos
convencionales.
Según se describe anteriormente, puede usarse
LERK-6 para separar células que expresan hek/elk. En
un método alternativo, LERK-6 o un dominio
extracelular o un fragmento del mismo puede conjugarse a un resto
detectable tal como ^{125}I para detectar células que expresan
hek/elk. El radiomarcaje con ^{125}I puede realizarse mediante
cualquiera de varias metodologías estándar que dan una molécula de
^{125}I-LERK-6 funcional marcada
hasta una alta actividad específica. O podría usarse un anticuerpo
yodado o biotinilado contra la región hek/elk o la región Fc de la
molécula. Puede usarse otro resto detectable, tal como una enzima
que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica,
biotina o avidina. Las células que han de probarse con respecto a
la expresión de hek/elk pueden ponerse en contacto con
LERK-6 marcado. Después de la incubación,
LERK-6 marcado no unido se retira y la unión se
mide usando el resto detectable.
Las características de unión de
LERK-6 (incluyendo variantes) también pueden
determinarse usando la hek/elk soluble conjugada (por ejemplo,
^{125}I-hek/elk:Fc) en ensayos de competición
similares a los descritos anteriormente. En este caso, sin embargo,
células intactas que expresan hek/elk unida a un substrato sólido
se usan para medir la extensión hasta la que una muestra que
contiene una variante de LERK-6 putativa compite
con respecto a la unión a LERK-6 con una hek/elk
soluble conjugada.
Otros medios para ensayar con respecto a
LERK-6 incluyen el uso de anticuerpos
anti-LERK-6, líneas celulares que
proliferan en respuesta a LERK-6 o líneas celulares
recombinantes que expresan hek/elk y proliferativas en presencia de
LERK-6.
Las proteínas LERK-6 descritas
aquí también pueden emplearse para medir la actividad biológica de
proteínas elk o hek en términos de su afinidad de unión para
LERK-6. Como un ejemplo, puede usarse
LERK-6 para determinar si la actividad biológica se
retiene después de la modificación de una proteína elk o hek (por
ejemplo, modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La
actividad biológica de una proteína elk o hek puede determinarse
así antes de que se use en un estudio de investigación, o
posiblemente en la clínica, por ejemplo.
Las proteínas LERK-6 encuentran
uso como reactivos que pueden emplearse por los que efectúan
estudios de "garantía de calidad", por ejemplo, para verificar
la vida útil y la estabilidad de proteína elk bajo diferentes
condiciones. Como ilustración, puede emplearse
LERK-6 en un estudio de afinidad de unión para medir
la actividad biológica de una proteína elk que se ha almacenado a
diferentes temperaturas o producido en diferentes tipos celulares.
La afinidad de unión de la proteína elk modificada para
LERK-6 se compara con la de una proteína elk no
modificada para detectar cualquier influencia adversa de las
modificaciones sobre la actividad biológica de elk. Asimismo, la
actividad biológica de una proteína hek puede determinarse usando
LERK-6.
Los polipéptidos LERK-6 también
encuentran uso como portadores para agentes de aporte unidos a los
mismos para células que soportan el receptor de la superficie
celular elk o hek. La expresión de antígeno para hek se ha
presentado para ciertas líneas celulares leucémicas, incluyendo la
línea celular de leucemia de células T humana denominada JM y la
línea celular de pre-leucemia de células B humana
denominada LK63 (Boyd y otros, J. Biol. Chem. 267:3262, 1992
y Wicks y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992).
Las proteínas LERK-6 pueden usarse así para aportar
agentes diagnósticos o terapéuticos a estas células (o a otros tipos
de células que se encuentra que expresan hek sobre la superficie
celular) en procedimientos in vitro o in vivo.
Un ejemplo de tal uso es exponer una línea
celular leucémica hek^{+} o elk^{+} a un conjugado de agente
terapéutico/LERK-6 para determinar si el agente
exhibe citotoxicidad para las células leucémicas. Un número de
diferentes agentes terapéuticos empalmados a LERK-6
puede incluirse en un ensayo para detectar y comparar el efecto
citotóxico de los agentes sobre las células leucémicas. Los
conjugados de LERK-6/agente diagnóstico pueden
emplearse para detectar la presencia de células hek^{+} in
vitro o in vivo.
Agentes diagnósticos y terapéuticos que pueden
empalmarse a un polipéptido LERK-6 incluyen, pero no
se limitan a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas
que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y
similares, eligiéndose el agente particular de acuerdo con la
aplicación pretendida. Ejemplos de fármacos incluyen los usados
para tratar diversas formas de cáncer, por ejemplo, mostazas
nitrogenadas tales como mostaza nitrogenada de
L-fenilalanina, o ciclofosfamida, agentes de
intercalación tales como cis-diaminodicloroplatino,
antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo,
alcaloides de la vinca tales como vincristina, y antibióticos tales
como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina y derivados de los
mismos. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina de la
difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa y fragmentos (por
ejemplo, cadenas simples) de las mismas. Radionúclidos adecuados
para uso diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I,
^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Radionúclidos
adecuados para uso terapéutico incluyen, pero no se limitan a,
^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re,
^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.
Tales agentes pueden empalmarse al
LERK-6 mediante cualquier procedimiento convencional
adecuado. LERK-6, que es una proteína, comprende
grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácido que pueden
hacerse reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para
formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la
proteína o el agente pueden derivarse para generar o empalmarse a un
grupo funcional reactivo deseado. La derivación puede implicar el
empalme de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales
disponibles para empalmar diversas moléculas a proteínas (Pierce
Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conoce un número de
técnicas para radiomarcar proteínas. Los metales de radionúclidos
pueden empalmarse a LERK-6 usando un agente
quelante bifuncional adecuado, por ejemplo.
Se preparan así conjugados que comprenden
LERK-6 y un agente diagnóstico o terapéutico
adecuado (preferiblemente conectados covalentemente). Los
conjugados se administran o se emplean de otro modo en una cantidad
apropiada para la aplicación particular.
Otro uso del LERK-6 de la
presente invención es como una herramienta de investigación para
estudiar el papel que LERK-6, junto con elk o hek,
puede representar en el crecimiento o la diferenciación de células
que tienen el receptor elk o hek. Los polipéptidos
LERK-6 de la presente invención también pueden
emplearse en ensayos in vitro para la detección de elk o
LERK-6 o las interacciones de los mismos. Asimismo,
LERK-6 encuentra uso en ensayos para hek o la
interacción de LERK-6 con hek.
Según se trata anteriormente, cuando se
analizaban diversos tejidos de rata con respecto a mRNA de elk, se
detectaban transcritos solo en el cerebro y los testículos (Lhotak y
otros, anteriormente). Se cree que la unión de
LERK-6 a receptores relacionados con eph sobre
tejido neural ejerce un efecto neuroprotector o neurotrófico.
LERK-6 encuentra uso como un
reactivo de cultivo tisular. Una proteína LERK-6
puede añadirse a neuronas cultivadas in vitro para potenciar
la viabilidad o prolongar la duración de las neuronas cultivadas,
facilitando así estudios de investigación y el posible tratamiento
clínico de tejido neural.
Puede preverse un método para tratar trastornos
de tejido neural, que implica poner en contacto el tejido neural
con LERK-6. Tales trastornos incluyen lesión o
enfermedades neurológicas, crónicas o agudas. Una proteína
LERK-6 puede administrarse a un mamífero para tratar
tal lesión o enfermedad. En una modalidad de la invención, se
emplea LERK-6 para tratar estados neurodegenerativos
caracterizados o mediados, al menos en parte, por el mecanismo de
muerte neural conocido como exocitotoxicidad. Además, puede
administrarse LERK-6 a un mamífero para ejercer un
efecto trófico sobre el tejido neural. En un paciente que sufre
pérdida de o daño a neuronas debido a lesión o enfermedad, el
LERK-6 puede potenciar la viabilidad de aquellas
neuronas que han sobrevivido.
Los polipéptidos LERK-6 de la
invención pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos usados
para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El
LERK-6 puede combinarse en una mezcla, como el único
material activo o con otros materiales activos conocidos, con
diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo,
Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (por
ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenes), emulsionantes,
solubilizantes, adyuvantes y/o portadores. Portadores adecuados y
sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co. Además, tales
composiciones pueden contener LERK-6 complejado con
polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporado en compuestos
polímeros tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico),
hidrogeles, etc., o incorporado en liposomas, microemulsiones,
micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, "fantasmas"
de eritrocitos, o esferoblastos. Tales composiciones influirán en el
estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de
liberación in vivo y la velocidad de depuración in
vivo de LERK-6. LERK-6 también
puede conjugarse a anticuerpos contra receptores específicos de
tejidos, ligandos o antígenos, o acoplarse a ligandos de receptores
específicos de tejidos. Cuando se encuentra hek/elk sobre células
neoplásticas, el LERK-6 puede conjugarse a una
toxina con lo que LERK-6 se usa para aportar la
toxina al sitio específico, o puede usarse para sensibilizar tales
células neoplásticas a agentes antineoplásticos administrados
subsiguientemente.
LERK-6 puede administrarse
tópicamente, parenteralmente o mediante inhalación. El término
"parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyección
intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión.
Estas composiciones contendrán típicamente una cantidad eficaz del
LERK-6, sola o en combinación con una cantidad
eficaz de cualquier otro material activo. Tales dosificaciones y
concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones
pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso
pretendido, el peso corporal y la edad del paciente y la ruta de
administración. Dosis preliminares pueden determinarse de acuerdo
con pruebas en animales, y el aumento a escala de las
dosificaciones para la administración a seres humanos puede
realizarse de acuerdo con prácticas aceptadas en la
especialidad.
Los polipéptidos LERK-6 pueden
existir como oligómeros, tales como dímeros o trímeros conectados
covalentemente o conectados no covalentemente. Los oligómeros
pueden estar conectados por enlaces disulfuro formados entre
residuos de cisteína de diferentes polipéptidos
LERK-6. En una modalidad de la invención, se crea un
dímero de LERK-6 fusionando LERK-6
a las regiones Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG1) de una manera
que no interfiere con la unión de LERK-6 al dominio
de unión a ligandos de hek/elk. El polipéptido de Fc preferiblemente
se fusiona al extremo C de un LERK-6 soluble (que
comprende solo la unión al receptor). La preparación general de
proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos
fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de
anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo,
por Ashkenazi y otros (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn
y otros (Nature 344:677, 1990). Una fusión génica que
codifica la proteína de fusión LERK-6:Fc se inserta
en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión
LERK-6:Fc se dejan ensamblar de forma muy similar en
las moléculas de anticuerpo, con lo que se forman enlaces disulfuro
intercatenarios entre polipéptidos de Fc, dando
LERK-6 divalente. Si se elaboran proteínas de fusión
con cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible
formar un oligómero de LERK-6 con tantas como cuatro
regiones extracelulares de LERK-6.
Alternativamente, pueden conectarse dos dominios de
LERK-6 soluble con un conector peptídico.
Células huésped adecuadas para la expresión de
polipéptidos LERK-6 incluyen procariotas, levadura o
células eucarióticas superiores. Vectores de clonación y expresión
apropiados para usar con huéspedes celulares de bacterias, hongos,
levaduras y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels y otros,
Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York,
(1985). También podrían emplearse sistemas de traducción libres de
células para producir polipéptidos LERK-6 usando
RNAs derivados de constructos de DNA descritos aquí.
Los procariotas incluyen organismos Gram
negativos o Gram positivos, por ejemplo, E. coli o
Bacilli. Células huésped procarióticas adecuadas para la
transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis,
Salmonella typhimurium, y diversas otras especies dentro de los
géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un
polipéptido LERK-6 puede incluir un residuo de
metionina N-terminal para facilitar la expresión del
polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met
N-terminal puede segmentarse del polipéptido
LERK-6 recombinante expresado.
Los polipéptidos LERK-6 pueden
expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del
género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae).
También pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como
Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de
levadura a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación
desde un plásmido de levadura 2\mu, una secuencia que se replica
autónomamente (ARS), una región promotora, secuencias para
poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción
y un gen marcador seleccionable. Secuencias promotoras adecuadas
para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para
metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman
y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras
enzimas glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg.
7:149, 1968 y Holland y otros, Biochem.
17:4900, 1978), tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en
levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman,
EPA-73.657 o en Fleer y otros, Gene,
107:285-195 (1991) y van den Berg y otros,
Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Otra
alternativa es el promotor de ADH2 reprimible con glucosa descrito
por Russell y otros (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y
otros (Nature 300:724, 1982). Pueden construirse
vectores lanzadera replicables tanto en levaduras como en E.
coli insertando secuencias de DNA de pBR322 para selección y
replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de
replicación) en los vectores de levadura descritos
anteriormente.
La secuencia líder de factor \alpha de
levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido
LERK-6. La secuencia líder de factor \alpha a
menudo se inserta entre la secuencia promotora y la secuencia
génica estructural. Véanse, por ejemplo, Kurjan y otros, Cell
30:933, 1982; y Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:5330; la Patente de EE.UU. 4.546.082 y EP 324.274.
Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de
polipéptidos recombinantes a partir de huéspedes de levadura son
conocidas por los expertos en la especialidad. Una secuencia líder
puede modificarse cerca de su extremo 3' para contener uno o más
sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia
líder al gen estructural.
Protocolos de transformación de levadura son
conocidos por los expertos en la especialidad. Uno de tales
protocolos es descrito por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y otros
selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en donde
el medio selectivo consiste en 0,67% de base nitrogenada de
levadura, 0,5% de casaminoácido, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de
adenina y 20 \mug/ml de uracilo.
Las células huésped de levadura transformadas
mediante vectores que contienen secuencia promotora de ADH2 pueden
hacerse crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un
ejemplo de un medio rico es uno que consiste en 1% de extracto de
levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementados con 80
\mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del
promotor de ADH2 se produce cuando la glucosa se agota del
medio.
Sistemas de cultivo de células huésped de
mamífero o insecto también podrían emplearse para expresar
polipéptidos LERK-6 recombinantes. Sistemas
baculovirales para la producción de proteínas heterólogas en células
de insecto son revisados por Luckow y Summers,
Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse líneas
celulares establecidas de origen de mamífero. Ejemplos de líneas
celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea
COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651)
(Gluzman y otros, Cell 23:175, 1981), células L,
células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de
hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL
10) y la línea celular CV-1/EBNA-1
derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI
(ATCC CCL 70) según se describe por McMahan y otros (EMBO J.
10: 2821, 1991).
Secuencias de control transcripcional y
traduccional para vectores de expresión de células huésped de
mamífero pueden cortarse de genomas virales. Secuencias promotoras
y secuencias potenciadoras comúnmente usadas se derivan de
poliomavirus, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y
citomegalovirus humano. Secuencias de DNA derivadas del genoma
viral SV40, por ejemplo, sitios de origen, promotor temprano y
tardío, potenciador, de reparación y poliadenilación de SV40 pueden
usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión
de una secuencia génica estructural en una célula huésped de
mamífero. Promotores tempranos y tardíos virales son
particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de
un genoma viral como un fragmento que también puede contener un
origen de replicación viral (Fiers y otros, Nature
273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40
menores o mayores, con tal de que se incluya la secuencia de
aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind
III hasta el sitio Bgl I situada en el sitio de origen de
replicación viral de SV40.
Vectores de expresión ejemplares para usar en
células huésped de mamífero pueden construirse según se describe
por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un
sistema útil para una expresión de alto nivel estable en cDNAs de
mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 puede
construirse substancialmente según se describe por Cosman y otros
(Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta
expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y otros,
Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC
39890. Vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se
describen en EP-A-0367566 y en la
Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/701.415, presentada
el 16 de mayo de 1991, incorporada mediante referencia aquí. Los
vectores pueden derivarse de retrovirus. En lugar de la secuencia
de señal natural, y además de una metionina iniciadora, puede
añadirse una secuencia de señal heteróloga, tal como la secuencia
de señal para IL-7 descrita en la Patente de Estados
Unidos 4.965.195; la secuencia de señal para el receptor de
IL-2 descrita en Cosman y otros, Nature
312:768 (1984); el péptido de señal de IL-4
descrito en EP 367.566; el péptido de señal del receptor de
IL-1 tipo I descrito en la Patente de EE.UU.
4.968.607 y el péptido de señal del receptor de IL-1
tipo II descrito en EP 460.846.
LERK-6 como una proteína
aislada, purificada u homogénea de acuerdo con la invención puede
producirse mediante sistemas de expresión recombinantes como los
descritos anteriormente o purificarse a partir de células presentes
en la naturaleza. LERK-6 puede purificarse hasta una
homogeneidad substancial, según se indica por una sola banda de
proteína durante el análisis mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Un procedimiento para producir
LERK-6 comprende cultivar una célula huésped
transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia
de DNA que codifica LERK-6 bajo condiciones
suficientes para promover la expresión de LERK-6.
LERK-6 se recupera a continuación del medio de
cultivo o los extractos celulares, dependiendo del sistema de
expresión empleado. Como se sabe por el experto, los procedimientos
para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con
factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si la
proteína recombinante se secreta o no en el medio de cultivo.
Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de
expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo
puede concentrarse en primer lugar usando un filtro de
concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo
una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después
de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una
matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel.
Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o un substrato que tiene grupos
dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados
comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede
emplearse una etapa de intercambio catiónico. Intercambiadores
catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que
comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren grupos
sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de
cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(RP-HPLC) empleando medios de
RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que
tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes) para
purificar adicionalmente LERK-6. Alguna o la
totalidad de las etapas de purificación precedentes, en diversas
combinaciones, son bien conocidas y pueden emplearse para
proporcionar una proteína recombinante substancialmente
homogénea.
Es posible utilizar una columna de afinidad que
comprende el dominio de unión a ligandos de receptores hek/elk para
purificar por afinidad polipéptidos LERK-6
expresados. Los polipéptidos LERK-6 pueden retirarse
de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por
ejemplo, en un tampón de elución de alto contenido de sal, y a
continuación dializarse en un tampón de contenido de sal inferior
para el uso, o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de
la matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la columna de
afinidad puede comprender un anticuerpo que se une a
LERK-6. El Ejemplo 5 describe un procedimiento para
emplear LERK-6 de la invención para generar
anticuerpos monoclonales dirigidos contra
LERK-6.
Proteína recombinante producida en un cultivo
bacteriano puede aislarse mediante ruptura inicial de las células
huésped, centrifugación, extracción de nódulos celulares si hay un
polipéptido insoluble o del fluido sobrenadante si hay un
polipéptido soluble, seguido por una o más etapas de concentración,
desalado, intercambio iónico, purificación por afinidad o
cromatografía de exclusión por tamaños. Finalmente, puede emplearse
RP-HPLC para etapas de purificación finales. Las
células microbianas pueden romperse mediante cualquier método
conveniente, incluyendo someter a ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, ruptura
mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Células huésped de levadura transformadas se
emplean preferiblemente para expresar LERK-6 como un
polipéptido secretado para simplificar la purificación. Un
polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células
huésped de levadura puede purificarse mediante métodos análogos a
los descritos por Urdal y otros (J. Chromatog.
296:171, 1984). Urdal y otros describen dos etapas de HPLC en
fase inversa secuenciales para la purificación de
IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC
preparativa.
Fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de
LERK-6 incluyen oligonucleótidos antisentido o de
sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola
hebra (RNA o DNA) capaz de unirse a secuencias de mRNA de
LERK-6 (sentido) o DNA de LERK-6
(antisentido) diana. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido,
de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la
región de codificación de cDNA de LERK-6. Tal
fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14
nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a
aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un
oligonucleótido antisentido o de sentido, basándose en una
secuencia de cDNA que codifica una proteína dada, se describe en,
por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van
der Krol y otros (BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos antisentido o de
sentido a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la
formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de
la secuencia diana mediante uno de varios medios, incluyendo
degradación potenciada de los dúplex, terminación prematura de la
transcripción o traducción o por otros medios. Los oligonucleótidos
antisentido pueden usarse así para bloquear la expresión de
proteínas LERK-6. Los oligonucleótidos antisentido o
de sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen cadenas
principales de azúcar-fosfodiéster modificadas (u
otras conexiones de azúcar, tales como las descritas en WO91/06629)
y en donde tales conexiones de azúcar son resistentes a nucleasas
endógenas. Tales oligonucleótidos con conexiones de azúcar
resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de
resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad
de secuencia para poder unirse a secuencias de nucleótidos diana.
Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen
los oligonucleótidos que están conectados covalentemente a restos
orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10448, y otros restos
que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia
de ácido nucleico diana, tales como
poli(L-lisina). Además, agentes de
intercalación, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos pueden empalmarse a oligonucleótidos de sentido
o antisentido para modificar las especificidades de unión del
oligonucleótido antisentido o de sentido para la secuencia de
nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos antisentido o de sentido
pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de
ácido nucleico diana mediante cualquier método de transferencia
génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de DNA mediada por
CaPO_{4}^{-}, electroporación o usando vectores de transferencia
génica tales como el virus de Epstein-Barr. Los
oligonucleótidos antisentido o de sentido se introducen
preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido
nucleico diana mediante la inserción del oligonucleótido antisentido
o de sentido en un vector retroviral adecuado, poniendo a
continuación en contacto la célula con el vector de retrovirus que
contiene la secuencia insertada, in vivo o ex vivo.
Vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, los
derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un
retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de
doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la Solicitud PCT
US 90/02656).
Los oligonucleótidos de sentido o antisentido
también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia
de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una
molécula que se une a un ligando, según se describe en WO 91/04753.
Moléculas que se unen a ligandos adecuadas incluyen, pero no se
limitan a, receptores de la superficie celular, factores de
crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a
receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula que se une a un ligando no interfiere
substancialmente con la capacidad de la molécula que se une a un
ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o
bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o
su versión conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido de sentido
o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, según se describe
en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido de sentido o
antisentido-lípido se disocia preferiblemente
dentro de la célula mediante una lipasa endógena.
Además de lo anterior, los siguientes ejemplos
se proporcionan para ilustrar modalidades particulares y no limitan
el alcance de la invención.
Ejemplo comparativo
1
Este ejemplo describe un procedimiento para
aislar una secuencia de DNA que codifica LERK-6
murino de la invención. Se obtuvo una biblioteca de cDNA
embrionario murino de 11,5 días disponible comercialmente de
Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California. La biblioteca
se cultivó en placas de acuerdo con los procedimientos detallados
en el manual proporcionado por Clonetech y se rastreó usando las
sondas radiomarcadas con ^{32}P. Las sondas se generaron cada una
usando técnicas estándar. Generalmente, se realizaron
amplificaciones por reacción en cadena de la polimerasa (Mullis y
Faloona, Meth. Enzymol. 155:335-350,
1987) usando dos grupos de cebadores. El primer grupo,
se usó para generar fragmentos de
DNA de doble hebra amplificados a partir del DNA de
LERK-3. LERK-3 es la materia de las
solicitudes de patente en tramitación junto con la presente Nº de
Serie 08/109.745, 08/114.426, 08/161.132 y 08/240.124, presentadas
el 9 de mayo de 1994. La sonda procedente de LERK-3
comprendía los nucleótidos 260 a 481 del Nº ID SEC: 1 de la
solicitud en tramitación junto con la presente Nº de Serie
08/240.124, presentada el 9 de mayo de 1994. El segundo grupo de
cebadores,
se usó para generar fragmentos de
DNA de doble hebra amplificados a partir del DNA de
LERK-4. LERK-4 también es la
materia de las solicitudes de patente en tramitación junto con la
presente Nº de Serie 08/109.745, 08/114.426, 08/161.132 y
08/240.124, presentadas el 9 de mayo de 1994. La sonda procedente de
LERK-3 comprendía los nucleótidos 110 a 467 del Nº
ID SEC: 3 de la solicitud en tramitación junto con la presente Nº de
Serie 08/240.124, presentada el 9 de mayo de 1994. Los fragmentos
se radiomarcaron con ^{32}P y se usaron como sondas para rastrear
una biblioteca embrionaria
murina.
El rastreo con las sondas se efectuó mediante
procedimientos convencionales y se identificaron clones de
hibridación. Las condiciones de hibridación consistían en 42ºC y
50% de Starks lavado hasta 0,1 X SSC a 63ºC. Se determinó la
secuencia de nucleótidos del inserto de cDNA de un clon individual
aislado de la biblioteca embrionaria murina, denominado clon
\lambda13. Una secuencia de cDNA substancialmente completa de la
región de codificación del cDNA del clon \lambda13, y la
secuencia de aminoácidos codificada por la misma, se presentan en
los Nº ID SEC: 1 y Nº ID SEC: 2, respectivamente. El marco de
lectura abierto dentro de esta secuencia codifica una proteína de
148 aminoácidos. Puesto que los extremos N de las proteínas de la
familia LERK no son homólogos, se cree que el primer aminoácido del
Nº ID SEC: 1 (Ala) está situado en o muy cerca del extremo N
natural. Además, debido a que el LERK-6 de esta
invención es homólogo con otras moléculas de LERK biológicamente
activas, existe una probabilidad significativa de que el cDNA del
Nº ID SEC: 1 codifique una proteína biológicamente activa. La
secreción de tal proteína activa es posible a través de los
procedimientos descritos anteriormente con respecto a la adición de
una metionina iniciadora adecuada y una secuencia de señal adecuada,
tal como aquella para IL-7 murina. La secuencia de
aminoácidos de LERK-6 es 58% homóloga con la de una
citoquina denominada LERK-3.
Un lisado celular que contiene DNA del clon
\lambda13 (el cDNA de LERK-6 en \lambdagt10) se
depositó en the American Type Culture Collection, Rockville, MD,
EE.UU. de A. el 15 de julio de 1994 y se le asignó el número de
registro ATCC 75829. El depósito se realizó bajo los términos del
Tratado de Budapest.
Este ejemplo describe la clonación de ácidos
nucleicos que codifican LERK-6 humano. La secuencia
de LERK-6 humano es de un clon genómico aislado
sondeando una biblioteca genómica humana con una sonda de cDNA de
LERK-6 murino que codifica los aminoácidos
30-173. Los filtros que contienen calvas se
hibridaron a sonda marcada con ^{32}P a 55ºC durante 24 h, se
lavaron hasta 0,5 x SSC a 55ºC y se expusieron a película de rayos X
(Kodak, XAR-5). Una secuencia de ácidos nucleicos
contenida en tal clon se muestra posteriormente, también en el Nº
ID SEC: 7, y los aminoácidos codificados por la misma se muestran en
el Nº ID SEC: 8:
En comparación con LERK-6
murino, el LERK-6 humano posee un 98,077 por ciento
de similitud y un 93,269 por ciento de identidad.
Un DNA de LERK-6 humano completo
se aisló sondeando una biblioteca de DNA genómico humano
(Stratagene, La Jolla, CA) con la secuencia de ácido nucleico
mostrada en el Nº ID SEC: 7. Los filtros que contenían calvas se
hibridaron a la sonda marcada con ^{32}P a 55ºC durante 24 h, se
lavaron hasta 0,5 x SSC a 55ºC y se expusieron a película de rayos
X. Se aislaron dos clones diferentes usando esta técnica. A
continuación, el mismo procedimiento de aislamiento se repitió
usando la biblioteca de DNA genómico humano procedente de una
preparación diferente (Stratagene, La Jolla, CA). Este procedimiento
daba como resultado el aislamiento de un tercer clon que tenía una
secuencia de nucleótidos diferente. Los tres clones aislados se
mapearon por restricción y a continuación se subclonaron en
plásmido Bluescript y se sometieron a secuenciación. Usando la
secuencia de LERK-6 murino como una plantilla, se
identificaron los intrones y exones de los clones. La secuencia de
DNA que codifica LERK-6 humano de longitud completa,
según se determina comparando las regiones de codificación del
LERK-6 murino, se identifica en el Nº ID SEC: 9 y la
secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de DNA de
longitud completa se identifica en el Nº ID SEC: 10.
Los plásmidos que incluyen el DNA de
LERK-6 clonado se depositaron en the American Type
Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU. de A., el _______ de
agosto de 1997 y se les asignó el número de registro ATCC ________.
Los depósitos se realizaron bajo los términos del Tratado de
Budapest.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector de expresión que codifica una proteína de fusión elk:Fc
soluble. Esta proteína de fusión puede emplearse en los ensayos de
unión del Ejemplo 5, para determinar las características de unión
de LERK-6.
Una secuencia de DNA y de aminoácidos codificada
para cDNA de elk de rata se presenta en Lhotak y otros (Mol.
Cell. Biol. 11:2496, 1991), incorporado por la presente mediante
referencia. La proteína elk de rata tiene un dominio extracelular
de 538 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 25 aminoácidos y
un dominio citoplásmico de 419 aminoácidos.
El fragmento de cDNA de elk de rata se fusionó
al extremo 5' de cDNA que codifica la porción Fc de un anticuerpo
de IgG1 humana. El cDNA de elk de rata puede obtenerse de T. Pawson
(Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto).
Un sitio de segmentación de endonucleasa de restricción Asp718 se
introdujo aguas arriba de la región de codificación de elk. Se
aisló un fragmento Asp718-BgIII de cDNA de elk de
rata (que comprende el dominio extracelular entero, la región de
transmembrana y una pequeña porción del dominio citoplásmico).
DNA que codifica una cadena polipeptídica simple
que comprende la región Fc de un anticuerpo para IgG1 humana se
clonó en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT SK®, que está
disponible comercialmente de Stratagene Cloning Systems, La Jolla,
California. Este vector plasmídico es replicable en E. coli y
contiene un segmento policonector que incluye 21 sitios de
restricción únicos. La secuencia de nucleótidos del DNA clonado,
junto con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de Fc
codificada por la misma, se describen en la solicitud PCT WO
93/10151, incorporada por la presente mediante referencia. Se ha
introducido un sitio BglII único y abarca los codones para
los aminoácidos tres y cuatro del polipéptido de Fc. El polipéptido
de Fc codificado se extiende desde la región de bisagra
N-terminal hasta el extremo C natural, es decir, es
una región Fc de anticuerpo esencialmente de longitud completa.
El fragmento de cDNA de elk
Asp718-BglII anteriormente descrito se clonó en el
vector pBLUESCRIPT SK® que contiene el cDNA de Fc, de modo que el
cDNA de elk está situados aguas arriba del cDNA de Fc. DNA de una
sola hebra derivado de la fusión génica resultante se mutagenizó
mediante los métodos descritos en Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82:488, 1985) y Kunkel y otros (Methods in Enzymol.
154:367, 1987) para fusionar perfectamente el dominio extracelular
entero de elk a la secuencia de Fc. El DNA mutagenizado se sometió a
secuenciación para confirmar que se habían retirado los nucleótidos
apropiados (es decir, que se sometían a deleción el DNA de la
región de transmembrana y el dominio citoplásmico parcial) y que las
secuencias de elk y Fc estaban en el mismo marco de lectura.
La proteína de fusión elk:Fc se sintetiza
preferiblemente en células huésped de mamífero, tales como células
CV1-EBNA o COS-7. La fusión génica
elk:Fc se cortó y se insertó en un vector de expresión de mamífero
denominado HAV-EO (Dower y otros, J.
Immunol. 142:4314, 1989). Células huésped de mamífero se
transfectaron con el vector de expresión recombinante resultante y
se cultivaron para permitir la expresión transitoria de la proteína
de fusión, que se secretó en el medio de cultivo a través del
péptido de señal de elk. La proteína de fusión de elk:Fc se
purificó mediante cromatografía de afinidad, usando una columna de
proteína A-Sepharose.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector de expresión que codifica una proteína de fusión hek:Fc
soluble. Esta proteína de fusión puede emplearse en los ensayos de
unión del Ejemplo 5, para determinar las características de unión
de LERK-6.
Un DNA y la secuencia de aminoácidos codificada
para cDNA de hek humano se presentan en Wicks y otros (Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Esta proteína hek
comprende (del extremo N al C) un dominio extracelular, un dominio
de transmembrana y un dominio citoplásmico.
Dos fragmentos de DNA, uno que codifica un
fragmento N-terminal del dominio extracelular de hek
y el otro que codifica un fragmento C-terminal del
dominio extracelular de hek, se aislaron mediante reacciones en
cadena de la polimerasa (PCR) realizadas bajo condiciones estándar,
usando cebadores oligonucleotídicos basados en la secuencia de
nucleótidos de hek publicada por Wicks y otros, anteriormente. La
plantilla para la PCR era cDNA preparado a partir de mRNA aislado
de una línea celular leucémica de células T humana denominada
CCRF-HSB-2 (ATCC
CCL-120.1). Los productos de PCR que contenían el
extremo 5' del DNA de hek se digirieron con SpeI y HindIII para
aislar un fragmento de DNA que se extiende desde el extremo 5' de la
secuencia de hek humano maduro (es decir, que carece de DNA que
codifica la secuencia de señal) hasta un sitio HindIII encontrado
en el gen hek. Los productos de PCR que contienen el extremo 3' del
DNA del dominio extracelular de hek se digirieron con HindIII y
ClaI para aislar un fragmento que se extiende desde el sitio HindIII
interno hasta un sitio ClaI justo aguas abajo del extremo 3' de la
secuencia que codifica el dominio extracelular de hek. El sitio
ClaI es un sitio de clonación múltiple (mcs) introducido justo aguas
abajo del dominio extracelular.
Se aisló DNA que codifica una muteína de la
región Fc de un anticuerpo para IgG1 humana. Este DNA de muteína de
Fc y el polipéptido codificado por el mismo se describen en la
Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/097.827, titulada
"Nueva Citoquina que es un Ligando para OX40", presentada el 23
de julio de 1993. Este DNA de muteína se derivó de un DNA que
codifica el polipéptido de Fc natural mediante mutagénesis dirigida
al sitio efectuada esencialmente según se describe por Deng y
Nickoloff, Anal. Biochem. 200:81 (1992). La secuencia
de aminoácidos del polipéptido de la muteína de Fc es idéntica a la
del polipéptido de Fc natural descrito en la solicitud PCT WO
93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala,
el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se
ha cambiado de Gly a Ala. Esta Fc de muteína exhibe afinidad
reducida para receptores de inmunoglobulina.
Un vector recombinante que contiene el DNA de
muteína de Fc se segmentó con ClaI y NotI, que segmentan el vector
en una región policonectora inmediatamente aguas arriba y aguas
abajo, respectivamente, del inserto de DNA de la muteína de Fc. Se
aisló el fragmento que codifica la muteína de Fc deseado.
El polipéptido de Fc de muteína se extiende
desde la región de bisagra N-terminal hasta el
extremo C natural, es decir, es una región Fc de anticuerpo
esencialmente de longitud completa. También pueden emplearse
fragmentos de regiones Fc, por ejemplo los que están truncados en
el extremo C-terminal. Los fragmentos contienen
preferiblemente múltiples residuos de cisteína (al menos los
residuos de cisteína de la región de bisagra) para permitir que se
formen enlaces disulfuro intercatenarios entre las porciones del
polipéptido de Fc de dos proteínas de fusión hek:Fc separadas,
creando dímeros.
Un vector de expresión de mamífero denominado
SMAG4 se segmentó con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende una
secuencia que codifica el péptido de señal de interleuqina 7 murina
(descrita en la Patente de EE.UU. 4.965.195) insertada en el vector
de alta expresión de mamífero pDC201 (descrito en Sims y otros,
Science 241:585, 1988 y en la solicitud PCT WO 89/03884), que
también es capaz de replicación en E. coli. SpeI segmenta el
vector inmediatamente aguas abajo de la secuencia que codifica el
péptido de señal de IL-7. NotI segmenta
aproximadamente 155 pb aguas abajo del sitio SpeI en un sitio de
clonación múltiple del vector. Se aisló el fragmento SpeI/NotI
grande que contiene las secuencias vectoriales y el DNA que codifica
el péptido de señal de IL-7.
Se efectuó una ligación cuatridireccional para
insertar los dos fragmentos de DNA que codifican hek y el fragmento
de DNA que codifica muteína de Fc descritos anteriormente en el
vector de expresión SMAG4 segmentado con SpeI/NotI. Células de
E. coli se transfectaron con la mezcla de ligación y el
vector recombinante deseado se aisló de las mismas. El vector
aislado codifica una proteína de fusión que comprende (desde el
extremo N al C) el péptido de señal de IL-7 murina,
el dominio extracelular de hek, cuatro aminoácidos codificados por
los mcs introducidos y la muteína de Fc.
El vector de expresión se cotransfectó a
continuación con el plásmido pSV3.NEO en células CV1/EBNA. La línea
celular CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de
riñón de mono como la descrita en McMahan y otros (EMBO J.,
10:2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa antígeno T de
SV40, que no es producido por las células huésped. Este vector
pSV3.NEO es similar a pSV3 (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78:2072, 1981), pero contiene adicionalmente un
gen de resistencia a neomicina. Las células transformadas se
cultivaron para permitir la expresión transitoria de la proteína de
fusión, que se secreta al medio de cultivo a través del péptido de
señal de IL-7 murina. La proteína de fusión puede
purificarse sobre una columna de proteína
A-Sepharose, eluirse y usarse para rastrear células
con respecto a la capacidad para unirse a la proteína hek:Fc o la
proteína elk:Fc.
La capacidad de LERK-6 para
unirse a elk o hek puede determinarse usando el siguiente ensayo. Se
preparan células que expresan LERK-6 sobre la
superficie celular. DNA de LERK-6 se amplifica
mediante PCR. Los cebadores empleados en la PCR se seleccionan para
definir los extremos de la región de codificación del DNA de
LERK-6, y también incluyen un sitio de restricción
Xho I en el extremo 5' y un sitio Not I en el extremo 3' del DNA
amplificado. El cebador 5' incluía adicionalmente una secuencia
Kozak de consenso aguas arriba del codón de iniciación.
Los productos de reacción se digieren con Xho I
y Not I y se insertan en el vector de expresión segmentado
con
Sal I (que es compatible con Xho I) y Not I. El vector de expresión puede ser pDC410, que es un vector de expresión de mamífero que también se replica en E. coli. pDC410 es similar a pDC406 (McMahan y otros, EMBO J. 10:2821, 1991). El sitio de clonación múltiple (mcs) de pDC410 difiere del pDC406 en que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada marco de lectura). Un promotor de polimerasa T7 aguas abajo del mcs facilita la secuenciación de DNA insertado en el mcs. Además, el origen de replicación de EBV se reemplaza por DNA que codifica el antígeno T grande de SV40 (conducido a partir de un promotor de SV40) en pDC410.
Sal I (que es compatible con Xho I) y Not I. El vector de expresión puede ser pDC410, que es un vector de expresión de mamífero que también se replica en E. coli. pDC410 es similar a pDC406 (McMahan y otros, EMBO J. 10:2821, 1991). El sitio de clonación múltiple (mcs) de pDC410 difiere del pDC406 en que contiene sitios de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada marco de lectura). Un promotor de polimerasa T7 aguas abajo del mcs facilita la secuenciación de DNA insertado en el mcs. Además, el origen de replicación de EBV se reemplaza por DNA que codifica el antígeno T grande de SV40 (conducido a partir de un promotor de SV40) en pDC410.
Células
CV1-EBNA-1 en platos de 10 cm^{2}
se transfectan con el vector de expresión recombinante que contiene
DNA de LERK-6. La línea celular
CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresa
constitutivamente antígeno 1 nuclear de EBV conducido a partir del
potenciador/promotor inmediato-temprano de CMV.
CV1-EBNA-1 se deriva de la línea
celular de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC
CCL 70), según se describe por McMahan y otros (EMBO J.
10:2821, 1991).
Las células transfectadas se cultivan durante 24
horas y las células de cada plato se reparten a continuación en una
placa de 24 pocillos. Después de cultivar 48 horas adicionales, se
efectúa un ensayo de unión mediante el siguiente procedimiento. Las
células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/pocillo)
se lavan con BM-NFDM, que es un medio de unión
(RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2
mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM, pH 7,2) al que se han añadido
50 mg/ml de leche en polvo desnatada. Las células se incuban a
continuación durante 1 hora a 37ºC con diversas concentraciones de
la proteína de fusión elk:Fc preparada en el Ejemplo 2 o la
proteína de fusión hek:Fc preparada en el Ejemplo 3. A continuación,
las células se lavan y se incuban con una concentración saturante
constante de una ^{125}I-anti-(IgG humana) de
ratón en medio de unión, con agitación suave durante 1 hora a 37ºC.
Después de un lavado intensivo, las células se liberan a través de
tripsinización.
La anti-(IgG humana) de ratón empleada
anteriormente se dirige contra la región Fc de IgG humana y puede
obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove,
PA. El anticuerpo se radioyoda usando el método de cloramina T
estándar. El anticuerpo se unirá a la porción Fc de cualquier
proteína de fusión elk:Fc o hek:Fc que se haya unido a las células.
En todos los ensayos, la unión no específica de
^{125}I-anticuerpo se ensaya en ausencia de
elk:Fc (o hek:Fc), así como en presencia de elk:Fc (o hek:Fc) y un
exceso molar de 200 veces de anticuerpo anti-(IgG humana) de ratón
no marcado.
El ^{125}I-anticuerpo unido a
células se cuantifica en un contador Packard Autogamma. Los cálculos
de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949)
se generan en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) desarrollado en
ordenador Microvax.
Ejemplo comparativo
6
Este ejemplo ilustra un método para preparar
anticuerpos monoclonales para LERK-6.
LERK-6 purificado, un fragmento del mismo tal como
el dominio extracelular, péptido sintético o células que expresan
LERK-6 pueden usarse para generar anticuerpos
monoclonales contra LERK-6 usando técnicas
convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la Patente
de EE.UU. 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con
LERK-6 como un inmunógeno emulsificado en adyuvante
completo de Freund e inyectado en cantidades que varían de
10-100 \mug subcutáneamente o
intraperitonealmente. De diez a doce días más tarde, los animales
inmunizados se refuerzan con LERK-6 adicional
emulsificado en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se
refuerzan periódicamente más tarde con un esquema de inmunización
de semanal a bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero
mediante sangrado retroorbital o escisión en la punta de la cola
para probar con respecto a anticuerpos para LERK-6
mediante ensayo de transferencia por gotas, ELISA (Ensayo de
Inmunoabsorción con Enzimas Ligadas) o inhibición de la unión a hek
o elk.
Después de la detección de una concentración de
anticuerpo apropiada, se les proporciona a los animales positivos
una inyección intravenosa final de LERK-6 en
solución salina. De tres a cuatro días más tarde, los animales son
sacrificados, las células del bazo se recogen y las células del bazo
se fusionan a una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NSI
o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan
células de hibridoma, que se cultivan en placa en múltiples placas
de microvaloración en un medio selectivo para HAT (hipoxantina,
aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no
fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.
Las células de hibridoma se rastrean mediante
ELISA con respecto a la reactividad contra LERK-6
purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en
Engvall y otros, Immunochem. 8:871, 1971 y la Patente
de EE.UU. 4.703.004. Una técnica de rastreo preferida es la técnica
de captura de anticuerpos descrita en Beckmann y otros, (J.
Immunol. 144:4212, 1990). Las células de hibridoma
positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones BALB/c
singeneicos para producir ascitis que contienen altas
concentraciones de anticuerpos monoclonales
anti-LERK-6-L.
Alternativamente, las células de hibridoma pueden desarrollarse
in vitro en matraces o botellas giratorias mediante diversas
técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de
ratón pueden purificarse mediante precipitación con sulfato
amónico, seguida por cromatografía de exclusión en gel.
Alternativamente, también puede usarse cromatografía de afinidad
basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, como
también cromatografía de afinidad basada en la unión a
LERK-6.
Este ejemplo describe un procedimiento para
generar ratones transgénicos que sobreexpresan
LERK-6. Los ratones transgénicos que sobreexpresan
LERK-6 pueden estudiarse para determinar los efectos
biológicos de la sobreexpresión. Pronúcleos de ratón (B16/J) se
microinyectan con DNA de LERK-6 de acuerdo con el
método descrito por Gordon y otros, Science
214:1244-1246, (1981). En general, los huevos de
ratón fertilizados que tienen pronúcleos visibles se ponen en
primer lugar en una cámara de inyección y se mantienen en su lugar
con una pequeña pipeta. Se usa una pipeta de inyección para
inyectar el gen que codifica el LERK-6 (por ejemplo,
el clon Nº 6C) en los productos del huevo. Los huevos inyectados se
(i) transfieren al oviducto de una hembra pseudopreñada 0,5 días
después del coito; (ii) se cultivan in vitro hasta el estadio
de dos células (durante la noche) y se transfieren al oviducto de
una hembra pseudopreñada 0,5 días después del coito; o (iii) se
cultivan in vitro hasta la fase de blastocisto y se transfieren al
útero de una hembra pseudopreñada 2,5 días después del coito.
Preferiblemente, puede usarse cualquiera de las dos primeras
opciones ya que evitan el cultivo in vitro prolongado y,
preferiblemente, aproximadamente 20-30 huevos
microinyectados deben transferirse para evitar camadas
pequeñas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citoquina Denominada LERK-6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Immunex Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE. UU. DE A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC Compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word para Windows, Versión 7.0a
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT - -pendiente de concesión- -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 27 de agosto de 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Henry, Janis C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.347
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2826
\hskip2.8cm245-35829/RJP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206) 587-0430
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFÁX: (206) 233-0644
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 555 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: LERK-6
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..52
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 184 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATATTTACT GCCCGCACTA CAACAGCT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGAAGGCG CTGTAGCGCT GGAAC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCCA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCTCAAGC ACTGGCCAGA ACTCTCTCTG GAGT
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 314 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..313
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 642 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..642
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido de Señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1-90
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 214 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Una secuencia de DNA aislada seleccionada del
grupo que consiste en:
- a)
- DNA que codifica un polipéptido que se une a la tirosina quinasa receptora hek/elk y que comprende los aminoácidos 1 a 184 del Nº ID SEC: 10;
- b)
- DNA humano que es el complemento de DNA humano que se hibrida bajo condiciones altamente restrictivas al DNA de (a), en donde el DNA humano que es el complemento codifica un polipéptido que se une a hek/elk;
- c)
- DNA que, debido a la degeneración del código genético, codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el DNA de (a) o (b).
2. Una secuencia de DNA aislada que comprende
los nucleótidos 88 a 642 del Nº ID SEC: 9.
3. Un polipéptido que comprende los aminoácidos
1 a 184 del Nº ID SEC: 10.
4. Un polipéptido que comprende los aminoácidos
1 a 145 del Nº ID SEC: 10.
5. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2.
6. Una célula huésped transfectada o
transformada con el vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 5.
7. Un procedimiento para producir un
polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo
con la reivindicación 6 bajo condiciones que promueven la
expresión.
8. Un mamífero no humano transgénico, la
totalidad de cuyo germen y células somáticas contienen una secuencia
de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 introducida en dicho
animal.
9. Un método para separar células que tienen el
receptor hek/elk sobre la superficie de las mismas de una mezcla de
células en suspensión, que comprende poner en contacto las células
en la mezcla con una superficie de contacto que tiene un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4
sobre la misma, y separar la superficie de contacto y la
suspensión.
10. Un método para aportar una molécula deseada
a una célula in vitro que tiene hek/elk sobre su superficie,
que comprende poner en contacto el hek/elk con una proteína de
fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 3 o la reivindicación 4 y la molécula deseada.
11. Una proteína de fusión que comprende un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación
4 y una molécula deseada, para usar en el aporte de la molécula
deseada a una célula que tiene hek/elk sobre su superficie.
12. Uso de una proteína que comprende un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación
4 y una molécula deseada, en la fabricación de una proteína de
fusión para el aporte de la molécula deseada a una célula que tiene
hek/elk sobre su superficie.
13. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 o la
reivindicación 4.
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---|---|---|---|
US920440 | 1997-08-29 | ||
US08/920,440 US5919905A (en) | 1994-10-05 | 1997-08-29 | Cytokine designated LERK-6 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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EP (1) | EP1009832B1 (es) |
JP (1) | JP2003532365A (es) |
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