ES2209184T3 - Composiciones que contienen bergamotina para aumentar la biodisponibilidad oral de agentes farmaceuticos. - Google Patents
Composiciones que contienen bergamotina para aumentar la biodisponibilidad oral de agentes farmaceuticos.Info
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Abstract
Una composición farmacéutica oral o un supositorio que comprende Bergamotina en su forma aislada y un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% mezclados con al menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptables.
Description
Composiciones que contienen Bergamotina para
aumentar la biodisponibilidad oral de agentes farmacéuticos.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica o un supositorio que comprende Bergamotina
(BG) y un compuesto que tiene biodisponibilidad oral baja. La
presente invención se refiere al uso de BG para aumentar la
biodisponibilidad de los compuestos mediante la coadministración
del compuesto con BG.
Más particularmente, la presente invención se
refiere al uso de BG para inhibir el metabolismo enzimático
intestinal de compuestos que tienen baja biodisponibilidad.
Específicamente, la inhibición del citocromo intestinal P450 3A4
mediante BG disminuye el metabolismo intestinal de los compuestos y
aumenta su biodisponibilidad oral. Adicionalmente, la presente
invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen BG
en combinación con un compuesto que tiene baja biodisponibilidad y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La biodisponibilidad oral se define como la
fracción de fármaco inalterada que alcanza la circulación sistémica
después de la administración por vía oral. La potenciación de la
biodisponibilidad de los agentes farmacéuticos ha atraído mucha
atención hacia el desarrollo de fármacos y la farmacología clínica.
Ya que el P450 3A4 es el enzima P450 principal expresado en los
intestinos e implicado en el metabolismo de un amplio espectro de
fármacos usados clínicamente, se considera que es uno de los
determinantes principales de la biodisponibilidad oral de estos
fármacos. Algunos fármacos costosos, tales como la ciclosporina,
FK506, taxol, indinavir, saquinavir, etc., se ha encontrado que son
metabolizados ampliamente por P450 3A4. Se ha encontrado que la
coadministración de algunos de estos fármacos con inhibidores de
P450 3A4 aumenta su biodisponibilidad.
Se ha demostrado que la coadministración oral de
zumo de pomelo aumenta significativamente la biodisponibilidad oral
de varios fármacos clínicamente usados incluyendo dihidropiridinas
(Bailey D.G., Spence J.D., Munoz C., and Arnold J.M.O.
Interaction of citrus juices with felodipine and nifedipine.,
Lancett, 1991;337:268-269 and Bailey D.G.,
Arnold J.M.O., Bend J.R., Tran L.T., and Spence J.D. Grapefruit
juice-felodipine interaction:reproducibility and
characterization with the extended release drug formulation.
Br.J.Clin. Pharmacol, 1995;40:135-140),
ciclosporina A (Ducharme M.P., Warbasse L.H. Characterización
with the extended release drug formulation, Br.J.Clin.
Pharmacol, 1995;40:135-140, ciclosporina A
(Ducharme M.P., Warbasse L.H and Edwards D.J. Disposition of
intravenous and oral cyclosporine after administration with
grapefruit juice. Clin. Pharmacol. Ther.,
1995;57:485-491), midazolam (Kuferschmidt H.H., Ha
H.R., Ziegler W.H., Meier P.J., and Krahenbuhl S. Interaction
between grapefruit juice and midazolam in humans, Clin. Pharmacol.
Ther., 1995;58:20-28), triazolam (Hukkinen
S.K., Varhe A., Olkkola K.T., and Neuvonen P.J. Plasma
concentrations of triazolam are increased by concomitant ingestion
of grapefruit juice, Clin Pharmacol.
Ther.,1995;58:127-131), terfenadina (Benton
R.E., Hoig P.K., Zamaani K., Cantinela L.R., and Woosley R.L.
Grapefruit juice alters terfenadine pharmacokinetics, resulting
in prolongation of repolarization on the electrocardiogram. Clin.
Pharmacol. Ther., 1996;59:383-388), y
etinil-estradiol (Weber A., Jager R., Borner A.,
Klinger G., Vollanth R., Mathey K., and Balogh A. Can grapefruit
juice influence ethinylestradiol bioavailability?
Contraception, 1996;53:41-47. Ya que todos
estos fármacos son metabolizados principalmente por el citocromo
P450 3A4, el enzima P450 intestinal y hepático predominante (Shimada
T., andamazaki H., Mimura M., Inui Y., and Guengerich F.P.
Interindividual variation in human liver cytochrome
P-450 enzymes involved in the oxidation of drugs,
carcinogens and chemicals:studies with liver microsomes of 30
Japanese and 30 Caucasians. J. Pharmacol. Exp.
Ther.,1994;270:414-422 and Watkins P.B.,
Wrighton S.A., Schuetz E.G., Molowa D.T., and Guzelian P.S.
Identification of glucocorticoid-inducible
cytochrome P-450 in the intestinal mucosa of rats
and man. J. Clin. Invest.,
1987;80:1029-1036), sugiere que el efecto del zumo
de pomelo puede ser debido a la inhibición de la actividad de P450
3A4. Más recientemente, se ha demostrado que el zumo de pomelo
disminuye drásticamente la inmunoreactividad del contenido de P450
3A4 en los enterocitos de los intestinos humanos sin ningún cambio
en el contenido del mRNA de P450 3A4 (Lown K.S., Bailey D.G.,
Fontana R.J., Janardan S.K., Adair C.H., Fortlage L.A., Brown M.B.,
Guo W., and Watkins P.B. Grapefurit juice increases felodipine
oral bioavailability in humans by decreasing intestinal CYP 3A
protein expression. J. Clin. Invest.,
1997;99:1-9). Estos resultados sugieren que la
degradación de la proteína P450 3A4 se puede acelerar mediante la
ingestión de zumo de pomelo (Lown, Supra., 1997). Debido a
que la inactivación suicida de P450 3A de rata podría acelerar la
degradación de la apoP450 (Correia M.A, Davoll S.H., Wrighton S.A.,
and Thomas P.E. Degradation of rat liver cytochrome P450 3A
after their inactivation by
3,5-dicarbethoxy-2,6-dimethyl-4-ethyl-1,4-dihydropyridina:
characterization of the proteolytic system. Arch. Biochem.
Biophys., 1992;297:228-238), se ha sugerido que
el mecanismo en el que se basa la inactivación de P450 3A4 está
implicado en los efectos del zumo de pomelo.
Para identificar los componentes principales del
zumo de pomelo responsables del aumento de la biodisponibilidad de
algunos fármacos, flavonoides, tales como naringenina, naringina,
quercetina, y kaemferol, han sido elegidos como posibles candidatos
debido a que han demostrado que inhiben competitivamente la
actividad de P450 3A4 in vitro (Miniscalco A., Lundahl J.,
Regardh C.G., Edgar B., and Eriksson U.G. Inhibition of
dihydropyridine metabolism in rat and human liver microsomes by
flavonoids found in grapefruit juice. J.Pharmacol. Exp.
Ther., 1992;261;1195-1199 and Ghosal A., Satoh
H., Thomas P.E., Bush E., and Moore D. Inhibition and kinetics of
cytochrome P450 3A4 activity in microsomes from rat, human and
cDNA- expressed human cytochrome P450. Drug. Metab.
Dispos., 1996;24:940-947). Sin embargo, la
administración oral de estos flavonoides no produjo los efectos del
zumo de pomelo (Bailey D.G., Arnold J.M.O., Munoz C., and Spence J.
Grapefruit juice-felodipine interaction:
mechanism, predictability, and effect of naringin. Clin.
Pharmacol.Ther., 1993;53;637-642 and Rashid J.,
McKinstry C., Renwick A.G., Dirnhuber M., Waller D.G., and George
C.F. Quercetin, an in vitro inhibitor of CYP3A, does not
contribute to the interaction between nifedipino and grapefruit
juice. Br. J. Clin. Pharmac.,
1993;36;460-463). Recientemente, la purificación
por HPLC del extracto de cloruro de metileno del zumo de pomelo a
conducido a la identificación de
6',7'-dihidroxibergamotina como un componente del
zumo de pomelo que causa la inhibición de la
6\beta-hidroxilasa-testosterona en
los microsomas del hígado de ratas inducidas con dexametasona
(Edwards D.J., Bellevue F.H., III, and Woster P.M. Identification
of 6',7'-dihydroxybergamottin, a cytochrome P450
inhibitor, in grapefruit juice. Drug. Metab. Dispos.,
1996;24:1287-1290).
En esta invención se ha encontrado
sorprendentemente e inesperadamente que BG es el compuesto principal
del zumo de pomelo responsable del mecanismo en el que se basa la
inhibición del citocromo humano P450 3A4. Por tanto, la
coadministración de un compuesto que tiene baja biodisponibilidad
oral en combinación con BG se puede usar para aumentar la
biodisponibilidad oral del compuesto.
Por consiguiente, una primera realización de la
presente invención proporciona una composición farmacéutica o un
supositorio que comprende bergamotina en su forma aislada y un
compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% en
mezcla con al menos un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéuticamente aceptables.
Una realización adicional añadida de la presente
invención, es el uso de bergamotina en su forma aislada para la
preparación de una composición farmacéutica oral o un supositorio
para inhibir el metabolismo intestinal enzimático de un compuesto
que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% y para aumentar
la biodisponibilidad de dicho compuesto.
Otra realización de la presente invención es el
uso de bergamotina en su forma aislada para la preparación de una
composición farmacéutica oral o un supositorio para inhibir el
metabolismo intestinal del citocromo P4503 A4.
La invención se describe adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos no limitantes que se refieren a las figuras
adjuntas 1 a 8, de las que se da a continuación resúmenes
reducidos.
La figura 1 muestra los perfiles de HPLC en fase
inversa del extracto de zumo de pomelo. El eluido se monitorizó por
detección UV a 310 nm, Panel A. Los cromatogramas iónicos
reconstruidos para BG [M + H]^{+} de m/z 339, Panel B; BG
monohidroxilada, [M + H]^{+} de m/z 355, Panel C; BG
bis-hidroxilada [M + H]^{+} de m/z 373,
Panel D.
La figura 2 es un espectro MS/MS de iones
producto de BG, [M + H]^{+} de m/z 339.
La figura 3 son espectros MS/MS de iones producto
de metabolitos de BG-monohidroxilada, [M +
H]^{+} de m/z 355, Panel A, 12,9 min (abundancia relativa
39%), Panel B, 17,7 min (6%); Panel C, 18,1 min (11%); Panel D, 19,6
min (7%); Panel E, 24,1 min (37%). Los sitios de oxidación
indicados están basados en el comportamiento de disociación
inducida por colisión del ión precursor de m/z 355; es decir, el
ión producto de m/z 203 corresponde al resto intacto de
5-hidroxipsoraleno y por tanto, se indicada la
oxidación de la cadena de isopreno. Los sitios de oxidación
específicos no se pueden determinar a partir de los datos
MS/MS.
La figura 4 son espectros MS/MS de iones producto
de BG bis-hidroxilada, [M + H]^{+} de m/z
373, Panel A; 12,9 min; Panel B 15,9 min. %). Los sitios de
oxidación indicados están basados en el comportamiento de
disociación inducida por colisión; es decir, el ión de m/z 203
(Panel A) corresponde al resto intacto de
5-hidroxipsoraleno y por tanto, está indicada la
oxidación de la cadena de isopreno. La pérdida de formaldehído
(Panel B) para dar un ión de m/z 343 se interpretó como indicadora
de oxidación alifática. Los sitios de oxidación específicos no se
pueden determinar a partir de los datos de MS/MS.
La figura 5 son espectros diferenciales con
monóxido de carbono reducido (panel superior) y espectros
UV-visible (panel inferior) de la mezcla de reacción
de P450 3A4 reconstituida, incubada con BG en presencia de NADPH (-
-), con BG en ausencia de NADPH (-\bullet-) y sin BG en presencia
de NADPH (- - -), respectivamente. P450 3A4 (0,5 nmol/ml) se incubó
con BG 50 \muM en un sistema reconstituido a 37ºC durante 15
minutos como se describe en Métodos y Materiales. Se diluyeron
alícuotas de 0,25 ó 0,2 ml de las mezclas de incubación en 1,75 ó
0,8 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 20%
y EDTA 0,5 mM y los espectros diferenciales de P450 con monóxido de
carbono reducido y los espectros UV-visible se
tomaron respectivamente como se describe en Materiales y
Métodos.
La figura 6 son perfiles de HPLC del sistema de
P450 3A4 reconstituido después de la incubación con BG 50 \muM en
presencia (---) o ausencia de NADPH (- - - -). El eluido se
monitorizó a 214 nm y 405 nm (de forma intercalada). Los picos A, B,
Y C representan la
P450-NADPH-reductasa, citocromo
b_{5} y P450 3A4, respectivamente.
La figura 7 muestra la inhibición dependiente del
tiempo y la concentración de la actividad de la
6\beta-hidroxilación de testosterona de P450 3A4
por BG en un sistema reconstituido. Los detalles experimentales se
describieron en Materiales y Métodos. La concentración de BG en las
muestras de preincubación fue 0 \muM (\Box), 5 \muM
(\lozenge), 10 \muM (o), 25 \muM (\Delta), 50 \muM
(\triangledown), y 100 \muM (X), respectivamente.
La figura 8 muestra la inhibición de BG de las
actividades de P450 1A2 (), 2A6 (\lozenge), 2C9 (\Box), 2D6
(\Delta), 2E1 (X), y 3A4 (o), en microsomas de hígado humano por
BG. Las actividades de los enzimas P450 se determinaron usando los
métodos descritos en Materiales y Métodos. Los resultados se
expusieron como media de los tres experimentos.
El término "baja biodisponibilidad oral" se
refiere a un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor
que 50%. Preferiblemente menor que 30%.
Bergamottin, también conocida como
5-geranoxipsoraleno, bergamotina o bergaptina, se
conoce químicamente como
(E)-4-[3,7-dimetil-2,6-octadienil)oxi]-7H-furol[3,2-g][1]benzopiran-7-ona
y tiene la siguiente estructura química:
La siguiente tabla 1 proporciona una lista de
abreviaturas y sus definiciones, usadas en la presente
invención.
| Abreviatura | Definición |
| NADPH | Dinucleótido de nicotinamida y adenina |
| GSH | Glutatione |
| LC/UV | Cromatografía líquida/espectroscopía Ultravioleta |
| LC/MS | Cromatografía líquida/espectroscopía de masas |
| HPLC | Cromatografía líquida de alta resolución |
| ESI | Ionización por electropulverización |
| CID | Disolución inducida por colisión |
| MgCl_{2} | Cloruro de magnesio |
| EDTA | Ácido etilendiaminotetraácético |
| CO | Monóxido de carbono |
| BG | Bergamotina |
| IC_{50} | Concentración para inhibición media |
| K_{inactivación} | Constante de velocidad máxima de inactivación |
| K_{I} | Constante requerida para la inactivación media máxima |
| P450 | Citocromo P450 |
Se ha identificado la bergamotina como un
compuesto principal en el zumo de pomelo responsable del mecanismo
de inactivación de P450 3A4. Se identificaron también en el zumo de
pomelo varios derivados de BG monooxigenados o dihidroxilados. El
contenido de dihidroxibergamotinas, una de las cuales se aisló
previamente y se identificó para la inhibición de la
6\beta-hidroxilasa de la testosterona en los
microsomas del hígado de rata (Edwards, Supra, 1996), se
determinó que representaba menos que 20% del contenido de BG en el
zumo de pomelo. La mayoría de los derivados de BG en el zumo de
pomelo contienen el grupo furanocumarina intacto, el cual se presume
que es el responsable de la inactivación de los P450. La
bergamotina y sus derivados mono- o di-hidroxilados
no se observaron en el zumo de naranja, lo cual es consecuente con
las publicaciones de que el zumo de naranja no causa tales efectos
inhibitorios sobre el metabolismo intestinal del fármaco (Bailey,
Supra., 1991). El contenido de BG y sus derivados puede
variar significativamente entre las diferentes preparaciones de
zumo de pomelo, lo que podría explicar la discrepancia publicada en
relación con el efecto del zumo de pomelo (Vanakoski J., Mattila
M.J., and Seppala T. Grapefruit juice does not enhance the
effects of midazolam and triazolam in man. Eur. J. Clin.
Pharmacol., 1996;50:501-508).
La inactivación de la actividad de P450 3A4 era
dependiente del tiempo y la concentración y también requería el
metabolismo de BG. Estos resultados sugieren que BG es un
inactivador de P450 3A4, en el que se basa el mecanismo (Walsh C.T.
Suicide substrates, mechanism-based enzyme
inactivation: recent developments. Ann. Rev. Biochem.,
1984;53:493-535). Se han publicado previamente
varias otras furanocumarinas que causan el mecanismo en el que se
basa la inactivación de los P450, por ejemplo, corandrina (Cai Y.,
Baer-Dubowska W., Ashwood-Smith
M.J., Ceska O., Tachibana S., and DiGiovanni J.
Mechanism-based inactivation of hepatic
ethoxyresorufin O-dealkylation activity by
naturally occurring coumarins. Chem. Res. Toxicol.,
1996;9:729-736) y 8-metoxipsoraleno
(Labbe G., Descariote V., Beaune P., Letteron P., Larrey D., and
Pessayre D. Suicide inactivation of cytochrome
P-450 by methoxsalen, evidence for the covalent
binding of a reactive intermediate to the protein moiety. J.
Pharmacol. Exp. Ther., 1989;250:1034-1042 and
Mays D.C., Hilliard J.B., Wong D.D., Chambers M.A., Park S.S.,
Gelboin H.V., and Gerber N. Bioactivation of
8-methoxypsoralen and irreversible inactivation of
cytochrome P-450 in mouse liver microsomes:
modification by monoclonal antibodies, inhibition of drug
metabolism and distribution of covalent adducts. J. Pharmacol. Exp.
Ther., 1990;254:720-731). Se sugirió que el
anillo de furano era el grupo responsable de la inactivación de
P450 1A basándose en los estudios de una serie de cumarinas de
origen natural (Cai, Supra, 1996). Se ha demostrado también
que algunos otros compuestos que contienen furano causan la
inactivación de P450. Un ejemplo es la furanopiridina
L-754.394, un inhibidor de la proteasa del HIV se
demostró que causa un mecanismo en el que se basa la inactivación
P450 3A4 mediante la formación de un epóxido químicamente reactivo
en el anillo de furano (Chiba M., Nishine J.A., and Lin J.H.
Potent and selective inactivation of human liver microsomal
cytochrome P-450 isoforms by
L-754,394, an investigational HIV protease
inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther.,
1995;275:1527-1534; Sahali-Sahly Y.,
Balani S.K., Lin J.H., and Baillie T.A. In vitro studies on the
metabolic activation of the furanopyridine
L-754,394, a highly potent and selective
mechanism-based inhibitor of cytochrome P450 3A4.
Chem. Res. Toxicol., 1996;9:1007-1012). Se
presume que la inactivación de P450 3A4 basada en un mecanismo
mediado por BG sigue un mecanismo similar en el que el anillo de
furano es activado a un intermedio reactivo que modifica
covalentemente un resto crítico en el sitio activo del enzima. La
inactivación parece que tiene lugar en el sitio activo debido a que
no se inhibe por la adición de 2 ó 3 \dagger mM GSH al sistema de
incubación. El valor de K_{inactivación} para la inactivación de
P450 3A4 mediada por BG de 0,3 min^{-1} indica que BG es uno de
los más potentes inactivadores de P450 3A4. Los valores de
K_{inactivación} para otros dos potentes inactivadores son 0,4
min^{-1} para gestodeno (Guengerich F.P.
Mechanism-based inactivation of human liver
microsomal cytochrome P-450 IIIA4 by gestodene.
Chem. Res. Toxicol., 1990;3:363-371) y 1,62
min^{-1} para L-754.394 (Chiba M., Supra,
1995;275:1527-1543). Adicionalmente, se encontró que
BG era más potente que 6',7'-dihidroxibergamotina
cuya K_{inactivación} se determinó que era 0,16 min^{-1} para
la inactivación de P450 3A4 en el sistema reconstituido. BG también
parece ser un inhibidor competitivo de P450 3A4. Esto es
consecuente con la observación de que BG se metaboliza
principalmente a varios metabolitos hidroxilados por P450 3A4. Sin
embargo, la inhibición competitiva puede ser sobreestimada porque
P450 3A4 puede sufrir algún mecanismo en el que se basa la
inactivación por BG durante la determinación de la actividad de la
6\beta-hidroxilación de la testosterona.
Ya que la actividad de P450 3A4 se ha publicado
que es estimulada por la \alpha-naftoflavona
(Ueng Y.F., Kuwabara T., Chun Y.J., and Guengerich F.P.
Cooperativity in oxidations catalyzed by cytochrome P450 3A4.
Biochemistry, 1997;36:370-381), se investigó la
posibilidad de que la \alpha-naftoflavona pudiera
tener un efecto sinergístico sobre la generación del metabolito
reactivo de BG que podría llevar después a aumentar la
inactivación. Los resultados de esta invención indican que la
\alpha-naftoflavona no tiene efecto sobre la
inactivación de P450 3A4 mediada por BG. Sin embargo, no está claro
si la \alpha-naftoflavona estimula la
hidroxilación de BG catalizada por el citocromo P450 3A4.
Se exploró preliminarmente en el presente estudio
el mecanismo de inactivación de P450 3A4 mediado por BG. La
formación del aducto Heme está bien documentada que es el mecanismo
para la inactivación de P450 por olefinas terminales y acetilenos
(Ortiz de Montellano P.R. and Correia M.A, Inhibition of
cytochrome P450. In Cytochrome P450-Structure,
Mechanism and Biochemistry (Ortiz de Montellano P.R., Ed. pp
305-366, Plenum Press, New York). Recientemente, el
aducto heme formado en un sistema recontituido se identificó y
caracterizó por espectroscopía visible, HPLC y espectroscopía de
masas (He K., Falick A.M., Chen B., Nilsson F., and Correia M.A.
Identification of the heme adduct and an active site peptide
modified during mechanism-based inactivation of rat
liver cytochrome P450 2B1 by secobarbital. Chem. Res. Toxicol.,
9:614-622 and He K., He Y.A., Szklarz G.D., Halpert
J.R., and Correia M.A. Secobarbital-mediated
inactivation of cytochrome P450 2B1 and its active site mutants:
partitioning between heme and protein alkylation and epoxidation.
J. Bol. Chem., 1996;271:25864-25872). El
espectro visible de la muestra de P450 3A4 inactivada por BG no
mostró ningún signo de formación del aducto heme. El único pico de
absorción observado en el espectro diferencial frente al testigo de
NADPH en el intervalo de 400 a 500 nm fue a aproximadamente 423 a
425 nm, lo que se presume que es debido a P450 reducido por NADPH.
El espectro de absorción mostró también que el contenido de heme no
disminuía significativamente para P450 3A4 inactivado por BG incluso
aunque la muestra perdiera 90% de la actividad de la
6\beta-hidroxilación de la testosterona. Este
resultado parece excluir el otro mecanismo alternativo implicado en
el mecanismo en que se basan varios inactivadores en el que causan
la fragmentación del grupo heme lo que lleva a la unión covalente
del fragmento heme a la apoproteína (Ortiz de Montellano,
Supra., 1995 and Yao K, Falick A.M., Patel N., and Correia
M.A. Cumene hydroperoxide-inactivation of
cytochrome P450 2B1: identification of an active site
heme-modified peptide. J. Biol. Chem.,
1993;268:59-65). Sin embargo, el espectro
diferencial con CO reducido de P450 3A4 disminuyó en
aproximadamente 40% después del tratamiento con BG en un sistema
reconstituido. Debido a que no hay ninguna evidencia de la
destrucción de heme o de la formación del aducto heme, es posible
que la BG unida pueda estar posicionada cerca del resto heme
mediante unión covalente a un sitio activo de residuo de
aminoácido, de tal manera que interfiere con la interacción de CO
con el grupo Heme ferroso. Los estudios de la inactivación de P450
por otra furanocumarina, 8-metoxipsoraleno,
sugieren que la unión covalente del
8-metoxipsoraleno al sitio activo de apoP450 podría
explicar la pérdida del espectro con CO reducido de P450 (Labbe,
Supra, 1989 and Mays, Supra, 1990). El análisis por
HPLC de P450 3A4 inactivado por BG proporciona una evidencia
indirecta que sugiere que BG podría modificar la apoP450. La pérdida
parcial de la apoproteína parece ser una característica común del
enzima P450 inactivado por la modificación de la proteína cuando la
mezcla de incubación de P450 se analiza por HPLC en fase inversa
(Roberts E.S., Hopkins N.E., Alworth D.A., and Hollenberg P.F.
Mechanism-based inactivation of cytochrome P450
2B1 by 2-ethynylnaphthalene: Identification of an
active site peptide. Chem. Res. Toxicol.,
1993;6:470-479 and He K., Supra, 1996). Se
podría esperar que algunos sitios activos hidrófobos de residuos de
aminoácidos del P450 inactivado están expuestos de modo que se unen
estrechamente al medio de fase inversa como resultado de los cambios
de conformación inducidos por la unión covalente. La modificación
covalente de apoP450 también se ha publicado previamente que es un
mecanismo para la inactivación de P450 por algunas otras
furanocumarinas (Labbe, Supra., 1989; Cai, Supra.,
1996; Mays, Supra., 1990). Por tanto, la inactivación de
P450 3A4 mediada por BG parece que se debe principalmente a la
modificación de la apoproteína, como se ha observado con
2-etinilnaftaleno y
9-etinilfenantreno para el mecanismo en que se basa
la inactivación de P450 2B1 y 2B4 (Roberts E.S., Hopkins N.E.,
Zaluzec E.J., Gage D.A., Alworth W.L., and Hollenberg P.F.
Identification of active-site peptides from
3H-labeled
2-ethynylnaphalene-inactivated P450
2B1 and 2B4 using amino acid sequencing and mass spectrometry.
Biochemistry, 1994;33:766-3771 and Roberts E.S.,
Hopkins N.E., Zaluzec E.J., Gage D.A., Alworth W.L., and Hollenberg
P.F. Mechanism-based inactivation of cytochrome
P450 2B1 by 9-ethynylphenanthrene. Arch. Biochem.
Biophys., 1995;323:295-302).
Aunque la inhibición o la inactivación de P450
3A4 por BG y sus derivados es importante para entender el efecto del
zumo de pomelo sobre la biodisponibilidad de varios fármacos usados
clínicamente que se sabe que son metabolizados en gran extensión por
el P450 3A4 intestinal, también se determinó en esta invención si
BG inhibe también las actividades de otros P450 humanos. Se demostró
que BG inhibía las actividades de varios P450 humanos incluyendo
1A2, 2A6, 2C9, 2C19, 2D6, y 2E1. debido a que el efecto del zumo de
pomelo parece manifestarse principalmente a nivel de los
intestinos, la contribución de cada enzima P450 al efecto puede ser
dependiente de su nivel de expresión en los intestinos. P450 3A4 es
el enzima P450 intestinal más abundante, mientras que los otros
P450, tales como 1A, 2A, 2C, 2D y 2E, son pobremente expresados en
los intestinos (Watkins, Supra, 1987 and Peters W.H.M. and
Kremers P.G. Cytochrome P450 in the intestinal mucosa of man.
Biochem. Pharmacol, 1989; 38:1535-1538). Se
sospecha que BG y sus derivados pueden ser pobremente absorbidos o
ampliamente metabolizados en el tubo digestivo de modo que tienen
poca ocasión de inactivar o inhibir los P450 del hígado.
Ciertos fármacos usados clínicamente son
ampliamente metabolizados por P450 3A4 y por tanto tienen una
biodisponibilidad oral relativamente baja (Bertz R.J. and Granneman
R., Clin. Pharmacokinet., 1997;32:210-258).
La tabla 2 muestra la fracción metabolizada y la biodisponibilidad
oral de diferentes fármacos usados clínicamente. Por tanto, la
pobre absorción de estos fármacos se debe al metabolismo de primer
paso de P450 3A4 en el tubo digestivo. Se ha demostrado que la
biodisponibilidad oral de algunos de estos fármacos aumenta
significativamente por la coadministración con zumo de pomelo. Se ha
descubierto en esta invención que la biodisponibilidad oral de
estos fármacos se puede mejorar por la formulación o
coadministración con BG, la furanocumarina principal del zumo de
pomelo.
Ya que el nivel de expresión del P450 3A4
intestinal varía significativamente entre los individuos, se ha
considerado como uno de los factores principales que contribuyen a
la variabilidad entre individuos del metabolismo del fármaco y de
los efectos del fármaco. Se ha descubierto además que tal
variabilidad se puede reducir por la inactivación de P450 3A4
intestinal mediante la coadministración de BG.
Los siguientes son ejemplos de fármacos usados
clínicamente que tienen pobre biodisponibilidad: Ciclosporina y
Tacrolimo son potentes agentes inmunodepresivos usados en los
trasplantes y en el tratamiento de trastornos autoinmunes
seleccionados. La Rapamicina está bajo desarrollo clínico para uso
en trasplantes y en el tratamiento de trastornos autoinmunes. Todos
estos agentes han demostrado que son metabolizados ampliamente por
P450 3A4. La Ciclosporina, Tacrolimo, y Rapamicina se absorben
pobremente, variando la biodisponibilidad oral entre 15% a 30%, 15%
a 20%, y 10% a 20%, respectivamente. Saquinavir, un inhibidor de la
proteasa del HIV, se absorbe muy pobremente con una
biodisponibilidad oral de 1% a 9%. Se ha demostrado que P450 3A4 es
el enzima fundamental responsable del metabolismo de Saquinavir.
Otros inhibidores de la proteasa del HIV, tales como Indinavir y
Ritonavir, son metabolizados también principalmente por P450 3A4 y
tienen una biodisponibilidad oral relativamente baja. Varias
dihidropiridinas usadas como bloqueantes de los canales de calcio,
tales como Felodipino, Isradipina, Nifedipino, Nimodipino y
Nisoldipino, son metabolizadas principalmente por P450 3A4. Su
pobre biodisponibilidad oral (5%-20%) se ha demostrado que es debida
principalmente al metabolismo de primer paso. Se ha demostrado que
la biodisponibilidad oral de algunas de las dihidropiridinas
aumenta por la coadministración con zumo de pomelo. La
Atorvastatina, un agente hipolipidémico e hipocolesterolémico, se
metaboliza principalmente por P450 3A4. La biodisponibilidad oral
es sólo de 14% a 30%. Todos estos agentes se pueden combinar con BG
y administrar a un paciente para aumentar su biodisponibilidad
oral. Adicionalmente, otros agentes listados en la tabla 2 se
pueden combinar también con BG para aumentar su biodisponibilidad
oral.
| Fármaco | Fracción metabolizada (%) | Biodisponibilidad oral (%) |
| Ciclosporina | >90 | 30-15 |
| Tacrolimo (FK 506) | >90 | 20-15 |
| Sirolimús (rapamicina) | >90 | 20-10 |
| Indinavir | Alta | \sim30 |
| Ritonavir | >90 | 60-80 |
| Saquinavir | >90 | 1-9 |
| Felodipino | >90 | 15-25 |
| Isradipina | >90 | 15-25 |
| Nicardipino | >90 | 20-30 |
| Nisoldipino | >90 | \sim5 |
| Nimodipino | >90 | 15-10 |
| Nitrendipino | >90 | 16-6 |
| Nifedipino | >90 | 40-60 |
| Verapamil | >90 | 20-30 |
| Etopósido | \sim50 | 35-70 |
| Tamoxifeno | >90 | |
| Vinblastina | \sim50 | Pobre |
| Vincristina | \sim50 | Pobre |
| Taxol | ||
| Atorvastatina | 14-30 | |
| Fluvastatina | \sim90 | 50-9 |
| Lovastatina | >90 | <5 |
| Pravastatina | >50 | 25-10 |
| Simvastatina | \sim60 | <5 |
| Terfenadina | >90 | \sim1 |
| Loratadina | >90 | Baja |
| Astemizol | >90 | Baja |
| Anfeltanil | >90 | Muy baja |
| Carbamazepina | >90 | >70 |
| Azitromicina | 30-35 | 35-45 |
| Claritromicina | >70 | 50-55 |
| Eritromicina | >90 | 30-65 |
| Itraconazol | >90 | 44-55 |
| Rifabutina | >90 | 20-12 |
| Lidocaina | >90 | 25-45 |
| Cisaprida | >90 | 35-40 |
| Sertralina | >90 | |
| Pimozida | >90 | <50 |
| Triazolam | >90 | 45-70 |
| Midazolam | >90 | 40-50 |
| Testosterona | >90 | Pobre |
| Medroxiprogesterona | >90 | <20 |
| Ergotamina | >90 | <1 |
Se separaron varios componentes del extracto de
acetato de etilo del zumo de pomelo por HPLC bajo las condiciones
descritas en Métodos y Materiales (figura 1). El análisis
estructural de los picos del componente por LC-MS/MS
reveló que el pico con un tiempo de retención de 26 minutos era BG
(figura 1). El espectro de iones producto y el tiempo de retención
de HPLC fueron idénticos al del estándar auténtico (figura 2). El
ión fragmento predominante de m/z 203 corresponde al resto
5-hidroxipsoraleno que subsiguientemente se
fragmenta para dar iones de m/z 174, 159, y 147 por pérdida de CO,
CO_{2}, C_{2}H_{2}O_{2}, respectivamente. El ión fragmento
de m/z 137 corresponde a la cadena lateral restante. Como se
muestra en la figura 1, hay al menos cinco productos BG
monooxigenados presentes en el zumo de pomelo. Sus estructuras
propuestas se muestran en la figura 3. Hay al menos dos productos
principales de BG dihidroxilado en el zumo de pomelo. El componente
que eluye a los 13 minutos tiene un espectro de iones producto y un
tiempo de retención en HPLC idéntico a la 6',7'dihidroxivergamotina
(véase figura 4). El ión molecular protonado de m/z 340 del
componente que eluye a los 24 minutos sufrió una fragmentación por
disociación (CID) inducida por colisión para dar un iones producto
principal de m/z 168 que sugeriría que este componente no es un
derivado de BG. La propia BG parece ser la furanocumarina
predominante en el extracto de zumo de pomelo con acetato de etilo
por determinación por LC/UV. Adicionalmente, se encontró que BG se
une a la columna C18 tan estrechamente que no es posible eluir
desde la columna con metanol al 60%, condición previamente usada
para identificar la 6',7'-dihidroxibergamotina en el
zumo de pomelo (Edwards, Supra, 1996).
El análisis por LC/UV de los extractos de acetato
de etilo del zumo de naranja indicó que no hay BG detectable en el
zumo de naranja.
La incubación de P450 3A4 con BG en el sistema
reconstituido dio como resultado una pérdida de 90% de la actividad
de 6\beta-hidroxilación de la testosterona (tabla
3). Aproximadamente 60% de la actividad de P450 se inhibió también
en ausencia de NADPH en el sistema reconstituido (Tabla 2). Sin
embargo, incluso cuando las muestras se diluyeron 20 veces para la
determinación de la actividad de
6\beta-hidroxilación de la testosterona, todavía
contenían BG 2,5 \muM. A esta concentración se encontró que BG
inhibía la actividad de P450 3A4 en aproximadamente 55% en
experimentos separados. Además, los contenidos de P450 medidos por
el espectro con CO reducido disminuyeron en aproximadamente 40%
después de 15 minutos de incubación de P450 3A4 con BG en presencia
de NADPH (Tabla 3). No hubo formación de un pico a 420 nm u otra
absorción en lugar de la de 450 nm en el intervalo de 400 a 500 nm
para el espectro diferencial de P450 reducido por CO (figura 5). La
absorción máxima del espectro absoluto fue a 425 nm para P450 3A4
inactivado por BG. Se corrió aproximadamente 2 nm a una longitud de
onda mas larga en comparación con P450 3A4 en presencia de NADPH
sin BG. No hubo ninguna indicación de destrucción del grupo heme;
sin embargo, hubo una pequeña mejora de la absorción máxima por P450
3A4 inactivado por BG (figura 5). El contenido de P450 también
disminuyó en una magnitud similar cuando se usó como referencia la
muestra de -NADPH/+BG. Este método se considera que reduce la
interferencia en la determinación de P450 por CO generado
endógenamente durante la incubación (Correia M.A., Decker C.,
Sugiyama K., Underwood M., Bornheim L., Wrighton S.A., Rettie A.E.,
and Trager W.F. Degradation of rat hepatic cytochrome P450 heme
by
3,5-dicarbethoxy-2,6-dimethyl-4-ethyl-1,4-dihydropyridine
to irreversibly bound protein adducts. Arch. Biochem. Biophys.,
1987;258:436-451).
Como se muestra en la figura 6, la cantidad de
apoP450 3A4 disminuyó selectivamente hasta aproximadamente 50%
cuando la muestra que contenía P450 3A4 inactivado por BG se analizó
por HPLC de fase inversa sobre una columna Poros. Se recuperaron de
la columna cerca de 100% de la reductasa y la proteína del
citocromo b5 cuando se comparó con testigos de -NADPH. Se recuperó
aproximadamente 90% de heme de la muestra que contenía P450 3A4
inactivado por BG, lo que estaba de acuerdo con los resultados
obtenidos de los análisis espectrales. No se pudo detectar ningún
pico heme modificado usando estas condiciones de HPLC.
Como se muestra en la figura 7, la inactivación
de P450 3A4 mediada por BG en un sistema reconstituido era
dependiente del tiempo y la concentración así como requería el
metabolismo de BG. La inactivación presentó cinéticas de pseudo
primer orden con respecto al tiempo. Se uso el análisis de
regresión lineal de los datos de la figura 7 para determinar las
constantes de velocidad inicial de inactivación (K_{obs}). Los
trazados dobles recíprocos de los valores de K_{obs} y las
concentraciones de BG dieron una constante de velocidad máxima
(K_{inactivación}) para la inactivación de 0,3 min^{-1} y una
concentración de inactivador requerida para la inactivación máxima
media (Ki) de 7,7 \muM (Walsh, Supra, 1984). Se observó
también una inhibición dependiente de la concentración para la
muestra sin preincubación. Esto era consecuente con el resultado de
la muestra de -NADPH/+BG en la tabla 3.
Se ha publicado que la
\alpha-naftoflavona estimula el metabolismo de
varios sustratos por P450 3A4 (Ueng, Supra, 1997). Por
tanto, se decidió asegurarse si incrementaría la formación del
metabolito reactivo de BG, y subsiguientemente potenciaría la
inactivación de P450 3A4. La \alpha-naftoflavona
no cambia la potencia de la inactivación de P450 3A4 mediada por
BG. La actividad de 6\beta-hidroxilación de la
testosterona de 3A4 se inactivó en aproximadamente 55% con BG 2
\muM cuando la \alpha-naftoflavona se incubó
simultáneamente en la mezcla de reacción a las concentraciones
finales que variaban entre 6 y 50 \muM. No se usaron
concentraciones más altas de \alpha-naftoflavona
debido a la limitación de la solubilidad.
Como se muestra en la figura 8, las actividades
de P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1, y 3A4 en los microsomas de hígado
humano fueron inhibidas por BG. Los IC_{50} fueron aproximadamente
X, X, 2,4, 3,0, 3,9, y 4,6 \muM para P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6,
2E1, y 3A4, respectivamente. Aproximadamente 71% y 100% de la
actividad de P450 2C19 fue inhibida por BG 2 y 20 \muM,
respectivamente.
| P450 (nmol/ml) | 6\beta-hidroxilación de testosterona | |
| (nmol/min/nmol) | ||
| BG-/NADPH+ | 0,44 | 7,9 |
| BG+/NADPH- | 0,47 | 2,9 |
| BG+/NADPH+ | 0,27 | 0,8 |
| ªP450 3A4 (0,5 nmol/ml) se incubó con BG 50 \muM en un sistema reconstituido a 37ºC durante 15 minutos como | ||
| se describe en Métodos y Materiales. Una alícuota (0,05 ml) de mezcla de incubación se diluyó en 0,95 ml de | ||
| tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) para la determinación de la actividad de 6\beta-hidroxilación de la testosterona. |
Los compuestos de la presente invención se pueden
preparar y administrar en una amplia variedad de formas
farmacéuticas orales.
Para preparar las composiciones farmacéuticas a
partir de los compuestos de la presente invención, los vehículos
farmacéuticamente aceptables pueden ser o sólidos o líquidos. Las
preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos,
píldoras, cápsulas, sellos, supositorios, y gránulos dispersables.
Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que pueden actuar
también como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes,
conservantes, agentes desintegrantes del comprimido, o un material
encapsulante.
En forma de polvos, el vehículo es un sólido
finamente dividido que está mezclado con el componente activo
finamente dividido.
En forma de comprimidos, el componente activo se
mezcla con el vehículo que tiene las propiedades aglutinantes
necesarias en las proporciones adecuadas y se compacta en la forma y
el tamaño deseados.
Los polvos y los comprimidos contienen
preferiblemente de cinco o diez a aproximadamente setenta por ciento
del compuesto activo. Los vehículos adecuados son carbonato de
magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina,
dextrina, almidón, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión,
mantequilla de coco, y similares. El término "preparación" se
pretende que incluya la formulación del compuesto activo con el
material de encapsulado como un vehículo que proporciona una cápsula
en la cual el componente activo con o sin otros vehículos, esta
rodeado por un vehículo, que está, por tanto, en asociación con él.
Similarmente, están incluidos los sellos y los comprimidos para
chupar. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos, y
comprimidos para chupar se pueden usar como formas farmacéuticas
sólidas adecuadas para la administración oral.
Para preparar los supositorios se funde primero
una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos
de ácidos grasos o mantequilla de coco, y el componente activo de
dispersa homogéneamente en ella, con agitación. La mezcla homogénea
fundida se vierte después en moldes de tamaño conveniente, se deja
que se enfríe, y por tanto que solidifique.
Las preparaciones de forma líquida incluyen
soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo agua o soluciones
de propilenglicol en agua.
Las soluciones acuosas adecuadas para uso oral se
pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y añadiendo
agentes colorantes, aromatizantes, estabilizantes y espesantes
adecuados como se desee.
Las suspensiones acuosas adecuadas para uso oral
se pueden preparar dispersando el componente activo finamente
dividido en agua con un material viscoso, tal como gomas naturales
o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de
sodio, y otros agentes de suspensión bien conocidos.
También están incluidas preparaciones en forma
sólida que están pensadas para convertirse, justo antes del uso, en
preparaciones en forma líquida para la administración oral. Tales
formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones.
Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo,
agentes colorantes, aromatizantes, estabilizantes, tampones,
edulcorantes artificiales o naturales, dispersantes, espesantes,
solubilizantes, y similares.
La preparación farmacéutica está preferiblemente
en una forma farmacéutica unitaria. En tal forma la preparación se
subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas
del componente activo. La forma farmacéutica unitaria puede ser una
preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de
la preparación, tales como comprimidos envasados, cápsulas, y polvos
en viales o ampollas. También, la forma farmacéutica unitaria pueden
ser las propias cápsulas, comprimidos, sellos, o comprimidos para
chupar, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas
formas envasadas.
La cantidad de componente activo en una
preparación de dosis unitaria se puede variar o ajustar de 0,1 mg a
100 mg, preferiblemente de 0,5 mg a 20 mg según la aplicación
particular y la potencia del componente activo. La composición, si
se desea, puede contener también otros agentes terapéuticos
compatibles.
En el uso terapéutico, los compuestos utilizados
en el método farmacéutico de esta invención se administran a una
dosis inicial de BG de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1
mg por kilogramo, al día. Se prefiere un intervalo de dosis diario
de BG de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,1 mg por
kilogramo. La dosis terapéutica apropiada de los compuestos de la
presente invención que se puede combinar con BG es conocida por los
expertos en la técnica. Las dosis, sin embargo, se pueden variar
dependiendo de los requerimientos del paciente, la severidad del
estado a ser tratado, y el compuesto a ser empleado. La
determinación de la dosis apropiada para una situación particular
está dentro de la experiencia de la técnica. Generalmente, el
tratamiento se inicia con pequeñas dosis que son menores que la
dosis óptima del compuesto. A partir de ahí, se aumenta la dosis
con pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo
según las circunstancias. Según convenga, la dosis diaria total se
puede dividir y administrar en porciones durante el día, si se
desea.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran
los métodos preferidos en esta invención para preparar los
compuestos de la invención.
NADPH,
L-\alpha-dilauroil- y
L-\alpha-dioleil-sn-glicero-3-fosfocolinas,
fosfatidilserina, catalasa, GSH, hidrocloruro del ácido
\delta-aminolevulínico, testosterona, 6\beta- y
11\beta-hidroxitestosterona, clorzoxazona,
cumarina, tolbutamida, se adquirieron de Sigma Chemical Company (St
Louis, MO). 7-hidroxicumarina (umbeliferona) se
obtuvo de Aldrich (Milwaukee, WI),
4-hidroximetiltolbutamida,
6-hidroxiclorzoxazona,
4'-hidroximefenitoina, bufurolol racémico, y
1'-hidroxibufurolol se obtuvieron de Gentest Corp.
(Woburn, MA).
Isopropil-\beta-D-tiogalactosidasa
se adquirió de Calbiochem Corp. (La Jolla, CA).
(S)-mefenitoina fue un regalo del Dr. W.F. Trager
(University of Washington, Seattle, WA). La Bergamotina se adquirió
de Indofine Chemical Company, Inc (Somerville, NJ):
Se prepararon zumo de pomelo y zumo de naranja
exprimiendo a mano mitades de pomelos o naranjas de Florida,
respectivamente. Se extrajo el zumo con acetato de etilo, y los
extractos secos se disolvieron en el tampón para HPLC para el
subsiguiente análisis. La identificación por LC/MS de los
componentes se realizó usando un espectrómetro de masas Quattro II
triple quadrupole (Micromass, Manchester, UK). La introducción de
la muestra y la ionización fue por ionización por
electropulverización (ESI) en el modo de ión positivo (voltaje en
cono de 30 v). Los datos de barrido se obtuvieron bajo el control
del sistema de datos Micromass Masslynx NT (Version 2,22). Los
componentes del zumo de pomelo se separaron por HPLC con una columna
C18 (Zorbax XDB 5 \mum, 2,1 x 150) eluida con ácido acético 100
mM (A) y acetonitrilo (B) con un gradiente de 30% de B durante 5
minutos y después de 30% a 70% de B durante 25 minutos a un caudal
de 200 \mul/minuto. Las determinaciones de los pesos moleculares
se realizaron por espectros de masas de captura a lo largo de un
intervalo de masas de 100 a 500 amu a una velocidad de barrido de
1,0 segundos/serie de diez. Las determinaciones de la estructura
molecular se realizaron por captura de barridos MS/MS de iones
producto a una velocidad de 1,0 segundos/serie de diez. La
activación de colisión se logró usando argón a una presión celular
del gas indicada de 0,2666 x 10^{-3}Pa (2,0 x 10^{-3} torr) y
una energía de colisión de 20 eV.
Un cDNA de P450 3A4 de longitud completa (excepto
por la deleción de los codones 3-12 en el extremo 5'
terminal) introducido por ingeniería genética en el vector pCW se
obtuvo del Dr. R. W. Estabrook (University of Texas Southwestern
Medical Center, Dallas, TX). El vector que contenía P450 3A4 se
transformó dentro de las células MV1304. El crecimiento de la E.
coli. transformada se llevó a cabo en un cultivo Terrific
modificado, y se indujo la expresión de P450 A4 por la adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactosida
1 mM. Se añadió ácido \delta-aminolevulínico (0,5
mM) para aumentar la síntesis de heme. Se preparó la fracción de la
membrana a partir de células bacterianas por tratamiento con
ultrasonidos después de tratamiento con lisozima y subsiguientemente
se aisló del homogenato de células bacterianas por centrifugación
diferencial. P450 3A4 se purificó hasta homogeneidad por
cromatografía en una columna DE52 de las membranas solubilizadas en
detergente como se ha descrito previamente (Gillam E.M., Baba T.,
Kim B.R., Ohmori S., and Guengerich F.P. Expression of modified
human cytochrome P450 3A4 in Escherichia coli and purification and
reconstitution of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys.,
1993;305:123-131).
La
P450-citocromo-NADPH-reductasa
y el citocromo b5 se purificaron por los métodos descritos
previamente a partir de microsomas del hígado de ratas
Long-Evans tratadas con fenobarbital (Waxman D.J.
and Walsh C. Phenobarbital-induced rat liver
cytochrome P450. J. Biol. Chem.,
1982;257:10446-10457; Omura T. and Sato R. The
carbon-monooxide binding pigment of liver
microsomes. J. Biol. Chem.,
1964;239;2370-2378).
Se reconstituyó P450 3A4 (0,5 nmol) con 20 \mug
de una mezcla (1:1:1) de
L-\alpha-dilauroil- y
L-\alpha-dioleil-sn-glicero-3-fosfocolinas
y fosfatidilserina, 200 \mug de ácido cólico, 1 nmol de
NADPH-reductasa, 0,5 nmol de citocromo b5, 500 U de
catalasa, 2 \mumol de GSH, MgCl_{2} 30 mM, EDTA 0,5 mM, y
glicerol al 20% en un volumen final de 1 ml de tampón Hepes 50 mM
(pH 7,5). Las reacciones con diferentes concentraciones de BG se
iniciaron por adición de NADPH 1 mM, y se terminaron sobre hielo.
Las incubaciones se realizaron a 37ºC durante los periodos de
tiempo indicados. Al final de la incubación, 0,2 ml de la mezcla de
incubación se diluyeron en 0,8 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5)
que contenía glicerol al 20% y EDTA 0,5 mM. Se registraron los
espectros entre 330 y 700 nm frente al tampón diluyente como
referencia sobre un espectrofotómetro DW2-OLIS en el
modo de haz partido. Se usó una alícuota de 0,25 ml para la
determinación del contenido de P450 por el método de Omura y Sato
(Omura and Sato, Supra, 1964). Se recogieron alícuotas
adicionales para la determinación de la actividad de
6\beta-hidroxilación de testosterona y el análisis
por HPLC.
Se diluyó una alícuota (0,05 ml) de la mezcla de
incubación en 0,95 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) que contenía
testosterona 200 \muM, 500 U de catalasa, 2 \mumol de GSH,
MgCl_{2}30 mM, EDTA 0,5 mM, y glicerol al 20% en un volumen final
de 1 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5), y se incubó durante 10
minutos a 37ºC. Se determinó la
6\beta-hidroxitestosterona por HPLC en una columna
C18 (Microsorb-MV, 5 \mum, 4,6 x 15 cm, Rainin,
Woburn) eluida isocráticamente con una fase móvil de metanol al 65%
a un caudal de 1 ml/min, y el eluido se monitorizó por detección UV
a 254 nm.
Después de 10 minutos de incubación de P450 3A4
con BG 50 \muM en el sistema reconstituido como se ha descrito
antes, se analizaron directamente 200 \mul de la mezcla de
reacción en una columna Poros como se ha descrito previamente
(Roberts E.S., Hopkins N.E., Alworth D.A., and Hollenberg P.F.
Mechanism-based inactivation of cytochrome P450
2B1 by 2-ethynylnaphthalene: Identification of an
active-site peptide. Chem. Res. Toxicol.,
1993;6;470-479). La elución se monitorizó por
detección UV a 14, 310, y 405 nm simultáneamente.
Se obtuvieron tejidos de hígado humano del
University of Chicago Distribution Center of LTPADS (Liver
Transplant Procurement and Distribution Service, University of
Minnesota, Minneapolis, MN), Human Biologics Inc. (Phoenix, AZ) y el
International Institute for the Advancement of Science (Exton, PA).
Se prepararon los microsomas del hígado por centrifugación
diferencial. Se usaron N3-desmetilación de la
cafeina (Tassaneeyakul W., Mohammed Z., Birkett D.J., McManus M.E.,
Veronese M.E., Turkey R.H., Quattrochi L.C., González F.J., and
Miners J.O. Caffeine as a probe for human cytochromes P450:
Validation using cDNA-expression,
immunoinhibition and microsomal kinetic anf inhibitor techniques.
Pharmacogenetics, 1992;2:173-183),
7-hidroxilación de la cumarina (Fentern J:H, and Fry
J.R. Metabolism of coumarin by rat, gerbil, and human liver
microsomes. Xenobiotica, 1992;22:357-367),
hidroxilación de la tolbutamida (Miners J.O., Smith K.J., Robson
R.A., McManus M.E., Veronese M.E., and Birkett D.J. Tolbutamide
hydroxylation by human liver microsomes: Kinetic characterization
and relationship to other cytochrome P450 dependent xenobiotic
oxidations. Biochem. Pharmacol.,
1988;37:1137-1144),
1'-hidroxilación de bufurolol racémico (Kronbach
T., Mathys D., Gut J., Catin T., and Meyer U.A.
High-performance liquid chromatographic assays
for bufurolol 1'-hydroxylase, debrisoquine
4-hydroxylase, and dextromethorphan
o-deethylase in microsomes and purified cytochrome
P450 isozymes of human liver. Anal. Biochem.,
1987;162:24-32), 6-hidroxilación de
la clorzoxazona (Peter R., Bocker R., Beaune P.H., Iwasaki M.,
Guengerich F.P., and Yang C.S. Hydroxylation of chlorzoxazone as
a specific probe for human liver cytochrome P450 IIEI. Chem. Res.
Toxicol., 1990;3:566-573), y
6\beta-hidroxilación de la testosterona (Sonderfan
A.J., Arlotto M.P., Dutton D.R., McMillen S.K., and Parkinson A.
Regulation of testosterone hydroxylation by rat liver microsomal
cytochrome P450. Arch. Biochem. Biophys.,
1987;255:27-41,4) para determinar las actividades de
P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1, y 3A4, respectivamente. Los
microsomas de hígado humano reunidos (N =6, 0,1-1 mg
proteína/ml) se incubaron con BG (1, 10, y 100 \muM) en presencia
de los correspondientes sustratos de prueba, cafeína 100 \muM,
cumarina 4 \muM, tolbutamida 100 \muM, bufurolol 10 \muM,
clorzoxazona 40 \muM, y testosterona 50 \muM en un volumen final
de 0,5 ml de tampón fosfato 0,1 mM (pH 7,4) a 37ºC durante los
periodos de tiempo apropiados, respectivamente. Las reacciones se
iniciaron por las adiciones de NADPH 1 mM y se terminaron en hielo.
Se uso la 4'-hidroxilación de
(S)-mefenitoina para la determinación de la
actividad de P450 2C19 (Meier U.T., Kronbach T., and Meyer U.A.
Assay of mephenytoin metabolism in human liver microsomes by
high-performance liquid chromatography. Anal
Biochem., 1985;151:286-291). Se incubó
(S)-mefenitoina (50 \muM) con microsomas de
hígado humano reunidos en un volumen final de 0,125 ml en presencia
de BG 0,2, 2, y 20 \muM, respectivamente. Se determinó la
concentración de 4'-hidroximefenitoina usando
LC-MS/MS. Los testigos experimentales estaban
constituidos por la incubación completa de los componentes sin la
adición de BG.
Claims (8)
1. Una composición farmacéutica oral o un
supositorio que comprende Bergamotina en su forma aislada y un
compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50%
mezclados con al menos un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéuticamente aceptables.
2. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que la baja biodisponibilidad es menor que
30%.
3. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el compuesto se
selecciona entre Ciclosporina, Tacrolimús (FK506), Sirolimús
(rapamicina), Indinavir, Saquinavir, Felodipino, Isradipino,
Nicardipino, Nisoldipino, Nimodipino, Nitrendipino, Nifedipino,
Verapamil, Etopósido, Tamoxifeno, Vinblastina, Vincristina,
Atorvastatina, Fluvastina, Lovastatina, Pravastatina, Simvastatina,
Terfenadina, Loratadina, Astemizol, Alfentanil, Carbamazepina,
Azitromicina, Itraconazol, Rifabutina, Lidocaina, Cisaprida,
Sertralina, Pimozida, Triazolam, Midazolam, Testosterona,
Medroxiprogesterona y Ergotamina.
4. El uso de la bergamotina en su forma aislada,
para la preparación de una composición farmacéutica o un
supositorio, para inhibir el metabolismo enzimático intestinal de
un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% y
para aumentar la biodisponibilidad de dicho compuesto.
5. El uso de la Bergamotina en su forma aislada,
para la preparación de una composición farmacéutica oral o un
supositorio para inhibir el metabolismo intestinal del citocromo
P4503 A4.
6. El uso según la reivindicación 4, en el que la
biodisponibilidad oral del compuesto es menor que 30%.
7. El uso según las reivindicaciones 4 ó 6, en el
que el compuesto que tiene baja biodisponibilidad oral se
selecciona entre Ciclosporina, Tacrolimús (FK506), Sirolimús
(rapamicina), Indinavir, Saquinavir, Felodipino, Isradipino,
Nicardipino, Nisoldipino, Nimodipino, Nitrendipino, Nifedipino,
Verapamil, Etopósido, Tamoxifeno, Vinblastina, Vincristina, Taxol,
Atorvastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Pravastatina,
Simvastatina, Terfenadina, Loratadina, Astemizol, Alfentanil,
Carbamazepina, Azitromicina, Eritromicina, Itraconazol, Rifabutina,
Lidocaina, Cisaprida, Sertralina, Pimozida, Triazolam, Midazolam,
Testosterona, Medroxiprogesterona y Ergotamina.
8. El uso según las reivindicaciones 4 a 6, en el
que la dosis inicial de Bergamotina es de 0,01 a 1 mg por
kilogramo, al día.
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