JP2001515035A - 薬剤の経口生体利用性を高めるベルガモッチンを含有する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 化合物の経口生体利用性を高めるために、腸の主力のＰ−４５０酵素であるＰ４５０ ３Ａ４の阻害に関与するグレープフルーツジュース中の主要な化合物ベルガモッチンが低い生体利用性を有する化合物と共に患者に同時投与される。さらに、これらを含有する医薬組成物、およびＢＧをグレープフルーツジュースから単離する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は化合物をベルガモッチン（Bergamottin）(ＢＧ）と共に患者に同時投
与することにより該化合物の経口生体利用性を高める方法に関する。さらに詳し
くは、本発明は低い生体利用性を有する化合物の腸での酵素代謝を阻害するため
のＢＧの使用に関する。特に、ＢＧによる腸のシトクロムＰ４５０ ３Ａ４の阻 害は化合物の腸代謝を減らし、それらの経口生体利用性を高める。さらに、本発
明は低い生体利用性を有する化合物および薬学的に許容しうる担体と共にＢＧを
含有する医薬組成物に関する。最後に、本発明はＢＧをグレープフルーツジュー
スから単離する方法に関する。

【０００２】 経口生体利用性は何れかの経路による投与後の体循環に到達する未変化の薬剤
の率として定義される。薬剤の生体利用性を高めることは薬剤の開発および臨床
薬理学において多大の注目を浴びている。Ｐ４５０ ３Ａ４は腸中で発現する主 要なＰ４５０酵素であり、臨床上使用される広域スペクトルの薬剤の代謝に関与
するため、これらの薬剤の経口生体利用性の決定因子の一つであると考えられる
。シクロスポリン、ＦＫ５０６、タキソール、インジナビル、サクイナビルなど
のような幾つかの費用のかかる薬剤はＰ４５０ ３Ａ４により広く代謝されるこ とがわかっている。これらの薬剤の幾つかはＰ４５０ ３Ａ４阻害剤と同時投与 するとそれらの生体利用性を高めることがわかっている。

【０００３】 グレープフルーツジュースと同時に経口投与するとジヒドロピリジンを含む幾
つかの臨床上使用される薬剤の経口生体利用性が有意に増加することが証明され
ている。（Bailey D.G., Spence J.D., Munoz C.およびArnold J.M.O.の「柑橘 類ジュースとフェロジピンおよびニフェジピンとの相互作用」、Lancett., 337,
268〜269 (1991年）；並びにBailey D.G., Arnold J.M.O., Bond J.R., Tran L
.T.およびSpence J.D.の「グレープフルーツジュースフェロジピン相互作用：徐
放性薬剤の再現性および特性決定」、Br. J. Clin. Pharmacol., 40, 135〜140
(1995年)）、シクロスポリンＡ（Ducharme M.P., Warbasse L.H.の「徐放性薬剤
の特性決定」、Br. J. Clin. Pharmacol., 40, 135〜140 (1995年)）、シクロス
ポリンＡ（Ducharme M.P., Warbasse, L.H.およびEdwards D.J.の「グレープフ ルーツジュースと一緒に静脈内および経口投与した後のシクロスポリンの性質」
、Clin. Pharmacol. Ther., 57, 485〜491 (1995年)）、ミダゾラム（Kuferschm
idt H.H., Ha H.R., Ziegler W.H., Meier P.J.およびKrahenbuhl S.の「ヒトに
おけるグレープフルーツジュースおよびミダゾラムの相互作用」、Clin. Pharma
col. Ther., 58, 20〜28 (1995年)）、トリアゾラム（Hukkinen S.K., Varhe A.
, Olkkola K.T.およびNeuvonen P.J.の「トリアゾラムの血漿濃度はグレープフ ルーツシュースの同時摂取により増加する」、Clin. Pharmacol. Ther., 58, 12
7〜131 (1995年)）、テルフェナジン（Benton R.E., Hoig P.K., Zamaani K., C
antilena L.R.およびWoosley R.L.の「グレープフルーツジュースはテルフェナ ジンの薬物動態を変え、心電図の再分極を延長する」、Clin. Pharmacol. Ther.
, 59, 383〜388（1996年）、およびエチニルエストラジオール（Weber A., Jage
r R., Borner A., Klinger G., Vollanth R., Mathey K.およびBalogh A.の「グ
レープフルーツジュースはエチニルエストラジオールの生体利用性に影響を与え
ることができるか？」、Contraception, 53, 41〜47 (1996年)）。これらの薬剤
はすべて主としてシトクロムＰ４５０ ３Ａ４、すなわち腸および肝臓の主力の Ｐ４５０酵素により代謝されるため（Shimada T., Yamazaki H., Mimura M., In
ui Y.およびGuengerich F.P.の「薬剤、発ガン性物質および化学薬品の酸化と関
係があるヒト肝シトクロムＰ−４５０酵素間の相互関係：３０人の日本人および
３０人の白人の肝ミクロソームを用いた研究」、J. Pharmacol. Exp. Ther., 27
0, 414〜422 (1994年）、並びにWatkins P.B., Wrighton S.A., Schuetz E.G.,
Molowa D.T.およびGuzelian P.S.の「ラットおよびヒトの腸粘膜におけるグルコ
コルチコイドが誘導するシトクロムＰ−４５０の同定」、J. Clin. Invest., 80
, 1029〜1036 (1987年)）、グレープフルーツジュースの効果はＰ４５０ ３Ａ４
活性の阻害によるものであると考えられる。ごく最近、グレープフルーツジュー
スはヒト腸粘膜上皮細胞の免疫反応性Ｐ４５０ ３Ａ４含量をＰ４５０ ３Ａ４ｍ
ＲＮＡ含量に変化なく劇的に減らすことがわかった（Lown K.S., Bailey D.G. F
ontana R.J., Janardan S.K., Adair C.H., Fortlage L.A., Brown M.B., Guo W
.およびWatkins P.B.の「グレープフルーツジュースは腸のＣＹＰ ３Ａタンパク
質の発現を減らすことによりヒトにおけるフェロジピンの経口生体利用性を増加
する」、J. Clin. Invest., 99, 1〜9 (1997年)）。これらの結果はＰ４５０ ３
Ａ４タンパク質の分解がグレープフルーツジュースの摂取により促進されること
を示唆している（上記のLownの文献（1997年)）。ラットＰ４５０ ３Ａの自殺失
活はアポＰ４５０の分解を促進するため（Correia M.A., Davoll S.H., Wrighto
n S.A.およびThomas P.E.の「３,５−ジカルベトキシ−２,６−ジメチル−４− エチル−１,４−ジヒドロピリジンによる失活後のラット肝シトクロムＰ４５０
３Ａの分解：タンパク質分解系の特性決定」、Arch. Biochem. Biophys., 297,
228〜238（1992年)）、Ｐ４５０ ３Ａ４の機構に基づく失活はグレープフルーツ
ジュースの作用と関係があることを示唆している。

【０００４】 ある種の薬剤の生体利用性を増加する役割を担うグレープフルーツジュース中
の主要成分を同定するのに、フラボノイド、例えばナリンゲニン、ナリンジン、
ケルセチンおよびケンフェロールがインビトロでＰ４５０ ３Ａ４活性を競合的 に阻害するため考えられる候補として選択されている（Miniscalco A., Lundahl
J., Regardh C.G., Edgar B.およびEriksson U.G.の「グレープフルーツジュー
ス中のフラボノイドによるラットおよびヒト肝ミクロソームのジヒドロピリジン
代謝阻害」、J. Pharmacol. Exp. Ther., 261, 1195〜1199 (1992年）、並びにG
hosal A., Satoh H., Thomas P.E., Bush E.およびMoore D.の「ラット、ヒト由
来のミクロソームのシトクロムＰ４５０ ３Ａ４活性およびｃＤＮＡ−発現ヒト シトクロムＰ４５０の阻害および速度論」、Drug Metab. Dispos., 24, 940〜94
7 (1996年)）。しかしながら、これらのフラボノイドの経口投与はグレープフル
ーツジュースの効果をもたらさなかった（Bailey D.G., Arnold J.M.O., Munoz
C.およびSpence J.の「グレープフルーツジュース−フェロジピン相互作用：ナ リンジンの機構、予測可能性および効果」、Clin. Pharmacol. Ther., 53, 637 〜642 (1993年）、並びにRashid J., McKinstry C., Renwick A.G., Dirnhuber
M., Waller D.G.およびGeorge C.F.の「インビトロでＣＹＰ３Ａを阻害するケル
セチンはニフェジピンとグレープフルーツジュースの相互作用に寄与しない」、
Br. J. Clin. Pharmac., 36, 460〜463 (1993年)）。最近、グレープフルーツジ
ュースの塩化メチレン抽出物のＨＰＬＣ精製により、デキサメタゾンが誘発する
ラット肝ミクロソームのテストステロン６β−ヒドロキシラーゼの阻害をひき起
こしたグレープフルーツジュースの一成分として６′,７′−ジヒドロキシベル ガモッチンを同定した（Edwards D.J., Bellevue F.H., IIIおよびWoster P.M. の「グレープフルーツジュース中のシトクロムＰ４５０阻害物質６′,７′−ジ ヒドロキシベルガモッチンの同定」、Drug Metab. Dispos., 24, 1287〜1290 (1
996年)）。

【０００５】 本発明者らは驚くべきことに、しかも予想外に、ＢＧがヒトシトクロムＰ４５
０ ３Ａ４の機構に基づく阻害に関与するグレープフルーツジュース中の主要化 合物であることを見い出した。すなわち、低い経口生体利用性を有する化合物を
ＢＧと組み合わせて同時投与することにより該化合物の経口生体利用性を高める
ことができる。 したがって、本発明の第一の態様によれば、低い生体利用性を有する化合物を
ＢＧと組み合わせて患者に投与することからなる該化合物の腸の酵素代謝を阻害
する方法が提供される。 さらに、本発明の別の態様は有効な量の低い生体利用性を有する化合物をＢＧ
と組み合わせて単位投与形態で投与するための医薬組成物である。 最後に、本発明はグレープフルーツジュースからＢＧを単離する方法に関する
。

【０００６】 本発明は添付した図１〜８を参照して下記の非限定的な実施例により詳しく説
明される。下記で各図について短く説明する。 図１はグレープフルーツジュース抽出物の逆相ＨＰＬＣ図を示す。溶出液をＵ
Ｖ検出により３１０nmでモニターした（パネルＡ）。〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３３ ９のＢＧ（パネルＢ）、〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ （パネルＣ）、〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３７３のビスヒドロキシル化ＢＧ（パネル Ｄ）についてのイオンクロマトグラムを再構成した。 図２は〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３３９のＢＧの生成物イオンＭＳ／ＭＳスペクト ルである。 図３は〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ代謝物の生成物 イオンＭＳ／ＭＳスペクトルである。パネルＡ、１２.９分（相対強度３９％)；
パネルＢ、１７.７分（６％）；パネルＣ、１８.１分（１１％）；パネルＤ、１
９.６分（７％）；パネルＥ、２４.１分（３７％）。表示した酸化部位は衝突が
ひき起こすｍ／ｚ ３５５の前駆体イオンの解離反応に基づく；すなわちｍ／ｚ
２０３の生成物イオンは完全な５−ヒドロキシプソラレン部分に相当し、イソプ
レン鎖の酸化が表示される。特定の酸化部位をＭＳ／ＭＳデータから決定するこ
とはできない。 図４は〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３７３のビスヒドロキシル化ＢＧの生成物イオン ＭＳ／ＭＳスペクトルである。パネルＡ、１２.９分；パネルＢ、１５.９分。表
示した酸化部位は衝突がひき起こす解離反応に基づく；すなわちｍ／ｚ ２０３ のイオン（パネルＡ）は完全な５−ヒドロキシプソラレン部分に相当し、イソプ
レン鎖の酸化が表示される。ホルムアルデヒドを失ってｍ／ｚ ３４３のイオン を生じること（パネルＢ）は脂肪族の酸化を意味すると解される。特定の酸化部
位をＭＳ／ＭＳデータから決定することはできない。

【０００７】 図５はＢＧと一緒にＮＡＤＰＨの存在下（−）、ＢＧと一緒にＮＡＤＰＨの不
存在下（-・-）、そしてＢＧなしでＮＡＤＰＨの存在下（---）、それぞれインキ
ュベートした再構成Ｐ４５０ ３Ａ４反応混合物の還元型−一酸化炭素差スペク トル（上部パネル）およびＵＶ−可視スペクトル（下部パネル）である。Ｐ４５
０ ３Ａ４（０.５ナノモル／ml）を方法および物質に記載のようにして３７℃で
１５分間、再構成系中で５０μMのＢＧと一緒にインキュベートした。０.２５ま
たは０.２mlアリコートのインキュベーション混合物を２０％グリセロールおよ び０.５mMのＥＡＴＡを含有する１.７５または０.８mlの５０mMヘペス緩衝液（p
H７.５）で希釈し、還元型−一酸化炭素Ｐ４５０差スペクトルおよびＵＶ−可視
スペクトルをそれぞれ「物質および方法」の項に記載のようにして測定した。 図６は５０μMのＢＧと一緒にＮＡＤＰＨの存在下（−）または不存在下（---
)でインキュベートした後のＰ４５０ ３Ａ４再構成系のＨＰＬＣ図である。溶出
液を２１４nmおよび４０５nm（挿入図）でモニターした。ピークＡ、ＢおよびＣ
はそれぞれＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ、シトクロムｂ₅およびＰ４５０
３Ａ４を示す。 図７は再構成系におけるＢＧによるＰ４５０ ３Ａ４のテストステロン６β− ヒドロキシル化活性の時間および濃度依存型阻害を示す。実験の詳細は「物質お
よび方法」の項に記載した。プレインキュベーション試料中のＢＧ濃度はそれぞ
れ０μM（□）、５μM（◇）、１０μM（○）、２５μM（△）、５０μM（▽） および１００μM（×）である。 図８はＢＧによるヒト肝ミクロソーム中のＰ４５０ １Ａ２（ ）、２Ａ６（◇
）、２Ｃ９（□）、２Ｄ６（△）、２Ｅ１（×）および３Ａ４（○）の活性の阻
害を示す。Ｐ４５０酵素の活性は「物質および方法」の項に記載の方法を使用し
て測定した。その結果を３回の実験の平均値として示した。

【０００８】 「低い経口生体利用性（low oral bioavailability)」なる用語は経口生体利 用性が５０％未満、好ましくは３０％未満の化合物を意味する。

【０００９】 ５−ゲラノキシプソラレン、ベルガモチンまたはベルガプチンとしても知られ
ているベルガモッチンは化学名（Ｅ）−４−〔（３,７−ジメチル−２,６−オク
タジエニル）オキシ〕−７Ｈ−フロ〔３,２−ｇ〕〔１〕ベンゾピラン−７−オ ンで知られており、次の化学構造

【化１】 を有する。

【００１０】 次の表１は本明細書で使用される略語およびその定義の一覧表である。

【表１】

【００１１】 ベルガモッチンはＰ４５０ ３Ａ４の機構に基づく失活を担うグレープフルー ツジュース中の主要な化合物として確認されている。幾つかのモノ酸素化または
ジヒドロキシル化ＢＧ誘導体もまた、グレープフルーツジュース中で確認された
。それらの一つで以前に単離され、ラット肝ミクロソーム中のテストステロン６
β−ヒドロキシラーゼを阻害することが確認された（上記のEdwardsの文献（199
6年)）ジヒドロキシベルガモッチンの含量はグレープフルーツジュース中のＢＧ
含量の２０％未満と測定された。グレープフルーツジュース中のＢＧ誘導体の殆
どは完全なフラノクマリン基を含有し、それはＰ４５０の不活性化に関与すると
考えられている。ベルガモッチンおよびそのモノまたはジヒドロキシル化誘導体
はオレンジジュース中では確認されておらず、このことはオレンジジュースが腸
の薬剤代謝において阻害作用を示さないという報告（上記のBaileyの文献（1991
年)）と一致する。ＢＧおよびその誘導体の含量は種々のグレープフルーツジュ ース製剤の中で有意に変動し、それによりグレープフルーツジュースの効果につ
いて報告された矛盾を説明できた（Vanakoski J., Mattila M.J.およびSeppala
T.の「グレープフルーツジュースはヒトにおけるミダゾラムおよびトリアゾラム
の効果を高めない」、Eur. J. Clin. Pharmacol., 50, 501〜508 (1996年)）。

【００１２】 Ｐ４５０ ３Ａ４活性の失活はＢＧの代謝を必要とし、時間および濃度に依存 する。これらの結果はＢＧがＰ４５０ ３Ａ４の機構に基づく不活性化物質であ ることを示唆している（Walsh C.T.の「自殺基質、機構に基づく酵素失活：最近
の開発」、Ann. Rev. Biochem., 53, 493〜535（1984年))。幾つかの他のフラノ
クマリンはＰ４５０の機構に基づく失活をひき起こすことが以前に報告されてい
る；例えばコランドリン（Cai Y., Baer-Dubowska W., Ashwood-Smith M.J., Ce
ska O., Tachibana S.およびDiGiovanni J.の「天然に存在するクマリンによる 肝エトキシレソルフィンＯ−脱アルキル活性の機構に基づく失活」、Chem. Res.
Toxicol., 9, 729〜736 (1996年)）および８−メトキシプソラレン（Labbe G.,
Descatiore V., Beaune P., Letteron P., Larrey D.およびPessayre D.の「メ
トキサレンによるシトクロムＰ−４５０の自殺失活；反応性中間体とタンパク質
部分の共有結合の証拠」、J. Pharmacol. Exp. Ther., 250, 1034〜1042 (1989 年）、並びにMays D.C., Hilliard J.B., Wong D.D., Chambers M.A. Park S.S.
, Gelboin H.V.およびGerber N.の「マウス肝ミクロソームにおける８−メトキ シプソラレンのバイオ活性化およびシトクロムＰ−４５０の不可逆失活：単クロ
ーン性抗体による変更、薬剤代謝の阻害および共有結合付加物」、J. Pharmacol
. Exp. Ther., 254, 720〜731 (1990年)）である。一連の天然に存在するクマリ
ンの研究（上記のCaiの文献（1996年)）に基づいてフラン環はＰ４５０ １Ａの 失活に関与する基であることが示唆された。幾つかの他のフラン含有化合物もま
たＰ４５０の失活をひき起こすことが証明されている。一つの例はフラノピリジ
ンＬ−７５４,３９４、すなわちフラン環で化学的に反応性のエポキシドを形成 することによりＰ４５０ ３Ａ４の機構に基づく失活をひき起こすことがわかっ ているＨＩＶプロテアーゼ阻害剤である（Chiba M., Nishine J.A.およびLin J.
H.の「研究中のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤Ｌ−７５４,３９４によるヒト肝ミク ロソームのシトクロムＰ−４５０イソフォームの強力で選択的な失活」、J. Pha
rmacol. Exp. Ther., 275, 1527〜1534 (1995年）；Sahali-Sahly Y., Balani S
.K., Lin J.H.およびBaillie T.A.の「シトクロムＰ４５０ ３Ａ４の非常に強力
で選択的な機構に基づく阻害剤であるフラノピリジンＬ−７５４,３９４の代謝 活性に関するインビトロ研究」、Chem. Res. Toxicol., 9, 1007〜1012（1996年
)）。ＢＧが仲介する機構に基づくＰ４５０ ３Ａ４の失活は、フラン環が酵素の
活性部位の決定的な部分を共有結合的に変更する反応性中間体に活性化される同
様の機構に従うと考えられる。失活は、２または３⁺mMのＧＳＨをインキュベー ション系に加えても阻害されないので、活性部位で起こるものと考えられる。Ｐ
４５０ ３Ａ４のＢＧが仲介する失活のＫ失活値が０.３分^-1であるということは
、ＢＧがＰ４５０ ３Ａ４のより強力な不活性化物質の一つであることを示唆し ている。他の２種の強力な不活性化物質のＫ失活値はゲストデンについては０. ４分^-1であり（Guengerich F.P.の「ゲストデンによるヒト肝ミクロソームのシ トクロムＰ−４５０IIIＡ４の機構に基づく失活」、Chem. Res. Toxicol., 3, 3
63〜371 (1990年)）、そしてＬ−７５４,３９４については１.６２分^-1である（
上記のChiba M.の文献、275、1527〜1534 (1995年)）。さらに、ＢＧは再構成系
中のＰ４５０ ３Ａ４の失活に関してそのＫ失活の測定値が０.１６分^-1である６
′,７′−ジヒドロキシベルガモッチンよりも強力であることがわかった。ＢＧ はまたＰ４５０ ３Ａ４の競合的阻害剤であるものと考えられる。このことはＢ Ｇが主としてＰ４５０ ３Ａ４により幾つかのヒドロキシル化代謝物に代謝され るという観察の結果と一致している。しかしながら、その競合的阻害は、テスト
ステロン６β−ヒドロキシル化活性の測定中にＰ４５０ ３Ａ４がＢＧによる機 構に基づく不活性化を受けるために過大評価されている可能性がある。

【００１３】 Ｐ４５０ ３Ａ４活性はα−ナファトフラボンにより刺激されることが報告さ れているため（Ueng Y.F., Kuwabara T., Chun Y.J.およびGuengerich F.P.の「
シトクロムＰ４５０ ３Ａ４が触媒する酸化における協同性」、Biochemistry, 3
6, 370〜381 (1997年)）、本発明者らはα−ナファトフラボンが不活性化を増大
しうるＢＧの反応性代謝物の生成において相乗作用を示す可能性について研究し
た。その結果、α−ナファトフラボンはＢＧが仲介するＰ４５０ ３Ａ４の失活 に対して何の影響も与えなかった。しかしながら、α−ナファトフラボンがシト
クロムＰ４５０ ３Ａ４が触媒するＢＧのヒドロキシル化を刺激するかどうかは わかっていない。

【００１４】 Ｐ４５０ ３Ａ４のＢＧが仲介する失活の機構は本研究において前もって研究 されている。ヘム付加物の生成は末端オレフィンおよびアセチレンによるＰ４５
０の失活機構であることが十分に証明されている（Ortiz de Montellano P.R.お
よびCorreia M.A.の「シトクロムＰ４５０の阻害」、シトクロムＰ４５０−構造
、機構および生化学（Ortiz de Montellano P.R.編, 第305〜366頁，プレナムプ
レス社））。最近、再構成系中で生成したヘム付加物が可視分光分析、ＨＰＬＣ
および質量分析により確認され、特性決定された（He K., Falick A.M., Chen B
., Nilsson F.およびCorreia M.A.の「セコバルビタールによるラット肝シトク ロムＰ４５０ ２Ｂ１の機構に基づく失活の間に変性した活性部位ペプチドとヘ ム付加物の確認」、Chem. Res. Toxicol., 9, 614〜622；並びにHe K., He Y.A.
, Szklarz G.D., Halpert J.R.およびCorreia M.A.の「セコバルビタールが関与
するシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の失活およびその活性部位変異体：ヘムおよび タンパク質のアルキル化およびエポキシド化間の分配」、J. Bol. Chem., 271,
25864〜25872 (1996年)）。ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４試料の可視スペ
クトルはヘム付加物生成の形跡を示さなかった。４００〜５００nmの範囲におい
て−ＮＡＤＰＨ対照と比較した差スペクトル中で観察された唯一の吸収ピークは
約４２３〜４２５nmのピークであり、それはＮＡＤＰＨ−還元型Ｐ４５０のもの
と考えられる。吸収スペクトルはまた、試料が９０％のテストステロン６β−ヒ
ドロキシル化活性を失ってもＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４に関するヘム 含量は有意に減少しないことを示した。この結果から、ヘムフラグメントとアポ
タンパク質の共有結合をもたらすヘムのフラグメント化をひき起こす幾つかの機
構に基づく不活性化物質と関係がある他の代替機構が除外されるものと考えられ
る（上記のOrtiz de Montellanoの文献（1995年）；並びにYao K., Falick A.M.
, Patel N.およびCorreia M.A.の「クメンヒドロペルオキシドによるシトクロム
Ｐ４５０ ２Ｂ１の失活：活性部位ヘム−変性ペプチドの確認」、J. Biol. Chem
., 268, 59〜65 (1993年)）。しかしながら、Ｐ４５０ ３Ａ４の還元型−ＣＯ差
スペクトルは再構成系においてＢＧで処理した後に約４０％減少した。ヘム分解
またはヘム付加物生成の証拠はないため、結合したＢＧはそれがＣＯとヘム鉄の
相互作用を妨害するように、活性部位アミノ酸残基との共有結合によりヘム部分
に接近して位置し得るものと考えられる。他のフラノクマリンの８−メトキシプ
ソラレンによるＰ４５０の失活に関する研究は、活性部位での８−メトキシプソ
ラレンとアポＰ４５０の共有結合がＰ４５０の還元型−ＣＯスペクトルの減少を
ひき起こしうることを示唆した（上記のLabbeの文献（1989年）および上記のMay
sの文献（1990年)）。ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４のＨＰＬＣ分析から 、ＢＧがアポＰ４５０の性質を変えることを示唆している間接的な証拠が得られ
た。アポタンパク質の部分的な減少はＰ４５０インキュベーション混合物を逆相
ＨＰＬＣにより分析した時のタンパク質の変性により失活したＰ４５０酵素につ
いての一般的な特徴であると考えられる（Roberts E.S., Hopkins N.E., Alwort
h D.A.およびHollenberg P.F.の「２−エチニルナフタレンによるシトクロムＰ ４５０ ２Ｂ１の機構に基づく失活：活性部位ペプチドの確認」、Chem. Res. To
xicol., 6, 470〜479 (1993年）、並びにHe K.の上記文献(1996年)）。失活した
Ｐ４５０の疎水性活性部位アミノ酸残基の幾つかはそれらが共有結合により起こ
る配座変化の結果として逆相媒質にしっかりと結合するように露出していると考
えられる。アポＰ４５０の共有結合による変性もまた幾つかの他のフラノクマリ
ンによるＰ４５０の失活機構の一つであると以前に報告された（Labbeの上記文 献(1989年)；Caiの上記文献（1996年)；Maysの上記文献（1990年)）。したがっ て、ＢＧが仲介するＰ４５０ ３Ａ４の失活は２−エチニルナファレンおよび９ −エチニルフェナントレンを用いたＰ４５０ ２Ｂ１および２Ｂ４の機構に基づ く失活で観察されたように、主としてアポタンパク質の変性によると考えられる
（Roberts E.S., Hopkins N.E., Zoluzec E.J., Gage D.A., Alworth W.L.およ びHollenberg P.F.の「アミノ酸配列分析法および質量分析法を使用する３Ｈ− 標識２−エチニルナファレンにより失活したＰ４５０ ２Ｂ１および２Ｂ４から の活性部位ペプチドの確認」、Biochemistry, 33, 766〜3771 (1994年）、並び にRoberts E.S., Hopkins N.E., Zaluzec E.J., Gage D.A., Alworth W.L.およ びHollenberg P.F.の「９−エチニルフェナントレンによるシトクロムＰ４５０
２Ｂ１の機構に基づく失活」、Arch. Biochem. Biophys., 323, 295〜302 (1995
年)）。

【００１５】 ＢＧおよびその誘導体によるＰ４５０ ３Ａ４の阻害または不活性化は、腸の Ｐ４５０ ３Ａ４により広く代謝されることが知られている幾つかの臨床上使用 される薬剤の生体利用性に対するグレープフルーツジュースの効果を理解するの
に重要であるが、本発明者らはさらにＢＧが他のヒトＰ４５０の活性を阻害する
かどうかについても調べた。ＢＧが１Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６
および２Ｅ１を含む幾つかのヒトＰ４５０の活性を阻害することがわかった。グ
レープフルーツジュースの効果は主に腸のレベルで現れるため、各Ｐ４５０酵素
の効果への寄与は腸内のその発現レベルに依存する。Ｐ４５０ ３Ａ４は最も豊 富な腸内Ｐ４５０酵素であり、１Ａ、２Ａ、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅのような他の
Ｐ４５０は腸内であまり発現しない（Watkinsの上記文献(1987年）、並びにPete
rs W.H.M.およびKremers P.G.の「ヒト腸粘膜のシトクロムＰ４５０」、Biochem
. Pharmacol., 38, 1535〜1538 (1989年)）。本発明者らはＢＧおよびその誘導 体が腸内であまり吸収されず、または広く代謝されるため、それらは肝Ｐ４５０
を不活性化または阻害する機会が少ないのではないかと考えている。

【００１６】 ある種の臨床上使用される薬剤はＰ４５０ ３Ａ４により広く代謝されるため 、その経口生体利用性は比較的低い（Bertz R.J.およびGranneman R.のClin. Ph
armacokinet 32, 210〜258 (1997年)）。表２は種々の臨床上使用される薬剤の 代謝分および経口生体利用性を示す。したがって、これらの薬剤の不十分な吸収
は腸Ｐ４５０ ３Ａ４による初回の通過代謝が一因である。幾つかのこれらの薬 剤の経口生体利用性はグレープフルーツジュースと共に同時投与することにより
有意に増加することがわかっている。本発明者らはこれらの薬剤の経口生体利用
性がグレープフルーツジュース中の主要なフラノクマリンであるＢＧを配合また
は同時投与することにより増大することを見い出した。 腸Ｐ４５０ ３Ａ４の発現レベルは個体間で有意に異なるため、薬剤代謝およ び薬剤効果の個体間変動に寄与する主要な要因の一つであると考えられている。
本発明者らはさらに、このような変動がＢＧの同時投与による腸Ｐ４５０ ３Ａ ４の失活により減少することを見い出した。

【００１７】 不十分な生体利用性を有する臨床上使用される薬剤の例を下記に示す：シクロ
スポリンおよびタクロリマスは臓器移植および所定の自己免疫疾患の治療におい
て使用される強力な免疫抑制剤である。ラパマイシンは移植や自己免疫疾患の治
療に使用するための臨床段階に入っている。これらの薬剤はすべてＰ４５０ ３ Ａ４により広く代謝されることがわかっている。シクロスポリン、タクロリマス
およびラパマイシンはその吸収が不十分であり、それぞれ１５％〜３０％、１５
％〜２０％および１０％〜２０％の経口生体利用性を有する。ＨＩＶプロテアー
ゼ阻害剤のサキナビルは吸収が非常に悪く、その経口生体利用性は１％〜９％で
ある。Ｐ４５０ ３Ａ４はサキナビルの代謝を担う主要な酵素であることがわか っている。インジナビルおよびリトナビルのような他のＨＩＶプロテアーゼ阻害
剤もまた、主としてＰ４５０ ３Ａ４により代謝され、比較的低い経口生体利用 性を有する。カルシウムチャンネル遮断剤として使用される幾つかのジヒドロピ
リジン、例えばフェロジピン、イスラジピン、ニフェジピン、ニモジピンおよび
ニソルジピンは主としてＰ４５０ ３Ａ４により代謝される。これらの不十分な 経口生体利用性（５％〜２０％）は主として初回通過代謝によることがわかって
いる。幾つかのジヒドロピリジンの経口生体利用性はグレープフルーツジュース
を同時投与することにより増加することがわかっている。抗高脂肪血症および抗
高コレステロール血症剤のアトルバスタチンは主としてＰ４５０ ３Ａ４により 代謝される。その経口生体利用性は僅か１４％〜３０％である。これらの薬剤は
すべて、その経口生体利用性を高めるためにＢＧと組み合わせて患者に投与する
ことができる。さらに、表２に記載した他の薬剤もまたＢＧと組み合わせてその
経口生体利用性を高めることができる。

【００１８】

【表２】

【００１９】

【表３】

【００２０】 グレープフルーツジュース中のＢＧおよびその誘導体の確認： グレープフルーツジュースの酢酸エチル抽出物中の幾つかの成分を「方法およ
び物質」の項に記載の条件下でＨＰＬＣにより分離した（図１）。ＬＣ−ＭＳ／
ＭＳによる成分ピークの構造分析の結果、保持時間が２６分のピークはＢＧであ
ることがわかった（図１）。生成物イオンスペクトルおよびＨＰＬＣ保持時間は
本物の基準試料が示すものと同じであった（図２）。ｍ／ｚ ２０３の主力のフ ラグメントイオンは５−ヒドロキシプソラレン部分に相当し、その後ＣＯ、ＣＯ ₂ およびＣ₂Ｈ₂Ｏ₂を失ってそれぞれｍ／ｚ １７４、１５９および１４７のフラ グメントイオンになる。ｍ／ｚ １３７のフラグメントイオンは残りの側鎖に相 当する。図１を見てわかるように、グレープフルーツジュース中に少なくとも５
種の一酸素化ＢＧ生成物が存在する。それらの仮の構造式を図３に示す。グレー
プフルーツジュース中に少なくとも２種の主要なジヒドロキシル化ＢＧ生成物が
存在する。１３分で溶出する成分は６′,７′−ジヒドロキシベルガモッチンと 同じ生成物イオンスペクトルおよびＨＰＬＣ保持時間を示した（図４参照）。２
４分で溶出する成分のｍ／ｚ ３４０のプロトン化分子イオンは衝突解離（ＣＩ Ｄ）によりフラグメント化してｍ／ｚ １６８の主要な生成物イオンを与えた。 このことはこの成分がＢＧの誘導体ではないことを示唆している。ＢＧそれ自体
はグレープフルーツジュースの酢酸エチル抽出物のＬＣ／ＵＶ測定において主な
フラノクマリンとして現れる。さらに、ＢＧはＣ１８カラムとしっかり結合する
ために、グレープフルーツジュース中の６′,７′−ジヒドロキシベルガモッチ ンを確認するのに以前使用された条件（Edwardsの上記文献（1996年)）の６０％
メタノールではカラムから溶離できないことがわかった。 オレンジジュースの酢酸エチル抽出物のＬＣ／ＵＶ分析はオレンジジュース中
に検出可能なＢＧが存在しないことを示した。

【００２１】 Ｐ４５０ ３Ａ４の失活： Ｐ４５０ ３Ａ４をＢＧと共に再構成系中でインキュベートした結果、テスト ステロン６β−ヒドロキシル化活性の９０％が失われた（表３）。また、Ｐ４５
０活性の約６０％が再構成系中、ＮＡＤＰＨの不存在下で阻害された（表２）。
しかしながら、テストステロン６β−ヒドロキシル化活性の測定において試料を
２０倍に希釈した時でさえ、それらはまだ２.５μMのＢＧを含有した。この濃度
のＢＧは別の実験でＰ４５０ ３Ａ４活性を約５５％阻害することがわかった。 さらに、還元型−ＣＯスペクトルにより測定されるＰ４５０含量はＰ４５０ ３ Ａ４をＢＧと共にＮＡＤＰＨの存在下で１５分間インキュベートした後約４０％
減少した（表３）。ＣＯ−還元型Ｐ４５０差スペクトルにおいて４００〜５００
nmの範囲で４２０nmのピーク生成または４５０nmのピークの代わりの他の吸収は
なかった（図５）。ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４についての完全スペク トルの最大吸収は４２５nmであった。それはＮＡＤＰＨの存在下でＢＧなしのＰ
４５０ ３Ａ４と比較して長波長側に約２nmシフトした。ヘム分解の形跡はなか った；しかしながら、ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４の最大の吸収を僅か に増大した（図５）。参照として−ＮＡＤＰＨ／＋ＢＧ試料を使用した場合、Ｐ
４５０含量もまた同程度まで減少した。この方法はインキュベーション中に内因
的に発生したＣＯによるＰ４５０測定の干渉を減少すると考えられる（Correia
M.A., Decker C., Sugiyama K., Underwocod M., Bornheim L., Wrighton S.A.,
Rettie A.E.およびTrager W.F.の「３,５−ジカルボエトキシ−２,６−ジメチ ル−４−エチル−１,４−ジヒドロピリジンによりラット肝シトクロムＰ４５０ ヘムを分解して不可逆的に結合したタンパク質付加物を得る」、Arch. Biochem.
Biophys., 258, 436〜451 (1987年)）。

【００２２】 ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４のＨＰＬＣ分析： 図６を見てわかるように、ＢＧにより失活したＰ４５０ ３Ａ４を含有する試 料を多孔質カラム（Poros column）における逆相ＨＰＬＣにより分析した結果、
アポＰ４５０ ３Ａ４の量が選択的に約５０％減少した。−ＮＡＤＰＨ対照と比 較して１００％近くのレダクターゼおよびシトクロムｂ₅タンパク質をカラムか ら回収した。ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４を含有する試料から約９０％ のヘムを回収した。このことはスペクトル分析で得られた結果と一致する。これ
らのＨＰＬＣ条件下で変性ヘムのピークは検出されなかった。

【００２３】 ＢＧによるＰ４５０の時間および濃度依存型失活： 図７を見てわかるように、再構成系におけるＢＧが関与するＰ４５０ ３Ａ４ の失活はＢＧの代謝を必要とするだけでなく、時間と温度にも依存する。失活は
時間に関して疑似一次反応を示した。図７のデータの一次回帰分析により失活の
初期速度定数（Ｋ_obs）を求めた。Ｋ_obs値とＢＧ濃度の二重−逆プロットから失
活の最大速度定数（Ｋ失活）０.３／分および半最大失活に必要な不活性化物質 の濃度（Ｋ_I）７.７μMを得た（Walshの上記文献（1984年)）。プレインキュベ ーションなしの試料についても濃度に依存する阻害が観察された。これは表３の
−ＮＡＤＰＨ／＋ＢＧ試料で得られた結果と一致した。

【００２４】 ＢＧが仲介する失活におけるα−ナファトフラボンの効果： α−ナファトフラボンはＰ４５０ ３Ａ４による幾つかの基質の代謝を刺激す ることが報告されている（Uengの上記文献（1997年)）。そのため、それがＢＧ の反応性代謝物質の生成を増大させ、Ｐ４５０ ３Ａ４の失活を促進するかどう かを調べてみた。α−ナファトフラボンはＢＧが関与するＰ４５０ ３Ａ４の失 活の効力を変えなかった。最終濃度が６〜５０μMのα−ナファトフラボンを反 応混合物中で同時にインキュベートした場合、３Ａ４のテストステロン６β−ヒ
ドロキシル化活性は２μMのＢＧにより約５５％失活した。溶解度が制限される ため、より高い濃度のα−ナファトフラボンは使用しなかった。

【００２５】 ＢＧによるヒト肝ミクロソームＰ４５０酵素の阻害： 図８を見てわかるように、ヒト肝ミクロソームのＰ４５０ １Ａ２、２Ａ６、 ２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４活性はＢＧにより阻害された。Ｐ４５０ １Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４のＩＣ₅₀値はそれぞれ約
Ｘ、Ｘ、２.４、３.０、３.９および４.６μMであった。２および２０μMのＢＧ
により、それぞれ約７１％および１００％のＰ４５０ ２Ｃ１９活性が阻害され た。

【００２６】

【表４】

【００２７】 本発明の化合物は様々な経口投与形態で製造し、投与することができる。 本発明の化合物から医薬組成物を製造する場合、薬学的に許容しうる担体は固
体または液体である。固形製剤には散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、
坐剤および分散性顆粒剤が含まれる。固体状担体は希釈剤、芳香剤、結合剤、保
存剤、錠剤崩壊剤または封入物質としても作用する一種または二種以上の物質で
あってよい。 散剤において、担体は微細な活性成分と混合される微粉固体である。 錠剤において、活性成分は必要な結合性を有する担体と適当な割合で混合され
、所望の形状および大きさに圧縮される。

【００２８】 散剤および錠剤は好ましくは５または１０〜約７０％の活性化合物を含有する
。適当な担体は炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラ
クトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチ
ルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ろう、カカオ脂
などである。「製剤」なる用語は、活性成分が他の担体と共にまたはそれなしで
担体により囲まれている、すなわち担体と会合しているカプセル剤を与えるよう
な、担体として封入物質を用いた活性化合物の製剤を包含することを企図してい
る。同様に、カシェ剤およびトローチ剤もまた包含される。錠剤、散剤、カプセ
ル剤、丸剤、カシェ剤およびトローチ剤は経口投与に適した固体投与形態として
使用することができる。

【００２９】 坐剤の製造では、最初に低融点ろう、例えば脂肪酸グリセリド混合物またはカ
カオ脂を溶融し、そして活性成分を撹拌などによりその中に均質に分散させる。 次に、溶融した均質混合物を好ましい大きさの金型に注ぎ、冷却して固化する。 液状製剤には液剤、懸濁剤および乳剤、例えば水溶液またはプロピレングリコ
ール水溶液が含まれる。 経口使用に適した水性液剤は活性成分を水に溶解し、適当な着色剤、芳香剤、
安定剤および増粘剤を所望により加えて製造することができる。

【００３０】 経口使用に適した水性懸濁剤は微細な活性成分を粘稠物質、例えば天然または
合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、
および他のよく知られている懸濁化剤と一緒に水中に分散させて製造することが
できる。 使用する直前に経口投与用液状製剤に変えることができる固形製剤もまた包含
される。このような液状形態には溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。これら
の製剤は活性成分の他に着色剤、芳香剤、安定剤、緩衝剤、人工および天然の甘
味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有することができる。

【００３１】 医薬製剤は好ましくは単位投与形態である。このような形態において、製剤は
適当な量の活性成分を含有する単位投与量に小分けされる。単位投与形態は別々
の量の製剤を含有するパッケージ製剤、例えば小包錠剤、カプセル剤、およびバ
イアルまたはアンプル中の散剤であってよい。また、単位投与形態はカプセル剤
、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤そのもの、あるいはこれらの何れかが適当な
数包装された形態であってよい。 単位投与製剤中における活性成分の量は、特定の用途および活性成分の効力に
応じて０.１mg〜１００mg、好ましくは０.５mg〜２０mgに変動し、または調整す
ることができる。さらに、本組成物は所望により他の相容性治療剤を含有するこ
とができる。

【００３２】 治療的用途において、本発明の薬学的方法で使用される化合物は１日あたり約
０.０１mg〜約１mgのＢＧ／kgの初期投与量で投与される。１日あたりのＢＧの 投与量は約０.０１mg〜約０.１mg／kgが好ましい。ＢＧと組み合わせる本発明の
化合物の適当な治療的投与量は当業者に知られている。しかしながら、その投与
量は患者の要求、治療する症状の程度、および使用する化合物に応じて変わる。
特定の状況における適当な投与量の決定は当業者に委ねられている。一般に、治
療は化合物の最適量よりも少ない投与量で開始される。その後、投与量はその状
況下で最適な効果が得られるまで少しずつ増やされる。好都合には、１日の全投
与量を所望により分割して１日に複数回投与することができる。 次の実施例により本発明の化合物を製造するための好ましい方法を詳しく説明
するが、本発明はこれらに制限されない。

【００３３】

【実施例】

物質および方法 化学物質：ＮＡＤＰＨ、Ｌ−α−ジラウロイル−およびＬ−α−ジオレイル−Ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ホスファチジルセリン、カタラーゼ、ＧＳＨ
、δ−アミノレブリン酸塩酸塩、テストステロン、６β−および１１β−ヒドロ
キシテストステロン、クロルゾキサゾン、クマリン、トルブタミドはシグマ化学
社から購入した。７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）はアルドリッチ
社から入手した。４−ヒドロキシメチルトルブタミド、６−ヒドロキシクロルゾ
キサゾン、４′−ヒドロキシメフェニトイン、ラセミ形ブフロロールおよび１′
−ヒドロキシブフロロールはゲンテスト社から入手した。イソプロピルβ−Ｄ−
チオガラクトシドはカルビオケム社から購入した。（Ｓ）−メフェニトインはW.
F. Trager博士（ワシントン大学）から贈られた。ベルガモッチンはインドフィ ン化学社から購入した。

【００３４】 実施例１ グレープフルーツジュース中のＢＧおよびその誘導体のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる
確認 半分にしたフロリダ産ホワイトグレープフルーツまたはオレンジをそれぞれ手
で絞ってグレープフルーツジュースまたはオレンジジュースを作った。ジュース
を酢酸エチルで抽出し、乾燥した抽出物を分析用のＨＰＬＣ緩衝液に溶解した。
各成分のＬＣ／ＭＳによる確認はクアトロ（Quattro）II三重四重極質量分析計 （マイクロマス社製）を使用して行った。試料の導入およびイオン化はエレクト
ロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により陽イオンモード（３０Ｖのコーン電圧）で
行った。スキャンデータはマイクロマスマスリンクス（Micromass Masslynx）Ｎ
Ｔデータシステム（バージョン２.２２）の制御下で得た。グレープフルーツジ ュースの成分は２００μl／分の流量で１００mMの酢酸（Ａ）およびアセトニト リル（Ｂ）を使用して３０％のＢで５分間、次に３０％〜７０％のＢで２５分間
グラジエント溶離するＣ１８カラム（５μm、２.１×１５０のゾルバックス（Zo
rbax）ＸＤＢ）上のＨＰＬＣにより分離した。分子量の測定は１.０秒／１０の スキャン速度で１００〜５００amuの質量範囲にわたる質量スペクトルを得るこ とにより行った。分子構造の測定は１.０秒／１０のスキャン速度でＭＳ／ＭＳ 生成物イオンをスキャニングすることにより行った。衝突活性化は２.０×１０^{- 3} トルの表示ガスのセル圧および２０eVの衝突エネルギーでアルゴンを使用して 行った。

【００３５】 実施例２ Ｐ４５０ ３Ａ４の発現および発現した酵素の精製 ｐＣＷベクターに移入された全長Ｐ４５０ ３Ａ４ ｃＤＮＡ（５′−末端のコ
ドン３−１２の欠失を除く）はR.W. Estabrook博士（テキサス大学南西メディカ
ルセンター）から入手した。ベクターを含有するＰ４５０ ３Ａ４はＭＶ１３０ ４細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌の増殖は変性テリフィックブロス（
Terrific Broth）中で行い、１mMのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを加
えてＰ４５０ Ａ４の発現を誘発した。δ−アミノレブリン酸（０.５mM）を加え
てヘムの合成を促進した。細菌細胞をリゾチームで処理した後音波処理により膜
分画を調製し、細菌細胞ホモジネートから分画遠心により単離した。前記のよう
にしてＰ４５０ ３Ａ４を界面活性剤で溶解した膜からＤＥ５２カラム上のクロ マトグラフィーにより精製して均質にした（Gillam E.M., Baba T., Kim B.R.,
Ohmori S.およびGuengerich F.P.の「大腸菌の変更したヒトシトクロムＰ４５０
３Ａ４の発現と酵素の精製および再構成」、Arch. Biochem. Biophys., 305, 1
23〜131 (1993年)）。

【００３６】 実施例３ ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびシトクロムｂ₅の単離 ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびシトクロムｂ₅をフェノ バルビタールで処理したロング−エバンス（Long-Evans）ラットの肝ミクロソー
ムから前記の方法により精製した（Waxman D.J.およびWalsh C.の「フェノバル ビタールが誘発するラット肝シトクロムＰ４５０」、J. Biol. Chem., 257, 104
46〜10457 (1982年)；Omura T.およびSato R.の「肝ミクロソームの一酸化炭素 結合色素」、J. Biol. Chem., 239, 2370〜2378 (1964年)）。

【００３７】 実施例４ 再構成系におけるＢＧが仲介するＰ４５０ ３Ａ４の失活 Ｐ４５０ ３Ａ４（０.５ナノモル）を最終容量が１mlの５０mMヘペス緩衝液（
pH７.５）中でＬ−α−ジラウロイル−およびＬ−α−ジオレイル−ｓｎ−グリ セロ−３−ホスホコリンとホスファチジルセリンの混合物（１：１：１、２０μ
g）、２００μgのコール酸、１ナノモルのＮＡＤＰＨレダクターゼ、０.５ナノ モルのシトクロムｂ₅、５００Ｕのカタラーゼ、２μモルのＧＳＨ、３０mMのＭ ｇＣｌ₂、０.５mMのＥＤＴＡ、および２０％のグリセロールと共に再構成した。
様々な濃度のＢＧを用いた反応は１mMのＮＡＤＰＨを加えて開始し、氷上で停止
させた。インキュベーションを３７℃で表示した時間行った。インキュベーショ
ンの終了後、０.２mlのインキュベーション混合物を２０％グリセロールおよび ０.５mMのＥＤＴＡを含有する０.８mlの５０mMヘペス緩衝液（pH７.５）で希釈 した。スプリットビームモードのＤＷ２−ＯＬＩＳ分光光度計において基準とし
て希釈緩衝液を使用して３３０〜７００nmのスペクトルを記録した。０.２５ml の試料を使用してOmuraおよびSatoの方法（OmuraおよびSatoの上記文献（1964年
)）によりＰ４５０含量を測定した。別の試料を採取してテストステロン６β− ヒドロキシル化活性の測定およびＨＰＬＣ分析を行った。

【００３８】 実施例５ テストステロン６β−ヒドロキシル化活性の測定 所定量(０.０５ml）のインキュベーション混合物を最終容量が１mlの５０mMヘ
ペス緩衝液（pH７.５）中における２００μMのテストステロン、５００Ｕのカタ
ラーゼ、２ミクロモルのＧＳＨ、３０mMのＭｇＣｌ₂、０.５mMのＥＤＴＡおよび
２０％グリセロールを含有する０.９５mlの５０mMヘペス緩衝液（pH７.５）で希
釈し、３７℃で１０分間インキュベートした。６β−ヒドロキシテストステロン
を１ml／分の流量で６５％メタノールの移動相を使用してイソクラティク溶離す
るＣ１８カラム（マイクロソルブ（Microsorb）−ＭＶ、５μm、４.６×１５cm 、Rainin、Woburn）上のＨＰＬＣにより測定し、溶出液をＵＶ検出により２５４
nmでモニターした。

【００３９】 実施例６ ＢＧが不活性化したＰ４５０ ３Ａ４のＨＰＬＣ分析 Ｐ４５０ ３Ａ４を上記のような再構成系中で５０μMのＢＧと一緒に１０分間
インキュベートした後、２００μlの反応混合物を前記のように多孔質カラムで 直接分析した（Roberts E.S., Hopkins N.E., Alworth D.A.およびHellenberg P
.F.の「２−エチニルナフタレンによるシトクロムＰ４５０ ２Ｂ１の機構に基づ
く失活：活性部位ペプチドの確認」、Chem. Res. Toxicol., 6, 470〜479 (1993
年)）。溶出液をＵＶ検出により１４、３１０および４０５nmで同時にモニター した。

【００４０】 実施例７ ＢＧによるヒト肝ミクロソームＰ４５０酵素活性の阻害 ヒト肝組織はシカゴ大学ＬＴＰＡＤＳ（肝臓移植の斡旋および分配サービス、
ミネソタ大学、ミネアポリス、ＭＮ）、ヒューマンバイオロジックス社（フェニ
ックス、ＡＺ）および国際科学振興学会（エキストン、ＰＡ）から入手した。肝
ミクロソームを分画遠心により調製した。カフェインのＮ３−脱メチル化（Tass
aneeyakul W., Mohammed Z., Birkett D.J., McManus M.E., Veronese M.E., Tu
key R.H., Quattrochi L.C., Gonzalez F.J.およびMiners J.O.の「ヒトシトク ロムＰ４５０のプローブとしてのカフェイン：ｃＤＮＡ−発現、免疫阻害、ミク
ロソーム動力学および阻害剤技術を使用する確認」、薬理遺伝学、2, 173〜183
(1992年)）、クマリンの７−ヒドロキシル化（Fentem J.H.およびFry J.R.の「 ラット、アレチネズミおよびヒト肝ミクロソームによるクマリンの代謝」、生体
異物、22, 357〜367 (1992年)）、トルブタミドのヒドロキシル化（Miners J.O.
, Smith K.J., Robson R.A., McManus M.E., Veronese M.E.およびBirkett D.J.
の「ヒト肝ミクロソームによるトルブタミドのヒドロキシル化：動力学の特徴お
よび生体異物酸化に依存する他のシトクロムＰ−４５０との関係」、Biochem. P
harmacol., 37, 1137〜1144 (1988年)）、ラセミブフロロールの１′−ヒドロキ
シル化（Kronbach T., Mathys D., Gut J., Catin T.およびMeyer U.A.の「ヒト
肝のミクロソーム中のブフロロール１′−ヒドロキシラーゼ、デブリソキン４−
ヒドロキシラーゼおよびデキストロメトルファンｏ−デエチラーゼについての高
速液体クロマトグラフィー分析と精製シトクロムＰ−４５０アイソザイム」、An
al. Biochem., 162, 24〜32 (1987年)）、クロルゾキサゾンの６−ヒドロキシル
化（Peter R., Bocker R., Beaune P.H., Iwasaki M., Guengerich F.P.およびY
ang C.S.の「ヒト肝シトクロムＰ−４５０IIＥＩの特異的プローブとしてのクロ
ルゾキサゾンのヒドロキシル化」、Chem. Res. Toxicol., 3, 566〜573 (1990年
)）、およびテストステロンの６β−ヒドロキシル化（Sonderfan A.J., Arlotto
M.P., Dutton D.R., McMillen S.K.およびParkinson A.の「ラット肝ミクロソ ームのシトクロムＰ−４５０によるテストステロンのヒドロキシル化の調節」、
Arch. Biochem. Biophys., 255, 27〜41.4 (1987年)）を使用してそれぞれＰ４ ５０ １Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４の活性を測定した 。プールしたヒト肝ミクロソーム（Ｎ＝６、０.１〜１mgのタンパク質／ml）を ＢＧ（１、１０および１００μM）と一緒に最終容量が０.５mlの０.１mMリン酸 塩緩衝液（pH７.５）中における相当するプローブ基質、すなわち１００μMのカ
フェイン、４μMのクマリン、１００μMのトルブタミド、１０μMのブフロロー ル、４０μMのクロルゾキサゾン、および５０μMのテストステロンの存在下、３
７℃でそれぞれ適当な時間インキュベートした。反応は１mMのＮＡＤＰＨを加え
て開始し、氷で停止させた。（Ｓ）−メフェニトインの４′−ヒドロキシル化を
使用してＰ４５０ ２Ｃ１９活性を測定した（Meier U.T., Kronbach T.およびMe
yer U.A.の「ヒト肝ミクロソームのメフェニトイン代謝の高速液体クロマトグラ
フィー分析」、Anal. Biochem., 151, 286〜291 (1985年)）。（Ｓ）−メフェニ
トイン（５０mM）を０.２、２および２０μMのＢＧの存在下、それぞれ最終容量
が０.１２５mlのプールしたヒト肝ミクロソームと一緒にインキュベートした。 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して４′−ヒドロキシメフェニトイン濃度を測定した。
実験の対照試料はＢＧを含まない全インキュベーション成分からなっていた。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 グレープフルーツジュース抽出物の逆相ＨＰＬＣ図を示す。溶出液をＵＶ検出
により３１０nmでモニターした。

【図１Ｂ】 ＢＧ〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３３９について再構成されたイオンクロマトグラム である。

【図１Ｃ】 モノヒドロキシル化ＢＧ〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５について再構成されたイ オンクロマトグラムである。

【図１Ｄ】 ビスヒドロキシル化ＢＧ〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３７３について再構成されたイ オンクロマトグラムである。

【図２】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３３９のＢＧの生成物イオンＭＳ／ＭＳスペクトルであ る。

【図３Ａ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ代謝物の生成物イオン ＭＳ／ＭＳスペクトルである〔１２.９分（相対強度３９％)〕。

【図３Ｂ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ代謝物の生成物イオン ＭＳ／ＭＳスペクトルである〔１７.７分（６％）〕。

【図３Ｃ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ代謝物の生成物イオン ＭＳ／ＭＳスペクトルである〔１８.１分（１１％）〕。

【図３Ｄ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ代謝物の生成物イオン ＭＳ／ＭＳスペクトルである〔１９.６分（７％）〕。

【図３Ｅ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３５５のモノヒドロキシル化ＢＧ代謝物の生成物イオン ＭＳ／ＭＳスペクトルである〔２４.１分（３７％）〕。

【図４Ａ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３７３のビスヒドロキシル化ＢＧの生成物イオンＭＳ／ ＭＳスペクトルである（１２.９分）。

【図４Ｂ】 〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ｍ／ｚ ３７３のビスヒドロキシル化ＢＧの生成物イオンＭＳ／ ＭＳスペクトルである（１５.９分）。

【図５】 ＢＧと一緒にＮＡＤＰＨの存在下（−）、ＢＧと一緒にＮＡＤＰＨの不存在下
（-・-）、そしてＢＧなしでＮＡＤＰＨの存在下（---）、それぞれインキュベー
トした再構成Ｐ４５０ ３Ａ４反応混合物の還元型−一酸化炭素差スペクトル（ 上部パネル）およびＵＶ−可視スペクトル（下部パネル）である。

【図６Ａ】 ５０μMのＢＧと一緒にＮＡＤＰＨの存在下（−）または不存在下（---)でイ ンキュベートした後のＰ４５０ ３Ａ４再構成系のＨＰＬＣ図であり、溶出液を ２１４ｎｍでモニターしたものを示す。ピークＡ、ＢおよびＣはそれぞれＰ４５
０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ、シトクロムｂ₅およびＰ４５０ ３Ａ４を示す。

【図６Ｂ】 溶出液を４０５ｎｍでモニターしたＨＰＬＣ図を示す。

【図７】 再構成系におけるＢＧによるＰ４５０ ３Ａ４のテストステロン６β−ヒドロ キシル化活性の時間および濃度依存型阻害を示す。プレインキュベーション試料
中のＢＧ濃度はそれぞれ０μM（□）、５μM（◇）、１０μM（○）、２５μM（
△）、５０μM（▽）および１００μM（×）である。

【図８】 ＢＧによるヒト肝ミクロソーム中のＰ４５０ １Ａ２（ ）、２Ａ６（◇）、２
Ｃ９（□）、２Ｄ６（△）、２Ｅ１（×）および３Ａ４（○）の活性の阻害を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ (72)発明者 ポール・ホーレンバーグ アメリカ合衆国ミシガン州48103．アンア ーバー．ウッドリリーコート1968 (72)発明者 トマス・エフ・ウルフ アメリカ合衆国ミシガン州48103．アンア ーバー．リバティポイントドライブ586 Ｆターム(参考） 4C071 AA01 AA08 BB01 CC12 EE07 FF17 HH05 HH08 4C076 AA12 BB05 DD59N FF34 4C084 AA16 MA52 NA11 ZC202

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 低い経口生体利用性を有する化合物をベルガモッチンと組み
   合わせて患者に投与することからなる該化合物の腸の酵素代謝を阻害する方法。
2. 【請求項２】 シトクロムＰ４５０ ３Ａ４腸代謝を阻害する請求項１記載 の方法。
3. 【請求項３】 腸の酵素代謝の阻害が化合物の経口生体利用性を高める請求
   項１記載の方法。
4. 【請求項４】 化合物の経口生体利用性が５０％未満である請求項１記載の
   方法。
5. 【請求項５】 化合物の経口生体利用性が３０％未満である請求項４記載の
   方法。
6. 【請求項６】 化合物はシクロスポリン、タクロリマス（ＦＫ５０６）、シ
   ロリマス（ラパマイシン）、インジナビル、リトナビル、サキナビル、フェロジ
   ピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニソルジピン、ニモジピン、ニトレンジピ
   ン、ニフェジピン、ベラパミル、エトポシド、タモキシフェン、ビンブラスチン
   、ビンリスチン、タキソール、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチ
   ン、プラバスタチン、シンバスタチン、テルフェナジン、ロラタジン、アステミ
   ゾール、アルフェンタニル、カルバマゼピン、アジスロマイシン、クラリスロマ
   イシン、エリスロマイシン、イトラコナゾール、リファブチン、リドカイン、シ
   スアプリド、セルトラリン、ピモジド、トリアゾラム、ミダゾラム、テストステ
   ロン、メドロキシプロゲステロンおよびエルゴタミンからなる群より選択される
   請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 ベルガモッチンと組み合わせた低い生体利用性を有する化合
   物を少なくとも１種の不活性な薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体と
   混合して含有する医薬組成物。