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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Suppositorium, die
bzw, das Bergamottin (BG) und eine Verbindung mit niedriger oraler
biologischer Verfügbarkeit
umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von BG
zum Erhöhen
der biologischen Verfügbarkeit
von Verbindungen durch gleichzeitige Verabreichung der Verbindung
mit BG.
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Insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung die Verwendung von BG zum Hemmen des enzymatischen Darmstoffwechsels
von Verbindungen mit niedriger biologischer Verfügbarkeit. Insbesondere vermindert
die Hemmung des Darm-Cytochroms P950 3A4 durch BG den Darmstoffwechsel
der Verbindungen und sie erhöht
deren orale biologische Verfügbarkeit.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen,
die BG in Kombination mit einer Verbindung mit niedriger biologischer
Verfügbarkeit
und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
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Orale biologische Verfügbarkeit
ist als der Anteil des unveränderten
Arzneimittels, der den systemischen Kreislauf nach der Verabreichung
auf oralem Weg erreicht, definiert. Das Verstärken der biologischen Verfügbarkeit
pharmazeutischer Mittel erfuhr sehr viel Aufmerksamkeit hinsichtlich
Arzneimittelentwicklung und klinischer Pharmakologie. Da P450 3A4 das
Haupt-P450-Enzym, das im Darm exprimiert wird, ist und am Stoffwechsel
eines breiten Spektrums klinisch verwendeter Arzneimittel beteiligt
ist, wird es als einer der Hauptfaktoren für die orale biologische Verfügbarkeit
dieser Arzneimittel angesehen. Es wurde ermittelt, dass einige kostenaufwendige
Arzneimittel, wie Cyclosporin, FK506, Taxol, Indinavir, Saquinavir
und dergleichen, von P450 3A4 intensiv metabolisiert werden. Es
wurde ermittelt, dass die gleichzeitige Verabreichung von einigen
dieser Arzneimittel mit P450-A4-Inhibitoren deren biologische Verfügbarkeit
erhöht.
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Es wurde gezeigt, dass die gleichzeitige
orale Verabreichung von Grapefruitsaft die orale biologische Verfügbarkeit
von mehreren klinisch verwendeten Arzneimitteln signifikant erhöht, wobei
diese die Hydropyridine (D. G. Bailey, J. D. Spence, C. Munoz und
J. M. O. Arnold. Interaction of citrus juices with felodipine and nifedipine.
Lancett, 1991; 337: 268–269,
und D. G. Bailey, J. M. O. Arnold, J. R. Bend, L. T. Tran und J.
D. Spence. Grapefruit juice – felodipine
interaction: reproducibility and characterization with the extended
release drug formulation. Br. J. Clin. Pharmacol., 1995; 40: 135–140), Cyclosporin
A (M. P. Durcharme, I. H. Warbasse und D. J. Edwards. Disposition
of intravenous and oral cyclosporine after administration with grapefruit
juice. Clin. Pharmacol. Ther., 1995; 57: 485–491), Midazolam (H. H. Kuferschmidt,
H. R. Ha, W. H. Ziegler, P. J. Meier und S. Krahenbuhl, Interaction
between grapefruit juice and midazolam in humans, Clin. Pharmacol.
Ther., 1995; 58: 20–28),
Triazolam (S. K. Hukkinen, A. Varhe, K. T. Olkkola und P. J. Neuvonen,
Plasma concentrations of triazolam are increased by concomitant
ingestion of grapefruit juice. Clin. Pharmacol. Ther., 1995; 58: 127–131), Terfenadin
(R. E. Benton, P. K. Hoig, K. Zamaani, L. R. Cantilena und R. L.
Woosley, Grapefruit juice alters terfenadine pharmacokinetics, resulting
in prolongation of repolarization on the electrocardiogram. Clin. Pharmacol.
Ther., 1996; 59: 383–388)
und Ethinylestradiol (A. Weber, R. Jager, A. Borner, G. Klinger,
R. Vollanth, K. Mathey und A. Balogh. Can grapefruit juice influence
ethinylestradiol biovailability? Contraception, 1996; 53: 41–47) umfassen.
Da alle diese Arzneimittel primär
durch Cytochrom P450 3A4, das vorherrschende P450-Enzym in Darm
und Leber, metabolisiert werden (T. Shimada, H. Yamazaki, M. Mimura,
Y. Inui und F. P. Guengerich, Interindividual variation in human
liver cytochrome P-450 enzymes involved in the oxidation of drugs,
carcinogens and chemicals: studies with liver microsomes of 30 Japanese
and 30 Caucasians. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1994; 270: 414–422 und
P. B. Watkins, S. A. Wrighton, E. G. Schuetz, D. T. Molowa und P. S.
Guzelian, Identification of glucocorticoid – inducible cytochrome P-450
in the intestinal mucosa of rats and man. J. Clin. Invest., 1987;
80: 1029–1036),
wurde nahegelegt, dass die Wirkung von Grapefruitsaft auf der Hemmung
der Aktivität
von P450 3A4 beruht. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Grapefruitsaft
den Gehalt von immunreaktivem P450 3A4 in Enterocyten des menschlichen
Darms ohne eine Änderung
des Gehalts von P450-3A4-mRNA drastisch vermindert (K. S. Lown,
D. G. Bailey, R. J. Fontana, S. K. Janardan, C. H. Adair, L. A.
Fortlage, M. B. Brown, W. Guo und P. B. Watkins, Grapefruit juice
increases felodipine oral bioavailability in humans by decreasing
intestinal CYP 3A protein expresion. J. Clin. Invest., 1997; 99:
1–9).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau des P450-3A4-Proteins
durch die Aufnahme von Grapefruitsaft beschleunigt werden kann (Lown,
aaO, 1997). Da eine Suizidinaktivierung von Ratten-P450-3A den Abbau
des apoP450 beschleunigen konnte (M. A. Correia, S. H. Davoll, S.
A. Wrighton und P. E. Thomas, Degradation of rat liver cytochrome
P450 3A after their inactivation by 3,5-dicarbethoxy-2,6-dimethyl-4-ethyl-1,4-dihydropyridine:
characterization of the proteolytic system. Arch. Biochem. Biophys.,
1992; 297: 228–238),
wurde nahege legt, dass eine auf einem Mechanismus basierende Inaktivierung
von P450 3A4 an den Wirkungen von Grapefruitsaft beteiligt ist.
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Um die Hauptkomponenten in Grapefruitsaft,
die für
das Erhöhen
der biologischen Verfügbarkeit
einiger Arzneimittel verantwortlich ist, zu identifizieren, wurden
Flavonoide, wie Naringenin, Naringin, Quercetin und Kaemferol, als
mögliche
Kandidaten gewählt,
da gezeigt wurde, dass sie die Aktivität von P450 3A4 in vitro hemmen
(A. Miniscalco, J. Lundahl, C. G. Regardh, B. Edgar und U. G. Eriksson,
Inhibition of dihydropyridine metabolism in rat and human liver
microsomes by flavonoids found in grapefruit juice. J. Pharmacol.
Exp. Ther., 1992; 261: 1195–1199
und A. Ghosal, H. Satoh, P. E. Thomas, E. Bush und D. Moore, Inhibition
and kinetics of cytochrome P450 3A4 activity in microsomes from
rat, human and cDNA-expressed human cytochrome P450. Drug Metab.
Dispos., 1996; 24: 940–947).
Jedoch ergab die orale Verabreichung dieser Flavonoide nicht die
Wirkungen von Grapefruitsaft (D. G. Bailey, J. M. O. Arnold, C.
Munoz und J. Spence, Grapefruit juice – felodipine interaction: mechanism,
predictability, and effect of naringin. Clin. Pharmacol. Ther.,
1993; 53: 637–642
und J. Rashid, C. McKinstry, A. G. Renwick, M. Dirnhuber, D. G.
Waller und C. F. George, Quercetin, an in vitro inhibitor of CYP3A,
does not contribute to the interaction between nifedipine and grapefruit
juice. Br. J. Clin. Pharmac., 1993; 36: 460–463). Vor kurzem führte die
HPLC-Reinigung eines Methylenchloridextrakts von Grapefruitsaft
zur Identifizierung von 6',7'-Dihydroxybergamottin
als einer Komponente von Grapefruitsaft, die die Hemmung von Testosteron-6β-hydroxylase
in Lebermikrosomen von Dexamethason-induzierten Ratten bewirkte
(D. J. Edwards, F. H. Bellevue, III und P. M. Woster, Identification
of 6',7'-dihydroxybergamottin,
a cytochrome P450 inhibitor, in grapefruit juice. Drug. Metab. Dispos.,
1996; 24: 1287–1290).
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Wir ermittelten überraschenderweise und unerwarteterweise,
dass BG die primäre
Verbindung in Grapefruitsaft ist, die für die Hemmung von humanem Cytochrom
P450 3A4 auf mechanistischer Basis verantwortlich ist. Daher kann
die gleichzeitige Verabreichung einer Verbindung mit niedriger oraler
biologischer Verfügbarkeit
in Kombinatioin mit BG zum Erhöhen
der oralen biologischen Verfügbarkeit
der Verbindung verwendet werden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Daher erfolgt durch eine erste Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung oder eines Suppositoriums, die bzw. das Bergamottin
in dessen isolierter Form und eine Verbindung mit einer oralen biologischen
Verfügbarkeit
von weniger als 50 im Gemisch mit mindestens einem pharmazeutisch
akzeptablen Streckmittel, Verdünnungsmittel
oder Träger
umfasst.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung von Bergamottin in dessen isolierter
Form zur Herstellung einer oralen pharmazeutischen Zusammensetzung
oder eines Suppositoriums zum Hemmen des enzymatischen Darmstoffwechsels
einer Verbindung mit einer oralen biologischen Verfügbarkeit
von weniger als 50% und zum Erhöhen
der biologischen Verfügbarkeit
der Verbindung.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung von Bergamottin in dessen isolierter
Form zur Herstellung einer oralen pharmazeutischen Zusammensetzung
oder eines Suppositoriums zum Hemmen des Darmstoffwechsels des Cytochroms
P450 3A4.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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Die Erfindung wird ferner durch die
folgenden nichtbeschränkenden
Beispiele, die sich auf die beigefügten 1 bis 8 beziehen,
deren Einzelheiten im folgenden kurz angegeben sind, beschrieben.
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1 zeigt
Umkehrphasen-HPLC-Profile von Grapefruitsaftextrakt. Das Eluat wurde
durch UV-Detektion bei 310 nm überwacht,
Blatt A. Rekonstruierte Ionenchromatogramme für BG,
[M + H]+ mit
m/z 339, Blatt B; monohydroxyliertes BG,
[M + H]+ mit
m/z 355, Blatt C; bishydroxyliertes BG,
[M + H]+ mit
m/z 373, Blatt D.
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2 ist
ein Produktion-MS/MS-Spektrum von BG, [M + H+ mit
] m/z 339.
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3 sind
Produktion-MS/MS-Spektren von monohydroxylierten BG-Metaboliten,
[M + H]+ mit m/z 355, Blatt A, 12,9 min
(39 relative Häufigkeit);
Blatt B, 17,7 min (6%); Blatt C (18,1 min (11%); Blatt D, 19,6 min (7%);
Blatt E, 24,1 min (37%). Die angegebenen Oxidationsstellen beruhen
auf dem stoßinduzierten
Dissoziationsverhalten des Vorläuferions
mit m/z 355; so entspricht das Produktion mit m/z 203 der intakten
5-Hydroxypsoraleneinheit, und daher wird die Oxidation der Isoprenkette
angezeigt. Spezielle Oxidationsstellen können aus den MS/MS-Daten nicht
bestimmt werden.
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4 sind
Produktion-MS/MS-Spektren von bishydroxyliertem BG, [M + H]+ mit m/z 373. Blatt A, 12,9 min; Blatt B,
15,9 min (%). Die angegebenen Oxidationsstellen beruhen auf dem
stoßinduzierten
Dissoziationsverhalten; so entspricht das Ion mit m/z 203 (Blatt
A) der intakten 5-Hydroxypsoraleneinheit und daher wird die Oxidation
der Isoprenkette angezeigt. Der Verlust von Formaldehyd (Blatt B)
unter Bildung eines Ions mit m/z 343 wurde so interpretiert, dass
er eine aliphatische Oxidation anzeigt. Spezielle Oxidationsstellen
können aus
den MS/MS-Daten nicht bestimmt werden.
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5 sind
relative bzw. reduzierte Kohlenmonoxiddifferenzspektren (oberes
Blatt) und UV/sichtbare Spektren (unteres Blatt) des wiederhergestellten
P450-3A4-Reaktionsgemischs, das mit BG in Gegenwart von NADPH (–), mit
BG in Abwesenheit von NADPH (-•-)
bzw. ohne BG in Gegenwart von NADPH (---) inkubiert wurde. P450
3A4 (0,5 nmol/ml) wurde, wie in "Methoden
und Materialien" beschrieben,
mit 50 μM
BG in einem wiederhergestellten System 15 min lang bei 37°C inkubiert.
Aliquote Mengen von 0,25 oder 0,2 ml der Inkubationsgemische wurden
in 1,75 oder 0,8 ml von 50 mM Hepes-Puffer (pH-Wert 7,5), der 20%
Glycerin und 0,5 mM EDTA enthielt, verdünnt, und die reduzierten Kohlenmonoxid-P450-Differenz-
und UV/sichtbaren-Spektren
wurden jeweils, wie in "Materialien
und Methoden" beschrieben,
aufgenommen.
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6 sind
HPLC-Profile des wiederhergestellten Systems von P450 3A4 nach Inkubation
mit 50 μM BG
in Gegenwart (-) oder Abwesenheit von NADPH (----). Das Eluat wurde
bei 214 nm und 405 nm (Ansatz) überwacht.
Die Peaks A, B bzw. C stehen für
P450-NADPH-Reduktase, Cytochrom b5 bzw.
P450 3A4.
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7 zeigt
die zeit- und konzentrationsabhängige
Hemmung der Testosteron-6β-hydroxylierungsaktivität von P450
3A4 durch BG in einem wiederhergestellten System. Die experimentellen
Einzelheiten wurden in "Materialien
und Methoden" beschrieben.
Die Konzentration von BG in den Vorinkubationsproben betrug 0 μM (☐),
5 μM (♢),
10 μM (O),
25 μM (Δ), 50 μM (∇) bzw.
100 μM (×).
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8 zeigt
die Hemmung der Aktivitäten
der P450-Enzyme 1A2 (), 2A6 (♢), 2C9 (☐), 2D6
(Δ), 2E1
(×) und
3A4 (O) in humanen Lebermikrosomen durch BG. Die Aktivitäten der
P450-Enzyme wurden unter Verwendung der in "Materialien und Methoden" beschriebenen Verfahren
bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert von drei Experimenten
angegeben.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Der Ausdruck "niedrige orale biologische Verfügbarkeit" bedeutet eine Verbindung
mit einer oralen biologischen Verfügbarkeit von weniger als 50%,
vorzugsweise weniger als 30%.
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Bergamottin, das auch als 5-Geranoxypsoralen,
Bergamotin oder Bergaptin bekannt ist, ist chemisch als (E)-4-[(3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl)oxy]-7H-furo[3,2-g][1]benzopyran-7-on
bekannt und besitzt die folgende chemische Struktur:
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Die folgende Tabelle 1 gibt eine
Liste von in der vorliegenden Erfindung verwendeten Abkürzungen und
Definitionen derselben an.
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Bergamottin wurde als primäre Verbindung
in Grapefruitsaft, die für
die Inaktivierung von P450 3A4 auf mechanistischer Basis verantwortlich
ist, identifiziert. Mehrere monooxygenierte oder dihyroxylierte BG-Derivate
wurden ebenfalls in Grapefruitsaft identifiziert. Es wurde bestimmt,
dass der Gehalt an Dihydroxybergamottinen, von denen eines früher isoliert
und als Testosteron-6β-hydroxylase
in Rattenlebermikrosomen hemmend identifiziert wurde (Edwards, aaO,
1996), weniger als 20% des Gehalts an BG in Grapefruitsaft betrug.
Die meisten der BG-Derivate in Grapefruitsaft enthalten die intakte
Furanocumaringruppe, von der angenommen wird, dass sie für die Inaktivierung
der P450-Enzyme verantwortlich ist. Bergamottin und dessen mono-
oder dihydroxylierten Derivate wurden in Orangensaft nicht beobachtet,
was mit Berichten konsistent ist, dass Orangensaft keine derartigen
Hemmwirkungen auf den Darmstoffwechsel von Arzneimitteln bewirkt (Bailey,
aaO, 1991). Der Gehalt an BG und dessen Derivaten kann zwischen
verschiedenen Zubereitungen von Grapefruitsaft signifikant variieren,
was für
die berichtete Diskrepanz im Hinblick auf die Wirkung von Grapefruitsaft
verantwortlich sein kann (J. Vanakoski, M. J. Mattila und T. Seppala,
Grapefruit juice does not enhance the effects of midazolam and triazolam
in man. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1996; 50: 501–508).
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Die Inaktivierung der Aktivität von P450
3A4 war zeit- und konzentrationsabhängig und erforderte die Metabolisierung
von BG. Diese Ergebnisse legen nahe, dass BG ein Inaktivator von
P450 3A4 auf mechanistischer Basis ist (C. T. Walsh, Suicide substrates,
mechanism-based enzyme inactivation: recent developments. Ann. Rev.
Biochem., 1984; 53: 493–535).
Von mehreren anderen Furanocumarinen wurde bereits berichtet, dass
sie eine Inaktivierung von P450-Enzymen auf mechanistischer Basis
bewirken, beispielsweise Corandrin (Y. Cai, W. Baer-Dubowska, M. J. Ashwood-Smith,
O. Ceska, S. Tachibana und J. DiGiovanni, Mechanism-based inactivation
of hepatic ethoxyresorufin O-dealkylation activity by naturally
occurring coumarins. Chem. Res. Toxicol., 1996; 9: 729–736) und
8-Methoxypsoralen (G. Labbe, V. Descatiore, P. Beaune, P. Letteron,
D. Larrey und D. Pessayre, Suicide inactivation of cytochrome P-450
by methoxsalen. evidence for the covalent binding of a reactive
intermediate to the protein moiety. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1989;
250: 1034–1042
und D. C. Mays, J. B. Hilliard, D. D. Wong, M. A. Chambers, S. S.
Park, H. V. Gelboin und N. Gerber, Bioactivation of 8-methoxypsoralen
and irreversible inactivation of cytochrome P-450 in mouse liver
microsomes: modification by monoclonal antibodies, inhibition of
drug metabolism and distribution of covalent adducts. J. Pharmacol.
Exp. Ther., 1990; 254: 720– 731).
Auf der Basis der Untersuchungen einer Reihe natürlich vorkommender Cumarine
wurde vorgeschlagen, dass der Furanring die für die Inaktivierung von P450
1A verantwortliche Gruppe ist (Cai, aaO, 1996). Es wurde auch gezeigt,
dass einige andere furanhaltige Verbindungen die Inaktivierung von
P450 bewirken. Ein Beispiel ist das Furanopyridin L-754394, ein
HIV-Proteaseinhibitor,
von dem gezeigt wurde, dass er eine Inaktivierung von P450 3A4 auf
mechanistischer Basis durch die Bildung eines chemisch reaktiven
Epoxids am Furanring bewirkt (M. Chiba, J. A. Nishine und J. H.
Lin, Potent and selective inactivation of human liver microsomal
cytochrome P-450 isoforms by L-754,394, an ivestigational HIV protease
inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1995; 275: 1527–1534; Y.
Sahali-Sahly, S. K. Balani, J. H. Lin und T. A. Baillie, In vitro
studies on the metabolic activation of the furanopyridine L-754,394,
a highly potent and selective mechanismbased inhibitor of cytochrome
P450 3A4. Chem. Res. Toxicol., 1996; 9: 1007–1012). Es wird angenommen,
dass die BG-vermittelte Inaktivierung von P450 3A4 auf mechanistischer
Basis einem ähnlichen
Mechanismus folgt, bei dem der Furanring zu einem reaktiven Zwischenprodukt
aktiviert wird, das eine kritische Einheit am aktiven Zentrum des
Enzyms kovalent modifiziert. Die Inaktivierung scheint am aktiven
Zentrum zu erfolgen, da sie durch die Zugabe von 2 oder 3 mM GSH
zu dem Inkubationssystem nicht gehemmt wurde. Der Wert von KInaktivierung für die BG-vermittelte Inaktivierung
von P450 3A4 von 0,3 min–1 zeigt an, dass BG
einer der stärkeren
Inaktivatoren von P450 3A4 ist. Die Werte von KInaktivierung
für zwei
andere starke Inaktivatoren sind 0,4 min–1 für Gestoden
(F. P. Guengerich, Mechanism-based inactivation of human liver microsomal
cytochrome P-450 IIIA4 by gestodene. Chem. Res. Toxicol., 1990;
3: 363–371)
und 1,62 min–1 für L-754394
(M. Chiba, aaO, 1995; 275: 1527–1534).
Ferner wurde ermittelt, dass BG wirksamer als 6',7'-Dihydroxybergamottin
ist, dessen KInaktivierung für die In aktivierung
von P450 3A4 in dem wiederhergestellten System als 0,16 min–1 bestimmt
wurde. BG scheint auch eine kompetitiver Inhibitor von P450 3A4
zu sein. Dies ist mit der Beobachtetung konsistent, dass BG primär zu mehreren
hydroxylierten Metaboliten durch P450 3A4 metabolisiert wird. Die
kompetitive Hemmung kann jedoch überschätzt sein,
da P450 3A4 während
der Bestimmung der Testosteron-6β-Hydroxylierungsaktivität eine Inaktivierung
auf mechanistischer Basis durch BG erfahren haben kann.
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Da berichtet wurde, dass die Aktivität von P450
3A4 durch α-Naphathoflavon
stimuliert wird (Y. F. Ueng, T. Kuwabara, Y. J. Chun und F. P. Guengerich,
Cooperativity in oxidations catalyzed by cytochrome P450 3A4. Biochemistry,
1997; 36: 370– 381),
untersuchten wir die Möglichkeit,
dass α-Naphathoflavon
eine synergistische Wirkung auf die Bildung des reaktiven Metaboliten
von BG haben kann, was dann zu einem Erhöhen der Inaktivierung führen kann.
Unsere Ergebnisse zeigen an, dass α-Naphathoflavon auf die BG-vermittelte Inaktivierung
von P450 3A4 keine Wirkung hatte. Jedoch ist nicht klar, ob α-Naphathoflavon
die Cytochrom-P450 3A4-katalysierte Hydroxylierung von BG stimuliert.
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Der Mechanismus der BG-vermittelten
Inaktivierung von P450 3A4 wurde in der vorliegenden Untersuchung
vorläufig
ermittelt. Es ist wohldokumentiert, dass die Hämadduktbildung der Mechanismus
zur Inaktivierung von P450 durch terminale Olefine und Acetylene
ist (P. R. Ortiz de Montellano und M. A. Correia, Inhibition of
cytochrome P450. In Cytochrome P450 – Structure, Mechanism and
Biochemistry, P. R. Ortiz de Montellano, Hrsg., S. 305–366, Plenum
Press, New York). Vor kurzem wurde ein in einem wiederhergestellten System
gebildetes Hämaddukt
identifiziert und mittels sichtbarer Spektroskopie, HPLC und Massenspektrometrie
charakterisiert (K. He, A. M. Falick, B. Chen, F. Nilsson und M.
A. Correia, Identific ation of the hem adduct and an active site
peptide modified during mechanism-based inactivation of rat liver
cytochrome P450 2B1 by secobarbital. Chem. Res. Toxicol., 9: 614–622 und
K. He, Y. A. He, G. D. Szklarz, J. R. Halpert und M. A. Correia,
Secobarbital-mediated inactivation of cytochrome P450 2B1 and its
active site mutants: partitioning between heme and protein alkylation
and epoxidation. J. Biol. Chem, 1996; 271: 25864–25872). Das sichtbare Spektrum
der BG-inaktivierten Probe von P450 3A4 zeigte kein Zeichen einer
Hämadduktbildung.
Der einzige Absorptionspeak, der im Differenzspektrum gegenüber der
-NADPH-Kontrolle im Bereich von 400 – 500 nm beobachtet wurde,
war bei etwa 423 bis 425 nm, der vermutlich auf NADPH-reduziertem
P450 beruht. Das Absorptionsspektrum zeigte auch, dass der Hämgehalt
für das
BG-inaktivierte P450 3A4 nicht signifikant abnahm, obwohl die Probe
90% der Testosteron-6β-hydroxylierungsaktivität verlor.
Dieses Ergebnis scheint den anderen alternativen Mechanismus auszuschließen, der
bei mehreren Inaktivatoren auf mechanistischer Basis insofern beteiligt
ist, als diese eine Hämfragmentierung
beiwirken, die zu einer kovalenten Bindung des Hämfragments an das Apoprotein
führt (Ortiz
de Montellano, aaO, 1995 und K. Yao, A. M. Falick, N. Patel und
M. A. Correia, Cumene hydroperoxide-inactivation of cytochrome P450
2B1: identification of an active site heme-modified peptide. J.
Biol. Chem, 1993; 268: 59–65).
Jedoch hatte das reduzierte CO-Differenzspektrum von P450 3A4 anschließend an
eine Behandlung mit BG in einem wiederhergestellten System um etwa
40% abgenommen. Da kein Anzeichen für einen Hämabbau oder eine Hämadduktbildung
vorliegt, ist es möglich, dass
das gebundene BG durch kovalente Bindung an einen Aminosäurerest
des aktiven Zentrums nahe der Hämeinheit
derart positioniert sein kann, dass es die Wechselwirkung von CO
mit Eisen(II)-häm
stört.
Untersuchungen der Inaktivierung von P450 durch ein anderes Furanocumarin,
8-Methoxypsoralen, legten nahe, dass die kovalente Bindung von 8-Methoxypsoralen
an apoP450 am aktiven Zentrum die Abnahme des CO-Reduktionsspektrums
von P450 bewirkt ist (Labbe, aaO, 1989 und Mays, aaO, 1990). Die
HPLC-Analyse von BG-inaktiviertem P450 3A4 ergab indirekte Anzeichen,
die nahelegten, dass BG apoP450 modifizieren kann. Eine partielle
Abnahme des Apoproteins scheint ein häufiges Merkmal für das durch
Modifikation des Proteins inaktivierte P450-Enzym zu sein, wenn
das P450-Inkubationsgemisch mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert wird (E. S. Roberts,
N. E. Hopkins, D. A. Alworth und P. F. Hollenberg, Mechanism-based
inactivation of cytochrome P450 2B1 by 2-ethynylnaphthalene: Identification
of an active-site peptide. Chem. Res. Toxicol., 1993; 6: 470–479 und
K. He, aaO, 1996). Es könnte
erwartet werden, dass einige hydrophobe Aminosäurereste des aktiven Zentrum
des inaktivierten P450 freiliegen, so dass sie als Ergebnis von
durch eine kovalente Bindung induzierten Konformationsänderungen
fest an das Umkehrphasenmedium binden. Es wurde auch bereits berichtet,
dass die kovalente Modifizierung von apoP450 ein Mechanismus für die Inaktivierung
von P450 durch einige andere Furanocumarine ist (Labbe, aaO, 1989;
Cai, aaO, 1996; Mays, aaO, 1990). Daher scheint die BG-vermittelte Inaktivierung
von P450 3A4 primär
auf der Modifizierung des Apoproteins zu beruhen, was mit 2-Ethinylnaphthalin
und 9-Ethinylphenanthren für
die Inaktivierung von P450 2B1 und 2B4 auf mechanistischer Basis
beobachtet wurde (E. S. Roberts, N. E. Hopkins, E. J. Zaluzec, D.
A. Gage, W. L. Alworth und P. F. Hollenberg, Identification of active-site
peptides from 3H-labeled 2-ethynylnaphalene-inactivated P450 2B1 and
2B4 using amino acid sequencing and mass spectrometry. Biochemistry,
1994; 33: 766–3771
und E. S. Roberts, N. E. Hopkins, E. J. Zaluzec, D. A. Gage, W.
L. Alworth und P. F. Hollenberg, Mechanism-based inactivation of
cytochrome P450 2B1 by 9-ethynylphenanthrene. Arch. Biochem. Biophys.,
1995; 323: 295–302).
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Obwohl die Hemmung oder Inaktivierung
von P450 3A4 durch BG und dessen Derivate zum Verständnis der
Wirkung von Grapefruitsaft auf die biologische Verfügbarkeit
von mehreren klinisch verwendeten Arzneimitteln, von denen bekannt
ist, dass sie durch P450 3A4 im Darm intensiv metabolisiert werden,
wichtig ist, bestimmten wir auch, ob BG auch die Aktivitäten der
anderen humanen P450-Enzyme hemmt. Es wurde gezeigt, dass BG die
Aktivitäten
von mehreren humanen P450-Enzymen, die 1A2, 2A6, 2C9, 2C19, 2D6
und 2E1 umfassen, hemmt. Da die Wirkung von Grapefruitsaft sich
primär
auf Darmebene zu manifestieren scheint, kann der Beitrag jedes P450-Enzyms
zu der Wirkung von dessen Expressionsgrad im Darm abhängig sein. P450
3A4 ist das häufigste
P450-Enzym im Darm, während
die anderen P450-Enzyme, wie 1A, 2A, 2C, 2D und 2E im Darm schlecht
exprimiert werden (Watkins, aaO, 1987 und W. H. M. Peters und P.
G. Kremers, Cytochrome P450 in the intestinal mucosa of man. Biochem.
Pharmacol., 1989; 38: 1535– 1538).
Wir vermuten, dass BG und dessen Derivate im Darm schlecht absorbiert
oder intensiv metabolisiert werden können, so dass sie eine geringe
Chance besitzen, Leber-P450-Enzyme
zu inaktivieren oder zu hemmen.
-
Bestimmte klinisch verwendete Arzneimittel
werden durch P450 3A4 intensiv metabolisiert und sie besitzen daher
eine relativ niedrige orale biologische Verfügbarkeit (R. J. Bertz und R.
Granneman, Clin. Pharmacokinet., 1997; 32: 210–258). Tabelle 2 zeigt den
metabolisierten Bruchteil und die orale biologische Verfügbarkeit
verschiedener klinisch verwendeter Arzneimittel. Daher resultiert
die schlechte Absorption dieser Arzneimittel partiell aus dem ersten
Metabolisierungsschritt durch P450 3A4 des Darms. Es wurde gezeigt, dass
die orale biologische Verfügbarkeit
von einigen dieser Arzneimittel durch gleichzeitige Verabreichung
mit Grapefruitsaft signifikant erhöht ist. Wir ermittelten, dass
die orale biologische Verfügbarkeit
dieser Arzneimittel durch eine Formulierung oder gleichzeitige Verabreichung
mit BG, dem primären Furanocumarin
in Grapefruitsaft verstärkt
werden kann.
-
Da der Expressionsgrad von P450 3A4
im Darm unter Individuen signifikant variiert, wurde angenommen,
dass er einer der Hauptfaktoren ist, die zur Schwankungsbreite der
Arzneimittelmetabolisierung und von Arzneimittelwirkungen zwischen
Individuen beiträgt.
Wir ermittelten ferner, dass diese Schwankungsbreite durch die Inaktivierung
von P450 3A4 im Darm durch gleichzeitige Verabreichung von BG verringert
werden kann.
-
Die folgenden sind Beispiele von
klinisch verwendeten Arzneimitteln, die eine geringe biologische
Verfügbarkeit
aufweisen: Cyclosporin und Tacrolimus sind starke immunsuppressive
Mittel, die bei einer Transplantation und bei der Behandlung ausgewählter Autoimmunerkrankungen
verwendet werden. Rapamycin ist in der klinischen Entwicklung zur
Verwendung bei einer Transplantation und bei der Behandlung von
Autoimmunerkrankungen verwendbar. Es wurde gezeigt, dass alle diese
Mittel durch P450 3A4 intensiv metabolisiert werden. Cyclosporin,
Tacrolimus und Rapamycin werden schlecht absorbiert, wobei die orale
biologische Verfügbarkeit
von 15% bis 30%, 15% bis 20% bzw. 10% bis 20% reicht. Saquinavir,
ein HIV-Proteaseinhibitor,
wird sehr schlecht absorbiert, mit einer oralen biologischen Verfügbarkeit
von 1% bis 9%. Es wurde gezeigt, dass P450 3A4 das primäre Enzym,
das für
den Stoffwechsel von Saquinavir verantwortlich ist, ist. Andere
HIV-Proteaseinhibitoren,
wie Indinavir und Ritonavir, werden ebenfalls primär durch
P450 3A4 verstoffwechselt und sie besitzen eine relativ niedrige
orale biologische Verfügbarkeit.
Mehrere Dihydropyridine, die als Calciumkanalblocker verwendet werden,
wie Felodipin, Isradipin, Nifedipin, Nimodipin und Nisoldipin, werden
primär
durch P450 3A4 metabolisiert. Es wurde gezeigt, dass deren geringe
orale biologische Verfügbarkeit
(5%–20%) hauptsächlich auf
einer ersten Meta bolisierungsstufe beruht. Es wurde gezeigt, dass
die orale biologische Verfügbarkeit
von einigen der Dihydropyridine durch gleichzeitige Verabreichung
mit Grapefruitsaft erhöht
wird. Atorvastatin, ein Hypolipidämie- und Hypocholesterinämiemittel,
wird primär
durch P450 3A4 metabolisiert. Die orale biologische Verfügbarkeit
beträgt
nur 14% bis 30%. Alle diese Mittel können mit BG vereinigt und an
einen Patienten verabreicht werden, wobei deren orale biologische
Verfügbarkeit
erhöht
wird. Ferner können
die anderen in Tabelle 2 aufgeführten
Mittel ebenfalls mit BG kombiniert werden, wobei deren orale biologische Verfügbarkeit
erhöht
wird.
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TABELLE
2. Klinisch verwendete Arzneimittel, die eine geringe orale biologische
Verfügbarkeit
besitzen, die primär
durch P450 3A4 metabolisiert werden.
-
Identifizierung von BG und dessen
Derivaten in Grapefruitsaft: Mehrere Komponenten des Ethylacetatextrakts
von Grapefruitsaft wurden mittels HPLC unter den in "Methoden und Materialien" beschriebenen Bedingungen
abgetrennt (1). Die
Strukturanalyse der Komponentenpeaks mittels LC-MS/MS ergab, dass der
Peak mit einer Retentionszeit von 26 min BG war (1). Das Produktion-Spektrum und die HPLC-Retentionszeit
war identisch mit der des authentischen Standards (2). Das vorherrschende Fragmention mit
m/z 203 entspricht der 5-Hydroxypsoraleneinheit,
die anschließend
fragmentiert wird, wobei Ionen mit m/z 174, 159 und 147 durch Abspaltung
von CO, CO2 bzw. C2H2O2 erhalten werden.
Das Fragmention mit m/z 137 entspricht der verbliebenen Seitenkette.
Wie in 1 gezeigt, sind
in Grapefruitsaft mindestens fünf
monooxygenierte BG-Produkte vorhanden. Deren versuchsweise Strukturen
sind in 3 angegeben.
In Grapefruitsaft sind mindestens zwei dihydroxylierte BG-Hauptprodukte
vorhanden. Die nach 13 min eluierende Komponente hatte ein Produktion-Spektrum
und eine HPLC-Retentionszeit, die mit 6',7'-Dihydroxybergamottin
identisch waren (s. 4).
Das protonierte Molekülion
mit m/z 340 der nach 24 min eluierenden Komponente erfuhr eine stoßinduzierte
Dissoziations(CID)fragmentierung unter Bildung eines Hauptproduktions
mit m/z 168, was nahelegt, dass diese Komponente kein Derivat von
BG ist. BG selbst scheint nach einer LC/UV-Bestimmung das vorherrschende
Furanocumarin im Extrakt von Grapefruitsaft durch Ethylacetat zu
sein. Ferner wurde ermittelt, dass BG an eine C18-Säule so fest
bindet, dass es mit 60% Methanol nicht von der Säule eluiert werden konnte,
wobei diese Bedingungen zuvor zur Identifizierung von 6',7'-Dihydroxybergamottin
in Grapefruitsaft verwendet wurden (Edwards, aaO, 1996).
-
Die LC/UV-Analyse der Ethylacetatextrakte
von Orangensaft ergab, dass in Orangensaft kein nachweisbares BG
vorhanden ist.
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Inaktivierung von P450 3A4: Die Inkubierung
von P450 3A4 mit BG in dem wiederhergestellten System führte zu
einer 90%igen Abnahme der Testosteron-6β-hydroxylierungsaktivität (Tabelle
3). Etwa 60% der P450-Aktivität
wurden ebenfalls in Abwesenheit von NADPH in dem wiederhergestellten
System gehemmt (Tabelle 2). Jedoch enthielten die Proben, selbst
wenn sie zur Bestimmung der Testosteron-6β-hydroxylierungsaktivität 20-fach verdünnt wurden,
immer noch 2,5 μM
BG. In getrennten Experimenten wurde ermittelt, dass BG bei dieser
Konzentration die Aktivität
von P450 3A4 um etwa 55% hemmte. Ferner nahmen der P450-Gehalt,
der durch das CO-Reduktionsspektrum ermittelt wurde, nach einer
15-minütigen
Inkubation von P450 3A4 mit BG in Gegenwart von NADPH um etwa 40%
ab (Tabelle 3). Es gab keine Bildung eines Peaks bei 420 nm oder
eine andere Absorption anstelle der bei 450 nm im Bereich von 400–500 nm
für das
CO-Reduktions-P450-Differenzspektrum (5).
Die maximale Absorption des absoluten Spektrums lag für BG-inaktiviertes P450
3A4 bei 425 nm. Sie war im Vergleich mit P450 3A4 in Gegenwart von
NRDPH ohne BG etwa 2 nm zu längerer
Wellenlänge
verschoben. Es gab keine Anzeichen eines Hämabbaus. Es gab jedoch eine
leichte Verstärkung
der maximalen Absorption für
BG-inaktiviertes P450 3A4 (5).
Der P450-Gehalt
war ebenfalls auf eine ähnliche
Größe verringert,
wenn eine –NADPH/+BG-Probe
als Referenz verwendet wurde. Es wird angenommen, dass dieses Verfahren
eine Störung
der Bestimmung von P450 durch endogen während der Inkubation erzeugtes
CO verringert (M. A. Correia, C. Decker, K. Sugiyama, M. Underwood,
L. Bornheim, S. A. Wrighton, A. E. Rettie und W. F. Trager, Degradation
of rat hepatic cytochrome P 450 heme by 3,5-dicarbethoxy-2,6-dimethyl-4-ethyl-1,4-dihydropyridine
to irreversibly bound protein adducts. Arch. Biochem. Biophys.,
1987; 258: 436–451).
-
HPLC-Analyse von BG-inaktiviertem
P450 3A4: Wie in 6 gezeigt,
war die Menge von apoP450 3A4 um etwa 50% selektiv verringert, wenn
die durch BG inaktiviertes P450 3A4 enthaltende Probe mittels Umkehrphasen-HPLC
auf einer Poros-Säule
analysiert wurde. Nahezu 100% des Reduktase- und Cytochrom-b5-proteins
wurden im Vergleich mit den -NADPH-Kontrollen von der Säule zurückgewonnen.
Etwa 90% des Häms
wurden von der BG inaktiviertes P450 3A4 enthaltenden Probe zurückgewonnen,
was in Übereinstimmung
mit den durch die Spektralanalyse erhaltenen Ergebnissen war. Kein
modifizierter Hämpeak
konnte unter Verwendung dieser HPLC-Bedingungen nachgewiesen werden.
-
Zeit- und konzentrationsabhängige Inaktivierung
von P450 3A4 durch BG: Wie in 7 gezeigt,
war die BG-vermittelte Inaktivierung von P450 3A4 in einem wiederhergestellten
System zeit- und konzentrationsabhängig und sie erforderte eine
Metabolisierung von BG. Die Inaktivierung zeigte bezüglich der
Zeit eine Kinetik pseudo-erster Ordnung. Eine lineare Regressionsanalyse
der Daten in 7 wurde
verwendet, um die Anfangsgeschwindigkeitskonstanten der Inaktivierung
(Kobs) zu bestimmen. Doppelt-reziproke Auftragungen der
Werte von Kobs und der BG-Konzentrationen
ergaben eine maximale Geschwindigkeitskonstante (KInaktivierung)
der Inaktivierung von 0,3 min–1 und eine für eine halbmaximale
Inaktivierung erforderliche Inaktivatorkonzentration (KI)
von 7,7 μM
(Walsh, aaO, 1984). Eine konzentrationsabhängige Hemmung wurde auch für die Probe
ohne Vorinkubation beobachtet. Dies war mit dem Ergebnis der Probe
von –NADPH/+BG
in Tabelle 3 konsistent.
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Wirkung von α-Naphathoflavon auf die BG-vermittelte
Inaktivierung: Es wurde berichtet, dass α-Naphathoflavon die Metabolisierung
mehrerer Substrate durch P450 3A4 stimuliert (Ueng, aaO, 1997).
Daher wurde beschlossen, zu testen, ob es die Bildung des reaktiven
Metaboliten von BG erhöht
und anschließend die
Inaktivierung von P450 3A4 verstärkt. α-Naphathoflavon änderte die
Stärke
der BG-vermittelten Inaktivierung von P450 3A4 nicht. Die Testosteron-6β-hydroxy lierungsaktivität von 3A4
wurde mit 2 μM
BG um etwa 55% inaktiviert, wenn α-Naphathoflavon
gleichzeitig im Reaktionsgemisch mit Endkonzentrationen im Bereich von
6 bis 50 μM
inkubiert wurde. Höhere
Konzentrationen von α-Naphathoflavon
wurden wegen der Löslichkeitsbeschränkung nicht
verwendet.
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Hemmung von humanen Lebermikrosomen-P450-Enzymen
durch BG: Wie in 8 angegeben,
wurden die Aktivitäten
von P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1 und 3A4 in humanen Lebermikrosomen
durch BG gehemmt. Die IC50-Werte betrugen
etwa X, X, 2,4, 3,0, 3,9 und 4,6 μM
für P450
1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1 bzw. 3A4. Etwa 71% und 100% der Aktivität von P450
2C19 wurden durch 2 bzw. 20 μM
BG gehemmt.
-
-
Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
in einer breiten Vielzahl oraler Dosierungsformen hergestellt und
verabreicht werden.
-
Zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen aus den Verbindungen der vorliegenden Erfindung
können
pharmazeutisch akzeptable Träger
entweder fest oder flüssig
sein. Zubereitungen fester Form umfassen Pulver, Tabletten, Pillen,
Kapseln, Kachets, Suppositorien und dispergierbare Granulate. Ein
fester Träger
können
eine oder mehrere Substanzen, die auch als Verdünnungsmittel, Aromatisierungsmittel,
Bindemittel, Konservierungsmittel, den Tablettenzerfall fördernde
Mittel fungieren können,
oder auch ein Einkapselungsmaterial sein.
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In Pulvern ist der Träger ein
feinzerteilter Feststoff, der im Gemisch mit der feinzerteilten
aktiven Komponente ist.
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In Tabletten wird die aktive Verbindung
mit dem Träger
mit den notwendigen Bindungseigenschaften in geeigneten Verhältnissen
gemischt und in der gewünschten
Form und Größe kompaktiert.
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Die Pulver und Tabletten enthalten
vorzugsweise 5 oder 10 bis etwa 70% der aktiven Verbindung. Geeignete
Träger
sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker, Lactose,
Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine,
Tragant, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, ein niedrigschmelzendes
Wachs, Kakaobutter und dergleichen. Der Ausdruck "Zubereitung" soll die Formulierung
der aktiven Verbindung mit Einkapselungsmaterial als Träger, das
eine Kapsel ergibt, in der die aktive Komponente mit oder andere
weitere Träger
von einem Träger
umgeben ist, der dadurch mit dieser in Verbindung ist, umfassen.
In ähnlicher
Weise werden Kachets und Pastillen umfasst. Tabletten, Pulver, Kapseln,
Pillen, Kachets und Pastillen können
als zur oralen Verabreichung geeignete feste Dosierungsformen verwendet
werden.
-
Zur Herstellung von Suppositorien
wird ein niedrigschmelzendes Wachs, beispielsweise ein Gemisch von
Fettsäureglyceriden
oder Kakaobutter, zunächst
geschmolzen und die aktive Komponente darin, beispielsweise durch
Rühren,
homogen dispergiert. Das geschmolzene homogene Gemisch wird dann
in Formen geeigneter Größe gegossen,
abkühlen
gelassen und dadurch verfestigt.
-
Zubereitungen flüssiger Form umfassen Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen, beispielsweise Wasser oder Wasser-Propylenglykol-Lösungen.
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Zur oralen Verwendung geeignete wässrige Lösungen können durch
Auflösen
der aktiven Komponente in Wasser und die Zugabe geeigneter Farbmittel,
Aromastoffe, Stabilisierungs- und Dickungsmittel nach Bedarf hergestellt
werden.
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Zur oralen Verwendung geeignete wässrige Suspensionen
können
durch Dispergieren der feinzerteilten aktiven Komponente in Wasser
mit einem viskosen Material, wie natürlichen oder synthetischen
Gummis, Harzen, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose,
und anderen bekannten Suspendiermitteln hergestellt werden.
-
Ebenfalls umfasst werden Zubereitungen
fester Form, die kurz vor der Verwendung in Zubereitungen flüssiger Form
zur oralen Verabreichung umgewandelt werden sollen. Derartige flüssige Formen
umfassen Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen. Diese Zubereitungen können zusätzlich zur
aktiven Komponente Farbmittel, Aromastoffe, Stabilisierungsmittel,
Puffer, künstliche
und natürliche
Süßungsmittel,
Dispergiermittel, Dickungsmittel, Solubilisierungsmittel und dergleichen
enthalten.
-
Die pharmazeutische Zubereitung ist
vorzugsweise in Einheitsdosisform. In einer derartigen Form ist die
Zubereitung in Einheitsdosen, die entsprechende Mengen der aktiven
Komponente enthalten, unterteilt. Die Einheitsdosisform kann eine
abgepackte Zubereitung, wobei die Packung diskrete Mengen der Zubereitung
enthält,
beispielsweise abgepackte Tabletten, Kapseln und Pulver in Phiolen
oder Ampullen, sein. Auch kann die Einheitsdosisform eine Kapsel,
Tablette, ein Kachet oder eine Pastille selbst sein, oder es kann
die entsprechende Anzahl dieser in abgepackter Form sein.
-
Die Menge der aktiven Komponente
in einer Einheitsdosiszubereitung kann gemäß der speziellen Anwendung
und der Wirksamkeit der aktiven Komponente von 0,1 mg bis 100 mg,
vorzugsweise 0,5 mg bis 20 mg variiert oder eingestellt werden.
Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch andere kompatible therapeutische
Mittel enthalten.
-
Bei der therapeutischen Verwendung
werden die bei dem pharmazeutischen Verfahren der vorliegenden Erfindung
verwendeten Verbindungen mit einer Anfangsdosis von BG von etwa
0,01 mg bis etwa 1 mg pro kg pro Tag verabreicht. Ein Tagesdosisbereich
von BG von etwa 0,01 mg bis etwa 0,1 mg pro kg ist bevorzugt. Die
geeignete therapeutische Dosismenge der Verbindungen der vorliegenden
Erfindung, die mit BG kombiniert werden kann, ist einem Fachmann
bekannt. Die Dosismengen können
jedoch in Abhängigkeit
von den Bedürfnissen
des Patienten, der Schwere der zu behandelnden Störung und
der zu verwendenden Verbindung variiert werden. Die Bestimmung der
geeigneten Dosismenge für
eine spezielle Situation ist einem Fachmann üblicher Erfahrung klar. Im
allgemeinen wird eine Behandlung mit kleineren Dosismengen, die
geringer als die optimale Dosis der Verbindung sind, begonnen. Danach
wird die Dosismenge in kleinen Inkrementen erhöht, bis die unter den Umständen optimale
Wirkung erreicht ist. Günstigerweise
kann die Gesamttagesdosis, falls gewünscht, aufgeteilt und in Portionen
während
des Tags verabreicht werden.
-
Die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele erläutern
die bevorzugten Verfahren der Erfinder zur Herstellung der Verbindungen
der Erfindung.
-
MATERIALEN UND METHODEN
-
Chemikalien: NADPH, L-α-Dilauroyl-
und L-α-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphocholine,
Phosphatidylserin, Catalase, GSH, δ-Aminolävulinsäurehydrochlorid, Testosteron,
6β- und
11β-Hydroxytestosteron,
Chlorzoxazon, Cumarin, Tolbutamid wurden bei Sigma Chemical Company
(St. Louis, MO) gekauft. 7-Hydroxycumarin (Umbelliferon)
wurde von Aldrich (Milwaukee, WI) erhalten. 4-Hydroxymethyltolbutamid,
6-Hydroxychlorzoxazon, 4'-Hydroxymephenytoin,
racemisches Bifurolol und 1'-Hydroxybufurolol
wurden von Gentest Corp. (Woburn, MA) erhalten. Isopropyl-β-D-thiogalactosid
wurde bei Calbiochem Corp. (La Jolla, CA) gekauft. (S)-Mephenytoin
war eine Gabe von Dr. W. F. Trager (University of Washington, Seattle,
WA). Bergamottin wurde bei Indofine Chemical Company, Inc. (Somerville,
NJ) gekauft.
-
Beispiel 1
-
LC-MS/MS-Identifizierung
von BG und dessen Derivaten in Grapefruitsaft
-
Grapefruitsaft oder Orangensaft wurde
durch Auspressen von halbierten weißen Florida-Grapefruits oder
-Orangen per Hand hergestellt. Der Saft wurde mit Ethylacetat extrahiert
und getrockneter Extrakt wurde zur anschließenden Analyse im HPLC-Puffer
gelöst.
Die LC/MS-Identifizierung der Komponenten wurde unter Verwendung
eines Quattro-II-Dreifachquadrupolmassenspektrometers (Micromass,
Manchester, UK) durchgeführt.
Die Probeneinführung
und -ionisierung wurde durch Elektro sprayionisierung (ESI) im Positivionenmodus
(Kolbenspannung von 30 V) durchgeführt. Die Scandaten wurden unter
Kontrolle des Micromass Masslynx NT-Datensystems (Version 2.22)
erhalten. Die Komponenten von Grapefruitsaft wurden mittels HPLC
auf einer C18-Säule
(Zorbax XDB 5 μm,
2,1 x 150) unter Elution mit 100 mM Essigsäure (A) und Acetonitril (B)
mit einem Gradienten von 30% B während
5 min und dann 30% bis 70% B innerhalb von 25 min mit einer Durchflussrate von
200 μl/min
aufgetrennt. Die Molekulargewichtsbestimmungen wurden durch Aufnehmen
der Massenspektren über
einen Massenbereich von 100 bis 500 amu mit einer Scanrate von 1,0
s/Dekade durchgeführt.
Die Bestimmungen der Molekülstruktur
wurden durch Aufnehmen von MS/MS-Produktion-Scans mit einer Scanrate
von 1,0 s/ Dekade durchgeführt.
Die Stoßaktivierung
wurde unter Verwendung von Argon mit einem angegebenen Gaszelldruck
von 0,2666 × 10–3 Pa
(2, 0 × 10–3 Torr)
und einer Stoßenergie
von 20 eV erreicht.
-
Beispiel 2
-
Expression von P450 3A4
und Reinigung des exprimierten Enzyms
-
Vollständige P450 3A4-cDNA (außer der
Deletion des Codons 3-12 am 5'-Ende),
die gentechnisch in den pCW-Vektor eingeführt war, wurde von Dr. R. W.
Estabrook (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas,
TX) erhalten. Der P450 3A4 enthaltende Vektor wurde in MV1304-Zellen
transformiert. Das Züchten
der transformierten E. coli wurde in modifiziertem Terrific Broth
durchgeführt
und die Expression von P450 A4 wurde durch die Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid
induziert. δ-Aminolävulinsäure (0,5 mM)
wurde zum Verstärken
der Hämsynthese
zugegeben. Die Membranfunktion wurde aus den Bakterienzellen durch
Ultraschallbehandlung nach der Behandlung mit Lysozym hergestellt
und anschließend
aus dem Bakterienzellhomogenat durch differentielle Zentrifugation
isoliert. P450 3A4 wurde durch Chromatographie auf einer DE52-Säule bis
zur Homogenität
von den Detergenssolubilisierten Membranen, wie im vorhergehenden
beschrieben, (E. M. Gillam, T. Baba, B. R. Kim, S. Ohmori und F.
P. Guengerich, Expression of modified human cytochrome P450 3A4
in Escherichia coli and purification and reconstitution of the enzyme.
Arch. Biochem. Biophys., 1993; 305: 123–131) gereinigt.
-
Beispiel 3
-
Isolierung von NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase
und Cytochrom b5
-
NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase und
Cytochrom b5 wurden aus Lebermikrosomen
von Phenobarbital-behandelten Long-Evans-Ratten nach bereits beschriebenen Verfahren
gereinigt (D. J. Waxman und C. Walsh, Phenobarbital-induced rat
liver cytochrome P450. J. Biol. Chem., 1982; 257: 10446–10457;
T. Omura und R. Sato, The carbon-monooxide binding pigment of liver
microsomes. J. Biol. Chem., 1964; 239; 2370–2378).
-
Beispiel 4
-
BG-vermittelte Inaktivierung
von P450 3A4 in einem wiederhergestellten System
-
P450 3A4 (0,5 nmol) wurde mit 20 μg eines Gemischs
(1 : 1 : 1) von L-α-Dilauroyl-
und L-α-Dioleyl-syn-glycero-3-phosphocholinen
und Phosphatidylserin, 200 μg
Cholsäure,
1 nmol NADPH-Reduktase, 0,5 nmol Cytochrom b5,
500 U Catalase, 2 μmol
GSH, 30 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA und 20% Glycerin
in einem Endvolumen von 1 ml 50 mM Hepes-Puffer (pH-Wert 7,5) wiederhergestellt.
Die Reaktionen mit verschiedenen Konzentrationen von BG wurden durch
Zugabe von 1 mM NADPH initiiert und auf Eis beendet. Die Inkubationen
wurden bei 37°C
während
den angegebenen Zeitspannen durchgeführt. Am Ende der Inkubation
wurden 0,2 ml des Inkubationsgemischs in 0,8 ml 50 mM Hepes-Puffer
(pH-Wert 7,5), der 20% Glycerin und 0,5 mM EDTA enthielt, verdünnt. Die
Spektren wurden zwischen 330 und 700 nm gegen den Verdünnungspuffer
als Referenz auf einem DW2-OLIS-Spektrophotometer im Modus mit aufgespaltenem
Strahl aufgezeichnet. Ein Aliquot von 0,25 ml wurde zur Bestimmung
des P450-Gehalts nach dem Verfahren von Omura und Sato (Omura und
Sato, aaO, 1964) verwendet. Weitere aliquote Teile wurden zur Bestimmung
der Testosteron-6β-hydroxylierungsaktivität und zur
HPLC-Analyse entnommen.
-
Beispiel 5
-
Bestimmung der Testosteron-6β-hydroxylierungsaktivität
-
Ein Aliquot (0,05 ml) des Inkubationsgemischs
wurde in 0,95 ml 50 mM Hepes-Puffer (pH-Wert 7,5), der 200 μM Testosteron,
500 U Catalase, 2 μMol
GSH, 30 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA und 20 Glycerin
in einem Endvolumen von 1 ml von 50 mM Hepes-Puffer (pH-Wert 7,5)
enthielt, verdünnt
und 10 min lang bei 37°C
inkubiert. 6β-Hydroxytestosteron
wurde mittels HPLC auf einer C18-Säule (Microsorb-MV, 5 μm, 4,6 × 15 cm, Rainin,
Woburn) unter isokratischer Elution mit einer mobilen Phase von
65 Methanol mit einer Durchflussrate von 1 ml/min bestimmt, und
das Eluat wurde mittels UV-Erfassung bei 254 nm überwacht.
-
Beispiel 6
-
HPLC-Analyse von BG-inaktiviertem
P450 3A4
-
Nach 10-minütiger Inkubation von P450 3A4
mit 50 μM
BG in dem, wie im vorhergehenden beschriebenen wiederhergestellten
System wurden 200 μl
des Reaktionsgemischs, wie im vorhergehenden beschrieben (E. S.
Roberts, N. E. Hopkins, D. A. Alworth und P. F. Hollenberg, Mechanism-based
inactivation of cytochrome P450 2B1 by 2-ethynylnaphthalene: Identification
of an active-site peptide. Chem. Res. Toxicol., 1993; 6: 470–479), auf
einer Poros-Säule
direkt analysiert. Das Eluat wurde mit tels UV-Erfassung bei 14,
310 und 905 nm gleichzeitig überwacht.
-
Beispiel 7
-
Hemmung der Aktivitäten der
humanen Lebermikrosomen-P450-Enzyme
durch BG
-
Humane Lebergewebe wurden von University
of Chicago Distribution Center of LTPADS (Liver Transplant Procurement
and Distribution Service, University of Minnesota, Minneapolis,
MN), Human Biologics Inc. (Phoenix, AZ) und dem International Institute
for the Advancement of Science (Exton, PA) erhalten. Die Lebermikrosomen
wurden durch differentielle Zentrifugation hergestellt. Caffein-N3-demethylierung
(W. Tassaneeyakul, Z. Mohammed, D. J. Birkett, M. E. McManus, M.
E. Veronese, R. H. Tukey, L. C. Quattrochi, F. J. Gonzalez und J.
O. Miners, Caffeine as a probe for human cytochromes P450: Validation
using cDNA-expression, immunoinhibition, and microsomal kinetic
and inhibitor techniques. Pharmacogenetics, 1992; 2: 173–183), Cumarin-7-hydroxylierung
(J. H. Fentem und J. R. Fry, Metabolism of coumarin by rat, gerbil,
and human liver microsomes. Xenobiotica, 1992; 22: 357–367), Tolbutamid-Hydroxylierung (J.
O. Miners, K. J. Smith, R. A. Robson, M. E. McManus, M. E. Veronese
und D. J. Birkett, Tolbutamide hydroxylation by human liver microsomes:
Kinetic characterization and relationship to other cytochrome P-450
dependent xenobiotic oxidations. Biochem. Pharmacol., 1988; 37:
11347– 1144),
racemische Bufurolol-1'-Hydroxylierung
(T. Kronbach, D. Mathys, J. Gut, T. Catin und U. A. Meyer, High-performance
liquid chromatographic assays for Bufurolol 1'-hydroxylase, debrisoquine 4-hydroxylase,
and dextromethorphan o-deethylase in microsomes and purified cytochrome P-450
isozymes of human liver. Anal. Biochem., 1987; 162: 24–32), Chlorzoxazon-6-Hydroxylierung (R.
Peter, R. Bocker, P. H. Beaume, M. Iwasaki, F. P. Guengerich und
C. S. Yang, Hydroxylation of chlorzoxazone as a specific probe for
human liver cytochrome P-450 IIEI. Chem. Res. Toxicol., 1990; 3:
566–573)
und Testosteron-6β-Hydroxylierung (A.
J. Sonderfan, M. P. Arlotto, D. R. Dutton, S. K. McMillen und A.
Parkinson, Regulation of testosterone hydroxylation by rat liver
microsomal cytochrome P-450. Arch. Biochem. Biophys., 1987; 255:
27–41,4)
wurden zur Bestimmung der Aktivitäten von P450 1A2, 2A6, 2C9,
2D6, 2E1 bzw. 3A4 verwendet. Gepoolte humane Lebermikrosomen (N
= 6, 0,1 – 1
mg Protein/ml) wurden mit BG (1, 10 und 100 μM) in Gegenwart der entsprechenden
Probensubstrate, 100 μM
Caffein, 4 μM
Cumarin, 100 μM
Tolbutamid, 10 μM
Bufurolol, 40 μM
Chlorzoxazon und 50 μM
Testosteron, in einem Endvolumen von 0,5 ml von 0,1 mM Phosphatpuffer
(pH-Wert 7,4) bei 37°C
während
der jeweils entsprechenden Zeitspannen inkubiert. Die Reaktionen
wurden durch die Zugabe von 1 mM NADPH initiiert und auf Eis beendet.
(S)-Mephenytoin-4'-Hydroxylierung
wurde zur Bestimmung der Aktivität
von P450 2C19 verwendet (U. T. Meier, T. Kronbach und U. A. Meyer,
Assay of mephenytoin metabolism in human liver microsomes by high-Performance
liquid chromatography. Anal. Biochem. 1985; 151: 286–291). (S)-Mephenytoin
(50 μM)
wurde mit gepoolten humanen Lebermikrosomen in einem Endvolumen
von 0,125 ml in Gegenwart von 0,2, 2 bzw. 20 μM BG inkubiert. Die 4'-Hydroxymephenytoin-Konzentration wurde
unter Verwendung von LC-MS/MS bstimmt. Kontrollversuche bestanden
aus den vollständigen
Inkubationskomponenten ohne die Zugabe von BG.
