ES2206602T3 - Compuestos y metodos terapeuticos inhibidores de angiogenesis. - Google Patents
Compuestos y metodos terapeuticos inhibidores de angiogenesis.Info
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Abstract
UN INHIBIDOR DE LA PROLIFERACION DE LAS CELULAS ENDOTELIALES, CAPAZ DE INHIBIR LA ANGIOGENESIS Y CAUSAR REGRESION TUMORAL, QUE TIENE APROXIMADAMENTE 20 KDA Y CORRESPONDE A UN FRAGMENTO CTERMINAL DEL COLAGENO TIPO XVIII, Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA ANGIOGENESIS.
Description
Compuestos y métodos terapéuticos inhibidores de
angiogénesis.
La presente invención se refiere a un nuevo
inhibidor de angiogénesis utilizable para el tratamiento de
enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tales como cáncer
dependiente de angiogénesis. La invención se refiere además a un
nuevo compuesto y método para la curación de cáncer dependiente de
angiogénesis. Además, la presente invención se refiere a ensayos de
diagnóstico y a equipos para medición de endostatina, a equipos
histoquímicos para la localización de la endostatina, a sondas
moleculares para controlar la biosíntesis de la endostatina, a
anticuerpos específicos para la endostatina, al desarrollo de
agonistas de péptidos y antagonistas del receptor de endostatina, y
a agentes citotóxicos relacionados con péptidos de endostatina.
Varias líneas de pruebas directas sugieren en la
actualidad que la angiogénesis esencial para el crecimiento y
persistencia de tumores sólidos y sus metástasis (Folkman, 1989;
Hori y otros, 1991; Kim y otros, 1993; Millauer y otros, 1994).
Para estimular la angiogénesis, los tumores sobrerregulan su
producción de una serie de factores angiogénicos, incluyendo los
factores de crecimiento de fibroblastos (FGF y BFGF) (Kandel y
otros, 1991) y factor de crecimiento celular endotelial
vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF). No obstante,
muchos tumores malignos generan también inhibidores de
angiogénesis, incluyendo angiostatina y trombospondina (Chen y
otros, 1995; Good y otros, 1990; O'Reilly y otros, 1994). Se ha
hecho la hipótesis de que el fenotipo angiogénico es el resultado
de un equilibrio neto entre estos reguladores positivos y negativos
de la neovascularización (Good y otros, 1990; O'Reilly y otros,
1994; Parangi y otros, 1996; Rastinejad y otros, 1989). Otros
varios inhibidores endógenos de angiogénesis han sido identificados
si bien no todos están asociados con la presencia de un tumor.
Entre éstos se incluyen el factor 4 de plaquetas (Gupta y otros,
1995; Maione y otros, 1990), interferón- alfa, proteína 10 inducible
por interferón (Angiolillo y otros, 1995; Strieter y otros, 1995),
que se induce por interleuquina 12 y/o interferón gamma (Voest y
otros, 1995), gro-beta (Cao y otros, 1995), y el
fragmento N-terminal de 16 kDa de prolactina (Clapp
y otros, 1993). El único inhibidor conocido de angiogénesis que
inhibe específicamente la proliferación de células endoteliales es
la angiostatina (O'Reilly y otros 1994).
La angiostatina es un inhibidor específico de la
proliferación de células endoteliales de aproximadamente 38
kiloDaltons (kDa). La angiostatina es un fragmento interno de
plasminógeno, que contiene, como mínimo, tres de los cinco
"kringles" de plasminógeno. La angiostatina se ha demostrado
que reduce el peso tumoral, y que inhibe la metástasis en ciertos
modelos de tumor. (O'Reilly y otros, 1994). Tal como se utiliza en
esta descripción, el término "angiostatina" se refiere a la
angiostatina anteriormente descrita; fragmentos de péptidos de
angiostatina que tienen actividad inhibidora de la proliferación de
células endoteliales; y análogos de angiostatina que tienen
homología de secuencia sustancial (tal como se define en esta
memoria) con respecto a la secuencia de aminoácido de la
angiostatina, que tienen actividad inhibidora de la proliferación
de células endoteliales.
La presente invención se refiere a un nuevo
inhibidor de proteínas, y a un método de utilización del mismo. La
proteína es un inhibidor potente y específico de la proliferación
endotelial y de la angiogénesis. La terapia sistémica con el
inhibidor provoca una supresión casi completa de angiogénesis
inducida por tumor, y muestra fuerte actividad antitumoral.
La proteína inhibitoria tiene un peso molecular
de aproximadamente 18.000 hasta aproximadamente 20.000 Daltons (18
a 20 kDa) y es capaz de inhibir proliferación celular endotelial en
células endoteliales de cultivo. La proteína puede ser
caracterizada adicionalmente por su secuencia de aminoácido
preferente N-terminal cuyos primeros veinte (20)
son los siguientes:
Un inhibidor de la proliferación celular
endotelial preferente según la invención es una proteína que tiene
las características antes descritas, y que se puede aislar y
purificar de la línea celular hemangioendotelioma murino EOMA. Esta
proteína inhibitoria ha sido designada endostatina.
La presente invención se refiere a una proteína
endostatina aislada, en la que la proteína endostatina o fragmento
de la misma es un fragmento de una zona C-terminal
nocolágena de una proteína colágena y en la que la proteína
endostatina, o fragmento de la misma, se caracteriza adicionalmente
por su capacidad en inhibir angiogénesis.
Rehn y otros (J. of Biol. Chem 269 (19):
13929-35, (1994)) y Sasaki y otros (EMBO J.,
17(15): 4249-56 (1998)) han numerado las
regiones C-terminal de colágeno XVIII utilizando
diferentes nomenclaturas.
La presente invención da a conocer métodos de
compuestos para el tratamiento de enfermedades y procedimientos
mediados por angiogénesis no deseada e incontrolada por la
administración a humanos o animales afectados de la angiogénesis de
un compuesto que comprende una endostatina sustancialmente
purificada o derivado de la endostatina en una dosis suficiente para
inhibir la angiogénesis. La presente invención es particularmente
útil para el tratamiento o reducción del crecimiento de tumores. La
administración de endostatina a humanos o animales con tumores en
fase de metástasis prevascularizada impide el crecimiento o
expansión de dichos tumores.
La presente invención comprende también métodos
de diagnóstico y equipos para la detección y medición de
endostatina en fluidos biológicos y tejidos y para la localización
de la endostatina en tejidos. El método de diagnóstico y equipo de
diagnóstico puede adoptar cualquier configuración bien conocida por
los técnicos de la materia. La presente invención comprende también
anticuerpos específicos para la endostatina y anticuerpos que
inhiben la unión de anticuerpos específicos para la endostatina.
Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos
monoclonales. Los anticuerpos específicos para la endostatina
pueden ser utilizados en equipos de diagnóstico para detectar la
presencia y cantidad de endostatina que es diagnóstico o
prognóstico de la existencia o de la recurrencia de cáncer u otras
enfermedades mediadas por angiogénesis. También se pueden
administrar anticuerpos específicos para endostatina a humanos o
animales para inmunizar pasivamente a los mismos contra la
endostatina, reduciendo de esta manera la inhibición
angiogénica.
La presente invención incluye también métodos de
diagnóstico y equipos para detectar la presencia y cantidad de
anticuerpos que se unen a endostatina en los fluidos corporales. El
método de diagnóstico y su equipo pueden tener cualquier
configuración de tipo bien conocido por los técnicos en la
materia.
La presente invención comprende también
fragmentos de péptido de endostatina que pueden ser marcados
isotópicamente o con otras moléculas, o proteínas para su
utilización en la detección y visualización de lugares de unión de
endostatina con técnicas de tipo conocido, incluyendo, sin que ello
sirva de limitación, tomografía de emisión de positrones,
autorradiografía, citómetro de flujo, ensayos de unión de
radiorreceptores, e inmunohistoquímica.
Estos péptidos de endostatina actúan también como
agonistas y antagonistas en el receptor de endostatina, aumentando
de esta manera o bloqueando la actividad biológica de la
endostatina. Estos péptidos son utilizados en el aislamiento del
receptor de endostatina.
La presente invención incluye también
endostatina, fragmentos de endostatina, antisueros de endostatina o
agonistas receptores de endostatina y antagonistas ligados a
agentes citotóxicos para aplicaciones terapéuticas y de
investigación.
La presente invención comprende sondas
moleculares para ácido ribonucleico y ácido deoxirribonucleico
involucradas en la transcripción y traducción de endostatina. Estas
sondas moleculares proporcionan medios de detección y medición de
la biosíntesis de endostatina en tejidos y células.
Un descubrimiento sorprendente es que varias
formas de proteína de endostatina recombinante pueden servir como
compuestos de liberación mantenida
anti-angiogénesis cuando se administra un animal con
tumor. Una forma preferente del compuesto de liberación mantenida
es una endostatina no replegada producida recombinantemente.
Adicionalmente la presente invención comprende
secuencias de ácido nucleico que comprenden codones de núcleótidos
correspondientes que codifican para la secuencia de aminoácido que
se ha indicado anteriormente y para sus fragmentos de péptidos que
inhiben la proliferación celular endotelial y endostatina.
La presente invención se refiere también a
métodos de utilización de la proteína de endostatina y fragmentos
de péptidos que corresponden a secuencias de ácido nucleico, y
anticuerpos que se unen específicamente al inhibidor y sus
péptidos, para el diagnóstico de enfermedades y desórdenes
relativos a células endoteliales.
La presente invención comprende además un método
para identificar receptores específicos para endostatina y
moléculas receptoras identificadas y aisladas
correspondientemente.
La invención se refiere también a un método para
identificar nuevas encimas capaces de liberar endostatina a partir
de colágeno tipo XVIII, y otras moléculas que contienen una
secuencia de aminoácido de endostatina, así como péptidos de la
misma. Estas encimas productoras de endostatina constituyen también
un aspecto de la invención.
Un método médico importante es una nueva forma de
control de natalidad, en el que una cantidad efectiva de endostatina
es administrada a una hembra, de manera tal que se inhibe la
vascularización endométrica uterina y no puede tener lugar o no se
puede mantener la implantación embrional.
Un aspecto importante específico de la presente
invención es el descubrimiento de un método nuevo y efectivo para
tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis, particularmente
cáncer dependiente de angiogénesis, en pacientes, y para la
curación de cáncer dependiente de angiogénesis en pacientes. El
método proporciona de manera inesperada el importante resultado
médico de la inhibición de crecimiento tumoral y reducción de masa
tumoral. El método se refiere a la coadministración de la
endostatina de la presente invención y otro compuesto
anti-angiogénesis, preferentemente angiostatina. De
acuerdo con ello, la presente invención comprende también
formulaciones que contienen endostatina, y opcionalmente
angiostatina, que son eficaces para el tratamiento o curación de
cánceres dependientes de angiogénesis.
De acuerdo con lo anterior, es un objetivo de la
presente invención dar a conocer un compuesto que comprende una
proteína de endostatina.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un método para el tratamiento de enfermedades y
procedimientos que son mediados por angiogénesis.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un método de diagnóstico o prognóstico y un equipo
para detectar la presencia y cantidad de endostatina en un fluido o
tejido corporal.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un método y compuesto para el tratamiento de
enfermedades y procesos que son mediados por angiogénesis
incluyendo, sin que ello sirva de limitación, hemangioma, tumores
sólidos, leucemia, metástasis, telangiectasia psoriasis
scleroderma, granuloma pirogénico, angiogénesis de miocardio,
neovascularización de placas, colaterales coronarias, colaterales
cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis isquémica de
extremidades, enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma
neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental,
artritis, neovascularización diabética, degeneración macular,
curación de heridas, úlcera péptica, fracturas, queloides,
vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación, y
placentación.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un compuesto para el tratamiento o reducción del
crecimiento del cáncer.
Un objetivo de la presente invención consiste en
dar a conocer un método para la detección y cuantificación de la
presencia de un anticuerpo específico para una endostatina en el
fluido corporal.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un compuesto que consiste en anticuerpos de
endostatina que son selectivos para regiones específicas de la
molécula de endostatina.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un método para la detección o prognosis de
cáncer.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un compuesto para su utilización en la
visualización y cuantificación de lugares de unión de endostatina
in vivo y in vitro.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un compuesto para su utilización en la detección y
cuantificación de la biosíntesis de la endostatina.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer una terapia para cáncer que tiene efectos
secundarios mínimos.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un compuesto que comprende endostatina o un
péptido de endostatina asociado a un agente citotóxico para el
tratamiento o represión del crecimiento de cáncer.
Éstos y otros objetivos, características y
ventajas de la presente invención quedarán evidentes después de la
lectura de la descripción detallada siguiente de las realizaciones
que se dan a conocer y de las reivindicaciones adjuntas.
Medios condicionados recogidos de células EOMA
confluentes o medios de base se aplicaron a células endoteliales
capilares bobinas con 1 ng/ml bFGF en un ensayo de proliferación de
72 horas. La proliferación de células endoteliales fue inhibida por
los medios condicionados de EOMA. Cada una de las barras representa
el \pm SEM medio.
\newpage
Los medios condicionados recogidos de células
EOMA confluentes fueron fraccionados sobre una columna de sefarosa
de heparina. La actividad de inhibición de proliferación endotelial
se eluyó aproximadamente a 0,8M NaCl.
Se aplicó un inhibidor purificado procedente de
cromatografía de columna de sefarosa de heparina a una columna de
filtración de gel y se eluyó como pico único.
Se aplicó inhibidor purificado por sefarosa de
heparina y cromatografía de filtración de gel a una columna de fase
inversa. El inhibidor eluyó como banda única de la columna
aproximadamente a 45% del acetonitrilo.
La secuencia N-terminal de un
inhibidor purificado de proliferación celular endotelial se ha
mostrado en relación con el diagrama esquemático de colágeno tipo
18. La secuencia N-terminal reveló identidad del
inhibidor aproximadamente con un fragmento
C-terminal de 20 kDa (mostrado en sombreado lleno)
para colágeno tipo XVIII. Las casillas abiertas representan los
dominios de colagenasa de colágeno tipo XVIII.
Se administró inhibidor recombinante producido en
E. coli a ratones sometidos a carcinoma de Pulmón de Lewis
que habían llegado a un volumen tumoral aproximadamente de 150
mm^{3}. El inhibidor fue administrado a una dosis de 20
mg/kg/día. La masa tumoral disminuyó hasta niveles no detectables
después de aproximadamente 12 días de tratamiento.
Figuras
7A-C
Figura 7A. Se implantó a ratones subcutáneamente
en el dorso células de carcinoma de pulmón de Lewis. Se empezó la
terapia sistémica con endostatina de ratón recombinante (20
mg/kg/día) cuando los tumores tenían aproximadamente un volumen de
200 mm^{3} (1% de peso corporal). Los tumores en los ratones
tratados con inhibidor de endostatina disminuyeron con rapidez y se
inhibieron aproximadamente >99% con respecto a controles
tratados con solución salina. Cada punto representa \pm SEM medio
para 5 ratones. El experimento fue repetido con resultados
comparables.
Figura 7B. Ratones representativos portadores de
tumor con y sin tratamiento después de 11 días de terapia sistémica
con endostatina. Los ratones tratados con solución salina (derecha)
presentaron tumores de color rojo con crecimiento rápido y
superficies ulceradas. Los ratones tratados con endostatina
(izquierda) tenían tumores residuales pequeños de color pálido
(flecha).
Figura 7C. Enfermedad residual de ratones
tratados con endostatina. Tres de los cinco ratones tratados con
endostatina fueron sacrificados después de 16 días de terapia. La
autopsia reveló pequeños tumores residuales blancos en el lugar de
la implantación primaria original (flechas).
Se sometieron los ratones a la acción de células
de Fibrosarcoma T241. Los ratones de control fueron tratados con
solución salina. Los ratones del experimento fueron tratados con 20
mg/kg/día de endostatina de ratón recombinante dirigida de E.
coli.
Ratones sometidos a células de Melanoma B16F10
Murino. Los animales de control fueron tratados con solución
salina. Los animales del experimento fueron tratados con 20
mg/kg/día de Endostatina de Ratón Recombinante directamente
procedente de E. coli.
Se trataron ratones con células de
hemangioendotelioma EOMA. Los animales de control fueron tratados
con solución salina. Los animales del experimento fueron tratados
con 20 mg/kg/día de Endostatina de Ratón Recombinante directamente
procedente de E. coli.
Se sometieron ratones a células de Carcinoma de
Pulmón de Lewis. Los animales de control fueron tratados con
solución salina. Los animales del experimento fueron tratados con
Endostatina Recombinante derivada de la secuencia de ratón o
Endostatina Recombinante directa de secuencia humana, de manera que
ambas Endostatinas fueron producidas por vía Recombinante en E.
coli. Se administró Endostatina de Ratón a 20 mg/kg/día o 2,5
mg/kg/día, y se administró Endostatina humana a 20 mg/kg/día.
Figuras
12A-C
Secciones histológicas de tumores de ratones
tratados con solución salina en comparación con ratones tratados
con endostatina, con implantación de carcinomas de pulmón de Lewis,
fueron analizadas en cuanto a proliferación (PCNA), apoptosis
(TUNEL), y angiogénesis (vWF). No se observó diferencia
significativa en el índice de proliferación de células tumorales
(figura 12A) en tumores tratados con respecto a tumores sin
tratamiento. Como contraste, el índice apoptótico de células
tumorales (figura 12B) incrementó 8 veces (p < 0,001) en los
ratones tratados con endostatina. La densidad de vasos (figura 12C)
fue determinada por contaje del número de vasos sanguíneos capilares
por campo de alta potencia (HPF) en secciones con tinción de
anticuerpos contra vWF. La angiogénesis se había suprimido casi
completamente en los tumores microscópicos residuales de los
ratones tratados con endostatina (p < 0,001).
Se implantaron ratones con células de carcinoma
de pulmón de Lewis de forma subcutánea en el dorso. Se empezó
terapia sistémica con inhibidor de ratón recombinante
(endostatina), administrada en una dosis de 20 mg/kg/día, cuando
los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm^{3} (1% de peso
corporal). Los tumores en los ratones tratados con el inhibidor de
endostatina se redujeron con rapidez esencialmente a niveles no
detectables después de unos 15 días de tratamiento. Cuando se
terminó el tratamiento, el volumen del tumor aumentó rápidamente y
fue tratable a continuación a los mismos niveles no detectables al
reiniciar el tratamiento. Los picos y valles de la figura muestran
el efecto cíclico de la inhibición con endostatina.
Se implantaron ratones por vía subcutánea en el
dorso con células de carcinoma de pulmón de Lewis. Se inició la
terapia sistémica con una combinación de endostatina de ratón
recombinante (20 mg/kg/día) y angiostatina del ratón recombinante
(20 mg/kg/día) cuando los tumores alcanzaron el volumen aproximado
de 300 mm^{3}. Los tumores de los ratones tratados con la terapia
de combinación se redujeron rápidamente esencialmente a nivel no
detectable en unos 15 días. De forma importante, los tumores que
habían sido reducidos permanecieron durmientes y no aumentaron su
tamaño o masa después de interrumpir el tratamiento. Éste es un
resultado no esperado de sustancial significación médica.
Los solicitantes han descubierto una nueva clase
de moléculas de proteína que tienen capacidad de inhibir la
proliferación endotelial cuando se añaden a células endoteliales
proliferantes in vitro. De acuerdo con ello, estas moléculas
de proteína han sido definidas funcionalmente como endostatinas, no
obstante, se debe comprender que esta definición funcional no limita
en modo alguno a la bioactividad de las endostatinas en cuanto a la
inhibición de crecimiento celular endotelial in vitro o in
vivo. Son posibles muchas otras funciones de las
endostatinas.
El término "endostatina" se refiere a una
proteína que tiene dimensiones preferentemente de 18 kDa a 20 kDa
determinadas por electroforesis de gel no reducido y reducido,
respectivamente. El término endostatina incluye también formas
precursoras de la proteína de 18 kDa a 20 kDa. El término
endostatina comprende también fragmentos de la proteína de 18 kDa a
20 kDa y proteínas y péptidos modificados que tienen una secuencia
aminoácida similar, y que son capaces de inhibir la proliferación
de células endoteliales. Por ejemplo, las sustituciones silenciosas
de aminoácidos, en las que la sustitución de un aminoácido por un
aminoácido estructural o químicamente similar no significa la
alteración de la estructura, conformación o actividad de la
proteína, tal como es bien conocido en esta técnica. Estas
sustituciones silenciosas están destinadas a quedar comprendidas
dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Se apreciará que el término "endostatina"
incluye proteínas acortadas o péptidos en los que uno o varios
aminoácidos han sido eliminados de cualquier extremo o de ambos de
la endostatina o de una región interna de la proteína, no obstante,
la proteína resultante retiene la actividad inhibidora de
proliferación endotelial. El término "endostatina" incluye
también proteínas o péptidos alargados en los que se añaden uno o
varios aminoácidos a uno o ambos extremos de la endostatina o a un
lugar interno de la proteína, pero que no obstante la molécula
resultante conserva la actividad inhibidora de proliferación
endotelial. Estas moléculas, por ejemplo con añadidura de tirosina
en la primera posición, son útiles para marcado, tal como
radio-iodado con ^{125}iodo para utilización en
ensayos. El marcado con otros radioisótopos puede ser útil para
conseguir una herramienta molecular para destruir la célula
objetivo que contiene receptores de endostatina. Otros marcadores
con moléculas tales como ricina pueden proporcionar un mecanismo
para destruir células con receptores de endostatina. "Homología
de secuencia sustancial" significa, como mínimo, aproximadamente
una homología de 70% entre una secuencia de residuo de aminoácido
en la secuencia análoga de endostatina, y la de endostatina
preferentemente, como mínimo, una homología de 80% aproximadamente,
más preferentemente una homología de 90% aproximadamente, como
mínimo.
Se incluyen también en la definición de un
término endostatina modificaciones de la proteína de endostatina,
sussubunidades y fragmentos de péptido. Estas modificaciones
incluyen sustituciones de aminoácidos naturales en lugares
específicos con otras moléculas, incluyendo sin que ello sirva de
limitación, aminoácidos naturales y no naturales. Estas
sustituciones pueden modificar la bioactividad de la endostatina y
producir agonistas biológicos o farmacológicos o antagonistas. El
término endostatina incluye también un fragmento de terminal N de
la endostatina que consiste en la secuencia de los primeros 20
aminoácidos N terminales que se muestra en la SEQ ID NO:1 y que se
muestra en la Tabla 1. Esta secuencia de los primeros 20 aminoácidos
de terminal N corresponde a un fragmento de terminal C del colágeno
de nueva identificación tipo XVIII.
La Tabla 1 muestra la correspondencia de las
designaciones de aminoácidos con 3 letras y 1 letra.
| Aminoácido | Residuo | Abreviatura |
| 1 | HIS | H |
| 2 | THR | T |
| 3 | HIS | H |
| 4 | GLN | Q |
| 5 | ASP | D |
| 6 | PHE | F |
| 7 | GLN | Q |
| 8 | PRO | P |
| 9 | VAL | V |
| 10 | LEU | L |
| 11 | HIS | H |
| 12 | LEU | L |
| 13 | VAL | V |
| 14 | ALA | A |
| 15 | LEU | L |
| Aminoácido | Residuo | Abreviatura |
| 16 | ASN | N |
| 17 | THR | T |
| 18 | PRO | P |
| 19 | LEU | L |
| 20 | SER | S |
La secuencia de aminoácido de terminal N de la
endostatina corresponde a un fragmento de péptido de 20 aminoácidos
interno hallado en el colágeno de ratón alfa 1 tipo XVIII,
iniciándose en el aminoácido 1105 y terminando en el aminoácido
1124. La secuencia del aminoácido de terminal N del inhibidor
corresponde también a un fragmento de péptido de 20 aminoácidos
interno hallado en el colágeno humano alfa 1 tipo XVIII, iniciándose
en el aminoácido 1132 y terminando en el aminoácido 1151.
La endostatina puede ser aislada a partir de
hemangioendotelioma EOMA murino. La endostatina puede ser producida
a partir de fuentes recombinantes, a partir de células alteradas
genéticamente implantadas en animales, de tumores, y de cultivos
celulares, así como otras fuentes. Se prevé que la endostatina es
realizada en células del sistema nervioso. La endostatina puede ser
aislada de fluidos corporales que incluyen, sin que sirva de
limitación, suero, orina y ascitos, o se pueden sintetizar por
métodos químicos o biológicos (por ejemplo, cultivo celular,
expresión de genes recombinantes, síntesis de péptidos y catálisis
enzimática in vitro de moléculas precursoras para conseguir
la endostatina activa). Las técnicas recombinantes comprenden
amplificación de genes de fuentes de ADN utilizando la reacción de
cadena de polimerasa (PCR), y amplificación de genes de fuentes ARN
utilizando transcriptasa inversa/PCR.
La endostatina inhibe de manera específica y
reversible la proliferación celular endotelial. Las moléculas de
proteínas del inhibidor de la invención se utilizan como
medicamento de control de natalidad, y para tratar enfermedades
relacionadas con angiogénesis, particularmente cánceres y tumores
dependientes de angiogénesis. Las moléculas de la proteína son
también útiles para curar cánceres dependientes de angiogénesis y
tumores. La capacidad inesperada y sorprendente de estos nuevos
compuestos para tratar y curar cánceres y tumores dependientes de
angiogénesis, satisface una necesidad insatisfecha hasta el momento
en medicina y proporciona importantes ventajas al género humano.
Términos importantes que se utilizan en esta
descripción se definirán de la manera siguiente. "Cáncer"
significa cánceres y tumores dependientes de angiogénesis, es
decir, tumores que requieren para su crecimiento (expansión en
volumen y/o masa) un incremento del número y densidad de los vasos
sanguíneos que les alimentan de sangre. "Reducción" significa
la reducción de masa y dimensiones del tumor.
Las proteínas que inhiben la proliferación
endotelial en la presente invención se pueden preparar por métodos
de síntesis de proteínas automatizados bien conocidos para los
expertos en la materia. De manera alternativa, las proteínas
inhibidoras de la proliferación endotelial, o endostatinas de la
presente invención se pueden aislar de proteínas conocidas más
grandes, tales como colágeno humano alfa 1 tipo XVIII y colágeno de
ratón alfa 1 tipo XVIII, proteínas que comparten una secuencia de
aminoácidos de terminal N común o similar. Se incluyen entre los
ejemplos de otras fuentes de endostatinas potenciales que tienen
secuencias de aminoácidos N terminales similares, la esterasa
pregástrica Bos taurus, colágeno humano alfa 1 tipo 15,
dehidrogenasa formato dependiente de NAD (EC 1.2.1.2) derivada de
Pseudomonas sp., proteína hexon s11459 de adenovirus bovino tipo 3,
producto de genes CELF21D12 2 F21d12.3 Caenorhabditis
elegans, proteína VAL1 TGMV AL1 derivada de virus mosaico
dorado del tomate, proteína hexon S01730 derivada de adenovirus 12
humano, Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, péptidos íntimamente
relacionados con la endostatina pueden ser derivados de la
secuencia de genes de esterasa pregástrica BOVMPE 1 (BOS TAURUS)
correspondiente a los aminoácidos 502 a 521, y el colágeno alfa 1
tipo 15 de humanos empezando en el aminoácido 316 y terminando en
el 335.
Las proteínas y péptidos derivados de éstas y de
otras fuentes, incluyendo síntesis de proteínas de forma manual o
automatizada, se pueden comprobar de manera fácil y rápida en
cuanto a actividad inhibidora de la proliferación endotelial
utilizando una serie de actividad biológica, tal como el ensayo de
proliferación celular endotelial de capilares bovinos. Otros
bioensayos de actividad inhibidora incluyen el ensayo CAM de pollo,
el ensayo corneal de ratón, y el efecto de administrar proteínas
aisladas o sintéticas en tumores implantados. El ensayo CAM de pollo
es descrito por O'Reilly, y otros en "Angiogenic Regulation of
Metastatic Growth" Cell, vol. 79 (2), 21 de octubre de 1994,
páginas 315-328, que se incorpora como referencia en
su totalidad a la presente descripción. De modo breve, embriones de
pollo de 3 días con yemas intactas son separados del huevo y
situados en un plato petri. Después de 3 días de incubación se
aplica un disco de metilcelulosa que contiene la proteína a
comprobar al CAM de los embriones individuales. Después de 48 horas
de incubación, los embriones y los CAMs son observados para
determinar si se ha inhibido el crecimiento endotelial. El ensayo
corneal de ratón comporta la implantación de una pastilla que
contiene factor de crecimiento junto con otra pastilla que contiene
el inhibidor de crecimiento endotelial supuesto, en la córnea del
ratón y observar el modelo de los capilares que se elaboran en la
córnea.
La invención presente también alarga las
secuencias de ácido nucleico que corresponden y clasifican para las
moléculas de proteína de inhibición de proliferación endotelial de
la invención, y anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen
específicamente a dichas moléculas de proteína. Las moléculas de
proteína biológicamente activa, secuencias de ácido nucleico que
corresponden a las proteínas, y anticuerpos que se unen
específicamente a las proteínas de la presente invención son útiles
para modular los procesos endoteliales in vivo y para el
diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas con las
células endoteliales, por ejemplo, por terapia de genes.
Las secuencias de ácido nucleico que corresponden
y que codifican para endostatina y análogos de endostatina se
pueden preparar basándose en el conocimiento de la secuencia de
aminoácido y la correspondencia reconocida en esta técnica entre
codones (secuencias de tres bases de ácido nucleico), y
aminoácidos. A causa de la degeneración del código genético, según
la cual la tercera base de un codón puede variar pero codificar
todavía para el mismo aminoácido, muchas secuencias de ácido
nucleico con distinta codificación posible son derivables para
cualquier proteína o fragmento de péptido específicos.
Las secuencias de ácido nucleico son sintetizadas
utilizando sistemas automatizados bien conocidos en esta técnica.
Se puede sintetizar la secuencia completa o bien se puede preparar
una serie de pequeños oligonucleótidos y posteriormente proceder a
su ligado junto para conseguir la secuencia de longitud completa.
De manera alternativa la secuencia de acción nucleico puede ser
derivada de un banco de genes utilizando sondas de oligonucleótidos
diseñadas basándose en la secuencia de minoácidos en el terminal N
y técnicas bien conocidas para el clonado de material genético.
La presente invención comprende también la
detección de endostatina en fluidos y tejidos corporales con el
objetivo de efectuar el diagnóstico o prognóstico de enfermedades
mediadas por angiogénesis, tales como cáncer. La presente invención
comprende también la detección de lugares de unión de endostatina y
receptores en células y tejidos. La presente invención incluye
también métodos de tratamiento o prevención de enfermedades
angiogénicas y procesos que incluyen, sin que haya sido de
limitación, artritis y tumores por estimulación de la producción de
endostatina y/o por administración de endostatina sustancialmente
purificada, o agonistas o antagonistas de endostatina y/o
antisueros de endostatina o antisueros dirigidos contra antisueros
de endostatina en un paciente. Los métodos de tratamiento
adicionales comprenden la administración de endostatina, fragmentos
de endostatina, antisueros de endostatina o agonistas receptores de
endostatina y antagonistas ligados a agentes citotóxicos. Se debe
comprender que la endostatina puede ser animal o humana por su
origen. La endostatina también puede ser producida sintéticamente
por reacción química o por técnicas recombinantes conjuntamente con
sistemas de expresión. También se puede producir una endostatina
enzimáticamente accionando diferentes moléculas, incluyendo
precursores de endostatina, conteniendo homología de secuencia o
identidad con segmentos de endostatina para generar péptidos que
tienen actividad antiangiogénesis.
La terapia de anticuerpos pasivos utilizando
anticuerpos que específicamente se unen con endostatina se pueden
utilizar para modular los procesos dependientes de endotelio, tales
como reproducción, desarrollo y curación de heridas y reparación de
tejidos. Además, se pueden administrar antisueros dirigidos a las
regiones Fab de anticuerpos de endostatina para bloquear la
capacidad de antisueros de endostatina endógenos en unirse a la
endostatina.
Se preparan anticuerpos específicos para la
endostatina y análogos de la endostatina de acuerdo con técnicas y
protocolos bien conocidos en esta técnica. Los anticuerpos pueden
ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos son utilizados en
formatos de inmunoensayo bien conocidos, tales como inmunoensayos
competitivos y no competitivos, incluyendo ensayo ELISA,
inmunoensayos "sandwich" y radioinmunoensayos (RIAs), para
determinar la presencia o ausencia de inhibidores de proliferación
endotelial de inhibidores de proliferación endotelial de la
presente invención en fluidos corporales. Entre los ejemplos de
fluidos corporales se incluyen, sin que ello sirva de limitación,
sangre, suero, fluido peritoneal, fluido pleural, fluido
cerebroespinal, fluido uterino, saliva, y moco.
Las proteínas, secuencias de acción nucleico y
anticuerpos de la presente invención son útiles para diagnóstico y
tratamiento de enfermedades y desórdenes relacionados con células
endoteliales. Un proceso de células endoteliales especialmente
importantes es la angiogénesis, formación de vasos sanguíneos. Las
enfermedades relacionadas con angiogénesis se pueden diagnosticar y
tratar utilizando las proteínas de inhibición de proliferación de
células endoteliales de la presente invención. Las enfermedades
relacionadas con angiogénesis incluyen, sin que sirva de limitación,
cáncer dependiente de angiogénesis incluyendo, por ejemplo, tumores
sólidos, tumores originados de la sangre, tales como leucemias y
metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas,
neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas
pirogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades
angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética,
retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto
corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis;
Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis de miocardio;
neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones
hemofílicas; angiofibroma; y granulación de heridas. Las proteínas
inhibidoras de proliferación de células endoteliales según la
presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedades de
estimulación anormal o excesiva de las células endoteliales. Estas
enfermedades incluyen, sin que ello sirva de limitación,
adherencias intestinales, aterosclerosis, escleroderma, y heridas
hipertróficas, es decir, queloides. Son también útiles en el
tratamiento de enfermedades que tienen angiogénesis como
consecuencia patológica, tales como la enfermedad de arañazos de
gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helobacter
pylori).
Las proteínas inhibidoras de proliferación
celular endotelial pueden ser utilizadas como agente de control de
natalidad al reducir o impedir la vascularización uterina requerida
para la implantación del embrión. Por lo tanto, la presente
invención da a conocer un método efectivo de control de natalidad
cuando se administra a una hembra una cantidad de la proteína
inhibitoria suficiente para impedir la implantación del embrión.
Según un aspecto del método de control de natalidad, una cantidad
de proteína inhibidora, suficiente para bloquear la implantación
del embrión, es administrada antes o después de que haya tenido
lugar el coito y fertilización, proporcionando de esta manera un
método eficaz de control de natalidad, posiblemente un método del
"día después". Si bien no se desea quedar limitado por esta
afirmación, se cree que la inhibición de la vascularización del
endometrio uterino interfiere con la implantación del blastocito.
Una inhibición similar de vascularización de la mucosa del tubo
uterino interfiere con la implantación del blastocito, impidiendo
que ocurra una gravidez tubal. Los métodos de administración pueden
comprender, sin que constituya limitación, pastillas, inyecciones
(intravenosa, subcutáneas, intramuscular), supositorios, esponjas
vaginales, tampones vaginales, y dispositivos intrauterinos. Se
cree también que la administración de endostatina interferirá con la
vascularización incrementada normal de la placenta y asimismo con
el desarrollo de vasos con un blastocito implantado
satisfactoriamente y con el desarrollo del embrión y el feto.
Inversamente, el bloque de receptores de
endostatina con análogos de endostatina que actúan como
antagonistas receptores puede ayudar a la endotelialización y a la
vascularización. Estos efectos pueden ser deseables en situaciones
de vascularización no adecuada del endometrio uterino e infertilidad
asociada, reparación de heridas, curación de corte e incisiones,
tratamiento de problemas vasculares en diabéticos, especialmente en
vasos de la retina y periféricos, ayuda a la vascularización en
tejidos transplantados, incluyendo músculos y piel, ayuda de
vascularización de músculo cardíaco especialmente después de
transplante de corazón o tejidos cardíacos y después de cirugía por
bypass, ayuda de vascularización de tumores sólidos relativamente
avasculares para aumentar el suministro de citotoxina, y aumento
del flujo sanguíneo al sistema nervioso incluyendo, sin que sirva
de limitación, el cortex cerebral y médula espinal.
Un descubrimiento sorprendente es que la
endostatina recombinante no replegada y no soluble es también un
potente compuesto anti-angiogénesis que sirve como
depósito para liberación mantenida cuando se administra a un
paciente.
La presente invención se refiere también a
métodos de utilización de endostatina, y fragmentos de péptidos de
endostatina inhibidores de la proliferación de células
endoteliales, secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a la
endostatina y fragmentos de péptidos activos de los mismos, así
como anticuerpos que aseguran específicamente a la endostatina y sus
péptidos, para diagnositcar enfermedades y desórdenes relacionados
con células endoteliales.
La presente invención comprende además un método
para la identificación de receptores específicos de endostatina y
las moléculas receptoras identificadas y aisladas de este
modo.
La presente invención da a conocer también un
método para la cuantificación de receptores de endostatina.
Un aspecto especialmente importante de la
presente invención es el descubrimiento de un método nuevo y
efectivo para tratar y curar cáncer dependiente de angiogénesis en
pacientes. Se ha descubierto de manera inesperada que la
co-administración de endostatina y de angiostatina
en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento tumoral y
para provocar una regresión mantenida de la masa tumoral a
dimensiones microscópicas, cura un cáncer dependiente de
angiogénesis. De acuerdo con ello, la presente invención incluye
también formulaciones efectivas por el tratamiento o curación de
cánceres y tumores dependientes de angiogénesis.
Más particularmente, la endostatina de ratón
recombinante, procedente de células de insectos o E. coli,
inhibe de manera potente la angiogénesis y el crecimiento de
metástasis y de tumores primarios. En un nuevo método de liberación
mantenida, la endostatina recombinante derivada de E. coli
fue administrada como suspensión no replegada en una cantidad
suficiente para inhibir la angiogénesis inhibiendo, por lo tanto,
el crecimiento tumoral. La masa tumoral fue reducida cuando se
administró endostatina recombinante en una cantidad suficiente para
provocar la regresión del tumor. Tumores primarios de
1-2% del peso corporal se redujeron en proporciones
que llegaban a 150 veces pasando a ser lesiones microscópicas
durmientes una vez tratadas por endostatina. Los análisis
inmunohistoquímicos de los tumores durmientes han revelado
angiogénesis bloqueada acompañada por alta proliferación de células
tumorales equilibrada por una elevada tasa de apóptosis de células
tumorales. No hay pruebas de toxicidad en ninguno de los ratones
tratados con endostatina.
Se prevé como parte de la presente invención que
la endostatina puede ser aislada de un fluido corporal, tal como
sangre u orina de pacientes o bien que la endostatina puede ser
producida por métodos de ADN recombinante o métodos químicos de
péptido sintéticos bien conocidos por los técnicos en la materia.
Los métodos de purificación de proteínas son bien conocidos en esta
técnica, y un ejemplo específico de un método para la purificación
de endostatina y de ensayar la actividad inhibitoria se ha indicado
en los ejemplos siguientes. El aislamiento de la endostatina
endógena humana se consigue utilizando técnicas similares.
Un ejemplo de un método de producción de
endostatina utilizando técnicas de ADN recombinante comporta las
etapas (1) identificar y purificar una endostatina, tal como se ha
indicado anteriormente, y tal como se describirá de manera más
completa más adelante, (2) determinar la secuencia de aminoácidos N-
terminal del inhibidor purificado, (3) generar sintéticamente una
sonda de oligonucleótico de ADN que corresponde a la secuencia de
aminoácidos en el terminal N, (4) generar un banco de genes de ADN
procedentes de ADN humano o de otros mamíferos, (5) sondar el banco
de genes con una sonda de oligonucleótidos de ADN, (6) seleccionar
clones que hibridizan al oligonucleótido, (7) aislar el gen
inhibidor del clon, (8) insertar el gen en un vector apropiado, tal
como un vector de expresión, (9) insertar el vector que contiene el
gen en un microorganismo u otro sistema de expresión capaz de
expresar el gen inhibidor, y (10) aislar el inhibidor producido de
forma recombinante. Las técnicas anteriores se describen de manera
más completa en manuales de laboratorio, tales como "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición, de Sambrook y
otros, Cold Spring Harbor Press, 1989.
El gen para endostatina también puede ser aislado
a partir de células o tejidos (tales como células tumorales) que
expresan elevados niveles de endostatina por medio de (1) aislar el
ARN mensajero con respecto al tejido, (2) utilizar transcriptasa
inversa para generar la secuencia de ADN correspondiente y a
continuación (3) utilizar PCR con los cebadores apropiados para
amplificar la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de
aminoácido de endostatina activa.
Otro método para la producción de endostatina o
fragmentos biológicamente activos de la misma es por síntesis de
péptido. Una vez que se ha hallado un fragmento biológicamente
activo de una endostatina utilizando el sistema de ensayo descrito
de manera más completa más adelante, se puede secuenciar, por
ejemplo, por métodos de secuenciado de péptidos automatizados. De
manera alternativa, una vez que el gen o secuencia de ADN que
codifica para endostatina es aislado, por ejemplo, por los métodos
descritos anteriormente, la secuencia de ADN puede ser determinada
proporcionando a su vez información con respecto a la secuencia de
aminoácido. Por lo tanto, si el fragmento biológicamente activo es
generado por métodos específicos, tales como digestos trípticos, o
si el fragmento es secuenciado en el terminal N, la secuencia de
aminoácidos restante se puede determinar a partir de la secuencia de
ADN correspondiente.
Una vez conocida la secuencia de aminoácido del
péptido, por ejemplo, los 20 aminoácidos del terminal N, el
fragmento puede ser sintetizado por técnicas bien conocidas en este
sector, por ejemplo, las que se indican en la obra "Solid Phase
Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R.C.
Sheppard, IRL Press, Oxford, Inglaterra. De modo similar, múltiples
fragmentos pueden ser sintetizados, los cuales a continuación son
enlazados entre sí para formar fragmentos más grandes. Estos
fragmentos de péptidos sintéticos pueden ser también preparados con
sustituciones de aminoácidos en lugares específicos a efectos de
probar la actividad agonística y antagonística in vitro y
in vivo. Se pueden utilizar fragmentos de péptidos que poseen
elevada afinidad de unión a tejidos, para aislar el receptor de
endostatina o las columnas de afinidad. El aislamiento y
purificación del receptor de endostatina es una fase fundamental
para determinar el mecanismos de acción de la endostatina. Esto
facilita el desarrollo de medicamentos para madurar la actividad
del receptor de endostatina, la ruta final para la actividad
biológica. El aislamiento del receptor posibilita la construcción de
sondas nucleótidas para controlar la localización y síntesis del
receptor utilizando tecnología in situ e hibridación en
solución.
La endostatina es efectiva en el tratamiento de
enfermedades o procesos mediados por angiogénesis o que comportan
angiogénesis. La presente invención comprende el método de
tratamiento de una enfermedad mediada por angiogénesis con una
cantidad efectiva de endostatina o agonistas y antagonistas de
endostatina. Las enfermedades mediadas por angiogénesis incluyen,
sin que ello sirva de limitación, tumores sólidos; tumores
originados en la sangre, tales como leucemias; metástasis tumoral;
tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos,
neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; artritis
reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por
ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez,
degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma
neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de
Osler-Webber; angiogénesis de miocardio;
neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones
hemofílicas; angiofibromas; y granulación de heridas. La endostatina
es útil en el tratamiento de enfermedades de estimulación excesiva
o anormal de las células endoteliales. Estas enfermedades incluyen,
sin que ello sirva de limitación, adherencias intestinales,
aterosclerosis, escleroderma y cicatrices hipertróficas, es decir,
queloides. La endostatina puede ser utilizada como agente de
control de natalidad al impedir la vascularización requerida para la
implantación del blastocisto y para desarrollo de la placenta, el
blastocisto, el embrión y el feto.
Los fragmentos de péptido sintético de
endostatina tienen una amplia variedad de utilizaciones. El péptido
que se une al receptor de endostatina con alta especificidad y
avidez es radioetiquetado y utilizado para visualización y
cuantificación de lugares de unión, utilizando técnicas
autorradiográficas y de unión de membrana. Esta aplicación
proporciona importantes herramientas de diagnóstico y de
investigación. El conocimiento de las propiedades de unión del
receptor de endostatina facilita la investigación del mecanismo de
transducción asociado al receptor.
Además, el etiquetado de estos péptidos con
isótopos de corto periodo de vida posibilita la visualización de
lugares de unión de receptor in vivo utilizando tomografía
de emisión de positrón u otras técnicas radiográficas modernas a
efectos de localizar tumores con lugares de unión de
endostatina.
La sustitución sistemática de aminoácidos dentro
de estos péptidos sintetizados da lugar a agonistas de péptidos de
alta afinidad y antagonistas al receptor de endostatina que
aumentan o disminuyen la unión de la endostatina a su receptor.
Estos agonistas son utilizados para suprimir el crecimiento de
micrometástasis, limitando de esta manera la extensión del cáncer.
Los antagonistas de la endostatina son aplicados en situaciones de
vascularización inadecuada para bloquear los efectos inhibitorios de
la angiostatina y posiblemente promover angiogénesis. Este
tratamiento puede tener efectos terapéuticos para ayudar al curado
de heridas en diabéticos.
Los péptidos de endostatina son utilizados para
desarrollar columnas de afinidad para aislamiento del receptor de
endostatina a partir de células tumorales cultivadas. El
aislamiento y purificación del receptor de endostatina es seguido
de secuenciado de aminoácidos. A continuación, se desarrollan sondas
de nucleótidos para inserción en vectores para expresión del
receptor. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la
materia. La transfección del receptor de endostatina en células
tumorales aumenta la capacidad de respuesta de estas células a
endostatina endógena o exógena, disminuyendo de esta manera la
velocidad de crecimiento metastático. Los agentes citotóxicos, tales
como ricina, están ligados a la endostatina y fragmentos de
péptidos de endostatina de alta afinidad, proporcionando de esta
manera una herramienta para la destrucción de células que unen la
endostatina. Estas células pueden ser halladas en muchas
localizaciones incluyendo, sin que ello sea limitativo,
micrometástasis y tumores primarios. Los péptidos ligados a agentes
citotóxicos son infundidos de una manera diseñada para hacer máximo
el suministro al lugar deseado. Por ejemplo, fragmentos de
endostatina de alta afinidad relacionados con ricina son
facilitados a través de una cánula a vasos que alimentan el lugar
objetivo o directamente al objetivo. Estos agentes son también
suministrados de manera controlada a través de bombas osmóticas
acopladas a cánulas de infusión. Una combinación de antagonistas de
endostatina puede ser co-aplicada con estimuladores
de angiogénesis para incrementar la vascularización de tejidos.
Este régimen terapéutico proporciona medios efectivos de
destrucción de cáncer metastático.
De acuerdo con la presente invención, la
endostatina puede ser utilizada en combinación con otros compuestos
y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo,
un tumor puede ser tratado de manera convencional por cirugía,
radiación o quimioterapia combinado con endostatina y entonces la
endostatina puede ser administrada subsiguientemente al paciente
para extender el carácter durmiente de las micrometástasis y para
estabilizar cualesquiera tumores primarios residuales.
La endostatina de la presente invención puede ser
también utilizada para generar anticuerpos específicos para el
inhibidor. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o
anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos, que específicamente se
unen a la endostatina, pueden ser utilizados en métodos y equipos
de diagnóstico, bien conocidos por los expertos en la materia, para
detectar o cuantificar la endostatina en un fluido o tejido
corporal. Los resultados de estas pruebas se pueden utilizar para el
diagnóstico o para predecir la existencia o recurrencia de cáncer u
otras enfermedades mediadas por angiogénesis.
La endostatina puede ser utilizada también en un
método de diagnóstico y en un equipo de detección para cuantificar
los anticuerpos capaces de unión con la endostatina. Estos equipos
permitirían la detección de anticuerpos de endostatina circulantes
que indican la extensión de micrometástasis en presencia de la
endostatina segregada por tumores primarios in situ. Los
pacientes que tienen estos anticuerpos circulantes antiendostatina,
pueden tener mayores probabilidades de desarrollar tumores y
cánceres, y pueden tener más probabilidades de recurrencia de cáncer
después de tratamiento o periodos de remisión. Los fragmentos Fab
de estos anticuerpos antiendostatina pueden ser utilizados como
antígenos para generar antisueros de fragmentos Fab antiendostatina
que se pueden utilizar para neutralizar la eliminación de
endostatina circulante por anticuerpos antiendostatina.
Otro aspecto de la presente invención es un
método para el bloqueo de la acción de endostatina endógena en
exceso. Esto se puede realizar al inmunizar pasivamente un humano o
animal con anticuerpos específicos para la endostatina no deseada
en el sistema. Este tratamiento puede ser importante en el
tratamiento de ovulación, menstruación y placentación anormales, y
vasculogénesis. Esto proporciona una herramienta útil para examinar
los efectos de la eliminación de la endostatina en procesos
metastáticos. El fragmento Fab de anticuerpos de endostatina
contiene el lugar de unión para endostatina. Este fragmento es
aislado a partir de anticuerpos de endostatina utilizando técnicas
conocidas por los expertos en la materia. Los fragmentos Fab de
antisueros de endostatina son utilizados como antígenos para
generar la producción de suero de fragmento
anti-Fab. La infusión de este antisuero contra los
fragmentos Fab de endostatina impide que la endostatina se una a
anticuerpos de endostatina. Las ventajas terapéuticas se obtienen al
neutralizar anticuerpos endógenos antiendostatina bloqueando la
unión de la endostatina a los fragmentos Fab de
anti-endostatina. El efecto neto de este
tratamiento consiste en facilitar la capacidad de endostatina de
circulación endógena para alcanzar las células objetivo,
disminuyendo de esta manera la extensión de la metástasis.
Se debe comprender que la presente invención se
prevé para incluir cualesquiera derivados de la endostatina que
tengan actividad inhibitoria endotelial. La presente invención
comprende la proteína de endostatina completa, derivados de la
proteína de endostatina y fragmentos biológicamente activos de la
proteína de endostatina. Éstos incluyen proteínas con actividad de
endostatina que tienen substituciones de aminoácidos o que tienen
azúcares u otras moléculas fijadas a grupos funcionales
aminoácidos. La presente invención incluye también genes que
codifican para endostatina y el receptor de endostatina, y
proteínas que son expresadas por estos genes.
Las proteínas y fragmentos de proteínas con la
actividad de endostatina descrita anteriormente se pueden disponer
en forma de proteínas aisladas y substancialmente purificadas y
fragmentos de proteínas en formulaciones farmacéuticamente
aceptables utilizando métodos de formulación conocidos por los
expertos ordinarios en la materia. Estas formulaciones pueden ser
administradas por rutas estándar. En general, las combinaciones se
pueden administrar por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal,
intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal,
intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa,
intraespinal, subcutánea o intramuscular). Además, la endostatina
puede ser incorporada en polímeros biodegradables que permiten una
liberación mantenida del compuesto, implantándose los polímeros en
las proximidades del lugar en que se desea el suministro del
medicamento, por ejemplo, en el lugar del tumor o implantado de
manera que la endostatina se libere lentamente de forma sistémica.
También se pueden utilizar minibombas osmóticas para proporcionar
el suministro controlado de altas concentraciones de endostatina a
través de cánulas al lugar de interés, por ejemplo, directamente en
un crecimiento metastásico o en el suministro vascular a dicho
tumor. Los polímero biodegradables y su utilización se describen,
por ejemplo, en detalle en la obra Brem y otros, J.
Neurosurg. 74:441-446 (1991), que se incorpora
por completo a la descripción actual como referencia.
La dosificación de la endostatina de la presente
invención dependerá del estado de la enfermedad que se trata y
otros factores clínicos tales como peso y estado del humano o
animal y la ruta de administración del compuesto. Para el
tratamiento de humanos o animales, se pueden administrar
aproximadamente desde 0,5 mg/kilogramo a 500 mg/kilogramo de
endostatina. Una gama más preferible es de 1 mg/kilogramo a 100
mg/kilogramo, siendo la gama más preferente de 2 mg/kilogramo a 50
mg/kilogramo. Dependiendo de la vida media de la endostatina en el
animal o humano específico, la endostatina puede ser administrada
entre varias veces al día hasta una vez a la semana. Se comprenderá
que la presente invención tiene aplicación para utilización humana y
veterinaria. Los métodos de la presente invención prevén
administraciones simples y múltiples, facilitadas de manera
simultánea o a lo largo de un período prolongado de tiempo.
Las formulaciones de endostatina incluyen las que
son apropiadas para administración oral, rectal, oftálmica
(incluyendo intravítrea o intracameral), nasal, tópica (incluyendo
bucal y sublingual), intrauterina, vaginal o parenteral (incluyendo
subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa,
intradermal, intracraneal, intratraqueal y epidural). Las
formulaciones de endostatina pueden ser presentadas de manera
conveniente en dosis unitarias y pueden ser preparadas por técnicas
farmacéuticas convencionales. Estas técnicas incluyen la etapa de
llevar a establecer una asociación entre el ingrediente activo y el
soporte o soportes farmacéuticos o bien excipientes. En general,
las formulaciones son preparadas al asociar de manera íntima y
uniforme el ingrediente activo con los portadores líquidos o
portadores sólidos finamente divididos o ambos y, a continuación, en
caso necesario, conformar el producto.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral comprenden soluciones de inyección estéril acuosa y no
acuosa que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con
la sangre del receptor de destino, y suspensiones estériles acuosas
y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes
espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en contenedores
de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y
viales herméticos, y se pueden almacenar en situación de
liofilización, requiriendo solamente la adición del portador líquido
estéril, por ejemplo, agua para las inyecciones, inmediatamente
antes de la utilización. Se pueden preparar soluciones de inyección
extemporáneas y suspensiones a partir de polvos estériles, gránulos
y tabletas del tipo anteriormente descrito.
Las formulaciones de dosificación unitaria
preferente son las que contienen una dosis o unidad diaria,
subdosis diaria, tal como se ha indicado anteriormente, o una
fracción apropiada de las mismas, del ingrediente administrado. Se
debe comprender que además de los ingredientes particularmente
mencionados, las formulaciones de la presente invención pueden
incluir otros agentes convencionales en esta técnica con respecto
al tipo de formulación en cuestión.
Diferentes fragmentos de péptidos de la molécula
de endostatina intacta pueden ser sintetizados para su utilización
en varias aplicaciones que incluyen, sin que ello sirva de
limitación, las siguientes: antígenos para el desarrollo de
antisueros específicos, como agonistas y antagonistas activos en
lugares de unión de endostatina, como péptidos a enlazar a agentes
citotóxicos para la exterminación dirigida de células que se unen a
la endostatina. Las secuencias de aminoácidos que comprenden estos
péptidos son seleccionadas en base a su posición en las regiones
exteriores de la molécula y son accesibles para la unión a
antisueros. Los términos amino y carbóxilo de la endostatina, así
como la región media de la molécula, son representados de manera
separada entre los fragmentos a sintetizar. El término amino distal
con respecto al aminoácido 20 y términos carbóxilo de endostatina
pueden contener residuos de tirosina y lisina o se pueden modificar
para que los contengan, y son marcados con muchas técnicas. Se
añade una tirosina o lisina a fragmentos que no tienen estos
residuos para facilitar el marcado de grupos reactivos amino e
hidróxilo en el péptido. Estas secuencias de péptidos son
comparadas a secuencias conocidas utilizando bancos de datos de
secuencia para determinar homologías de secuencias potenciales.
Esta información facilita la eliminación de secuencias que muestran
un elevado grado de homología de secuencia a otras moléculas,
aumentando así el potencial para alta especificidad en el desarrollo
de antisueros, agonistas y antagonistas de la endostatina.
Se pueden sintetizar péptidos en una instalación
microquímica estándar y la pureza puede ser comprobada con HPLC y
espectrofotometría de masas. Los métodos de síntesis de péptidos,
purificación HPLC y espectrofotometría de masas son conocidos
habitualmente por los expertos en esta materia.
Los péptidos y la endostatina son producidos
también en E. Coli recombinante, tal como se describe más
adelante, o en sistemas de expresión de insectos o de levadura, y
purificados por cromatografía de columna.
La endostatina y los péptidos derivados de
endostatina se pueden acoplar a otras moléculas utilizando métodos
estándar. El término amino distal con respecto al aminoácido 20 y
el término carbóxilo de endostatina pueden contener residuos de
tirosina y lisina y son marcados isotópicamente y no isotópicamente
por muchas técnicas, por ejemplo, radiomarcado utilizando técnicas
convencionales (residuos de tirosina-clonamina T,
yodógeno, lactoperoxidasa; residuos de
lisina-reactivo de Bolton-Hunter).
Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por los técnicos
en la materia. La técnica de acoplamiento es escogida en base a los
grupos funcionales disponibles en los aminoácidos incluyendo, sin
que sirva de limitación, amino, sulfidral, carbóxilo, amida, fenol
e imidazol. Varios reactivos utilizados para conseguir estos
acoplamientos incluyen entre otros, glutaraldehído, bencidina
diinitrada, carbodiimida, y p-benzoquinona.
Los péptidos de endostatina están acoplados
químicamente a isótopos, encimas, proteínas portadoras, agentes
citotóxicos, moléculas fluorescentes y otros compuestos para una
serie de aplicaciones. La eficacia de la reacción de acoplamiento
es determinada utilizando diferentes técnicas apropiadas para la
reacción específica. Por ejemplo, radiomarcado de un péptido de
endostatina o proteína con ^{125}I se consigue utilizando
cloramina T y Na^{125}I de alta actividad específica. La reacción
termina con metabisulfito sódico y la mezcla es desalada sobre
columnas eliminables. El péptido marcado es eluído de la columna y
se recogen fracciones. Se retiran partes alícuotas de cada fracción
y se miden por radioactividad en un contador gamma. De esta manera,
el Na^{125}I sin reaccionar es separado del péptido de endostatina
marcada. Las fracciones de péptido con la radioactividad específica
más elevada son almacenadas para utilización subsiguiente, tales
como análisis de la capacidad de unión a antisueros de
endostatina.
Otra aplicación de la conjugación de péptidos es
para la producción de antisueros policlonales. Por ejemplo, los
péptidos de endostatina que contienen residuos de lisina son
ligados a albúmina de suero bovino purificado, utilizando
glutaraldehído. La eficacia de la reacción es determinada midiendo
la incorporación de péptido radiomarcado. El glutaraldehído sin
reaccionar y el péptido son separados por diálisis. El conjugado es
almacenado para utilización subsiguiente.
Se puede generar antisuero contra endostatina.
Después de síntesis del péptido y su purificación se forman
antisueros monoclonal y policlonal utilizando técnicas establecidas
conocidas por los técnicos en la materia. Por ejemplo, se pueden
formar antisueros policlonales en conejos, ovejas, cabras y otros
animales. Los péptidos de endostatina conjugados a una molécula
portadora tal como albúmina de suero bovino o la propia
endostatina, se combinan con una mezcla coadyuvante, emulsificada e
inyectada por vía subcutánea en múltiples lugares en la espalda,
cuello, flancos, y algunas veces en las plantas de los pies. Se
realizan inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, por
ejemplo, de 2 a 4 semanas. Se obtienen muestras de sangre por
venipuntura, por ejemplo, utilizando las venas marginales de la
oreja después de dilatación, aproximadamente de 7 a 10 días después
de cada inyección. Las muestras de sangre son coaguladas durante
una noche a 4ºC y centrifugadas aproximadamente a 2400 X g a 4ºC
durante aproximadamente 30 minutos. El suero es retirado,
fraccionado en partes alícuotas y almacenado a 4ºC para su
utilización inmediata a una temperatura de -20 a -90ºC para
análisis subsiguiente.
Todas las muestras de suero, desde la generación
de antisueros policlonales, o muestras de medios de la producción
de antisueros monoclonales, son analizadas para la determinación de
la concentración. La concentración o título se establece por varios
métodos, por ejemplo, utilizando análisis "dot blots" y
análisis de densidad, y asimismo, con precipitación de complejos de
péptido radiomarcado-anticuerpo utilizando proteína
A, antisueros secundarios, etanol frío o carbón
activado-dextrano, seguido de medición de actividad
con un contador gamma. Los antisueros de concentración más elevada
son purificados también sobre columnas de afinidad que se tienen a
disposición comercialmente. Los péptidos de la endostatina son
acoplados al gel en la columna de afinidad. Las muestras de
antisuero se hacen pasar por la columna y los anticuerpos
antiendostatina permanecen unidos a la columna. Estos anticuerpos
son eluídos posteriormente, recogidos y evaluados para
determinación de titulación y especificidad.
Los antisueros de endostatina de titulación más
elevada son comprobados para establecer lo siguiente: a) dilución
antisuero óptima para unión específica más elevada del antígeno y
menor unión no específica más baja, b) capacidad de unir cantidades
crecientes de péptido de endostatina en una curva de desplazamiento
estándar, c) reactividad cruzada potencial con péptidos
relacionados y proteínas, incluyendo especies relacionadas con
endostatina, d) capacidad de detectar péptidos de endostatina en
extractos de plasma, orina, tejidos y en medios de cultivo de
células.
También se prevén equipos para la medición de la
endostatina como parte de la presente invención. Antisueros que
poseen la concentración y especificidad más elevadas y que pueden
detectar péptidos de endostatina en extractos de plasma, orina,
tejidos y en medio de cultivo celular, son examinados
adicionalemente para establecer equipos de utilización rápida para
medición rápida, fiable sensible y específica, y localización de la
angiostatina. Estos equipos de ensayo comprenden, sin que ello sirva
de limitación, las siguientes técnicas: ensayos competitivos y no
competitivos, radioinmunoensayos, bioluminiscencia y
quimioluminiscencia, ensayos fluorométricos, ensayos sandwich,
ensayos inmunoradiométricos, "dot blots", ensayos de encimas
ligadas incluyendo ELISA, placas de microtitulación, tiras con
recubrimiento de anticuerpos o varillas para control rápido de orina
o sangre, así como inmunocitoquímica. Para cada dispositivo, la
gama o rango, sensibilidad, precisión, fiabilidad, especificidad y
capacidad de reproducción del ensayo quedan establecidos. Las
variaciones dentro del ensayo y entre ensayos se establecen en los
puntos de 20%, 50% y 80% en las curvas estándar de desplazamiento o
de actividad.
Un ejemplo de un equipo de ensayo habitualmente
utilizado en investigación y en ensayos clínicos es un equipo de
radioinmunoensayo (RIA). Se muestra a continuación un RIA de
endostatina. Después de la radioyodación y purificación sucesivas
de endostatina o de un péptido de endostatina, el antisuero que
posee la mayor concentración se añade a varias diluciones a tubos
que contienen una cantidad relativamente constante de
radioactividad, tal como 10.000 cpm, en un sistema tampón adecuado.
Otros tubos contienen tampón o suero preinmune para determinar la
unión no específica. Después de incubación a 4C durante 24 horas,
la proteína A es añadida y los tubos son sometidos a torbellino,
incubados a temperatura ambiente durante 90 minutos y centrifugados
aproximadamente a 2000-2500 Xg a 4C para precipitar
los complejos de anticuerpo unido al antígeno marcado. El
sobrenadante es eliminado por aspiración y la radioactividad de las
pastillas es contada en un contador de rayos gamma. La dilución
antisuero que se une aproximadamente 10 a 40% del péptido marcado
después de sustracción de la unión no específica se caracteriza
adicionalmente.
A continuación, una gama de dilución
(aproximadamente 0,1 pg a 10ng) del péptido de endostatina
utilizado para desarrollo del antisuero es evaluada por adición de
cantidades conocidas del péptido a los tubos que contienen péptido
radiomarcado y antisuero. Después de un periodo de incubación
adicional, por ejemplo de 24 a 48 horas, se añade proteína A y los
tubos son centrifugados, el sobrenadante es retirado y la
radioactividad de las pastillas es objeto de contaje. El
desplazamiento de la unión de péptido de endostatina radiomarcada
por el péptido de endostatina sin marcar (estándar) proporciona una
curva estándar. Varias concentraciones de otros fragmentos de
péptido de endostatina, plasminógeno, endostatina de diferentes
especies y péptidos homólogos se añaden a los tubos de ensayo para
caracterizar la especificidad del antisuero de endostatina.
Extractos de varios tejidos incluyendo, sin que
sirva de limitación, tumores primarios y secundarios, carcinoma de
pulmón de Lewis, cultivos de células que producen endostatina,
placenta, útero y otros tejidos tales como cerebro, hígado e
intestinos, son preparados utilizando técnicas de extracción que
han sido utilizadas satisfactoriamente para extracción de
endostatina. Después de liofilización o Speed Vac de los extractos
de tejidos, se añade un tampón de ensayo y diferentes cantidades
alícuotas se sitúan en tubos RIA. Los extractos de células
conocidas que producen endostatina producen curvas de
desplazamiento que son paralelas a la curva estándar, mientras que
los extractos de tejidos que no producen endostatina no desplazan
la endostatina radiomarcada con respecto al antisuero de
endostatina. Además, se añaden extractos de orina, plasma y fluido
cerebroespinal de animales con carcinoma de pulmón de Lewis a los
tubos de ensayo en cantidades crecientes. Las curvas de
desplazamiento paralelo indican la utilidad del ensayo de
endostatina para medir la endostatina en tejidos y en fluidos
corporales.
Los extractos de tejidos que contienen
endostatina son caracterizados adicionalmente sometiendo partes
alícuotas a HPLC de fase inversa. Las fracciones eluidas son
recogidas, secadas en Speed Vac, reconstituidas en tampón RIA y
analizadas en el RIA de endostatina. La máxima cantidad de
inmunorreactividad de endostatina es localizada en las fracciones
que corresponden a la posición de elución de la endostatina.
El equipo de ensayo proporciona instrucciones,
antisuero, endostatina o péptido de endostatina y posiblemente
endostatina radiomarcada y/o reactivos para precipitación de
complejos endostatina unida-anticuerpo de
endostatina. El conjunto o equipo es útil para la medición de
endostatina en fluidos y tejidos biológicos extraídos de animales y
humanos con y sin tumores.
Otro equipo es utilizado para localización de
angiostatina en tejidos y células. El equipo de inmunohistoquímica
de endostatina proporciona instrucciones, antisuero de endostatina
y posiblemente suero de bloqueo y antisuero secundario ligado a una
molécula fluorescente tal como fluorosceína de isotiocianato o
algún otro reactivo utilizado para visualizar el antisuero
primario. Las técnicas de inmunohistoquímica son bien conocidas por
los expertos en la materia. Este equipo de inmunohistoquímica de
endostatina permite la localización de la endostatina en secciones
de tejidos y en celdas de cultivo utilizando microscopio óptico y
electrónico. Se utiliza tanto para la investigación como para
objetivos clínicos. Por ejemplo, se efectúa la biopsia de tumores o
su recogida y se cortan secciones de tejidos con un microtomo para
exterminar lugares de producción de endostatina. Esta información es
útil para el diagnóstico y posiblemente para objetivos terapéuticos
en la detección y tratamiento de cáncer.
La invención se ilustrará adicionalmente por
medio de los ejemplos siguientes, que no se tienen que considerar
de modo alguno como limitadores de su alcance. Por el contrario, se
debe comprender claramente que se puede recurrir a otras diferentes
realizaciones, modificaciones y equivalentes de los mismos que,
después de la lectura de la presente descripción, pueden sugerirse a
los expertos en la materia.
Una línea celular de hemangioendotelioma murino,
EOMA (Obeso y otros, 1990), fue evaluada en cuanto a pruebas de
producción de inhibidores de proliferación endotelial. Muchos de
los inhibidores endógenos conocidos de angiogénesis inhiben la
proliferación in vitro de células endoteliales.
Recogida de medio acondicionado: Células de la
línea celular EOMA de hemangioendotelioma murino fueron mantenidas
en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino (BCS) y 1% de
glutamina-penicilina-estreptomicina
(GPS) en un incubador a 37ºC y 10% de CO_{2}. Los medios
acondicionados procedentes de células EOMA (es decir, medios de
cultivo utilizados para el crecimiento de células EOMA) fueron
aplicados a células endoteliales capilares bovinas, estimuladas con
bFGF, en un ensayo de proliferación de 72 horas. Los medios
acondicionados inhibieron de manera reversible la proliferación de
células endoteliales capilares en comparación con los controles. El
modelo de inhibición era coherente con la presencia de actividad
inhibitoria y estimuladora de la proliferación de células
endoteliales (figura 1).
Para determinar si el inhibidor de la
proliferación de células endoteliales capilares producida por
células EOMA era la angiostatina, se aplicaron medios
acondicionados y acumulados a una columna de lisina (lisina
conjugada con perlas de cromatografía Sepharose^{TM}). La Sefarosa
de lisina une la angiostatina y ha sido utilizada para su
purificación (O'Reilly y otros, 1996). La actividad inhibitoria de
células endoteliales se observó solamente en la fracción de flujo
pasante y no en la fracción unida (no se muestran datos). La falta
de unión de la actividad inhibitoria a sefarosa de lisina sugirió
que el nuevo inhibidor de la proliferación de células endoteliales
no era la angiostatina.
Dado que varios inhibidores de angiogénesis
tienen afinidad para la heparina, los inventores aplicaron el flujo
pasante procedente de la columna de sefarosa de lisina a una
columna de sefarosa de heparina. La heparina unida con actividad
inhibitoria con afinidad relativamente elevada fue eluida con
0,6-0,8 M NaCl en 10 mM Tris pH 7,4, tal como se ha
mostrado en la figura 2. Para purificar adicionalmente la actividad
inhibitoria, la muestra fue concentrada y aplicada a filtración de
gel (gel fino Bio-Rad Bio-Gel
P-100 o Pharmacia Sephacryl S-200HR
gel) en columna (ver figura 3), seguido de varios ciclos de HPLC de
fase inversa con una columna C4. La actividad inhibitoria fue eluida
a partir de la columna C4 con acetonitrilo 40-45%
en 0,1% de ácido trifluoroacético, tal como se indica como ejemplo
en la figura 4. Después de la columna C4 final, la actividad
inhibitoria fue asociada a una proteína de masa molecular de
aproximadamente 20 kDa (reducida) o 18 kDa (no reducida), por
SDS-PAGE, purificada a homogeneidad aparente.
Con respecto a los Ejemplos 2 y 3, se prepararon
sefarosa de lisina, sefarosa de heparina, Gel Sephacryl
S-200 HR (Pharmacia, Uppsala, Suecia), gel de
poliacrilamida fina Bio-Gel P-100
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), y una columna
de fase inversa C4 (SynChropak RP-4 (100 x 4,6
mm)(Synchrom, Inc., Lafayette, IN) de acuerdo con las
recomendaciones de los fabricantes. Se equilibró una columna de
heparina-sefarosa (50 x 2,5 cm) con 50 mM NaCl 10 mM
Tris-HCl pH 7,4. Se aplicó medio acondicionado y
acumulado y la columna fue lavada con el tampón de equilibrado. La
columna fue eluida con un gradiente continuo de 50
mM-2 M NaCl en 10 mM Tris-HCl a pH
7,4 (volumen total 200 ml) seguido de 100 ml de 2 M NaCl en 10 mM
Tris-HCl at pH 7,4. Se recogieron fracciones y se
aplicó una parte alícuota de cada una de ellas a células
endoteliales capilares. Las fracciones que inhibieron su
proliferación fueron dializadas (MWCO = 6.000 - 8.000) contra PBS y
concentradas utilizando un concentrador 4000 MWCO Nanospin (Gelman
Sciences, Ann Arbor, MI)
Una columna Bio-Gel
P-100 o Sephacryl S-200 HR (75 x 1,5
cm) fue equilibrada con PBS. La muestra de cromatografía de
heparina sefarosa fue aplicada y la columna fue llenada con tampón
de equilibrio. Se recogieron fracciones y se aplicó una parte
alícuota de cada una de ellas a células endoteliales. Las
fracciones que inhibieron la proliferación endotelial fueron
concentradas y dializadas tal como se ha indicado anteriormente.
Una columna SynChropak RPG (100 x 4,6 mm) fue
equilibrada con H_{2}O/0,1% ácido trifluoracético (TFA). Se
utilizaron reactivos de calidad HPLC (Pierce, Rockford, IL). La
muestra de cromatografía de filtrado de gel fue aplicada a la
columna y la columna fue llenada con un gradiente de acetonitrilo
en 0,1% TFA a 0,5 ml/minuto y se recogieron fracciones. Se evaporó
una parte alícuota de cada una por centrifugación al vacío, se
resuspendió en PBS, y se aplicó a células endoteliales capilares.
La actividad inhibitoria fue purificada adicionalmente hasta
homogeneidad aparente mediante, como mínimo, dos ciclos
subsiguientes en la columna SynChropak C4.
Para caracterizar adicionalmente el inhibidor de
20 kDa, los inventores lo probaron en varias líneas celulares de
origen endotelial y no endotelial. Para el ensayo de BCE, se
obtuvieron células endoteliales capilares bovinas y se cultivaron
tal como se ha descrito anteriormente (Folkman y otros, 1979). Para
el ensayo de proliferación, las células fueron lavadas con PBS y
dispersadas en una solución al 0,05% de tripsina. Se preparó una
suspensión celular (25.000 células/ml) con DMEM + 10% BCS + 1% GPS,
aplicada sobre placas de cultivo gelatinizadas de 24 pocillos (0,5
mewed) y se incubaron (37ºC, 10% CO_{2}) durante 24 horas. El
medio fue substituido por 0,25 ml de DMEM + 5% BCS + 1% GPS y se
aplicó la muestra de prueba. Después de 20 minutos de incubación,
el medio y el bFGF fueron añadidos para obtener un volumen final de
0,5 ml de DMEM + 5% BCS + 1% GPS + 1 ng/ml bFGF. Después de 72
horas, las células fueron dispersadas en tripsina resuspendida en
Hematall (Fisher Scientific, Pittsbu rgh, PA), y contadas en un
contador Coulter.
Se mantuvieron células de músculos lisos aórticos
bovinos (SMC), epitelio de pigmentos retinales bovinos (RPE),
epitelio de pulmón (MLE), carcinoma de pulmón de Lewis (LLC), y
EOMA así como fibroblastos 3T3 en un incubador con 10% de CO_{2}
y temperatura de 37ºC. Para los ensayos de proliferación, las
células se lavaron con PBS y se dispersaron en una solución de
tripsina al 0,05%. Las condiciones óptimas para los ensayos de
proliferación celular se establecieron para cada tipo de células
distintas. Se utilizó suero fetal de vaca (FCS) para las células
RPE, MLE, y LLC y se utilizó BCS para los otros tipos de células.
Una suspensión celular (20.000 células/ml para SMC, RPE, MLE; 15.000
células/ml para 3T3; 10.000 células/ml para LLC, EOMA) fue
preparada con DMEM + 10% de suero bovino + 1% GPS, aplicado sobre
placas de cultivo de 24 pocillos (0,5 ml/pocillo), y con incubación
(37ºC, 10% CO_{2}) durante 24 horas. El medio fue substituido por
0,5 ml de DMEM + 5% de suero bovino + 1% GPS y se aplicó la muestra
de la prueba. Después de 72 horas, se dispersaron las células en
tripsina, se resuspendieron en Hematall (Fisher Scientific,
Pittsburgh, PA), y se contaron mediante un contador Coulter.
Solamente las células endoteliales se inhibieron
de manera significativa, tal como se muestra en la Tabla 2.
| Inhibidas | No inhibidas |
| Células endoteliales capilares bovinas | Células de músculos lisos aórticos bovinos |
| Células epiteliales de pigmentos retinales bovinos | |
| Fibroblastos 3T3 | |
| Células epiteliales de pulmón de cobaya | |
| Células de hemangioendotelioma EOMA | |
| Células de carinoma de pulmón de Lewis |
La inhibición fue observada en primer lugar para
dosis de 100 ng/ml observando una inhibición máxima para dosis de
600 ng/ml o superiores. No se apreció inhibición significativa para
células de origen no endotelial para dosis de 1 unidad logarítmica
superior a las utilizadas para la inhibición de la proliferación de
células endoteliales capilares (no se muestran datos).
El inhibidor de 20 kDa de proliferación de
células endoteliales capilares del medio acondicionado fue
purificado hasta homogeneidad, tal como se ha descrito en los
ejemplos anteriores, resuelto por SDS-PAGE,
electroaplicado ("electroblotted") sobre PVDF
(Bio-Rad, Richmond, CA), detectado mediante tinción
Ponceau S, y recortado de la membrana. La secuencia N terminal fue
determinada por degradación automatizada Edman sobre un secuenciador
de proteínas PE/ABD Model 470A (Foster City, CA) funcionando con
suministro en fase gaseosa de ácido trifluoracético.
Se llevaron a cabo búsquedas de biblioteca de
secuencias y alineaciones contra GenBank, Brookhaven Protein,
SWISS-PROT combinados, y bases de datos PIR. Las
búsquedas fueron llevadas a cabo en el National Center for
Biotechnology Information a través de la utilización del servicio de
red BLAST.
El análisis de microsecuencia del inhibidor
reveló identidad con un fragmento C terminal de colágeno XVIII. El
clonado molecular y secuencia de colágeno XVIII fue descrito en
primer lugar por Olsen y sus colaboradores y por Rehn y
Pihlajaniemi (Oh y otros., 1994; Rehn and Pihlajaniemi, 1994). El
colágeno XVIII es un nuevo colágeno que consiste en una región N
terminal con 3 variantes de corte y empalme ("splice")
(Muragaki y otros., 1995; Rehn y Pihlajaniemi, 1995), una serie de
dominios similares al colágeno con interrupciones y un dominio C
terminal de 35 kDa no colágeno (NC1). Un análisis de microsecuencia
de terminal N de 18 aminoácidos del inhibidor purificado de
proliferación de células endoteliales confirma que es idéntico a un
fragmento C terminal de este dominio NC1 (figura 5). Los inventores
han designado este fragmento inhibitorio de colágeno XVIII
"endostatina" y está incluido en el grupo de moléculas que
tienen actividad de endostatina.
El inhibidor celular de proliferación endotelial
de la presente invención puede ser expresado de forma recombinante
en cualquier sistema utilizado para expresar proteínas. Ejemplos no
limitadores de dichos sistemas de expresión comprenden sistemas de
expresión bacteriana, sistemas de expresión de levaduras, y
sistemas de expresión vírica de insectos.
La endostatina de ratón recombinante fue
expresada utilizando el sistema de expresión BacPAK baculovirus
(CLONTECH Laboratories) siguiendo el protocolo del fabricante. De
forma breve, un fragmento de cADN que codifica la secuencia de
señal y parte terminal C (región endostatina) del colágeno de ratón
XVIII fue insertado en el vector de transferencia pBacPAK8. A
continuación se cotransfectaron el ADN viral (vector de expresión)
BacPAK6 y el ADN plásmido del clon
pBacPAK8-endostatina (vector de transferencia
modificado), en las células del insecto Sf21 y se recogieron medios
que contenían endostatina de ratón expresada. El BacPAK6 fue
digerido en primer lugar con encima BSU36 para hacerla no
competente para replicación independiente. El medio que contenía la
endostatina de ratón expresada fue aplicado a una columna de
Sefarosa de heparina 1,5 x 40 cm que había sido equilibrada con 50
mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4. La columna fue lavada con el tampón de
equilibrado y a continuación fue eluída de manera secuencial con
0,2M NaCl, 0,4 M NaCl, 0,6 M NaCl y 1 M NaCl en 10 mM Tris Ph 7,4.
Toda la cromatografía fue llevada a cabo a 4ºC. El NaCl 0,6 M
eluyente (que inhibía células endoteliales capilares bovinas en un
ensayo de proliferación de 72 horas) fue dializado
(6-8000 MWCO) contra PBS y a continuación
reaplicado a la columna de Sefarosa de heparina. La columna fue
eluída con un gradiente de 50 mM NaCl-1,2 M NaCl en
10 mM Tris pH 7,4. Se aplicó una parte alícuota de cada fracción a
células endoteliales bovinas capilares, tal como se ha indicado
anteriormente, y se reunieron fracciones que inhibían la
proliferación, se dializaron contra PBS, y se concentraron
utilizando un concentrador centrífugo Nanospin Plus (Gelman
Sciences) (MWCO = 10.000). El análisis SDS-PAGE de
la muestra concentrada mostró una banda discreta de M_{r}
aparente de 20 kDa.
La parte de terminal C del cADN del colágeno
XVIII fue utilizada para amplificar el cADN de endostatina de ratón
que fue clonado en el vector pETKH1 (derivado de pET11d)(Studier y
otros, 1990). La inducción resultó en la producción de una proteína
de fusión que tenía la secuencia de aminoácido
MARRASVGTD(SEQ ID NO:2)(RRAS=secuencia de reconocimiento de
proteína kinasa A) y residuos de histidina 6 en el terminal N
seguido de la secuencia de endostatina de ratón (pTB01#8). El
plásmido pTB01#8 fue transformado en BL21:DE3 y la proteína de
fusión fue purificada sobre perlas de NI^{+2}-NTA
tal como se describe (QiaExpressionist Handbook, Qiagen). De modo
breve, se cultivaron E. coli hasta un O.D._{600} de 0,8 -
0,9 y se indujo la expresión de la proteína de fusión durante 3
horas con 1 mM IPTG. Las bacterias fueron agrupadas en pastillas y
resuspendidas en urea 8 M, 10mM Tris-HCl pH 8,0
conteniendo 10 mM de imidazol y con incubación durante 1 hora a
temperatura ambiente. La suspensión fue centrifugada durante 15
minutos a 20.000 g y el sobrenadante fue incubado con perlas de
Ni^{+2}-NTA durante 1 hora a temperatura ambiente.
La suspensión fue transferida a una columna y lavada con urea 8 M,
0,1 M Na-fosfato, 10 mM Tris-HCl pH
6,25 conteniendo 10 mM de imidazol. La proteína fue eluída con el
mismo tampón, conteniendo 250 mM de imidazol. Las fracciones que
contenían endostatina fueron extensamente dializadas contra PBS.
Durante la diálisis, precipitó la endostatina. La endostatina
precipitada fue resuspendida en PBS, la concentración de proteína
fue ajustada a 2 - 4 mg/ml, y la endostatina fue almacenada a -20ºC
hasta su utilización. Para los estudios con ratones, la endostatina
fue suministrada a una suspensión en PBS. Para el ensayo
corioalantoico de polluelo, se dializó adicionalmente la endostatina
contra agua y a continuación se liofilizó.
Se produjo endostatina de ratón recombinante en
sistemas de expresión de baculovirus y E. coli. Utilizando
cromatografía de Sefarosa de heparina secuencial se purificó
endostatina de ratón recombinante hasta homogeneidad aparente a
partir de un medio de células de insectos. Se utilizó
Ni^{+2}-NTA-agarosa para purificar
la endostatina de ratón derivada de E. coli.
El análisis SDS-PAGE mostró una
banda discreta de aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 22 kDa
(reducida) purificada a homogeneidad aparente para endostatinas
recombinantes derivadas de baculovirus y E. coli,
respectivamente (no se muestran datos). Se dializaron ambas contra
PBS antes de utilización. Después de diálisis, el material del
sistema E. coli precipitó y fue suministrado a una
suspensión para estudios in vivo subsiguientes. La
endostatina recombinante de baculovirus inhibió específicamente la
proliferación de células endoteliales capilares bovinas de forma
dependiente de la dosis. La inhibición fue observada a dosis de 100
ng/ml con inhibición máxima observada a dosis superiores a 600
ng/ml. No se observó inhibición significativa de proliferación de
células de origen no endotelial o de células EOMA, cuando se
comprobó la endostatina a dosis hasta 1 unidad logarítmica superior
a las utilizadas para inhibir la proliferación celular
endotelial.
El material precipitado (no replegado) no era
comprobable in vitro, a causa de su insolubilidad. No
obstante, un pequeño porcentaje era soluble en PBS durante diálisis
y esta fracción fue utilizada para los ensayos celulares
endoteliales. Además, después del replegado, fue soluble e inhibió
la proliferación endotelial (no se muestran datos). Cuando este
material soluble fue aplicado a células endoteliales, se observó
que era inhibitorio en concentraciones comparables a endostatina
nativa y derivada de baculovirus.
Para probar la capacidad de la endostatina de
ratón recombinante en inhibir angiogénesis in vivo, los
inventores utilizaron el ensayo de membrana corioalantoica (CAM) de
polluelo (Folkman, 1985; Nguyen y otros, 1994 que se incorporan a
la descripción actual a título de referencia). Se rompieron huevos
Leghorn blanco fertilizados de tres días (Spafas, Norwich, CT), y se
colocaron embriones con yemas intactas en platillos petri de 100 x
20 mm (Folkman, 1985). Después de 3 días de incubación (37ºC y 3%
CO_{2}), se aplicó un disco de metilcelulosa (Fisher Scientific,
Fair Lawn, N.J.) conteniendo endostatina al CAM de embriones
individuales. Los discos se prepararon por secado de endostatina en
10 \mul de 0,45% metilcelulosa (en H_{2}O) sobre varillas de
teflón. Después de 48 horas de incubación, se observaron embriones y
los CAM por medio un estereomicroscopio.
A dosis de 10-20 \mug/10
\mul, se observó una potente inhibición in vivo de
angiogénesis tanto para endostatinas derivadas de E. coli
como de baculovirus en la totalidad de los CAMs sometidos a prueba
(n=5/grupo). El precipitado de endostatina derivado de E.
coli se disolvió gradualmente a lo largo de 5 días y produjo un
efecto antiangiogénico mantenido sobre las CAM implantadas. Como
contraste, la endostatina soluble derivada de baculovirus se
disolvió en 24 horas y proporcionó un efecto antiangiogénico máximo
dentro de un periodo de 48 horas. No hubo pruebas de toxicidad en
ninguno de los embriones de pollo sometidos a prueba.
Se produjo endostatina humana de forma
recombinante utilizando métodos similares.
Dado que el crecimiento del tumor depende de
angiogénesis, los inventores trataron metástasis de carcinoma de
pulmón de Lewis sistemáticamente con endostatina de ratón
recombinante expresada en el sistema baculovirus. Se sacrificaron
animales con carcinomas de pulmón de Lewis de
600-1200 mm^{3} y se limpió la piel superpuesta
al tumor con betadina y etanol. En una pantalla de flujo laminar se
realizó la excisión de tejidos del tumor en condiciones asépticas.
Se preparó una suspensión de células tumorales en 0,9% de solución
salina normal por paso de tejidos de tumor viables a través de una
criba y una serie de agujas hipodérmicas secuencialmente más
pequeñas con medida de 22 a 30 de diámetro. La concentración final
fue ajustada a 1 x 10^{7} células/ml y la suspensión fue colocada
sobre hielo. Después de limpiar el lugar con etanol, el dorso
subcutáneo de ratones en la línea media próxima recibió la inyección
de 1 x 10^{6} células en 0,1 ml de solución salina.
Cuando los tumores tuvieron una dimensión de 1500
mm^{3}, aproximadamente 14 días después del implante, los ratones
fueron sometidos a la eliminación quirúrgica del tumor. La incisión
fue cerrada por simples suturas interrumpidas. Desde el día de la
operación, los ratones recibieron inyecciones intraperitoniales
diarias de endostatina de ratón recombinante (baculovirus) o
solución salina. Los ratones recibieron 0,3 mg/kg/dia de
endostatina, una vez al día con inyección subcutánea. Cuando los
ratones de control enfermaron de enfermedad metastásica (es decir,
después de 13 días de tratamiento) todos los ratones fueron
sacrificados y sometidos a autopsia. Se contaron metástasis de
superficie pulmonar por medio de estereomicroscopio con 4
aumentos.
El crecimiento de metástasis de carcinoma de
pulmón de Lewis se suprimió casi por completo por la administración
sistémica de endostatina con una dosis de 0,3 mg/kg/dia por via
subcutánea (7 \pm 3 metástasis/ratón, n=4, p < 0,001). Como
contraste, ratones tratados con solución salina después de
eliminación de un tumor primario de carcinoma de pulmón de Lewis, la
metástasis de pulmón creció rápidamente (77 \pm 7
metástasis/ratón). El peso del pulmón, que refleja el peso del
tumor, fue de 240 \pm 25 mg en los ratones tratados con
endostatina con respecto a 760 \pm 30 mg en los ratones de control
(p < 0,001). Además, no se apreció pérdida de peso o prueba de
toxicidad en ninguno de los ratones tratados con endostatina.
El rendimiento de la endostatina del sistema de
baculovirus fue más bajo que el del sistema E. coli, es
decir, 1-2 mg/litro con respecto
30-40 mg/litro. Por lo tanto, los inventores
utilizaron endostatina derivada de E. coli para estudiar el
efecto de la terapia de endostatina sobre el crecimiento de tumores
primarios. Los inventores produjeron endostatina de ratón
recombinante procedente de E coli en cantidad suficiente para tratar
tumores primarios en carcinoma de cáncer de Lewis. La endostatina
fue administrada como suspensión de la proteína purificada
precipitada a ratones con carcinomas de pulmón de Lewis de como
mínimo 100-200 mm^{3}. La proteína fue purificada
por medios convencionales pero no fue replegada antes de su
administración a los ratones. El precipitado inyectado fue
reabsorbido lentamente a lo largo de 24-48
horas.
Los inventores no conocen ningún precedente de la
utilización de un depósito inyectado de proteína recombinante no
replegada como método de liberación mantenida en animales. No
obstante, la endostatina se reabsorbió gradualmente in vivo y
demostró tener una potente actividad antiangiogénica que resultó
en una actividad prolongada anti-tumoral y
anti-angiogénica. Por lo tanto, estos datos
sugieren un nuevo método general para la liberación controlada de
proteínas recombinantes. Basándose en esta idea, los inventores han
suministrado angiostatina recombinante no replegada a partir de
E. coli con éxito similar.
De acuerdo con ello, un aspecto de la invención
consiste en la administración de endostatina recombinante o
análogos de endostatina en un estado no replegado a efectos de
proporcionar un depósito de liberación sostenida de proteína
inhibidora de proliferación de células endoteliales a lo largo de
un período mínimo de 8 horas, de manera deseable un mínimo de 12
horas, de manera más deseable como mínimo 24 horas o como mínimo 48
horas, dependiendo del paciente y de la enfermedad a tratar. La
angiostatina no replegada y opcionalmente recombinante es
administrada para proporcionar de manera similar, un depósito de
liberación sostenida de proteína capaz de liberar proteína de
angiostatina a lo largo de un período mínimo de 8 horas, de manera
deseable como mínimo 12 horas, de manera más deseable como mínimo de
24 horas o como mínimo 48 horas, dependiendo del paciente y de la
enfermedad a tratar.
Se implantaron carcinomas de pulmón de Lewis a
ratones tal como se ha descrito anteriormente. Los tumores fueron
medidos con un medidor de esfera graduada ("dialcaliper") y se
determinaron los volúmenes de tumores utilizando la forma
anchura^{2} x longitud x 0,52, y la proporción del volumen del
tumor tratado con respecto al de control (T/C) fue determinada para
el punto correspondiente al final del tiempo. Después de que el
volumen del tumor fue de 100-200 mm^{3}
(0,5-1% de peso corporal), lo que ocurrió dentro de
un período de 3-7 días, los ratones fueron
distribuidos al azar en dos grupos. Un grupo recibió endostatina de
ratón recombinante (E. coli) en forma de suspensión en PBS
inyectada de forma subcutánea en un lugar alejado del tumor, una vez
al día. El otro grupo recibió inyecciones comparables del vehículo
solamente. Los experimentos fueron terminados y los ratones
sacrificados y sometidos a autopsia cuando el ratón de control
empezó a morir.
El crecimiento de tumores primarios de pulmón de
Lewis fue suprimido de manera potente por la terapia sistémica con
endostatina. Al incrementar la dosis de endostatina fue asociado a
una eficacia mejorada (no se muestran datos). Para una dosis de 10
mg/kg, el crecimiento del tumor quedó inhibido en 97% en
comparación con los ratones de control tratados solamente con el
vehículo. Para una dosis de 20 mg/kg suministrada una vez al día en
dos experimentos separados, hubo una regresión casi completa de los
tumores primarios establecidos (inhibición>99%, p<0,001).
Estos resultados sorprendentes e inesperados son los mostrados en
las figuras 6 y 7.
Las figuras 8, 9, 10 y 11 demuestran la eficacia
de la endostatina de ratón recombinante para inhibir crecimiento de
tumores en una serie de modelos distintos de tumores. También ha
demostrado la efectividad de la endostatina derivada de humanos
para la inhibición de crecimiento de tumores.
El análisis inmunohistoquímico (figura 12) de los
pequeños tumores residuales mostró una potente inhibición de
angiogénesis en los tumores tratados con endostatina. Además, el
índice de proliferación de tumores en los ratones tratados con
endostatina y solución salina se encontraba al mismo nivel en
ambos grupos mientras que el índice apoptótico aumentó 8 veces
después de la terapia con endostatina. La terapia con endostatina
tiene como resultado un modelo similar de atenuación del tumor
("carácter durmiente") al que se ha descrito anteriormente para
la angiostatina (Holmgren y otros, 1995; O'Reilly y otros, 1996).
Además, no hubo pruebas de toxicidad relacionada con el medicamento
en ninguno de los ratones sometidos a tratamiento.
Después de la descontinuación de la terapia de
endostatina, un tumor recurrió en el lugar primario dentro de un
período de 5-14 días, se vascularizó, y
eventualmente provocó la muerte del ratón (datos no mostrados). De
manera notable, los inventores descubrieron que la endostatina de
ratón recombinante derivada de E. coli con un marcado
("tag") de polihistidina en el terminal C, que fue expresada,
purificada y administrada de manera similar al producto etiquetado
N-terminal antes escrito no inhibió la angiogénesis
en el ensayo CAM y no tuvo efecto en el crecimiento de carcinomas
de pulmón de Lewis (datos no mostrados). Estos datos apoyan
fuertemente que la actividad antitumoral y antiangiogénica de la
endostatina recombinante son debidas a la estructura específica de
la endostatina y no a contaminantes en la muestra.
La figura 13 muestra los resultados de un
tratamiento cíclico de carcinoma de pulmón de Lewis con endostatina
de ratón recombinante derivada de E. coli. Estos resultados
muestran claramente regresión reproducible dependiente de
endostatina, de la masa tumoral, seguida de crecimiento del tumor
después de la terminación del tratamiento con endostatina.
Estos resultados muestran que un
hemangioendotelioma murino produce un nuevo y específico inhibidor
de 20 kDa de la proliferación celular endotelial in vitro
que es asimismo un potente inhibidor de angiogénesis y de
crecimiento tumoral in vivo. La secuencia
N-terminal de este inhibidor, endostatina, es
idéntica a un fragmento C-terminal de colágeno
XVIII. La administración sistémica de endostatina recombinante
inhibe de forma potente la angiogénesis, mantiene la metástasis a
dimensiones microscópicas, y provoca la regresión de tumores
primarios a menos de 1 mm^{3}, con reducción de más de 150 veces.
Dado que mientras se efectúa el tratamiento en los ratones no hay
repetición de crecimiento de los tumores, no hay pruebas de
resistencia a los medicamentos ni toxicidad. Es interesante
observar que alguno de los fragmentos del dominio
C-terminal de colágeno tipo XVIII más largos que la
endostatina no inhiben la proliferación celular endotelial (no se
muestran datos).
La endostatina fue descubierta por la misma
estrategia utilizada para descubrir la angiostatina (O'Reilly y
otros, 1994), es decir, aislamiento de un tumor. Si bien es
contra-intuitivo que los tumores deben ser una
fuente de inhibidores de angiogénesis, los resultados indicados
parecen validar este enfoque.
Esto conduce a la pregunta de por qué los
inhibidores de angiogénesis deben encontrarse presentes en tumores
que son angiogénicos. Una posibilidad consiste en que un inhibidor
podría ser "dejado" después de su regulación descendente
("down-regulation") de su producción por una
célula tumoral sometida al cambio de fenotipo angiogénico. Este
parece ser el caso de la trombospondina producida por células
Li-Fraumeni en las que el segundo alelo para p53 es
mutado o deleccionado (Dameron y otros, 1994).
Una segunda posibilidad es que la actividad
proteolítica que acompaña al crecimiento del tumor y que es un
importante componente del crecimiento de vasos sanguíneos
capilares, puede también movilizar inhibidores de angiogénesis
circulantes procedentes de proteínas precursoras que no son
inhibitorias en sí mismas. Por ejemplo, la angiostatina inhibe la
angiogénesis y la proliferación celular endotelial, mientras que el
plasminógeno no lo hace (O'Reilly y otros, 1996; O'Reilly y otros,
1994). Para la endostatina se revela un modelo similar.
La histología de tumores que se reducen por
terapia de endostatina mostró efecto columnar ("cuffing")
perivascular de células tumorales rodeando uno o varios microvasos
en los que la angiogénesis quedó bloqueada. Las células tumorales
mostraron elevada proliferación equilibrada por elevada apoptosis,
sin ganancia neta en dimensiones del tumor. Estos datos son
coherentes con un modelo de nuevo tipo de carácter durmiente del
tumor recientemente propuesto (Holmgren y otros, 1995). Además, la
endostatina inhibió la proliferación de células endoteliales in
vitro, pero no tuvo efecto en células de carcinoma de pulmón de
Lewis o en otros tipos de células incluyendo de músculos lisos,
epitelio, fibroblastos, y línea celular EOMA de las que se
purificó.
El hecho de que un inhibidor específico de
proliferación de células endoteliales pueda reducir un tumor a
dimensiones microscópicas y mantenerlo en estado durmiente, a pesar
del hecho de que las células del tumor son refractarias al
inhibidor desde el inicio, indica que la población endotelial puede
ejercer un fuerte control regulador del crecimiento en las células
tumorales.
Los resultados con la endostatina soportan la
teoría (Folkman, 1996) de que para efectos terapéuticos es
interesante interpretar el tumor en términos de dos poblaciones
celulares distintas: una población celular tumoral y una población
celular endotelial, cada una de las cuales puede estimular el
crecimiento de la otra. El crecimiento de cada una de las
poblaciones celulares puede ser inhibido de manera óptima por
agentes que se dirigen de manera selectiva o específica a dicho
tipo de célula, es decir, quimioterapia citotóxica y terapia
antiangiogénica. Además, el tratamiento combinado de ambas
poblaciones celulares puede ser mejor que el tratamiento individual
de cualquiera de dichos tipos celulares.
Para probar esta teoría, ratones afectados por
carcinoma de pulmón de Lewis, y presentando tumores que habían
llegado a unas dimensiones aproximadas de 300 mm^{3}, fueron
tratados con una terapia de combinación comprendiendo angiostatina
y endostatina, cada una de ellas a una dosis de 20 mg/kg/día
durante 25 días. Los tumores se redujeron a niveles microscópicos
aproximadamente al día 10 de tratamiento. Un descubrimiento
completamente inesperado fue que los tumores permanecían en el
tamaño reducido y en estado durmiente aproximadamente durante tres
meses, incluso después de haber terminado el tratamiento por
completo, tal como se ha mostrado en la figura 14. Experimentos de
duración más prolongada indican que un tratamiento inicial del
tumor con una combinación de angiostatina y endostatina provoca una
atenuación o carácter durmiente muy prolongado, cuyo período real
es desconocido en este momento.
Este carácter durmiente a largo plazo se
considera una curación por los expertos en la materia. Por ejemplo,
la directriz NIH para determinar cuándo un tratamiento es eficaz
como curación del cáncer, es que el tumor permanezca durmiente (es
decir, sin incrementar de tamaño) durante un período que es 10
veces el tiempo en el que normalmente se dobla el tumor. El período
de atenuación o carácter durmiente conseguido utilizando una
combinación de endostatina y angiostatina supera ampliamente este
criterio.
De acuerdo con ello, un importante aspecto de la
invención es un compuesto que comprende una combinación de
angiostatina y endostatina, o un análogo de endostatina, en
cantidades suficientes para provocar un carácter durmiente a largo
plazo o curación de los cánceres dependientes de angiogénesis
cuando se administra a pacientes con cánceres dependientes de
angiogénesis. La administración puede ser sistémica, por ejemplo,
por inyección, en cuyo caso la dosis es determinada dependiendo
del paciente y del cáncer específico, pero que generalmente es como
mínimo de 0,2 mg/kg/día, de manera deseable un mínimo de 2,0
mg/kg/día, y de forma más deseable como mínimo 20 mg/kg/día. En
general, los compuestos son suministrados diariamente como mínimo
durante 10 días, de forma deseable un mínimo de 20 días, de manera
más deseable como mínimo 25 días. Las rutas alternativas de
administración sistémicas incluyen una vía oral en la que el
compuesto se formula, por ejemplo, en forma de microperlas dotadas
de recubrimiento, para proteger la proteína contra ambientes
digestivos inactivantes; vía transdérmica y vía bombeo.
De manera alternativa, se pueden utilizar
diferentes dosis y períodos de tratamiento si el compuesto es
administrado localmente a un lugar dependiente de angiogénesis, tal
como un tumor. Esta administración puede ser, por ejemplo,
implantación quirúrgica o inyección local en el lugar, o cerca del
mismo.
Tanto la endostatina como la angiostatina se
demuestran inhibidores específicos de la proliferación de células
endoteliales. Por lo tanto, es probable que la endostatina se una a
estructuras específicas exclusivamente expresadas sobre la
superficie de las células endoteliales. Los inventores no han
observado la existencia de ningún otro inhibidor específico de la
proliferación celular endotelial.
La identificación y aislamiento de proteínas que
específicamente se unen a la endostatina viene acompañada de
métodos bien conocidos en esta técnica, por ejemplo, por
cromatografía de afinidad y clonado de expresión.
Las células endoteliales capilares bovinas (BCE)
están radioetiquetadas con [35S]-metionina, células
totales y extractos de membrana preparados y aplicados a columnas
de afinidad preparadas con endostatina. Como control negativo se
aíslan extractos de proteínas de fibroblastos de manera similar.
Las proteínas unidas son eluídas a partir de la columna, utilizando
un gradiente NaCl y las diferentes fracciones son analizadas
utilizando análisis estándar SDS-PAGE y
autorradiografía. Este procedimiento proporciona proteínas que se
unen íntimamente a la columna de endostatina y que están presentes
solamente en las fracciones derivadas de células endoteliales. La
comparación de los modelos electroforéticos del gel de los dos tipos
de células revela proteínas expresadas únicas de las células de
BCE. Las secuencias de proteínas son determinadas a continuación y
los genes correspondientes son clonados. Una librería cADN de
células endoteliales capilares bovinas es preparada y rastreada con
una técnica PCR oligobasada degenerativa para localizar los cADN de
la proteína o proteínas de unión específica con endostatina. La
hibridación utilizando oligonucleótidos degenerativos al cADN
correspondiente se utiliza también para identificar genes de
proteínas de unión con endostatina. Otro enfoque es el de cultivar
anticuerpos contra las secuencias de péptidos con métodos descritos
anteriormente en la Descripción Detallada y inmunorrastrear la misma
biblioteca.
Se prepara una biblioteca cADN de células BCE.
Se aísla poli-A mARN a partir de células BCE cuya
proliferación ha sido inhibida previamente por endostatina. Estas
células expresan una proteína de unión con endostatina. La
correspondiente biblioteca cADN es transfectada a células que
permiten elevada expresión de los diferentes cADN. La actividad de
unión de la endostatina a células que expresa la proteína receptora
sobre la superficie, es utilizada como selección positiva de estas
células. Para seleccionar estas células se etiqueta la endostatina
purificada con biotina y como consecuencia detectada utilizando,
alternativamente, perlas magnéticas acopladas a estreptavidina o
selección FACS. De manera alternativa, se utiliza un anticuerpo
contra endostatina para rastreo. Después de la selección de las
células positivas, se aíslan los plásmidos correspondientes, se
amplifican y son transfectados contra células de alta expresión.
Después de varias pasadas de selección positiva, los plásmidos son
analizados para insertos idénticos utilizando digestión de
endonucleasa y PCR. Utilizando estos datos se forman grupos de
complementación secuenciados y analizados con el programa de red
BLAST. Además de análisis de ordenador, los cADN individuales son
transfectados a células de alta expresión y comprobados en cuanto a
actividad de unión de endostatina en diferentes condiciones (por
ejemplo, competición con endostatina no etiquetada, desarrollo de la
unión a lo largo del tiempo, análisis Scatchard, etc., en otras
palabras, la utilización de procedimientos de caracterización de
receptor "clásicos" conocidos por los expertos en la
materia).
Se designan diferentes cebadores PCR, se clonan
los correspondientes cADN en el sistema de expresión E.
coli, y los diferentes fragmentos de endostatina son
purificados hasta estado de homogeneidad. El cADN de longitud
completa es cortado de los términos N y C. Como primer rastreo se
utilizan el ensayo de proliferación endotelial capilar y el ensayo
de embrión de pollo para determinar la actividad residual en
comparación con el fragmento de longitud completa.
El colágeno XVIII pertenece al tipo de familia de
colágeno no fibrilar y se puede encontrar en tres diferentes
variantes de corte y pegado ("splicing") codificando para las
proteínas con 1315-, 1527-, y 1774 residuos de aminoácidos (Rehn,
PNAS 91:4234, 1994). La diferencia es provocada por alteraciones en
la parte N terminal del gen y por lo tanto las tres variantes de
corte y pegado podrían potencialmente ser fuente de endostatina que,
por su parte, es un fragmento de un dominio no colágeno 11 (NC11).
La función del colágeno XVIII no es conocida pero, dado que su
mensaje es sustancialmente expresado en órganos altamente
vascularizados, se ha propuesto un papel en el conjunto y/o
estructura de matriz perivascular (Oh, y otros., Genomics,
19:494, 1994). Una primera indicación de la función del colágeno
XVIII se desprendió de la purificación de endostatina como potente
inhibidor de proliferación celular endotelial.
De estos datos preliminares de las observaciones
iniciales de los inventores de que la endostatina era purificada a
partir de un medio condicionado de un hemangioendotelioma (EOMA),
los inventores se preguntaron si la encima o encimas que liberan
endostatina procedente del colágeno XVIII podían ser
identificadas.
Los últimos 325 residuos de aminoácido que
codifican el dominio NC11 son expresados en E. coli y en un
sistema de baculovirus de células de insecto, utilizándose la
proteína purificada como sustrato para identificar encimas que
clonan esta región de colágeno XVIII. Mediante PCR se clona un
fragmento de cADN que codifica el dominio NC11 en el vector de
expresión E. coli (serie pET) que permite elevada expresión
de la proteína objetivo después de inducción con IPTG. De manera
alternativa se utiliza un vector apropiado para expresión de
células de insecto. Las proteínas son etiquetadas con la etiqueta
HIS_{6}-Tag situada en el terminal C para
purificación utilizando perlas de Ni^{2+}-NTA. Un
conjugado de fosfatasa alcalina de Ni^{2+}-NTA
puede detectar el término C mediante el ensayo Western ("Western
blotting"). Se prepara otro constructo que tiene no solamente
una etiqueta HIS_{6}-Tag en el terminal C, sino
que codifica, asimismo, la hemaglutinina (etiqueta HA en el término
N). Esto se detecta por el ensayo Western con un anticuerpo
monoclonal HA-específico. Los términos N y C de la
proteína siguieron después de la incubación sobrenadante EOMA y
diferentes extractos de metaloproteinasa.
El producto de fraccionamiento se detecta por
análisis SDS-PAGE o análisis Western, la proteína
es recodificada utilizando las perlas Ni^{2+}-NTA,
se eluye con imidazol, se dializa contra PBS y se comprueba en
cuanto actividad inhibitoria en los diferentes ensayos in
vitro e in vivo (por ejemplo, proliferación de células
endoteliales, embriones de pollo y ensayo corneal de ratón). Si el
producto de fraccionamiento purificado muestra actividad
inhibitoria, se lleva a cabo secuenciado de aminoácidos N terminal y
se compara con la secuencia inicial de endostatina obtenida a
partir del sobrenadante EOMA. De acuerdo con ello, el proceso de
cribado se puede ampliar para purificar suficiente proteína para la
comprobación en ratones afectados por tumores, y comparar esta
actividad a la del dominio completo NC11.
Se incorporan las siguientes referencias en su
totalidad a esta descripción, a modo de referencia.
Angiolillo, A. L., Sgadari, C.,
Taub, D. D., Liao, F., Farber, J. M.,
Miaheshwarl, S., Kieinman, H. K., Reaman, G.
H., and Tosato, G. (1995). Human
interferon-inducible protein 10 is a potent
inhibitor of anglogenesis in vivo. J. Exp. Med. 182,
155-162.
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in vivo by interleukin 12. J. Natl. Cancer Inst. 87,
581-586.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: The Children's Medical Center Corporation
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 300 Longwood Avenue
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: USA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02115
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (617) 735-7050
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (617) 232-7485
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Compuestos y Métodos Antiangiogénicos Terapéuticos.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS. 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disco blando
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Programa PatentIn #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Murino
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Colágeno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SECUENCIA Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His
Leu Val Ala Leu Asn}
\sac{Thr Pro Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Murino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: Colágeno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SECUENCIA Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Trh His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His
Leu Val Ala Leu Asn}
\sac{Thr Pro Leu Ser}
Claims (57)
1. Proteína de endostatina aislada, en la que la
proteína de endostatina es un fragmento de una región C terminal no
colágena de una proteína de colágeno y en la que la proteína de
endostatina se caracteriza adicionalmente por su capacidad
en inhibir angiogénesis.
2. Proteína de endostatina, según la
reivindicación 1, en la que la proteína de colágeno es una proteína
de colágeno no fibrilar.
3. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2, en la que la proteína de colágeno es
una proteína de colágeno tipo XVIII.
4. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2, en la que la proteína de colágeno es
una proteína de colágeno tipo XV.
5. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en la que la región no colágena de
terminal C es un dominio NC1.
6. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína de endostatina es
producida de forma recombinante.
7. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en la que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácido de tipo natural.
8. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la que la proteína de endostatina es
humana.
9. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en la que la proteína de endostatina
inhibe angiogénesis in vivo.
10. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en la que la proteína de endostatina
inhibe angiogénesis in vitro.
11. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en la que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácidos N terminal mostrada en la ID DE
SECUENCIA Nº 1.
12. Proteína de endostatina, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en la que la proteína de endostatina
tiene un peso molecular aproximadamente de 18 kDa determinado por
electroforesis no reductora, o aproximadamente de 20 kDa
determinada por electroforesis de gel reductor.
13. Proteína, según la reivindicación 12, en la
que la proteína de endostatina se une a una columna de afinidad de
heparina y no se une a una columna de afinidad de lisina.
14. Compuesto que comprende una secuencia de
ácido nucleico aislada que codifica la proteína de endostatina,
según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 13.
15. Compuesto, según la reivindicación 14, en el
que la proteína de colágeno es una proteína de colágeno no
fibrilar.
16. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 y 15, en el que la proteína de colágeno es una
proteína de colágeno tipo XVIII.
17. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 y 15, en el que la proteína de colágeno es una
proteína de colágeno tipo XV.
18. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en el que la región no colágena C
terminal es un dominio NC1.
19. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, en el que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácido de tipo natural.
20. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, en el que la secuencia de ácido nucleico
es humana.
21. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20, en el que la proteína de endostatina
inhibe angiogénesis in vivo.
22. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20, en el que la proteína de endostatina
inhibe angiogénesis in vitro.
23. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 22, en el que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácidos N terminal mostrada en ID
SECUENCIA Nº 1.
24. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 23, en el que la proteína de endostatina
tiene un peso molecular de aproximadamente 18 kDa determinado por
electroforesis de gel no reductor, o aproximadamente 20 kDa
determinado por electroforesis de gel reductor.
25. Compuesto, según la reivindicación 24, en el
que la proteína de endostatina se une a columna de afinidad de
heparina y no se une a columna de afinidad de lisina.
26. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 25, que comprende, además, un vector que
contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de
endostatina, de manera que el vector es capaz de expresar la
proteína de endostatina cuando se encuentra presente en una
célula.
27. Compuesto, según la reivindicación 26, en el
que el vector se encuentra en la célula y en el que la célula es
seleccionada del grupo que consiste en células bacterianas, células
de levadura y células de insectos.
28. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 26 y 27, en el que la célula es E. coli, Pichia
pastoris o Drosophila.
29. Anticuerpo aislado, en el que el anticuerpo
se une selectivamente a la proteína de endostatina de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, a través de una proteína de
colágeno.
30. Anticuerpo aislado, según la reivindicación
29, en el que la proteína de endostatina es un fragmento de una
proteína de colágeno no fibrilar.
31. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 y 30, en el que la proteína de endostatina es
un fragmento de una proteína de colágeno tipo XVIII.
32. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 31, en el que la proteína de endostatina es
un fragmento de una proteína de colágeno tipo XV.
33. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 32, en el que el anticuerpo se une
selectivamente a la proteína de endostatina a través de una
proteína de colágeno tipo XVIII.
34. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 33, en el que el anticuerpo se une
selectivamente a la proteína de endostatina a través de una
proteína de colágeno tipo XV.
35. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 34, en el que la región no colágena de
terminal C es un dominio NC1.
36. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 35, en el que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácidos N terminal mostrada en ID
SECUENCIA Nº 1.
37. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 36, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
38. Hibridoma que produce el anticuerpo
monoclonal de la reivindicación 37.
39. Anticuerpo aislado que inhibe la unión del
anticuerpo de la reivindicación 29.
40. Método de expresión de proteína de
endostatina que comprende la transfección de un vector en una
célula, en el que el vector comprende la secuencia de ácidos
nucleicos de la reivindicación 14.
41. Método, según la reivindicación 40, en el que
la proteína de colágeno es una proteína de colágeno no
fibrilar.
42. Método, según cualquiera de la
reivindicaciones 40 y 41, en el que la proteína de colágeno es una
proteína de colágeno tipo XVIII.
43. Método, según cualquiera de la
reivindicaciones 40 y 41, en el que la proteína de colágeno es una
proteína de colágeno tipo XV.
44. Método, según cualquiera de la
reivindicaciones 40 a 43, en el que la región no colágena C
terminal es un dominio NC1.
45. Método, según cualquiera de la
reivindicaciones 40 a 44, en el que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácidos N terminal mostrada en la ID DE
SECUENCIA Nº 1.
46. Método, según cualquiera de la
reivindicaciones 40 a 45, en el que la proteína de endostatina
tiene un peso molecular aproximadamente de 18 kDa determinado por
electroforesis de gel no reductor, o aproximadamente 20 kDa
determinado por electroforesis de gel reductor.
47. Método para detectar la proteína de
endostatina, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en
una muestra que comprende:
- a.
- combinar la mezcla que se sospecha que contiene proteína de endostatina con un anticuerpo de unión específico de la proteína de endostatina; y
- b.
- detectar la presencia de unión entre la proteína de endostatina y el anticuerpo, detectando de esta manera la proteína de endostatina en la muestra.
48. Método, según la reivindicación 47, en el que
la proteína de colágeno es una proteína de colágeno no
fibrilar.
49. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 47 y 48, en el que la proteína de colágeno es una
proteína de colágeno tipo XVIII.
50. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 47 y 48, en el que la proteína de colágeno es una
proteína de colágeno tipo XV.
51. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 47 a 50, en el que la región no colágena de
terminal C es un dominio NC1.
52. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 47 a 51, en el que la proteína de endostatina
tiene una secuencia de aminoácidos de terminal N mostrada en la ID
DE SECUENCIA Nº 1.
53. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 47 a 52, en el que la proteína de endostatina
tiene un peso molecular aproximadamente de 18 kDa determinado por
electroforesis de gel no reductor, o aproximadamente 20 kDa
determinado por electroforesis de gel reductor.
54. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 47 a 53, en el que la muestra es tomada de un
fluido corporal o tejido de un individuo seleccionado del grupo que
consiste en sangre, plasma, fluido espinal, saliva, semen,
secreciones vaginales u orina.
55. Método, según la reivindicación 54, en el que
el individuo tiene una enfermedad o estado relacionado con
angiogénesis.
56. Utilización de proteína de endostatina, o de
un fragmento de la misma, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, o un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 28, o un anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 39 para la preparación de un medicamento para
el tratamiento de enfermedades relacionadas con angiogénesis.
57. Utilización, según la reivindicación 56, en
la que la enfermedad relacionada con angiogénesis es seleccionada
del grupo que consiste en cáncer, tumores sólidos, tumores
generados en la sangre, leucemias, metástasis tumorales, tumores
benignos, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas,
granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades
angiogénicas oculares, retinopatía diabética, retinopatía de
premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneal,
glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, rubeosis, Síndrome
de Osler-Webber, angiogénesis de miocardio,
neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones
hemofílicas, angiofibroma, granulación de heridas, adherencias
intestinales, arteriosclerosis, escleroderma, cicatrices
hipertróficas, queloides, enfermedad de rasguños de gato ("car
scratch") y úlceras.
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US583595P | 1995-10-23 | 1995-10-23 | |
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| US2307096P | 1996-08-02 | 1996-08-02 | |
| US23070P | 1996-08-02 | ||
| US2626396P | 1996-09-17 | 1996-09-17 | |
| US26263P | 1996-09-17 | ||
| US740168 | 1996-10-22 | ||
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