JP2002524036A - 抗血管形成プラスミドおよび送達システムならびにその作製および使用方法 - Google Patents

抗血管形成プラスミドおよび送達システムならびにその作製および使用方法

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Abstract

(57)【要約】 抗血管形成プラスミドを動物の体内へ送達することによって、腫瘍活性を低下させる。 【解決手段】本発明は遺伝子送達及び遺伝子治療に関し、動物における抗血管形成因子を発現させるための新規な核酸構成体、発現のための核酸構成体と合体させて送達するための調合物、およびそのような構成体および調合物の調製および使用方法を提供する。特に、この発明は治療用抗血管形成コード化核酸を細胞に送達して腫瘍活性を調節するためのプラスミド構成体、それらの構成体の使用方法（サイトカイン、好ましくは、ＩＬ−１２など、他の薬剤との併合治療を含む）、およびそのような構成体の調製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子送達および遺伝子治療に関し、哺乳動物において抗血管形成
遺伝子産物を発現させるための新規な核酸コンストラクト、発現させるための核
酸コンストラクトが処方された送達用処方物、ならびにそのようなコンストラク
トおよび処方物の調製方法および使用方法を提供する。
【０００２】
【発明の背景】
本発明の背景についての以下の説明は、読者が本発明を理解することを助ける
ために単に提供されるだけであり、本発明の先行技術を記載または構成すること
を認めるものではない。
【０００３】 腫瘍を有する宿主において、効果的な免疫応答がないことは、腫瘍の弱い抗原
性または腫瘍の免疫抑制的な環境のためである。免疫療法は、腫瘍−宿主の相互
作用を腫瘍に特異的な抗原の導入によって強化することであり、あるいは局所的
なサイトカイン発現によって免疫機能を追加することである。ＩＬ−２、ＩＦＮ
−αおよびＩＬ−１２のようないくつかのサイトカイン遺伝子医薬品が開発され
ている。ポリマー系送達システムに処方された、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２またはＩ
Ｌ−１２をコード化する核酸を直接腫瘍内注射することによって、腫瘍を有する
マウスは、ネズミの同系腫瘍モデルにおける腫瘍成長の抑制をもたらす免疫応答
を発現させている。別の方法である抗血管形成遺伝子療法が、免疫原性腫瘍およ
び非免疫原性腫瘍の両方に対する治療方法として認識されている。
【０００４】 腫瘍は、血管を介して酸素および養分を獲得する。血管の生成すなわち血管形
成は、腫瘍の成長および転移に必要である。さらに、腫瘍における微小血管密度
は、腫瘍の成長、転移の危険性、腫瘍の再発または死と明確な関係を示している
（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８２：４
〜６（１９９０）；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１：２７〜
３１（１９９５））。腫瘍の血管形成の開始は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦなどの
血管形成因子のアップレギュレーションによって、あるいはエンドスタチン、ア
ンギオスタチンおよびトロンボスポンジン−１などの抗血管形成因子のダウンレ
ギュレーションによって開始され得る（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．＆Ｆｏｌｋｍａｎ
，Ｊ．、Ｃｅｌｌ、８６：３５３〜６４（１９９６））。従って、血管形成イン
ヒビタを再構成することにより、癌治療の一応の対策が得られる（Ｈｏｒｉ，Ａ
．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：６１８０〜４（１９９１）；Ｋｉｍ，Ｋ．
Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ、３６２：８４１〜４（１９９３）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．
Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、７９：３１５〜２８（１９９４）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．
Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、８８：２７７〜８５（１９９７）；Ｃｌａｐｐ，Ｃ．他、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３３：１２９２〜９（１９９３）；Ｇｕｐｔａ，
Ｓ．Ｋ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、９２：７７９９〜７８０
３（１９９５））。
【０００５】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、血管形成インヒビタであるタンパ
ク質の拡大しつつあるファミリー(expanding family)の２つの構成成分である。
アンギオスタチンは、成熟型プラスミノーゲンの内部タンパク質分解フラグメン
トである。これは、クリングルドメイン（残基９８〜４４０）として知られてい
る三重環のジスルフィド結合した構造を４つ含有する。３個のクリングルドメイ
ンの形態（残基９８〜３３３）は、生体外（Ｃａｏ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１：２９４６１〜２
９４６７（１９９６））および生体内（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６３６７〜６３７２（１９９８））に
おいてより強力であることが明らかにされている。エンドスタチンは、コラーゲ
ン１８ａのＣ末端のタンパク質分解フラグメントである。その構造は、内皮細胞
（ＥＣ）表面の接着因子分子であるＥ−セレクチンの構造と類似している（Ｈｏ
ｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．他、ＥＭＢＯ Ｊ．、１７：１６５６〜６４（１９９８
））。
【０００６】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンはともに、生体外で内皮細胞（ＥＣ）
の分化を抑制し、生体内で血管形成を抑制し得る。さらに、組換えタンパク質は
、大用量で注射されたときに、腫瘍の成長および転移をマウスモデルにおいて抑
制することが明らかにされている。最近、アンギオスタチンおよびエンドスタチ
ンの組合せは、腫瘍の成長および転移の抑制における相乗作用を有していること
が明らかにされている（Ｂａｃｈｅｌｏｔ，Ｔ．他、ＡＡＲＣの抄録、第３９巻
、１９９８年３月）。抗血管形成療法は、ネズミの腫瘍モデルでの放射線療法に
おける相乗作用を示し得ることもまた明らかにされている（Ｍａｕｃｅｒｉ他、
Ｎａｔｕｒｅ、３９４：２８７（１９９８））。
【０００７】 抗血管形成療法は、腫瘍細胞ではなく、ＥＣを標的とする。ＥＣは、全身的に
送達された薬物に対してより大きな受容性を有し、従って、抗血管形成療法は、
散在性癌の処置において特に有用である。さらに、ＥＣは形質転換されず、癌の
実験モデルの抗血管形成療法は後天的な薬物耐性をもたらさない。抗血管形成療
法には生体内における治療的レベルの長期間の維持が必要とされるので、組換え
タンパク質の連続的な送達は費用がかかり、扱いにくい。
【０００８】
【発明の概要】
本発明は、遺伝子送達および遺伝子治療に関し、抗血管形成コード化配列を生
物、好ましくは哺乳動物、において発現させるための新規な核酸コンストラクト
、発現させるための核酸コンストラクトが処方された送達用処方物、ならびにそ
のようなコンストラクトおよび組成物の調製方法および使用方法を提供する。特
に、本発明は、腫瘍活性を調節するために、治療遺伝子を細胞に送達するための
プラスミドコンストラクトに関する。本発明はまた、そのようなコンストラクト
の使用方法（放射線療法などの他の処置方法またはサイトカイン、好ましくは、
ＩＬ−１２、などの薬剤との混合療法を含む）、ならびにそのようなコンストラ
クトの調製方法に関する。本明細書中に示されている薬学的に受容可能で費用的
に有効な高効率の送達システムにより、従来技術に対して予期されない改善が示
される。
【０００９】 プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をヌクレアーゼから保護し、かつ注射された組
織におけるｐＤＮＡの分散および保持を制御することによってタンパク質発現を
増大させる相互作用的同義遺伝子送達システムを利用する遺伝子治療法が用いら
れている。このような同義相互作用非縮合(polymeric interactive non-condens
ing)（ＰＩＮＣ）システムにより、未処方のプラスミドを生理食塩水において送
達することと比較して、組織からのより大きな量の遺伝子発現が日常的に得られ
る。ＰＶＰとの複合体として処方された、ネズミのＩＦＮα４またはＩＬ−１２
をコード化するプラスミド発現システムにより、抗腫瘍の免疫応答が、皮下のネ
ズミ腫瘍に直接注射した後でもたらされ得る。ヒトのインスリン様成長因子−１
（ｈＩＧＦ−Ｉ）をコード化し、ＰＩＮＣ複合体として処方されたプラスミドを
使用することによって、生物学的に活性なヒトＩＧＦ−Ｉの長期間の生成が筋肉
内注射の後の生体内において示されている。筋肉内送達された遺伝子により、循
環系における治療生成物の多くて持続的な発現が達成され得るので、筋肉内送達
癌遺伝子医薬品は、遺伝子治療の大きな限界である散在性疾患の処置において使
用することできると考えられる。
【００１０】 これに代えて、腫瘍転移を有する特定の臓器（例えば、肺）へ治療遺伝子を投
与することは、満たせない臨床的要求に対してより適し得る。遺伝子的欠陥の処
置のための肺への遺伝子送達が、実験的モデルならびに臨床試験で探究されてい
る。Ｎ−［１−（２−３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化ト
リメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）／コレステロール／プラスミドの３：１の
正荷電複合体を使用することによる、導入遺伝子の増強された肺発現が気管内投
与または静脈内注射の後で明らかにされた。
【００１１】 脂質／ＤＮＡの尾静脈注射によって、血清における検出可能なレベルのヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ）、血漿における検出可能なレベルのヒト第ＩＸ因子（ｈＦ
ＩＸ）、ならびに肺および肝臓における検出可能なレベルのクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyltransferase) （ＣＡＴ
）が、カチオン性脂質対共脂質の比が４：１ｍｏｌ／ｍｏｌである４００ｎｍの
押出リポソームから調製された正荷電の脂質／プラスミド複合体で認められた。
正荷電のプラスミド／カチオン性脂質複合体の肺気道への投与によって、Ｔｈ１
細胞表現型に類似するサイトカインパターンが誘導されるが、導入遺伝子の発現
がない場合でさえも、ＩＬ−１２プラスミド／脂質複合体を投与した後における
ネズミの肺におけるＩＬ−１２の導入遺伝子発現により、同系のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスにおけるＲｅｎｃａ腫瘍の肺転移物の成長が抑制される。
【００１２】 抗血管形成因子を発現させるための腫瘍ＥＣ特異的プロモーターの使用をここ
で説明する。増殖しているＥＣに特異的なプロモーターを選択するために少なく
とも２つの方法が使用された。１つは、腫瘍ＥＣで特異的に発現している遺伝子
、例えばｆｌｋ−１およびａｖｂ３のインテグリン、のプロモーターをクローニ
ングすることである。もう１つは、エンドセリン−１エンハンサーのようなＥＣ
に特異的なエンハンサーおよびサイクリンＡのような細胞周期特異的プロモータ
ーのキメラなプロモーターをつくることである。
【００１３】 本発明は、プロトタイプの抗血管形成遺伝子とエンドスタチンおよびアンギオ
スタチンを使用することによって、抗血管形成遺伝子療法により、固形腫瘍の成
長を腫瘍内注射または筋肉内注射のいずれかによって抑制されることを明らかに
した。抗血管形成遺伝子療法によりまた、処方された抗血管形成遺伝子の筋肉内
送達または静脈内送達の後に肺転移腫瘍が抑制される。
【００１４】 従って、第１の側面において、本発明は、組織特異的エレメントおよび抗血管
形成コード化配列を有するプラスミドを特徴とする。好ましくは、組織特異的エ
レメントは、内皮細胞に特異的であり、かつ抗血管形成コード化配列に転写的に
連結されている。下記に詳しく説明するように、プラスミドは、１つまたは複数
のサイトメガロウイルスプロモーター配列などの転写制御配列を必要に応じて含
むことができる。
【００１５】 “組織特異的エレメント”は、ＥＴ−１、ｆｌｋ−１、アルファ−Ｖ、ベータ
−３、ＩＣＡＭ−２、ｃｙｃＡ、Ｅ２Ｆ１およびｃｄｃ６からなる群から選択さ
れることが好ましいプロモーターを含むことができ、あるいはＣＭＶ、４コピー
のＥＴ−１、および７コピーのＥＴ−１からなる群から選択されることが好まし
いエンハンサーを含むことができる。ＥＣ組織特異的プロモーターの例を以下で
詳しく説明する。
【００１６】 組織特異的エレメントは、好ましくは、抗血管形成コード化配列の発現が、関
係する組織または細胞において、好ましくは、優勢的（５０％を超える）レベル
、ほぼ全面的（約９０％以上）レベル、あるいは全面的（約１００％）レベルに
なるまで増強されるような方法で、抗血管形成コード化配列と結合または連結さ
れる。例えば、発現を約２倍増強させることができる。
【００１７】 ここで使用されている用語“プラスミド”は、遺伝物質（すなわち、核酸）で
構成されたコンストラクトをいう。これは、挿入されているコード化配列が真核
生物細胞に転写され得るように配置された遺伝子エレメントを含み、また、プラ
スミドはウイルス核酸に由来する配列を含むことができるが、そのようなウイル
ス配列は、ウイルス粒子へのプラスミドの取り込みを引き起こさず、従って、プ
ラスミドは非ウイルス性ベクターである。好ましくは、プラスミドは、閉環した
環状ＤＮＡ分子である。
【００１８】 “サイトメガロウイルスプロモーター”は、転写プロモーターおよび上流のエ
ンハンサー配列として真核生物細胞において機能し得るサイトメガロウイルス由
来の１つまたは複数の配列をいう。エンハンサー配列は、転写を、関連するプロ
モーターから、より高頻度で生じさせる。
【００１９】 これに関連して、“転写的に連結された”とは、転写に適したシステムにおい
て、転写が制御配列（複数を含む）の指揮下で開始され、そのような制御配列（
複数を含む）と転写的に連結されている配列によって進行することを意味する。
得られた転写物には、得られる翻訳生成物を変化させるような変異が生じないの
が好ましい。
【００２０】 “コード化領域”または“コード化配列”の用語は、正常な塩基対形成とコド
ン使用の関係に従って、発現が所望される特定の遺伝子生成物をコード化する核
酸配列をいう。従って、コード化配列は、適正な長さの転写物が生成され、機能
的な所望の生成物を生成するのに適切な読み枠での翻訳をもたらすような関係で
転写制御配列（制御エレメントならびに翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンを
含み得る）に対して設置しなければならない。
【００２１】 好ましい実施形態において、“抗血管形成コード化配列”は、エンドスタチン
、アンギオスタチン、トロンボスポンジン−１、ｐ５３、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−
α、短縮型組織因子、インテグリンαｖβ３ブロッキング因子、ＶＨＬ遺伝子生
成物、細胞周期依存性キナーゼインヒビタ、ＶＥＧＦｒ、ｂＦＧＦｒおよびｂＦ
ＧＦ結合タンパク質からなる群から選択される生成物をコード化し、好ましくは
、（プラスミドを収容する生物、好ましくは、ヒト、に関して）最適なコドン使
用、または（プラスミドを収容する生物、好ましくは、ヒト、に関して）準最適
なコドン使用を有する合成された配列であり、あるいはここで記載されているプ
ラスミドのいずれか、より好ましくは、プラスミドｐＥＳ１２８１、ｐＩＰ１３
１６、ｐＡＳ１０９５またはｐＡＳ１０９６、のヌクレオチド配列を有する。
【００２２】 抗血管形成コード化配列は、関係する生物における血管形成を、好ましくは著
しい程度（例えば、治療効果が得られる程度）に低下させるか、または生体外ア
ッセイで血管形成を低下させる生成物をコード化する。
【００２３】 本発明のプラスミドにおいて使用するに好適なコード化領域の１つの具体的な
例は、抗血管形成因子をコード化する天然の配列である。従って、好ましい実施
形態において、コード化領域は、そのような抗血管形成因子をコード化する天然
のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有する。しかし、合成されたコー
ド化配列である抗血管形成コード化配列を有することが好ましい場合がある。好
ましい実施形態において、抗血管形成コード化配列は、最適なコドン使用または
準最適なコドン使用を利用して合成された配列である。
【００２４】 従って、“ヒト抗血管形成因子をコード化する配列”または“ヒト抗血管形成
コード化配列”は、正常な塩基対形成および翻訳コドン使用の関係に基づいて、
ヒト抗血管形成因子のアミノ酸配列をコード化する核酸配列である。コード化配
列は、天然のヒト抗血管形成因子の正確に完全なアミノ酸配列をコード化するこ
とが好ましいが、これは必須ではない。コード化されたポリペプチドは、そのポ
リペプチドが抗血管形成活性を保持している限り、好ましくは、そのポリペプチ
ドが、天然のヒト抗血管形成因子の、少なくとも５０％、７５％、９０％または
９７％の活性である限り、より好ましくは、天然のヒト抗血管形成因子と完全に
同じ活性である限り、天然のヒト抗血管形成因子と異なっていてもよい。つまり
、抗血管形成コード化配列によってコード化されたポリペプチドは、天然のヒト
抗血管形成因子と少し、好ましくは、１５％未満、１０％未満、５％未満または
１％未満の変化で異なっていても良い。このような変化は、１つまたは複数のア
ミノ酸の欠失、付加または置換などの１つまたは複数の種々のタイプのものであ
り得る。
【００２５】 用語“転写制御配列”は、転写的に連結されたコード化領域の転写速度を制御
する配列をいう。従って、この用語には、プロモーター、オペレーターおよびエ
ンハンサーが含み得る。特定の転写ユニットの場合、転写制御配列には、少なく
ともプロモーター配列が含まれる。
【００２６】 プラスミドはまた、好ましい実施形態において、好ましくは、ヒトの成長ホル
モン遺伝子から得られる成長ホルモンの３’非翻訳領域を含むことができる。
【００２７】 “成長ホルモンの３’非翻訳領域”は、実体的なポリペプチドをコード化する
領域の下流（すなわち、３’側）に位置する配列であって、成長ホルモン遺伝子
、好ましくは、ヒトの成長ホルモン遺伝子、に由来する天然の３’ＵＴＲ／ポリ
（ａ）シグナルの少なくとも一部を含む配列である。この領域は、一般には転写
されるが、翻訳されない。真核生物細胞における発現のためには、ポリＡテール
（poly-A-tail）の付加をシグナルする配列を含むことが一般には好ましい。他
の合成された遺伝子エレメントの場合、合成された３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグ
ナルは、天然に生じるＵＴＲエレメントと異なる配列を有する。この配列は、例
えば、ＡＬＵ反復配列を欠失させることによって改変することができる。そのよ
うなＡＬＵ反復配列の欠失は、トランスフェクションされた細胞における発現カ
セットとゲノム物質との相同的組換えの確率を低下させるように作用する。
【００２８】 プラスミドは、好ましくは、コード化配列の発現に関して適切な関係にあるプ
ロモーター、ＴＡＴＡボックス、Ｃａｐサイト、ならびに第１のイントロンおよ
びイントロン／エキソン境界を含む。プラスミドはまた、プロモーターとコード
化配列との間に挿入された５’ｍＲＮＡリーダー配列、および／またはニワトリ
の骨格性α−アクチン遺伝子から得られるイントロン／５’ＵＴＲを含むことが
できる。また、プラスミドは、ここに記載されているプラスミドのいずれかのプ
ラスミドのヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有することができる。
【００２９】 プラスミドはまた、（ａ）第１の５‘非翻訳領域と転写的に連結された第１の
転写制御配列、第１のイントロン、第１のコード化配列、および第１の３’非翻
訳領域／ポリ（Ａ）シグナルを有する第１の転写ユニットであって、第１のイン
トロンが制御配列と第１のコード化配列との間に存在する第１の転写ユニット；
および（ｂ）第２の５‘非翻訳領域と転写的に連結された第２の転写制御配列、
第２のイントロン、第２のコード化配列、および第２の３’非翻訳領域／ポリ（
Ａ）シグナルを有する第２の転写ユニットであって、第２のイントロンが制御配
列と第２のコード化配列との間に存在する第２の転写ユニットを含有することが
でき、ここで第１および第２のコード化配列は、任意の２つの異なる抗血管形成
因子、好ましくは、アンギオスタチンおよびエンドスタチンをコード化する配列
を含有するが、ＩＰ−１０およびエンドスタチン、またはＩＰ−１０およびＴＳ
Ｐｆなどの他の組合せもまた可能である。
【００３０】 本発明はまた、組織特異的エレメントおよび抗血管形成コード化配列を用いた
プラスミドおよび関連生成物ならびに方法を提供し、この場合、抗血管形成コー
ド化配列は、融合またはハイブリッドのペプチドまたはタンパク質をコード化す
る。この融合またはハイブリッドの因子は、例えば、アンギオスタチンおよびエ
ンドスタチンの融合物であり得る。融合物の各部分は、好ましくは、それ自身で
抗血管形成性であり、融合物またはハイブリッド物の一部として提供された場合
、高い抗血管形成作用を有している。
【００３１】 “転写ユニット”または“発現カセット”の用語は、転写の開始および停止を
指揮する配列エレメントとともに、少なくとも１つのコード化配列を含有するヌ
クレオチド配列をいう。しかし、転写ユニットは、転写後または翻訳後のプロセ
スに関与する配列を含み得るさらなる配列を含むことができる。好ましい実施形
態において、第１の転写制御配列または第２の転写制御配列は、１つまたは複数
のサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。第１および第２の転写制
御配列は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００３２】 “５‘非翻訳領域”または“５‘ＵＴＲ”は、プロモーター領域の３’、に位
置し、その下流にあるコード化領域の５’に位置する配列をいう。従って、その
ような配列は転写されるが、翻訳開始コドンの上流に存在し、従って、ポリペプ
チド生成物の部分には翻訳されない。
【００３３】 ここで記載するプラスミドの場合、１つまたは複数のプロモーター、５‘非翻
訳領域（５‘ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナル、およびイントロンは
合成された配列であり得る。これに関連して、用語“合成”は、配列が、そのよ
うなタイプの天然に生じる遺伝子エレメントの配列によって直接提供されず、む
しろ、人為的に作製された配列である（すなわち、分子生物学的方法により人に
よってつくられる）ことを意味する。そのような合成された配列の１つまたは複
数の部分は、天然に生じる配列と同じであり得るが、特定の遺伝子エレメントの
配列全体は、そのようなタイプの天然に生じる遺伝子エレメントとは異なる。そ
のような合成された遺伝子エレメントの使用により、そのエレメントの機能的特
性を、所望する機能のために適切に設計することができる。
【００３４】 従って、“合成イントロン”は、天然に生じるイントロン配列ではなく、正常
な転写後プロセスのときにＲＮＡ転写物から除かれる配列をいう。そのようなイ
ントロンは、様々な異なる特性を有するように設計することができ、特に、その
ようなイントロンは、所望する強度のスプライシング部位を有するように設計す
ることができる。
【００３５】 好ましい実施形態において、第１および第２のコード化領域は、５‘から３“
の方向での、アンギオスタチン、それに続くエンドスタチンのコード化領域であ
る。
【００３６】 ”アンギオスタチンのコード化配列“は、正常な塩基対形成および翻訳コドン
使用の関係に基づいて、上記に記載されているヒトアンギオスタチンをコード化
する核酸配列である。エンドスタチンのコード化配列も同様に定義される。
【００３７】 好ましい実施形態において、アンギオスタチンのコード化配列は、エンドスタ
チンのコード化配列の５‘に存在する。当業者は、２よりも多くの抗血管形成コ
ード化配列が用いられた場合、その抗血管形成コード化配列のすべてが単一の転
写ユニットに存在し得ること、あるいはすべてが別個の転写ユニットに存在し得
ること、あるいは（コード化配列が３つの場合）、任意の２つのコード化配列が
１つの転写ユニットに存在し、残りのコード化配列が別の転写ユニットに存在し
得ることが理解されるであろう。
【００３８】 プラスミドはまた、可変的スプライシングを有するイントロン、第１のコード
化配列、および第２のコード化配列を含有することができ、この場合、第１およ
び第２のコード化配列は、任意の２つの異なる抗血管形成因子、好ましくは、ア
ンギオスタチンおよびエンドスタチン、をコード化する配列を含む。
【００３９】 好ましい実施形態において、プラスミドはまた、（ａ）第１のコード化配列お
よび第２のコード化配列と転写的に連結された転写制御配列と、（ｂ）５’非翻
訳領域と、（ｃ）第１のコード化配列の５’、に存在するイントロンと、（ｄ）
第１のコード化配列の３‘に存在し、かつ第２のコード化配列の５’に存在する
選択的スプライシングサイトと、（ｅ）３‘非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルと
を有する。転写制御配列は、好ましくは、サイトメガロウイルスプロモーター配
列を含む。
【００４０】 好ましい実施形態において、プラスミドはまた、（ａ）第１のコード化配列、
ＩＲＥＳ配列、第２のコード化配列、および３‘非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナ
ルと転写的に連結された転写制御配列であって、ＩＲＥＳ配列が第１のコード化
配列と第２のコード化配列との間に存在する転写制御配列と、（ｂ）プロモータ
ーと第１のコード化配列との間に存在するイントロンとを有し、第１および第２
のコード化配列は、任意の２つの抗血管形成因子、好ましくは、アンギオスタチ
ンおよびエンドスタチン、をコード化する配列を含む。転写制御配列は、好まし
くは、サイトメガロウイルスプロモーター配列を含み、ＩＲＥＳ配列は、好まし
くは、脳心筋炎ウイルス(encephalomyocarditis virus)から得られる。
【００４１】 遺伝子発現のためにコード化配列が送達される場合、核酸配列に加えて、１つ
または複数の他の成分を含む送達組成物または送達システムを提供することは一
般に有用である。そのような組成物は、例えば、それ自身の免疫刺激作用を有す
る非ＤＮＡ成分などによって、ＤＮＡの完全性を維持すること、および／または
ＤＮＡの細胞取り込みを増強すること、および／または免疫原性増強剤として作
用することを助けることができる。
【００４２】 従って、別の局面において、本発明は、上記に記載したプラスミドと保護的な
相互作用性の非凝縮性化合物（ＰＩＮＣ）とを含有する組成物を特徴とする。
【００４３】 ＰＩＮＣは、哺乳動物細胞への核酸分子の送達を生体内で増強する。好ましく
は、核酸分子は、細胞内で発現させられる遺伝子生成物のコード化配列を含む。
多くの場合、その適切な遺伝子生成物はポリペプチドまたはタンパク質である。
好ましくは、ＰＩＮＣは、ＰＩＮＣがゲルを形成しないような条件、またはゲル
形態が約３０℃〜４０℃での投与時に存在しないような条件のもとで使用される
。従って、このような組成物において、ＰＩＮＣは３０％（ｗ／ｖ）以下の濃度
で存在する。或る好ましい実施形態において、ＰＩＮＣ濃度はさらに低く、例え
ば、２０％以下、１０％以下、５％以下または１％以下である。従って、このよ
うな組成物は、例えば、植物プロトプラストのエチレングリコール媒介トランス
フェクションの際、あるいは薬物送達または核酸送達するためのゲル形成の際の
ように化合物がより大きな濃度で使用されるところの、このような化合物または
類似する化合物の使用とは化合物の濃度および機能的作用が異なる。一般に、Ｐ
ＩＮＣは、それらがＰＩＮＣとして使用される条件でゲル形態ではないが、その
ような化合物には、特定の条件のもとでゲルを形成し得るものがある。
【００４４】 本発明の化合物および組成物に関連して、“保護する”または“保護的な”の
用語は、核酸の分解速度が特定の環境で低下するような、このような化合物と核
酸との相互作用の効果である。そのような分解は、特にヌクレアーゼの酵素的作
用を含む様々な異なる要因のためであり得る。保護的な作用は、種々の方法で、
例えば、ヌクレアーゼ分子の排除によって、あるいは水の排除によって提供され
得る。
【００４５】 核酸を保護し、かつ／または核酸の生物利用性を延ばすいくつかの化合物はま
た、ファンデルワールス力、イオン−双極子相互作用、イオン誘導双極子相互作
用、水素結合またはイオン結合などの分子間力および／または原子価結合によっ
て核酸と相互作用または会合し得る。これらの相互作用は下記の機能をもたらし
得る：（１）遮蔽によるヌクレアーゼからの核酸の立体選択的な保護；（２）“
相乗りエンドサイトーシス”による核酸の容易な細胞取り込み。相乗りエンドサ
イトーシスは、エンドサイトーシスによって取り込まれ得るキャリアと複合体を
形成した薬物または他の物質の細胞取り込みである。ＣＶ ＵｇｌｅａおよびＣ
Ｄｕｍｉｔｒｉｕ−Ｍｅｄｖｉｃｈｉ、合成オリゴマーの医学的適用、Ｐｏｌ ｙｍｅｒｉｃ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、 Ｓｅｖｅｒｉａｎ Ｄｕｍｉｔｒｉ
ｕ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９３年を参照のためにここ
に援用する。
【００４６】 記載された所望の効果を達成するためには、核酸を保護し、かつ／または核酸
の生物利用性を延ばす化合物が両親媒性を有すること、すなわち、親水性領域お
よび疎水性領域の両方を有することが望ましい。しかし、これは必須ではない。
化合物の親水性領域は、核酸の主としてイオン性で親水性の領域と会合すること
ができ、一方、化合物の疎水性領域は、核酸の拡散を遅らせて、ヌクレアーゼか
ら核酸を保護するように作用し得る。
【００４７】 さらに、疎水性領域は細胞膜と特異的に相互作用し、これにより、化合物のエ
ンドサイトーシス、従って同様に、化合物と会合した核酸のエンドサイトーシス
を容易にし得る。このプロセスにより、核酸の細胞周辺濃度が上昇し得る。
【００４８】 両親媒性を有し得る薬剤であって、薬学的に受容可能であると一般に見なされ
ている薬剤を下記に示す：ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルコール；ポリ
酢酸ビニル；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ポロキサマー（
プルロニクス(Pluronics)）；ポロキサミン（テトロニクス(Tetronics)）；エチ
レン酢酸ビニル；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース；ヘテロ多糖類（ペクチン類）；キトサン類；ホス
ファチジルコリン類（レシチン類）；ミグリオール；ポリ乳酸；ポリヒドロキシ
酪酸；キサンタンゴム。同様に、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸（ＰＥＧ−
ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール−ポリヒドロキシ酪酸（ＰＥＧ−ＰＨＢ）、
ポリビニルピロリドン−ポリビニルアルコール（ＰＶＰ−ＰＶＡ）などのコポリ
マー系、ならびにＮ−ビニルプリン（またはＮ−ビニルピリミジン）誘導体およ
びＮ−ビニルピロリドンのコポリマーなどの誘導体化コポリマーが有る。しかし
、上記化合物のすべては必ずしも、下記に記載されるような保護的な相互作用性
の非凝縮性化合物ではない。
【００４９】 このような組成物に対する保護的な相互作用性の非凝縮性化合物に関連して、
用語“非凝縮性”は、会合した核酸が、組成物において使用されている濃度での
ＰＩＮＣとの相互作用により凝縮または崩壊しないことを意味する。従って、Ｐ
ＩＮＣは、タイプおよび／または使用濃度において、そのような凝縮性ポリマー
とは異なる。汎用される凝縮性ポリマーの例には、ポリリシンおよびカスケード
ポリマー（球状ポリカチオン）が含まれる。
【００５０】 さらに、そのような化合物および会合した核酸分子と関連して、用語“送達を
増強する”は、少なくとも、ＰＩＮＣおよび核酸の量が最適化されている条件に
おいて、核酸が生理食塩水で送達される場合よりも大きな生物学的効果が得られ
ることを意味する。従って、核酸によってコード化された遺伝子生成物の発現が
所望される場合、ＰＩＮＣ：核酸の組成物で得られる発現レベルは、特定のＰＩ
ＮＣ／コード化配列の組合せについての適切な方法による送達に関して、生理食
塩水における同じ量の核酸で得られる発現よりも大きい。
【００５１】 上記組成物の好ましい実施形態において、ＰＩＮＣは、ポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＰ−ＰＶＡコポリマー、Ｎ
−メチル−２−ピロリドン（ＮＭ２Ｐ）、エチレングリコールまたはプロピレン
グリコールである。ポロキサマー（プルロニクス）が使用される組成物の場合、
核酸は、好ましくは、ウイルスベクターではない。すなわち、核酸は非ウイルス
ベクターである。
【００５２】 他の好ましい実施形態において、ＰＩＮＣは、標的化リガンドと結合する。そ
のような標的化リガンドは様々な異なるタイプであり得る。そのような標的化リ
ガンドには、ガラクトシル残基、フコサル（ｆｕｃｏｓａｌ）残基、マンノシル
残基、カルンチチン（ｃａｒｎｔｉｔｉｎｅ）誘導体、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体、ペプチドリガンド、およびＤＮＡ結合タンパク質が含まれる
が、これらに限定されない。これらの標的化リガンドは、抗原提示細胞、肝細胞
、筋細胞、上皮細胞、内皮細胞および癌細胞などの細胞に存在するレセプターと
結合し得る。
【００５３】 標的化リガンドおよびＰＩＮＣの会合に関連して、用語“と結合する”は、物
理的な会合が熱力学的に有利であるように、それらの一部が互いに相互作用を有
することを意味する。このことは、少なくとも、その会合に関する自由エネルギ
ーファンクションが局所的に最小であることを表している。そのような相互作用
には、共有結合、または非共有結合的相互作用、例えば、イオン結合、水素結合
、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、およびこれらの相互作用の組
合せを含みう得る。
【００５４】 標的化リガンドは様々なタイプであり得るが、１つの実施形態において、リガ
ンドは抗体である。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を用い
ることができる。
【００５５】 核酸はまた、様々な形態で存在し得る。好ましくは、核酸は、物理的形態を変
化させる化合物（１つまたは複数）と会合しないが、他の実施形態においては、
核酸は（凝縮性ポリマーなどにより）凝縮し、カチオン性脂質と処方され、ペプ
チドと処方され、あるいはカチオン性ポリマーと処方される。
【００５６】 好ましい実施形態において、保護的な相互作用を成し得る非凝縮性化合物はポ
リビニルピロリドンであり、かつ／またはプラスミドは、０．５％〜５０％の間
のＰＶＰを有する溶液中に、より好ましくは約５％のＰＶＰを有する溶液中に存
在する。ＤＮＡは、好ましくは少なくとも約８０％がスーパーコイル状であり、
より好ましくは少なくとも約９０％がスーパーコイル状であり、最も好ましくは
少なくとも約９５％がスーパーコイル状である。
【００５７】 別の側面において、本発明は、保護的な相互作用を成し得る非凝縮性化合物と
、抗血管形成コード化配列を含有するプラスミドとを含有する組成物を特徴とす
る。
【００５８】 さらに別の側面において、本発明は、本発明のプラスミド（または、抗血管形
成コード化配列を含有するプラスミド）およびカチオン性脂質を、好ましくは、
中性の共脂質とともに含有する組成物を特徴とする。
【００５９】 好ましくは、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、中性の共脂質はコレステロ
ール（ｃｈｏｌ）である。ＤＯＴＭＡは１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−
トリメチルアンモニウムプロパンであり、これは参照のためにここに援用するＥ
ｐｐｓｔｅｉｎ他の米国特許第４，８９７，３５５号、１９９０年１月３０日発
行、において記載されまた論じられている。しかし、他の脂質および脂質の組合
せを他の実施形態において使用することができる。様々なそのような脂質が、Ｇ
ａｏ＆Ｈｕａｎｇ、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：７１０〜７２２
に記載されており、これは参照のためにここに援用する。他のカチオン性脂質送
達技術が、Ｂｒｉｇｈａｍの米国特許第５，６７６，９５４号、１９９７年１０
月１４日発行、に記載されており、これは参照のためにすべての図面を含むその
全体をここに援用する。
【００６０】 カチオン性脂質とＤＮＡとの電荷比もまた重要な要因であり、好ましい実施形
態においては、ＤＮＡおよびカチオン性脂質は、負電荷対正電荷の比が１：０．
１〜１：１０の間であるような量で、好ましくは１：０．３〜１：６の間である
ような量で、より好ましくは約１：３であるような量で存在する。好ましくはあ
るが、比が１：３であることは必ずしも必要ではない。従って、好ましくは、組
成物に必要な電荷比は約１：０．１〜１：１０の間であり、より好ましくは約１
：０．３〜１：６の間である。
【００６１】 用語“カチオン性脂質”は、生理学的なｐＨにおいて正味の正電荷を有する脂
質、好ましくは、そのようなｐＨにおいて負の電荷を有さない脂質をいう。その
ような脂質の例がＤＯＴＭＡである。同様に、“中性の共脂質”は、生理学的な
ｐＨにおいて通常は非荷電である脂質をいう。そのような脂質の例がコレステロ
ールである。
【００６２】 従って、ＤＮＡおよびカチオン性脂質に関する“負電荷対正電荷の比”は、カ
チオン性脂質における正味の正電荷と比較したＤＮＡにおける正味の負電荷の比
をいう。
【００６３】 ＤＮＡの形態は発現効率に影響を及ぼすので、ＤＮＡは、好ましくは少なくと
約８０％がスーパーコイル状であり、より好ましくは少なくとも約９０％がスー
パーコイル状であり、最も好ましくは少なくとも約９５％がスーパーコイル状で
ある。組成物は、好ましくは、本質的に約１０％のラクトースからなる等張性の
炭水化物溶液のような等張性の炭水化物溶液を含む。好ましい実施形態において
、組成物、カチオン性脂質および中性の共脂質は、１００ナノメートル〜１，０
００ナノメートルの間、好ましくは２００ナノメートル〜９００ナノメートルの
間、より好ましくは約８００ナノメートルの押出しサイズを有するリポソームと
して調製される。好ましくは、リポソームは、約２０ｎｍ〜８００ｎｍの間、よ
り好ましくは約５０ｎｍ〜４００ｎｍの間、さらにより好ましくは約７５ｎｍ〜
２００ｎｍの間、最も好ましくは約１００ｎｍの平均直径を有するように調製さ
れる。マイクロ流動化が、そのようなリポソームの好ましい調製方法である。
【００６４】 別の側面において、本発明は、（ａ）抗血管形成コード化配列を含むプラスミ
ドおよびカチオン性脂質を、好ましくは中性の共脂質とともに有する第１の成分
であって、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、中性の共脂質がコレステロール
であり、かつプラスミド中のＤＮＡおよびカチオン性脂質は、負電荷対正電荷の
比が１：０．１〜１：１０の間、好ましくは、１：０．３〜１：６の間、より好
ましくは約１：３、であるような量で存在する第１の成分と、（ｂ）保護的な相
互作用性の非凝縮性化合物を含み、第１の成分がその内部に存在する第２の成分
とを含有する組成物を特徴とする。
【００６５】 別の側面において、本発明は、保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、第１
の抗血管形成コード化配列、好ましくは、アンギオスタチンコード化配列、を含
む第１のプラスミドと、第２の抗血管形成サブユニットコード化配列、好ましく
は、エンドスタチンコード化配列、を独立して有する１つまたは複数の他のプラ
スミドとを有する組成物を提供する。
【００６６】 他の側面において、本発明は、保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、アン
ギオスタチンコード化配列を有する第１のプラスミドと、エンドスタチンコード
化配列を有する１つまたは複数の他のプラスミドとを含む組成物を特徴とする。
【００６７】 本発明により、抗血管形成コード化配列を有するプラスミドおよびカチオン性
脂質を、好ましくは中性の共脂質とともに含有する組成物もまた提供される。
【００６８】 他の側面において、本発明は、組織特異的エレメントおよび抗血管形成コード
化配列をプラスミドに挿入することによって、上記に記載されるプラスミドのい
ずれかを作製するための方法を特徴とする。
【００６９】 本発明はまた、上記に記載される組成物の作製方法を提供する。この方法は、
（ａ）抗血管形成コード化配列を含有する転写ユニットを有するＤＮＡ分子を調
製すること；（ｂ）保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を調製すること；およ
び（ｃ）保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を、ＤＮＡと、治療的有効量の抗
血管形成コード化配列を哺乳動物に送達し得る組成物が形成されるような条件で
組み合わせることを含むことができる。
【００７０】 好ましくは、ＤＮＡ分子はプラスミドである。この場合、プラスミドは抗血管
形成コード化配列を含み、より好ましくは、ヒト成長ホルモン３‘非翻訳領域／
ポリ（Ａ）シグナルをも含む。
【００７１】 この方法は、（ａ）抗血管形成コード化配列を有するＤＮＡを調製する工程；
（ｂ）カチオン性脂質を、好ましくは中性の共脂質との混合物で調製する工程で
あって、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、中性の共脂質がコレステロールで
ある工程；および（ｃ）カチオン性脂質を、ＤＮＡと、カチオン性脂質およびＤ
ＮＡが１：０．１〜１：１０の間、好ましくは１：０．３〜１：６の間、より好
ましくは約１：３、の負電荷対正電荷の比で存在するような量で組み合わせる工
程を含むことができる。
【００７２】 別の実施形態において、この方法は、（ａ）抗血管形成コード化配列を含有す
るプラスミドおよびカチオン性脂質を、好ましくは中性の共脂質とともに有する
第１の成分を調製する工程であって、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、中性
の共脂質がコレステロールであり、かつプラスミド中のＤＮＡおよびカチオン性
脂質は、負電荷対正電荷の比が１：０．１〜１：１０の間、好ましくは１：０．
３〜１：６の間、より好ましくは約１：３、であるような量で存在する工程；（
ｂ）保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を有する第２の成分を調製する工程；
および（ｃ）第１および第２の成分を、得られた組成物が第２の成分の内部に第
１の成分を含むように組み合わせる工程を含む。
【００７３】 別の実施形態において、この方法は、（ａ）保護的な相互作用性の非凝縮性化
合物を調製する工程、（ｂ）第１の抗血管形成コード化配列、好ましくは、アン
ギオスタチンコード化配列、を有する第１のプラスミドを調製する工程、（ｃ）
他の抗血管形成コード化配列、好ましくは、エンドスタチンコード化配列、を独
自に有する１つまたは複数の他のプラスミドを調製する工程、および（ｄ）保護
的な相互作用性の非凝縮性化合物と、第１の抗血管形成コード化配列を有するプ
ラスミドと、他のプラスミドとを組み合わせる工程を含む。
【００７４】 本発明の組成物を作製する方法はまた、プラスミドを、抗血管形成コード化配
列およびカチオン性脂質と、そして好ましくは、同様に、中性の共脂質とも組み
合わせることを含むことができる。
【００７５】 別の側面において、本発明は、哺乳動物の異常または疾患を、そのような異常
または疾患を罹っている哺乳動物に、以下に記載する治療的有効量のプラスミド
を投与することによって処置するための方法を提供する。
【００７６】 組成物の“治療的有効量”は、疾患または異常の症状または徴候の少なくとも
一時的な軽減または改善をもたらすのに十分な量である。従って、そのような量
はまた、薬理学的効果をもたらすのに十分である。組成物のそのような量は、永
続的な改善あるいはすべての症状または徴候の改善をもたらす必要はない。癌治
療剤の治療的有効量は、転移疾患の場合における全体的な腫瘍領域（すなわち、
転移物の数またはそれらのサイズ）を減少させる量であり、あるいは、限局性癌
における腫瘍塊を小さくさせる量である。
【００７７】 上記の異常または疾患は、好ましくは癌であり、例えば、腺腫および腺癌を含
む上皮腺癌；ポリープ、乳頭腫、扁平上皮細胞癌および移行上皮細胞癌を含む扁
平癌および移行性癌；ポジティブ型組織タイプ、肉腫および他（の腫）を含む結
合組織癌；リンパ腫、白血病およびホジキンス病を含む造血癌およびリンパ細網
癌；神経腫、肉腫、神経線維腫および芽細胞腫を含む神経組織癌；奇形腫および
奇形癌を含む混合組織起源の癌である。処置に適用され得る他の癌性異常には、
下記のいずれかの癌が含まれる：副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍；成
人の癌、乳癌、原発部位が不明な癌、胃腸管の類癌腫、頸部癌、小児癌、結腸癌
および直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌および頸部癌、小島細胞癌および他の膵
臓腺癌、カポジ肉腫、腎臓癌、白血病、肝臓癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌
、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンス病リンパ腫、非ホジキンス病リンパ腫、メ
ラノーマ、中皮腫、転移癌、多発性筋炎、卵巣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、膵臓癌、
副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、骨および柔組織の肉腫、皮膚癌、小
腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜疾患、子宮：子宮内膜癌、子宮
：子宮肉腫、膣癌、または外陰部癌。本発明の組成物は、好ましくは注射により
投与される。しかし、本発明の方法はまた、半ビボで行うことができる。
【００７８】 別の側面において、本発明は、細胞をトランスフェクションするのに十分な時
間にわたって細胞をここに記載されているプラスミドと接触させることによって
細胞をその場でトランスフェクションするための方法（すなわち、遺伝子を細胞
に送達して発現させるための方法）を提供する。細胞のトランスフェクションは
、好ましくは生体内で行われ、そのような接触は、好ましくは約５％のＰＶＰ溶
液の存在下で行われる。
【００７９】 別の側面において、本発明は、（ａ）多数の細胞を本発明のプラスミドまたは
組成物でトランスフェクションすること；および（ｂ）その多数の細胞を、ベク
ター内の核酸配列（この核酸配列は抗血管形成因子をコード化する）の発現を可
能にする条件下で培養することによって、多数の細胞における抗血管形成遺伝子
の送達および発現を行うための方法を特徴とする。
【００８０】 好ましい実施形態において、抗血管形成因子はヒトの抗血管形成因子であり、
細胞はヒト細胞であり、かつ／またはその接触は約５％のＰＶＰ溶液の存在下で
行われる。
【００８１】 別の側面において、本発明は、本発明のプラスミドまたは組成物で細胞をその
場でトランスフェクションすることによって疾患または異常を処置するための方
法を特徴とする。“その場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）”は、細胞によっては生体内ま
たは生体外であり得る細胞の本来の発生位置におけることを意味する。従って、
ここで求められているように、例えば、その場でのトランスフェクションは、半
ビボトランスフェクションと区別するために主として使用される用語である。上
記の疾患または異常は、限局性の疾患または異常（例えば、固形腫瘍）、あるい
は全身的な疾患または異常（例えば、転移癌）であり得る。
【００８２】 別の側面において、本発明は、本発明のプラスミドまたは組成物でトランスフ
ェクションされた細胞を特徴とする。
【００８３】 さらに別の側面において、本発明は、哺乳動物の異常または疾患を、そのよう
な異常または疾患を罹っている哺乳動物に、ここに記載する組成物の治療的有効
量を投与することによって処置するための方法を特徴とする。
【００８４】 哺乳動物の異常または疾患を処置するための方法はまた、そのような異常また
は疾患に罹っている哺乳動物に、アンギオスタチンコード化配列を有する第１の
プラスミドとエンドスタチンコード化配列を有する第２のプラスミドとの組成物
の治療的有効量を投与することを特徴とし、そのような投与を含む。
【００８５】 これらの組成物は生体内における細胞への核酸分子の送達に有用であるので、
関連した側面において、本発明により、組成物が投与の生体内部位において提供
される。特に、これには、哺乳動物における生体内部位が含まれる。
【００８６】 好ましい実施形態において、核酸分子は、遺伝子産物をコード化する配列を含
む。好ましい実施形態においてもまた、投与部位は、動物、特に哺乳動物、の間
質空間または間質組織においてである。
【００８７】 本発明はまた、上記組成物の使用方法を提供する。従って、さらなる関連する
側面において、組成物が、哺乳動物に、好ましくは、組織または間質空間に導入
される組成物の投与方法が提供される。
【００８８】 この分野で知られているような様々な送達方法を利用することができるが、好
ましい実施形態においては、組成物は注射によって組織または間質空間に導入さ
れる。組成物はまた、様々な異なる組織に送達され得るが、好ましい実施形態に
おいては、そのような組織は筋肉または腫瘍である。
【００８９】 別の関連する側面において、本発明は、上記に記載されている組成物の治療的
有効量を投与することによって哺乳動物の異常または疾患を処置するための方法
を提供する。好ましい実施形態において、そのような異常または疾患は癌である
。
【００９０】 上記に記載した本発明の要約は非限定的なものであり、本発明の他の特徴およ
び利点は、下記の好適な実施形態の詳細な説明、ならびに請求項から明らかとな
るであろう。
【００９１】 好ましい具体例の詳細な説明 本発明のプラスミド、関連産物および方法は、以下に詳細に記述される。 Ｉ．一般原理 本発明は、哺乳類細胞中の抗血管形成コーディング配列の送達および発現につ
いての発現系、および哺乳類に対するそのような発現系または他の発現系を送達
する処方および方法に関する。 したがって、抗血管形成剤、好ましくはヒト・エンドスタチンまたはアンギオ
スタチンをコードするヌクレオチド配列を含む、特定の遺伝子コンストラクトが
、記述されている。このようなコンストラクトは、ここに記述されるとおり有益
に処方され、そして投与され、それにより本発明の発現系を利用しうる。
【００９２】 このようなプラスミドの具合のよい産生をさせるために、プラスミドが、高い
コピー数まで細胞での複製をする能力があることが一般的に好ましい。一般に、
このような産生は、原核生物の細胞、特にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ
．ｃｏｌｉ））細胞で行われる。したがって、プラスミドは、原核生物の細胞中
で機能性のある複製起点を含むのが好ましく、そして好ましくは、複製起点が、
高いコピー数に複製を指示するものである。 プラスミドコンストラクト中で合成遺伝子要素を利用することも可能である。 以下に記述されるとおり、これらの要素は、真核生物系での転写後プロセシン
グに影響を及ぼす。したがって、合成配列の使用は、特定の用途のために所望さ
れるとおりプロセシング特性の設計を可能にする。一般に、その要素は迅速で、
そして正確なプロセシングを提供するように設計される。 哺乳類系に対する所望の発現産物をコードするＤＮＡを送達するために、送達
システムを利用することが通常好ましい。このような系は、複数の利益を提供で
き、特に、ＤＮＡの完全性を保護する安定化する他、細胞への取込を促進する。
【００９３】 さらに、その処方の非ＤＮＡ成分は、免疫系増強または活性化に寄与しうる。
結果として、送達システムの成分は、免疫刺激効果を増強または最小限にする特
定の遺伝子産物と関連して選択されうる。 プラスミドは、サイトカイン、例えばＩＬ−１２またはその１つまたはそれ以
上のサブユニットのような抗癌または抗腫瘍剤の発現のための要素をも包含しう
る。 治療用分子の「サブユニット」は、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子であり、１
つまたはそれ以上の他の分子と合せて、関連する製剤上の活性を示す複合体を形
成する。このような複合体の例としては、ホモ二量体およびヘテロ二量体の他、
より多くのサブユニットを有する複合体が挙げられる。ヘテロ二量体の特定の例
は、ｐ４０およびｐ３５のサブユニットを有するＩＬ−１２である。 同様に、治療は、単独のプラスミドまたは別々のプラスミドのいずれかにおけ
る抗血管形成性コーディング配列、および１つまたはそれ以上のサイトカインま
たは他の抗癌または抗腫瘍コーディング配列の投与に関与しうる。このようなプ
ラスミドは、保護的、相互作用性の非縮合化合物である、カチオン性脂質および
中性共脂質、またはこれらの双方とともに、送達のための組成物に組込まれうる
。
【００９４】 これらが、特に有効な例である一方で、その他の成分が、本発明の抗血管形成
発現ベクターを含む処方で利用されて、抗血管形成剤の有効な送達および発現を
提供し、あるいは免疫系成分の活性化の操作が望みうる他のコーディング配列を
提供する。 コーディング配列の選択と関連して、送達システムの成分および製造方法の選
択により、コード化された遺伝子産物の特定の効果と送達システム組成物全体の
免疫系効果の均衡を取ることができる。送達システム処方の投与の生物学的効果
を制御するかかる能力は、抗血管形成剤をコードするコンストラクトと送達シス
テムの特定の処方に加えて、本発明の一つの態様を表す。コード化遺伝子産物と
、送達システム成分及びそのパラメーターとの同時選択は、高いレベルの遺伝子
発現をただ提供するよりむしろ所望の効果の増強を提供する。特に、そのような
増強は、典型的なＰＶＰ含有組成物の抗腫瘍効果として、以下に記述される。
【００９５】 ＩＬ−１２も投与される系について、抗腫瘍効果は、単に添加したというより
も大きい（すなわち、単に、抗血管形成剤単独およびＩＬ−１２単独の抗腫瘍効
果の総計より大きい）可能性がある。免疫刺激効果の増強は、例えば、ワクチン
用途についての他の関連においても好ましい。 対照的に、ある種の用途については、免疫系効果を最小限にする送達系を選択
することが好ましい。例えば、肺組織の腫れを最小限にするために、免疫系活性
化が、肺に送達されるべき組成ついて最小限にされるのがしばしば好ましい。 特定のコーディング配列についての送達システム成分および調製技術を選択す
るための有用なアプローチ法は、以下のとおり進行しうるが、しかしこれらの工
程及びその順序に限定されるものではない。
【００９６】 １．インビトロでの適切な発現を提供する特定の遺伝子コンストラクトを選択
する。 ２．望ましい免疫刺激効果および／または生体内の生理学的効果に基づいて送
達システムの成分を選択する。このような効果は生体内のモデル系で試験され確
認される。 ３．望ましい免疫刺激効果と調和し、および／または望ましい生体内での生理
学上の効果の増強と調和する、他の送達システムのパラメーターを選択する。例
えば、このようなパラメーターとしては、１つまたはそれ以上の他の組成物成分
に対するＤＮＡの量および比率、非ＤＮＡ組成物成分の相対量、送達システム処
方粒子のサイズ、環状ｄｓＤＮＡベクターについてのスーパーコイルＤＮＡの含
有率、および送達システム処方粒子の調製のための特定の方法が挙げられる。特
定のタイプの処方に関連する特定のパラメーターは、明らかであるか、あるいは
試験によって容易に決定される。
【００９７】 以下の説明は、抗血管形成剤コードコンストラクトに関する、成分およびパラ
メーターの選択を例示する。しかし、そのアプローチ法は、多様な他のコーディ
ング配列を含むコンストラクトに使用可能であることが認識されるべきである。 ＩＩ．プラスミドコンストラクト発現系 Ａ．プラスミド設計および構築 本発明の方法およびコンストラクトについて、抗血管形成剤をコードする配列
の送達および発現について有用である多数の異なるプラスミドが構築された。し
たがって、これらのプラスミドは、抗血管形成剤のためのコーディング領域を、
それらのコーディング領域の発現に必要であるか、または有用である遺伝的要素
と一緒に含む。
【００９８】 これらの具体例が、特定の出所から得られるｃＤＮＡクローンまたは部分的ゲ
ノム配列を利用した一方で、当業者は、他の出所から抗血管形成コーディング配
列を容易に得るか、または公表された抗血管形成コーディングおよび／またはフ
ランキング配列に基づくプローブ（類）を用いてライブラリー中のｃＤＮＡクロ
ーンを同定することによってコーディング配列を得ることができた。 抗血管形成剤についてのコーディング配列は、真核生物および細菌の遺伝的要
素を含む発現プラスミドに組込まれた。真核生物の遺伝的要素としては、ＣＭＶ
即時型プロモーター及び５’ＵＴＲ、および、ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲ／ポ
リ（ａ）シグナルが挙げられる。これらは、ＲＮＡプロセシングの正確性および
効率、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳を制御することによって遺伝子発現に影響を
及ぼす。
【００９９】 ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲは、ヒト成長ホルモン遺伝子から得られ、そして
好ましくは、ポリ（ａ）シグナルを含む。この配列は、ｃＤＮＡ配列、ゲノム配
列、修飾されたゲノム配列、あるいは抗血管形成剤をコードする合成配列につい
ての自然の翻訳終止コドンに続いて直ぐに連結されうる。 ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲ／ポリ（ａ）シグナルの例は、下のヒト成長ホル
モン３’ＵＴＲ（ヌクレオチド１−１００）および３’フランキング配列（ヌク
レオチド１０１−１９１；ジーンバンクアクセス番号Ｊ０３０７１、ＨＵＭＧＨ
ＣＳＡ）によって示される。 1 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGT ポリ（ａ）シグナル 51 TGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCA 101 TTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTG 151 GTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGC
【０１００】 ５’および３’ＵＴＲおよびフランキング領域は、さらに、より正確に、通常
の方法論、例えば欠失または突然変異分析や、あるいは同等の方法によって同定
することができ、適切な転写及び翻訳機能を示す他の配列を提供するように修飾
されうる。プラスミド、プラスミド骨格、ヒト抗血管形成ｃＤＮＡ、および最終
コンストラクトの構築は、実施例で以下に記述される。 以下に検討される数種のＥＣ−特異的プロモーターは、文献に記述されている
。
【０１０１】 インビトロで高濃度およびＥＣ−特異的発現を支持することが示されたヒトの
バン・ウイルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子フランキング領域および最初のエク
ソンは、インビボでのＥＣの副集団のみでｌａｃＺを発現し、そして実験された
種々の臓器の血管床では発現しなかった（Ａｉｒｄら、ＰＮＡＳ、９２巻：４５
６７−４５７１頁（１９９５年））。それは、非特異的コアプロモーター（−９
０から＋２２まで）、全ての細胞型でその活性を阻害する陰性要素（−４７８か
ら−３００まで）、およびＥＣ中でのみ抑制を解除する陽性要素から構成され、
そしてＥＣ特異的発現（＋１５０から＋２４７まで）を生じる。この陽性要素が
、ウシのｖＷＦプロモーターに現れないことが示された。
【０１０２】 プレプロエンドセリン（ＥＴ−１）遺伝子プロモーターは、ヒトのエンドセリ
ン遺伝子プロモーター（−２４０から−８６まで）の１１９塩基対（「ｂｐ」）
断片であり、最小のＳＶ４０プロモーターに融合した場合にＣＡＴのＥＣ特異的
発現を指示する。ネズミのＥＴ−１プロモーターは、トランスジェニックマウス
中のＬＵＣまたは脂質過酸化酵素のいずれかの発現を指示する（Ｈａｒａｔｓら
、ＪＣＩ ９５巻：１３３５−４４頁、１９９５年）。しかし、移入遺伝子の発
現は、血管のＥＣに制限されなかったが、しかし動脈平滑筋肉でも存在し、洗濯
された上皮に存在した。さらに、その発現のレベルは、動脈で高い、から静脈お
よび毛細血管で低い、までの範囲にあり、そして臓器の間およびその臓器内の両
方で発現において明らかな多様性があった。
【０１０３】 細胞内接着分子−２（ＩＣＡＭ−２）遺伝子プロモーターのＳｔｙＩ（−３３
６から＋２３まで）断片が、トランスジェニックマウスでの腎臓および肺の血管
形成に対する異種遺伝子（ＣＤ５９）発現を指示することが示された。それは、
ＴＡＴＡ欠乏プロモーターであり、そしてＳｐ１、ＧＡＴＡおよびＥＴＳ結合部
位を含む。 アルファｖベータ３インテグリンは、腫瘍上皮で優先的に発現される。アルフ
ァｖベータ３インテグリン（フィブロネクチン受容体）と対照的に、アルファｖ
ベータ３インテグリン（ビトロネクチン受容体）は、ある種の成長因子と協同す
る。その発現の阻害は、ヒトが治癒する間じゅう新たな血管形成を遮断する。 ヒトアルファｖ遺伝子の５’フランキング領域、第１エキソン、および第１イ
ントロンの一部を含む１５．５ｋｂのＤＮＡ断片が同定され、そしてヒトアルフ
ァｖ遺伝子プロモーターと名付けられた。転写開始部位は、ＡＴＧ部位の１６９
ｂｐ上流にマッピングされた。５’フランキング領域は、ＴＡＴＡボックスまた
は開始要素を含まないが、４つのＳｐ１，２つのＥｔｓおよび１つのＧＡＴＡ結
合部位を含む。アルファｖ遺伝子プロモーターの２２２ｐｂ領域は、アルファｖ
プロモーター活性に強力な正の効果を発揮することが示された。
【０１０４】 ５’からスタートコドンまでの２．０ｋｂの配列を含む６ｋｂのヒトゲノムＤ
ＮＡ断片は、ヒトのベータ３遺伝子プロモーターとして定義される。５’からス
タートコドンまでの５８４ｂｐ断片は、プロモーター欠乏の対照ＣＡＴコンスト
ラクトより５倍までＣＡＴレポーター遺伝子の発現を促進する。このベータ３プ
ロモーターは、ＴＡＴＡおよびＣＡＡＴシス作用要素を欠くが、しかし、転写開
始部位に隣接して２つのＳｐ１部位がある。ベータ３プロモーターが、ＰＭＡお
よびレチノイン酸によって上向きに調節されうるが、しかし、ＴＮＦ／ＩＦＮガ
ンマのような前炎症サイトカインによっては上向きに調節されないことが示され
た。 血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）およびその２つのＥＣ特異的受容体チ
ロシンキナーゼ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲおよびＦｌｔ−１は、生理学的および病理
学的血管形成で主要な役割を果す。マウスのＦｌｔ遺伝子プロモーターの−３１
１８から＋２０９までの断片、およびマウスのＦｌｋ−１遺伝子プロモーターの
−１８２９から＋１４８までの断片がクローン化された。低酸素症は、生体内で
のＶＥＧＦおよびその受容体の上向き調節についての主要な機構であることが示
された。一過性形質移入アッセイで、低酸素症は、Ｆｌｔ−１プロモーターの強
力な転写活性化に至るのに対して、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ転写は、実質的に変化し
ていなかった。Ｆｌｔ−１プロモーターの４３０ｂｐ領域は、低酸素症に応答し
て転写のために必要とされ、そしてこの領域は、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）
共通配列を含む。
【０１０５】 エンドセリン−１エンハンサー、マウスのエンドセリン−１遺伝子の転写開始
部位の３２０から３６４ｂｐ上流の間に配置された内皮細胞特異的調節領域は、
ＢｕおよびＱｕａｒｔｅｒｍｏｕｓによって同定された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２７２巻：３２６１３−３２６２２頁（１９９７年））。このエンハンサ
ー配列の３個のコピーは、ＥＴ−１プロモーターおよび異種プロモーターの両方
を活性化することが示された。 細胞サイクル特異的プロモーターサイクリンＡ、Ｅ２Ｆ１、またはｃｄｃ６に
よって駆動される遺伝子発現は、細胞サイクル依存形態で調節され、そしてこの
調節は、本質的に転写レベルにある。これらの遺伝子のプロモーターは、共通Ｅ
２Ｆ部位を含み、この部位は、休止Ｇ０（ゼロ）相での抑制に、そしてある種の
場合には細胞を周期変化させる上で活性化に起因する。（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｂ
．、Ｘ．Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｅｉｃｋ、およびＣ．Ｂｒ
ｅｃｈｏｔ．１９９４年）。ヒトのサイクリンＡ遺伝子の構造および細胞サイク
ルで調節された転写は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１
巻：５４９０−５４９４頁で記述される。細胞サイクル進行の正および負のレギ
ュレーターに応答したＥ２Ｆ１発現の自動調節制御は、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ
．８巻：１５１４−１５２５頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．、Ｒ．Ｖ．Ｓｈｏ
ｈｅｔ、およびＢ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ １９９７年に記述される。酵母Ｃｄｃ６
ｐ発現に関連したヒトタンパク質は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９４巻：１４２−１４７頁；Ｙａｎ，Ｚ．、Ｊ．ＤｅＧｒｅｇｏｒｉ、
Ｒ．Ｓｈｏｈｅｔ、Ｇ．Ｌｅｏｎｅ、Ｂ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ、Ｊ．Ｒ．Ｎｅｖｉ
ｎｓ、およびＲ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９８年に記述される。Ｃｄｃ６は
、Ｅ２Ｆによって調節され、そして哺乳類細胞中でＤＮＡ複製に必須である。
【０１０６】 Ｂ．合成の遺伝的要素 ある種の具体例では、一部または全ての遺伝的要素は、合成でありえて、合成
オリゴヌクレオチドに由来することができ、そしてそれゆえ自然の遺伝配列から
直接的には得られない。これらの合成要素は、多くの異なる発現ベクターに使用
するのに適切である。 ＲＮＡスプライシングが正確でそして有効であることを確実にするスプライス
部位を有する合成イントロンが設計される。ｍＲＮＡ３’末端形成およびｍＲＮ
Ａ安定性を促進する合成３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルが設計される。合成５
’ＵＴＲは、翻訳の開始を促進するように設計される。典型的な合成要素の設計
は、以下にさらに詳細に記述される。
【０１０７】 合成要素の特性の要約 典型的な合成５’ＵＴＲ、イントロン、および３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナ
ルは、以下に示される一般的特性を示す： ５’ＵＴＲ 短い 二次構造の欠如 コザック配列 イントロン挿入のための部位 イントロン ５’スプライス部位配列は、共通に適合する。 ５’スプライス部位配列は、Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端に正確に相補性である
。 分岐点配列は、共通に適合する。 分岐点配列は、Ｕ２ｓｎＲＮＡに相補性である。 ３’スプライス部位は、共通に適合する。 ポリピリミジン束は、長さ１６塩基であり、そして７個の逐次Ｔを含む。（束
は、少なくとも５個の逐次Ｔを含むのが好ましい。） 内部制限酵素部位を含む。 ＢｂｓＩは５’ｓｓで切断し、ＥａｒＩは３’ｓｓで切断する。 ３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ） ウサギのβ−グロブリン３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルに基づく。 タンデムに２個のポリ（Ａ）シグナルから構成される。
【０１０８】 合成５’ＵＴＲ（ＵＴ６）の特性 ５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、メッセンジャーＲＮＡの翻訳効率に影響を
及ぼし、したがって、真核生物の遺伝子発現の重要な決定因子である。治療目的
の遺伝子を発現するベクターによってコードされたｍＲＮＡの翻訳効率を最大限
にする合成５’ＵＴＲ配列（ＵＴ６）が設計された。 合成５’ＵＴＲ（ＵＴ６）の配列は、以下に示される。コザック配列は、太字
であり、そしてスタートコドンは、二重下線が付けられる。イントロンの位置（
残基４８と４９の間）は、三角形で示され、そして共通スプライス部位のエキソ
ン部位を形成する配列は、一重下線が付けられる。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏ
Ｉについての制限部位は、上線が付けられている。HindIII ▽ NcoI AAGCTTACTCAACACAATAACAAACTTACTTACAATCTTAATTAACAGGCCACCATGG ｃａｐ部位およびスタートコドンの間に配置された５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ
）は、ｍＲＮＡ翻訳の効率に影響することが知られている。開始因子に対する５
’ｃａｐ構造の接近可能性、４３Ｓ前開始複合体の結合とそれに続く移動、また
は開始コドンの認識に影響する任意の特性は、ｍＲＮＡ翻訳能力に影響する。効
果的な５’ＵＴＲは、長さが中程度であり、二次構造を欠き、上流開始コドンを
欠き、そして最適な位置の状況内でＡＵＧを有するものであることが予想される
（Ｋｏｚａｋ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７６巻：８１５−８２１頁（１９９４年）
；Ｊａｎｓｅｎら、１９９４年）。これらの特徴を示す５’ＵＴＲは、５’ｃａ
ｐ構造の効果的な認識、続いてリボソームによる高速で妨害されないリボソーム
走査を可能にし、それにより翻訳開始プロセスを促進するに違いない。 合成５’ＵＴＲの配列は、長さ中程度（５４ヌクレオチド（ｎｔｓ））であり
、Ｇが欠乏しているが、ＣおよびＡ残基が豊富であり、上流ＡＴＧを欠き、最適
なコザック配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）の状況内に意図されるＡＴＧを置き、そ
して潜在的二次構造を欠くように設計された。合成５’ＵＴＲ配列は、また、ｍ
ＲＮＡを標的にするＡＵ豊富な配列を欠いて、細胞質で迅速に分解されるように
設計された。
【０１０９】 実験は、イントロンが、ｃＤＮＡベクターからの遺伝子発現を増加すること、
そして５’ＵＴＲに配置されるイントロンが、３’ＵＴＲに配置されるものより
いっそう有効であることを例示した（ＨｕａｎｇおよびＧｏｒｍａｎ、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １０巻：１８０５−１８１０頁（１９９０年）；Ｅｖａ
ｎｓおよびＳｃａｒｐｕｌｌａ、Ｇｅｎｅ ８４巻：１３５−１４２頁（１９８
９年）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５巻：８３６−８４０頁（１９８８年）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：４７８−４８２頁（１９９１年
）；Ｃｈｏｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １１巻：３０７０−３０７４
頁（１９９１年））。したがって、合成５’ＵＴＲ配列は、共通スプライス部位
配列をイントロンに合わせるように設計された。例えば、イントロンは、残基４
８と４９の間に配置されうる（以下のイントロン配列構造を参照）。位置４６−
４８にあるＣＡＧは、共通５’スプライス部位のエキソン部分である。位置４９
にあるＧは、共通３’スプライス部位のエキソン部分である。 クローニング操作を促進するために、合成５’ＵＴＲ配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ
部位で始まり、そしてＮｃｏＩ部位で終止するように設計された。
【０１１０】 合成イントロンの特性 ＲＮＡスプライシングは、ほとんどの真核生物の遺伝子の発現に必要とされる
。最適な遺伝子発現については、ＲＮＡスプライシングは、非常に高効率でそし
て正確でなければならない。ＯＰＴＩＶＳ８Ｂと称される合成イントロンは、最
大限に効率的でそして正確であるように設計された。 典型的な合成イントロン、ＯＰＴＩＶＳ８の構造は、以下に示される。５’ス
プライス部位（５’ｓｓ）、分岐点（ｂｐ）、および３‘’スプライス部位（３
’ｓｓ）についての配列は、二重下線が付されている。制限酵素ＢｂｓＩおよび
ＥａｒＩについての認識配列は、上線が付されている。ＢｂｓＩについての切断
部位は、５’ｓｓに対応し、そしてＥａｒＩについての切断部位は、３’ｓｓに
対応する。 5'ss bp 3'ss | BbsI | EarI | 5'CAG GTAAGTGTCTTC---(77)---TACTAACGGTTCTTTTTTTCTCTTCACAG G 3' ５’スプライス部位（５’ｓｓ）配列は、樹立された共通配列、ＭＡＧ↓ＧＴ
ＲＡＧＴ（ここで、Ｍ＝ＣまたはＡ、およびＲ＝ＧまたはＡである）に適合する
。スプライシングの機構は、前ｍＲＮＡおよびＵ１ｓｎＲＮＡの５’ｓｓの間の
相互作用に関与し、そしてＯＰＴＩＶＳ８Ｂの５’ｓｓ配列は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ
の５’末端に正確に相補性であるように選択された。 5'ss 5' CAGGUAAGU 3' ||||||||| U1 RNA 3' GUCCAUUCA 5' 哺乳類では、分岐点についての共通配列（ＹＮＹＴＲＡＹ、ここでＹ＝Ｃまた
はＴ，Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝任意の塩基、そして下線付きＡ残基は、実際の分岐
点である）は、非常にあいまいである。スプライシングの機構が、前ｍＲＮＡの
分岐点（ｂｐ）とＵ２ｓｎＲＮＡの間の相互作用に関与するので、ＯＰＴＩＶＳ
８Ｂの分岐点配列は、この相互作用を最大限にするために選択された。（分岐点
自身が膨れ上がることに注目されたい。）。選択配列も、酵母での前ｍＲＮＡス
プライシングについて必須であることが知られている分岐点配列に適合する。分
岐点は、特に、３’スプライス部位の１８−３８ヌクレオチド（ｎｔｓ）上流に
配置される。ＯＰＴＩＶＳ８Ｂで、分岐点は、３’スプライス部位から２４ｎｔ
ｓ上流に配置される。 BP 5' UACUAAC 3' ||||| | U2 RNA 3' AUGAU G 5' ３’スプライス部位（３’ｓｓ）の配列は、樹立した共通配列、Ｙ11ＮＹＡＧ
↓Ｇ（ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ、およびＮ＝任意の塩基である）に適合する。３
’スプライス部位では、ポリピリミジン束（Ｙ11）は、スプライス部位強度の主
要な決定因子である。ＯＰＴＩＶＳ８Ｂでの最適なスプライス部位機能について
は、ポリピリミジン束の長さは、１６塩基に延長され、そしてその配列は、７個
の逐次Ｔ残基を含むように調節された。この特性は、最適なスプライシングが、
ポリピリミジン束で少なくとも５個の逐次Ｔ残基の存在を必要とするために含ま
れる。
【０１１１】 インビトロでのスプライシングは、一般的に、イントロンが長さ＞８０ｎｔｓ
である場合最適である（Ｗｉｅｒｉｎｇａら、１９８４年；Ｕｌｆｅｎｄａｈｌ
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３巻：６２９９−６３１５頁（１９８
５年））。多くのイントロンが、長さ数千の塩基でありうるが、ほとんどの自然
に生じるイントロンは、長さ９０−２００ｎｔである（Ｈａｗｋｉｎｓ、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６巻：９８９３−９９０８頁（１９８８年））。
合成イントロンの長さ（１１８ｎｔｓ）は、この後者の範囲内に入る。 ３個の内部制限酵素部位、ＢｂｓＩ、ＮｈｅＩおよびＥａｒＩを有するＯＰＴ
ＩＶＳ８Ｂが、設計された。これらの制限部位は、合成イントロン配列を含む遺
伝子のスクリーニングおよび同定を促進する。加えて、ＢｂｓＩおよびＥａｒＩ
部位が、それらの切断部位は、５’ｓｓ（ＢｂｓＩ）または３’ｓｓ（ＥａｒＩ
）に正確に対応するように配置された。ＥａｒＩ制限部位を供給するポリピリミ
ジン束の配列が、特に設計された。これらの配置でのＢｂｓＩおよびＥａｒＩ部
位の封入は、それらが、イントロンを、遺伝子から正確に欠失させるので有用で
ある。それらは、遺伝子内の他の配置に挿入されえた「イントロン・カセット」
の生成をも可能にする。 ＢｂｓＩ部位と分岐点配列との間の７７個の塩基は、ＮｈｅＩ制限部位を封入
する以外は配列中では任意である。
【０１１２】 （合成３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルの特性） 真核生物のｍＲＮＡの３’末端は、ポリアデニル化の過程によって形成される
。この過程は、部位特異的部位ＲＮＡ切断、続いてポリ（Ａ）尾部を添加するこ
とに関与する。ポリ（Ａ）尾部を欠くＲＮＡは、非常に不安定である。したがっ
て、切断／ポリアデニル化の効率は、ｍＲＮＡレベル、そしてそれにより、遺伝
子発現レベルの主要な決定因子である。２ＸＰＡ１は、合成配列であり、２個の
有効なポリ（Ａ）シグナルを含み、ポリアデニル化で最大限に有効であるように
設計されている。 ポリ（Ａ）シグナルは、ほとんどの真核生物のｍＲＮＡの３’末端の形成に必
要とされる。シグナルは、２つのＲＮＡプロセシング反応：ＲＮＡ転写産物の部
位特異的エンドヌクレオチド切断、および、ポリ（Ａ）尾部形成のために、新た
に産生された３’末端へのアデニレート（およそ２５０）の段階添加を指示する
。ポリ（Ａ）シグナルは、３つの部分：ヘキサヌクレオチド、切断部位、および
下流要素を有する。ヘキサヌクレオチドは、典型的には、ＡＡＵＡＡＡであり、
そして切断部位は、最も頻繁にはジヌクレオチドＣＡに対応する３’側である（
Ｓｈｅｅｔｓら、１９８７年）。下流要素は、最適なポリ（Ａ）シグナル機能に
必要とされ、そして切断部位の下流に配置される。下流要素についての配列必要
性は、まだ十分に樹立されていないが、一般に、ＵＧ−またはＵ−豊富な配列と
して見られる（Ｗｉｃｋｅｎｓ、１９９０年；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ、
６４巻：６７１−６７４頁、１９９１年；Ｗａｈｌｅ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１
４巻：１１３−１１８頁、１９９２年；ＣｈｅｎおよびＮｏｒｄｓｔｒｏｍ、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻：２５６５−２５７２頁、１９９２年）
【０１１３】 自然に生じるポリ（Ａ）シグナルは、それらの効率は非常に多様である（Ｐｅ
ｔｅｒｓｏｎ、１９９２年）。特定のポリ（Ａ）シグナルの効果は、下流要素の
品質によって主に決定される（Ｗａｈｌｅ、１９９２年）。治療目的の遺伝子を
発現するように設計された発現ベクターで、可能な限り効率的であるポリ（Ａ）
シグナルを有することが重要である。 ポリ（Ａ）効率は、切断およびポリアデニル化されそこなった転写産物は、核
画分で迅速に分解されるので、遺伝子発現に重要である。実際に、非ポリアデニ
ル化ＲＮＡが、非常に不安定であるので、生きた細胞でのポリアデニル化の効率
は、測定するのが困難である。ｍＲＮＡ安定性について必要とされるべきである
のに加えて、ポリ（Ａ）尾部は、ｍＲＮＡの翻訳能力に寄与し、そしてスプライ
シングまたはＲＮＡ輸送のような他のＲＮＡプロセシング反応に影響しうる（Ｊ
ａｃｋｓｏｎおよびＳｔａｎｄａｒｔ、Ｃｅｌｌ、６２巻：１５−２４頁、１９
９０年；Ｗａｈｌｅ、１９９２年）。 ある種の真核生物の遺伝子は、１つ以上のポリ（Ａ）部位を有し、それにより
切断／ポリアデニル化反応が、最初の部位で生じることに失敗すると、後半部位
の内の１つで生じることが暗示される。ＣＯＳ細胞形質導入実験で、２個の強力
なポリ（Ａ）部位を有する遺伝子は、単独の強力なポリ（Ａ）部位を有するもの
よりおよそ２倍多くのｍＲＮＡを生じた（Ｂｏｒｄｏｎａｒｏ、１９９５年）。
これらのデータは、転写産物の際立った画分が、単独の「効率的な」ポリ（Ａ）
シグナルを有する場合でさえ未プロセス化のままであることを示唆する。したが
って、１つ以上のポリ（Ａ）部位を含むことが望ましい可能性がある。
【０１１４】 典型的な合成ポリ（Ａ）シグナルの配列は、下に示される。配列は、２ＸＰＡ
と名付けられる。ヘキサヌクレオチド配列および下流要素配列は、二重下線を付
けられ、そして２つのポリ（Ａ）部位は、ｐＡ番号１およびｐＡ番号２として標
識される。具合のよい制限部位は、上線が付けられている。全体の２ＸＰＡ単位
は、ＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片としてクローニング実験で移行されうる。内部のＢ
ｓｐＨＩ断片の欠失が、１ＸＰＡ単位の形成を生じる。
【０１１５】XbaI BspHI TCTAGAGCATTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGAC G pA#1 Hex | Downstream element TCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCAC T BspHI CGGTACTAGAGCATTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATC T pA#2 Hex | Downstream element GACGTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTC T KpnI CACTCGGTACC
【０１１６】 上に示される合成ポリ（Ａ）部位の配列は、ウサギのβ−グロビンポリ（Ａ）
シグナルの配列、強力であると文献で特徴づけられたシグナルに基づいている（
ＧｉｌおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｃｅｌｌ、４９巻：３９９−４０６頁、１９
８７年：ＧｉｌおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：４７３−
４７４頁、１９８４年）。この主要な特性の内の１つは、その下流要素の構造で
あり、そしてそれは、ＵＧ−およびＵ−豊富ドメインを含む。 １ＸＰＡ配列に対応する二本鎖ＤＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチドから構
築された。その後、１ＸＰＡ配列の２つのコピーが、結合して２ＸＰＡ配列を形
成した。その配列は、第１のポリ（Ａ）シグナル含有断片の５’末端に特徴的な
ＸｂａＩ部位を有し、第二のポリ（Ａ）シグナル含有断片の３’末端に特徴的な
ＫｐｎＩ部位を有するように結合された。
【０１１７】 Ｃ．コーディング配列 数種の天然のヒト抗血管形成コーディング配列のヌクレオチド配列が知られて
おり、そして以下に、抗血管形成剤もコードする合成配列とともに提供される。 ある場合には、目的の抗血管形成剤をコードする天然の配列の代わりに、抗血
管形成剤をコードする合成配列を利用することは有効である。このような合成配
列は、天然配列とは異なるコドンを利用し、それゆえ、天然の配列とは劇的に異
なるヌクレオチド配列を有している。特に、ヒトでの発現のために少なくとも部
分的に最適化されたコドン用法を示す合成配列が使用されうる。天然配列は、こ
のような最適なコドン用法を示さない。好ましくは、実質的に全てのコドンが最
適化される。 ヒトにおける最適なコドン用法は、図１６に示すように、高発現されるヒト遺
伝子におけるコドン使用頻度によって示される。コドン用法チャート図は、ウイ
スコンシン州マディソンのジェネティックス・コンピュータ・グループの、ウイ
スコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージ、バージョン８．１から得ら
れるプログラム「Ｈｕｍａｎ＿Ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」から得られる。高度に発現さ
れたヒト遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンは、ヒト宿主細胞における発現に
ついての最適なコドンであることが推定され、それゆえ、合成コーディング配列
を構築する根拠となる。合成抗血管形成コーディング配列の例は、以下の表で底
部の配列として示される。
【０１１８】 しかし、十分に最適化されたコドン用法を示す配列を使用するよりも、同じア
ミノ酸が、あまり一緒に密着するか、または豊富であるので適切に一様なコドン
用法を行うことができない領域以外で最適化したコドン用法を備える配列を使用
することが好ましい。 さらに、実質的にコドン用法が最適化された実質的部分を備える合成配列を使
用できる。例えば、天然のコーディング配列と比較して、少なくとも５０％、７
０％、８０％または９０％の最適化コドンを有する合成配列を使用できる。他の
特定の合成配列は、図１６中のコドン用法チャート図を参照して選択できる。配
列は、ポリペプチド配列のアミノ酸の各々についてのコドンを選択することによ
って選定される。その後、ポリペプチドの各々に対応するＤＮＡ分子は、通常の
化学的合成方法によって構築されうる。例えば、短いオリゴヌクレオチドが合成
され、そしてその後、適切な関係で連結されて、全長のコーディング配列を構築
する。 当業者は、最適化コドン用法を用いた種々の核酸配列を構築できることを認識
するであろう。 ヒトＩＰ−１０、エンドスタチンおよびアンギオスタチンについての好ましい
コドン用法は、以下に規定される。
【０１１９】 ヒトＩＰ−１０についての好ましいコドン配列 1 aagcttacca tgaaccagac cgccatcctg atctgctgcc tgatcttcct gaccctgagc 61 ggcatccagg gcgtgcccct gagccgcacc gtgcgctgca cctgcatcag catcagcaac 121 cagcccgtga acccccgcag cctggagaag ctggagatca tccccgccag ccagttctgc 181 ccccgcgtgg agatcatcgc caccatgaag aagaagggcg agaagcgctg cctgaacccc 241 gagagcaagg ccatcaagaa cctgctgaag gccgtgagca aggagatgag caagcgcagc 301 ccgggcggag gtggcagcgg cggaggtggc agcggcggag gtggcagcgg atcctctaga
【０１２０】 ヒトエンドスタチンについての好ましいコドン配列 1 CACAGCCACC GCGACTTCCA GCCCGTGCTG CACCTGGTGG CCCTGAACAG 51 CCCCCTGAGC GGCGGCATGC GCGGCATCCG CGGCGCCGAC TTCCAGTGCT 101 TCCAGCAGGC CCGCGCCGTG GGCCTGGCCG GCACCTTCCG CGCCTTCCTG 151 AGCAGCCGCC TGCAGGACCT GTACAGCATC GTGCGCCGCG CCGACCGCGC 201 CGCCGTGCCC ATCGTGAACC TGAAGGACGA GCTGCTGTTC CCCAGCTGGG 251 AGGCCCTGTT CAGCGGCAGC GAGGGCCCCC TGAAGCCCGG CGCCCGCATC 301 TTCAGCTTCG ACGGCAAGGA CGTGCTGCGC CACCCCACCT GGCCCCAGAA 351 GAGCGTGTGG CACGGCAGCG ACCCCAACGG CCGCCGCCTG ACCGAGAGCT 401 ACTGCGAGAC CTGGCGCACC GAGGCCCCCA GCGCCACCGG CCAGGCCAGC 451 AGCCTGCTGG GCGGCCGCCT GCTGGGCCAG AGCGCCGCCA GCTGCCACCA 501 CGCCTACATC GTGCTGTGCA TCGAGAACAG CTTCATGACC GCCAGCAAGT 551 GA
【０１２１】 ヒトアンギオスタチンについての好ましいコドン配列 1 ATGGAGCACA AGGAGGTGGT GCTGCTGCTG CTGCTGTTCC TGAAGAGCGG 51 CCAGGGCGAG CCCCTGGACG ACTACGTGAA CACCCAGGGC GCCAGCCTGT 101 TCAGCGTGAC CAAGAAGCAG CTGGGCGCCG GCAGCATCGA GGAGTGCGCC 151 GCCAAGTGCG AGGAGGACGA GGAGTTCACC TGCCGCGCCT TCCAGTACCA 201 CAGCAAGGAG CAGCAGTGCG TGATCATGGC CGAGAACCGC AAGAGCAGCA 251 TCATCATCCG CATGCGCGAC GTGGTGCTGT TCGAGAAGAA GGTGTACCTG 301 AGCGAGTGCA AGACCGGCAA CGGCAAGAAC TACCGCGGCA CCATGAGCAA 351 GACCAAGAAC GGCATCACCT GCCAGAAGTG GAGCAGCACC AGCCCCCACC 401 GCCCCCGCTT CAGCCCCGCC ACCCACCCCA GCGAGGGCCT GGAGGAGAAC 451 TACTGCCGCA ACCCCGACAA CGACCCCCAG GGCCCCTGGT GCTACACCAC 501 CGACCCCGAG AAGCGCTACG ACTACTGCGA CATCCTGGAG TGCGAGGAGG 551 AGTGCATGCA CTGCAGCGGC GAGAACTACG ACGGCAAGAT CAGCAAGACC 601 ATGAGCGGCC TGGAGTGCCA GGCCTGGGAC AGCCAGAGCC CCCACGCCCA 651 CGGCTACATC CCCAGCAAGT TCCCCAACAA GAACCTGAAG AAGAACTACT 701 GCCGCAACCC CGACCGCGAG CTGCGCCCCT GGTGCTTCAC CACCGACCCC 751 AACAAGCGCT GGGAGCTGTG CGACATCCCC CGCTGCACCA CCCCCCCCCC 801 CAGCAGCGGC CCCACCTACC AGTGCCTGAA GGGCACCGGC GAGAACTACC 851 GCGGCAACGT GGCCGTGACC GTGAGCGGCC ACACCTGCCA GCACTGGAGC 901 GCCCAGACCC CCCACACCCA CAACCGCACC CCCGAGAACT TCCCCTGCAA 951 GAACCTGGAC GAGAACTACT GCCGCAACCC CGACGGCAAG CGCGCCCCCT 1001 GGTGCCACAC CACCAACAGC CAGGTGCGCT GGGAGTACTG CAAGATCCCC 1051 AGCTGCGACA GCAGCCCCGT GAGCACCGAG CAGCTGGCCC CCACCGCCCC 1101 CCCCGAGCTG ACCCCCGTGG TGCAGGACTG CTACCACGGC GACGGCCAGA 1151 GCTACCGCGG CACCAGCAGC ACCACCACCA CCGGCAAGAA GTGCCAGAGC 1201 TGGAGCAGCA TGACCCCCCA CCGCCACCAG AAGACCCCCG AGAACTACCC 1251 CAACGCCGGC CTGACCATGA ACTACTGCCG CAACCCCGAC GCCGACAAGG 1301 GCCCCTGGTG CTTCACCACC GACCCCAGCG TGCGCTGGGA GTACTGCAAC 1351 CTGAAGAAGT GC
【０１２２】 本発明のプラスミドによってコードされうる種々の抗血管形成因子の例が、以
下に記述される。別の例は、１９９８年１月２１に公表されたＭｉｘｓｏｎの欧
州特許公報ＥＰ０８１９ ７５８ Ａ２に記述され、あらゆる図面を含めて全体
に参照してここに組込まれる。 １．エンドスタチンおよびアンギオスタチン： エンドスタチンは、拡大しつつある血管形成阻害剤のタンパク質ファミリーの
一員である。それは、コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ＫＤａのＣ末端断片（１８４
ａ．ａ．）であり、そしてインビトロで内皮細胞増殖を、生体内で血管形成を選
択的に阻害する（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、８８巻、２７７−
２８５頁、１９９７年）。アンギオスタチンは、成熟プラスミノーゲン（３８Ｋ
ｄａおよび３６２ａ．ａ．）の内部タンパク質分解断片である（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌ
ｙ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、７９巻、３１５−３２８頁、１９９４年）。それは
、クリングル・ドメインとして知られる４つの三重ループジスルフィド結合構造
を含む。３つのクリングル・ドメイン形態が、いっそう強力であることが示され
た（Ｃａｏ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、２９４６１−７頁
、１９９６年）。前臨床研究において、Ｅ．ｃｏｌｉで発現したｒエンドスタチ
ンまたはアンギオスタチンは、高い用量（１５−１６日間の１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ
）で注入されて、腫瘍成長有効性の９７％阻害を達成した。アンギオスタチンは
、血中で２日の半減期を示すことが主張されている。
【０１２３】 ２．腫瘍抑制遺伝子： ｐ５３およびその誘導抗血管形成タンパク質トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ
−１）：ｐ５３は、ヒト腫瘍の半分で突然変異されている。野生型ｐ５３は、ｐ
２１（サイクリン依存性の阻害剤）およびｐＲＢ（別の腫瘍抑制剤）を介するこ
とによって細胞サイクルを調節する。さらに、ｐ５３は、ジスルフィド結合によ
って結合された３つの同一の１８０ｋｄサブユニットから構成される大型三量体
糖タンパク質である抗血管形成因子ＴＳＰ−１の合成を誘導する。ＴＳＰ−１遺
伝子の１０１３−１６５０によってコードされるＴＳＰ−１の断片であるＴＳＰ
ｆは、いっそう強力な抗血管形成活性を示す。陽イオンリポソームに複合された
α−アクチン駆動ｐ５３遺伝子の全身的静脈投与は、ヌードマウスにおける悪性
のヒト胸部癌の成長および転移を減少することが分かった（Ｌｅｓｏｏｎ−Ｗｏ
ｏｄら、ＰＮＡＳ、３６巻：４２１頁、１９９５年）。その一次標的は、腫瘍の
血管構造系であると考えられる。ＴＳＰｆと組合わせたｐ５３が、マウスの腫瘍
モデルにおける遺伝子治療において、ｐ５３単独より効果的に腫瘍を減少させる
ことが示された。ｐＲＢ、ｐ２１、ｐ１６および細胞サイクル依存性キナーゼの
他の阻害剤は、内皮の細胞増殖を阻害して、それにより生体内で血管形成を遮断
することも示される。バン・ヒッペル・リンダウ遺伝子（ＶＨＬ）突然変異は、
腎臓癌で最も特徴とされる。ＶＨＬの突然変異（Ｍｕｔｉｏｎ）は、ＶＥＧＦの
高い発現と非常に血管形成性を導く。野生型ＶＨＬ遺伝子の送達は、ＶＥＧＦの
発現を減少させ、そして血管形成を遮断する。
【０１２４】 ３．インテグリンαｖβ３遮断 インテグリンαｖβ３は、血管形成性血管の表面に機能的に関連する。インテ
グリンαｖβ３についてのＲＧＤ含有ペプチド・リガンドは、腫瘍を負うマウス
に静脈で注射されたときに腫瘍に戻ることができる。このリガンドは、最近、マ
ウスモデルにおける癌治療において、化学療法剤が腫瘍血管構造を標的とするの
に使用された（Ａｒａｐ，Ｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９巻：３７７頁、１９９
８年）。切断されたＭＭＰ−２（ＰＥＸ）によるインテグリンαｖβ３とマトリ
ックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）との間の相互関係の崩壊は、血管
形成を遮断することが示された。
【０１２５】 ４．血管形成因子受容体遮断： ＶＥＧＦ（ｆｌｔおよびｆｌｋ）についての、およびｂＦＧＦ（ｂＦＧＦ受容
体およびｂＦＧＦ結合タンパク質）についての受容体は、成長因子の血管形成シ
グナル発生を調節する。血管形成因子に対する抗体を中和することは、血管形成
および腫瘍の成長を遮断しえた。選択的に、可溶性受容体は、成長因子の結合に
おいて野生型受容体と競合して、それにより血管形成を遮断できる。 ５．サイトカインおよびキモカイン： ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αのようなサイトカイン、およびＩＰ−１０のよう
なキモカインは、それらの免疫調節効果に加えて、血管形成の強力な阻害剤であ
ることが示された。 ６．血栓症因子（血液凝固の刺激剤）： 組織因子（ＴＦ）は、トロンボゲン形成のカスケードについての主要な開始受
容体である。切断されたＴＦ（ｔＴＦ）は、二重特異性抗体によって腫瘍血管構
造の標的とされ、そしてマウスにおける腫瘍梗塞を引き起した（Ｈｕａｎｇ，Ｘ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻：５４７頁、１９９７年）。
【０１２６】 Ｄ．処方 多くの処方における核酸の送達および発現は、ヌクレアーゼのような生物の成
分による核酸の分解により限定される。したがって、インビボで送達されるとき
の核酸の保護は、生じる発現をおおいに増強し、それにより所望の製薬学上また
は治療上の効果が増強される。溶液中で核酸（例えば、ＤＮＡ）と相互作用する
が、しかし核酸を凝縮しないある種の型の化合物は、核酸にインビボでの保護を
提供し、そしてそれに応じてコード化された遺伝子産物の発現を増強することが
分かった。 プラスミドと相互作用し、および迅速な細胞外ヌクレアーゼ分解からプラスミ
ドを保護するように設計された送達システムの使用が記述された［Ｍｕｍｐｅｒ
，Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． １３巻：７０１−７０９頁、１９９６年
；Ｍｕｍｐｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９７年。遺伝子療法に対する提起］。ＰＩＮ
Ｃシステムの特徴は、それらが、プラスミドに柔軟性を維持させ、そしてヌクレ
アーゼ分解から保護されながら筋肉を通して自由に拡散させる非凝縮システムで
あることである。ＰＩＮＣシステムが、以下に最初に検討されるが、カチオン性
脂質に基づいたシステムおよびＰＩＮＣＳとカチオン性脂質の両方を利用するシ
ステムが、本発明の範囲内でもあることが理解されるであろう。
【０１２７】 ＰＩＮＣシステムの共通の構造的成分は、それらが、親水性および疎水性部分
の両方を有する両親媒性分子であることである。ＰＩＮＣの親水性部分は、水素
結合（水素結合アクセプターまたは供与群を介して）、ファンデルワールス相互
作用、および／またはイオン性相互作用によってプラスミドと相互作用すること
が意味される。例えば、ＰＶＰおよびＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭ２Ｐ）
は、水素結合アクセプターである一方で、ＰＶＡおよびＰＧは、水素結合供与体
である。 ４つ全ての分子は、種々の（ポリ）アニオン性分子と複合体を形成することが
報告された［Ｂｕｈｌｅｒ Ｖ．、ＢＡＳＦアクチエンゲゼルシャフト・ファイ
ンケミア、ルドウィグシャフェン、３９−４２頁；Ｇａｌａｅｖ Ｙら、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍ．Ａ． ６８４巻：４５−５４頁（１９９４年）；Ｔａｒａｎｔｉｎｏ
Ｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ． ８３巻：１２１３−１２１６頁（１９９４
年）；Ｚｉａ，Ｈ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ８巻：５０２−５０４頁（１９
９１年）；］。ＰＩＮＣシステムの疎水性部分は、プラスミドをコーティングを
形成して、その表面をいっそう疎水性にさせるように設計される。Ｋａｂａｎｏ
ｖらは、先に、プラスミドの疎水性を増加させ、プラスミドをヌクレアーゼ分解
から保護し、そして生物学的膜に対するその親和性を増加させるように設計され
たプラスミド凝縮のためのカチオン性ポリビニル誘導体の使用を記述した［Ｋａ
ｂａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．およびＫａｂａｎｏｖ，Ｖ．Ａ．、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈ
ｅｍ． ６巻：７−２０頁、１９９５年；Ｋａｂａｎｏｖ，Ｖ．Ａ．ら、Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３１巻：１４３７−１４４３頁、１９９１年；Ｙａｒｏｓｌ
ａｖｏｖ，Ａ．Ａ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８４巻：１７７−１８０
頁、１９９６年］。
【０１２８】 実質的保護効果が観察される；ラットの筋肉における遺伝子発現の少なくとも
１までの対数の増強が、生理食塩水で処方されるプラスミドに関してこれらの典
型的なＰＩＮＣシステムで示された。ＰＩＮＣシステムと複合したプラスミドを
用いた筋肉内でのレポーター遺伝子の発現は、プラスミドが生理食塩水中で処方
された場合より、いっそう再現性がよかった。例えば、生理食塩水中で処方され
たプラスミドを用いて筋肉内でのレポーター遺伝子発現についての変動の係数は
、９６±３５％（ｎ＝２０例；８−１２筋肉／例）であったのに対して、ＰＩＮ
Ｃシステムで複合されたプラスミドとの変動の係数は、４０±１９％（ｎ＝３０
例；８−１２筋肉／例）であった。生理食塩水中で処方されたプラスミドを用い
たレポーター遺伝子発現についての変動の係数が高いのは、先に記述された［Ｄ
ａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４巻：１５１−９頁、
１９９３年］。さらに、ＤＮＡ：生理食塩水についての結果と対照的に、異なる
形態を示すプラスミドが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）と複合した場合にお
いて、筋肉内での遺伝子発現で有為な差異はなかった。これは、ＰＶＰが全ての
形態のプラスミドを、高速ヌクレアーゼ分解から保護できることを示唆する。
【０１２９】 １．ＰＩＮＣ高分子（ＰＶＰ）とプラスミドとの間の相互作用の要約 分子モデリングを用いて、典型的なＰＩＮＣ高分子であるＰＶＰは、プラスミ
ドの塩基対とその主たる溝内で水素結合を形成し、そしてＰＶＰのビニル骨格に
よりプラスミド上に疎水性表面を生じることが示された。これらの相互作用は、
複合プラスミドへの臭化エチジウム挿入の阻害によるのと同様に、ＰＶＰによる
プラスミド・ゼータ電位の調節によって支持される。ＰＶＰとプラスミドとの間
の見かけの結合は、ｐＨと塩濃度に相関し、そしてプラスミド／ＰＶＰ複合体の
筋肉内注射後のβ−ｇａｌ発現においてこれらのパラメーターの効果が例示され
た（Ｍｕｍｐｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９７年。遺伝子療法に対する提起）。プラ
スミド／ＰＶＰ複合体の物理化学的特性の要約は、下の表Ｉに列記される。
【０１３０】
【表１】 表Ｉ：プラスミド／ＰＶＰ複合体の物理化学的特性の要約方法 結果 分子モデリング 水素結合および疎水性プラスミド表面が観察された フーリエ変換赤外 水素結合が示された ＤＮエースＩ検証 ＰＶＰの存在下でプラスミド分解の速度が減じられる 微量滴定熱量測定 吸熱プロセスを示す正の熱の反応 電位差滴定 プラスミドおよびＰＶＰが複合化されるとき、１単位ｐＨ
低下 動的透析 ＰＶＰの拡散の速度がプラスミドの存在下で減少した ゼータ電位調節 ＰＶＰによってプラスミドの表面荷電が減少した 臭化エチジウム挿入 プラスミド／ＰＶＰ複合化によって臭化エチジウム挿入が
減少した 浸透圧 超浸透処方（すなわち、３４０ｍｏｓｍ／ｋｇＨ2Ｏ） 蛍光分光計 プラスミド／ＰＶＰ結合が、塩中で、および／またはｐＨ
７で減少した
【０１３１】 ２．筋肉内での発現の組織学 スライド走査技術を用いたβ−ｇａｌについての免疫組織化学は、ラットの脛骨
筋の全断面にわたってβ−ｇａｌ発現部位の一様な分布を示した。非常に局在化
した領域が、ＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミドが生理食塩水中で処方されたときに
、β−ｇａｌに関して陽性に染色された。β−ｇａｌ陽性細胞は、プラスミドが
生理食塩水中で注射されるときには、針管の周囲にもっぱら観察された。これは
、先に公表された結果と一致している［Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４７巻：１４６５−６８頁、１９９０年；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４巻：１５１−９頁、１９９３年；Ｄａｖｉｓ，Ｈ
．Ｌ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４巻：７３３−４０頁、１９９３年
］。 対照的に、β−ｇａｌについての免疫反応性は、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＣ
ＭＶ−β−ｇａｌプラスミド／ＰＶＰ複合体（１：１７ｗ／ｗ）の筋肉内注射の
後、筋肉組織の広範な領域で観察された。陽性筋肉繊維の大半は、筋肉束のエッ
ジに配置されるらしかった。したがって、ラットの筋肉中のβ−ｇａｌについて
の染色は、プラスミド／ＰＶＰ複合体を使用すると、β−ｇａｌについて陽性に
染色された筋肉繊維の数が、生理食塩水処方を使用して見られたよりおよそ８倍
多いことを示した。陽性に染色された筋肉繊維は、プラスミド／ＰＶＰ複合体を
使用した筋肉組織中においてより非常の多くの領域にわたって観察されもし、そ
れにより注射されたプラスミドが、筋肉内注射後、広範に分散された証拠を供し
た。
【０１３２】 ラットの骨格筋での増強されたプラスミド分布および発現は、複合化による細
胞外ヌクレアーゼ分解からの保護、およびプラスミド／ＰＶＰ複合体の高浸透圧
効果の両方の結果であった。しかし、ＤｏｗｔｙおよびＷｏｌｆｆらは、生理学
的浸透圧の２倍までの浸透圧が、筋肉内での遺伝子発現に明らかには影響しない
ことを示した［Ｄｏｗｔｙ，Ｍ．Ｅ．およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．遺伝子療法：
直接的遺伝子移行の方法および用途、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ（編）、１９９４年。
ビルクハウザー、ボストン、８２−９８頁］。これは、ＰＶＰ複合化によってプ
ラスミドの発現が増強されるのは、もっともヌクレアーゼ保護によるようであり
、そして浸透圧効果によることは少ないことを示唆する。さらに、ＰＶＰによる
プラスミドの表面修飾（例えば、疎水性が増加し、そして負の表面荷電が減少す
ること）は、筋肉細胞によるプラスミドの取込をも促進しうる。
【０１３３】 ３．ＰＩＮＣ高分子の構造−活性の関係 一連のビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体の構造と、ラットの筋肉内で
の遺伝子発現のレベルとの間に線状の関係がある。ある種のビニルピロリドンモ
ノマーをＰＶＰ中の酢酸ビニルに置換することが、プラスミドとの水素結合を形
成する能力の減少した共重合体を生じた。相互作用が減少して、順次、筋肉内注
射後にラット筋肉内での遺伝子発現のレベルを減少させた。共重合体中のビニル
ピロリドンモノマー（ＶＰＭ）含量範囲が減少するのに伴い、β−ｇａｌの発現
が、線状に（Ｒ＝０．９７）減少した。 ｐＨおよび粘性が全ての複合体において等価であったので、上記データは、こ
れらの数値が、筋肉細胞へのプラスミドの送達に影響する最も重要なパラメータ
ーではないことを示す。これらのデータは、プラスミドへのＰＩＮＣ高分子の結
合が増加して、筋肉内のプラスミドの保護および生物的利用性が増加することを
示唆する。
【０１３４】 ４．別のＰＩＮＣシステム 上に記述される構造−活性の関係は、プラスミドとの相互作用を増強もするで
あろう新規共重合体を設計するのに使用できる。増強されたＰＩＮＣシステムの
結合親和が、ヌクレアーゼ分解からのプラスミドのいっそう集約的な保護により
、結果として、それらの筋肉内注射後に遺伝子発現のさらなる増強を生じるよう
な、「機会を有する相互に作用するウィンドウ」（ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖ
ｅ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）があることが予想される。
プラスミドの凝縮の発生、または「三重鎖」型形成−これらはいずれもが、筋肉
における生物的利用性を低下させ、そして、結果的に遺伝子発現を減少させる−
のいずれをも超えたところに最適な相互作用があることが予想される。 上に示されるとおり、ＰＩＮＣ化合物は、一般に、疎水性部分と親水性部分と
の両方を有する両親媒性化合物である。多くの場合に、親水性部分は、極性基に
よって提供される。そのような極性基は、それに限定されないが、ピロリドン、
アルコール、アセテート、アミン、またはピロール、ピラゾール、イミダゾール
、トリアゾール、ジチオール、オキサゾール、（イソ）チアゾール、オキサジア
ゾール、オキサトリアゾール、ジアオキサゾール、オキサチオール、ピロン、ジ
オキシン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、（イソ
）オキサジン、インドール、インダゾール、カルパゾール、およびプリンおよび
これらの基の誘導体を含めた、化学および物理学のＣＲＣハンドブック（７２版
）、編集者Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｌｉｄｅの２−７３頁および２−７４頁に示される
もののような複素環式基のような基によって提供されうることは当業界で認識さ
れており、参照してここに組込まれる。
【０１３５】 化合物は、また、疎水性基を含み、高分子の場合には、典型的には分子の骨格
に含まれるが、しかし非重合性分子の部分でもありうる疎水性基も含有する。こ
のような疎水性骨格基の例としては、しかしこれらに限定されるものではないが
、ビニル、エチル、アクリレート、アクリルアミド、エステル、セルロース、ア
ミド、ヒドライド、エーテル、カルボネート、ホスファゼン、スルホン、プロピ
レン、およびこれらの基の誘導体が挙げられる。種々の基の極性上の特徴は、例
えば、任意の入門の有機化学の教科書における極性についての考察によって例示
されるとおり当業者にまったくよく知られている。 核酸と相互作用するこのような分子の能力は、当業者にも知られ、そしてその
ような分子間相互作用をモデル化するコンピュータ・プログラムの使用によって
予測されうる。選択的に、またはそのようなモデル化に加えて、有効な化合物は
、１）ヌクレアーゼの消化速度の阻害の決定、２）ＤＮＡのコーティングを示す
ＤＮＡのゼータ電位の改変、または３）ＤＮＡを挿入する臭化エチジウムのよう
な挿入剤の能力の阻害、のような１つまたはそれ以上の試験を使用して容易に同
定できる。
【０１３６】 ５．標的リガンド 核酸配列の送達および発現について上述された核酸／ＰＩＮＣ複合体に加えて
、特定の具体例では、特定の組織、細胞、または細胞の領域または区画での発現
を優先的に得るために、標的リガンドを提供するのも有用である。 このような標的ＰＩＮＣ複合体としては、プラスミド（または他の核酸分子）
に複合されたＰＩＮＣシステム（モノマーまたはポリマー性ＰＩＮＣ化合物）が
挙げられる。ＰＩＮＣシステムは、リガンドに親和性を示す受容体に結合する標
的リガンド（ＴＬ）に共有結合で、または非共有結合で付着（または結合）され
る。このような受容体は、細胞の表面に、または区画内にありうる。このような
ターゲッティングは、核酸の取込みまたは細胞内輸送の増強を提供する。 標的リガンドとしては、これらに限定されないが、ガラクトシル基、フコサル
基、マンノシル基、カルニチン誘導体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体、ペプチドリガンド、およびＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。有用に標的
にされうる細胞の例は、これらに限定されないが、抗原提示細胞、肝細胞、ミオ
サイト、上皮細胞、内皮細胞、および癌細胞が挙げられる。
【０１３７】 このような標的複合体の形成は、ＰＩＮＣシステムに共有結合で付着された標
的リガンド（ＴＬ）の以下の例によって例示される： ＴＬ−ＰＩＮＣ ＋ プラスミド → ＴＬ−ＰＩＮＣ::::::プラスミド このような標的化複合体の形成も、ＰＩＮＣシステムに非共有結合で付着した
標的リガンド（ＴＬ）の以下の例によって例示される： ＴＬ::::::ＰＩＮＣ ＋ プラスミド → ＴＬ::::::ＰＩＮＣ::::::プラスミ
ド または、代替的に、 ＰＩＮＣ ＋ プラスミド → ＰＩＮＣ::::::プラスミド＋ＴＬ→ ＴＬ::::
::ＰＩＮＣ::::::プラスミド これらの例で、::::::は、イオン性、水素結合、ファンデルワールス相互作用
、疎水性相互作用、またはこのような相互作用の組合せのような非共有結合の相
互作用である。 細胞障害剤についてのターゲッティング方法は、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８８５２号、国際公開番号ＷＯ９６／３９１
２４号で記述され、全ての図面を含め全体で参照してここに組込まれる。この出
願では、細胞障害材料のターゲッティングのための高分子親和性システムの使用
であって、ｚｉｐ高分子、すなわち相互作用する高分子の対を使用する２段階の
ターゲッティング方法を用いることが記載されている。相互作用高分子の１つに
付着した抗体は、細胞標的に結合する。その後、その高分子は、細胞障害剤に付
着した第二の高分子についての標的として作用する。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら
で参照されるとおり、毒性剤の送達のための他の二段階（または多段）システム
も、記述される。
【０１３８】 別の態様では、核酸コーディング配列を、ＰＩＮＣシステムまたはＰＩＮＣ標
的リガンド複合体についての非天然の標的を使用する二段階標的アプローチ法を
使用して送達し、発現させることができる。したがって、例えば、ＰＩＮＣ−プ
ラスミド複合体は、細胞性標的（例えば、ＭＡＢ）に結合するリガンドにそれ自
身付着される結合対の構成成分を標的にできる。ある種の化合物についての結合
対は、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎらで参照されるとおりＰＩＮＣ化合物としてここ
で同定された。代替的に、ＰＩＮＣは、抗体のような標的リガンドに複合化され
うる。その抗体は、例えば第二の抗体に結合する非天然の標的にターゲッティン
グされうる。
【０１３９】 III．抗血管形成コンストラクトおよび処方の評価についてのモデルシステム 抗癌治療での抗血管形成性の発現プラスミドコンストラクト及び処方を用いる
概念にしたがって、ネズミのモデルシステムが、ネズミの腫瘍細胞系列に基づい
て利用された。最初に使用される細胞系列は、ネズミの鱗状細胞癌（Ｓ．Ｃ．）
から由来した細胞系列であるＳ．Ｃ． ＶＩＩ／ＳＦであった。 頭部および頚部の鱗状細胞癌は、経口および喉頭腔をつなぐ細胞で始まる。臨
床的疾患は、浸潤を介して進行し、そして内在する組織およびリンパ管に広がる
。未分化のインビボ継代腫瘍細胞系列Ｓ．Ｃ． ＶＩＩ／ＳＦは、この典型的な
成長パターンを示す。さらに、その迅速な成長速度は、個々の実験について比較
的短い試験期間を提供する。他のネズミの腫瘍細胞系列としては、別のＳＣＣ系
列ＫＬＮ−２０５、ケラチノサイトラインＩ−７、および結腸腺癌系列ＭＣ−３
８が挙げられる。
【０１４０】 最適なモデルシステムは、臨床的疾患に観察されるものと類似のインビボで腫
瘍成長速度（すなわち、腫瘍は、移殖の４−１０日後に治療の準備ができる）、
侵入および局所拡大を示すこと、そして実験的治療についての利用しやすさを提
供することに基づいた条件を満足するのが好ましい。記述したように、ＳＣＣ
ＶＩＩ／ＳＦ細胞系列は、一次モデルシステム細胞系列として利用された。この
細胞系列は、典型的に迅速に成長し、それにより腫瘍細胞移殖の１４−１７日後
に未治療の同遺伝子型のマウスの死亡を起す。 この細胞系列は、多様な方法で使用されて、多様な異なる試験に適切なモデル
システムを提供する。そのような４つの可能性は、以下に記述される。 第一に、ＳＣＣＶＩＩ細胞は、細胞培養に利用されて、発現レベルおよび細胞
毒性のような抗血管形成剤発現コンストラクトおよび処方上の特徴のインビトロ
評価を提供する。 第二に、その細胞は、マウスの皮下に移殖されうる。この系は、移植部位の利
用性が有益である試験に利用されうる。例として、この方法は、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の発現に基づいた発現効率の評価
に利用された。 第三に、その細胞は、経皮で顎二腹筋の筋膜に移植されうる。 第四に、その細胞は、経皮で顎二腹筋／顎舌骨筋に移植されうる。モデル３お
よび４の重要な特性は、以下の表に示される。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】 マウスモデルで処置した腫瘍サイズは、一般に、２０−５０ｍｍ3である。５
０ｍｍ3のマウスの腫瘍は、約６．６ｃｍの平均直径を有する１５０ｃｃ3のヒト
腫瘍とおおよそ等価である。この腫瘍サイズは、第Ｉ相臨床治験で処置されるこ
とが提案されるサイズよりおおよそ１０倍大きい。このことは、このマウスモデ
ルが、ヒト患者で予測される腫瘍負荷を評価することについて強く指向している
ことを示す。
【０１４３】 IV．インビボ送達についての処方 Ａ．一般原理 上に記述されたもののような発現系が、適切な部位に送達される場合に発現に
ついてのポテンシャルを提供するとき、コンストラクトの送達および細胞取込み
の双方を助けることができる送達系で発現系コンストラクト（類）を提供するこ
とは有益である。したがって、本発明は、１つまたはそれ以上の発現系コンスト
ラクト（例えば、上に記述されるとおりＤＮＡプラスミド）、および保護的で相
互作用性の非凝縮性の化合物を含む特定の処方も提供する。 プラスミドコンストラクトに関連する他の一つの際立った因子は、開環状（Ｏ
Ｃ）形態よりむしろスーパーコイル（ＳＣ）形態にあるプラスミドの含有率であ
る。 Ｂ．送達および発現 多様な送達方法を、上述のコンストラクトおよび処方を用いて使用でき、特に
、腫瘍部位に注射することによる送達を使用できる。下顎下腫瘍モデルは、治療
されるべき腫瘍の４つの四分円への注射を利用した。 Ｃ．ヒト抗血管形成処方の抗癌効果 上に記述される抗血管形成処方の投与の効果は、Ｓ．Ｃ．ＶＩＩマウスの腫瘍
モデルを用いて評価された。上述されるプラスミドコンストラクトが、送達処方
に組込まれた。その処方は、注射によって送達された。マウス腫瘍の進行中にあ
る腫瘍細胞中のヒト抗血管形成プラスミドの発現の効果は、このような抗血管形
成発現が、そのような腫瘍に対して有効であることを示した。 Ｄ．典型的な処方の毒性評価 典型的な処方は、試験された濃度で高い細胞毒性を示さず、それによりその処
方は、インビボで直接的毒性作用によって細胞を有意に死滅させはしないことが
示唆された。
【０１４４】 Ｖ．投与 ここに使用される場合、投与とは、体へのＤＮＡのプラスミドまたは担体の導
入の経路をいう。上述された送達の方法に加えて、発現系コンストラクトおよび
送達システム処方を、多様な異なる方法によって投与できる。 投与は、標的組織に直接的、または全身投与後の標的組織への標的送達によっ
て行われうる。特に、本発明は、遺伝子療法に有用である特定のレベルで、組織
内で任意の特異的核酸配列の制御された発現を樹立するために、体への発現シス
テムの投与または処方によって疾病を治療するのに使用できる。 ベクター（プラスミド）の投与のための好ましい手段、および送達のための処
方の使用は、上に記述される。好ましい具体例は、針注射を用いる直接注射によ
る。 任意に選択されたベクターコンストラクトの投与経路は、発現ベクターのため
の特定の用途に依存する。一般に、使用された各ベクターコンストラクトについ
ての特定の処方は、特定の標的組織に関してのベクターの取り込み、に焦点をあ
てるであろう。取り込みは後に引き続き有効性の提示を生じる。取込みに関する
調査は、ベクターの細胞取込み、および選択したＤＮＡの発現を評価する取込ア
ッセイを含む。このようなアッセイは、取込み後の標的ＤＮＡの局在部位をも決
定し、そして発現タンパク質の定常状態濃度維持のための要件を確立する。その
後、有効性および細胞毒性が試験されうる。毒性には、細胞活性のみならず、細
胞機能も含む。 筋肉細胞は、溶液、懸濁液、またはコロイドとしてＤＮＡ粒子を筋肉に単回注
射した後、ＤＮＡを細胞外空間から取り込む特徴的な能力を示す。この方法によ
るＤＮＡの発現は、数ヶ月間保持されうる。
【０１４５】 処方されたＤＮＡベクターの送達は、標的細胞によりエンドサイトーシスを受
ける巨大分子複合体にＤＮＡを取込むことを伴う。このような複合体としては、
脂質、タンパク質、炭化水素、合成有機化合物または無機化合物が挙げられうる
。好ましくは、複合体は、特定の比率でＤＮＡ、カチオン性脂質、および中性脂
質を含む。ベクターで形成された複合体の特徴（サイズ、荷電、表面特徴、組成
）は、体の中でベクターの生物的利用性を決定する。処方の他の要素は、リガン
ドとして機能し、細胞の表面または内側で特異的受容体と相互作用する。その所
要の他の要素は、細胞への侵入、エンドソームからの開放、そして核への侵入を
促進するように機能する。
【０１４６】 送達は、ＤＮＡ輸送媒体の使用を介しても通してもできる。ＤＮＡ輸送媒体と
は、ＤＮＡベクターに結合し、そして上皮細胞によって取込まれる能力がある分
子をいう。ＤＮＡ輸送媒体は、ＤＮＡに非共有結合で結合し、そして細胞膜を介
してＤＮＡを有効に輸送する能力のある分子複合体を含む。その輸送媒体は、ま
た、核膜を介してＤＮＡを輸送することが好ましい。例えば、その全て（図面を
含めて）が、ここで参照してここに組込まれる以下の出願を参照：（１）１９９
２年３月２０日に提出された、「ＤＮＡ輸送媒体系および使用方法」と題される
Ｗｏｏらによる、米国特許出願番号第０７／８５５，３８９号、現在放棄されて
いる；（２）１９９３年３月１９日に提出された、「ＤＮＡ輸送媒体系および使
用方法」（米国および他の国々を意味する）と題されるＷｏｏらによる、ＰＣＴ
／ＵＳ９３／０２７２５、国際公開番号ＷＯ９３／１８７５９号；（３）Ｗｏｏ
らによる、１９９３年１２月１４日に提出された米国特許出願番号第０８／１６
７，６４１号、「核酸輸送媒体系および使用方法」と題されるＷｏｏによる一部
継続出願；（４）Ｓｚｏｋａらによる、１９９２年７月１４日に提出された、米
国特許出願番号第０７／９１３，６６９号、「自己集合ポリヌクレオチド送達系
」と題される一部継続出願および（５）１９９３年４月５日に提出された、「自
己集合ポリヌクレオチド送達系」（米国および他の国々を意味する）と題される
Ｓｚｏｋａらによる、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３４０６号、国際公開番号ＷＯ９３
／１９７６８号。
【０１４７】 ＤＮＡ輸送媒体系は、独立にかつ非共有結合でＤＮＡに結合する数種の要素を
含む粒子から構成されうる。各要素は、ＤＮＡに結合するカチオン性基と複合化
されたタンパク質のような特異的受容体または他の官能基を認識するリガンドか
ら構成される。使用されうるカチオンの例は、スペルミン、スペルミン誘導体、
ヒストン、カチオン性ペプチドおよび／またはポリリジンである。１つの要素は
、ＤＮＡベクターおよび標的細胞上の細胞表層受容体の両方に結合する能力があ
る。このような要素の例は、アシアログリコタンパク質受容体、葉酸受容体、マ
ンノース−６−ホスフェート受容体、またはカルニチン受容体と相互作用する有
機化合物である。第二の要素は、ＤＮＡベクターおよび核膜上の受容体の両方に
結合する能力がある。核リガンドは、核膜を介して輸送媒体系を認識および輸送
する能力がある。このようなリガンドの例は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原またはヒスト
ンから得られる核標的配列である。第三の要素は、ＤＮＡベクターおよび上皮溶
解を誘導する要素の両方に結合する能力がある。例としては、アデノウイルス、
インフルエンザウイルスヘマグルチニンに関連したペプチド、または上に引用さ
れるＳｚｏｋａ特許に記述されたＧＡＬＡペプチドのような不活性化ウイルス粒
子が挙げられる。
【０１４８】 腫瘍に直接的に遺伝子を移動させることは、非常に有効であった。実験は、Ｄ
ＮＡの腫瘍細胞への直接注射による投与で、注射の領域内で遺伝子の発現を生じ
ることを示す。注射されたＤＮＡは、染色体に取り込まれない染色体外状態で保
持されることが好ましい。導入のためのこの手段は、好ましい具体例である。 投与は、上の好ましい具体例で記述されたとおりの脂質をも含みうる。脂質は
、単層、二層、または多層形態に配列された脂質と、およびＤＮＡのような水溶
性化合物を捕捉する内部水溶性空間とからなる、直径０．０５から数ミクロンま
での範囲にある中空球形小胞であるリポソームを形成しうる。脂質は、リポソー
ムを形成しなくても有用でありうる。特定の例としては、ＤＮＡと標的細胞の膜
とに相互作用して、ＤＮＡが細胞に入ることを促進するＤＯＰＥを含むカチオン
性脂質および複合体の使用が挙げられる。
【０１４９】 遺伝子送達は、遺伝子操作された細胞を移殖することによっても行われうる。
例えば、筋芽細胞と称される未熟な筋肉細胞は、筋肉繊維に遺伝子を運ぶのに使
用されうる。組換えヒト成長因子を発現するように遺伝子操作された筋芽細胞は
、成長ホルモンを動物の血液に分泌できる。組込まれた遺伝子の分泌は、３ヶ月
までの期間、常に保持されうる。 筋芽細胞は、最終的に分化し、そして存在する筋肉組織に融合する。細胞が、
存在する構造に組込まれるので、それは、耐性があるのみならず、育成される。
筋芽細胞は、遺伝子治療を必要とする個人から筋肉組織を取ることによって容易
に得ることができ、そして一般に操作された細胞は、患者の筋肉に損傷を起すこ
となしに容易に戻すこともできる。同様に、ケラチノサイトが、遺伝子を組織に
送達するのに使用しうる。多数のケラチノサイトは、小さな生検の培養によって
生成されうる。培養は、層形成シートとして作製され、そしてヒトに移殖したと
き、長年かけて組織特異的品質で改善し続ける上皮を生じることができる。ケラ
チノサイトは、培養中で適切なベクターをケラチノサイトに形質導入することに
よって、遺伝子操作される。ケラチノサイトは、上皮を皮膚から分画する基底膜
によって循環から分離されているが、ヒトのケラチノサイトは、産生したタンパ
ク質を循環内に分泌する。 送達の選択された方法は、適切な生物学的効果を発揮するレベルで、核酸カセ
ット内にコードされる遺伝子産物の発現を生じるに違いない。発現の程度は、疾
病、ベクターおよび遺伝子産物の薬物動態学、および投与の経路に依存するが、
しかし、０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、そして好ましくは０．０１−
１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にあるべきである。このレベルは、標準の方法に
よって容易に決定しうる。それは、多かれ少なかれ、最適な投与に依存しえた。
治療の期間は、疾病徴候が経過する間は、できれば連続して、延長される。投与
の回数は、疾病、送達媒体、および治験からの有効性データに依存する。
【０１５０】実施例 本発明は、以下の特定の実施例に関連していっそう十分に記述される。ただし
、これらの実施例は本発明の範囲を限定するように解釈されるべきものではない
。
【０１５１】実施例１ ＥＣ特異的エンハンサーおよびプロモーターをクローニングする。 プロモーター：２組のレポーターベクター − ＣＡＴ（ｐＣＴ１１３２およ
びｐＣＴ１１３３）またはＬＵＣ（レポーター遺伝子としてｐＬＣ１１３７およ
びｐＬＣ１１３８）のいずれかを有するＣＭＶｅｎｈ+／ｐｒｏ-およびＣＭＶｅ
ｎｈ-／ｐｒｏ+が構築された。ＳａｃＩ部位はこれらのベクター内の特徴的な部
位である。プロモーター配列は２つのプライマー（５’プライマー、ＳａｃＩ部
位を有する３’プライマー）を用いたＰＣＲ、およびそれに続くＴＡベクターへ
のクローニングによってヒトゲノムＤＮＡから増幅される。右配向を示すコンス
トラクト（３’は、ＴＡベクター上のＳａｃＩ部位から離れており、その結果Ｓ
ａｃＩ消化はＰＣＲ挿入産物を付与する）。ＳａｃＩ断片は上のベクターのＳａ
ｃＩ部位に挿入される。
【０１５２】 多量体化エンドセリンエンハンサー：エンドセリンエンハンサー（ＥＴｅ）が
オーバーハングで合成され、下に示されるようなＢgｌ ＩＩおよびＢａｍ Ｈ
Ｉ部位が形成された。 gatctGTACTTCATACTTTTCATTCCAATGGGGTGACTTTGCTTCTGGAG aCATGAAGTATGAAAAGTAAGGTTACCCCACTGAAACGAAGACCTCctag このＤＮＡ断片は高濃度での連結することによって多量体化され、そしてＢｇ
ｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化され、逆方向および裏返し反復が排除された。４
個および７個のタンデムコピーを有するＤＮＡ種がゲル精製され、そして種々の
内皮特異的または増殖特異的プロモーターを含むプラスミドに挿入された。
【０１５３】 材料および方法 ＥＣ特異的プロモーター駆動レポーターコンストラクトの構築：内皮特異的プ
ロモーターを含むプラスミドが以下のとおり構築された。エンドセリン−１（Ｅ
Ｔ−１）、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１、ＩＣＡＭ−２、β３およびαＶの最小プロモー
ター配列、および細胞サイクル依存性遺伝子（サイクリンＡ、Ｅ２Ｆ１、または
ｃｄｃ６）がヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによって直接的に増幅された。その後
、増幅プロモーター配列をｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にサブクローン化さ
せた。その後、プロモーター配列を、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片として、ルシフェ
ラーゼ・レポーター遺伝子、合成イントロンおよびヒト成長ホルモン３’未翻訳
領域／ポリ（Ａ）シグナルを含む発現プラスミドｐＬＣ１１３６にサブクローン
化させて、プロモーター特異的発現コンストラクトを作成した。プラスミドをイ
ー・コリ宿主株(E. coli host strains)ＤＨ５α中でカナマイシン選択下で育成
させ、そしてアルカリ性溶解およびクロマトグラム法を用いて精製した。注射の
ために利用された精製プラスミドは以下の特異性を示した：＜５０Ｅｕ／ｍｇ内
毒素。
【０１５４】 内皮細胞培養および形質移入 ヒト臍帯の大動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が内皮細胞成長因子の補足を伴う５
％仔ウシ血清で補足したＥＢＭ−１培地（クロンテック・インコーポレーテッド
）中の６穴プレートで育成された。２−４継代にあるＨＵＶＥＣを形質移入に使
用した。ＨｅＬａ細胞も１０％仔ウシ血清、１％グルタミンおよび１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシンで補足したダルベッコの修飾イーグル培地中の６穴プレ
ートで育成された。培養細胞がＤＥＡＥ−デキストランによって２μｇのレポー
ターコンストラクトを用いて形質移入された。形質移入効率を修正するために、
サイトメガロウイルス即時型プロモーターによって起動されるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含む０．５μｇのプラスミドｐＢＧ０９６５も各形質移入に含まれ
た。形質移入の４８時間後、細胞抽出物を作成し、ルシフェラーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼアッセイを行った。相対的ルシフェラーゼ活性がβ−ガラクトシ
ダーゼ単位に対する光単位の比として計算された。ＨＵＶＥＣについての修正さ
れた光単位がＨｅＬａ細胞についての修正された光単位に分割され、畳込まれた
内皮特異性が得られた。
【０１５５】 細胞特異的プロモーターを増殖する分析：生じるレポータープラスミドは２つ
の異なる内皮セルラインＨＵＶＥＣおよびＢＡＥＣにＥＣ−エンハンサーおよび
細胞サイクル特異的プロモーターを含み、そしてその活性が非内皮セルラインＮ
ＩＨ３Ｔ３中のものと比較された。レポーター活性をこれらのサンプルでアッセ
イした。
【０１５６】 結果 プラスミドの構築：生じるレポーターコンストラクトは代表的コンストラクト
ＥＴ−エンハンサー／ＥＴ−プロモーター、ｐＬＣ１２６４およびｐＬＣ１２６
５であるような図面に列記される。 ＥＣ−特異的活性分析：ＨＵＶＥＣおよびＨｅＬａ細胞中のＥＴｅ／ＥＴｐの
活性および特異性（ＥＣ対ＨｅＬａ）が図面に示される。データはＥＴｅが１０
倍までＥＣ中で特異的にＥＴｐ発現を増強することを示した。 サイクリンＡ、Ｅ２Ｆ１またはｃｄｃ６プロモーターの上流に挿入された４個
または７個のコピーのＥＴｅは内皮細胞で特異的に数倍発現を増大する。増殖特
異的プロモーターおよび内皮特異的エンハンサーから構成されるこれらのキメラ
調節要素は生体内で内皮細胞を分割する上で特異的に強い発現を達成する手段を
提供しうる。
【０１５７】 抗血管形成遺伝子のＥＣ−特異的発現：エンドスタチンまたはアンギオスタチ
ンについてのコーディング配列がベクターｐＬＣ１２６５に挿入され、ｐＥＳ１
３５８およびｐＡＳ１３５９が生成された。したがって、エンドスタチンおよび
アンギオスタチンの発現はＥＴｅ／ＥＴｐによって起動された。エンドスタチン
およびアンギオスタチン発現の特異性が決定される。
【０１５８】実施例２：癌治療のための抗血管形成遺伝子薬 材料および方法 プラスミド構築：エンドスタチンまたはアンギオスタチンについての発現カセ
ットを含むプラスミドが以下のとおり構築された。エンドスタチンのコーディン
グ配列はコラーゲン１８ａｌの１８４ａａのＣ末端である。（ヒトコラーゲン型
ＸＶＩＩＩアルファ１ 受託番号Ｌ２２５４８号；Ｏｈ，Ｓ．Ｐ．、Ｗａｒｍａ
ｎ、Ｍ．Ｌ．、Ｓｅｌｄｉｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｄ．、Ｋｎｏｌｌ，
Ｊ．Ｈ．、Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｓ．およびＯｌｓｅｎ，Ｂ．Ｒ．） ヒトＸＶＩＩ
Ｉ型コラーゲンをコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニングおよび
マウス染色体１０およびヒト染色体２１へのアルファ１（ＸＶＩＩＩ）コラーゲ
ン遺伝子の局在化。Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９（３）巻、４９４−４９９頁（１９
９４年）。アンギオスタチンはヒトプラスミノーゲン（受託番号Ｍ７４２２０号
；Ｂｒｏｗｎｅ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｏｄｄ，Ｉ．、Ｃａ
ｒｅｙ，Ｊ．Ｅ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｇ．Ｍ．Ｐ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｄ．
およびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．）の内部断片（９７−４４０ａａ）である。
ＨｅＬａ細胞中の組換えヒトプラスミノーゲンおよびアグリコプラスミノーゲン
の発現。Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ（１９９１年）。エンドスタチンおよびアン
ギオスタチンのコーディング配列が、５’末端にＢａｍＨＩ部位を加えるととも
に３’末端にＸｂａＩ部位を加えるオリゴヌクレオチドプライマー（下に示され
た）を用いてヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック）からＰＣＲによって直接的に増
幅された。 ヒト・アンギオスタチン５’プライマー ATg gAA CAT AAg gAA gTg gTT CTT ヒト・アンギオスタチン３’プライマー（ＸｈｏＩ部位を有する） gC CTCgAg gCA TTT TTT CAg gTT gCA gTA CTC ヒト・アンギオスタチン３’プライマー（内部プライマー）Ｋ３ gC ggATcc AAA gTg TAT CTC TCA gAg TgC AAg マウス・アンギオスタチン５’プライマー ATg gAC CAT AAg gAA gTA ATC CTT マウス・アンギオスタチン３’プライマー（付加されたＸｈｏＩ部位を有する） gC CTCgAg gCA CCg CTT CAg gTT gCA gTA TTC マウス・アンギオスタチン３’プライマー（内部プライマー）Ｋ３？ gC ggATCC gTg TAT CTg TCA gAA TgT AAg ACC マウス・エンドスタチン５’プライマー（付加されたＢａｍＨＩを有する） gCggATCC CAT ACT CAT CAg gAC TTT CAg CCA マウス・エンドスタチン３’プライマー（付加されたＸｈｏＩを有する） gCCTCgAg CAT TTT ggA gAA AgA ggT CAT gAA ヒト・エンドスタチン５’プライマー gAATTC CAC AgC CAC CgC gAC TTC CAg CCg ヒト・エンドスタチン３’プライマー CTCgAg CTA CTT ggA ggC AgT CAT gAA gCT
【０１５９】 その後、増幅したエンドスタチンまたはアンギオスタチン配列がｐＣＲ２．１
（インビトロゲン）にサブクローニングされた。その後、エンドスタチンまたは
アンギオスタチンについてのコーディング配列がＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片とし
て中間体ベクターｐＨｏｏｋ１（インビトロゲン）のＳｆｉＩ−ＸｂａＩ部位に
サブクローニングされた。したがって、インフルエンザウイルスから得られるＩ
ｇｋシグナルペプチドおよびＨＡエピトープについてのコーディング配列はエン
ドスタチンまたはアンギオスタチンのものの上流であった。その後、Ｉｇｋ−Ｈ
Ａ−エンドスタチンまたは−アンギオスタチンについてのコーディング配列が、
ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として、サイトメガロウイルス即時型プライマー、合
成イントロンおよびウシ成長ホルモン３’未翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルを含
む発現プラスミドにサブクローニングされ、エンドスタチンまたはアンギオスタ
チン発現系ｐＥＳ１１００（ネズミ・エンドスタチン、ｍＥ）、ｐＥＳ１２８１
（ヒト・エンドスタチン、ｈＥ）、ｐＡＳ１０９５（ヒト・アンギオスタチンｋ
１−ｋ４、ｈＡｋ４）またはｐＡＳ１０９６（ヒト・アンギオスタチンｋ１−ｋ
３、ｈＡｋ３）が形成された。ＨＡ−エピトープが組換えＰＣＲによってｐＥＳ
１１００から欠失され、ＨＡを含まないマウス・エンドスタチン（ｐＥＳ１０６
２、ｍＥ−ＨＡ−）（図１）についての発現プラスミドが生成された。プラスミ
ドｐＶＣ０６１２（空のプラスミド、ＥＰ）はサイトメガロウイルス即時型プロ
モーターおよびＡｌｉｌａ外、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８巻：
１７８５−１７９５頁（１９９７年）に記載されているｐＶＣ０２８９骨格中の
ウシ成長遺伝子から得られる３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルを含む発現要素を
含有する。プラスミドｐＶＣ０６１２が生体内実験で対照プラスミドとして使用
された。腫瘍内注射のためのプラスミドがイー・コリ宿主株ＤＨ５α中でカナマ
イシン選択下で育成され、そしてアルカリ性溶解およびクロマトグラム法を用い
て精製された。腫瘍内注射のために利用された精製プラスミドは以下の特性を示
した：＜５０Ｅｕ／ｍｇ内毒素；＜１％タンパク質；および＜２０％染色体ＤＮ
Ａ。
【０１６０】 プラスミド調製： ＤＮＡ／ＰＶＰ複合体：先の文献（Ｍｕｍｐｅｒ外、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ、１３巻、５号（１９９６年）、およびＭｕｍｐｅｒ外
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、５２巻：１
９１−２０３頁（１９９８年））に記載されているように、精製発現プラスミド
および対照プラスミドがＰＩＮＣ送達系中に３ｍｇＤＮＡ／ｍｌの濃度で調製さ
れた。 リポソームおよびＤＮＡ／脂質複合体の製造：４：１モル比の陽イオン性脂質
ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２−３−ジオレイルオキシ）プロピル）−ｎ−ｎ−ｎ
−トリメチルアンモニウムクロライド）およびコレステロールから構成される小
型臍帯小胞（ＳＵＶ）が押し出し（４００ｎｍ）によって作製された。正に荷電
したプラスミド／脂質複合体が、対照条件（Ｆｒｅｉｍａｒｋ外、Ｔｈｅ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６０巻：４５８０−４５８６頁（
１９９８年））の下、リポソームとプラスミドを混合することによって、１０％
（ｗ／ｖ）ラクトース中において１：３−／＋荷電比で調製された。複合体の平
均直径およびゼータ電位が動的光走査およびドップラー電気泳動性光走査を用い
て特徴付けられた。複合化効率はアガロースゲル電気泳動によって測定された。
【０１６１】 細胞培養：Ｃｏｓ−１細胞がＤＭＥＭ中で培養された。内皮細胞（ＨＵＶＥＣ
、ＨＬＭＥＣおよびＢＡＥＣ）がクロンテックスから得られ、そして製造業者に
よって提供された特定の培地で培養された。ＴＳ／ＡはＢＡＬＢ／ｃマウスから
自発的に生じた中程度に分化した哺乳類の腺癌の最初の生体内移殖片からの腫瘍
セルラインであり、イタリア国ボローニャ大学、Ｐ．Ｎａｎｎｉ博士によって確
立されたものである（Ｎａｎｎｉ外、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
、１巻：３７３−３７６頁（１９８３年））。多数の前免疫化検証試験によって
、ＴＳ／Ａが長期継続抗腫瘍免疫性Ｒｅｎｃａを引出さないことが示され、自発
的に生じるネズミの腎細胞癌、ＣＴ２６、結腸腺癌もルイス肺癌（ＬＬＣ、ＡＴ
ＣＣから得られる転移性変異体）とともに使用された。腫瘍細胞培養が、加湿さ
れた５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で、コーニング（コーニング、ニューヨーク）
製の無菌の使い捨てフラスコ内で維持された。その際、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｅ
ｎｃａ、ＴＳ／Ａ）、または１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００
Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（全てライフ
・テクノロジーズから入手されたもの）で補助されたＤＭＥＭ（ＬＬＣ）のいず
れかが使用された。 ヒト・エンドスタチンおよびアンギオスタチンに対するマウス抗体の産生：
生理食塩水中で調製された７５μμｇのｐＥＳ１２８１またはｐＡＳ１０９６
が筋肉内に注射され、そして１４および２８日目に追加免疫した。抗体はウエス
タンブロッティングによって決定された。
【０１６２】 エンドスタチンおよびアンギオスタチンのウエスタンブロット分析：Ｃｏｓ細
胞、Ｅｃｓまたは腫瘍細胞が２．５×１０5細胞／ウエルで６穴プレートに載せ
られ、そして血清を含まないＤＭＥＭ中の２μｇのプラスミドｐＥＳ１１００、
ｐＥＳ１０６２、ｐＥＳ１２８１、ｐＡＳ１０９５またはｐＡＳ１０９６および
３μｇのリポフェクタミン（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、
メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用して形質移入された。上清が２４時間
後に回収され、そしてエンドスタチンまたはアンギオスタチンがマウスのモノク
ローナル抗−ＨＡおよびプロテインＡおよびＧアガロース（ベーリンガー・マン
ハイム、インディアナ州インディアナポリス）を用いて免疫沈降させられた。サ
ンプルは１２％トリス−グリシンゲルにかけられ、そしてミリポアのＰＶＤＦ膜
でエレクトロブロッティングにかけられた。モノクローナル抗−ＨＡ（ベーリン
ガー・マンハイム）、抗アンギオスタチン（ＩｇＧ（エンザイム・リサーチ・ラ
ボラトリーズ・インコーポレーテッド）または抗エンドスタチンが１：１０００
で使用され、続いて抗マウス（またはウサギ）Ｉｇ ＨＲＰ（アマシャム・ライ
フ・サイエンス）が１：１０００で使用された。レインボー分子量マーカー（ア
マシャム・ライフ・サイエンス）を使用して、タンパク質のサイズが決定された
。検出はアマシャムＥＣＬキットを用いて行なわれた。
【０１６３】 アンギオスタチン／エンドスタチンＥＬＩＳＡ：上清（１ｍｌ／ウエル）が上
の形質移入細胞から採取され、そしてエンドスタチンまたはアンギオスタチンの
濃度が酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析された。４℃で一
晩５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（１／５００希釈）中でアフィニティー精製されたヤギ
の抗−ＰＧ（プラスミノーゲン）ＩｇＧ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリー
ズ・インコーポレーテッド）または抗−エンドスタチン（フォークマン・ラボ）
がＥＬＩＳＡプレート（ファルコンの柔軟性ＰＶＣ番号３９１２号）にコーティ
ングされ、そして室温で４時間、ＰＢＳ中の１５０μｌ／ウエルの２％ＢＳＡで
遮断された。上清（１００μｌ／ウエル）が添加され、そして３７℃で１時間、
インキュベートされた。ＨＢＳ−ツイーン−ＢＳＡ緩衝液（２３．８ＭのＨＥＰ
ＥＳ、５．８４ＭのＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ツイーン；ｐＨ７．２
）中で１／５００に希釈されたマウスのモノクローナル抗−ＨＡ（ベーリンガー
・マンハイム）が添加（１００μｌ／ウエル）され、そして３７℃で１時間イン
キュベートされた。ＨＢＳ−ツイーン−ＢＳＡ緩衝液で１／５００に希釈された
ペルオキシダーゼ接合抗−マウスＩｇＧ（アマシャム・ライフ・サイエンス）が
添加（１００μｌ／ウエル）され、そして３７℃で１時間インキュベートされた
。０．１％Ｈ2Ｏ2でクエン酸−リン酸緩衝液（５．２Ｍクエン酸、１３．８Ｍの
Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ５）中で希釈された１００μｌ／ウエルのＯＰＤ基質（ｏ−
フェニレンジアミン（シグマ５ｍｇ錠剤））を使用し、２〜５分間発色させた。
５０μｌ／ウエルの２．５ＭのＨ2ＳＯ4を添加することによって、反応が停止さ
れた。ＥＬ３４０マイクロプレート・リーダー（バイオ−テク・インストルメン
ツ）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。一連の２倍希釈のプラス
ミノーゲン−リシン結合部位Ｉ（シグマ）、形質移入された細胞から得られるＨ
Ａ−アンギオスタチンまたはＨＡ−エンドスタチンが標準として使用された。 動物：正常な８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ｂ１マウスをテキサス州ヒュ
ーストンのハーラン・ラボラトリーズから購入した。マウスは、２３℃、湿度４
０％および１２時間／１２時間の明暗サイクルで、任意のげっ歯類用飼料および
水で維持した。動物は調査の開始前の少なくとも４日間順化させた。
【０１６４】 腫瘍成長および治療の生体内での評価： ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ｂ１マウスは、特定数の細胞を含んだ３０μμｌの
単独細胞懸濁液を用いて、左わき腹中央部の皮下でテストされた。腫瘍サイズが
およそ１０ｍｍ3に達してから７日後、エンドスタチン／ＰＶＰまたはＥＰ／Ｐ
ＶＰでの処置が開始され、１〜２日間隔で２週間（総数８回処置：４／週）繰返
された。腫瘍体積は２つの垂直径および深さについて電気カリパスで測定された
。腫瘍マス（ｍｍ3）の測定は週二回で４０〜５０日間実施された。１ｃｍ3の体
積を越える腫瘍マスを有する全てのマウスは動物愛護の観点から安楽死させた。
腫瘍成長に対するエンドスタチンまたはアンギオスタチン遺伝子療法の効果につ
いてのデータは繰返し測定分析によって分析された。主要な効果が明らかである
場合、個々の治療手段がダンカンの多重範囲試験を用いて比較された。腫瘍拒絶
におけるエンドスタチンまたはアンギオスタチン遺伝子療法の効果についてのデ
ータがＡＮＯＶＡによって分析した。全ての場合に、０．０５未満のｐ値は統計
的に有為であると考えられた。
【０１６５】 肺転移および治療の生体内での評価： １００μＬのＨＢＳＳ（ハンクスの均衡塩溶液、Ｃａ++またはＭｇ++、ライフ
・テクノロジーズ）中の３×１０5Ｒｅｎｃａ細胞を尾部静脈に注射することに
よって、肺転移がマウスで樹立された。動物は１５０ワットのランプを用いて暖
められ、そして尾部静脈注射前にマウス抑制器に入れられた。腫瘍注射の４また
は７日後、週一回、２〜３週間にわたって、エンドスタチン／ＤＣ、アンギオス
タチン／ＤＣまたはＥＰ／Ｄコンスがマウスに静脈注射された。肺は、２２ゲー
ジの強制栄養供給針を用いて、１〜２ｍＬの墨汁溶液（１５０ｍＬの滅菌Ｈ2Ｏ
、３０ｍＬ墨汁、４滴の水酸化アンモニウム）が噴霧され、その後、少なくとも
２４時間、フェケテの溶液（９０ｍＬホルムアルデヒド、３７％溶液、９００ｍ
Ｌの７０％ＥｔＯＨ、４５ｍＬ氷酢酸）で固定された。解剖用顕微鏡下で転移が
計数された。生存データがカプラン−ミールの対数段階試験を用いて分析された
。全ての他のデータはウインドウズ・ソフトウエア（データモスト・コーポレー
ション、ユタ州サンディ）用のスタットモスト（StatMost）におけるニューマン
−キール試験を使用して分析された。データはｐ値が＜０．０５である場合に統
計的に有為であると考えられた。
【０１６６】 ＬＬＣモデル：皮下腫瘍（直径８−１２ｍｍ）が無菌で切除された。全ての壊
死ゾーンが除去され、そして生育可能な組織が微塵切りにされ、そしてコラーゲ
ン（Ｉ型、２００Ｕ／ｍｌ）およびデオキシリボヌクレアーゼ（２７０Ｕ／ｍｌ
）（シグマ・ケミカル・カンパニ、ミズーリー州セントルイス）で分離された。
細胞は助剤でＤＭＥＤに懸濁され、そして５−１０×１０6の生育可能な細胞／
Ｔ１７５フラスコに載せられた。３時間接着後、培養物は洗浄され、そして新た
な培地が付与された。４８時間後、接着性腫瘍細胞を簡潔なトリプシン分解によ
って回収し、培地で一回洗浄し、そしてＨＢＳＳに再懸濁させた。０．１ｍｌの
ＨＢＳＳ中のアリコート量の１０６細胞が皮下に注射された。腫瘍が直径１２〜
１５であるとき、マウスはメトキシフルランで麻酔された。１群のマウス中の腫
瘍が手術で削り取られ、そしてその部分が金属で閉じられた。他の群のマウスは
擬似手術が施され、ｓｃ腫瘍がそのまま残された。マウスを、毎日監視し、そし
て手術の１０〜１４日後に殺された。肺が計量され、そして上記のように染色さ
れた。 筋肉注射および電気穿刺：２００〜３００μｇのＤＮＡ／ＰＶＰ（３ｍｇ／ｍ
ｌ）が１匹のマウスの脚の脛側（２５μｌ）および排腹筋（５０μｌ）に注射さ
れ、注射の２分後に、その注射された脚に電気穿刺（５００Ｖ／ｃｍ、４パルス
で９６ｕｓｅｃ）が行われた。
【０１６７】 組織学的分析：ＣＤ−３１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＭＡＣ−１免疫染色について：
凍結切片が５μＭで切断され、そしてその後、続いて室温で１０分間にわたって
アセトンで固定された。免疫組織化学がアビジン・ビオチン法を利用して達成さ
れた。室温で１０分間にわたって１％Ｈ2Ｏ2溶液で切片をインキュベートするこ
とによって、内因性ペルオキシダーゼを急冷した。非特異的結合はパワーブロッ
ク（PowerBlock）（カタログ番号ＨＫ０８５−５Ｋ、バイオジェネックス（Biog
enex）、米国カリフォルニア州サンラモン）を用いて室温で５分間インキュベー
ションすることによって遮断された。その後、切片は一次抗体の適切な希釈を用
いて室温で１時間にわたってインキュベートされた。ＰＢＳでの洗浄に続いて、
二次抗体、ビオチニル化抗−ラット（カタログ番号ＢＡ−４００１、ベクター・
ラボラトリーズ（Vector Laboratories）、米国カリフォルニア州バーリンゲー
ム）が１：４００の割合で添加され、そして切片が室温で１時間インキュベート
された。ＰＢＳでの洗浄に続いて、ベクタスタイン試薬（カタログ番号ｐｋ−６
００１、ベクター・ラボラトリーズ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）が
１：８０の希釈で添加し、そして切片が室温で１時間インキュベートされた。３
，３−ジアミノベンズイジン（安定なＤＡＢ、カタログ番号７５０１１８号、リ
サーチ・ジェネティックス（Research Genetics）、米国アラバマ州ハンツビル
）をクロマゲンとして使用した。使用した一次抗体は全てのラットの抗マウスモ
ノクローナル抗体であった。抗体および希釈は、ＣＤ３（カタログ番号１９９１
４−Ｄ１９、ジブコ、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）１：２５０、ＣＤ
４（カタログ番号３８０２２０号、セイカガク・アメリカ・インコーポレーテッ
ド、米国メリーランド州ジャムスビル）１：１０，０００、ＭＡＣ−１（カタロ
グ番号ＣＬ８９４１ＡＰ、シーダー・レーン・ラボラトリーズ・リミテッド（Ce
dar Lane Laboratories, LTD）、米国ニューヨーク州ウエストベリー）１：１０
０、ＣＤ３１（カタログ番号０９５１Ｄ号、ファルミンゲン（Pharmingen）、米
国カリフォルニア州サンディエゴ）１：８００であった。 アポトーシスの細胞がアポップタグ・インサイチュー（apopTag inSitu）アポ
トーシス検出キット（カタログ番号Ｓ７１００−ＫＩＴ、オンカー（Oncor）、
米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）を利用して検出された。ジゴキシゲニン
−ヌクレオチドの残渣が末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによ
って触媒としてＤＮＡに添加された。 ＰＣＮＡ免疫染色がマウス・ツー・マウスＨＲＰキット（カタログ番号ＭＴＭ
００１号、サイテック（Scytek）、米国ユタ州ローガン）およびそれに続く製造
業者の指示を利用して達成された。１：１０，０００の希釈でのＰＣＮＡ抗体（
カタログ番号３２２５１号、ファルミンゲン、米国カリフォルニア州サンディエ
ゴ）。
【０１６８】 抗血管形成アッセイ：ＥＣ増殖アッセイの生体外での阻害は以下のとおり行わ
れた。５，０００細胞のヒト肺微細血管の内皮細胞（ＨＬＭＥＣ）がゼラチン化
した９６穴培養プレートに載せられ、そして成長因子（ｂＦＧＦ）を含有する１
００ｕｌ ＨＬＭＥＣ培地中で２４時間、インキュベート（３７℃、５％ＣＯ2
）された。培地は形質移入細胞から８０ｕｌのエンドスタチン含有またはアンギ
オスタチン含有の上清に交換された。２０分のインキュベート後、２０ｕｌのＨ
ＬＭＥＣ培地が添加された。７２時間後、ＷＳＴ−１アッセイ（ベーリンガー）
によって細胞数が分析された。 生体内での新生血管形成がマウス角膜で分析された。＜１ｕｌ（アルミニウム
ショ糖硫酸塩；シグマ）のヒドロンペレット（ヒドロン（Hydoron）；インター
フェロン・サイエンス（Interferon Science））が１μｇ／ｍｌでｂＦＧＦを含
有するように調製され、そしてＣ５７ｂ１マウスの０．３〜０．５ｍｍの角膜に
縁郭から移殖された。翌日、ＤＮＡ／ＰＶＰが筋肉内へ注射されるか、またはＤ
ＮＡ／ＤＣが静脈へ注射された。移殖の３、４および５日後に、スリット−ラン
プ顕微鏡で血管形成が評価された。５日目に、最大限の血管形成が達成された。
エンドスタチンまたはアンギオスタチン遺伝子薬による血管形成の阻害が対照ベ
クターと比較することによって試験された。
【０１６９】 結果 エンドスタチンおよびアンギオスタチンについての発現プラスミドの構築：エ
ンドスタチンまたはアンギオスタチン（ｋ１〜ｋ３）についてのコーディング配
列がコラーゲン１８ａ（エンドスタチン前駆体）およびプラスミノーゲン（アン
ギオスタチン前駆体は肝臓に豊富である）から肝臓ｃＤＮＡライブラリーからＰ
ＣＲ増幅された。アンギオスタチンおよびエンドスタチンがそれらの自然の分泌
配列を欠く内部断片であり、そしてアンギオスタチンまたはエンドスタチンに対
する入手可能な市販の抗体がないという事情により、インフルエンザ・ヘマグル
チニンタンパク質から得られる９ａａであるＨＡエピトープをアンギオスタチン
またはエンドスタチンのＮ末端にタグ付けすることによって、このペプチドに対
する抗体を検出用に使用することができる。Ｉｇ−カッパ・シグナルペプチドは
、融合タンパク質の分泌を指示するために、ＨＡ−アンギオスタチンまたはエン
ドスタチンの上流に添加される。ＨＡ−タグ付マウスエンドスタチン（ｍＥ、ｐ
ＥＳ１１００）、ＨＡ−不含マウスのエンドスタチン（ｍＥ−ＨＡ―、ｐＥＳ１
０６２）、ＨＡ−ヒト・エンドスタチン（ｈＥ、ｐＥＳ１２８１）、ＨＡ−ヒト
・アンギオスタチンｋ１−ｋ４（ｈＡｋ４）、ＨＡ−アンギオスタチンｋ１〜ｋ
３（ｈＡｋ３、ｐＡＳ１０９６）についての発現プラスミドが構築された。そし
て、その地図が図１に示された。
【０１７０】 生物活性エンドスタチンおよびアンギオスタチンの発現：それらの発現を評価
するために、発現プラスミドがｃｏｓ−１細胞、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ま
たはＲｅｎｃａ腫瘍細胞に形質移入される。移入遺伝子の発現が、ＲＴ−ＰＣＲ
によって細胞内のｍＲＮＡについて試験され、また、ウエスタンブロッティング
によって培地中のタンパク質について試験された（図２）。結果は、エンドスタ
チンおよびアンギオスタチンが示された通りの正しいサイズで転写されたこと、
および分断しそこなった産物が検出されなかったことを示した。組換えタンパク
質が、２２ＫＤ（ＨＡ−ｍＥ）、２１ＫＤ（ｍＥ）、２０ＫＤ（ＨＡ−ｈＥ）ま
たは３０ＫＤ（ＨＡ−ｈＡｋ３）のおよその分子量を有する単一バンドとして存
在した。タンパク質発現が−エンドスタチンまたはプラスミノーゲン抗体および
抗−ＨＡエピトープ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡで定量的に評価された。結果は、
ｍＥおよびｈＡｋ３が培養培地中で約４ｎｇ／ｍｌであることを示した。ｈＡｋ
３はｈＡｋ４より高いレベルで発現された。抗−エンドスタチン抗体を用いたウ
エスタンブロッティングによって、ｍＥ−ＨＡ―発現が測定された。エンドスタ
チンおよびアンギオスタチンを含む調整培地は内皮細胞増殖に対して強力な阻害
効果を示した。
【０１７１】 生体内発現 腫瘍内注射：２４ｕｇのＤＮＡ／ＰＶＰが腫瘍内で注射され、そして腫瘍を２
４時間で回収された。エンドスタチンまたはアンギオスタチンのタンパク質発現
がＥＬＩＳＡによって測定された。腫瘍培養用培地もエンドスタチンおよびアン
ギオスタチンの生物活性について試験された。 筋肉内送達：４００−４２０μｇのＤＮＡ／ＰＶＰが筋肉内に注射され、続い
て電気穿刺が行われた（材料および方法参照）。血清が２、５および１０日に収
集された。データは、血清中の３〜５ｎｇ／ｍｌのエンドスタチンまたは１０−
１５ｎｇ／ｍｌのアンギオスタチンが５日目に産生され、そして電気穿刺によっ
て移入遺伝子のレベルが３〜５倍まで増大することを示した。発現は１０日目に
減少した。 血管内送達：ＤＯＴＭＡ：ｃｈｏｌ調製されたエンドスタチンまたはアンギオ
スタチン発現プラスミドが正常マウスに静脈注射された。エンドスタチンおよび
アンギオスタチンの発現が肺中のｍＲＮＡについてはＲＴ−ＰＣＲによって測定
され、そして血清中のタンパク質発現についてはＥＬＩＳＡによって測定された
。４００ｎｍサイズの粒子は高率で発現を生じ、また、ＳＵＶ調製よりさらに多
い二次サイトカイン効果を示しうる（生体内の有効性参照）。
【０１７２】 生体内での有効性：エンドスタチンの生体内での抗腫瘍活性を評価する３つの
アプローチは、以下に記載されるとおり、腫瘍内注射によるｓｃ腫瘍、筋肉内注
射によるｓｃ腫瘍および全身送達（静脈内および筋肉内）による肺腫瘍モデルで
ある。これらの３つのモデルから得られるデータが以下に要約されている。 腫瘍内注射でのＲｅｎｃａのｓ．ｃ．腫瘍モデル：４回／週の割合で二週間（
総計７回の処置）にわたって２４μｇのエンドスタチン遺伝子／ＰＶＰを腫瘍内
投与することによって、１４匹のネズミのうち７匹で完全な抑制が誘導された（
５０％抑制率、ｐ＜０．０５）。生存率は、２１日目で、ベクター／ＰＶＰ群に
おける２１％（３／１４）からエンドスタチン／ＰＶＰ群における７８％（１１
／１４）へと増大した。ＨＡ−タグを有するヒト・エンドスタチンが構築された
。ヒト・エンドスタチン／ＰＶＰの腫瘍内注射によって、Ｒｅｎｃａのｓｃ腫瘍
モデルにおける５１％腫瘍成長阻害が得られた。 エンドスタチン遺伝子薬によって抑制された腫瘍は２９日までに顕微鏡的潜伏
状況のままであるが、腫瘍潜伏性を維持するためには、組換えタンパク質を用い
た６サイクルの治療（各サイクル２７日間について４００μｇ／マウス／日）が
必要とされる（Ｂｏｅｈｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０巻、４０４−７頁）。ここ
に表されるデータは、エンドスタチン遺伝子薬がマウスの腫瘍モデルで強力な抗
腫瘍活性を示すこと、および組換えタンパク質に比べてさらに多くの利点を示す
ことを明らかに示している。エンドスタチン／ＰＶＰ処置による抑制中の腫瘍の
組織学的分析は、血管形成（ＣＤ３１染色）が３〜５倍減少されること、腫瘍ア
ポトーシス（ＴｄＴ免疫染色）が３倍増加されることを示した。腫瘍増殖（ＰＣ
ＮＡ染色）および腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ３、ＣＤ４およびＭａｃ−１染色）に
は変化はない。
【０１７３】 全身送達でのＲｅｎｃａのｓ．ｃ．腫瘍：１２０μｇのエンドスタチン／ＰＶ
Ｐの筋肉内注射に続いて電気穿刺（週２×、脚を換える）によって、４０％のＲ
ｅｎｃａ腫瘍注入が誘起された。退縮している腫瘍は血管形成を減少させた。反
復実験により、３４％の腫瘍成長阻害および延命効果が示された。 しかし、全体として腫瘍成長が５０〜６０％減少することが観察されたが、ベ
クターまたはエンドスタチン／ＤｏCｍａ：ｃｈｏｌ（ＳＵＶ、３０μｇ／週２
×）の血管内送達によっては遺伝子特異的効果は示されなかった。他の脂質を使
用することによって、結果の改善が予想される。
【０１７４】 全身送達での肺転移モデル：４００ｎｍ粒子中の１５μｇＤＮＡでのＩＬ−１
２は延命効果を誘起することが示された。エンドスタチン、アンギオスタチンが
遺伝子薬の静脈内送達または筋肉内送達によって延命効果を発揮できるかどうか
について、現在を調査されている。 ＬＬＣはｓｃ原発性腫瘍が切除されるときに肺に転移しうる。この肺転移モデ
ルは抗血管形成性遺伝子薬によって肺転移の阻害効果を評価するために樹立され
る。 マウスの角膜アッセイ：マウスの角膜血管形成がｂＦＧＦペレットを移植する
ことによって誘導された。翌日、エンドスタチン遺伝子薬がＤＮＡ／ＤＣまたは
ＤＮＡ／ＰＶＰのいずれかが静脈注射によって送達された（材料および方法参照
）。結果は、静脈注射によるエンドスタチンは５日目までにｂＦＧＦで誘導され
た角膜血管形成を強力に阻害することを示した。
【０１７５】 新たな抗血管形成遺伝子：エンドスタチンおよびアンギオスタチンが別々の転
写単位によって起動されるエンドスタチン−アンギオスタチンについての二重防
壁の発現プラスミド（ｐＡＳ１２５４）も構築された。 ＩＰ−１０、インターフェロン誘導因子１０は強力なキモカインであるととも
に抗血管形成因子である。トロンボスポジン−１（ＴＳＰ−１）、ＥＣ表面上の
ｐ５３で誘導される糖タンパク質はアンギオスタチンの強力な阻害剤である。内
部断片（ＴＳＰｆ）はその活性のために必須である。ＩＰ−１０ｃＤＮＡが最適
なヒト化コドンを有する公表されたタンパク質配列から逆転写された。ｃＤＮＡ
がオペロンによって合成され、ＩＰ−１０（ｐＩＰ−１３１６）についての発現
プラスミド、ＩＰ−１０／エンドスタチン融合タンパク質（ｐＩＰ１３１１）お
よびＩＰ−１０／ＴＳＰｆ融合タンパク質が構築された。ＩＰ−１０の発現プラ
スミド、ＩＰ−１０／ｈＥ融合タンパク質およびＩＰ−１０／ＴＳＰｆ融合タン
パク質がｍＲＮＡについてはＲＴ−ＰＣＲによって測定され、タンパク質につい
てはウエスタンブロッティングで測定された。約１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌタン
パク質が培養用培地で発現された。これらのコンストラクトは、同遺伝子型の抗
腫瘍有効性が達成され得るかどうかを知るために、Ｒｅｎｃａのｓｃモデルで試
験される。
【０１７６】 当業者であれは、本発明がその目的を達成して記載された結果および利点を得
るとともにそこで固有のものを獲得するのに極めて適していることを容易に理解
できよう。ここに記載されている分子複合体および方法、手段、処置、分子、特
定化合物は現時点における代表的な好ましい実施の形態であり、発明の範囲を制
限するものと解されるべきものではない。当業者によって行われるであろう変更
および他の使用形態は特許請求項の範囲によって限定される本発明の範囲に包含
されるものである。 当業者にとっては明らかなことであるが、ここに開示されている発明に対して
は、発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々に変更および修正を加える
ことが可能である。 明細書に開示している全ての特許および公開公報は、本発明に関係する当業者
のレベルを示すものである。全ての特許および公開公報はここにおいてそのまま
文献援用されており、それらの開示内容はそれぞれ本質的にここに開示されてい
るものとして扱われる。
【０１７７】 ここに例示的に記載されている発明は、任意の単一または複数の要素やここに
開示されていない単一又は複数の限定のない態様において適宜に実施可能である
。したがって、例えば、ここにおけるそれぞぞれの場合において、「有する」、
「実質的に〜から成る」および「〜から成る」という用語はそれぞれ他の２つの
用語のいずれかと置換可能である。使用されている用語および表現は、限定を伴
わない記述用語として使用され、これらの用語および表現の使用は記載された特
性と同等の特性またはその一部を排除することを意図するものではなく、種々の
変更は主張された発明の範囲に包含され得るもの認識される。したがって、本発
明は好ましい実施の形態および選択的な特性によってその本質が開示されたが、
理解されるべき点は、ここに開示された内容の変更および修正が当業者によって
追求され得るものであり、そのような修正および変更は添付の請求の範囲におい
て限定された発明の範囲内に包含されるということである。 さらに、発明の特性または特徴がマーカッシュ形式で記載されている場合、当
業者であれば、その発明はマーカッシュグループに含まれる個々の要素またはそ
のサブグループによっても記載されることを認識するであろう。例えば、Ｘが臭
素、塩素およびヨウ素から成る群から選択されると記載されている場合、Ｘが臭
素である請求項およびＸが臭素および塩素である請求項も包含される。 他の実施の形態は以下の請求項に包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＥＳ１１００、ｐＥＳ１０６２およびｐＥＳ１２８１のプラスミドマップを
示す。
【図２】 ｐＡＳ１０９５およびｐＡＳ１０９６のプラスミドマップを示す。
【図３】 様々な内皮細胞特異的コンストラクトに関するプラスミド情報を示す。
【図４】 ｐＬＣ１２６４のプラスミドマップを示す。
【図５】 本発明のプラスミドのルシフェラーゼ活性および内皮細胞特異性を示す。
【図６】 内皮細胞性エンハンサーの多重体化手順を示す。
【図７】 ｐＡＳ１３５９およびｐＥＳ１３５８のプラスミドマップを示す。
【図８】 生物活性エンドスタチンの生体内発現を示す。
【図９】 エンドスタチン／ＰＶＰがＲｅｎｃａ腫瘍を抑制することを示す。
【図１０】 エンドスタチン／ＰＶＰがＥＣのアポトーシスを誘導することを示す。
【図１１】 筋肉内送達後の血清中におけるエンドスタチンおよびアンギオスタチンの発現
を示す。
【図１２】 エンドスタチン／ＰＶＰが、筋肉内送達の後で皮下Ｒｅｎｃａ腫瘍を抑制する
ことを示す。
【図１３】 エンドスタチン／ＰＶＰが、筋肉内送達の後で皮下Ｒｅｎｃａ腫瘍を抑制する
ことを示す。
【図１４】 肺におけるエンドスタチン導入遺伝子のｍＲＮＡを示す。
【図１５】 マウス角膜での血管形成アッセイを示す。
【図１６】 好ましいコドン使用表を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 35/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 メーレンス，ドロシー アメリカ合衆国 77386 テキサス，スプ リング，ハブロック ドライヴ 1711 (72)発明者 ラルストン，ロバート アメリカ合衆国 77381 テキサス，ザ ウッドランズ，レイク リーフ プレイス ６ (72)発明者 サリヴァン，シーン アメリカ合衆国 77381 テキサス，ザ ウッドランズ，サウス フラグストン パ ス・サークル 99 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 BA21 BA22 BA26 BA80 CA04 CA12 DA02 EA04 FA01 FA02 GA13 HA17 4B065 AA90X AA90Y AA93X AB01 AC14 BA02 CA44 4C076 BB11 CC27 DD48 DD70 EE16 EE51 FF11 FF68 FF70 4C084 AA02 AA13 BA01 BA22 CA17 CA18 CA25 DA27 MA05 MA16 MA66 NA13 NA14 ZB262

Claims (83)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗血管形成コード配列に転写可能に連結された組織特異的エ
    レメントを有するプラスミド。
  2. 【請求項２】 前記組織特異的エレメントは内皮細胞に特異的である請求項
    １に記載のプラスミド。
  3. 【請求項３】 前記組織特異的エレメントはプロモーターを有する請求項１
    に記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】 前記プロモーターはＥＴ−１、ｆｌｋ−１、アルファ−Ｖ、
    ベータ−３、ＩＣＡＭ−２、ｃｙｃＡ、Ｅ２Ｆ１およびｃｄｃ６から成る群から
    選択される請求項３に記載のプラスミド。
  5. 【請求項５】 前記組織特異的エレメントはエンハンサーを有する請求項１
    に記載のプラスミド。
  6. 【請求項６】 前記エンハンサーはＣＭＶ、４コピーのＥＴ−１および７コ
    ピーのＥＴ−１から成る群から選択される請求項５に記載のプラスミド。
  7. 【請求項７】 前記コード配列はエンドスタチン、アンギオスタチン、トロ
    ンボスポンジン−１、ｐ５３、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、短縮型組織因子、イン
    テグリンαｖβ３ブロッキング因子、ＶＨＬ遺伝子産物、細胞周期依存性キナー
    ゼ阻害剤、ＶＥＧＦｒ、ｂＦＧＦｒ及びｂＦＧＦ結合タンパク質から成る群から
    選択される産物をコードする請求項１に記載のプラスミド。
  8. 【請求項８】 コード配列は最適なコドン使用を有する合成された配列であ
    る請求項７に記載のプラスミド。
  9. 【請求項９】 前記コード配列はプラスミドｐＥＳ１２８１、ｐＩＰ１３１
    ６、ｐＡＳ１０９５またはｐＡＳ１０９６のヌクレオチド配列を有する請求項１
    に記載のプラスミド。
  10. 【請求項１０】 成長ホルモンの３’非翻訳領域をさらに有する請求項１に
    記載のプラスミド。
  11. 【請求項１１】 前記成長ホルモンの３’非翻訳領域はヒトの成長ホルモン
    遺伝子からのものである請求項１０に記載のプラスミド。
  12. 【請求項１２】 ＡＬＵ反復配列またはＡＬＵ反復様配列が前記３’非翻訳
    領域から除かれている請求項１０に記載のプラスミド。
  13. 【請求項１３】 前記プラスミドは前記コード配列の発現に関して適切な関
    係にあるプロモーター、ＴＡＴＡボックス、Ｃａｐ部位ならびに第１のイントロ
    ンおよびイントロン／エキソン境界を含む請求項１に記載のプラスミド。
  14. 【請求項１４】 前記プラスミドは前記プロモーターと前記コード配列との
    間に挿入された５’ｍＲＮＡリーダー配列をさらに有する請求項１３に記載のプ
    ラスミド。
  15. 【請求項１５】 前記プラスミドはニワトリの骨格性α−アクチン遺伝子か
    らのイントロン／５’ＵＴＲをさらに有する請求項１に記載のプラスミド。
  16. 【請求項１６】 第１の転写ユニットと、第２の転写ユニットとをさらに有
    し、 第１の転写ユニットが第１の５’非翻訳領域と転写可能に連結された第１の転
    写制御配列、第１のイントロン、第１のコード配列および第１の３’非翻訳領域
    ／ポリ（Ａ）シグナルを有し、前記第１のイントロンは前記制御配列と前記第１
    のコード配列との間に存在し、 第２の転写ユニットが第２の５’非翻訳領域と転写可能に連結された第２の転
    写制御配列、第２のイントロン、第２のコード配列および第２の３’非翻訳領域
    ／ポリ（Ａ）シグナルを有し、前記第２のイントロンは前記制御配列と前記第２
    のコード配列との間に存在し、 前記第１および第２のコード配列はアンギオスタチンのコード配列およびエン
    ドスタチンのコード配列を有している請求項１に記載のプラスミド。
  17. 【請求項１７】 前記第１の転写制御配列または前記第２の転写制御配列は
    １つまたは複数のサイトメガロウイルスプロモーター配列を有する請求項１６に
    記載のプラスミド。
  18. 【請求項１８】 前記第１および第２の転写制御配列は同じである請求項１
    ６に記載のプラスミド。
  19. 【請求項１９】 前記第１および第２の転写制御配列は異なっている請求項
    １６に記載のプラスミド。
  20. 【請求項２０】 前記アンギオスタチンのコード配列は前記エンドスタチン
    のコード配列の５’側に存在している請求項１９に記載のプラスミド。
  21. 【請求項２１】 可変的スプラシングを有するイントロンと、第１のコード
    配列と、第２のコード配列とをさらに有し、 前記第１および第２のコード配列はアンギオスタチンのコード配列と、エンド
    スタチンのコード配列を有する配列とを有している請求項１に記載のプラスミド
    。
  22. 【請求項２２】 第１のコード配列および第２のコード配列と転写可能に連
    結された転写制御配列と、 ５’非翻訳領域と、 前記第１のコード配列の５’側に存在するイントロンと、 前記第１のコード配列の３’側に存在するとともに前記第２のコード配列の５
    ’側に存在する選択的スプラシング部位と、 ３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルと、 をさらに有する請求項２１に記載のプラスミド。
  23. 【請求項２３】 前記転写制御配列はサイトメガロウイルスプロモーター配
    列を有する請求項２２に記載のプラスミド。
  24. 【請求項２４】 第１のコード配列、ＩＲＥＳ配列、第２のコード配列およ
    び３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルと転写可能に連結された転写制御配列と
    、 プロモーターと前記第１のコード配列との間に存在するイントロンと、 をさらに有し、前記ＩＲＥＳ配列は前記第１のコード配列と前記第２のコード
    配列の間に存在し、 前記第１および第２のコード配列はアンギオスタチンのコード配列およびエン
    ドスタチンのコード配列を有する請求項１に記載のプラスミド。
  25. 【請求項２５】 前記転写制御配列はサイトメガロウイルスプロモーター配
    列を有する請求項２４に記載のプラスミド。
  26. 【請求項２６】 前記ＩＲＥＳ配列は脳心筋炎ウイルスから得られる請求項
    ２４に記載のプラスミド。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドと、保護的
    な相互作用性の非凝縮性化合物とを含む組成物。
  28. 【請求項２８】 前記保護的な相互作用性の非凝縮性化合物はポリビニルピ
    ロリドンである請求項２７に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】 前記プラスミドは０．５％〜５０％の間のＰＶＰを有する
    溶液中に存在している請求項２７に記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 前記溶液は約５％のＰＶＰを含んでいる請求項２９に記載
    の組成物。
  31. 【請求項３１】 前記ＤＮＡは少なくとも約８０％がスーパーコイル状であ
    る請求項２７に記載の組成物。
  32. 【請求項３２】 前記ＤＮＡは少なくとも約９０％がスーパーコイル状であ
    る請求項３１に記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 前記ＤＮＡは少なくとも約９５％がスーパーコイル状であ
    る請求項３２に記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、抗血管形成コー
    ド配列を有するプラスミドとを有している組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドと、カチオ
    ン性脂質とを有する組成物。
  36. 【請求項３６】 中性の共脂質をさらに有する請求項３５に記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである請求項３５に記載
    の組成物。
  38. 【請求項３８】 前記中性の共脂質はコレステロールである請求項３６に記
    載の組成物。
  39. 【請求項３９】 前記プラスミド中のＤＮＡおよび前記カチオン性脂質は負
    電荷対正電荷の比が１：０．１〜１：１０の間にあるような量で存在している請
    求項３５に記載の組成物。
  40. 【請求項４０】 前記比は１：０．３〜１：６の間である請求項３９に記載
    の組成物。
  41. 【請求項４１】 前記比は約１：３である請求項４０に記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 前記ＤＮＡは少なくとも約８０％がスーパーコイル状であ
    る請求項３５に記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 前記ＤＮＡは少なくとも約９０％がスーパーコイル状であ
    る請求項４２に記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 前記ＤＮＡは少なくとも約９５％がスーパーコイル状であ
    る請求項４３に記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 等張性の炭水化物溶液をさらに有する請求項３５に記載の
    組成物。
  46. 【請求項４６】 前記等張性の炭水化物溶液は実質的には約１０％のラクト
    ースから成る請求項４５に記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 前記カチオン性脂質および前記中性の共脂質は１００ナノ
    メートル〜１，０００ナノメートルの間の押出しサイズを有するリポソームとし
    て調製される請求項３６に記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 前記サイズは２００ナノメートル〜９００ナノメートルの
    間である請求項４７に記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 前記サイズは約４００ナノメートルである請求項４８に記
    載の組成物。
  50. 【請求項５０】 第１の成分と、第２の成分とを有する組成物であって、 第１の成分が抗血管形成コード配列を含むプラスミドおよびカチオン性脂質を
    中性の共脂質とともに含有し、前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、前記中
    性の共脂質はコレステロールであり、前記プラスミド中のＤＮＡおよび前記カチ
    オン性脂質は負電荷対正電荷の比が約１：３であるような量で存在し、 第２の成分が保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を含有し、前記第１の成分
    が第２の成分内に存在している組成物。
  51. 【請求項５１】 保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、アンギオスタチ
    ンのコード配列を有する第１のプラスミドと、エンドスタチンのコード配列を独
    立に有する１つまたは複数の他のプラスミドとを有する組成物。
  52. 【請求項５２】 抗血管形成コード配列およびカチオン性脂質を中性の共脂
    質とともに含有する含む組成物。
  53. 【請求項５３】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドを作製する
    方法であって、抗血管形成コード配列および組織特異的エレメントをプラスミド
    に挿入する段階を有する方法。
  54. 【請求項５４】 前記抗血管形成コード配列および前記組織特異的エレメン
    トを転写可能に連結する段階をさらに有する請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 請求項３４に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．抗血管形成コード配列を有する転写ユニットを有するＤＮＡ分子を調製す
    る段階と、 ｂ．保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を調製する段階と、 ｃ．治療的有効量の抗血管形成コード配列を哺乳動物に送達可能な組成物が形
    成されるような条件下において、前記保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と前
    記ＤＮＡとを結合させる段階と、 を有する方法。
  56. 【請求項５６】 前記ＤＮＡ分子はプラスミドであり、前記プラスミドは抗
    血管形成コード配列およびヒトの成長ホルモン３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグ
    ナルを有している請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 請求項３６に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．抗血管形成コード配列を有するＤＮＡを調製する段階と、 ｂ．カチオン性脂質および中性の共脂質の混合物を調製する段階と、 ｃ．前記混合物と前記ＤＮＡとを、前記カチオン性脂質および前記ＤＮＡが約
    １：３の負電荷対正電荷の比で存在するような量で組み合わせる段階と、 を有し、前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、前記中性の共脂質はコレス
    テロールである方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５０に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．抗血管形成コード配列を有するプラスミドおよびカチオン性脂質を中性の
    共脂質とともに有する第１の成分を調製する段階と、 ｂ．保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を有する第２の成分を調製する段階
    と、 ｃ．前記第１および第２の成分を、得られる組成物が前記第２の成分内に前記
    第１の成分を有するように組み合わせるする段階と、 を有し、前記カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、前記中性の共脂質はコレス
    テロールであり、前記プラスミド中のＤＮＡおよび前記カチオン性脂質は負電荷
    対正電荷の比が約１：３であるような量で存在している方法。
  59. 【請求項５９】 請求項５１に記載の組成物を作製する方法であって、 ａ．保護的な相互作用性の非凝縮性化合物を調製する段階と、 ｂ．アンギオスタチンのコード配列を含む第１のプラスミドを調製する段階と
    、 ｃ．エンドスタチンのコード配列を独立に有する１つまたは複数の他のプラス
    ミドを調製する段階と、 ｄ．前記保護的な相互作用性の非凝縮性化合物と、前記アンギオスタチンのコ
    ード配列を含む前記プラスミドと、前記他のプラスミドとを組み合わせる段階と
    、 を有する方法。
  60. 【請求項６０】 抗血管形成コード配列を含むプラスミドおよびカチオン性
    脂質を中性の共脂質とともに組み合わせる段階を有する請求項５２に記載される
    組成物を作製する方法。
  61. 【請求項６１】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項１〜２６のいずれ
    かに記載のプラスミドを投与する段階を有する方法。
  62. 【請求項６２】 前記プラスミドを一時的に発現させる段階をさらに有する
    請求項６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記異常または疾患はガンである請求項６１に記載の方法
    。
  64. 【請求項６４】 前記組成物は注射により投与される請求項６３に記載の方
    法。
  65. 【請求項６５】 細胞をその場で形質移入する方法であって、前記細胞を形
    質移入するのに十分な時間にわたって、前記細胞を請求項１〜２６のいずれかに
    記載のプラスミドと接触させる段階を含む方法。
  66. 【請求項６６】 前記細胞の形質移入はインビボで行われる請求項６５に記
    載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記接触は約５％のＰＶＰ溶液の存在下で行われる請求項
    ６５に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 多数の細胞における抗血管形成遺伝子の送達および発現を
    行うための方法であって、 （ａ）前記多数の細胞を請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドで形質
    移入する段階と、 （ｂ）抗血管形成因子をコードする核酸配列をベクター内に発現させ得る条件
    下で前記多数の細胞をインキュベーションする段階と、 を有する方法。
  69. 【請求項６９】 前記抗血管形成因子はアンギオスタチンまたはエンドスタ
    チンであり、前記細胞がヒト細胞である請求項６８に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記接触は約５％のＰＶＰ溶液の存在下で行われる請求項
    ６８に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 疾患または異常を処置する方法であって、細胞をその場で
    請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドで形質移入する段階を有する方法
    。
  72. 【請求項７２】 前記疾患または異常は局在化した疾患または異常である請
    求項７１に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記疾患または異常は固形腫瘍である請求項７２に記載の
    方法。
  74. 【請求項７４】 前記疾患または異常は全身性の疾患または異常である請求
    項７１に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記疾患または異常は転移ガンである請求項７４に記載の
    方法。
  76. 【請求項７６】 請求項１〜２６のいずれかに記載のプラスミドで形質移入
    された細胞。
  77. 【請求項７７】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項２７に記載の組成
    物を投与する段階を有する方法。
  78. 【請求項７８】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項３４に記載の組成
    物を投与する段階を有する方法。
  79. 【請求項７９】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項３５に記載の組成
    物を投与する段階を有する方法。
  80. 【請求項８０】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項５０に記載の組成
    物を投与する段階を有する方法。
  81. 【請求項８１】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項５１に記載の組成
    物を投与する段階を有する方法。
  82. 【請求項８２】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物に治療的有効量の請求項５２に記載の組成
    物を投与する段階を有する方法。
  83. 【請求項８３】 哺乳動物の異常または疾患を処置する方法であって、前記
    異常または疾患に罹っている哺乳動物にアンギオスタチンのコード配列を有する
    第１のプラスミドとエンドスタチンのコード配列を有する第２のプラスミドとの
    組成物の治療的有効量を投与する段階を有する方法。
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