DE69629826T2

DE69629826T2 - Therapeutische antiangiogenische zusammensetzungen und verfahren

Info

Publication number: DE69629826T2
Application number: DE69629826T
Authority: DE
Inventors: S. Michael O'REILLY; M. Judah Folkman
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1995-10-23
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2016-10-24
Also published as: US7179608B2; NZ321356A; CN1202932A; US6746865B1; US20020086352A1; NO981803D0; US6630448B2; ES2206602T3; JP2004236662A; US7655458B2; US6544758B2; US6764995B2; AU7466696A; US20040102372A1; US20030219426A1; US20020123458A1; EP0857210B1; US20030087393A1; US20020127595A1; JP2002501362A

Description

Technisches Gebiet
Diese Anmeldung betrifft einen neuen Inhibitor der Angiogenese, der nützlich zur Behandlung Angiogenese-bezogener Erkrankungen ist, wie z. B. von Angiogenese-abhängigem Krebs. Die Erfindung betrifft ferner eine neue Zusammensetzung und ein neues Verfahren zur Heilung von Angiogenese-abhängigem Krebs. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Assays (Tests) und Kits zur Endostatinmessung, histochemische Kits zur Lokalisierung von Endostatin, molekulare Sonden zur Überwachung der Endostatinbiosynthese, Antikörper, die spezifische für das Endostatin sind, die Entwicklung von Peptidagonisten und -antagonisten für den Endostatinrezeptor, und cytotoxische Mittel, die an Endostatinpeptide gebunden sind.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene Linien eines direkten Nachweises legen jetzt nahe, daß Angiogenese wesentlich für das Wachstum und die Beständigkeit von soliden Tumoren und ihren Metastasen ist (Folkman, 1989; Hori et al., 1991; Kim et al., 1993; Millauer et al., 1994). Zur Stimulierung von Angiogenese erhöhen Tumore ihre Erzeugung einer Vielzahl angiogener Faktoren, einschließlich der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF und BFGF) (Kandel et al., 1991) und des vaskulären Endothelzell-Wachstumsfaktors/vaskulären Permeabilitätsfaktors (VEGF/VPF). Jedoch erzeugen viele bösartige Tumoren ebenfalls Inhibitoren der Angiogenese, einschließlich Angiostatin und Thrombospondin (Chen et al., 1995; Good et al., 1990; O'Reilly et al., 1994). Es wird postuliert, daß der angiogene Phänotyp das Ergebnis eines Nettogleichgewichts zwischen diesen positiven und negativen Regulatoren der Gefäßneubildung ist (Good et al., 1990; O'Reilly et al., 1994; Parangi et al., 1996; Rasinejad et al., 1989). Verschiedene andere endogene Inhibitoren der Angiogenese wurden identifiziert, obwohl nicht alle mit der Gegenwart eines Tumors verbunden sind. Diese schließen ein: Blutplättchenfaktor 4 (Gupta et al., 1995; Maione et al., 1990), Interferon-alpha, Interferon-induzierbares Protein 10 (Angiolillo et al., 1995; Strieter et al., 1995), das durch Interleukin-12 und/oder Interferon-gamma induziert wird (Voest et al., 1995), Gro-beta (Cao et al., 1995) und das 16 kDa N-terminale Fragment von Prolactin (Clapp et al., 1993). Der einzige bekannte Angiogenese-Inhibitor, der spezifisch die Endothelzellproliferation hemmt, ist Angiostatin (O'Reilly et al., 1994).
Angiostatin ist ein spezifischer Inhibitor der Endothelzellproliferation mit ca. 38 kiloDalton (kDa). Angiostatin ist ein internes Fragment von Plasminogen, das wenigstens drei der fünf Kringles von Plasminogen enthält. Es wurde gezeigt, daß Angiostatin das Tumorgewicht reduziert und die Metastase bei bestimmten Tumormodellen inhibiert (O'Reilly et al., 1994). Wie hier nachfolgend verwendet, bezeichnet der Begriff "Angiostatin" Angiostatin wie oben beschrieben; Peptidfragmente von Angiostatin, die eine die Endothelzellproliferation inhibierende Aktivität besitzen; und Analoga von Angiostatin, die eine substantielle Sequenzhomologie (wie hier definiert) mit der Aminosäuresequenz von Angiostatin haben, und die eine die Endothelzellproliferation inhibierende Aktivität haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Protein-Inhibitor und Verfahren zu seiner Verwendung. Das Protein ist ein wirksamer und spezifischer Inhibitor der Endothelproliferation und Angiogenese. Die systemische Therapie mit dem Inhibitor verursacht eine beinahe vollständige Unterdrückung der tumorinduzierten Angiogenese, und er weist eine stake Antitumoraktivität auf.
Das inhibitorische Protein hat ein Molekulargewicht von ca. 18 000 bis ca. 20 000 Dalton (18 bis 20 kDa) und kann die Endothelzellproliferation in kultivierten Endothelzellen hemmen. Das Protein kann ferner durch seine bevorzugte N-terminale Aminosäuresequenz charakterisiert werden, von der die ersten zwanzig (20) wie folgt sind:
Ein bevorzugter Endothelzell-Proliferationsinhibitor der Erfindung ist ein Protein mit den oben beschriebenen Charakteristika, das aus der murinen Hämangioendotheliom-Zellinie EOMA isoliert und gereinigt werden kann. Dieses inhibitorische Protein wurde Endostatin genannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Endostatinprotein, worin das Endostatinprotein oder ein Fragment davon ein Fragment einer C-terminalen nicht-kollagenen Region eines Kollagenproteins ist, und worin das Endostatinprotein oder ein Fragment davon ferner durch seine Fähigkeit zur Inhibierung der Angiogenese gekennzeichnet ist.
Rehn et al. (J. of Biol. Chem. 269 (19): 13929-35 (1994)) und Sasaki et al. (EMBO J., 17(15): 4249-56 (1998)) haben die C-terminalen Regionen von Kollagen XVIII unter Verwendung unterschiedlicher Nomenklaturen numeriert.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen und Prozessen bereit, die durch ungewünschte und unkontrollierte Angiogenese vermittelt werden, durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein substantiell gereinigtes Endostatin oder Endostatin-Derivat in einer zur Inhibierung der Angiogenese ausreichenden Dosierung umfaßt, an einen Menschen oder ein Tier. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich zur Behandlung oder zur Unterdrückung des Wachstums von Tumoren. Verabreichung von Endostatin an einen Menschen oder ein Tier mit vorvaskularisierten metastasierenden Tumoren verhindert das Wachstum oder die Expansion dieser Tumore.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls diagnostische Verfahren und Kits zum Nachweis und zur Messung von Endostatin in biologischen Flüssigkeiten und Geweben und zur Lokalisierung von Endostatin in Geweben ein. Das diagnostische Verfahren und Kit können in jeder Konfiguration sein, die den Durchschnittsfachleuten allgemein bekannt ist. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Antikörper, die spezifisch für das Endostatin sind, und Antikörper, die die Bindung von für das Endostatin spezifischen Antikörpern inhibieren, ein. Diese Antikörper können polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Die für Endostatin spezifischen Antikörper können in diagnostischen Kits zum Nachweis der Gegenwart und Menge von Endostatin verwendet werden, was diagnostisch oder prognostisch für das Auftreten oder erneute Auftreten von Krebs oder anderen durch Angiogenese vermittelten Erkrankungen ist. Für Endostatin spezifische Antikörper können ebenfalls an einen Menschen oder an Tier zur Passivimmunisierung des Menschen oder Tieres gegen Endostatin verabreicht werden, wodurch die angiogene Inhibierung reduziert wird.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls diagnostische Verfahren und Kits zum Nachweis der Gegenwart und Menge von Antikörpern ein, die Endostatin in Körperflüssigkeiten binden. Das diagnostische Verfahren und Kit können in jeder Konfiguration sein, die den Durchschnittsfachleuten allgemein bekannt ist.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Endostatin-Peptidfragmente ein, die mit Isotopen oder anderen Molekülen oder Proteinen markiert sein können, zur Verwendung im Nachweis und der Visualisierung von Endostatin-Bindungsstellen mit Techniken des Standes der Technik, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Positronemissionstomographie, Autoradiographie, Durchflußcytometrie, Radiorezeptor-Bindungsassays und Immunohistochemie.
Diese Endostatinpeptide wirken ebenfalls als Agonisten und Antagonisten am Endostatinrezeptor, wodurch die biologische Aktivität von Endostatin gesteigert oder blockiert wird. Solche Peptide werden in der Isolierung des Endostatinrezeptors verwendet.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Endostatin, Endostatinfragmente, Endostatin-Antiseren oder Endostatinrezeptoragonisten und -antagonisten, die an cytotoxische Mittel gebunden sind, für therapeutische und Forschungsanwendungen ein.
Die vorliegende Erfindung schließt molekulare Sonden für die Ribonukleinsäure und Desoxyribonukleinsäure ein, die an der Transkription und Translation von Endostatin beteiligt ist. Diese molekularen Sonden stellen Mittel zum Nachweis und zur Messung der Endostatinbiosynthese in Geweben und Zellen bereit.
Ein überraschender Befund ist, daß verschiedene Formen von rekombinantem Endostatinprotein als Antiangiogenese-Verbindungen mit Langzeitfreisetzung ("sustained release") bei Verabreichung an ein Tier mit Tumor dienen können. Eine bevorzugte Form der Verbindung mit Langzeitfreisetzung ist nicht-neugefaltetes rekombinant erzeugtes Endostatin.
Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die entsprechende Nukleotid-Codonen umfassen, die für die oben offenbarte Aminosäuresequenz und für Endostatin und Endothelzellproliferationinhibierende Peptidfragmente davon codieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Verwendung des Endostatinproteins und von Peptidfragmenten, entsprechenden Nuklein säuresequenzen und Antikörpern, die spezifisch an den Inhibitor und seine Peptide binden, zur Diagnose von Endothelzell-bezogenen Erkrankungen und Störungen.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Rezeptoren, die spezifisch für Endostatin sind, und die dadurch identifizierten und isolierten Rezeptormoleküle.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung neuer Enzyme, die Endostatin aus Kollagen Typ XVIII freisetzen können, und anderer Moleküle, die eine Endostatin-Aminosäuresequenz enthalten, und von Peptiden davon. Solche Endostatin-erzeugenden Enzyme sind ebenfalls ein Aspekt der Erfindung.
Ein wichtiges medizinisches Verfahren ist eine neue Form der Geburtenkontrolle, worin eine wirksame Menge Endostatin an eine Frau verabreicht wird, so daß die uterine endometriale Gefäßbildung inhibiert wird und die Embryoeinnistung nicht auftreten kann oder aufgehalten wird.
Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Auffinden eines neuen und wirksamen Verfahrens zur Behandlung von Angiogenese-bezogenen Erkrankungen in Patienten, insbesondere Angiogeneseabhängigem Krebs, und zur Heilung von Angiogenese-abhängigem Krebs in Patienten. Das Verfahren liefert unerwartet das medizinisch wichtige Ergebnis der Inhibierung von Tumorwachstum und Reduktion der Tumormasse. Das Verfahren betrifft die Co-Verabreichung des Endostatins der vorliegenden Erfindung und einer anderen Anti-Angiogenese-Verbindung, bevorzugt Angiostatin. Entsprechend schließt die vorliegende Erfindung ebenfalls Formulierungen ein, die Endostatin und gegebenenfalls Angiostatin enthalten, die wirksam zur Behandlung oder Heilung von Angiogeneseabhängigen Krebstypen sind.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die ein Endostatinprotein umfaßt.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen und Prozessen bereitzustellen, die durch Angiogenese vermittelt werden.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein diagnostisches oder prognostisches Verfahren oder Kit zum Nachweis der Gegenwart und Menge von Endostatin in einer Körperflüssigkeit oder in Gewebe bereitzustellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen und Prozessen bereitzustellen, die durch Angiogenese vermittelt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hämangion, feste Tumore, Leukämie, Metastase, Telangiektasie, Psoriasis, Sklerodermie, pyogenes Granulom, Myokardangiogenese, Plaque-Neovaskularisation, Koronarkollateralgefäße, Zerebralkollateralgefäße, arteriovenöse Fehlbildungen, ischämische Extremitätenangiogenese, Hornhauterkrankungen, Rubeose, neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, Arthritis, diabetische Neovaskularisation, Makuladegeneration, Wundheilung, Ulcus pepticum, Brüche, Keloide, Vaskulogenese, Hämatopoese, Ovulation, Menstruation und Plazentation.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Unterdrückung des Wachstums von Krebs bereitzustellen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung der Gegenwart eines für ein Endostatin spezifischen Antikörpers in einer Körperflüssigkeit bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die aus Antikörpern gegen Endostatin besteht, die selektiv für spezifische Regionen des Endostatinmoleküls sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis oder zur Prognose von Krebs bereitzustellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Visualisierung und Quantifizierung von Stellen der Endostatinbindung in vivo und in vitro bereitzustellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Verwendung im Nachweis und in der Quantifizierung der Endostatinbiosynthese bereitzustellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Therapie für Krebs bereitzustellen, die minimale Nebenwirkungen hat.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die Endostatin oder ein Endostatinpeptid umfaßt, das ein cytotoxisches Mittel gebunden ist, zur Behandlung oder Unterdrückung des Wachstums von Krebs.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der folgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der anhängenden Patentansprüche ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Inhibierung der kapillaren Endothelzellproliferation durch konditionierte Medien aus EOMA-Zellen
Konditionierte Medien, die aus konfluenten EOMA-Zellen oder Basismedien gesammelt wurden, wurden auf bovine kapillare Endothelzellen mit 1 ng/ml bFGF in einem 72-stündigen Proliferationsassay aufgetragen. Die Endothelzellproliferation wurde durch die EOMA-konditionierten Medien gehemmt. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± Standardfehler dar.
2: Reinigung eines Inhibitors der Endothelproliferation aus EOMA-konditionierten Medien
Konditionierte Medien, die aus konfluenten EOMA-Zellen gesammelt wurden, wurden an einer Heparin-Sepharose-Säule fraktioniert. Die Endothelproliferation-inhibierende Aktivität eluierte bei ca. 0,8 M NaCl.
3: Reinigung eines Inhibitors der Endothelproliferation durch Gelfiltration
Gereinigter Inhibitor aus Heparin-Sepharose-Säulenchromatographie wurde auf eine Gelfiltrationssäule aufgetragen und als Einzelpeak eluiert.
4: Reinigung von Inhibitor der Endothelzellproliferation durch Umkehrphasen-Säulenchromatographie
Durch Heparin-Sepharose- und Gelfiltrationschromatographie gereinigter Inhibitor wurde auf eine Umkehrphasensäule aufgetragen. Der Inhibitor eluierte als einzelne Bande aus der Säule bei ca. 45% Acetonitril.
5: N-terminale Aminosäuresequenz eines Inhibitors der Endothelzellproliferation
Die N-terminale Sequenz des gereinigten Inhibitors der Endothelzellproliferation ist im Verhältnis zu einem schematischen Diagramm von Kollagen Typ XVIII gezeigt. Die N-terminale Sequenz zeigte die Identität des Inhibitors mit einem ca. 20 kDa C-terminalen Fragment (gezeigt in ausgefüllter Schattierung) für Kollagen Typ XVIII. Die offenen Kästchen stellen die Kollagenase-Domänen von Kollagen Typ XVIII dar.
6: Behandlung von Lewis-Lungenkarzinom mit rekombinantem Maus-Endostatininhibitor
Rekombinanter Inhibitor, der E. coli erzeugt wurde, wurde an mit Lewis-Lungenkarzinom geimpfte Mäuse verabreicht, die ein Tumorvolumen von ca. 150 mm³ erreicht hatten. Der Inhibitor wurde mit 20 mg/kg/Tag verabreicht. Die Tumormasse entwickelte sich zu nicht nachweisbaren Mengen nach einer Behandlung von ca. 12 Tagen zurück.
7A–C: Systemische Therapie mit rekombinantem Endostatin rückentwickelt Primärtumoren von Lewis-Lungenkarzinom
7A. Mäusen wurden subkutan am Rücken Lewis-Lungenkarzinomzellen implantiert. Die systemische Therapie mit rekombinantem Maus-Endostatin (20 mg/kg/Tag) wurde begonnen, als die Tumore ca. 200 mm³ waren (1% Körpergewicht). Die Tumore in den mit Endostatininhibitor behandelten Mäusen nahmen schnell ab und wurden zu > 99% relativ zu mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen inhibiert. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung für 5 Mäuse dar. Das Experiment wurde mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt.
7B. Repräsentative behandelte und unbehandelte Mäuse mit Tumor nach 11 Tagen systemischer Therapie mit Endostatin. Kochsalzlösung-behandelte Mäuse (rechts) besaßen schnellwachsende rote Tumore mit ulzerösen Oberflächen. Endostatin-behandelte Mäuse (links) hatten kleine blasse Resttumore (Pfeil).
7C. Verbleibende Erkrankung bei Endostatin-behandelten Mäusen. Drei der fünf Endostatin-behandelten Mäuse wurden nach 16 Tagen Therapie getötet. Die Autopsie zeigte kleine weiße verbleibende Tumore an der Stelle der ursprünglichen primären Implantation (Pfeile).
8: Behandlung von murinem T241-Fibrosarkom mit rekombinantem Maus-Endostatin aus E. coli
Mäuse wurden mit T241 Fibrosarkom-Zellen geimpft. Kontrollmäuse wurden mit Kochsalzlösung behandelt. Experimentelle Mäuse wurden mit 20 mg/kg/Tag von rekombinantem Maus-Endostatin, das aus E. coli gewonnen wurde, behandelt.
9: Behandlung von murinem B16F10-Melanom mit rekombinantem Maus-Endostatin aus E. coli
Mäuse wurden mit murinen B16F10-Melanomzellen geimpft. Kontrolltiere wurden mit Kochsalzlösung behandelt. Experimentelle Tiere wurden mit 20 mg/kg/Tag von rekombinantem Maus-Endostatin, das aus E. coli gewonnen wurde, behandelt.
10: Behandlung von EOMA-Hämangioendotheliom mit rekombinantem Maus-Endostatin aus E. coli
Mäuse wurden mit EOMA-Hämangioendotheliom-Zellen geimpft. Kontrolltiere wurden mit Kochsalzlösung behandelt. Experimentelle Tiere wurden mit 20 mg/kg/Tag von rekombinantem Maus-Endostatin, das aus E. coli gewonnen wurde, behandelt.
11: Behandlung von Lewis-Lungenkarzinom mit rekombinantem Maus- oder humanem Endostatin, das E. coli gewonnen wurde
Mäuse wurden mit Lewis-Lungenkarzinomzellen geimpft. Kontrolltiere wurden mit Kochsalzlösung behandelt. Experimentelle Tiere wurden mit rekombinantem Endostatin, das aus der Maussequenz gewonnen wurde, oder mit rekombinantem Endostatin, das aus der Humansequenz gewonnen wurde, behandelt, wobei beide Endostatintypen rekombinant in E. coli erzeugt wurden. Maus-Endostatin wurde mit entweder 20 mg/kg/Tag oder 2,5 mg/kg/Tag verabreicht, und Human-Endostatin wurde mit 20 mg/kg/Tag verabreicht.
12A–C: Endostatin-Ergebnisse in der Inhibierung der Angiogenese und in der Zunahme der Apoptose von Primärtumoren von Lewis-Lungenkarzinom
Histologische Schnitte von Tumoren aus mit Kochsalzlösung gegenüber mit Endostatin behandelten Mäusen, denen Lewis-Lungenkarzinome implantiert worden waren, wurden auf Proliferation (PCNA), Apoptose (TUNEL) und Angiogenese (vWF) analysiert. Es gab keinen signifikanten Unterschied im proliferativen Index der Tumorzellen (12A) in den behandelten gegenüber den unbehandelten Tumoren. Im Gegensatz erhöhte sich der apoptotische Index der Tumorzellen (12B) 8-fach (p < 0,001) in den mit Endostatin behandelten Mäusen. Die Gefäßdichte (12C) wurde durch Zählen der Anzahl von kapillaren Blutgefäßen durch ein Hochleistungsfeld ("high-power field", HPF) in mit Antikörpern gegen vWF angefärbten Schnitten bestimmt. Angiogenese wurden fast vollständig unterdrückt in den verbleibenden mikroskopischen Tumoren der mit Endostatin behandelten Mäuse (p < 0,001).
13: Cyclisierende Ruhezustandtherapie von Lewis-Lungenkarzinom mit rekombinantem Maus-Endostatin aus E. coli
Mäusen wurden subkutan auf dem Rücken Lewis-Lugenkarzinomzellen implantiert. Die systemische Therapie mit rekombinantem Mausinhibitor (Endostatin), verabreicht mit einer Dosis von 20 mg/kg/Tag, wurde begonnen, als die Tumore ca. 200 mm³ waren (1% des Körpergewichts). Die Tumore in den mit Endostatininhibitor behandelten Mäusen entwickelten sich zu im wesentlichen nicht-nachweisbaren Mengen nach ca. 15 Tagen Therapie zurück. Wenn die Behandlung beendet wurde, nahm das Tumorvolumen schnell zu und war anschließend behandelbar auf die gleichen nicht-nachweisbaren Mengen durch Wiedereinsetzung der Behandlung. Die Spitzen und Täler in der Figur zeigen die cyclisierende Wirkung der Inhibierung mit Endostatin.
14: Kombinationstherapie mit rekombinantem Maus-Antiostatin und Endostatin aus E. coli
Mäusen wurden subkutan auf dem Rücken Lewis-Lugenkarzinomzellen implantiert. Die systemisch Therapie mit einer Kombination aus rekombinantem Maus-Endostatin (20 mg/kg/Tag) und rekombinantem Maus-Angiostatin (20 mg/kg/Tag) wurde begonnen, als die Tumore ca. 300 mm³ waren. Die Tumore in den mit der Kombinationstherapie behandelten Mäusen entwickelten sich schnell auf im wesentlichen nicht-nachweisbare Mengen in ca. 15 Tagen zurück. Es ist wichtig, daß die zurückentwickelten Tumore ruhend blieben und ihre Größe oder Masse sich nicht erhöhte, nachdem die Behandlung beendet wurde. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis von substantieller medizinischer Bedeutung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Anmelder haben eine neue Klasse von Proteinmolekülen gefunden, die die Fähigkeit zur Inhibierung der Endothel-Proliferation besitzen, wenn sie in vitro zu sich vermehrenden Endothelzellen gegeben werden. Entsprechend wurden diese Proteinmoleküle funktionell als Endostatine definiert, jedoch ist es selbstverständlich, daß diese funktionelle Definition keineswegs die Bioaktivität der Endostatine auf die Inhibierung des Endothelzellwachstums in vitro oder in vivo beschränkt. Viele andere Funktionen von Endostatinen sind wahrscheinlich.
Der Begriff "Endostatin" bezeichnet ein Protein, das bevorzugt eine Größe von 18 bis 20 kDa hat, gemäß Bestimmung durch nicht-reduzierte bzw. reduzierte Gelelektrophorese. Der Begriff Endostatin schließt ebenfalls Vorläuferformen des 18 bis 20 kDa Proteins ein. Der Begriff Endostatin schließt ebenfalls Fragmente dieses 18 bis 20 kDa Proteins und modifizierte Proteine und Peptide ein, die eine im wesentlichen ähnliche Aminosäuresequenz haben und die die Proliferation von Endothelzellen inhibieren können. z. B. sind stumme Substitutionen von Aminosäuren allgemein fachbekannt, wenn der Austausch einer Aminosäure mit einer strukturell oder chemisch ähnlichen Aminosäure die Struktur, Konformation oder Aktivität des Proteins nicht signifikant verändert. Solche stummen Substitutionen sollen in den Umfang der anliegenden Patentansprüche fallen.
Man wird anerkennen, daß der Begriff "Endostatin" gekürzte Proteine oder Peptide einschließt, in denen eine oder mehrere Aminosäuren aus einem oder beiden Enden des Endostatins oder aus einer internen Region des Proteins entfernt sind, wobei dennoch das resultierende Molekül die Endothelproliferation-inhibierende Aktivität beibehält. Der Begriff "Endostatin" schließt ebenfalls verlängerte Protein oder Peptide ein, in denen eine oder mehrere Aminosäuren zu einem oder beiden Enden des Endostatins oder zu einem internen Ort im Protein addiert sind, wobei dennoch das resultierende Molekül die Endothelproliferation-inhibierende Aktivität beibehält. Solche Moleküle, z. B. mit Tyrosin, das in der ersten Position addiert ist, sind nützlich zur Markierung wie z. B. Radioiodierung mit ¹²⁵Iod, zur Verwendung in Assays. Die Markierung mit anderen Radioisotopen kann nützlich in der Bereitstellung eines molekularen Werkzeugs zur Zerstörung der Zielzelle sein, die Endostatinrezeptoren enthält. Andere Markierungen mit Molekülen wie z. B. Ricin können einen Mechanismus zur Zerstörung von Zellen mit Endostatinrezeptoren bereitstellen.
"Substantielle Sequenzhomologie" bedeutet wenigstens ca. 70% Homologie zwischen der Aminosäurerestsequenz in der Endostatin-analogen Sequenz und derjenigen von Endostatin, bevorzugt wenigstens ca. 80% Homologie, besonders bevorzugt wenigstens ca. 90% Homologie.
Ebenfalls eingeschlossen in der Definition des Begriffs Endostatin sind Modifikationen des Endostatinproteins, seiner Untereinheiten und Peptidfragmente. Solche Modifikationen schließen Substitionen natürlich vorkommender Aminosäuren an spezifischen Orten mit anderen Molekülen ein, einschließlich aber nicht beschränkt auf natürlich und nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren. Solche Substitutionen können die Bioaktivität von Endostatin modifizieren und biologische oder pharmakologische Agonisten oder Antagonisten erzeugen. Der Begriff Endostatin schließt ebenfalls ein N-terminales Fragment von Endostatin ein, das aus der Sequenz der ersten 20 N-terminalen Aminosäuren besteht, das in SEQ ID NO: 1 und in Tabelle 1 gezeigt ist. Diese Sequenz der ersten 20 N-terminalen Aminosäuren entspricht einem C-terminalen Fragment des neu identifizierten Kollagens Typ XVIII.
Tabelle 1 zeigt die Entsprechung der 3-Buchtaben- und 1-Buchstaben-Aminosäurebezeichnungen.
Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Die N-terminale Aminosäuresequenz von Endostatin entspricht einem internen Peptidfragment mit 20 Aminosäuren, das im Maus-Kollagen alpha 1 Typ XVIII gefunden wird, beginnend bei Aminosäure 1105 und endend bei Aminosäure 1124. Die N-terminale Aminosäuresequenz des Inhibitors entspricht ebenfalls einem internen Peptidfragment mit 20 Aminosäuren, das in humanem Kollagen alpha 1 Typ XVIII gefunden wird, beginnend bei Aminosäure 1132 und endend bei Aminosäure 1151.
Endostatin kann aus murinem Hämangioendotheliom EOMA isoliert werden. Endostatin kann aus rekombinanten Quellen erzeugt werden, aus genetisch veränderten Zellen, die in Tiere implantiert wurden, aus Tumoren und aus Zellkulturen sowie aus anderen Quellen. Es wird erwartet, daß Endostatin in Zellen des Nervensystems hergestellt wird. Endostatin kann aus Körperflüssigkeiten isoliert werden, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf Serum, Urin und Aszites, oder durch chemische oder biologische Verfahren synthetisiert werden (z. B. Zellkultur, rekombinante Genexpression, Peptidsynthese und enzymatische Katalyse in vitro von Vorläufermolekülen, um aktives Endostatin zu ergeben). Rekombinante Techniken schließen die Gemamplifikation aus DNA-Quellen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Genamplifikation aus RNA-Quellen unter Verwendung von reverser Transkriptase/PCR ein.
Endostatin inhibiert spezifisch und reversibel die Endothelzellproliferation. Die Inhibitorproteinmoleküle der Erfindung sind nützlich als Wirkstoff zur Geburtenkontrolle und zur Behandlung von Angiogenesebezogenen Erkrankungen, insbesondere Angiogenese-abhängigen Krebstypen und Tumoren. Die Proteinmoleküle sind ebenfalls nützlich zur Heilung von Angiogenese-abhängigen Krebstypen und Tumoren. Die unerwartete und überraschende Fähigkeit dieser neuen Verbindungen zur Behandlung und Heilung von Angiogenese-abhängigen Krebstypen und Tumoren beantwortet einen lang bestehenden und unerfüllten Bedarf in der Medizin und liefert einen wichtigen Vorteil für die Menschheit.
Wichtige Begriffe, die hier verwendet werden, werden wie folgt definiert. "Krebs" bezeichnet Angiogenese-abhängige Krebstypen und Tumore, d. h. Tumore, die für ihr Wachstum (Expansion von Volumen und/oder Masse) eine Zunahme der Anzahl und Dichte der Blutgefäße erfordern, die sie mit Blut versorgen. "Regression" bezeichnet die Reduktion der Tumormasse und -größe.
Die Endothelproliferation-inhibierenden Proteine der vorliegenden Erfindung können durch automatisierte Methodiken zur Proteinsynthese hergestellt werden, die einem Fachmann allgemein bekannt sind. Alternativ können die Endothelproliferation-inhibierenden Proteine oder Endostatine der vorliegenden Erfindung aus größeren bekannten Proteinen isoliert werden, wie z. B. aus humanem Kollagen alpha 1 Typ XVIII und Maus-Kollagen alpha 1 Typ XVIII, Proteinen, die eine gemeinsame oder ähnliche N-terminale Aminosäuresequenz teilen. Beispiele für andere potentielle Endostatinquellen mit ähnlichen N-terminalen Aminosäuresequenzen schließen folgende ein: Bos taurus prägastrische Esterase, humanes Kollagen alpha 1 Typ 15, NAD-abhängige Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2), die aus Pseudomonas sp. stammt, s11459 Hexon-Protein vom bovinen Adenovirus Typ 3, CELF21D12 2 F21d12.3 Caenorhabditis elegans-Genprodukt, VAL1 TGMV AL1-Protein, das aus dem Tomato-golden-Mosaik-Virus stammt, s01730 Hexon-Protein, abgeleitet aus dem humanen Adenovirus 12, Saccharomyces cerevisiae. z. B. können eng mit Endostatin verwandte Peptide aus BOVMPE 1 prägastrischer Esterase (BOS TAURUS)-Gensequenz, entsprechend den Aminosäuren 502 bis 521, und Kollagen alpha 1 Typ 15 aus Menschen, beginnend bei Aminosäure 316 und endend bei 335, gewonnen werden.
Aus diesen und anderen Quellen, einschließlich manueller und automatisierter Proteinsynthese, gewonnene Proteine und Peptide können schnell und leicht auf eine Endothelproliferation-inhibierende Aktivität unter Verwendung eines biologischen Aktivitätstests untersucht werden, wie z. B. mit dem bovinen Kapillarendothelzell-Proliferationstest. Andere Bioassays auf inhibierende Aktivität schließen den Hühner-CAM-Assay, den Maus-Hornhaut-Test und die Wirkung der Verabreichung isolierter oder synthetisierter Proteine auf implantierte Tumoren ein. Der Hühner-CAM-Assay wird von O'Reilly et al. in "Angiogenic Regulation of Metastatic Growth", Cell, Bd. 79(2), 21. Oktober 1994, S. 315–328, beschrieben, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird. Kurz gesagt werden 3 Tage alte Hühnerembryos mit intakten Dottern vom Ei getrennt und in eine Petrischale gegeben. Nach 3 Tagen Inkubation wird eine Methylcellulose-Scheibe, die das zu untersuchende Protein enthält, auf die CAM individueller Embryos gelegt. Nach 48 Stunden Inkubation werden die Embryos und CAMs zur Bestimmung beobachtet, ob das Endothelwachstum inhibiert wurde. Der Maus-Hornhauttest beinhaltet das Implantieren eines wachstumsfaktorhaltigen Pellets neben einem anderen Pellet, das den vermuteten Endothelwachstumsinhibitor enthält, in die Hornhaut einer Maus und das Beobachten des Musters der Kapillaren, die in der Hornhaut ausgebildet werden.
Die Erfindung der Anmelder umfaßt ebenfalls Nukleinsäuresequenzen, die den Endothelproliferation-inhibierenden Proteinmolekülen der Erfindung entsprechen und diese codieren, und monoklonale und polyklonale Antikörper, die spezifisch an solche Proteinmoleküle binden. Die biologisch aktiven Proteinmoleküle, Nukleinsäuresequenzen, die den Proteinen entsprechen, und Antikörper, die spezifisch an die Proteine der vorliegenden Erfindung binden, sind nützlich zur Modulierung von Endothelprozessen in vivo und zur Diagnose und Behandlung von Endothelzell-bezogenen Erkrankungen, z. B. durch Gentherapie.
Nukleinsäuresequenzen, die Endostatin und Endostatinanaloga entsprechen und diese codieren, können auf der Basis des Wissens der Aminosäuresequenz und der fachlich anerkannten Entsprechung zwischen Codonen (Sequenzen von drei Nukleinsäurebasen) und Aminosäuren hergestellt werden. Wegen der Entartung des genetischen Codes, in dem die dritte Base in einem Codon variieren kann, obwohl sie dennoch für die gleiche Aminosäure codiert, sind viele unterschiedliche mögliche codierende Nukleinsäuresequenzen für jedes besondere Protein oder Peptidfragment ableitbar.
Nukleinsäuresequenzen werden unter Verwendung automatisierter, allgemein fachbekannter Systeme synthetisiert. Entweder die gesamte Sequenz kann synthetisiert werden, oder eine Reihe kleinerer Oligonukleotide wird hergestellt und anschließend miteinander ligiert, um die Sequenz voller Länger zu erhalten. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz und allgemein bekannter Techniken zur Klonierung genetischen Materials geschaffen werden, abgeleitet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls den Nachweis von Endostatin in Körperflüssigkeiten und Geweben für den Zweck der Diagnose oder Prognose von Angiogenese-vermittelten Erkrankungen wie Krebs ein. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls den Nachweis von Endostatin-Bindungsstellen und -Rezeptoren in Zellen und Geweben ein. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von angiogenen Erkrankungen und Prozessen ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Arthritis und Tumore, durch Stimulierung der Produktion von Endostatin und/oder durch Verabreichung von im wesentlichen gereinigtem Endostatin oder Endostatin-Agonisten oder -Antagonisten und/oder Endostatin-Antiseren oder gegen Endostatin-Antiseren gerichteten Antiseren an einen Patienten. Zusätzliche Behandlungsverfahren schließen die Verabreichung von Endostatin, Endostatinfragmenten, Endostatinantiseren oder Endostatinrezeptoragonisten und -antagonisten, die mit cytotoxischen Mitteln verbunden sind, ein. Es ist selbstverständlich, daß das Endostatin tierischen oder humanen Ursprungs sein kann. Endostatin kann ebenfalls synthetisch durch chemische Reaktion oder durch rekombinante Techniken in Verbindung mit Expressionssystemen erzeugt werden. Endostatin kann ebenfalls durch enzymatische Spaltung unterschiedlicher Moleküle, einschließlich Endostatin-Vorläufern, die Sequenzhomologie oder -identität mit Segmenten von Endostatin enthalten, erzeugt werden, um Peptide mit Antiangiogeneseaktivität zu erzeugen.
Die passive Antikörpertherapie unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch Endostatin binden, kann zur Modulierung von Endothel-abhängigen Prozessen eingesetzt werden, wie z. B. Reproduktion, Entwicklung und Wundheilung und Gewebereparatur. Zusätzlich können gegen die Fab-Regionen von Endostatin-Antikörpern gerichtete Antiseren verabreicht werden, um die Fähigkeit von endogenen Endostatin-Antiseren zur Bindung von Endostatin zu blockieren.
Für Endostatin und Endostatinanaloga spezifische Antikörper werden gemäß allgemein fachbekannten Techniken und Protokollen hergestellt. Die Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein. Die Antikörper werden in allgemein bekannten Immuntestformaten verwendet, wie z. B. kompetitiven und nicht-kompetitiven Immuntests, einschließlich ELISA, Sandwich-Immuntests und Radioimmuntests (RIAs), um die Gegenwart oder Abwesenheit der Endothelproliferationsinhibitoren der vorliegenden Erfindung in Körperflüssigkeiten zu bestimmen. Beispiele für Körperflüssigkeiten schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Blut, Serum, Peritonealerguß, Pleuralflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Uterusflüssigkeit, Speichel und Schleim.
Die Proteine, Nukleinsäuresequenzen und Antikörper der vorliegendem Erfindung sind nützlich zur Diagnose und Behandlung von Endothelzellbezogenen Erkrankungen und Störungen. Ein besonders wichtiger Endothelzellprozeß ist die Angiogenese, die Bildung von Blutgefäßen. Angiogenesebezogene Erkrankungen können unter Verwendung der Endothelzellproliferation-inhibierenden Proteine der vorliegenden Erfindung diagnostiziert und behandelt werden. Angiogenese-bezogene Erkrankungen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Angiogenese-abhängigen Krebs, der z. B. solide Tumore, blutbürtige Tumore wie Leukämie und Tumormetastasen einschließt; gutartige Tumore, z. B. Hämangiome, Akustikusneurome, Neurofibrome, Trachome und pyogene Granulome; rheumatoide Arthritis; Psoriasis; angiogene Augenerkrankungen, z. B. diabetische Retinopathie, Frühgeborenen-Retinopathie, Makuladegeneration, Hornhauttransplantabstoßung, neovaskuläres Glaukom, retrolenale Fibroplasie, Rubeose; Osler-Webber-Syndrom; Myokardangiogenese; Plaque-Neovaskularisation; Telangiektasie; Blutergelenke; Angiofibrom; und Wundgranulation. Die Endothelzellproliferation-inhibierenden Proteine der vorliegenden Erfindung sind nützlich in der Behandlung von Erkrankungen mit übermäßiger oder abnormaler Stimulation der Endothelzellen. Diese Erkrankungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Darmverwachsungen, Atherosklerose, Sklerodermie und hypertrophische Narben, d. h. Keloide. Sie sind ebenfalls nützlich in der Behandlung von Erkrankungen, die Angiogenese als eine pathologische Konsequenz besitzen, wie z. B. Katzenkratzkrankheit (Rochele minalia quintosa) und Geschwüre (Heliobacter pylori).
Die Endothelzellproliferation-inhibierenden Proteine können als Geburtenkontrollmittel durch Reduzierung oder Verhinderung der Uterusvaskularisation verwendet werden, die für die Embryoeinnistung erforderlich ist. Dadurch stellt die vorliegende Erfindung ein wirksames Geburtenkontrollverfahren bereit, wenn eine zur Verhinderung der Embryoeinnistung ausreichende Menge des inhibitorischen Proteins an eine Frau verabreicht wird. In einem Aspekt des Geburtenkontrollverfahrens wird eine zur Blockierung der Embryoeinnistung ausreichende Menge des inhibierenden Proteins verabreicht, bevor oder nachdem Verkehr und Befruchtung erfolgt sind, wodurch ein wirksames Verfahren der Geburtenkontrolle bereitgestellt wird, gegebenenfalls ein Verfahren "am Morgen danach". Obwohl wir nicht durch diese Aussage gebunden zu sein wünschen, wird angenommen, daß die Inhibierung der Vaskularisation der Gebärmutterschleimhaut mit der Ein nistung der Blastozyste wechselwirkt. Eine ähnliche Inhibierung der Vaskularisation der Eileiterschleimhaut wechselwirkt mit der Einnistung der Blastozyste, wodurch das Auftreten einer Eileiterschwangerschaft verhindert wird. Verabreichungsverfahren können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Pillen, Injektionen (intravenös, subkutan, intramuskulär), Suppositorien, Vaginalschwämme, Vaginaltampons und intrauterine Vorrichtungen. Es wird ebenfalls angenommen, daß die Endostatinverabreichung mit der normalen gesteigerten Vaskularisation der Plazenta Wechselwirken wird, und ebenfalls mit der Entwicklung von Gefäßen innerhalb einer erfolgreich eingenisteten Blastozyste und der Entwicklung von Embryo und Fötus.
Umgekehrt kann die Blockade von Endostatinrezeptoren mit Endostatinanaloga, die als Rezeptorantagonisten wirken, die Endothelbildung und Vaskularisation fördern. Solche Wirkungen können wünschenswert bei Situationen einer unangemessenen Vaskularisation der Gebärmutterschleimhaut und damit verbundener Unfruchtbarkeit sein, bei Wundheilung, Heilung von Schnitten und Einschnitten, Behandlung von Gefäßproblemen bei Diabetikern, speziell von retinalen und peripheren Gefäßen, Förderung der Vaskularisation in transplantiertem Gewebe, einschließlich Muskel und Haut, Förderung der Vaskularisation des Herzmuskels, speziell im Anschluß an Transplantation eines Herzen oder von Herzgewebe und nach Bypass-Chirurgie, Förderung der Vaskularisation von soliden und relativ gefäßlosen Tumoren zur gesteigerten Cytotoxinübertragung, und Steigerung des Blutflusses zum Nervensystem, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Großhirnrinde und das Rückenmark.
Ein überraschender Befund liegt darin, daß nicht neugefaltetes und nicht-lösliches rekombinantes Endostatin ebenfalls eine wirksame Antiangiogeneseverbindung ist, die als Depot mit andauernder Freisetzung bei Verabreichung an einen Patienten dient.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren der Verwendung von Endostatin und Endothelzellproliferation-inhibierenden Peptidfragmenten von Endostatin, Nukleinsäuresequenzen, die Endostatin und aktiven Peptidfragmenten davon entsprechen, und von Antikörpern, die spezifisch an Endostatin und seine Peptide binden, zum Diagnostizieren von Endothelzellbezogenen Erkrankungen und Störungen.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Identifizierung endostatinspezifischer Rezeptoren und die dadurch identifizierten und isolierten Rezeptormoleküle.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Quantifizierung von Endostatinrezeptoren bereit.
Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Auffinden eines neuen und wirksamen Verfahrens zur Behandlung und Heilung von Angiogenese-abhängigem Krebs bei Patienten. Es wurde unerwartet gefunden, daß die Co-Verabreichung von Endostatin und Angiostatin in einer Menge, die zur Inhibierung des Tumorwachstums und zur Verursachung einer anhaltenden Regression der Tumormasse auf mikroskopische Größe ausreichend ist, Angiogenese-abhängigen Krebs heilt. Entsprechend schließt die vorliegende Erfindung ebenfalls Formulierungen ein, die wirksam zur Behandlung oder Heilung von Angiogenese-abhängigen Krebstypen und Tumoren sind.
Ganz besonders hemmt rekombinantes Maus-Endostatin aus Insektenzellen oder E. coli wirksam die Angiogenese und das Wachstum von Metastasen und Primärtumoren. In einem neuen Verfahren der anhaltenden Freisetzung wurde aus E. coli stammendes rekombinantes Endostatin als eine nicht-neugefaltete Suspension in einer zur Hemmung der Angiogenese ausreichenden Menge verabreicht, wodurch das Tumorwachstum gehemmt wurde. Die Tumormasse wurde reduziert, wenn rekombinantes Endostatin in einer zur Verursachung von Regression des Tumors ausreichenden Menge verabreicht wurde. Primärtumore mit 1–2% des Körpergewichts bildeten sich um mehr als 150-fach zurück, so daß sie mikroskopische ruhende Läsionen wurden, wenn sie mit Endostatin behandelt wurden. Die immunohistochemische Analyse der ruhenden Tumore zeigte eine blockierte Angiogenese, begleitet von hoher Proliferation der Tumorzellen, die durch eine hohe Rate der Tumorzellapoptose ausgeglichen ist. Es gab keinen Hinweis auf Toxizität in irgendeiner der mit Endostatin behandelten Mäuse.
Es wird als Teil der vorliegenden Erfindung vorgesehen, daß Endostatin aus einer Körperflüssigkeit, wie z. B. Blut oder Urin von Patienten, isoliert werden kann oder das Endostatin durch rekombinante DNA-Methoden oder synthetische peptidchemische Verfahren, die den Durchschnittsfachleuten allgemein bekannt sind, erzeugt werden kann. Proteinreinigungsverfahren sind allgemein fachbekannt, und ein spezifisches Beispiel für ein Verfahren zur Reinigung von Endostatin und zum Test auf Inhibitoraktivität wird in den nachfolgenden Beispielen bereitgestellt. Die Isolierung von humanem endogenem Endostatin wird unter Verwendung ähnlicher Techniken erreicht.
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Erzeugung von Endostatin unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken beinhaltet die Schritte aus: (1) Identifizieren und Reinigen eines Endostatins wie oben erörtert und wie ausführlicher nachfolgend beschrieben, (2) Bestimmen der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Inhibitors, (3) synthetisches Erzeugen einer DNA-Oligonukleotidsonde, die der N-terminalen Aminosäuresequenz entspricht, (4) Erzeugen einer DNA-Genbank aus humaner oder anderer Säugetier-DNA, (5) Untersuchen der Genbank mit der DNA-Oligonukleotidsonde, (6) Auswählen von Klonen, die mit dem Oligonukleotid hybridisieren, (7) Isolieren des Inhibitorgens aus dem Klon, (8) Inserieren des Gens in einen geeigneten Vektor, wie z. B. einen Expressionsvektor, (9) Inserieren des genhaltigen Vektors in einen Mikroorganismus oder ein anderes Expressionssystem, das zur Expression des Inhibitorgens fähig ist, und (10) Isolieren des rekombinant erzeugten Inhibitors. Die obigen Techniken werden ausführlicher in Laborhandbüchern beschrieben, wie z. B. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage, von Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989.
Das Gen für Endostatin kann ebenfalls aus Zellen oder Gewebe (wie z. B. Tumorzellen) isoliert werden, die hohe Menge von Endostatin exprimieren, durch (1) Isolieren von Boten-RNA aus dem Gewebe, (2) unter Verwendung reverser Transkriptase zur Erzeugung der entsprechenden DNA-Sequenz und anschließend (3) unter Verwendung von PCR mit den geeigneten Primern zur Amplifizierung der DNA-Sequenz, die für die aktive Endostatin-Aminosäuresequenz codiert.
Noch ein anderes Verfahren zur Erzeugung von Endostatin oder biologisch aktiven Fragmenten davon ist durch die Peptidsynthese. Sobald ein biologisch aktives Fragment eines Endostatins unter Verwendung des nachfolgend ausführlicher beschriebenen Testsystems gefunden ist, kann es sequenziert werden, z. B. durch automatisierte Peptidsequenzierungsverfahren. Alternativ kann die DNA-Sequenz, sobald das Gen oder die DNA-Sequenz, die für Endostatin codiert, isoliert ist, z. B. durch die oben beschriebenen Verfahren, bestimmt werden, was wiederum Informationen bezüglich der Aminosäuresequenz liefert. So kann die verbleibende Aminosäuresequenz, falls das biologisch aktive Fragment durch spezifische Verfahren erzeugt wird, wie durch tryptische Verdauungen, oder falls das Fragment N-terminal sequenziert wird, aus der entsprechenden DNA-Sequenz bestimmt werden.
Sobald die Aminosäuresequenz des Peptids bekannt ist, z. B. die N-terminalen 20 Aminosäuren, kann das Fragment durch allgemein fachbekannte Techniken synthetisiert werden, wie exemplarisch angegeben durch "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", E. Atherton und R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford, England. In ähnlicher Weise können multiple Fragmente synthetisiert werden, die anschließend miteinander verbunden werden, um größere Fragmente zu bilden. Diese synthetischen Peptidfragmente können ebenfalls mit Aminosäuresubstitutionen an spezifischen Orten hergestellt werden, um auf agonistische und antagonistische Aktivität in vitro und in vivo zu untersuchen. Peptidfragmente, die eine Bindung mit hoher Affinität an Geweben besitzen, können zur Isolierung des Endostatinrezeptors an Affinitätssäulen verwendet werden. Die Isolierung und Reinigung des Endostatinrezeptors ist ein fundamentaler Schritt hin zur Aufklärung des Wirkungsmechanismus von Endostatin. Diese erleichtert die Entwicklung von Wirkstoffen zur Modulierung der Aktivität des Endostatinrezeptors, der letzte Schritt zur biologischen Aktivität. Die Isolierung des Rezeptors ermöglicht die Konstruktion von Nukleotidsonden zur Überwachung des Ortes und der Synthese des Rezeptors, wobei in-situ- und Lösungs-Hybridisierungtechnologie verwendet wird.
Endostatin ist wirksam in der Behandlung von Erkrankungen und Prozessen, die durch Angiogenese vermittelt werden oder diese beinhalten. Die vorliegende Erfindung schließt das Verfahren der Behandlung einer Angiogenese-vermittelten Erkrankung mit einer wirksamen Menge von Endostatin oder Endostatinagonisten und -antagonisten ein. Die Angiogenesevermittelten Erkrankungen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf solide Tumore; blutbürtige Tumore, wie z. B. Leukämie; Tumormetastase; gutartige Tumore, z. B. Hämangiome, Akustikusneurome, Neurofibrome, Trachome und pyogene Granulome; rheumatoide Arthritis; Psoriasis; angiogene Augenkrankheiten, z. B. diabetische Retinopathie, Frühgeborenen-Retinopathie, Makuladegeneration, Hornhauttransplantatabstoßung, neovaskuläres Glaukom, retrolentale Fibroplasie, Rubeose; Osler-Webber-Syndrom; Myokardangiogenese; Plaque-Neovaskularisation; Telangiektasie; Blutergelenke; Angiofibrom; und Wundgranulation. Endostatin ist nützlich in der Behandlung von Erkrankungen mit übermäßiger oder abnormaler Stimulation der Endothelzellen. Diese Erkrankungen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Darmverwachsungen, Atherosklerose, Sklerodermie und hypertrophe Narben, d. h. Keloide. Endostatin kann als Geburtenkontrollmittel durch Verhinderung der Vaskularisation verwendet werden, die für die Blastozysteneinnistung und zur Entwicklung der Plazenta, der Blastozyste, des Embryos und des Fötus erforderlich ist.
Die synthetischen Peptidfragmente des Endostatins besitzen eine Vielzahl von Verwendungen. Das Peptid, das an den Endostatinrezeptor mit hoher Spezifität und Kraft bindet, wird radiomarkiert und zur Visualisierung und Quantifizierung der Bindungsstellen unter Verwendung autoradiographischer und Membranbildungstechniken eingesetzt. Diese Anwendung liefert wichtige diagnostische und Forschungswerkzeuge. Das Wissen um die Bindungseigenschaften des Endostatinrezeptors erleichtert die Untersuchung der Transduktionsmechanismen, die mit dem Rezeptor verbunden sind.
Zusätzlich ermöglicht die Markierung dieser Peptide mit kurzlebigen Isotopen die Visualisierung der Rezeptorbindungsstellen in vivo unter Verwendung der Positronemissionstomographie oder anderer moderner radiographischer Techniken, um Tumore mit Endostatinbindungsstellen zu lokalisieren.
Die systematische Substitution von Aminosäuren innerhalb dieser synthetisierten Peptide liefert hochaffine Peptidagonisten und -antagonisten für den Endostatinrezeptor, die die Endostatinbindung an seinen Rezeptor steigern oder vermindern. Solche Agonisten werden verwendet, um das Wachstum von Mikrometastasen zu unterdrücken, wodurch die Ausbreitung von Krebs eingeschränkt wird. Antagonisten gegen Endostatin werden in Situationen der unangemessenen Vaskularisation angewendet, um die inhibitorischen Wirkungen von Angiostatin zu blockieren und gegebenenfalls Angiogenese zu fördern. Diese Behandlung kann therapeutische Wirkungen zur Förderung der Wundheilung bei Diabetikern haben.
Endostatinpeptide werden zur Entwicklung von Affinitätssäulen zur Isolierung des Endostatinrezeptors aus kultivierten Tumorzellen eingesetzt. Der Isolierung und Reinigung des Endostatinrezeptors schließt sich eine Aminosäuresequenzierung an. Als nächstes werden Nukleotidsonden zur Insertion in Vektoren zur Expression des Rezeptors entwickelt. Diese Techniken sind den Fachleuten allgemein bekannt. Die Transfektion des Endostatinrezeptors in Tumorzellen steigert die Reaktivität dieser Zellen für endogenes oder exogenes Endostatin und verringert dadurch die Geschwindigkeit des Metastasenwachstums.
Cytotoxische Mittel wie Ricin werden mit Endostatin und hochaffinen Endostatin-Peptidfragmenten verbunden, um dadurch ein Werkzeug zur Zerstörung von Zellen zu liefern, die Endostatin binden. Diese Zellen können an vielen Orten gefunden werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Mikrometastasen und Primärtumore. Peptide, die mit cytotoxischen Mitteln verbunden sind, werden in einer zur Maximierung der Übertragung an den gewünschten Ort geschaffenen Weise infundiert. z. B. werden Ricin-gebundene hochaffine Endostatinfragmente durch eine Kanüle in Gefäße, die den Zielort versorgen, oder direkt in das Ziel übertragen. Solche Mittel werden ebenfalls in einer gesteuerten Weise durch Osmosepumpen, die mit Infusionskanülen gekoppelt sind, übertragen. Eine Kombination aus Endostatinantagonisten kann mit Stimulatoren der Angiogenese co-appliziert werden, um die Vaskularisation des Gewebes zu erhöhen. Dieses Therapieschema liefert ein wirksames Mittel zur Zerstörung von metastasierendem Krebs.
Erfindungsgemäß kann Endostatin in Kombination mit anderen Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden. z. B. kann ein Tumor herkömmlich durch Chirurgie, Bestrahlung oder Chemotherapie in Kombination mit Endostatin behandelt werden, und anschließend kann Endostatin an den Patienten zur Ausdehnung des Ruhezustands von Mikrometastasen und zur Stabilisierung von etwaigem verbleibendem Primärtumor verabreicht werden.
Das Endostatin der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch für den Inhibitor sind. Die Antikörper können entweder polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Diese Antikörper, die spezifisch an das Endostatin binden, können in diagnostischen Verfahren und Kits verwendet werden, die den Durchschnittsfachleuten allgemein bekannt sind, um das Endostatin in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe nachzuweisen oder zu quantifizieren. Ergebnisse aus diesen Untersuchungen können zum Diagnostizieren oder Vorhersagen des Auftretens oder erneuten Auftretens von Krebs und anderen Angiogenese-vermittelten Erkrankungen verwendet werden.
Das Endostatin kann ebenfalls in einem diagnostischen Verfahren und Kit zum Nachweisen und Quantifizieren von Antikörpern verwendet werden, die Endostatin binden können. Diese Kits würden den Nachweis von Endostatin-Antikörpern im Kreislauf erlauben, was das Ausbreiten von Mikrometastasen in Gegenwart von Endostatin anzeigt, das durch Primärtumore in situ sezerniert wird. Patienten, die solche Anti-Endostatin-Antikörper im Kreislauf besitzen, können wahrscheinlicher Tumore und Krebstypen entwickeln und können wahrscheinlicher ein Wiederauftreten von Krebs nach Behandlungen oder Zeiträumen der Remission aufweisen. Die Fab-Fragmente dieser Anti-Endostatin-Antikörper können als Antigene zur Erzeugung von Anti-Endostatin-Fab-Fragment-Antiseren verwendet werden, die zur Neutrali sierung der Entfernung von Endostatin im Kreislauf durch Anti-Endostatin-Antikörper verwendet werden können.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Blockieren der Wirkung von überschüssigem endogenen Endostatin. Dies kann durch passives Immunisieren eines Menschen oder Tieres mit Antikörpern erfolgen, die spezifisch für das ungewünschte Endostatin in dem System sind. Diese Behandlung kann wichtig in der Behandlung abnormaler Ovulation, Menstruation und Plazentation und Vaskulogenese sein. Dies liefert ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Wirkungen der Endostatinentfernung auf metastasierende Prozesse. Das Fab-Fragment von Endostatin-Antikörpern enthält die Bindungsstelle für Endostatin. Dieses Fragment wird aus Endostatin-Antikörpern unter Verwendung von Techniken isoliert, die den Fachleuten bekannt sind. Die Fab-Fragmente von Endostatin-Antiseren werden als Antigene zum Hervorrufen der Erzeugung von Anti-Fab-Fragment-Serum verwendet. Die Infusion dieses Antiserums gegen die Fab-Fragmente von Endostatin verhindert die Bindung von Endostatin an Endostatin-Antikörper. Der therapeutische Nutzen wird durch Neutralisieren endogener Anti-Endostatin-Antikörper durch Blockierung der Bindung von Endostatin an die Fab-Fragmente von Anti-Endostatin erhalten. Der Nettoeffekt dieser Behandlung ist die Erleichterung der Fähigkeit von endogenem Endostatin im Kreislauf, Zielzellen zu erreichen, wodurch die Ausbreitung von Metastasen vermindert wird.
Es ist selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung alle Derivate des Endostatins einschließen soll, die eine Endothel-inhibitorische Aktivität besitzen. Die vorliegende Erfindung schließt das gesamte Endostatinprotein, Derivate des Endostatinproteins und biologisch aktive Fragmente des Endostatinproteins ein. Diese schließen Proteine mit Endostatinaktivität ein, die Aminosäuresubstitutionen aufweisen oder Zucker oder andere Moleküle an Aminosäure-funktionelle Gruppen angebracht aufweisen. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Gene ein, die für Endostatin und den Endostatinrezeptor codieren, und Proteine, die durch diese Gene exprimiert werden.
Die oben beschriebenen Proteine und Proteinfragemente mit der Endostatin-Aktivität können als isolierte und im wesentlichen gereinigte Proteine und Proteinfragmente in pharmazeutisch akzeptablen Formulierungen unter Verwendung von Formulierungsverfahren bereitgestellt werden, die den Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Diese Formulierungen können auf Standardwegen verabreicht werden. Allgemein können die Kombinationen auf dem topischen, transdermalen, intraperitonealen, intrakranialen, intrazerebroventrikulären, intrazerebralen, intravaginalen, intrauterinen, oralen, rektalen oder parenteralen (z. B. intravenösen, intraspinalen, subkutanen oder intramuskulären) Weg verabreicht werden. Zusätzlich kann das Endostatin in biologisch abbaubare Polymere eingearbeitet werden, was die anhaltende Freisetzung der Verbindung erlaubt, wobei die Polymere in der Nähe des Ortes implantiert werden, an dem die Wirkstoffübertragung gewünscht ist, z. B. an der Stelle eines Tumors, oder so implantiert werden, daß das Endostatin systemisch langsam freigesetzt wird. Osmotische Minipumpen können ebenfalls zur Bereitstellung einer kontrollierten Übertragung hoher Konzentrationen von Endostatin durch Kanülen an den interessierenden Ort verwendet werden, wie z. B. direkt in ein Metastasenwachstum oder in die vaskuläre Zufuhr zum Tumor. Die biologisch abbaubaren Polymere und ihre Verwendung werden z. B. ausführlich beschrieben in Brem et al., J. Neurosurg. 74: 441–446 (1991), das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird.
Die Dosierung des erfindungsgemäßen Endostatins wird vom Krankheitszustand oder behandelten Zustand und anderen klinischen Faktoren wie Gewicht und Zustand des Menschen oder Tieres und dem Weg der Verabreichung der Verbindung abhängen. Zur Behandlung von Menschen oder Tieren können zwischen ca. 0,5 mg/kg und 500 mg/kg des Endostatins verabreicht werden. Ein besonders bevorzugter Bereich ist 1 mg/kg bis 100 mg/kg, wobei der am meisten bevorzugte Bereich 2 mg/kg bis 50 mg/kg ist. Abhängigkeit von der Halbwertszeit des Endostatins im besonderen Tier oder Menschen kann das Endostatin zwischen mehrere Male pro Tag und einmal pro Woche verabreicht werden. Es ist selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung Anwendung für sowohl menschliche als auch veterinärmedizinische Verwendung hat. Die erfindungsgemäßen Verfahren sehen einzelne sowie multiple Verabreichungen vor, die entweder simultan oder über einen erweiterten Zeitraum gegeben werden.
Die Endostatinformulierungen schließen diejenigen ein, die zur oralen, rektalen, ophthalmischen (einschließlich intravitrealen oder intrakameralen), nasalen, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), intrauterinen, vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intraperitonealen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen, intrakranialen, intratrachealen und epiduralen) Verabreichung geeignet sind. Die Endostatinformulierungen können zweckmäßig in Einheitsarzneiformen angeboten werden und können durch herkömmliche pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Solche Techniken schließen den Schritt des Inverbindungbringens des aktiven Bestandteils und des (der) pharmazeutischen Träger(s) oder Exzipienten ein. Allgemein werden die Formulierungen durch gleichförmiges und inniges Inverbindungbringen des aktiven Bestandteils mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder beiden und anschließendes, falls erforderlich, Formen des Produkts hergestellt.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöst Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zum Blut des beabsichtigten Empfängers machen; sowie wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z. B. in versiegelten Ampullen und Phiolen, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, z. B. Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionslösungen können aus sterilen Pulvern, Granalien und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungsformulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Unterdosis, wie hier oben angegeben, oder einen geeigneten Bruchteil davon des verabreichten Bestandteils enthalten. Es sollte selbstverständlich sein, daß die Formulierungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den Bestandteilen, insbesondere zu den oben genannten, andere Mittel einschließen können, die in Bezug auf den betreffenden Typ der Formulierung herkömmlich auf diesem Gebiet sind.
Unterschiedliche Peptidfragmente des intakten Endostatinmoleküls können zur Verwendung in verschiedenen Anwendungen synthetisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden: als Antigene zur Entwicklung spezifischer Antiseren, als Agonisten und Antagonisten, die aktiv an Endostatin-Bindungsstellen sind, als Peptide zur Bindung an cytotoxische Mittel zur Ausrichtung des Abtötens von Zellen, die Endostatin binden. Die Aminosäuresequenzen, die diese Peptide umfassen, werden auf der Basis ihrer Position auf den äußeren Regionen des Moleküls ausgewählt und sind zur Bindung an Antiseren zugänglich. Die Amino- und Carboxyltermini des Endostatins sowie die mittlere Region des Moleküls werden separat unter den zu synthetisierenden Fragmenten dargestellt. Der Aminoterminus, der distal zur 20. Aminosäure ist, und die Carboxyltermini des Endostatins können Tyrosin- und Lysinreste enthalten oder dazu modifiziert werden und werden durch viele Techniken markiert. Ein Tyrosin oder Lysin wird zu Fragmenten addiert, die diese Reste nicht aufweisen, um das Markieren der reaktiven Amino- und Hydroxyl-Gruppen am Peptid zu erleichtern. Diese Peptidsequenzen werden mit bekannten Sequenzen unter Verwendung von Sequenzdatenbanken verglichen, um potentielle Sequenzhomologien zu bestimmen. Diese Information erleichtert die Eliminierung von Sequenzen, die einen hohen Grad von Sequenzhomologie mit anderen Molekülen aufweisen, wodurch das Potential für eine hohe Spezifität in der Entwicklung von Antiseren, Agonisten und Antagonisten gegen Endostatin gesteigert wird.
Peptide können in einer standardmäßigen mikrochemischen Einrichtung synthetisiert und die Reinheit mit HPLC und Massenspektrophotometrie überprüft werden. Verfahren der Peptidsynthese, HPLC-Reinigung und Massenspektrophotometrie sind den Fachleuten üblicherweise bekannt.
Peptide und Endostatin werden ebenfalls in rekombinatem E. coli wie oben beschrieben oder in Insekten- oder Hefe-Expressionssystemen erzeugt und durch Säulenchromatographie gereinigt.
Endostatin und von Endostatin abgeleitete Peptide können an andere Moleküle unter Verwendung von Standardverfahren gekuppelt werden. Der zur 20. Aminosäure distale Aminoterminus und der Carboxylterminus von Endostatin können beide Tyrosin- und Lysinreste enthalten und werden isotopisch und nicht-isotopisch durch viele Techniken markiert, z. B. unter Verwendung von herkömmlichen Techniken radiomarkiert (Tyrosinreste: Chloramin T, Iodogen, Lactoperoxidase; Lysinreste: Bolten-Hunter-Reagens). Diese Kupplungstechniken sind den Fachleuten allgemein bekannt. Die Kupplungstechnik wird auf der Basis der an den Aminosäuren verfügbaren funktionellen Gruppen ausgewählt, einschließlich aber nicht beschränkt auf Amino, Sulfhydral, Carboxyl, Amid, Phenol und Imidazol. Verschiedene Reagenzien, die zum Bewirken dieser Kupplungen verwendet werden, schließen u. a. Glutaraldehyd, diazotiertes Benzidin, Carbodiimid und p-Benzochinon ein.
Endostatinpeptide werden chemisch an Isotope, Enzyme, Trägerproteine, cytotoxische Mittel, fluoreszente Moleküle und andere Verbindungen für eine Vielzahl von Anwendungen gekuppelt. Die Wirksamkeit der Kupplungsreaktion wird unter Verwendung unterschiedlicher Techniken bestimmt, die angemessen für die spezifische Reaktion sind. z. B. wird die Radiomarkierung eines Endostatinpeptids oder -proteins mit ¹²⁵I unter Verwendung von Chloramin T und Na¹²⁵I mit hoher spezifischer Aktivität erreicht. Die Reaktion wird mit Natriummetabisulfit beendet, und die Mischung wird auf Einwegsäulen entsalzt. Das markierte Peptid wird aus der Säule eluiert und die Fraktionen aufgefangen. Teilmengen werden aus jeder Fraktion entfernt und die Radioaktivität in einem gamma-Zähler gemessen. Auf diese Weise wird das unreagierte Na¹²⁵I vom markierten Endostatinpeptid getrennt. Die Peptidfraktionen mit der höchsten spezifischen Radioaktivität werden für die anschließende Verwendung gelagert, wie zur Analyse der Fähigkeit zur Bindung an Endostatin-Antiseren.
Eine andere Anwendung der Peptidkonjugation ist zur Erzeugung polyklonaler Antiseren. Z. B. werden Endostatinpeptide, die Lysinreste enthalten, an gereinigtes Rinderserumalbumin unter Verwendung von Glutaraldehyd gebunden. Die Wirksamkeit der Reaktion wird durch Messung des Einbaus von radiomarkiertem Peptid bestimmt. Unreagierter Glutaraldehyd und Peptid werden durch Dialyse getrennt. Das Konjugat wird zur anschließenden Verwendung gelagert.
Antiserum gegen Endostatin kann erzeugt werden. Nach der Peptidsynthese und Reinigung werden sowohl monoklonale als auch polyklonale Antiseren unter Verwendung etablierter Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, gezüchtet. z. B. können polyklonale Antiseren in Kaninchen, Schafen, Ziegen oder anderen Tieren gezüchtet werden. Mit einem Trägermolekül, wie z. B. Rinderserumalbumin, oder Endostatin selbst konjugierte Endostatinpeptide werden mit einer Hilfsstoffmischung kombiniert, emulgiert und subkutan an mehrfachen Stellen auf dem Rücken, Hals, Flanken und manchmal in die Fußsohlen subkutan injiziert. Auffrischungsinjektionen werden in regelmäßigen Intervallen vorgenommen, wie z. B. alle 2 bis 4 Wochen. Blutproben werden durch Venenpunktion erhalten, z. B. unter Verwendung der randständigen Ohrenvene nach Streckung, ca. 7 bis 10 Tage nach jeder Injektion. Die Blutproben werden über Nacht bei 4°C gerinnen gelassen und mit ca. 2400 × g bei 4°C für ca. 30 Minuten zentrifugiert. Das Serum wird entfernt, geteilt und bei 4°C zur unmittelbaren Verwendung oder bei –20 bis –90°C zur anschließenden Analyse gelagert.
Alle Serumproben aus der Erzeugung polyklonaler Antiseren oder Medienproben aus der Erzeugung monoklonaler Antiseren werden zur Bestimmung des Titers analysiert. Der Titer wird durch verschiedene Mittel erhalten, z. B. unter Verwendung von Dot-Blots und Dichteanalyse, und ebenfalls durch Ausfällung von radiomarkierten Peptid-Antikörper-Komplexen unter Verwendung von Protein A, sekundären Antiseren, kaltem Ethanol oder Aktivkohle-Dextran gefolgt von Aktivitätsmessung mit einem gamma-Zähler. Die Antiseren mit dem höchstem Titer werden ebenfalls an Affinitätssäulen gereinigt, die handelsüblich sind. Endostatinpeptide werden an das Gel in der Affinitätssäule gekuppelt. Antiserumproben werden durch die Säule geleitet, und Anti-Endostatin-Antikörper bleiben an der Säule gebunden. Diese Antikörper werden anschließend eluiert, gesammelt und zur Bestimmung von Titer und Spezifität ausgewertet.
Die Endostatinantiseren mit dem höchsten Titer werden zum Erhalt der folgenden Information getestet: a) optimale Antiserumverdünnung für die höchste spezifische Bindung des Antigens und niedrigste nicht-spezifische Bindung, b) Fähigkeit zur Bindung zunehmender Mengen von Endostatinpeptid in einer Standardverdrängungskurve, c) potentielle Kreuzreaktivität mit verwandten Peptiden und Proteinen, einschließlich Endostatin-bezogener Typen, d) Fähigkeit zum Nachweis von Endostatinpeptiden in Extrakten von Plasma, Urin, Geweben und in Zellkulturmedien.
Kits zur Messung von Endostatin werden ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Antiseren, die den höchsten Titer und die höchste Spezifität besitzen und Endostatinpeptide in Extrakten von Plasma, Urin, Geweben und in Zellkulturmedien nachweisen können, werden ferner zum Erhalt leicht zu verwendender Kits zur schnellen, verläßlichen, empfindlichen und spezifischen Messung und Lokalisierung von Angiostatin untersucht. Diese Testkits schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die folgenden Techniken: kompetitive und nicht-kompetitive Tests, Radioimmuntest, Biolumineszenz- und Chemilumineszenz-Tests, fluorometrische Tests, Sandwich-Assays, immunoradiometrische Tests, Dot-Blots, enzymgekoppelte Tests einschließlich ELISA, Mikrotiterplatten, antikörperbeschichtete Streifen oder Tauchstreifen zur schnellen Überwachung von Urin oder Blut, und Immunocytochemie. Für jedes Kit werden der Bereich, die Empfindlichkeit, die Genauigkeit, die Verläßlichkeit, die Spezifität und die Reproduzierbarkeit des Tests erhalten. Die Variation innerhalb des Tests und zwischen den Tests wird bei den Punkten 20%, 50% und 80% auf den Standardkurven der Verdrängung oder Aktivität bestimmt.
Ein Beispiel für ein Testkit, das üblicherweise in der Forschung und in der Klinik verwendet wird, ist ein Radioimmuntest-(RIA)-Kit. Ein Endostatin-RIA wird nachfolgend erläutert. Nach erfolgreicher Radioiodierung und Reinigung von Endostatin oder eines Endostatinpeptids wird das Antiserum, das den höchsten Titer besitzt, in verschiedenen Verdünnungen in Röhrchen hinzugegeben, die eine relativ konstante Menge von Radioaktivität, wie z. B. 10 000 cpm, in einem geeigneten Puffersystem enthalten. Andere Röhrchen enthalten Puffer oder Präimmunserum zur Bestimmung der nichtspezifischen Bindung. Nach Inkubation bei 4°C für 24 Stunden wird Protein A hinzugegeben, und die Röhrchen werden verwirbelt, bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert und mit ca. 2000–2500 × g bei 4°C zur Ausfällung der Komplexe aus an markiertes Antigen gebundenem Antikörper zentrifugiert. Der Überstand wird durch Absaugen entfernt und die Radioaktivität in den Pellets in einem gamma-Zähler gezählt. Die Antiserumverdünnung, die ca. 10 bis 40% des markierten Peptids nach Subtraktion der nicht-spezifischen Bindung bindet, wird weiter charakterisiert.
Als nächstes wird eine Verdünnungsreihe (ca. 0,1 pg bis 1 ng) des zur Entwicklung des Antiserums verwendeten Endostatinpeptids durch Zugabe bekannter Mengen des Peptids in Röhrchen, die radiomarkiertes Peptid und Antiserum enthalten, ausgewertet. Nach einem zusätzlichen Inkubationszeitraum, z. B. 24 bis 48 Stunden, wird Protein A hinzugegeben, und die Röhrchen werden zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Radioaktivität im Pellet gezählt. Die Verdrängung der Bindung von radiomarkiertem Endostatinpeptid durch das unmarkierte Endostatinpeptid (Standard) liefert eine Standardkurve. Verschiedene Konzentrationen von anderen Endostatinpeptidfragmenten, Plasimogen, Endostatin aus unterschiedlichen Arten und homologen Peptiden werden zu den Teströhrchen hinzugegeben, um die Spezifität des Endostatinantiserums zu charakterisieren.
Extrakte aus verschiedenen Geweben, einschließlich aber nicht beschränkt auf Primär- und Sekundärtumore, Lewis-Lungenkarzinom, Kulturen von endostatinerzeugenden Zellen, Plazenta, Uterus und andere Gewebe wie Gehirn, Leber und Darm, werden unter Verwendung von Extraktionstechniken hergestellt, die erfolgreich zur Extraktion von Endostatin eingesetzt wurden. Nach Lyophilisierung oder Speed Vac der Gewebeextrakte wird Testpuffer hinzugegeben, und unterschiedliche Teilmengen werden in die RIA-Röhrchen gegeben. Extrakte aus bekannten endostatinerzeugenden Zellen erzeugen Verdrängungskurven, die parallel zur Standardkurve sind, wohingegen Extrakte von Geweben, die kein Endostatin erzeugen, das radiomarkierte Endostatin nicht aus dem Endostatin-Antiserum verdrängen. Zusätzlich werden Extrakte von Urin, Plasma und Zerebrospinalflüssigkeit aus Tieren mit Lewis-Lungenkarzinom zu den Teströhrchen in zunehmenden Mengen gegeben. Parallele Verdrängungskurven zeigen die Nutzbarkeit des Endostatintests zur Messung von Endostatin in Geweben und Körperflüssigkeiten an.
Gewebeextrakte, die Endostatin enthalten, werden zusätzlich charakterisiert, indem Teilmengen der Umkehrphasen-HPLC unterworfen werden.
Eluatfraktionen werden gesammelt, im Speed Vac getrocknet, in RIA-Puffer rekonstituiert und im Endostatin-RIA analysiert. Der maximale Betrag an Endostatinimmunreaktivität wird in den Fraktionen lokalisiert, die der Elutionsposition von Endostatin entspricht.
Das Testkit stellt Anleitungen, Antiserum, Endostatin oder Endostatinpeptid und gegebenenfalls radiomarkiertes Endostatin und/oder Reagenzien zur Ausfällung von gebundenen Endostatin-Endostatinantikörper-Komplexen bereit. Das Kit ist nützlich zur Messung von Endostatin in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeextrakten von Tieren und Menschen mit und ohne Tumoren.
Ein weiteres Kit wird zur Lokalisierung von Angiostatin in Geweben und Zellen verwendet. Dieses Endostatin-Immunihistochemie-Kit stellt Anleitungen, Endostatin-Antiserum und gegebenenfalls blockierendes Serum und sekundäres Antiserum bereit, das an ein fluoreszentes Molekül wie Fluoresceinisothiocyanat oder an ein anderes Reagens, das zur Visualisierung des primären Antiserums verwendet wird, gebunden ist. Immunohistochemietechniken sind den Fachleuten allgemein bekannt. Dieses Endostatin-Immunohistochemie-Kit erlaubt die Lokalisierung von Endostatin in Gewebeschnitten und kultivierten Zellen unter Verwendung von sowohl Licht- als auch Elektronenmikroskopie. Es wird für sowohl Forschungs- als auch klinische Zwecke verwendet. z. B. werden Tumore gesammelt oder eine Biopsie daran durchgeführt und Gewebeschnitte mit einem Mikrotom vorgenommen, um Orte der Endostatin-Produktion zu untersuchen. Solche Information ist nützlich für diagnostische und gegebenenfalls therapeutische Zwecke im Nachweis und in der Behandlung von Krebs.
Diese Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele erläutert, die keinesfalls als Auferlegung von Beschränkungen auf ihren Umfang aufgefaßt werden sollen. Im Gegenteil ist es klar zu verstehen, daß Auswege auf verschiedene andere Ausführungsbeispiele, Modifikationen und Äquivalente davon verfügbar sein können, die sich nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung den Fachleuten selbst nahelegen.
Beispiel 1
Identifizierung eines Inhibitors der kapillaren Endothelzellproliferation aus Hämangioendotheliomzellen
Eine murine Hämangioendotheliom-Zellinie, EOMA (Obeso et al., 1990), wurde auf Hinweise für die Produktion von Inhibitoren der Endothelzellproliferation untersucht. Viele der bekannten endogenen Inhibitoren der Angiogenese hemmen die Proliferation von Endothelzellen in vitro.
Sammlung konditionierter Medien: Zellen der murinen Hämangioendotheliom-Zellinie EOMA wurden in DMEM, das mit 10% Kälberserum (BCS) und 1% Glutamin-Penicillin-Streptomycin (GPS) ergänzt war, in einem Inkubator bei 37°C und 10% CO₂ gehalten. Konditionierte Medien aus EOMA-Zellen (d. h. zum Züchten von EOMA-Zellen verwendete Kulturmedien) wurden auf bovine Kapillarendothelzellen, die mit bFGF stimuliert wurden, in einem 72-stündigen Proliferationstest angewendet. Die konditionierten Medien hemmten reversibel die Proliferation von kapillaren Endothelzellen im Vergleich zu den Kontrollen. Das Muster der Inhibierung war übereinstimmend mit der Gegenwart von inhibitorischer und stimulierender Aktivität der Endothelzellproliferation (1).
Beispiel 2
Inhibitorische Aktivität der Endothelzellproliferation nicht aufgrund von Angiostatin
Zur Bestimmung, ob der Inhibitor der kapillaren Endothelzellproliferation, die durch die EOMA-Zellen erzeugt wurde, Angiostatin war, wurden gesammelte konditionierte Medien auf eine Lysinsäule angewendet (mit Sepharose^TM-Chromatographieperlen konjugiertes Lysin). Lysin-Sepharose bindet Angiostatin und wurde zuvor zu dessen Reinigung verwendet (O'Reilly et al., 1996). Die Endothelzell-inhibitorische Aktivität wurde nur in der Durchflußfraktion und nicht in der gebundenen Fraktion gefunden (Daten nicht gezeigt). Der Mangel an Bindung der inhibitorischen Aktivität an Lysin-Sepharose legt nahe, daß der neue Inhibitor der Endothelzellproliferation nicht Angiostatin war.
Beispiel 3
Reinigung eines 20 kDa-Proteins aus den konditionierten Medien von EOMA-Zellen, das spezifisch die Endothelzellproliferation inhibiert
Weil verschiedene Angiogenese-Inhibitoren eine Affinität für Heparin besitzen, wendeten wir den Durchfluß aus der Lysin-Sepharose-Säule auf eine Heparin-Sepharose-Säule an. Die inhibitorische Aktivität band Heparin mit relativ hoher Affinität und wurde mit 0,6–0,8 M NaCl in 10 mM Tris pH 7,4 wie in 2 gezeigt eluiert. Zur weiteren Reinigung der inhibitorischen Aktivität wurde die Probe aufkonzentriert und auf eine Gelfiltrationssäule (Bio-Rad Bio-Gel P-100 feines Gel oder Pharmacia Sephacryl S-200HR-Gel) angewendet (siehe 3), gefolgt von verschiedenen Durchläufen der Umkehrphasen-HPLC mit einer C4-Säule. Die inhibitorische Aktivität wurde aus der C4-Säule mit 40–45% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert, beispielhaft gezeigt durch 4. Nach der letzten C4-Säule war die inhibitorische Aktivität mit einem Protein mit einem Molekulargewicht von 20 kDa (reduziert) oder 18 kDa (nicht-reduziert) gemäß SDS-PAGE, gereinigt zur scheinbaren Homogenität, verbunden.
In bezug auf Beispiele 2 und 3 wurden Lysin-Sepharose, Heparin-Sepharose, Sephacryl S-200 HR-Gel (Pharmacia, Uppsala, Schweden), Bio-Gel P-100 feines Polyacrylamid-Gel (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) und eine SynChropak RP-4 (100 × 4,6 mm) C4-Umkehrphasensäule (Synchrom, Inc., Lafayette, IN) gemäß den Herstellerempfehlungen vorbereitet. Eine Heparin-Sepharose-Säule (50 × 2,5 cm) wurde mit 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 äquilibriert. Gesammelte konditionierte Medien wurden aufgetragen, und die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen. Die Säule wurde mit einem kontinuierlichen Gradienten von 50 mM-2 M NaCl in 10 mM Tris-HCl bei pH 7,4 (200 ml Gesamtvolumen) gefolgt von 100 ml 2 M NaCl in 10 mM Tris-HCl bei pH 7,4 eluiert. Fraktionen wurden gesammelt, und eine Teilmenge von jeder wurde auf die kapillaren Endothelzellen angewendet. Fraktionen, die deren Proliferation inhibierten, wurden gegen PBS dialysiert (MWCO = 6000– 8000) und unter Verwendung eines 4000 MWCO-Nanospin-Konzentrators (Gelman Sciences, Ann Arbor, Mi) auf konzentriert.
Eine Bio-Gel P-100-Säule oder eine Sephacryl S-200 HR-Säule (75 × 1,5 cm) wurde mit PBS äquilibriert. Die Probe aus der Heparin-Sepharose-Chromatographie wurde aufgetragen, und die Säule wurde mit dem Äqulibrierungspuffer eluiert. Fraktionen wurden gesammelt, und eine Teilmenge von jeder wurde auf die Endothelzellen angewendet. Fraktionen, die die Endothelproliferation inhibierten, wurden aufkonzentriert und wie oben dialysiert.
Eine SynChropak RPG-Säule (100 × 4,6 mm) wurde mit H₂O/0,1% Trifluoressigsäure (TFA) äquilibriert. Reagenzien von HPLC-Qualität (Pierce Rockford, IL) wurden verwendet. Die Probe aus der Gelfiltrationschromatographie wurde auf die Säule aufgetragen, und die Säule wurde mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,1% TFA mit 0,5 ml/Minute eluiert, und Fraktionen wurden gesammelt. Eine Teilmenge von jeder wurde durch Vakuumzentrifugieren eingedampft, in PBS resuspendiert und auf die kapillaren Endothelzellen angewendet. Die inhibitorische Aktivität wurde weiter zur scheinbaren Homogenität durch wenigstens zwei nachfolgende Durchläufe an der SynChropak C4-Säule gereinigt.
Zur weiteren Charakterisierung des 20 kDa-Inhibitors untersuchten wir ihn an verschiedenen Zellinien mit Endothel- und Nicht-Endothel-Ursprung. Für den BCE-Test wurden bovine kapillare Endothelzellen erhalten und wie zuvor beschrieben gezüchtet (Folkman et al., 1979). Für den Proliferationstest wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in einer 0,05%igen Lösung von Trypsin dispergiert. Eine Zellsuspension (25 000 Zellen/ml) wurde mit DMEM + 10% BCS + 1% GPS hergestellt, auf gelatinisierte Kulturplatten mit 24 Vertiefungen (0,5 ml/Vertiefung) ausplattiert und für 24 Stunden inkubiert (37°C, 10% CO₂). Die Medien wurden gegen 0,25 ml DMEM + 5% BCS + 1% GPS ausgetauscht und die Testprobe eingebracht. Nach 20 Minuten Inkubation wurden Medien und bFGF hinzugegeben, um ein Endvolumen von 0,5 ml DMEM + 5% BCS + 1% GPS + 1 ng/ml bFGF zu erhalten. Nach 72 Stunden wurden die Zellen in Trypsin dispergiert, in Hematall (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) resuspendiert und durch einen Coulter-Zähler gezählt.
Nicht-Endothelzell-Proliferationstests
Zellen aus bovinem glattem Aortamuskel (SMC), bovinem retinalem Pigmentepithel (RPE), Nerz-Lungenepithel (MLE), Lewis-Lungenkarzinom (LLC) und EOMA und 3T3-Fibroblasten wurden in einem Inkubator bei 10% CO₂ und 37°C gehalten. Für die Proliferationstests wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in einer 0,05%igen Lösung von Trypsin dispergiert. Optimale Bedingungen für die Zellproliferationstests wurden für jeden unterschiedlichen Zelltyp entwickelt. Fötales Kälberserum (FCS) wurde für die RPE-, MLE- und LLC-Zellen verwendet, und BCS wurde für die anderen Zelltypen verwendet. Eine Zellsuspension (20 000 Zellen/ml für SMC, RPE, MLE; 15 000 Zellen/ml für 3T3; 10 000 Zellen/ml für LLC, EOMA) wurde mit DMEM + 10% Rinderserum + 1% GPS hergestellt, auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen ausplattiert (0,5 ml/Vertiefung) und für 24 Stunden inkubiert (37°C, 10% CO₂). Die Medien wurden gegen 0,5 ml DMEM + 5% Rinderserum + 1% GPS ausgetauscht und die Testprobe aufgetragen. Nach 72 Stunden wurden die Zellen in Trypsin dispergiert, in Hematall (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) resuspendiert und mit einem Coulter-Zähler gezählt.
Nur die Endothelzellen wurden signifikant inhibiert, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Wirkung von Endostatin auf Endothel- und Nicht-Endothelzellproliferation
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Die Inhibierung wurde zuerst bei Dosen von 100 ng/ml beobachtet, wobei eine maximale Inhibierung bei Dosen von 600 ng/ml oder größer beobachtet wurde. Keine signifikante Inhibierung wurde für Zellen mit Nicht-Endothelursprung bei Dosen beobachtet, die eine Größenordnung größer als diejenige war, die zur Inhibierung der kapillaren Endothelzellproliferation verwendet wurde (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4
Mikrosequenzanalyse des 20 kDa-Proteins zeigt Identität mit einem Fragment von Kollagen XVIII
Der 20 kDa-Inhibitor der kapillaren Endothelzellproliferation aus den konditionieren Medien wurde zur Homogenität wie in den obigen Beispielen beschrieben gereinigt, durch SDS-Page aufgetrennt, auf PVDF elektrogeblottet (Bio-Rad, Richmond, CA), durch Ponceau-S-Anfärbung nachgewiesen und aus der Membran herausgeschnitten. Die N-terminale Sequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau an einem Proteinsequenzer PE/ABD Modell 470A (Foster City, CA), der mit Gasphasenübertragung von Trifluoressigsäure betrieben wurde, bestimmt.
Sequenzbibliotheksrecherchen und -angleichungen wurden gegen die kombinierten Datenbanken von GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT und PIR durchgeführt. Die Recherchen wurden am National Center for Biotechnology Information durch die Verwendung des BLAST-Netzwerkdienstes durchgeführt.
Die Mikrosequenzanalyse des Inhibitors zeigte eine Identität mit einem C-terminalen Fragment von Kollagen XVIII. Die molekulare Klonierung und Sequenz von Kollagen XVIII wurden zuerst von Olsen und seinen Mitarbeitern und von Rehn und Pihlajaniemi beschrieben (Oh et al., 1994; Rehn und Pihlajaniemi, 1994). Kollagen XVIII ist ein neues Kollagen, das aus einer N-terminalen Region mit 3 Spleiß-Varianten (Muragaki et al., 1995; Rehn und Pihlajaniemi, 1995), einer Reihe von kollagenartigen Domänen mit Unterbrechungen und einer 35 kDa C-terminalen nicht-kollagenen (NCl) Domäne besteht. Eine 18-Aminosäure-N-terminale Mikrosequenzanalyse des gereinigten Inhibitors der Endothelzellproliferation bestätigt, daß er identisch mit einem C-terminalen Fragment dieser NC1-Domäne ist (5). Wir haben dieses inhibitorische Fragment von Kollagen XVIII "Endostatin" genannt, und es ist in der Gruppe von Molekülen eingeschlossen, die Endostatinaktivität besitzen.
Beispiel 5
Rekombinantes Maus-Endostatin (Baculovirus oder E. coli) hemmt die Endothelzellproliferation in vitro und die Angiogenese in vivo
Der erfindungsgemäße Endothelzellproliferationsinhibitor kann rekombinant in jedem System exprimiert werden, das zur Expression von Proteinen verwendet wird. Nicht-beschränkende Beispiele solcher Expressionssysteme schließen bakterielle Expressionssysteme, Hefeexpressionssysteme und virale Insektenexpressionssysteme ein.
Rekombinantes Maus-Endostatin wurde unter Verwendung des BacPAK-Baculovirus-Expressionssystems (CLON-TECH Laboratories) unter Befolgen des Herstellerprotokolls exprimiert. Kurz gesagt wurde ein cDNA-Fragment, das die Signalsequenz und den C-terminalen Teil (Endostatinregion) von Maus-Kollagen XVIII codiert, in den pBacPAK8-Transfervektor inseriert. Virale BacPAK6-DNA (Expressionsvektor) und Plasmid-DNA des pBacPAK8-Endostatinklons (modifizierter Transfervektor) wurden dann in Sf21-Insektenzellen cotransfiziert, und Medien, die das exprimierte Maus-Endostatin enthielten, wurden gesammelt. Das BacPAK6 wurde zuerst mit BSU36-Enzym verdaut, um es inkompetent für die unabhängige Replikation zu machen. Die Medien, die exprimiertes Maus-Endostatin enthielten, wurden auf eine 1,5 × 40 cm Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und dann nacheinander mit 0,2 M NaCl, 0,4 M NaCl, 0,6 M NaCl und 1 M NaCl und 10 mM Tris, pH 7,4 eluiert. Die gesamte Chromatographie wurde bei 4°C durchgeführt. Das 0,6 M NaCl Elutionsmittel (das bovine kapillare Endothelzellen in einem 72-stündigen Proliferationstest inhibierte) wurde gegen PBS dialysiert (6-8000 MWCO) und dann erneut auf die Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 50 mM NaCl–1,2 M NaCl in 10 mM Tris pH 7,4 eluiert. Eine Teilmenge jeder Fraktion wurde auf bovine kapillare Endothelzellen wie oben angewendet, und Fraktionen, die die Proliferation hemmten, wurden gesammelt, gegen PBS dialysiert und unter Verwendung eines Zentrifugenkonzentrators Nanospin Plus (Gelman Sciences) aufkonzentriert (MWCO = 10 000). SDS-PAGE der aufkonzentrierten Probe zeigte eine diskrete Bande mit einem scheinbaren Mr von 20 kDa.
Expression und Reinigung von rekombinantem Maus-Endostatin aus E. coli
Der C-terminale teil der cDNA von Kollagen XVIII wurde zur Amplifizierung der cDNA von Maus-Endostatin verwendet, das in den pETKH1-Vektor (pET11D-Derivat) (Studier et al., 1990) kloniert wurde. Die Induktion führte zur Erzeugung eines Fusionsproteins, das die Aminosäuresequenz MARRASVGTD (SEQ ID NO: 2) (RRAS = Proteinkinase A-Erkennungssequenz) und 6 Histidinreste am N-Terminus gefolgt von der Sequenz von Maus-Endostatin trägt (pTB01#8). Das pTB#8-Plasmid wurde zu BL21: DE3 transformiert, und das Fusionsprotein wurde an Ni²⁺-NTA-Perlen wie beschrieben gereinigt (QiaExpressionist Handbook, Quiagen). Kurz gesagt wurde E. coli bis zu einem OD₆₀₀ von 0,8–0,9 gezüchtet, und die Expression des Fusionsproteins wurde dann für 3 Stunden mit 1 mM IPTG induziert. Die Bakterien wurden pelletiert und in 8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, das 10 mM Imidazol enthielt, resuspendiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde für 15 Minuten mit 20 000 g zentrifugiert und der Überstand mit den Ni²⁺-NTA-Perlen für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde in eine Säule überführt und mit 8 M Harnstoff, 0,1 M Na-Phosphat, 10 mM Tris-HCl pH 6,25, das 10 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Das Protein wurde mit dem gleichen Puffer, der 250 mM Imidazol enthielt, eluiert. Die Endostatin enthaltenden Fraktionen wurden umfassend gegen PBS dialysiert. Während der Dialyse fiel das Endostatin aus. Das ausgefallene Endostatin wurde in PBS resuspendiert, die Protein-Konzentration wurde auf 2–4 mg/ml eingestellt, und das Endostatin wurde bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Für die Mausuntersuchungen wurde Endostatin als Suspension in PBS übertragen. Für den Hühner-Chorioallantois-Membrantest wurde Endostatin weiter gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisert.
Rekombinantes Maus-Endostatin wurde sowohl in Baculovirus- als auch in in E. coli-Expressionssystemen erzeugt. Unter Verwendung sequenzieller Heparin-Sepharose-Chromatographie wurde rekombinantes Maus-Endostatin zur scheinbaren Homogenität aus Insektenzellmedien gereinigt. Ni²⁺-NTA-Agarose wurde zur Reinigung des aus E. coli stammenden Maus-Endostatins verwendet.
SDS-PAGE zeigte eine diskrete Bande von ca. 20 kDa oder ca. 22 kDa (reduziert), gereinigt zur scheinbaren Homogenität für aus Baculovirus bzw. E. coli stammende rekombinante Endostatine (Daten nicht gezeigt). Beide wurden gegen PBS vor der Verwendung dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Material aus dem E. coli-System ausgefällt und als Suspension für anschließende Untersuchungen in vivo übertragen. Rekombinantes Endostatin aus Baculovirus hemmte spezifisch die Proliferation von bovinen kapillaren Endothelzellen in einer dosisabhängigen Weise. Die Inhibierung wurde bei Dosen von 100 ng/ml beobachtet, wobei eine maximale Inhibierung bei Dosen von oberhalb 600 ng/ml beobachtet wurde. Keine signifikante Inhibierung der Proliferation von Zellen mit Nicht-Endothelursprung oder der EOMA-Zellen wurde beobachtet, wenn Endostatin mit Dosen von bis zu einer Größenordnung über diejenigen getestet wurde, die zur Inhibierung der Endothelzellproliferation verwendet wurde.
Das ausgefällte (nicht neugefaltete) Material war nicht in vitro testfähig wegen seiner Unlöslichkeit. Jedoch war ein kleiner Prozentsatz in PBS während der Dialyse löslich, und diese Fraktion wurde für die Endothelzelltests verwendet. Außerdem war es nach dem Neufalten löslich und hemmte die Endothelproliferation (Daten nicht gezeigt). Wenn dieses lösliche Material auf Endothelzellen angewendet wurde, wurde festgestellt, daß es bei Konzentrationen hemmend war, die vergleichbar mit sowohl nativem als auch aus Baculovirus stammendem Endostatin waren.
Zur Untersuchung auf die Fähigkeit des rekombinanten Maus-Endostatins zur Inhibierung von Angiogenese in vivo verwendeten wir den Hühner-Chorioallantois-Membran-(CAM)-Test (Folkman, 1985; Nguyen et al., 1994, die hier durch Verweis eingeführt werden). Kurz gesagt wurden drei Tage alte befruchtete weiße Leghorn-Eier (Spafas, Norwich, CT) aufgebrochen, und Embryos mit intaktem Eidotter wurden in 100 × 20 mm Petrischalen gegeben (Folkman, 1985). Nach 3 Tagen Inkubation (37°C und 3% CO₂) wurde eine Methylcellulose-Scheibe (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), die Endostatin enthielt, auf die CAM individueller Embryos aufgebracht. Die Scheiben wurden durch Trocknung von Endostatin in 10 μl 0,45%iger Methylcellulose (in H₂O) auf Teflonstäbchen hergestellt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden Embryos und CAMs mittels eines Stereomikroskops beobachtet.
Bei Dosen von 10–20 μg/10 μl Scheibe gab es eine wirksame Inhibierung der Angiogenese in vivo sowohl für die aus E. coli als auch aus Baculovirus stammenden Endostatine in allen untersuchten CAMs (n = 5/Gruppe). Das aus E. coli stammende Endostatinpräzipitat löste sich allmählich während 5 Tagen auf und erzeugte eine anhaltende antiangiogene Wirkung auf die implantierten CAMs. Im Gegensatz löste sich das lösliche, aus Baculovirus stammende Endostatin innerhalb von 24 Stunden auf und ergab eine maximale antiangiogene Wirkung innerhalb eines Zeitraums von 48 Stunden. Es gab keinen Hinweis auf Toxizität in irgendeinem der untersuchten Hühnerembryos.
Humanes Endostatin wurde rekombinant unter Verwendung ähnlicher Verfahren hergestellt.
Beispiel 6
Rekombinantes Maus-Endostatin hemmt das Wachstum von Metastasen
Weil das Tumorwachstum angiogeneseabhängig ist, behandelten wir Lewis-Lungenkarzinommetastasen systematisch mit rekombinantem Maus-Endostatin, das im Baculovirus-System exprimiert wurde. Tiere mit Lewis-Lungenkarzinomen von 600–1200 mm³ Tumor wurden getötet, und die über dem Tumor liegende Haut wurde mit Betadin und Ethanol gereinigt. In einem Abzug mit laminarem Fluß wurde Tumorgewebe unter aseptischen Bedingungen herausgeschnitten. Eine Suspension aus Tumorzellen in 0,9%iger normaler Kochsalzlösung wurde durch Leiten von lebensfähigem Tumorgewebe durch ein Sieb und eine Reihe sequenziell kleinerer Injektionsnadeln mit einem Durchmesser von 22 bis 30 gauge hergestellt. Die Endkonzentration wurde auf 1 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt, und die Suspension wurde auf Eis gestellt. Nach Säuberung der Stelle mit Ethanol wurden die subkutanen Rücken von Mäusen in der proximalen Mittellinie mit 1 × 10⁶ Zellen in 0,1 ml Kochsalzlösung injiziert.
Als die Tumore eine Größe von 1500 mm³ hatten, ca. 14 Tage nach der Implantation, wurde den Mäusen der Tumor chirurgisch entfernt. Der Einschnitt wurde mit einfachen unterbrochenen Nähten verschlossen. Ab dem Tag der Operation erhielten die Mäuse täglich intraperitoneale Injektionen von rekombinantem (Baculovirus) Maus-Endostatin oder Kochsalzlösung. Die Mäuse erhielten 0,3 mg/kg/Tag von Endostatin einmal täglich über eine subkutane Injektion. Als die Kontrollmäuse an der Metastasekrankheit erkrankten (d. h. nach 13 Tagen Behandlung), wurden alle Mäuse getötet und autopsiert. Lungen-Oberflächenmetastasen wurden mittels eines Stereomikroskops mit 4-facher Vergrößerung gezählt.
Das Wachstum von Lewis-Lungenkarzinommetastasen wurde beinahe vollständig durch die systemische Verabreichung von Endostatin mit einer Dosis von 0,3 mg/kg/Tag, das subkutan gegeben wurde, unterdrückt (7 ± 3 Metastasen/Maus, n = 4, p < 0,001). Im Gegensatz wuchsen die Lungenmetastasen in den mit Kochsalzlösung nach Entfernung eines Lewis-Lungenkarzinom-Primärtumors behandelten Mäuse schnell (77 ± 7 Metastasen/Maus). Das Lungengewicht, das die Tumorlast widerspiegelt, betrug 240 ± 25 mg in den mit Endostatin behandelten Mäusen gegenüber 760 ± 30 mg in den Kontrollmäusen (p < 0,001). Außerdem gab es keinen Gewichtsverlust oder einen Hinweis auf Toxizität in irgendeiner der mit Endostatin behandelten Mäuse.
Beispiel 7
Rekombinantes Maus-Endostatin hemmt das Wachstum von Primärtumoren
Die Ausbeute von Endostatin aus dem Baculovirussystem war niedriger als diejenige aus dem E. coli-System, d. h. 1–2 mg/l gegenüber 30–40 mg/l. Wir verwendeten deshalb aus E. coli stammendes Endostatin zur Untersuchung der Wirkung einer Endostatin-Therapie auf das Primärtumorwachstum. Wir erzeugten rekombinantes Maus-Endostatin aus E. coli in ausreichender Menge, um Lewis-Lungenkarzinom-Primärtumore zu behandeln. Das Endostatin wurde als Suspension des ausgefällten gereinigten Proteins an Mäuse verabreicht, die Lewis-Lungenkarzinome von wenigstens 100–200 mm³ trugen. Das Protein wurde durch herkömmliche Mittel gereinigt, aber wurde vor seiner Verabreichung an die Mäuse nicht neu gefaltet. Das injizierte Präzipitat wurden langsam während 24–48 Stunden resorbiert.
Wir sind uns keines früheren Falls der Verwendung eines injizierten Depots von nicht-neugefaltetem rekombinantem Protein als anhaltendes Freisetzungsverfahren in Tieren bewußt. Dennoch wurde Endostatin allmählich in vivo resorbiert und bewies eine antiangiogene Aktivität, die zu verlängerter Antitumor- und antiangiogener Aktivität führte. Daher legen diese Daten ein neues allgemeines Verfahren für die kontrollierte Freisetzung rekombinanter Proteine nahe. Auf der Basis dieser Überlegung haben wir nicht-neugefaltetes rekombinantes Angiostatin aus E. coli mit ähnlichem Erfolg übertragen.
Entsprechend ist ein Aspekt der Erfindung die Verabreichung von rekombinantem Endostatin oder Endostatinanaloga in einem nicht-neugefalteten Zustand, um ein anhaltendes Freisetzungsdepot von Endothelzellproliferation-inhibierendem Protein über einen Zeitraum von wenigstens 8 Stunden, wünschenswert wenigstens 12 Stunden, besonders wünschenswert wenigstens 24 oder wenigstens 48 Stunden bereitzustellen, abhängig vom Patienten und der zu behandelnden Erkrankung. Gegebenenfalls wird rekombinantes und nicht-neugefaltetes Angiostatin verabreicht, um in ähnlicher Weise ein anhaltendes Freisetzungsdepot von Protein bereitzustellen, das Angiostatinprotein über einen Zeitraum von wenigstens 8 Stunden, wünschenswert wenigstens 12 Stunden, besonders wünschenswert wenigstens 24 Stunden oder wenigstens 48 Stunden freisetzen kann, abhängig vom Patienten und der zu behandelnden Krankheit.
Mäusen wurden Lewis-Lungenkarzinome wie oben beschrieben implantiert. Die Tumore wurden mit einem Skalengreifzirkel gemessen, und Tumorvolumina wurden unter Verwendung der Formel Breite² × Länge × 0,52 bestimmt, und das Verhältnis von behandeltem zu Kontroll-Tumorvolumen (T/C) wurde für den letzten Zeitpunkt bestimmt. Nachdem das Tumorvolumen 100–200 mm³ betrug (0,5–1% des Körpergewichts), was innerhalb von 3 bis 7 Tagen auftrat, wurden die Mäuse statistisch in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe erhielt rekombinantes Maus-Endostatin (E. coli) als Suspension in PBS, subkutan injiziert an einer vom Tumor entfernten Stelle einmal täglich. Die andere Gruppe erhielt vergleichbare Injektionen von Träger allein. Die Experimente wurden beendet, und die Mäuse wurden getötet und autopsiert, als die Kontrollmäuse zu sterben begannen.
Das Wachstum der Lewis-Primärlungentumore wurde wirksam durch systemische Therapie mit Endostatin unterdrückt. Eine Zunahme der Dosis von Endostatin war mit einer verbesserten Wirkung verbunden (Daten nicht gezeigt). Bei einer Dosis von 10 mg/kg wurde das Tumorwachstum um 97% im Vergleich zu Kontrollmäusen, die allein mit Träger behandelt wurden, inhibiert. Bei einer einmal täglich gegebenen Dosis von 20 mg/kg in zwei separaten Experimenten gab es eine fast vollständige Regression von etablierten Primärtumoren (> 99% Inhibierung, p < 0,001). Diese überraschenden und unerwarteten Ergebnisse sind in 6 und 7 gezeigt.
8, 9, 10 und 11 zeigen die Wirksamkeit von rekombinantem Maus-Endostatin zur Hemmung des Tumorwachstums in einer Vielzahl unterschiedlicher Tumormodelle. Ebenfalls gezeigt wird die Wirksamkeit von aus Menschen stammendem Endostatin zur Hemmung des Tumorwachstums.
Die immunohistochemische Analyse (12) der verbleibenden kleinen Tumore zeigte eine wirksame Hemmung der Angiogenese in den mit Endostatin behandelten Tumoren. Ferner war der proliferative Index der Tumore in den mit Endostatin und mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen auf dem gleichen hohen Niveau in beiden Gruppen, während der Apoptoseindex nach der Endostatintherapie auf das 8-fache zunahm. Somit führt die Endostatintherapie zu einem ähnlichen Muster der Tumorruhe wie dasjenige, das wir zuvor für Angiostatin beschrieben haben (Holmgren et al., 1995; O'Reilly et al., 1996). Ferner gab es keinen Hinweis auf eine wirkstoffbezogene Toxizität in irgendeiner der behandelten Mäuse.
Nach Unterbrechung der Endostatintherapie kehrte ein Tumor an der primären Stelle innerhalb von 5 bis 14 Tagen zurück, wurde vaskularisiert und tötete schließlich die Maus (Daten nicht gezeigt). Vor allem haben wir gefunden, daß aus E. coli stammendes rekombinantes Maus-Endostatin mit einem C-terminalen Polyhistidinmarker, das in einer vergleichbaren Weise zu dem oben beschriebenen N-terminal markierten Produkt exprimiert, gereinigt und verabreicht wurde, nicht die Angiogenese im CAM-Test hemmte und keine Wirkung auf das Wachstum von Lewis-Lungenkarzinomen hatte (Daten nicht gezeigt). Diese Daten sprechen stark dafür, daß die Antitumor- und antiangiogene Aktivität von rekombinantem Endostatin auf der spezifischen Struktur von Endostatin und nicht auf einer Verunreinigung in der Probe beruht.
13 zeigt die Ergebnisse einer cyclischen Behandlung von Lewis-Lungenkarzinom mit aus E. coli stammendem rekombinantem Maus-Endostatin. Diese Ergebnisse zeigen deutlich eine reproduzierbare Endostatin-abhängige Regression der Tumormasse, gefolgt von Tumorwachstum nach Beendigung der Endostatinbehandlung.
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein murines Hämangioendotheliom einen neuen und spezifischen 20 kDa-Inhibitor der Endothelzellproliferation in vitro erzeugt, der auch ein wirksamer Inhibitor der Angiogenese und des Tumorwachstums in vivo ist. Die N-terminale Sequenz dieses Inhibitors, Endostatin, ist identisch mit einem C-terminalen Fragment von Kollagen XVIII. Systemische Verabreichung des rekombinanten Endostatins hemmt wirksam die Angiogenese, hält Metastasen auf einer mikroskopischen Größe und entwickelt Primärtumore zu weniger als 1 mm³ zurück, eine über 150-fache Reduktion. Solange Mäuse behandelt werden, gibt es kein erneutes Wachstum der Tumore, keinen Hinweis auf Wirkstoffresistenz und keine Toxizität. Es ist bemerkenswert, daß einige Fragmente der C-terminalen Domäne von Kollagen Typ XVIII, die länger als Endostatin sind, nicht die Endothelzellproliferation hemmen (Daten nicht gezeigt).
Endostatin wurde durch die gleiche Strategie gefunden, die zum Auffinden von Angiostatin eingesetzt wurde (O'Reilly et al., 1994), d. h. durch Isolierung aus einem Tumor. Obwohl es nicht eingängig ist, daß Tumore eine Quelle für Angiogeneseinhibitoren sein sollten, scheinen die hier angegebenen Ergebnisse diesen Ansatz zu bestätigen.
Dies führt zur Frage, warum Angiogeneseinhibitoren in Tumoren vorhanden sein sollten, die angingen sind. Eine Möglichkeit besteht darin, daß ein Inhibitor ein "Überbleibsel" nach der Abregulierung seiner Produktion durch eine Tumorzelle sein könnte, die die Umschaltung zum angiogenen Phänotyp erfährt. Dies scheint der Fall für Thrombospondin zu sein, das durch Li-Fraumeni-Zellen erzeugt wird, in denen das zweite Allel für p53 mutiert oder deletiert ist (Dameron et al., 1994).
Eine zweite Möglichkeit besteht darin, daß die proteolytische Aktivität, die das Tumorwachstum begleitet und die eine wichtige Komponente des kapillaren Blutgefäßwachstums ist, auch Angiogeneseinhibitoren im Kreislauf aus Vorläuferproteinen mobilisieren kann, die nicht selbst inhibitorisch sind. Angiostatin hemmt z. B. Angiogenese und Entothelzellproliferation, während Plasminogen dies nicht tut (O'Reilly et al., 1996; O'Reilly et al., 1994). Für Endostatin wird ein ähnliches Muster gefunden.
Die Histologie von Tumoren, die sich unter Endostatintherapie zurückentwickelten, zeigte eine perivaskuläre Manschettenbildung von Tumorzellen, die ein oder mehrere Mikrogefäße umgeben, in denen die Angiogenese blockiert war. Tumorzellen zeigten eine hohe, durch hohe Apoptose ausgeglichene Proliferation mit keinem Nettogewinn der Tumorgröße. Diese Daten stimmen überein mit einem Modell eines neuen Typs von Tumorruhe, das kürzlich vorgeschlagen wurde (Holmgren et al., 1995). Außerdem hemmte Endostatin die Proliferation von Endothelzellen in vitro, aber hatte keine Wirkung auf Lewis-Lugenkarzinomzellen oder andere Zelltypen, einschließlich glatte Muskelzellen, Epithel, Fibroblasten und die EOMA-Zellinie, aus der es gereinigt wurde.
Die Tatsache, daß ein spezifischer Inhibitor der Endothelzellproliferation einen Tumor zu einer mikroskopischen Größe zurückbilden kann und ihn in einem schlafenden Zustand halten kann, trotz der Tatsache, daß die Tumorzellen refraktär für den Inhibitor von Beginn an sind, zeigt, daß die Endothelpopulation eine kräftige wachstumsregulierende Kontrolle über die Tumorzellen ausüben kann.
Die Ergebnisse mit Endostatin stützen die Theorie (Folkman, 1996), daß es für therapeutische Zwecke ergiebig ist, sich einen Tumor als zwei unterschiedliche Zellpopulationen vorzustellen: eine Tumorzellpopulation und eine Endothelzellpopulation, von denen jede das Wachstum der anderen stimulieren kann. Das Wachstum jeder Zellpopulation kann optimal durch Mittel inhibiert werden, die selektiv oder spezifisch auf diesen Zelltyp gerichtet sind, d. h. cytotoxische Chemotherapie und antiangiogene Therapie. Außerdem kann eine kombinierte Behandlung beider Zellpopulationen besser sein als die Behandlung eines Zelltyps allein.
Um diese Theorie zu testen impften wir Mäuse mit Lewis-Lungenkarzinomen, und die erworbenen Tumore, die eine Größe von ca. 300 mm³ erreicht hatten, wurden mit einer Kombinationstherapie behandelt, die Angiostatin und Endostatin umfaßte, jeweils mit einer Dosis von 20 mg/kg/Tag für 25 Tage. Die Tumore bildeten sich auf mikroskopische Niveaus etwa am Tag 10 der Behandlung zurück. Ein völlig unerwarteter Befund war, daß die Tumore zurückgebildet und ruhend für ca. 3 Monate blieben, selbst nachdem die gesamte Behandlung beendet war, wie in 14 gezeigt wird. Experimente mit längerer Dauer zeigen, daß eine anfängliche Behandlung des Tumors mit einer Kombination aus Angiostatin und Endostatin einen sehr lang andauernden Ruhezustand verursacht, wobei der tatsächliche Zeitraum derzeit unbekannt ist.
Ein solcher langandauernder Ruhezustand wird von einem Fachmann als Heilung betrachtet. z. B. ist die NIH-Richtlinie für die Bestimmung, wann eine Behandlung wirksam als Krebsheilung ist, daß der Tumor ruhend (d. h. in der Größe nicht zunehmend) für 10-mal die normale Verdopplungszeit des Tumors bleibt. Die unter Verwendung einer Kombination aus Endostatin und Angiostatin erreichte Ruhezustandslänge überschreitet dieses Kriterium bei weitem.
Entsprechend ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung eine Zusammensetzung, die eine Kombination aus Angiostatin und Endostatin oder einem Endostatinanalog in einer Menge umfaßt, die ausreichend ist, um einen lang andauernden Ruhezustand oder eine Heilung von Angiogenese-abhängigen Krebstypen bei Verabreichung an Patienten mit Angiogenese-abhängigen Krebstypen zu verursachen. Die Verabreichung kann systemisch erfolgen, z. B. durch Injektion, wobei in diesem Fall die Dosierung vom Patienten und dem besonderen Krebs abhängt, die aber allgemein wenigstens 0,2 mg/kg/Tag, wünschenswert wenigstens 2,0 mg/kg/Tag, besonders wünschenswert wenigstens 20 mg/kg/Tag beträgt. Allgemein wird die Zusammensetzung täglich für wenigstens 10 Tage, wünschenswert wenigstens 20 Tage, besonders wünschenswert wenigstens 25 Tage verabreicht. Alternative systemische Verabreichungswege schließen oral ein, wenn die Zusammensetzung z. B. in überzogenen Mikroperlen formuliert wird, um das Protein vor inaktivierenden Verdauungsumgebungen zu schützen; transdermal; und über eine Pumpe.
Alternativ können unterschiedliche Dosierungen und Behandlungszeiträume verwendet werden, falls die Zusammensetzung lokal an eine Angiogenese-abhängige Stelle verabreicht wird, wie z. B. an einen Tumor. Eine solche Verabreichung kann z. B. eine chirurgische Implantation oder lokale Injektion in die oder in die Nähe der Stelle sein.
Beispiel 8
Isolierung des mutmaßlichen Rezeptors für Endostatin
Sowohl Endostatin als auch Angiostatin scheinen spezifische Inhibitoren der Endothelzellproliferation zu sein. Daher ist es wahrscheinlich, daß Endostatin an spezifische Strukturen bindet, die ausschließlich auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert werden. Wir sind uns keiner Existenz irgendwelcher anderer spezifischer Inhibitoren der Endothelzellproliferation bewußt.
Das Identifizieren und Isolieren von Proteinen, die spezifisch an Endostatin binden, wird durch allgemein fachbekannte Verfahren erreicht, z. B. durch Affinitätschromatographie und Expressionsklonierung.
Affinitätschromatographie. Bovine kapillare Endothelzellen (BCE) werden mit [³⁵S]-Methionin radiomarkiert, Vollzell- und Membranextrakte werden hergestellt und auf mit Endostatin vorbereitete Affinitätssäulen aufgetragen. Als Negativkontrolle werden Fibroblasten-Proteinextrakte in einer ähnlichen Weise isoliert. Gebundene Proteine werden aus der Säule unter Verwendung eines NaCl-Gradienten eluiert, und die unterschiedlichen Fraktionen werden unter Verwendung von standardmäßigem SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Dieses Verfahren liefert Proteine, die fest an die Endostatinsäule gebunden und nur in den aus Endothelzellen stammenden Fraktionen vorhanden sind. Der Vergleich der gelelektrophoretischen Muster der zwei Zelltypen zeigt exprimierte Proteine, die spezifisch für die BCE-Zellen sind. Proteinsequenzen werden anschließend bestimmt und (ein) entsprechende s) Gen e) kloniert. Eine cDNA-Bibliothek von bovinen kapillaren Endothelzellen wird hergestellt und mit einem degenerativen Oligonukleotid auf Basis der PCR-Technik durchmustert, um die cDNA(s) des (der) Endostatin-spezifischen Bindungsprotein(e/s) zu lokalisieren. Hybridisierung unter Verwendung degenerativer Oligonukleotide mit der entsprechenden cDNA wird ebenfalls zur Identifizierung von Genen der Endostatin-Bindungsproteine verwendet. Ein anderer Ansatz ist das Züchten von Antikörpern gegen die Peptidsequenzen mit den zuvor in der ausführlichen Beschreibung beschriebenen Verfahren und die Immundurchmusterung der gleichen Bibliothek.
Expressionsklonierung. Eine cDNA-Bibliothek von BCE-Zellen wird vorbereitet. Poly-A-mRNA wird aus BCE-Zellen isoliert, deren Proliferation zuvor durch Endostatin inhibiert wurde. Diese Zellen exprimieren ein Endostatin-Bindungsprotein. Die entsprechende cDNA-Bibliothek wird in Zellen transfiziert, die eine hohe Expression der verschiedenen cDNAs erlauben. Die Bindungsaktivität von Endostatin an Zellen, die das Rezeptorprotein auf der Oberfläche exprimieren, wird als positive Auswahl dieser Zellen verwendet. Zur Auswahl dieser Zellen wird gereinigtes Endostatin mit Biotin markiert und entsprechend unter Verwendung von entweder Streptavidin-gekuppelten magnetischen Perlen oder FACS-Sortierung nachgewiesen. Alternativ wird ein Antikörper gegen Endostatin zur Durchmusterung verwendet. Nach Selektion der positiven Zellen werden die entsprechenden Plasmide isoliert, amplifiziert und wieder in Zellen mit hoher Expression transfiziert. Nach mehreren Durchläufen der positiven Selektion werden Plasmide auf identische Inserte unter Verwendung von Endonukleaseverdauung und PCR analysiert. Unter Verwendung dieser Daten werden Komplementierungsgruppen gebildet, sequenziert und mit dem BLAST-Netzwerkprogramm analysiert. Zusätzlich zur Computeranalyse werden individuelle cDNAs in Zellen mit hoher Expression retransfiziert und auf Endostatin-Bindungsaffinität unter unterschiedlichen Bedingungen getestet (z. B. Konkurrenz mit nicht-markiertem Endostatin, Zeitverlauf der Bindung, Scatchard-Analyse, etc., in anderen Worten durch Verwendung "klassischer" Rezeptorcharakterisierungsverfahren, die den Fachleuten bekannt sind).
Beispiel 9
Bestimmung der minimalen Region des Maus-Endostatinproteins, die für dessen antiangiogene Aktivität verantwortlich ist
Unterschiedliche PCR-Primer werden konstruiert, die entsprechenden cDNAs werden in das E. coli-Expressionssystem kloniert und die unterschiedlichen Endostatinfragmente zur Homogenität gereinigt. Die cDNA voller Länge wird sowohl aus dem N- als auch dem C-Terminus geschnitten. Als eine erste Durchmusterung werden der kapillare Endothelproliferationstest und der Hühnerembryotest verwendet, um die im Vergleich mit dem Fragment voller Länge verbleibende Aktivität zu bestimmen.
Beispiel 10
Bestimmung des (der) mutmaßlichen Enzym e/s), das/die Endostatin aus Kollagen XVIII freisetzen kann/können
Kollagen XVIII gehört zur Familie der Kollagene vom nicht-fibrillären Typ und kann in drei unterschiedlichen Spleißungsvarianten gefunden werden, die für Proteine mit 1315, 1527 und 1774 Aminosäureresten codieren (Rehn, PNAS 91: 4234, 1994). Der Unterschied wird durch Veränderungen im N-terminalen Teil des Gens verursacht, und daher könnten alle drei Spleißungsvarianten potentiell die Quelle für Endostatin sein, das selbst ein Fragment der nicht-kollagenen Domäne 11 (NC11) ist. Die Funktion von Kollagen XVIII ist nicht bekannt, aber eine Rolle im perivaskulären Matrixaufbau und/oder in dieser Struktur wurde vorgeschlagen, weil seine "Message" im wesentlichen in hochvaskularisierten Organen exprimiert wird (Oh, et al., Genomics, 19: 494, 1994). Ein erster Hinweis zur Funktion von Kollagen XVIII stammte aus der Reinigung von Endostatin als wirksamer Inhibitor der Endothelzellproliferation.
Aus diesen vorläufigen Daten und aus unserer anfänglichen Beobachtung, daß Endostatin aus konditioniertem Medium eines Hämangioendothelioms (EOMA) gereinigt wurde, fragten wir uns, ob das (die) Enzym(e), das/die Endostatin aus Kollagen XVIII freisetzt/freisetzen, identifiziert werden könnte(n).
Die letzten 325 Aminosäurereste, die für die NC11-Domäne codieren, werden in E. coli und im Insektenzell-Baculovirus-System exprimiert, das gereinigte Protein wird als Substrat zur Identifizierung von Enzymen verwendet, die diese Region von Kollagen XVIII klonieren. Durch PCR wird ein cDNA-Fragment, das die NC11-Domäne codiert, in einen E. coli-Expressionsvektor (pET-Reihe) kloniert, der eine hohe Expression des Zielproteins nach Induktion mit IPTG erlaubt. Alternativ wird ein zur Insektenzellexpression geeigneter Vektor verwendet. Die Proteine werden mit dem HIS₆-Tag, das sich am C-Terminus befindet, zur Reinigung unter Verwendung von Ni²⁺-NTA-Perlen markiert. Ein Ni²⁺-NTA-alkalische Phosphatase-Konjugat kann den C-Terminus durch Western Blotting nachweisen. Ein anderes Konstrukt wird hergestellt, das nicht nur ein HIS6-Tag am C-Terminus hat, sondern auch das Hämagglutinin (HA-Tag) am N-Terminus codieren wird. Dieses wird durch Western Blotting mit einem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper detektiert. Der N- und C-Terminus des Proteins werden im Anschluß an Inkubation mit EOMA-Überstand und unterschiedlichen Metalloproteinase-Extrakten detektiert.
Das Spaltungsprodukt wird durch SDS-PAGE-Analyse oder Western-Blotting nachgewiesen, das Protein wird erneut unter Verwendung der Ni²⁺-NTA-Perlen gereinigt, mit Imidazol eluiert, gegen PBS dialysiert und auf Inhibitoraktivität in den verschiedenen Tests in vitro und in vivo untersucht (z. B. Endothelzellproliferations-, Hühnerembryo- und Maus-Hornhauttest). Falls das gereinigte Spaltungsprodukt eine inhibitorische Aktivität zeigt, wird die N-terminale Aminosäuresequenzierung durchgeführt und mit der ursprünglichen Ausgangssequenz von Endostatin verglichen, die aus dem EOMA-Überstand erhalten wird. Entsprechend kann das Spaltungsverfahren im Maßstab vergrößert werden, um ausreichend Protein zum Test in Mäusen mit Tumor zu reinigen und um diese Aktivität mit derjenigen der NC11-Domäne voller Länge zu vergleichen.
Literaturstellen
Die folgenden Literaturstellen werden hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt:
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Endostatinprotein, worin das Endostatinprotein ein Fragment einer C-terminalen nicht-kollagenen Region eines Kollagenproteins ist, und worin das Endostatinprotein ferner durch seine Fähigkeit zur Hemmung von Angiogenese gekennzeichnet ist.
Endostatinprotein gemäss Anspruch 1, worin das Kollagenprotein ein nicht-fibrilläres Kollagenprotein ist.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 und 2, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XVIII ist.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 und 2, worin das Kollagenprotein ein Protein von Kollagentyp XV ist.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die C-terminale, nicht-kollagene Region eine NC1-Domäne ist.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Endostatinprotein rekombinant erzeugt ist.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Endostatinprotein eine Aminosäuresequenz hat, die natürlich vorkommt.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Endostatinprotein menschlich ist.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Endostatinprotein Angiogenese in vivo hemmt.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Endostatinprotein Angiogenese in vitro hemmt.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Endostatinprotein eine wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz hat.
Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Endostatinprotein ein Molekulargewicht von ca. 18 kDa, bestimmt durch nicht-reduzierende Gelelektrophorese, oder ca. 20 kDa, bestimmt durch reduzierende Gelelektrophorese, hat.
Endostatinprotein gemäss Anspruch 12, worin das Endostatinprotein an eine Heparin-Affinitätssäule bindet und nicht an eine Lysin-Affinitätssäule bindet.
Zusammensetzung, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die das Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 codiert.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, worin das Kollagenprotein ein nicht-fibrilläres Kollagenprotein ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 und 15, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XVIII ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 und 15, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XV ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 17, worin die C-terminale nicht-kollagene Region eine NC1-Domäne ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 18, worin das Endostatinprotein eine Aminosäuresequenz hat, die natürlich vorkommt.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 19, worin die Nukleinsäuresequenz menschlich ist.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 20, worin das Endostatinprotein Angiogenese in vivo hemmt.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 20, worin das Endostatinprotein Angiogenese in vitro hemmt.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 22, worin das Endostatinprotein eine wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz hat.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 23, worin das Endostatinprotein ein Molekulargewicht von ca. 18 kDa, bestimmt durch nicht-reduzierende Gelelektrophorese, oder ca. 20 kDa, bestimmt durch reduzierende Gelelektrophorese, hat.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 24, worin das Endostatinprotein an eine Heparin-Affinitätssäule bindet und nicht an eine Lysin-Affinitätssäule bindet.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 25, die ferner einen Vektor umfasst, der die Nukleinsäuresequenz enthält, die das Endostatinprotein codiert, worin der Vektor das Endostatinprotein exprimieren kann, wenn er in einer Zelle vorliegt.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 26, worin der Vektor in der Zelle ist, und worin die Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus bakteriellen Zellen, Hefezellen und Insektenzellen besteht.
Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 26 und 27, worin die Zelle E. coli, Pichia pastoris oder Drosophila ist.
Isolierter Antikörper, worin der Antikörper selektiv das Endostatinprotein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 über ein Kollagenprotein bindet.
Isolierter Antikörper gemäss Anspruch 29, worin das Endostatinprotein ein Fragment eines nicht-fibrillären Kollagenproteins ist.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 und 30, worin das Endostatinprotein ein Fragment eines Proteins vom Kollagentyp XVIII ist.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 bis 31, worin das Endostatinprotein ein Fragment eines Proteins vom Kollagentyp XV ist.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 bis 32, worin der Antikörper selektiv das Endostatinprotein über ein Protein vom Kollagentyp XVIII bindet.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 bis 33, worin der Antikörper selektiv das Endostatinprotein über ein Protein vom Kollagentyp XV bindet.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 bis 34, worin die C-terminale nicht-kollagene Region eine NC1-Domäne ist.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 bis 35, worin das Endostatinprotein eine wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz hat.
Isolierter Antikörper gemäss einem der Ansprüche 29 bis 36, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Hybridom, das den monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 37 erzeugt.
Isolierter Antikörper, der die Bindung des Antikörpers gemäss Anspruch 29 hemmt.
Verfahren zur Expression eines Endostatinproteins, welches das Transfizieren eines Vektors in eine Zelle umfasst, worin der Vektor die Nukleinsäuresequenz gemäss Anspruch 14 umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 40, worin das Kollagenprotein ein nicht-fibrilläres Kollagenprotein ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 40 und 41, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XVIII ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 40 und 41, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XV ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 40 bis 43, worin die C-terminale nicht-kollagene Region eine NC1-Domäne ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 40 bis 44, worin das Endostatinprotein eine wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz hat.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 40 bis 45, worin das Endostatinprotein ein Molekulargewicht von ca. 18 kDa, bestimmt durch nicht-reduzierende Gelelektrophorese, oder ca. 20 kDa, bestimmt durch reduzierende Gelelektrophorese, hat.
Verfahren zum Nachweis des Endostatinproteins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in eine Probe, umfassend: (a) Vereinigen der Probe, von der vermutet wird, dass sie das Endostatinprotein enthält, mit einem Endostatinprotein-spezifischen bindenden Antikörper; und (b) Nachweisen der Gegenwart der Bindung zwischen dem Endostatinprotein und dem Antikörper, um dadurch das Endostatinprotein in der Probe nachzuweisen.
Verfahren gemäss Anspruch 47, worin das Kollagenprotein ein nicht-fibrilläres Kollagenprotein ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 47 und 48, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XVIII ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 47 und 48, worin das Kollagenprotein ein Protein vom Kollagentyp XV ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 47 bis 50, worin die C-terminale nicht-kollagene Region eine NC1-Domäne ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 47 bis 51, worin das Endostatinprotein eine wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz hat.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 47 bis 52, worin das Endostatinprotein ein Molekulargewicht von ca. 18 kDa, bestimmt durch nicht-reduzierende Gelelektrophorese, oder ca. 20 kDa, bestimmt durch reduzierende Gelelektrophorese, hat.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 47 bis 53, worin die Probe aus einer Körperflüssigkeit oder Gewebe eines Individuums entnommen wird, die/das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Blut, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Speichel, Sperma, vaginalen Sekreten oder Urin besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 54, worin das Individuum eine Angiogenese-bezogene Krankheit oder einen solchen Zustand hat.
Verwendung eines Endostatinproteins oder eines Fragments davon gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 oder einer Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 14 bis 28 oder eines Antikörpers gemäss einem der Ansprüche 29 bis 39 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Angiogenese-bezogenen Krankheit.
Verwendung gemäss Anspruch 56, worin die Angiogenese-bezogene Krankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Krebs, soliden Tumoren, blutbürtigen Tumoren, Leukämien, Tumormetastasen, gutartigen Tumoren, Hämangiomen, Akustikusgeschwulsten, Neurofibromen, Trachomen, pyogenen Granulomen, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, angiogenen Augenkrankheiten, diabetischer Retinopathie, Frühgeborenen-Retinopathie, Makuladegeneration, Hornhauttransplantatabstossung, neovaskulärem Glaukom, retrolentalen Fibroplasien, Rubeose, Osler-Webber-Syndrom, Myokardangiogenese, Plaque-Neovaskularisation, Telangiektasie, Blutergelenken, Angiofibrom, Wundgranulation, Darmverwachsungen, Atherosklerose, Sklerodermie, hypertrophischen Narben, Keloiden, Katzenkratzkrankheit und Geschwüren besteht.