DE19615710A1 - Verfahren zur Gewinnung und Anwendung eines biologisch aktiven Eiweisstoffes - Kollagenfragment HF-COLL-18/514cf - in partiell aufgereinigter und synthetischer Form aus Körperflüssigkeiten zur Beeinflussung des Zellwachstums und der Diagnose von Kollagenerkrankungen sowie der Osteoporose - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung und Anwendung eines biologisch aktiven Eiweisstoffes - Kollagenfragment HF-COLL-18/514cf - in partiell aufgereinigter und synthetischer Form aus Körperflüssigkeiten zur Beeinflussung des Zellwachstums und der Diagnose von Kollagenerkrankungen sowie der OsteoporoseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Eiweißstoffes in reiner oder
partiell aufgereinigter Form aus menschlichen Körperflüssigkeiten, der die Fähigkeit
besitzt, das Wachstum von Zellen zu beeinflussen. Dieser Stoff ist dadurch
gekennzeichnet, daß er insbesondere aus Hämofiltrat oder Hämodialysat, das aus
menschlichem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden kann. Der Stoff ist als
HF-COLL-18/514cf bezeichnet und kann zum Zwecke (1) der Analyse von Erkrankungen, (2) zur
medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikament benutzt werden.
Der Stoff HF-COLL-18/514cf wurde erstmals aus dem Hemofiltrat Nierenkranker nach
Ultrafiltration am Hemodialyseapparat gewonnen und wurde nach seiner molekularen
Masse und den 30 Aminosäuren des N-Terminus charakterisiert. Zur Darstellung des
HF-COLL-18/514cf wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; Offenlegungsschrift
DE 36 33 707 A1) verfeinert, welches zuvor für Gewinnung von Eiweißstoffen aus
Hemofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von
einem Molekulargewicht unter 20 Kilodalton, die bei veno-venöser oder arterio-venöser
Shuntverbindung abfiltriert werden, können die das HF-COLL-18/514cf enthaltende
Fraktionen überraschenderweise durch Massenspektrometrie erkannt werden. Es wurde
weiter festgestellt, daß bei speziellen weiteren Verfahren diese Substanz
erstaunlicherweise derart aufgereinigt werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher
Eiweißstoff identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Der Stoff ist
überraschenderweise eine Variante eines Fragmentes von einem Protein, wobei das Protein
bisher lediglich auf cDNA-Ebene bekannt ist (Oh et al., 1994, Genomics Vol. 19, S. 494).
Der Wert dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß dieser Stoff aus dem bisher als
wertlos betrachteten Hemofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich
verwertbare Substanz benutzt zu werden.
Damit wurde ein Molekül entdeckt, dessen Struktur bisher unbekannt war und dessen
Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist. Die therapeutische und wirtschaftliche
Verwendung wurde geprüft und das HF-COLL-18/514cf wurde überraschenderweise als
wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt.
Der genannte Stoff HF-COLL-18/514cf ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß er durch
chemische Synthese und durch gentechnologische Produktion gewonnen werden kann und
überraschenderweise für zahlreiche weitere Belange genutzt werden kann, u. a. für die
Analyse im menschlichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von
Erkrankungen des Binde- und Stützgewebes, insbesondere Osteoporose, des
Urogenitaltraktes sowie des Respirationstraktes, des cardiovasculären Systems und des
Nervenapparates.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Peptid, das HF-COLL-18/514cf, seine
Herstellung, dieses enthaltende Arzneimittel sowie dieses enthaltende Aufbereitungen und
seine Verwendung dafür.
Das Blutpeptid HF-COLL-18/514cf hat die aminoterminale Sequenz
Val-Ala-Arg-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala--Asp-Phe-Gln-
Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu . . .
sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere
amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte HF-COLL-18/514cf-Derivate und
Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein Molekulargewicht von
18.493(3) Dalton festgestellt werden.
Damit ist weiter Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Peptid, das
HF-COLL-18/514cf, bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als ein gut zugängliches
Arzneimittel mit biologisch und therapeutischer Aktivität eines natürlichen Analogons des
im Blut vorkommenden Stoffes verwandt werden kann.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines
Herstellungsverfahrens für dieses HF-COLL-18/514cf sowie die Anwendung des HF-
COLL-18/514cf als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diagnostische
Indikationen. Dazu kann das HF-COLL-18/514cf als hochreiner Stoff oder - wenn für die
bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten
Peptidgemisches verwandt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter verschiedene Verfahren zur Herstellung dieses
HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine
prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromatographisch
gereinigt wird, sowie ein weiteres Verfahren zur Herstellung der HF-COLL-18/514cf
bezogenen Moleküle bzw. seiner Derivate, indem man es aus menschlichem Blut über
Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert, und schließlich ein Verfahren zur
Herstellung des HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate, indem man diese
HF-COLL-18/514cf-Moleküle durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und
Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten
sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt.
Die Arzneimittelzubereitung enthält HF-COLL-18/514cf oder ein physiologisch
verträgliches Salz des HF-COLL-18/514cf. Die Form und Zusammensetzung des
Arzneimittels, welches das HF-COLL-18/514cf enthält, richtet sich nach der Art der
Verabreichung. Das humane HF-COLL-18/514cf kann parenteral, intranasal, oral und
mittels Inhalation verabreicht werden. Vorzugsweise wird HF-COLL-18/514cf zu einem
Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittelbar
vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe
enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder
Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper
erhöhen.
Die zu verabreichende Tagesdosis für HF-COLL-18/514cf hängt von der Indikation und
der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von
100 bis 1200 Einheiten (µg)/Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vorzugsweise bei 300-2400
Einheiten (µg)/Tag.
Das erfindungsgemäße Peptid HF-COLL-18/514cf ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich
besonders auch für die Langzeit-Therapie bei Osteoporose oder anderen Erkrankungen
des Stütz- und Bindegewebes eignet und bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion
auslöst.
Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei
Stoffwechselerkrankungen des Stütz- und Bindegewebes, der Atemwege, des
Herz-Kreislaufsystems und Urogenitalapparates sowie des Nervensystems einzusetzen, da es zur
Herstellung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann die geeignet
sind, Änderungen der Stoffwechsellage dieser Organe festzustellen oder zu beeinflussen.
Als Ausgangsmaterial wurde Hemofiltrat verwendet, das in großen Mengen bei der
Behandlung niereninsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer
Molekülgröße von etwa 20.000 Dalton enthält.
Das Hemofiltrat wurde mittels einer Hemofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter
Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton
(Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von
niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hemofiltration in einer stabilen
Stoffwechsellage befanden, und wurde unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansauern
und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. In vier Extraktionen mit
einer Kationenaustauschersäule (TSK SP 650(M), Merck, Darmstadt, DE) wurden 2860 l
Hämofiltrat verarbeitet. 93% der gepoolten Extrakte wurden auf dem obengenannten
Säulenmaterial nacheinander durch verschiedene Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten
eluiert. Die Rohfraktionen wurden anschließend gefriergetrocknet.
500 mg von 2200 mg der letzten Rohfraktion wurden mittels präparativer
RP-Chromatographie grob nach Hydrophobizität getrennt. Von einer PrepPak Cartridge mit
den Dimensionen 47×300 mm der Firma Waters wurden Fraktionen abgesammelt. Die
Fraktion 31, wurde für die weitere Aufreinigung benutzt.
UV-Absorption während der analytischen RP-Chromatographie der Fraktion 31, die aus
der Auftrennung in Abbildung 1 gewonnen wurde. In einem Gradienten auf einer
Vydac-Säule (10×250 mm Stahlmantel, Material: RP C18, 300 , 5 µm) konnte eine weitere
Auftrennung erzielt werden. Die Eluenten waren Wasser mit 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure
und Acetonitril mit 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure.
Mit einem Vestec BT II (Vestec, Houston, Texas, USA) wurden Massenspektren von dem
nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf aus der Präparation im Schritt III mit
alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäüre als Matrix gemessen. Es zeigen sich Peaks von dem einfach,
zweifach und dreifach protoniertem Molekül. Eine molekulare Masse von 18,5 Kilodalton
bestimmt. Verschiedene Nebenbestandteile sind noch sichtbar. In den Fraktionen 45 und
46 wurde eine molekulare Masse von 18,5 Kilodalton entdeckt.
In einer abschließenden analytischen RP-Chromatographie von den gepoolten Fraktionen
45 und 46, die aus der Auftrennung in Schritt III gewonnen wurden, konnte in der
Fraktion 25 hochaufgereinigtes HF-COLL-18/514cf isoliert werden.
5 µl der Fraktion 25 wurden direkt zur Messung in der Kapillar-Zonen-Elektrophorese
verwendet. Das Elektropherogramm zeigt lediglich einen Peak und keine weiteren Peaks
von Nebenbestandteilen. Dieses Ergebnis zeigt, daß in der Endreinigungsstufe ein
hochreines HF-COLL-18/514cf vorlag.
Gerät: P/ACE System 2000, Beckman Instruments GmbH, München, DE
Kapillare: Uncoated Fused Silica, 500 mm ξ 75 µm ID
Puffer: 100 mM Natriumphosphat pH 2,5
0,02% Hydroxypropylmethylcellulose
Temperatur: 25 °C
Injektion: 20 sec entspricht 120 nl
Laufzeit: 25 Minuten
Strom: 80 mA, konstant
Absorption: 200 nm.
Kapillare: Uncoated Fused Silica, 500 mm ξ 75 µm ID
Puffer: 100 mM Natriumphosphat pH 2,5
0,02% Hydroxypropylmethylcellulose
Temperatur: 25 °C
Injektion: 20 sec entspricht 120 nl
Laufzeit: 25 Minuten
Strom: 80 mA, konstant
Absorption: 200 nm.
Mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie auf einem Vestec BT II des nativen,
gereinigten HF-COLL-18/514cf aus Fraktion 25 im Schritt V konnten auf zwei Matrices
(alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und 2,5-Dihydroxybenzoesäure) Spektren erhalten
werden. Es zeigen sich Peaks von dem einfach, zweifach und dreifach protoniertem
Molekül. Die molekulare Masse wird mit 18507(20) Dalton bestimmt. Nebenbestandteile
sind nicht sichtbar.
Für eine genauere Bestimmung der molekularen Masse des nativen, gereinigten
HF-COLL-18/514cf wurde aus Fraktion 25 des Schrittes V zusätzlich ein Massenspektrum
mit einem Elektrospray-Massenspektrometer (Sciex API III, Perkin-Elmer, Langen, DE)
gemessen. Es zeigen sich Peaks von dem acht- bis elffach protoniertem Molekül. Die
molekulare Masse von HF-COLL-18/514cf wird hier mit 18493(3) Dalton bestimmt.
Claims (14)
1. HF-COLL-18/514cf mit der aminoterminalen Sequenz
Val-Ala-Arg-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala--Asp-Phe-Gln-
Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu . . . sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere
amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte HF-COLL-18/514cf-Derivate.
Weiterhin natürliche und künstliche Fragmente mit biologischer Wirkung, die aus der
Aminosäurensequenz abgeleitet werden.
2. Verfahren zur Herstellung des HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate und seiner
Fragmente nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine
prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromatographisch
gereinigt wird.
3. Verfahren zur Herstellung des HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate und seiner
Fragmente nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man es aus menschlichem Blut
über übliche Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert.
4. Verfahren zur Herstellung des HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate und seiner
Fragmente nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man das HF-COLL-18/514cf
oder seine Derivate durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und
Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten
sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt.
5. Arzneimittel, enthaltend das humane, zirkulierende HF-COLL-18/514cf oder seiner
Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1 oder hergestellt nach Ansprüchen 2 bis 4,
das HF-COLL-18/514cf als aktiven Wirkstoff neben üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen.
6. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen
des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Stütz- und
Bindegewebes.
7. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen
des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung der Atemwege und des
Urogenitalapparates.
8. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen
des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf- und
Nervensystems.
9. Verwendung dem Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen
des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intugementes und der
Sinnesorgane.
10. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von
Systemerkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von HF-COLL-18/514cf
insbesondere bei z. B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur
Verwendung von HF-COLL-18/514cf zur Substitutionstherapie.
11. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von chronischen
Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit Erkrankungen gemäß Ansprüchen 6 bis 10,
indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei
Erkrankungen auf den Knochenumbau (Osteoporose) oder am Zahnapparat benutzt wird.
12. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von akuten
Erkrankungen, gemaß Ansprüchen 6 bis 12, indem es in geeigneter Form für die
Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.
13. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Diagnose von Erkrankungen,
insbesondere nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 12, indem spezifische Antikörper
gegen synthetische Teilstücke oder das gesamte Peptid oder seiner Derivate und seiner
Fragmente hergestellt werden und die Blutkonzentration HF-COLL-18/514cf über
Immuntests gemessen wird.
14. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 in verschiedenen galenischen
Applikationsformen, insbesondere der lyophilisierten, mit Mannit aufgenommenen Form in
sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder
Infusionslösungen zur wiederholten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen
von 30 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines HF-COLL-18/514cf pro Therapie-Einheit.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19615710A DE19615710A1 (de) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | Verfahren zur Gewinnung und Anwendung eines biologisch aktiven Eiweisstoffes - Kollagenfragment HF-COLL-18/514cf - in partiell aufgereinigter und synthetischer Form aus Körperflüssigkeiten zur Beeinflussung des Zellwachstums und der Diagnose von Kollagenerkrankungen sowie der Osteoporose |
| EP97921682A EP0896584A2 (de) | 1996-04-22 | 1997-04-22 | BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGEN |
| AU27665/97A AU2766597A (en) | 1996-04-22 | 1997-04-22 | Biologically active protein (collagen fragment hf-coll-18/514cf) for inhibiting the growth of tumours and capillary profilerations |
| JP09537737A JP2000511511A (ja) | 1996-04-22 | 1997-04-22 | 腫瘍成長阻害及び毛細管増殖のための生物学的活性タンパク質、コラーゲンフラグメントＨＦ―ＣＯＬＬ―１８／５１４ｃｆ |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19615710A DE19615710A1 (de) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | Verfahren zur Gewinnung und Anwendung eines biologisch aktiven Eiweisstoffes - Kollagenfragment HF-COLL-18/514cf - in partiell aufgereinigter und synthetischer Form aus Körperflüssigkeiten zur Beeinflussung des Zellwachstums und der Diagnose von Kollagenerkrankungen sowie der Osteoporose |
Publications (1)
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| DE19615710A1 true DE19615710A1 (de) | 1997-10-23 |
Family
ID=7791888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19615710A Withdrawn DE19615710A1 (de) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | Verfahren zur Gewinnung und Anwendung eines biologisch aktiven Eiweisstoffes - Kollagenfragment HF-COLL-18/514cf - in partiell aufgereinigter und synthetischer Form aus Körperflüssigkeiten zur Beeinflussung des Zellwachstums und der Diagnose von Kollagenerkrankungen sowie der Osteoporose |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999048924A1 (en) * | 1998-03-24 | 1999-09-30 | The Children's Medical Center Corporation | Endostatin derived peptides with anti-angiogenic and anti-cancer activity |
| WO2002068457A2 (en) * | 2001-02-27 | 2002-09-06 | Universita' Degli Studi Di Milano | Antiangiogenic peptides derived from endostatin |
| GB2378134A (en) * | 2001-06-13 | 2003-02-05 | Mars Uk Ltd | Glutamine containing health food |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2000017240A1 (de) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Haemopep Pharma Gmbh | Hmw-endostatin zur hemmung des wachstums von tumoren und von gefässwucherungen und zur diagnose von gefäss- und tumorerkrankungen |
| WO2004050125A1 (ja) * | 2002-12-03 | 2004-06-17 | Koken Co.,Ltd. | 腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤の抑制剤 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3633797C2 (de) * | 1986-10-03 | 1995-08-10 | Forssmann Wolf Georg | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten) |
| WO1993016716A1 (en) * | 1992-02-24 | 1993-09-02 | Northwestern University | Method and composition for inhibiting angiogenesis |
| ATE248912T1 (de) * | 1995-10-23 | 2003-09-15 | Childrens Medical Center | Therapeutische antiangiogenische zusammensetzungen und verfahren |
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1996
- 1996-04-22 DE DE19615710A patent/DE19615710A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-04-22 WO PCT/EP1997/002012 patent/WO1997040073A2/de not_active Application Discontinuation
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- 1997-04-22 EP EP97921682A patent/EP0896584A2/de not_active Withdrawn
- 1997-04-22 AU AU27665/97A patent/AU2766597A/en not_active Abandoned
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|---|---|---|---|---|
| WO1999048924A1 (en) * | 1998-03-24 | 1999-09-30 | The Children's Medical Center Corporation | Endostatin derived peptides with anti-angiogenic and anti-cancer activity |
| WO2002068457A2 (en) * | 2001-02-27 | 2002-09-06 | Universita' Degli Studi Di Milano | Antiangiogenic peptides derived from endostatin |
| WO2002068457A3 (en) * | 2001-02-27 | 2002-11-14 | Univ Degli Studi Milano | Antiangiogenic peptides derived from endostatin |
| GB2378134A (en) * | 2001-06-13 | 2003-02-05 | Mars Uk Ltd | Glutamine containing health food |
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| Publication number | Publication date |
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| AU2766597A (en) | 1997-11-12 |
| JP2000511511A (ja) | 2000-09-05 |
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| WO1997040073A3 (de) | 1997-12-24 |
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|---|---|---|---|
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: BIOVISION AG, 30625 HANNOVER, DE |
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Free format text: SCHRADER, MICHAEL, DR.RER.NAT., 30625 HANNOVER, DE FORSSMANN, WOLF-GEORG, PROF. DR.MED., 30625 HANNOVER, DE RAIDA, MANFRED, DR.PHIL.NAT., 30625 HANNOVER, DE SCHULZ-KNAPPE, PETER, DR.MED., 30625 HANNOVER, DE STAENDKER, LUDGER, 30625 HANNOVER, DE |
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