ES2203073T3 - Dosificado para cepas especificas de conformaciones de una proteina relacionadas con varias enfermedades. - Google Patents
Dosificado para cepas especificas de conformaciones de una proteina relacionadas con varias enfermedades.Info
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Abstract
Un método de determinación de la cantidad de una forma sensible al tratamiento de una conformación ligada a la enfermedad de una proteína en una unidad de muestra, consistente en: determinar la cantidad total de la conformación ligada a la enfermedad de una proteína en una cantidad unitaria de una muestra; someter la muestra a un tratamiento en condiciones suficientes para hidrolizar substancialmente toda la proteína de la muestra, excepto la proteína ligada a la enfermedad insensible al tratamiento; determinar la cantidad de proteína ligada a la enfermedad insensible al tratamiento en una cantidad unitaria de muestra sometida al tratamiento, y restar la cantidad de proteína insensible al tratamiento de la cantidad total de proteína ligada a la enfermedad para obtener la cantidad de proteína ligada a la enfermedad sensible al tratamiento en la muestra.
Description
Dosificado para cepas específicas de
conformaciones de una proteína relacionadas con varias
enfermedades.
Esta invención se relaciona, en general, con
inmunoensayos. Más concretamente, la invención se relaciona con un
ensayo que permite la detección de una cepa específica de una forma
conformacional ligada a la enfermedad de una proteína (tal como
PrP^{Sc}) que puede tener una afinidad muy baja de unión a
anticuerpos.
Los priones son patógenos infecciosos que causan
invariablemente enfermedades priónicas fatales (encefalopatías
espongiformes) del sistema nervioso central en humanos y animales.
Los priones difieren significativamente de las bacterias, los virus
y los viroides. La hipótesis dominante es que no es necesario ningún
ácido nucleico para que pueda proceder la infectividad de una
proteína priónica.
Un paso fundamental en el estudio de los priones
y de las enfermedades que causan fue el descubrimiento y la
purificación de una proteína denominada proteína priónica [Bolton,
McKinley y col. (1982), Science 218:
1309-1311; Prusiner, Bolton y col. (1982),
Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley, Bolton
y col. (1983), Cell 35: 57-62]. Desde
entonces, se han clonado, secuenciado y expresado en animales
transgénicos los genes completos codificantes de proteínas
priónicas. PrP^{c} está codificada por un gen hospedador de una
sola copia [Basler, Oesch y col. (1986), Cell 46:
417-428] y, cuando se expresa PrP^{c}, ésta se
encuentra generalmente en la superficie externa de las neuronas.
Muchas líneas de evidencia indican que las enfermedades priónicas
son el resultado de la transformación de la forma normal de la
proteína priónica (PrP^{c}) en la forma anormal (PrP^{Sc}). No
existe ninguna diferencia detectable en la secuencia de aminoácidos
de las dos formas. Sin embargo, cuando se compara PrP^{Sc} con
PrP^{c}, aquélla tiene una conformación con un mayor contenido en
láminas \beta y un menor contenido en
\alpha-hélice [Pan, Baldwin y col. (1993),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10962-10966;
Safar, Roller y col. (1993), J. Biol. Chem. 268:
20276-20284]. La presencia de la forma anormal
PrP^{Sc} en los cerebros de humanos o animales infectados es el
único marcador diagnóstico específico de la enfermedad de las
enfermedades priónicas.
PrP^{Sc} tiene un papel clave tanto en la
transmisión como en la patogénesis de las enfermedades priónicas
(encefalopatías espongiformes) y es un factor crítico en la
degeneración neuronal [Prusiner (1997), The Molecular and Genetic
Basis of Neurological Disease, 2ª Edición: 103-143].
Las enfermedades priónicas más comunes en animales son el scrapie de
las ovejas y de las cabras y la encefalopatía espongiforme bovina
("BSE") del ganado vacuno [Wilesmith y Wells (1991), Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 172: 21-38]. Se han
identificado cuatro enfermedades priónicas de humanos: (1) kuru, (2)
la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob ("CJD"),
(3) la enfermedad de
Gerstmann-Streussler-Sheinker
("GSS") y (4) el insomnio familiar fatal ("FFI")
[Gajdusek (1997), Science 197: 943-960;
Medori, Tritscher y col. (1992), N.Engl. J. Med. 326:
444-449]. Inicialmente, la presentación de
enfermedades priónicas humanas heredadas planteó un dilema que ha
sido desde entonces explicado por el origen genético celular de la
PrP.
Los priones existen en múltiples aislados (cepas)
con distintas características biológicas cuando estas diferentes
cepas infectan en hospedadores genéticamente idénticos [Prusiner
(1997), The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2ª
Edición: 165-186]. Las cepas difieren en el tiempo
de incubación, en topología de acumulación de la proteína PrP^{Sc}
y, en algunos casos, también en la distribución y en las
características de la patología cerebral [DeArmond y Prusiner
(1997), Greenfield's Neuropathology, 6ª Edición:
235-280]. Dado que PrP^{Sc} es el principal, y
probablemente el único, componente de los priones, la existencia de
cepas de priones ha planteado un acertijo en cuanto a cómo puede
estar codificada la información biológica en una molécula distinta
de una constituida por ácidos nucleicos. El tratamiento
proteolítico parcial de homogeneizados de cerebro que contienen
algunos aislados priónicos ha resultado generar péptidos con
movilidades electroforéticas ligeramente diferentes [Bessen y Marsh
(1992), J. Virol. 66: 2096-2101; Bessen y Marsh
(1992), J. Gen. Virol. 73: 329-334; Telling, Parchi
y col. (1996), Science 274: 2079-2082]. Estos
hallazgos sugerían sitios de escisión proteolítica diferentes
debido a la diferente conformación de las moléculas PrP^{Sc} en
diferentes cepas de priones. Alternativamente, las diferencias
observadas pueden ser explicadas por la formación de diferentes
complejos con otras moléculas, formando distintos sitios de escisión
en PrP^{Sc} en diferentes cepas [Marsh y Bessen (1994), Phil.
Trans. R. Soc. Lond. B. 343: 413-414]. Algunos
investigadores han propuesto que diferentes aislados priónicos
pueden diferir en los patrones de glicosilación de la proteína
priónica [Collinge, Sidle y col. (1996), Nature 383:
685-690; Hill, Zeidler y col. (1997), Lancet 349:
99-100]. Sin embargo, la fiabilidad de los patrones
de glicosilación y de mapeo de péptidos en el diagnóstico de
múltiples cepas priónicas es aún debatida actualmente [Collings,
Hill y col. (1997), Nature 386: 564; Somerville, Chong y col.
(1997), Nature 386: 564].
Se facilita un sistema para detectar PrP^{Sc}
aumentando la inmunorreactividad tras la desnaturalización en Serban
y col., Neurology, Vol. 40, Nº 1, Ja 1990. Un ensayo directo lo
suficientemente sensible y específico para PrP^{Sc} infecciosa en
muestras biológicas podría abolir potencialmente por completo la
necesidad de inoculaciones animales. Desgraciadamente, eso no parece
posible con los actuales ensayos para PrP^{Sc} -se estima que el
límite de sensibilidad actual de la detección de PrP^{Sc} basada
en proteinasa K y en Western blot está en el rango de 1 \mug/ml,
que corresponde a 10^{4} - 10^{5} unidades infecciosas
priónicas. Adicionalmente, la especificidad de los ensayos
tradicionales basados en proteinasa K para PrP^{Sc} está en
interrogante a la luz de los recientes descubrimientos de la
resistencia sólo relativa o nula a la proteinasa K de preparaciones
de priones indudablemente infecciosas [Hsiao, Groth y col. (1994),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9126-9130;
Telling y col. (1996), Genes & Dev.].
La transtiretina humana ("TTR") es una
proteína normal del plasma compuesta por cuatro unidades con
estructura predominante de láminas \beta y sirve como
transportador de la hormona tiroxina. El autoensamblaje anormal de
la TTR en fibrillas amiloides provoca dos formas de enfermedades
humanas, a saber, la amiloidosis sistémica senil ("SSA") y la
polineuropatía amiloide familiar ("FAP") [Kelly (1996),
Curr. Opin. Struct. Biol. 6(1): 11-7].
La causa de la formación de amiloide en la FAP son mutaciones
puntuales en el gen de la TTR; la causa de la SSA es desconocida.
El diagnóstico clínico es establecido histológicamente detectando
los depósitos de amiloide in situ en material de biopsia.
Hasta la fecha, es poco lo que se sabe acerca del
mecanismo de la conversión de TTR en amiloide in vivo. Sin
embargo, varios laboratorios han demostrado que la conversión de
amiloide puede ser simulada in vitro por desnaturalización
parcial de la TTR humana [McCutchen, Colon y col. (1993),
Biochemistry 32(45): 12119-27;
McCutchen y Kelly (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun.
197(2): 415-21]. El mecanismo de
transición conformacional implica a un intermediario
conformacional monomérico que se polimeriza en fibrillas de
amiloide con estructura de láminas \beta lineales [Lai, Colon y
col. (1996), Biochemistry 35(20):
6470-82]. El proceso puede ser mitigado por unión
con moléculas estabilizadoras, tales como la tiroxina o el
triyodofenol [Miroy, Lai y col. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93(26): 15051-6].
A la vista de los puntos anteriores, existe una
clara necesidad de un ensayo específico, de alto rendimiento y
efectivo en cuanto a costes para estudiar materiales de muestra en
cuanto a la presencia de cepas específicas de una proteína
patógena, incluyendo la transtiretina y la proteína priónica.
La metodología de ensayo de la invención permite:
(1) determinar si una muestra contiene una conformación de una
proteína asociada a enfermedad y la concentración y cantidad de ésta
si está presente; (2) determinar la cantidad de un compuesto
químico, tal como una proteína ligada a la enfermedad y resistente a
las proteasas en una muestra y restando la cantidad de la cantidad
total de proteína ligada a la enfermedad determinando la cantidad
de proteína ligada a la enfermedad sensible a proteasas en la
muestra, y (3) determinar la cepa y el tiempo de incubación de una
proteína ligada a la enfermedad (i) relacionando las cantidades
relativas de proteína resistente a proteasas y sensible a proteasas
con cepas conocidas, para así determinar la cepa, y (ii)
representando la concentración de proteína sensible a proteasas en
un gráfico del tiempo de incubación frente a la concentración de
proteína sensible a proteasas para cepas conocidas, para predecir
el tiempo de incubación de una cepa desconocida dada.
Se determina la presencia y la concentración de
proteína en una conformación ligada a la enfermedad por uno de tres
métodos básicos diferentes. De acuerdo con el método primario, se
divide primeramente una muestra en dos porciones. Se pone en
contacto una primera porción con un anticuerpo marcado que se une a
la conformación no ligada a la enfermedad de la proteína, pero no a
la conformación ligada a la enfermedad de la proteína. Se somete
entonces la segunda porción a un tratamiento de despliegue de la
proteína que aumenta la afinidad de unión por cualquier proteína en
la segunda conformación por parte del anticuerpo. En general, el
tratamiento de despliegue de la proteína expondrá un epitopo al que
se puede unir el anticuerpo, cuyo epitopo no está expuesto en la
conformación ligada a la enfermedad. En consecuencia, la proteína
ligada a la enfermedad que no se unió al anticuerpo antes del
tratamiento de despliegue de la proteína se unirá ahora al
anticuerpo. Se hace entonces una comparación entre la cantidad de
anticuerpo que se une a la proteína en la primera porción no
tratada y la cantidad de anticuerpo que se une a la proteína en la
segunda porción. Una diferencia entre la cantidad de anticuerpo que
se une en la primera y segunda porción indica la presencia de
proteína ligada a la enfermedad en la muestra. Dependiendo de la
proteína y del tratamiento de despliegue de la proteína empleado,
puede ser necesario hacer un ajuste debido al efecto del tratamiento
sobre la proteína en la conformación no ligada a la enfermedad.
Expuesto a modo de etapas, el método de ensayo
básico de la invención consiste en (a) disponer de una muestra
sospechosa de contener una proteína (que tiene una primera
conformación y una segunda conformación ligada a la enfermedad), (b)
dividir la muestra en primera y segunda porciones, (c) poner en
contacto la primera porción con un anticuerpo que se une a la
primera conformación con una afinidad mayor que a la segunda
conformación, (d) someter la segunda porción a un tratamiento de
despliegue de proteínas para hacer que cualquier proteína en la
segunda conformación adopte una conformación diferente que tenga una
mayor afinidad por el anticuerpo, (e) poner en contacto la segunda
porción con el anticuerpo, (f) determinar los niveles relativos de
unión del anticuerpo a dichas primera y segunda porciones y (g)
determinar la presencia o ausencia de proteína en la segunda
conformación en base a la comparación.
Una vez se ha determinado que una muestra
contiene proteína en conformación ligada a la enfermedad, es también
útil determinar la cepa en relación al tiempo de incubación de la
proteína. Puede hacerse esto obteniendo otra porción de la muestra
que resultó ser positiva en cuanto a proteína en la conformación
ligada a la enfermedad. Se somete esta porción a un tratamiento
limitado con proteasa que hidroliza la mayor parte de la proteína en
la muestra, salvo la proteína altamente resistente en la
conformación ligada a la enfermedad, por ejemplo PrP
27-30 resistente a proteasas. Se determina entonces
la concentración y la cantidad de la proteína resistente al
tratamiento. Restando la cantidad de proteína resistente al
tratamiento en la muestra de la cantidad total de proteína ligada a
la enfermedad en la muestra, se obtiene la cantidad de proteína
ligada ala enfermedad en la muestra que es sensible a la digestión
con proteasas, por ejemplo de PrP^{Sc} sensible a proteasas. Cada
cepa de proteína ligada a la enfermedad tiene una razón conocida de
proteína total en la conformación ligada a la enfermedad (por
ejemplo, PrP^{Sc} nativa) con respecto a la cantidad de proteína
en conformación ligada a la enfermedad que se desnaturaliza por un
tratamiento desnaturalizador de proteínas (PrP^{Sc} sensible a
proteasas). Así, la razón (total:desnaturalizada) puede ser
equiparada a la de una cepa conocida para determinar la cepa en una
muestra.
El método de determinación de la cepa en
cualquier conformación ligada a la enfermedad de una proteína puede
ser expuesto a modo de etapas. El método es llevado a cabo (a)
aislando proteína en la formación ligada a la enfermedad, por
ejemplo por centrifugación; (b) tratando la proteína aislada con un
compuesto (por ejemplo, clorhidrato de guanidina) que desnaturaliza
una forma de la proteína aislada, pero no otra; (c) determinando la
razón de proteína resistente al tratamiento con respecto a la
cantidad total de proteína ligada a la enfermedad y, (d) comparando
la razón con la de un patrón predeterminado de una cepa conocida,
determinando así la cepa de la proteína ligada a la enfermedad en
una muestra. Este método es más fácilmente aplicado cuando la cepa
halló correspondencias con una cepa conocida. Si no hay
correspondencia con una cepa conocida y no se cometió ningún error
experimental, se puede suponer que se ha descubierto una nueva
cepa.
El tiempo de incubación de una conformación
ligada a la enfermedad de una proteína puede ser determinado incluso
si la cepa es previamente desconocida. Se determina (a) aislando
proteína en la formación ligada a la enfermedad, por ejemplo por
centrifugación; (b) tratando la proteína aislada (por ejemplo, con
proteinasa K, que hidroliza una forma de la proteína aislada, pero
no la otra); (c) restando la cantidad de proteína ligada a la
enfermedad no desnaturalizada (proteína resistente al tratamiento)
de la cantidad total de proteína ligada a la enfermedad para hallar
la cantidad de proteína ligada a la enfermedad que se
desnaturaliza; (d) representando la cantidad de proteína ligada a
la enfermedad (sensible al tratamiento) encontrada en (c) en un
gráfico del tiempo de incubación frente a la cantidad de proteína
ligada a la enfermedad no desnaturalizada (cuyo gráfico tiene
representadas cepas conocidas con tiempos de incubación conocidos),
y (e) prediciendo de este modo el tiempo de incubación.
El ensayo de la invención es útil en el estudio
de muestras que contienen proteínas que están presentes en al menos
dos conformaciones (por ejemplo, una conformación nativa no ligada
a la enfermedad y una conformación ligada a la enfermedad) y que
están presentes a niveles de 1 x 10^{3} partículas/ml o menos. La
presente invención utiliza anticuerpos que no se unen o que tienen
un grado relativamente bajo de afinidad por la conformación ligada a
la enfermedad apretadamente configurada de la proteína. Un
anticuerpo útil para la unión a PrP^{c} es el anticuerpo
monoclonal 3F4 producido por la línea celular de hibridoma ATCC
HB9222, depositada el 8 de Octubre de 1986 en la American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y
descrita en la Patente EE.UU. 4.806.627, concedida el 21 de Febrero
de 1989, que se da como referencia de los anticuerpos que se unen
selectivamente a PrP^{c}. Además de anticuerpo, se podrían usar
otras parejas de unión que se unan a la conformación no ligada a la
enfermedad, pero no a la conformación ligada a la enfermedad, en el
ensayo de la invención. Se dispone de anticuerpos comerciales, tales
como 3F4 y otros usados en los ensayos descritos en los
ejemplos.
Para demostrar el método primario de la presente
invención, se parte de una muestra que se divide en al menos dos
porciones. La primera porción es puesta en contacto con anticuerpos
marcados sin tratar las proteínas y la segunda porción es tratada
con anticuerpos marcados después de haber sometido las proteínas a
un tratamiento de despliegue de proteínas que hace que cualquier
proteína en la conformación ligada a la enfermedad asuma una
conformación que tiene un grado mayor de afinidad de unión por los
anticuerpos (por ejemplo, que expone un epitopo previamente no
expuesto). Se comparan las lecturas (es decir, se resta una de la
otra) y se deduce la presencia de proteínas en la conformación
ligada ala enfermedad en base a la diferencia entre las dos
lecturas.
De acuerdo con una segunda realización del ensayo
básico, es posible utilizar el concepto básico de la presente
invención sin obtener dos lecturas para cada ensayo. Esto puede
hacerse estableciendo un patrón en base a llevar a cabo el ensayo
sobre un número estadísticamente significativo de muestras
estrechamente relacionadas. Después de haber establecido el ensayo,
se sabrá el nivel de unión de anticuerpos que se observaría cuando
una muestra dada no contiene ninguna proteína en conformación ligada
a la enfermedad. Usando el patrón, se somete entonces una muestra de
ensayo a un tratamiento de despliegue de proteínas para convertir
cualquier proteína en conformación ligada a la enfermedad en una
conformación diferente que tiene un grado mucho mayor de afinidad
de unión por los anticuerpos marcados. Se compara entonces la
medición obtenida con el patrón. Si la diferencia entre el patrón y
la medición obtenida está fuera de un rango dado, se puede deducir
que la muestra original incluía proteínas en conformación ligada a
la enfermedad. Estos resultados podrían ser conformados (1) mediante
la primera realización antes descrita y/o (2) estudiando la muestra
con un anticuerpo que se une sólo a la conformación ligada a la
enfermedad de la proteína véase US96/14840.
Una tercera realización de la invención puede
utilizar cualquiera de las realizaciones antes descritas, junto con
las fórmulas aquí facilitadas, para calcular (cuantitativamente) el
número de proteínas (concentración) en la conformación ligada a la
enfermedad presente en la muestra original.
Según cualquiera de las realizaciones del ensayo,
es preferible pretratar la muestra en estudio para (1) eliminar
cuantas proteínas contaminantes sea posible y (2) aumentar la
concentración de proteína ligada a la enfermedad en la muestra en
relación a la conformación no ligada a la enfermedad de la proteína.
Por ejemplo, la muestra inicial puede ser químicamente tratada con
un compuesto que degrade o desnaturalice preferencialmente las
proteínas contaminantes y/o la forma de la proteína relajada no
ligada a la enfermedad y/o se la expone a anticuerpos que se unen
preferencialmente (para eliminarlos) a los contaminantes y/o a la
conformación no ligada a la enfermedad de la proteína.
Puede ser posible aumentar aún más la
sensibilidad de diversos aspectos de la invención concentrando la
conformación ligada a la enfermedad de una proteína añadiendo un
compuesto que se une selectivamente a la conformación ligada a la
enfermedad para formar un complejo y centrifugando la muestra para
precipitar el complejo, que es entonces estudiado según los métodos
aquí descritos. Se describen características específicas
concernientes a los métodos de concentración con detalle en nuestra
solicitud copendiente WO 99/42487, titulada "Procedimiento para
concentrar proteína con conformación ligada a la enfermedad".
Las diferentes realizaciones del ensayo de la
invención antes descrito son todas tipos "directos" de
inmunoensayos lo que significa que la muestra es directamente
estudiada con el anticuerpo marcado con o sin tratamiento para
cambiar la conformación de cualesquiera proteínas con conformación
ligada a la enfermedad presentes en la muestra. También se puede
usar un ensayo "indirecto". Por ejemplo, puede ser deseable
aumentar el número de proteínas ligadas a la enfermedad en la
muestra (de haberlas) mediante el uso de un ratón transgénico y
aumentar así cualquier señal obtenida. Para llevar a cabo estas
realizaciones de la invención, se usa primeramente la muestra para
inocular un ratón transgénico cuyo genoma ha sido modificado, de tal
forma que desarrollará síntomas de enfermedad cuando se le inocule
con proteínas en la conformación ligada a la enfermedad. Después de
inocular el ratón, se deja que pase un período de tiempo suficiente
(por ejemplo, 30 días), después del cual se sacrifica el ratón
transgénico y se usa una muestra, tal como tejido de cerebro
homogeneizado, del ratón en el ensayo directo antes descrito. La
presente invención aumenta la capacidad de los ratones transgénicos
para detectar priones acortando el período de tiempo que ha de
pasar hasta poder hacer una determinación en cuanto a si la muestra
original incluía proteínas en la conformación ligada al estado de la
enfermedad. También sería posible usar ratones del tipo expuesto y
descrito en cualquiera de las Patentes EE.UU. 5.565.186, 5.763.740
ó 5.792.901, o aplicar PrP marcada en epitopo, según se describe en
la Patente EE.UU. 5.750.361, para purificar por afinidad la
PrP^{Sc} del cerebro de un ratón Tg y aplicar a continuación el
ensayo de la presente invención. Sin la presente invención, se
inocula el ratón y se ha de esperar hasta que le ratón inoculado
demuestra realmente síntomas de la enfermedad. Dependiendo del
ratón, esto puede llevar varios meses o incluso años. Cualquiera de
los ensayos de la presente invención podría ser usado con cualquier
ratón transgénico, tal como los antes descritos. El ensayo podría
ser utilizado mucho antes de que el ratón desarrolle síntomas de
enfermedad, acortando así el tiempo necesario para determinar si una
muestra incluye proteínas infecciosas.
La metodología del ensayo de la presente
invención puede ser aplicada a cualquier tipo de muestra cuando se
sospecha que la muestra contiene una proteína que aparece en al
menos dos conformaciones. La proteína debe aparecer en una
conformación que se una a anticuerpos conocidos, anticuerpos que
pueden ser generados u otras parejas de unión específica. La segunda
conformación debe ser lo suficientemente diferente de la primera
conformación en términos de su afinidad de unión como para que las
dos conformaciones puedan ser distinguidas usando anticuerpos o
parejas de unión que tengan un grado mucho mayor de afinidad por la
primera conformación que por la segunda conformación. En su forma
conceptualmente más simple, la invención funciona mejor cuando un
anticuerpo marcado conocido se une a una forma no ligada a la
enfermedad de una proteína con un alto grado de afinidad y no se
une (o se une con un grado de afinidad extremadamente bajo) a la
misma proteína cuando está presente en su conformación ligada a la
enfermedad. Sin embargo, en realidad, una proteína dada puede tener
más de dos conformaciones. La proteína puede tener más de una
conformación no ligada a la enfermedad y más de una conformación
ligada a la enfermedad (Telling y col., Science (1996)). La
invención es aún útil cuando existen múltiples conformaciones de
formas no ligadas a la enfermedad y ligadas a la enfermedad de la
proteína siempre que (1) al menos una conformación no ligada a la
enfermedad difiera de al menos una conformación ligada a la
enfermedad en términos de su afinidad de unión y que (2) sea posible
tratar la conformación ligada a la enfermedad de la proteína para
aumentar substancialmente su afinidad de unión.
Tal como se ha indicado antes, el ensayo de la
invención puede ser usado para estudiar cualquier tipo de muestra
para cualquier tipo de proteína, siempre que la proteína incluya
una conformación no ligada a la enfermedad y una ligada a la
enfermedad. Sin embargo, la invención fue particularmente
desarrollada para estudiar muestras en cuanto a la presencia de (1)
proteínas PrP y determinar si la muestra incluía una proteína PrP
en su conformación ligada a la enfermedad, es decir, si incluía
PrP^{Sc}; (2) formas insolubles de \betaA4 asociadas a la
enfermedad de Alzheimer, y (3) transtiretina. En consecuencia, gran
parte de la descripción que sigue se dirige a la utilización del
inmunoensayo de la presente invención para detectar la presencia de
PrP^{Sc} (o en menor medida de \betaA4 o de transtiretina (TTR))
en una muestra -entendiéndose que los mismos conceptos generales
son aplicables para detectar las conformaciones ligadas a la
enfermedad de una amplia variedad de diferentes tipos de proteínas.
Además, la descripción se dirige, en particular, a la descripción de
cómo determinar el tiempo de incubación y la cepa particular de
priones infecciosos (PrP^{Sc}) en una muestra -entendiéndose que
los mismos conceptos generales son aplicables a la determinación
del tiempo de incubación y de la cepa particular de otras proteínas
apretadas asociadas a diferentes enfermedades.
El presente método de detección de PrP^{Sc} fue
desarrollado marcando IgG purificada seleccionada con europio. Los
anticuerpos empleados (3F4) tienen una alta afinidad de unión por
PrP^{c} (conformación no ligada a la enfermedad), que tiene una
conformación rica en \alpha-hélice. Los
anticuerpos tienen una baja afinidad de unión por PrP^{Sc}
(conformación ligada a la enfermedad), que tiene una conformación
rica en láminas \beta. La IgG puede ser obtenida de anticuerpos
comunes monoclonales, policlonales o recombinantes, que reconocen
típicamente la secuencia 90-145 de PrP^{c} y de
la proteína priónica conformacionalmente no desplegada. Se
entrecruzaron químicamente diferentes conformaciones de proteína
priónica recombinante con placas de poliestireno a través de una
etapa de activación con glutaraldehído. Las afinidades relativas de
la IgG marcada con Eu con la conformación
\alpha-helicoidal, de láminas \beta y de
arrollamiento aleatorio de la proteína priónica de hámster Sirio
recombinante correspondiente a la secuencia 90-231,
fueron determinadas por fluorescencia de resolución temporal y de
disociación aumentada en un formato de placa de poliestireno de 96
pocillos.
Se puede hacer una determinación de las
afinidades relativas de diferentes anticuerpos marcados para
proteínas por diferentes métodos. Sin embargo, la conformación
ligada a enfermedad de una proteína está con frecuencia presente en
una concentración muy baja en relación a la de la conformación no
ligada a enfermedad. En consecuencia, a menudo se requieren métodos
muy sensibles para detectar cualquier aumento causado por el
tratamiento de la conformación ligada a la enfermedad de la
proteína. La fluorescencia con resolución temporal y disociación
aumentada y, más preferiblemente, los fluorómetros de doble
longitud de onda accionados por láser, son dispositivos
particularmente útiles -véase Hemmilä y col., Bioanalytical
Applications of Labeling Technologies (eds. Hemmilä),
113-119 (Wallas Oy, Turki, Finlandia, 1995).
Equilibrando cuidadosamente este método, es
posible detectar el aumento de señal en la reactividad de
anticuerpos en la transición del estado conformacional de láminas
\beta al estado desnaturalizado. Esta señal es relativamente
grande en comparación con la obtenida de la transformación de su
estado nativo de \alpha-hélice en su estado
tratado relajado o desnaturalizado. De este modo, se puede asignar
el estado conformacional original de la proteína priónica por el
ensayo diferencial a estados nativos y tratados. Cuando se trata
una muestra que no contiene proteína rica en láminas \beta, se
obtiene algún incremento en la inmunorreactividad. Esta cantidad de
aumento debe ser ajustada y, después de hacerlo, se hace referencia
a la concentración o cantidad resultante como "cantidad
ajustada". La cantidad de unión específica de anticuerpo sobre la
obtenida para la conformación \alpha-helicoidal de
PrP^{c} (más allá de la cantidad ajustada) es una medida de la
presencia de conformación rica en láminas \beta, que es esencial
para la patogenicidad e infectividad de PrP^{Sc}.
Un aspecto de la invención es ofrecer un
inmunoensayo que sea aplicable al estudio de muestras que contienen
proteínas, cuyas muestras son sospechosas de contener una proteína
que se produce en una conformación nativa no ligada a enfermedad y
en una conformación ligada a enfermedad (por ejemplo, proteína PrP,
proteína \betaA4 y transtiretina).
Otro aspecto de la invención es ofrecer un ensayo
que diferencia entre (1) proteínas ligadas a enfermedad o porciones
de las mismas que no son hidrolizadas por tratamiento limitado con
proteasas con una proteasa tal como la proteinasa K (proteínas
resistentes a proteasas, por ejemplo PrP 27-30) y
(2) proteínas ligadas a enfermedad que se hidrolizan por un
tratamiento limitado con proteasas con una proteasa tal como la
proteinasa K (por ejemplo, PrP^{Sc} sensible a proteasas).
Otro aspecto es facilitar un método para
determinar la razón de proteína nativa total ligada a la enfermedad
con respecto a proteína ligada a enfermedad que se desnaturaliza
por tratamiento desnaturalizante de proteínas.
Una ventaja de la invención es que permite la
detección de proteína ligada a enfermedad (por ejemplo, PrP^{Sc}
sensible a proteasas) que se hidroliza durante la digestión con
proteasas de la proteína nativa no ligada a la enfermedad (por
ejemplo, PrP^{c}) y que, por lo tanto, no sería detectada por las
metodologías convencionales de Western blot.
Una característica de la invención es que puede
ser usada para calcular el tiempo de incubación de una proteína
infecciosa.
Una ventaja de la presente invención es que el
inmunoensayo puede determinar rápidamente y con exactitud la
presencia de proteínas en la conformación ligada a la enfermedad
(por ejemplo, PrP^{Sc}, \betaA4 y transtiretina) incluso si el
anticuerpo usado en el ensayo no se une o tiene un grado muy bajo de
afinidad de unión por la proteína en la conformación ligada a la
enfermedad y la conformación ligada a la enfermedad está presente
en una concentración más baja que la conformación no ligada a la
enfermedad.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
ensayo que haga posible no sólo determinar (1) si una partícula
patógena está presente en una muestra, sino (2) determinar la
concentración de las partículas en una muestra, (3) determinar la
cepa concreta de partícula presente y (4) el tiempo de
incubación.
Una característica de la invención es que la
señal obtenida puede ser aumentada mediante el uso de animales
transgénicos, por ejemplo ratones, que son usados para detectar la
presencia de una proteína en una muestra.
Otra característica de la invención es que se
puede usar fluorescencia con resolución temporal y disociación
aumentada o un fluorómetro de longitud de onda doble accionado por
láser para aumentar la sensibilidad.
Otra ventaja es que el ensayo puede detectar los
niveles de la conformación causante de la enfermedad de una proteína
a una concentración de 1 x 10^{3} partículas/ml o menos.
Un objeto específico es facilitar un ensayo
diagnóstico para determinar la presencia de proteína priónica
infecciosa en materiales de muestra variables obtenidos o derivados
de tejidos y/o de fluidos corporales humanos, de primates, de monos,
de cerdos, de bóvidos, de ovejas, de ciervos, de alces, de gatos,
de perros, de ratones y de pollos.
Otro objeto específico es proporcionar un ensayo
diagnóstico para determinar la presencia de proteína \betaA4 en
materiales de muestra variables obtenidos o derivados de tejidos
y/o de fluidos corporales humanos, de primates, de monos, de
cerdos, de bóvidos, de ovejas, de ciervos, de alces, de gatos, de
perros, de ratones y de pollos.
Otro objeto es proporcionar un ensayo rápido para
proteína priónica infecciosa nativa en los cerebros de animales
transgénicos y no transgénicos inyectados con material de muestra
que potencialmente contiene priones.
Otro objeto es proporcionar un método para
evaluar los procedimientos de descontaminación estudiando el nivel
de desnaturalización de proteínas patógenas (por ejemplo, priones o
\betaA4 de láminas \beta) después de dichos tratamientos.
Otro objeto es proporcionar un método rápido para
el estudio selectivo de diferentes compuestos para evaluar su
potencial para el tratamiento de enfermedades asociadas a
conformaciones ligadas a la enfermedad de diferentes proteínas, tal
como estudiando compuestos en cuanto a su efecto estabilizador sobre
diferentes conformaciones proteicas (por ejemplo, PrP^{c} o
conformación \alpha-helicoidal de \betaA4), o a
su impacto desestabilizador sobre la conformación patógena (por
ejemplo, PrP^{Sc} o conformación de láminas \beta de \betaA4)
de una proteína.
Otro objeto es presentar un método rápido para
estudiar diferentes compuestos farmacéuticos con potencial para el
tratamiento de enfermedades priónicas, tal como estudiando
compuestos en cuanto a su efecto estabilizador sobre la conformación
de \alpha-hélice de una isoforma normal de la
proteína PrP^{c} o a su efecto desestabilizador sobre la
conformación de láminas \beta de la isoforma patógena de la
proteína PrP^{Sc}.
Otra ventaja es que el proceso puede ser llevado
a cabo sin anticuerpo directamente capaz de reconocer una
conformación infecciosa de una proteína y sin usar una etapa de
proteinasa K para eliminar la señal de las isoformas normales (no
ligadas a la enfermedad) de la proteína, tal como PrP^{c}.
Otra ventaja es que, en el procedimiento de la
invención, no se necesita un anticuerpo directamente capaz de
reconocer la conformación patógena de \betaA4 o de la
transtiretina.
Una característica importante del ensayo es el
diseño rápido, efectivo en cuanto a costes y de alto rendimiento que
puede ser diseñado con capacidad para estudiar 96 muestras al día
por placa de 96 pocillos.
Otro aspecto de la invención es el método
diagnóstico para detectar cuantitativamente la TTR en la
conformación anormal amiloide el material de muestra obtenido de
tejidos y fluidos corporales humanos y animales y de productos
farmacéuticos. El procedimiento de la invención proporciona un
método directo y sensible para distinguir y cuantificar las
conformaciones normal y amiloide de la TTR en una mezcla presente
en materiales de muestra.
La cuantificación se basa en una medición de la
diferencia en afinidades de anticuerpos monoclonales o policlonales
por la TTR en la conformación normal o amiloide frente a la
conformación de arrollamiento aleatorio. La presente invención
describe tres métodos de evaluación y la fórmula matemática usada
para dicha cuantificación.
Un objeto importante es proporcionar un ensayo
diagnóstico específico para la TTR patógena en materiales de muestra
variables obtenidos o derivados de tejidos humanos, de primates, de
monos, de cerdos, de bóvidos, de ovejas, de ciervos, de alces, de
gatos, de perros y de pollos.
Otro objeto es proporcionar un ensayo rápido para
la forma amiloide de la TTR en animales transgénicos.
Otro objeto es proporcionar un método rápido para
estudiar diferentes compuestos farmacéuticos con potencial para el
tratamiento de la amiloidosis sistémica senil (SSA) y de la
polineuropatía amiloidósica familiar (FAP). Dichos compuestos son
estudiados en cuanto a su efecto estabilizador sobre la conformación
normal de la TTR o a su impacto desestabilizador sobre la
conformación amiloide de la TTR.
Aún otro objeto es disponer de un método rápido
para estudiar el impacto de diferentes mutaciones espontáneas y
diseñadas en el gen de la TTR sobre la conformación, la estabilidad
y la formación de amiloide de dichos productos génicos TTR en
animales transgénicos que albergan genes APP naturales o
artificiales.
La ventaja específica es que el ensayo de la
invención puede detectar una forma patógena de TTR en una mezcla con
formas no patógenas desnaturalizadas de la misma o en mezcla con una
forma soluble de TTR -por ejemplo, detecta menos de 1 x 10^{3}
partículas por ml.
Éstos y otros objetos, ventajas y características
del procedimiento de la invención resultarán evidentes para los
expertos en la técnica tras la lectura de los detalles del método
de ensayo, del desarrollo y estudio de anticuerpos y del ratón
transgénico, como se describirá a continuación con mayor detalle en
relación a las figuras adjuntas.
La Figura 1 es una espectrografía de la
conformación de la SHaPrP90-231 recombinante
determinada por espectroscopía de dicroísmo circular ("CD"),
que muestra que las dos bandas mayores con mínimos a 208 y 222 nm
indican conformación \alpha-helicoidal; la banda
simple negativa con mínimo a 217 nm es característica de
conformación predominantemente de láminas \beta. La figura muestra
la conversión de la ShaPrP90-231 de conformación
\alpha-helicoidal en conformación de láminas
\beta durante la incubación a 37ºC durante 72 h, según se
determina por espectroscopía de dicroísmo circular (CD). La
concentración de proteína era de 5 mg/ml.
La Figura 2 es un gráfico que muestra los
resultados del ensayo competitivo de SHaPrP90-231
recombinante en conformaciones \alpha-helicoidal y
desnaturalizada en presencia de un 5% de homogeneizado de cerebro de
ratón PrP^{0/0}, donde la diferencia en la pendiente y en los
puntos de entrecruzamiento obtenidos con IgG 3F4 marcada con
europio indica que cada conformación tiene diferente afinidad y
diferente número de sitios de unión, y donde además los puntos de
los datos y las barras representan la media \pm SEM obtenida de
cuatro mediciones independientes.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
calibración de un ensayo directo con SHaPrP90-231
recombinante en conformación \alpha-helicoidal en
presencia de un 5% de homogeneizado de cerebro de ratón PrP^{0/0},
donde los puntos de los datos y las barras representan la media
\pm SEM obtenida de cuatro mediciones independientes.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la
calibración de un ensayo directo con SHaPrP90-231
recombinante en conformación de láminas \beta en presencia de un
5% de homogeneizado de cerebro de ratón PrP^{0/0}, donde los
puntos de datos y las barras representan la media \pm SEM
obtenida de cuatro mediciones independientes.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la
validación de entrada-salida de un ensayo directo
para formas tanto \alpha-helicoidales como de
láminas \beta de SHaPrP90-231 en presencia de un
5% de homogeneizado de cerebro de ratón PrP^{0/0}, donde la
cantidad de proteína en el eje de las x fue determinada por análisis
de aminoácidos y la cantidad de proteína en el eje de las y fue
calculada a partir del ensayo.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la razón
entre las señales de SHaPrP90-231 tratada (se
muestra desplegada como desnaturalizada) y nativa en conformaciones
\alpha-helicoidales y
\beta-laminares desarrolladas con IgG 3F4 marcada
con Eu, donde los puntos de datos y las barras representan la media
\pm SEM obtenida de cuatro mediciones independientes. Dos bandas
mayores en el espectro CD con mínimos a 208 y 222 nm indican una
conformación \alpha-helicoidal, una sola banda
negativa con mínimo a 217 nm es característica de una conformación
predominantemente \beta-laminar y un seno negativo
hacia los 197 nm documenta una conformación de arrollamiento
aleatorio. La calibración del inmunoensayo dependiente de
conformación fue realizada en presencia de un 5% (p/v) de
homogeneizado de cerebro de ratón Prnp^{0/0}. Los puntos de datos
y las barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro
mediciones independientes.
La Figura 7 es un gráfico que muestra los
resultados de un ensayo directo para la proteína PrP^{c} en
homogeneizado de cerebro normal de hámster, donde los puntos de
datos y las barras representan la media \pm SEM obtenida de
cuatro mediciones independientes.
La Figura 8 es un gráfico que muestra los
resultados de un ensayo directo para PrP^{c+Sc} en homogeneizado
de hámster infectado con scrapie, donde los puntos de datos y las
barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro mediciones
independientes.
La Figura 9 es un gráfico que muestra la cantidad
total de proteínas PrP en cerebros normales de hámster y la cantidad
de PrP^{Sc} \beta-laminar en ambos cerebros
calculadas a partir del modelo, donde los puntos de datos y las
barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro mediciones
independientes.
La Figura 10 es un gráfico que muestra la
cantidad total de proteínas PrP en cerebros de hámster infectados
con scrapie y la cantidad de PrP^{Sc}
\beta-laminar en ambos cerebros calculada a partir
del modelo, donde los puntos de datos y las barras representan la
media \pm SEM obtenida de cuatro mediciones independientes. La
concentración de SHaPrP en la ordenada fue calculada por la fórmula
(1). Las muestras de homogeneizados de cerebro al 5% (p/v)
obtenidas de hámsteres Sirios normales o infectados con scrapie
fueron diluidas seriadamente en homogeneizado de ratón Prnp^{0/0}
al 5% (p/v). Los puntos de datos y las barras representan la media
\pm SEM obtenida de cuatro mediciones independientes.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la
correlación de la infectividad y la cantidad de forma
\beta-laminar de SHaPrP^{Sc} calculada por el
ensayo directo y la fórmula, donde se sonicó SHaPrP^{Sc}
purificada en presencia de un 5% de homogeneizado de cerebro de
ratón PrP^{0/0} y se diluyó como se ha descrito, y donde los
puntos de datos y las barras representan la media \pm SEM obtenida
de cuatro mediciones independientes.
La Figura 12 es un gráfico de \betaA4
(1-40) en las conformaciones de
\alpha-hélice y de láminas \beta producido por
espectroscopía de dicroísmo circular (CD), que muestra bandas
mayores a 208 y 222 nm para la conformación helicoidal y una sola
banda negativa a 217 nm para la conformación predominantemente
\beta-laminar (a pH 7,4).
La Figura 13 es un gráfico de un ensayo directo
de A4\beta soluble (1-40).
La Figura 14 es un gráfico de un ensayo directo
de la forma \beta-laminar de A4\beta
(1-40).
La Figura 15 es un gráfico que muestra la razón
de A4\beta (1-40) desnaturalizada a nativa.
La Figura 16 muestra la conversión de
ShaPrP90-231 recombinante de la conformación
\alpha-helicoidal a la
\beta-laminar durante la incubación a 37ºC
durante 72 h, según se determina por ensayo diferencial directo. La
mayor señal de la conformación nativa a -24 h indica
desestabilización de la estructura nativa, con una conformación más
abierta, seguido de conversión en la estructura secundaria
\beta-laminar (véase la Figura 16). La
concentración de proteína era de 5 mg/ml.
La Figura 17 muestra que tanto HFIP como el
glicerol son capaces de prevenir la transición conformacional
\alpha a \beta de la ShaPrP90-231 recombinante.
Los cambios en la señal TRF se expresan como cambio fraccionado,
donde un valor positivo indica estabilización y uno negativo
desestabilización. Las condiciones experimentales eran como en las
Figs. 1 y 16.
Figura 18: El polisulfato de pentosano estabiliza
la conformación negativa de ShaPrP90-231 a bajas
concentraciones; el rojo Congo no tiene efecto sobre la estabilidad
de ShaPrP90-231. Los cambios en la señal TRF se
expresan como cambio fraccionado, donde un valor positivo indica
estabilización y uno negativo desestabilización. Las condiciones
experimentales eran como en las Figs. 1 y 16.
Figura 19: El detergente zwitteriónico
ZW3-12 desestabilizaba la conformación nativa de la
Sha90-231 \alpha-helicoidal. Las
condiciones experimentales eran como en las Figs. 1 y 16; los
cambios en la señal TRF se expresan como cambio fraccionado, donde
un valor positivo indica estabilización y uno negativo
desestabilización.
La Figura 20 muestra la calibración de un ensayo
directo con TTR humana purificada en conformación normal. Las placas
fueron reveladas con los anticuerpos primarios
anti-TTR (Accurate Chemical and Scientific
Corporation, Westbury, NY) y anticuerpo secundario
anti-conejo marcado con Eu. Los puntos de datos y
las barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro
mediciones independientes.
La Figura 21 muestra la calibración de un ensayo
directo con TTR humana purificada en conformación amiloide. Las
placas fueron reveladas con anticuerpos primarios
anti-TTR y anticuerpo secundario
anti-conejo marcado con Eu. Los puntos de datos y
las barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro
mediciones independientes.
La Figura 22 muestra la razón entre señales de
TTR desnaturalizada y nativa en conformaciones normal y amiloide,
revelada como se ha descrito antes. Los puntos de datos y las
barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro mediciones
independientes.
Figura 23: Fórmula modificada para calcular la
cantidad de TTR en conformación amiloide por los datos obtenidos por
ensayo directo con anticuerpo policlonal anti-TTR.
Los cambios con respecto a la ecuación general reflejan la razón
invertida de estados desnaturalizados y nativos para las formas
normal y amiloide de la TTR. La diferencia entre la fluorescencia
del estado desnaturalizado de la muestra y la esperada para la
transición de la proteína normal nativa al estado desnaturalizado
es proporcional a la cantidad de TTR en conformación amiloide.
F_{n} - señal total de conformación nativa; F_{nN} y F_{nA} -
las señales de las conformaciones normal nativa y amiloide,
respectivamente; F_{d} - señal total de TTR en estado
desnaturalizado; F_{dN} y F_{dA} son las señales de los estados
normal o amiloide desnaturalizados de la TTR;
\DeltaF_{n\rightarrow d} - aumento total de la señal en la
transición de los estados nativo a desnaturalizado;
\DeltaF_{Nn\rightarrow d} - aumento de la señal de conformación
normal en la transición del estado nativo al desnaturalizado;
\DeltaF_{An\rightarrow d} - cambio en la señal de la
conformación amiloide en la transición del estado nativo al
desnaturalizado; f_{Nn\rightarrow d} - factor de correlación para
la transición del estado nativo al desnaturalizado de la TTR
normal.
La Figura 24 es un gráfico del "índice
priónico" (que es la razón de anticuerpo que se une a la proteína
PrP desnaturalizada frente al que se une a la proteína PrP nativa)
frente a la concentración de PrP^{Sc} en \mug/ml. Los resultados
mostrados representan la media \pm SEM obtenida de tres cerebros
diferente de hámsteres Sirios LVG/LAK infectados con diferentes
cepas de priones.
La Figura 25 es un gráfico determinado por
espectroscopía de dicroísmo circular (CD) de SHaPrP
(90-231) purificada de E. coli.
Las Figuras 26 a 29 son todas ellas gráficos
usados para distinguir ocho cepas de PrP^{Sc} por medio del
inmunoensayo de la invención, donde:
La Figura 26 es un gráfico de barras de la PrP
total en comparación con la PrP^{Sc}. Las columnas y las barras
representan la media \pm SEM obtenida de tres diferentes cerebros
de hámsteres sirios LVG/LAK infectados con diferentes cepas de
priones y medido en tres experimentos independientes.
La Figura 27 es un gráfico que muestra la razón
de unión de anticuerpo a PrP desnaturalizada/nativa y la función de
concentración de PrP^{Sc} en los cerebros de hámsteres Sirios
infectados con diferentes cepas de priones. La concentración de
PrP^{Sc} (fórmula 1) y la razón de unión de anticuerpo a PrP
desnaturalizada/nativa fueron medidas por un inmunoensayo
dependiente de conformación.
La Figura 28 es un gráfico de homogeneizados de
cerebro de hámsteres Sirios inoculados con diferentes cepas de
scrapie y se digirieron controles no inoculados, representados por
C, con 50 \mug/ml de proteinasa K durante 2 h a 37ºC antes del
inmunoensayo dependiente de conformación.
La Figura 29 es un gráfico del tiempo de
incubación representado en función de la concentración de la
fracción sensible a proteinasa K de PrP^{Sc} ([PrP^{Sc}]-[PrP
27-30]).
Las Figuras 30 y 31 son gráficos que muestran la
disociación de equilibrio y el despliegue de PrP^{c} y PrP^{Sc}
en tres cepas de priones. Razón de unión de anticuerpo a PrP
desnaturalizada/nativa y cambio fraccionado aparente de despliegue
de las proteínas priónicas durante la disociación de equilibrio y el
despliegue, donde:
La Figura 30 es un gráfico de los datos de los
cerebros de controles no inoculados (C) y de hámsteres Sirios
infectados con las cepas Sc237, DY y HY de priones analizados por un
inmunoensayo dependiente de conformación; se representa la razón de
unión de anticuerpo a PrP desnaturalizada/nativa en función de la
concentración de GdnHCl.
La Figura 31 es un gráfico de dichos datos que
muestra el cambio fraccionado aparente por despliegue (F_{app}) de
PrP^{Sc} de las cepas Sc237, DY y HY. Los puntos y las barras
representan la media \pm SEM obtenida de cuatro mediciones
diferentes.
Las Figuras 32 y 33 son gráficos que muestran el
rango dinámico y la sensibilidad de la razón de unión de anticuerpo
a PrP en los estados desnaturalizado y nativo. Los homogeneizados
[5% (p/v)] preparados a partir de los cerebros de hámsteres Sirios
que exhibían signos de disfunción del SNC \sim70 días después de
la inoculación con priones Sc237 fueron seriadamente diluidos a un
homogeneizado de cerebro SHa normal al 5% (p/v) y se midió la
presencia de PrP^{Sc} después de la precipitación con NaPTA por
un inmunoensayo dependiente de conformación, donde:
La Figura 32 es un gráfico que muestra la razón
de las señales de fluorescencia de alícuotas desnaturalizadas y
nativas representada en función de la dilución de un homogeneizado
de cerebro infectado con scrapie.
La Figura 33 es un gráfico en el que se calculó
la cantidad absoluta de PrP^{c} y PrP^{Sc} a partir de la
fórmula (1) y se representó en función de la dilución del
homogeneizado de cerebro infectado con scrapie. Los puntos de datos
y las barras representan la media \pm SEM obtenida de cuatro
mediciones independientes.
Las Figuras 34 y 35 son todas ellas gráficos que
muestran el tiempo de incubación para ocho cepas de PrP^{Sc},
donde:
La Figura 34 muestra cada cepa representada como
tiempo de incubación frente a PrP^{Sc} total.
La Figura 35 muestra cada cepa representada como
tiempo de incubación frente a PrP^{Sc} resistente al tratamiento o
a las proteasas, que es PrP 27-30.
Es muy interesante comparar las Figuras 34 y 35,
en donde no es evidente ninguna correlación entre PrP^{Sc} o PrP
27-30 con el tiempo de incubación, con la Figura
29, que muestra una relación lineal para los datos que representan
el tiempo de incubación frente a la PrP^{Sc} resistente a
tratamiento o a proteasas, es decir, el tiempo de incubación frente
a (PrP^{Sc} total - PrP 27-30), donde PrP
27-30 es la PrP^{Sc} resistente a proteasas.
Antes de exponer y describir los presentes
ensayos y métodos, hay que entender que esta invención no se limita
a anticuerpos, proteínas, marcajes, ensayos o métodos particulares,
ya que éstos pueden obviamente variar. Hay que entender también que
la terminología usada aquí tiene el fin de describir sólo
realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el
alcance de la presente invención quedará limitado únicamente por
las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de forma diferente, todos
los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo
significado que el comúnmente entendido por alguien con
conocimientos ordinarios en la técnica a la que esta invención
pertenece. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales
similares o equivalentes a los aquí descritos en la práctica o en
las pruebas de la presente invención, se describen ahora los
métodos y materiales preferidos.
El término "proteína", tal como se utiliza
aquí, pretende abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluye
secuencias modificadas, tales como glicoproteínas. El término
incluye proteínas y péptidos naturales, así como aquéllos que son
sintetizados recombinante o sintéticamente. Tal como se usa en
relación a la presente invención, el término "proteína"
pretende cubrir específicamente proteínas naturales que aparecen en
al menos dos conformaciones diferentes, donde ambas conformaciones
tienen la misma o substancialmente la misma secuencia de
aminoácidos, pero tienen diferentes estructurales dimensionales. Las
dos conformaciones de la proteína incluyen al menos una conformación
que no está relacionada con un estado de enfermedad y al menos una
conformación que está relacionada con un estado de enfermedad -
patógena. Un ejemplo específico y preferido de una proteína, tal
como se usa en relación a esta descripción, es una proteína PrP que
incluye la forma no ligada a la enfermedad, a la que se hace
referencia como PrP^{c}, y la forma ligada a la enfermedad, a la
que se hace referencia como PrP^{Sc}. Aunque una proteína
priónica o la forma PrP^{Sc} de una proteína PrP es infecciosa y
patogénica, la conformación ligada a la enfermedad de otras
proteínas no es infecciosa aunque sea patógena. Tal como se usa
aquí, el término patógeno puede significar que la proteína
realmente causa la enfermedad o puede simplemente significar que la
proteína está asociada a la enfermedad y, por lo tanto, está
presente cuando la enfermedad está presente. Por lo tanto, una
proteína patógena, tal como se usa en relación a esta descripción,
no es necesariamente una proteína que sea el agente causal
específico de una enfermedad.
Las muestras estudiadas pueden contener una serie
de diferentes proteínas y las proteínas de estas muestras son
tratadas mediante uno o más tipos de tratamiento diferentes, como
se describe a continuación, para obtener un resultado deseado.
"Pretratamiento" es empleado aquí para
describir los más suaves de los tipos diferentes de tratamiento
aplicados en los ensayos de la invención. El pretratamiento es
eventualmente realizado precozmente en el método para desnaturalizar
o hidrolizar proteínas que (1) son fácilmente hidrolizadas o
desnaturalizadas y (2) no son del tipo general que las proteínas de
interés. El pretratamiento es llevado a cabo para destruir la
proteína contaminante, de tal forma que pueda ser más fácilmente
eliminada de la muestra que contiene las proteínas de interés. Se
podría utilizar el tratamiento suave con bajas concentraciones de
una proteasa durante un período corto de tiempo para el
pretratamiento. El pretratamiento puede eliminar proteínas
contaminantes por otros medios, tales como por contacto de la
muestra con anticuerpos que se unen a proteínas contaminantes que se
espera estén presentes en la muestra.
Los términos "tratamiento de despliegue de la
proteína" o "tratamiento de despliegue" o
"desnaturalización" y similares son usados indistintamente aquí
para describir un procedimiento mediante el cual se manipula física
y/o químicamente una muestra una porción de la misma y,
específicamente, proteínas en la conformación ligada a la
enfermedad de la muestra, de tal forma que se hace que las
proteínas de la muestra en conformación ligada a la enfermedad se
desplieguen en algún grado, es decir, que cambien a una
conformación diferente con una mayor afinidad de unión con una
pareja de unión, tal como un anticuerpo, por ejemplo exponiendo un
epitopo previamente no expuesto o parcialmente expuesto. Se hace
también referencia a las proteínas así tratadas como proteínas en
una conformación relajada, cuya conformación aumenta la afinidad de
unión de la proteína a una pareja de unión, tal como un anticuerpo.
El tratamiento de despliegue incluye someter la muestra a calor,
presión y/o agentes químicos. En una realización preferida, las
muestras que contienen PrP^{Sc} (que es la conformación ligada a
la enfermedad que tiene configuraciones estructurales
\beta-laminares) son tratadas (por ejemplo, con
clorhidrato de guanidina) de tal forma que la proteína asuma una
conformación diferente (por ejemplo, que tenga una configuración
\alpha-helicoidal y/o una configuración de
arrollamiento aleatorio) que tenga una afinidad de unión a
anticuerpo cuatro veces mayor o más.
"Tratamiento limitado con proteasas"
significa el tratamiento de una muestra proteica de tal forma que
todas, o substancialmente todas, las proteínas, salvo las más
resistentes al tratamiento (por ejemplo, PrP^{Sc} resistente a
proteasas -es decir, PrP 27-30), se hidrolicen o se
rompan en trozos, es decir, en pequeños péptidos y/o aminoácidos.
Este tipo de tratamiento lítico es llevado a cabo para hidrolizar
proteínas de interés en la configuración no ligada a la enfermedad,
así como proteínas de interés en la conformación ligada a la
enfermedad, que son "sensibles" al tratamiento limitado con
proteasas. Las únicas proteínas no hidrolizadas por el tratamiento
limitado con proteasas son las proteínas de interés en la
conformación ligada a la enfermedad que son "resistentes" a
este tratamiento (por ejemplo, PrP 27-30).
Se espera algo de ensayo y error en la
determinación de los parámetros (por ejemplo, temperatura, tiempo,
tipo de proteasa y concentración) necesarios para obtener el tipo
deseado de tratamiento. Condiciones suaves para el pretratamiento,
medias para el despliegue y duras para el tratamiento limitado con
proteasas.
Los términos "proteína PrP", "PrP" y
similares son utilizados aquí indistintamente y significan tanto la
forma de partícula infecciosa PrP^{Sc}, que se sabe produce
enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales,
como la forma no infecciosa PrP^{c} que, en condiciones
apropiadas, se convierte en la forma infecciosa PrP^{Sc}.
Utilizamos aquí los términos "prion",
"proteína priónica" y "proteína PrP^{Sc}" y similares
indistintamente para referirnos a la forma infecciosa PrP^{Sc} de
la PrP y es una contracción de las palabras "proteína" e
"infección". Las partículas están mayormente constituidas, si
no de forma exclusiva, por moléculas de PrP^{Sc} codificadas por
un gen PrP. Los priones son distintos de las bacterias, de los
virus y de los viroides. Los priones conocidos infectan a animales
para producir el scrapie, una enfermedad degenerativa transmisible
del sistema nervioso de las ovejas y de las cabras, así como la
encefalopatía espongiforme bovina ("BSE") o "enfermedad de
las vacas locas" y la encefalopatía espongiforme felina de los
gatos. Cuatro enfermedades priónicas que se sabe afectan a los
humanos son (1) el kuru, (2) la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob ("CJD"), (3) la enfermedad de
Gerstmann-Straussler-Schinker
("GSS") y (4) el insomnio familiar fatal ("FFI"). Tal como
se usa aquí, "prion" incluye todas las formas de priones que
causan todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en
cualquier animal utilizado -y, en particular, en humanos y en
animales de granja.
El término "gen PrP" es usado aquí para
describir material genético que expresa proteínas, incluyendo
polimorfismos conocidos y mutaciones patogénicas. El término "gen
PrP" se refiere, en general, a cualquier gen de cualquier
especie que codifique para cualquier forma de una proteína PrP.
Algunas secuencias PrP comúnmente conocidas están descritas en
Gabriel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
9097-9101 (1992), y en las Patentes EE.UU.
5.565.186, 5.763.740 y 5.792.901 y en WO97/04814, cuya referencia se
da por la exposición y la descripción de dichas secuencias. El gen
PrP puede proceder de cualquier animal, incluyendo los animales
"hospedadores" y "de ensayo" aquí descritos y cualquier
polimorfismo y mutación del mismo, reconociéndose que los términos
incluyen otros genes PrP de este tipo aún por descubrir. La
proteína expresada por dicho gen puede asumir una forma PrP^{c}
(no ligada a la enfermedad) o una forma PrP^{Sc} (ligada a la
enfermedad).
El término "anticuerpo" significa una
proteína inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno. El
anticuerpo, tal como se utiliza aquí, pretende incluir la totalidad
del anticuerpo, así como cualquier fragmento del anticuerpo (por
ejemplo, F(ab)', Fab, Fv) capaz de unirse al epitopo,
antígeno o fragmento antigénico de interés. Los anticuerpos
preferidos para los ensayos de la invención son inmunorreactivos o
inmunoespecíficos y, por lo tanto, se unen especifica y
selectivamente a una proteína de interés, por ejemplo una proteína
A4\beta amiloide o una proteína PrP. Se prefieren los anticuerpos
que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos tanto para la forma
nativa no ligada a la enfermedad como para la forma tratada ligada a
la enfermedad, pero no para la forma no tratada ligada a la
enfermedad (por ejemplo, para la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc}
no tratada, pero no para la PrP^{Sc} nativa). Los anticuerpos son
preferiblemente inmunoespecíficos -por ejemplo, sin reacción cruzada
substancial con materiales relacionados. Algunos anticuerpos
específicos que pueden ser usados en relación a la invención están
descritos en la solicitud PCT publicada WO 97/10505, cuya
referencia es incluida por su exposición y descripción de
anticuerpos. Los anticuerpos descritos en la solicitud PCT que se
unen selectivamente a PrP^{Sc} no deben ser usados para realizar
el ensayo básico de la presente invención, pero podrían ser usados
para confirmar la presencia de PrP^{Sc} cuando se desnaturalizan
otras proteínas. El término "anticuerpo" abarca todos los
tipos de anticuerpos, por ejemplo policlonales, monoclonales y los
producidos por metodología de exhibición de fagos. Son anticuerpos
particularmente preferidos de la presente invención los anticuerpos
que tienen un grado relativamente alto de afinidad tanto por la
PrPC nativa como por la PrP^{Sc} tratada, pero un grado
relativamente bajo de afinidad de unión, o substancialmente ninguna,
por la PrP^{Sc}. Más concretamente, los anticuerpos de la
invención tienen cuatro veces o más, más preferiblemente quince
veces o más, y aún más preferiblemente 30 veces o más, de afinidad
de unión por la PrP^{c} nativa y por la PrP^{Sc} desnaturalizada
en comparación con la afinidad de unión por la PrP^{Sc}
nativa.
Otro anticuerpo útil para unirse a PrP^{c} es
el anticuerpo monoclonal 263K 3F4, producido por la línea celular de
hibridoma ATCC HB9222, depositada el 8 de Octubre de 1986 en la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD 20852 y expuesta y descrita en la Patente EE.UU. 4.806.627,
concedida el 21 de Febrero de 1989, aquí incluida como referencia
por su descripción de anticuerpos que se unen selectivamente a
PrP^{c}.
"Anticuerpo purificado" se refiere a aquél
que está suficientemente libre de otras proteínas, carbohidratos y
lípidos con los que se asocia de forma natural. Dicho anticuerpo
"se une preferiblemente" a una conformación ligada a la
enfermedad tratada o desnaturalizada de una proteína, tal como la
conformación \beta-laminar de A4\beta o de la
proteína PrP^{Sc} (o un fragmento antigénico de éstas) y no
reconoce o se une substancialmente a otras moléculas antigénicamente
no relacionadas. Un anticuerpo purificado de la invención es
preferiblemente inmunorreactivo con, e inmunoespecífico para, una
especie, y más preferiblemente inmunoespecífico para la PrP^{c}
nativa y para las formas tratadas o desnaturalizadas de PrP^{c} y
PrP^{Sc}, pero no para la PrP^{Sc} nativa o no tratada.
"Fragmento antigénico" de una proteína (por
ejemplo, una proteína PrP^{c}) significa una porción de dicha
proteína que es capaz de unirse a un anticuerpo.
Por "se une específicamente" se quiere decir
una alta avidez y/o una alta afinidad de unión de un anticuerpo a un
polipéptido específico, por ejemplo a un epitopo de una proteína,
por ejemplo una proteína PrP^{c} o A4\beta. La unión del
anticuerpo a su epitopo sobre este polipéptido específico es
preferiblemente más potente que la unión del mismo anticuerpo a
cualquier otro epitopo, particularmente a los que pueden estar
presentes en moléculas en asociación con, o en la misma muestra de,
el polipéptido específico de interés; por ejemplo, se une más
fuertemente a fragmentos epitópicos de una proteína tal como
PrP^{Sc}, de tal forma que, ajustando las condiciones de unión,
el anticuerpo se une casi exclusivamente a un sitio epitópico o a
fragmentos de una proteína deseada, tal como un fragmento epitópico
expuesto por tratamiento de PrP^{Sc} y no expuesto en la
PrP^{Sc} nativa no tratada.
Por "anticuerpo detectablemente marcado",
"anti-PrP detectablemente marcado" o
"fragmento anti-PrP detectablemente marcado" se
entiende un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que conserva la
especificidad de unión) que tiene unido un marcaje detectable. El
marcaje detectable es normalmente unido por conjugación química,
pero, cuando el marcaje es un polipéptido, podría unirse
alternativamente por técnicas de ingeniería genética. Los métodos
para la producción de proteínas detectablemente marcadas son bien
conocidos en la técnica. Los marcajes detectables conocidos en la
técnica son normalmente radioisótopos, fluoróforos, marcajes
paramagnéticos, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante)
u otros restos o compuestos que, o bien emiten una señal detectable
(por ejemplo, radiactividad, fluorescencia, color), o bien emiten
una señal detectable tras la exposición del marcaje a su substrato.
En la técnica se conocen diversas parejas de marcaje
detectable/substrato (por ejemplo, peroxidasa de rábano
picante/diaminobencidina, avidina/estreptavidina,
luciferasa/luciferina), métodos para marcar anticuerpos y métodos
para usar anticuerpos marcados (véase, por ejemplo, Harlow y Lane,
eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El europio es un marcaje
particularmente preferido.
- Las abreviaturas aquí utilizadas incluyen:
- SNC para sistema nervioso central,
- BSE para encefalopatía espongiforme bovina,
- CJD para enfermedad de Creutzfeldt-Jacob,
- FFI para insomnio familiar fatal,
- GdnHCl para clorhidrato de guanidina,
- GSS para enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker,
- Hu para humano,
- HuPrP para la proteína priónica humana,
- Mo para ratón,
- MoPrP para proteína priónica de ratón,
- SHa para hámster Sirio,
- SHaPrP para proteína priónica de hámster Sirio,
- Tg para transgénico,
- Tg(SHaPrP) para un ratón transgénico que contiene el gen PrP de un hámster Sirio,
- Tg(HuPrP) para ratones transgénicos que contienen el gen PrP humano completo,
- Tg(ShePrP) para ratones transgénicos que contienen el gen PrP de oveja completo,
- Tg(BovPrP) para ratones transgénicos que contienen el gen PrP de vaca completo,
- PrP^{Sc} para la isoforma del scrapie de la proteína priónica,
- PrP^{c} para la isoforma normal común contenida en la célula de la proteína priónica,
- PrP 27-30 o PRPSc 27-30 para la forma resistente al tratamiento o a proteasas de PrP^{Sc},
- MoPrP^{Sc} para la isoforma del scrapie de la proteína priónica del ratón,
- MHu2M para un gen PrP quimérico murino/humano donde una región del gen PrP murino está substituida por una secuencia humana correspondiente que difiere del PrP del ratón en 9 codones,
- los ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos de la invención que incluyen el gen quimérico MHu2M,
- MHu2MPrP^{Sc} para la isoforma del scrapie del gen PrP quimérico humano/murino,
- PrP^{CJD} para la isoforma CJD de una proteína PrP,
- Prnp^{0/0} para la ablación de ambos alelos de un gen de proteína priónica endógeno, por ejemplo el gen MoPrP,
- Tg(SHaPrP^{+/0})81/Prnp^{0/0} para una línea particular (81) de ratones transgénicos que expresan SHaPrP, +/0 indica heterozigótico.
- Tg(HuPrP)/Prnp^{0/0} para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de proteína priónica humano (HuPrP) con un ratón con ambos alelos del gen de la proteína priónica endógeno alterados,
- Tg(MHu2M)/Prnp^{0/0} para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de proteína priónica quimérico (MHu2M) con un ratón que tiene ambos alelos del gen de la proteína priónica endógeno alterados.
- TTR para la transtiretina,
- FVB para una cepa endogámica estándar de ratones usada frecuentemente en la producción de ratones transgénicos, ya que los huevos de los ratones FVB son relativamente grandes y toleran la microinyección de ADN exógeno relativamente bien,
- [PrP_{\beta}] - concentración de proteína priónica en conformación \beta-laminar,
- [\betaA4_{\beta}] - concentración de \betaA4 en conformación \beta-laminar,
- [DRC] - concentración de una conformación de una proteína ligada a la enfermedad.
El método de ensayo consiste en disponer de una
muestra sospechosa de contener una proteína que asume una primera
conformación y una segunda conformación ligada a enfermedad y es
capaz de detectar una conformación ligada a enfermedad de una
proteína cuando está presente en una concentración muy baja en
relación a la concentración de la conformación no ligada a la
enfermedad. Se divide la muestra en una primera porción y una
segunda porción. La primera porción se une preferiblemente a la
superficie del soporte sólido y a continuación se la pone en
contacto con un anticuerpo marcado. El anticuerpo es de un tipo que
se une a la proteína en su primera conformación con un grado de
afinidad mayor (cuatro veces o más) que con la que se une a la
proteína en su segunda conformación ligada a enfermedad. La segunda
porción de la muestra es entonces sometida a un tratamiento de
despliegue que hace que cualquier proteína en la segunda
conformación ligada a enfermedad asuma una conformación diferente,
cuya conformación tiene un grado mayor de afinidad (cuatro veces o
más superior) por el anticuerpo marcado en comparación con la
afinidad por la proteína en la segunda conformación no tratada
ligada a la enfermedad. La segunda porción (sometida al tratamiento
de despliegue) se une entonces, preferiblemente, a la superficie
del soporte sólido. La proteína tratada unida al soporte contacta
entonces con un anticuerpo marcado en condiciones que permiten que
el anticuerpo se una a las proteínas en la primera conformación o a
las proteínas en la conformación no plegada.
Después de dar a los anticuerpos marcados tiempo,
temperatura y condiciones químicas (por ejemplo, pH) suficientes
para unirse a las proteínas presentes en las respectivas porciones,
se determina el nivel de unión del anticuerpo marcado a la proteína
en cada porción. Se usa un ensayo altamente sensible, tal como un
ensayo que implica fluorescencia con resolución temporal y mayor
disociación o un fluorómetro de doble longitud de onda accionado
por láser, que hace posible detectar concentraciones en una
cantidad en el rango de aproximadamente 1 x 10^{3} partículas por
ml o menos. Se requiere un alto grado de sensibilidad, ya que, en
la mayoría de las muestras, la concentración de proteína en la
conformación ligada a la enfermedad será muy baja en comparación
con la concentración de la proteína en la conformación no ligada a
la enfermedad, por ejemplo de 3 órdenes de magnitud o más de
diferencia. Por ejemplo, la conformación no ligada a la enfermedad
de la proteína podría estar presente en una cantidad de
aproximadamente 1 x 10^{8} partículas/ml, mientras que la
conformación ligada a la enfermedad de la proteína está sólo
presente en una cantidad de 1 x 10^{4} partículas/ml. Así,
cualquier aumento de señal observado debido al sometimiento de la
conformación ligada a la enfermedad de la proteína a un tratamiento
de despliegue será muy pequeño en relación a la señal obtenida de
la proteína en la conformación no ligada a la enfermedad.
Después de obtener el nivel de unión para ambas
porciones de la muestra, se comparan los niveles. Por ejemplo, se
resta el nivel de unión del anticuerpo marcado a una proteína en la
primera porción del nivel de unión del anticuerpo a una proteína en
la segunda porción. La diferencia entre los dos refleja la cantidad
de proteína presente en la muestra original que estaba en la segunda
conformación ligada a la enfermedad -después de ajustar en cuanto a
las diferencias causadas (de haberlas) por el aumento de la
afinidad de unión de la proteína en la primera porción.
Más concretamente, con algunas proteínas puede
haber algunas diferencias debidas al efecto del tratamiento de
despliegue sobre las proteínas que están en la conformación nativa
no ligada a la enfermedad -por ejemplo, están expuestos más
epitopos de la proteína en la conformación ligada a la enfermedad
gracias al tratamiento. Esta diferencia debe ser tenida en cuenta
al sacar conclusiones con respecto a si la muestra original incluía
proteínas en la segunda conformación ligada a la enfermedad. La
consideración de este efecto es mostrada en las Figuras 3 y 4. En la
Fig. 3, se muestra una comparación de la unión de anticuerpos a una
muestra no tratada que contiene sólo proteína nativa en su
configuración no ligada a la enfermedad con la misma proteína
nativa después del tratamiento de despliegue. Tal como se muestra en
la Fig. 3, existe alguna diferencia entre los resultados obtenidos
con la proteína tratada que muestra una señal más potente, en el
sentido de que el tratamiento de despliegue aumentó la afinidad de
unión de la proteína. Sin embargo, la Fig. 4 muestra los mismos
resultados cuando la muestra original incluía proteínas que estaban
en la segunda conformación ligada a enfermedad. Las proteínas
nativas ligadas a enfermedad (PrP^{Sc}) que no son sometidas al
tratamiento de despliegue dan una señal muy débil. Sin embargo, las
proteínas PrP^{Sc} tratadas en despliegue dan una señal muy
fuerte. La gran diferencia entre las muestras de PrP^{Sc}
tratadas en despliegue y las de las no tratadas o nativas es una
clara indicación de que la muestra original incluía proteínas con la
segunda conformación ligada a la enfermedad, en el sentido de que
estas proteínas no se unen a anticuerpos o se unen a anticuerpos
con un grado muy bajo de afinidad de unión. Sin embargo, después del
tratamiento de despliegue estas proteínas se unen a los anticuerpos
tan bien o casi tan bien o mejor que las proteínas en la
conformación no ligada a la enfermedad que fueron tratadas mediante
el tratamiento de despliegue.
El ensayo puede ser usado para estudiar la
presencia de la conformación ligada a enfermedad de una proteína
dada en cualquier tipo de muestra. Algunas de las muestras más
típicas estudiadas incluyen productos farmacéuticos que incluyen
componentes que derivan de mamíferos vivos o que usan materiales
derivados de mamíferos vivos en su procesado. Sería también deseable
estudiar órganos para trasplante y artículos alimentarios, tales
como una carne de vaca sospechosa de contener priones infecciosos.
La invención podría ser usada para estudiar la presencia de la
conformación ligada a la enfermedad de uno o más tipos de proteínas,
tales como PrP^{Sc} infecciosa, en productos farmacéuticos,
cosméticos, tejidos de biopsias o de autopsias, cerebro, médula
espinal, nervios periféricos, músculo, fluido cerebroespinal,
sangre y componentes sanguíneos, nódulos linfáticos y en cultivos
derivados de animales o de humanos infectados o potencialmente
infectados por las formas ligadas a enfermedad de proteínas tales
como priones.
Un ensayo de la invención puede usar todos y cada
uno de los tres tipos básicos de tratamiento que se han definido
anteriormente. Los tratamientos son (1) pretratamiento, (2)
tratamiento de despliegue y (3) tratamiento limitado con proteasas.
En general, las condiciones del pretratamiento son suaves, las del
tratamiento de despliegue moderadas y las del tratamiento limitado
con proteasas severas. Cada tipo de tratamiento puede emplear los
mismos medios (por ejemplo, proteasas, tiempo, temperatura, etc.),
pero emplea cada uno de ellos en un grado diferente, por ejemplo,
una mayor concentración, tiempo más prolongado o temperatura
superior.
El tratamiento de despliegue desnaturaliza la
proteína, pero no hidroliza las proteínas de interés, y puede
incluir la exposición de las proteínas a cualquier medio físico y/o
químico que haga que la proteína originalmente presente en una
conformación apretada ligada a la enfermedad asuma una conformación
más relajada que tiene un mayor grado de afinidad de unión por
cualquier compañero de unión, tal como anticuerpos. En general, el
tratamiento de despliegue implica someter la proteína a algún medio
que haga que los epitopos que hay sobre la proteína que no estaban
previamente expuestos o que lo estaban parcialmente queden expuestos
o queden más expuestos, de tal forma que un anticuerpo u otro
compañero de unión se pueda unir más fácilmente al epitopo recién
expuesto.
Los métodos usados para el tratamiento de
despliegue pueden incluir: (1) métodos físicos, tales como presión
hidrostática o temperatura, (2) químicos, tales como pH ácido o
alcalino, sales caotrópicas, detergentes desnaturalizantes,
clorhidrato de guanidina y proteinasas, tales como la proteinasa K,
y (3) combinaciones de los anteriores.
El tiempo de tratamiento variará dependiendo del
tratamiento utilizado, pero éste debe ser llevado a cabo durante un
tiempo suficiente para obtener el efecto deseado, por ejemplo, para
que el tratamiento de despliegue exponga nuevos sitios de unión,
pero no tanto como para desnaturalizar o hidrolizar completamente
la proteína. Cuando se lleva a cabo el tratamiento de despliegue
sobre proteínas PrP sin tratamiento químico, se eleva la
temperatura a aproximadamente 40ºC hasta aproximadamente 80ºC
durante un tiempo suficiente para obtener la cantidad deseada de
despliegue de la PrP^{Sc}. La temperatura puede ser inferior y el
tiempo más corto si se eleva el pH a 12 ó 13.
Antes de llevar a cabo el tratamiento o el
estudio con anticuerpos de cualquier porción de la muestra, puede
ser deseable someter la muestra a un pretratamiento. El
pretratamiento es llevado a cabo para destruir o eliminar las
proteínas no relacionadas, así como algo de la forma no ligada a la
enfermedad de la proteína presente en la muestra. Como ejemplos de
metodología de pretratamiento se incluyen la producción de una
columna que incluye anticuerpos unidos a superficies de soporte,
cuyos anticuerpos se unen a la conformación no ligada a la
enfermedad de la proteína, eliminando así tanta conformación no
ligada a la enfermedad de las proteínas como sea posible. Se pueden
usar también anticuerpos que se unen a proteínas no relacionadas
pero comunes. Alternativamente, la muestra puede ser sometida a
tratamiento físico, tal como presión hidrostática a largo plazo o
temperatura sola o en combinación con agentes químicos, tales como
ácidos o álcalis según se ha indicado antes, para destruir las
proteínas presentes en la muestra, cuyas proteínas no están
relacionadas con las que están siendo estudiadas o están en la
conformación no ligada a la enfermedad. En algunos casos, se
destruirán proteínas en la conformación no ligada a la enfermedad y
ligada a la enfermedad. Sin embargo, se destruirá un porcentaje
relativo mayor de las proteínas en la conformación no ligada a la
enfermedad, ya que estas proteínas están inicialmente en una
conformación más laxa, que es más vulnerable a la destrucción. Así,
la metodología del pretratamiento da lugar a una muestra que incluye
una concentración relativamente inferior de la conformación no
ligada a la enfermedad de la proteína en relación a la
concentración de la conformación ligada a la enfermedad de la
proteína. Esto aumenta la sensibilidad del ensayo, haciendo posible
la detección de cantidades menores de la conformación ligada a la
enfermedad de la proteína. Se prefiere la eliminación de las
proteínas frente a la destrucción de éstas, en el sentido de que la
destrucción reducirá la sensibilidad si se destruye la conformación
ligada a la enfermedad. Se describe un método de pretratamiento
particularmente útil en nuestra WO 99/42487, titulada
"Procedimiento para concentrar proteína con conformación ligada a
la enfermedad".
El tratamiento limitado con proteasas es un
tratamiento lítico que representa el método de tratamiento más
severo usado en la preparación de muestras para los ensayos de la
invención. Después de haber sometido una porción de una muestra al
tratamiento de pretratamiento, se divide ésta en dos porciones y se
somete una de las dos porciones al tratamiento de despliegue. Si el
ensayo básico muestra que la proteína ligada a la enfermedad está
presente en la muestra, entonces se determina la cantidad total (o
concentración) de la proteína ligada a la enfermedad. Se somete
entonces otra porción de la muestra original o de la proteína ligada
a la enfermedad total aislada a un tratamiento limitado con
proteasas. Este tratamiento destruirá o hidrolizará toda o
substancialmente toda la proteína de la muestra, salvo la proteína
ligada a la enfermedad resistente al tratamiento limitado con
proteasas (por ejemplo, PrP 27-30). Se determina
entonces la cantidad (o concentración) de esta proteína resistente
a proteasas y se resta de la cantidad total de proteína ligada a la
enfermedad para hallar la proteína ligada a la enfermedad sensible
a proteasas (por ejemplo, PrP^{Sc} sensible a proteasas). El
tratamiento limitado con proteasas o el tratamiento lítico puede
incluir (1) métodos químicos, tales como la exposición a pH extremos
(por ejemplo, 2 o menos o 12 o más) o a compuestos fuertemente
reductores u oxidantes, y/o (2) métodos enzimáticos, tales como
proteasas (por ejemplo, proteinasa K). La concentración de los
compuestos de tratamiento, así como el tiempo y la temperatura,
variarán con la proteína que esté siendo tratada y el resultado
final que haya que obtener. Cuando se tratan proteínas PrP, se
lleva a cabo el tratamiento para (1) hidrolizar todas o
substancialmente todas las proteínas no PrP presentes en la muestra,
(2) hidrolizar todas o substancialmente todas las
no-PrP^{c} presentes, (3) hidrolizar la
PrP^{Sc} sensible a proteasas presente y (4) hidrolizar los 65
aminoácidos N-terminales de la PrP^{Sc}
resistente a proteasas presente, dejando así sólo PrP
27-30 no hidrolizada.
El tratamiento limitado con proteasas puede ser
realizado, al igual que el tratamiento o el pretratamiento de
despliegue, con temperatura. Por ejemplo, se puede obtener la
hidrólisis de proteínas PrP calentando por encima de 80ºC a 132ºC
durante 1 a 3 días. El tiempo y la temperatura pueden reducirse
significativamente elevando el pH a 12 ó 13. El objeto de este
tratamiento es hacer algo más que desplegar proteínas e hidrolizar
proteínas.
El método de acoplamiento químico o por afinidad
de proteínas PrP al soporte de plástico está generalmente descrito
en la literatura disponible y puede variar. Los anticuerpos usados
en el ensayo diagnóstico son Fab policlonales, monoclonales o
recombinantes y necesitan ser específicos de especie con unión
preferente a la PrP^{c} nativa o a la forma desnaturalizada de la
PrP^{Sc} preferiblemente con una reactividad al menos 4 veces
mayor con la PrP^{Sc} infecciosa, suponiendo la misma cantidad de
antígeno.
Un aspecto de la invención es un procedimiento en
dos etapas para diagnosticar la enfermedad priónica midiendo
cuantitativamente la forma infecciosa nativa de la proteína
PrP^{Sc} en material de muestra o en los cerebros de animales
susceptibles inoculados con dicho material. La muestra es
preferiblemente pretratada para eliminar la mayor cantidad posible
de proteína no relacionada y no ligada a la enfermedad. La muestra
pretratada es dividida en dos alícuotas. La primera alícuota es
entrecruzada con el soporte sólido de plástico en la conformación
nativa a través de una etapa de activación química en condiciones
no desnaturalizantes, es decir, sin tratamiento. La segunda porción
de la muestra es primeramente sometida a un tratamiento de
despliegue y luego entrecruzada al soporte de plástico. Ambas
porciones del material de muestra reaccionan in situ con los
anticuerpos marcados, que reconocen preferentemente la PrP^{c}
nativa o la PrP^{Sc} tratada en despliegue de la especie animal
dada. La cantidad del anticuerpo unido a las conformaciones tratada
en despliegue o nativa de la proteína PrP es registrada por la
señal del marcaje IgG. El exceso de la señal obtenida con la
porción de la muestra sometida al tratamiento de despliegue sobre
la esperada de un aumento de la señal obtenida con la conformación
nativa \alpha-helicoidal de PrP^{c} (es decir,
el aumento sobre la cantidad ajustada) es la medida de la cantidad
de PrP^{Sc} infecciosa con estructura
\beta-laminar en la muestra original. La fórmula
desarrollada para el cálculo del contenido en PrP^{Sc} es mostrada
en las fórmulas aquí facilitadas y está ejemplificada en el
Ejemplo 11.
Ejemplo 11.
El diagnóstico de la presencia de priones se
establece por tres procedimientos: (1) medición de la muestra
tratada sola y detección del aumento en la cantidad de PrP total en
la muestra examinada por encima de los niveles de fondo de
PrP^{c} obtenidos de controles normales; (2) cálculo de la razón
entre la señal desnaturalizada y la nativa para un anticuerpo dado
-por ejemplo, valores mayores de 2,2 para IgG 3F4 marcada con
europio indican la presencia de PrP^{Sc} usando preferiblemente
fluorescencia con resolución temporal y disociación aumentada, y
(3) evaluación del exceso de la señal de la muestra desnaturalizada
sobre el esperado de un aumento en la señal para la conformación
\alpha-helicoidal de PrP^{c} como medida de la
cantidad de PrP^{Sc} infecciosa con estructura
\beta-laminar en la muestra original.
Preferiblemente, antes de la etapa (1) el método utiliza una etapa
de pretratamiento mediante el cual se elimina o destruye la
PrP^{c} en cantidades relativas mayores de la de la
PrP^{Sc}.
En el cerebro de hámster Sirio infectado con
scrapie, la concentración de PrP^{Sc} es 5-10
veces mayor que la de PrP^{c} cuando los animales enferman. En
este momento, el título de priones en los cerebros es de
10^{7}-10^{8} unidades de DI_{50}/ml de
homogeneizado al 10%. El sistema altamente cuantitativo que hemos
desarrollado nos permite restar la señal PrP^{Sc}. La resta puede
ser fácilmente llevada a cabo cuando la concentración de PrP^{Sc}
es mayor que la de PrP^{c}. Sin embargo, la resta se hace difícil
cuando la concentración de PrP^{Sc} es mucho menor que la de
PrP^{c}.
Para abordar el anterior problema, el presente
ensayo utiliza el principio de afinidad entre diferentes
conformaciones de antígeno y anticuerpo. Para medir la
concentración de PrP^{Sc} cuando es mucho menor que la de
PrP^{c}, el sistema de detección tiene que tener una extremada
sensibilidad y un rango lineal de al menos 10^{4}. El ensayo aquí
descrito puede fácilmente detectar PrP^{Sc} a una concentración
de (aproximadamente) 50 pg/ml usando IgG marcada con europio.
Suponiendo 10^{5}-10^{6} moléculas de
PrP^{Sc} por unidad de DI_{50}, el presente ensayo puede
detectar fácilmente 5 x 10^{2} - 5 x 10^{3} unidades de
DI_{50} por ml.
El ensayo puede detectar PrP^{Sc} en mezclas
(por el método directo) donde la concentración de PrP^{Sc} es
menor del 1% de la concentración de PrP^{c}. Se puede conseguir
sensibilidad adicional por inmunoprecipitación usando un formato en
emparedado para un ensayo de estado sólido, centrifugación
diferencial con extracción con detergentes para eliminar la
PrP^{c}, el método indirecto con animales transgénicos o
combinaciones de éstos. Una estimación conservadora es que dichos
procedimientos deben permitir la medición de entre 5 y 50 unidades
de DI_{50} por ml o, de un modo menos conservador, medir entre
0,1 y 0,01 unidades de DI_{50} por ml. Dichas mediciones deben
proporcionar un medio "positivo" rápido de establecimiento de
esterilidad biológica, que es la "ausencia" de
infectividad.
Los métodos de generación de anticuerpos son
generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Al ser
frecuentemente la forma ligada a la enfermedad una configuración
más apretada que la forma no ligada a la enfermedad, con menos
epitopos expuestos, se pueden generar fácilmente anticuerpos que se
unen sólo a la forma no ligada a la enfermedad de la proteína o a la
forma tratada ligada a la enfermedad. Por ejemplo, se pueden
generar anticuerpos que detectan formas tratadas de la proteína
PrP^{Sc} y proteína PrP^{c} inmunizando conejos o ratones con la
conformación \alpha-helicoidal de PrP
recombinante, PrP^{c} nativa de cerebros de animales, péptidos
sintéticos en conformación \alpha-helicoidal o de
arrollamiento aleatorio o frente a PrP^{Sc} desnaturalizada o PrP
27-30. Sólo los anticuerpos con una afinidad al
menos 4 veces mayor por la PrP^{c} (o la conformación
desnaturalizada de la PrP^{Sc} de la misma especie) en
comparación con su afinidad por la PrP^{Sc} deberán ser
seleccionados. El método de generación, purificación, marcaje y
detección de anticuerpos pueden variar.
La IgG o los Fab's pueden ser purificados de
diferentes fuentes por HPLC de afinidad usando una columna de
proteína A y HPLC de exclusión por tamaños. Los anticuerpos
purificados pueden ser marcados con europio y detectados por
fluorescencia con resolución temporal. La unión de anticuerpos a
diferentes conformaciones de proteína PrP puede ser medida por
fluorescencia con resolución temporal y disociación aumentada. Sin
embargo, el sistema de detección de IgG unida a PrP sobre un
soporte sólido in situ o en solución puede variar. Además, es
posible usar métodos inmunológicos directos o indirectos,
incluyendo radiomarcajes directos, fluorescencia, luminiscencia,
amplificación con avidina-biotina o ensayos ligados
a enzimas con substratos coloreados o luminiscentes.
Se describe un anticuerpo que puede ser usado en
la invención en US 4.806.627, concedida el 21 de Febrero de 1989,
que describe el anticuerpo monoclonal 263K 3F4, producido por la
línea celular ATCC HB9222, depositada el 8 de Octubre de 1986. La
línea celular productora del anticuerpo puede ser obtenida de la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD 20852.
En general, la infección con scrapie no consigue
producir una respuesta inmune en organismos hospedadores tolerantes
a la PrP^{Sc} de la misma especie. Los anticuerpos que se unen a
PrP^{c} o a PrP^{Sc} están descritos en WO97/10505, publicada
el 20 de Marzo de 1997. Se puede usar cualquier anticuerpo que se
una a PrP^{c} y no a PrP^{Sc} y los expertos en la técnica
pueden generarlos usando procedimientos conocidos; por ejemplo,
véanse los métodos de producción de librerías de anticuerpos con
exhibición de fagos en US 5.223.409. Se han producido, sin embargo,
anticuerpos policlonales anti-PrP en conejos tras la
inmunización con grandes cantidades de SHaPrP 27-30
desnaturalizada con ácido fórmico o con SDS [Bendheim, Barry y col.
(1984), Nature 310: 418-421; Bode, Pocchiari
y col. (1985), J. Gen. Virol. 66: 2471-2478;
Safar, Ceroni y col. (1990), Neurology 40:
513-517]. De forma similar, se ha producido una
cantidad de anticuerpos monoclonales anti-PrP frente
a PrP 27-30 en ratones [Barry y Prusiner (1986),
J. Infect. Dis. 154: 518-521; Kascsak,
Rubinstein y col. (1987), J. Virol. 61:
3688-3693]. Estos anticuerpos fueron generados
frente a la PrP 27-30 desnaturalizada con ácido
fórmico o con SDS y pueden reconocer la PrP^{c} nativa y la
PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada tanto de SHa como de humanos
por igual, pero no se unen a MoPrP. No es sorprendente que los
epitopos de estos anticuerpos fueran mapeados en regiones de la
secuencia que contienen diferencias de aminoácidos entre SHa- y
MoPrP [Rogers, Yehiely y col. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 3182-3186].
No está totalmente claro por qué muchos
anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones antes citadas se
unen a la PrP^{c} y a la PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada,
pero no a la PrP^{Sc} nativa. Sin inclinarnos por ninguna teoría
en particular, se sugiere que esto puede tener lugar porque los
epitopos que quedan expuestos cuando la proteína está en la
conformación PrP^{c} no están expuestos o están parcialmente
escondidos en la configuración PrP^{Sc} -donde la proteína es
relativamente insoluble y está plegada de un modo más compacto.
Para los fines de la invención, una indicación de
que no se produce unión significa que la constante de equilibrio o
de afinidad K_{a} es de 10^{6} l/mol o menos. Además, se
reconocerá que la unión existe cuando la K_{a} es de 10^{7}
l/mol o más, preferiblemente de 10^{8} l/mol o más. La afinidad
de unión de 10^{7} l/mol o más puede ser debida a (1) un solo
anticuerpo monoclonal (es decir, grandes números de un tipo de
anticuerpos), o (2) una pluralidad de diferentes anticuerpos
monoclonales (por ejemplo, grandes números de cada uno de cinco
anticuerpos monoclonales diferentes), o (3) grandes números de
anticuerpos policlonales. Es también posible usar una combinación
de (1)-(3). Los anticuerpos preferidos seleccionados se unirán con
una avidez al menos 4 veces mayor a las formas de PrP^{Sc}
tratadas o desnaturalizadas de la proteína en comparación con su
unión a la conformación nativa de PrP^{Sc}. La diferencia de
cuatro veces en la afinidad de unión puede ser conseguida usando
varios anticuerpos diferentes según los (1)-(3) anteriores y, como
tal, algunos de los anticuerpos en una mezcla podrían tener una
diferencia de menos de 4 veces.
Se puede usar una variedad de tipos diferentes de
ensayos de la invención con uno o más anticuerpos diferentes. Los
expertos en la técnica reconocerán que los anticuerpos pueden ser
marcados con marcajes conocidos y usados con la robótica, ensayos en
emparedado, detectores electrónicos, citometría de flujo, etc.
actualmente disponibles.
Empleando la metodología descrita anteriormente,
es posible calcular la diferencia entre la cantidad de señal
obtenida de una muestra que no ha sido tratada y la señal obtenida
de una muestra que ha sido tratada. Esta diferencia representa
(después de ajustar en cuanto al efecto del tratamiento sobre la
conformación no ligada a la enfermedad) la cantidad (concentración)
de proteína en conformación ligada a la enfermedad presente en la
muestra original. Después de obtener la diferencia, se puede usar
la fórmula a continuación expuesta para calcular la cantidad de
proteína en la conformación ligada a la enfermedad presente en la
muestra original por unidad de volumen.
a)
\hskip1,5cmF_{n} = F_{n\alpha} + F_{n\beta} \rightarrow F_{n\alpha} = F_{n} - F_{n\beta}, F_{n\beta} \sim fondo
b)
\hskip1,5cmF_{d} = F_{d\alpha} + F_{d\beta}
\Delta F_{n\rightarrow d} =
\Delta F_{\alpha n\rightarrow d} + \Delta F_{\beta n\rightarrow
d}
\Delta F_{\beta n\rightarrow
d} = F_{d} - F_{n}- \Delta F_{\alpha n\rightarrow
d}
[PrP_{\beta}] o [DRC] \sim \Delta F_{\beta
n \rightarrow d} = F_{d} - (F_{n} * f_{\alpha n\rightarrow
d})
La definición de cada una de las variables
anteriores es facilitada a continuación.
| F - | señal de fluorescencia (obsérvese que se podría usar cualquier señal detectable); |
| F_{n} - | señal de fluorescencia de la conformación nativa; |
| F_{n\alpha} y F_{n\beta} - | señales de fluorescencia de las conformaciones nativas \alpha-helicoidal y \beta-laminar; |
| F_{d} - | señal de fluorescencia de PrP en el estado tratado o desnaturalizado; |
| F_{d\alpha} y F_{d\beta} - | son las señales de los estados \alpha-helicoidal y \beta-laminar desnaturalizados de PrP; |
| \DeltaF_{n\rightarrow d} - | aumento de la señal de fluorescencia en la transición del estado nativo al desnaturalizado; |
| \DeltaF_{\alpha n\rightarrow d} - | aumento en la señal de fluorescencia de la conformación \alpha-helicoidal en la transición del estado |
| nativo al desnaturalizado; | |
| \DeltaF_{\beta n\rightarrow d} - | aumento en la señal de la conformación \beta-laminar en la transición del estado nativo al |
| desnaturalizado; | |
| f_{\alpha n\rightarrow d} - | factor de correlación para la transición del estado nativo al desnaturalizado de la PrP \alpha-helicoidal; |
| [PrP_{\beta}] - | concentración de proteína priónica en conformación \beta-laminar; |
| [DRC] - | concentración de cualquier proteína en conformación ligada a la enfermedad; |
| \sim - | proporcional a; |
| * - | múltiple. |
La fórmula dada anteriormente es usada para
calcular específicamente la concentración de proteína priónica en la
conformación \beta-laminar. Sin embargo, las
mismas fórmulas pueden ser usadas para calcular la concentración de
cualquier proteína, es decir, la concentración de cualquier
conformación constreñida ligada a la enfermedad de una proteína,
tal como una [\betaA4_{\beta}]. Más en general, [DRC]
representa la concentración de la conformación ligada a enfermedad
de una proteína.
Para dar un ejemplo específico, las anteriores
definiciones son dadas concretamente con respecto a proteínas PrP,
cuyas proteínas incluyen al menos una conformación relajada no
ligada a enfermedad (PrP^{c}) que incluye una conformación
\alpha-helicoidal y al menos una conformación
constreñida ligada a la enfermedad (PrP^{Sc}) que incluye una
conformación \beta-laminar. Las fórmulas son
usadas para calcular la concentración de la conformación ligada a
la enfermedad de la proteína presente en la muestra. Según las
fórmulas y definiciones específicas antes dadas, las fórmulas son
usadas para calcular la concentración de proteínas priónicas que
incluyen la configuración \beta-laminar (véase el
Ejemplo 11).
La señal usada en el cálculo de la fórmula
anterior es una señal fluorescente. Sin embargo, se puede usar
cualquier señal detectable. La señal total está representada por
F_{n}, que es una combinación de la señal recibida de la
conformación ligada a la enfermedad y de la no ligada a la
enfermedad. Ésta es una señal que se calcularía a partir de la
porción Nº 1 que no está tratada por el ensayo antes descrito. La
variable F_{d} es la señal que se obtiene tratando la porción Nº
2 de la muestra. Esta señal es una combinación de la señal recibida
de la proteína tratada en la conformación no ligada a la enfermedad
más la proteína tratada en la conformación ligada a la
enfermedad.
Se ha reconocido que existe una diferencia en la
señal obtenida tratando una muestra (por ejemplo, mediante un
tratamiento de despliegue) que incluye la conformación no ligada a
la enfermedad de la proteína. La diferencia ha de ser tenida en
cuenta para obtener una lectura exacta. La diferencia de señal
obtenida entre la muestra nativa y la muestra tratada es, por
supuesto, una combinación de la diferencia de señal obtenida
tratando la conformación ligada a la enfermedad y la conformación
no ligada a la enfermedad. El aumento en la señal obtenida
sometiendo la conformación ligada a la enfermedad al tratamiento de
despliegue, es decir, que la diferencia entre la señal de la
conformación ligada a la enfermedad no tratada y la señal recibida
de la conformación ligada a la enfermedad tratada puede ser
calculada restando la señal recibida tratando toda la muestra de la
señal recibida calculando el aumento en la señal obtenida de la
conformación no ligada a la enfermedad no tratada y la conformación
no ligada a la enfermedad tratada. Usando estas ecuaciones, es
posible producir la ecuación final que da la concentración de
proteína en la conformación ligada a la enfermedad presente en la
muestra original (véase el Ejemplo 11).
Diferentes animales, incluidos los humanos,
pueden infectarse con diferentes cepas de proteínas patógenas. Se
facilita aquí una "tabla de mutaciones" para enumerar algunas
de las diferentes mutaciones asociadas a diferentes cepas de
infecciones priónicas. A veces puede ser importante qué cepa
específica ha infectado a un individuo, en el sentido de que dicha
información puede ser útil para (1) obtener un diagnóstico más
preciso, (2) administrar el tratamiento apropiado o (3) determinar
la fuente de infección comparando la cepa con una cepa de una fuente
probable de infección.
La cepa particular de proteína patógena que causa
una infección puede ser determinada a partir de dos informaciones
que pueden ser calculadas usando la presente invención. El Ejemplo
11 muestra cómo puede ser usada la presente invención para
determinar la cantidad absoluta, es decir, la concentración de
priones en una muestra de un tamaño dado. El Ejemplo 8 muestra cómo
calcular el "índice priónico", que es la razón anticuerpo que
se une a proteína desnaturalizada:proteína PrP nativa. El "índice
priónico" para otras proteínas es la razón de unión de cualquier
pareja de unión a la forma desnaturalizada:nativa de la proteína.
En términos generales, el "índice priónico" es simplemente una
caracterización numérica del efecto que tiene el tratamiento sobre
la proteína.
Para determinar la cepa particular, se ha de
calcular primeramente un patrón para cada cepa. Se puede hacer esto
determinando el efecto (índice priónico) de un tratamiento
particular sobre una cantidad conocida de una cepa conocida. Se
puede representar como se muestra en la Figura 24. Una vez se ha
calculado el patrón, se puede determinar fácilmente la cepa de
otras muestras -los patrones son preferiblemente calculados a un
número de diferentes concentraciones de cada cepa. Para determinar
la cepa de una sola muestra, se calcula la concentración de la
proteína en la muestra y el efecto del tratamiento sobre esa
concentración. Los resultados son equiparados con el patrón (como
en la Figura 24) para determinar la cepa. El Ejemplo 18 es un
ejemplo específico de ello tomado en combinación con la Figura 24.
La misma concentración de la misma cepa resultará afectada del
mismo modo por un tratamiento dado. Sin embargo, la misma
concentración de cepas diferentes resultará afectada de un modo
distinto por el mismo tratamiento, haciendo posible determinar la
cepa.
Gran parte de la descripción y de los ejemplos
específicos aquí dados se relacionan con el uso del ensayo con
respecto a la determinación de la presencia de PrP^{Sc} en la
muestra. Sin embargo, como se ha indicado antes, el ensayo de la
invención puede ser aplicado a la determinación de la presencia de
cualquier proteína que asuma dos formas conformacionales
diferentes, una de las cuales se asocia a la enfermedad. Lo que
sigue es una lista no limitativa de enfermedades con proteínas
insolubles asociadas que asumen dos o más conformaciones
diferentes.
| Enfermedad | Proteínas insolubles |
| Enfermedad de Alzheimer | APP, péptido A\beta, \alpha1-antiquimotripsina |
| tan, componente no-A\beta | |
| Enfermedades priónicas, enfermedad de Creutzfeld Jakob, | |
| scrapie y encefalopatia espongiforme bovina | PrP^{Sc} |
| ALS | SOD y neurofilamentos |
| Enfermedad de Pick | Cuerpo de Pick |
| Enfermedad de Parkinson | Cuerpo de Lewy |
| Diabetes tipo 1 | Amilina |
| Mieloma múltiple-discrasias de células plasmáticas | cadena IgGL |
| Polineuropatía amiloidósica familiar | Transtiretina |
| Carcinoma medular del tiroides | Procalcitonina |
| Fallo renal crónico | \beta_{2}-Microglobulina |
| Fallo cardíaco congestivo | Factor natriurético atrial |
| Amiloidosis cardíaca y sistémica senil | Transtiretina |
| Inflamación crónica | Amiloide A sérica |
| Aterosclerosis | ApoA1 |
| Amiloidosis familiar | Gelsolina |
Habría que hacer notar que las proteínas
insolubles antes enumeradas incluyen cada una una serie de variantes
o mutaciones que dan lugar a diferentes cepas, las cuales quedan
todas incluidas en la presente invención. Se dan a continuación
mutaciones y polimorfismos patógenos conocidos en el gen PrP en
relación con las enfermedades priónicas y se dan las secuencias de
los humanos, ovinos y bovinos en US 5.565.186, concedida el 15 de
Octubre de 1996.
Tabla de
mutaciones
| Mutaciones patógenas humanas | Polimorfismos humanos | Polimorfismos ovinos | Polimorfismos bovinos |
| Inserto de 2 octarrepeticiones | Codon 129 Met/Val | Codon 171 Arg/Glu | 5 ó 6 octarrepeticiones |
| Inserto de 4 octarrepeticiones | Codon 219 Glu/Lys | Codon 136 Ala/Val | |
| Inserto de 5 octarrepeticiones | |||
| Inserto de 6 octarrepeticiones | |||
| Inserto de 7 octarrepeticiones | |||
| Inserto de 8 octarrepeticiones | |||
| Inserto de 9 octarrepeticiones | |||
| Codon 102 Pro-Leu | |||
| Codon 105 Pro-Leu | |||
| Codon 117 Ala-Val | |||
| Codon 145 Parada | |||
| Codon 178 Asp-Asn | |||
| Codon 180 Val-Ile | |||
| Codon 198 Phe-Ser | |||
| Codon 200 Glu-Lys | |||
| Codon 210 Val-Ile | |||
| Codon 217 Asn-Arg | |||
| Codon 232 Met-Ala |
También habría que hacer notar que dichas
proteínas tienen dos conformaciones tridimensionales diferentes con
la misma secuencia de aminoácidos. Una conformación se asocia a las
características de la enfermedad y es generalmente insoluble,
mientras que la otra conformación no se asocia a las características
de la enfermedad y es soluble. La metodología de la presente
invención no se limita a las enfermedades, proteínas y cepas
enumeradas.
Un aspecto de la invención consiste en un
procedimiento en dos etapas para diagnosticar la enfermedad de
Alzheimer en base a la presencia de una forma constreñida de una
proteína (amiloidosis \betaA4) midiendo cuantitativamente la
forma \beta-laminar de la proteína \betaA4 en el
material de muestra, por ejemplo en el cerebro o en los fluidos
corporales. Se divide la muestra en dos alícuotas. Se entrecruza la
primera alícuota con un soporte sólido de plástico (material
polimérico de cadena larga) en conformación nativa a través de una
etapa de activación química en condiciones no desnaturalizantes. Se
somete primeramente la segunda porción de la muestra a un
tratamiento de despliegue y luego se entrecruza con el soporte de
plástico. Ambas porciones del material de muestra reaccionan in
situ con los anticuerpos marcados, que reconocen
preferentemente la \betaA4 soluble o la \betaA4 con tratamiento
de despliegue de la especie humana o de una especie animal dada. Se
registra la cantidad de anticuerpo unido a las conformaciones
desplegada o nativa de la proteína \betaA4 por la señal del
anticuerpo secundario marcado. El exceso de la señal obtenida con la
muestra sometida al tratamiento de despliegue en comparación con el
cambio esperado en la señal obtenida con la conformación nativa
\alpha-helicoidal de la proteína \betaA4 es la
medida de la cantidad de \betaA4 con estructura
\beta-laminar en la muestra original. La fórmula
desarrollada para el cálculo del contenido \betaA4 fue dada
anteriormente en relación al cálculo del contenido en
PrP^{Sc}.
Se establece el diagnóstico de la amiloidosis
\betaA4 (enfermedad de Alzheimer) mediante tres procedimientos:
(1) medición de la muestra desnaturalizada sola y detección del
aumento en la cantidad (concentración) de \betaA4 total en la
muestra examinada por encima de los niveles de fondo de \betaA4
soluble obtenidos de controles normales; (2) cálculo de la
proporción entre la señal del tratamiento de despliegue frente a la
nativa para un anticuerpo dado (índice proteico) -por ejemplo,
valores superiores a 2 para el anticuerpo monoclonal 6F3D y el
anticuerpo secundario marcado con europio; (3) evaluación del
cambio de la señal de la muestra desnaturalizada sobre el cambio
esperado en la señal para la conformación
\alpha-helicoidal de \betaA4 como medida de la
cantidad de \betaA4 infecciosa con estructura
\beta-laminar en la muestra original. La fórmula
desarrollada para el cálculo del contenido en \betaA4 fue dada
anteriormente. También se puede determinar la capa particular de
\betaA4 usando la misma metodología antes descrita para
determinar la cepa de PrP^{Sc} en una muestra.
La invención proporciona un método diagnóstico
directo para detectar la presencia de formas patógenas de proteína
\betaA4 en productos farmacéuticos, en tejido de biopsia o
autopsia, en cerebro, en médula espinal, en nervios periféricos, en
músculo, en fluido cerebroespinal, en sangre y componentes de la
sangre, en nódulos linfáticos y en cultivos derivados de humanos o
animales que expresan, o que potencialmente expresan, proteína
\betaA4. La invención hace también posible seguir la transición
conformacional de \alpha-hélice a láminas \beta
de la proteína \betaA4 o de sus fragmentos de origen sintético o
recombinante y disponer de un método para estudiar compuestos en
cuanto a su capacidad para estabilizar la conformación soluble
normal de la proteína \betaA4 y así prevenir la conversión en
proteína patógena \betaA4 insoluble y con estructura
\beta-laminar.
Como métodos típicos de desnaturalización de una
muestra se incluyen: (1) métodos físicos, tales como la presión
hidrostática o la temperatura; (2) métodos químicos, tales como pH
ácido o alcalino, sales caotrópicas o detergentes
desnaturalizadores, y (3) combinaciones de los anteriores. Los
métodos de acoplamiento químico o por afinidad de proteína
\betaA4 a un soporte de plástico están descritos en la literatura
disponible y pueden variar. Los anticuerpos usados en el ensayo
diagnóstico pueden ser Fab policlonales, monoclonales o
recombinantes y deben ser específicos de especie, con unión
preferente a la forma soluble o desnaturalizada de \betaA4 con
preferiblemente al menos una diferencia de 2 veces en la reactividad
entre la \betaA4 que tiene estructura
\alpha-helicoidal y la que tiene estructura
\beta-laminar, suponiendo la misma cantidad de
antígeno.
Los métodos de unión de la muestra al soporte de
plástico pueden variar y pueden ser covalentes o no covalentes, como
se describe en la literatura disponible. La sensibilidad del ensayo
descrito en los ejemplos puede aumentar usando anticuerpos de alta
afinidad, formato de emparedado, inmunoprecipitación o
centrifugación diferencial. Sin embargo, sólo se usarán los
anticuerpos con una afinidad al menos 2 veces mayor para la
conformación tratada desplegada en comparación con la
\beta-laminar nativa de la \betaA4 de la misma
especie para el ensayo diagnóstico. Los métodos de generación,
purificación, marcaje y detección de anticuerpos pueden variar. La
unión de anticuerpos a diferentes conformaciones de proteína
\betaA4 fue medida por fluorescencia con resolución temporal y
aumento de la disociación. Sin embargo, el sistema de detección de
IgG unida a \betaA4 sobre soporte sólido in situ o en
solución puede variar y puede usar métodos inmunológicos directos o
indirectos, incluyendo radiomarcajes directos, fluorescencia,
luminiscencia, amplificación con avidina-biotina o
ensayos ligados a enzimas con substratos coloreados o
luminiscentes.
Los siguientes ejemplos son facilitados para
dotar a los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica de una
exposición y una descripción completas de cómo hacer y utilizar los
ensayos de la presente invención y no pretenden limitar el alcance
de lo que los inventores consideran como su invención, ni pretenden
representar o implicar que los experimentos que se dan a
continuación son todos o son los únicos experimentos realizados. Se
han hecho esfuerzos por asegurar la exactitud con respecto a los
números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero
hay que considerar algunos errores y desviaciones experimentales. A
menos que se indique en contrario, las partes son partes en peso,
el peso molecular es peso molecular medio ponderal, la temperatura
es en grados centígrados y la presión es la atmosférica o próxima a
ella.
Para el desarrollo y la calibración de los
ensayos diagnósticos, se replegaron proteínas priónicas
recombinantes de hámster Sirio de la secuencia
90-231 en conformaciones
\alpha-helicoidales o
\beta-laminares según se ha descrito [Mehlhorn,
Groth y col. (1996), Biochemistry 35:
5528-5537]. Se usó PCR
(Perkin-Elmer) para amplificar el ADN
correspondiente a diferentes porciones de la proteína priónica de
hámster Sirio con objeto de ligarlo en vectores de secreción en
E. coli. Se sintetizaron varios cebadores oligonucleótidos
5' con un sitio de restricción Mlu I en la secuencia codificante
C-terminal del péptido señal STII [Lee, Moseley y
col. (1983), Infect. Immun. 42: 264-268;
Picken, Mazaitis y col. (1983), Infect. Immun. 42:
269-275] y los aminoácidos iniciales de la secuencia
PrP apropiada. Se usó un cebador oligonucleotídico 3' que se
correspondía con el extremo 3' de PrP, un codon de parada y un
sitio de restricción Bam HI con cada uno de los oligonucleótidos 5'.
Se purificaron los productos amplificados por PCR, se ligaron en
los vectores previamente digeridos con MluI/Bam HI y se
transformaron en DH5a. Se secuenciaron los clones que contenían el
inserto PrP y se transformaron en la cepa de expresión deficiente
en proteasas 27C7 (ATCC# 55244).
Se llevó a cabo la producción a gran escala como
se ha descrito antes para otras proteínas usando un medio diferente
[Carter, Kelley y col. (1992), Biotechnology 10:
163-167]; se inocularon 500 ml de un cultivo de una
noche crecido en medio LB suplementado con ampicilina en 7 L de
medio de fermentación en un fermentador aireado de 10 L (Braun,
modelo E10). Se hizo crecer a las células a 37ºC a una alta
velocidad de agitación y se indujo la expresión por deprivación de
fosfatos. A las 4 h, se añadió una solución de glucosa al 50% a un
ritmo de 1 ml/min; se monitorizaron los niveles de glucosa usando
una varilla de inmersión para glucosa (Diastix, Miles Inc.). Se
mantuvo un pH de 7,4 a lo largo de la operación por adición
automatizada de H_{2}SO_{4} al 10% o de NH_{4}OH al 24%. El
volumen final era de 10 L, en donde se consiguió una DO_{600} de
\geq100 después de 36 h. Se recogió la E. coli por
centrifugación a 10.000 x g durante 30 min y se guardó la pasta
resultante a -20ºC.
Para la purificación, se resuspendieron 100 g de
pasta de E. coli en 1 L de Tris-HCl 25 mM, pH
8,0, EDTA 5 mM (tampón A). Se centrifugó a 10.000 x g durante 20 min
y se desechó el sobrenadante, que contenía proteínas periplásmicas
solubles. Se resuspendió la pella en 1 L de tampón A, se pasó a
través de un disruptor de células (Microfluidics International,
modelo MF110) dos veces y se centrifugó a 30.000 x g durante 1 h,
tras lo cual se desechó el sobrenadante y se lavó pella una vez en
tampón A y se centrifugó de nuevo a 30.000 x g durante 1 h. En este
punto, la pella pudo ser guardada a -20ºC antes de la posterior
separación. Se solubilizó a continuación en GdnHCl 8
M/Tris-HCl 25 mM, pH 8,0/DTT 100 mM (tampón B) y se
centrifugó a 14.000 x g durante 20 min para eliminar el resto de
materia insoluble. Se separaron alícuotas de 6 ml del sobrenadante,
que contenía \sim 200 mg de proteína total, por cromatografía de
exclusión por tamaños ("SEC") usando una columna HiLoad
Superdex 200 de 26 mm x 60 cm (Pharmacia), eluyendo con GdnHCl 6
M/Tris-HCl 12,5 mM, pH 8,0/DTT 5 mM/EDTA 1 mM
(tampón C) a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Se juntaron las
fracciones enriquecidas en proteína priónica recombinante
identificadas por SDS-PAGE y se purificaron después
por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase invertida
("RP-HPLC") empleando una columna
C-4 de 25 mm x 25 cm (Vydac); Tampón 1: H_{2}O/TFA
0,1%, Tampón 2: acetonitrilo/TFA 0,09%, velocidad de flujo 5 ml/min.
Se encontró la proteína recombinante rPrP en las fracciones que
contenían un 40% de acetonitrilo. Si se guardaba el eluato SEC a 4ºC
durante varios días antes de la RP-HPLC, la proteína
recombinante eluía en las primeras fracciones que contenían sólo un
35% de acetonitrilo.
Se concentraron muestras de la proteína reducida
y la forma oxidada replegada usando una columna Centricon (Amicon)
con un corte de peso molecular de 10.000 Da. El tampón para la
proteína reducida era MES 10 mM, pH 6,5, mientras que la forma
oxidada fue concentrada en el tampón de replegamiento antes
descrito. Se determinaron las conformaciones de las formas
replegadas oxidadas y reducidas de la proteína
SHaPrP90-231 por espectroscopía de dicroísmo
circular (CD) (Fig. 1).
Se usaron las dos proteínas producidas según el
Ejemplo 1 como patrones para el ensayo de priones y para establecer
la sensibilidad y el rango de linealidad del método de diagnóstico.
Se usó la PrP^{c} de cerebro de hámster Sirio purificada para
calibrar la detección de las proteínas priónicas y se correlacionó
con los resultados obtenidos con la SHaPrP90-231
recombinante en las conformaciones
\alpha-helicoidal, \beta-laminar
y desnaturalizada. Se purificó la proteína PrP^{c} como se ha
descrito con algunas modificaciones menores [Pan, Stahl y col.
(1992), Protein Sci. 1: 1343-1352; Pan,
Baldwin y col. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
10962-10966]. Se determinó el contenido en proteína
por análisis de aminoácidos. La pureza de la proteína PrP^{c},
demostrada en SDS-PAGE seguida de tinción con plata
y Western, era \geq95%.
Se purificó PrP^{Sc} estándar de hámster Sirio
a partir de un pool estándar de cerebros de hámster infectados con
la cepa de scrapie Sc237 según está descrito, con sólo
modificaciones menores [Turk, Teplow y col. (1988), Eur. J.
Biochem. 176: 21-30]. La infectividad de este
patrón, determinada por un ensayo de tiempo de incubación en
hámsteres Sirios tras inoculación intracerebral, era de 10^{7,3}
DI_{50}/ml y la infectividad específica de 10^{8,2} DI_{50}/mg
de proteína PrP^{Sc}. Sin embargo, la infectividad específica
puede variar de lote a lote en \pm 10^{0,5} DI_{50}/mg. Se
determinó el contenido en proteína por un ensayo BCA usando
seroalbúmina bovina como patrón. Se consideró que la preparación era
homogénea con una banda mayor por SDS-PAGE después
de la tinción con plata y de los Western Blots.
Los protocolos y los métodos de producción y
caracterización de anticuerpos están descritos en general en algún
otro lugar [Harlow y Lane (1988), antes citado: 726]. Los datos
descritos en éste y en los ejemplos siguientes fueron generados con
el anticuerpo policlonal N12 y P3 purificados por inmunoafinidad
[Safar, Ceroni y col. (1990), Neurology 40:
513-517; Rogers, Serban y col. (1991), J.
Immunol. 147: 3568-3574] producidos frente a
péptidos sintéticos correspondientes a la secuencia
90-145 (N12) y 222-231 (P3) de la
PrP de hámster Sirio [Barry, Vincent y col. (1988), J. Immunol.
140: 1188-1193]; JS2 frente a la PrP
27-30 de hámster Sirio desnaturalizada [Safar,
Ceroni y col. (1990), Neurology 40: 513-517].
El desarrollo y las características del anticuerpo monoclonal 3F4
usado en el ensayo están descritas en algún otro lugar [Kascsak,
Rubenstein y col. (1987), J. Virol. 61:
3688-3693] y están descritas en US 4.806.627, todas
ellas aquí incorporadas como referencia por su exposición y
descripción de anticuerpos que pueden ser usados en la invención y
de métodos de producción de éstos y de anticuerpos relacionados. Se
desarrollaron más recientemente los Fab recombinantes reconocedores
de las formas desnaturalizadas de la proteína priónica [Williamson,
Peretz y col. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:
7279-7282].
Se unió covalentemente
SHaPrP90-231 en conformación
\alpha-helicoidal,
\beta-laminar y de arrollamiento aleatorio a
placas de poliestireno activadas con glutaraldehído y se incubó con
anticuerpo primario seriadamente diluido. Se determinó la cantidad
de IgG que reaccionaba con cada conformación de
SHaPrP90-231 bien directamente con IgG 3F4 marcada
con Eu, bien indirectamente con anticuerpo
anti-conejo o anti-ratón marcado con
europio, según los protocolos usuales y se midió la señal total por
fluorescencia con resolución temporal y aumento de la disociación.
Para el desarrollo del ensayo, se seleccionaron anticuerpos con una
razón de señal de conformación desnaturalizada a conformación
\beta-laminar de SHaPrP90-231
igual o mayor de 4.
Se diluyó SHaPrP90-231
recombinante purificada, replegada en una conformación
\alpha-helicoidal o
\beta-laminar, en homogeneizado de cerebro al 5%
(p/v) obtenido de ratón PrP^{0/0} y que no contenía proteína
priónica. Se produjo el homogeneizado de cerebro por tres
explosiones de 30 seg en un homogeneizador PowerGen equipado con una
sonda de plástico desechable en TBS, pH 7,4, que contenía un cóctel
de inhibidores de proteinasas (PMSF 1 mM, 2 \mug/ml de aprotinina
y 2 \mug/ml de leupeptina) y se centrifugó a 5ºC durante 5 min a
500 G en una centrífuga de mesa. Se diluyó el sobrenadante
resultante 1:1 en TBS con un 4% (p/v) final de Sarcosyl y se volvió
a homogeneizar por tres explosiones de 30 seg en un homogeneizador
PowerGen. A continuación, se trató el homogeneizado con diferentes
diluciones de SHaPrP90-231 recombinante en
conformación \alpha-helicoidal o
\beta-laminar (pretratamiento).
En un ensayo competitivo típico, se preincuba el
analito PrP en diferentes conformaciones con IgG 3F4 marcada con
europio y se transfiere luego a la placa e poliestireno revestida
con ShaPrP90-231 recombinante en estado
desnaturalizado con SDS. Los resultados para el analito
SHaPrP90-231 en estado
\alpha-helicoidal y desnaturalizado (Figura 2)
indican una marcada diferencia en los sitios de unión disponibles y
en la afinidad de la IgG 3F4 marcada con europio con diferentes
conformaciones de proteína priónica.
En el ensayo directo, cada muestra de la curva de
dilución fue dividida en dos alícuotas: (1) no tratada y denominada
nativa y (2) mezclada con GdnHCl 4 M final y calentada durante 5
min a 100ºC y denominada desnaturalizada (tratamiento de
despliegue). Ambas muestras fueron diluidas 20 veces con H_{2}O y
se cargaron las alícuotas en una placa de poliestireno activada con
glutaraldehído. Se bloquearon las placas, incubadas durante la
noche a 5ºC, con TBS, pH 7,8, que contenía un 0,5% de BSA (p/v) y un
6% de sorbitol (p/v). En la siguiente etapa, se lavaron tres veces
con TBS, pH 7,8, que contenía un 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se
incubaron con los anticuerpos marcados con europio antes enumerados.
Se revelaron las placas después de 7 etapas adicionales de lavado
en una solución de intensificación proporcionada por el proveedor
del marcaje de europio (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y se contó la
señal en un fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku,
Finlandia).
Los parámetros obtenidos del ensayo directo con
IgG 3F4 marcada con Eu fueron representados en función de la
concentración. Los resultados obtenidos con
SHaPrP90-231 en conformación
\alpha-helicoidal (Figura 3) indican una
diferencia relativamente pequeña entre la señal de la proteína
\alpha-helicoidal y la de la desnaturalizada. El
límite de sensibilidad para la PrP desnaturalizada en presencia de
homogeneizado de cerebro al 5% es \leq1 ng/ml y el rango de
linealidad superior a 3 órdenes de magnitud. En los experimentos
con la forma \beta-laminar de
SHaPrP90-231 (Figura 4), la IgG 3F4 marcada con Eu
se une fuertemente a una forma desnaturalizada de la proteína. Por
el contrario, la reactividad con la forma
\beta-laminar nativa de la proteína sólo excedía
marginalmente al fondo, incluso a concentraciones altas de proteína.
Cuando se expresan los resultados como razón de la fluorescencia del
estado desnaturalizado frente al nativo de la proteína priónica
(Figuras 3 y 4), la razón para la conformación
\alpha-helicoidal es de 1-1,8 y
para SHaPrP90-231 recombinante en conformación
\beta-laminar es de 5-50.
Este efecto fue además utilizado para analizar
muestras de PrP de conformación desconocida, donde el pequeño
aumento de señal de la IgG 3F4 marcada con Eu tras la
desnaturalización de la PrP es una característica de la
conformación \alpha-helicoidal. Por el contrario,
el gran aumento en la señal por encima del cambio esperado para la
conformación \alpha-helicoidal es diagnóstico de
la PrP90-231 en conformación
\beta-laminar (Figuras 3 y 4). Los resultados son
expresados en dos formas diferentes: (1) como una razón (Figura 6),
donde un índice \leq1,8 para la SHaPrP90-231
recombinante indica que la proteína estaba originalmente toda en
conformación de \alpha-hélice y un índice >1,8
indica la presencia de conformación
\beta-helicoidal, y (2) como una fórmula aquí
mostrada y ejemplificada en el Ejemplo 11, donde el exceso de
aumento de señal por encima de lo esperado para la conformación
\alpha-helicoidal es proporcional a la cantidad de
SHaPrP90-231 en conformación
\beta-laminar.
La calibración de entrada/salida para la
ShaPrP90-231 desnaturalizada en ambas conformaciones
\alpha-helicoidal y
\beta-laminar era lineal en tres órdenes de
magnitud y proporciona un alto grado de confianza (Figura 5) para el
ensayo. También se estudió la PrP^{c}, seriadamente diluida en
homogeneizado de ratón PrP^{0/0}, que dio resultados con un alto
grado de confianza dentro de un rango de linealidad de 3 órdenes de
magnitud. A continuación, se calibró el ensayo mediante PrP^{Sc}
infecciosa en presencia de homogeneizado de ratón PrP^{0/0} al
5%. La calibración con PrP^{Sc} dio una respuesta lineal dentro
de un rango similar.
Usando el método diferencial, la razón entre la
señal de la PrP^{c} de cerebro desnaturalizada con respecto a la
nativa era, para la IgG 3F4 monoclonal marcada con Eu, de 2,2
(Figura 7), y para los N12 y P3 policlonales, de 1,0. La calibración
para PrP^{Sc} dio una razón \geq20 (Figura 8) para la IgG 3F4
marcada con Eu y >4 para los anticuerpos N12 y P3. Utilizando las
fórmulas desarrolladas aquí mostradas, toda la PrP^{c} estaba en
rango completo en conformación \alpha-helicoidal.
Por el contrario, la cantidad calculada de PrP^{Sc} en la
conformación \beta-laminar infecciosa estaba,
como se había anticipado, próxima a la cantidad total de proteína
priónica.
La medición cuantitativa exacta de la PrP total
evaluando exclusivamente la señal de la muestra desnaturalizada
(sometida a tratamiento de despliegue) dio un valor medio de
PrP^{c} en homogeneizados de cerebro de hámster Sirio normal al
5% de 5,0 \pm 0,2 \mug/ml (media \pm SEM) (Figura 9). La
dilución seriada de homogeneizado de cerebro de hámster infectado
con scrapie (cepa Sc237) en homogeneizado de cerebro de ratón
PrP^{0/0} dio valores de PrP total de 36,0 \pm 4 \mug/ml
(Figura 10), con una amplia linealidad de la medición. Como la
única condición conocida para la acumulación de proteína priónica es
la acumulación de la forma infecciosa PrP^{Sc}, el aumento de los
niveles de PrP total en la muestra estudiada es indicativo de la
presencia de priones. Este ensayo de priones puede ser usado: (1)
de modo directo en cerebro, muestras de tejidos, fluidos corporales
o productos farmacéuticos tras la determinación de valores control
normales, o (2) de modo indirecto detectando la elevación de PrP
total en el cerebro de animales experimentales inoculados
intracerebralmente con la muestra de tejido, fluido corporal o
producto farmacéutico estudiada sospechosa de contener priones.
La razón entre la afinidad del anticuerpo por la
proteína PrP^{c} de cerebro de hámster Sirio desnaturalizada
(sometida a tratamiento de despliegue) y la nativa está en un
amplio rango de concentración para la IgG 3F4 marcada con Eu de
entre 0,8 y 2,2. La razón en el cerebro infectado con scrapie es, a
lo largo de todo el rango de linealidad, superior a esos valores
(Figura 11). El "índice priónico" da una indicación relativa
de la presencia de PrP^{Sc} infecciosa y, por lo tanto, de
priones. Este modo de ensayo de priones puede ser usado: (1) de modo
directo en cerebro, muestras de tejidos, fluidos corporales o
productos farmacéuticos tras la determinación del índice para los
controles normales, o (2) de modo indirecto detectando la elevación
del índice de proteína priónica desnaturalizada/nativa en el
cerebro de animales experimentales inoculados intracerebralmente
con la muestra de tejido, fluido corporal o producto farmacéutico
estudiada sospechosa de contener priones.
Utilizando el ensayo directo y las fórmulas aquí
dadas, no existe cantidad detectable de forma
\beta-laminar de PrP^{Sc} en homogeneizado de
cerebro normal. Por el contrario, la mayor parte de la PrP total en
el cerebro de hámster infectado con scrapie se debía a la
acumulación de PrP^{Sc} (Figuras 9 y 10). La correlación entre el
título priónico y la PrP^{Sc} calculada por la fórmula tiene una
amplia linealidad y un corte de sensibilidad de \sim 10^{3}
DI_{50}/ml (Figura 11). La fórmula da una indicación cuantitativa
de la presencia de proteína PrP en conformación anormal, que guarda
correlación cuantitativa con el título priónico. Este modo de ensayo
priónico puede ser usado: (1) de modo directo en cerebro, muestras
de tejidos, fluidos corporales o productos farmacéuticos, o (2) de
modo indirecto calculando el contenido en PrP^{Sc} en el cerebro
de animales experimentales inoculados intracerebralmente con la
muestra de tejido, fluido corporal o producto farmacéutico
estudiada sospechosa de contener priones. Después de establecer una
curva de calibración entre PrP^{Sc} y el título priónico, es
posible estimar el título directamente por el contenido en
PrP^{Sc}.
Se incuban alícuotas de una solución de 100
\mug/ml de la forma \alpha-helicoidal de
SHaPrP90-231 recombinante o de
SHaPrP29-231 o de péptidos correspondientes
recombinantes o sintéticos de la proteína priónica en tampón
acetato de Na 20 mM, pH 5,5, durante 24 h a 37ºC con concentraciones
10^{-3} a 10^{-6} M de glicerol, ciclodextrinas, heparina,
sulfato de heparina, Rojo Congo, éster de colesterol y
dimiristoilfosfatidilcolina. Se dividen entonces las muestras en dos
alícuotas: (1) no tratada, denominada nativa, y (2) mezclada con
GdnHCl 4 M final y calentada durante 5 min a 100ºC, denominada
desnaturalizada (tratamiento de despliegue). Se diluyen ambas
muestras 20 veces en H_{2}O y se cargan alícuotas en una placa de
poliestireno activada con glutaraldehído. Se bloquean las placas,
incubadas durante la noche a 5ºC, con TBS, pH 7,8, que contiene un
0,5% (p/v) de BSA y un 6% (p/v) de sorbitol. En la etapa siguiente,
se lavan tres veces con TBS, pH 7,8, que contiene un 0,05% (v/v) de
Tween® 20 y se incuban con IgG 3F4 marcada con europio. Se revelaron
las placas después de 7 etapas adicionales de lavado en una solución
de intensificación proporcionada por el proveedor del marcaje de
europio (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y se contó la señal en un
Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia).
Se calcula el grado de conversión de la
conformación \alpha-helicoidal en la
\beta-laminar de PrP por el "índice priónico"
o, alternativamente, por las fórmulas aquí facilitadas. Algunos
compuestos que inhiben la conversión estabilizando aparentemente la
conformación de tipo nativo de la proteína priónica tienen un
potencial terapéutico in vivo.
El método de ensayo queda demostrado en el
siguiente ejemplo con homogeneizado de cerebro de hámster Chino
infectado con scrapie diluido 4 veces en homogeneizado de cerebro
de ratón PrnP^{0/0}:
a) Se calibra cada placa con un patrón interno
consistente en cinco puntos de dilución de
SHaPrP90-231 desnaturalizada. Se revela la
fluorescencia con resolución temporal ("TRF") de la PrP total
con IgG 3F4 marcada con Eu y se representan los valores de la
fluorescencia con resolución temporal en función de la
concentración de PrP (Figura 4). Se ajustan los datos a una ecuación
lineal o polinomial usando el método de mínimos cuadrados y se
selecciona la mejor función para el cálculo de la PrP
desnaturalizada:
(1)PrP [\mu g/ml] = -0,22935
+ 0,00026567\text{*}[TRF] +
0,0000000012255\text{*}[TRF]^{2}
b) En el resto de la placa, se incuban alícuotas
nativas y desnaturalizadas de homogeneizado de cerebro de hámster
Sirio infectado con scrapie, diluidas 4 veces, y entrecruzadas con
el soporte de plástico, con IgG 3F4 marcada con Eu. Se calcula el
contenido de PrP total según la fórmula anterior a partir de la
señal de fluorescencia de la muestra
desnaturalizada:
| Concentración de homogeneizado de | TRF nativa [cpm] | TRF desnaturalizada [cpm] | PrP^{c+S} c [\mug/ml) |
| cerebro infectado con scrapie (%) | |||
| 5 | 4.214 | 109.814 | 43,7 |
| 1,25 | 1.381 | 30.804 | 9,1 |
| 0,3125 | 1.070 | 11.240 | 2,9 |
c) Se calcula la razón de las señales de
fluorescencia entre muestras desnaturalizadas (sometidas al
tratamiento de despliegue) y nativas:
| Concentración de homogeneizado | TRF nativa [cpm] | TRF* desnaturalizada | Razón desnaturalizada |
| de cerebro infectado con scrapie (%) | [cpm] | */nativa | |
| 5 | 4.214 | 109.814 | 26,1 |
| 1,25 | 1.381 | 30.804 | 22,3 |
| 0,3125 | 1.070 | 11.240 | 10,5 |
| * desnaturalizada indica que se sometió a tratamiento de despliegue. |
El valor normal de PrP^{c} determinado en el
homogeneizado de cerebro de hámster normal es de 2,2; valores por
encima de 2,2 se consideran anormales e indican la presencia de
PrP^{Sc}.
d) El exceso de señal de fluorescencia por encima
del esperado para PrP \alpha-helicoidal en la
transición del estado nativo al desnaturalizado (desplegado) es una
medida de la cantidad de PrP^{Sc} y se calcula según la fórmula
dada:
(2)\Delta F_{\beta
n\rightarrow d} = F_{d} - (F_{n} \text{*} f_{\alpha n\rightarrow
d})
donde f es el valor máximo del factor para la
señal de fluorescencia en la transición del estado nativo al
desnaturalizado de PrP^{c}, F_{d} es la fluorescencia de la
muestra desnaturalizada (desplegada) y F_{n} es la fluorescencia
de la muestra nativa. Se calcula entonces la cantidad de PrP^{Sc}
a partir de \DeltaF_{\beta n\rightarrow d} y de la ecuación
(1):
| Concentración de homogeneizado de cerebro infectado | \DeltaTRF_{\beta n\rightarrow d} [cpm] | PrP^{Sc} [\mug/ml) |
| con scrapie (%) | ||
| 5 | 100.543,2 | 38,9 |
| 1,25 | 27.765,8 | 8,1 |
| 0,3125 | 8.886 | 2,2 |
El valor positivo calculado para la forma
\beta-laminar de la proteína priónica indica la
presencia de PrP^{Sc}.
Se obtuvieron formas solubles de \betaA4
(1-40) y \betaA4 (1-42) de Bachem
(Torrance, CA). Se solubilizó una porción del péptido liofilizado
fresco en PBS, pH 7,4, que contenía un 20% (v/v) de HFIP
(hexafluoroisopropanol,
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)
o un 1% (p/v) de SDS (dodecilsulfato de sodio) a una concentración
final de proteína 50 \muM; se denominó a esta proteína
"soluble" y se la guardó a -80ºC hasta su uso. Se resuspendió
una segunda porción del péptido en PBS, pH 7,4, a una concentración
final \geq350 \muM y se incubó durante 72 h a 37ºC. Se denominó
a esta porción de la proteína "insoluble" y se la guardó hasta
su uso a -80ºC.
Se usaron ambas proteínas como patrones para el
desarrollo del ensayo y para establecer la sensibilidad y el rango
de linealidad. La espectroscopía CD (dicroísmo circular) (Figura
12) demostró que la proteína soluble tiene una conformación
\alpha-helicoidal (véase la línea continua de la
Figura 12). Por el contrario, la proteína \betaA4 tratada durante
72 h a 37ºC se había convertido por completo en la conformación
\beta-laminar (véase la línea discontinua de
la
Figura 12).
Figura 12).
Los protocolos y los métodos de producción y
caracterización de anticuerpos están descritos en general en algún
otro lado [Harlow y Lane (1988), antes citado: 726]. Los datos
descritos en éste y en los siguientes ejemplos fueron generados con
el anticuerpo monoclonal 6F3D, desarrollado frente a un péptido
sintético correspondiente a la secuencia de la proteína \betaA4
humana (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). Sin embargo,
también se podrían usar anticuerpos policlonales producidos frente
al análogo sintético de la proteína \betaA4. También se podría
usar Fab recombinante reconocedor de formas desnaturalizadas de la
proteína \betaA4.
Se unió covalentemente proteína \betaA4 en
conformación \alpha-helicoidal,
\beta-laminar o de arrollamiento aleatorio a
placas de poliestireno activadas con glutaraldehído y se incubó con
anticuerpo primario seriadamente diluido. Se determinó la cantidad
de IgG que reaccionaba con cada conformación de \betaA4 con
anticuerpo anti-conejo o anti-ratón
marcado con europio según los protocolos habituales y se midió la
señal total por fluorescencia de resolución temporal y aumento de
la disociación Se seleccionaron los anticuerpos con una razón de
señal de conformación desnaturalizada (sometida a tratamiento de
despliegue) a conformación \beta- laminar de \betaA4 igual o
mayor de 2 para desarrollar el ensayo.
En el ensayo directo, cada muestra de curva de
dilución de las formas \alpha-helicoidal y
\beta-laminar de la proteína \betaA4 fue
dividida en dos alícuotas: (1) no tratada (denominada nativa) y (2)
mezclada con GdnHCl 4M final/1% de Sarcosyl y calentada durante 5
min a 100ºC (denominada "desnaturalizada", lo que significa que
fue sometida a un tratamiento de despliegue). Ambas muestras fueron
diluidas 20 veces con H_{2}O y se cargaron alícuotas en una placa
de poliestireno activada con un 0,2% de glutaraldehído durante 2 h.
Se bloquearon las placas, incubadas durante la noche a 5ºC, con
TBS, pH 7,8, que contenía un 0,5% (p/v) de BSA y un 6% (p/v) de
sorbitol. Se lavaron entonces las muestras tres veces con TBS, pH
7,8, que contenía un 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con
anticuerpos primarios frente a la proteína \betaA4 (6F3D,
Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). Se lavaron las muestras y
se revelaron después con anticuerpos secundarios marcados con
europio frente a IgG de ratón (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Se
revelaron las placas después de 7 etapas adicionales de lavado en
solución de intensificación (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y se
contó la señal en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku,
Finlandia). Los resultados para el analito indican una marcada
diferencia en los sitios de unión disponibles y en la afinidad de
la IgG anti-\betaA4 por diferentes conformaciones
de proteína \betaA4.
\newpage
El método podría ser llevado a cabo usando un
ensayo competitivo, donde se preincuba el analito \betaA4 en
diferentes conformaciones con IgG anti-\betaA4 y
se transfiere después a la placa de poliestireno revestida de
proteína \betaA4 sintética en estado desnaturalizado con GdnHCl,
es decir, proteína \betaA4 desplegada.
Los parámetros obtenidos del ensayo directo con
IgG anti-\betaA4 6F3D fueron representados en
función de la concentración. Los resultados obtenidos con \betaA4
en conformación \beta-helicoidal (Figura 13)
muestran una gran diferencia entre la señal de la proteína
\beta-laminar y desnaturalizada. El límite de
sensibilidad para la \beta4A desnaturalizada es \leq1 \mug/ml
y el rango de linealidad está por encima de los 2 órdenes de
magnitud. En los experimentos con la forma
\alpha-helicoidal de \betaA4 (Figura 14), la IgG
6F3D se une con igual fuerza a las formas nativa y desnaturalizada
de la proteína. Por el contrario, la reactividad con la forma
\beta-laminar nativa de la proteína excedía sólo
marginalmente al fondo incluso a altas concentraciones de proteína.
Cuando los resultados se expresan como razón de la fluorescencia de
los estados desnaturalizado y nativo de la \betaA4 (Figura 15),
la razón de la conformación \alpha-helicoidal es
\leq1 y para la \betaA4 en conformación
\beta-laminar está en un rango dado de
concentración de \geq1,5.
Este efecto fue además utilizado para analizar
muestras de \beta4A de conformación desconocida, donde el pequeño
aumento de señal de la IgG 3F4 marcada con Eu tras la
desnaturalización de \betaA4 es una característica de la
conformación \alpha-helicoidal. Por el contrario,
el gran aumento de señal por encima del cambio esperado para la
conformación \alpha-helicoidal es diagnóstico de
la conformación \beta-laminar (Figura 15). Los
resultados pueden ser expresados en dos formas diferentes: (1) como
razón (Figura 15), donde un índice \geq1,0 para \betaA4 indica
que la proteína estaba toda ella originalmente en conformación
\alpha-helicoidal y un índice >1,5 indica la
presencia de conformación \beta-laminar, o (2) por
la fórmula mostrada anteriormente, donde el exceso de aumento de
señal por encima de lo esperado para la conformación
\alpha-helicoidal es proporcional a la cantidad de
\betaA4 en conformación \beta-laminar.
La medición cuantitativa exacta de la \betaA4
total evaluando exclusivamente la señal de la muestra
desnaturalizada es aparentemente más exacta que la medición de la
\betaA4 en conformación nativa (Figuras 13 y 14). El valor normal
de la proteína puede ocultar una porción significativa de la forma
\beta-laminar de la proteína \betaA4 debido a
la menor reactividad de esta forma con anticuerpos. Debido a que la
única condición para la acumulación de proteína \betaA4 es la
acumulación de la forma \beta-laminar de \betaA4
en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer, los
mayores niveles de \betaA4 total en la muestra estudiada son
indicativos de la presencia de formas patógenas de \betaA4. Este
ensayo \betaA4 puede ser usado en muestras de tejido, de fluidos
corporales o de productos farmacéuticos sospechosas de contener
formas \beta-laminares de \betaA4.
La razón entre la afinidad de anticuerpos por la
proteína \betaA4 humana desnaturalizada (sometida a tratamiento de
despliegue) y la afinidad por la proteína nativa está un amplio
rango de concentración para IgG 6F3D de entre 0,8 y 1,0. La razón
para la \betaA4 \beta-laminar está, a lo largo
de todo el rango de linealidad, por encima de esos valores (Figura
15). El "índice de amiloide \betaA4" da una indicación
relativa de la presencia de \betaA4
\beta-laminar insoluble patógena. Este modo de
ensayo \betaA4 puede ser usado de modo directo en cerebro,
muestras de tejidos, fluidos corporales o productos farmacéuticos
tras la determinación del índice para controles normales.
Utilizando el ensayo directo y la fórmula antes
mostrada, se puede calcular la cantidad de formas patógenas de
proteína \betaA4 \beta-laminar en cerebro,
muestras de tejidos, fluidos corporales o productos
farmacéuticos.
Se incuban alícuotas de una solución 350 \muM
de la forma \alpha-helicoidal de la \betaA4
sintética (1-40) o de péptidos correspondientes
recombinantes o sintéticos de la proteína \betaA4 en PBS, pH 7,4,
durante 72 h a 37ºC con concentraciones 10^{-3} - 10^{-6} M de
glicerol, ciclodextrinas, heparina, sulfato de heparina, Rojo
Congo, éster de colesterol y dimiristoilfosfatidilcolina. Se dividen
entonces las muestras en dos alícuotas: (1) no tratada, que
contiene un 1% de Sarcosyl y denominada "nativa", y (2)
mezclada con GdnHCl 4 M final/1% de Sarcosyl y calentada durante 5
min a 100ºC, denominada "desnaturalizada", lo que significa que
se ha sometido a un tratamiento de despliegue. Ambas muestras son
diluidas 20 veces con H_{2}O y se cargan alícuotas en una placa
de poliestireno activada con glutaraldehído. Se bloquean las
placas, incubadas durante la noche a 5ºC, con TBS, pH 7,8, que
contiene un 0,5% (p/v) de BSA y un 6% (p/v) de sorbitol. En la etapa
siguiente, se lavan tres veces con TBS, pH 7,8, que contiene un
0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incuban con IgG 6F3D y luego con
anticuerpo anti-ratón marcado con Eu. Se revelan las
placas después de 7 etapas adicionales de lavado en solución de
intensificación y se cuenta la señal en un Fluorómetro DELFIA 1234
(Wallac Inc., Turku, Finlandia).
Se calcula el grado de conversión de conformación
\alpha-helicoidal en
\beta-laminar de la \betaA4 por el "índice de
amiloide" (Figura 15) o, alternativamente, por la fórmula
mostrada anteriormente. Cualquier compuesto que inhiba la
conversión estabilizando la conformación
\alpha-helicoidal de la proteína \betaA4 puede
tener un potencial terapéutico in vivo para prevenir la
formación de amiloide madura.
Se obtuvieron formas solubles de TTR de Sigma
Chemical Comp. Se solubilizó una porción de la proteína en tampón
KCl 100 mM, pH 7,4, a una concentración final de proteína de 0,5
mg/ml; esta proteína fue denominada "normal" y se guardó a
-80ºC hasta su uso. Se convirtió la segunda porción de la proteína
en amiloide según se ha descrito [Lai, Colon y col. (1996),
Biochemistry 35(20): 6470-82]. Resumiendo,
se resuspendió la proteína en tampón KCl 100 mM, que contenía
acetato de sodio 50 mM, pH 4,4, a una concentración de proteína de
0,2 mg/ml y se incubó durante 72 h a 37ºC. Se denominó a esta
porción de la proteína "amiloide" y se la guardó a -80ºC hasta
su uso. La turbidimetría y el ensayo de unión a Rojo Congo
verificaron la conversión eficiente en amiloide [Lai, Colon y col.
(1996), Biochemistry 35(20):
6470-82]. Ambas proteínas fueron usadas como
patrones para el desarrollo del ensayo y para establecer la
sensibilidad y el rango de linealidad.
Los protocolos y los métodos de producción y
caracterización de anticuerpos están descritos en general en algún
otro sitio., Los datos descritos en éste y en los ejemplos
siguientes fueron generados con un anticuerpo policlonal
comercializado, producido frente a la TTR humana purificada
(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY).
En el ensayo directo, cada muestra de proteína
tomada de la curva de dilución de las formas normal y amiloide de la
TTR fue dividida en dos alícuotas: (1) no tratada y denominada
"nativa" y (2) mezclada con GdnHCl 4M final/1% de Sarcosyl y
calentada durante 5 min a 100ºC y denominada "desnaturalizada"
(sometida a un tratamiento de despliegue). Ambas muestras fueron
diluidas 20 veces con H_{2}O y se cargaron alícuotas en una placa
de poliestireno activada con un 0,2% de glutaraldehído durante 2 h.
Se bloquearon las placas, incubadas durante la noche a 5ºC, con
TBS, pH 7,8, que contenía un 0,5% (p/v) de BSA y un 6% (p/v) de
sorbitol. En la siguiente etapa, se lavaron las muestras tres veces
con TBS, pH 7,8, que contenía un 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se
incubaron con anticuerpos primarios frente a TTR (Accurate Chemical
and Scientific Corporation, Westbury, NY), se lavaron y se revelaron
después con anticuerpos secundarios marcados con europio frente a
IgG de conejo (Wallac Inc., Turku, Finlandia). Se revelaron las
placas después de 7 etapas adicionales de lavado en solución de
intensificación y se contó la señal en un Fluorómetro DELFIA 1234
(Wallac Inc., Turku, Finlandia).
La razón entre la afinidad de anticuerpos por la
forma desnaturalizada (desplegada) y por la nativa de la TTR humana
normal está en un amplio rango de concentración para el anticuerpo
policlonal 1-3.3. La razón para la forma amiloide
de la TTR es, a lo largo de todo el rango de linealidad, de entre
0,7 y 1,0 (Figura 18). El "índice de amiloide TTR" da una
indicación relativa de la presencia de TTR patógena insoluble
formadora de amiloide. Este modo de ensayo TTR está siendo usado de
modo directo en cerebro, muestras de tejidos, fluidos corporales o
productos farmacéuticos tras la determinación del índice para
controles normales.
Usando la fórmula del ensayo directo (Figura 19),
se puede calcular la cantidad de la forma amiloide de la TTR en
nervios periféricos, muestras de tejidos, fluidos corporales o
productos farmacéuticos. En la fórmula (Figura 19), el aumento de
señal menor de lo esperado para la conformación normal es
proporcional a la cantidad de TTR en conformación amiloide.
Se incuban alícuotas de una solución de 0,2 mg/ml
de la forma normal de la TTR sintética o de péptidos
correspondientes recombinantes o sintéticos de la TTR en tampón KCl
100 mM que contiene 50 mM de acetato de sodio, pH 4,4, durante 72 h
a 37ºC con concentraciones 10^{-3} a 10^{-6} de los compuestos
orgánicos estudiados. Se dividen entonces las muestras en dos
alícuotas: (1) no tratada, que contiene un 1% de Sarcosyl y
denominada "nativa", y (2) mezclada con GdnHCl 4M final/1% de
Sarcosyl y calentada durante 5 min a 100ºC, denominada
"desnaturalizada". Ambas muestras son diluidas 20 veces con
H_{2}O y se cargan alícuotas en una placa de poliestireno
activada con glutaraldehído. Se bloquearon las placas, incubadas
durante la noche a 5ºC, con TBS, pH 7,8, que contenía un 0,5% (p/v)
de BSA y un 6% (p/v) de sorbitol. En la siguiente etapa, se lavaron
las muestras tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía un 0,05%
(v/v) de Tween® 20, y se incubaron con anticuerpo policlonal
anti-TTR (Accurate Chemical and Scientific
Corporation, Westbury, NY) y luego con anticuerpo
anti-conejo marcado con Eu. Se revelaron las placas
después de 7 etapas adicionales de lavado en solución de
intensificación y se contó la señal en un Fluorómetro DELFIA 1234
(Wallac Inc., Turku, Finlandia).
Se calcula el grado de conversión de la
conformación normal a la amiloide de la TTR por el "índice de
amiloide" (Figura 18) o, alternativamente, por la fórmula
(Figura 19). Cualquier compuesto que inhiba la conversión de la
conformación normal estabilizada de la TTR puede tener un potencial
terapéutico in vivo para prevenir la formación de amiloide
madura.
Se infectaron hámsteres Sirios (LVG/LAK) por
inyección intracerebral de los siguientes aislados de scrapie
adaptados a hámster, es decir, que se infectaron diferentes grupos
de hámsteres con cepas individuales de priones como sigue: Drowsy
(Dy), 139H, Hyper (Hy), Me7, MT-C5 y Sc237. Los
animales fueron sacrificados en las fases terminales de la
enfermedad y se congelaron inmediatamente los cerebros y se
guardaron a -70ºC. Se homogeneizaron los cerebros sobre hielo por
golpes de 3x30 seg de un homogeneizador PowerGen (Fisher Scientific,
Pittsburgh, PA) en PBS, pH 7,4, que contenía un cóctel de
inhibidores de proteasas (PMSM 5 mM, aprotinina y leupeptina 4
\mug/ml). Se centrifugaron los homogeneizados resultantes al 10%
(p/v) durante 5 min a 500 x g en una centrífuga de mesa. Se mezcló
el sobrenadante 1:1 con Sarcosyl al 4% en PBS, pH 7,4, y se dividió
en dos alícuotas: (1) no tratada y denominada nativa, y (2) mezclada
con una concentración final de GdnHCl 4M y calentada durante 5 min a
80-100ºC y denominada desnaturalizada -sometida a un
tratamiento de despliegue. Ambas muestras fueron diluidas 20 veces
con H_{2}O y se cargaron alícuotas en una placa de poliestireno
activada durante 1 h con glutaraldehído al 0,2% en PBS. Se
bloquearon las placas, incubadas durante la noche a 5ºC, con TBS, pH
7,8, que contenía un 0,5% (p/v) de BSA y un 6% (p/v) de sorbitol. En
la siguiente etapa, se lavaron las muestras tres veces con TBS, pH
7,8, que contenía un 0,05% (v/v) de Tween® 20, y se incubaron
durante 2 h con anticuerpo monoclonal 3F4 marcado con europio. Se
revelaron las placas después de 7 etapas adicionales de lavado en
solución de intensificación proporcionada por el proveedor del
marcaje de europio (Wallac Inc., Turku, Finlandia) y se contó la
señal en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku,
Finlandia). Se calcularon el contenido en PrP^{Sc} y el "índice
priónico" (razón de anticuerpo que se une a la proteína PrP
desnaturalizada (desplegada):nativa como se ha descrito en los
Ejemplos 11 y 8 se representaron en coordenadas xy como se muestra
en la Figura 24. Se podía suponer que otras muestras estudiadas y
que dieran lugar a los mismos cálculos tenían la misma cepa de
prion en ellas.
Se infectaron hámsteres Sirios (LVG:Lak) por
inyección intracerebral de los siguientes aislados de scrapie
adaptados a hámster: Drowsy (Dy), 139H, Hyper (Hy),
Me7-H, MT-C5, Sc237, SHa(Me7)
y SHa(RML). Se pasó la cepa Sc237, descrita por Marsh y col.,
J. Infect. Dis. 131: 104-110 (1975),
repetidamente en hámsteres Sirios dorados (LVG:Lak, Charles River
Laboratories). Esta cepa parece ser indistinguible de la cepa 236K
(véase Kimberlin y col., J. Gen. Virol. 34:
295-304 (1977)). La cepa MT-C5 fue
aislada en hámsteres Sirios (LVG:Lak) a partir de una vaca
infectada con un segundo pase de scrapie de oveja (véase Hebbs y
col., Bovine Spongeform Encephalopathy: The BSE Dilema,
84-91 (Springer, NY, 1996). Para el aislado de
hámster Me7, véase Kimberlin y col. Las cepas de hámster DY y HY
están descritas por Marsh y col., J. Gen. Virol. 72:
589-594 (1991). El aislado 139A fue obtenido
después de más de 20 pases del aislado Chandler en ratones (véase
Dickenson y col., Slow Virus Disease of Animals in A Man (ed.
Kimberlin, RH), 209-241 (North Holland Pub,
Amsterdam 1976)). El pase de priones 139A de ratón en hámsteres
Sirios dorados LVG:Lak produjo el aislado 139H (Kimberlin y col.,
Micro. Pathog. 2: 405-415 (1987)). Después
de seis pases en hámster Sirio, los priones 139H eran según
Kimberlin y col. Las cepas SHa(Me7) y SHa(RML) fueron
generadas por pase de la cepa Me7 del scrapie a través de
Tg(MH2M) quiméricos y luego dos veces en hámsteres Sirios
(Scott y col., J. Virol. 71: 9032-9044
(1997)).
Los animales fueron sacrificados en las fases
terminales de la enfermedad y se congelaron inmediatamente los
cerebros a -70ºC. Los cerebros fueron homogeneizados sobre hielo por
tres golpes de 30 seg de un homogeneizador PowerGen (Fisher
Scientific, Pittsburgh, PA) en PBS, pH 7,4, que contenía
inhibidores de proteasas (PMSF 5 mM, aprotinina y leupeptina 4
\mug/ml de cada). Se centrifugaron los homogeneizados resultantes
al 10% (p/v) durante 5 min a 500 x g en una centrífuga de mesa y se
mezcló el sobrenadante 1:1 con un Sarcosyl al 4% en PBS, pH
7,4.
Se determinó el título de los priones Sc237 en
homogeneizado de cerebro al 5% (p/v) por medio de un ensayo de
tiempo de incubación en grupos de 4 hámsteres Sirios, según
describen Prusiner y col., Cell 35: 349-358
(1983).
Para el desarrollo y la calibración de
inmunoensayos dependientes de conformación, se replegó
SHaPrP(90-231) recombinante en conformación
\alpha- helicoidal o \beta-laminar según se ha
descrito (Mehlhorn y col., Biochemistry 35:
5528-5537 (1996)). Se usó PCR
(Perkin-Elmer) para amplificar el ADN
correspondiente a diferentes porciones de SHaPrP para ligar en
vectores de secreción de Escherichia coli. Se secuenciaron
los clones que contenían el inserto PrP y se transformaron en la
cepa de expresión deficiente en proteasas 27C7 (ATCC# 55244). Para
la purificación, se resuspendieron 100 g de pasta de E. coli
en 1 L de Tris-HCl 25 mM, pH 8,0/EDTA 5 mM (tampón
A). Se centrifugó a 10.000 x g durante 20 min y se desechó el
sobrenadante, que contenía proteínas periplásmicas solubles. Se
resuspendió la pella en 1 L de tampón A, se pasó a través de un
disruptor celular dos veces (Microfluidics International, modelo
MF110) y se centrifugó a 30.000 x g durante 1 h, tras de lo cual se
desechó el sobrenadante y se lavó la pella una vez en tampón A y se
centrifugó de nuevo a 30.000 x g durante 1 h. Se solubilizó la
pella a continuación en GdnHCl 8 M/Tris-HCl 25 mM,
pH 8,0/DTT 100 mM (tampón B) y se separaron alícuotas de 6 ml del
sobrenadante, que contenía \sim 200 mg de proteína total, por
cromatografía de exclusión por tamaños (SEC), seguido de
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase invertida
(RP-HPLC) empleando una columna C-4
de 25 mm x 25 cm (Vydac); Tampón 1: H_{2}O/TFA 0,1%, Tampón 2:
acetonitrilo/TFA 0,09%, velocidad de flujo 5 ml/min.
Se concentraron muestras de la proteína reducida
y de la forma oxidada replegada usando un Centricon (Amicon) con un
corte de peso molecular de 10.000 Da. El tampón para la proteína
reducida era MES 10 mM, pH 6,5, mientras que la forma oxidada fue
concentrada en el tampón de replegamiento antes descrito. La
espectroscopía de dicroísmo circular (CD) en un espectropolarímetro
Jasco 720, según describen Safar y col., J. Biol. Chem. 268:
20276-20284 (1993), confirmó que la proteína
reducida se replegaba en una conformación
\beta-laminar y que la proteína oxidada se
replegaba en una conformación
\alpha-helicoidal.
Se purificó SHaPrP^{c} de un modo similar al
descrito por Pan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
10962-10966 (1993). Se determinó el contenido en
proteína por análisis de aminoácidos. La pureza de la PrP^{c} era
del 95%, según se demuestra por SDA-PAGE seguida de
tinción con plata y de Western blot.
Se purificó la SHaPrP^{Sc} a partir de un pool
estándar de cerebros de hámster infectados con la cepa de scrapie
Sc237 de un modo similar al descrito por Turk y col., Eur. J.
Biochem. 176: 21-30 (1988). La infectividad de
este pool era de 7,3 DI_{50}/ml, según se determinó por medio de
un ensayo de tiempo de incubación en hámsteres Sirios tras
inoculación intracerebral, y la infectividad específica era de 8,2
DI_{50}/ml de PrP^{Sc}. Se consideró que la preparación era
homogénea, con una banda mayor en SDA-PAGE después
de la tinción con plata y de los Western blots.
Los datos fueron generados con el anticuerpo
monoclonal 3F4, descrito en Kascsak y col., J. Virol. 61:
3688-3693 (1987). Se purificó la IgG a partir de
fluido ascítico por cromatografía en Proteína A en una columna de
FPLC de Pharmacia y se marcó con un quelato de europio de ácido
N-(p-isotiocianatobencil)dietilentriamina-N^{1},N^{2},N^{3},
N^{3}-tetraacético (DTTA) a pH 9,6 durante 16 h a
temperatura ambiente, según los protocolos del fabricante (Wallac
Inc., Turku, Finlandia). La razón molar final Eu/IgG era de 13.
Se dividió cada muestra en dos alícuotas:
i) no tratada y denominada nativa y ii) mezclada con
GdnHCl a una concentración final de 4 M, calentada durante 5 min a
80ºC y denominada desnaturalizada (sometida a tratamiento de
despliegue). Ambas muestras fueron inmediatamente diluidas 20 veces
con H_{2}O que contenía inhibidores de proteasas (PMSF 5 mM,
aprotinina y leupeptina, 4 (PMSF 5 mM, aprotinina y leupeptina, 4
\mug/ml de cada) y se cargaron alícuotas en una placa de
poliestireno de 96 pocillos que había sido previamente activada
durante 1 h con glutaraldehído al 0,2% en PBS, pH 7,4. Se incubaron
las placas durante la noche a 5ºC y se bloquearon después con TBS,
pH 7,8, que contenía un 0,5% (p/v) de BSA y un 6% (p/v) de sorbitol,
durante 2 h a temperatura ambiente. En la etapa siguiente, se
lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía un 0,05% (v/v) de
Tween 20, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h con
anticuerpos 3F4 marcados con europio. Se revelaron las placas
después de siete etapas de lavado en solución de intensificación,
proporcionada por el proveedor del marcaje de europio (Wallac Inc.,
Turku, Finlandia), y se contó la señal en un fluorómetro DELFIA 1234
(Wallac Inc., Turku, Finlandia).
Se calibró el ensayo para diferentes
conformaciones de PrP en presencia de un homogeneizado de cerebro al
5% (p/v) obtenido de ratones deficientes en PrP
(PrnP^{0/0}) según describen Büehler y col., Nature
356: 577-582 (1992). Se dio un impulso al
homogeneizado con SHaPrP(90-231) recombinante
purificada en conformaciones \alpha-helicoidal y
\beta-laminar, según se determinó por
espectroscopía CD, y con PrP^{c} y PrP^{Sc} purificadas de
cerebros SHa. Se representaron los datos de la unión de anticuerpos
a SHaPrP(90-231)
\alpha-helicoidal recombinante desnaturalizada o
a PrP^{c} de cerebro SHa en función de la unión a la proteína
nativa y se ajustaron mediante el programa de regresión de mínimos
cuadrados para obtener el coeficiente de correlación
f_{\alpha}.
Se denominó a la razón entre la unión de IgG
marcada con Eu a PrP en la conformación nativa y la desnaturalizada
(desplegada), medida por TRF, TRF_{D}/TRF_{N}. Lo que sigue es
un modelo matemático que puede ser utilizado para calcular el
contenido de PrP con estructura \beta-laminar en
una muestra desconocida directamente:
(formula
1)[PrP_{\beta}] \sim \Delta TRF_{\beta} =
TRF_{D}-(TRF_{N} \text{*}
f_{\alpha})
En la fórmula 1, un exceso de unión de anticuerpo
a la proteína PrP en la transición del estado nativo al
desnaturalizado (desplegado) por encima de lo esperado para la
conformación \alpha-helicoidal es directamente
proporcional a la cantidad de proteína PrP en conformación
\beta-laminar.
Los símbolos de las ecuaciones son los
siguientes: \DeltaTRF_{\beta}, cambio en la fluorescencia con
resolución temporal de PrP en conformación
\beta-laminar durante la transición del estado
nativo al desnaturalizado;
TRF_{D}, fluorescencia con resolución temporal
de PrP en estado desnaturalizado (es decir, desplegado);
TRF_{N}, fluorescencia con resolución temporal
de PrP en conformación nativa, y
f_{\alpha}, coeficiente de correlación para la
dependencia de TRF_{D} con respecto a TRF_{N} obtenido con
homogeneizado de cerebro SHa reducido seriadamente diluido y con
SHaPrP^{c} purificada. Se obtuvo el coeficiente ajustando el
gráfico de la unión de anticuerpos a proteína desnaturalizada
(desplegada)/nativa con el programa de regresión de mínimos
cuadrados no lineal.
Se mezcló homogeneizado de cerebro [5% (p/v)] que
contenía un 2% de Sarcosyl con una solución stock que contenía un 4%
de fosfotungstato de sodio (NaPTA) y MgCl_{2} 170 mM, pH 7,4, para
obtener una concentración final de NaPTA al
0,2-0,3%. Típicamente, se incubaron muestras de 1 ml
durante 16 h a 37ºC en una plataforma oscilante y se centrifugaron a
14.000 x g en una centrífuga de mesa (Eppendorf) durante 30 min a
temperatura ambiente. Se realizó un tratamiento eventual con 25
\mug/ml de proteinasa K durante 1 h a 37ºC antes o después de la
precipitación (pretratamiento descontaminante). Se resuspendió la
pella en H_{2}O que contenía inhibidores de proteasas (PMSF 0,5
mM, aprotinina y leupeptina, 2 \mug/ml de cada) y se estudió por
el inmunoensayo dependiente de conformación de la invención.
Se mezclaron manualmente alícuotas de
homogeneizados de cerebro al 5% (p/v) en PBS, pH 7,4, que contenía
un 2% de Sarcosyl y un cóctel de inhibidores de proteasas (PMSF 0,5
mM, aprotinina y leupeptina, 2 \mug/ml de cada) hasta la
concentración final de GdnHCl y una concentración constante de
proteína en la muestra y se equilibró durante 16 h a 23ºC. se
controló la concentración de la solución stock de GdnHCl 8 M
(Pierce, Rockford, IL) en TBS, pH 7,4, por refractometría. Se
diluyeron las muestras equilibradas 20 veces hasta la misma
concentración final de proteína y de GdnHCl y se estudiaron con IgG
3F4 marcada con Eu en inmunoensayos dependientes de conformación
como se ha descrito.
Los datos brutos de cada ensayo fueron
convertidos en una razón de unión de anticuerpo a PrP
desnaturalizada (desplegada)/nativa o el cambio fraccionado
aparente de despliegue: Fapp, Safar y col., J. Biol. Chem.
268: 20276-20284 (1993), y Safar y col.,
Biochemistry 33: 8875-8883 (1994), usando la
fórmula F_{app} =
(Y_{obsd}-Y_{N})/(Y_{U}-Y_{N}),
donde Y_{obsd} es el valor observado del parámetro e Y_{N} e
Y_{U} son los valores de los parámetros para las formas nativas y
desplegadas, respectivamente, a la concentración dada de GdnHCl.
Se prepararon muestras en rejillas de cobre de
1.000 mallas revestidas de carbono a las que se descargó de brillo
antes de la tinción. Se absorbieron muestras de 5 \mul durante
\sim 30 seg y se lavaron con 2 gotas de agua. Se obtuvo el
contraste por el NaPTA retenido como tinción positiva procedente de
la etapa de precipitación con NaPTA en la preparación; no se usó
tinción adicional. Después de secar, se visualizaron las muestras
en un microscopio electrónico Jeol 100CX II a 80 kV a un aumento
estándar de 40.000. Se calibró el aumento con cristales de catalasa
con tinción negativa.
La presente invención es aquí mostrada y descrita
en lo que se considera las realizaciones más prácticas y preferidas.
Se reconoce, sin embargo, que se pueden hacer cambios en la misma
siempre que queden dentro del alcance de la invención y que se le
ocurrirán modificaciones obvias a un experto en la técnica tras la
lectura de esta descripción.
Claims (11)
1. Un método de determinación de la cantidad de
una forma sensible al tratamiento de una conformación ligada a la
enfermedad de una proteína en una unidad de muestra, consistente
en:
determinar la cantidad total de la conformación
ligada a la enfermedad de una proteína en una cantidad unitaria de
una muestra;
someter la muestra a un tratamiento en
condiciones suficientes para hidrolizar substancialmente toda la
proteína de la muestra, excepto la proteína ligada a la enfermedad
insensible al tratamiento;
determinar la cantidad de proteína ligada a la
enfermedad insensible al tratamiento en una cantidad unitaria de
muestra sometida al tratamiento, y
restar la cantidad de proteína insensible al
tratamiento de la cantidad total de proteína ligada a la enfermedad
para obtener la cantidad de proteína ligada a la enfermedad
sensible al tratamiento en la muestra.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
muestra deriva de un animal y el tratamiento incluye el contacto con
una proteasa,
donde la cantidad total de conformación ligada a
la enfermedad de la proteína y la cantidad de proteína insensible al
tratamiento son determinadas usando una metodología capaz de
detectar concentraciones de proteína a lo largo de un rango de
cinco órdenes de magnitud o más, y
donde además la conformación ligada a la
enfermedad de la proteína está presente en la muestra en una
concentración de 1 x 10^{3} partículas/ml o menos.
3. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde la conformación ligada a la enfermedad
de la proteína es seleccionada entre el grupo consistente en
proteína \betaA4, PrP^{Sc} y transtiretina.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde la conformación ligada a la enfermedad
de la proteína es PrP^{Sc} y el tratamiento es seleccionado entre
el grupo consistente en calor por encima de 80ºC, presión y
tratamiento químico en una cantidad suficiente para hidrolizar
substancialmente toda la proteína en la muestra, excepto PrP
27-30, que es la proteína resistente al
tratamiento.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, que además incluye:
la determinación de la razón de proteína ligada a
la enfermedad sensible al tratamiento con respecto a la proteína
ligada a la enfermedad total y
la comparación de la razón determinada con una
razón conocida de una cepa conocida de proteína ligada a la
enfermedad, para así determinar la cepa de la proteína ligada a la
enfermedad de la muestra;
donde la proteína ligada a la enfermedad es
PrP^{Sc} y la cepa conocida de PrP^{Sc} es una cepa seleccionada
entre el grupo consistente en: Drowsy, 139H, Hyper, Me7,
MT-C5, RML y Sc237.
6. Un método de determinación de la cantidad de
PrP^{Sc} sensible a proteasas en una muestra, consistente en:
determinar la cantidad total de PrP^{Sc} en una
cantidad unitaria de una muestra;
someter la muestra a un tratamiento limitado con
proteasas con una proteasa en condiciones suficientes para
hidrolizar substancialmente toda la proteína de la muestra, a
excepción de la PrP^{Sc} insensible a las proteasas;
determinar la cantidad de PrP^{Sc} insensible
al tratamiento en una cantidad unitaria de muestra sometida a
tratamiento con proteasas, y
restar la cantidad de la PrP^{Sc} insensible al
tratamiento de la cantidad total de PrP^{Sc} para obtener la
cantidad de PrP^{Sc} sensible al tratamiento en la muestra.
7. El método de la reivindicación 6, donde se
determinan las cantidades de PrP^{Sc} total usando una metodología
capaz de detectar concentraciones de proteína en un rango de cinco
órdenes de magnitud o más.
8. El método de las reivindicaciones 4, 6 ó 7,
donde la cantidad de PrP^{Sc} total y la de PrP^{Sc} insensible
al tratamiento son determinadas usando fluorescencia con resolución
temporal y aumento de disociación.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 4, 6 ó 7, donde la cantidad de PrP^{Sc} total y
la de PrP^{Sc} insensible al tratamiento son determinadas usando
un fluorómetro de doble longitud de onda accionado por láser.
10. El método de las reivindicaciones 4, 6 ó 7,
que además incluye:
la determinación de la razón de PrP^{Sc}
sensible al tratamiento con respecto a la PrP^{Sc} total y
la comparación de la razón determinada con una
razón conocida de una cepa conocida de PrP^{Sc} para así
determinar la cepa y el tiempo de incubación de la PrP^{Sc} en la
muestra.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 4, 6 ó 7, que además incluye:
representar la cantidad de PrP^{Sc} sensible a
proteasas en una cantidad unitaria de muestra en un gráfico del
tiempo de incubación frente a la cantidad de PrP^{Sc} sensible en
una cantidad unitaria de muestra, cuyo gráfico incluye los datos
representados de cepas conocidas de PrP^{Sc}, y determinar de este
modo el tiempo de incubación de la cepa y el tiempo de incubación
de PrP^{Sc} en la muestra.
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