ES2218807T3 - Ensayo para la deteccion de una forma conformacional de una proteina relacionada con una enfermedad. - Google Patents
Ensayo para la deteccion de una forma conformacional de una proteina relacionada con una enfermedad.Info
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Abstract
Se describe un procedimiento de análisis que hace posible determinar la presencia de una conformación relacionada con una enfermedad de una proteína (por ejemplo, PrP{sup,Sc} o la forma de l mina {be} de {be}A4) en una muestra. Una muestra se divide en dos porciones y la primera porción forma enlaces cruzados con un primer soporte sólido y después entra en contacto con un anticuerpo marcado que se une a una forma de la proteína no relacionada con la enfermedad con un mayor grado de afinidad (por ejemplo, de 4 a 30 veces mayor) que a la forma de la proteína relacionada con la enfermedad para cambiar la conformación a una forma con una mayor afinidad de unión por el anticuerpo marcado. La segunda porción tratada después se une a un segundo soporte sólido y entra en contacto con el anticuerpo marcado. Se determina el nivel de unión del anticuerpo marcado a una proteína en la primera y segunda porciones y se comparan las cantidades medidas en cada una. La diferencia entre las dos mediciones esuna indicación de si la conformación de la proteína relacionada con la enfermedad estaba presente en la muestra. El procedimiento también puede determinar la concentración de la conformación relacionada con la enfermedad y la cepa particular presente.
Description
Ensayo para la determinación de una forma
conformacional de una proteína relacionada con una enfermedad.
La presente invención se refiere en general a
inmunoensayos. Más particularmente, la invención se refiere a un
ensayo que permite la detección de una forma conformacional
relacionada con una enfermedad producida por una proteína (tal como
PrP^{Sc}) que puede tener afinidad de unión a anticuerpos muy
reducida y que permite además la identificación de la cepa
particular responsable de la enfermedad.
Los priones son patógenos infecciosos que causan
enfermedades producidas por priones invariablemente fatales
(encefalopatías espongiformes) del sistema nervioso central en seres
humanos y animales. Los priones se diferencian significativamente
de las bacterias, virus y viroides. La hipótesis dominante es que
no se necesita ácido nucleico para permitir que ocurra la
infectividad de una proteína prión.
Un paso importante en el estudio de priones y de
las enfermedades que éstos causan fue el descubrimiento y la
purificación de una proteína llamada proteína prión [Bolton,
McKinley et al (1982) Science
218:1309-1311; Prusiner, Bolton et al
(1982) Biochemistry 21:6942-6950;
McKinley, Bolton et al (1983) Cell
35:57-62]. Desde entonces, los genes que
codifican la proteína prión completos han sido clonados,
secuenciados y expresados en animales transgénicos. La PrP^{c}
es codificada por un gen hospedante de una sola copia [Basler, Oesch
et al (1986) Cell 46:417-428]
y, cuando se expresa la PrP^{c}, en general se halla en la
superficie externa de las neuronas. Muchas líneas de evidencia
indican que las enfermedades producidas por priones son
consecuencia de la transformación de la forma normal de la proteína
prión (PrP^{c}) en la forma anormal (PrP^{Sc}). No existe una
diferencia detectable en la secuencia de aminoácido de las dos
formas. No obstante, la PrP^{Sc}, al compararse con la PrP^{c},
posee una conformación con contenido mayor de hoja \beta y
contenido menor de hélice \alpha [Pan, Baldwin et al (1993)
Proc Natl Acad Sci EE. UU.
90:10962-10966; Safar, Roller et al
(1993) J Biol Chem 268:20276-20284].
La presencia de la forma anormal de PrP^{Sc} en cerebros de seres
humanos o animales infectados es el único marcador de diagnóstico
específico de la enfermedad, en enfermedades producidas por
priones.
La PrP^{Sc} cumple una función clave tanto en
la transmisión como en la patogénesis de enfermedades producidas por
priones (encefalopatías espongiformes) y es un factor crítico en la
degeneración neuronal [Prusiner (1997) The Molecular and Genetic
Basis of Neurological Disease, 2ª Edición: 103-143].
Las enfermedades producidas por priones más comunes en animales son
scrapie de ovejas y cabras y encefalopatía espongiforme en
ganadería bovina (BSE) [Wilesmith y Wells (1991) Curr Top
Microbiol Immunol 172:21-38]. Se han
identificado cuatro enfermedades producidas por priones en humanos:
(1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(ECJ), (3) Enfermedad de
Gerstmann-Streussler-Sheinker (GSS)
y (4) insomnio familiar fatal (IFF) [Gajdusek (1997) Science
197:943-960; Medori, Tritschler et al
(1992) N Engl J Med 326:444-449].
Inicialmente, la presentación de las enfermedades producidas por
priones heredadas en seres humanos planteaban una cuestión
intrincada que desde entonces ha sido explicada por el origen
genético celular de la PrP.
Los priones existen en aislamientos (cepas)
múltiples con distintas características biológicas cuando estas
cepas diferentes infectan en hospedantes genéticamente idénticos
[Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological
Disease, 2ª Edición:165-186]. Las cepas difieren
por el tiempo de incubación, por la topología de acumulación de la
proteína PrP^{Sc} y, en algunos casos, también por la
distribución y características de la patología cerebral [DeArmond y
Prusiner (1997) Greenfield's Neuropathology, 6ª
Edición:235-280]. Dado que la PrP^{Sc} es el
principal, y muy probablemente el único, componente de priones, la
existencia de cepas de priones ha planteado una cuestión intrincada
en cuanto a cómo la información biológica puede cifrarse en una
molécula que no sea una comprendida por ácidos nucleicos. Se ha
descubierto que el tratamiento proteolítico parcial de
homogeneizados cerebrales que contienen algunos aislamientos de
priones genera péptidos con movilidades electroforéticas levemente
diferentes [Bessen y Marsh (1992) J Virol
66:2096-2101; Bessen y Marsh (1992) J Gen Virol
73:329-334; Telling, Parchi et al (1996)
Science 274:2079-2082] Estos hallazgos sugirieron
diferentes sitios de escisión proteolítica debido a la conformación
diferente de moléculas de PrP^{Sc} en diferentes cepas de
priones. Alternativamente, las diferencias observadas podrían
explicarse mediante la formación de diferentes complejos con otras
moléculas, formando distintos sitios de escisión en la PrP^{Sc} de
diferentes cepas [Marsh y Bessen (1994) Phil Trans R Soc Lond B
343:413-414]. Algunos investigadores han propuesto
que los diferentes aislamientos de prión pueden diferir en los
diferentes patrones de glicosilación de la proteína prión
[Collinge, Sidle et al (1996) Nature
383:685-690; Hill, Zeidler et al (1997)
Lancet 349:99-100]. No obstante, la confiabilidad
tanto de los patrones de mapeo de péptidos como de glicosilación en
diagnósticos de cepas de priones múltiples aún se debate [Collings,
Hill et al (1997) Nature 386:564; Somerville, Chong et
al (1997) Nature 386:564].
Un sistema para detectar la PrP^{Sc} aumentando
la inmunoreactividad después de la desnaturalización se provee en
Serban, et al., Neurology, Vol. 40, No 1, Ja 1990. Un ensayo
directo lo suficientemente sensible y específico para PrP^{Sc}
infecciosa en muestras biológicas podría potencialmente anular
completamente la necesidad de inoculaciones animales.
Desafortunadamente, esto no parece ser posible con los ensayos de
PrP^{Sc} actuales; se estima que el límite de sensibilidad actual
de detección de PrP^{Sc} basada en proteinasa K y transferencia
western está en el intervalo de 1 \mug/ml, lo que corresponde a
10^{4}-10^{5} unidades infecciosas de prión.
Adicionalmente, la especificidad de los ensayos tradicionales
basados en proteinasa K para PrP^{Sc} merece consideración, en
vista de los hallazgos recientes de ninguna resistencia o
resistencia solamente relativa de proteinasa K de preparaciones de
priones indudablemente infecciosos [Hsiao, Groth et al (1994)
Proc Natl Acad Sci EE. UU.
91:9126-9130; Telling, et al (1996)
Genes & Dev. 10(14)
1736-1750].
La transtiretina (TTR) humana es una proteína de
plasma normal compuesta por cuatro unidades estructuradas
predominantemente de hoja \beta idénticas y sirve como portadora
de la hormona tiroxina. El autoensamblaje anormal de TTR en
fibrilas amiloides provoca dos formas de enfermedades humanas, a
saber amiloidosis sistémica senil (SSA) y polineuropatía amiloide
familiar (PAF) [Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol
6(1): 11-7]. El caso de formación
amiloide en PAF son mutaciones puntiformes en el gen de TTR; la
causa de SSA se desconoce. El diagnóstico clínico se establece
histológicamente, detectando depósitos de amiloide in situ
en material bióptico.
Hasta el momento, se sabe poco acerca del
mecanismo de conversión de TTR a amiloide in vivo. No
obstante, varios laboratorios han demostrado que la conversión a
amiloide se puede simular in vitro por desnaturalización
parcial de TTR humana normal [McCutchen, Colon et al (1993)
Biochemistry 32(45): 12119-27;
McCutchen y Kelly (1993) Biocherm Biophys Res Commun 197(2)
415-21]. El mecanismo de transición conformacional
comprende un intermediario conformacional monomérico que se
polimeriza a fibrillas amiloides estructuradas de amiloide
estructurada de hoja \beta lineal [Lai, Colon et al (1996)
Biochemistry 35(20):6470:82]. El proceso se
puede mitigar uniendo con moléculas estabilizadoras tales como
tiroxina o triiodofenol [Miroy, Lai et al (1996) Proc
Natl Acad Sci EE. UU. 93(26):
15051-6].
Kascsak et al (1993) Dev. Bio. Stand. 80,
141-151 describe el uso de anticuerpos para PrP en
el diagnóstico de encefalopatías espongiformes transmisibles. La
publicación internacional WO 93/23432 describe polipéptidos de
priones solubles con terminales C modificadas y métodos para
detectar los polipéptidos solubles. La patente estadounidense No
5.565.186 (Prusiner et al), patente estadounidense de los
presentes inventores, describe un método para detectar priones,
utilizando un animal transgénico. La publicación internacional WO
97/43649 describe chaperonas capaces de unirse a proteínas prión y
distinguir las isoformas de PrP^{c} y PrP^{sc}.
En vista de los puntos expuestos, existe
claramente la necesidad de un ensayo específico, altamente
transparente y rentable, para probar materiales de muestra para la
presencia de proteínas patogénicas, incluyendo proteína prión y
transtiretina. La invención presentada ofrece un ensayo no solo
capaz de detectar proteínas patogénicas sino de determinar la cepa
específica.
Existen dos procedimientos diferentes para
detectar niveles reducidos de una conformación de enfermedad de una
proteína. El método más simple requiere que se haya calculado un
estándar predeterminado y comprende proporcionar una muestra que se
presume contiene una proteína que asume dos conformaciones (una
primera conformación y una segunda conformación relacionada con
enfermedad), tratar la muestra para convertir cualquier proteína de
la segunda conformación en una conformación diferente que tiene
mayor afinidad de unión de anticuerpos, poner en contacto la
muestra tratada con un anticuerpo que se una a la proteína en su
primera conformación y/o a la conformación diferente que tiene una
afinidad mayor que la segunda conformación, determinar el nivel de
unión de anticuerpos a la proteína y comparar el nivel de unión con
el estándar predeterminado, determinando de este modo la
probabilidad de que la muestra contenga proteína en la segunda
conformación relacionada con enfermedad basada en la comparación.
La metodología aquí descrita permite la detección de la
conformación con enfermedad a un nivel de 1 x 10^{3} partículas/ml
o menos.
El ensayo de la invención también se puede llevar
a cabo sin utilizar un estándar predeterminado. Este método de
ensayo comprende (a) proporcionar una muestra que se presume
contiene una proteína (con una primera conformación y una segunda
conformación relacionada con enfermedad), (b) dividir la muestra en
primera y segunda porciones, (c) poner en contacto la primera
porción con un anticuerpo que se una a la primera conformación con
afinidad mayor que la segunda conformación, (d) tratar la segunda
porción para provocar que cualquier proteína en la segunda
conformación adopte una conformación diferente que tenga una
afinidad mayor hacia el anticuerpo, (e) poner en contacto la segunda
porción con el anticuerpo, (f) determinar los niveles relativos de
unión de anticuerpos a dichas primera y segunda porciones y (g)
determinar la presencia o ausencia de proteínas en la segunda
conformación en base a la comparación.
El ensayo de la invención es útil para ensayar
muestras que contienen proteínas, las cuales están presentes en al
menos dos conformaciones (p. ej., conformación con enfermedad y
conformación sin enfermedad nativa) y están presentes a niveles de 1
x 10^{3} partículas/ml o menos. La presente invención utiliza
anticuerpos que no se unen o tienen un grado de afinidad
relativamente reducido hacia la conformación de enfermedad
estrechamente configurada de la proteína. Un anticuerpo útil es el
anticuerpo monoclonal 263K 3F4 producido por la línea celular de
hibridoma ATCC HB9222 depositada el 8 de octubre de 1986 en
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852 y revelada y descrita en la patente
estadounidense 4.806.627, expedida el 21 de febrero de 1989,
incorporada por referencia a los anticuerpos revelados que se unen
selectivamente a PrP^{c}.
Un ejemplo específico del ensayo se puede llevar
a cabo proporcionando una muestra dividida en una primera porción y
una segunda porción. La primera porción está unida a un primer
soporte sólido y luego en contacto con un anticuerpo marcado que se
une a la forma sin enfermedad de la proteína con un grado mayor de
afinidad (p. ej., afinidad 4 a 30 veces superior) que el anticuerpo
que se une a la forma con enfermedad. La segunda porción de la
muestra se trata en un modo que provoca la forma de enfermedad
estrechamente unida de la proteína presente en la muestra (si la
hay) para asumir una conformación más relajada que tenga una
afinidad de unión superior al anticuerpo marcado. Después del
tratamiento, la segunda porción también se une a la superficie de
un soporte sólido. A partir de entonces, la segunda porción entra
en contacto con el mismo tipo de anticuerpos marcados utilizados en
la primera porción. En base a la cantidad de proteína unida a
anticuerpos en el soporte, se determina luego el nivel de proteína
en la primera porción. El nivel de proteína en la segunda porción
tratada se determina del mismo modo. Se determina la diferencia
entre ambas y si se observa que la cantidad de unión de anticuerpos
a proteínas en la segunda porción es significativamente mayor que
aquella de la primera porción, es posible deducir que la muestra
original contenía proteínas en la conformación relacionada con
enfermedad estrechamente unida. Además, mediante el uso de
fórmulas y un sistema de ensayo particularmente sensible de la
presente, es posible determinar la cantidad de la conformación
relacionada con enfermedad de la proteína presente en la muestra
original por unidad de volumen. Incluso, determinando la relación
entre la unión de anticuerpo a proteína desnaturalizada y la unión
de anticuerpo a proteína nativa, es posible determinar la cepa
particular de una proteína presente relacionada con enfermedad.
Para demostrar el concepto básico de la presente
invención, es necesario incluir una muestra inicial que se divida en
al menos dos porciones. La primera porción se pone en contacto con
anticuerpos marcados sin tratar las proteínas y la segunda porción
se trata con anticuerpos marcados después de que las proteínas han
sido tratadas en un modo que provoca que cualquiera de las
proteínas en la conformación con enfermedad asuma una conformación
con un grado superior de afinidad de unión hacia los anticuerpos.
Las lecturas se comparan (es decir, una se resta a la otra) y la
presencia de proteínas en la conformación relacionada con
enfermedad se deduce en base a la diferencia entre las dos
lecturas. No obstante, es posible utilizar el concepto básico de la
presente invención sin obtener dos lecturas para cada ensayo. Esto
se puede efectuar estableciendo un estándar basado en la
realización del ensayo en una cantidad estadísticamente
significativa de muestras muy relacionadas. Después de que se ha
establecido el estándar, se sabrá el nivel de unión de anticuerpos
que deberá observarse cuando la muestra no contenga ninguna proteína
en la conformación relacionada con enfermedad. Al utilizar el
estándar, se trata luego una muestra para posterior prueba, como
para convertir cualquier proteína de la conformación relacionada con
enfermedad en una conformación diferente con un grado muy superior
de afinidad de unión hacia los anticuerpos marcados. La medición
obtenida se compara luego con el estándar. Si la diferencia entre
el estándar y la medición obtenida está fuera de un intervalo
determinado, se puede deducir que la muestra original incluía
proteínas en la conformación relacionada con enfermedad.
Una tercera realización de la invención puede
utilizar cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas,
junto con las fórmulas provistas en la presente, con el fin de
calcular (cuantitativamente) el número de proteínas de la
conformación relacionada con enfermedad presentes dentro de la
muestra original.
En una cuarta realización, se determina la cepa
particular de la proteína infecciosa presente en una muestra. La
cepa se determina comparando el "índice de proteína" de la
muestra probada con el índice de proteína conocido de una cepa de
partícula de una proteína determinada. El "índice de proteína"
de la muestra se calcula determinando la relación entre la cantidad
de anticuerpo que se une a la forma desnaturalizada de la proteína
y la cantidad de anticuerpo que se une a la proteína nativa.
De acuerdo con cualquiera de los sistemas, es
preferible pretratar la muestra que está siendo probada en un modo
que disminuya la concentración de la conformación sin enfermedad en
relación con la concentración de la conformación con enfermedad de
la proteína. Por ejemplo, la muestra inicial se puede tratar
químicamente con un compuesto que preferentemente degrada la forma
relajada, sin enfermedad de la proteína y/o se expone a anticuerpos
que preferentemente se unen y en consecuencia eliminan la
conformación sin enfermedad de la proteína.
Puede ser posible aumentar más la sensibilidad de
distintos aspectos de la invención, concentrando la conformación con
enfermedad de una proteína, agregando un compuesto que
selectivamente se une a la conformación con enfermedad para formar
un complejo y centrifugando la muestra para precipitar el complejo
que se prueba luego de acuerdo con los métodos aquí descritos. Los
datos específicos respecto de dichos métodos de concentración se
describen en detalle en el número de expediente de abogado de
nuestra solicitud en tramitación con la presente 6510/098001,
presentada en la misma fecha que la presente solicitud titulada
"Procedimiento para concentración de proteínas con conformación
relacionada con enfermedad" (ahora publicada como
WO99/42487).
Las diferentes realizaciones del ensayo de la
invención anteriormente descritas son todas tipos de inmunoensayos
"directos", es decir, la muestra se ensaya directamente con el
anticuerpo marcado, ya sea con o sin tratamiento para cambiar la
conformación de cualquier proteína de conformación relacionada con
enfermedad presente en la muestra. También se puede utilizar un
ensayo "indirecto". Por ejemplo, puede ser conveniente
aumentar el número de proteínas relacionadas con enfermedad en la
muestra (si las hay), mediante el uso de un ratón transgénico y
reforzar de este modo cualquier señal obtenida.
Para llevar a cabo estas realizaciones de la
invención, la muestra se utiliza primero para inocular un ratón
transgénico al que se le ha modificado su genoma, de modo que
presentará síntomas de enfermedad al inocularse con proteínas de la
conformación relacionada con enfermedad. Después de inocular los
ratones, se deja transcurrir un período suficiente (p. ej., 30 días)
después del cual se sacrifica al animal transgénico y se utiliza
una muestra, tal como tejido cerebral homogeneizado del ratón, en
el ensayo directo anteriormente descrito. La presente invención
incrementa la capacidad de los ratones transgénicos para detectar
priones, reduciendo el período que debe transcurrir hasta que se
puede efectuar una determinación respecto de si la muestra original
incluía proteínas en la conformación relacionada con enfermedad.
También sería posible aplicar PrP marcada con epítopo, como se
describe en la publicación internacional WO 97/46572 para purificar
la afinidad de la PrP^{Sc} del cerebro de un ratón Tg y después
aplicar el ensayo de la presente invención. Sin la presente
invención, el ratón se inocula y se debe esperar hasta que el ratón
inoculado realmente demuestre síntomas de la enfermedad.
Dependiendo del ratón, esto puede llevar varios meses o incluso
años.
La metodología de ensayo de la presente invención
se puede aplicar a cualquier tipo de muestra, cuando se presume que
la muestra contiene una proteína que se presenta en al menos dos
conformaciones. La proteína debe presentarse en una conformación
que se una a anticuerpos conocidos, anticuerpos que se puedan
generar u otros elementos enlazantes específicos. La segunda
conformación debe ser suficientemente diferente de la primera
conformación en términos de su afinidad de unión, de modo que las
dos conformaciones puedan distinguirse utilizando anticuerpos o
elementos enlazantes con un grado muy superior de afinidad hacia la
primera conformación que hacia la segunda conformación. En su
forma conceptualmente más simple, la invención funciona de modo
óptimo cuando un anticuerpo conocido marcado se une a una forma sin
enfermedad de una proteína con un alto grado de afinidad y no se une
(o se une con un grado extremadamente bajo de afinidad) a la misma
proteína, cuando está presente en su conformación relacionada con
enfermedad. No obstante, en realidad, una proteína determinada
puede tener más de dos conformaciones. La proteína puede tener más
de un conformación sin enfermedad y más de una conformación
relacionada con enfermedad, (Telling et al, Science (1996)).
La invención es incluso útil cuando existen múltiples
conformaciones de formas con y sin enfermedad de la proteína,
siempre que (1) al menos una conformación sin enfermedad difiera de
al menos una conformación con enfermedad en términos de su afinidad
de unión; y (2) sea posible tratar la conformación relacionada con
enfermedad de la proteína como para incrementar sustancialmente su
afinidad de unión.
Como se indicó anteriormente, el ensayo de la
invención se puede utilizar para ensayar cualquier tipo de muestra
para cualquier tipo de proteína, siempre que la proteína incluya
una conformación sin enfermedad y una relacionada con enfermedad.
No obstante, la invención se desarrolló particularmente para
ensayar muestras para la presencia de (1) proteínas PrP y determinar
si la muestra incluyó una proteína PrP en su conformación con
enfermedad, es decir, incluyó PrP^{Sc} (2) formas insolubles de
\betaA4 asociadas con enfermedad de Alzheimer y (3)
transtiretina. Por consiguiente, gran parte de la siguiente
descripción se dirige a utilizar el inmunoensayo de la presente
invención para detectar la presencia de PrP^{Sc} (o a un grado
menor \betaA4 o transtiretina (TTR)) en una muestra,
entendiéndose que los mismos conceptos generales son aplicables
para detectar conformaciones relacionadas con enfermedad de una
amplia gama de diferentes tipos de proteínas. Asimismo, la
descripción se dirige particularmente a describir cómo determinar la
cepa particular de priones infecciosos (PrP^{Sc}) en una muestra,
entendiéndose que los mismos conceptos generales son aplicables
para determinar la cepa particular de otras proteínas compactas
asociadas con diferentes enfermedades.
El presente método de detección de PrP^{Sc} se
desarrolló marcando IgG purificada seleccionada con Europio. Los
anticuerpos utilizados poseen una gran afinidad de unión hacia la
PrP^{c} (conformación sin enfermedad) que comprende una
configuración \alpha-helicoidal. Los anticuerpos
poseen una afinidad de unión reducida hacia la PrP^{Sc}
(conformación con enfermedad) que comprende una configuración hoja
\beta. La IgG se puede obtener de anticuerpos monoclonales,
policlonales o recombinantes comunes, que típicamente reconocen la
secuencia 90-145 ó 222-231 de
PrP^{c} y proteína prión de modo conformacional no plegado.
Diferentes conformaciones de proteína prión recombinante se
reticularon químicamente a placas de poliestireno a través de una
etapa de activación de glutaraldehído. Las afinidades relativas de
la IgG marcada con Eu con conformación aleatoria en espiral,
\alpha-helicoidal y hoja \beta de proteína
prión de hámster sirio recombinante correspondientes a la secuencia
90-231 se determinaron por fluorescencia aumentada
por disociación de resolución en el tiempo en un formato de placa
de poliestireno de 96 pocillos.
Se puede efectuar una determinación de las
afinidades relativas de diferentes anticuerpos marcados hacia
proteínas mediante diferentes métodos. No obstante, la
conformación relacionada con enfermedad de una proteína a menudo
está presente en una concentración muy reducida en relación con
aquella de la conformación sin enfermedad. Por consiguiente, a
menudo requiere métodos muy sensibles para detectar cualquier
incremento causado por el tratamiento de la conformación con
enfermedad de la proteína. Un método particularmente sensible es
la fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el
tiempo.
Al calibrar cuidadosamente este método, es
posible detectar el incremento de señal en la reactividad de los
anticuerpos en la transición del estado conformacional hoja \beta
al estado desnaturalizado. Esta señal es relativamente grande
comparada con aquella obtenida de la transformación de su estado
\alpha-helicoidal nativo al estado relajado o
desnaturalizado tratado. Por lo tanto, el estado conformacional
original de la proteína prión se puede transferir mediante el
ensayo diferencial en estados nativo y tratado. Cuando se trata una
muestra que no contiene proteína en hoja \beta, se obtiene algún
incremento en la inmunoreactividad. Esta cantidad de incremento se
debe ajustar durante y después de hacerlo, de modo que se haga
referencia a la concentración o cantidad resultante como la
"cantidad ajustada". La cantidad de unión específica de
anticuerpos sobre aquella obtenida para una conformación
\alpha-helicoidal de PrP^{c} (más allá de la
cantidad ajustada) es una medida de la presencia de conformación
hoja \beta, que es esencial para patogenicidad e infectividad de
la PrP^{Sc}.
Un objeto primario de la invención es proveer un
inmunoensayo aplicable para ensayar muestras que contengan
proteínas, en donde se presuma que las muestras contienen una
proteína que se presenta dentro de una conformación relacionada con
enfermedad y una conformación sin enfermedad nativa (p. ej.,
proteína PrP, proteína \betaA4 y transtiretina).
Una ventaja de la presente invención es que el
inmunoensayo puede determinar rápida y precisamente la presencia de
proteínas en la conformación relacionada con enfermedad (p. ej.,
PrP^{Sc}, \betaA4 y transtiretina) aunque el anticuerpo
utilizado en el ensayo no se una o tenga un grado muy reducido de
afinidad de unión hacia la proteína en la conformación relacionada
con enfermedad, y la conformación relacionada con enfermedad esté
presente en una concentración menor que la conformación sin
enfermedad.
Otro objeto de la invención es proveer un ensayo
que hace posible no solo determinar (1) si está presente una
partícula patogénica en una muestra sino también (2) determinar la
concentración de las partículas en una muestra, y (3) determinar la
cepa particular de la partícula presente.
Una característica de la invención es que la
señal obtenida se puede aumentar mediante el uso de animales
transgénicos, p. ej., ratones que se utilizan para detectar la
presencia de una proteína en una muestra.
Otra característica es que la fluorescencia
aumentada por disociación de resolución en el tiempo se utiliza para
aumentar la sensibilidad.
Otra ventaja es que el ensayo puede detectar
niveles de conformación de enfermedad en una proteína a una
concentración de 1 x 10^{3} partículas/ml o menos.
Un objeto específico es proveer un ensayo de
diagnóstico para determinar la presencia de la proteína prión
infecciosa en materiales de muestra variables obtenidos o derivados
de tejidos y/o fluidos corporales de seres humanos, primate, mono,
cerdo, bovino, oveja, ciervo, alce, perro, gato, ratón y pollo.
Otro objeto específico es proveer un ensayo de
diagnóstico para determinar la presencia de proteína \betaA4 en
materiales de muestra variables obtenidos o derivados de tejidos
y/o fluidos corporales de seres humanos, primate, mono, cerdo,
bovino, oveja, ciervo, alce, perro, gato, ratón y pollo.
Otro objeto es proveer un ensayo rápido para
proteína prión infecciosa nativa en los cerebros de animales
transgénicos y no transgénicos inyectados con material de muestra
que potencialmente contiene priones.
Otro objeto es proveer un método para evaluar
procedimientos de descontaminación, ensayando el nivel de
desnaturalización de proteínas patogénicas (p. ej., priones o
\betaA4 en hoja \beta) después de dichos tratamientos.
Otro objeto es proveer un método rápido para
detectar diferentes compuestos a fin de evaluar su potencial en el
tratamiento de enfermedades asociadas con conformaciones con
enfermedad de diferentes proteínas, como puede ser detectando el
efecto estabilizante de compuestos en diferentes conformaciones de
proteínas (p. ej., PrP^{c} o conformación
\alpha-helicoidal de \betaA4) o su impacto
desestabilizante en la conformación patogénica (p. ej., PrP^{Sc}
o conformación hoja \beta de \betaA4) de una proteína.
Otro objeto es proveer un método rápido para
detectar diferentes compuestos farmacéuticos con potencial para
tratamiento de enfermedades producidas por priones, como puede ser
detectando el efecto estabilizante de los compuestos sobre una
conformación \alpha-helicoidal de una isoforma
normal de la proteína PrP^{c} o su impacto desestabilizante en la
conformación hoja \beta de la isoforma patogénica de la proteína
PrP^{Sc}.
Otra ventaja es que el procedimiento se puede
llevar a cabo sin un anticuerpo directamente capaz de reconocer una
conformación infecciosa de una proteína y sin utilizar una etapa de
proteinasa K para eliminar la señal de isoformas normales (sin
enfermedad) de la proteína, como PrP^{c}.
Otra ventaja es que en el procedimiento inventado
no hay necesidad de que el anticuerpo sea directamente capaz de
reconocer la conformación patogénica de \betaA4 o
transtiretina.
Una característica importante del ensayo es el
diseño rápido, rentable y altamente transparente que se puede
diseñar con la capacidad para detectar 96 muestras por día por placa
de 96 pocillos.
Otro aspecto de la invención es el método de
diagnóstico para detectar cuantitativamente TTR en la conformación
amiloide anormal en el material de muestra obtenido de fluidos
corporales, tejidos humanos y animales, y compuestos farmacéuticos.
El procedimiento inventado provee un método directo, sensible para
distinguir y cuantificar las conformaciones normales y amiloides de
TTR en una mezcla presente en materiales de muestra.
La determinación se basa en una medición de la
diferencia en afinidades de anticuerpos monoclonales o policlonales
con TTR en conformación normal o amiloide contra conformación en
espiral aleatoria. La presente invención describe tres métodos de
evaluación y la fórmula matemática utilizada para dicha
cuantificación.
Un objeto importante es proveer un ensayo de
diagnóstico específico para TTR patogénica en materiales de muestra
variables obtenidos o derivados de tejidos de seres humanos,
primate, mono, cerdo, bovino, oveja, ciervo, alce, canino, gato,
ratón y pollo.
Otro objeto es proveer un ensayo rápido para la
forma amiloide de TTR en animales transgénicos.
Otro objeto es proveer un método rápido para
detectar diferentes compuestos farmacéuticos con potencial para el
tratamiento de amiloidosis sistémica senil (SSA) y polineuropatía
amiloidótica familiar (PAF). Se detecta el efecto estabilizante de
dichos compuestos sobre la conformación normal de TTR o su impacto
desestabilizante sobre la conformación amiloide de TTR.
Otro objeto es proveer un método rápido para
detectar el impacto de diferentes mutaciones espontáneas y
diseñadas en el gen de TTR sobre la conformación, estabilidad y
formación amiloide de dichos productos génicos de TTR en animales
transgénicos que hospedan genes naturales o artificiales APP.
La ventaja específica es que el ensayo inventado
puede detectar formas patogénicas de TTR en una mezcla con formas no
patogénicas desnaturalizadas de la misma o en una mezcla con una
forma soluble de TTR, por ejemplo, detectar menos de 1 x 10^{3}
partículas por ml.
Éstos y otros objetos, ventajas y características
del procedimiento inventado serán obvios para aquellas personas con
experiencia en la técnica, al leer los detalles del método de
ensayo, el desarrollo y la prueba de anticuerpos y del ratón
transgénico a medida que se describan más detalladamente a
continuación, con referencia a las figuras anexas.
La Figura 1 es un espectrógrafo de la
conformación de SHaPrP90-231 recombinante de acuerdo
con lo determinado por espectroscopia de dicroismo circular (CD)
que muestra las dos bandas principales con mínimos a 208 y 222 nm,
que indican una conformación \alpha-helicoidal; la
banda negativa simple con mínimos a 217 nm es característica de una
conformación predominantemente hoja \beta;
la Figura 2 es un gráfico que muestra los
resultados de un ensayo competitivo de SHaPrP90-231
recombinante en conformaciones \alpha-helicoidal y
desnaturalizada en presencia de 5% de homogeneizado cerebral de
ratón PrP^{0/0} en el que la diferencia en los puntos de
cruzamiento e inclinación obtenida con IgG 3F4 marcada con Europio
indica que cada una de las conformaciones tiene tanto una afinidad
diferente como un número de sitios de unión y además en la que las
barras y puntos de datos representan \pmSEM promedio obtenido a
partir de cuatro mediciones independientes;
la Figura 3 es un gráfico que muestra la
calibración de un ensayo directo con SHaPrP90-231
recombinante en una conformación
\alpha-helicoidal, en presencia de 5% de
homogeneizado cerebral de ratón PrP^{0/0}, en el que las barras y
puntos de datos representan \pmSEM promedio obtenido a partir de
cuatro mediciones independientes;
la Figura 4 es un gráfico que muestra la
calibración de un ensayo directo con SHaPrP90-231
recombinante en una conformación hoja \beta, en presencia de 5%
de homogeneizado cerebral de ratón PrP^{0/0}, en el que las barras
y puntos de datos representan \pmSEM promedio obtenido a partir
de cuatro mediciones independientes;
la Figura 5 es un gráfico que muestra la
validación de entrada-salida de un ensayo directo
tanto para formas \alpha-helicoidal como hoja
\beta de SHaPrP90-231 en presencia de 5% de
homogeneizado cerebral de ratón PrP^{0/0}, en el que la cantidad
de la proteína en el eje x se determinó por análisis de aminoácidos
y la cantidad de proteína en el eje y, se calculó a partir del
ensayo;
la Figura 6 es un gráfico que muestra la relación
entre las señales de SHaPrP90-231 tratada
(desnaturalizada) y nativa en conformaciones \alpha- helicoidal y
hoja \beta, desarrolladas con IgG 3F4 marcada con Europio, en
donde las barras y puntos de datos representan \pmSEM promedio
obtenido a partir de cuatro mediciones independientes;
la Figura 7 es un gráfico que muestra los
resultados de un ensayo directo para la proteína PrP^{c} en
homogeneizados cerebrales de hámster, en el que los puntos de datos
y barras representan \pmSEM promedio obtenido a partir de cuatro
mediciones independientes;
la Figura 8 es un gráfico que muestra los
resultados de un ensayo directo para PrP^{c+Sc} en homogeneizados
cerebrales de hámster infectado con scrapie, en el que los puntos
de datos y barras representan \pmSEM promedio obtenido a partir
de cuatro mediciones independientes;
la Figura 9 es un gráfico que muestra la cantidad
total de proteínas PrP en cerebros de hámster normales y la
cantidad de PrP^{Sc} hoja \beta en ambos cerebros calculada a
partir del modelo, en el que los puntos de datos y barras
representan \pmSEM promedio obtenido a partir de cuatro mediciones
independientes;
la Figura 10 es un gráfico que muestra la
cantidad total de proteínas PrP en cerebros de hámster infectados
con scrapie y la cantidad de PrP^{Sc} hoja \beta en ambos
cerebros, calculada a partir del modelo, en el que los puntos de
datos y barras representan \pmSEM promedio obtenido a partir de
cuatro mediciones independientes;
la Figura 11 es un gráfico que muestra la
correlación de la infectividad y la cantidad de forma hoja \beta
de SHaPrP^{Sc}, según lo calculado a partir del ensayo directo y
la fórmula, en el que la SHaPrP^{Sc}purificada se sonicó en
presencia de 5% homogeneizado cerebral de ratón PrP^{0/0} y se
diluyó según lo descrito y en el que los puntos de datos y barras
representan \pmSEM promedio obtenido a partir de cuatro
mediciones independientes;
la Figura 12 es un gráfico de \betaA4
(1-40) tanto en conformaciones
\alpha-helicoidales como hoja \beta producidas
por espectroscopia de dicroismo circular (CD), que muestra los
enlaces principales a 208 y 222 nm para la conformación helicoidal
y una banda negativa simple a 217 nm para la conformación
predominantemente en hoja \beta (a pH 7,4);
la Figura 13 es un gráfico de un ensayo directo
de A4\beta (1-40) soluble;
la Figura 14 es un gráfico de un ensayo directo
de la forma hoja \beta de A4\beta (1-40);
la Figura 15 es un gráfico que muestra la
relación de A4\beta (1-40) desnaturalizada a
nativa ;
la Figura 16 muestra la conversión de
SHaPrP90-231 recombinante de conformación
\alpha-helicoidal a hoja \beta durante la
incubación a 37ºC durante 72 hs, según lo determinado por
espectroscopia de dicroismo circular (CD). La concentración de
proteína fue 5 mg/ml;
la Figura 17 muestra la conversión de
ShaPrP90-231 recombinante de conformación
\alpha-helicoidal a hoja \beta durante la
incubación a 37ºC durante 72 hs, según lo determinado por un ensayo
diferencial directo. La señal aumentada de conformación nativa a
\sim24 hs indica la desestabilización de la estructura nativa con
conformación más abierta, seguida por conversión a una estructura
secundaria en hoja \beta (véase Figura 16). La concentración de
proteína fue 5 mg/ml;
la Figura 18 muestra que tanto HFIP como glicerol
son capaces de prevenir la transición conformacional de \alpha a
\beta en ShaPrP90-231 recombinante. Los cambios
en la señal de TRF se expresan como la variación relativa, en la que
los valores positivos indican estabilización, desestabilización
negativa. Las condiciones experimentales fueron las de las Figuras
16 y 17;
Figura 19: El pentosan polisulfato estabiliza la
conformación nativa de ShaPrP90-231 a bajas
concentraciones; el rojo Congo no tiene efecto sobre la estabilidad
de ShaPrP90-231. Los cambios en la señal de TRF se
expresan como variación relativa, en la que el valor positivo indica
estabilización, desestabilización negativa. Las condiciones
experimentales fueron las de las Figuras. 16 y 17;
Figura 20: El detergente zwitteriónico
ZW3-12 desestabilizó la conformación nativa, de
Sha90-231 \alpha-helicoidal. Las
condiciones experimentales fueron las de las Figuras 16 y 17; los
cambios en la señal de TRF se expresan como variación relativa, en
la que el valor positivo indica estabilización, desestabilización
negativa;
la Figura 21 muestra la calibración de un ensayo
directo con TTR humana purificada en conformación normal. Las
placas se revelaron con anticuerpos primarios
anti-TTR (Accurate Chemical and Scientific
Corporation, Westbury, NY) y anticuerpo secundario
anti-conejo marcado con Eu. Los puntos de datos y
barras representan \pmSEM promedio obtenido a partir de cuatro
mediciones independientes;
la Figura 22 muestra la calibración de un ensayo
directo con TTR humana purificada en conformación amiloide. Las
placas se revelaron con anticuerpos primarios
anti-TTR y anticuerpo secundario
anti-conejo marcado con Eu. Los puntos de datos y
barras representan \pmSEM promedio obtenido a partir de cuatro
mediciones independientes;
la Figura 23 muestra la relación entre las
señales de TTR desnaturalizada y nativa en conformaciones normales
y amiloides, desarrolladas como se describió anteriormente. Los
puntos de datos y barras representan \pmSEM promedio obtenido a
partir de cuatro mediciones independientes;
Figura 24: Fórmula modificada para calcular la
cantidad de TTR en conformación amiloide a partir de los datos
obtenidos mediante el ensayo directo con anticuerpo policlonal
anti-TTR. Los cambios de la ecuación general
reflejan la relación inversa de los estados desnaturalizado y
nativo para formas normales y amiloides de TTR. La diferencia
entre la fluorescencia del estado desnaturalizado de la muestra y
aquella esperada para la transición de proteína normal nativa al
estado desnaturalizado es proporcionada a la cantidad de TTR en la
conformación amiloide. F_{n}, señal total de conformación nativa;
F_{nN} y F_{nA}, señales de conformaciones normales nativas y
amiloides, respectivamente; F_{d}, señal total de TTR en estado
desnaturalizado; F_{dN} y F_{dA} son las señales de estados
amiloides o normales desnaturalizados de TTR;
\DeltaF_{n-d}, el aumento total de la señal en
la transición de estados nativo a desnaturalizado;
\DeltaF_{Nn-d}, aumento en la señal de
conformación normal en la transición de estado nativo a
desnaturalizado; \DeltaF_{n d}, cambio en la señal de
conformación amiloide en la transición de estado nativo a
desnaturalizado; f_{Nn d}, factor de correlación para la
transición de estado nativo a desnaturalizado de TTR normal;
la Figura 25 es un gráfico del "índice de
prión" (que es la relación de unión de anticuerpos a proteína
PrP desnaturalizada frente a nativa) frente a la concentración de
PrP^{Sc} en \mug/ml. Los resultados exhibidos representan el
\pmSEM promedio obtenido a partir de tres cerebros diferentes de
hámsteres sirio LVG/LAK infectados con diferentes cepas de
priones.
Antes de describir los presentes ensayos y
métodos, se entenderá que la invención no está limitada a
anticuerpos, proteínas, marcadores, ensayos o métodos particulares,
los cuales, por supuesto, pueden variar. Asimismo, se entenderá
que la terminología utilizada en la presente tiene como fin
describir realizaciones particulares únicamente y no tiene como fin
ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará
limitado solamente por las reivindicaciones anexas.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el
mismo significado que comúnmente interpreta una persona con
experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta
invención. Si bien en la práctica o prueba de la presente
invención se puede utilizar cualquier método y material similar o
equivalente a aquellos descritos en la presente, los métodos y
materiales preferidos serán ahora descritos.
Las publicaciones analizadas en la presente se
proveen exclusivamente para la descripción anterior a la fecha de
presentación de la presente solicitud. No se interpretará que la
presente invención no está autorizada a anteceder a dicha
publicación en virtud de una invención anterior. Asimismo, las
fechas de publicación provistas están sujetas a cambio si se
descubre que la fecha de publicación real es diferente a la aquí
provista.
El término "proteína", como se utiliza en la
presente, tiene como fin abarcar cualquier secuencia de aminoácido
e incluir secuencias modificadas tales como glicoproteínas. El
término incluye péptidos y proteínas naturales, como así también
aquellos sintetizados recombinante o sintéticamente. Tal como se
utiliza en relación con la presente invención, el término
"proteína" tiene específicamente como fin cubrir proteínas
naturales que se presentan en al menos dos conformaciones
diferentes en donde ambas conformaciones tienen la misma o
sustancialmente la misma secuencia pero tienen tres estructuras
dimensionales diferentes. Las dos conformaciones de la proteína
incluyen al menos una conformación no relacionada con un estado de
enfermedad y al menos una conformación relacionada con un estado de
enfermedad patogénico. Un ejemplo específico y preferido de una
proteína, según lo utilizado en conexión con esta descripción, es
una proteína PrP que incluye la forma sin enfermedad denominada
forma PrP^{c} y la forma relacionada con enfermedad denominada
PrP^{Sc}. Si bien una proteína prión o la forma PrP^{Sc} de
una proteína PrP es infecciosa y patogénica, la conformación con
enfermedad de otras proteínas no es infecciosa aunque si
patogénica. Tal como se utiliza en la presente, el término
patogénico puede significar que la proteína realmente causa la
enfermedad o simplemente puede significar que la proteína está
asociada con la enfermedad y por lo tanto está presente cuando lo
está la enfermedad. Por lo tanto, una proteína patogénica, como se
utiliza en conexión con esta descripción, no es necesariamente una
proteína que es el agente causante específico de una
enfermedad.
Los términos "tratar", "tratamiento" y
similares se emplean aquí intercambiablemente para describir un
procedimiento mediante el cual una muestra o porción de la misma y
específicamente proteínas en la muestra se manipulan física y/o
químicamente, de modo de provocar que las proteínas en la muestra en
una conformación relacionada con enfermedad cambien a una
conformación diferente que tenga una afinidad de unión superior con
un elemento enlazante tal como un anticuerpo. Las proteínas
tratadas también se denominan proteínas desnaturalizadas o
parcialmente desnaturalizadas o proteínas en una conformación
relajada, cuya conformación aumenta la afinidad de unión de la
proteína al elemento enlazante tal como un anticuerpo. Tratar
incluye someter la muestra a calor, presión y/o compuestos
químicos. En una realización preferida, las muestras que contienen
PrP^{Sc} (que es la conformación relacionada con enfermedad que
comprende configuraciones estructurales hoja \beta) se tratan de
modo que la proteína asume una conformación diferente (p. ej., que
comprende una configuración \alpha-helicoidal y/o
una configuración en espiral aleatoria) que tiene cuatro veces o
más afinidad superior de unión a anticuerpos.
Los términos "proteína PrP", "PrP" y
similares se utilizan intercambiablemente en la presente y
significan tanto la forma PrP^{Sc} de partícula infecciosa que se
conoce que provoca enfermedades (encefalopatías espongiformes) en
seres humanos y animales, como la forma PrP^{c}no infecciosa que,
bajo condiciones apropiadas, se convierte a la forma PrP^{Sc}
infecciosa.
Los términos "prión", "proteína prión"
y "proteína PrP^{Sc}" y similares se utilizan
intercambiablemente en la presente para referirse a la forma
PrP^{Sc} infecciosa de PrP y es una contracción de las palabras
"proteína" e "infección". Las partículas están
comprendidas mayormente, si no exclusivamente, por moléculas de
PrP^{Sc} codificadas por un gen de PrP. Los priones son
distintos a las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos
infectan animales para causar scrapie, una enfermedad transmisible,
degenerativa del sistema nervioso de ovejas y cabras, como también
encefalopatía espongiforme en bovinos (BSE) o "enfermedad de la
vaca loca" y encefalopatía espongiforme felina en gatos. Las
cuatro enfermedades producidas por priones que se sabe afectan a
los seres humanos son (1) kuru, (2) Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (ECJ), (3) Enfermedad de
Gerstmann-Straussler-Sheinker (GSS)
y (4) insomnio familiar fatal (IFF). Tal como se utiliza en la
presente, "prión" incluye todas las formas de priones que
provocan todas y cada una de estas enfermedades u otras en
cualquier animal utilizado, y en particular, en seres humanos y
animales de granja domesticados.
La expresión "gen de PrP" se utiliza en la
presente para describir material genético que expresa proteínas,
incluyendo mutaciones patogénicas y polimorfismos conocidos. La
expresión "gen de PrP" se refiere en general a cualquier gen
de cualquier especie que codifica cualquier forma de una proteína
prión. Algunas secuencias de PrP comúnmente conocidas se describen
en Gabriel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.
89:9097-9101 (1992), patente estadounidense
5.565.186 y WO97/04814. El gen de PrP puede ser de cualquier
animal, incluyendo animales "hospedantes" y "de prueba"
descritos en la presente, y todos y cada uno de los polimorfismos y
mutaciones de los mismos, reconociéndose que los términos incluyen
dichos otros genes de PrP aún por descubrirse. La proteína
expresada por dicho gen puede asumir ya sea una forma PrP^{c}
(sin enfermedad) como PrP^{Sc} (con enfermedad).
El término "anticuerpo" equivale a una
proteína de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno.
Anticuerpo, tal como se utiliza en la presente, tiene como fin
incluir al anticuerpo en su totalidad, como también a cualquier
fragmento de anticuerpo (p. ej., F(ab)', Fab, Fv) capaz de
unirse al epítopo, antígeno o fragmento antigénico de interés. Los
anticuerpos preferidos para los ensayos de la invención son
inmunoreactivos o inmunoespecíficos y por lo tanto se unen
específica y selectivamente a una proteína de interés, p. ej., una
proteína amiloide A4\beta o una proteína PrP. Se prefieren los
anticuerpos inmunoreactivos e inmunoespecíficos tanto para la forma
sin enfermedad nativa como para la forma con enfermedad tratada,
pero no para la forma con enfermedad no tratada (p. ej., tanto para
PrP^{c} nativa y PrP^{Sc} tratada pero no para PrP^{Sc}
nativa). Los anticuerpos para PrP son preferentemente
inmunoespecíficos, p. ej., no sustancialmente reactivos cruzados con
materiales relacionados. Algunos anticuerpos específicos que se
pueden emplear en conexión con la invención se describen en la
solicitud PCT publicada, WO 97/10505. Los anticuerpos revelados en
la solicitud PCT que selectivamente se unen a PrP^{Sc} no deberán
utilizarse en la presente invención. El término "anticuerpo"
abarca todos los tipos de anticuerpos, p. ej., policlonales,
monoclonales y aquellos producidos por la metodología de exhibición
de fago. Los anticuerpos particularmente preferidos de la
invención son anticuerpos que tienen un grado relativamente alto de
afinidad tanto hacia PrP^{c} nativa como hacia PrP^{Sc}
tratada, pero un grado relativamente bajo o sustancialmente ninguna
afinidad de unión hacia PrP^{Sc}. Más específicamente, los
anticuerpos de la invención preferentemente poseen cuatro veces o
más, más preferentemente quince veces o más y aun más
preferentemente 30 veces o más afinidad de unión hacia PrP^{c}
nativa y PrP^{Sc} desnaturalizada, en comparación con la afinidad
de unión hacia PrP^{Sc} nativa.
"Anticuerpo purificado" se refiere a aquel
que sustancialmente no contiene otras proteínas, carbohidratos y
lípidos con los cuales se asocia naturalmente. Dicho anticuerpo
"preferentemente se une" a una conformación con enfermedad
tratada o desnaturalizada de una proteína, tal como la conformación
hoja \beta de la proteína PrP^{Sc}o A4\beta (o un fragmento
antigénico de las mismas) y no reconoce sustancialmente o se une a
otras moléculas no relacionadas de modo antigénico. Un anticuerpo
purificado de la invención es preferentemente inmunoreactivo e
inmunoespecífico para una especie específica y más preferentemente
inmunoespecífico para PrP^{c} nativa y para formas tratadas o
desnaturalizadas de PrP^{c} y PrP^{Sc}, pero no para PrP^{Sc}
nativa o no tratada.
"Fragmento antigénico" de una proteína (p.
ej., proteína PrP) significa una porción de dicha proteína capaz de
unirse a un anticuerpo.
Por "se une específicamente" se entiende
gran fuerza y/o gran afinidad de unión de un anticuerpo a un
polipéptido específico, p. ej., epítopo de una proteína, p. ej.,
una proteína PrP^{c} o A4\beta. La unión de un anticuerpo a su
epítopo en este polipéptido específico es preferentemente más fuerte
que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo,
particularmente aquellos que pueden estar presentes en moléculas
asociadas, o en la misma muestra, que el polipéptido específico de
interés, p. ej., se une más fuertemente a fragmentos de epítopo de
una proteína tal como PrP^{Sc}, de modo que al ajustar las
condiciones de unión, el anticuerpo se une casi exclusivamente a un
sitio o fragmentos de epítopo de una proteína deseada tal como un
fragmento de epítopo expuesto por tratamiento de PrP^{Sc} y, no
expuesto en PrP^{Sc} nativa no tratada.
Por "anticuerpo detectablemente marcado",
"anti-PrP detectablemente marcada" o fragmento
de "anti-PrP detectablemente marcado" se
entiende un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que retiene
especificidad de unión), que tiene un marcador detectable acoplado.
El marcador detectable normalmente se acopla mediante conjugación
química pero cuando el marcador es un polipéptido, podría
alternativamente acoplarse mediante técnicas de ingeniería genética.
Los métodos para la producción de proteínas detectablemente
marcadas se conocen en la técnica. Los marcadores detectables se
conocen en la técnica pero normalmente son radioisótopos,
fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (p. ej., peroxidasa
de rábano picante u otras fracciones o compuestos que ya sea emiten
una señal detectable (p. ej., radioactividad, fluorescencia, color)
o emiten una señal detectable después de la exposición del marcador
a su sustrato. Los distintos pares de marcador/sustrato
detectables (p. ej., peroxidasa de rábano picante/diaminobenzidina,
avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferina), métodos para marcar
anticuerpos y métodos para usar anticuerpos marcados se conocen en
la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A
Laboratory Manual (1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY)). El europio es un marcador particularmente
preferido.
Las abreviaturas utilizadas en la presente
incluyen:
SNC para sistema nervioso central;
BSE para encefalopatía espongiforme en
bovinos;
ECJ para Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob;
IFF para insomnio familiar fatal;
GSS para Enfermedad de
Gerstmann-Strassler-Scheinker;
Hu para humano:
HuPrP para proteína prión humana;
Mo para ratón;
MoPrP para proteína prión de ratón;
SHa para hámster sirio;
SHaPrP para una proteína de prión de hámster
sirio;
Tg para transgénico;
Tg(SHaPrP) para un ratón transgénico que
contiene el gen de PrP de un hámster sirio;
Tg(HuPrP) para ratones transgénicos que
contienen el gen de PrP humano completo;
Tg(ShePrP) para ratones transgénicos que
contienen el gen de PrP de oveja completo;
Tg(BovPrP) para ratones transgénicos que
contienen el gen de PrP de vaca completo;
PrP^{Sc} para la isoforma de scrapie de la
proteína prión;
PrP^{c} para la isoforma normal, común
contenida celular de la proteína prión;
MoPrP^{Sc} para la isoforma de scrapie de la
proteína prión de ratón;
MHu2M para un gen de PrP de ratón/ser humano
quimérico en el que una región del gen de PrP de ratón se reemplaza
por una secuencia humana correspondiente que difiere del PrP de
ratón en 9 codones;
Ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos
de la invención que incluyen el gen MHu2M quimérico;
MHu2MPrP^{Sc} para la isoforma de scrapie del
gen de PrP humano/de ratón quimérico;
PrP^{ECJ} para la isoforma ECJ de una proteína
PrP;
Pmp^{0/0} para ablación de ambos alelos de un
gen de proteína prión endógena, p. ej., el gen de MoPrP;
Tg(SHaPrP^{+/0})81/Pmp^{0/0}
para una línea particular (81) de ratones transgénicos que expresan
SHaPrP, +/0 indica heterocigótico;
Tg(HuPrp)/Pmp^{0/0} para un ratón
híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de proteína prión
humana (HuPrP) con un ratón con ambos alelos del gen de proteína
prión endógena rotos;
Tg(MHu2M)/PmP^{0/0} para un ratón
híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de proteína prión
quimérico (MHu2M) con un ratón con ambos alelos del gen de proteína
prión endógena rotos;
TTR para transtiretina;
FVB para una cepa endogámica estándar de ratones,
a menudo utilizada en la producción de ratones transgénicos, ya que
los huevos de ratones de FVB son relativamente grandes y toleran
relativamente bien la microinyección de ADN exógeno;
[PrP_{\beta}] - concentración de proteína prión
en conformación hoja \beta;
[\betaA4_{\beta}] - concentración de
\betaA4 en conformación hoja \beta;
[DRC] - concentración de una conformación
relacionada con enfermedad de una proteína.
El método de ensayo comprende proveer una
muestra, la cual se presume contiene una proteína que asume una
primera conformación y una segunda conformación relacionada con
enfermedad y es capaz de detectar una conformación con enfermedad de
la proteína, cuando está presente en una concentración muy reducida
en relación con la concentración de la conformación sin enfermedad.
La muestra se divide en una primera porción y una segunda porción.
La primera porción está preferentemente unida a la superficie del
soporte sólido y a partir de allí se pone en contacto con un
anticuerpo marcado. El anticuerpo es de un tipo que se une a la
proteína en su primera configuración con un grado de afinidad mayor
(cuatro veces o más) que como se une a la proteína en su segunda
conformación relacionada con enfermedad. La segunda porción de la
muestra se trata luego en un modo que causa que cualquier proteína
en la segunda conformación relacionada con enfermedad asuma una
conformación diferente, cuya conformación posee un grado de
afinidad mayor (cuatro veces superior o más) para el anticuerpo
marcado, en comparación con la afinidad hacia la proteína en la
segunda conformación relacionada con enfermedad no tratada. La
segunda porción tratada luego se une, preferentemente, a la
superficie del soporte sólido. La proteína tratada unida al
soporte luego se pone en contacto con un anticuerpo marcado bajo
condiciones que permiten que el anticuerpo se una a las proteínas
en la primera configuración o a proteínas en la configuración
diferente asumida.
Después de que los anticuerpos marcados han sido
provistos de tiempo, temperatura y condiciones químicas suficientes
(p. ej., pH) para unir las proteínas apropiadas presentes en las
respectivas porciones, se determina el nivel de unión del
anticuerpo marcado a la proteína en cada porción. Se utiliza un
ensayo altamente sensible, tal como un ensayo que comprende
fluorescencia aumentada por disociación de resolución en el tiempo,
posibilitando la detección de concentraciones en una cantidad en el
intervalo de aproximadamente 1 x 10^{3} partículas por ml o
menos. Se requiere un alto grado de sensibilidad, ya que en la
mayoría de las muestras la concentración de proteína en la
conformación con enfermedad será muy reducida en comparación con la
concentración de la proteína en la conformación sin enfermedad, p.
ej., 3 órdenes de magnitud o más diferentes. Por ejemplo, la
conformación sin enfermedad de la proteína podría estar presente en
una cantidad de aproximadamente 1 x 10^{8} partículas/ml,
mientras que la conformación con enfermedad de la proteína está
solamente presente en una cantidad de 1 x 10^{4} partículas/ml.
Por lo tanto, cualquier incremento en la señal observado, debido al
tratamiento de la conformación con enfermedad de la proteína será
muy pequeño en relación con la señal que está siendo obtenida de la
proteína en la conformación sin enfermedad.
Después de obtener el nivel de unión para ambas
porciones de la muestra, se comparan los niveles. Por ejemplo, el
nivel de unión de un anticuerpo marcado a una proteína en la
primera porción se resta al nivel de unión de un anticuerpo a una
proteína en la segunda porción. La diferencia entre los dos
refleja la cantidad de proteína presente en la muestra original que
estaba en la segunda conformación relacionada con enfermedad,
después de ajustar las diferencias provocadas (si las hubiese)
aumentando la afinidad de unión de la proteína en la primera
porción.
Más específicamente, con algunas proteínas puede
haber algunas diferencias debido al efecto del tratamiento en las
proteínas que están en la conformación sin enfermedad nativa, p.
ej., por tratamiento, se exponen más epítopos de la proteína en la
conformación relacionada con enfermedad. Esta diferencia debería
considerarse al llegar a conclusiones con respecto a si la muestra
original incluía proteínas en la segunda conformación relacionada
con enfermedad. La explicación de este efecto se muestra dentro de
las Figuras 3 y 4. En la Fig. 3, se muestra una comparación de la
unión de anticuerpos a una muestra no tratada que contiene
solamente proteína nativa en su configuración sin enfermedad con la
misma proteína nativa después del tratamiento. Como se muestra
dentro de la Fig. 3, hay alguna diferencia entre los resultados
obtenidos con la proteína tratada que muestra una señal más fuerte,
en el sentido que el tratamiento aumentó la afinidad de unión de la
proteína. No obstante, la Fig. 4 muestra los mismos resultados
cuando la muestra original incluía proteínas que estaban en la
segunda conformación relacionada con enfermedad. Las proteínas
nativas no tratadas proveen una señal muy débil. No obstante, las
proteínas tratadas proveen una señal muy fuerte. La gran
diferencia entre las muestras tratadas y no tratadas es una clara
indicación de que la muestra original incluía proteínas con la
segunda conformación relacionada con enfermedad, en el sentido que
estas proteínas no se unen a anticuerpos o se unen a anticuerpos
con un grado muy reducido de afinidad de unión. Sin embargo,
después del tratamiento, estas proteínas se unen a los anticuerpos
tan bien o prácticamente tan bien o mejor que las proteínas en la
conformación sin enfermedad que fueron tratadas.
El ensayo se puede utilizar para probar la
presencia de la conformación con enfermedad de una proteína
determinada dentro de cualquier tipo de muestra. Algunas de las
muestras más típicas que se probarán incluyen compuestos
farmacéuticos que incluyen componentes que derivan de mamíferos
vivos o usan materiales que derivan de mamíferos vivos en su
procesamiento. También sería conveniente probar órganos para
trasplante y artículos alimenticios tales como carne vacuna, que se
sospechaba que contenían priones infecciosos. La invención podría
utilizarse para probar la presencia de la conformación con
enfermedad de uno o más tipos de proteínas, tales como PrP^{Sc}
infecciosa en productos farmacéuticos, productos cosméticos, tejido
de biopsia o autopsia, cerebro, médula espinal, nervio periférico,
músculo, fluido cerebroespinal, sangre y componentes sanguíneos,
ganglios linfáticos y en cultivos derivados de animales o seres
humanos infectados o potencialmente infectados por las formas con
enfermedad de proteínas tales como priones.
Tal como se indicó anteriormente, "tratar"
puede incluir exponer las proteínas a cualquier medio físico y/o
químico que provoca que la proteína que está originalmente presente
en una conformación compacta relacionada con enfermedad, asuma una
conformación más relajada con un grado superior de afinidad de
unión hacia un elemento enlazante tal como anticuerpos. En general,
el tratamiento o la desnaturalización, como se denomina algunas
veces en la presente, comprende someter la proteína a algún medio
que provoca que se expongan los epítopos de la proteína que no
estaban previamente expuestos, de modo tal que un anticuerpo u otro
elemento enlazante pueda unirse al epítopo recientemente expuesto.
Los métodos de tratamiento que se pueden utilizar incluyen: (1)
físico, tal como temperatura o presión hidroestática, (2) químico,
tal como pH ácido o alcalino, sales caotrópicas, detergentes
desnaturalizantes y proteinasas, tales como Proteinasa K y (3)
combinaciones de los métodos recientemente mencionados.
El tiempo de tratamiento variará dependiendo del
tratamiento utilizado, pero deberá llevarse a cabo con tiempo
suficiente como para exponer nuevos sitios de unión pero no tan
prolongado como para desnaturalizar completamente la proteína.
Antes de llevar a cabo el tratamiento o la prueba
de anticuerpos de cualquiera de las porciones de la muestra, puede
ser conveniente someter la muestra a un pretratamiento. El
pretratamiento se lleva a cabo con el fin de destruir o eliminar la
forma sin enfermedad de la proteína presente dentro de la muestra.
Los ejemplos de metodología de pretratamiento incluyen producir una
columna que incluye anticuerpos unidos a superficies de soporte
cuyos anticuerpos se unen a la conformación sin enfermedad de la
proteína, eliminando de este modo tanta conformación sin enfermedad
de las proteínas como sea posible. Alternativamente, la muestra
puede someterse a tratamiento físico tal como presión hidroestática
de temperatura a largo plazo, sola o en combinación con productos
químicos tales como ácidos o alcalinos, como se indicó
anteriormente en la fase de "tratamiento" pero llevándose a
cabo durante un período más prolongado y en un modo tal como para
destruir las proteínas presentes en la muestra, cuyas proteínas se
encuentran en la conformación sin enfermedad. En algunos casos, las
proteínas en la conformación sin enfermedad y con enfermedad se
destruirán. No obstante, un porcentaje relativo superior de las
proteínas en la conformación sin enfermedad se destruirá, ya que
estas proteínas se encuentran inicialmente en una conformación
suelta, que es más vulnerable a destrucción. Por lo tanto, la
metodología de pretratamiento resulta en una muestra que incluye
una concentración relativamente inferior de la conformación sin
enfermedad de la proteína, en relación con la concentración de la
conformación con enfermedad de la proteína. Esto aumenta la
sensibilidad del ensayo, haciendo posible la detección de
concentraciones inferiores de la conformación con enfermedad de la
proteína. Se prefiere la eliminación a la destrucción de las
proteínas, dado que la destrucción disminuirá la sensibilidad si se
destruye la conformación con enfermedad. Un método de
pretratamiento particularmente útil se revela en el expediente de
abogado de nuestra solicitud 6510/098001, presentada en la misma
fecha que la presente solicitud titulada "Procedimiento para
concentración de proteínas con conformación relacionada con
enfermedad" (ahora publicada como WO 99/42487).
El método de acoplamiento químico o por afinidad
de la proteína PrP al soporte plástico se describe en general en la
literatura existente y puede variar. Los anticuerpos utilizados en
el ensayo de diagnóstico consisten en Fab recombinante, policlonal
o monoclonal y necesitan ser especies específicas con unión
preferencial a la PrP^{c} nativa o a la forma desnaturalizada de
PrP^{Sc}, preferentemente con reactividad al menos 4 veces
inferior con PrP^{Sc} infecciosa, asumiendo la misma cantidad del
antígeno.
Un aspecto de la invención es un procedimiento en
dos etapas para diagnosticar enfermedades producidas por priones,
midiendo cuantitativamente la forma nativa infecciosa de la proteína
PrP^{Sc} en un material de muestra o en los cerebros de animales
susceptibles inoculados con dicho material. La muestra se divide
en dos alícuotas. La primera alícuota se reticula con el soporte
plástico sólido en la conformación nativa a través de una etapa de
activación química bajo condiciones no desnaturalizantes, es decir,
sin tratamiento. La segunda porción de la muestra se trata primero
y luego se reticula con el soporte plástico. Ambas porciones del
material de muestra reaccionan in situ con los anticuerpos
marcados que preferentemente reconocen la PrP^{c} nativa o
PrP^{Sc} tratada de las especies animales determinadas. La
cantidad del anticuerpo unido a conformaciones tratadas o nativas
de proteína PrP se registra mediante la señal del marcador de IgG.
El exceso de la señal obtenida con la muestra desnaturalizada en
función de aquel esperado a partir de un incremento en la señal
obtenida con la conformación \alpha-helicoidal
nativa de PrP^{c} (es decir, el incremento en función de la
cantidad ajustada) es la medida de la cantidad de PrP^{Sc}
estructurada con hoja \beta infecciosa en la muestra original.
La fórmula desarrollada para cálculos de contenido de PrP^{Sc} se
muestra en las fórmulas aquí provistas y se ilustra en el Ejemplo
11.
El diagnóstico de enfermedades producidas por
priones se establece mediante tres procedimientos: (1) medición de
la muestra tratada sola y detección del incremento en la cantidad
de PrP total en la muestra examinada por encima de los niveles de
fondo de PrP^{c} obtenidos a partir de controles normales; (2)
cálculo de la relación entre señal desnaturalizada frente a nativa
para anticuerpos determinados, por ejemplo, valores superiores a 2,2
para IgG 3F4 marcada con Europio indican la presencia de
PrP^{Sc}, preferentemente utilizando fluorescencia aumentada por
disociación de resolución en el tiempo; (3) evaluación del exceso
de señal de la muestra desnaturalizada en función de aquel esperado
a partir del incremento en la señal para conformación
\alpha-helicoidal de PrP^{c} como una medida de
la cantidad de PrP^{Sc} estructurada con hoja \beta infecciosa
en la muestra original. Preferentemente, antes de la etapa (1), el
método utiliza una etapa de pretratamiento por medio de la cual se
elimina o destruye la PrP^{c} en cantidades relativas superiores
a aquella de la PrP^{Sc}.
En un cerebro de hámster sirio infectado con
scrapie, la concentración de PrP^{Sc} es 5-10
veces mayor que la de PrP^{c} cuando se enferman los animales.
En ese momento, la concentración de priones en sus cerebros es
10^{7}-10^{8} unidades ID_{50}/ml de 10%
homogeneizado. El sistema altamente cuantitativo que se ha
desarrollado permite sustraer la señal de PrP^{c}. La
sustracción se puede llevar a cabo fácilmente cuando la
concentración de PrP^{Sc} es mayor que la de PrP^{c}. No
obstante, la sustracción se torna difícil cuando la concentración de
PrP^{Sc} es mucho menor que la de PrP^{c}.
Para dirigirse al problema mencionado, el
presente ensayo utiliza el principio de afinidad entre diferentes
conformaciones de antígeno y anticuerpo. Para medir la
concentración de PrP^{Sc} cuando es mucho menor que la de
PrP^{c}, el sistema de detección debe poseer una sensibilidad
extrema y un alcance lineal de al menos 10^{4}. El ensayo
descrito en la presente puede detectar fácilmente PrP^{Sc} a una
concentración de (aproximadamente) 50 pg/ml, utilizando IgG marcada
con Europio. Asumiendo 10^{5}-10^{6} moléculas
de PrP^{Sc} por unidad ID_{50}, el presente ensayo puede
detectar fácilmente 5 x 10^{2} - 5 x 10^{3} unidades ID_{50}
por ml.
El ensayo puede detectar PrP^{Sc} en mezclas
(mediante el método directo) en el que la concentración de
PrP^{Sc} es menor que 1% de la concentración de PrP^{c}. Se
puede lograr una sensibilidad adicional a través de
inmunoprecipitación, utilizando un formato del tipo sándwich para un
ensayo de estado sólido, centrifugación diferencial con extracción
de detergente para eliminar la PrP^{c}, el método indirecto de
animal transgénico o combinaciones de estos métodos. Una
estimación conservadora es que dichos procedimientos deberían
permitir la medición entre 5 y 50 unidades ID_{50} por ml o menos
conservadoramente medir entre 0,1 y 0,01 unidades ID_{50} por ml.
Dichas mediciones proporcionarían un medio "positivo" rápido
para establecer la esterilidad biológica, que es la "ausencia"
de la infectividad.
Los ensayos anteriormente descritos, que pueden
identificar la presencia de una conformación relacionada con
enfermedad de una proteína, se pueden aplicar para identificar
compuestos que luego podrían utilizarse como fármacos en el
tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas con la
conformación con enfermedad de la proteína. Por ejemplo, las
composiciones que se conoce incluyen conformaciones relacionadas
con enfermedad de una proteína se pueden utilizar para inocular un
ratón transgénico del tipo revelado y descrito en la patente
estadounidense 5.565.186 y en la publicación PCT WO97/04814. El
ratón inoculado puede luego tratarse con un compuesto que se cree
previene la infección. Después de proporcionar un período
suficiente para la incubación, el cerebro de ratón se extrae y
prueba utilizando el ensayo anteriormente descrito, para determinar
si el compuesto de tratamiento fue eficaz para prevenir la
infección. La metodología también podría aplicarse a situaciones en
las que la infección ya ha tenido lugar, con el fin de determinar
si un compuesto particular podría estabilizar la infección, es
decir, prevenir mayor formación de la conformación con enfermedad
de la proteína.
El ensayo de la presente invención se puede
emplear en combinación con la metodología descrita dentro de la
publicación internacional WO 97/16728 ya presentada. Esta solicitud
revela compuestos que se pueden poner en contacto con proteínas en
una conformación sin enfermedad, con el fin de convertir esos
compuestos en una conformación con enfermedad. La metodología es
útil en el sentido que permite detectar la capacidad de los
compuestos de prevenir la formación de la conformación relacionada
con enfermedad de la proteína. El ensayo de la presente invención
hace posible medir precisamente el efecto de cualquier compuesto de
prueba en la prevención de la formación de la conformación
relacionada con enfermedad.
En base a lo previamente mencionado, se puede
observar que la invención incluye un método para detectar compuestos
que afectan la forma conformacional de cualquier proteína tal como
una proteína PrP, que posee una primera conformación no relacionada
con enfermedad (p. ej., PrP^{c}) y una segunda conformación
relacionada con enfermedad (p. ej., PrP^{Sc}). El método
comprende proveer primero una muestra con la proteína presente en la
primera conformación sin enfermedad. La muestra luego se pone en
contacto con un compuesto de prueba al que se le está evaluando su
utilidad terapéutica. Después de agregar el compuesto de prueba,
la muestra se pone en contacto con un compuesto o grupo de
compuestos que inducen la proteína en la primera configuración sin
enfermedad a convertirse en la segunda conformación con enfermedad.
Después de un período suficiente, la muestra se ensaya utilizando
la presente invención. El ensayo de la presente invención hará
posible determinar con precisión cómo el compuesto de prueba afectó
la conversión de la proteína de la conformación sin enfermedad a la
conformación con enfermedad. Será obvio para aquellas personas con
experiencia en la técnica que lean esta descripción, que el
compuesto de prueba puede agregarse en diferentes puntos de tiempo
en relación con la adición del compuesto que afecta el cambio
conformacional. En consecuencia, la metodología se puede utilizar
para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para
estabilizar otros cambios de la conformación sin enfermedad a la
conformación con enfermedad y/o determinar la capacidad del
compuesto de prueba para prevenir la iniciación de cualquier
conversión de la conformación sin enfermedad a la conformación con
enfermedad. Si bien la publicación internacional WO 97/16728 revela
un medio para convertir una conformación sin enfermedad a una
conformación con enfermedad, otros medios para obtener el mismo
resultado serán obvios para aquella persona con experiencia en la
técnica al leer la presente solicitud y revisar el estado de la
técnica relacionado. Por consiguiente, la presente invención tiene
como fin abarcar cualquier medio físico, químico o biológico que se
utilizaría para convertir una proteína dentro de una primera
conformación sin enfermedad, a una segunda conformación con
enfermedad y aplicar el ensayo aquí descrito. Además, la presente
invención tiene como fin abarcar compuestos terapéuticos que se
obtienen como resultado de la aplicación del método de detección de
la invención, es decir, compuestos producidos mediante el método de
la invención.
Las personas con experiencia en la técnica en
general conocen los métodos para generar anticuerpos. Dado que la
forma con enfermedad se encuentra a menudo en una configuración más
compacta que la forma sin enfermedad, con menos epítopos expuestos,
se pueden generar fácilmente anticuerpos que se unen solamente a la
forma sin enfermedad de la proteína o a la forma tratada con
enfermedad. Por ejemplo, los anticuerpos que detectan formas
tratadas de proteína PrP^{Sc} y proteína PrP^{c} se pueden
generar inmunizando conejos o ratones con conformaciones
\alpha-helicoidales de PrP recombinante, PrP^{c}
nativa de cerebros animales, péptidos sintéticos en conformaciones
\alpha-helicoidales o en espiral aleatorias, o
contra PrP^{Sc} desnaturalizada o PrP 27-30.
Solo deberán seleccionarse los anticuerpos con afinidad al menos 4
veces superior hacia PrP^{c} (o conformación desnaturalizada de
PrP^{Sc} de la misma especie), en comparación con su afinidad
hacia PrP^{Sc}. El método de generación, purificación, marcaje y
detección de anticuerpos puede variar.
La IgG o Fab se puede purificar a partir de
diferentes fuentes por HPLC de afinidad, utilizando HPLC de
exclusión por tamaño y columna de proteína A. Los anticuerpos
purificados se pueden marcar con Europio y detectar mediante
fluorescencia de resolución en el tiempo. La unión de anticuerpos
con diferentes conformaciones de proteína PrP se puede medir
mediante fluorescencia aumentada por disociación de resolución en
el tiempo. No obstante, el sistema de detección de IgG unida a PrP
en soporte sólido in situ o en disolución puede variar. A
su vez, también es posible utilizar métodos inmunológicos directos
o indirectos, incluyendo fluorescencia, luminiscencia, ampliación de
avidina-biotina, radiomarcadores directos o ensayos
unidos a enzimas con sustratos de color o luminiscentes.
Un anticuerpo que se puede utilizar en la
invención se describe en la publicación internacional US 4.806.624,
expedida el 21 de febrero de 1989, la cual describe un anticuerpo
monoclonal 263K 3F4, producido por la línea celular ATCC HB9222,
depositada el 8 de octubre de 1986, incorporada a la presente por
referencia. La línea celular que produce el anticuerpo se puede
obtener de la American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.
En general, la infección de scrapie no puede
producir una respuesta inmune, siendo los organismos hospedantes
tolerantes a la PrP^{Sc} de algunas especies. Los anticuerpos
que se unen ya sea a PrP^{c} o a PrP^{Sc} se describen en la
WO97/10505, publicada el 20 de marzo de 1997. Se puede usar
cualquier anticuerpo que se una a PrP^{c} y no a PrP^{Sc} y
aquellos con experiencia en la técnica podrán generar los
procedimientos conocidos, p. ej., véanse métodos para producción de
bibliotecas de anticuerpos en la publicación internacional US
5.223.409. Los anticuerpos anti-PrP policlonales
podrían ser preparados en conejos después de la inmunización con
grandes cantidades de ácido fórmico o SHaPrP 27-30
desnaturalizada con SDS [Bendheim, Barry et al (1984)
Nature 310:418-421; Bode, Pocchiari
et al (1985) J Gen Virol
66:2471-2478; Safar, Ceroni et al
(1990) Neurology 40:513-517]. De
modo similar, se ha producido una cantidad escasa de anticuerpos
monoclonales anti-PrP contra PrP
27-30 en ratones [Barry y Prusiner (1986) J
Infect Dis 154:518-521; Kascsak,
Rubinstein et al (1987) J Virol
61:3688-3693]. Estos anticuerpos se
generaron contra PrP 27-30 desnaturalizada con SDS
o ácido fórmico y son capaces de reconocer PrP^{c} nativa y
PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada tanto de SHa como de seres
humanos igualmente bien, pero no se unen a MoPrP. No
sorprendentemente, los epítopos de estos anticuerpos se localizaron
en regiones de la secuencia que contenía diferencias de aminoácidos
entre SHa y MoPrP [Rogers, Yehiely et al (1993) Proc Natl
Acad Sci EE. UU. 90: 3182-3186].
No está totalmente clara la razón por la cual
muchos anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones
previamente citadas se unirán a PrP^{c} y PrP^{Sc} tratada o
desnaturalizada pero no a PrP^{Sc} nativa. Sin influencias de
ninguna teoría particular, se sugiere que esto puede ocurrir porque
los epítopos que están expuestos cuando la proteína tiene la
conformación PrP^{c}, no están expuestos o están parcialmente
ocultos en la configuración PrP^{Sc}, en la que la proteína es
relativamente insoluble y está más compactamente plegada.
Para los propósitos de la invención, una
indicación de que no hay unión significa que la constante K_{a} de
equilibrio o afinidad es 10^{6} l/mol o menos. Asimismo, la
unión será reconocida como existente cuando la K_{a}, sea de
10^{7} l/mol o superior, preferentemente 10^{8} l/mol o
superior. La afinidad de unión de 10^{7} l/mol o más se puede
deber a (1) un anticuerpo monoclonal simple (es decir, grandes
cantidades de una clase de anticuerpos) o (2) una pluralidad de
anticuerpos monoclonales diferentes (p. ej., grandes cantidades de
cada uno de los cinco anticuerpos monoclonales diferentes) o (3)
grandes cantidades de anticuerpos policlonales. También es posible
usar combinaciones de (1)-(3). Los anticuerpos seleccionados
preferidos se unirán al menos 4 veces más ávidamente a las formas de
PrP^{Sc} tratadas o desnaturalizadas de la proteína, en
comparación con su unión a la conformación nativa de PrP^{Sc}.
Esta cuádruple diferencia en la afinidad de unión se puede lograr
utilizando varios anticuerpos diferentes como para (1)-(3)
anteriores y como tales, algunos de los anticuerpos en mezcla
podrían tener más de una diferencia cuádruple.
Una variedad de diferentes tipos de ensayos de la
invención se puede utilizar con uno o más anticuerpos diferentes.
Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que los
anticuerpos se pueden marcar con marcadores conocidos y utilizarse
con robótica, ensayos del tipo sándwich, detectores electrónicos,
citometría de flujo y similares actualmente disponibles.
Utilizando la metodología anteriormente descrita,
es posible calcular la diferencia entre la cantidad de señal
obtenida de una muestra que no ha sido tratada y la señal obtenida
con una muestra que ha sido tratada. Esta diferencia representa
(después de ajustarse para el efecto del tratamiento en la
conformación sin enfermedad) la cantidad (concentración) de proteína
en la conformación con enfermedad presente en la muestra original.
Después de obtener la diferencia, la fórmula expuesta a
continuación se puede utilizar para calcular la cantidad de
proteína en la conformación con enfermedad presente en la muestra
original por unidad de volumen.
a) F_{n} = F_{n \alpha} + F_{n \beta}
\rightarrow F_{n \alpha} = F_{n} - F_{n \beta} \cdot F_{n
\beta} \sim fondo
b) F_{d} = f_{d \alpha} + F_{d \beta}
\Delta
F_{n-d} = \Delta F_{\alpha n-d} +
\Delta F_{\beta
n-d}
\Delta F_{\beta
n-d} = F_{d} - F_{n} - \Delta F_{\alpha
n-d}
[PrP_{\beta}] o [DRC] \sim \DeltaF_{\beta
n-d} = F_{d} - (F_{n} * f_{\alpha
n-d})
A continuación se provee la definición de cada
una de las variables anteriormente mencionadas.
F - señal de fluorescencia (obsérvese que se
puede emplear cualquier señal detectable);
F_{n} - señal de fluorescencia de una
conformación nativa;
F_{n \alpha} y F_{n \beta} señales de
fluorescencia de conformaciones
\alpha-helicoidales y hoja \beta nativas,
respectivamente;
F_{d} - señal de fluorescencia de PrP en el
estado tratado o desnaturalizado;
F_{d \alpha} y F_{d \beta} - son las señales
de estados hoja \beta y \alpha-helicoidales
desnaturalizados de PrP;
\DeltaF_{n-d} - aumento de la
señal de fluorescencia en la transición de estado nativo a
desnaturalizado;
\DeltaF_{\alpha n-d} -
incremento en la señal de fluorescencia de una conformación
\alpha-helicoidal en la transición de estado
nativo a desnaturalizado;
\DeltaF_{\beta n-d} -
incremento en la señal de conformación hoja \beta en la
transición de estado nativo a desnaturalizado;
f_{\alpha n-d} - factor de
correlación para la transición de estado nativo a desnaturalizado
de una PrP \alpha-helicoidal;
[PrP_{\beta}] - concentración de proteína prión
en conformación hoja \beta.
[DRC] - concentración de cualquier proteína en
conformación relacionada con enfermedad.
La fórmula previamente provista se utiliza para
calcular específicamente la concentración de proteína prión en la
conformación hoja \beta. No obstante, las mismas fórmulas se
pueden utilizar para calcular la concentración de cualquier
proteína, es decir, la concentración de cualquier conformación
compacta con enfermedad de una proteína tal como
[\betaA4_{\beta}]. Más generalmente, [DRC] representa la
concentración de la conformación relacionada con enfermedad de una
proteína.
Para proveer un ejemplo específico, las
definiciones anteriores han sido expuestas específicamente con
respecto a proteínas PrP, en las que las proteínas incluyen al menos
una conformación relajada sin enfermedad (PrP^{c}), que incluye
una configuración \alpha-helicoidal y al menos una
conformación compacta relacionada con enfermedad (PrP^{Sc}) que
incluye una configuración hoja \beta. Las fórmulas se utilizan
para calcular la concentración de la conformación relacionada con
enfermedad de la proteína presente en la muestra. Para las
fórmulas y definiciones específicas anteriormente provistas, las
fórmulas se utilizan para calcular la concentración de proteínas
prión que incluyen la configuración hoja \beta (véase Ejemplo
11).
La señal utilizada para calcular la fórmula
anteriormente expuesta es una señal de fluorescencia. No obstante,
se puede emplear cualquier señal detectable. La señal total está
representada por F_{n} que es una combinación de la señal
recibida de las conformaciones con y sin enfermedad. Ésta es una
señal que se calcularía a partir de la porción No 1, que no es
tratada en el ensayo anteriormente descrito. La variable F_{d}
es la señal que se obtiene tratando la porción No 2 de la muestra.
Esta señal es una combinación de la señal recibida de una proteína
tratada en la conformación sin enfermedad más la proteína tratada
en la conformación con enfermedad.
Se ha reconocido que hay una diferencia en la
señal obtenida tratando una muestra que no incluye la conformación
relacionada con enfermedad de la proteína. La diferencia debe
explicarse para obtener una lectura precisa. La diferencia en la
señal obtenida entre la muestra nativa y la muestra tratada es, por
supuesto, una combinación de la diferencia en la señal obtenida
tratando la conformación relacionada con enfermedad y la
conformación sin enfermedad. El incremento en la señal obtenida
tratando la conformación con enfermedad, es decir, la diferencia
entre la señal de la conformación con enfermedad no tratada y la
señal recibida de la conformación con enfermedad tratada, se puede
calcular restando la señal recibida al tratar la muestra completa
de la señal recibida al calcular el incremento en señal obtenido de
la conformación sin enfermedad no tratada y de la conformación sin
enfermedad tratada. Al utilizar estas ecuaciones, es posible
producir la ecuación final que provee la concentración de proteína
en la conformación con enfermedad presente en la muestra original
(véase Ejemplo 11).
Diferentes animales, incluyendo seres humanos, se
pueden infectar con diferentes cepas de proteínas patogénicas. Se
provee aquí una "tabla de mutaciones" para enumerar algunas de
las diferentes mutaciones asociadas con diferentes cepas de
infecciones producidas por priones. Algunas veces, puede ser
importante conocer qué cepa específica ha infectado a un individuo,
dado que dicha información puede ser útil en (1) proveer un
diagnóstico más preciso, (2) administrar el tratamiento apropiado o
(3) determinar el origen de la infección comparando la cepa con una
cepa en un origen probable de infección.
La cepa particular de proteína patogénica que
provoca una infección se puede determinar a partir de dos partes de
información que se pueden calcular utilizando la presente
invención. El Ejemplo 11 muestra cómo la presente invención se
puede utilizar para determinar la cantidad absoluta, es decir, la
concentración de priones en una muestra de un tamaño determinado.
El Ejemplo 8 muestra cómo calcular el "índice de prión" que es
la relación de unión de anticuerpos a proteína PrP desnaturalizada:
nativa. Un "índice de proteína" para otras proteínas es la
relación de unión de cualquier elemento enlazante a la forma
desnaturalizada: nativa de la proteína. En términos generales, el
"índice de prión" es simplemente una caracterización numérica
del efecto que tiene el tratamiento sobre la proteína.
Para determinar la cepa particular, se debe
calcular primero un estándar para cada cepa. Esto se realiza
determinando el efecto (índice de prión) de un tratamiento
particular en una cantidad conocida de una cepa conocida. Esto se
puede trazar como se muestra en la Figura 25. Una vez calculado el
estándar, la cepa de otras muestras se puede determinar fácilmente;
los estándares se calculan preferentemente en una cantidad de
concentraciones diferentes para cada cepa. Para determinar la cepa
de una muestra simple, se calcula la concentración de proteína en
la muestra y el efecto del tratamiento en esa concentración. Los
resultados se comparan con el estándar (como se muestra en la
Figura 25) para determinar la cepa. El Ejemplo 18 es un ejemplo
específico de esto, tomado en combinación con la Figura 25. La
misma concentración de la misma cepa se efectuará del mismo modo
mediante un tratamiento determinado. No obstante, la misma
concentración de diferentes cepas se efectuará de modo diferente
mediante el mismo tratamiento, haciendo posible la determinación de
la cepa.
Gran parte de la descripción y de los ejemplos
específicos provistos en la presente se refieren al uso del ensayo
en conexión con la determinación de la presencia de PrP^{Sc} en
la muestra. Sin embargo, como se indicó anteriormente, el ensayo
de la invención se puede aplicar para determinar la presencia de
cualquier proteína que asuma dos formas conformacionales
diferentes, una de las cuales estará asociada con enfermedad. El
siguiente es un listado no limitante de enfermedades con proteínas
insolubles asociadas que asumen dos o más conformaciones
diferentes.
Enfermedad | Proteínas insolubles |
Enfermedad de Alzheimer | APP, A\beta péptido, \alpha1-antiquimotripsina, |
tan, componente sin A\beta | |
Enfermedades producidas por priones, | |
enfermedad de Creutzfeld Jakob, | |
encefalopatía espongiforme en bovinos y | |
scrapie | |
PrP^{Sc} | |
ALS | SOD y neurofilamento |
Enfermedad de Pick | Cuerpo de Pick |
Enfermedad de Parkinson | Cuerpo de Lewy |
Diabetes de Tipo I | Amilina |
Mieloma múltiple - discrasias de células | |
plasmáticas | |
IgGL-cadena | |
Polineuropatía amiloidítica familiar | |
Transtiretina | |
Carcinoma medular de tiroides | Procalcitonina |
Insuficiencia cardiaca crónica | |
\beta_{2}-microglobulina | |
Insuficiencia cardiaca congestiva | Factor natriurético atrial |
Amiloidosis sistémica y cardiaca senil | |
Transtiretina | |
Inflamación crónica | Amiloide A del suero |
Aterosclerosis | ApoA1 |
Amiloidosis familiar | Gelsolina |
Deberá observarse que las proteínas insolubles
anteriormente enumeradas incluyen, cada una, un número de variancia
o mutaciones que resultan en diferentes cepas, todas abarcadas por
la presente. Las mutaciones patogénicas conocidas y los
polimorfismos en el gen de PrP relacionados con enfermedades
producidas por priones se exponen a continuación y las secuencias de
seres humanos, ovejas y bovinos se exponen en la publicación
internacional US 5.565.186, expedida el 15 de octubre de 1996.
Tabla de
mutaciones
Mutaciones humanas | Polimorfismos | Polimorfismos | Polimorfismos |
patogénicas | humanos | de ovejas | bovinos |
2 inserciones de | Codón 129 | Codón 171 | 5 ó 6 octarepeticiones |
octarepeticiones | Met/Val | Arg/Glu | |
4 inserciones de | Codón 219 | Codón 136 | |
octarepeticiones | Glu/Lys | Ala/Val | |
5 inserciones de | |||
octarepeticiones | |||
6 inserciones de | |||
octarepeticiones | |||
7 inserciones de | |||
octarepeticiones | |||
8 inserciones de | |||
octarepeticiones | |||
9 inserciones de | |||
octarepeticiones | |||
Codón 102 Pro-leu | |||
Codón 105 Pro-Leu | |||
Codón 117 Ala-Val | |||
Codón 145 Finalizador | |||
Codón 178 Asp-Asn | |||
Codón 180 Val-Ile | |||
Codón 198 Phe-Ser | |||
Codón 200 Glu-Lys | |||
Codón 210 Val-Ile | |||
Codón 217 Asn-Arg | |||
Codón 232 Met-Ala |
También se debe observar que dichas proteínas
poseen dos conformaciones tridimensionales diferentes con la misma
secuencia de aminoácidos. Una conformación está asociada con las
características de enfermedad y es en general insoluble, mientras
que la otra conformación no está asociada con las características
de enfermedad y es soluble. La metodología de la presente
invención no está limitada a las enfermedades, proteínas y cepas
mencionadas.
Un aspecto de la invención comprende un
procedimiento en dos etapas para diagnosticar la enfermedad de
Alzheimer basándose en la presencia de una forma compacta de una
proteína (amiloidosis de \betaA4), midiendo cuantitativamente la
forma hoja \beta de la proteína \betaA4 en un material de
muestra, p. ej., en el cerebro o en los fluidos corporales. La
muestra se divide en dos alícuotas. La primera alícuota se
reticula con un soporte de plástico sólido (material polimérico de
cadena larga) en conformación nativa a través de una etapa de
activación química bajo condiciones no desnaturalizantes. La
segunda porción de la muestra se desnaturaliza primero y luego se
reticula con el soporte plástico. Ambas porciones del material de
muestra reaccionan in situ con los anticuerpos marcados que
preferentemente reconocen la \betaA4 soluble o la \betaA4
desnaturalizada del ser humano o de una especie animal determinada.
La cantidad del anticuerpo unida a las conformaciones
desnaturalizadas o nativas de la proteína \betaA4 se registra
mediante la señal del anticuerpo secundario marcado. El exceso de
la señal obtenida con la muestra desnaturalizada en comparación con
ese cambio esperado en la señal obtenida con la conformación
\alpha-helicoidal nativa de la proteína \betaA4
es la medida de la cantidad de \betaA4 estructurada con hoja
\beta en la muestra original. La fórmula desarrollada para el
cálculo de contenido de \betaA4 se proporcionó anteriormente en
relación con el cálculo de contenido de PrP^{Sc}.
El diagnóstico de amiloidosis de \betaA4
(enfermedad de Alzheimer) se establece a través de tres
procedimientos: (1) medición de muestra desnaturalizada sola y
detectando el incremento en la cantidad (concentración) de
\betaA4 total en la muestra examinada por encima de los niveles de
fondo de \betaA4 soluble obtenidos a partir de controles
normales; (2) cálculo de la relación entre señal desnaturalizada
frente a nativa para anticuerpos determinados (índice de proteína)
- por ejemplo valores superiores a 2 para anticuerpo monoclonal
6F3D y anticuerpo secundario marcado con europio; (3) evaluación
del cambio de la señal de muestra desnaturalizada en función de
aquel cambio esperado en la señal para conformación
\alpha-helicoidal de \betaA4 como una medida de
la cantidad de \betaA4 estructurada con hoja \beta infecciosa
en la muestra original. La fórmula desarrollada para el cálculo de
contenido de \betaA4 se proporcionó anteriormente. La cepa
particular de \betaA4 también se puede determinar utilizando la
misma metodología ya descrita para determinar la cepa de PrP^{Sc}
en una muestra.
La invención provee un método de diagnóstico
directo para detectar la presencia de formas patogénicas de la
proteína \betaA4 en compuestos farmacéuticos, tejido de autopsia
o biopsia, cerebro, médula espinal, nervios periféricos, músculo,
fluido cerebroespinal, sangre y componentes sanguíneos, ganglios
linfáticos, y en cultivos derivados de animales o seres humanos que
expresan o expresan potencialmente la proteína \betaA4. La
invención también hace posible seguir la transición conformacional
de hélice \alpha a hoja \beta de la proteína \betaA4 o sus
fragmentos de origen sintético o recombinante y proporciona un
método para detectar compuestos por su capacidad de estabilizar la
conformación soluble normal de la proteína \betaA4 y por lo tanto
prevenir la conversión en proteína \betaA4 insoluble, patogénica y
estructurada con hoja \beta.
Los métodos típicos de desnaturalización de la
muestra incluyen: (1) físico, tal como temperatura o presión
hidroestática, (2) químico, tal como pH ácido o alcalino, sales
caotrópicas o detergentes desnaturalizantes, y (3) combinaciones de
los ya mencionados. Los métodos de acoplamiento químico o de
afinidad de la proteína \betaA4 a un soporte plástico se describen
en la literatura existente y pueden variar. Los anticuerpos
utilizados en el ensayo de diagnóstico pueden ser Fab recombinante,
policlonales o monoclonales y deben ser especies específicas con
unión preferencial a la forma desnaturalizada o soluble de
\betaA4, preferentemente con por lo menos una diferencia doble en
la reactividad entre la \betaA4 estructurada con hoja \beta y
hélice \alpha, asumiendo la misma cantidad de antígeno.
Los métodos para acoplamiento de la muestra al
soporte plástico pueden variar y ser covalentes o no covalentes, tal
como se describe en la literatura existente. La sensibilidad del
ensayo descrito en los ejemplos se puede aumentar utilizando
anticuerpos de gran afinidad, formato del tipo sándwich,
inmunoprecipitación o centrifugación diferencial. No obstante,
únicamente los anticuerpos que tiene una afinidad de al menos el
doble para conformación desnaturalizada y comparada con la
conformación de hoja \beta nativa de \betaA4 de la misma
especie se utilizarán para el ensayo de diagnóstico. Los métodos
de generación, purificación, marcaje y detección de anticuerpos
pueden variar. Se midió la unión de anticuerpos a diferentes
conformaciones de la proteína \betaA4 mediante fluorescencia
aumentada por disociación de resolución en el tiempo. Sin embargo,
el sistema de detección de IgG unida a \betaA4 en soporte sólido
in situ o en disolución puede variar y se pueden emplear
métodos inmunológicos directos o indirectos, incluyendo
radiomarcadores directos, fluorescencia, luminiscencia, ampliación
avidina-biotina, o ensayos de enlace a enzimas con
sustratos de color o luminiscentes.
Los siguientes ejemplos se exponen a fin de
proporcionar a aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, una
revelación y descripción completa de cómo llevar a cabo y utilizar
los ensayos de la presente invención y no tienen como fin limitar
el alcance de lo que los inventores consideran su invención, ni
tampoco representar o implicar que los experimentos expuestos a
continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se ha
hecho lo posible para asegurar la precisión con respecto a los
números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) aunque
deberán tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones
experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes
son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en
peso, temperatura es en grados centígrados y presión es presión
atmosférica o prácticamente presión atmosférica.
Para el desarrollo y la calibración de los
ensayos de diagnóstico, se replegaron proteínas prión de hámster
sirio recombinantes de secuencia 90-231 en
conformaciones \alpha-helicoidal u hoja \beta,
como se describe en [Mehlhorn, Groth et al (1996)
Biochemistry 35:5528-5537]. Se usó
PCR (Perkin-Elmer) para ampliar el ADN
correspondiente a diferentes porciones de la proteína prión de
hámster sirio con el fin de ligarse a vectores de secreción de
E. coli. Se sintetizaron varios cebadores de oligonucléotido
5' con un sitio de restricción de Mlu 1 dentro de la secuencia de
codificación C-terminal del péptido de señal STII
[Lee, Moseley et al (1983)] Infect Immun
42:264-268; Picken, Mazaitis et al
(1983) Infect Immun 42:269-275] y los
aminoácidos iniciales de la secuencia de PrP apropiada. Se utilizó
un cebador de oligonucléotido 3' unido al extremo 3' de PrP, un
codón finalizador y un sitio de restricción Bam HI con cada uno de
los oligonucléotidos 5'. Los productos ampliados con PCR se
purificaron, ligaron a los vectores previamente digeridos con
Mlul/Bam HI y se transformaron en DH5a. Los clones que contenían
la inserción de PrP se secuenciaron y transformaron en la cepa de
expresión deficiente de proteasa 27C7 (ATCC# 55244).
La expresión a gran escala se llevó a cabo como
se describió previamente para otras proteínas, utilizando un medio
diferente [Carter, Kelley et al (1992) Biotechnology
10:163-167]; Se inocularon 500 mL de un
cultivo que se desarrolló toda la noche en medio LB complementado
con ampicilina, en 7 L de medio de fermentación en un fermentador
aireado de 10 L (Braun, modelo E10). Se desarrollaron células a
37ºC, a una alta velocidad de agitación y se indujo la expresión a
través de un medio de cultivo sin fosfato. Después de 4 hs, se
agregó una disolución de glucosa al 50% a una velocidad de 1 mL/min;
los niveles de glucosa se controlaron utilizando una tira reactiva
de glucosa (Diastix, Miles Inc.). Se mantuvo un pH de 7,4 en toda
la prueba mediante la adición automática de 10% H_{2}SO_{4} o
24% NH_{4}OH. El volumen final fue 10 L en el cual se logró un
OD_{600} de \geq 100 después de 36 hs. La E. coli se
recogió por centrifugación a 10.000 x g durante 30 min y la pasta
resultante se almacenó a -20ºC.
Para la purificación, se resuspendieron 100 g de
pasta de E. coli en 1 L de 25 mM Tris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA
(tampón A). Esto se centrifugó a 10.000 x g durante 20 min y se
descartó el sobrenadante que contenía las proteínas periplásmicas
solubles. El sedimento se resuspendió en 1 L de tampón A, se pasó
dos veces a través de un destructor celular (Microfluidics
International, modelo MF110) y se centrifugó a 30.000 x g durante 1
h, después de lo cual se descartó el sobrenadante y el sedimento se
lavó una vez en el tampón A y se centrifugó nuevamente a 30.000 x g
durante 1 h. En esta etapa, el sedimento pudo almacenarse a -20ºC
antes de la separación. Subsiguientemente, se solubilizó en 8M Gdn
HCl/25 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM DTT (tampón B) y
se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min para eliminar la materia
insoluble restante. Se separaron alícuotas de 6 mL del
sobrenadante que contenían \sim200 mg de proteína total, por
cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), utilizando una columna
de 26 mm x 60 cm HiLoad Superdex 200 (Pharmacia), eluyendo con 6M
Gdn HCl/12,5 mM Tris-HCl, pH 8,0/5mM DTT/1 mM EDTA
(tampón C) a un caudal de 2 mL/min. Las fracciones enriquecidas
para la proteína prión recombinante según lo identificado por
SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida)
se mezclaron y se purificaron adicionalmente por cromatografía
líquida de alta performance de fase inversa
(RP-HPLC), empleando una columna C-4
de 25 mm x 25 cm (Vydac); Tampón 1: H_{2}O/0,1% TFA, Tampón 2:
acetonitrilo/0,09% TFA, caudal 5 mL/min. Se halló la proteína rPrP
recombinante en fracciones que contenían 40% acetonitrilo. Si el
eluato de SEC se almacenaba a 4ºC durante varios días antes de
RP-HPLC, la proteína recombinante se eluía en
fracciones más tempranas que contenían solo 35% acetonitrilo.
Las muestras de la proteína reducida y la forma
oxidada replegada se concentraron utilizando una columna Centricon
(Amicon) con un peso molecular reducido de 10.000 Da. El tampón
para la proteína reducida fue 10 mM MES, pH 6,5, mientras que la
forma oxidada se concentró en el tampón para repliegue anteriormente
descrito. Las conformaciones de las formas oxidada replegada y
reducida de la proteína SHaPrP90-231 se determinaron
por espectroscopia de dicroismo circular (CD) (Fig. 1).
Ambas proteínas producidas para el Ejemplo 1 se
usaron como estándares para el ensayo de prión y para establecer la
sensibilidad y el alcance lineal del método de diagnóstico. La
PrP^{c} de cerebro de hámster sirio se usó para la calibración de
la detección de la proteína prión y se correlacionó con los
resultados obtenidos en SHaPrP90-231 recombinante en
conformaciones \alpha-helicoidales, hoja \beta y
desnaturalizadas. La proteína PrP^{c} se purificó tal como se
describe, con algunas modificaciones menores [Pan, Stahl et
al (1992) Protein Sci 1:1343-1352;
Pan, Baldwin et al (1993) Proc Natl Acad Sci EE. UU.
90: 10962-10966]. El contenido de proteína
se determinó mediante análisis de aminoácidos. La pureza de la
proteína PrP^{c}, según lo demostrado en SDS PAGE con posterior
tinción de plata y Western fue \geq 95%.
Se purificó PrP^{Sc} de hámster sirio estándar
de una mezcla estándar de cerebros de hámster infectados con cepa
Sc237 de scrapie, tal como se describe, solamente con modificaciones
menores [Turk, Teplow et al (1988) Eur J Biochem
176:21-30]. La infectividad de este
estándar, según lo determinado por un ensayo de tiempo de
incubación en hámsteres sirio después de la inoculación
intracerebral, fue de 10^{7,3} ID_{50}/ml y la infectividad
específica de 10^{8,2} ID_{50}/mg de proteína PrP^{Sc}. No
obstante, la infectividad específica puede variar de parte a parte
\pm 10^{0,5} ID_{50}/mg. El contenido de proteína se
determinó a través de un ensayo BCA, utilizando albúmina de suero
bovino como un estándar. La preparación se consideró homogénea con
una banda principal en SDS PAGE después de la tinción con plata y
de las transferencias western.
Los protocolos y métodos para producción y
caracterización de anticuerpos se describen en general en otras
partes [Harlow y Lane (1998) supra: 726]. Los datos
descritos en éste y en los siguientes ejemplos se generaron con
anticuerpo N12 y P3 policlonal purificado de inmunoafinidad y
[Safar, Ceroni et al (1990) Neurology 40:
513-517; Rogers, Serban et al (1991) J
Immunol 147:3568-3574] elaborado contra
la secuencia correspondiente de péptidos sintéticos
90-145 (N12) y 222-231 (P3) de PrP
de Hámster sirio [Barry, Vincent et al (1988) J
Immunol 140:1188-1193]; JS2 contra PrP
27-30 desnaturalizada de hámster sirio [Safar,
Ceroni et al (1990) Neurology
40:513-517]. El desarrollo y las
características del anticuerpo monoclonal 3F4 utilizado en el
ensayo se describen en otras partes (Kascsak, Rubenstein et
al (1987) J Virol 61:3688-3693] y
se describen en la publicación internacional US 4.806.627, todas
incorporadas por referencia para revelar y describir los
anticuerpos que se pueden utilizar con la invención y los métodos
para elaborar aquellos anticuerpos y otros relacionados. Las
formas de proteína prión desnaturalizadas que reconocen Fab
recombinante se desarrollaron muy recientemente [Williamson, Peretz
et al (1996) Proc Natl Acad Sci EE. UU.
93:7279-7282].
La SHaPrP90-231 en conformaciones
en espiral aleatorias, \alpha-helicoidales y de
hoja \beta se acopló covalentemente a placas de poliestireno
activadas con glutaraldehído y se incubó con anticuerpo primario
diluido en serie. La cantidad de IgG que reaccionó con cada
conformación de SHaPrP90-231 se determinó ya sea
directamente con IgG 3F4 marcada con Eu o indirectamente con
anticuerpo anti-ratón o anti-conejo
marcado con europio, de acuerdo con protocolos usuales y se midió
la señal total a través de fluorescencia aumentada por disociación
de resolución en el tiempo. Para el desarrollo del ensayo se
seleccionaron anticuerpos con la relación de señal de conformación
desnaturalizada frente a conformación hoja \beta de
SHaPrP90-231 igual o superior a 4.
SHaPrP90-231 recombinante
purificada, replegada en conformación
\alpha-helicoidal u hoja \beta se diluyó en 5%
(p/v) de homogeneizado cerebral obtenido de ratón PrP^{0/0} y sin
proteína prión. El homogeneizado cerebral se elaboró mediante tres
ráfagas de 30 seg en un homogeneizador PowerGen equipado con sonda
desechable plástica en TBS, pH 7,4 que contenía un cóctel de
inhibidores de proteasa (1 mM PMSF, 2 \mug/ml de Aprotinina y 2
\mug/ml de Leupeptina) y se centrifugó a 5ºC durante 5 min a 500 G
en una máquina centrífuga de escritorio. El sobrenadante
resultante se diluyó 1:1 en TBS con 4% (p/v) Sarcosilo final y se
homogeneizó nuevamente mediante tres ráfagas de 30 seg en un
homogeneizador PowerGen. Luego, el homogeneizado se mezcla con
diferentes diluciones de SHaPrP90-231 recombinante
en conformaciones \alpha-helicoidales u hoja
\beta.
En un ensayo competitivo típico, el analito PrP
en diferentes conformaciones se preincuba con IgG 3F4 marcada con
europio y se transfiere luego a la placa de poliestireno revestida
con ShaPrP90-231 recombinante en estado
desnaturalizado de SDS. Los resultados del analito
SHaPrP90-231 en un estado
\alpha-helicoidal y desnaturalizado (Figura 2)
indican una notable diferencia tanto en los sitios de unión
existentes como en la afinidad de la IgG 3F4 marcada con europio
con conformaciones diferentes de la proteína prión.
En el ensayo directo, cada muestra de curva de
dilución se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada y designada
nativa; (2) mezclada con 4M Gdn HCl final y calentada durante 5 min
a 100ºC y designada desnaturalizada. Ambas muestras se diluyeron 20
veces con H_{2}O y se cargaron las alícuotas en una placa de
poliestireno activada con glutaraldehído. Las placas, incubadas
durante toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que
contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa
siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05%
(v/v) de Tween® 20 y se incubaron con los anticuerpos marcados con
europio ya mencionados. Las placas se revelaron después de 7
etapas de lavado adicionales en disolución de contraste suministrada
por el proveedor de marcadores de europio (Wallac Inc., Turku,
Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234
(Wallac Inc., Turku, Finlandia).
Los parámetros obtenidos del ensayo directo con
IgG 3F4 marcada con Eu se trazaron como una función de la
concentración. Los resultados obtenidos con
SHaPrP90-231 en conformación
\alpha-helicoidal (Figura 3) indican una
diferencia relativamente pequeña entre la señal de proteína
\alpha-helicoidal y desnaturalizada. El límite
de sensibilidad para la PrP desnaturalizada en presencia de 5%
homogeneizado cerebral es \leq 1 ng/ml y el alcance lineal sobre 3
órdenes de magnitud. En los experimentos con la forma hoja \beta
de SHaPrP90-231 (Figura 4), la IgG 3F4 marcada con
Eu se une fuertemente a una forma desnaturalizada de la proteína.
En contraste, la reactividad con la forma hoja \beta nativa de la
proteína solo excede marginalmente el fondo, incluso a altas
concentraciones de la proteína. Cuando los resultados se expresan
como la relación de la fluorescencia de estados desnaturalizados
frente a nativos de la proteína prión (Figuras 3 y 4), la relación
para conformación \alpha-helicoidal es
1-1,8 y para SHaPrP90-231
recombinante en conformación hoja \beta es
5-50.
Este efecto se utilizó además para analizar
muestras de PrP de conformación desconocida, donde el pequeño
incremento en señal de IgG 3F4 marcada con Eu después de la
desnaturalización de PrP es una característica de la conformación
\alpha-helicoidal. En contraste, el gran
incremento en la señal por encima del cambio esperado para una
conformación \alpha-helicoidal es el diagnóstico
de la PrP90-231 en conformación hoja \beta
(Figuras 3 y 4). Los resultados se expresan en dos formas
diferentes: (1) como una relación (Figura 6), donde el índice
\leq 1,8 para SHaPrP90-231 recombinante indica que
la proteína estaba originalmente en toda la conformación hélice
\alpha y el índice > 1,8 indica la presencia de conformación
hoja \beta; (2) como una fórmula que se muestra en la presente y
se ilustra en el Ejemplo 11, donde el incremento en exceso de señal
por encima de aquel esperado para la conformación
\alpha-helicoidal es proporcionado a la cantidad
de SHaPrP90-231 en la conformación hoja
\beta.
La calibración de entrada/salida de
ShaPrP90-231 desnaturalizada, tanto en
conformaciones \alpha-helicoidales como hoja
\beta, fue lineal dentro de tres órdenes de magnitud y
proporciona un alto grado de certeza (Figura 5) para el ensayo.
También se ensayó la PrP^{c}, diluida en serie en homogeneizados
de ratón PrP^{0/0} que proporcionó resultados con alto grado de
certeza dentro del alcance lineal de 3 órdenes de magnitud. Luego,
el ensayo se calibró mediante PrP^{Sc} infecciosa purificada en
presencia de 5% de homogeneizado cerebral PrP^{0/0}. La
calibración con PrP^{Sc} proporcionó una respuesta lineal dentro
de un alcance similar.
Al utilizar el método diferencial, la relación
entre la señal de PrP^{c} cerebral nativa frente a
desnaturalizada fue para IgG 3F4 monoclonal marcada con Eu 2,2
(Figura 7), para P3 y N12 monoclonal 1,0. La calibración para
PrP^{Sc} produjo una relación \geq 20 (Figura 8) para IgG 3F4
marcada con Eu y >4 para anticuerpos N12 y P3. Al utilizar las
fórmulas desarrolladas que se muestran en la presente, toda la
PrP^{c} estuvo en alcance total en la conformación
\alpha-helicoidal. En contraste, la cantidad
calculada de PrP^{Sc} en conformación hoja \beta infecciosa
estuvo, como se anticipó, próxima a la cantidad total de proteína
prión.
La medición cuantitativa precisa de PrP total,
evaluando exclusivamente la señal de muestra desnaturalizada,
produjo un valor promedio de PrP^{c} en 5% de homogeneizados
cerebrales de Hámster sirio normal de 5,0 \pm 0,2 \mug/ml
(Media \pm SEM) (Figura 9). La dilución en serie de
homogeneizados cerebrales de hámster infectado con scrapie (Cepa
Sc237) en homogeneizado cerebral de ratón PrP^{0/0} produjo
valores de PrP total 36,0\pm4 \mug/ml (Figura 10) con amplio
alcance de la medición. Dado que la única condición conocida para
acumulación de la proteína prión es la acumulación de la forma
PrP^{Sc}infecciosa, los niveles aumentados de PrP total en la
muestra probada indican la presencia de priones. Este ensayo de
priones se puede utilizar: (1) en modo directo en muestras de
cerebro, tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos
después de la determinación de valores de control normales; o (2)
en modo indirecto, detectando la elevación de PrP total en el
cerebro de animales experimentales inoculados intracerebralmente
con la muestra probada de producto farmacéutico, fluido corporal o
tejido que se presume contiene priones.
La relación entre la afinidad de anticuerpos
hacia proteína PrP^{c} de cerebro de hámster sirio
desnaturalizada frente a nativa se encuentra en el alcance de
concentración amplio para IgG 3F4 marcada con Eu entre
0,8-2,2. La relación en el cerebro infectado con
scrapie se encuentra en todo el alcance lineal por encima de esos
valores (Figura 11). El "índice de prión" es un indicador
relativo de la presencia de PrP^{Sc} infecciosa y por consiguiente
de priones. Este modo de ensayo de priones se está utilizando: (1)
en modo directo en muestras de tejido, cerebro, fluidos corporales
o compuestos farmacéuticos después de la determinación del índice
para controles normales; o (2) en modo indirecto, detectando el
índice elevado de proteína prión desnaturalizada/nativa en el
cerebro de animales experimentales inoculados intracerebralmente con
muestras probadas de tejido, fluido corporal o compuestos
farmacéuticos que se presume contienen priones.
Al utilizar el ensayo directo y las fórmulas
provistas en la presente, no existe cantidad detectable de forma
hoja \beta de PrP^{Sc} en homogeneizado cerebral normal. A la
inversa, la mayoría de la PrP total en cerebro de hámster infectado
con scrapie se debió a la acumulación de PrP^{Sc} (Figuras 9 y
10). La correlación entre la valoración de priones y la PrP^{Sc}
calculada a partir de la fórmula posee un límite lineal y de
sensibilidad de \sim10^{3} ID_{50}/ml (Figura 11). La
fórmula produce un indicador cuantitativo de la presencia de
proteína PrP en conformación anormal que se correlaciona
cuantitativamente con la valoración de priones. Este modo de ensayo
de priones se utiliza: (1) en modo directo en muestras de cerebro,
tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos; o (2) en
modo indirecto, calculando el contenido de PrP^{Sc} en cerebros
de animales experimentales inoculados intracerebralmente con
muestras probadas de tejido, fluido corporal o productos
farmacéuticos que se presume contienen priones. Después de
establecer una curva de calibración entre la valoración de priones
y la PrP^{Sc}, es posible estimar la valoración directamente a
partir del contenido de PrP^{Sc}.
Las alícuotas de una disolución de 100 \mug/ml
de la forma \alpha-helicoidal de
SHaPrP90-231 o SHaPrP29-231
recombinante, o péptidos correspondientes recombinantes o
sintéticos de la proteína prión se incuban en 20 mM tampón de
acetato de Na, pH 5,5, durante 24 hs a 37ºC con
10^{-3}-10^{-6} M concentraciones de glicerol,
ciclodextrinas, heparina, sulfato de heparina, Rojo Congo, éster de
colesterol, dimiristoilfosfatidilcolina. Las muestras se dividen
luego en dos alícuotas: (1) no tratada, designada nativa; (2)
mezclada con 4M Gdn HCl final y calentada durante 5 min a 100ºC,
designada desnaturalizada. Ambas muestras se diluyen 20 veces con
H_{2}O y las alícuotas se cargan en una placa de poliestireno
activada con glutaraldehído. Las placas, incubadas toda la noche a
5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y
6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se lavaron tres veces
con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se
incubaron con IgG 3F4 marcada con europio. Las placas se revelaron
después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de
contraste proporcionada por el proveedor del marcador de europio
(Wallac Inc., Turku, Finlandia) y la señal se contó en un
Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia).
El grado de conversión de conformación
\alpha-helicoidal a hoja \beta de la PrP se
calcula a partir del "índice de prión" o alternativamente a
partir de las fórmulas provistas en la presente. Algunos
compuestos que inhiben la conversión estabilizando aparentemente la
conformación del tipo nativo de la proteína prión pueden poseer
potencial terapéutico in vivo.
El método de ensayo se demuestra en el siguiente
ejemplo con homogeneizado cerebral de hámster sirio infectado con
scrapie, diluido 4 veces
a) Cada placa se calibra con un estándar interno
que consiste en cinco puntos de dilución de
SHaPrP90-231 desnaturalizada. La fluorescencia de
resolución en el tiempo (TRF) de PrP total se desarrolla con IgG 3F4
marcada con Eu y los valores de la fluorescencia de resolución en
el tiempo se trazan como una función de la concentración de PrP
(Figura 4). Los datos se ajustan dentro de una ecuación lineal o
polinomial, utilizando el método menos cuadrado y se selecciona la
mejor función para el cálculo de PrP desnaturalizada.
PrP [\mu g/ml] = -0,22935 +
0,00026567\text{*}
[TRF]+
(1)0,0000000012255\text{*}
[TRF]
^{2}
b) En el resto de la placa, se incubaron
alícuotas nativas y desnaturalizadas de homogeneizado cerebral de
hámster sirio infectado con scrapie, diluidas 4 veces y reticuladas
con el soporte plástico, con IgG 3F4 marcada con Eu. El contenido
de PrP total se calculó de acuerdo con la fórmula anteriormente
expuesta, a partir de la señal de fluorescencia de la muestra
desnaturalizada:
Concentración de | TRF nativa | TRF desnaturalizada | PrP^{c+Sc}[\mug/ml] |
homogeneizado de | [cpm] | [cpm] | |
cerebro infectado | |||
con scrapie [%] | |||
5 | 4214 | 109814 | 43,7 |
1,25 | 1381 | 30804 | 9,1 |
0,3125 | 1070 | 11240 | 2,9 |
Se calcula la relación de las señales de
fluorescencia entre muestras nativas y desnaturalizadas:
Concentración de | TRF nativa | TRF desnaturalizada | Relación desnaturalizada/ |
homogeneizado de | [cpm] | [cpm] | nativa |
cerebro infectado | |||
con scrapie [%] | |||
5 | 4214 | 109814 | 26,1 |
1,25 | 1381 | 30804 | 22,3 |
0,3125 | 1070 | 11240 | 10,5 |
El valor normal de PrP^{c} determinado a partir
de homogeneizado de cerebro de hámster normal es 2,2; los valores
superiores a 2,2 se consideran anormales e indican la presencia de
PrP^{Sc}.
a) El exceso de señal de fluorescencia en función
de aquel esperado para PrP \alpha-helicoidal en
la transición de estado nativo a desnaturalizado es una medida de
la cantidad de PrP^{Sc} y se calcula de acuerdo con las fórmulas
provistas:
(2)\Delta F_{\beta
n-d} = F_{d} - (F_{d} \text{*} f_{\alpha
n-d})
donde f = es el valor máximo del factor para la
señal de fluorescencia en la transición del estado de PrP^{c}
nativo a desnaturalizado; F_{d} es la fluorescencia de la muestra
desnaturalizada; y F_{n} es la fluorescencia de la muestra
nativa. La cantidad de PrP_{Sc} se calcula luego a partir de
\DeltaF_{\beta n-d} y la ecuación
(1):
\newpage
Concentración de | \DeltaTRF_{\beta n-d} nativa | PrP^{Sc} [\mug/ml] |
homogeneizado de | [cpm] | |
cerebro infectado | ||
con scrapie | ||
(%) | ||
5 | 100543,2 | 38,9 |
1,25 | 27765,8 | 8,1 |
0,3125 | 8886 | 2,2 |
El valor positivo calculado para la forma hoja
\beta de proteína prión indica la presencia de PrP^{Sc}.
Las formas solubles de \betaA4
(1-40) y \betaA4 (1-42) se
obtuvieron de Bachem (Torrance, CA). Se solubilizó una porción del
péptido liofilizado nuevo en PBS, pH 7,4, que contenía 20% (v/v) de
HFIP (hexafluoroisopropanol;
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)
o 1% (p/v) SDS (dodecilsulfato de sodio) en concentración de
proteína final de 50 \muM; esta proteína se designó "soluble"
y se almacenó a -80ºC hasta su uso. Una segunda porción del
péptido se resuspendió en PBS, pH 7,4, en la concentración final
\geq 350 \muM y se incubó durante 72 hs a 37ºC. Esta porción
de la proteína se designó "insoluble" y se almacenó hasta su
uso a -80ºC.
Se utilizaron ambas proteínas como estándares
para el desarrollo del ensayo y para establecer el alcance lineal y
la sensibilidad. La espectroscopia de CD (dicroismo circular)
(Figura 12) demostró que la proteína soluble tiene una conformación
\alpha-helicoidal (véase la línea llena de la
Figura 12). En contraste, la proteína \betaA4 tratada durante 72
hs a 37ºC se convirtió completamente en conformación hoja \beta
(véase la línea de rayas de la Figura 12).
Los protocolos y métodos de producción y
caracterización de anticuerpos se describen en general en otras
partes [Harlow y Lane (1988) supra:726]. Los datos
descritos en éste y en los siguientes ejemplos se generaron con
anticuerpo monoclonal 6F3D, desarrollado contra péptido sintético
correspondiente a la secuencia de proteína \betaA4 humana
(Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). No obstante, también
podrían utilizarse anticuerpos policlonales elaborados contra
análogos sintéticos de proteína \betaA4. También se podrían
utilizar formas desnaturalizadas que reconocen Fab recombinante de
proteína \betaA4.
La proteína \betaA4 en conformaciones
\alpha-helicoidales, hoja \beta y en espiral
aleatorias se acoplaron covalentemente a placas de poliestireno
activadas con glutaraldehído y se incubaron con anticuerpo primario
diluido en serie. La cantidad de IgG que reacciona con cada
conformación de \betaA4 se determinó con anticuerpo
anti-ratón o anti-conejo marcado con
europio, de acuerdo con protocolos usuales y la señal total se
midió por fluorescencia aumentada por disociación de resolución en
el tiempo. Para desarrollar el ensayo, se seleccionaron
anticuerpos con la relación de señal de la conformación
desnaturalizada frente a hoja \beta de \betaA4 igual o superior
a 2.
En el ensayo directo, cada muestra de la curva de
dilución de formas \alpha-helicoidal y hoja
\beta de proteína \betaA4 se dividió en dos alícuotas: (1) no
tratada (designada nativa); y (2) mezclada con 4M Gdn.HCl/1%
Sarcosilo final y se calentó durante 5 min a 100ºC (designada
"desnaturalizada"). Ambas muestras se diluyeron 20 veces con
H_{2}O y las alícuotas se cargaron en una placa de poliestireno
activada con 0,2% de glutaraldehído durante 2 hs. Las placas,
incubadas durante toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH
7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). Las muestras
se lavaron luego tres veces con TBS, pH 7,8 que contenía 0,05%
(v/v) de Tween® 20 y se incubaron con anticuerpos primarios contra
proteína \betaA4 (6F3D, Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ).
Las muestras se lavaron y luego se desarrollaron con anticuerpos
secundarios marcados con europio contra IgG de ratón (Wallac Inc.,
Turku, Finlandia). Las placas se revelaron después de 7 etapas de
lavado adicionales en disolución de contraste (Wallac Inc., Turku,
Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234
(Wallac Inc., Turku, Finlandia). Los resultados para el analito
indican una diferencia notable tanto en sitios de unión como en IgG
anti-\betaA4 de afinidad con diferentes
conformaciones de proteína \betaA4.
El método podría llevarse a cabo utilizando un
ensayo competitivo, en el que el analito \betaA4 en diferentes
conformaciones se preincuba con IgG anti-\betaA4 y
luego se transfiere a la placa de poliestireno revestida con
proteína \betaA4 sintética en estado desnaturalizado Gdn.HCl.
Los parámetros obtenidos del ensayo directo con
IgG 6F3D anti-\betaA4 de se trazan como una
función de la concentración. Los resultados obtenidos con
\betaA4 en conformación \beta-helicoidal (Figura
13) muestran una gran diferencia entre la señal de proteína de hoja
\beta y desnaturalizada. El límite de sensibilidad para
\betaA4 desnaturalizada es \leq 1 \mug/ml y el alcance
lineal es más de 2 órdenes de magnitud. En los experimentos con la
forma \alpha-helicoidal de \betaA4 (Figura 14),
la IgG 6F3D se une igual de fuerte para ambas formas nativa y
desnaturalizada de la proteína. En contraste, la reactividad con
la forma nativa de hoja \beta de la proteína solo excede
marginalmente el fondo, incluso a altas concentraciones de la
proteína. Cuando los resultados se expresan como una relación de
la fluorescencia de los estados desnaturalizado frente a nativo de
\betaA4 (Figura 15), la relación para conformación
\alpha-helicoidal es \leq 1 y para \betaA4 en
conformación hoja \beta está en un intervalo de concentración
\geq 1,5.
Este efecto se utilizó además para analizar
muestras de \betaA4 de conformación desconocida en las que el
incremento pequeño en señal de IgG 3F4 marcada con Eu, después de
la desnaturalización de \betaA4, es una característica de
conformación \alpha-helicoidal. En contraste, el
gran incremento en la señal por encima del cambio esperado para la
conformación \alpha-helicoidal es el diagnóstico
de la conformación hoja \beta (Figura 15). Los resultados se
pueden expresar en dos formas diferentes: (1) como una relación
(Figura 15), en la que el índice \leq 1,0 para \betaA4 indica
que la proteína estaba originalmente en toda la conformación hélice
\alpha y el índice > 1,5 indica la presencia de conformación
hoja \beta; (2) como para la fórmula anteriormente expuesta, en
la que el incremento en exceso de señal por encima de aquel
esperado para una conformación \alpha-helicoidal
es proporcionado a la cantidad de \betaA4 en la
conformación
hoja \beta.
hoja \beta.
La medición cuantitativa precisa de \betaA4
total, evaluando exclusivamente la señal de muestra
desnaturalizada, es aparentemente más precisa que la medición de
\betaA4 en conformación nativa (Figuras 13 y 14). El valor
normal de la proteína puede ocultar una porción significativa de la
forma hoja \beta de proteína \betaA4, debido a la reactividad
inferior de esta forma con anticuerpos. Ya que la única condición
conocida para acumulación de proteína \betaA4 es la acumulación
de la forma hoja \beta de \betaA4 en los cerebros de pacientes
con enfermedad de Alzheimer, los niveles aumentados de \betaA4
total en la muestra probada indican la presencia de formas
patogénicas de \betaA4. Este ensayo de \betaA4 se puede
utilizar en muestras de tejido, fluidos corporales o compuestos
farmacéuticos que se presume contienen las formas hoja \beta de
\betaA4.
La relación entre afinidad de anticuerpos hacia
la proteína \betaA4 humana nativa frente a desnaturalizada se
encuentra en el intervalo de concentración amplio para IgG 6F3D,
entre 0,8-1,0. La relación para \betaA4 de hoja
\beta se encuentra en todo el alcance lineal por encima de esos
valores (Figura 15). El "índice amiloide de \betaA4" produce
un indicador relativo de la presencia de \betaA4 en hoja \beta
insoluble patogénica. Este modo de ensayo de \betaA4 se puede
usar en modo directo en muestras de cerebro, tejido, compuestos
farmacéuticos o fluidos corporales después de la determinación del
índice para controles normales.
Al utilizar el ensayo directo y la fórmula
anteriormente expuesta, se puede calcular la cantidad de formas
patogénicas de proteína \betaA4 en hoja \beta en muestras de
cerebro, tejido, fluidos corporales o compuestos farmacéuticos.
Las alícuotas de una disolución 350 \muM de la
forma \alpha-helicoidal de \betaA4 sintética
(1-40) o péptidos sintéticos o recombinantes
correspondientes de la proteína \betaA4 se incuban en PBS, pH 7,4,
durante 72 hs a 37ºC con 10^{-3}-10^{-6} M
concentraciones de glicerol, ciclodextrinas, heparina, sulfato de
heparina, Rojo Congo, éster de colesterol,
dimiristoilfosfatidilcolina. Las muestras se dividen luego en dos
alícuotas: (1) no tratada, que contiene 1% Sarcosilo y designada
"nativa"; y (2) mezclada con 4M Gdn HCl/1% Sarcosilo final y
calentada durante 5 min a 100ºC, designada "desnaturalizada".
Ambas muestras se diluyen 20 veces con H_{2}O y las alícuotas se
cargan en una placa de poliestireno activada con glutaraldehído.
Las placas, incubadas durante toda la noche a 5ºC, se bloquearon
con TBS, pH 7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v).
En la etapa siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8 que
contenía 0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con IgG 6F3D y
luego con anticuerpo anti-ratón marcado con Eu.
Las placas se revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales
en disolución de contraste y la señal se contó en un Fluorómetro
DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia).
El grado de conversión de conformación
\alpha-helicoidal a hoja \beta de \betaA4 se
calcula a partir del "índice amiloide" (Figura 15) o
alternativamente a partir de la fórmula anteriormente expuesta.
Cualquier compuesto que inhibe la conversión estabilizando la
conformación \alpha-helicoidal de la proteína
\betaA4 puede tener potencial terapéutico in vivo,
previniendo la formación amiloide madura.
Se obtuvieron formas solubles de TTR de Sigma
Chemical Comp. Una porción de la proteína se solubilizó en 100 mM
tampón KCl, pH 7,4, en concentración de proteína final de 0,5 mg/ml;
esta proteína se designó "normal" y se almacenó a -80ºC hasta
su uso. La segunda porción de la proteína se convirtió a amiloide,
tal como se describe [Lai, Colon et al (1996)
Biochemistry 35(20):6470-82].
En breve, la proteína se resuspendió en 100 mM de tampón KCl, que
contenía 50 mM acetato de sodio, pH 4,4, a una concentración de
proteína de 0,2 mg/ml y se incubó durante 72 hs a 37ºC. A esta
porción de la proteína se la designó "amiloide" y se almacenó
hasta su uso a -80ºC. El ensayo de unión de Rojo Congo y la
turbidimetría verificaron la conversión eficiente a amiloide [Lai,
Colon et al (1996) Biochemistry
35(20):6470-82]. Ambas proteínas se
utilizaron como estándares para el desarrollo del ensayo y para
establecer la sensibilidad y el alcance lineal.
Los protocolos y métodos de la producción y
caracterización de anticuerpos se describen en general en otras
partes. Los datos descritos en éste y en los siguientes ejemplos
se generaron con anticuerpo policlonal existente en plaza,
desarrollado contra TTR humana purificada (Accurate Chemical and
Scientific Corporation, Westbury, NY).
En el ensayo directo, cada muestra de proteína
tomada a partir de la curva de dilución de formas normales y
amiloides de TTR se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada y
designada "nativa"; (2) mezclada con 4M Gdn HCl/1% Sarcosilo
final y calentada durante 5 min a 100ºC y designada
"desnaturalizada". Ambas muestras se diluyeron 20 veces con
H_{2}O y las alícuotas se cargaron en una placa de poliestireno
activada con 0,2% glutaraldehído durante 2 hs. Las placas,
incubadas toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que
contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente,
se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía 0,05% (v/v) de
Tween 20 y se incubaron con anticuerpos primarios contra TTR
(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY), se
lavaron y luego se evaporaron con anticuerpos secundarios marcados
con europio contra IgG de conejo (Wallac Inc., Turku, Finlandia).
Las placas se revelaron después de siete etapas de lavado
adicionales en disolución de contraste y la señal se contó en un
Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finlandia).
La relación entre la afinidad de anticuerpos
hacia la forma desnaturalizada frente a la nativa de TTR humana
normal se encuentra en el amplio intervalo de concentración para el
anticuerpo policlonal 1-3:3. La relación para la
forma amiloide de TTR se encuentra en el alcance lineal total entre
0,7 y 1,0 (Figura 18). El "índice amiloide de TTR" produce un
indicador relativo de la presencia de TTR formadora de amiloide
patogénica e insoluble. Este modo de ensayo de TTR se está
utilizando en modo directo en muestras de cerebro, tejido, fluidos
corporales o compuestos farmacéuticos después de la determinación
del índice para controles normales.
Al utilizar la fórmula del ensayo directo (Figura
19), se puede calcular la cantidad de forma amiloide de TTR en
muestras de tejido, nervio periférico, fluidos corporales o
compuestos farmacéuticos. En la fórmula (Figura 19), el incremento
inferior al esperado de la señal para la conformación normal es
proporcional a la cantidad de TTR en la conformación amiloide.
Las alícuotas de una disolución de 0,2 mg/ml de
la forma normal de TTR sintética, o los péptidos recombinantes o
sintéticos correspondientes de la TTR, se incuban en 100 mM tampón
de KCl, que contiene 50 mM de acetato de sodio, pH 4,4, durante 72
hs a 37ºC con 10^{-3} - 10^{-6} M concentraciones de los
compuestos orgánicos probados. Las muestras se dividen luego en dos
alícuotas: (1) no tratada, que contiene 1% Sarcosilo y designada
"nativa"; (2) mezclada con 4M Gdn HCl/1% Sarcosilo final y
calentada durante 5 min a 100ºC, designada "desnaturalizada".
Ambas muestras se diluyen 20 veces con H_{2}O y las alícuotas se
cargan en una placa de poliestireno activada con glutaraldehído.
Las placas, incubadas toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH
7,8, que contenía 0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa
siguiente, se lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía
0,05% (v/v) de Tween® 20 y se incubaron con anticuerpo
anti-TTR policlonal (Accurate Chemical and
Scientific Corporation, Westbury, NY) y luego anticuerpo
anti-conejo marcado con Eu. Las placas se
revelaron después de 7 etapas de lavado adicionales en disolución de
contraste y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac
Inc., Turku, Finlandia).
El grado de conversión de conformación normal a
amiloide de TTR se calcula a partir del "índice amiloide"
(Figura 18) o alternativamente a partir de la fórmula (Figura 19).
Cualquier compuesto que inhibe la conversión estabilizando la
conformación normal de TTR puede tener potencial terapéutico in
vivo, previniendo la formación de amiloide madura.
Se infectaron hámsteres sirio (LVG/LAK) mediante
inyección intracerebral de los siguientes aislamientos de scrapie
adaptados a hámster, es decir, se infectaron diferentes grupos de
hámsteres con cepas individuales de priones, de la siguiente
manera: Drowsy (Dy), 139H, Hyper (Hy), Me7, MT-C5 y
Sc237. Se aplicó eutanasia a los animales en estadios terminales
de enfermedad y sus cerebros se congelaron y almacenaron
inmediatamente a -70ºC. Los cerebros se homogeneizaron en hielo
con 3 golpes de 30 seg en un homogeneizador PowerGen (Fisher
Scientific, Pittsburg, PA) en PBS, pH 7,4, que contenía un cóctel de
inhibidores de proteasa (PMSF 5mM, Aprotinina y Leupeptina 4
\mug/ml). 10% (p/v) de los homogeneizados resultantes se
centrifugó durante 5 min a 500 g en una máquina centrífuga de
escritorio. El sobrenadante se mezcló 1:1 con 4% Sarcosilo en PBS,
pH 7,4 y se dividió en dos alícuotas: (1) no tratada y designada
nativa; (2) mezclada con una concentración final 4M Gdn Hcl y
calentada durante 5 min a 80-100ºC y designada
desnaturalizada. Ambas muestras se diluyeron 20 veces con H_{2}O
y las alícuotas se cargaron en una placa de poliestireno activada
durante 1 h con 0,2% glutaraldehído en PBS. Las placas, incubadas
toda la noche a 5ºC, se bloquearon con TBS, pH 7,8, que contenía
0,5% BSA (p/v) y 6% Sorbitol (p/v). En la etapa siguiente, se
lavaron tres veces con TBS, pH 7,8, que contenía 0,05% (v/v) de
Tween 20 y se incubaron durante 2 hs con anticuerpo 3F4 monoclonal
marcado con Europio. Las placas se revelaron después de 7 etapas
de lavado adicionales en disolución de contraste proporcionada por
el proveedor del marcador de Europio (Wallac Inc., Turku,
Finlandia) y la señal se contó en un Fluorómetro DELFIA 1234 (Wallac
Inc., Turki, Finlandia). El contenido de PrP^{Sc} y el "índice
de prión" (relación de unión de anticuerpo a proteína PrP
desnaturalizada-nativa) se calcularon como se
describe en los Ejemplos 11 y 8 y se registraron en coordenadas xy,
como se muestra en la Figura 25. Se presume que otras muestras
probadas y que resultaron en los mismos cálculos podrían tener la
misma cepa de prión.
La presente invención se muestra y describe aquí
en lo que se considera las realizaciones más prácticas y
preferidas. Se reconoce, no obstante, que se pueden efectuar
desviaciones, las cuales estarán dentro del alcance de la invención
y que las modificaciones serán obvias para aquellas personas con
experiencia en la técnica al leer la presente descripción.
Claims (13)
1. Un método para determinar la presencia de una
forma patogénica de una proteína seleccionada en una muestra que
comprende una primera conformación no patogénica de la proteína y
una segunda conformación patogénica de la proteína, comprendiendo
el método:
poner en contacto una primera porción de la
muestra con un elemento enlazante, teniendo dicho elemento
enlazante una afinidad mayor hacia la primera conformación que
hacia la segunda conformación y determinar una primera
concentración;
tratar una segunda porción de la muestra para
cambiar la segunda conformación a una conformación que tiene una
afinidad de unión superior hacia el elemento enlazante;
poner en contacto la segunda porción tratada de
la muestra con el elemento enlazante para determinar una segunda
concentración;
ajustar la segunda concentración para proveer una
concentración ajustada, cuyo ajuste compensa la afinidad
incrementada de la proteína en la primera conformación hacia el
elemento enlazante resultante del tratamiento; y
comparar la primera concentración con la
concentración ajustada para determinar la presencia de proteína en
la segunda conformación patogénica.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la muestra se obtiene de un animal que no exhibe síntomas
de enfermedad;
en el que la primera concentración y la segunda
concentración se determinan utilizando fluorescencia aumentada por
disociación de resolución en el tiempo;
en el que además la segunda conformación
patogénica de la proteína está presente en la muestra en una
concentración de 1 x 10^{3} partículas/ml o menos;
en el que dicha proteína se selecciona entre el
grupo que consiste en proteína \betaA4; proteína PrP y
transtiretina.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha proteína está unida a una superficie sólida y en el
que el tratamiento comprende someter dicha segunda porción de la
muestra a un tratamiento seleccionado entre el grupo que consiste
en calor, presión y desnaturalización química, suficiente como para
convertir al menos 2% de cualquier proteína en dicha segunda forma,
a dicha forma enlazante;
en el que dicho elemento enlazante comprende un
anticuerpo marcado que tiene una afinidad hacia dicha primera
conformación por lo menos cuatro veces superior a su afinidad hacia
dicha segunda conformación.
4. Un método para determinar la presencia de una
forma patogénica de una proteína seleccionada en una muestra que
comprende una primera conformación no patogénica de la proteína y
una segunda conformación patogénica de la proteína, comprendiendo
el método:
tratar la muestra para convertir la segunda
conformación de la proteína en una conformación enlazante que tiene
una afinidad hacia un elemento enlazante superior a la segunda
conformación;
poner en contacto la muestra tratada con el
elemento enlazante para determinar una concentración;
ajustar la concentración para proveer una
concentración ajustada que compensa la afinidad incrementada de la
primera conformación de la proteína al elemento enlazante resultante
del tratamiento; y
comparar dicha primera concentración ajustada con
una concentración conocida seleccionada entre el grupo que consiste
en una concentración de control y una concentración estándar
predeterminada para determinar la presencia de la proteína en la
segunda conformación en la muestra.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que dicho elemento enlazante comprende un anticuerpo marcado
y en el que la concentración se determina utilizando citometría de
flujo;
en el que la concentración ajustada se compara
con una concentración conocida determinada de una muestra de
control no infectada tratada o se compara con una concentración
conocida predeterminada de una muestra tratada de una población no
infectada;
en el que además el anticuerpo es 3F4;
en el que también la proteína en la segunda
conformación está presente en la muestra en una concentración de 1
x 10^{3} moléculas de proteína o menos por ml, y en el que la
proteína en la primera conformación está presente en la muestra en
una concentración de 1 x 10^{6} moléculas de proteína o más por
ml.
6. Un método para identificar un compuesto que
tiene una actividad terapéutica contra una enfermedad mediada por
priones, donde dicha enfermedad mediada por priones está
caracterizada por una proteína que tiene una primera forma y
una segunda forma que difieren en conformación, estando una de
dichas formas asociada con dicha enfermedad mediada por priones,
comprendiendo dicho método:
proveer un animal susceptible a una enfermedad
mediada por priones;
administrar un compuesto de prueba a dicho
animal;
inducir dicha enfermedad mediada por priones;
obtener una muestra de dicho animal;
poner en contacto una primera porción de muestra
que contiene dicha proteína con un elemento enlazante, teniendo
dicho elemento enlazante una afinidad mayor hacia dicha primera
forma de dicha proteína que dicha segunda forma, y determinar una
primera concentración;
tratar una segunda porción de la muestra para
convertir dicha segunda forma en una forma enlazante que tenga una
afinidad mayor hacia dicho elemento enlazante;
poner en contacto la segunda porción tratada con
el elemento enlazante para determinar una segunda
concentración;
ajustar la segunda concentración para proveer una
concentración ajustada que compensa la afinidad incrementada de la
proteína en la primera forma hacia el elemento enlazante resultante
del tratamiento; y
comparar la primera concentración con la
concentración ajustada para determinar la concentración de la
proteína en la segunda forma y deducir el efecto del compuesto de
prueba sobre la concentración de proteína en la segunda forma.
7. Un método para determinar una cepa de una
proteína patogénica en una muestra que comprende:
determinar la concentración de una conformación
patogénica de una proteína en una muestra;
tratar la muestra en un modo tal como para
cambiar la conformación patogénica de la proteína a una conformación
que tiene una afinidad de unión mayor hacia un elemento enlazante
que la conformación patogénica;
determinar el efecto del tratamiento de la
proteína en la conformación patogénica; y
comparar el efecto determinado con un efecto
estándar conocido para una cepa conocida a una concentración
conocida y deducir de este modo la cepa de la conformación
patogénica de la proteína en la muestra.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que la concentración de la conformación patogénica y el efecto
por el tratamiento se determinan utilizando un anticuerpo marcado
como el elemento enlazante y utilizando fluorescencia aumentada por
disociación de resolución en el tiempo;
en el que la conformación patogénica de la
proteína es PrP^{Sc} y la PrP^{Sc} se trata con proteinasa
K.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 4, 6 y 7, en el que el elemento enlazante es
un anticuerpo.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera
conformación al menos diez veces mayor que su afinidad hacia dicha
segunda conformación.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera
conformación al menos treinta veces mayor que su afinidad hacia
dicha segunda conformación.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera
conformación al menos cuatro veces mayor que su afinidad hacia
dicha segunda conformación.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que dicho anticuerpo posee una afinidad hacia dicha primera
conformación al menos treinta veces mayor que su afinidad hacia
dicha segunda conformación.
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