DE69909442T2

DE69909442T2 - Assay für spezifische stämme von mit mehreren krankheiten zusammenhängenden proteinkonformationen

Info

Publication number: DE69909442T2
Application number: DE69909442T
Authority: DE
Inventors: B. Stanley PRUSINER; G. Jiri SAFAR; E. Fred COHEN
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2019-02-06
Also published as: AU2660299A; WO1999042829A1; AU753331B2; CA2318477A1; EP1057022B1; ATE244889T1; JP2003519357A; ES2203073T3; EP1057022A4; KR20010041135A; BR9908059A; DE69909442D1; EP1057022A1; DE1057022T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Immunoassays. Genauer bezieht sich die Erfindung auf einen Assay, welcher die Bestimmung eines spezifischen Stammes einer mit einer Krankheit verbundenen Konformationsform eines Proteins (wie z. B. PrP^Sc), welcher eine sehr niedrige Antikörper-Bindungsaffinität haben kann, ermöglicht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prione sind infektiöse Pathogene, die immer tödliche Prionkrankheiten (spongiforme Encephalopathien) des zentralen Nervensystems in Menschen und Tieren verursachen. Prione unterscheiden sich signifikant von Bakterien, Viren und Viroiden. Die vorherrschende Hypothese ist, dass keine Nukleinsäure notwendig ist, um zu ermöglichen, dass die Infektiosität eines Prion-Proteins voranschreitet.
Ein bedeutender Schritt bei der Untersuchung der Prionen und der Krankheiten, die sie verursachen, war die Entdeckung und Aufreinigung eines Proteins, genannt Prion-Protein [Bolton, McKinley et al. (1982) Science 218: 1309–1311; Prusiner, Bolton et al. (1982) Biochemistry 21: 6942–6950; McKinley, Bolton et al. (1983) Cell 35: 57–62]. Seitdem sind vollständige Prion-Protein-kodierende Gene kloniert, sequenziert und in transgenen Tieren expremiert worden. PrP^c wird von einem in Einzelkopie vorliegenden Wirtsgen kodiert [Basler, Oesch et al. (1986) Cell 46: 417–428], und wenn PrP^c exprimiert wird, wird im Allgemeinen auf der äußeren Oberfläche von Neuronen gefunden. Viele Beweisrichtungen deuten darauf hin, dass sich Prionkrankheiten aus der Transformation der normalen Form des Prion-Proteins (PrP^c) in die abnormale Form (PrP^Sc) ergeben. Es gibt keinen bestimmbaren Unterschied in der Aminosäuresequenz der zwei Formen. Dennoch hat PrP^Sc eine Konformation mit höherem Gehalt an β-Faltblatt und einem niedrigeren Gehalt an α-Helix, im Vergleich zu PrP^c [Pan, Baldwin et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962–10966; Safar, Roller et al. (1993) J Biol Chem 268: 20276–20284]. Die Anwesenheit der abnormalen PrP^Sc-Form in den Gehirnen von infizierten Menschen oder Tieren ist der einzige Krankheits-spezifische diagnostische Marker für Prionkrankheiten.
PrP^Sc spielt eine Schlüsselrolle sowohl in der Transmission als auch in der Pathogenese von Prionkrankheiten (spongiforme Encephalopathien) und es ist ein kritischer Faktor in neuronaler Degeneration [Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2^nd Edition: 103–143]. Die verbreitetsten Prionkrankheiten in Tieren sind die Traberkrankheit (scrapie) bei Schafen und Ziegen und bovine spongiforme Encephalopathie (BSE) bei Rindern [Wilesmith and Wells (1991) Curr Top Microbiol Immunol 172: 21–38]. Vier Prionkrankheiten der Menschen sind identifiziert worden: (1) kuru, (2) Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Streussler-Sheinker-Krankheit (GSS) und (4) tödliche familiäre Schlaflosigkeit (fatal familial insomnia) (FFI) [Gajdusek (1977) Science 197: 943–960; Medori, Tritschler et al. (1992) N Engl J Med 326: 444– 449]. Anfangs gab das Vorliegen der ererbten humanen Prionkrankheiten ein Rätsel auf, welches seitdem durch den zellulären genetischen Ursprung von PrP erklärt worden war.
Prione existieren in mehrfachen Isolaten (Stämmen) mit verschiedenen biologischen Eigenschaften, wenn diese unterschiedlichen Stämme genetisch identische Wirte infizieren (Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2^nd Edition: 165–186]. Die Stämme unterscheiden sich in der Inku bationszeit, in der Topologie der Anhäufung von PrP^Sc-Protein und in einigen Fällen auch in der Verteilung und in den Eigenschaften der Hirnpathologie [DeArmond und Prusiner (1997) Greenfield's Neuropathology, 6^th Edition: 235-280]. Weil PrP^Sc die Haupt-, und sehr wahrscheinlich die einzige, Komponente von Prionen ist, hat die Existenz von Prionstämmen insofern ein Rätsel aufgegeben, als biologische Information in einem Molekül verschlüsselt werden kann, anders als in einem aus Nukleinsäuren bestehenden. Es wurde entdeckt, dass die teilweise proteolytische Behandlung von Gehirnhomogenaten, die einige Prion-Isolate enthalten, Peptide mit leicht unterschiedlichen elektrophoretischen Beweglichkeiten generiert [Bessen and Marsh (1992) J Virol 66: 2096–2102; Bessen and Marsh (1992) J Gen Virol 73: 329 – 334; Telling, Parchi et al. (1996) Science 274: 2079–2082]. Diese Befunde weisen auf unterschiedliche proteolytische Schnittstellen gemäß der unterschiedlichen Konformationen der PrP^Sc-Moleküle in unterschiedlichen Stämmen von Prionen hin. Alternativ könnten die beobachteten Unterschiede durch Bildung von unterschiedlichen Komplexen mit anderen Molekülen erklärt werden, wobei sie verschiedene Schnittstellen in PrP^Sc in verschiedenen Stämmen bilden [Marsh and Bessen (1994) Phil Trans R Soc Lond B 343: 413–414]. Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass sich verschiedene Prion-Isolate in den Glykosylierungsmustern des Prion-Proteins unterscheiden können [Collinge, Sidle et al. (1996) Nature 383: 685–690; Hill, Zeidler et al. (1997) Lancet 349: 99–100]. Dennoch wird die Zuverlässigkeit von sowohl der Glykosylierungs- als auch der Peptid-Zuordnungsmuster in den Diagnoseverfahren von mehrfachen Prionstämmen gegenwärtig immer noch diskutiert [Collings, Hill et al. (1997) Nature 386 : 564; Somerville, Chong et al. (1997) Nature 386 : 564].
Ein System zur Bestimmung von PrP^Sc durch Erhöhen der Immunreaktivität nach Denaturierung wird in Serban, et al., Neurology, Vol. 40, Nr. 1, Ja 1990, zur Verfügung gestellt. Ein ausreichend sensitiver und spezifischer direkter Assay für infektiöses PrP^Sc in biologischen Proben könnte möglicherweise den Bedarf an Tier-Inokulationen komplett aufheben. Unglücklicherweise scheint dies mit den gegenwärten PrP^Sc-Assays nicht möglich zu sein -- es wird geschätzt, dass das gegenwärte Sensitivitätslimit von Proteinase-K und Western-Blot-basierender PrP^Sc-Bestimmung in einem Bereich von 1 μg/ml liegt, was 10⁴ bis 10⁵ infektiösen Prion-Einheiten entspricht. Zusätzlich ist die Spezifität des herkömmlichen Proteinase-K-basierenden Assays für PrP^Sc im Licht der kürzlichen Befunde von nur relativer oder keiner Proteinase-K-Resistenz von unzweifelhaft infektiösen Prion-Zubereitungen fraglich [Hsiao, Groth et al. 81994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 9126–9130] Telling, et al. (1996) Genes & Dev.
Humanes Transthyretin (TTR) ist ein normales Plasmaprotein, bestehend aus vier identischen, vorherrschend β-Faltblatt-strukturierten Einheiten, und dient als ein Transporter des Hormons Thyroxin. Abnormale Selbstanordnung von TTR in amyloide Fibrillen verursacht zwei Formen von menschlichen Krankheiten, namentlich senile systemische Amyloidose (SSA) und familiäre amyloide Polyneuropathie (FAP) [Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol 6(1): 11–7]. Der Grund für die Amyloidbildung in FAP sind Punktmutationen im TTR-Gen; der Grund von SSA ist unbekannt. Die klinische Diagnose ist histologisch durch die Bestimmung von Amyloid-Ablagerungen in situ in Biopsiematerial etabliert.
Bis heute ist wenig bekannt über den Mechanismus der TTR-Konversion in Amyloid in vivo. Dennoch zeigten einige Laboratorien, dass amyloide Konversion in vitro durch teilweises Denaturieren von normalem humanem TTR angeregt werden kann [McCutchen, Colon et al. (1993) Biochemistrv 32(45): 12119–27; McCutchen and Kelly (1993) Biochem Biophys Res Commun 197(2): 415–21]. Der Mechanismus des Konformationsübergangs schließt ein monomeres Konformationszwischenprodukt mit ein, welches in lineare β-Faltblatt-strukturierte amyloide Fibrillen polymerisiert [Lai, Colon et al. (1996) Biochemistrv 35 20 6470–82]. Der Vorgang kann durch Bindung mit stabilisierenden Molekülen wie z. B. Thyroxin oder Triiodophenol gemildert werden [Miroy, Lai et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 26 : 15051–6].
Angesichts der obigen Punkte besteht klar ein Bedarf an einem spezifischen, hochdurchsätzigen, und kosteneffektiven Assay zum Testen von Probenmaterialien auf die Gegenwart von spezifischen Stämmen eines pathogenen Proteins, einschließlich Transthyretin und Prionprotein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Assay-Methodologie der Erfindung ermöglicht: (1) Bestimmen, ob eine Probe eine Konformation eines Proteins enthält, welche mit einer Krankheit verbunden ist und die Konzentration und die Menge von solchem, falls vorhanden; (2) Bestimmen der Menge einer chemischen Verbindung wie z. B. eines Proteaseresistenten mit einer Krankheit verbundenen Proteins in einer Probe und Bestimmen der Menge des Protease-sensitiven Krankheitsproteins in der Probe durch Abziehen dieser Probe von der Gesamtmenge des vorliegenden mit einer Krankheit verbundenen Proteins; und (3) Bestimmen des Stammes und der Inkubationszeit eines mit einer Krankheit verbundenen Proteins durch (i) Beziehen der relativen Mengen an Protease-resistentem und Protease-sensitivem Protein auf bekannte Stämme, um so den Stamm zu bestimmen; und (ii) Auftragen der Konzentration an Protease-sensitivem Protein auf einem Graphen der Inkubationszeit gegen die Konzentration eines Protease-sensitiven Proteins für bekannte Stämme, um die Inkubationszeit eines gegebenen unbekannten Stammes vorherzusagen.
Das Vorliegen und die Konzentration eines Proteins in einer mit der Krankheit verbundenen Konformation wird über eine der drei verschiedenen Grundverfahren bestimmt. Gemäß des Erstverfahrens wird eine Probe zuerst in zwei Teile geteilt. Der erste Teil wird mit einem markierten Antikörper in Kontakt gebracht, der die Nicht-Krankheits-Konformation des Proteins bindet, aber nicht die mit einer Krankheit verbundene Konformation des Proteins. Der zweite Teil wird dann einer Protein-Entfaltungsbehandlung unterworfen, welche die Bindungsaffinität für jegliches Protein in der zweiten Konformation für diesen Antikörper erhöht. Im Allgemeinen wird die Protein-Entfaltungsbehandlung ein Epitop freilegen, an welches der Antikörper binden kann, welches Epitop in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation nicht freigelegt ist. Dementsprechend wird das mit einer Krankheit verbundene Protein, welches nicht den Antikörper vor der Protein-Entfaltungsbehandlung band, den Antikörper jetzt binden. Dann wird ein Vergleich zwischen der Menge an Antikörperbindung an das Protein in dem ersten unbehandelten Teil mit der Menge an Antikörperbindung an das Protein in dem zweiten Teil durchgeführt. Ein Unterschied zwischen der Menge an Antikörper-Bindung in den ersten und zweiten Teilen weist auf die Anwesenheit eines mit einer Krankheit verbundenen Proteins in der Probe hin. Abhängig von dem Protein und der verwendeten Protein-Entfaltungsbehandlung kann es nötig sein, eine Anpassung gemäß dem Effekt des Behandlung-1-Proteins in der nicht mit einer Krankheit verbundenen Konformation zu machen.
Angegeben in einer schrittweisen Methode umfasst das grundlegende Assay-Verfahren der Erfindung (a) zur Verfügungstellen einer Probe, die verdächtig ist, ein Protein zu enthalten (eine erste Konformation und eine zweite, auf eine Krankheit bezogene Konformation habend), (b) Teilen der Probe in erste und zweite Teile, (c) In-Kontakt-Bringen des ersten Teils mit einem Antikörper, der an die erste Konformation mit höherer Affinität als an die zweite Konformation bindet, (d) Unterwerfen des zweiten Teiles einer Protein-Entfaltungsbehandlung, um jegliches Protein in der zweiten Konformation zu veranlassen, eine unterschiedliche Konformation anzunehmen, eine höhere Affinität für den Antikörper habend, (e) In-Kontakt-Bringen des zweiten Teiles mit dem Antikörper, (f) Bestimmen der relativen Level an Antikörperbindung zu den ersten und zweiten Teilen und (g) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Protein in einer zweiten Konformation, basierend auf dem Vergleich.
Sobald bestimmt wurde, dass eine Probe ein Protein mit einer mit Krankheit verbundenen Konformation enthält, ist es ferner nützlich, den Stamm in Bezug auf Inkubationszeit des Proteins zu bestimmen. Dies kann getan werden durch Erhal ten eines anderen Teils der Probe, welcher auf Protein mit einer mit Krankheit verbundenen Konformation positiv getestet wurde. Dieser Teil wird einer beschränkten Protease-Behandlung unterworfen, welche das meiste Protein in der Probe hydrolysiert, aber nicht höchstresistentes Protein in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation, z. B. Protease-resistentes PrP 27–30. Die Konzentration und Menge des Behandlungs-resistenten Proteins wird dann bestimmt. Durch Abziehen der Menge an Protease-resistentem Protein in der Probe von der Gesamtmenge von dem mit einer Krankheit verbundenen Protein in der Probe erhält man die Menge an mit Krankheit verbundenem Protein in der Probe, welche empfindlich ist für Protease-Verdauung, z. B. Protease-sensitives PrP^Sc. Jeder Stamm von mit einer Krankheit verbundenem Protein hat ein bekanntes Verhältnis von Gesamtprotein in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation (z. B. natives PrP^Sc) zu der Menge an Protein in mit einer Krankheit verbundenen Konformation, welches durch eine Protein-denaturierende Behandlung denaturiert wird (Protease-sensitives PrP^Sc). So kann das Verhältnis (gesamt: denaturiert) dem eines bekannten Stammes angepasst werden, um den Stamm in der Probe zu bestimmen.
Das Verfahren zum Bestimmen des Stammes von jeglicher mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins kann auch in einer schrittweisen Art und Weise angegeben werden. Das Verfahren wird ausgeführt durch (a) Isolieren eines Proteins in einer mit einer Krankheit verbundenen Formation, z. B. durch Zentrifugieren; (b) Behandeln des isolierten Proteins mit einer Verbindugn (z. B. Guanidin-Hydrochlorid), welche eine Form des isolierten Proteins denaturiert, aber nicht die andere; (c) Bestimmen des Verhältnisses von Protein, das gegenüber der Behandlung resistent ist, in Bezug auf die Gesamtmenge von mit einer Krankheit verbundenem Protein; und (d) Vergleichen des Verhältnisses mit dem eines vorbestimmten Standards eines bekannten Stammes, dadurch den Stamm des mit einer Krankheit verbundenen Proteins in der Probe bestimmend. Dieses Verfahren ist leichter anzuwenden, wenn der entdeckte Stamm mit einem bekannten Stamm übereinstimmt. Falls keine Übereinstimmung mit einem bekann ten Stamm ist, und kein experimenteller Fehler gemacht wurde, wird angenommen, dass ein neuer Stamm entdeckt worden ist.
Die Inkubationszeit einer mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins kann, sogar wenn der Stamm vorher unbekannt war, bestimmt werden. Diese wird bestimmt durch (a) Isolieren des Proteins in der mit einer Krankheit verbundenen Formation, z. B. durch Zentrifugieren; (b) Behandeln des isolierten Proteins (z. B. mit Proteinase K), was eine Form des isolierten Proteins, aber nicht die andere hydrolysiert; (c) Abziehen der Menge an nicht-denaturiertem, mit einer Krankheit verbundenem Protein (Behandlungs-resistentes Protein) von der Gesamtmenge an mit einer Krankheit verbundenem Protein, um die Menge an mit einer Krankheit verbundenem Protein, welches denaturiert ist, herauszufinden; (d) Auftragen der Menge an mit einer Krankheit verbundenem Protein (Behandlungssensitiv), gefunden in (c) auf einen Graphen der Inkubationszeit gegen die Menge an nicht-denaturiertem, mit einer Krankheit verbundenem Protein (welcher Graph bekannte Stämme mit bekannten Inkubationszeiten aufgetragen hat); und (e) dadurch Vorhersagen der Inkubationszeit.
Der Assay der Erfindung ist beim Testen von Proben nützlich, welche Proteine enthalten, welche mindestens in zwei Konformationen (z. B. einer nativen, Nicht-Krankheit-Konformation und einer Krankheits-Konformation) vorliegen, und auf einem Niveau von 1 × 10³ Partikel/ml oder weniger vorliegen. Die vorliegende Erfindung verwendet Antikörper, die nicht binden oder die ein relativ geringes Maß an Affinität für die fest konfigurierte Krankheits-Konformation des Proteins haben. Ein nützlicher Antikörper für die Bindung an PrP^c ist der monoklonale Antikörper 3F4, produziert von der Hybridomzell-Linie ATCC HB 9222, hinterlegt am 8. Oktober 1986 in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, und offenbart und beschrieben in dem U.S.-Patent 4,806,627, erteilt am 21. Februar 1989 – auf das Bezug genommen wird, um Antikörper zu offenbaren, welche selektiv PrP^c binden. Zusätzlich zum Antikörper könnten andere Bindungspartner, welche die auf keine Krankheit be zogene Konformation binden, aber nicht die auf eine Krankheit bezogene Konformation, in dem Assay der Erfindung verwendet werden. Antikörper, wie z. B. 3F4 und andere in den in den Beispielen beschriebenen Assays verwendete, sind kommerziell erhältlich.
Um das Erstverfahren hinter der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, beginnt man mit einer Startprobe, welche in mindestens zwei Teile geteilt wird. Der erste Teil wird mit markierten Antikörpern ohne Behandeln der Proteine in Kontakt gebracht, und der zweite Teil wird mit markierten Antikörpern behandelt, nachdem die Proteine einer Proteinentfaltungsbehandlung unterzogen worden waren, welche jegliche Proteine in der Krankheitskonformation veranlasst, eine Konformation anzunehmen, welche ein höheres Maß an Bindungsaffinität für die Antikörper (z. B. liegt ein bisher nicht freigelegtes Epitop frei) hat. Die Messwerte werden verglichen (z. B. einer vom anderen abgezogen) und das Vorliegen von Proteinen in einer mit Krankheit verbundenen Konformation wird, basierend auf dem Unterschied zwischen den zwei Messwerten, hergeleitet.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform des grundlegenden Assays ist es möglich, das grundliegende Konzept hinter der vorliegenden Erfindung zu verwenden, ohne zwei Messwerte für jeden Assay zu erhalten. Dies kann durch Etablieren eines Standards, basierend auf dem Ausführen des Assays an einer statistisch signifikanten Anzahl von nahe beieinanderliegenden Proben, ausgeführt werden. Nachdem der Standard etabliert worden ist, wird man das Niveau an Antikörper-Bindung wissen, welches beobachtet werden sollte, wenn eine gegebene Probe keine Proteine in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation enthält. Unter Verwendung des Standards unterzieht man dann die zu testende Probe einer Protein-Entfaltungsbehandlung, um jegliche Proteine in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation in eine unterschiedliche Konformation überzuführen, welche ein viel höheres Maß an Bindungsaffinität für die markierten Antikörper hat. Die erhaltene Messung wird dann mit dem Standard verglichen. Falls der Unterschied zwischen dem Standard und der erhaltenen Messung außerhalb eines gegebenen Bereichs liegt, kann abgeleitet werden, dass die ursprüngliche Probe Proteine in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation miteinschloss. Diese Ergebnisse könnten bestätigt werden (1) durch die erste Ausführungsart, oben beschrieben, und/oder (2) durch Testen der Probe mit einem Antikörper, der nur die mit einer Krankheit verbundene Konformation des Proteins bindet – siehe US 96/14840.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung kann jede der oben offenbarten Ausführungsformen mit den hier zur Verfügung gestellten Formeln verwenden, um die Anzahl der Proteine (Konzentration) in der mit einer Krankheit verbundenen Konfomation, die in der ursprünglichen Probe vorliegen, (quantitativ) zu berechnen.
In Übereinstimmung mit jeder der Assay-Ausführungen ist es bevorzugt, die zu testende Probe vorzubehandeln, um (1) so viele kontaminierende Proteine wie möglich zu entfernen; und (2) die Konzentration des mit einer Krankheit verbundenen Proteins in der Probe relativ zu der nicht mit einer Krankheit verbundenen Konformation des Proteins zu erhöhen. Zum Beispiel kann die anfängliche Probe mit einer Verbindung, welche vorzugsweise kontaminierende Proteine abbaut oder denaturiert, chemisch behandelt werden, und/oder die relaxierte, nicht-Krankheitsform des Proteins und/oder wird Antikörpern ausgesetzt, welche vorzugsweise Kontaminationen und/oder nicht-Krankheits-Konformationen des Proteins bindet (um sie zu entfernen).
Es kann möglich sein, weiter die Sensitivität von verschiedenen Aspekten der Erfindung durch Konzentrierung der Krankheitskonformation eines Proteins durch Zugabe einer Verbindung, welche selektiv an die Krankheitskonformation bindet, zu erhöhen, um einen Komplex zu bilden, und Zentrifugieren der Probe, um den Komplex zu präzipitieren, welcher dann gemäß den hier beschriebenen Verfahren getestet wird. Besonderheiten bezüglich solcher Konzentrationsverfahren sind im Detail in unserer mitanhängigen Anmeldung WO 99/42487, betitelt "Process for Concentrating Protein with Disease-Related Conformation", beschrieben.
Die verschiedenen Ausführungsformen des oben beschriebenen Assays der Erfindung sind alle "direkte" Arten von Immunoassays – bedeutend, dass die Probe direkt mit dem markierten Antikörper entweder mit oder ohne Behandlung getestet wird, um die Konformation eines jeden Proteins, das mit einer mit einer Krankheit verbundenen Konformation in der Probe vorliegt, zu verändern. Ein "indirekter" Assay kann auch verwendet werden. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, die Anzahl der mit einer Krankheit verbundenen Proteine in der Probe zu erhöhen (wenn überhaupt) durch die Verwendung von einer transgenen Maus und dadurch jegliches erhaltene Signal verstärkend. Um diese Ausführungsformen der Erfindung durchzuführen, wird die Probe zuerst dazu verwendet, um eine transgene Maus zu inokulieren, die ihr Genom modifiziert bekommen hat, so dass sie Krankheitssymptome entwickeln wird, wenn sie mit Proteinen, die in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation vorliegen, inokuliert wird. Nachdem die Mäuse inokuliert worden sind, läßt man eine ausreichende Zeitperiode vorbeigehen (z. B. 30 Tage), nach der das transgene Tier getötet wird und eine Probe wie z. B. homogenisiertes Gehirngewebe aus der Maus in dem oben beschriebenen direkten Assay verwendet wird. Die vorliegende Erfindung erhöht die Fähigkeit von transgenen Mäusen, Prione zu bestimmen durch Abkürzen der Zeitperiode, die vorbeigehen muss, bis eine Bestimmung gemacht werden kann, ob die ursprüngliche Probe Proteine in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation beinhaltete. Es würde auch möglich sein, Mäuse von dem in jeglichen der U.S.-Patente 5,565,186; 5,763,740 oder 5,792,901 offenbarten und beschriebenen Typs zu verwenden, oder Epitop-gekennzeichnetes PrP, wie in US-Patent 5,750,361 offenbart, anzuwenden, um das PrP^Sc aus dem Gehirn einer Tg-Maus Affinitäts-aufzureinigen und danach den Assay der vorliegenden Erfindung anzuwenden. Ohne die vorliegende Erfindung wird die Maus inokuliert und man muss warten, bis die inokulierte Maus tatsächlich Symptome der Krankheit zeigt. Abhängig von der Maus, kann dies mehrere Monate oder sogar Jahre in Anspruch nehmen. Jeglicher der Assays der vorliegenden Erfindung könnte mit jeglicher transgenen Maus, z. B. solchen wie oben beschrieben, verwendet werden. Der Assay könnte gut verwendet werden, bevor die Maus Symptome der Krankheit entwickelt, dadurch die Zeit, die gebraucht wird, um zu bestimmen, ob eine Probe infektiöse Proteine beinhaltet, verkürzend.
Die Assay-Methodologie der vorliegenden Erfindung kann auf jegliche Art von Probe angewendet werden, wenn die Probe verdächtigt wird, ein Protein zu enthalten, welches in mindestens zwei Konformationen erscheint. Das Protein muss in einer Konformation erscheinen, welche an bekannte Antikörper bindet, Antikörper, welche generiert werden können oder andere spezifische Bindungspartner. Die zweite Konformation muss ausreichend unterschiedlich von der ersten Konformation in Bezug auf ihre Bindungsaffinität sein, so dass die zwei Konformationen unter Verwendung von Antikörpern oder Bindungspartnern, welche ein viel höheres Maß an Affinität für die erste Konformation als für die zweite Konformation haben, unterschieden werden können. In ihrer konzeptionell einfachsten Form funktioniert die Erfindung am besten, wenn ein bekannter markierter Antikörper eine Nicht-Krankheitsform eines Proteins mit einem hohen Ausmaß an Affinität bindet, und nicht (oder mit einem extrem geringen Grad an Affinität bindet) das gleiche Protein, wenn es in seiner mit einer Krankheit verbundenen Konformation vorliegt. Dennoch kann in der Wirklichkeit ein gegebenes Protein mehr als zwei Konformationen haben. Das Protein kann mehr als eine Nicht-Krankheits-Konformation haben und mehr als eine mit einer Krankheit verbundenen Konformation, (Telling, et al., Science (1996)). Die Erfindung ist noch nützlich, wenn vielfache Konformationen von Nicht-Krankheits- und Krankheitsformen des Proteins existieren – vorausgesetzt, dass (1) mindestens eine Nicht-Krankheits-Konformation sich von mindestens einer Krankheits-Konformation bezüglich ihrer Bindungsaffinität unterscheidet; und (2) es möglich ist, die mit einer Krankheit verbundenen Konformation des Proteins so zu behandeln, dass ihre Bindungsaffinität wesentlich verstärkt wird.
Wie oben angegeben, kann der Assay der Erfindung verwendet werden, um jede Art von Probe auf jede Art von Protein zu testen, vorausgesetzt, das Protein beinhaltet eine Nicht-Krankheits- und eine mit einer Krankheit verbundene Konformation. Dennoch wurde die Erfindung insbesondere entwickelt, um Proben auf die Anwesenheit von (1) PrP-Proteinen zu testen und zu bestimmen, ob die Probe ein PrP-Protein in seiner Krankheits-Konformation, d. h. PrP^Sc beinhaltet, (2) unlöslichen Formen von βA4, verbunden mit Alzheimer-Krankheit und (3) Transthyretin. Demgemäß ist viel der folgenden Offenbarung gerichtet auf die Verwendung des Immunoassays der vorliegenden Erfindung, um die Anwesenheit von entweder PrP^Sc (oder in einem geringeren Ausmaß βA4 oder Transthyretin (TTR)) in einer Probe zu bestimmen – wobei es sich versteht, dass die gleichen allgemeinen Konzepte anwendbar sind, um mit einer Krankheit verbundene Konformationen eines weiten Bereichs von verschiedenen Typen von Proteinen zu bestimmen. Ferner ist die Offenbarung insbesondere auf die Beschreibung gerichtet, wie man die Inkubationszeit und den jeweiligen Stamm von infektiösen Prionen (PrP^Sc) in einer Probe bestimmt – wobei es sich versteht, dass die gleichen allgemeinen Konzepte anwendbar sind auf das Bestimmen der Inkubationszeit und des jeweiligen Stammes von anderen eingeschränkten Proteinen, die mit verschiedenen Krankheiten verbunden sind.
Das vorliegende Verfahren der PrP^Sc-Bestimmung wurde durch das Markieren von ausgewähltem aufgereinigtem IgG mit Europium entwickelt. Verwendete Antikörper (3F4) haben eine hohe Bindungsaffinität für PrP^c (Nicht-Krankheits-Konformation), welches eine α-Helix-reiche Konformation umfasst. Die Antikörper haben eine niedrige Bindungsaffinität für PrP^Sc (Krankheits-Konformation), welche eine β-Faltblatt-reiche Konformation umfasst. Das IgG kann aus allgemeinen monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörpern erhalten werden, typischerweise die Sequenz 90–145 von PrP^c und konformativ ungefaltetes Prion-Protein erkennend. Verschiedene Konformationen von rekombinantem Prion-Protein wurden chemisch zu Polystyrol-Platten durch einen Glutaraldehyd-Aktivierungsschritt vernetzt. Die relativen Affinitäten des Eu-markierten IgG zu α-helikaler, β-Faltblatt und zufällig gewendelter Konformation des rekombinanten Syrischen-Hamster-Prion-Proteins, entsprechend Sequenz 90–231, wurden durch Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz in einem 96-Loch Polystyrol-Plattenformat bestimmt.
Eine Bestimmung der relativen Affinitäten von verschiedenen markierten Antikörpern zu Proteinen kann durch verschiedene Verfahren ausgeführt werden. Dennoch ist die mit einer Krankheit verbundene Konformation eines Proteins oft in sehr niedrigen Konzentrationen relativ zu der der Nicht-Krankheits-Konformation vorhanden. Demgemäß erfordert es oft sehr sensitive Verfahren, um jeglichen Anstieg zu bestimmen, der durch die Behandlung der Krankheits-Konformation des Proteins verursacht wurde. Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz und mehr bevorzugt Laser-gesteuertes Fluorometer mit zwei Wellenlängen sind besonders nützliche Vorrichtungen – siehe Hemmilä et al., Bioanalytical Applications of Labeling Technologies (eds. Hemmilä) 113–119 (Wallas Oy. Turku, Finland, 1995).
Durch vorsichtiges Kalibrieren dieses Verfahrens ist es möglich, den Signalanstieg in der Antikörper-Reaktivität beim Übergang vom β-Faltblatt-Konformationszustand zum denaturierten Zustand zu bestimmen. Dieses Signal ist relativ groß verglichen mit dem, das aus der Transformation von seinem nativen α-helikalen zu dem behandelten relaxierten oder dem denaturierten Zustand erhalten wird. So kann der ursprüngliche Konformationszustand des Prion-Proteins durch den unterschiedlichen Assay nativen und behandelten Zuständen zugeordnet werden. Wenn eine Probe, die kein β-Faltblatt-reiches Protein enthält, behandelt wird, wird ein leichter Anstieg der Immunoreaktivität erhalten. Diese Menge an Anstieg muss eingestellt werden und danach wird auf die resultierende Konzentration oder Menge als die "eingestellte Menge" Bezug genommen. Die Menge an Antikörper-spezifischem Binden oberhalb dem für eine α-helikale Konformation von PrP^c erhaltenen (über der eingestellten Menge hinaus) ist ein Maß für die Anwesenheit von β-Faltblatt-reicher Konformation, welche für die Pathogenität und Infektiosität von PrP^Sc essentiell ist.
Ein Aspekt der Erfindung ist es, einen Immunoassay zur Verfügung zu stellen, welcher auf das Testen von Proben anwendbar ist, welche Proteine enthalten, die verdächtigt sind, ein Protein zu enthalten, welches innerhalb einer nativen Nicht-Krankheits-Konformation und einer mit einer Krankheit verbundenen Konformation erscheint (z. B. PrP-Protein, βA4-Protein und Transthyretin).
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist es, einen Assay zur Verfügung zu stellen, welcher unterscheidet zwischen (1) mit mit einer Krankheit verbundenen Proteinen oder Teilen davon, welche nicht durch beschränkte Protease-Behandlung mit einer Protease wie z. B. Proteinase K hydrolysiert werden (Protease-resistente Proteine, z. B. PrP 27–30) und (2) mit einer Krankheit verbundenen Proteine, welche durch eine beschränkte Protease-Behandlung mit einer Protease wie z. B. Proteinase K hydrolysiert werden (z. B. Protease-sensitives PrP^Sc).
Ein anderer Aspekt ist es, ein Verfahren für das Bestimmen des Verhältnisses von gesamten nativem mit einer Krankheit verbundenem Protein zu mit einer Krankheit verbundenem Protein, welches durch Protein-denaturierende Behandlung denaturiert wird, zur Verfügung zu stellen.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass sie die Bestimmung von mit einer Krankheit verbundenem Protein (z. B. Protease-sensitivem PrP^Sc), welches während Protease-Verdauung des Nicht-Krankheits-, nativen Proteins (z. B. PrP^c) hydrolysiert wird, und so mit konventioneller Western-Blot-Methodologie nicht bestimmt werden könnte, erlaubt.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass sie verwendet werden kann, um die Inkubationszeit eines infektiösen Proteins zu berechnen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass der Immunoassay schnell und genau die Anwesenheit von Proteinen in mit einer Krankheit verbundenen Konformation (z. B. PrP^Sc, βA4 und Transthyretin) bestimmen kann, obwohl der in dem Assay verwendete Antikörper nicht bindet oder ein sehr niedriges Maß an Bindungsaffinität für das Protein in der mit der Krankheit verbundenen Konformation hat und die mit einer Krankheit verbundene Konformation in einer niedrigeren Konzentration vorliegt als die Nicht-Krankheits-Konformation.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist es, einen Assay zur Verfügung zu stellen, der es ermöglicht, nicht nur zu bestimmen, (1) ob ein pathogenes Partikel in der Probe vorliegt, sondern (2) die Konzentration der Partikel in der Probe zu bestimmen, (3) den jeweiligen Stamm des vorliegenden Partikels zu bestimmen und (4) die Inkubationszeit.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass das erhaltene Signal durch die Verwendung von transgenen Tieren verstärkt werden kann, z. B. Mäuse, welche verwendet werden, um das Vorhandensein eines Proteins in der Probe zu bestimmen.
Ein anderes Merkmal ist, dass Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz oder ein Laser-gesteuertes Fluorometer mit zwei Wellenlängen verwendet werden kann, um die Sensitivität zu erhöhen.
Ein anderer Vorteil ist, dass der Assay Mengen an krankheitsverursachender Konformation eines Proteins mit einer Konzentration von 1 × 10³ Partikel/ml oder weniger bestimmen kann.
Ein spezieller Gegenstand ist, einen diagnostischen Assay zum Bestimmen der Anwesenheit von infektiösem Prion-Protein in verschiedenen Probenmaterialien, erhalten oder abgeleitet von Mensch, Primaten, Affen, Schwein, Rind, Schaf, Rotwild, Elch, Katze, Hund, Maus und Hühnergeweben und/oder Körperflüssigkeiten zur Verfügung zu stellen.
Ein anderer spezieller Gegenstand ist, einen diagnostischen Assay zum Bestimmen der Anwesenheit von βA4-Protein in verschiedenen Probenmaterialien, erhalten oder abgeleitet von Mensch, Primaten, Affen, Schwein, Rind, Schaf, Rotwild, Elch, Katze, Hund, Maus und Hühnchengeweben und/oder Körperflüssigkeiten zur Verfügung zu stellen.
Ein anderer Gegenstand ist, einen schnellen Assay für natives infektiöses Prion-Protein in den Gehirnen von transgenen und nicht-transgenen Tieren, injiziert mit Probenmaterial, das potenziell Prione enthält, zur Verfügung zu stellen.
Ein anderer Gegenstand ist, ein Verfahren zur Bewertung von Dekontaminations-Verfahren durch Testen der Mengen der Denaturierung von pathogenen Proteinen (z. B. Prione oder β-Faltblatt βA4) nach solchen Behandlungen zur Verfügung zu stellen.
Ein anderer Gegenstand ist, ein schnelles Verfahren zum Screenen bzw. zur Durchsiebung verschiedener Verbindungen zur Verfügung zu stellen, um ihr Potenzial zur Behandlung von Krankheiten, die mit Krankheits-Konformationen von verschiedenen Proteinen verbunden sind, zu beurteilen, z. B. durch Screenen bzw. Durchsiebung von Verbindungen auf ihren stabilisierenden Effekt auf verschiedene Protein-Konformationen (z. B. PrP^c oder α-helikale Konformation von βA4) oder ihren destabilisierenden Einfluss auf die pathogene Konformation (z. B. PrP^Sc oder β-Faltblatt-Konformation von βA4) eines Proteins.
Ein anderer Gegenstand ist, ein schnelles Verfahren zum Screenen bzw. zur Durchsiebung verschiedener pharmazeutischer Verbindungen mit Potenzial zur Behandlung von Prion-Krankheit zur Verfügung zu stellen, z. B. durch Screenen bzw. Durchsiebung von Verbindungen auf ihren stabilisierenden Effekt auf α-helikale Konformation einer normalen Isoform des PrP^c-Proteins oder ihren de stabilisierenden Einfluss auf die β-Faltblatt-Konformation auf die pathogene IsoforM des PrP^Sc-Proteins.
Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren ausgeführt werden kann, ohne dass ein Antikörper in der Lage ist, direkt eine infektiöse Konformation eines Proteins zu erkennen, und ohne Verwendung eines Proteinase k-Schritts zur Eliminierung des Signals von normalen (Nicht-Krankheits-) IsoforMen des Proteins wie z. B. PrP^c.
Ein anderer Vorteil ist, dass in dem gefundenen Verfahren kein Bedarf an einem Antikörper ist, der in der Lage ist, direkt eine pathogene Konformation von βA4 oder Transthyretin zu erkennen.
Ein wichtiges Merkmal des Assays ist die schnelle, kosteneffiziente und Hochdurchsatz-Konstruktion, welche mit einer Kapazität zum Screenen bzw. zur Durchsiebung von 96 Proben pro Tag pro 96 Lochplatte ausgelegt werden kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das diagnostische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von TTR in der abnormalen, amyloiden Konformation im Probenmaterial, erhalten aus humanen und tierischen Geweben, Körperflüssigkeiten und Arzneimitteln. Das gefundene Verfahren stellt ein direktes sensitives Verfahren zur Unterscheidung und Quantifizierung der normalen und amyloiden Konformationen von TTR in einer Mischung, die in Probenmaterialien vorliegt, zur Verfügung.
Die Quantifizierung basiert auf einer Messung des Unterschieds in den Affinitäten von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern zu TTR in normaler oder amyloider Konformation gegen eine zufällig gewendelte Konformation. Die vorliegende Erfindung beschreibt drei Verfahren zur Beurteilung und die mathematischen Formel, die für solche Quantifizierungen verwendet wird.
Ein wichtiger Gegenstand ist, einen spezifischen Diagnose-Assay für pathogenes TTR in verschiedenen Probenmaterialien, erhalten oder abgeleitet von Mensch, Primat, Affe, Schwein, Rind, Schaf, Rotwild, Elch, Katze, Hund und Hühnergeweben zur Verfügung zu stellen.
Ein anderer Gegenstand ist, einen schnellen Assay für die amyloide Form von TTR in transgenen Tieren zur Verfügung zu stellen.
Ein anderer Gegenstand ist, ein schnelles Verfahren zum Screenen bzw. zur Durchsiebung verschiedener Arzneimittelverbindungen mit Potenzial zur Behandlung von Seniler Systemischer Amyloidose (SSA) und Familiärer Amyloider Polyneuropathie (FAP) zur Verfügung zu stellen. Solche Verbindungen werden auf ihren stabilisierenden Effekt auf normale Konformation von TTR oder ihren destabilisierenden Einfluss auf die amyloide Konformation von TTR hin gescreent bzw. durchsiebt.
Noch ein anderer Gegenstand ist, ein schnelles Verfahren zum Screenen bzw. zur Durchsiebung des Einflusses von verschiedenen spontanen und konstruierten Mutationen in dem TTR-Gen auf die Konformation, Stabilität und amyloide Formation von solchen TTR-Genprodukten in transgenen Tieren, die natürliche oder künstliche APP-Gene beherbergen, zur Verfügung zu stellen.
Der spezifische Vorteil ist, dass der gefundene Assay pathogene Formen von TTR in einer Mischung mit denaturierten nicht-pathogenen Formen der gleichen oder in einer Mischung mit einer löslichen Form von TTR bestimmen kann – z. B. weniger als 1 × 10³ Partikel pro ml bestimmen kann.
Diese und andere Gegenstände, Vorteile und Merkmale des gefundenen Verfahrens werden dem Fachmann nach dem Lesen der Details des Assay-Verfahrens, der Antikörper-Entwicklung und Austestung, und der transgenen Maus, ausführli cher beschrieben unten mit Bezug auf die angehängten Abbildungen, offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Spektrograph der Konformation von rekombinantem SHaPrP90-231, wie durch Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) bestimmt, zeigend die zwei Hauptbanden mit Minima bei 208 und 222 nm, welche eine α-helikale Konformation anzeigen; eine einzelne negative Bande mit einem Minimum bei 217 nm ist charakteristisch für die vorherrschende β-Faltblatt-Konformation. Die Figur zeigt die Umwandlung von rekombinantem SHaPrP90–231 von einer α-helikalen zu einer β-Faltblatt-Konformation während der Inkubation bei 37°C für 72 Stunden, wie durch Zirkulardichroismus(CD)-Spektroskopie bestimmt. Die Proteinkonzentration war 5 mg/ml;
2 ist ein Graph, der die Ergebnisse des Verdrängungsassays von rekombinantem SHaPrP90–231 in α-helikaler und in denaturierter Konformation in der Anwesenheit von 5% PrP^0/0 Maus-Gehirnhomogenat zeigt, worin die Differenz in Steigung und in Kreuzungspunkten, erhalten mit Europium-markiertem 3F4 IgG, anzeigt, dass jede der Konformationen beides, eine unterschiedliche Affinität und Anzahl an Bindungsstellen, hat und ferner wobei die Datenpunkte und Balken, den Durchschnitt von ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
3 ist ein Graph, der den Abgleich eines direkten Assays mit rekombinantem SHaPrP90–231 in α-helikaler Konformation in der Anwesenheit von 5% PrP^0/0 Maus-Gehirnhomogenat zeigt, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
4 ist ein Graph, der den Abgleich eines direkten Assays mit rekombinantem SHaPrP90–231 in β-Faltblatt-Konformation in der Anwesenheit von 5% PrP^0/0 Maus-Gehirnhomogenat zeigt, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
5 ist ein Graph, der die Eingangs-Ausgangs-Bewertung eines direkten Assays für beide, α-helikale und β-Faltblatt Formen von SHaPrP90–231 in der Anwesenheit von 15 PrP^0/0 Maus-Gehirnhomogenat zeigt, worin die Menge an Protein auf der x-Achse bestimmt wurde durch Aminosäureanalyse und die Menge an Protein auf der y-Achse aus dem Assay errechnet wird;
6 ist ein Graph, der das Verhältnis zwischen den Signalen von behandeltem (ungefaltet gezeigt als denaturiert) und nativem SHaPrP90–231 in α-helikalen und β-Faltblatt-Konformationen zeigt, entwickelt mit Eu-markiertem 3F4 IgG, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren. Zwei Hauptbanden in dem CD-Spektrum mit Minima bei 208 und 222 nm weisen auf eine α-helikale Konformation hin; eine einzige negative Bande mit einem Minimum bei 217 nm ist charakteristisch für eine vorhenschende β-Faltblatt-Konformation; ein negativer Minimumbereich gegen 197 nm belegt eine zufällig gewendelte Konformation. Der Abgleich des Konformations-abhängigen Immunoassays wurde in der Anwesenheit von 5% (w/v) Prnp^0/0 Maus-Gehirnhomogenat durchgeführt. Die Datenpunkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen;
7 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines direkten Assays für PrP^c-Protein in normalem Hamser-Gehirnhomogenat zeigt, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
8 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines direkten Assays für PrP^c+Sc in mit Traberkrankheit (Scrapie) infiziertem Hamster-Gehirnhomogenat zeigt, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
9 ist ein Graph, der die Gesamtmenge an PrP-Proteinen in normalen Hamstergehirnen und die Menge an β-Faltblatt PrP^Sc in beiden Gehirnen zeigt, errechnet aus dem Modell, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
10 ist ein Graph, der die Gesamtmenge an PrP-Proteinen in mit Traberkrankheit (Scrapie) infizierten Hamstergehirnen und die Menge an β-Faltblatt PrP^Sc in beiden Gehirnen zeigt, errechnet aus dem Modell, worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren. Die Konzentration von SHaPrP auf der Ordinate wurde aus Formel (1) errechnet. Die Proben von 5% (w/v) Gehirnhomogenaten, erhalten aus normalen oder mit Traberkrankheit (Scrapie)-infizierten syrischen Hamstern wurden serienmäßig verdünnt in 5% (w/v) Prnp^0/0 Maus-Homogenat. Datenpunkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen;
11 ist ein Graph, der die Korrelation der Infektiosität und Menge an β-Faltblatt-Form von SHaPrP^Sc wie berechnet aus dem direkten Assay und der Formel, worin aufgereinigtes SHaPrP^Sc in der Anwesenheit von 5% PrP^0/0 Maus-Gehirnhomogenat beschallt wurde und wie beschrieben verdünnt wurde, zeigt, und worin die Datenpunkte und Balken den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen, repräsentieren;
12 ist ein Graph von βA4(1–40) in beiden, α-helikalen und β-Faltblatt-Konformationen, produziert durch Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie, Hauptbanden bei 208 und 222 nm für die helikale Konformation und eine einzelne negative Bande bei 217 nm für die vorhenschende β-Faltblatt-Konformation (bei pH 7,4) zeigend;
13 ist ein Graph eines direkten Assays von löslichem A4β (1–40);
14 ist ein Graph eines direkten Assays für die β-Faltblatt-Form von A4β (1– 40);
15 ist ein Graph, der das Verhältnis von denaturiertem zu nativem A4β (1– 40) zeigt;
16 zeigt die Umwandlung von rekombinantem SHaPrP90-231 von einer α-helikalen zu einer β-Faltblatt-Konformation während Inkubation bei 37°C für 72 Stunden, wie bestimmt durch direkten Differenzassay. Das erhöhte Signal der nativen Konformation bei ∼24 Stunden zeigt die Destabilisierung der nativen Struktur mit einer offeneren Konformation an, gefolgt von einer Umwandlung zu β-Faltblatt-Sekundärstruktur (siehe 16). Die Proteinkonzentration betrug 5 mg/ml;
17 zeigt, dass beide, sowohl HFIP als auch Glycerol, in der Lage sind, einen α- zu β-Konformationsübergang von rekombinantem SHaPrP90–231 zu verhindern. Die Veränderungen in dem TRF-Signal sind als Teilveränderung dargestellt, wo ein positiver Wert eine Stabilisierung anzeigt, ein negativer Wert Destabilisierung. Die experimentellen Bedingungen waren wie in den 1 und 16;
18: Pentosan Polysulfat stabilisiert die native Konformation von ShaPrP90-231 bei niedrigen Konzentrationen; Kongo Rot hat keine Wirkung auf die Stabilität von SHaPrP90–231. Die Veränderungen im TRF-Signal sind als Teilveränderung dargestellt, wo ein positiver Wert eine Stabilisierung anzeigt, ein negativer Wert Destabilisierung. Die experimentellen Bedingungen waren wie in den 1 und 16;
19: Das zwitterionische Detergens ZW3–12 destabilisiert die native Konformnation eines α-helikalen Sha90–231. Die experimentellen Bedingungen waren wie in den 1 und 16; die Veränderungen in dem TRF-Signal sind als Teilveränderung ausgedrückt, wo positive Werte eine Stabilisierung anzeigen, negative Werte eine Destabilisierung;
20 zeigt den Abgleich eines direkten Assays mit aufgereinigtem humanem TTR in normaler Konformation. Die Platten wurden mit den Anti-TTR-Primärantikörpern (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) und dem sekundären Eu-markierten Anti-Kaninchen-Antikörper entwickelt. Die Datenpunkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen;
21 zeigt den Abgleich des direkten Assays mit aufgereinigtem humanem TTR in amyloider Konformation. Die Platten wurden mit Anti-TTR-Primärantikörpern und sekundären Eu-markiertem Anti-Kaninchen-Antikörper entwickelt. Die Datenpunkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen;
22 zeigt das Verhältnis zwischen den Signalen von denaturiertem und nativem TTR in normalen und amyloiden Konformationen, entwickelt wie oben beschrieben. Die Datenpunkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen;
23: Modifizierte Formel zum Berechnen der Menge von TTR in amyloider Konformation aus den Daten, erhalten von dem direkten Assay mit anti-TTRpolyklonalem Antikörper. Die Veränderungen aus der allgemeinen Gleichung reflektieren das umgekehrte Verhältnis von denaturierten und nativen Zuständen für normale und amyloide Formen von TTR. Der Unterschied zwischen der Fluoreszenz des denaturierten Zustands der Probe und dem aus dem Übergang von nativem normalem Protein zu denaturiertem Zustand erwarteten ist proportional zur Menge von TTR in amyloider Konformation. F_n–Gesamtsignal an nativer Konformation; F_nN und F_nA–die Signale von nativen normalen bzw. amyloiden Konformationen; F_d–Gesamtsignal von TTR in denaturiertem Zustand; F_dN und F_dA sind die Signale der denaturierten normalen oder amyloiden Zustände von TTR; ΔF_n→d – der Gesamtanstieg des Signals beim Übergang von nativen zu denaturierten Zuständen; ΔF_Nn→d –Anstieg des Signals der normalen Konformation beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand; ΔF_An→d –Veränderung in dem Signal der amyloiden Konformation beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand; f_Nn→d – Korrelationsfaktor für den Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand von normalem TTR;
24 ist ein Graph des "Prionindexes" (welcher das Verhältnis von Antikörperbindung an denaturiertes gegen natives PrP-Protein ist) gegen die Konzentration von PrP^Sc in μg/ml. Die gezeigten Ergebnisse repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus drei unterschiedlichen Gehirnen von LVG/LAK syrischen Hamstern, infiziert mit unterschiedlichen Prionstämmen;
25 ist ein Graph, durch Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie von SHaPrP(90–231), aufgereinigt aus E.coli, bestimmt;
26 bis 29 sind alles Graphen, die verwendet werden, um acht Stämme von PrP^Sc durch den Immunassay der Erfindung zu unterscheiden, worin:
26 ein Balkengraph von gesamtem PrP, verglichen mit PrP^Sc ist. Die Säulen und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus drei unterschiedlichen Gehirnen von LVG/LAK syrischen Hamstern, infiziert mit verschiedenen Prionstämmen und gemessen in drei unabhängigen Experimenten;
27 ein Graph ist, der das Verhältnis von Antikörperbindung zu denaturiertem/nativem PrP zeigt, und eine Funktion der Konzentration von PrP^Sc in den Gehirnen von syrischen Hamstern, infiziert mit verschiedenen Prionstämmen. Die Konzentration von PrP^Sc (Formel 1) und das Verhältnis der Antikörperbindung an denaturiertes/natives PrP wurden durch Konformations-abhängigen Immunoassay gemessen;
28 ein Graph ist von Gehirnhomogenaten aus syrischen Hamstern, inokuliert mit verschiedenen Traberkrankheit (Scrapie)-Stämmen und nicht-inokulierten Kontrollen, benannt C, die mit 50 μg/ml Proteinase K für zwei Stunden bei 37°C vor dem Konformations-abhängigen Immunoassay verdaut wurden;
29 ein Graph der Inkubationszeit ist, aufgetragen als eine Funktion der Konzentration der Proteinase-K-sensitiven Fraktion von PrP^Sc ([PrP^Sc]–[PrP 27-30]);
30 und 31 sind Graphen, die die Gleichgewichtsdissoziation und Entfaltung von PrP^c und PrP^Sc in drei Prionstämmen zeigt. Das Verhältnis von Antikörperbindung an denaturiertes/natives PrP und sichtbarer Teilveränderung von Entfalten von Prion-Proteinen während Gleichgewichtsdissoziation und Entfaltung, worin
30 ein Graph ist von Daten von den Gehirnen von nicht-inokulierten Kontrollen (C) und syrischen Hamstern, infiziert mit Sc237, DY und HY-Stämmen von Prionen, analysiert durch die Konformations-abhängigen Immunoassays; das Verhältnis von Antikörperbindung zu denaturiertem /nativem PrP ist als Funktion der GdnHCl-Konzentration aufgetragen;
31 ein Graph solcher Daten ist, zeigend die sichtbare Teilveränderung in der Entfaltung (F_app) von PrP^Sc von den Sc237, DY und HY-Stämmen. Die Punkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unterschiedlichen Messungen;
32 und 33 sind Graphen, die den dynamischen Bereich und die Sensitivität des Verhältnisses von Antikörperbindung zu PrP in denaturierten und nativen Zuständen zeigen. Homogenate [5%(w/v)], zubereitet aus den Gehirnen von syrischen Hamstern, die CNS-Dysfunktion ∼70d nach Inokulation mit Sc237-Prionen zeigen, wurden serienmäßig in 5% (w/v) normales SHa-Gehirnhomogenat verdünnt, und die Anwesenheit von PrP^Sc wurde nach NaPTA-Präzipitation durch den Konformations-abhängigen Immunoassay gemessen, worin:
32 ein Graph ist, der das Verhältnis der Fluoreszenz-Signale von denaturierten und nativen Aliquots, aufgetragen als eine Funktion der Verdünnung von mit Traberkrankheit (Scrapie) infiziertem Gehirn-Homogenat zeigt;
33 ein Graph ist, worin die Absolutmenge von PrP^c und PrP^Sc aus Formel (1) errechnet wurde und als eine Funktion der Verdünnung von mit Traberkrankheit (Scrapie) infiziertem Gehirnhomogenat aufgetragen wurde. Diese Datenpunkte und Balken repräsentieren den Durchschnitt ± SEM, erhalten aus vier unabhängigen Messungen;
34 und 35 sind alle Graphen, die die Inkubationszeit für acht Stämme von PrP^Sc zeigen, worin:
34 jeden aufgetragenen Stamm als Inkubationszeit gegen gesamtes PrP^Sc zeigt;
35 jeden Stamm, aufgetragen als Inkubationszeit gegen Behandlungs- oder Protease-resistentes PrP^Sc, welches PrP 27–30 ist, zeigt.
Es ist am interessantesten, die 34 und 35, wo keine Korrelation von PrP^Sc oder PrP 27–30 mit der Inkubationszeit ersichtlich ist, mit 29 zu vergleichen, welche eine lineare Beziehung für die Daten, die die Inkubationszeit gegen Behandlungs- oder Protease-sensitives PrP^Sc auftragen, z. B. die Inkubationszeit gegen (Gesamt-PrP^Sc–PrP 27–30), wo PrP 27–30 das Protease-resistente PrP^Sc ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGS- FORMEN
Bevor die vorliegenden Assays und Verfahren offenbart und beschrieben werden, muss es verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Antikörper, Proteine, Markierungen, Assays oder Verfahren beschränkt ist, da diese natürlich variieren können. Es muss auch verstanden werden, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung der jeweiligen Ausführungsformen da ist, und nicht dafür gedacht ist, einschränkend zu sein, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche beschränkt sein wird.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung wie gemeinhin von einem normalen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die zu den hier beschriebenen ähnlich oder gleich sind, in der Praxis oder zum Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien jetzt beschrieben.
DEFINITIONEN
Der Ausdruck "Protein" wie hierin verwendet, ist dazu gedacht, jegliche Aminosäuresequenz zu umfassen und modifizierte Sequenzen wie z. B. Glykoproteine einzuschließen. Der Ausdruck schließt natürlich vorkommende Proteine und Peptide mit ein, genauso wie solche, welche rekombinant oder synthetisch synthetisiert werden. Wie verwendet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck "Protein" ausdrücklich dazu gedacht, alle natürlich vorkommenden Proteine abzudecken, die in mindestens zwei verschiedenen Konformationen vorkommen, worin beide Konformationen die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz haben, aber verschiedene dreidimensionale Strukturen haben. Die zwei Konformationen des Proteins schließen mindestens eine Konformation mit ein, die nicht mit einem Krankheitszustand verbunden ist und mindestens eine Konformation, welche mit einem Krankheitszustand verbunden ist – pathogen. Ein spezifisches und bevorzugtes Beispiel eines Proteins wie im Zusammenhang mit dieser Offenbarung verwendet, ist ein PrP-Protein, welches die Nicht-Krankheitsform einschließt, bezeichnet als die PrP^C-Form und die Krankheits-verbundene Form, bezeichnet als die PrP^Sc-Form. Obwohl ein Prion-Protein oder die PrP^Sc-Form eines PrP-Proteins infektiös und pathogen ist, ist die Krankheits-Konformation von anderen Proteinen nicht infektiös, obwohl sie pathogen ist. Wie hier verwendet, kann der Ausdruck pathogen bedeuten, dass das Protein die Krankheit eigentlich verursacht, oder es kann einfach bedeuten, dass das Protein mit der Krankheit verbunden ist und daher vorhanden ist, wenn die Krankheit vorhanden ist. Somit ist ein pathogenes Protein wie in Verbindung mit dieser Offenbarung verwendet, nicht notwendigerweise ein Protein, welches das spezifisch verursachende Agens einer Krankheit ist.
Proben, die getestet werden, können eine Anzahl von verschiedenen Proteinen enthalten und die Proteine dieser Proben sind mittels einer oder mehrerer verschiedener Arten von Behandlung, wie unten beschrieben, behandelt, um das gewünschte Ergebnis zu erhalten.
"Vorbehandlung" wird hier verwendet, um die mildeste der in den Assays der Erfindung angewendeten verschiedenen Arten von Behandlung zu beschreiben. Vorbehandlung kann optional ausgeführt werden früh in dem Verfahren, um Pro teine zu denaturieren oder zu hydrolysieren, welche (1) leicht zu hydrolysieren oder zu denaturieren sind und (2) nicht den gleichen allgemeinen Typ wie die Proteine von Interesse haben. Die Vorbehandlung wird ausgeführt, um kontaminierendes Protein aufzuschließen, so dass sie leichter aus der Probe, die die interessierenden Proteine enthält, entfernt werden können. Milde Behandlung mit niedrigen Konzentrationen einer Protease über einen kurzen Zeitraum könnte für die Vorbehandlung verwendet werden. Die Vorbehandlung kann kontaminierende Proteine durch andere Mittel, wie z. B. durch In-Verbindung-Bringen der Probe mit Antikörpern, welche die kontaminierenden Proteine binden, welche erwartet werden, in der Probe vorhanden zu sein, zu entfernen.
Die Ausdrücke "Protein-Entfaltungs-Behandlung" oder "Entfaltungs-Behandlung" oder "Denaturierung" und ähnliche werden hier austauschbar verwendet, um ein Verfahren zu beschreiben, worin eine Probe oder ein Teil davon und insbesondere Proteine in der Krankheitskonformation der Probe physikalisch und/oder chemisch manipuliert werden, so dass die Proteine in der Probe in einer Krankheitsbezogenen Konformation veranlasst werden, sich in einem gewissen Ausmaß zu entfalten, d. h. in eine verschiedene Konformation mit einer höheren Bindungsaffinität mit einem Bindungspartner wie z. B. einem Antikörper; zu wechseln, z. B. durch Freilegen eines vorher nicht freigelegten oder teilweise freigelegten Epitops. Proteine, die auf diese Art behandelt werden, werden auch als Proteine in einer relaxierten Konformation bezeichnet, welche Konformation die Bindungsaffinität des Proteins zu einem Bindungspartner wie z. B. einem Antikörper erhöht. Entfaltungsbehandlung schließt das Unterwerfen der Probe der Hitze, des Druckes und/oder der Chemikalien mit ein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben, die PrP^Sc enthalten (welches die mit einer Krankheit verbundene Konformation, umfassend β-Faltblatt-strukturelle Konfigurationen, ist), so behandelt (d. h. mit Guanidinhydrochlorid), dass das Protein eine unterschiedliche Konformation annimmt (d. h. umfassend eine α-helikale Konfiguration und/oder eine zufällig gewendelte Konfiguration), eine viermal oder mehr höhere Antikörper-Bindungsaffinität habend.
"Beschränkte Protease-Behandlung" bezeichnet ein derartiges Behandeln einer Proteinprobe, dass alle oder im Wesentlichen alle der Proteine außer die, die gegenüber der Behandlung am meisten resistent sind (z. B. Protease-resistentes PrP^Sc–d. h. PrP 27–30), hydrolysiert oder in Stücke gebrochen werden, d. h. in kleine Peptide und/oder Aminosäuren. Diese Art der lytischen Behandlung wird ausgeführt, um interessierende Proteine in die Nicht-Krankheits-Konformation zu hydrolysieren, als auch Proteine von Interesse in die Krankheits-Konformation, die "sensitiv" gegenüber der beschränkten Protease-Behandlung sind. Die einzigen Proteine, die nicht durch die beschränkte Protease-Behandlung hydrolysiert werden, sind interessierende Proteine in die Krankheits-Konformation, welche "resistent" gegenüber dieser Behandlung sind (z. B. PrP 27–30).
Einige empirische Versuche sind beim Bestimmen der Parameter (z. B. Temperatur, Zeit, Proteaseart und -konzentration), die benötigt werden, um die gewünschte Art der Behandlung zu erhalten, zu erwarten. Milde Bedingungen für die Vorbehandlung, mittlere für die Entfaltungs- und harte für die beschränkte Protease-Behandlung.
Die Ausdrücke "PrP-Protein" und "PrP" und ähnliche werden hier austauschbar verwendet und sollen beides, sowohl die infektiöse Partikelform von PrP^Sc, die bekannt dafür ist, Krankheiten (spongiforme Encephalopathien) in Menschen und Tieren zu verursachen, als auch die nicht-infektiöse Form PrP, welche unter geeigneten Bedingungen in die infektiöse PrP^Sc-Form umgewandelt wird, bedeuten.
Die Ausdrücke "Prion", "Prion-Protein" und "PrP^Sc-Protein" und ähnliche werden hier abwechselnd benutzt und beziehen sich auf die infektiöse PrP^Sc-Form von PrP, und ist eine Zusammenziehung der Wörter "Protein" und "Infektion". Partikel bestehen größtenteils, falls nicht ausschließlich, aus PrP^Sc-Molekülen, kodiert von einem PrP-Gen. Prione sind von Bakterien, Viren und Viroiden verschieden. Bekannte Prione infizieren Tiere und verursachen Traberkrankheit (Scrapie), eine übertragbare, degenerative Erkrankung des Nervensystems von Schafen und Ziegen, als auch bovine spongiforme Encephalopathie (BSE), oder "Mad Cow Disease", und katzenartige spongiforme Encephalopathie (Feline Spongiform Encephalopathy) von Katzen. Vier Prion-Krankheiten, von denen bekannt ist, dass sie Menschen betreffen, sind (1) Kuru, (2) Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) Fatale Familiäre Insomnia (Fatal Familial Insomnia) (FFI). Wie hierin verwendet, schließt "Prion" alle Formen von Prionen mit ein, die alle oder irgendeine dieser Krankheiten oder andere in irgendwelchen verwendeten Tieren verursachen, mit ein - und insbesondere in Menschen oder domestizierten Nutztieren.
Der Ausdruck "PrP-Gen" wird hier verwendet, um genetisches Material zu beschreiben, welches Proteine, einschließliche bekannte Polymorphismen und pathogene Mutationen, exprimiert. Der Ausdruck "PrP-Gen" bezieht sich im Allgemeinen auf jegliche Gene von jeglichen Spezies, welche jegliche Form eines PrP-Proteins kodieren. Einige allgemein bekannte PrP-Sequenzen sind beschrieben in Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 9097–9101 (1992), und U.S.-Patente 5,565,186; 5,763,740; 5,792,901; und WO 97104814, auf die Bezug genommen wird, um solche Sequenzen zu offenbaren und zu beschreiben. Das PrP-Gen kann aus jeglichem Tier stammen, eingeschlossen der hierin beschriebenen "Wirts-" und "Test-Tiere", und jegliche und alle Polymorphismen und Mutationen davon, wobei es klar erkannt werden muss, dass die Ausdrücke andere solche PrP-Gene, die noch entdeckt werden müssen, miteinschließen. Die von solch einem Gen exprimierten Proteine können entweder eine PrP (Nicht-Krankheits-) oder PrP^Sc-(Krankheits-)Form annehmen.
Der Ausdruck "Antikörper" steht für ein Immunglobulin-Protein, welches in der Lage ist, ein Antigen zu binden. Antikörper wie hier verwendet, ist gemeint, den gesamten Antikörper als auch jegliche Antikörper-Fragmente (z. B. F(ab)', Fab, Fv), die in der Lage sind, das Epitop, Antigen oder antigene Fragment von Interesse zu binden, miteinzuschließen. Bevorzugte Antikörper für die Assays der Erfindung sind immunoreaktiv oder immunospezifisch für und binden somit spezifisch und selektiv ein Protein von Interesse, z. B. ein A4β-Amyloid-Protein oder ein PrP-Protein. Antikörper, welche immunoreaktiv und immunospezifisch für beide, sowohl die native Nicht-Krankheitsform als auch die behandelte Krankheitsform, aber nicht für die unbehandelte Krankheitsform (z. B. für sowohl natives PrP^c und behandeltes PrP^Sc, aber nicht für natives PrP^Sc) sind, werden bevorzugt. Antikörper für PrP sind vorzugsweise immunospezifisch–z. B. nicht im Wesentlichen kreuzreaktiv mit verwandten Materialien. Einige spezifische Antikörper, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können, sind offenbart in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 97/10505, auf die Bezug genommen wird, um Antikörper zu offenbaren und zu beschreiben. Antikörper, die in der PCT-Anmeldung offenbart sind, welche selektiv PrP^Sc binden, sollten nicht verwendet werden, um den Grundassay der vorliegenden Erfindung auszuführen, könnten aber verwendet werden, um die Anwesenheit von PrP^Sc zu bestätigen, wenn andere Proteine denaturiert sind. Der Ausdruck "Antikörper" umfasst alle Arten von Antikörpern, z. B. polyklonale, monoklonale und solche, die durch die Phagen-Display-Methodologie produziert werden. Insbesondere bevorzugte Antikörper der Erfindung sind Antikörper, welche ein relativ hohes Maß an Affinität für sowohl natives PrP^c als auch behandeltes PrP^c haben, aber ein relativ geringes Maß an oder im Wesentlichen keine Bindungsaffinität für PrP^Sc. Mehr spezifisch, Antikörper der Erfindung haben vorzugsweise viermal oder mehr, stärker bevorzugt fünfzehnmal oder mehr, und noch stärker bevorzugt 30 Mal oder mehr Bindungsaffinität für sowohl natives PrP^c als auch denaturiertes PrP^c, verglichen mit der Bindungsaffinität für natives PrP^c.
Ein nützlicher Antikörper, um PrP^c zu binden, ist der monoklonale Antikörper 263K 3F4, produziert durch die Hybridom-Zelllinie ATCC HB9222, hinterlegt am 8. Oktober 1986 in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 und offenbart und beschrieben im U.S.-Patent 4,806,627, erteilt am 21. Februar 1981 – auf das Bezug genommen wird, um Antikörper zu offenbaren, welche selektiv PrP^c binden.
"Aufgereinigter Antikörper" bezieht sich auf den, der im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Kohlehydraten und Lipiden, mit denen er normalerweise verbunden ist, ist. Solch ein Antikörper "bindet vorzugsweise" eine behandelte oder denaturierte Krankheitskonformation eines Proteins, wie z. B. die β-Faltblatt-Konformation von A4β oder PrP^Sc-Protein (oder ein antigenes Fragment davon), und erkennt im Wesentlichen nicht oder bindet nicht an andere, antigene nichtverwandte Moleküle. Ein aufgereinigter Antikörper der Erfindung ist vorzugsweise immunoreaktiv mit und immunospezifisch für eine bestimmte Spezies und mehr bevorzugt immunospezifisch für natives PrP und für behandelte oder denaturierte Formen von PrP und PrP^Sc, aber nicht für natives oder unbehandeltes PrP^Sc.
Mit "antigenem Fragment" eines Proteins (z. B. ein PrP-Protein) ist ein Teil eines solchen Proteins gemeint, welches in der Lage ist, einen Antikörper zu binden.
Durch "bindet spezifisch" ist ein hohes Aviditäts- und/oder hohes Affinitätsbinden eines Antikörpers an ein spezifisches Polypeptid, z. B. Epitop eines Proteins, z. B. eines PrP oder A4β-Proteins gemeint. Antikörperbindung an das Epitop dieses spezifischen Polypeptids ist vorzugsweise fester als die Bindung des gleichen Antikörpers an ein beliebig anderes Epitop, insbesondere an solche, welche in Molekülen in Verbindung damit vorliegen können, oder in der gleichen Probe, da das spezifische Polypeptid von Interesse, z. B. stärker Epitop-Fragmente eines Proteins wie z. B. PrP^Sc bindet, so dass durch das Einstellen der Bindungsbedingungen der Antikörper fast ausschließlich an Epitopstellen oder Fragmente eines gewünschten Proteins, wie z. B. eines Epitop-Fragments, freigelegt durch Behandlung von PrP^Sc und nicht freigelegt an nativem, unbehandeltem PrP^Sc, bindet.
Durch "nachweisbar markierte Antikörper", "nachweisbar markiertes Anti-PrP" oder "nachweisbar markiertes Anti-PrP-Fragment" ist ein Antikörper (oder Antikörper-Fragment, welches die Bindungsspezifizität beibehält) mit einer ange hängten, nachweisbaren Markierung gemeint. Die nachweisbare Markierung ist normalerweise durch chemische Konjugation angehängt, aber wo die Markierung ein Polypeptid ist, könnte sie alternativ durch Genmanipulationen angehängt werden. Verfahren zur Herstellung von nachweisbar markierten Proteinen sind im Fach wohlbekannt. Nachweisbare Markierungen sind bekannt in dem Fach, sind jedoch normalerweise Radioisotope, Fluorophore, paramagnetische Markierungen, Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase) oder andere Teile oder Verbindungen, die entweder ein nachweisbares Signal (z. B. Radioaktivität, Fluoreszenz, Farbe) emittieren, oder ein nachweisbares Signal nachdem die Markierung ihrem Substrat ausgesetzt worden ist, emittieren. Verschiedene nachweisbare Markierung/Substrat-Paare (z. B. Meerrettich-Peroxidat/Diaminobenzidin, Avidin/Streptavidin, Luciferase/Luciferin), Verfahren zur Markierung von Antikörpern, und Verfahren zur Verwendung von markierten Antikörpern sind in dem Fach wohlbekannt (siehe z. B. Harlow and Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). Eine besonders bevorzugte Markierung ist Europium.
Hierin verwendete Abkürzungen beinhalten:

CNS für zentrales Nervensystem;
BSE für bovine spongiforme Encephalophatie;
CJD für Creutzfeldt-Jacob-Krankheit;
FFI für Fatal Familial Insomnia;
GdnHCI für Guanidinhydrochlorid;
GSS für Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit;
Hu für human;
HuPrP für Human-Prion-Protein;
Mo für Maus;
MoPrP für Maus-Prion-Protein;
SHa für syrischer Hamster;
SHaPrP für syrisches Hamster-Prion-Protein;
Tg für transgen;
Tg(SHaPrP) für eine transgene Maus, die das PrP-Gen eines syrischen Hamsters enthält;
Tg(HuPrP) für transgene Mäuse, die das komplette humane PrP-Gen enthalten;
Tg(ShePrP) für transgene Mäuse, die das komplette Schaf-PrP-Gen enthalten;
Tg(BovPrP) für transgene Mäuse, die das komplette Kuh-PrP-Gen enthalten;
PrP^Sc für die Traberkrankheit (Scrapie)-Isoform des Prion-Proteins;
PrP für die zellulär enthaltene, gebräuchliche, normale Isoform des Prion-Proteins;
PrP 27–30 oder PrP^Sc 27–30 für die Behandlungs- oder Protease-resistente Form von PrP^Sc;
MoPrP^Sc für die Traberkrankheit (Scrapie)-Isoform des Maus-Prion-Proteins;
MHu2M für ein chimäres Maus/Human-PrP-Gen, worin eine Region des Maus-
PrP-Gens durch eine entsprechende Human-Sequenz, welche sich vom Maus-PrP in 9 Kodons unterscheidet, ersetzt ist;
Tg(MHu2M) Mäuse sind transgene Mäuse der Erfindung, welche das chimäre MHu2M-Gen beinhalten;
MHu2MPrP^Sc für die Traberkrankheit (Scrapie)-Isoform des chimären Human/Maus-PrP-Gens;
PrP^CJD für die CJD-Isoform eines PrP-Proteins;
Prnp^0/0 für die Entfernung von beiden Allelen eines endogenen Prion-Protein-Gens, z. B. des MoPrP-Gens;
Tg(SHaPrP^+/0)81/Prnp^0/0 für eine spezielle Linie (81) transgener Mäuse, die SHaPrP exprimieren, +/0 bezeichnet heterozygot;
Tg(HuPrP)/Prnp^0/0 für eine Hybridmaus, die durch Kreuzung einer Maus mit einem Human-Prion-Protein-Gen (HuPrP) mit einer Maus, bei der beide Allele des endogenen Prion-Proteins unterbrochen sind, erhalten wurde;
Tg(MHu2M)/Prnp^0/0 für eine Hybridmaus, erhalten durch Kreuzen einer Maus mit einem chimären Prion-Protein-Gen (MHu2M) mit einer Maus, die beide Allele des endogenen Prion-Proteins unterbrochen hat;
TTR für Transthyretin;
FVB für einen Standard-Inzuchtstamm von Mäusen, die oft in der Herstellung von transgenen Mäusen verwendet werden, da Eier von FVB-Mäusen relativ groß sind und Mikroinjektion von exogener DNA relativ gut tolerieren;
[PrP_β]–Konzentration von Prion-Protein in β-Faltblatt-Konformation;
[β-A4_β]–Konzentration von βA4 in β-Faltblatt-Konformation;
[DRC]–Konzentration einer mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins.

ALLGEMEINE ASPEKTE DER ERFINDUNG
Das Assay-Verfahren umfasst das Zur-Verfügung-Stellen einer Probe, die verdächtigt wird, ein Protein zu enthalten, welches eine erste Konformation annimmt und eine zweite, mit einer Krankheit verbundene Konformation, und ist in der Lage, eine Krankheits-Konformation des Proteins nachzuweisen, wenn es relativ zu der Konzentration der Nicht-Krankheits-Konformation in einer sehr niedrigen Konzentration vorliegt. Die Probe wird in einen ersten Teil und in einen zweiten Teil geteilt. Der erste Teil wird bevorzugt an die Oberfläche des festen Trägers gebunden und danach in Kontakt mit einem markierten Antikörper gebracht. Der Antikörper ist von solcher Art, welche das Protein in seiner ersten Konformation mit einem höheren (viermal oder mehr) Maß an Affinität bindet, als sie ein Protein in seiner zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation bindet. Der zweite Teil der Probe wird dann einer Entfaltungsbehandlung unterworfen, welche jedes Protein in der zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation dazu bringt, eine unterschiedliche Konformation anzunehmen, welche Konformation ein höheres Maß an Affinität (viermal oder noch höher) für den markierten Antikörper hat, verglichen mit der Affinität für das Protein in der unbehandelten zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation. Der zweite Teil (der Entfaltungsbehandlung unterworfen) wird dann vorzugsweise an die Oberfläche des festen Trägers gebunden. Das behandelte, an den Träger gebundene Protein wird dann mit markiertem Antikörper unter Bedingungen, welche dem Antikörper erlauben, an die Proteine in der ersten Konformation oder Proteine in der ungefalteten Konformation zu binden, in Kontakt gebracht.
Nachdem den markierten Antikörpern genügend Zeit, Temperatur und chemische Bedingungen (z. B. pH) zur Verfügung gestellt worden ist, um die geeigneten Proteine, die in den jeweiligen Teilen vorliegen, zu binden, wird das Niveau der Bindung der markierten Antikörper an das Protein in jedem Teil bestimmt. Ein hochsensitiver Assay wird verwendet, wie z. B. ein Assay beinhaltend Zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz oder Laser-gesteuertes Fluorometer mit zwei Wellenlängen, was es möglich macht, Konzentrationen in einer Menge in dem Bereich von ungefähr 1 × 10³ Partikeln pro ml oder weniger zu bestimmen. Ein hohes Maß an Sensitivität ist erforderlich, da in den meisten Proben die Konzentration an Protein in der Krankheits-Konformation im Vergleich zu der Konzentration an Protein in der Nicht-Krankheits-Konformation sehr niedrig sein wird, z. B. drei Größenordnungen oder mehr verschieden. Zum Beispiel könnte die Nicht-Krankheits-Konformation des Proteins in einer Menge von ungefähr 1 × 10⁸ Partikel/ml vorliegen, wohingegen die Krankheits-Konformation eines Proteins nur in einer Menge von 1 × 10⁴ Partikel/ml vorliegt. So wird jeglicher Anstieg im Signal, bemerkt durch Unterwerfen der Krankheits-Konformation des Proteins einer Entfaltungsbehandlung, im Vergleich zu dem Signal, das von dem Protein in der Nicht-Krankheits-Konformation erhalten wird, sehr klein sein.
Nachdem das Bindungsniveau für beide Teile der Probe erhalten worden ist, werden die Niveaus verglichen. Zum Beispiel wird der Bindungslevel eines markierten Antikörpers an ein Protein in dem ersten Teil abgezogen von dem Bindungslevel eines Antikörpers an ein Protein in dem zweiten Teil. Der Unterschied zwischen den beiden widerspiegelt die Menge an Protein, die in der ursprünglichen Probe enthalten war, welche in der zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation war; nach dem Einstellen auf Unterschiede (falls irgendwelche da waren), verursacht durch Ansteigen der Bindungsaffinität des Proteins in dem ersten Teil.
Mehr spezifisch, mit einigen Proteinen können wegen der Wirkung der Entfaltungsbehandlung auf die Proteine, welche in einer nativen, Nicht-Krankheits-Konformation sind, einige Unterschiede sein – z. B. sind mehr Epitope des Proteins in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation durch die Behandlung freigelegt. Diese Unterschiede sollten beim Ziehen von Schlüssen im Hinblick darauf berücksichtigt werden, ob die ursprüngliche Probe Proteine in der zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation beinhaltete. Das Berücksichtigen dieses Effekts wird gezeigt in den 3 und 4. Im 3 ist ein Vergleich von Antikörperbindung an eine unbehandelte Probe gezeigt, welche nur natives Protein in seiner Nicht-Krankheits-Konfiguration enthält, mit dem gleichen nativen Protein nach der Entfaltungsbehandlung. Wie in 3 gezeigt, besteht einiger Unterschied zwischen den mit dem behandelten Protein erhaltenen Ergebnissen, zeigend ein stärkeres Signal, indem die Entfaltungsbehandlung die Bindungsaffinität des Proteins erhöhte. Dennoch zeigt 4 die gleichen Ergebnisse, wenn die ursprüngliche Probe Proteine enthielt, die in der zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation waren. Die nativen (PrP^Sc) mit einer Krankheit verbundenen Proteine, welche keiner Entfaltungsbehandlung unterzogen werden, liefern ein sehr schwaches Signal. Jedoch liefern die Entfaltungs-behandelten PrP^Sc-Proteine ein sehr starkes Signal. Der große Unterschied zwischen den Entfaltungsbehandelten und den unbehandelten oder nativen PrP^Sc-Proben ist ein klares Anzeichen dafür, dass die ursprüngliche Probe Proteine mit der zweiten, mit einer Krankheit verbundenen Konformation beinhaltete, da diese Proteine keine Antikörper binden oder an Antikörper mit einem sehr niedrigen Grad an Bindungsaffinität binden. Jedoch binden nach der Entfaltungsbehandlung diese Proteine genauso gut oder fast so gut oder besser an die Antikörper als die Proteine in der Nicht-Krankheits-Konformation, welche durch die Entfaltungsbehandlung behandelt worden waren.
Dieser Assay kann verwendet werden, um auf die Anwesenheit einer Krankheits-Konformation eines gegebenen Proteins innerhalb jeglicher Art einer Probe hin zu testen. Einige der typischsten Proben, die getestet werden, schließen Arzneimittel, welche Komponenten miteinschließen, welche aus lebenden Säugetieren abgeleitet werden, mit ein oder verwenden Materialien, abgeleitet aus lebenden Säugetieren in ihrer Entwicklung. Es würde also wünschenswert sein, Organe für die Transplantation und Nahrungsmittelartikel wie z. B. Rindfleisch (beef), welches verdächtigt war, infektiöse Prione zu enthalten, zu testen. Die Erfindung könnte verwendet werden, um auf die Anwesenheit der Krankheits-Konformation von einem oder mehreren Typen von Proteinen hin zu testen, wie z. B. infektiöses PrP^Sc in Arzneimitteln, Kosmetika, Biopsie- oder Autopsie-Gewebe, Gehirn, Rückenmark, periphere Nerven, Muskeln, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Blut und Blutkomponenten, Lymphknoten und in Tier- oder Mensch-abgeleiteten Kulturen, infiziert oder potenziell infiziert durch Krankheitsformen von Proteinen, wie z. B. Prionen.
BEHANDLUNG–ENTFALTUNG
Ein Assay der Erfindung kann alle oder beliebige der drei Grundtypen von Behandlung, welche oben definiert sind, verwenden. Die Behandlungen sind (1) Vorbehandlung, (2) Entfaltungsbehandlung und (3) begrenzte Protease-Behandlung. Im Allgemeinen sind die Bedingungen für die Vorbehandlung mild, solche für die Entfaltungsbehandlung moderat und solche für begrenzte Protease-Behandlung rauh. Jede Art von Behandlung kann die gleichen Mittel anwenden (z. B. Proteasen, Zeit, Temperatur, etc.), aber jede wird in einem verschiedenen Ausmaß angewendet, z. B. höhere Konzentration, längere Zeit, höhere Temperatur.
Die Entfaltungsbehandlung denaturiert das Protein, aber hydrolysiert nicht Proteine von Interesse, und kann Freisetzen der Proteine gegen jegliche physikalische und/oder chemische Hilfsmittel einschließen, was zur Folge hat, dass das Protein, welches ursprünglich in einer festen, mit einer Krankheit verbundenen Konfor mation vorliegt, eine relaxiertere Konformation annimmt, welche ein höheres Maß an Bindungsaffinität für jeglichen Bindungspartner, wie z. B. Antikörper hat. Im Allgemeinen beinhaltet die Entfaltungsbehandlung das Unterwerfen des Proteins einiger Hilfsmittel, welche zur Folge haben, dass Epitope auf dem Protein, welche vorher nicht freigelegt waren oder teilweise freigelegt waren, freigelegt werden oder mehr freigelegt werden, so dass ein Antikörper oder anderer Bindungspartner leichter an das neu freigelegte Epitop binden kann.
Verwendete Verfahren zur Entfaltungsbehandlung können einschließen: (1) physikalische, wie z. B. hydrostatischer Druck oder Temperatur, (2) chemische, wie z. B. saurer oder basischer pH, chaotrope Salze, denaturierende Detergenzien, Guanidinhydrochlorid und Proteinasen, wie z. B. Proteinase K und (3) Kombinationen von obigen.
Die Behandlungszeit wird von der verwendeten Behandlung abhängend variieren, sollte aber genügend lange ausgeführt werden, um den gewünschten Effekt zu erhalten, z. B. bei der Entfaltungsbehandlung, um neue Bindestellen freizulegen, aber nicht so lange, um das Protein vollständig zu denaturieren oder zu hydrolysieren. Wenn die Entfaltungsbehandlung an PrP-Proteinen ohne chemische Behandlung ausgeführt wird, wird die Temperatur um ungefähr 40°C auf ungefähr 80°C für eine Zeit, die ausreichend ist, um die gewünschte Menge an ungefaltetem PrP^Sc zu erhalten, erhöht. Wenn der pH auf 12 oder 13 erhöht wird, kann die Temperatur niedriger und die Zeit kürzer sein.
VORBEHANDLUNG
Vor dem Ausführen der Behandlung oder dem Antikörper-Testen von jedem Teil der Probe mag es wünschenswert sein, die Probe einer Vorbehandlung zu unterwerfen. Die Vorbehandlung wird durchgeführt, um nicht verwandte Proteine als auch einige der Nicht-Krankheitsformen des Proteins, die in der Probe vorhanden sind, zu zerstören oder zu entfernen. Beispiele von Vorbehandlungsmethodologien schließen das Herstellen einer Säule mit ein, welche Antikörper, gebunden an Trägeroberflächen, mit einschließt, welche Antikörper die Nicht-Krankheits-Konformation des Proteins binden, dadurch so viel wie möglich der Nicht-Krankheits-Konformation der Proteine entfernend. Antikörper, welche nicht verwandte, aber herkömmliche Proteine binden, können auch verwendet werden. Alternativ kann die Probe einer physikalischen Behandlung unterworfen werden, wie z. B. lang anhaltender hydrostatischer Druck oder Temperatur allein oder in Kombination mit Chemikalien, wie z. B. Säuren oder Basen wie oben angegeben, um die Proteine, welche in der Probe vorliegen, zu zerstören, Proteine, die nicht verwandt sind mit solchen, auf die getestet wird, ob sie in der Nicht-Krankheits-Konformation vorliegen, oder die in der Krankheits-Konformation vorliegen. Unter einigen Umständen werden Proteine in der Nicht-Krankheits- und der Krankheits-Konformation zerstört werden. Dennoch wird ein höherer relativer Prozentsatz der Proteine in der Nicht-Krankheits-Konformation zerstört werden, da diese Proteine anfangs in einer lockereren Konformation vorliegen, welche anfälliger für Zerstörung ist. Folglich resultiert die Vorbehandlungsmethodologie in einer Probe, welche eine relativ geringe Konzentration an Nicht-Krankheits-Konformation des Proteins relativ zu der Konzentration der Krankheits-Konformation des Proteins beinhaltet. Dies erhöht die Sensitivität des Assays, es möglich machend, niedrigere Konzentrationen der Krankheits-Konformation des Proteins zu bestimmen. Entfernung der Proteine wird bevorzugt über die Zerstörung von solchen, da die Zerstörung die Sensitivität erniedrigen wird, falls die Krankheits-Konformation zerstört wird. Ein besonders nützliches Vorbehandlungsverfahren ist offenbart in unserer WO 99/42487, benannt "Process for Concentrating Protein with Disease-Related Conformation".
BESCHRÄNKTE PROTEASE-BEHANDLUNG–LYTISCHE BEHANDLUNG
Die beschränkte Protease-Behandlung ist eine lytische Behandlung, welche das rauheste verwendete Behandlungsverfahren zur Herstellung von Proben für die Assays der Verwendung ist. Nachdem ein Teil der Proben der Vorbehandlungs-Behandlung unterzogen worden ist, wird es in zwei Teile geteilt, und eines dieser zwei Teile wird der Entfaltungsbehandlung unterworfen. Falls der Grundassay zeigt, dass mit einer Krankheit verbundenes Protein in der Probe vorhanden ist, dann wird die Gesamtmenge (oder Konzentration) des mit einer Krankheit verbundenen Proteins bestimmt. Ein anderer Teil der ursprünglichen Probe oder des isolierten gesamten mit einer Krankheit verbundenen Proteins wird dann der beschränkten Protease-Behandlung unterzogen. Diese Behandlung wird alle oder im Wesentlichen alle Proteine in der Probe zerstören oder hydrolysieren, außer das mit einer Krankheit verbundene Protein, welches resistent gegenüber der beschränkten Protease-Behandlung ist (z. B. PrP 27–30). Die Menge (oder Konzentration) dieses Protease-resistenten Proteins wird dann bestimmt und von der Gesamtmenge des mit einer Krankheit verbundenen Proteins subtrahiert, um das Protease-sensitive, mit einer Krankheit verbundene Protein (z. B. Proteasesensitives PrP^Sc) zu finden. Die beschränkte Protease-Behandlung oder lytische Behandlung kann einschließen (1) chemische Verfahren wie z. B. extremen pH-Werten (z. B. 2 oder weniger oder 12 oder darüber), stark reduzierenden oder oxidierenden Verbindungen ausgesetzt sein und/oder (2) enzymatische Verfahren wie z. B. Proteasen (z. B. Proteinase K). Die Konzentration der Behandlungsverbindungen als auch die Zeit und die Temperatur werden mit dem Protein, das behandelt wird, und dem zu erhaltenden Endergebnis variieren. Wenn PrP-Proteine behandelt werden, wird die Behandlung ausgeführt, um (1) alle oder im Wesentlichen alle Nicht-PrP-Proteine, die in der Probe vorhanden sind, zu hydrolysieren; (2) alle oder im Wesentlichen alle vorhandenen Nicht-PrP^c zu hydrolysieren; (3) vorliegendes Protease-sensitives PrP^Sc zu hydrolysieren; und (4) die 65 N-terminalen Aminosäuren von vorhandenem Protease-resistentem PrP^Sc zu hydrolysieren, dadurch nur PrP 27–30 unhydrolysiert lassend.
Die begrenzte Protease-Behandlung kann, wie die Entfaltungsbehandlung oder Vorbehandlung, mit Temperatur ausgeführt werden. Zum Beispiel kann Hydrolyse von PrP-Proteinen durch Erhitzen auf über 80°C bis 132°C für ein bis drei Tage erhalten werden. Die Zeit und Temperatur können signifikant reduziert werden durch Erniedrigung des pHs auf 12 oder 13. Gegenstand dieser Behandlugn ist, mehr als Proteine zu entfalten und Proteine zu hydrolysieren.
BINDEN VON PROTEINEN AN TRÄGEROBERFLÄCHEN
Das Verfahren des chemischen oder Affinitätskoppeln von PrP-Proteinen an den Kunststoffträger ist im Allgemeinen in verfügbarer Literatur beschrieben und kann variieren. Die in dem diagnostischen Assay verwendeten Antikörper sind polyklonal, monoklonal oder rekombinantes Fab und müssen Spezies-spezifisch sein, mit bevorzugtem Binden an natives PrP^c oder die denaturierte Form von PrP^Sc mit vorzugsweise mindestens vierfach niedrigerer Reaktivität mit infektiösem PrP^Sc, wobei die gleiche Menge an Antigen angenommen wird.
VERWENDEN DES ASSAYS, UM PRIONEN (PrP^Sc) ZU BESTIMMEN
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Zwei-Schritt-Verfahren, um eine Prion-Krankheit durch quantitatives Messen der nativen infektiösen Form von PrP^Sc-Protein in Probenmaterial oder in den Gehirnen von verdächtigten Tieren, mit solchem Material inokuliert, zu diagnostizieren. Die Probe ist bevorzugt vorbehandelt, um so viel wie möglich nicht verwandtes und Nicht-Krankheits-Protein zu entfernen. Die vorbehandelte Probe wird in zwei Aliquots geteilt. Das erste Aliquot wird mit dem festen Kunststoffträger in nativer Konformation durch einen chemischen Aktivierungsschritt unter nicht-denaturierenden Bedingungen, d. h. keiner Behandlung, vernetzt. Der zweite Teil der Probe wird erst einer Entfaltungsbehandlung unterzogen und dann mit dem Kunststoffträger vernetzt. Beide Teile des Probenmaterials reagieren in situ mit den markierten Antikörpern, die bevorzugt natives PrP^Sc oder Entfaltungs-behandeltes PrP^Sc der gegebenen Tierarten erkennen. Die Menge an Antikörper, gebunden an das Entfaltungsbehandelte PrP-Protein oder an native Konformationen von PrP-Protein wird durch das Signal der IgG-Markierung erfasst. Der Überschuss an mit dem der Entfaltungsbehandlung unterzogenen Teil der Probe erhaltenem Signal gegenüber dem Signal, das aus einem Anstieg des mit der nativen α-helikalen Konformation von PrP^Sc (z. B. die Erhöhung gegenüber der Einstellungsmenge) erhaltenen Signals erwartet wird, ist das Maß für die Menge an infektiösem β-Faltblatt-strukturiertem PrP^Sc in der ursprünglichen Probe. Die für die Berechnung des PrP^Sc-Gehalts entwickelte Formel wird in den hier zur Verfügung gestellten Formeln gezeigt und wird in Beispiel 11 beispielhaft erläutert.
Die Diagnose der Anwesenheit von Prionen wird durch drei Verfahren begründet: (1) Messung der behandelten Probe allein und Bestimmen des Anstiegs in der gesamten PrP-Menge in der untersuchten Probe gegenüber dem Hintergrundniveau von PrP^c, erhalten aus normalen Kontrollen; (2) Berechnung des Verhältnisses zwischen denaturiertem gegen nativem Signal für gegebene Antikörper – z. B. Werte höher als 2,2 für Europium-markiertes 3F4 IgG zeigt die Anwesenheit von PrP^Sc an, bevorzugt verwendend Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz; (3) Beurteilung des Überschusses an denaturiertem Probensignal gegenüber dem Signal, das aus einem Anstieg des Signals für α-helikale Konformation von PrP^Sc als ein Maß für die Menge an infektiösem β-Faltblatt-strukturiertem PrP^Sc in der ursprünglichen Probe erwartet wird. Bevorzugt vor Schritt (1) verwendet das Verfahren einen Vorbehandlungsschritt, wobei PrP^Sc in relativen Mengen, die größer sind als die von PrP^Sc, entfernt oder zerstört wird.
In einem mit Traberkrankheit (Scrapie)-infizierten syrischen Hamster-Gehirn ist die Konzentration von PrP^Sc 5- bis 10-mal höher als PrP^c, wenn die Tiere krank werden. Zu dieser Zeit beträgt der Prion-Titer in ihren Gehirnen 10⁷ bis 10⁸ ID₅₀ Einheiten/ml 10% Homogenat. Das hochquantitative System, das wir entwickelt haben, erlaubt es uns, das PrP^c-Signal zu subtrahieren. Die Subtraktion kann leicht ausgeführt werden, wenn die Konzentration von PrP^Sc größer ist als PrP^c. Jedoch wird die Subtraktion schwierig, wenn die Konzentration von PrP^Sc viel weniger ist als PrP^c.
Um das vorangehende Problem anzugehen, verwendet der vorliegende Assay das Prinzip von Affinität zwischen verschiedenen Konformationen von Antigen und Antikörper. Um die Konzentration von PrP^Sc zu messen, wenn sie viel geringer ist als PrP^c, muss das Detektionssystem extreme Sensitivität haben und einen linearen Bereich von mindestens 10⁴. Der hier beschriebene Assay kann PrP^Sc leicht bei einer Konzentration von (ungefähr) 50 pg/ml unter Verwendung von Europium-markiertem IgG bestimmen. Bei angenommenen 10⁵ bis 10⁶ PrP^Sc-Molekülen pro ID₅₀-Einheit kann der vorliegende Assay leicht 5 × 10² – 5 × 10³ ID₅₀ Einheiten pro ml bestimmen.
Der Assay kann PrP^Sc in Mischungen (durch direktes Verfahren) bestimmen, wo die Konzentration von PrP^Sc weniger als ein Prozent der Konzentration von PrP^c ist. Zusätzliche Sensitivität kann durch Immunopräzipitation erhalten werden, unter Verwendung eines Sandwich-Formats für einen Festzustand-Assay, differenzielles Zentrifugieren mit Detergens-Extraktion, um PrP^c zu entfernen, das indirekte transgene Tier-Verfahren oder eine Kombination dieser Verfahren. Eine zurückhaltende Schätzung ist, dass solche Verfahren Messungen von zwischen 5 und 50 ID₅₀ Einheiten pro ml erlauben sollten oder, weniger zurückhaltend, erlauben sollten, zwischen 0,1 und 0,01 ID₅₀ Einheiten pro ml zu messen. Solche Messungen würden ein schnelles, "positives" Mittel zur Etablierung biologischer Sterilität, welche die "Abwesenheit" von Infektiosität ist, zur Verfügung stellen.
ANTIKÖRPER
Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern sind dem Fachmann im Allgemeinen bekannt. Da die Krankheitsform oft eine festere Konfiguration als die Nicht-Krankheitsform mit weniger freigelegten Epitopen ist, kann man schnell Antikörper generieren, die nur die Nicht-Krankheitsform des Proteins oder die behandelte Krankheitsform binden. Zum Beispiel können Antikörper, die die behandelten Formen von PrP^Sc-Protein und PrP^c-Protein detektieren, durch Immunisierung von Kaninchen oder Mäusen mit α-helikalen Konformationen von rekombinantem PrP, nativem PrP^c aus Tier-Gehirnen, synthetischen Peptiden in α-helikaler oder zufällig gewendelten Konformationen generiert werden, oder gegen denaturiertes PrP^Sc oder PrP 27–30. Nur Antikörper mit einer mindestens viermal höheren Affinität für PrP^C (oder für denaturierte Konformation von PrP^Sc der gleichen Spezies), verglichen mit ihrer Affinität für PrP^Sc, sollten ausgewählt werden. Das Verfahren der Antikörper-Herstellung, Aufreinigung, Markierung und Detektion kann variieren.
Die IgGs oder Fabs können aus verschiedenen Quellen durch Affinitäts-HPLC unter Verwendung einer Protein-A-Säule und Größenausschluss HPLC aufgereinigt werden. Die aufgereinigten Antikörper können mit Europium markiert werden und durch Zeit-aufgelöste Fluoreszenz bestimmt werden. Der Antikörper, der an verschiedene Konformationen des PrP-Proteins bindet, kann durch Zeitaufgelöste, Dissoziations-verstärkte Fluoreszenz gemessen werden. Dennoch kann das System der Detektion von PrP-gebundenem IgG auf einem festen Träger in situ oder in Lösung variieren. Ferner ist es möglich, direkte oder indirekte immunologische Verfahren zu verwenden, eingeschlossen direkte Radiomarkierungen, Fluoreszenz, Lumineszenz, Avidin-Biotin-Verstärkung oder Enzym-verbundene Assays mit Farb- oder Lumineszenz-Substraten.
Ein Antikörper, der in der Erfindung verwendet werden kann, ist in US 4,806,627 , erteilt am 21. Februar 1989, offenbart, offenbarend den monoklonalen Antikörper 263K 3F4, hergestellt durch die Zelllinie ATCC HB9222, hinterlegt am 8. Oktober 1986. Die Zelllinie, die den Antikörper produziert, kann von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, erhalten werden.
Im Allgemeinen produziert eine Traberkrankheit (Scrapie)-Infektion mit Wirtsorganismen, die tolerant gegenüber PrP^Sc aus der gleichen Spezies sind, keine Immunantwort. Antikörper, die entweder PrP^c oder PrP^Sc binden, sind in WO 97/10505, veröffentlicht am 20. März 1997, offenbart. Jeglicher Antikörper, der PrP^c und nicht PrP^Sc bindet, kann verwendet werden, und Fachleute können solche unter der Verwendung von bekannten Verfahren, z. B, siehe Verfahren zur Herstellung von Phagen-Display-Antikörper-Bibliotheken in US 5,223,409 , generieren. Dennoch wurden polyklonale Anti-PrP-Antikörper in Kaninchen im Anschluss an die Immunisierung mit großen Mengen an Ameisensäure oder SDS-denaturiertem SHaPrP 27–30 hochgezogen [Bendheim, Barry et al. (1984) Nature 310: 418–421; Bode, Pocchiari et al. (1985) J Gen Virol 66: 2471–2478; Safar, Ceroni et. (1990) Neurology 40: 513–517]. Auf die gleiche Weise wurden eine Handvoll von anti-PrP-monoklonalen Antikörpern gegen PrP 27–30 in Mäusen hergestellt [Barry and Prusiner (1986) J Infect Dis 154: 518–521]; Kascsak, Rubenstein et al. (1987) J Virol 61: 3688–3693]. Diese Antikörper wurden gegen Ameisensäure oder SDS-denaturiertes PrP 27–30 generiert und sind in der Lage, natives PrP^c und behandeltes oder denaturiertes PrP^Sc von beiden, SHa und Menschen, gleich gut zu erkennen, aber sie binden nicht MoPrP. Nicht überraschend wurden die Epitope dieser Antikörper auf Regionen der Sequenz abgebildet, die Aminosäure-Unterschiede zwischen SHa und MoPrP enthalten (Rogers, Yehiely et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 3182–3186].
Es ist nicht vollkommen klar, warum viele Antikörper der in den oben zitierten Publikationen beschriebenen Art PrP^c binden und behandeltes oder denaturiertes PrP^Sc, aber nicht natives PrP^Sc. Ohne an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass das vorkommen kann, weil Epitope, die freigelegt sind, wenn das Protein in der PrP^c-Konformation vorliegt, nicht freiliegen oder teilweise in der PrP^Sc-Konfiguration verborgen sind – wo das Protein relativ unlöslich und kompakter zusammengefaltet ist.
Zum Zwecke der Erfindung bedeutet das Anzeichen, dass keine Bindung stattfindet, dass die Gleichgewichts- oder Affinitätskonstante K_a 10⁶ l/Mol oder weniger ist. Ferner wird eine Bindung als existierend betrachtet, wenn K_a bei 10⁷ l/Mol oder größer ist, vorzugsweise bei 10⁸ l/Mol oder größer. Die Bindungsaffinität von 10⁷ l/Mol oder mehr kann liegen an (1) einem einzelnen monoklonalen Antikörper (d. h. große Anzahl an einer Art von Antikörper) oder (2) einer Vielzahl von verschiedenen monoklonalen Antikörpern (z. B. eine große Anzahl von jedem der fünf verschiedenen monoklonalen Antikörper) oder (3) einer großen Anzahl von polyklonalen Antikörpern. Es ist auch möglich, Kombinationen von (1) bis (3) zu verwenden. Ausgewählte bevorzugte Antikörper werden mit mindestens viermal größerer Avidität an die behandelten oder denaturierten PrP^Sc-Formen des Proteins binden, verglichen mit ihrer Bindung an die native Konformation von PrP^Sc. Der vierfache Unterschied in der Bindungsaffinität kann durch Verwendung einiger verschiedener Antikörper wie in (1) bis (3) oben zustande kommen, und als solche könnten einige der Antikörper in der Mischung weniger als einen vierfachen Unterschied haben.
Eine Vielzahl von verschiedenen Arten an Assays der Erfindung kann mit einem oder mehreren verschiedenen Antikörpern verwendet werden. Fachleute werden erkennen, dass Antikörper mit bekannten Markierungen markiert werden und mit zur Zeit verfügbaren Robotern, Sandwich-Assays, elektronischen Detektoren, Durchflusscytometrie und Ähnlichem verwendet werden können.
QUANTITATIVE BERECHNUNGEN
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methodologie ist es möglich, den Unterschied zwischen der Menge an Signal, erhalten aus einer Probe, die nicht behandelt worden ist, und dem Signal, erhalten aus einer Probe, welche behandelt worden ist, zu berechnen. Dieser Unterschied repräsentiert (nach Einstellen auf den Effekt der Behandlung auf die Nicht-Krankheits-Konformation) die Menge (Konzentration) eines Proteins in einer Krankheits-Konformation, vorliegend in der ursprünglichen Probe. Nach dem Erhalt des Unterschiedes kann die unten angegebene Formel verwendet werden, um die Menge an Protein in der Krankheits-Konformation, vorliegend in der ursprünglichen Probe, pro Volumeneinheit zu berechnen. a) Fn = Fnα + Fnβ → Fnα = Fn – Fnβ, Fnβ ∼ Hintergrund b) Fd = Fdα + Fdβ ΔFn→d = ΔFαn→d + ΔFβn→d ΔFβn→d = Fd – Fn – ΔFαn→d [PrPβ] oder [DRC] ∼ ΔFβn→d = Fd – (Fn * fαn→d)
Die Definition von jeder der obigen Variablen ist unten gegeben.
F – Fluoreszenzsignal (beachte, dass jedes bestimmbare Signal verwendet werden könnte);
F_n – Fluoreszenzsignal der nativen Konformation;
F_nα und F_nβ – Fluoreszenzsignale der nativen α-helikalen bzw. β-Faltblatt-Konformationen;
F_d – Fluoreszenzsignal von PrP in behandeltem oder denaturiertem Zustand;
F_dα und F_dβ – sind die Signale von denaturierten α-helikalen bzw. β-Faltblatt-Zuständen von PrP;
ΔF_n→d – Anstieg des Fluoreszenz-Signals beim Übergang vom nativen zum denaturierten Zustand;
ΔF_αn→d – Anstieg des Fluoreszenz-Signals der α-helikalen Konformation beim Übergang vom nativen zum denaturierten Zustand;
ΔF_βn→d – Anstieg des Signals der β-Faltblatt-Konformation beim Übergang vom nativen zum denaturierten Zustand;
f_αn→d – Korrelationsfaktor beim Übergang vom nativen zum denaturierten Zustand von α-helikalem PrP;
[PrP_β] – Konzentration des Prion-Proteins in β-Faltblatt-Konformation; [DRC] – Konzentration von jeglichem Protein in der mit einer Krankheit verbundenen Konformation.
∼ – proportional zu.
* – mal.
Die oben zur Verfügung gestellte Formel wird speziell dafür verwendet, um die Konzentration des Prion-Proteins in der β-Faltblatt-Konformation zu berechnen. Dennoch können die gleichen Formeln auch verwendet werden, um die Konzentration eines jeglichen Proteins zu berechnen, d. h. die Konzentration von jeglicher zusammengezogener Krankheits-Konformation eines Proteins, wie z. B. [βA4_β]. Allgemeiner repräsentiert [DRC] die Konzentration einer mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins.
Um ein bestimmtes Beispiel zur Verfügung zu stellen, wurden die obigen Definitionen speziell im Hinblick auf PrP-Proteine zur Verfügung gestellt, welche Proteine mindestens eine relaxierte, Nicht-Krankheits-Konformation (PrP^c) einschließen, welche eine α-helikale Konformation und mindestens eine zusammengezogene, mit einer Krankheit verbundene Konformation (PrP^Sc) einschließt, welche eine β-Faltblatt-Konformation einschließt. Die Formeln werden verwendet, m die Konzentration der mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins, vorliegend in der Probe, zu berechnen. Durch die spezifischen, oben zur Verfügung gestellten Formeln und Definitionen werden die Formeln verwendet, im die Konzentration der Prion-Proteine, welche die β-Faltblatt-Konformation mit einschließen (siehe Beispiel 11), zu berechnen.
Das Signal, das beim Berechnen der obigen Formel verwendet wurde, ist ein Fluoreszenz-Signal. Dennoch kann jegliches bestimmbare Signal verwendet ^werden. Das Gesamtsignal wird repräsentiert durch F_n, welches eine Kombination des Signals ist, das aus den mit einer Krankheit und den nicht mit einer Krankheit verbundenen Konformationen erhalten wurde. Dies ist ein Signal, welches aus dem Teil Nr. 1, welches nicht durch den oben beschriebenen Assay behandelt wird, berechnet werden würde. Die Variable F_d ist das Signal, welches durch Behandeln von Teil Nr. 2 der Probe erhalten wird. Dieses Signal ist eine Kombination des aus dem behandelten Protein in der Nicht-Krankheits-Konformation plus dem behandelten Protein in der Krankheits-Konformation erhaltenen Signals.
Es ist erkannt worden, dass es einen Unterschied gibt in dem Signal, das durch das Behandeln einer Probe (z. B. durch Entfaltungs-Behandlung) erhalten wurde, welche die nicht mit einer Krankheit verbundene Konformation des Proteins mit einschließt. Dieser Unterschied sollte berücksichtigt werden, um einen exakten Messwert zu erhalten. Der Unterschied in dem erhaltenen Signal zwischen der nativen Probe und der behandelten Probe ist natürlich eine Kombination des Unterschiedes in dem Signal, erhalten durch Behandlung der mit einer Krankheit verbundenen Konformation und der Nicht-Krankheits-Konformation. Der Anstieg des durch Unterwerfen der Krankheits-Konformation einer Entfaltungs-Behandlung erhaltenen Signals, d. h. der Unterschied zwischen dem Signal der unbehandelten Krankheits-Konformation und dem erhaltenen Signal aus der behandelten Krankheits-Konformation, kann durch Subtraktion des aus dem Behandeln der gesamten Probe erhaltenen Signals von dem Signal, erhalten aus dem Berechnen des Anstiegs des Signals, erhalten aus der unbehandelten, Nicht-Krankheits-Konformation und der behandelten Nicht-Krankheits-Konformation, berechnet werden. Unter Verwendung dieser Gleichungen ist es möglich, die Endgleichung zu produzieren, welche die Konzentration an in der ursprünglichen Probe vorliegendem Protein in der Krankheits-Konformation zur Verfügung stellt (siehe Beispiel 11).
UNTERSCHEIDNG (TYPISIERUNG) VON PROTEINSTÄMMEN
Verschiedene Tiere, einschließlich Menschen, können mit verschiedenen Stämmen von pathogenen Proteinen infiziert werden. Eine "Mutationstabelle" ist hier zur Verfügung gestellt, um einige der verschiedenen Mutationen aufzulisten, die mit verschiedenen Stämmen von Prion-Infektionen verbunden sind. Hin und wieder kann es wichtig sein, welcher spezifische Stamm ein Individuum infiziert hat, da solche Information nützlich sein können im (1) Zur-Verfügung-Stellen einer genaueren Diagnose, (2) Applizieren der geeigneten Behandlung oder (3) im Bestimmen der Quelle der Infektion durch Abgleichen des Stammes mit einem Stamm in einer möglichen Infektionsquelle.
Der bestimmte Stamm von pathogenem Protein, der eine Infektion verursacht, kann aus zwei Arten von Information, welche unter Verwendung der vorliegenden Erfindung berechnet werden kann, bestimmt werden. Beispiel 11 zeigt, wie die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um die Absolutmenge zu bestimmen, d. h. die Konzentration der Prionen in einer Probe von einer gegebenen Größe. Beispiel 8 zeigt, wie der "Prion-Index" berechnet wird, welcher das Verhältnis von Antikörperbindung an denaturiertes : natives PrP-Protein ist. Ein "Protein-Index" für andere Proteine ist das Verhältnis der Bindung irgendeines Bindungspartners an die denaturierte : native Form des Proteins. In allgemeinen Worten ist der "Prion-Index" einfach eine numerische Charakterisierung der Wirkung, die die Behandlung auf ein Protein hat.
Um den bestimmten Stamm zu bestimmen, muss man zuerst einen Standard für jeden Stamm berechnen. Dies wird getan durch Bestimmen der Wirkung (Prion-Index) einer bestimmten Behandlung auf eine bekannte Menge eines bekannten Stamms. Das kann, wie in 24 gezeigt, aufgetragen werden. Sobald der Standard berechnet ist, kann der Stamm von anderen Proben leicht bestimmt werden – Standards werden bevorzugt als eine Anzahl von verschiedenen Konzentrationen für jeden Stamm berechnet. Um den Stamm einer einfachen Probe zu bestimmen, berechnet man die Konzentration an Protein in der Probe und die Wirkung der Behandlung auf diese Konzentration. Die Ergebnisse werden mit den Standards abgeglichen (wie in 24), um den Stamm zu bestimmen. Beispiel 18 ist ein spezifisches Beispiel davon, in Kombination mit 24 genommen. Die gleiche Konzentration des gleichen Stammes wird durch eine gegebene Behandlung in gleicher Weise betroffen sein. Dennoch wird die gleiche Konzentration von verschiedenen Stämmen durch die gleiche Behandlung verschieden betroffen sein, wodurch es möglich wird, den Stamm zu bestimmen.
KRANKHEITEN VERBUNDEN MIT UNLÖSLICHEN PROTEINEN
Viel der Offenbarung und der spezifischen Beispiele, die hier zur Verfügung gestellt sind, bezieht sich auf die Verwendung des Assays im Zusammenhang mit der Bestimmung der Anwesenheit von PrP^Sc in der Probe. Dennoch kann, wie oben angegeben, der Assay der Erfindung angewendet werden, um die Anwesenheit jeglichen Proteins, welches zwei verschiedene Konformationsformen annimmt, zu bestimmen, eine davon ist mit der Krankheit verbunden. Das Folgende ist eine nicht-begrenzende Liste von Krankheiten mit verbundenen unlöslichen Proteinen, welche zwei oder mehr verschiedene Konformationen annehmen.
Es sollte beachtet werden, dass die oben aufgeführten unlöslichen Proteine jedes eine Anzahl an Varianten oder Mutationen mit einschließt, welche in verschiedenen Stämmen resultieren, welche alle durch die vorliegende Erfindung umfasst werden. Bekannte pathogene Mutationen und Polymorphismen in dem PrP-Gen, bezogen auf Prion-Krankheiten, sind unten angegeben, und die Sequenzen von Mensch, Schafen und Rind sind in US 5,565,186 , erteilt am 15. Oktober 1996, angegeben.
MUTATIONSTABELLE
Es sollte auch beachtet werden, dass solche Proteine zwei verschiedene dreidimensionale Konformationen bei gleicher Aminosäuresequenz haben. Eine Konformation ist mit Krankheitsmerkmalen verbunden und ist im Allgemeinen unlöslich, wohingegen die andere Konformation nicht mit Krankheitsanzeichen verbunden ist und löslich ist. Die Methodologie der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die Krankheiten, Proteine und aufgelisteten Stämme beschränkt.
BESTIMMEN DER β-FALTBLATTFORM VON βA4
Ein Aspekt der Erfindung beinhaltet ein Zwei-Schritt-Verfahren, um Alzheimer-Krankheit zu diagnostizieren, basierend auf der Anwesenheit einer zusammengezogenen Form eines Proteins (βA4-Amyloidose) durch quantitatives Messen der β-Faltblattform von βA4-Protein in dem Probenmaterial, z. B. in dem Gehirn oder in Körperflüssigkeiten. Die Probe wird in zwei Aliquots geteilt. Das erste Aliquot wird in nativer Konformation durch einen chemischen Aktivierungsschritt unter nicht-denaturierenden Bedingungen mit einem festen Kunststoff (langkettiges Polymer-Material)-Träger vernetzt. Der zweite Teil der Probe wird erst einer Entfaltungsbehandlung unterzogen und dann mit dem Kunststoffträger vernetzt. Beide Teile des Probenmaterials reagieren in situ mit den markierten Antikörpern, die bevorzugt lösliches βA4 oder Entfaltungs-behandeltes βA4 vom Mensch oder einer gegebenen Tierart erkennen. Die Menge an Antikörper, gebunden an gefal tete oder native Konformationen von βA4-Protein wird durch das Signal des markierten zweiten Antikörpers erfasst. Der Überschuss an Signal, erhalten mit der Entfaltungs-behandelten Probe, verglichen mit der erwarteten Veränderung in dem Signal, erhalten mit der nativen α-helikalen Konformation von βA4-Protein, ist das Maß für die Menge an β-Faltblatt-strukturiertem βA4 in der ursprünglichen Probe. Die Formel, die entwickelt wurde, um den βA4-Gehalt zu berechnen, wird oben in Verbindung mit der Berechnung des PrP^Sc-Gehalts zur Verfügung gestellt.
Die Diagnose von βA4-Amyloidose (Alzheimer-Krankheit) wird durch drei Verfahren begründet : (1) Messen der denaturierten Probe alleine und durch Bestimmen des Anstiegs an Gesamt- βA4-Gehalt (Konzentration) in der untersuchten Probe über den Hintergrund-Levels von löslichem βA4, erhalten aus normalen Kontrollen; (2) Berechnung des Verhältnisses zwischen dem Entfaltungsbehandelten gegen nativen Signal für gegebene Antikörper (Protein-Index)–z. B. Werte, die höher sind als 2 für den monoklonalen Antikörper 6F3D und Europium-markierten zweiten Antikörper; (3) Beurteilung der Veränderung des Signals der denaturierten Probe über die erwartete Veränderung in dem Signal für die αhelikale Konformation von βA4 hinaus als ein Maß für die Menge an infektiösem β-Faltblatt-strukturiertem βA4 in der ursprünglichen Probe. Die Formel, die für die Berechnung des βA4-Gehalts entwickelt wurde, ist oben angegeben. Der jeweilige Stamm von βA4 kann auch unter Verwendung der gleichen Methodologie wie oben zur Bestimmung des Stamms von PrP^Sc in der Probe beschrieben, bestimmt werden.
Die Erfindung stellt ein direktes Diagnoseverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von pathogenen Formen von βA4-Protein in Arzneimitteln, Biopsie- oder Autopsie-Gewebe, Gehirn, Rückenmark, periphere Nerven, Muskel, Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Blut und Blutkomponenten, Lymphknoten und in von Tier oder Mensch abgeleiteten Kulturen, die βA4-Protein exprimieren oder potenziell exprimieren, zur Verfügung. Die Erfindung ermöglicht auch, der α-Helix zu β-Faltblatt-Konformationsübergang von βA4-Protein oder seinen Fragmenten von synthetischem oder rekombinantem Ursprung zu folgen, und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um Verbindungen auf ihre Fähigkeit hin, die normale lösliche Konformation von βA4-Protein zu stabilisieren, zu screenen, und so die Umwandlung in pathogenes, unlösliches und β-Faltblatt-strukturiertes βA4-Protein zu verhindern.
Typische Verfahren zur Proben-Denaturierung enthalten: (1) physikalische, z. B. hydrostatischer Druck und Temperatur, (2) chemische, wie z. B. saurer oder basischer pH, chaotrope Salze oder denaturierende Detergenzien, und (3) eine Kombination der obigen. Verfahren zur chemischen oder Affinitäts-Bindung von βA4-Protein an einen Kunststoffträger sind in verfügbarer Literatur beschrieben und können variieren. Antikörper, die in diesem Diagnose-Assay verwendet werden, können polyklonal; monoklonal oder rekombinantes Fab sein und müssen artspezifisch sein, mit bevorzugtem Binden an die lösliche oder denaturierte Form von βA4 mit bevorzugt mindestens zweifachem Unterschied in der Reaktivität zwischen α-helikalem und β-Faltblatt-strukturiertem βA4 annehmend die gleiche Menge an Antigen.
Verfahren zum Anheften der Probe an den Kunststoffträger können variieren und können kovalent oder nicht-kovalent sein, wie in verfügbarer Literatur beschrieben. Die Sensitivität des in den Beispielen beschriebenen Assays kann durch Verwendung von Hoch-Affinitätsantikörpern, Sandwich-Formaten, Immunopräzipitation oder differentialer Zentrifugation erhöht werden. Dennoch sollen nur Antikörper mit einer mindestens zweifachen Affinität für Entfaltungs-behandelte, verglichen mit der nativen β-Faltblatt-Konformation von βA4 der gleichen Art für den diagnostischen Assay verwendet werden. Die Verfahren der Antikörper-Generierung, Aufreinigung, Markierung und Bestimmung können variieren. Das Antikörper-Binden an verschiedene Konformationen von βA4-Protein wurde durch Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz gemessen. Dennoch kann das System zur Bestimmung von βA4-gebundenem IgG an einem festen Träger in situ oder in Lösung variieren, und kann direkte oder indirekte im munologische Verfahren verwenden, einschließlich direkte Radiomarkierungen, Fluoreszenz, Lumineszenz; Avidin-Biotin-Amplifikation oder Enzym-verbundene Assays mit Farb- oder Lumineszenz-Substraten.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden vorgelegt, um auf diese Weise Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung davon, wie man Assays der vorliegenden Erfindung herstellt und verwendet, zur Verfügung zu stellen, und sind nicht dazu gedacht, den Bereich davon, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, einzuschränken, noch sind sie dazu gedacht, zu zeigen oder zu implizieren, dass die nachstehenden Beispiele alle oder die einzigen durchgeführten Experimente sind. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Sorgfalt und Genauigkeit im Hinblick auf die verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, etc.) sicherzustellen, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten in Betracht gezogen werden. Sofern nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, Molekulargewicht ist mittlere Molmasse, Temperatur ist in Grad Celsius und Druck ist bei oder nahe Atmosphärendruck.
BEISPIEL 1
EXPRESSION VON REKOMBINANTEN PRION-PROTEINEN
Für die Entwicklung und die Kalibrierung der Diagnose-Assays wurden rekombinante Syrische-Hamster-Prion-Proteine der Sequenz 90–231 wie beschrieben in αhelikale und β-Faltblatt-Konformationen rückgefaltet [Mehlhorn, Groth et al. (1996) Biochemistry 35: 5528–5537]. PCR (Perkin-Elmer) wurde verwendet, um die DNA, die verschiedenen Teilen des Syrischen-Hamster-Prion-Proteins entspricht, zu verstärken, um in E. coli-Sekretionsvektoren zu ligieren. Mehrere 5'-Oligonukleotid-Primer wurden mit einer Mlu-I-Restriktionsstelle innerhalb der C terminalen kodierenden Sequenz des STII-Signal-Peptids [Lee, Moseley et al. (1983) Infect Immun 42: 264–268; Picken, Mazaitis et al., (1983) Infect Immun 42: 269–275] und der anfänglichen Aminosäuren der geeigneten PrP-Sequenz synthetisiert. Ein 3'-Oligonukleotid-Primer entspricht dem 3'-Ende von PrP, ein Stop-Codon und eine Bam-HI-Restriktionsstelle wurden für jeden der 5'-Oligonukleotide verwendet. Die PCR-verstärkten Produkte wurden aufgereinigt, in den vorher mit Mlul/Bam HI verdauten Vektor ligiert, und in DH5a transformiert. Klone, die den PrP-Einsatz enthalten, wurden sequenziert und in den Protease-Defizienten-Expressionsstamm 27C7 (ATCC# 55244) transformiert.
Expression in großem Maßstab wurde wie vorher für andere Proteine beschrieben unter Verwendung eines anderen Mediums durchgeführt [Carter, Kelley et al. (1992) Biotechnology 19: 163–167]; 500 ml einer Über-Nacht-Kultur, gezüchtet in LB-Medium, angereichert mit Ampicillin, wurden in 7 l Fermentationsmedium in einen durchlüfteten 10 l-Fermentor (Braun, Modell E10) inokuliert. Die Zellen wurden bei 37°C mit einer hohen Rührgeschwindigkeit gezüchtet und die Expression wurde durch Phosphat-Aushungerung induziert. Nach 4 Stunden wurde eine 50%ige Glukoselösung mit einer Rate von 1 ml/min hinzugefügt; Glukose-Levels wurden unter Verwendung eines Glukose-Messstabs (Diastix, Miles Inc.) überwacht. Ein pH von 7,4 wurde während des Laufs durch automatisches Hinzufügen von 10% H₂SO₄ oder 24% NH₄OH beibehalten. Das Endvolumen betrug 10 l, in welchem nach 36 h eine OD₆₀₀ von ≥ 100 erreicht wurde. Die E. coli wurden durch Zentrifugieren bei 10.000 × g für 30 min abgeerntet, und die resultierende Paste wurde bei –20°C gelagert.
Zur Aufreinigung wurden 100 g E. coli-Paste in 1 l 25 mM Tris·HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA (Puffer A) resuspendiert. Das wurde bei 10.000 × g für 20 min zentrifugiert und der Überstand, der die löslichen Periplasma-Proteine enthielt, wurde verworfen. Das Pellet wurde in 1 l Puffer A resuspendiert, zweimal durch einen Zelltrenner durchpassiert (Microfluidics International, Modell MF110), und für 1h bei 30.000 × g zentrifugiert, wonach der Überstand verworfen wurde und das Pellet einmal in Puffer A gewaschen wurde und wieder bei 30.000 × g für 1h zentrifugiert wurde. Bei dieser Stufe könnte das Pellet vor einer weiteren Auftrennung bei –20°C gelagert werden. Anschließend wurde es in 8 M GdnHCl/25 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM DTT (Puffer B) aufgelöst und bei 14.000 × g für 20 min zentrifugiert, um die übrigbleibenden, unlöslichen Sachen zu entfernen. Aliquots von 6 ml des Überstands, enthaltend ungefähr 200 mg Gesamtprotein, wurden durch Größenausschluss-Chromatographie (SEC) unter Verwendung einer 26 mm × 60 cm HiLoad Superdex 200-Säule (Pharmacia} aufgetrennt, unter Elution mit 6M GdnHCl/12,5 mM Tris-HCl, pH 8,0/5 mM DTT/1 mM EDTA (Puffer C) bei einer Flussrate von 2 ml/min. Die für das rekombinante Prion-Protein angereicherten Fraktionen wie durch SDS-PAGE identifiziert, wurden zusammengeführt und weiterhin durch Revers-Phase-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) unter Anwendung einer 25 nun × 25 cm C-4-Säule (Vydac) aufgereinigt; Puffer 1: H₂O/0,1% TFA, Puffer 2: Acetonitrol/0,09% TFA, Flussrate S ml/min. Das rekombinante Protein rPrP wurde in Fraktionen gefunden, die 40% Acetonitril enthalten. Falls das SEC-Eluat bei 4°C für mehrere Tage vor der RP-HPLC gelagert wurde, wurde das rekombinante Protein in früheren Fraktionen, die nur 35% Acetonitril enthielten, eluiert.
Proben des reduzierten Proteins und der rückgefalteten oxidierten Form wurden unter Verwendung einer Centricon-Säule (Amicon) mit einem Molekulargewicht-Cut-Off bei 10.000 Da aufkonzentriert. Der Puffer für das reduzierte Protein war 10 mM MES, pH 6,5, wohingegen die oxidierte Form in dem Rückfaltungspuffer wie oben beschrieben aufkonzentriert wurde. Die Konformationen der rückgefalteten oxidierten und reduzierten Formen von SHaPrP90–231-Protein wurden durch Zirkular-Dichroismus (CD)-Spektroskopie bestimmt (1).
BEISPIEL 2
AUFREINIGUNG VON HAMSTER-PrP^c AUS NORMALEM UND PrP^Sc AUS MIT TRABERKRANKHEIT (SCRAPIE)-INFIZIERTEN HAMSTERGEHIRNEN
Beide durch Beispiel 1 hergestellten Proteine wurden als Standards für den Prion-Assay und für die Etablierung des Sensitivitäts- und linearen Bereichs des Diagnoseverfahrens verwendet. Das aufgereinigte Syrische-Hamster-Gehirn-PrP^Sc wurde für die Kalibrierung von Prion-Protein-Bestimmung verwendet und mit Ergebnissen, erhalten von rekombinantem SHaPrP90–231 in α-helikalen und β-Faltblatt- und denaturierten Konformationen, korreliert. Das PrP^c-Protein wurde wie beschrieben mit einigen kleineren Modifikationen aufgereinigt [Pan, Stahl et al. (1992) Protein Sci 1: 1343–1352; Pan, Baldwin et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962–10966]. Proteingehalt wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die Reinheit des PrP^c-Proteins betrug ≥ 95%, wie mit SDS-PAGE, gefolgt durch Silberfärbung und Western, gezeigt.
Standard-Syrisches-Hamster-PrP^Sc wurde aus einem Standard-Pool von mit Traberkrankheit (Scrapie)-Stamm Sc237-infizierten Hamstergehirnen wie beschrieben mit nur kleineren Modifikationen aufgereinigt [Turk, Teplow et al. (1988) Eur J Biochem 176: 21–30]. Die Infektiosität dieses Standards betrug 10^7,3 ID₅₀/ml, wie bestimmt durch einen Inkubationszeit-Assay mit syrischen Hamstern nach intracerebraler Inokulation, und spezifische Infektiosität betrug 10^8,2 ID₅₀/mg von PrP^Sc-Protein. Dennoch kann die spezifische Infekiosität von Charge zu Charge um ± 10^0,5 ID₅₀/mg variieren. Der Proteingehalt wurde durch einen BCA-Assay unter Verwendung von bovinem Serumalbumin als Standard bestimmt. Die Zubereitung wurde als homogen betrachtet mit einer Hauptbande auf der SDS-PAGE nach Silberfärbung und Western Blots.
BEISPIEL 3
SELEKTIONS- MARKIERUNGS- UND BESTIMMUNGSVERFAHREN VON IN DEM ASSAY VERWENDETEN ANTIKÖRPERN
Die Protokolle und Verfahren der Antikörperherstellung und -charakterisierung sind im Allgemeinen anderswo beschrieben [Harlow and Lane (1988) oben: 726]. Die in diesem und in den folgenden Beispielen beschriebenen Daten wurden mit Immunoaffinitäts-aufgereinigtem polyklonalen Antikörper N12 und P3 generiert [Safar, Ceroni et al. (1990) Neurologe 40: 513–517; Rogers, Serban et al. (1991) J Immunol 147: 3568–3574], hergestellt gegen synthetische Peptide, die der Sequenz 90–145 (N12) und 222–231 (P3) von Syrischem-Hamster-PrP entsprechen [Barry, Vincent et al. (1988) J Immunol 140: 1188–1193]; JS2 gegen denaturiertes Syrisches-Hamster-PrP 27–30 [Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40: 513–517]. Die Entwicklung und Eigenschaften des in diesem Assay verwendeten monoklonalen Antikörpers 3F4 sind anderswo beschrieben [Kascsak, Rubenstein et al. (1987) J Virol 61: 3688–3693] und sind in US 4,806,627 beschrieben, alle von diesen sind durch Bezugnahme aufgenommen, um Antikörper, die mit der Erfindung und Verfahren, um diese und ähnliche Antikörper herzustellen, zu offenbaren und zu beschreiben. Das rekombinante Fab, das denaturierte Formen von Prion-Proteinen erkennt, wurde gerade erst entwickelt [Williamson, Peretz et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 7279–7282].
SHaPrP90–231 in α-helikalen, β-Faltblatt- und zufällig gewendelten Konformationen wurden kovalent an Glutaraldehyd-aktivierte Polystyrolplatten angehängt und mit serienmäßig verdünntem Primärantikörper inkubiert. Die Menge an IgG, die mit jeder Konformation von SHaPrP90–231 reagiert, wurde entweder direkt mit Eu-markiertem 3F4 IgG bestimmt, oder indirekt mit Europium-markiertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Antikörper, gemäß normalen Protokollen, und das Gesamtsignal wurde durch Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz bestimmt. Zur Entwicklung des Assays wurden Antikörper mit einem Signalverhältnis von denaturierter zu β-Faltblatt-Konformation von SHaPrP90-231 gleich oder höher als 4 ausgewählt.
BEISPIEL 4
KOMPETITIVES UND DIREKTES ASSAY-FORMAT
Aufgereinigtes rekombinantes SHAPrP90–231, rückgefaltet in eine α-helikale oder β-Faltblatt-Konformation, wurde in 5% (w/v) Hirnhomogenat, erhalten aus einer PrP^0/0-Maus und kein Prion-Protein enthaltend verdünnt. Das Gehirnhomogenat wurde durch drei 30-Sek.-Stöße in einem PowerGen-Homogenator, ausgestattet mit einer wegwerfbaren Plastiksonde in TBS, pH 7,4 enthaltend Proteaseinhibitor-Cocktails (1 mM PMSF; 2 μg/ml Aprotinin und 2 μg/ml Leupeptin), hergestellt und bei 5°C für 5 min bei 500 G in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde 1 : 1 in TBS verdünnt mit End- 4% (w/v) Sarcosyl, und wiederum durch drei 30-Sek.-Stöße in einem PowerGen-Homogenator homogenisiert. Als Nächstes wurde das Homogenat mit verschiedenen Verdünnungen von rekombinantem SHaPrP 90–231 in α-helikalen oder β-Faltblatt-Konformationen geimpft (Vorbehandlung).
In einem typischen kompetitiven Assay wird der Analyt PrP in verschiedenen Konformationen mit Europium-markiertem 3F4 IgG vorinkubiert, und dann auf die Polystyrolplatte, beschichtet mit rekombinantem SHAPrP 90–231 in SDS-denaturiertem Zustand transferiert. Ergebnisse für den Analyt SHaPrP 90–231 in α-helikalem und denaturiertem Zustand (2) zeigen einen bestimmten Unterschied in beiden, den verfügbaren Bindungsstellen und der Affinität von Europium-markiertem 3F4 IgG, mit verschiedenen Konformationen des Prion-Proteins an.
Im direkten Assay wurde jede Probe der Verdünnungskurve in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandelt und nativ benannt; (2) gemischt mit End- 4M GdnHCl und erhitzt auf 100°C für 5 min und denaturiert (Entfaltungs-Behandlung) benannt. Beide Proben wurden 20-fach mit H₂O verdünnt und die Aliquots wurden auf Polystyrolplatte, aktiviert mit Glutaraldehyd, geladen. Die Platten, inkubiert über Nacht bei 5°C, wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween® 20 gewaschen und mit Europium-markierten Antikörpern, oben angegeben, inkubiert. Die Platten wurden nach zusätzlich sieben Waschschritten in Verstärkungslösung, zur Verfügung gestellt von dem Europium-Marker-Zulieferer (Wallac Inc., Turku, Finnland), entwickelt, und das Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt.
BEISPIEL 5
DIFFERENZIELLER TEST FÜR VERSCHIEDENE KONFORMATIONEN VON SHaPrP90–231
Die Parameter, die aus einem direkten Assay mit Eu-markiertem 3F4 IgG erhalten wurden, wurden als eine Funktion der Konzentration aufgetragen. Die mit SHaPrP90–231 in α-helikaler Konformation (3) erhaltenen Ergebnisse zeigen einen relativ kleinen Unterschied zwischen dem Signal von α-helikalem und denaturiertem Protein an. Die Sensitivitätsgrenze für denaturiertes PrP in Anwesenheit von 5% Gehirnliomogenat ist ≤ 1 ng/ml und der Linearitätsbereich über drei Größenordnungen. In den Experimenten mit der β-Faltblatt-Konformation von SHaPrP90–231 (4) bindet Eu-markiertes 3F4 IgG fest an eine denaturierte Form des Proteins. Dagegen reicht die Reaktivität mit der nativen β-Faltblatt-Form des Proteins nur marginal über den Hintergrund hinaus, sogar bei hohen Proteinkonzentrationen. Wenn die Ergebnisse als ein Verhältnis der Fluoreszenz des denaturierten gegen nativen Zustands des Prion-Proteins ausgedrückt werden (3 und 4), beträgt das Verhältnis für die α-helikale Konformation 1–1,8 und für rekombinantes SHaPrP90–231 in β-Faltblatt-Konformation 5–50.
Diese Wirkung wurde ferner verwendet, um PrP-Proben von unbekannter Konformation zu analysieren, wo der kleine Anstieg an Signal von Eu-markiertem 3F4 IgG nach der Denaturierung von PrP eine Eigenschaft der α-helikalen Konformation ist. Dagegen ist der große Anstieg in dem Signal über der erwarteten Veränderung für α-helikale Konformation diagnostisch für PrP90–231 in β-Faltblatt-Konformation (3 und 4). Die Ergebnisse werden in zwei verschiedenen Formen ausgedrückt: (1) als ein Verhältnis (6), wo der Index ≤ 1,8 für rekombinantes SHaPrP90–231 anzeigt, dass das Protein ursprünglich in einer gesamten α-helikalen Konformation war, und der Index > 1,8 zeigt an, dass β-Faltblatt-Konformation anwesend ist; (2) als eine Formel, hier gezeigt und dargestellt in Beispiel 11, wo der überschüssige Anstieg an Signal über dem erwarteten für α-helikale Konformation proportional ist zu dem Betrag von SHaPrP90-231 in β-Faltblatt-Konformation.
BEISPIEL 6
QUANTITATIVER ASSAY FÜR REKOMBINANTES SHaPrP90–231 UND PrP^c
Die Eingabe/Ausgabe-Kalibrierung für denaturiertes SHaPrP90–231 in beiden, sowohl α-helikaler als auch β-Faltblatt-Konformation, war innerhalb dreier Größenordnungen linear, und stellt einen hohen Konfidenzgrad (5) für den Assay zur Verfügung. Auch getestet wurde PrP^c, seriell verdünnt in PrP^0/0-Maus-Homogenat, was Ergebnisse mit einem hohen Konfidenzgrad innerhalb eines linearen Bereichs von drei Größenordnungen zur Verfügung stellt. Als Nächstes wurde der Assay durch aufgereinigtes infektiöses PrP^Sc in der Anwesenheit von 5% PrP^0/0 Gehirnhomogenat kalibriert. Die Kalibrierung mit PrP^Sc stellt eine lineare Antwort innerhalb eines ähnlichen Bereiches zur Verfügung.
Unter Verwendung des differenziellen Verfahrens betrug das Verhältnis zwischen dem Signal von denaturiertem gegen nativem Gehirn-PrP^Sc für Eu-markierten monoklonalen 3F4 IgG 2,2 (7), für polyklonalen N12 und P3 1,0. Die Kalibrierung für PrP^Sc ergab ein Verhältnis von ≥ 20 (8) für 3F4 Eu-markiertes IgG, und > 4 für N12- und P3-Antikörper. Unter Verwendung der hier gezeigten entwickelten Formen war das gesamte PrP im vollen Bereich in einer α-helikalen Konformation. Dagegen war die berechnete Menge an PrP^Sc in infektiöser, β-Faltblatt-Konformation wie erwartet nah an der Gesamtmenge von Prion-Protein.
BEISPIEL 7
DIAGNOSE DER PRION-KRANKHEIT, BASIEREND AUF EINEM ANSTIEG VON GESAMT-PRION-PROTEIN OBERHALB PHYSIOLOGISCHER PrP^c-LEVEL
Genaue quantitative Messung von Gesamt-PrP durch ausschließliche Beurteilung des Signals von denaturierter Probe (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfen) ergab einen durchschnittlichen Wert von PrP in 5% normalem Syrischen-Hamstergehirn-Homogenaten von 5,0 ± 0,2 μg/ml (Durchschnittswert ± SEM) (9). Die serielle Verdünnung von mit Traberkrankheit (Scrapie) (Stamm Sc237)-infiziertem Hamstergehirn-Homogenat in PrP^0/0-Mausgehirn-Homogenat ergab Werte von Gesamt-PrP 36,0 ± μg/ml (10), mit breiter Linearität der Messung. Da die einzige bekannte Bedingung für die Akkumulation von Prion-Protein die Akkumulation der infektiösen PrP^Sc-Form ist, sind die angestiegenen Level von Gesamt-PrP in der getesteten Probe hinweisend auf die Anwesenheit von Prionen. Dieser Prion-Assay kann verwendet werden: (1) in direkter Art und Weise in Gehirn, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach der Bestimmung von normalen Kontrollwerten; oder (2) in indirekter Art und Weise durch Bestimmung der Erhöhung von Gesamt-PrP in dem Gehirn von Versuchstieren, intracerebral inokuliert mit Testgewebe, Körperflüssigkeit oder pharmazeutischer Probe, verdächtigt, Prionen zu enthalten.
BEISPIEL 8
DIAGNOSE DER PRION-KRANKHEIT, BASIEREND AUF EINEM ANSTIEG DES SIGNALVERHÄLTNISSES ZWISCHEN DENATURIERTEM GEGEN NATIVEM PrP ("PRION-INDEX")
Das Verhältnis zwischen der Antikörper-Affinität für denaturiertes (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfenes) gegen natives Syrisches-Hamstergehirn-PrP^c-Protein liegt innerhalb des breiten Konzentrationsbereichs für Eu-markiertes 3F4 IgG zwischen 0,8–2,2. Das Verhältnis in dem mit Traberkrankheit (Scrapie)-infizierten Gehirn ist durch den vollen Linearitätsbereich oberhalb dieser Werte (11). Der "Prion-Index" gibt einen relativen Indikator für die Anwesenheit von infektiösem PrP^Sc und so für die Anwesenheit von Prionen. Diese Art und Weise des Prion-Assays kann verwendet werden: (1) in direkter Art und Weise in Gehirn, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach Bestimmung des Index für normale Kontrollen; oder (2) in indirekter Art und Weise durch Bestimmen des angehobenen denaturierten/nativen Prion-Protein-Index in dem Gehirn von Versuchstieren, intracerebral inokuliert mit getestetem Gewebe, Körperflüssigkeit oder pharmazeutischer Probe, verdächtigt, Prione zu enthalten.
BEISPIEL 9
DIAGNOSE DER PRION-KRANKHEIT AUS DIFFERENZIELLEM ASSAY DURCH BERECHNEN DES PrP^Sc-GEHALTS
Unter Verwendung des direkten Assays und der hier zur Verfügung gestellten Formeln, ist in normalem Gehirnhomogenat keine detektierbare Menge an β-Faltblatt-Form von PrP^Sc. Umgekehrt war das meiste des Gesamt-PrP in mit Traberkrankheit (Scrapie)-infiziertem Hamstergehirn infolge der Anhäufung von PrP^Sc (9 und 10). Die Korrelation zwischen dem aus der Formel berechneten Prion-Titer und PrP^Sc hat eine breite Linearität und einen Sensitivitäts-Cutoff von ∼10³ ID₅₀/ml (11). Die Formel gibt einen quantitativen Indikator für die Anwesenheit von PrP-Protein in abnormaler Konformation, welche quantitativ mit dem Prion-Titer korreliert. Diese Art und Weise des Prion-Assays kann verwendet werden: (1) in direkter Art und Weise in Gehirn, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln; oder (2) in indirekter Art und Weise durch Berechnen des PrP^Sc-Gehalts in dem Gehirn von Versuchstieren, intracerebral inokuliert mit getestetem Gewebe, Körperflüssigkeit oder pharmazeutischen Proben, verdächtigt, Prionen zu enthalten. Nach Etablierung einer Eichkurve zwischen PrP^Sc und dem Prion-Titer ist es möglich, den Titer direkt aus dem PrP^Sc-Gehalt zu bestimmen.
BEISPIEL 10
MESSUNG VON α-HELIKALER ZU β-FALTBLATT-UMWANDLUNG VON PrP-PROTEIN IN VITRO, UM DE NOVO PRION-GENERIERUNG UND POTENZIELLE KRANKHEITSTHERAPEUTIKA ZU SCREENEN
Aliquots von einer 100 μg/ml Lösung der α-helikalen Form von rekombinantem SHaPrP90–231 oder SHaPrP29-231 oder entsprechenden rekombinanten oder synthetischen Peptiden des Prion-Proteins werden in 20 mM Acetatpuffer, pH 5,5, für 24 Stunden bei 37°C mit 10^–3 bis 10^–6 M Konzentrationen von Glycerol, Cyclodextrine, Heparin, Heparinsulfat, Kongo Rot (Congo Red), Cholesterolester, Dimyristolphosphatidylcholin inkubiert. Die Proben werden dann in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandeltes, benannt nativ; (2) gemischtes mit End-4M GdnHCl und erhitzt für 5 min bei 100°C, benannt denaturiert (Entfaltungs-Behandlung). Beide Proben werden mit Wasser 20-fach verdünnt und Aliquots werden auf Polystyrolplatte, aktiviert mit Glutaraldehyd, geladen. Die Platten, über Nacht inkubiert bei 5°C, werden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) blockiert. Im nächsten Schritt werden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) von Tween® 20 gewaschen und mit Europium-markiertem 3F4 IgG inkubiert. Die Platten werden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkungslösung, zur Verfügung gestellt durch den Europi um-Marker-Zulieferer (Wallac Inc., Turku, Finnland), entwickelt, und das Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt.
Der Grad an Umwandlung von α-helikaler zu β-Faltblatt-Konformation von PrP wird aus dem "Prion-Index" oder alternativ aus den hier zur Verfügung gestellten Formeln berechnet. Einige Verbindungen, welche die Umwandlung durch offensichtliches Stabilisieren der nativ-ähnlichen Konformation des Prion-Proteins inhibieren, können in vivo therapeutisches Potenzial haben.
BEISPIEL 11 Das Assay-Verfahren wird anhand des folgenden Beispiels mit mit Traberkrankheit (Scrapie)-infiziertem Syrischen-Hamstergehirn-Homogenat gezeigt, vierfach verdünnt in PrP^0/0-Mausgehirn-Homogenat:

a) Jede Platte wird mit einem internen Standard, bestehend aus fünf Verdünnungspunkten von denaturiertem SHaPrP90–231 kalibriert. Zeit-aufgelöste Fluoreszenz (TRF) an Gesamt-PrP wird mit Eu-markiertem 3F4 IgG entwickelt, und die Zeit-aufgelösten Fluoreszenzwerte werden als eine Funktion der PrP-Konzentration aufgetragen (4). Die Daten werden innerhalb einer linearen oder Polynom-Gleichung unter Verwendung der Methode des kleinsten Quadrates eingebaut, und die beste Funktion wird zur Berechnung von denaturiertem PrP ausgewählt: PrP [μg/ml] = –0,22935 + 0,00026567*[TRF] + 0,0000000012255*[TRF]2 (1)
b) Auf dem Rest der Platte wurden native und denaturierte Aliquots von mit Traberkrankheit (Scrapie)-infiziertem Syrischen-Hamstergehirn-Homogenat, vierfach verdünnt, und auf den Kunststoffträger vernetzt, mit Eu-markiertem 3F4 IgG inkubiert. Der Gesamt-PrP-Gehalt wird gemäß der obigen Formel aus dem Fluoreszenzsignal der denaturierten Probe berechnet:
c) Das Verhältnis der Fluoreszenzsignale zwischen denaturierten (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfenen) und nativen Proben wird berechnet:
Der normale Wert von PrP^c, bestimmt aus normalem Hamstergehirn-Homogenat, beträgt 2,2; die Werte über 2,2 werden als abnormal betrachtet und weisen auf die Anwesenheit von PrP^Sc hin.
d) Der Überschuss an Fluoreszenzsignal über dem erwarteten für α-helikales PrP beim Übergang von nativem zu denaturiertem (ungefaltetem) Zustand ist ein Maß der Menge von PrP^Sc und wird gemäß der zur Verfügung gestellten Formeln berechnet: ΔFβn→d = Fd – (Fn * fαn→d) (2)wo f = der maximale Wert des Faktors für das Fluoreszenzsignal beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand von PrP^c ist ; Fa ist die Fluoreszenz der denaturierten (ungefalteten) Probe; und F_n ist die Fluoreszenz der nativen Probe. Die Menge an PrP^Sc wird dann aus ΔF_βn→d und Gleichung (1) berechnet:
Der positive Wert, berechnet für die β-Faltblatt-Form des Prion-Proteins weist auf die Anwesenheit von PrP^Sc hin.

BEISPIEL 12
STANDARDS VON LÖSLICHEN (α-HELIKALEN) UND UNLÖSLICHEN (β-FALTBLATT)-FORMEN VON βA4-PROTEIN
Lösliche Formen von βA4 (1–40) und βA4 (1–42) wurden von Bachem (Torrance, CA) erhalten. Ein Teil des frisch lyophilisierten Peptids wurde in PBS, pH 7,4, enthaltend 20% (v/v) von HFIP (Hexafluorisopropanol; 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2- propanol) oder 1% (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat) bis zu einer Endproteinkonzentration von 50 μM gelöst; dieses Protein wurde "löslich" benannt und bei – 80°C bis zum Gebrauch gelagert. Ein zweiter Teil des Peptids wurde in PBS, pH 7,4, bis zur Endkonzentration von ≥ 350 μM resuspendiert und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser Teil des Proteins wurde "unlöslich" benannt und bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert.
Beide Proteine wurden als Standards für die Assay-Entwicklung und für die Etablierung des Sensitivitäts- und Lineartitätsbereichs verwendet. Die CD (Zirkulardichroismus)-Spektroskopie (12) zeigte, dass lösliches Protein eine αhelikale Konformation hat (siehe die durchgezogene Linie von 12). Dagegen wandelte sich das βA4-Protein, behandelt für 72 Stunden bei 37°C, vollständig in eine β-Faltblatt-Konformation (siehe gestrichelte Linie von 12) um.
SELEKTIONS-MARKIERUNGS- UND BESTIMMUNGSVERFAHREN VON IN DEM ASSAY VERWENDETEN ANTIKÖRPERN
Die Protokolle und Verfahren für die Antikörper-Hestellung und – charakterisierung sind im Allgemeinen anderswo beschrieben [Harlow and Lane (1988) oben: 726]. Die hier beschriebenen Daten und die folgenden Beispiele wurden mit monoklonalem Antikörper 6F3D generiert, entwickelt gegen synthetisches Peptid, das der Human-Sequenz von βA4-Protein entspricht (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). Dennoch können auch polyklonale Antikörper, hergestellt gegen ein synthetisches Analogon vom βA4-Protein, verwendet werden. Rekombinantes Fab, das denaturierte Formen von βA4-Protein erkennt, kann auch verwendet werden.
βA4-Protein in α-helikalen, β-Faltblatt- und zufällig gewendelten Konformationen wurde dann kovalent an die Glutaraldehyd-aktivierten Polystyrol-Platten angeheftet und mit seriell verdünntem primären Antikörper inkubiert. Die Menge an IgG, die mit jeder Konformation von βA4 reagiert, wurde mit Europium-markiertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Antikörper gemäß allgemeinen Protokollen bestimmt, und das Gesamtsignal wurde durch Zeit-aufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz gemessen. Antikörper mit dem Signalverhältnis von denaturiertem (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfenen) gegen β-Faltblatt-Konformation von βA4 von gleich oder höher als 2 wurden ausgewählt, um den Assay zu entwickeln.
DIREKTES UND KOMPETITIVES ASSAY-FORMAT
In einem direkten Assay, wurde jede Probe der Verdünnungskurve von α-helikalen und β-Faltblatt-Formen von βA4-Protein in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandelt (benannt nativ); und (2) gemischt mit End-4M GdnHCl/1% Sarcosyl, und erhitzt auf 100°C für 5 min (benannt "denaturiert", bedeutend, dass es einer Entfaltungs-Behandlung unterworfen war). Beide Proben wurden 20-fach mit H₂O verdünnt und Aliquots wurden auf Polystyrol-Platten, aktiviert mit 0,2% Glutaraldehyd für 2 Stunden, geladen. Die Platten, inkubiert über Nacht bei 5°C, wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v), blockiert. Die Proben wurden dann dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween® 20, gewaschen, und mit einem Primär-Antikörper gegen βA4-Protein inkubiert (6F3D, Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). Die Proben wurden gewaschen und dann mit Europium-markiertem, sekundären Antikörpern gegen Maus-IgG entwickelt (Wallac Inc., Turku, Finnland). Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkungslösung (Wallac Inc., Turku, Finnland) entwickelt, und das Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt. Die Ergebnisse für den Analyt weisen auf einen merklichen Unterschied in beidem, der verfügbaren Bindungsstellen- und Affinitäts-Anti-βA4-IgG mit verschiedenen Konformationen von βA4-Protein hin.
Das Verfahren konnte unter Verwendung eines kompetitiven Assays ausgeführt werden, wo der Analyt βA4 in verschiedenen Konformationen mit Anti-βA4-IgG vorinkubiert wird und dann auf die Polystyrolplatte, beschichtet mit synthetischem βA4-Protein in GdnHCl-denaturiertem Zustand, d. h. ungefaltetes βA4-Protein, transferiert wird.
DIFFERENZIELLER TEST FÜR VERSCHIEDENE KONFORMATIONEN VON βA4
Die aus einem direkten Assay mit 6F3D-Anti-βA4-IgG erhaltenen Parameter wurden als eine Funktion der Konzentration aufgetragen. Die mit βA4 in β-helikaler Konformation erhaltenen Ergebnisse (13) zeigen einen großen Unterschied zwischen dem Signal des β-Faltblatts und des denaturierten Proteins. Die Sensitivitätsgrenze für denaturiertes βA4 ist ≤ 1 μg/ml, und der Linearitätsbereich ist über zwei Größenordnungen. In den Experimenten mit der α-helikalen Form von βA4 (14) bindet 6F3D IgG gleich stark an sowohl die nativen als auch denaturierten Formen des Proteins. Dagegen überschreitet die Reaktivität mit der nativen β-Faltblatt-Form des Proteins nur marginal den Hintergrund, sogar bei hohen Proteinkonzentrationen. Wenn die Ergebnisse als ein Verhältnis der Fluoreszenz des denaturieren gegen nativen Zustands von βA4 ausgedrückt werden (15), ist das Verhältnis für die α-helikale Konformation ≤ 1 und für βA4 in Faltblatt-Konformation ist das Verhältnis in einem gegebenen Konzentrationsbereich ≥ 1,5.
Dieser Effekt wurde ferner verwendet, um βA4-Proben von unbekannter Konformation zu analysieren, wo der schmale Anstieg im Signal von Eu-markiertem 3F4 IgG nach der Denaturierung von βA4 eine Eigenschaft der α-helikalen Konformation ist. Dagegen ist der starke Anstieg des Signals über die erwartete Änderung für eine α-helikale Konformation hinaus diagnostisch für die β-Faltblatt-Konformation (15). Die Ergebnisse können in zwei verschiedenen Formen ausgedrückt werden: (1) als ein Verhältnis (15), wo der Index ≤ 1,0 für βA4 anzeigt, dass das Protein ursprünglich in einer gesamt-α-helikalen Konformation vorlag, und der Index > 1,5 die Anwesenheit von β-Faltblatt-Konformation anzeigt; (2) durch die oben gezeigte Formel, wo der überschüssige Anstieg an Signal über den für α-helikale Konformation erwarteten proportional zu der Menge an βA4 in β-Faltblatt-Konformation ist.
BEISPIEL 13
DIAGNOSE VON ALZHEIMER-KRANKHEIT. BASIEREND AUF DEM ANSTIEG VON GESAMT-βA4-PROTEIN ÜBER PHYSIOLOGISCHE LEVEL HINAUS
Genaue quantitative Messung von Gesamt-βA4 durch ausschließliches Beurteilen des Signals von denaturierter Probe ist offensichtlich viel genauer als die Messung von βA4 in nativer Konformation (13 und 14). Der normale Wert des Proteins kann einen signifikanten Teil der β-Faltblatt-Form von βA4-Protein infolge geringerer Reaktivität dieser Form mit Antikörpern verbergen. Da die einzige bekannte Bedingung zur Akkumulation von βA4-Protein die Akkumulation der β-Faltblatt-Form von βA4 in den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist, weisen die erhöhten Level von Gesamt-βA4 in der getesteten Probe auf die Anwesenheit von pathogenen Formen von βA4 hin. Dieser βA4-Assay kann in Gewebe, Körperflüssigkeiten oder pharmazeutischer Probe, verdächtigt, β-Faltblatt-Formen von βA4 zu enthalten, verwendet werden.
DIAGNOSE VON ALZHEIMER-KRANKHEIT, BASIEREND AUF DEM ANSTIEG DES SIGNALSVERHÄLTNISSES ZWISCHEN DENATURIERTEM GEGEN NATIVEM βA4 ("βA4-AMYLOID-INDEX")
Das Verhältnis zwischen der Antikörper-Affinität für denaturiertes (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfenes) gegen natives humanes βA4-Protein ist in dem breiten Konzentrationsbereich für 6F3D IgG zwischen 0,8 bis 1,0. Das Verhältnis für β-Faltblatt-βA4 ist durch den vollen linearen Bereich überhalb dieser Werte (15). Der "βA4-Amyloid-Index" gibt einen relativen Indikator für die Anwesenheit von pathogenem, unlöslichem β-Faltblatt-βA4 an. Diese Art und Weise des βA4-Assays kann in direkter Weise in Gehirn, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach der Bestimmung des Index für normale Kontrollen verwendet werden.
DIAGNOSE VON ALZHEIMER-KRANKHEIT AUS DIFFERENZIELLEM ASSAY DURCH BERECHNUNG DES βA4-GEHALTS
Unter Verwendung des direkten Assays und der oben gezeigten Formel kann die Menge an pathogenen Formen von β-Faltblatt-βA4-Protein in Gehirn, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln berechnet werden.
BEISPIEL 14
MESSUNG VON α-HELIX ZU FALTBLATT-UMWANDLUNG VON βA4-PROTEIN IN VITRO, UM POTENZIELLE KRANKHEITSTHERAPEUTIKA ZU SCREENEN
Die Aliquots einer 350 μM-Lösung der α-helikalen Form von synthetischem βA4 (1–40), oder entsprechende rekombinante oder synthetische Peptide von dem βA4-Protein werden in PBS, pH 7,4, für 72 Stunden bei 37°C mit 10^–3–10^–6 M Konzentrationen von Glycerol, Cyclodextrinen, Heparin, Heparinsulfat, Kongorot, Cholesterolester, Dimyristylphosphatidylcholin, inkubiert. Die Proben werden dann in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandelt, enthaltend 1% Sarcosyl und benannt "nativ"; und (2) gemischt mit End-4M GdnHCl/1% Sarcosyl und erhitzt auf 100°C für 5 min, benannt "denaturiert", bedeutend, dass es Entfaltungs-Behandlung unterworfen wurde. Beide Proben werden 20-fach mit H₂O verdünnt, und die Aliquots werden auf eine Polystyrolplatte, aktiviert mit Glutaraldehyd, geladen. Die Platten, inkubiert über Nacht bei 5°C, wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween® 20, gewaschen und mit 6F3D IgG inkubiert und dann mit Eu-markiertem Anti-Maus-Antikörper. Die Platten wurden nach zusätzlichen 7 Waschschritten in Verstärkungslösung entwickelt und Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland), gezählt.
Der Grad an Umwandlung von α-helikaler zu β-Faltblatt-Konformation von βA4 wird aus dem "Amyloid-Index" berechnet (15) oder alternativ aus der oben gezeigten Formel. Jegliche Verbindung, welche die Umwandlung durch Stabilisierung der α-helikalen Konformation von βA4-Protein inhibiert, kann therapeuti- sches Potenzial in vivo haben durch Verhinderung der Bildung von maturem Amyloid.
BEISPIEL 15
STANDARDS VON NORMALEN UND AMYLOIDEN FORMEN VON TTR
Lösliche Formen von TTR wurden von Sigma Chemical Comp. erhalten. Ein Teil des Proteins wurde in 100 mM KCl-Puffer, pH 7,4, bis zu einer Endproteinkonzentration von 0,5 mg/ml solubilisiert; dieses Protein wurde "nomal" benannt und bei –80°C bis zum Gebrauch gelagert. Der zweite Teil des Proteins wurde wie beschrieben in Amyloid umgewandelt [Lai, Colon et al. (1996) Biochemistry 35 (20): 6470–82]. Kurz gesagt, wurde das Protein in 100 mM KCl-Puffer, enthaltend 50 mM Natriumacetat, pH 4,4, bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml resuspendiert und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser Teil des Proteins wurde "Amyloid" benannt und wurde bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert. Der Trübungsmessungs- und Kongorot-Bindungsassay verifizierten die effiziente Umwandlung in Amyloid [Lai, Colon et al. (1996) Biochemistry 35 (20): 6470–82]. Beide Proteine wurden als Standards für die Assay-Entwicklung und um den Sensitivitäts- und Linearitätsbereich zu etablieren, verwendet.
DIREKTES ASSAY-FORMAT
Die Protokolle und Verfahren, um Antikörper herzustellen und zu charakterisieren, sind im Allgemeinen anderswo beschrieben. Die Daten, die hierin und in den folgenden Beispielen beschrieben sind, wurden mit kommerziell erhältlichem polyklonalem Antikörper generiert, entwickelt gegen aufgereinigtes humanes TTR (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY).
Im direkten Assay wurde jede Probe von Protein, genommen aus der Verdünnungskurve von normalen und amyloiden Formen von TTR, in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandelt und benannt "nativ"; (2) gemischt mit End-4M GdnHCl/1% Sarcosyl und erhitzt auf 100°C für 5 min und benannt "denaturiert" (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfen). Beide Proben wurden 20-fach mit Wasser verdünnt, und die Aliquots wurden auf Polystyrolplatte, aktiviert mit 0,2% Glutaraldehyd für 2 Stunden, geladen. Die Platten, inkubiert über Nacht bei 5°C, wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween 20 gewaschen und mit primären Antikörpern gegen TTR inkubiert (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY), gewaschen, und dann mit Europium-markierten sekundären Antikörpern gegen Kaninchen-IgG entwickelt (Wallac Inc., Turku, Finnland). Die Platten wurden nach zusätzlichen 7 Waschschritten in Verstärkungslösung entwickelt und das Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc, Turku, Finnland) gezählt.
BEISPIEL 16
DIAGNOSE VON SSA UND FAP BASIEREND AUF EINEM ANSTIEG DES SIGNAL-VERHÄLTNISSES ZWISCHEN DENATURIERTEM GEGEN NATIVEM TTR ("TTR-AMYLOIDER INDEX")
Das Verhältnis zwischen der Antikörper-Affinität für denaturierte (ungefaltete) gegen native Form von normalem humanem TTR ist in dem breiten Konzentrationsbereich für polyklonalen Antikörper 1–3 : 3. Das Verhältnis für die amyloide Form von TTR ist durch den vollen linearen Bereich zwischen 0,7–1,0 (18). Der "TTR-Amyloide Index" gibt einen relativen Indikator für die Anwesenheit von pathogenem, unlöslichem und Amyloid-bildendem TTR. Diese Art und Weise des TTR-Assays wird in direkter Art und Weise in Gehirn, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach Bestimmung des Index für normale Kontrollen verwendet.
DIAGNOSE VON SSA UND FAP AUS DIFFERENZIELLEM ASSAY DURCH BERECHNUNG DES TTR-AMYLOIDEN GEHALTS
Unter Verwendung der direkten Assay-Formel (19) kann der Gehalt an amyloider Form von TTR in peripherem Nerv, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln berechnet werden. In der Formel (19) ist der niedriger als erwartete Anstieg an Signal für die normale Konformation proportional zu der Menge an TTR-amyloider Konformation.
BEISPIEL 17
MESSUNG VON NORMALER ZU AMYLOIDER UMWANDLUNG VON TTR IN VITRO, UM DIE POTENZIELLEN KRANKHEITSTHERAPEUTIKA ZU SCREENEN
Die Aliquots von einer 0,2 mg/ml Lösung von normaler Form von synthetischem TTR oder korrespondierende rekombinante oder synthetische Peptide von TTR sind in 100 mM KCl-Puffer, enthaltend 50 mM Natriumacetat, pH 4,4, für 72 Stunden bei 37°C mit 10^–3 bis 10^–6 M Konzentrationen von getesteten organischen Verbindungen inkubiert. Die Proben werden dann in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandelt, enthaltend 1% Sarcosyl und benannt "nativ"; (2) gemischt mit End-4M GdnHCl/1% Sarcosyl und erhitzt auf 100°C für 5 min, benannt "denaturiert". Beide Proben werden 20-fach mit Wasser verdünnt, und Aliquots werden auf eine Polystyrolplatte, aktiviert mit Glutaraldehyd, geladen. Die Platten, inkubiert über Nacht bei 5°C, werden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) blockiert. Im nächsten Schritt werden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween® 20 gewaschen und mit polyklonalem Anti-TTR-Antiköper inkubiert (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY), und dann mit Eu-markiertem Anti-Kaninchen-Antikörper. Die Platten werden nach zusätzlichen 7 Waschschritten in Verstärkungslösung entwickelt, und das Signal auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt.
Der Grad an Umwandlung von normaler zu amyloider Konformation von TTR wird aus dem "Amyloid-Index" (18) berechnet oder alternativ aus der Formel (19). Jegliche Verbindung, welche die Umwandlung durch Stabilisierung der normalen Konformation von TTR inhibiert, kann in vivo durch Verhinderung der Bildung von maturem Amyloid therpeutisches Potenzial haben.
BEISPIEL 18
TYPISIERUNG VON PRION-ISOLATEN (STÄMMEN) IN SYRISCHEN HAMSTERN
Syrische Hamster (LVG/LAK) wurden durch intracerebrale Injektion der folgenden Hamster-adaptierten Traberkrankheit (Scrapie)-Isolate infiziert, d. h. wurden verschiedene Gruppen von Hamstern mit individuellen Stämmen von Prionen wie folgt infiziert: Drowsy (Dy), 139H, Hyper (Hy), Me7, MT-C5 und Sc237. Die Tiere wurden in terminalen Stadien der Krankheit euthanasiert und ihre Gehirne wurden sofort gefroren und bei –70C gelagert. Die Gehirne wurden auf Eis durch 3 × 30 sek. Schläge eines PowerGen-Homogenisators (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) in PBS, pH 7,4, enthaltend Protease-Inhibitor-Cocktail (PMSF 5mM, Aprotinin und Leupeptin 4 μg/ml) homogenisiert. Resultierende 10% (w/v) Homogenaten wurden für 5 min bei 500 g mit einer Tischzentrifuge zentrifugieren. Der Überstand wurde 1 : 1 mit 4% Sarcosyl in PBS, pH 7,4, gemischt, und in zwei Aliquots geteilt: (1) unbehandelt und benannt nativ; (2) gemischt mit einer End konzentration von 4M GdnHCl und für 5 min auf 80–100°C erhitzt und benannt denaturiert–einer Entfaltungs-Behandlung unterzogen. Beide Proben wurden 20-fach mit H₂O verdünnt, und Aliquots wurden auf eine Polystyrol-Platte, aktiviert für 1 Stunde mit 0,2% Glutaraldehyd in PBS, geladen. Die Platten, inkubiert über Nacht bei 5°C, wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween 20 gewaschen, und für 2 Stunden mit Europiummarkiertem monoklonalem Antikörper 3F4 inkubiert. Die Platten wurden nach zusätzlichen 7 Waschschritten in Verstärkungslösung zur Verfügung gestellt durch den Europium-Marker-Zulieferer (Wallac Inc., Turku, Finnland), entwickelt und das Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt. Der PrP^Sc-Gehalt und "Prion-Index" (Verhältnis von Antikörper-Bindung an (ungefaltet) denaturiertes : natives PrP-Protein) wurde wie in den Beispielen 11 und 8 beschrieben, berechnet, und in xy-Koordinaten, wie in 24 gezeigt, aufgetragen. Von anderen getesteten und in den gleichen Berechnungen resultierenden Proben konnte angenommen werden, dass sie den gleichen Prion-Stamm haben.
BEISPIEL 19
PRION-STÄMME
Syrische Hamster (LVG:Lak) wurden durch intracerebrale Injektion der folgenden Hamster-adaptierten Traberkrankheit (Scrapie)-Isolate infiziert: Drowsy (DY), 139H, Hyper (HY), Me7-H, MT-C5, Sc237, SHa(Me7) und SHa(RML). Der in Marsh et al., J. Infect. Dis., 131: 104–110 (1975) beschriebene Sc237-Stamm wurde wiederholt in goldenen syrischen Hamstern (LVG:Lak, Charles River Laboratories) passagiert. Dieser Stamm scheint vom Stamm 263K unterscheidbar zu sein (siehe Kimberlin et al., J. Gen. Virol, 34: 295–304 (1977)). Der MT-C5-Stamm wurde in syrischen Hamstern (LVG.Lak) aus einer Kuh, infiziert mit einer zweiten Passage von Schaf-Traberkrankheit (Scrapie) (siehe Hebbs et al., Bovine Spongeform Encephalophaty: The BSE Dilemma, 84–91 (Springer, NY 1996)), isoliert. Für das Me7-Hamsterisolat siehe Kimberlin et al. Die DY- und HY-Hamsterstämme sind in Marsh et al., J. Gen. Virol., 72: 589–594 (1991) offenbart. Das 139A-Isolat wurde nach über 20 Passagen des Chandler-Isolats in Mäusen (siehe Dickenson et al., Slow Virus Disease of Animals in a Man (ed. Kimberlin, RH) 209–241 (North Holland Pub. Amsterdam 1976)) erhalten. Passage von Maus-139A-Prionen in LVG-Lak goldenen syrischen Hamstern produzierte das 139H-Isolat (Kimberlin et al., Micro. Pathogl, 2: 405–415 (1987)). Nach sechs Passagen in syrischen Hamstern waren die 139H-Prione genau so wie durch Kimberlin et al. Die Stämme SHa(Me7) und SHa(RML) wurden durch Passage des Me7-Stammes von Traberkrankheit (Scrapie) durch chimäre Tg(MH2M) generiert und dann zweimal in syrischen Hamstern (Scott et al., J. Virol., 71: 9032–9044 (1997)).
Die Tiere wurden in den terminalen Stadien der Krankheit euthanasiert und ihre Gehirne wurden sofort gefroren und bei –70°C gelagert. Die Gehirne wurden auf Eis durch drei 30-sek. Schläge eines PowerGen-Homogenisators (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) in PBS, pH 7,4, enthaltend Protease-Inhibitoren (5 mM PMSF; Aprotinin und Leupeptin, jedes 4 μg/ml) homogenisiert. Die resultierenden 10%-igen (w/v) Homogenate wurden für 5 min bei 500 g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert; der Überstand wurde 1 : 1 mit 4% Sarcosyl in PBS, pH 7,4, gemischt.
Prion-Bioassays
Der Titer von Sc237-Prionen wurde in 5% (w/v) Gehirn-Homogenat durch Inkubationszeit-Assay und Gruppen von vier syrischen Hamstern wie in Prusiner et al. Cell, 35: 349–358 (1983) bestimmt.
BEISPIEL 20
EXPRESSION, AUFREINIGUNG UND RÜCKFALTUNG VON REKOMBINANTEM SHaPrP(90–231)
Für die Entwicklung und Kalibrierung von Konformations-abhängigen Immunoassays wurde rekombinantes SHaPrP(90–231) in α-helikale oder β-Faltblatt-Konformationen wie in (Mehlhorn et al., Biochemistry, 35: 5528–5537 (1996)) rückgefaltet. PCR (Perkin-Elmer) wurde verwendet, um die DNA, die verschiedenen Teilen von SHaPrP entspricht, für die Ligation in Escherichia coli-Sekretionsvektoren zu verstärken. Klone, die das PrP-Insert enthielten, wurden sequenziert und in den Protease-defizienten Expressionsstamm 27C7 (ATCC# 55244) transformiert. Für die Aufreinigung wurden 100 g E. coli-Paste in 1 l 25 mM Tris-HCl, pH 8,0/5 mM EDTA (Puffer A) resuspendiert. Dies wurde bei 10.000 × g für 20 min zentrifugiert, und der Überstand, enthaltend lösliche periplasmatische Proteine, wurde verworfen. Das Pellet wurde in 1 1 Puffer A resuspendiert, durch einen Zellteiler (Microfluidics International, Modell MF110) passiert, und bei 30.000 × g für 1 Stunde zentrifugiert, danach wurde der Überstand verworfen und das Pellet wurde einmal in Puffer A gewaschen und wieder bei 30.000 g für 1 Stunde zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 8 M GdnHCl/25 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM DTT (Puffer B) solubilisiert, und Aliquots von 6 ml des Überstands, enthaltend ungefähr 200 mg Gesamtprotein, wurden durch Größenausschluss-Chromatographie (SEC) aufgetrennt, gefolgt durch Revers-Phase-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung einer 25 mm × 25 cm C-4-Säule (Vydac) getrennt; Puffer 1; H₂O/0,1 % TFA, Puffer 2; Acetonitril/0,09% TFA, Flussrate 5 mL/min.
Proben des reduzierten Proteins und der rückgefalteten oxidierten Form wurden unter Verwendung einer Centricon (Amicon) mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10.000 Da konzentriert. Der Puffer für das reduzierte Protein war 10 mM MES, pH 6,5, wohingegen die oxidierte Form in dem oben beschriebenen Rückfaltungspuffer konzentriert wurde. Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie auf einem Jasco-720-Spektropolarmeter, wie beschrieben in Safar et al., J. Biol. Chem., 268: 20276–20284 (1993), bestätigte, dass das reduzierte Protein sich in eine β-Faltblatt-Konformation rückfaltete, und dass das oxidierte Protein sich in eine α-helikale Konformation rückfaltete.
BEISPIEL 21
AUFREINIGUNG VON SHaPrP^c UND SHaPrP^Sc AUS GEHIRN
SHaPrP^c wurde in einer ähnlichen Art und Weise wie die in Pan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10962–10966 (1993} beschrieben, aufgereinigt. Der Proteingehalt wurde durch Aminosäwe-Analyse bestimmt. Die Reinheit von PrP^c betrug 95%, wie durch SDS-PAGE gefolgt durch Silberfärbung und Western Blot gezeigt.
SHaPrP^Sc wurde aus einem Standardpool von mit Traberkrankheit (Scrapie)-Stamm Sc237-infizierten Hamstergehirnen in einer ähnlichen Art wie in Turk et al., Eur. J. Biochem., 176: 21–30 (1988) beschrieben, aufgereinigt. Die Infektiosiät dieses Pools betrug 7,3 ID₅₀/ml, wie durch einen Inkubationszeit-Assay an syrischen Hamstern nach intracerebraler Inokulation bestimmt, und die spezifische Infektiosität betrug 8,2 ID₅₀/mg PrP^Sc. Die Zubereitung wurde als homogen betrachtet, mit einer Hauptbande auf der SDS-PAGE nach Silberfärbung und Western Blots.
BEISPIEL 22
MARKIERUNG VON ANTIKÖRPERN
Die Daten wurden mit monoklonalem Antikörper 3F4 generiert, beschrieben in Kascsak et al., J. Virol., 61: 3688–3693 (1987). Das IgG wurde aus Ascitesfluid durch Protein-A-Chomatographie auf einer Pharmacia FPLC-Säule aufgereinigt und mit Europium-Chelat von N-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylentriamin-N¹,N²,N³,N³-tetraessigsäure (DTTA) bei pH 9,6 für 16 Stunden bei Raumtemperatur gemäß den Protokollen des Herstellers (Wallac Inc., Turku, Finnland) markiert. Das End-Eu-IgG molare Verhältnis war 13.
BEISPIEL 23
IMMUNOASSAY FÜR PrP^Sc DURCH DISSOZIATIONSVERSTÄRKTE, ZEIT-AUFGELÖSTE FLUORESZENZ-SPEKTROSKOPIE (TRF)
Jede Probe wurde in zwei Aliquots geteilt: i) unbehandelt und benannt nativ und ii) gemischt zu einer Endkonzentration von 4 M GdnHCl, erhitzt für 5 min auf 80 °C, und benannt denaturiert (einer Entfaltungs-Behandlung unterworfen). Beide Proben wurden sofort 20-fach mit H₂O verdünnt, enthaltend Protease-Inhibitoren (5 mM PMSF; Aprotinin und Leupeptin, jedes 4 μg/ml), und die Aliquots wurden auf eine 96-Loch Polystyrol-Platte, die vorher für 1 Stunde mit 0,2% Glutaraldehyd in PBS, pH 7,4, aktiviert wurde, geladen. Die Platten wurden über Nacht bei 5°C inkubiert, und dann mit PBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (w/v) und 6% Sorbitol (w/v) für 2 Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Im nächsten Schritt wurden sie dreimal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (v/v) Tween 20 gewaschen und bei Raumtemperatur für 2 Stunden mit Europium-markierten 3F4-Antikörpern inkubiert. Die Platten wurden nach 7 Waschschritten in Verstärkungslösung, zur Verfügung gestellt durch den Europium-Marker-Zulieferer (Wallac Inc., Turku, Finnland), entwickelt, und das Signal wurde auf einem DELFIA 1234 Fluorometer (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt.
BEISPIEL 24
KALIBRIERUNG DES KONFROMATIONS-ABHÄNGIGEN IMMUNOASSAYS FÜR PrP
Der Assay wurde für verschiedene Konformationen von PrP in der Anwesenheit von 5% (w/v) Gehirn-Homogenat, erhalten von PrP-defizienten (Prep^0/0) Mäusen wie beschrieben in Büehler et al., Nature. 356: 577–582 (1992) kalibriert. Das Homogenat wurde mit aufgereinigtem rekombinanten SHaPrP(90–231) in α-helikalen oder β-Faltblatt-Konformationen, wie bestimmt durch CD-Spektroskopie, eingeimpft, und mit PrP^C und PrP^Sc, aufgereinigt aus SHa-Gehirnen. Die Daten über Antikörper-Bindung an denaturiertes rekombinantes α-helikales SHaPrP(90–231) oder SHa-Gehirn-PrP^c wurden als eine Funktion der Bindung an das native Protein aufgetragen und durch das Regressionsprogramm der kleinsten Quadrate angepasst, um den Korrelationskoeffizienten f_α zu erhalten.
BEISPIEL 25
VERHÄLTNIS DER ANTIKÖRPER-BINDUNG AN DENATURIERTES/NATIVES PrP UND QUANTIFIZIERUNG VON PrP^Sc
Das Verhältnis zwischen der Bindung von Eu-markiertem IgG an PrP in nativen und denaturierten (ungefalteten) Konformationen, gemessen durch TRF, wurde TRF_D/TRF_N benannt. Das Folgende ist ein mathematisches Modell, welches verwendet werden kann, um den Gehalt an β-Faltblatt-strukturiertem PrP in einer unbekannten Probe direkt zu berechnen: [PrPβ] ∼ ΔTRFβ = TRFD–(TRFN*fα) (FORMEL 1)
In Formel 1 ist ein Überschuss an Antikörper-Bindung an PrP-Protein beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand (ungefaltet) über den für eine α-helikale Konformation erwarteten hinaus direkt proportional zu der Menge an PrP-Proteinen β-Faltblatt-Konformation.
Die Symbole in den Gleichungen sind wie folgt:
ΔTRF_β–Veränderung in der Zeit-aufgelösten Fluoreszenz von PrP in der β-Faltblatt-Konformation während des Übergangs von dem nativen zum denaturierten Zustand;
TRF_D–Zeit-aufgelöste Fluoreszenz von PrP in dem denaturierten (d. h. ungefalteten) Zustand;
TRF_N–Zeit-aufgelöste Fluoreszenz von PrP in der nativen Konformation; und
f_α–der Korrelationskoeffizient für die Abhängigkeit von TRF_D von TRF_N, erhalten mit seriell verdünntem, reduzierten SHα-Gehirn-Homogenat und mit aufgereinigtem SHaPrP^c. Der Koeffizient wurde durch Anpassen der graphischen Darstellung der Antikörper-Bindung an (ungefaltetes) denaturiertes/natives Protein durch das nicht-lineare Regressionsprogramms der kleinsten Qudarate erhalten.
BEISPIEL 26
PRÄZIPITATION VON PRIONEN DURCH NATRIUMPHOSPHOWOLFRAMAT
Gehirn-Homogenat [5% (w/v)], enthaltend 2% Sarcosyl, wurde mit Stock-Lösung, enthaltend 4% Natriumphosphowolframat (NaPTA) und 170 mM MgCl₂, pH 7,4, gemischt, um eine Endkonzentration von 0,2 bis 0,3% NaPTA zu erhalten. Typischerweise wurden 1 ml Proben für 16 Stunden bei 37°C auf einer Schüttel-Plattform inkubiert, und bei 14.000 × g in einer Tischzentrifuge (Eppen dorf) für 30 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die optionale Behandlung mit 25 μg/ml Proteinase K über 1 Stunde bei 37°C wurde vor oder nach der Präzipitation (Dekontaminations-Vorbehandlung) durchgeführt. Das Pellet wurde in H₂O, enthaltend Protease-Inhibitoren (0,5 mM PMSF; Aprotinin und Leupeptin, jedes 2 μg/ml) resuspendiert, und durch Konformations-abhängigen Immunoassay der Erfindung getestet.
BEISPIEL 27
GLEICHGEWICHTS-DISSOZIATION UND ENTFALTUNG IN GdnHCl
Aliquots von 5% (w/v) Gehirn-Homogenaten in PBS, pH 7,4, enthaltend 2% Sarcosyl und Protease-Inhibitor-Cocktail (5 mM PMSF, Aprotinin und Leupeptin, jedes 4 μg/ml) wurden manuell auf die Endkonzentration von GdnHCl und konstanter Proteinkonzentration in einer Probe gemischt, und für 16 Stunden bei 23 °C equilibriert. Die Konzentration der Stocklösung von 8 M GdnHCl (Pierce, Rockford, IL) in TBS, pH 7,4, wurde durch Refraktrometrie kontrolliert. Equilibrierte Proben wurden 20-fach bis zur gleichen End-Protein- und GdnHCl-Konzentration verdünnt, und mit Eu-markiertem 3F4 IgG wie beschrieben in Konformations-abhängigen Immunoassays getestet.
Die Rohdaten aus jedem Assay wurden in ein Verhältnis von Antikörper-Bindung zu (ungefaltetem) denaturiertem/nativem PrP oder von der offensichtlichen fraktionellen Veränderung von unfaltend: F_app Safar et al., J. Biol. Chem., 268: 20276-20284 (1993) und Safar et al., Biochemistry, 33: 8875–8883 (1994) umgewandelt unter Verwendung der Formel F_app = (Y_obsd – Y_N)/(Y_U – Y_N), wo Y_obsd der beobachtete Wert der Parameter ist, und Y_N und Y_U die Werte für die Parameter für die nativen bzw. ungefalteten Formen sind, bei der gegebenen GdnHCl-Konzentration.
BEISPIEL 28
ELEKTRONEN-MIKROSKOPIE
Proben wurden auf Kohlenstoff-beschichteten 1,000 Maschen (Mesh) Kupfernetzen, die vor dem Färben Glüh-entladen wurden, zubereitet. 5 μl-Proben wurden für ungefährt 30 sek. absorbiert und mit 2 Wassertropfen gewaschen. Kontrast wurde durch NaPTA, als positive Färbung aus dem NaPTA-Präzipitationsschritt in der Zubereitung beibehalten, zur Verfügung gestellt; kein zusätzliches Färben wurde verwendet. Nach dem Trocknen wurden die Proben in einem Jeol 100CX II-Elektronenmikroskop bei 80 kV einer Standardvergrößerung von 40.000 angeschaut. Die Vergrößerung wurde mit negativ gefärbten Katalase-Kristallen kalibriert.
Die fertige Erfindung wird hierin in einer Form gezeigt und beschrieben, welche als die praktischste betrachtet wird, und bevorzugte Ausführungsformen. Es muss dennoch in Betracht gezogen werden, dass davon Abweichungen gemacht werden können, welche innerhalb des Bereichs der Erfindung sind, und dass einem Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung offensichtliche Modifikationen einfallen werden.

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Menge einer behandlungssensitiven Form einer mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins in einer Probeneinheit, umfassend: Bestimmen der Gesamtmenge der mit einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins in einer Probeneinheitsmenge; Unterwerfen der Probe einer Behandlung unter Bedingungen, die ausreichend sind, um im Wesentlichen das gesamte Protein in der Probe mit Ausnahme des behandlungsinsensitiven, mit einer Krankheit verbundenen Proteins zu hydrolysieren; Bestimmen der Menge des behandlungsinsensitiven, mit einer Krankheit verbundenen Proteins in einer Probeneinheitsmenge, die der Behandlung unterworfen wird; und Abziehen der Menge des behandlungsinsensitiven Proteins von der Gesamtmenge des mit einer Krankheit verbundenen Proteins, um die Menge des behandlungssensitiven, mit einer Krankheit verbundenen Proteins in der Probe zu erhalten;
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe von einem Tier stammt und die Behandlung den Kontakt mit einer Protease umfasst; wobei die Gesamtmenge der mit einer Krankheit verbundenen Konformation des Proteins und die Menge des behandlungsinsensitiven Proteins unter Verwendung einer Methodologie bestimmt werden, die in der Lage ist, Proteinkonzentrationen über einen Bereich von fünf Größenordnungen oder mehr zu bestimmen; und wobei ferner die mit einer Krankheit verbundene Konformation des Proteins in der Probe in einer Konzentration von 1 × 10³ Partikeln/ml oder weniger vorhanden ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die mit einer Krankheit verbundene Konformation des Proteins ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus βA4 Protein, PrP^Sc und Transthyretin.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die mit einer Krankheit verbundene Konformation des Proteins PrP^Sc ist und die Behandlung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hitze über 80°C, Druck und chemische Behandlung in einer Menge, ausreichend um im Wesentlichen das gesamte Protein in der Probe mit Ausnahme von PrP 27-30 zu hydrolysieren, welches das behandlungsresistente Protein ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, ferner umfassend: Bestimmen des Verhältnisses von temperatursensitivem, mit einer Krankheit verbundenem Proteinen zu mit einer Krankheit verbundenen Gesamtprotein; Vergleichen des bestimmten Verhältnisses mit einem bekannten Verhältnis eines bekannten Stammes eines mit einer Krankheit verbundenen Proteins, um damit den Stamm des mit einer Krankheit verbundenen Proteins in der Probe zu bestimmen; wobei das mit einer Krankheit verbundene Protein PrP^Sc ist und der bekannte Stamm von PrP^Sc von einem Stamm ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Drowsy, 139H, Hyper, Me7, MT-C5, RML und Sc237.
Verfahren zum Bestimmen der Menge von proteasesensitivem PrP^Sc in einer Probe, umfassend: Bestimmen der Gesamtmenge von PrP^Sc in einer Probeneinheitsmenge; Unterwerfen der Probe einer limitierten Proteasebehandlung mit einer Protease unter Bedingungen, die ausreichend sind, um im Wesentlichen das gesamte Protein in der Probe mit Ausnahme von Protease insensitiven PrP^Sc zu hydrolysieren; Bestimmen der Menge von behandlungsinsensitivem PrP^Sc in einer Probeneinheitsmenge, die einer Proteasebehandlung unterworfen wurde; und Abziehen der Mengen von behandlungsinsensitiven PrP^Sc von der Gesamtmenge an PrP^Sc, um die Menge an behandlungssensitivem PrP^Sc in der Probe zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Mengen an Gesamt-PrP^Sc unter Verwendung einer Methodologie bestimmt werden, die in der Lage ist, Proteinkonzentrationen über einen Bereich von fünf Größenordnungen oder mehr zu bestimmen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4, 6 oder 7, bei dem die Menge an Gesamt PrP^Sc und behandlungsinsensitivem PrP^Sc unter Verwendung von zeitaufgelöster, durch Dissoziation-verstärkte Fluoreszenz bestimmt werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4, 6 oder 7, bei dem die Menge an Gesamt-PrP^Sc und behandlungsinsensitivem PrP^Sc unter Verwendung eines lasergesteuerten Fluorometers mit zwei Wellenlängen bestimmt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 4, 6 oder 7, ferner umfassend: Bestimmen der Verhältnisse von behandlungssensitivem PrP^Sc zu Gesamt-PrP^Sc; und Vergleichen des bestimmten Verhältnisses mit einem bekannten Verhältnis eines bekannten Stammes von PrP^Sc, um dadurch den Stamm und die Inkubationszeit von PrP^Sc in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4, 6 oder 7, ferner umfassend: Auftragen der Menge an proteasesensitivem PrP^Sc in einer Probeneinheitsmenge auf einem Graphen der Inkubationszeit gegen die Menge an sensitivem PrP^Sc in einer Probeneinheitsmenge, wobei der Graph aufgetragene Daten von bekannten Stämmen von PrP^Sc einschließt und wodurch damit die Inkubationszeit des Stammes und die Inkubationszeit des PrP^Sc in der Probe bestimmt werden.