KR20010041135A - 단백질의 다중의 질병 관련된 입체구조의 특이적인스트레인에 대한 분석 - Google Patents

Abstract

본 발명의 분석 방법은 (1)샘플이 질병과 연관된 입체구조의 단백질을 포함하는가를 결정하고 만약 존재한다면 그것의 농도와 양을 측정하고; (2)샘플안에 있는 프로테아제 저항성의 질병 관련된 단백질의 양을 측정하고, 존재하는 질병 관련된 단백질의 총량으로부터 그 양을 공제함으로써 샘플안에 있는 프로테아제 민감성의 질병 단백질의 양을 측정하고; (3)(i)프로테아제 저항성 및 프로테아제 민감성 단백질의 상대적인 양을 기지의 스트레인에 관련시킴으로써 스트레인을 결정하고; (ii)기지의 스트레인에 대한 프로테아제 민감성 단백질의 인큐베이션 시간 대 농도의 그래프상에서 프로테아제 민감성 단백질의 농도를 플롯팅하여 샘플안에 있는 미지의 스트레인의 단백질의 인큐베이션 시간을 예견함에 의하여 질병 관련된 단백질의 스트레인 및 인큐베이션 시간의 측정하는 것을 허용한다.

Description

단백질의 다중의 질병 관련된 입체구조의 특이적인 스트레인에 대한 분석{ASSAY FOR SPECIFIC STRAINS OF MULTIPLE DISEASE RELATED CONFORMATIONS OF A PROTEIN}

프리온(prion)은, 인간과 동물에서 중추신경계의 치명적인 프리온 질병(해면양 뇌병증)을 예외없이 일으키는 감염성의 병원체이다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 유의하게 다르다. 지배적인 가설은, 프리온 단백질의 감염성이 생기게 하기위해 어떠한 핵산도 필수적이지 않다는 것이다.

프리온과 프리온이 일으키는 질병의 연구에 있어서의 주요한 단계는 프리온 단백질이라 표시되는 단백질의 발견과 정제였다[Bolton, McKinley 등 (1982) Science 218:1309-1311; Prusiner, Bolton 등 (1982) Biochemistry 21:6942-6950; McKinley, Bolton 등 (1983) Cell 35:57-62]. 이후로 완전한 프리온 단백질-암호화 유전자가 클로닝되고, 서열분석되고 트랜스제닉 동물안에서 발현되어 왔다. PrP^c는 단일-카피 숙주 유전자에 의하여 암호화되고[Basler, Oesch 등 (1986) Cell 46:417-428] PrP^c가 발현될 때 그것은 일반적으로 뉴런의 바깥쪽 표면상에서 발견된다. 많은 계열의 증거가, 정상적인 형태의 프리온 단백질(PrP^c)이 비정상적인 형태(PrP^Sc)로 변환한 결과로 프리온 질병이 생긴다는 것을 가리킨다. 두 형태들의 아미노산 서열에는 검출가능한 차이가 없다. 그러나, PrP^c와 비교될 때 PrP^Sc는 보다 높은 β-시트(sheet)와 보다 낮은 α-나선 함유량을 가진 입체구조를 가진다[Pan, Baldwin 등 (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:10962-10966; Safar, Roller 등 (1993) J Biol Chem 268:20276-20284]. 감염된 인간이나 동물의 뇌에서의 비정상적인 형태(PrP^Sc)의 존재는 프리온 질병의 유일한 절병-특이적인 진단표지이다.

PrP^Sc는 프리온 질병(해면양 뇌병증)의 전파와 발병기전 모두에 있어서 중요한 역할을 하고 뉴런의 퇴화에 있어서 결정적인 요인이다[Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2nd Edition:103-143]. 동물에서 가장 흔한 프리온 질병은 양과 염소의 스크래피(scrapie)와 소과의 소 해면양 뇌병증(BSE)이다[Wilesmith와 Wells (1991) Curr Top Microbiol Immunol 172:21-38]. 인간의 네가지 프리온 질병이 확인되어 왔다:(1)쿠루병(kuru), (2)크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob Disease(CJD)), (3)게르스트만-스트로이슬러-쉐인커병(Gerstmann-Streussler-Sheinker Disease(GSS)), 및 (4)치명적인 가족성 불면증(fatal familial insomnia(FFI))[Gajdusek (1977) Science 197:943-960; Medori, Tritschler 등 (1992) N Engl J Med 326:444-449]. 처음에, 유전되는 인간의 프리온 질병의 표현은 수수께끼였고, 이후로 PrP의 세포 유전적 기원에 의하여 설명되어 왔다.

다른 스트레인들이 유전학적으로 동일한 숙주내로 감염될 때, 프리온은 다중의 분리주(isolates)(스트레인)안에서 독특한 생물학적인 특성을 가지고 존재한다 [Prusiner(1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2nd Edition:165-186]. 스트레인은 인큐베이션 시간에 의하여, PrP^Sc단백질의 축적의 위상에 의하여, 그리고, 몇몇 경우에는 뇌 병리학의 분포와 특성에 의하여도 다르다[DeArmond와 Prusiner(1997) Greenfield's Neuropathology, 6th Edition:235-280]. PrP^Sc가 프리온의 주요 성분이고, 프리온의 유일한 성분일 가능성도 크기 때문에, 프리온 스트레인의 존재는, 핵산으로 구성된 분자가 아닌 분자안에 어떻게 생물학적인 정보가 암호화될 수 있는가에 대한 수수께끼를 제기해 왔다. 몇몇의 프리온 분리주를 포함하는 뇌 균질물의 부분적인 단백분해적 처리는, 약간 다른 전기영동 이동성을 가진 펩티드를 발생시키는 것으로 알려져 왔다[Bessen과 Marsh(1992) J Virol 66:2096-2101; Bessen과 Marsh(1992) J Gen Virol 73:329-334; Telling, Parchi 등(1996) Science 274:2079-2082]. 이러한 발견은, 다른 스트레인의 프리온안에 있는 다른 입체구조의 PrP^Sc분자에 기인한 다른 단백분해적 절단부위를 제안했다. 양자택일적으로, 관찰된 차이는 다른 분자들과 다른 복합체를 형성하고 다른 스트레인안의 PrP^Sc에서 독특한 절단부위를 형성하는 것에 의하여 설명될 수 있을 것이다[Marsh와 Bessen (1994) Phil Trans R Soc Lond B 343:413-414]. 몇몇 연구자들은 다른 프리온 분리주들이 프리온 단백질의 당화 양상에서 다를 수 있을 것이라고 제안하였다[Collinge, Sidle 등 (1996) Nature 383:685-690; Hill, Zeidler 등 (1997) Lancet 349:99-100]. 그러나, 다중의 프리온 스트레인의 진단에 있어서 당화 및 펩티드 매핑 양상 둘다의 신뢰성은 지금 여전히 논쟁된다[Collings, Hill 등 (1997) Nature 386:564; Somerville, Chong 등 (1997) Nature 386:564].

변성후에 면역반응성을 증강시킴으로써 PrP^Sc를 검출하기 위한 체계는 Serban, 등, Neurology, Vol.40, No.1, 1990년 1월에서 제공된다. 생물학적인 샘플안에 있는 감염성 PrP^Sc에 대한 충분히 민감하고 특이적인 직접적인 분석은 어쩌면 동물 접종의 필요성을 완전히 없앨 수 있을 것이다. 불행하게도, 그러한 것은 현행의 PrP^Sc분석으로는 가능해 보이지 않는다 -- 프로테이나제-K 및 웨스턴 블롯-기초한 PrP^Sc검출의 현행의 민감성 한계는 10⁴-10⁵프리온 감염성 단위에 상응하는 1㎍/ml의 범위에 있는 것으로 평가된다. 추가하여, PrP^Sc에 대한 전통적인 프로테이나제-K-기초한 분석의 특이성은, 확실히 감염성인 프리온 조제물의 프로테이나제-K 저항성이 단지 상대적이거나 전혀 없다는 최근의 발견에 비추어 문제가 된다[Hsiao, Groth 등 (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:9126-9130]. Telling, 등 (1996) Genes ＆ Dev.

인간의 트랜스티레틴(transthyretin(TTR))은 네개의 동일한, 우세하게 β-시트 구조의 단위로 구성된 정상적인 혈장 단백질이고, 호르몬 티록신의 운반체로서 작용한다. 아밀로이드 원섬유로의 TTR의 비정상적인 자가 조립은 두 형태의 인간 질병, 즉 노인성 전신성 아밀로이드증(SSA)와 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)을 일으킨다[Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol 6(1):11-7]. FAP에서의 아밀로이드 형성의 원인은 TTR 유전자에서의 점 돌연변이이고; SSA의 원인은 알려져 있지 않다. 임상적인 진단은 생검 물질에서 인시튜(in situ)로 아밀로이드의 퇴적을 검출함으로써 조직학적으로 확립된다.

현재까지, 생체내에서의 TTR의 아밀로이드로의 전환의 기전에 대하여 거의 알려져 있지 않다. 그러나, 몇몇 연구실은, 아밀로이드 전환이 정상적인 인간 TTR의 부분적인 변성에 의하여 생체외에서 모사될 수 있을 것이라는 것을 입증해왔다 [McCutchen, Colon 등 (1993) Biochemistry 32(45):12119-27; McCutchen과 Kelly (1993) Biochem Biophys Res Commun 197(2) 415-21]. 입체구조 전이의 기전은, 선형의 β-시트 구조의 아밀로이드 원섬유로 중합하는 단량체적인 입체구조의 매개체를 포함한다[Lai, Colon 등 (1996) Biochemistry 35(20):6470-82]. 이 과정은 티록신이나 트리아이오도페놀(triiodophenol)과 같은 안정화 분자를 이용한 결합에 의하여 완화될 수 있다[Miroy, Lai 등 (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(26):15051-6].

상기의 관점에서, 트랜스티레틴과 프리온 단백질을 포함하는 병원성 단백질의 특이적인 스트레인의 존재에 대하여 샘플 물질을 시험하기 위한, 특이적이고 높은 병류이고(flow-through) 비용-효율적인 분석의 필요성이 분명히 있다.

발명의 개요

본 발명의 분석 방법은: (1)샘플이 질병과 연관된 입체구조의 단백질을 포함하는지를 결정하고 만약 존재한다면 그것의 농도와 양을 측정하고; (2)샘플안에 있는 프로테아제 저항성의 질병 관련된 단백질과 같은 화학적인 화합물의 양을 측정하고, 존재하는 질병 관련된 단백질의 총량으로부터 그 양을 공제함으로써 샘플안에 있는 프로테아제 민감성의 질병 단백질의 양을 측정하고; (3)(i)프로테아제 저항성 및 프로테아제 민감성 단백질의 상대량을 기지의 스트레인에 관련시켜서 스트레인을 측정하고; (ii)인큐베이션 시간 대 기지의 스트레인에 대한 프로테아제 민감성 단백질 농도의 그래프상에서 프로테아제 민감성 단백질의 농도를 플롯팅하여 주어진 미지의 스트레인의 인큐베이션 시간을 예견함에 의하여, 질병 관련된 단백질의 스트레인 및 인큐베이션 시간을 측정하는 것을 허용한다.

질병 관련된 입체구조인 단백질의 존재와 농도는 세가지 다른 기본 방법중의 하나를 통하여 측정된다. 근본적인 방법을 따라서, 샘플은 먼저 두 부분으로 나누어진다. 첫번째 부분을, 단백질의 비-질병 입체구조에는 결합하지만 단백질의 질병 관련된 입체구조에는 결합하지 않는 표지된 항체와 접촉시킨다. 그리고나서 두번째 부분을, 항체에 대한 두번째의 입체구조인 어떤 단백질이든지의 결합 친화성을 증가시키는 단백질 언폴딩(unfolding) 처리에 처하게 한다. 일반적으로 단백질 언폴딩 처리는, 항체가 결합할 수 있는 항원결정부를 노출시킬 것인데, 이 항원결정부는 질병 관련된 입체구조에서는 노출되지 않는다. 따라서, 단백질 언폴딩 처리전에는 항체와 결합하지 않는 질병 관련된 단백질이 이제 그 항체와 결합할 것이다. 그리고나서, 첫번째의 미처리된 부분안에 있는 단백질에 결합하는 항체의 양과 두번째 부분안에 있는 단백질에 결합하는 항체의 양사이를 비교한다. 첫번째 및 두번째 부분에서의 항체결합의 양사이에서의 차이는 샘플안에 질병 관련된 단백질이 존재한다는 것을 가리킨다. 단백질 및 사용된 단백질 언폴딩 처리에 의존하여, 비-질병 관련된 입체구조인 단백질에 대한 처리의 효과에 기인하여 조절을 하는 것이 필수적일 수 있을 것이다.

단계식으로 설명하자면, 본 발명의 기본적인 분석방법은 (a)단백질(첫번째의 입체구조 및 두번째의, 질병-관련된 입체구조를 가지는)을 포함하는 것으로 추정되는 샘플을 제공하고, (b)샘플을 첫번째와 두번째의 부분으로 나누고, (c)두번째의 입체구조에 대해서보다 더 높은 친화성으로 첫번째의 입체구조에 결합하는 항체와 첫번째의 부분을 접촉시키고, (d)두번째의 부분에 단백질 언폴딩 처리를 하여서 두번째의 입체구조인 모든 단백질이 항체에 대하여 보다 높은 친화성을 갖는 다른 입체구조를 채택하도록 하고, (e)두번째의 부분을 항체와 접촉시키고, (f)상기 첫번째 및 두번째 부분에 대한 항체 결합의 상대적인 수준을 측정하고, (g)비교에 근거하여 두번째 입체구조인 단백질의 존재여부를 결정하는 것을 포함한다.

일단 샘플이 질병 관련된 입체구조인 단백질을 포함한다는 것이 결정되면, 그 단백질의 인큐베이션 시간에 대한 관계에서 스트레인을 측정하는 것이 추가적으로 유용하다. 이것은, 질병 관련된 입체구조인 단백질에 대하여 양성으로 시험된 샘플의 또하나의 부분을 얻음으로써 행해질 수 있다. 이 부분은, 질병 관련된 입체구조인 고도로 저항성인 단백질(예를 들어, 프로테아제 저항성 PrP 27-30을 제외하고 샘플안에 있는 대부분의 단백질을 가수분해시키는 제한된 프로테아제 처리에 처한다. 그리고나서, 처리 저항성 단백질의 농도와 양이 측정된다. 샘플안에 있는 질병 관련된 단백질의 총량으로부터 샘플안에 있는 처리 저항성 단백질의 양을 공제함으로써, 프로테아제 분해에 민감한 샘플안의 질병 관련된 단백질의 양이 얻어질 수 있는데, 예를 들어 프로테아제 민감성 PrP^Sc이다. 질병 관련된 단백질의 각 스트레인은, 단백질변성처리에 의하여 변성되는 질병 관련된 입체구조인 단백질(프로테아제 민감성인 PrP^Sc)의 양에 대한 질병관련된 입체구조(예를 들어, 천연의 PrP^Sc)인 총 단백질의 기지의 비율을 가진다. 그러므로, (총: 변성된)비율은 샘플안의 스트레인을 결정하기 위하여 기지의 스트레인의 비율에 매치(match)될 수 있다.

단백질의 어떤 질병 입체구조이든지 그것의 스트레인을 결정하는 방법도 또한 단계식으로 설명될 수 있다. 그 방법은, (a)예를 들어, 원심분리에 의하여 질병 관련된 형태인 단백질을 분리하고; (b)분리된 단백질의 한 형태를 변성시키지만 다른 형태는 변성시키지 않는 화합물(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드)로 분리된 단백질을 처리하고; (c)질병 관련된 단백질의 총량에 상대적인, 처리에 저항성인 단백질의 비율을 측정하고; (d)그 비율을 기지의 단백질의 앞서 측정된 표준의 비율에 비교함으로써 샘플안의 질병 관련된 단백질의 스트레인을 결정함에 의하여 수행된다. 이 방법은, 발견된 스트레인이 기지의 스트레인에 매치될 때 보다 쉽게 적용된다. 만약, 기지의 스트레인에 매치되지 않고 실험적인 오차가 없었다면, 새로운 스트레인이 발견된 것으로 가정될 수 있을 것이다.

단백질의 질병 관련된 입체구조의 인큐베이션 시간은, 그 스트레인이 이전에 알려지지 않았더라도 측정될 수 있다. 이것은, (a)예를 들어, 원심분리에 의하여 질병 관련된 형태인 단백질을 분리하고; (b)분리된 단백질의 한 형태를 변성시키지만 다른 형태는 변성시키지 않는 (예를 들어, 프로테이나제 K로) 분리된 단백질을 처리하고; (c)변성되지 않은 질병 관련된 단백질(처리 저항성 단백질)의 양을, 질병 관련된 단백질의 총량으로부터 공제하여 변성된 질병 관련된 단백질의 양을 알아내고; (d)(c)에서 찾아진 질병 관련된(처리 민감성인) 단백질의 양을, 인큐베이션 시간 대 변성되지 않은 질병 관련된 단백질 양의 그래프상에 플롯팅하여 (이 그래프는 기지의 인큐베이션 시간을 이용하여 기지의 스트레인을 플롯팅하였다); (e)인큐베이션 시간을 예견함으로써 측정된다.

본 발명의 분석은 적어도 두개의 입체구조로 존재하고(예를 들어, 천연의 비-질병 입체구조 및 질병 입체구조) 1 x 10³개 입자/ml이하의 수준에서 존재하는 단백질을 포함하는 샘플을 분석하는데 있어서 유용하다. 본 발명은 단단하게 배열된 질병-입체구조의 단백질과 결합하지 않거나 그것에 대하여 상대적으로 낮은 정도의 친화성을 가진 항체를 이용한다. PrP^c에의 결합을 위하여 유용한 항체는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852에 1986년 10월 8일에 기탁된 하이브리도마 셀라인 ATCC HB9222에 의하여 생산되고, 선택적으로 PrP^c에 결합하는 항체를 개시하기 위하여 참고에 의하여 연합된, 1989년 2월 21일에 발행된 U.S. 특허 제4,806,627호에서 개시되고 설명된 단클론항체 3F4이다. 항체에 추가하여, 비-질병 관련된 입체구조와 결합하지만 질병 관련된 입체구조와는 결합하지 않는 다른 결합 파트너가 본 발명의 분석에서 사용될 수 있을 것이다. 실시예에서 설명된 분석에서 사용되는 3F4 및 다른 것들과 같은 항체들은 상업적으로 이용가능하다.

본 발명 배후의 근본적인 방법을 증명하기 위하여, 적어도 두개의 부분으로 나누어진 개시샘플을 가지고 시작될 수 있다. 첫번째의 부분은, 단백질을 처리함없이 표지된 항체와 접촉되고, 두번째의 부분은, 단백질에 단백질 언폴딩 처리를 하여 질병 입체구조인 모든 단백질이 항체에 대하여 보다 높은 정도의 결합 친화성을 가지는(예를 들어, 이전에는 노출되지 않았던 항원결정부를 노출시키는) 입체구조를 취하게 한 후에 표지된 항체로 처리된다. 판독(readings)을 비교(즉, 하나로부터 공제된 다른 하나)하고, 질병 관련된 입체구조인 단백질의 존재는 두 판독간의 차이에 근거하여 추론된다.

기본적인 분석의 두번째 구체예에 따라, 각각의 분석에 대한 두개의 판독을 얻지 않고도 본 발명 배후의 기본 개념을 사용하는 것이 가능하다. 이것은, 통계적으로 유의한 수의 밀접하게 관련된 샘플에 대한 분석을 수행함에 근거하여 표준을 확립함으로써 행해질 수 있다. 표준이 확립된 후에, 주어진 샘플이 질병 관련된 입체구조인 단백질을 포함하지 않을 때 관찰되어야 하는 항체 결합의 수준을 알 것이다. 그리고나서, 표준을 이용하여, 시험될 샘플을 단백질 언폴딩 처리하여서 질병 관련된 입체구조인 모든 단백질을 표지 항체에 대하여 훨씬 더 높은 정도의 결합 친화성을 가진 다른 입체구조로 전환시킨다. 그리고나서, 얻어진 측정을 표준과 비교한다. 만약 표준과 얻어진 측정간의 차이가 일정한 범위에서 벗어난다면, 원래의 샘플이 질병 관련된 입체구조인 단백질을 포함했다고 추론될 수 있다. 이러한 결과는 (1)상기에 설명된 첫번째의 구체예를 통하여 및/또는 (2)단백질의 질병 관련된 입체구조와만 결합하는 항체로 샘플을 시험함으로써 확인될 수 있을 것이다-US96/14840 참고.

본 발명의 세번째 구체예는 상기에서 개시된 구체예중 어느 것을, 원래의 샘플내에 존재하는 질병 관련된 입체구조인 단백질의 수(농도)를 (정량적으로) 계산하기 위하여 본원에서 제공된 식과 함께 이용할 수 있다.

분석 구체예들중 어떤 것이든에 따라, 시험되고 있는 샘플을 전-처리해서 (1)가능한 한 많은 오염물질 단백질을 제거하고; (2)비-질병 관련된 입체구조의 단백질에 상대적인 샘플안에 있는 질병 관련된 단백질의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 초기 샘플은, 오염물질 단백질 및/또는 단백질의 이완된, 비-질병 형태를 우선적으로 분해하거나 변성시키는 화합물을 이용하여 화학적으로 처리될 수 있고/거나 오염물질 및/또는 단백질의 비-질병 입체구조(를 제거하기 위하여)에 우선적으로 결합하는 항체에 노출된다.

질병 입체구조에 선택적으로 결합하여 복합체를 형성하는 화합물을 첨가하고 샘플을 원심분리하여 본원에서 설명된 방법에 따라 시험되는 그 복합체를 침전함에 의하여 질병 입체구조의 단백질을 농축시킴으로써, 본 발명의 다양한 양태의 민감성을 추가적으로 증강시키는 것이 가능할 수 있을 것이다. 그러한 농축 방법에 관한 특성은, "Process for Concentrating Proteins with Disease-Related Conformation"이라는 제목의 본 발명자들의 공동-보류중인 출원 No. 09/026,967에서 상세하게 설명된다.

상기에 설명된 본 발명의 분석의 다른 구체예는 모두 "직접적인" 유형의 면역분석인데 -- 샘플안에 존재하는 모든 질병 관련된 입체구조 단백질의 입체구조를 변화시키는 처리를 하거나 하지 않으면서, 샘플은 표지된 항체를 이용하여 직접적으로 분석된다는 것을 의미한다. "간접적인" 분석이 또한 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스의 사용에 의하여 (만약, 있다면) 샘플안에 있는 질병 관련된 단백질의 수를 증강시키고, 그렇게 함으로써 얻어지는 모든 신호를 증강시키는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 이러한 구체예를 수행하기 위하여, 샘플은 먼저 그 게놈이 변형되어 있는 트랜스제닉 마우스를 접종하기 위하여 사용되어, 질병 관련된 입체구조인 단백질로 접종될 때 그 트랜스마우스는 질병의 증상을 발생할 것이다. 마우스가 접종되면, 충분한 기간의 시간이 지나도록 한 다음(예를 들어, 30일) 그 트랜스제닉 마우스를 희생시켰고, 마우스로부터의 균질화된 뇌 조직과 같은 샘플을 상기에서 설명된 직접적인 분석에 사용한다. 본 발명은, 원래의 샘플이 질병 관련된 입체구조인 단백질을 포함했는지에 관하여 결정될 때까지 지나야만 하는 시간의 기간을 감소시킴에 의하여 프리온을 검출하기 위한 트랜스제닉 마우스의 능력을 증강시킨다. U.S. 특허 제5,565,186호, 제5,763,740호; 또는 제5,792,901호중의 어느 것에서든 개시되고 설명된 유형의 마우스를 이용하거나 U.S. 특허 제5,750,361호(참고에 의하여 연합된)에서 개시된 대로의 항원결정부 태깅된 PrP를 적용해서 Tg 마우스의 뇌로부터 PrP^Sc를 친화성 정제한 후 본 발명의 분석을 적용하는 것이 또한 가능할 것이다. 본 발명없이는, 마우스를 접종하고, 그 접종된 마우스가 실제로 질병의 증상을 증명할 때까지 기다려야 한다. 마우스에 따라, 이것은 몇달 또는 심지어 몇년까지도 걸릴 수 있다. 본 발명의 분석중 어느 것이나 상기에 설명된 트랜스제닉 마우스와 같은 어떤 트랜스제닉 마우스를 이용하여서든 사용될 수 있을 것이다. 본 분석은 마우스가 질병의 증상을 발달시키기 전에 사용될 수 있어서, 샘플이 감염성 단백질을 포함하는지를 결정하는데 필요한 시간을 줄인다.

본 발명의 분석 방법론은, 샘플이 적어도 두 입체구조로 발생하는 단백질을 포함하는 것으로 추정될 때 어떤 유형의 샘플에라도 적용될 수 있다. 단백질은 기지의 항체에 결합하는 한 입체구조로 발생해야 하는데, 항체 또는 다른 특이적인 결합 파트너는 발생될 수 있다. 두번째의 입체구조는 그것의 결합 친화성에 있어서 첫번째의 입체구조와 충분히 달라서, 두 입체구조는 두번째 입체구조에 대해서보다 첫번째 입체구조에 대하여 훨씬 높은 정도의 친화성을 가지는 항체나 결합 파트너를 이용하여 구별될 수 있어야 한다. 개념적으로 가장 단순한 형태로, 기지의 표지된 항체가 높은 정도의 친화성으로 단백질의 비-질병 형태에 결합하고, 동일한 단백질이 질병 관련된 입체구조로 존재할 때는 그 동일한 단백질에 결합하지 않을(때 또는 극도로 낮은 정도의 친화성으로 결합할) 때 본 발명은 가장 잘 작용한다. 그러나, 실제로는, 주어진 단백질이 둘이상의 입체구조를 가질 수 있을 것이다. 단백질은 하나이상의 비-질병 입체구조와 하나이상의 질병 관련된 입체구조를 가질 수 있을 것이다, (Telling, 등, Science (1996)). 본 발명은 단백질의 비-질병 및 질병 형태의 다중의 입체구조가 존재할 때 여전히 유용하다--(1)적어도 하나의 비-질병 입체구조가 그것의 결합 친화성에 있어서 적어도 하나의 질병 입체구조와 다르고; (2)단백질의 질병 관련된 입체구조를 처리하여 그것의 결합 친화성을 실질적으로 증강시키는 것이 가능하다면.

상기에서 가리켜진 대로, 본 발명의 분석은, 단백질이 비-질병 및 질병 관련된 입체구조를 포함한다면 어떤 유형의 단백질에 대해서든 어떤 형태의 샘플이라도 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 특히, (1)PrP 단백질의 존재에 대하여 샘플을 분석하고 샘플이 질병 입체구조인 PrP 단백질을 포함하는지를, 즉 PrP^Sc를 포함하는지를 결정하고, (2)알츠하이머병과 연관된 불용성 형태의 βA4 및 (3)트랜스티레틴에 대하여 샘플을 분석하기 위하여 전개되었다. 따라서, 다음의 개시의 많은 부분이 본 발명의 면역분석을 이용하여 샘플안에 있는 PrP^Sc(또는 보다 작은 정도로 βA4 또는 트랜스티레틴(TTR))을 검출하는 것으로 향해지며-- 넓은 범위의 다른 유형의 단백질의 질병 관련된 입체구조를 검출하기 위하여 동일한 일반적인 개념이 적용가능하다는 것이 이해된다. 추가적으로, 본 개시는 특히, 샘플안에 있는 감염성 프리온(PrP^Sc)의 인큐베이션 시간과 특별한 스트레인을 측정하는 방법을 설명하는데로 향해지고--다른 질병과 연관된 다른 억제된 단백질의 인큐베이션 시간과 특별한 스트레인을 측정하기 위하여 동일한 일반적인 개념이 적용가능하다는 것이 이해된다.

PrP^Sc검출의 본 방법은 선택된 정제된 IgG를 유로퓸으로 표지함으로써 전개되었다. 사용된 항체(3F4)는 α-나선이 풍부한 입체구조를 포함하는 PrP^c(비-질병 입체구조)에 대하여 높은 결합 친화성을 가진다. 그 항체는 β-시트가 풍부한 입체구조를 포함하는 PrP^Sc(질병 입체구조)에 대하여 낮은 결합 친화성을 가진다. IgG는 흔한 단클론성, 다클론성, 또는 재조합체 항체로부터 얻어질 수있을 것이고, 전형적으로 PrP^c의 서열 90-145 및 입체구조적으로 언폴딩된 프리온 단백질을 인식한다. 재조합체 프리온 단백질의 다른 입체구조들은 글루타르알데히드 활성화 단계를 통하여 폴리스티렌 플레이트에 화학적으로 교차연결되었다. 서열 90-231에 상응하는 재조합체 시리아 햄스터 프리온 단백질의 α-나선, β-시트, 및 무작위적 코일 입체구조와 Eu-표지된 IgG의 상대적인 친화성은, 시간-분해성의(time-resolved), 해리-증강성의(dissociation-enhanced) 형광에 의하여 96-웰 폴리스티렌 플레이트 포맷에서 측정되었다.

단백질에 대한 다른 표지된 항체의 상대적인 친화성은 다른 방법에 의하여 측정될 수 있다. 그러나, 단백질의 질병 관련된 입체구조는 비-질병 입체구조의 농도에 상대적인 매우 낮은 농도로 종종 존재한다. 따라서, 단백질의 질병 입체구조의 처리에 의하여 생기는 어떤 증가라도 검출하기 위한 매우 민감한 방법이 종종 필요하다. 시간-분해성의, 해리-증강성의 형광 및 보다 바람직하게는 이중의 파장, 레이저-구동된 형광분석기가 특히 유용한 장치이고--Hemmila 등, Boianalytical Applications of Labeling Technologies (eds. Hemmila) 113-119 (Wallas Oy. Turku, Finland, 1995)를 참고하라.

이 방법을 조심스럽게 보정함으로써, β-시트 입체구조 상태로부터 변성된 상태로의 전이에서 항체 반응성에서의 신호 증가를 검출하는 것이 가능하다. 이 신호는, 천연의 α-나선형 상태로부터 처리된, 이완된 또는 변성된 상태로의 변형으로부터 얻어지는 신호에 비교하여 상대적으로 크다. 그러므로, 프리온 단백질의 원래의 입체구조 상태가 천연의 상태와 처리된 상태에서의 차별적인 분석에 의하여 지정될 수 있다. β-시트가 풍부한 단백질을 포함하지 않는 샘플이 처리될 때, 어느정도의 증가가 면역반응성에서 얻어진다. 이러한 증가량은 조정되어야 하고 그러한 것을 한 후에 결과적인 농도 또는 양은 "조정된 양"이라 불린다. PrP^Sc의 α-나선형 입체구조에 대하여 얻어지는 항체-특이적인 결합을 넘는(조정된 양을 넘는) 항체-특이적인 결합의 양은, PrP^Sc의 병원성 및 감염성에 필수적인 β-시트가 풍부한 입체구조의 존재의 측정이다.

본 발명의 양태는, 단백질을 포함하는 샘플을 분석하기 위하여 적용가능한 면역분석을 제공하는 것인데, 이 샘플은 천연의 비-질병 입체구조 및 질병 관련된 입체구조내에서 발생하는 단백질(예를 들어, PrP 단백질, βA4 단백질 및 트랜스티레틴)을 포함하는 것으로 추정된다.

본 발명의 또하나의 양태는 (1)프로테이나제 K와 같은 프로테아제를 이용한 제한된 프로테아제 처리에 의하여 가수분해되지 않는 질병 관련된 단백질 또는 그것의 부분(프로테아제 저항성 단백질, 예를 들어 PrP 27-30) 및 (2)프로테이나제 K와 같은 프로테아제를 이용한 제한된 프로테아제 처리에 의하여 가수분해되는 질병 관련된 단백질(예를 들어, 프로테아제-민감성 PrP^Sc) 사이를 구별하는 분석을 제공하는 것이다.

또하나의 양태는, 단백질 변성 처리에 의하여 변성된 질병 관련된 단백질에 대한 총 천연의 질병 관련된 단백질의 비율을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 장점은, 비-질병, 천연의 단백질(예를 들어, PrP^c)의 프로테아제 분해동안 가수분해되어서 전통적인 웨스턴 블롯 방법론을 통하여 검출되지 않을 질병 관련된 단백질(예를 들어, 프로테아제 민감성 PrP^Sc)의 검출을 허용한다는 것이다.

본 발명의 특징은 감염성 단백질의 인큐베이션 시간을 계산하기위하여 사용될 수 있다는 것이다.

본 발명의 장점은, 본 분석에서 사용된 항체가 질병 관련된 입체구조인 단백질과 결합하지 않거나 질병 관련된 입체구조인 단백질에 대해 매우 낮은 정도의 결합 친화성을 가지며 질병 관련된 입체구조가 비-질병 입체구조보다 더 낮은 농도로 존재함에도 불구하고, 면역분석이 질병 관련된 입체구조인 단백질(예를 들어, PrP^Sc, βA4및 트랜스티레틴)의 존재를 신속하고 정확하게 측정할 수 있다는 것이다.

본 발명의 또하나의 목적은, (1)병원성 입자가 샘플안에 존재하는지를 측정하는 것뿐 아니라 (2) 샘플안에 있는 그 입자의 농도를 측정하고, (3)존재하는 입자의 특별한 스트레인 및 (4)인큐베이션 시간을 측정하는 것을 가능하게 하는 분석을 제공하는 것이다.

본 발명의 특징은, 트랜스제닉 동물, 예를 들어 샘플안의 단백질의 존재를 검출하기 위하여 사용되는 트랜스제닉 마우스의 사용에 의하여 얻어지는 신호가 증강될 수 있다는 것이다.

또하나의 특징은, 시간-분해성의, 해리-증강성의 형광 또는 이중의 파장, 레이저 구동된 형광분석기가 민감성을 증강시키기 위하여 사용될 수 있다는 것이다.

또하나의 장점은, 본 분석이 1 x 10³개 입자/ml이하의 농도에서 단백질의 질병-일으키는 입체구조의 수준을 검출할 수 있다는 것이다.

특이적인 목적은, 인간, 영장류, 원숭이, 돼지, 소과, 양, 사슴, 고라니(elk), 고양이, 개, 마우스 및 닭 조직 및/또는 체액으로부터 얻어지거나 유도된 다양한 샘플 물질안에 있는 감염성 프리온 단백질의 존재를 측정하기 위한 진단 분석을 제공하는 것이다.

또하나의 특이적인 목적은, 인간, 영장류, 원숭이, 돼지, 소과, 양, 사슴, 고라니, 고양이, 개, 마우스 및 닭 조직 및/또는 체액으로부터 얻어지거나 유도된 다양한 샘플 물질안에 있는 βA4 단백질의 존재를 측정하기 위한 진단 분석을 제공하는 것이다.

또하나의 목적은, 잠재적으로 프리온을 포함하는 샘플로 주사된 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 동물의 뇌안에 있는 천연의 감염성 프리온 단백질에 대한 신속한 분석을 제공하는 것이다.

또하나의 목적은, 그러한 처리후에 병원성 단백질(예를 들어, 프리온 또는 β-시트 βA4)의 변성의 수준을 분석함으로써 오염제거 절차를 평가하는 방법을 제공하는 것이다.

또하나의 목적은, 다른 화합물에 대하여, 다른 단백질들의 질병 입체구조와 연관된 질병을 치료하기 위한 다른 화합물들의 잠재성을 평가하기 위하여 그 화합물들을 선별하는 신속한 방법을 제공하는 것인데, 예를 들어, 다른 단백질 입체구조(예를 들어, PrP^c또는 α-나선형 입체구조의 βA4)에 대한 화합물의 안정화 효과 또는 단백질의 병원성 입체구조(예를 들어, PrP^Sc또는 β-시트 입체구조의 βA4)에 대한 화합물의 불안정화 효과에 대하여 그 화합물을 선별함에 의한다.

또하나의 목적은 프리온 질병 치료를 위한 잠재성을 가진 다른 약제적인 화합물을 선별하는 신속한 방법을 제공하는 것인데, 예를 들어, PrP^c단백질의 정상적인 이소형의 α-나선형 입체구조에 대한 화합물의 안정화 효과 또는 PrP^Sc단백질의 병원성 이소형의 β-시트 입체구조에 대한 화합물의 불안정화 효과에 대하여 그 화합물을 선별함에 의한다.

또하나의 장점은, 단백질의 감염성 입체구조을 직접적으로 인식할 수 있는 항체없이, 그리고 PrP^c와 같은 정상적인(비-질병) 이소형의 단백질의 신호를 제거하기 위하여 프로테이나제 K 단계를 사용하지 않고, 본 과정이 수행될 수 있다는 것이다.

또하나의 장점은, 발명된 과정에서, 병원성 입체구조의 βA4 또는 트랜스티레틴을 직접적으로 인식할 수 있는 항체가 필요없다는 것이다.

본 분석의 중요한 특징은, 1일당 96웰 플레이트당 96개의 샘플을 선별하는 수용능으로 고안될 수 있는 신속하고, 비용효율적이고 높은 병류의 고안이다.

본 발명의 또하나의 양태는, 인간과 동물의 조직, 체액, 및 약제로부터 얻어진 샘플 물질안에 있는 비정상적인, 아밀로이드 입체구조인 TTR을 정량적으로 검출하는 진단 방법이다. 발명된 과정은 샘플물질안에 존재하는 혼합물안에 있는 정상적인 입체구조 및 아밀로이드 입체구조의 TTR을 구별하고 정량하는 직접적인, 민감한 방법을 제공한다.

정량은, 무작위적인 코일 입체구조에 대항하는, 정상적인 입체구조 또는 아밀로이드 입체구조인 TTR과의 단클론성 또는 다클론성 항체의 친화성에 있어서의 차이의 측정에 기초한다. 본 발명은 그러한 정량을 위하여 사용되는 세가지의 평가 방법과 수학식을 설명한다.

중요한 목적은, 인간, 영장류, 원숭이, 돼지, 소과, 양, 사슴, 고라니, 고양이, 개, 및 닭 조직으로부터 얻어지거나 유도된 다양한 샘플 물질안에 있는 병원성 TTR에 대한 특이적인 진단 분석을 제공하는 것이다.

또하나의 목적은 트랜스제닉 동물안에 있는 아밀로이드 형태의 TTR에 대한 신속한 분석을 제공하는 것이다.

또하나의 목적은, 노인성 전신성 아밀로이드증(senile systemic amyloidosis (SSA)) 및 가족성 아밀로이드증 다발신경병증(familial amyloidotic polyneuropathy (FAP))의 치료를 위한 잠재성을 가진 다른 약제적인 화합물을 선별하는 신속한 방법을 제공하는 것이다. 그러한 화합물은, 정상적인 입체구조의 TTR에 대한 그것의 안정화 효과 또는 아밀로이드 입체구조의 TTR에 대한 그것의 불안정화 효과에 대하여 선별된다.

또하나의 목적은, TTR 유전자안의 다른 자발적인 돌연변이 및 고안된 돌연변이가, 천연의 또는 인공적인 APP 유전자를 가진 트랜스제닉 동물안에서의 그러한 TTR 유전자 산물의 입체구조, 안정성, 및 아밀로이드 형성에 미치는 효과를 선별하는 신속한 방법을 제공하는 것이다.

특이적인 장점은, 발명된 분석이, 변성된 비병원성 형태의 TTR을 포함하는 혼합물안 또는 가용성 형태의 TTR을 포함하는 혼합물안에 있는 병원성 형태의 TTR을 검출할 수 있을 것이라는 것인데- 예를 들어, 1 x 10³개 이하의 입자/ml을 검출할 수 있을 것이다.

발명된 과정의 이러한 목적, 장점 및 특징 및 다른 목적, 장점 및 특징은, 첨부된 도면을 참고하여 하기에서 더욱 충분하게 설명된 대로의 분석방법, 항체 발달과 시험, 및 트랜스제닉 마우스의 상세한 설명을 읽으면 당업계에서 숙련된 사람에게는 분명해 질 것이다.

이 발명은 일반적으로 면역분석에 관한 것이다. 보다 자세히는, 본 발명은, 매우 낮은 항체 결합 친화성을 가질 수 있을 단백질의 질병-관련된 입체구조 형태의 특이적인 스트레인(예를 들어, PrP^Sc)을 검출하는 것을 허용하는 분석에 관한 것이다.

도 1은 원편광이색성(CD)분광법에 의하여 측정될 때의 재조합체 SHaPrP90-231의 입체구조의 분광도표이고, 208nm와 222nm에서 최소치를 가진 두개의 주요한 띠는 α-나선형 입체구조를 가리키고; 217nm에서 최소치를 가지는 단일한 음성적인 띠는 주로 β-시트 입체구조에 특징적이다. 이 도면은, 원편광이색성(CD)분광법에 의하여 측정될 때, 37℃에서 72시간동안 인큐베이션하는 동안 α-나선형에서 β-시트 입체구조로 재조합체 ShaPrP90-231가 전환함을 보여준다. 단백질 농도는 5mg/ml이었다;

도 2는, 5% PrP^0/0마우스 뇌 균질물의 존재하에서 α-나선형 및 변성된 입체구조인 재조합체 SHaPrP90-231의 경합적인 분석의 결과를 보여주는 그래프인데, 이때 유로퓸-표지된 3F4 IgG을 이용하여 얻어진 기울기와 교차점에서의 차이는 각각의 입체구조가 다른 친화성 및 결합부위의 수를 가진다는 것을 가리키고, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 3은, 5% PrP^0/0마우스 뇌 균질물의 존재하에서 α-나선형 입체구조인 재조합체 SHaPrP90-231를 이용한 직접적인 분석의 보정을 보여주는 그래프인데, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 4는, 5% PrP^0/0마우스 뇌 균질물의 존재하에서 β-시트 입체구조인 재조합체 SHaPrP90-231를 이용한 직접적인 분석의 보정을 보여주는 그래프인데, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 5는, 5% PrP^0/0마우스 뇌 균질물의 존재하에서 α-나선형 및 β-시트 형태의 SHaPrP90-231 둘 다를 위한 직접적인 분석의 입출력 검증을 보여주는 그래프이고, 이때 x축상의 단백질의 양은 아미노산 분석에 의하여 측정되고 y축상의 단백질의 양은 본 분석으로부터 계산된다;

도 6은, Eu-표지된 3F4 IgG를 이용하여 전개된, α-나선형 및 β-시트 입체구조인 처리된(변성될 때 보여지는 언폴딩된) SHaPrP90-231 및 천연의 SHaPrP90-231의 신호사이의 비율을 보여주는 그래프인데, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다. 208nm와 222nm에서 최소치를 가지는 CD 스펙트럼에서의 두개의 주요한 띠는 α-나선형 입체구조를 가리키고; 217nm에서 최소치를 가지는 단일의 음성적인 띠는 주로 β-시트 입체구조에 특징적이고; 197nm로의 음성적인 골(trough)은 무작위적-코일 입체구조를 보고한다. 입체구조-의존성 면역분석의 보정은 5%(w/v) PrP^0/0마우스 뇌 균질물의 존재하에서 수행되었다. 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 7은, 정상적인 햄스터 뇌 균질물안에 있는 PrP^c단백질에 대한 직접적인 분석의 결과를 보여주는 그래프이고, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 8은 스크래피 감염된 햄스터 뇌 균질물안에 있는 PrP^c+Sc에 대한 직접적인 분석의 결과를 보여주는 그래프이고, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 9는, 정상적인 햄스터 뇌안에 있는 PrP 단백질의 총량 및 그 모델로부터 계산된 둘 다의 뇌안에 있는 β-시트 PrP^Sc의 양을 보여주는 그래프이고, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 10은, 스크래피 감염된 햄스터 뇌안에 있는 PrP 단백질의 총량 및 그 모델로부터 계산된 둘 다의 뇌안에 있는 β-시트 PrP^Sc의 양을 보여주는 그래프이고, 이때 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다. 세로좌표상의 SHaPrP의 농도는 수학식 1로부터 계산되었다. 정상적인 또는 스크래피-감염된 시리아 햄스터로부터 얻어진 5%(w/v) 뇌 균질물의 샘플은 5%(w/v) Prnp^0/0마우스 균질물로 연속적으로 희석되었다. 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 11은, 직접적인 분석과 식으로부터 계산될 때, 감염성과, β-시트 형태의 SHaPrP^Sc의 양의 상관관계를 보여주고, 이때 정제된 SHaPrP^Sc는 5% PrP^0/0마우스 뇌 균질물의 존재하에서 초음파처리되었고 설명된 대로 희석되었으며 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 12는, 나선형 입체구조를 위한 208nm와 222nm에서의 주요 띠 및 주로 β-시트 입체구조를 위한 217nm에서의 단일의 음성적인 띠를 보여주는 원편광이색성 (CD)분광법에 의하여 생산된 α-나선형 및 β-시트 입체구조인 βA4(1-40)의 그래프이다.

도 13은 가용성 A4β(1-40)의 직접적인 분석의 그래프이고;

도 14는 β-시트 형태의 A4β(1-40)의 직접적인 분석의 그래프이고;

도 15는 천연의 A4β(1-40)에 대한 변성된 A4β(1-40)의 비율을 보여주는 그래프이고;

도 16은, 직접적인 차별적인 분석에 의하여 측정될 때, 37℃에서 72시간동안 인큐베이션하는 동안 α-나선형에서 β-시트 입체구조로의 재조합체 ShaPrP90-231의 전환을 보여준다. ~24시간에서의 천연의 입체구조의 증가된 신호는, β-시트 2차 구조로의 전환으로 이어지는 보다 열린 입체구조를 가진 천연의 구조의 불안정화를 가리킨다(도 16을 참고). 단백질 농도는 5mg/ml였다;

도 17은 HFIP와 글리세롤 둘다가 재조합체 ShaPrP90-231의 α에서 β로의 입체구조 전이를 막을 수 있다는 것을 보여준다. TRF 신호에서의 변화는 변화율(fractional change)로서 표현되었고, 이때 양성값은 안정화를 가리키고 음성값은 불안정화를 가리킨다. 실험적인 조건은 도 1과 16대로 였다;

도 18에서: 펜토산 폴리설페이트(Pentosan polysulfate)가 낮은 농도에서 ShaPrP90-231의 천연의 입체구조를 안정화시키고; 콩고레드는 ShaPrP90-231의 안정성에 아무 효과가 없다. TRF 신호에서의 변화는 변화율로서 표현되었고, 이때 양성값은 안정화를 가리키고 음성값은 불안정화를 가리킨다. 실험적인 조건은 도 1과 16대로 였다;

도 19에서: 쯔비터이온성 세제 ZW3-12는 α-나선형 Sha90-231의 천연의 입체구조를 불안정화시켰다. 실험적인 조건은 도 1과 16대로 였고; TRF 신호에서의 변화는 변화율로서 표현되었고, 이때 양성값은 안정화를 가리키고 음성값은 불안정화를 가리킨다;

도 20은 정상적인 입체구조인 정제된 인간의 TTR을 이용한 직접적인 분석의 보정을 보여준다. 플레이트는 항-TTR 1차항체(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) 및 2차의 Eu-표지된 항-토끼 항체를 이용하여 전개되었다. 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 21은 아밀로이드 입체구조인 정제된 인간의 TTR을 이용한 직접적인 분석의 보정을 보여준다. 플레이트는 항-TTR 1차항체 및 2차의 Eu-표지된 항-토끼 항체를 이용하여 전개되었다. 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 22는, 상기에서 셜명된 대로 전개된, 정상적인 입체구조 및 아밀로이드 입체구조인 변성된 TTR 및 천연의 TTR의 신호사이의 비율을 보여준다. 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 23은: 항-TTR 다클론항체를 이용한 직접적인 분석에 의하여 얻어진 자료로부터 아밀로이드 입체구조인 TTR의 양을 계산하기 위한 변형된 식이다. 일반 방정식으로부터의 변화는 TTR의 정상적인 형태 및 아밀로이드 형태에 대한 변성된 상태 및 천연의 상태의 역비율을 반영한다. 샘플의 변성된 상태의 형광과, 천연의 정상적인 단백질로부터 변성된 상태로의 전이를 위하여 기대되는 형광사이의 차이는 아밀로이드 입체구조인 TTR의 양에 비례한다. F_n-천연의 입체구조의 총 신호; F_nN과 F_nA-각각, 정상적인 입체구조와 아밀로이드 입체구조의 신호; F_d-변성된 상태인 TTR의 총 신호; F_dN과 F_dA는 TTR의 변성된 정상적인 상태 또는 아밀로이드 상태의 신호이고; △F_n→d-천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이에 있어서의 신호의 총 증가; △F_Nn→d-천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이에 있어서의 정상적인 입체구조의 신호에서의 증가; △F_An→d-천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이에 있어서의 아미로이드 입체구조의 신호에서의 변화; f_Nn→d-정상적인 TTR의 천연의 상태에서 변성된 상태로의 변이를 위한 상관인자;

도 24는 "프리온 지수"(변성된 PrP 단백질 대 천연의 PrP 단백질에 대한 항체 결합의 비율) 대 ㎍/ml단위의 PrP^Sc의 농도의 그래프이다. 보여진 결과는 다른 프리온 스트레인으로 감염된 LVG/LAK 시리아 햄스터의 세개의 다른 뇌로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 25는 E. coli로부터 정제된 SHaPrP(90-231)의 원편광이색성(CD)분광법에 의하여 결정될 때의 그래프이다.

도 26-29는 본 발명의 면역분석을 통하여 PrP^Sc의 여덟개의 스트레인을 구별하기 위하여 사용된 모든 그래프이고, 이때:

도 26은 PrP^Sc와 비교된 총 PrP의 막대그래프이다. 칼럼과 막대는 다른 프리온 스트레인으로 감염된 LVG/LAK 시리아 햄스터의 세개의 다른 뇌로부터 얻어지고 세번의 독립적인 실험으로 측정된 평균±SEM을 나타낸다;

도 27은, 변성된/천연의 PrP에 대한 항체 결합의 비율을 나타내는 그래프이고, 다른 프리온 스트레인으로 감염된 시리아 햄스터의 뇌안에 있는 PrP^Sc의 농도의 함수이다. PrP^Sc의 농도(식 1) 및 변성된/천연의 PrP^Sc에 대한 항체 결합의 비율은 입체구조-의존성 면역분석에 의하여 측정되었다.

도 28은 다른 스크래피 스트레인으로 접종된 시리아 햄스터의 뇌 균질물의 그래프이고, C로 표시된 접종되지 않은 대조표준은 입체구조-의존성 면역분석전에 2시간동안 37℃에서 50㎍/ml의 프로테이나제 K를 이용하여 분해되었다;

도 29는 PrP^Sc의 프로테이나제 K-민감성 분획([PrP^Sc]-[PrP27-30])의 농도의 함수로서 플롯팅된 인큐베이션 시간의 그래프이다;

도 30과 31은 세개의 프리온 스트레인에서의 PrP^c와 PrP^Sc의 평형 해리 및 언폴딩을 보여주는 그래프이다. 평형 해리 및 언폴딩 동안의 변성된/천연의 PrP에 대한 항체 결합의 비율 및 프리온 단백질의 언폴딩의 분명한 변화율, 이때:

도 30은, 입체구조-의존성 면역분석에 의하여 분석된, 접종되지 않은 대조표준(C) 및 프리온의 Sc237, DY, 및 HY 스트레인으로 감염된 시리아 햄스터의 뇌로부터 얻어진 자료의 그래프이고; 변성된/천연의 PrP에 대한 항체 결합의 비율은 GdnHCl 농도의 함수로서 플롯팅된다;

도 31은 Sc237, DY, 및 HY 스트레인으로부터의 PrP^Sc의 분명한 변화율 언폴딩(F_app)을 보여주는 그러한 자료의 그래프이다. 점과 막대는 네번의 다른 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 32와 33은 변성된 상태 및 천연의 상태인 PrP에 대한 항체 결합의 비율의 동적인 범위 및 민감성을 보여주는 그래프이다. Sc237 프리온으로 접종시킨 후 ~70일에 CNS 기능장애의 징후를 보이는 시리아 햄스터의 뇌로부터 조제된 균질물[5%(w/v)]을, 5%(w/v) 정상적인 SHa 뇌 균질물로 연속적으로 희석하였고, 입체구조-의존성 면역분석에 의하여 NaPTA 침전후에 PrP^Sc의 존재를 측정하였는데, 이때:

도 32는, 스크래피-감염된 뇌 균질물의 희석의 함수로 플롯팅된 변성된 분액 및 천연의 분액의 형광 신호의 비율을 보여주는 그래프이고;

도 33은, PrP^c와 PrP^Sc의 절대량이, 수학식 1로부터 계산되었고 스크래피-감염된 뇌 균질물의 희석의 함수로서 플롯팅된 그래프이다. 자료점과 막대는 네번의 독립적인 측정으로부터 얻어진 평균±SEM을 나타낸다;

도 34와 35은 PrP^Sc의 여덟개의 스트레인을 위한 인큐베이션 시간을 보여주는 모든 그래프이고, 이때:

도 34는 인큐베이션 시간 대 총 PrP^Sc으로서 플롯팅된 각각의 스트레인을 보여주고;

도 35는 인큐베이션 시간 대 PrP 27-30인 처리 또는 프로테아제 저항성 PrP^Sc로서 플롯팅된 각각의 스트레인을 보여준다;

PrP^Sc또는 PrP 27-30의 인큐베이션 시간과의 상관관계가 분명하지 않은 도 34와 35를, 인큐베이션 시간 대 처리 또는 프로테아제 민감성 PrP^Sc, 즉 인큐베이션 시간 대 (총 PrP^Sc-PrP 27-30)를 프롯팅하는 자료를 위한 선형 관계를 보여주는 도 29를 비교하는 것이 가장 흥미로운데, 이 PrP 27-30은 프로테아제 저항성 PrP^Sc이다.

본 분석과 방법이 개시되고 설명되기 전에, 이 발명이, 그자체로서 물론 다양할 수 있을 특별한 항체, 단백질, 표지, 분석 또는 방법에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 특별한 구체예만을 설명하는 것을 목적으로 하며, 한정하려고 의도되지 않는다는 것도 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는, 이 발명이 속하는 당업계에서 보통의 기술을 가진 사람에 의하여 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 설명된 방법 및 물질과 비슷하거나 등가인 모든 방법 및 물질이 본 발명의 실시나 시험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본원에서 언급된 모든 출판물은 참고에 의해 본원에 연합되어, 그 출판물이 인용되는 것과 연결하여 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명한다.

본원에서 토의된 출판물은 본 출원의 제출일자전의 개시에 대하여만 제공된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 이전 발명의 덕분으로 그런 출판물을 예상할 자격이 있지는 않다는 것을 승인하는 것으로서 해석되지는 않아야 한다. 게다가, 제공된 출판물의 일자는, 실제적인 출판일자가 본원에서 제공된 일자와 다르다는 것이 발견되면 변화된다.

정의

본원에서 사용된 대로의 "단백질"이라는 용어는 어느 아미노산 서열이라도 둘러싸고 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함하도록 의도된다. 이 용어는 재조합적으로 또는 합성적으로 합성된 단백질과 펩티드는 물론, 자연-발생적인 단백질과 펩티드를 포함한다. 본 발명과 연결하여 사용될 때, "단백질"이라는 용어는, 적어도 두개의 다른 입체구조로 발생하는 자연-발생적인 단백질을 감싸도록 특정하게 의도되는데, 이때 두 입체구조 모두는 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 다른 3차원 구조를 가진다. 단백질의 두개의 입체구조는 질병 상태와 관련되지 않은 적어도 하나의 입체구조 및 질병 상태와 관련된--병원성의 적어도 하나의 입체구조를 포함한다. 이 개시와 연결하여 사용될 때의 단백질의 특정하고 바람직한 예는 PrP^c형태라고 불리는 비-질병 형태, 및 PrP^Sc라고 불리는 질병 관련된 형태를 포함하는 PrP 단백질이다. 프리온 단백질 또는 PrP 단백질의 PrP^Sc형태가 감염성이고 병원성이라 하더라도, 다른 단백질의 질병 입체구조은 병원성이지만 감염성이 아니다. 본원에서 사용될 때, 병원성이라는 용어는 단백질이 실제로 질병을 일으킨다는 것을 의미할 수 있을 것이지만, 단백질이 질병에 연관되어 있어서 질병이 존재할 때 그 단백질이 존재한다는 것을 단순히 의미할 수 있을 것이다. 그러므로, 이 개시에 연결하여 사용될 때의 병원성 단백질이 반드시 질병의 특이적인 원인물질인 단백질인 것은 아니다.

분석되고 있는 샘플은 많은 다른 단백질들을 포함할 수 있을 것이고 이러한 샘플의 단백질들은 원하는 결과를 얻기 위하여 하기에서 설명된 대로의 하나이상의 다른 유형의 처리을 통하여 처리된다.

"전처리"는 본 발명의 분석에서 적용되는 다른 유형의 처리중 가장 온건한 것을 설명하기 위하여 본원에서 사용된다. 전처리는, (1)쉽게 가수분해되거나 변성되고 (2)관심있는 단백질과 동일한 일반적인 유형이 아닌 단백질을 변성시키거나 가수분해시키기 위하여 방법의 초기에 선택적으로 수행된다. 전처리는, 오염물질 단백질을 분쇄하여 그것들이 관심있는 단백질을 포함하는 샘플로부터 보다 용이하게 제거될 수 있도록 하기 위하여 수행된다. 단기동안 낮은 농도의 프로테아제를 이용한 온건한 처리는 전처리를 위하여 사용될 수 있을 것이다. 전처리는, 샘플안에 존재할 것으로 예상되는 오염물질 단백질에 결합하는 항체와 샘플을 접촉시킴에 의한 것과 같은 다른 방법에 의하여, 오염물질 단백질을 제거할 수 있다.

"단백질 언폴딩 처리" 또는 "언폴딩 처리" 또는 "변성" 및 유사한 용어는, 샘플 또는 샘플의 부분 및 명확하게는 샘플안의 질병 입체구조인 단백질이 물리적으로 및/또는 화학적으로 조작되어서, 예를 들어 이전에는 노출되지 않았거나 부분적으로 노출된 항원결정부을 노출시킴으로써, 샘플안에 있는 질병 관련된 입체구조인 단백질이 어느 정도까지 언폴딩하도록 되는, 즉 항체와 같은 결합 파트너와 더 높은 결합 친화성을 가지는 다른 입체구조로 변화되는 과정을 설명하기 위하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 방법으로 처리된 단백질은 이완된 입체구조인 단백질이라고 불리는데, 이완된 입체구조는 항체와 같은 결합 파트너에 대한 단백질의 결합 친화성을 증가시킨다. 언폴딩 처리는 샘플에 열, 압력 및/또는 화학물질을 가하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, PrP^Sc(β-시트 구조의 배열을 포함하는 질병-관련된 입체구조)를 포함하는 샘플이 처리되어(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드를 이용하여)단백질이 네배이상 큰 항체 결합 친화성을 가지는 다른 입체구조(예를 들어, α-나선형 및/또는 무작위적 코일 배열을 포함하는)를 취하게 된다.

"제한된 프로테아제 처리"는, 처리에 매우 저항성인 단백질(예를 들어, 프로테아제 저항성 PrP^Sc-즉, PrP27-30)을 제외한 모든 또는 실질적으로 모든 단백질이 조각들, 즉 작은 펩티드 및/또는 아미노산으로 가수분해되거나 쪼개지도록 단백질 샘플을 처리하는 것을 의미한다. 이 유형의 용해처리(lytic treatment)는, 제한된 프로테아제 처리에 "민감성"인 질병 입체구조인 관심있는 단백질은 물론, 비-질병 배열인 관심있는 단백질을 가수분해하기 위하여 수행된다. 제한된 프로테아제 처리에 의하여 가수분해되지 않는 유일한 단백질은 이 처리에 "저항성"인 질병 입체구조(예를 들어, PrP 27-30)인 관심있는 단백질이다.

원하는 유형의 처리를 얻기 위하여 필요한 매개변수(예를 들어, 온도, 시간, 프로테아제 유형 및 농도)를 결정함에 있어서, 어느정도의 시행착오가 예상된다. 전처리를 위한 온건한 조건, 언폴딩을 위한 중간의 조건, 그리고 제한된 프로테아제 처리를 위한 가혹한 조건.

"PrP 단백질", "PrP" 및 유사한 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고 인간과 동물에서 질병(해면양 뇌병증)를 일으킨다고 알려진 감염성 입자 형태 PrP^Sc와, 적당한 조건하에서 감염성 PrP^Sc형태로 전환되는 비감염성 형태 PrP^c둘 모두를 의미할 것이다.

"프리온", "프리온 단백질" 및 "PrP^Sc단백질" 및 유사한 용어는, PrP 단백질의 감염성 PrP^Sc형태를 가리키기 위해 본 발명자들이 본원에서 상호교환가능하게 사용하였고, "단백질"과 "감염"이라는 단어의 단축이다. 입자는 PrP 유전자에 의하여 암호화되는 PrP^Sc분자로 배타적이지 않다면 주로 구성된다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 다르다. 기지의 프리온은 동물을 감염시켜 소과의 해면양 뇌병증(BSE), 또는 "광우병", 및 고양이의 고양이과 해면양 뇌병증은 물론, 양과 염소의 신경계의 전파가능한, 퇴행성 질병인 스크래피를 일으킨다. 인간에게 침범하는 것으로 알려진 네개의 프리온 질병은 (1)쿠루병, 2)크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3)게르스트만-스트로이슬러-쉐인커병 (GSS), 및 (4)치명적인 가족성 불면증(FFI)이다. 본원에서 사용될 때 "프리온"은, 사용된 어느 동물에서건- 및 특히 인간과 길들여진 농장 동물에서 이러한 질병이나 다른 질병중 모두 또는 어느 질병을 일으키는 모든 형태의 프리온을 포함한다.

"PrP 유전자"라는 용어는 기지의 다형(polymorphism) 및 병원성 돌연변이를 포함하는 단백질을 발현하는 유전 물질을 설명하기 위하여 본원에서 사용된다. "PrP 유전자"라는 용어는 일반적으로, 어떠한 형태의 프리온 단백질이라도 암호화하는 어떤 종이든지의 어떤 유전자라도 가리킨다. 흔히 PrP 서열이라 알려진 몇몇은 그런 서열을 개시하고 설명하기 위하여 참고에 의하여 본원에 연합된 Gabriel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1992)와 US 특허 제5,565,186호; 제5,763,740호; 제5,792,901호; 및 WO97/04814에서 설명된다. PrP 유전자는 본원에서 설명된 "숙주" 및 "시험" 동물을 포함하여 어떤 동물로부터이든 얻어질 수 있으며 그것의 어떤 또는 모든 다형 및 돌연변이일수 있는데, 그 용어는 언젠가 발견될 다른 그런 PrP 유전자를 포함한다고 인식된다. 그런 유전자에 의하여 발현되는 단백질은 PrP^c(비-질병) 또는 PrP^Sc(질병) 형태를 취할 수 있다.

"항체"라는 용어는 항원과 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 나타낸다. 본원에서 사용될 때의 항체는, 관심있는 항원결정부(epitope), 항원 또는 항원성 단편과 결합할 수 있는 항체단편(예를 들어, F(ab)', Fab, Fv)은 물론 전체 항체를 포함하도록 의미된다. 본 발명의 분석을 위한 바람직한 구체예는 관심있는 단백질, 예를 들어 A4β 아밀로이드 단백질 또는 PrP 단백질에 대하여 면역반응성이거나 면역특이적이어서 특이적으로 또는 선택적으로 그 단백질에 결합한다. 천연의 비-질병 형태와 처리된 질병 형태 둘 모두에 대해서는 면역반응성이거나 면역특이적이지만 미처리된 질병 형태에 대해서는 면역반응성이거나 면역특이적이지 않은(예를 들어, 천연의 PrP^c과 처리된 PrP^Sc에 대해서는 면역반응성이거나 면역특이적이지만 천연의 PrP^Sc에 대해서는 면역반응성이거나 면역특이적이지 않은) 항체가 바람직하다. PrP에 대한 항체는 바람직하게는 면역특이적이다-예를 들어, 관련된 물질과 실질적으로 교차-반응성이 아니다. 본 발명과 연결하여 사용될 수 있는 몇몇 특이적인 항체는, 항체를 설명하고 개시하기 위하여 본원에 참고에 의하여 연합된 공개된 PCT 출원 WO 97/10505에서 개시된다. 이 공개된 PCT 출원은, 또한 참고에 의하여 본원에 연합된 USSN 08/713,939에 상응한다. PrP^Sc와 선택적으로 결합하는 그 PCT 출원에서 개시된 항체는 본 발명의 기본적인 분석을 수행하기 위하여 사용되어서는 않되지만, 다른 단백질이 변성될 때 PrP^Sc의 존재를 확인하기 위하여 사용될 수 있을 것이다. "항체"라는 용어는 모든 유형의 항체, 예를 들어 단클론성, 다클론성 및 파지 전시(phage display) 방법에 의하여 생산되는 항체들을 둘러싼다. 본 발명의 특히 바람직한 항체는 천연의 PrP^c와 처리된 PrP^Sc에 대하여 상대적으로 높은 정도의 친화성을 가지지만 PrP^Sc에 대해서는 상대적으로 낮은 정도의 친화성을 가지거나 실질적으로 친화성을 가지지 않는 항체이다. 보다 명확하게 말하면, 본 발명의 항체는 천연의 PrP^Sc에 대한 결합 친화성과 비교될 때, 천연의 PrP^c과 변성된 PrP^Sc둘 모두에 대하여 바람직하게는 네배이상, 더욱 바람직하게는 15배이상, 더욱더 바람직하게는 30배이상의 결합 친화성을 가진다.

PrP^c에 결합하기 위한 한 유용한 항체는, PrP^c에 선택적으로 결합하는 항체를 개시하기 위하여 참고에 의하여 연합된, 1986년 10월 8일에 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852에서 기탁된 하이브리도마 셀라인 ATCC HB9222에 의하여 생산되고 1989년 2월 21일에 발행된 U.S. 특허 제4,806,627호에서 개시되고 설명된 단클론항체 263K 3F4이다.

"정제된 항체"는 자연적으로 연관되는 다른 단백질, 탄수화물, 및 지질이 충분히 없는 항체를 가리킨다. 그런 항체는, A4β 또는 PrP^Sc단백질 (또는 그것의 항원성 단편)의 β-시트 입체구조와 같은 단백질의 처리되거나 변성된 질병 입체구조에 "우선적으로 결합"하고, 다른 항원적으로 관련되지 않은 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지는 않는다. 본 발명의 정제된 항체는, 바람직하게는 특이적인 종과 면역반응성이고 특이적인 종에 대해 면역특이적이며 보다 바람직하게는 천연의 PrP^c및 처리되거나 변성된 형태의 PrP^c와 PrP^Sc에 대해서는 면역특이적이지만 천연의 또는 미처리된 PrP^Sc에 대해서는 면역특이적이지 않다.

단백질(예를 들어, PrP 단백질)의 "항원성 단편"은 항체를 결합할 수 있는 그런 단백질의 부분으로 의미된다.

"특이적으로 결합한다"에 의하여, 특이적인 폴리펩티드, 예를 들어 PrP^Sc및 A4β 단백질과 같은 단백질의 항원결정부에 대한 항체의 높은 결합활성(avidity) 및/또는 높은 친화성 결합이 의미된다. 특이적인 폴리펩티드상의 항원결정부에 대한 항체 결합은, 바람직하게는 어떤 다른 항원결정부, 특히 연관된 분자안이나 동일한 샘플안에 존재할 수 있을 것들에 대한 동일한 항체의 결합보다 강한데, 예를 들어 관심있는 특이적인 폴리펩티드가 PrP^Sc와 같은 단백질의 항원결정부 단편에 보다 강하게 결합해서, 결합조건을 조정함으로써 PrP^Sc의 처리에 의하여 노출되고 천연의 미처리된 PrP^Sc상에서는 노출되지 않는 항원결정부 단편과 같은 원하는 단백질의 항원결정부 부위 또는 단편에 항체가 거의 배타적으로 결합하도록 하기 때문이다.

"검출가능하게 표지된 항체", " 검출가능하게 표지된 항-PrP" 또는 "검출가능하게 표지된 항-PrP 단편"에 의하여 부착된 검출가능한 표지를 가진 항체 (또는 결합특이성을 보유한 항체 단편)가 의미된다. 검출가능한 단편은 보통 화학적 결합에 의하여 부착되지만, 표지가 폴리펩티드인 경우에, 양자택일적으로 유전공학 기술에 의하여 부착될 수 있을 것이다. 검출가능하게 표지된 단백질의 생산을 위한 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다. 검출가능한 표지는 당업계에서 알려져 있으나, 보통 검출가능한 신호를 방출하거나(예를 들어, 방사능, 형광, 색) 그 기질에 표지를 노출시킨 후 검출가능한 표지를 방출하는 방사성동위원소, 형광단(fluorophores), 상자성 표지, 효소(서양고추냉이 퍼옥시다제), 또는 다른 모이어티(moeities) 또는 화합물이다. 다양한 검출가능한 표지/기질 짝(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제/디아미노벤지딘, 아비딘/스트렙타비딘, 루시퍼라제/루시페린), 항체를 표지하기 위한 방법, 및 표지된 항체를 이용하기 위한 방법이 당업계에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Harlow와 Lane, eds (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY을 참고하라). 유로퓸(Europium)은 특히 바람직한 표지이다.

본원에서 사용된 약어는 다음을 포함한다:

중추신경계를 위한 CNS;

소과의 해면양 뇌병증을 위한 BSE;

크로이츠펠트-야콥병을 위한 CJD;

치명적인 가족성 불면증을 위한 FFI;

구아니딘 하이드로클로라이드를 위한 GdnHCl;

게르스트만-스트로이슬러-쉐인커병을 위한 GSS;

인간을 위한 Hu;

인간의 프리온 단백질을 위한 HuPrP;

마우스를 위한 Mo;

마우스 프리온 단백질을 위한 MoPrP;

시리아 햄스터를 위한 SHa;

시리아 햄스터 프리온 단백질을 위한 SHaPrP;

트랜스제닉을 위한 Tg;

시리아 햄스터의 PrP 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 위한 Tg(SHaPrP);

완전한 인간의 PrP 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 위한 Tg(HuPrP);

완전한 양의 PrP 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 위한 Tg(ShePrP);

완전한 소의 PrP 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 위한 Tg(BovPrP);

프리온 단백질의 스크래피 이소형을 위한 PrP^Sc;

프리온 단백질의 세포의 포함된 흔한, 정상적인 이소형을 위한 PrP^c;

PrP^Sc의 처리 또는 프로테아제 저항성 형태를 위한 PrP 27-30 또는 PrP^Sc27-30;

마우스 프리온 단백질의 스크래피 이소형을 위한 MoPrP^Sc;

9개의 코돈에서 마우스 PrP와 차이가 나는 상응하는 인간의 서열에 의해 마우스 PrP 유전자의 영역이 대치된 키메라 마우스/인간 PrP 유전자를 위한 MHu2M;

Tg(MHu2M) 마우스는 키메라 MHu2M 유전자를 포함하는 본 발명의 트랜스제닉 마우스이고;

키메라 인간/마우스 PrP 유전자의 스크래피 이소형을 위한 MHu2MPrP^Sc;

PrP 유전자의 CJD 이소형을 위한 PrP^CJD;

내생의 프리온 단백질 유전자, 예를 들어 MoPrP 유전자의 두 대립유전자 모두의 제거를 위한 Prnp^0/0;

SHaPrP를 발현하는 특별한 계열(81)의 트랜스제닉 마우스를 위한 Tg(SHaPrP^+/0)81/Prnp^0/0, +/0은 이종접합성을 가리킨다;

인간의 프리온 단백질 유전자(HuPrP)를 가진 마우스를 내생의 프리온 단백질 유전자의 두 대립유전자 모두가 혼란된 마우스와 교차시킴으로써 얻어지는 하이브리드 마우스를 위한 Tg(HuPrP)/Prnp^0/0;

키메라 프리온 단백질 유전자(Mhu2M)를 가진 마우스를 내생의 프리온 단백질 유전자의 두 대립유전자 모두가 혼란된 마우스와 교차시킴으로써 얻어지는 하이브리드 마우스를 위한 Tg(MHu2M)Prnp^0/0;

트랜스티레틴을 위한 TTR;

FVB 마우스의 난자가 상대적으로 크고 외래의 DNA의 미세주사를 상대적으로 잘 견뎌내기 때문에 트랜스제닉 마우스의 생산에 종종 이용되는 표준적인 동종번식의 마우스 스트레인을 위한 FVB;

[PrP_β]- β-시트 입체구조인 프리온 단백질의 농도;

[βA4_β]- β-시트 입체구조인 βA4의 농도;

[DRC]- 단백질의 질병 관련 입체구조의 농도.

발명의 일반적인 양태

분석 방법은, 첫번째의 입체구조 및 두번째의 질병 관련된 입체구조를 취하는 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 샘플을 제공하는 것을 포함하고, 비-질병 입체구조의 농도에 상대적인 매우 낮은 농도로 존재하는 질병 입체구조의 단백질을 검출할 수 있다. 샘플은 첫번째의 부분과 두번째의 부분으로 나누어진다. 첫번째의 부분을, 바람직하게는 고체 지지물질의 표면에 결합시킨 후, 표지된 항체와 접촉시킨다. 항체는, 두번째의 질병 관련된 입체구조인 단백질에 결합하는 것보다 더 높은(네배이상의) 정도의 친화성을 가지고 첫번째의 입체구조인 단백질에 결합하는 유형의 것이다. 그리고나서, 샘플의 두번째의 부분은, 두번째의, 질병 관련된 입체구조인 모든 단백질이 다른 입체구조를 취하게 하는 언폴딩 처리에 처해지는데, 이 다른 구조는, 미처리된 두번째의 질병 관련된 입체구조인 단백질에 대한 친화성과 비교될 때 표지된 항체에 대하여 보다 높은 정도의(네배이상의) 친화성을 가진다. 그리고나서, 바람직하게는, 두번째의 부분(언폴딩 처리된)은 고체 지지물질의 표면에 결합된다. 그리고나서, 지지물질에 결합된 처리된 단백질은, 첫번째의 입체구조인 단백질 또는 언폴딩된 입체구조인 단백질에 항체가 결합하도록 허용하는 조건하에서 표지된 항체와 접촉된다.

표지된 항체가 각각의 부분안에 존재하는 적당한 단백질에 결합하기에 충분한 시간, 온도 및 화학적 조건(예를 들어, pH)과 함께 제공된 후, 각 부분안에서의 단백질에 대한 표지된 항체의 결합의 수준이 측정된다. 시간-분해성의, 해리-증강성의 형광 또는 이중의 파장, 레이저-구동된 형광분석기를 포함하는 분석과 같은 고도로 민감한 분석이 사용되어, 약 1 x 10³개 입자/ml이하의 범위내의 양인 농도를 검출하는 것을 가능하게 한다. 대부분의 샘플안에서 비-질병 입체구조인 단백질의 농도에 비교하여 질병 입체구조인 단백질의 농도가 매우 낮기 때문에, 예를 들어 10의 3승이상이 다르기 때문에, 높은 정도의 민감성이 요구된다. 예를 들어, 단백질의 질병 입체구조가 1 x 10⁴개 입자/ml의 양으로만 존재하는 반면, 단백질의 비-질병 입체구조는 약 1 x 10⁸개 입자/ml의 양으로 존재할 수 있을 것이다. 그러므로, 단백질의 질병 입체구조를 언폴딩 처리함에 기인하여 주목되는 신호에서의 증가는, 비-질병 입체구조인 단백질로부터 얻어지고 있는 신호에 비하여 매우 작을 것이다.

샘플의 두 부분 다에 대한 결합의 수준이 얻어진 후, 그 수준을 비교한다. 예를 들어, 첫번째의 부분안의 단백질에 대한 표지된 항체의 결합의 수준을, 두번째의 부분안의 단백질에 대한 항체의 결합의 수준으로부터 공제한다. 둘사이의 차이는 두번째의, 질병 관련된 입체구조였던 원래의 샘플안에 있는 단백질의 양을 반영한다 -- 첫번째의 부분안의 단백질의 결합 친화성을 증가시킴으로써 생기는 차이를 (만약 존재한다면) 조정한 후에.

보다 명확하게 말하면, 몇몇 단백질에 있어서, 천연의 비-질병 입체구조인 단백질에 미치는 언폴딩 처리의 효과에 기인한 어느정도의 차이가 있을 수 있을 것이다 -- 예를 들어, 질병 관련된 입체구조인 단백질의 보다 많은 항원결정부가 처리에 의하여 노출된다. 이러한 차이는, 원래의 샘플이 두번째의, 질병 관련된 입체구조를 포함했는가에 관하여 결론을 끌어내는에 있어서 설명되어야 한다. 이러한 효과를 설명하는 것은 도 3과 4에서 보여진다. 도 3에서, 비-질병 배열인 천연의 단백질만을 포함하는 미처리된 샘플에 대한 항체 결합을, 언폴딩 처리 후 동일한 천연의 단백질과 비교한 것이 보여진다. 도 3에서 보여지는 대로, 언폴딩 처리가 단백질의 결합 친화성을 증가시켰다는 점에서, 보다 강한 신호를 보여주는 처리된 단백질을 이용하여 얻어진 결과들사이에 어느정도의 차이가 있다. 그러나, 도 4는, 원래의 샘플이 두번째의, 질병 관련된 입체구조인 단백질을 포함했을 때의 동일한 결과를 보여준다. 언폴딩 처리되지 않은 천연의(PrP^Sc) 질병 관련된 단백질은 매우 약한 신호를 제공한다. 언폴딩 처리된 PrP^Sc샘플과 미처리된 또는 천연의 PrP^Sc샘플사이의 큰 차이는, 그 단백질이 항체에 결합하지 않거나 매우 낮은 정도의 결합 친화성을 가지고 항체에 결합하는 두번째의, 질병 관련된 입체구조를 가진 단백질을 원래의 샘플이 포함했다는 것의 분명한 표시이다. 그러나, 언폴딩 처리후에, 이러한 단백질은, 언폴딩 처리를 통하여 처리된 비-질병 입체구조인 단백질만큼 잘, 또는 거의 그만큼 잘, 또는 그보다 더 잘 항체에 결합한다.

본 분석은, 어떤 유형이든 그 샘플안의 주어진 단백질의 질병 입체구조의 존재에 대하여 시험하기 위하여 사용될 수 있다. 시험될 몇몇의 가장 전형적인 샘플에는, 살아있는 포유동물로부터 유도된 성분을 포함하거나 그것의 가공에 있어서 살아있는 포유동물로부터 유도된 물질을 사용하는 약제가 포함된다. 이식을 위한 기관 또는, 감염성 프리온을 포함하는 것으로 추정되는 소고기와 같은 식품 품목을 시험하기 위하여 이 분석이 또한 바람직할 수 있을 것이다. 본 발명은, 약제, 화장품, 생검 또는 검시 조직, 뇌, 척수, 말초신경, 근육, 뇌척수액, 혈액 및 혈액성분, 림프절, 및 프리온과 같은 단백질의 질병 형태에 의하여 감염되거나 잠재적으로 감염된 동물 또는 인간-유도된 배양안에 있는 감염성 PrP^Sc와 같은 하나이상의 유형의 단백질의 질병 입체구조의 존재에 대하여 시험하기 위하여 사용될 수 있을 것이다.

처리-언폴딩

본 발명의 분석은, 상기에서 정의된 세가지의 기본적인 처리 유형중 모두 또는 어떤 것을 사용할 수 있다. 그 처리들은 (1)전처리, (2)언폴딩 처리 및 (3)제한된 프로테아제 처리이다. 일반적으로, 전처리를 위한 조건은 온건하고, 언폴딩 처리를 위한 조건은 중간이고 제한된 프로테아제 처리를 위한 조건은 가혹하다. 각각의 유형의 처리는 동일한 방법(예를 들어, 시간, 온도 등)을 사용할 수 있지만, 예를 들어, 보다 높은 농도, 보다 긴 시간, 보다 높은 온도로 각각 다른 정도로 사용한다.

언폴딩 처리는 단백질을 변성시키지만 관심있는 단백질을 가수분해하지 않으며, 단단하게 된, 질병 관련된 입체구조로 원래 존재하는 단백질이, 항체와 같은 결합 파트너에 대하여 보다 높은 정도의 결합 친화성을 가지는 보다 이완된 입체구조를 취하도록 하는 어떤 물리적 및/또는 화학적 방법에라도 단백질을 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 언폴딩 처리는, 이전에는 노출되지 않았거나 부분적으로 노출되었던 단백질상의 항원결정부가 노출되거나 보다 노출되어서 항체나 다른 결합 파트너가 새롭게 노출된 항원결정부에 보다 쉽게 결합할 수 있도록 하는 몇가지 방법에 단백질을 처하게 하는 것을 포함한다. 언폴딩 처리를 위하여 사용되는 방법은 (1)정수압 또는 온도와 같은 물리적인 방법, (2)산성 또는 염기성의 pH, 카오트로픽 염, 변성시키는 세제, 구아니딘 하이드로클로라이드 및 프로테이나제 K와 같은 프로테이나제와 같은 화학적인 방법, 및 (3)상기의 조합을 포함할 수 있을 것이다.

처리 시간은 사용된 처리에 따라 다양할 것이지만, 원하는 효과를 얻기에, 예를 들어 언폴딩 처리가 새로운 결합 부위를 노출시키기에 충분한 시간동안 수행되어야 하지만, 단백질을 완전히 변성시키거나 가수분해시킬 만큼 길지 않아야 한다. 화학적인 처리없이 PrP 단백질에 언폴딩 처리를 수행할 때, PrP^Sc언폴딩의 원하는 양을 얻기에 충분한 시간동안 약 40℃에서 약 80℃까지 온도를 올린다. pH를 12 또는 13으로 올린다면 온도는 더 낮을 수 있고 시간은 더 짧을 수 있다.

전처리

샘플의 부분의 처리 또는 항체 시험을 수행하기 전에, 단백질에 전처리하는 것이 바람직할 수 있을 것이다. 전처리는, 샘플안에 존재하는 어느정도의 비-질병 형태의 단백질은 물론, 관련되지 않은 단백질을 파괴하거나 제거하기 위하여 수행된다. 전처리 방법론의 예에는, 지지물질 표면에 결합된 항체를 포함하는 칼럼을 생산하는 것이 포함되는데, 이 항체는 단백질의 비-질병 입체구조에 결합함으로써 가능한한 많은 비-질병 입체구조의 단백질을 제거한다. 관련되지 않지만 흔한 단백질에 결합하는 항체가 또한 사용될 수 있다. 양자택일적으로, 샘플은, 장기간의 정수압 또는 온도와 같은 물리적인 처리에 단독으로 처해지거나 또는 상기에 가리켜진 대로의 산 또는 염기와 같은 화학물질과 조합하여 물리적인 처리에 처해져서 샘플안에 존재하는 단백질을 파괴할 수 있는데, 이 단백질은 분석되고 있는 단백질에 관련되지 않는 단백질 또는 비-질병 입체구조인 단백질이다. 몇가지 예에서, 비-질병 및 질병 입체구조인 단백질이 파괴될 것이다. 그러나, 보다 높은 상대적인 백분율의 비-질병 입체구조인 단백질이 파괴될 것인데, 이 단백질이 처음에 보다 파괴되기 쉬운 보다 느슨한 입체구조이기 때문이다. 그러므로, 전처리 방법론의 결과, 단백질의 질병 입체구조의 농도에 비하여 상대적으로 더 낮은 농도의 비-질병 입체구조의 단백질을 포함하는 샘플이 생긴다. 이것은 분석의 민감성을 증가시켜서 보다 낮은 농도의 질병 입체구조의 단백질을 검출하는 것을 가능하게 한다. 질병 입체구조가 파괴되면 파괴가 민감성을 감소시킨다는 점에서 단백질의 제거는 그러한 것의 파괴보다 바람직하다. 특히 유용한 전처리 방법은 "Process for Concentrating Protein with Disease-Related Conformation"이라는 제목의 본 발명자들의 특허출원 일련번호 09/026,967에서 개시된다.

제한된 프로테아제 처리-용해 처리

제한된 프로테아제 처리는, 본 발명의 분석을 위하여 샘플을 조제하는데 사용되는 가장 가혹한 처리 방법인 용해처리이다. 샘플의 부분에 전처리 처리를 한 후에, 그것을 두 부분으로 나누고 두 부분중의 하나에 언폴딩 처리를 한다. 만약, 질병 관련된 단백질이 샘플안에 존재한다는 것을 기본적인 분석이 보여주면, 질병 관련된 단백질의 총량 (또는 농도)를 측정한다. 그리고나서, 원래의 샘플의 또하나의 부분 또는 분리된 총 질병 관련된 단백질에 제한된 프로테아제 처리를 한다. 이 처리는, 제한된 프로테아제 처리에 저항성인 질병 관련된 단백질(예를 들어, PrP 27-30)을 제외하고, 샘플안에 있는 모든 또는 실질적으로 모든 단백질을 파괴하거나 가수분해할 것이다. 그리고나서, 이 프로테아제 저항성 단백질의 양(또는 농도)이 측정되고, 질병 관련된 단백질의 총량으로부터 공제되어 프로테아제 민감성인 질병 관련된 단백질(예를 들어, 프로테아제-민감성 PrP^Sc)을 찾는다. 제한된 프로테아제 처리 또는 용해 처리에는, (1)화합물을 강하게 환원시키거나 산화시키는, pH에 있어서 극단(예를 들어, 2이하 또는 12이상)에 노출되는 것과 같은 화학적인 방법; 및/또는 (2)프로테아제(예를들어, 프로테이나제 K)와 같은 효소적인 방법이 포함될 수 있을 것이다. 시간과 온도는 물론 처리하는 화합물의 농도는 처리되고 있는 단백질 및 얻어질 최종 결과에 따라 다양할 것이다. PrP 단백질을 처리할 때, 처리는, (1)샘플안에 존재하는 모든 또는 실질적으로 모든 비-PrP 단백질을 가수분해시키고; (2)존재하는 모든 또는 실질적으로 모든 비-PrP^c단백질을 가수분해시키고; (3)존재하는 프로테아제 민감성 PrP^Sc를 가수분해시키고; (4)존재하는 프로테아제 저항성 PrP^Sc의 65개의 N-말단의 아미노산을 가수분해시킴으로써 PrP 27-30만이 가수분해되지 않고 남게하기 위하여 수행된다.

제한된 프로테아제 처리는, 언폴딩 처리 또는 전처리와 같이 온도를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, PrP 단백질의 가수분해는 1 내지 3일동안 80℃이상 132℃까지 가열함으로써 얻어질 수 있다. 시간과 온도는 pH를 12 또는 13까지 올림으로써 유의하게 감소될 수 있다. 이 처리의 목적은 단백질을 언폴딩시키는 것보다 더이상을 하고 단백질을 가수분해시키는 것이다.

지지물질 표면에 단백질을 결합시키는 것

플라스틱 지지물질에의 PrP 단백질의 화학적 또는 친화성 결합의 방법은 이용가능한 문헌에서 일반적으로 설명되고 다양할 수 있을 것이다. 진단상의 분석에서 사용되는 항체는 다클론성, 단클론성 또는 재조합체 Fab이고, 천연의 PrP^c또는 변성된 형태의 PrP^Sc에 우선적으로 결합하고, 동일한 양의 항원을 가정할 때 바람직하게는 감염성 PrP^Sc와의 반응성은 적어도 네배 더 낮은 종 특이성이 있을 필요가 있다.

프리온(PrP^Sc)을 검출하기 위하여 분석을 사용하기

본 발명의 한 양태는, 샘플 물질안에 있거나 그러한 물질로 접종된 감염되지 쉬운 동물의 뇌안에 있는 천연의 감염성 형태의 PrP^Sc단백질을 정량적으로 측정함으로써 프리온 질병을 진단하기 위한 두 단계 과정이다. 바람직하게는 샘플을 전처리하여 가능한한 많은 관련되지 않은 단백질과 비-질병 단백질을 제거한다. 전처리된 샘플을 두개의 분액으로 나눈다. 첫번째의 분액은, 비-변성 조건하에서 화학적인 활성화 단계를 통하여 천연의 입체구조로, 즉 미처리로 고체 플라스틱 지지물질에 교차연결된다. 샘플의 두번째의 부분은 먼저 언폴딩 처리된 후 플라스틱 지지물질에 교차연결된다. 샘플 물질의 두 부분 다는, 주어진 동물 종의 천연의 PrP^c또는 언폴딩 처리된 PrP^Sc를 우선적으로 인식하는 표지된 항체와 인시튜 반응한다. 언폴딩 처리된 또는 천연의 입체구조의 PrP 단백질에 결합된 항체의 양은 IgG 표지의 신호에 의하여 보고된다. 천연의 α-나선형 입체구조의 PrP^c를 이용하여 얻어진 신호에서의 증가로부터 예상되는 것을 넘은 언폴딩 처리된 샘플의 부분을 이용하여 얻어진 신호의 초과량(즉, 조정된 양을 넘은 증가)은 원래의 샘플안에 있는 감염성 β-시트 구조의 PrP^Sc의 양의 측정이다. PrP^Sc함유량의 계산을 위하여 전개된 식은 본원에서 제공된 식에서 보여지고 실시예 11에서 예시된다.

프리온의 존재의 진단은 세개의 절차:(1)처리된 샘플 단독의 측정 및 정상적인 대조 표준으로부터 얻어진 PrP^c의 배경수준 이상의, 검사된 샘플안의 총 PrP 양에서의 증가를 검출함으로써의 측정; (2)주어진 항체에 대한 변성된 신호 대 천연의 신호사이의 비율의 계산-예를 들어, 바람직하게는 시간-분해성, 해리-증강성 형광을 사용하여 유로퓸-표지된 3F4 IgG에 대하여 2.2 보다 높은 값은 PrP^Sc의 존재를 가리키고; (3)PrP^c의 α-나선형 입체구조를 위한 신호에서의 증가로부터 예상되는 것을 넘은 변성된 샘플 신호의 초과량을, 원래의 샘플안에 있는 감염성 β-시트 구조의 PrP^Sc양의 측정으로서 평가하는 것에 의하여 확립된다. 바람직하게는, 단계 (1)전에 방법이 전-처리 단계를 이용함으로써 PrP^Sc의 상대량보다 더 큰 상대량으로 PrP^c가 제거되거나 파괴된다.

스크래피 감염된 시리아 햄스터 뇌에서, 그 동물이 병들었을 때 PrP^Sc의 농도는 PrP^c보다 5-10배 더 높다. 이때에, 그것의 뇌안의 프리온 역가는 10% 균질물의 10⁷-10⁸ID₅₀유니트/ml이다. 본 발명자들이 개발한 고도로 정량적인 체계는 본 발명자들이 PrP^c신호를 공제하는 것을 허용한다. 공제는 PrP^Sc의 농도가 PrP^c보다 클 때 쉽게 수행될 수 있다. 그러나, PrP^Sc가 PrP^c보다 훨씬 작을 때 공제는 어려워진다.

앞서 말한 문제를 제거하기 위하여, 본 분석은 다른 입체구조의 항원과 항체사이의 친화성의 원리를 이용한다. PrP^Sc가 PrP^c보다 훨씬 작을 때 PrP^Sc의 농도를 측정하기 위하여, 검출 체계는 극단적인 민감성 및 적어도 10⁴의 선형의 범위를 가져야 한다. 본원에서 설명된 분석은 유로퓸-표지된 IgG를 사용하여 PrP^Sc를 (약) 50pg/ml의 농도에서 쉽게 검출할 수 있다. ID₅₀유니트 당 10⁵-10⁶개의 PrP^Sc분자를 가정하면, 본 분석은 5 x 10²-5 x 10³ID₅₀유니트/ml을 쉽게 검출할 수 있다.

이 분석은, PrP^Sc의 농도가 PrP^c의 농도의 1% 미만인 혼합물에서 (직접적인 분석에 의하여) PrP^Sc를 검출할 수 있다. 추가적인 민감성은, 면역침전에 의하여, 고체상태 분석을 위한 샌드위치 포맷, PrP^c를 제거하기 위한 세제 추출을 이용한 분획원심분리, 간접적인 트랜스제닉 동물 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 이용하여 성취될 수 있다. 보존적인 평가는, 그러한 절차가 5와 50 ID₅₀유니트/ml 사이의 측정을 허용해야 한다는 것이지만, 덜 보존적으로는 0.1과 0.01 ID₅₀유니트/ml사이를 측정한다. 그러한 측정은 감염성이 "부재"하는 생물학적인 무균을 확립하는 신속하고 "적극적인" 방법을 제공할 것이다.

항체

항체를 발생시키는 방법은 일반적으로 당업계에서 숙련된 사람들에게 알려져있다. 질병 형태는 종종 비-질병 형태보다 더 단단한 배열이고 항원결정부를 덜 노출시킨다는 점에서, 단배질의 비-질병 형태 또는 처리된 질병 형태에만 결합하는 항체가 쉽게 발생될 수 있다. 예를 들어, 처리된 형태의 PrP^Sc단백질및 PrP^c단백질을 검출하는 항체는, 재조합체 PrP, 동물의 뇌로부터의 천연의 PrP^c, α-나선형 또는 무작위적 코일 입체구조인 합성 펩티드을 이용하여, 또는 변성된 PrP^Sc또는 PrP 27-30에 대항하여 토끼 또는 마우스를 면역시킴으로써 발생될 수 있을 것이다. PrP^Sc에 대한 친화성에 비교하여 PrP^c(또는 동일 종의 PrP^Sc의 변성된 입체구조)에 대하여 적어도 4배 더 높은 친화성을 가지는 항체만이 선택되어야 한다. 항체 발생, 정제, 표지 및 검출의 방법은 다양할 수 있을 것이다.

IgG 또는 Fab는, 단백질 A 칼럼을 이용한 친화성 HPLC 및 크기배제 HPLC에 의하여 다른 공급원들로부터 정제될 수 있을 것이다. 정제된 항체는 유로퓸으로 표지될 수 있을 것이고 시간-분해성의 형광에 의하여 검출될 수 있을 것이다. PrP 단백질의 다른 입체구조들에 대한 항체 결합은 시간-분해성, 해리-증강성의 형광에 의하여 측정될 수 있을 것이다. 그러나, 인시튜 또는 용액안에서의 고체 지지물질상의 PrP-결합된 IgG의 검출 체계는 다양할 수 있을 것이다. 추가적으로, 직접적인 방사성표지, 형광, 발광, 아비딘-비오틴 증폭, 또는 색이나 발광 기질을 이용한 효소-연결된 분석을 포함하는 직접 또는 간접적인 면역학적 방법을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항체는, 참고에 의하여 본원에 연합된 1986년 10월 8일에 기탁된 셀라인 ATCC HB9222에 의하여 생산되는 단클론항체 263K 3F4를 개시하는, 1989년 2월 21일에 발행된 US 4,806,627에서 개시된다. 그 항체를 생산하는 셀라인은 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852로부터 얻어질 수 있다.

일반적으로 스크래피 감염은, 숙주 유기체가 동일한 종으로부터의 PrP^Sc에 관대하여(tolerant) 면역반응을 만들어내는데 실패한다. PrP^c또는 PrP^Sc에 결합하는 항체가 1997년 3월 20일에 공개된 WO97/10505에서 개시된다. PrP^c에는 결합하지만 PrP^Sc에는 결합하지 않는 어떠한 항체라도 사용될 수 있고, 당업계에서 숙련된 사람은 기지의 절차를 사용하여 그런 것을 발생시킬 수 있는데, 예를 들어, US 5,223,409에서의 파지 전시 항체 라이브러리를 만드는 방법을 참고하라. 그래도, 많은 양의 포름산 또는 SDS-변성된 SHaPrP 27-30을 이용하여 면역한 다음에 토끼안에서 다클론성 항-PrP 항체가 만들어졌다[Bendheim, Barry 등, (1984) Nature 310:418-421; Bode, Pocchiari 등 (1985) J Gen Virol 66:2471-2478; Safar, Ceroni 등 (1990) Neurology 40:513-517]. 비슷하게, PrP 27-30에 대항하여 소량의 항-PrP 단클론항체가 마우스안에서 생산되었다[Barry와 Prusiner (1986) J Infect Dis 154:518-521; Kascsak, Rubenstein 등 (1987) J Virol 61:3688-3693]. 이러한 항체는 포름산- 및 SDS-변성된 PrP 27-30에 대항하여 발생되었고, SHa와 인간 둘 다로부터의 천연의 PrP^c및 처리된 또는 변성된 PrP^Sc를 동등하게 잘 인식할 수 있지만 MoPrP에는 결합하지 않는다. 놀라울 것 없이, 이러한 항체의 항원결정부는, SHa- 및 MoPrP 사이의 아미노산 차이를 포함하는 서열의 영역으로 매핑되었다[Rogers, Yehiely 등 (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:3182-3186].

상기에 인용된 출판물에서 설명된 유형의 많은 항체가 PrP^c및 처리된 또는 변성된 PrP^Sc에는 결합하지만 천연의 PrP^Sc에는 결합하지 않는 이유는 완전히 명확하지는 않다. 어떤 특별한 이론에도 결합되지 않고, 단백질이 PrP^c입체구조일 때 노출되는 항원결정부가 PrP^Sc배열에서는 노출되지 않거나 부분적으로 감춰지기 때문에 그런 일이 발생할 수 있을 것이라고 믿어지는데, PrP^Sc배열에서 단백질은 상대적으로 불용성이고 보다 밀집적으로 함께 접힌다.

본 발명의 목적을 위하여, 결합이 발생하지 않는다는 표시는 평형 또는 친화성 상수 K_a가 10⁶l/몰 이하임을 의미한다. 추가적으로, 결합은, K_a가 10⁷l/몰 이상, 바람직하게는 K_a가 10⁸l/몰 이상일 때 존재하는 것으로서 인식될 것이다. 10⁷l/몰 이상의 결합 친화성은 (1)단일의 단클론항체(즉, 많은 수의 한 종류의 항체) 또는 (2)다수의 다른 단클론항체(예를 들어, 많은 수의 5개의 다른 단클론항체 각각) 또는 (3)많은 수의 다클론항체에 기인할 수 있을 것이다. (1)-(3)의 조합을 이용하는 것도 역시 가능하다. 선택된 바람직한 항체는, 천연의 입체구조의 PrP^Sc에의 결합과 비교될 때 단백질의 처리된 또는 변성된 PrP^Sc형태의 단백질에 적어도 4배 더 탐욕적으로(avidly) 결합할 것이다. 결합 친화성에 있어서 4배 차는 상기의 (1)-(3)에 대하여 몇몇의 다른 항체를 사용함으로써 성취될 수 있을 것이고, 혼합물안의 항체중 몇몇은 그자체로서 4배미만의 차이를 가질 수 있을 것이다.

본 발명의 다양한 다른 유형의 분석이 하나이상의 다른 항체와 함께 사용될 수 있을 것이다. 당업계에서 숙련된 사람은 항체가 기지의 표지로 표지될 수 있을 것임과 지금 이용가능한 로봇공학, 샌드위치 분석, 전자 검출기, 플롯팅우 세포계수법 등과 함께 사용될 수 있을 것임을 인식할 것이다.

정량적인 계산

상기에 설명된 방법론을 이용하여, 처리되지 않은 샘플로부터 얻어지는 신호의 양과 처리된 샘플을 이용하여 얻어지는 신호의 양사이의 차이를 계산하는 것이 가능하다. 이 차이는, 원래의 샘플안에 존재하는 질병 입체구조인 단백질의 양(농도)을 (비-질병 입체구조에 대한 처리의 효과를 조정한 후) 나타낸다. 차이를 얻은 후에, 단위 부피당 원래의 샘플에 존재하는 질병 입체구조인 단백질의 양을 계산하기 위하여 하기에 보여지는 식이 사용될 수 있다.

a)F_n= F_nα+ F_nβ→ F_nα= F_n- F_nβ, F_nβ∼ 배경

b) F_d= F_dα+ F_dβ

△F_n→d= △F_αn→d+ △F_βn→d

△F_βn→d= F_d- F_n- △F_αn→d

[PrP_β] 또는 [DRC] ∼ △F_βn→d= F_d- (F_n* f_αn→d)

상기 변수 각각의 정의는 하기에 제공된다.

F - 형광신호(어떤 검출가능한 신호라도 사용될 수 있을 것임을 주목하라);

F_n- 천연의 입체구조의 형광신호;

F_nα와 F_nβ- 천연의 α-나선형 및 β-시트 입체구조 각각의 형광신호;

F_d- 처리된 또는 변성된 상태인 PrP의 형광신호;

F_dα와 F_dβ- 변성된 α-나선형 및 β-시트 상태의 PrP의 신호;

△F_n→d- 천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이에서 형광신호의 증가;

△F_αn→d- 천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이에서 α-나선형 입체구조의 형광

신호에서의 증가;

△F_βn→d- 천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이에서 β-시트 입체구조의 형광

신호에서의 증가;

f_αn→d- α-나선형 PrP의 천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이를 위한 상관인

자;

[PrP_β] - β-시트 입체구조인 프리온 단백질의 농도.

[DRC] - 질병 관련된 입체구조인 어떤 단백질이든지의 농도.

∼ - 에 비례하는.

* - 곱하기.

상기에 제공된 식은 β-시트 입체구조인 프리온 단백질의 농도를 특이적으로 계산하기 위하여 사용된다. 그러나, 어떠한 단백질이라하더라도 그 농도, 즉 [βA4_β]와 같은 단백질의 어떠한 억제된, 질병 입체구조라 하더라도 그 농도를 계산하기 위하여 동일한 식이 사용될 수 있다. 보다 일반적으로, [DRC]는 질병 관련된 입체구조의 단백질의 농도를 나타낸다.

특이적인 예를 제공하기 위하여, 상기의 정의는 PrP 단백질에 관하여 특이적으로 제공되었는데, 이 단백질은 α-나선형 입체구조를 포함하는 적어도 하나의 이완된, 비-질병 입체구조(PrP^c) 및 β-시트 입체구조를 포함하는 적어도 하나의 억제된, 질병 관련된 입체구조(PrP^Sc)를 포함한다. 식은, 샘플안에 존재하는 단백질의 질병 관련된 입체구조의 농도를 계산하기 위하여 사용된다. 상기에 제공된 특이적인 식과 정의에 대하여, 식은, β-시트 배열을 포함하는 프리온 단백질의 농도를 계산하기 위하여 사용된다(실시예 11을 참고).

상기의 식을 계산하는데 사용되는 신호는 형광신호이다. 그러나, 어떠한 검출가능한 신호라도 사용될 수 있다. 총 신호는, 질병 및 비-질병 관련된 입체구조로부터 수용된 신호의 조합인 F_n에 의하여 나타내진다. 이것은, 상기에서 설명된 분석에 대하여 처리되지 않은 제 1의 부분으로부터 계산될 신호이다. 변수 F_d는 샘플의 제 2 부분을 처리함으로써 얻어지는 신호이다. 이 신호는, 비-질병 입체구조인 처리된 단백질 더하기 질병 입체구조인 처리된 단백질로부터 수용된 신호의 조합이다.

질병 관련된 입체구조의 단백질을 포함하지 않는 샘플을 (예를 들어, 언폴딩 처리를 통하여) 처리함으로써 얻어지는 신호에 있어서 차이가 있다는 것이 인식되어 왔다. 이 차이는 정확한 판독을 얻기 위하여 설명되어야 한다. 물론, 천연의 샘플과 처리된 샘플사이에서 얻어지는 신호에 있어서의 차이는, 질병 관련된 입체구조와 비-질병 입체구조를 처리함으로써 얻어지는 신호에 있어서의 차이의 조합이다. 질병 입체구조에 언폴딩처리를 함으로써 얻어지는 신호에 있어서의 증가, 즉 미처리된 질병 입체구조의 신호와 처리된 질병 입체구조로부터 수용되는 신호 사이의 차이는, 미처리된 비-질병 입체구조와 처리된 비-질병 입체구조로부터 얻어지는 신호에 있어서의 증가를 계산하는 것으로부터 수용된 신호로부터 전체의 샘플을 처리함으로써 수용된 신호를 공제함으로써 계산될 수 있다. 이러한 방정식을 사용하여, 원래의 샘플안에 존재하는 질병 입체구조인 단백질의 농도를 제공하는 최종의 방정식을 생산하는 것이 가능하다(실시예 11을 참고하라).

단백질 스트레인의 구별(타이핑)

인간을 포함하는 다른 동물들이 다른 스트레인의 병원성 단백질로 감염될 수 있을 것이다. "돌연변이 표"가 프리온 감염의 다른 스트레인과 연관된 몇몇의 다른 돌연변이를 목록에 쓰기 위하여 본원에서 제공된다. 때때로, 어떤 특이적인 스트레인이 개체를 감염시켰는가 하는 것이 중요한데, 그런 정보가 (1)보다 정확한 진단을 제공하거나, (2)적당한 치료를 집행하거나, (3)가능한 감염원안의 스트레인에 스트레인을 매치시킴으로써 감염원을 결정하는데에 있어서 유용할 수 있을 것이라는 점에서 그러하다.

감염을 일으키는 특별한 스트레인의 병원성 단백질은, 본 발명를 사용하여 계산될 수 있는 두가지의 정보로부터 결정될 수 있다. 실시예 11은 어떻게 본 발명이 절대량, 즉 주어진 크기의 샘플안에 있는 프리온의 농도를 측정하기 위하여 사용될 수 있는가를 보여준다. 실시예 8은, 변성된 PrP 단백질:천연의 PrP 단백질에 대한 항체 결합의 비율인 "프리온 지수"를 계산하는 방법을 보여준다. 다른 단백질을 위한 "단백질 지수"는, 그 단백질의 변성된:천연의 형태에 대한 어떠한 결합 파트너라도의 결합의 비율이다. 일반적인 용어로, "프리온 지수"는 간단히 단백질에 처리가 미치는 효과의 수적인 특성화이다.

특별한 스트레인을 결정하기 위하여, 먼저 각각의 스트레인을 위한 표준이 계산되어야 한다. 이것은, 기지의 양의 기지의 스트레인에 대한 특별한 처리의 효과(프리온 지수)를 측정함으로써 행해진다. 이것은 도 24에서 보여지는 것과 같이 플롯팅될 수 있다. 일단 표준이 계산되면, 다른 샘플의 스트레인이 쉽게 결정될 수 있는데--표준은 바람직하게는 각각의 스트레인을 위한 많은 다른 농도에서 계산된다. 간단한 샘플의 스트레인을 결정하기 위하여, 샘플안의 단백질의 농도와 그 농도에 대한 처리의 효과가 계산된다. 결과는 스트레인을 결정하기 위하여 표준에 매치된다(도 24에서 처럼). 실시예 18은 도 24와 조합하여 취해진 것과 같은 것의 특이적인 실시예이다. 동일한 스트레인의 동일한 농도는 주어진 처리에 의하여 동일한 방법으로 달성될 것이다. 그러나, 다른 스트레인의 동일한 농도는 동일한 처리에 의하여 다르게 달성되어서 스트레인을 결정하는 것을 가능하게 할 것이다.

불용성 단백질과 연관된 질병

본원에서 제공된 개시와 특이적인 실시예의 다량은 샘플안의 PrP^Sc의 존재를 측정하는 것과 연결한 본 분석의 사용에 관한 것이다. 그러나 상기에서 가리켜진 대로, 본 발명의 분석은 두개의 다른 입체구조 모양을 취하는 모든 단백질의 존재를 측정하기 위하여 적용될 수 있는데, 그 모양의 하나는 질병과 연관된다. 다음은 두개이상의 다른 입체구조를 취하는 연관된 불용성 단백질을 가진 질병의 비-한정적인 목록이다.

질병	불용성 단백질
알츠하이머 병	APP, Aβ 펩티드, α1-안티키모트립신, 탄(tan), 비-Aβ 성분
프리온 질병, 크로이츠펠트-야콥병, 스크래피 및 소과의 해면양 뇌병증	PrPSc
ALS	SOD 및 신경세사
픽병(Pick's disease)	픽체(Pick body)
파킨슨병	루이체(Lewy body)
당뇨 유형 I	아밀린(Amylin)
다발성 골수종--혈장세포 이혼화증(Multiple myeloma--plasma cell dyscrasias)	IgGL-사슬
가족성 아밀로이드증 다발신경병증(Familial amyloidotic polyneuropathy)	트랜스티레틴
갑상선의 수질성 암종	프로칼시토닌(Procalcitonin)
만성적인 신부전증	β2--마이크로글로불린
울혈성 심부전증	심방의 나트륨배설촉진 인자
노인성 심장 및 전신성 아밀로이드증	트랜스티레틴
만성 염증	혈청 아밀로이드 A
죽상경화증	ApoA1
가족성 아밀로이드증	겔솔린(Gelsolin)

상기에 각각 목록에 쓰여진 불용성 단백질은, 본 발명에 의하여 모두 둘러싸이는 다른 스트레인들이 생기게 하는 많은 변이 또는 돌연변이를 포함한다는 것이 주목되어야 한다. 프리온 질병에 관련된 PrP 유전자에서의 기지의 병원성 돌연변이 및 다형이 하기에서 주어지고 인간, 양, 소과의 서열은 1996년 10월 15일에 발행된 US 5,565,186에서 주어진다.

돌연변이 표

병원성 인간의 돌연변이	인간의 다형	양의 다형	소과의 다형
2 옥타반복 삽입물 (octarepeat insert)	코돈 129 Met/Val	코돈 171 Arg/Glu	5 또는 6옥타반복(octarepeats)
4 옥타반복 삽입물	코돈 219 Glu/Lys	코돈 136 Ala/Val
5 옥타반복 삽입물
6 옥타반복 삽입물
7 옥타반복 삽입물
8 옥타반복 삽입물
9 옥타반복 삽입물
코돈 102 Pro-Leu
코돈 105 Pro-Leu
코돈 117 Ala-Val
코돈 145 종결
코돈 178 Asp-Asn
코돈 180 Val-Ile
코돈 198 Phe-Ser
코돈 200 Glu-Lys
코돈 210 Val-Ile
코돈 217 Asn-Arg
코돈 232 Met-Ala

그러한 단백질이 동일한 아미노산 서열을 가진 두개의 다른 3-차원의 입체구조를 가진다는 것이 또한 주목되어야 한다. 한 입체구조는 질병 특성과 연관되고 일반적으로 불용성이지만, 다른 하나의 입체구조는 질병 특성과 연관되지 않고 가용성이다. 본 발명의 방법론은 목록에 쓰여진 질병, 단백질 및 스트레인에 한정되지 않는다.

β-시트 형태의 βA4를 검출하기

본 발명의 한 양태는, 샘플 물질, 예를 들어 뇌 또는 체액안에 있는 β-시트 형태의 βA4 단백질을 정량적으로 측정함으로써 억제된 형태의 단백질(βA4 아밀로이드증)의 존재에 근거하여 알츠하이머병을 진단하는 두 단계 과정을 포함한다. 샘플은 두개의 분액으로 나누어진다. 첫번째의 분액은, 비변성 조건하에서 화학적인 활성화 단계을 통하여 천연의 입체구조로 고체 플라스틱(긴 사슬의 중합체 물질) 지지물질에 교차연결된다. 샘플의 두번째의 분액은, 먼저 언폴딩 처리된 후 플라스틱 지지물질에 교차연결된다. 샘플의 둘다의 부분은, 인간 또는 주어진 동물 종의 가용성 βA4 또는 언폴딩 처리 βA4를 우선적으로 인식하는 표지된 항체와 인시튜 반응한다. 언폴딩된 또는 천연의 입체구조의 βA4 단백질에 결합된 항체의 양은 표지된 2차항체의 신호에 의하여 기록된다. 천연의 α-나선형 입체구조의 βA4 단백질을 이용하여 얻어진 신호에서의 예상된 변화에 비교하여 언폴딩처리된 샘플을 이용하여 얻어진 신호의 초과량은 원래의 샘플안에 있는 β-나선형 구조의 βA4의 양의 측정이다. βA4 함유량의 계산을 위하여 전개된 식은 PrP^Sc함유량의 계산과 연결하여 상기에서 제공된다.

βA4 아밀로이드증(알츠하이머병)의 진단은 세 절차에 의하여 확립된다:(1)변성된 샘플 단독의 측정 및 정상적인 대조표준으로부터 얻어진 가용성 βA4의 배경수준을 넘는, 검사된 샘플안의 총 βA4 양(농도)에서의 증가를 검출함으로써의 측정; (2)주어진 항체(단백질 지수)에 대한 언폴딩처리된 대 천연의 신호간의 비율을 계산-예를 들어, 단클론항체 6F3D 및 유로퓸 표지된 2차항체에 대하여 2보다 높은 값; (3)원래의 샘플안에 있는 감염성 β-시트 구조의 βA4의 양의 측정으로서, α-나선형 입체구조의 βA4를 위한 신호에서의 예상되는 변화를 넘은, 변성된 샘플 신호의 변화의 평가. βA4 함유량의 계산을 위해 전개된 식이 상기에 제공된다. 특별한 스트레인의 βA4도 또한 샘플안의 PrP^Sc의 스트레인을 결정하기 위하여 상기에 설명된 동일한 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

본 발명은 약제, 생검 또는 검시 조직, 뇌, 척수, 말초신경, 근육, 뇌척수액, 혈액 또는 혈액성분, 림프절 및, βA4 단백질을 발현하거나 잠재적으로 발현하는 동물- 또는 인간-유도된 배양물안에 있는 병원성 형태의 βA4 단백질의 존재를 검출하기 위한 직접적인 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, βA4 단백질 또는 합성 또는 재조합체 기원의 그것의 단편의 α-나선-에서-β-시트로의 입체구조적 전이를 뒤따르는 것을 가능하게 하고, βA4 단백질의 정상적인 가용성 입체구조를 안정화시켜서 병원성의 불용성 및 β-시트 구조로의 βA4 단백질로의 전환을 막는 능력을 가진 성분들을 선별하는 방법을 제공하는 것을 가능하게 만든다.

샘플 변성의 전형적인 방법에는, (1)정수압 또는 온도와 같은 물질적인 방법, (2)산성 또는 염기성 pH, 카오트로픽 염, 또는 변성하는 세제와 같은 화학적인 방법 , 및 (3)상기의 조합이 포함된다. 플라스틱 지지물질로의 βA4 단백질의 화학적 또는 친화성 결합의 방법은 이용가능한 문헌에서 설명되로 다양할 수 있을 것이다. 진단상의 분석에서 사용되는 항체는 다클론성, 단클론성 또는 재조합체 Fab일 수 있을 것이고, 가용성 또는 변성된 형태의 βA4에 우선적으로 결합하고 바람직하게는, 동일한 양의 항원을 가정할 때 α-나선형 및 β-시트 구조의 βA4간의 반응성에 있어서 적어도 2배 차이를 가지는 종 특이성이 있어야 한다.

플라스틱 지지물질로의 샘플 부착의 방법은 다양할 수 있을 것이고 이용가능한 문헌에서 설명되는 것처럼 공유결합 또는 비-공유결합적일 수 있을 것이다. 실시예들에서 설명된 분석의 민감성은, 높은-친화성 항체, 샌드위치 포맷, 면역침전, 또는 분획원심분리를 이용함으로써 증가될 수 있을 것이다. 그러나, 동일한 종의 βA4의 천연의 β-시트 입체구조에 비교될 때 언폴딩처리된 입체구조에 대하여 적어도 2배의 친화성을 갖는 항체만이 진단상의 분석을 위하여 사용될 수 있을 것이다. 항체 발생, 정제, 표지 및 검출의 방법은 다양할 수 있을 것이다. βA4 단백질의 다른 입체구조들에 대한 항체 결합은 시간-분해성, 해리-증강성 형광에 의하여 측정되었다. 그러나, 인시튜 또는 용액안의 고체 지지물질상의 βA4-결합된 IgG의 검출체계는 다양할 수 있을 것이고, 직접적인 방사성표지, 형광, 발광, 아비딘-비오틴 증폭, 또는 색이나 발광기질을 이용항 효소-연결된 분석을 포함하는 직접 또는 간접적인 면역학적인 방법을 사용할 수 있을 것이다.

다음에 오는 실시예는, 당업계에서 보통의 기술을 가진 사람에게 본 발명의 분석을 만들고 사용하는 방법의 완전한 개시와 설명을 제공하기 위하여 보여지며, 본 발명자들이 그들의 발명이라고 여기는 것의 범위를 한정하려고 의도되지 않으며, 하기의 실험들이 수행된 모든 실험이거나 수행된 유일한 실험임을 나타내거나 암시하려고 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 보증하기 위하여 노력해왔지만, 몇몇의 실험의 오차와 편차는 보고되어야 한다. 달리 표시되지 않으면, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고 압력은 대기압 또는 그 근처에서이다.

실시예 1

재조합체 프리온 단백질의 발현

진단상의 분석의 전개와 보정을 위하여, 설명된 대로[Mehlhorn, Groth 등 (1996) Biochemistry 35:5528-5537] 서열 90-231의 재조합체 시리아 햄스터 프리온 단백질이 α-나선형 또는 β-시트 입체구조로 다시 접혀졌다. E. coli 분비 벡터안으로 결찰시키기 위하여 PCR을 이용하여 시리아 햄스터 프리온 단백질의 다른 부분에 상응하는 DNA를 증폭하였다. 몇개의 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머가, STII 신호펩티드의 C-말단의 코딩 서열내에 Mlu I 제한부위[Lee, Moseley 등 (1983) Infect Immun 42:264-268; Picken, Mazaitis 등 (1983) Infect Immun 42:269-275] 및 적당한 PrP 서열의 최초의 아미노산들을 가지도록 합성되었다. PrP의 3'말단, 종결코돈 및 Bam HI 제한부위에 매칭하는 3'올리고뉴클레오티드 프라이머가 각각의 5'올리고뉴클레오티드와 함께 사용되었다. PCR 증폭된 산물이 정제되고, MluI/Bam HI으로 이전에 분해된 벡터안으로 결찰되고 DH5a안으로 형질전환되었다. PrP 삽입물을 포함하는 클론은 서열분석되었고 프로테아제 결함있는 발현 스트레인 27C7(ATCC# 55244)안으로 형질전환되었다.

큰 스케일 발현이, 다른 매질을 이용하여 다른 단백질을 위하여 이전에 설명된 방법대로 수행되었다[Carter, Kelly 등 (1992) Biotechnology 10:163-167]; 암피실린으로 보충된 LB 배지안에서 성장된 밤샘 배양 500mL이 탄산가스 포함시켜진(aerated) 10 L 발효기(Braun, 모델 E10)안의 7L의 발효 매질안으로 접종되었다. 세포를 높은 교반 속도로 37℃에서 배양하였고, 인산 기아에 의하여 발현이 유도되었다. 4시간후에, 50% 글루코스 용액을 1mL/분의 속도로 첨가하였고; 글루코스 수준은 글루코스 계량봉(Diastix, Miles Inc.)을 이용하여 모니터되었다. 7.4의 pH가, 10% H₂SO₄또는 24% NH₄OH의 자동화된 첨가에 의한 작업에 걸쳐서 유지되었다. 최종 부피는 100이상의 OD₆₀₀이 36시간후에 달성되는 10 L였다. E. coli는 30분동안 10,000 x g에서 원심분리함으로써 수확되었고 결과적인 펠렛은 -20℃에서 저장되었다.

정제를 위하여, 100g의 E. coli 펠렛을 1 L의 25mM Tris·HCl, pH 8.0, 5mM EDTA(완충용액 A)안에 재현탁하였다. 이것을 10,000 x g에서 20분동안 원심분리하였고 가용성의 주변세포질의 단백질을 포함하는 상청액을 버렸다. 펠렛을 1 L의 완충용액 A안에 재현탁하고, 세포 디스럽터(disrupter)를 통하여 두번 통과하였고(Microfluidics International, 모델 MF110), 30,000 x g에서 1시간동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고, 펠렛을 완충용액 A에 한번 세척하고, 다시 30,000 x g에서 1시간동안 원심분리하였다. 이 단계에서, 추가적인 분별전에 펠렛을 -20℃에서 저장할 수 있을 것이다. 그다음에, 펠렛을 8M GdnHCl/25mM Tris-HCl, pH 8.0/100mM DTT(완충용액 B)에 용해시키고, 14,000 x g에서 20분동안 원심분리하여 남아있는 불용성 물질을 제거하였다. ~200mg 총 단백질을 포함하는 상청액의 6mL의 분액을, 26mm x 60 cm HiLoad Superdex 200 칼럼(Pharmacia)을 이용하여 크기배제 크로마토그라피(SEC)에 의하여 분별하였는데, 6M GdnHCl/12.5 mM Tris-HCl, pH 8.0/5mM DTT/1mM EDTA(완충용액 C)를 이용하여 2mL/분의 유속으로 용출하였다. SDS-PAGE에 의하여 확인되었을 때 재조합체 프리온 단백질이 풍부한 분획을 모아서, 25mm x 25cm C-4 칼럼(Vydac); 완충용액 1: H₂O/0.1% TFA, 완충용액 2: 아세토니트릴/0.09% TFA, 유속 5mL/분을 사용하여, 역상고성능 액체크로마토그라피(RP-HPLC)에 의하여 추가적으로 정제하였다. 만약 RP-HPLC전에 몇일동안 SEC 용출액이 4℃에서 저장되었다면, 재조합체 단백질은 35% 아세토니트릴만을 포함하는 보다 이른 분획에서 용출되었다.

환원된 단백질 및 다시 접힌 산화된 형태의 샘플이, 10,000 Da의 분자량 한계를 가진 Centricon 칼럼(Amicon)을 이용하여 농축되었다. 환원된 단백질을 위한 완충용액은 10mM MES, pH 6.5였으나 산화된 형태는 상기에 설명된 다시 접히게 하는 완충용액안에서 농축되었다. SHaPrP90-231 단백질의 다시 접힌 산화된 형태와 환원된 형태의 입체구조는 원편광이색성(CD)분광법에 의하여 측정되었다(도 1).

실시예 2

정상 햄스터 뇌로부터 햄스터 PrP^c의 정제 및 스크래피 감염된 햄스터 뇌로부터 PrP^Sc의 정제

실시예 1에 대하여 생산된 두 단백질 모두는 프리온 분석을 위한 표준으로서 사용되었고 진단방법의 민감성 및 선형 범위을 확립하기 위하여 사용되었다. 정제된 시리아 햄스터 뇌 PrP^c는, 프리온 단백질 검출의 보정을 위하여 사용되었고 α-나선형, β-시트, 및 변성된 입체구조인 재조합체 SHaPrP90-231상에서 얻어진 결과와 상호연관되었다. PrP^c단백질은 약간의 중요하지 않은 변형을 하면서 설명된 대로 정제되었다[Pan, Stahl 등 (1992) Protein Sci 1:1343-1352; Pan, Baldwin 등 (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:10962-10966]. 단백질의 함유량은 아미노산 분석에 의하여 측정되었다. PrP^c단백질의 순도는, 은 염색과 웨스턴으로 이어지는 SDS PAGE상에서 증명되었을 때 ≥95%였다.

표준적인 시리아 햄스터 PrP^Sc는, 중요하지 않은 변형만을 하면서 설명된 대로, 스크래피 스트레인 Sc237 감염된 햄스터 뇌의 표준적인 풀(pool)로부터 정제될 수 있다[Turk, Teplow 등 (1988) Eur J Biochem 176:21-30]. 대뇌내 접종후의 시리아 햄스터상의 인큐베이션 시간 분석에 의하여 측정될 때, 이 표준의 감염성은 10^7.3ID₅₀/ml이었고 특이적인 감염성은 10^8.2ID₅₀/PrP^Sc단백질의 mg이었다. 그러나, 특이적인 감염성은 로트에서 로트±10^0.5ID₅₀/mg까지 다양할 수 있을 것이다. 단백질 함유량은 소과의 혈청 알부민을 표준으로서 이용하여 BCA 분석에 의하여 측정될 수 있다. 조제물은, 은 염색과 웨스턴 블롯후 SDS PAGE상에서 하나의 주요 띠를 가져서 동종이라고 생각되었다.

실시예 3

본 분석에서 사용되는 항체의 선택, 표지 및 검출 방법

항체 생산과 특성화의 프로토콜 및 방법은 일반적으로 어떤 다른 곳에서 설명된다[상기의 Harlow와 Lane (1988):726]. 이 실시예와 다음의 실시예들에서 설명된 자료들은, 시리아 햄스터 PrP의 서열 90-145(N12)와 222-231(P3)에 상응하는 합성 펩티드[Barry, Vincent 등 (1988) J Immunol 140:1188-1193]에 대항하여 만들어진, 면역친화성 정제된 다클론항체 N12와 P3[Safar, Ceroni 등 (1990) Neurology 40:513-517; Rogers, Serban 등 (1991) J Imunnol 147:3568-3574]; 변성된 시리아 햄스터 PrP 27-30에 대항하여 만들어진 JS2[Safar, Ceroni 등 (1990) Neurology 40:513-517]를 이용하여 발생되었다. 본 분석에서 사용된 단클론항체 3F4의 발생과 특성화는 어떤 다른 곳에서 설명되고[Kascsak, Rubenstein 등 (1987) J Virol 61:3688-3693], US 4,806,627에서 설명되는데, 이들 모두는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 항체와 이 항체 및 관련된 항체를 만드는 방법을 개시하고 설명하기 위하여 참고에 의하여 연합된다. 변성된 형태의 프리온 단백질을 인식하는 재조합체 Fab가 가장 최근에 개발되었다[Williamson, Peretz 등 (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:7279-7282].

α-나선형, β-시트, 및 무작위적 코일 입체구조인 SHaPrP90-231은 글루타르알데히드 활성화된 폴리스티렌 플레이트에 공유결합적으로 부착되었고, 연속적으로 희석된 1차 항체와 함께 인큐베이션되었다. 각각의 입체구조의 SHaPrP90-231와 반응하는 IgG의 양은, 보통의 프로토콜에 따라서 Eu-표지된 3F4 IgG를 이용하여 직접적으로, 또는 유로퓸 표지된 항-토끼 또는 항 마우스 항체를 이용하여 간접적으로 측정되었고, 총 신호는 시간-분해성, 해리-증강성 형광에 의하여 측정되었다. 분석 전개를 위하여, SHaPrP90-231의 변성된 대 β-시트 입체구조의 신호 비율이 4이상인 항체가 선택되었다.

실시예 4

경합적인 및 직접적인 분석 포맷

정제된 재조합체 SHaPrP90-231는, α-나선형 또는 β-시트 입체구조로 다시 접혀져서, PrP^0/0마우스로부터 얻어지고 프리온 단백질을 포함하지 않는 5%(w/v) 뇌 균질물로 희석되었다. 뇌 균질물은, 프로테아제 억제제 칵테일(1mM PMSF, 2㎍/ml의 Aprotinin, 2㎍/ml의 Leupeptin)을 포함하는 TBS, pH 7.4안의 플라스틱 처분가능한 프로브를 갖춘 PowerGen 균질화기안에서 세번의 30초간의 돌발(burst)에 의하여 만들어졌고 데스크위 원심분리기안에서 5℃에서 5분동안 500G로 원심분리되었다. 결과적인 상청액을 최종 4%(w/v) Sarcosyl을 포함하는 TBS에 1:1로 희석하였고, PowerGen 균질화기안에서 세번의 30초간의 돌발에 의하여 다시 균질화시켰다. 다음에, 균질물은, α-나선형 또는 β-시트 입체구조인 재조합체 SHaPrP90-231의 다른 희석과 섞였다(전처리).

전형적인 경합적인 분석에서, 다른 입체구조인 애널라이트 PrP는 유로퓸 표지된 3F4 IgG와 함께 전인큐베이션되었고, 그후 SDS-변성된 상태인 ShaPrP90-231으로 코팅된 폴리스티렌 플레이트로 옮겨졌다. α-나선형 및 변성된 상태인 애널라이트 SHaPrP90-231에 대한 결과(도 2)는, 프리온 단백질의 다른 입체구조와의, 유로퓸-표지된 3F4 IgG의 이용가능한 결합부위 및 친화성에서의 뚜렷한 차이를 나타낸다.

직접적인 분석에서, 희석 곡선의 각각의 샘플은 두개의 분액으로 나누어진다:(1)미처리된 및 천연의이라고 표시됨; (2)최종 4M GdnHCl과 혼합되고 5분동안 100℃로 가열되고 변성된(언폴딩 처리)이라고 표시됨. 두 샘플 다는 H₂O에의하여 20배 희석되었고 분액은 글루타르알데히드로 활성화된 플리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트는 5℃에서 밤새 인큐베이션되었고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol(w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하였고, 상기 목록에 쓰여진 유로퓸-표지된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트는, 유로퓸 표지 공급자(Wallac Inc. Turku, Finland)에 의하여 제공되는 증강 용액안에서 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다.

실시예 5

SHaPrP90-231의 다양한 입체구조에 대한 차별적인 시험

Eu-표지된 3F4 IgG를 이용한 직접적인 분석으로부터 얻어진 매개변수들은 농도의 함수로 플롯팅되었다. α-나선형 입체구조인 SHaPrP90-231를 이용하여 얻어진 결과(도 3)는 α-나선형 및 변성된 단백질의 신호사이에서의 상대적으로 작은 차이를 나타낸다. 5% 뇌 균질물의 존재하에서 변성된 PrP를 위한 민감성 한계는 ≤1 ng/ml이고, 선형 범위는 10의 3승을 넘는다. SHaPrP90-231의 β-시트 형태(도 4)를 이용한 실험에서, Eu-표지된 3F4 IgG는 그 단백질의 변성된 형태에 강하게 결합한다. 대조적으로, 그 단백질의 천연의 β-시트 형태와의 반응성은 높은 단백질 농도에서조차 오직 최저 한계에 가깝게만 배경을 초과했다. 프리온 단백질의 변성된 대 천연의 상태의 형광의 비율로서 결과가 표현될 때(도 3과 4) α-나선형 입체구조를 위한 비율은 1-1.8이고 β-시트 입체구조인 재조합체 SHaPrP90-231을 위해서는 5-50이다.

PrP 변성후 Eu-표지된 3F4 IgG의 신호에 있어서의 작은 증가가 α-나선형 입체구조의 특징인 미지의 입체구조의 PrP 샘플을 분석하기 위하여 이 효과가 추가적으로 사용되었다. 대조적으로, α-나선형 입체구조를 위해 예상되는 변화를 넘는 신호에서의 큰 증가는 β-시트 입체구조인 PrP90-231의 특징이다(도 3과 4). 결과는 두개의 다른 형태로 표현된다: (1)지수로서(도 6), 이때 재조합체 SHaPrP90-231을 위한 1.8이하의 지수는 그 단백질이 원래 모두 α-나선형 입체구조임을 표시하고, 1.8을 넘는 지수는 β-시트 입체구조의 존재를 표시하고; (2)본원에서 보여지고 실시예 11에서 예시된 식으로서, 이때 α-나선형 입체구조를 위하여 예상되는 것을 넘어 초과한 신호의 증가는 β-시트 입체구조인 SHaPrP90-231의 양에 비례한다.

실시예 6

재조합체 SHaPrP90-231 및 PrP^c를 위한 정량적인 분석

α-나선형 및 β-시트 입체구조인 변성된 SHaPrP90-231를 위한 입/출력 보정은 10의 3승내에서 선형이었고, 분석을 위한 고도의 신뢰성(도 5)을 제공한다. 10의 3승의 선형 범위내에서 고도의 신뢰성을 가지며 결과를 제공하는 PrP^0/0마우스 균질물로 연속적으로 희석된 PrP^c도 또한 분석되었다. 다음에, 5% PrP^0/0뇌 균질물의 존재하에서 정제된 감염성 PrP^Sc에 의하여 분석이 보정되었다. PrP^Sc를 이용한 보정은 유사한 범위내에서 선형의 반응을 제공하였다.

차별적인 방법을 이용하여, 변성된 대 천연의 뇌 PrP^c사이의 비율은, Eu-표지된 단클론성 3F4 IgG에 대하여 2.2(도 7)였고 다클론성 N12와 P3에 대하여 1.0이었다. PrP^Sc를 위한 보정은 3F4 Eu-표지된 IgG을 위하여 ≥20의 비율을 주었고(도 8) N12와 P3 항체를 위하여 ＞4의 비율을 주었다. 본원에서 보여지는 대로 전개된 식을 이용함으로써, 모든 PrP^c는 완전한 범위에서 α-나선형 입체구조였다. 대조적으로, 감염성의, β-시트 입체구조인 PrP^Sc의 계산된 양은 예상된 대로 총량의 프리온 단백질에 가까웠다.

실시예 7

생리학적인 PrP^c수준을 넘는 총 프리온 단백질의 증가에 근거한 프리온 질병의 진단

변성된 샘플(언폴딩처리된)의 신호를 배타적으로 평가함에 의한 총 PrP의 정확한 정량적인 측정은, 5% 정상적인 시리아 햄스터 뇌 균질물안의 PrP^c평균값 5.0±0.2㎍/ml(평균±SEM)을 주었다(도 9). 스크래피(스트레인 Sc237)-감염된 햄스터 뇌 균질물의 PrP0/0 마우스 뇌 균질물로의 연속적인 희석은, 측정의 넓은 선형을 가진 총 PrP 36.0±4㎍/ml의 값을 주었다(도 10). 프리온 단백질의 축적을 위한 유일한 기지의 조건은 감염성 PrP^Sc의 축적이기 때문에, 시험된 샘플안에 있는 총 PrP의 증가된 수준은 프리온의 존재를 표시한다. 이 프리온 분석은 :(1)정상적인 대조표준 값의 결정후에 뇌, 조직 샘플, 체액 또는 약제안에서 직접적인 양식으로; 또는 (2)프리온을 포함하는 것으로 추정되는 시험된 조직, 체액 또는 약제 샘플을 이용하여 대뇌내로 접종된 실험 동물의 뇌안에 있는 총 PrP의 상승을 검출함으로써 간접적인 양식으로 사용될 수 있을 것이다.

실시예 8

변성된 대 천연의 PrP사이의 신호비율("프리온 지수")의 증가에 근거한 프리온 질병의 진단

변성된(언폴딩처리된) 대 천연의 시리아 햄스터 뇌 PrP^c단백질에 대한 항체 친화성사이의 비율은 넓은 농도 범위에서 Eu-표지된 3F4 IgG를 위하여 0.8-2.2사이이다. 스크래피-감염된 뇌에서의 비율은 완전한 선형의 범위에 걸쳐서 이 값들을 넘는다(도 11). "프리온 지수"는 감염성 PrP^Sc, 그러므로 프리온의 존재의 상대적인 표시를 부여한다. 프리온 분석의 이 양식은: (1)정상적인 대조표준을 위한 지수의 결정후에 뇌, 조직 샘플, 체액 또는 약제안에서 직접적인 양식으로; 또는 (2)프리온을 포함하는 것으로 추정되는 시험된 조직, 체액 또는 약제 샘플을 이용하여 대뇌내로 접종된 실험 동물의 뇌안에서의 상승된 변성된/천연의 프리온 단백질 지수을 검출함으로써 간접적인 양식으로 사용될 수 있을 것이다.

실시예 9

PrP^Sc함유량을 계산함에 의한 차별적인 분석으로부터의 프리온 질병의 진단

본원에서 제공된 직접적인 분석과 식을 이용함으로써, 정상적인 뇌 균질물에는 검출가능한 양의 β-시트 형태의 PrP^Sc이 없다. 반대로, 스크래피-감염된 햄스터 뇌안에 있는 총 PrP의 대부분은 PrP^Sc의 축적에 기인한다(도 9와 10). 프리온 역가와 식으로부터 계산된 PrP^Sc사이의 보정은 넓은 선형과 ~10³ID₅₀/ml의 민감성 한계를 가진다(도 11). 식은, 프리온 역가와 정량적으로 상호관련되는 비정상적인 입체구조인 PrP 단백질의 존재의 정량적인 표시자를 부여한다. 이 양식의 프리온 분석은: (1)뇌, 조직 샘플, 체액 또는 약제안에서 직접적인 양식으로; 또는 (2)프리온을 포함하는 것으로 추정되는 시험된 조직, 체액 또는 약제 샘플을 이용하여 대뇌내로 접종된 실험 동물의 뇌안에 있는 PrP^Sc를 계산함으로써 간접적인 양식으로 사용될 수 있을 것이다. PrP^Sc와 프리온 역가 사이에 보정 곡선을 확립한 후, PrP^Sc함유량으로부터 직접적으로 역가를 어림하는 것이 가능하다.

실시예 10

새로운 프리온 발생 및 잠재적인 질병 치료학을 선별하기 위한 생체외에서의 PrP 단백질의 α-나선에서 -β- 시트로의 전환의 측정

재조합체 SHaPrP90-231, 또는 SHaPrP90-231, 또는 프리온 단백질의 상응하는 재조합체 또는 합성 펩티드의 α-나선형 형태의 100㎍/ml의 분액을, 20mM 아세트산 나트륨 완충용액, pH 5.5에서 24시간동안 37℃로 10^-3-10^-6M 농도의 글리세롤, 시클로덱스트린, 헤파린, 헤파린 설페이트, 콩고레드, 콜레스테롤 에스테르 디미리스토일 포스패티딜콜린과 함께 인큐베이션하였다. 그리고나서 샘플을 두개의 분액으로 나누었다:(1)미처리된, 천연의이라고 표시됨; (2)최종 4M GdnHCl과 혼합되고 100℃로 5분동안 가열된, 변성된(언폴딩처리된)이라고 표시됨. 두 샘플 다는 H₂O에 의하여 20배 희석되었고 분액은 글루타르알데히드로 활성화된 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트를 5℃에서 밤새 인큐베이션하였고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol (w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하였고, 유로퓸-표지된 3F4 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트는, 유로퓸 표지 공급자(Wallac Inc. Turku, Finland)에 의하여 제공되는 증강 용액안에서 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다.

PrP의 α-나선에서 -β- 시트 입체구조로의 전환 정도는 "프리온 지수"로부터 또는 양자택일적으로 본원에서 제공된 식으로부터 계산된다. 프리온 단백질의 천연의-유사 입체구조를 분명하게 안정화시킴으로써 전환을 억제하는 몇가지 화합물이 생체내에서 치료상의 잠재성을 가질 수 있을 것이다.

실시예 11

본 분석방법은 Prnp^0/0마우스 뇌 균질물로 4배 희석된 스크래피-감염된 시리아 햄스터 뇌 균질물을 이용한 다음에 오는 실시예에서 예증된다:

a)각각의 플레이트는 변성된 SHaPrP90-231의 5개의 희석점으로부터 구성되는 안쪽의 표준을 이용하여 보정된다. 총 PrP의 시간-분해성 형광(TRF)는 Eu-표지된 3F4 IgG를 이용하여 전개되고 시간-분해성 형광 값은 PrP 농도의 함수로 플롯팅된다(도 4). 자료는, 최소자승법을 이용하여 1차 또는 다항 방정식내에 맞고, 최적의 함수가 변성된 PrP의 계산으로부터 선택된다:

PrP[㎍/ml] = -0.22935 + 0.00026567*[TRF] +

0.0000000012255*[TRF]²

b)플레이트의 나머지위에서, 스크래피-감염된 시리아 햄스터 뇌 균질물의 천연의 및 변성된 분액은 4배로 희석되고 플라스틱 지지물질에 교차결합되어서 Eu-표지된 3F4 IgG와 함께 인큐베이션되었다. 총 PrP 함유량은, 변성된 샘플의 형광신호로부터 상기의 식에 따라 계산되었다:

스크래피 감염된 뇌균질물 농도 [%]	천연의 TRF [cpm]	변성된 TRF [cpm]	PrPc+ScTRF [cpm]
5	4214	109814	43.7
1.25	1381	30804	9.1
0.3125	1070	11240	2.9

c)변성된(언폴딩처리된) 및 천연의 샘플 사이의 형광신호의 비율이 계산된다:

스크래피 감염된 뇌균질물 농도 [%]	천연의 TRF [cpm]	변성된* TRF [cpm]	변성된*/천연의비율
5	4214	109814	26.1
1.25	1381	30804	22.3
0.3125	1070	11240	10.5

*변성된은 그것이 언폴딩처리되었다는 것을 표시한다.

정상적인 햄스터 뇌 균질물로부터 측정된 PrP^c의 정상적인 값은 2.2이고; 2.2를 넘는 값은 비정상적인 것으로 고려되고 PrP^Sc의 존재를 표시한다.

d)천연의 상태에서 변성된(언폴딩처리된) 상태로의 전이에 있는 α-나선형 PrP를 위하여 예상되는 것을 넘은 형광 신호의 초과량은 PrP^Sc의 양의 측정이고, 다음에 제공되는 식에 따라 계산된다.

△F_βn→d= F_d- (F_n* f_αn→d)

이 식에서, f = PrP^c의 천연의 상태로부터 변성된 상태로의 전이에 있는 형광신호를 위한 인자의 최대치; F_d는 변성된(언폴딩처리된) 샘플의 형광이고; F_n은 천연의 샘플의 형광이다. 그리고나서, PrP^Sc의 양은 △F_βn→d와 수학식 1로부터 계산된다:

스크래피 감염된 뇌균질물 농도(%)	△TRFβn→d[cpm]	PrPSc[㎍/ml]
5	100543.2	38.9
1.25	27765.8	8.1
0.3125	8886	2.2

β-시트 형태의 프리온 단백질을 위하여 계산된 양의 값은 PrP^Sc의 존재를 나타낸다.

실시예 12

βA4 단백질의 가용성(α-나선형) 및 불용성(β-시트) 형태의 표준

βA4(1-40)과 βA4(1-42)의 가용성 형태가 Bachem(Torrance, CA)로부터 얻어졌다. 신선한 동결건조된 펩티드의 한 부분을, 최종 농도 50μM로 20%(v/v)의 HFIP(헥사플루오로이소프로판올; 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올) 또는 1% SDS(소듐 도데실설페이트)를 포함하는 PBS, pH 7.4에 용해하였고; 이 단백질은 "가용성"이라고 표시되고 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다. 펩티드의 두번째 부분은, 350μM 이상의 최종 농도로 PBS, pH 7.4에 재현탁되었고 37℃에서 72시간동안 인큐베이션되었다. 이 부분의 단백질은 "불용성"이라고 표시되었고 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다.

두 단백질 다는 분석 전개를 위한 표준으로서 사용되었고 민감성 및 선형 범위를 확립하기 위하여 사용되었다. CD(원편광이색성)분광법(도 12)은 가용성 단백질이 α-나선형 입체구조를 가진다는 것을 증명하였다. 대조적으로, 37℃에서 72시간동안 처리된 βA4 단백질은 β-시트 입체구조로 완전히 전환되었다(도 12의 점선을 참고).

본 분석에서 사용되는 항체의 선택, 표지 및 검출 방법

항체 생산과 특성화의 프로토콜 및 방법은 일반적으로 어떤 다른 곳에서 설명된다[상기의 Harlow와 Lane (1988):726]. 이 실시예와 다음의 실시예들에서 설명된 자료들은, 인간의 βA4 단백질의 서열에 상응하는 합성 펩티드에 대항하여 발달된 단클론항체 6F3D를 이용하여 발생되었다(Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ). 그러나, βA4 단백질의 합성 유사체에 대항하여 만들어진 다클론항체가 또한 사용될 수 있을 것이다. βA4 단백질의 변성된 형태를 인식하는 재조합체 Fab 가 또한 사용될 수 있을 것이다.

α-나선형, β-시트, 및 무작위적 코일 입체구조인 βA4 단백질은 글루타르알데히드 활성화된 폴리스티렌 플레이트에 공유결합적으로 부착되었고, 연속적으로 희석된 1차 항체와 함께 인큐베이션되었다. 각각의 입체구조의 βA4 단백질과 반응하는 IgG의 양은, 보통의 프로토콜에 따라서 유로퓸 표지된 항-토끼 또는 항 마우스 항체를 이용하여 측정되었고, 총 신호는 시간-분해성, 해리-증강성 형광에 의하여 측정되었다. 분석을 전개하기 위하여, βA4 단백질의 변성된 대 β-시트 입체구조의 신호 비율이 2이상인 항체가 선택되었다.

직접적인 및 경합적인 분석 포맷

직접적인 분석에서, βA4 단백질의 α-나선형 및 β-시트 형태의 각각의 샘플을 두개의 분액으로 나눈다: (1)미처리된(천연의이라고 표시됨); 및 (2)최종 4M GdnHCl/1% Sarcosyl과 혼합되고 100℃로 5분동안 가열된("변성된"이라고 표시되고, 그것이 언폴딩처리되었음을 의미함). 두 샘플 다는 H₂O에 의하여 20배 희석되었고 분액은 0.2% 글루타르알데히드로 2시간동안 활성화된 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트를 5℃에서 밤새 인큐베이션하였고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol (w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 그리고나서, 샘플을, 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하였고, βA4 단백질에 대한 1차 항체(6F3D, Resaerch Diagnostics Inc., Flanders, NJ)와 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 세척한 후, 마우스 IgG에 대항하는 유로퓸-표지된 2차 항체(Wallac Inc. Turku, Finland)와 함께 전개시켰다. 플레이트는, 증강 용액(Wallac Inc. Turku, Finland)안에서의 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다. 애널라이트에 대한 결과는, βA4 단백질의 다른 입체구조들과 항-βA4 IgG의 이용가능한 결합부위 및 친화성에 있어서의 뚜렷한 차이를 나타낸다.

본 방법은 경합적인 분석을 이용하여 수행될 수 있을 것인데, 이때 애널라이트 βA4는 다른 입체구조들로 항-βA4 IgG과 함께 전인큐베이션된 후, GdnHCl-변성된 상태인 합성 βA4 단백질, 즉 언폴딩된 βA4 단백질로 코팅된 폴리스티렌 플레이트로 옮겨진다.

βA4의 다양한 입체구조에 대한 차별적인 시험

6F3D 항-βA4 IgG를 이용한 직접적인 분석으로부터 얻어진 매개변수들은 농도의 함수로 플롯팅되었다. β-나선형 입체구조인 βA4를 이용하여 얻어진 결과(도 13)는 β-시트 및 변성된 단백질의 신호사이에서 큰 차이를 보여준다. 변성된 βA4 를 위한 민감성 한계는 ≤1㎍/ml이고, 선형 범위는 10의 2승을 넘는다. βA4의 α-나선형 형태를 이용한 실험에서(도 14), 6F3D IgG는 그 단백질의 천연의 및 변성된 형태 둘다에 똑같이 강하게 결합한다. 대조적으로, 그 단백질의 천연의 β-시트 형태와의 반응성은 높은 단백질 농도에서조차 오직 최저 한계에 가깝게만 배경을 초과했다. βA4의 변성된 대 천연의 상태의 형광의 비율로서 결과가 표현될 때(도 15) α-나선형 입체구조를 위한 비율은 ≤1이고 β-시트 입체구조인 βA4을 위해서는 주어진 농도 범위에서 ≥1.5이다.

βA4의 변성후 Eu-표지된 3F4 IgG의 신호에 있어서의 작은 증가가 α-나선형 입체구조의 특징인 미지의 입체구조의 βA4 샘플을 분석하기 위하여 이 효과가 추가적으로 사용되었다. 대조적으로, α-나선형 입체구조를 위해 예상되는 변화를 넘는 신호에서의 큰 증가는 β-시트 입체구조의 특징이다(도 15). 결과는 두개의 다른 형태로 표현될 수 있을 것이다: (1)지수로서(도 15), 이때 βA4를 위한 1.0이하의 지수는 그 단백질이 원래 모두 α-나선형 입체구조임을 표시하고, 1.5를 넘는 지수는 β-시트 입체구조의 존재를 나타내고; (2)상기에서 보여지는 식으로, 이때 α-나선형 입체구조를 위하여 예상되는 것을 넘어 초과한 신호의 증가는 β-시트 입체구조인 βA4의 양에 비례한다.

실시예 13

생리학적인 수준을 넘은 총 βA4 단백질의 증가에 근거한 알츠하이머병의 진단

변성된 샘플의 신호를 배타적으로 평가함에 의한 총 βA4의 정확한 정량적인 측정은, 천연의 입체구조인 βA4의 측정보다 분명히 더 정확하다(도 13과 14). 단백질의 정상적인 값은, βA4 단백질의 β-시트 형태의 유의한 부분을 감출 수 있을 것인데, 이 형태의 항체와의 보다 낮은 반응성 때문이다. βA4 단백질의 축적을 위한 유일한 기지의 조건은 알츠하이머병에 걸린 환자의 뇌안에서의 βA4의 β시트 형태의 축적이기 때문에, 시험된 샘플안에 있는 총 βA4의 증가된 수준은 병원성 형태의 βA4의 존재를 표시한다. 이 βA4 분석은, β-시트 형태의 βA4를 포함하는 것으로 추정되는 조직, 체액 또는 약제학적 샘플에서 사용될 수 있을 것이다.

변성된 대 천연의 βA4사이의 신호비율("βA4 아밀로이드 지수")의 증가에 근거한 알츠하이머병의 질병의 진단

변성된(언폴딩처리된) 대 천연의 인간의 βA4 단백질에 대한 항체 친화성사이의 비율은 넓은 농도 범위에서 6F3D IgG를 위하여 0.8-1.0사이이다. β-시트 βA4를 위한 정량은 완전한 선형의 범위에 걸쳐서 이 값들을 넘는다(도 15). "βA4 아밀로이드 지수"는 감염성의 불용성 β-시트 βA4의 존재의 상대적인 표시를 부여한다. βA4 분석의 이 양식은, 정상적인 대조표준을 위한 지수의 결정후에 뇌, 조직 샘플, 체액 또는 약제안에서 직접적인 양식으로 사용될 수 있을 것이다.

βA4 함유량을 계산함에 의한 차별적인 분석으로부터의 알츠하이머병의 진단

상기에서 보여진 직접적인 분석과 식을 이용함으로써, 병원성 형태의 β-시트 βA4 단백질의 양이 뇌, 조직 샘플 또는 약제안에서 계산될 수 있다.

실시예14

잠재적인 질병 치료학을 선별하기 위한 생체외에서의 βA4 단백질의 α-나선에서 -β-시트로의 전환의 측정

합성 βA4(1-40, 또는 상응하는 βA4 단백질의 재조합체 또는 합성 펩티드의 α-나선형 형태의 350μM 용액의 분액을, PBS, pH 7.4에서 72시간동안 37℃로 10^-3-10^-6M 농도의 글리세롤, 시클로덱스트린, 헤파린, 헤파린 설페이트, 콩고레드, 콜레스테롤 에스테르, 디미리스토일 포스패티딜콜린과 함께 인큐베이션하였다. 그리고나서 샘플을 두개의 분액으로 나누었다:(1)미처리된, 1% Sarcosyl을 포함하고 "천연의"이라고 표시됨; (2)최종 4M GdnHCl/1% Sarcosyl과 혼합되고 100℃로 5분동안 가열된, "변성된"이라고 표시되고 언폴딩처리된 것을 의미함. 두 샘플 다는 H₂O에 의하여 20배 희석되었고 분액은 글루타르알데히드로 활성화된 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트를 5℃에서 밤새 인큐베이션하였고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol (w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하고 6F3D IgG와 함께 인큐베이션한 후, 유로퓸-표지된 항-마우스 항체와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트는, 증강 용액안에서 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다.

βA4의 α-나선형에서 β-시트 입체구조로의 전환 정도는 "아밀로이드 지수"로부터(도 15) 또는 양자택일적으로 상기에 제공된 식으로부터 계산된다. α-나선형 입체구조의 βA4 단백질을 안정화시킴으로써 전환을 억제하는 모든 화합물은, 성숙한 아밀로이드의 형성을 막음으로써 생체내에서 치료상의 잠재성을 가질 수 있을 것이다.

실시예 15

정상적인 및 아밀로이드 형태의 TTR의 표준

가용성 형태의 TTR은 Sigma Chemical Comp로부터 얻어졌다. 단백질의 한 부분을, 최종 농도 0.5mg/ml로 100mM KCl 완충용액, pH 7.4에 용해하였고; 이 단백질은 "정상적인"이라고 표시되고 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다. 단백질의 두번째 부분은 설명된 대로 아밀로이드로 전화되었다[Lai, Colon 등 (1996) Biochemistry 35(20):6470-82]. 간단히 말해서, 단백질은, 단백질 농도 0.2 mg/ml로 50mM 아세트산 나트륨, pH 4.4를 포함하는 100mM KCl 완충용액에 재현탁되었고, 37℃에서 72시간동안 인큐베이션되었다. 이 부분의 단백질은 "아밀로이드"라고 표시되었고 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다. 탁도측정법 및 콩고레드 결합 분석이 아밀로이드로의 효과적인 전환을 확증하였다[Lai, Colon 등 (1996) Biochemistry 35(20):6470-82]. 두 단백질 다는 분석 전개를 위한 표준으로서 사용되었고 민감성 및 선형 범위를 확립하기 위하여 사용되었다.

직접적인 분석 포맷

항체 생산과 특성화의 프로토콜 및 방법은 일반적으로 어떤 다른 곳에서 설명된다. 이 실시예와 다음의 실시예들에서 설명된 자료들은, 정제된 인간의 TTR에 대항하여 발달된 상업적으로 이용가능한 다클론항체를 이용하여 발생되었다 (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY).

직접적인 분석에서, 정상적인 및 아밀로이드 형태의 TTR의 희석 곡선으로부터 취해진 단백질의 각각의 샘플을 두개의 분액으로 나눈다: (1)미처리된, "천연의"이라고 표시됨; (2)최종 4M GdnHCl/1% Sarcosyl과 혼합되고 100℃로 5분동안 가열되고 "변성된"(언폴딩처리된)이라고 표시됨. 두 샘플 다는 H₂O에 의하여 20배 희석되었고 분액은 0.2% 글루타르알데히드로 2시간동안 활성화된 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트를 5℃에서 밤새 인큐베이션하였고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol (w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를, 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하였고, TTR에 대항하는 1차 항체(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY)와 함께 인큐베이션하고, 세척한 후, 토끼 IgG에 대항하는 유로퓸-표지된 2차 항체(Wallac Inc. Turku, Finland)와 함께 전개시켰다. 플레이트는, 증강 용액안에서의 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다.

실시예 16

변성된 대 천연의 TTR사이의 신호비율("TTR 아밀로이드 지수")의 증가에 근거한 SSA와 FAB의 진단

정상적인 인간의 TTR의 변성된(언폴딩된) 대 천연의 형태에 대한 항체 친화성사이의 비율은 넓은 농도 범위에서 다클론항체를 위하여 1-3.3이다. 아밀로이드 형태의 TTR을 위한 비율은 완전한 선형의 범위에 걸쳐서 0.7-1.0사이이다(도 18). "TTR 아밀로이드 지수"는 감염성, 불용성 및 아밀로이드-형성하는 TTR의 존재 상대적인 표시를 부여한다. TTR 분석의 이 양식은, 정상적인 대조표준을 위한 지수의 결정후에 뇌, 조직 샘플, 체액 또는 약제안에서 직접적인 양식으로 사용되고 있다.

TTR 아밀로이드 함유량을 계산함에 의한 차별적인 분석으로부터의 SSA와 FAP의 진단

직접적인 분석 식을 이용함으로써(도 19), 아밀로이드 형태의 TTR의 양이 말초신경, 조직 샘플, 체액 또는 약제안에서 계산될 수 있다. 식에서(도 19), 정상적인 입체구조를 위한 신호의 예상된 증가보다 낮은 것이 아밀로이드 입체구조인 TTR의 양에 비례한다.

실시예 17

잠재적인 질병 치료학을 선별하기 위한 생체외에서의 TTR 단백질의 정상적인-에서-아밀로이드로의 전환의 측정

합성 TTR, 또는 상응하는 TTR의 재조합체 또는 합성 펩티드의 정상적인 형태의 0.2mg/ml의 분액을, 50mM 아세트산 나트륨, pH 4.4를 포함하는 100mM KCl 완충용액에 37℃에서 72시간동안 10^-3-10^-6M 농도의 유기화합물과 함께 인큐베이션하였다. 그리고나서, 샘플을 두개의 분액으로 나누었다:(1)미처리된, 1% Sarcosyl을 포함하고 "천연의"이라고 표시됨; (2)최종 4M GdnHCl/1% Sarcosyl과 혼합되고 100℃로 5분동안 가열된, "변성된"이라고 표시됨. 두 샘플 다는 H₂O에 의하여 20배 희석되었고 분액은 글루타르알데히드로 활성화된 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트를 5℃에서 밤새 인큐베이션하였고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol (w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하고 다클론성 항-TTR 항체(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY)와 함께 인큐베이션한 후, Eu-표지된 항-토끼 항체와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트는, 증강 용액안에서 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다.

TTR의 정상적인 입체구조에서 아밀로이드 입체구조로의 전환 정도는 "아밀로이드 지수"로부터(도 18) 또는 양자택일적으로 식(도 19)으로부터 계산된다. 정상적인 입체구조의 TTR을 안정화시킴으로써 전환을 억제하는 모든 화합물은, 성숙한 아밀로이드의 형성을 막음으로써 생체내에서 치료상의 잠재성을 가질 수 있을 것이다.

실시예 18

시리아 햄스터안의 프리온 분리주(스트레인)의 타이핑

시리아 햄스터(LVG/LAK)는 다음에 오는 햄스터 적응된 스크래피 분리주의 대뇌내 주사에 의하여 감염되었고, 즉 다른 집단의 햄스터가 다음과 같은 개개의 스트레인의 프리온으로 감염되었다: Drowsy(Dy), 139H, Hyper(Hy), Me7, MT-C5 및 Sc237. 동물을 질병의 말기 단계에서 안락사시키고 그것의 뇌를 즉시 냉동시키고 -70℃에서 저장하였다. 뇌를, 프로테아제 억제제 칵테일(PMSF 5mM, Aprotinin과 Leupeptin 4㎍/ml)을 포함하는 PBS, pH 7.4안에서, 얼음상에서, PowerGen 균질화기(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)의 3x30초 공정에 의하여 균질화시켰다. 결과적인 10%(w/v) 균질물은 데스크위 원심분리기에서 5분동안 500 g로 원심분리되었다. 상청액을 PBS, pH 7.4안의 4% Sarcosyl과 1:1로 혼합하였고, 두개의 분액으로 나누었다: (1)미처리된 및 천연의이라고 표시됨; (2)최종 농도 4M GdnHcl과 혼합되고 5분동안 80-100℃로 가열되고 변성된-언폴딩 처리된. 두 샘플 다는 H₂O에의하여 20배 희석되었고 분액은 PBS안의 0.2% 글루타르알데히드로 1시간동안 활성화된 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트는 5℃에서 밤새 인큐베이션되었고, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol(w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를 0.05%(v/v)의 Tween20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하였고, 유로퓸-표지된 단클론항체 3F4와 함께 2시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트는, 유로퓸 표지 공급자(Wallac Inc. Turku, Finland)에 의하여 제공되는 증강 용액안에서 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234 형광분석기(Wallac Inc. Turku, Finland)상에서 계산되었다. PrP^Sc함유량과 "프리온 지수"(변성된(언폴딩된):천연의 PrP 단백질에 대한 항체 결합의 비율)가 실시예 11과 8에서 설명된 대로 계산되었고 도 24에서 보여지는 대로 xy 좌표상에 플롯팅되었다. 시험되어 동일한 계산이 생기게 하는 다른 샘플은 그안에 동일한 스트레인의 프리온을 가지는 것으로 가정될 수 있을 것이다.

실시예 19

프리온 스트레인

시리아 햄스터(LVG/LAK)는 다음에 오는 햄스터-적응된 스크래피 분리주의 대뇌내 주사에 의하여 감염되었다: Drowsy(Dy), 139H, Hyper(Hy), Me7-H, MT-C5, Sc237, SHa(Me7), 및 SHa(RML). Marsh 등, J. Infect. Dis., 131:104-110(1975)에서 설명된 Sc237 스트레인은 금빛의 시리아 햄스터(LVG:Lak, Charles River Laboratories)안에서 반복적으로 계대되었다. 이 스트레인은 스트레인 263K로부터 구별이 불가능한 것으로 보인다(Kimberlin 등, J. Gen. Virol., 34:295-304(1977)을 참고). MT-C5 스트레인을, 두번째 계대의 양 스크래피로 감염된 소로부터 시리아 햄스터(LVG:Lak)에서 분리하였다(Hebbs 등, Bovine Spongeform Encephalopathy: The BSE Dilema, 84-91 (Springer, NY 1996)). Me7 햄스터 분리주에 대하여 Kimberlin 등을 참고하라. DY와 HY 햄스터 스트레인은 Marsh 등, J. Gen. Virol., 72:589-594(1991)에서 개시된다. 139A 분리주는 마우스에서의 Chandler 분리주의 20회이상의 계대후에 얻어졌다(Dickenson 등, Slow Virus Disease of Animals in a Man(ed. Kimberlin, RH)209-241 (North Holland Pub. Amsterdam 1976)을 참고). LVG:Lak 금빛의 시리아 햄스터안에서의 마우스 139A 프리온의 계대가 139H 분리주를 생산하였다(Kimberlin 등, Micro. Pathog., 2:405-415(1987)). 시리아 햄스터에서의 6회 계대후에, 139H 프리온은 Kimberlin 등의 대로였다. 스트레인 SHa(Me7)과 SHa(RML)은 키메라 Tg(MH2M)을 거쳐서 스크래피의 Me7 스트레인을 계대하고, 그후 시리아 햄스터에서 두번 계대함으로써 발생하였다(Scott 등, J. Virol., 71:9032-9044(1997)).

동물을 질병의 말기 단계에서 안락사시키고 그것의 뇌를 즉시 냉동시키고 -70℃에서 저장하였다. 뇌를, 프로테아제 억제제(5mM PMSF, Aprotinin과 Leupeptin 각각 4㎍/ml)를 포함하는 PBS, pH 7.4안에서, 얼음상에서, PowerGen 균질화기 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)의 세번의 30초 공정에 의하여 균질화시켰다. 결과적인 10%(w/v) 균질물은 데스크위 원심분리기에서 5분동안 500 g로 원심분리되었다. 상청액을 PBS, pH 7.4안의 4% Sarkosyl과 1:1로 혼합하였다.

프리온 생분석

Sc237 프리온의 역가는, Prusiner 등 Cell, 25:349-358(1983)에서 설명된 대로, 4마리의 시리아 햄스터의 집단으로 인큐베이션 시간 분석에 의하여 5%(w/v) 뇌 균질물안에서 측정되었다.

실시예 20

재조합체 SHaPrP(90-231)의 발현, 정제, 및 다시접힘

입체구조-의존성 면역분석의 전개와 보정을 위하여, 재조합체 SHaPrP(90-231)은, (Mehlhorn 등 Biochemistry 35:5528-5537(1996))에서 설명된 대로 α-나선형 또는 β-시트 입체구조로 다시 접혔다. Escherichia coli 분비 벡터안으로 결찰시키기 위하여 PCR을 이용하여 SHaPrP의 다른 부분에 상응하는 DNA를 증폭하였다. PrP 삽입물을 포함하는 클론은 서열분석되었고 프로테아제 결함있는 발현 스트레인 27C7(ATCC# 55244)안으로 형질전환되었다. 정제를 위하여, 100g의 E. coli 펠렛을 1 L의 25mM Tris·HCl, pH 8.0/5mM EDTA(완충용액 A)에 재현탁하였다. 이것을 10,000 x g에서 20분동안 원심분리하였고 가용성의 주변세포질의 단백질을 포함하는 상청액을 버렸다. 펠렛을 1 L의 완충용액 A안에 재현탁하고, 세포 디스럽터를 통하여 두번 통과하였고(Microfluidics International, 모델 MF110), 30,000 x g에서 1시간동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고, 펠렛을 완충용액 A에 한번 세척하고, 다시 30,000 x g에서 1시간동안 원심분리하였다. 그다음에, 펠렛을 8M GdnHCl/25mM Tris-HCl, pH 8.0/100mM DTT(완충용액 B)에 용해시키고, ~200mg 총 단백질을 포함하는 상청액의 6mL의 분액을 크기배제 크로마토그라피(SEC)에 의하여 분별하고, 이어서 25mm x 25cm C-4 칼럼(Vydac); 완충용액 1; H₂O/0.1% TFA, 완충용액 2; 아세토니트릴/0.09% TFA, 유속 5mL/분을 사용하여 역상 고성능 액체크로마토그라피(RP-HPLC)로 분별하였다.

환원된 단백질 및 다시 접힌 산화된 형태의 샘플이, 10,000 Da의 분자량 한계를 가진 Centricon(Amicon)을 이용하여 농축되었다. 환원된 단백질을 위한 완충용액은 10mM MES, pH 6.5였으나 산화된 형태는 상기에 설명된 다시 접히게 하는 완충용액안에서 농축되었다. Safar 등, J. Biol. Chem., 268:20276-20284(1993)에서 설명된 대로, Jasco 720 분광편광계상의 원편광이색성(CD)분광법이, 환원된 단백질은 β-시트 입체구조로 다시 접히고, 산화된 단백질은 α-나선형 입체구조로 다시 접힌다는 것을 확실하게 하였다.

실시예 21

뇌로부터의 SHaPrP^c및 SHaPrP^Sc의 정제

SHaPrP^c는 Pan 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10962-10966(1993)에서 설명된 방법과 유사한 방법으로 정제되었다. 단백질의 함유량은 아미노산 분석에 의하여 측정되었다. PrP^c단백질의 순도는, 은 염색과 웨스턴 블롯으로 이어지는 SDS-PAGE상에서 증명되었을 때 95%였다.

SHaPrP^Sc는, Turk 등 Eur. J. Biochem., 176:21-30(1988)에서 설명된 방법과 유사한 방법으로 스크래피 스트레인 Sc237-감염된 햄스터 뇌의 표준적인 풀로부터 정제되었다. 대뇌내 접종후의 시리아 햄스터상의 인큐베이션 시간 분석에 의하여 측정될 때, 이 풀의 감염성은 7.3 ID₅₀/ml이었고 특이적인 감염성은 8.2 ID₅₀/PrP^Sc의 mg이었다. 조제물은, 은 염색과 웨스턴 블롯후 SDS-PAGE상에서 하나의 주요 띠를 가져서 동종이라고 생각되었다.

실시예 22

항체의 표지

Kascsak 등, J. Virol., 61:3688-3693(1987)에서 설명된, 단클론항체 3F4를 이용하여 자료가 발생되었다. IgG는 Pharmacia FPLC 칼럼상의 단백질 A 크로마토그라피에 의하여 복수액으로부터 정제되었고, N-(p-이소티오시아나토벤질)-디에틸렌트리아민-N¹,N²,N³,N³-테트라아세틱 애시드(DTTA)의 유로퓸-킬레이트를 이용하여 pH 9.6에서 16시간동안 실온에서 제조자의 프로토콜에 따라 표지되었다(Wallac Inc., Turku, Finland). 최종의 Eu/IgG 몰 비율은 13이었다.

실시예 23

해리-증강성, 시간-분해성 형광 분광분석법(TRF)에 의한 PrP^Sc에 대한 면역분석

각각의 샘플을 두개의 분액으로 나누었다: i)미처리된 및 천연의이라고 표시됨; ii)최종 농도 4M GdnHcl과 혼합되고 5분동안 80℃로 가열되고 변성된이라고 표시된-언폴딩 처리된. 두 샘플 다는 즉시 프로테아제 억제제(5mM PMSF, 아프로티닌과 류펩틴 각각 4㎍/ml)를 포함하는 H₂O를 이용하여 20배 희석되었고, 분액은 PBS, pH 7.4안의 0.2% 글루타르알데히드로 이전에 1시간동안 활성화된 96-웰 폴리스티렌 플레이트상에 로딩되었다. 플레이트는 5℃에서 밤새 인큐베이션된 후, 0.5% BSA(w/v)과 6% Sorbitol(w/v)을 포함하는 TBS, pH 7.8을 이용하여 2시간동안 실온에서 봉쇄되었다. 다음 단계에서, 플레이트를 0.05%(v/v)의 Tween 20을 포함하는 TBS, pH 7.8로 세번 세척하였고, 유로퓸-표지된 3F4와 함께 2시간동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트는, 유로퓸 표지 공급자(Wallac Inc. Turku, Finland)에 의하여 제공되는 증강 용액안에서 추가적인 7번의 세척 단계후에 전개되었고 신호는 DELFIA 1234(Wallac Inc. Turku, Finland) 형광분석기상에서 계산되었다.

실시예 24

PrP에 대한 입체구조-의존성 면역분석의 보정

본 분석은, Buehler 등, Nature, 356:577-582(1992)에서 설명된 대로 PrP-결함있는(Prnp^0/0) 마우스로부터 얻어진 5%(w/v) 뇌 균질물의 존재하에서 다른 입체구도의 PrP에 대하여 보정되었다. 균질물은, CD분광법에 의하여 측정되 대로의 α-나선형 또는 β-시트 입체구조인 정제된 재조합체 SHaPrP(90-231)와, 그리고 SHa 뇌로부터 정제된 PrP^c및 PrP^Sc와 섞였다. 변성된 재조합체 α-나선형 SHaPrP(90-231) 또는 SHa 뇌 PrP^c에의 항체 결합에 대한 자료는, 천연의 단백질에 대한 결합의 함수로서 플롯팅되었고, 최소자승회귀 프로그램에 의하여 맞추어져서 상관계수 f_α를 얻었다.

실시예 25

변성된/천연의 PRP에 대한 항체 결합의 비율 및 PRP^Sc의 정량

TRF에 의하여 측정된 천연의 및 변성된(언폴딩된) 입체구조인 PrP에 대한 Eu-표지된 IgG의 결합사이의 비율이 TRF_D/TRF_N으로 표시되었다. 다음은, 미지의 샘플안에 있는 β-시트-구조의 PrP의 함유량을 직접적으로 계산하기 위하여 사용될 수 있는 수학적인 모델이다:

[PrP_β]~ △TRF_β= TRF_D- (TRF_N*f_α) (식 1)

식 1에서, α-나선형 입체구조를 위해 예상되는 것을 넘은, 천연의 상태에서 변성된 상태(언폴딩된)로의 전이인 PrP 단백질에 대한 항체 결합의 초과량은, β-시트 입체구조인 PrP 단백질의 양에 직접적으로 비례한다.

방정식안의 기호는 다음과 같다: △TRF_β, 천연의 상태에서 변성된 상태로의 전이 동안 β-시트 입체구조인 PrP의 시간-분해성 형광에서의 변화;

TRF_D, 변성된(즉, 언폴딩된) 상태인 Prp의 시간-분해성 형광

TRF_N, 천연의 입체구조인 PrP의 시간-분해성 형광; 및

f_α, 연속적으로 희석된 환원된 SHa 뇌 균질물 및 정제된 SHaPrP^c를 이용하여 얻어진 TRF_N에 대한 TRF_D의 의존성을 위한 상관계수. 이 계수는, 비선형 최소자승 회귀프로그램에 의하여 (언폴딩된)변성된/천연의 단백질에 대한 항체 결합의 플롯을 맞춤으로써 얻어졌다.

실시예 26

인텅스텐산 나트륨에 의한 프리온의 침전

2% Sarkosyl을 포함하는 뇌 균질물[5% (w/v)]을, 4% 인텅스텐산 나트륨 (NaPTA)와 170mM MgCl₂, pH 7.4를 포함하는 원액과 혼합하여, 0.2-0.3% NaPTA의 최종농도를 얻었다. 전형적으로, 1ml 샘플을 16시간동안 37℃로 흔들리는 플랫폼상에서 인큐베이션하였고, 테이블위 원심분리기(Eppendorf)안에서 14,000g로 30분동안 실온에서 원심분리하였다. 25㎍/ml의 프로테이나제 K를 이용한 37℃에서이 1시간동안의 최적의 처리는 침전 전 또는 후에 수행되었다(오염물제거 전처리). 펠렛은, 프로테아제 억제제(0.5mM PMSF; 아프로티닌과 류펩틴 각각 2㎍/ml)를 포함하는 H₂O에 재현탁되었고, 본 발명의 입체구조-의존성 면역분석에 의하여 분석되었다.

실시예 27

GdnHCl안에서의 평형 해리 및 언폴딩

2% Sarkosyl과 프로테아제 억제제 칵테일(5mM PMSF; 아프로티닌과 류펩틴 각각 4㎍/ml)을 포함하는 PBS, pH 7.4안의 5%(w/v) 뇌 균질물의 분액을, 최종농도의 GdnHCl 및 샘플안의 일정한 단백질 농도가 되도록 손으로 혼합하였고, 16시간동안 23℃에서 평형으로 되었다. TBS, pH 7.4안의 8M GdnHCl(Pierce, Rockford, IL)의 원액의 농도는 굴절률측정법에 의하여 조절되었다. 평형이 된 샘플은 동일한 최종의 단백질 및 GdnHCl 농도까지 20-배 희석되었고, 설명된 대로 입체구조-의존성 면역분석에서 Eu-표지된 3F4 IgG을 이용하여 분석되었다.

각각의 분석으로부터의 원시자료는, 식 F_app=(Y_obsd-Y_N)/(Y_U-Y_N)을 이용하여, (언폴딩된)변성된/천연의 PrP에 대한 항체 결합의 비율 또는 언폴딩의 분명한 분수적인 변화:F_aapSafar 등, J. Biol. Chem., 268:20276-20284(1993) 및 Safar 등, Biochemistry, 33:8875-8883(1994)로 전환되었는데, 이 식에서 Y_obsd는 매개변수의 관찰된 값이고 Y_N과 Y_U는 주어진 GdnHCl 농도에서의, 천연의 형태 및 언폴딩된 형태 각각을 위한 매개변수의 값이다.

실시예 28

전자 현미경법

샘플은, 염색전에 백열광 방출되어진 탄소-피복된 1,000 그물눈 구리 격자위에서 조제되었다. 5㎕ 샘플은 ~30초동안 흡착되었고 2방울의 물로 세척되었다. 대조는, 조제물안의 NaPTA 침전으로부터의 양성적인 염색으로서 유지되는 NaPTA에 의하여 제공되었고; 추가적인 염색은 사용되지 않았다. 건조시킨 후에, 40,000의 표준적인 확대로 80 kV에서 Jeol 100CX II 전자현미경을 이용하여 샘플을 관찰하였다. 확대는 음성적으로 염색된 카탈라제 결정을 이용하여 보정되었다.

본 발명은, 가장 실용적이라고 생각되는 것과 바람직한 구체예에 있어서 본원에서 보여지고 설명된다. 그러나, 본 발명의 범위내인 이탈이 이루어질 수 있다는 것이 인정되고, 이 개시를 읽으면 당업계에서 숙련된 사람에게 자명한 변형이 발생할 것임이 인정된다.

Claims (11)

1. 샘플의 단위량안에 있는 단백질의 질병 관련된 입체구조의 총량을 측정하는 단계;

   처리 비민감성의 질병 관련된 단백질을 제외하고 샘플안에 있는 실질적으로 모든 단백질을 가수분해시키기에 충분한 조건하에서 샘플을 처리하는 단계;

   처리된 샘플의 단위량안에 있는 처리 비민감성의 질병 관련된 단백질의 양을 측정하는 단계 및;

   질병 관련된 단백질의 총량으로부터 처리 비민감성의 단백질의 양을 공제하여 샘플안에 있는 처리 민감성의, 질병 관련된 단백질의 양을 얻는 단계를 포함하는, 한 단위의 샘플안에 있는 단백질의 질병 관련된 입체구조의 처리 민감성 형태의 양을 측정하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 샘플이 동물 유도되고 처리가 프로테아제와의 접촉을 포함하고,

   질병 관련된 입체구조의 단백질의 총량 및 처리 비민감성의 단백질의 양이, 10의 5승 이상의 범위에 걸쳐서 단백질 농도를 검출할 수 있는 방법론을 이용하여 측정되고,

   추가적으로, 질병 관련된 입체구조의 단백질이 1 x 10³개 입자/ml 이하의 농도로 샘플안에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 질병 관련된 입체구조의 단백질이 βA4 단백질, PrP^Sc, 및 트랜스티레틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 질병 관련된 입체구조의 단백질이 PrP^Sc이고, 처리는 처리 저항성 단백질인 PrP 27-30을 제외하고 샘플안에 있는 실질적으로 모든 단백질을 가수분해시키기에 충분한 양으로 80℃이상의 열, 압력 및 화학적인 처리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

   총 질병 관련된 단백질에 대한 처리 민감성인 질병 관련된 단백질의 비율을 측정하는 단계와;

   측정된 비율을 질병 관련된 단백질의 기지의 스트레인의 기지의 비율과 비교함으로써 샘플안에 있는 질병 관련된 단백질의 스트레인을 결정하는 단계를 추가적으로 포함하고;

   질병 관련된 단백질이 PrP^Sc이고, PrP^Sc의 기지의 스트레인이 Drowsy, 139H, Hyper, Me7, MT-C5, RML 및 Sc237로 구성된 군으로부터 선택된 스트레인인 것 특징으로 하는 방법.
6. 샘플의 단위량안에 있는 PrP^Sc의 총량을 측정하는 단계;

   프로테아제 비민감성 PrP^Sc를 제외하고 샘플안에 있는 실질적으로 모든 단백질을 가수분해시키기에 충분한 조건하에서 프로테아제를 이용한 제한된 프로테아제 처리로 샘플을 처리하는 단계;

   프로테아제 처리된 샘플의 단위량안에 있는 처리 비민감성 PrP^Sc의 양을 측정하는 단계 및;

   PrP^Sc의 총량으로부터 처리 비민감성 PrP^Sc의 양을 공제하여 샘플안에 있는 처리 민감성 PrP^Sc의 양을 얻는 단계를 포함하는, 샘플안에 있는 프로테아제 민감성 PrP^Sc의 양을 측정하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 총 PrP^Sc의 양이 10의 5승 이상의 범위에 걸쳐서 단백질 농도를 검출할 수 있는 방법론을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 총 PrP^Sc및 처리 비민감성 PrP^Sc의 양이 시간-분해성 해리 증강성 형광을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 총 PrP^Sc및 처리 비민감성 PrP^Sc의 양이 이중의 파장, 레이저 구동된 형광분석기를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 총 PrP^Sc에 대한 처리 민감성 PrP^Sc의 비율을 측정하는 단계와;

    측정된 비율을 PrP^Sc의 기지의 스트레인의 기지의 비율과 비교함으로써 샘플안에 있는 PrP^Sc의 스트레인과 인큐베이션 시간을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 단위량안에 있는 민감성 PrP^Sc의 인큐베이션 시간 대 양의 그래프상에서 샘플의 단위량안에 있는 프로테아제 민감성 PrP^Sc의 양을 플롯팅하되, 이 그래프가 PrP^Sc의 기지의 스트레인의 플롯팅된 자료를 포함함으로써 샘플안에 있는 PrP^Sc의 스트레인과 인큐베이션 시간을 측정하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.