EP2195431A1 - Verfahren zur steigerung von proteintitern - Google Patents

Verfahren zur steigerung von proteintitern

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EP2195431A1
EP2195431A1 EP08803328A EP08803328A EP2195431A1 EP 2195431 A1 EP2195431 A1 EP 2195431A1 EP 08803328 A EP08803328 A EP 08803328A EP 08803328 A EP08803328 A EP 08803328A EP 2195431 A1 EP2195431 A1 EP 2195431A1
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EP
European Patent Office
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protein
cell
interest
antibody
lysine
Prior art date
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Ceased
Application number
EP08803328A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dorothee Ambrosius
Barbara Enenkel
Christian Eckermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority to EP08803328A priority Critical patent/EP2195431A1/de
Publication of EP2195431A1 publication Critical patent/EP2195431A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Definitions

  • TECHNICAL FIELD This invention relates to optimized proteins, particularly antibody Fc moieties, and methods for producing biopharmaceuticals of such enhanced antibodies and Fc fusion proteins with enhanced productivity, and to a method of producing and purifying proteins Biomolecule is completely homogeneous with respect to the C-terminal lysine.
  • Biomolecules such as proteins, polynucleotides, polysaccharides and the like are increasingly gaining commercial importance as drugs, as diagnostics, as additives in foods, detergents and the like, as research reagents and for many other applications.
  • the need for such biomolecules can be determined - e.g. in the case of proteins - usually no longer satisfy by isolating the molecules from natural sources but requires the use of biotechnological production methods.
  • the biotechnological production of proteins typically begins with the isolation of the DNA encoding the desired protein and its cloning into a suitable expression vector. After transfection of the recombinant expression vector into suitable prokaryotic or eukaryotic expression cells and subsequent selection of transfected, recombinant cells, the latter are cultured in fermenters and the desired protein is expressed. Subsequently, the harvest of the cells or of the culture supernatant and the workup and purification of the protein contained therein takes place. In the case of biopharmaceuticals, such as proteins used as drugs, eg therapeutic antibodies, the product yield is crucial. In addition, the separation of impurities is important. Here, process- and product-dependent impurities can be distinguished from each other.
  • the process-dependent contaminants include components of the host cells, such as proteins and nucleic acids, or stem from cell culture (such as media components) as well as work-up (such as salts or detached chromatography ligands).
  • product-dependent impurities occur. These are molecular variants of the product with different properties. These include, for example, shortened forms such as precursors and hydrolytic degradation products, enzymatic cleavage of C-terminal amino acid residues of proteins, but also modified forms, for example, by deamination, different Glykosyl michsmuster or incorrectly linked disulfide bridges.
  • the product-dependent variants include polymers and aggregates. Contaminants are any other materials of a chemical, biochemical or microbiological nature that are not directly related to the manufacturing process. Other contaminants include viruses that may undesirably occur in cell cultures.
  • CIEX Cation Ion Exchange Chromatography
  • Isoelectric Focusing Isoelectric Focusing
  • clEF Capillary Isoelectric Focusing
  • LCMS Liquid Chromatography Mass Spectrometry
  • the starting point for the evaluation of the production batch is the physico-chemical product properties, the purity, the homogeneity and the efficacy and safety of the product.
  • Electrophoretic (IEF) or chromatographic (IEC, SEC, RP) separation methods and mass spectroscopic methods (MS, ESI, MALDI) are used to evaluate product purity and product heterogeneity.
  • the control of product purity ensures sufficient depletion of impurities and the removal of fission products and aggregated protein molecules resulting from enzymatic, mechanical or chemical processes in the manufacturing process.
  • the evaluation of the product homogeneity is primarily based on the deviations in the glycosylation pattern and the charge heterogeneity.
  • the efficacy of a product describes its biological activity, which in the case of antibodies is composed of properties such as the antigen-binding capacity, the induction of effector functions, serum half-life and others. Factors determining product safety include sterility and bacterial endotoxin load on the product lot. Due to the large number of control values, which must be ensured or respected in a generated production batch for its release, a reduction of the control values, z. B. by eliminating the batch influencing parameter, desirable.
  • the present invention surprisingly achieves this object by a method for the production of proteins which allows an increased yield by removing already at the DNA level the C-terminal coding codon (for example lysine) and subsequently inserting a stop codon.
  • This method enables an increase in the protein titer, in particular of antibodies having a C-terminal lysine heavy chain deletion.
  • the present invention describes recombinant DNA constructs of proteins, in particular of antibody molecules such as IgGI, IgG2, IgG3, IgG4 and Fc fusion constructs which have a deletion of the C-terminal lysine. Due to the modification of the expression construct and the deletion of the C-terminal Lys codon, only molecules with a homogeneous C-terminus of the heavy chain are produced.
  • Mammalian cell fusion proteins for the production of new biopharmaceutical drugs often have molecules that exhibit heterogeneity at the C-terminus of the heavy chain.
  • the purified end product has with respect to the C-terminus of the heavy chain, three different species: 1) complete chains with C-terminal lysine according to the DNA sequence (Lys 2) or 2) partial chain (Lys 1) and 3) deletion of the C-terminal lysine on both Chains (Lys 0).
  • the proportions of the two species are unpredictable. Thus, differences may occur depending on the cell, fermentation conditions and manufacturing batch. It is unclear whether the antibody structure has any influence on this intracellular enzymatic cleavage of lysine.
  • Fermentation conditions and thus different metabolic processes in the cell have a significant influence. Furthermore, it is still unknown at what point in the production of the product in the cell (co-translational, post-translational), at which location and by which enzyme the cleavage of the lysine takes place. Possible batch fluctuations can thus not be prevented and counter-control is thus not specifically possible.
  • the codon for lysine in the expression construct for the heavy chain of antibodies has already been deleted at the DNA level at the 3 ' end.
  • the heavy chain C-terminus is highly conserved, and the C-terminus lysine is always present in both human and mouse antibodies, for example. Because of this, lysine is expected to be essential for expression, folding or secretion.
  • lysine is expected to be essential for expression, folding or secretion.
  • the product titer is increased by at least 10%, preferably at least 20% and particularly preferably by at least 50%.
  • the main advantage of the current state of the art is that using these constructs only the variant of the C-terminus without lysine for the heavy chain can occur. This eliminates the possibility of batch fluctuations and the proportion of product characterization work.
  • Particularly surprising in the present invention is that the constructs without C-terminal lysine lead to increased product titers, which is particularly advantageous for a high yield.
  • the present invention is preferably applicable to processes for producing recombinant antibodies and / or Fc fusion proteins.
  • the present invention is applicable to other molecules having C-terminal amino acid deletions. Examples include EPO and tPA, where C-terminal arginine deletions occur.
  • the invention relates to the improved production and purification of optimized proteins, the constituent of which is, inter alia, the immunoglobulin domain C H 3.
  • An often observed effect of these proteins is the cleavage of the C-terminal lysine. This usually incomplete processing of the heavy chain leads to product heterogeneity.
  • the corresponding codon of the C-terminal lysine of the heavy antibody chain was deleted by means of recombinant DNA technology. This deletion in the optimized Surprisingly, antibody does not lead to a disadvantage in the expression or intracellular protein processing but rather to an increased product titer compared to the wild type.
  • the optimized antibodies prove to be advantageous in purification by a better elution behavior due to the reduced charge heterogeneity and they are characterized by an improved homogeneity.
  • the present invention does not result from the prior art.
  • product heterogeneity needs to be analyzed for each production lot before it can be released.
  • For the qualitative and quantitative determination of the heterogeneity of lysine residues at the C-terminus of the heavy chain laborious and costly analysis methods must be used.
  • FIGURE 1 SCHEMATICARY REPRESENTATION OF THE RECOMBINANT
  • VECTORS The vectors shown here are used to express the monoclonal antibodies of the IgGI and IgG4 isotype in CHO-DG44 cells.
  • P / E is a combination of CMV enhancer and hamster Ub / S27a promoter
  • CMV is a combination of CMV enhancer and promoter
  • P is just a promoter element
  • T is a termination signal for transcription needed for polyadenylation of the transcribed mRNA.
  • the position and direction of transcription initiation within each transcription unit is indicated by an arrow.
  • the amplifiable selectable marker dlhydrofolate reductase is abbreviated "dhfr.”
  • the selection marker neomycin phosphotransferase is labeled “npt” and the neomycin phosphotransferase mutant produced by point mutation F240I contains “npt F240I”.
  • "IgG1 HC” encodes the heavy chain of the IgGI isotype wild-type F19 antibody and IgG1-Lys heavy chain antibody of this antibody with a C-terminal lysine deletion.
  • IgG4 HC identifies the IgG4 wild-type heavy chain gene and "IgG4-Lys” again, the heavy chain of the IgG4 with a C-terminal lysine deletion.
  • LC encodes the IgGI or IgG4 antibody light chain.
  • the cell culture supernatants are removed and the IgGI titers determined by ELISA and the SEAP activity.
  • the IgGI titer is corrected for transfection efficiency.
  • the figure shows the average of 10 parallel pools with comparable product quantities for both variants.
  • FIGURE 3 EXPRESSION OF IGG1 WILD TYPE AND IGG1 LYSININE
  • the concentration of IgGI antibody produced in the cell culture supernatant is determined by ELISA and the specific productivity per cell and day is calculated.
  • the bars represent the means of specific productivity (dotted bars) and titer (striped bars) all pools in the test from each 3 - 4 cultivation passages in 75cm 2 cell culture bottles.
  • FIGURE 4 EXPRESSION OF IGG1 WILD TYPE AND IGG1 LYSENSION DELUTION MUTANT IN STABLE AMPLIFIED
  • MTX methotrexate
  • the concentration of IgGI antibody produced in the cell culture supernatant is determined by ELISA and the specific productivity per cell and day is calculated.
  • the bars represent, on the one hand, the mean values of the specific productivity (dotted bars) and the titer (striped bars) of each individual pool in the test from 6 cultivation passages each in 75 cm 2 cell culture bottles. On the other hand, the mean value (MW) from all pool data is given.
  • Figure 4A shows the data from the cell pools transfected with the IgGI wild type
  • Figure 4B shows the data from the cell pools transfected with the IgG1 lysine deletion variant.
  • the latter produce on average 86% more antibodies with 120% higher specific productivity than the cell pools transfected with the IgGI wild type.
  • FIGURE 5 INFLUENCE OF C-TERMINAL LYSINE DELETION ON
  • FIGURE 6 EXPRESSION OF IGG4 WILD TYPE AND IGG4 LYSINE
  • DHFR-mediated gene amplification is subsequently performed by addition of 100 nM methotrexate (MTX) to the culture medium
  • MTX methotrexate
  • concentration of IgG4 antibody produced in the cell culture supernatant is determined by ELISA and the specific productivity per cell and day is calculated.
  • the bars represent, on the one hand, the mean values of the specific productivity (dotted bars) and the titer (striped bars) of each individual pool in the test from 6 cultivation passages each in 75 cm 2 cell culture bottles.
  • the mean value (MW) from all pool data is given.
  • Figure 6A shows the data from the cell pools transfected with the IgG4 wild-type
  • Figure 6B shows the data from the cell pools transfected with the IgG4-lysine deletion variant. The latter produce on average 63% more antibodies with 70% higher specific productivity than the cell pools transfected with the IgG4 wild-type.
  • FIGURE 7 EXPRESSION OF IGG4 WILD TYPE AND IGG4 LYSINE
  • a stepwise DHFR-mediated gene amplification is performed.
  • 100 nM methotrexate (MTX) is added to the culture medium.
  • MTX methotrexate
  • a second round of gene amplification is carried out by adding 400 nM MTX to the culture medium.
  • successfully amplified cell pools are obtained for the lgG4 wild-type 4 and for the lgG4-lysine deletion variant 6.
  • the concentration of IgG4 antibody produced in the cell culture supernatant is determined by ELISA and the specific productivity per cell and day is calculated.
  • the bars represent, on the one hand, the mean values of the specific productivity (dotted bars) and the titer (striped bars) of each individual pool in the test from 4 cultivation passages each in 75 cm 2 cell culture bottles.
  • the mean value (MW) from all pool data is given.
  • Figure 7A shows the data from the cell pools transfected with the IgG4 wild-type
  • Figure 7B shows the data from the cell pools transfected with the IgG4-lysine deletion variant. The latter produce on average 53% more Antibodies at 66% higher specific productivity than the cell pools transfected with the IgG4 wildtype.
  • FIGURE 8 QUANTIFICATION OF PRODUCT REPRODUCTION BY PROTEIN A HPLC
  • the determined values for the product yield of IgGI and IgG4 are independent of the lysine deletion over 90%.
  • the monomer content of the isotypes and the corresponding lysine deletion variants is in the range of 89.23 to 97.93%. Both the yield and the monomer content are higher for the IgGI-Lys than for the WT-variant.
  • FIGURE 9 ISOELECTRIC FOCUSING (IEF) OF ISOTYPES
  • IGG1 and IGG4 The antibodies were incubated in vitro with carboxypeptidase B to cleave existing C-terminal lysine.
  • FIGURE 10 DETECTION OF C-TERMINAL LYSINE BY LC-MS
  • the dark gray bars represent the heavy chain (HC) portions without lysine.
  • FIGURE 11 SEPARATION OF THE ANTIBODIES BY WCX Separation of IgGI-WT (A) and IgGI-Lysine (B) by means of a weak cationic exchange (WCX).
  • the enzymatic lysine cleavage by carboxypeptidase B shows a reduction of the basic peaks 1 and 2 in the WT IgGI.
  • the overlay (C) of IgGI WT without CpB (upper line) and IgGI WT + CpB (lower line) shows the reduction of the basic peak areas a total of 9.8%.
  • the overlay (D) of IgGI-Lys without CpB (upper line) and IgGI-Lys + CpB (lower line) shows no reduction of the basic peak area (below 1%).
  • FIGURE 12 QUANTIFICATION OF THE C-TE RM I NAL E LYSINE MEDIUM
  • titer is an indication of the product concentration in a defined volume, eg ng / mL, mg / mL, mg / L, g / L.
  • specific productivity is meant the amount of protein produced by the cell in pg per cell per day, calculated by the formula pg / ((Ct-Co) t / In (Ct-Co)), where Co
  • Yield describes the percentage recovery of the respective product variants after separation by means of chromatography on a matrix, for example a protein A matrix.
  • Product concentration of proteins encoded by a selected nucleotide sequence can be determined by ELISA, but can also be determined by other methods such as e.g. by protein A HPLC, Western blot, radioimmunoassay, immunoprecipitation, detection of the biological activity of the protein, immunostaining of the protein with subsequent FACS analysis or fluorescence microscopy, direct detection of a fluorescent protein by FACS analysis or by spectrophotometry.
  • the "gene of interest” contained in the expression vector of the invention comprises a nucleotide sequence of any length encoding a product of interest
  • the gene product or “product of interest” is typically a protein, polypeptide, peptide or fragment or derivative thereof. It can also be RNA or antisense RNA.
  • the gene of interest may be in full length, in truncated form, as a fusion gene or a labeled gene. It may be genomic DNA or preferably cDNA or corresponding fragments or fusions.
  • the gene of interest may be the native gene sequence, mutated or otherwise modified. Such modifications include codon optimizations for adaptation to a particular host cell and humanization.
  • the gene of interest may encode a secreted, cytoplasmic, nuclear localized, membrane bound or cell surface bound polypeptide.
  • the term "nucleic acid,”"nucleotidesequence,” or “nucleic acid sequence” refers to an oligonucleotide, nucleotides, polynucleotides and fragments thereof, and DNA or RNA of genomic or synthetic origin which may be in single or double stranded and represent the coding or noncoding strand of a gene
  • standard techniques such as site-specific mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis, can be used.
  • Encoding means the property or ability of a specific sequence of nucleotides in a nucleic acid, such as a gene in a chromosome or an mRNA, as a template for the synthesis of other polymers and macromolecules such as rRNA, tRNA, mRNA, other RNAs.
  • a gene encodes a protein when transcription and subsequent translation of the mRNA produce the desired protein in a cell or other biological system
  • both the coding strand the nucleotide sequence of which is identical with the mRNA sequence and is normally also indicated in sequence databases, eg EMBL or GenBank, as well as the noncoding strand of a gene or cDNA serving as template for the transcription can be designated as coding for a product or protein
  • Nucleic acid encoding a protein also includes nuk linolenic acids, which have a different nucleotide sequence sequence due to the degenerate genetic code, but result in the same amino acid sequence of the protein. Nucleic acid sequences encoding proteins may also contain introns.
  • cDNA refers to deoxyribonucleic acids prepared by reverse transcription and synthesis of the second strand of DNA from a mRNA or other RNA produced by a gene, which, when present as a double-stranded DNA molecule, contains both a coding DNA as well as a non-coding strand.
  • Biopharmaceutically significant proteins / polypeptides include e.g. Antibodies or immunoglobulins, enzymes, cytokines, lymphokines, adhesion molecules, receptors and their derivatives or fragments are, however, not limited to these. In general, all polypeptides that act as agonists or antagonists and / or find therapeutic or diagnostic use are important. Other proteins of interest are, for example, proteins / polypeptides which are used for altering the properties of host cells in the context of so-called "cell engineering", such as anti-apoptotic proteins, chaperones, metabolic enzymes, glycosylation enzymes and their derivatives or fragments, but are not limited to these.
  • cell engineering such as anti-apoptotic proteins, chaperones, metabolic enzymes, glycosylation enzymes and their derivatives or fragments, but are not limited to these.
  • polypeptides is used for amino acid sequences or proteins and refers to polymers of amino acids of any length
  • Expression also includes proteins that are posttranslational in response to, for example, glycosylation, phosphorylation, acetylation or
  • Protein processing can be modified.
  • the structure of the polypeptide may be e.g. by substitutions, deletions or insertion of amino acids, fusion with other proteins, while retaining its biological activity.
  • the polypeptides can multimerize and homo- and
  • immunoglobulins There are several classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG 1 IgM, IgYJgW.
  • immunoglobulin and antibodies are used synonymously.
  • therapeutic antibodies are monoclonal, polyclonal, multispecific and single chain antibodies or immunoglobulins and fragments thereof, such as Fab, Fab ', F (ab') 2, Fc and Fc 'fragments, light (L) and heavy (H) immunoglobulin chains and their constant, variable or hypervariable regions, as well as Fv and Fd fragments.
  • the antibodies may be of human or non-human origin. Humanized and chimeric antibodies are also considered.
  • fragment antigen-binding Fab
  • Protease such as papain
  • Other antibody fragments are also generated from conventional antibodies or by DNA cloning. Other antibody fragments are
  • F (ab ') 2 fragments which can be prepared by proteolytic digestion with pepsin.
  • the variable region of the heavy and light chain are often linked together by means of a short peptide fragment of about 10 to 30 amino acids, particularly preferably 15 amino acids. In this way, a single polypeptide chain is formed in which VH and VL are linked by a peptide linker.
  • Such antibody fragments are also referred to as a single-chain Fv fragment (scFv). Examples of scFv antibodies are known and described.
  • scFv derivatives In recent years, various strategies have been developed to produce multimeric scFv derivatives. The intention is the generation of recombinant antibodies with improved pharmacokinetic properties and enhanced binding avidity. To achieve multimerization of the scFv fragments, these are prepared as fusion proteins with multimerization domains.
  • the CH3 region of an IgG or coiled coil structures may function as multimerization domains, such as the leucine zipper domains, while in other strategies, the interaction between the VH and VL regions of the scFv fragment may become multimerization
  • diabody refers to a divalent homodimeric scFv derivative.
  • the shortening of the peptide linker in the scFv molecule to 5-10 amino acids results in the formation of homodimers by superposition of VHA / L chains.
  • the diabodies can additionally be stabilized by introduced disulfide bridges. Examples of diabodies can be found in the literature.
  • minibody refers to a divalent, homodimeric scFv derivative which consists of a fusion protein which contains the CH3 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgGI, as a dimerization region which links the scFv fragments via a hinge Region, also of IgG, and a linker region
  • thabody refers to a trivalent homotrimeric scFv derivative. The direct fusion of VH-VL without the use of a linker sequence leads to the formation of trimers.
  • fragments designated by the skilled person as mini-antibodies which have a bi-, tri- or tetravalent structure, are likewise derivatives of scFv fragments.
  • the multimerization is achieved via di-, tri- or tetrameric "coiled-coil" structures.
  • the production of the expression vector according to the invention can in principle be carried out by conventional methods familiar to the person skilled in the art.
  • a vector eg suitable promoters, enhancers, termination and polyadenylation signals, Antibiotic resistance genes, selection markers, origins of replication and splice signals.
  • Conventional cloning vectors can be used for the preparation, for example plasmids, bacteriophages, phagemids, cosmids or viral vectors such as baculovirus, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes simplex virus, but also artificial or artificial or mini-chromosomes.
  • the eukaryotic expression vectors also typically contain prokaryotic sequences, such as origin of replication, and antibiotic resistance genes, which allow multiplication and selection of the vector in bacteria.
  • prokaryotic sequences such as origin of replication, and antibiotic resistance genes, which allow multiplication and selection of the vector in bacteria.
  • a variety of eukaryotic expression vectors containing multiple cloning sites for introducing a polynucleotide sequence are known and some are commercially available from various companies such as Stratagene, La JoIIa, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI, USA or BD Biosciences Clontech, Paolo Alto, CA, USA.
  • the expression of the genes can take place within an expression vector of one or more transcription units.
  • a region which contains one or more genes to be transcribed is defined as a "transcription unit.”
  • the genes within a transcription unit are functionally linked together in such a way that all genes within such a unit are under the transcriptional control of the same promoter or promoter / enhancer.
  • IRES elements or introns can be used to functionally link genes within a transcription unit.
  • the expression vector may contain a single transcriptional unit for expression of the gene or genes of interest and, for example, selection marker genes. Alternatively, these genes can also be arranged in two or more transcription units. Different combinations of the genes within a transcription unit are possible. In another embodiment of the present invention, more than one expression vector consisting of one, two or more transcription units may be introduced into a host cell by co-transfection or in sequential transfections in any order. Any combination of regulatory elements and genes on each vector can be chosen as long as sufficient expression of the transcription units is ensured. If necessary, additional regulatory elements and genes, such as additional genes of interest or selection markers, can be positioned on the expression vectors.
  • eukaryotic host cells preferably mammalian cells, and especially rodent cells such as e.g. Mouse, rat and hamster cell lines.
  • rodent cells such as e.g. Mouse, rat and hamster cell lines.
  • preferred host cells are hamster cells, such as BHK21, BHK TK ", CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1, and CHO-DG44 cells or derivatives / descendants of these cell lines.
  • CHO-DG44 particularly preferred are CHO-DG44, CHO DUKX, CHO-K1 and BHK21 cells, in particular CHO-DG44 and CHO-DUKX cells, likewise suitable are mouse myeloma cells, preferably NSO and Sp2 / 0 cells and derivatives / derivatives of these cell lines, but also derivatives and derivatives of these cells, others Mammalian cells, including but not limited to human, mouse, rat, monkey, rodent, or eukaryotic cells, including, but not limited to, yeast, insect, avian, and plant cells, may also be used as host cells for the production of biopharmaceutical proteins ,
  • Transfection of the eukaryotic host cells with a polynucleotide or an expression vector according to the invention is carried out by customary methods. Suitable transfection methods are e.g. liposome-mediated transfection, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, polycation (e.g., DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection, and viral infections.
  • a stable transfection is performed wherein the constructs are integrated into either the genome of the host cell or an artificial chromosome / minichromosome or are stably episomally contained in the host cell.
  • any sequence or gene introduced into a host cell will be referred to as a "heterologous sequence” or “heterologous gene” with respect to the host cell. Even if the sequence to be introduced or the gene to be introduced is identical to an endogenous sequence or an endogenous gene of the host cell.
  • a hamster actin gene that is introduced into a hamster host cell is by definition a heterologous gene.
  • mAbs monoclonal antibodies
  • the transfection of suitable host cells can in principle be carried out in two different ways.
  • Such mAbs are composed of several subunits, the heavy and light chains.
  • Genes encoding these subunits can be housed in independent or multicistronic transcription units on a single plasmid, with which the host cell is then transfected. This is supposed to be the stoichiomehsche Ensure representation of genes after integration into the genome of the host cell.
  • independent transcription units it must be ensured here that the mRNAs which code for the various proteins have the same stability, transcription and translation efficiency.
  • the expression of the genes takes place within a multicistronic transcription unit by a single promoter and only one transcript is formed.
  • IRES elements By using IRES elements, a fairly efficient internal translation initiation of the genes in the second and subsequent cistrons is enabled. Nevertheless, the expression rates for these cistrons are lower than those of the first cistron, whose translation initiation through a so-called cap-dependent pre-initiation complex is much more efficient than the IRES-dependent translation initiation additional intercistronic elements are introduced, which, in conjunction with the IRES elements, ensure uniform expression rates.
  • Another possibility which is preferred according to the invention for simultaneously producing a plurality of heterologous proteins is co-transfection, in which the genes are integrated separately into different expression vectors.
  • This has the advantage that certain ratios of the genes and gene products can be adjusted to each other, whereby differences in the mRNA stability and in the transcription and translation efficiency can be compensated.
  • the expression vectors are more stable and easier to handle in both cloning and transfection.
  • the host cells are additionally transfected, preferably co-transfected, with one or more vectors having genes which code for one or more other proteins of interest.
  • the other vectors used for co-transfection code for the one or more other proteins of interest under the control of the same Promoter, preferably under the control of the same promoter / enhancer combination and for at least one selection marker, for example, the dihydrofolate reductase.
  • the host cells are cotransfected with at least two eukaryotic expression vectors, at least one of the two vectors containing at least one gene encoding at least protein of interest, and the other vector containing one or more nucleic acids according to the invention in any combination , Position and orientation, and optionally also for at least one gene (of interest encoded, and these nucleic acids according to the invention their transcription or expression-enhancing effect on the genes of interest, which are located on the other co-transfected vector, via co-integration mediate with the other vector.
  • the host cells are preferably established under serum-free conditions, adapted and cultivated, if appropriate in media which are free from animal proteins / peptides.
  • media which are free from animal proteins / peptides.
  • Examples of commercially available media are Ham 's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove 's Modified Dulbecco's medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serum-free CHO medium (Sigma), and protein-free CHO medium (Sigma) ,
  • DMEM Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • IMDM Iscove 's Modified Dulbecco's medium
  • CD-CHO Invitrogen
  • serum-free media are preferred according to the invention, it is also possible to use media which have been cultivated with a suitable amount for cultivating the host cells Serum were added.
  • media which have been cultivated with a suitable amount for cultivating the host cells Serum were added.
  • one or more suitable selection agents are added to the medium.
  • selection agent refers to a substance which impairs the growth or survival of host cells having a deficiency for the respective selection marker gene.
  • G418 preferably geneticin (G418) is used as a medium supplement for the selection of heterologous host cells which are a wild-type or, preferably, wild-type If the host cells are to be transfected with several expression vectors, eg if several genes of interest are to be introduced separately into the host cell, they usually have different selection marker genes.
  • selection marker gene is a gene that allows for the specific selection of cells that receive this gene by adding a suitable selection agent to the culture medium.
  • an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker Can be grown and thus selected in the presence of the corresponding antibiotic, but nontransfected cells can not grow or survive under these selection conditions, there are positive, negative and bifunctional selection markers, positive selection markers allow the selection and thus enrichment of transformed cells Mediating resistance to the selection agent or compensating for a metabolic or catabolic defect of the host cell, in contrast, cells that have received the gene for the selection marker may be targeted by negative selection markers en, be selectively eliminated.
  • selection markers used in this invention including the amplifiable Selection marker includes genetically engineered mutants and variants, fragments, functional equivalents, derivatives, homologs and fusions with other proteins or peptides as long as the selection marker retains its selective properties.
  • Such derivatives have considerable homology in the amino acid sequence in the regions or domains to which the selective property is attributed.
  • the literature describes a variety of selection marker genes, including bifunctional (positive / negative) markers.
  • selection markers commonly used in eukaryotic cells include the genes for aminoglycoside phosphotransferase (APH), hygromycin phosphotransferase (HYG), dihydrofolate reductase (DHFR), thymidine kinase (TK), glutamine synthetase, asparagine synthetase and genes conferring resistance to neomycin (G418), puromycin, histidinol D, bleomycin, phleomycin and zeocin.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • HAG hygromycin phosphotransferase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • TK thymidine kinase
  • glutamine synthetase glutamine synthetase
  • asparagine synthetase genes conferring resistance to neomycin (G418), puromycin, histidino
  • the cells according to the invention can optionally also be subjected to one or more gene amplification steps in which they are cultured in the presence of a selection agent which leads to an amplification of an amplifiable selection marker gene.
  • the prerequisite is that the host cells are additionally transfected with a gene which codes for an amplifiable selection marker. It is conceivable that the gene which codes for an amplifiable selection marker is present on one of the expression vectors according to the invention or is introduced into the host cell with the aid of another vector.
  • the amplifiable selection marker gene usually encodes an enzyme required for the growth of eukaryotic cells under certain culture conditions.
  • the amplifiable selection marker gene may encode dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the gene is amplified when culturing a host cell transfected therewith in the presence of the selection agent methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • the DHFR marker is particularly well suited for selection and subsequent amplification when using DHFR-negative basic cells such as CHO-DG44 or CHO-DUKX, since these cells do not express endogenous DHFR and thus do not grow in purine-free medium. Therefore, here the DHFR gene can be used as a dominant selection marker and the transformed cells are selected in hypoxanthine / thymidine-free medium.
  • amplifiable selection marker genes which can be used according to the invention are, for example, glutamine synthetase, methallothionein, adenosine deaminase, AMP deaminase, UMP synthase, xanthine-guanine phosphoribosyltransferase and thymdilate synthetase.
  • the rate of expression may be generally determined either based on the amount of corresponding mRNA present in the host cell or on the amount of gene product produced encoded by the gene of interest.
  • the amount of mRNA generated by transcription of a selected nucleotide sequence can be determined, for example, by Northern blot hybridization, ribonuclease RNA protection, in situ hybridization of cellular RNA, or by PCR methods (e.g., quantitative PCR). Proteins encoded by a selected nucleotide sequence may also be prepared by various methods, such as e.g.
  • titre or increase in productivity is meant increasing the expression, synthesis or secretion of a heterologous gene introduced into a host cell Sequence, for example, a gene encoding a therapeutic protein, as compared to a suitable control, for example, mutant protein versus wild-type protein called.
  • a titer or productivity increase is when a cell of the invention is cultured by a method of the invention described herein, and when that cell has at least an increase in specific productivity or titer of 10%.
  • a titer or productivity increase is also present when a cell according to the invention is cultured by a method according to the invention described here, and when this cell has at least one increase in specific productivity or titer of 20%, 50% and 75%, respectively ,
  • a titer or increase in productivity is in particular also present if a cell according to the invention is cultured by a method according to the invention described here, and if this cell has at least an increase in specific productivity or titer of 10-500%, preferably 20-300%, more preferably 50-200%.
  • a titer or productivity increase can be achieved both by using one of the expression vectors according to the invention and by using one of the methods according to the invention.
  • the corresponding methods can be combined with a FACS-based selection of recombinant host cells containing as further selection marker, for example, one (or more) fluorescent protein (s) (eg GFP) or a cell surface marker.
  • s fluorescent protein
  • Other methods for achieving increased expression although a combination of different methods is possible, for example, based on the use of c / s-active elements for manipulating the chromatin structure (eg LCR, UCOE, EASE, insulators, S / MARs, STAR elements ), Use of (artificial) transcription factors, treatment of cells with natural or synthetic agents to upregulate endogenous or heterologous gene expression, improve the stability (half-life) of the mRNA or protein, improve mRNA translation initiation, increase gene dose by using episomal plasmids (based on the use of viral sequences as the origin of replication, eg of SV40, polyoma, adenovirus, EBV or BPV), use of amplification-promoting
  • the selected high producing cells are preferably cultured in a serum-free culture medium and preferably in suspension culture under conditions which allow expression of the gene of interest.
  • the protein / product of interest is preferably recovered as a secreted gene product from the cell culture medium.
  • the gene product can also be isolated from cell lysates.
  • standard purification steps are performed. For this one often first removes cells and cell debris from the culture medium or lysate.
  • the desired gene product may then be released from contaminating soluble proteins, polypeptides and nucleic acids, e.g. by fractionation on immunoaffinity and ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC or chromatography on Sephadex, silica or cation exchange resins such as DEAE.
  • Methods which result in the purification of a heterologous protein expressed by recombinant host cells are known to the person skilled in the art and are described in the literature.
  • the present invention relates to a method for increasing the titer of a
  • Proteins of interest of a cell characterized in that a. in a nucleic acid sequence encoding the protein of interest, at least the codon deleted for the C-terminal
  • Amino acid encoded b. the cell is transfected with a vector containing the altered nucleic acid from a) and c. the cell is cultured under conditions that allow production of the protein of interest.
  • the present invention relates to a method for increasing the titer of an antibody of a cell, characterized in that in a nucleic acid sequence which codes for the heavy chain of the antibody, at least the codon which codes for the C-terminal amino acid lysine, the cell deleted is transfected with a vector containing the altered nucleic acid and the cell is cultured under conditions that allow production of the antibody of interest.
  • the present invention preferably relates to a method for increasing the specific productivity of a protein of interest of a cell, characterized in that in a nucleic acid sequence coding for the protein of
  • Amino acid is coded, the cell is transfected with a vector containing the altered nucleic acid, and the cell is cultured under conditions that allows production of the protein of interest.
  • the present invention relates to a method for increasing the specific productivity of an antibody of a cell, characterized in that in a nucleic acid sequence which codes for the heavy chain of the antibody, at least the codon is deleted, that for the C-terminal amino acid Lysine is transfected, the cell is transfected with a first vector containing the altered nucleic acid, the cell is co-transfected with a second vector containing the light chain of an antibody, and the cell is cultured under conditions that require production of the antibody allowed.
  • the modified heavy chain and the light chain or subunits of a heteromeric protein are introduced in successive transfections in any order.
  • the present invention relates to a method for increasing the specific productivity of an antibody or any heteromeric protein of interest of a cell, characterized in that in a nucleic acid sequence which codes for the heavy chain of the antibody, at least the codon is deleted, which codes for the C-terminal amino acid lysine, the cell is transfected with a vector which contains both the altered nucleic acid for the heavy chain of an antibody and the light chain of an antibody, and the cell is cultured under conditions involving production of the antibody Antibody allowed.
  • the vector with which the cell is transfected is a bi- or multicistronic vector.
  • the vector with which the cell is transfected is a vector which contains the heavy and light antibody chain as separate transcription units,
  • an IgGI molecule is expressed and secreted despite the deletion of the C-terminal lysine in CHO cells and the amounts of product are comparable to the cells transfected by IgGI wild-type (FIG. 2).
  • cells expressing the lysine deletion variant of the IgGI on average achieve even 27% higher titers or 32% higher specific productivities than cells expressing the IgGI wild type (FIG. 3).
  • This production advantage of the lysine deletion variant is still present even if a DHFR-based gene amplification is induced in these cell pools by addition of 100 nM MTX.
  • the titre and / or the specific productivity is increased by 10-500%, preferably 20-300%, particularly preferably 50-200% with respect to the comparison value of the protein without the deletion of the C-terminal amino acid .
  • the titre and / or the specific productivity is increased by at least 10%, preferably by at least 20%, further preferably by at least 50%, and particularly preferably by at least 75% with respect to the reference value of the protein without the deletion of the C-terminal amino acid.
  • the specific productivity is at least 5 pg / cell / day.
  • the present invention furthermore relates to a method for generating an expression vector for the increased production of a protein of interest, characterized in that in the nucleic acid sequence which codes for the protein of interest, at least the codon coding for the C-terminal amino acid is deleted, and the thus modified nucleic acid sequence is introduced into an expression vector.
  • the present invention further relates to a method for producing a cell with increased titer and / or increased specific productivity of a
  • Proteins of interest characterized in that a cell according to a treated according to the invention and then a single cell cloning is carried out, for example via dilution cloning or FACS based Einzellzellablage.
  • the present invention furthermore relates to a method for producing a protein of interest in a cell, characterized in that a group of cells is treated according to a method according to the invention, these cells are selected in the presence of at least one selection pressure, optionally a single cell cloning is carried out and the protein of Interest is derived from the cells or the culture supernatant.
  • a specific embodiment of the method according to the invention for producing at least one protein of interest is characterized in that the cells used for the preparation are additionally subjected to a gene amplification step after the selection step by means of selection means.
  • a specific embodiment of all said processes according to the invention is characterized in that the C-terminal amino acid is lysine (Lys) or arginine (Arg), preferably Lys.
  • Another specific embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the protein of interest is an antibody, an Fc fusion protein, EPO or tPA.
  • a preferred embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the protein of interest is a heavy chain of an antibody and the C-terminal amino acid is lysine (Lys).
  • a specific embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the heavy chain of the antibody is of the IgGI, IgG2, IgG3 or IgG4 type, preferably of the IgGI, IgG4 or IgG2 type.
  • the protein of interest is a monoclonal, polyclonal, mammalian, mouse, chimeric, humanized, primate or human antibody or an antibody fragment or derivative of a heavy chain of an immunoglobulin antibody or a Fab, F (ab ') 2, Fc, Fc-Fc fusion protein, Fv, single chain Fv, single domain Fv, tetravalent single chain Fv, disulfide-linked Fv, domain-deleted antibody, a minibody, diabody, or a fusion polypeptide of one of said fragments with another peptide or polypeptide or is an Fc-peptide fusion protein, an Fc-toxin fusion protein or a
  • Another specific embodiment of all said processes according to the invention is characterized in that the cell is cultured in suspension culture.
  • a special embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the cell is cultured serum-free.
  • a further specific embodiment of all said processes according to the invention is characterized in that the cell is cultured in chemically defined medium.
  • a preferred embodiment of all said processes according to the invention is characterized in that the cell is cultured in protein-free medium.
  • a preferred embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the cell is a eukaryotic cell, for example from yeast, plants, worms, insects, birds, fish, reptiles or mammals.
  • a further preferred embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the cell is a mammalian cell.
  • a particularly preferred embodiment of all said methods according to the invention is characterized in that the cell is a CHO cell.
  • a further specific embodiment of the abovementioned process according to the invention is characterized in that the CHO cell is selected from the group: CHO wild type, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11 and CHO Pro-5. Particularly preferred is a CHO DG44 cell.
  • the invention further relates to an expression vector with increased expression of a gene of interest generatable by one of the aforementioned methods of the invention.
  • the invention further relates to a cell generatable according to one of the aforementioned methods of the invention.
  • the invention further relates to a method of producing and purifying a protein of interest, characterized in that at least one C-terminal amino acid of the corresponding gene of interest is deleted and the resulting protein of interest has a reduced heterogeneity compared to the wild-type protein without deletion.
  • a specific embodiment of the method according to the invention is characterized in that the C-terminal amino acid is lysine (Lys) or arginine (Arg), preferably Lys.
  • Another specific embodiment of the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is an antibody, an Fc fusion protein, EPO or tPA.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is a heavy chain of an antibody and the C-terminal amino acid lysine (Lys).
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the heavy chain of the antibody is of the IgGI, IgG2, IgG3 or IgG4 type, preferably of the IgGI, IgG2 or IgG4 type.
  • a special embodiment of the method according to the invention is characterized in that cells are cultivated in suspension culture for the production.
  • Another specific embodiment of the method according to the invention is characterized in that cells are serum-free for the production be cultivated.
  • a further specific embodiment of all said processes according to the invention is characterized in that the cell is cultured in chemically defined medium.
  • a preferred embodiment of all said processes according to the invention is characterized in that the cell is cultured in protein-free medium.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the cells are mammalian cells.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the cells are CHO cells, preferably CHO DG44 cells.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that in the purification of the protein of interest, a lower salt concentration is used in comparison to the purification of a wild-type protein without deletion.
  • the invention further relates to a method for producing an antibody, characterized in that in a nucleic acid which codes for the heavy chain of an antibody, at least the codon which codes for the C-terminal amino acid lysine, the cell is transfected with a vector containing the nucleic acid thus altered, and the cell is cultured under conditions permitting expression of the antibody.
  • immunoglobulin G immunoglobulin G
  • Lys Lys in mAb: monoclonal antibody
  • NPT neomycin phosphotransferase
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • the cells CHO-DG44 / dhfr " ⁇ are permanently stored as suspension cells in serum-free CHO-S-SFMII medium supplemented with hypoxanthine and thymidine (HT) (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, DE) in cell culture flasks at 37 ° C. in a humid atmosphere and 5%.
  • HT hypoxanthine and thymidine
  • the cell counts and the viability are determined with a Cedex (Innovatis) and the cells are then seeded in a concentration of 1-3 x 10 5 / mL and passaged every 2-3 days.
  • a Cedex Innovatis
  • Lipofectamine Plus reagent For each transfection mixture, a total of 1.0-0.1 ⁇ g of plasmid DNA, 4 ⁇ L of Lipofectamine and 6 ⁇ L of Plus reagent are mixed according to the manufacturer's instructions and in a volume of 200 ⁇ L to 6 ⁇ 10 5 cells in 0 , 8 ml HT-supplemented CHO-S-SFMII medium. After incubation for 3 hours at 37 ° C.
  • CHO-S-SFMII medium 2 ml of HT-supplemented CHO-S-SFMII medium are added. After a cultivation time of 48 hours, the transfection batches are either harvested (transient transfection) or subjected to selection. Since one expression vector contains one DHFR and the other an NPT selection marker, the cotransfected cells are transferred to CHO-S-SFMII medium without hypoxanthine and thymidine supplement for DHFR- and NPT-based selection 2 days after transfection and added to the medium also added G418 (Invitrogen) in a concentration of 400 ug / mL.
  • G418 Invitrogen
  • DHFR-based gene amplification of the integrated heterologous genes is achieved by addition of the selection agent MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) in a concentration of 5-2000 nM to an HT-free CHO-S-SFMII medium.
  • MTX Sigma, Deisenhofen, DE
  • eukaryotic expression vectors are used which are based on the pAD-CMV vector and mediate the expression of a heterologous gene via the combination CMV enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter (WO 97/15664) or CMV enhancer / CMV promoter. While the base vector pBID contains the dhfr minigene which serves as an amplifiable selection marker, in the pBIN vector the dhfr minigene is replaced by an NPT gene.
  • the NPT selection marker including SV40 early promoter and TK polyadenylation signal, was isolated from the commercial plasmid pBK-CMV (Stratagene, La JoIIa, CA) as a 1640 bp Bsu36I fragment. After a replenishment reaction of the fragment ends by Klenow DNA polymerase, the fragment was ligated with the 3750 bp Bsu36l / Stul fragment of the vector pBID, which was also treated with Klenow DNA polymerase. In both vectors, the expression of the heterologous gene is controlled by the combination CMV enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter.
  • the vector pBIN ⁇ a is a derivative of the vector pBIN and contains a modified NPT gene. It is the NPT variant F240I (Phe240lle), whose cloning is described in WO2004 / 050884.
  • F240I He240lle
  • a derivative of the vector pBID the expression of the heterologous gene is under the control of the CMV enhancer / promoter combination.
  • Supernatants from stably transfected CHO-DG44 cells are determined by ELISA according to standard protocols, using on the one hand a goat anti human IgG Fc fragment (Dianova, Hamburg, DE) and on the other hand an AP-conjugated goat anti human kappa light chain antibody (Sigma) becomes. As a standard purified antibody of the same isotype as the expressed antibodies.
  • Productivities (pg / cell / day) are calculated using the formula pg / ((Ct-Co) t / In (Ct-Co)), where Co and Ct indicate the cell number at sowing or harvesting and t the cultivation time.
  • the SEAP titer in culture supernatants of transiently transfected CHO-DG44 cells is quantified using the SEAP Reporter Gene Assay according to the protocol specifications of the manufacturer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE).
  • the heavy chain of the monoclonal humanized F19 antibody (IgGI / kappa) is isolated as a 1.5 kb Nael / HindIII fragment from the plasmid pG1 D105F19HC (NAGENESEQ: AAZ32786) and inserted into the EcoRI (filled in with Klenow DNA polymerase) and HindIII-digested vector pBID cloned resulting in the vector pBID / F19HC (Fig.1).
  • the light chain is expressed as a 1.3 kb HindIII / EcoRI fragment from the plasmid pKN100F19LC (NAGENESEQ: AAZ32784) and cloned into the corresponding cleavage sites of the vector pBIN, resulting in the vector pBIN / F19LC ( Figure 1).
  • the deletion of the C-terminal lysine on the heavy chain of the F19 antibody is carried out by means of PCR using the mutagenic primer F19HC-Lys rev gacgtctaga tcaacccgga gacagggaga ggc (SEQ ID NO: 1) with complementary sequence to the gene sequence corresponding to the last amino acids of the encoded heavy chain in the C-terminal region.
  • the codon of C-terminal lysine is replaced by a stop codon.
  • an Xbal restriction cleavage site follows, which is used for later cloning.
  • This mutagenic primer is used in combination with the primer F19 heavy4 atctgcaacg tgaatcacaa gc (SEQ ID NO: 2), which has complementarity to a more upstream sequence in the heavy chain constant region.
  • the template used for PCR mutagenesis is the vector pBID / F19HC.
  • the resulting 757 bp PCR product is digested with BmgBI (an endogenous site downstream of primer position F19 heavy4) and XbaI and the 547 bp restriction fragment used to replace the corresponding sequence region in the vector pBID / F19HC. This results in the vector pBID / IgG1-Lys, which codes for a heavy chain of the F19 antibody with deleted C-terminal amino acid lysine (Fig.
  • control plasmids pBID / F19HC and pBIN / F19LC which encode the monoclonal antibody F19 in its wild-type configuration, that is including the C-terminal lysine on the heavy chain
  • pBID / IgG1-Lys and pBIN / F19LC encoding an F19 antibody whose heavy chain has a C-terminal lysine deletion
  • the IgGI molecule is expressed and secreted and the amounts of product are comparable to the cells transfected by IgGI wild-type (FIG. 2).
  • stably transfected cells For stable transfection of CHO-DG44 cells, co-transfection is carried out with the same plasmid combinations as described above, producing 10 pools per combination. As a negative control, two mock-transfected pools are carried, ie treated the same, but without DNA addition in the transfection mixture. The selection of stably transfected cells is carried out two days after transfection in HT-free medium with the addition of 400 ⁇ g / mL G418. After selection, the IgGI titer and the specific productivity of the cell pools are determined over a period of 3-4 passages (passenger rhythm 2-2-3 days).
  • the heavy chain is cloned as a 2.2 kb BamHI / SmaI fragment into the EcoRI (filled-in interface by treatment with Klenow DNA polymerase) and BamHII-digested plasmid pBIDa
  • the plasmid pBIDa / IgG4 HC results (FIG. 1).
  • the light chain is cloned as a 1.1 kb BamHI / EcoRI fragment into the BamHI / EcoRI sites of the plasmid pBINa, resulting in the plasmid pBIN8a / IgG4 LC (FIG . 1 ).
  • the deletion of the C-terminal lysine on the IgG4 antibody heavy chain is carried out by PCR using the mutagenic primer IgG4HC-Lys revgacgtctaga tcaacccaga gacagggaga ggct (SEQ ID NO: 3) with complementary sequence sequence corresponding to the last amino acids of the heavy chain encoded in the C-terminal region.
  • the codon of C-terminal lysine is replaced by a stop codon.
  • an Xbal restriction cleavage site follows, which is used for later cloning.
  • This mutagenic primer is used in combination with the primer HC for ⁇ ccctgacctagagcccaccc (SEQ ID NO: 4), which has complementarity to a more upstream sequence in the heavy chain constant region.
  • the vector pBIDa / IgG4 HC serves as template for the PCR mutagenesis.
  • the resulting 1013 bp PCR product is digested with BmgBI (an endogenous cleavage site downstream of primer position HC for ⁇ ) and XbaI, and the 644 bp restriction fragment used to replace the corresponding sequence region in vector pBIDa / IgG4 HC.
  • BmgBI an endogenous cleavage site downstream of primer position HC for ⁇
  • XbaI 644 bp restriction fragment used to replace the corresponding sequence region in vector pBIDa / IgG4 HC.
  • This results in the vector pBIDa / IgG4-Lys which codes for
  • control plasmids pBIDa / IgG4 HC and pBIN8a / IgG4 LC which encode for the monoclonal IgG4 antibody in its wild-type configuration, that is, including the C-terminal lysine on the heavy chain
  • the IgG4 molecule is even produced slightly better than the IgG4 wild type (FIG. 5).
  • C-terminal lysine ions become Fc fusion proteins (bivalent or bispecific) in which biomolecules such as cytokines, soluble receptors, etc. are part of an Fc fusion protein (examples: alefacept, LFA-3-Fc, etanercept TNFR-Fc ), performed.
  • transient transfections it is first tested whether the deletion of the C-terminal amino acid has an influence on expression and secretion. Thereafter, stable transfections are performed and the specific productivities and titres of cell pools expressing mutated proteins or wild-type proteins are compared.
  • the work-up is identical.
  • Protein A affinity chromatography (MabSelect, GE) is according to the manufacturer's instructions.
  • the quantification of the product yield after Protein A chromatography is carried out by means of Protein A HPLC.
  • the yields of both variants of the isotype IgGI are over 90% independent of the lysine codon deletion ( Figure 8).
  • the lysine deletion has no negative influence on the affinity chromatography or the product yield.
  • the product heterogeneity with respect to the C-terminal lysine is qualitatively determined in isoelectric focusing (IEF) as well as quantitatively by weak cationic exchange (WCX) (see Figs. 9 and 11).
  • the antibodies are incubated with carboxypeptidase B.
  • carboxypeptidase B At 37 ° C., 10 ⁇ g carboxypeptidase B are incubated in 100 ⁇ L and an antibody concentration of 1 mg / ml for 2 h.
  • Figure 9 shows a reduction in the number of bands for the WT antibody (IgGI) after enzymatic cleavage with carboxypeptidase B (CpB).
  • Cation exchange chromatography (ProPac WCX-10/4 x 250 mm) was performed at a flow rate of 1 mL / min and a 5-10% gradient over 40 min (buffer A 2OmM MES buffer pH 6.7; buffer B: 20 mM, 1M NaCl pH6.7).
  • the pillar is loaded with 40 ⁇ g each antibody.
  • the WT and the -Lys variant are analyzed respectively with and without enzymatic CpB treatment.
  • the states Lys1 and Lys2 are characterized by the basic peaks 1 and 2. Their product content is -10%.
  • the elution profile or overlay of the variant with Lysindeletion has a very low heterogeneity in the basic range. The product content is less than 1% (Fig.11).
  • EXAMPLE 5 PURIFICATION OF IGG4 WT AND IGG4-LYS
  • the work-up is identical to the IgGL.
  • the protein A affinity chromatography (MabSelect, GE) is carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the quantification of the product yield after Protein A chromatography is carried out by means of Protein A HPLC.
  • the yields of both variants of the isotype IgG4 are also over 90% independent of the lysine codon deletion ( Figure 8).
  • the product heterogeneity with respect to the C-terminal lysine is quantitatively determined by LC-MS (see FIGS. 10 and 12). To determine the C-terminal lysine distribution, the antibody samples are first reduced with DTT.
  • the reduced light chain and the reduced heavy chain are separated via HPSEC and analyzed in subsequent (in-line) ESI-TOF-MS.
  • the distribution of the C-terminal lysine is based on the peak areas for the HC 1 -446 and HC 1 -447, respectively.
  • mass shift by lysine is shown as a function of glycosylation (GO, G1, G2) ( Figure 12).
  • the calculated product content of antibody molecules (IgG4 WT) with C-terminal lysines in the heavy chain is approximately 20% ( Figure 10).
  • EXAMPLE 6 THERMAL STABILITY
  • the determination of the thermal stability by means of intrinsic fluorescence shows no influence of the C-terminal lysine (IgGI WT and -Lys T m 69 ° C, or IgG4 WT and -Lys 64 ° C).
  • the excitation wavelength is 295 nm.
  • the respective emission spectrum is measured in 1 ° C increments over a range of 25 ° C to 85 ° C.
  • the emission spectra are recorded over a wavelength range of 300 nm to 450 nm.
  • the protein concentrations are 0.1 mg / mL in PBS buffer.
  • the investigation shows that the C-terminal lysine of the heavy antibody chain has no influence on the thermal stability of the antibody molecule.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Steigerung des Titers eines Proteins von Interesse in einer Zelle sowie die verbesserte Produktion und Reinigung von optimierten Biomolekülen, deren Bestandteil u.a. die Domäne CH3 ist. Ein oftmals beobachteter Effekt bei Biomolekülen ist die Abspaltung der C-terminalen Aminosäure(n), z.B. des C-terminalen Lysins. Die zumeist unvollständige Prozessierung beispielsweise der schweren Kette von Antikörpern führt zu Produktheterogenität. Zur Vermeidung dieser Produktheterogenität wurde mittels rekombinanter DNA-Technologie das entsprechende Codon des C-terminalen Lysins der schweren Antikörperkette deletiert. Diese optimierten Antikörper führen zu einem, im Vergleich zum Wildtyp, erhöhten Produkttiter. Zusätzlich erweisen sie sich als vorteilhaft in der Reinigung durch ein besseres Elutionsverhalten aufgrund der reduzierten Ladungsheterogenität.

Description

VERFAHREN ZUR STEIGERUNG VON PROTEINTITERN
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET Die Erfindung betrifft optimierte Proteine, insbesondere Antikörper Fc-Teile, bzw. Fc-Fusionsproteine und Verfahren zur Herstellung bzw. biopharmazeutischen Produktion solcher optimierten Antikörper und Fc-Fusionsproteine mit gesteigerter Produktivität sowie ein Verfahren zur Produktion und Aufreinigung von Proteinen, wobei das produzierte Biomolekül vollständig homogen bezüglich des C- terminalen Lysins ist.
HINTERGRUND
Biomoleküle wie Proteine, Polynukleotide, Polysaccharide und dergleichen gewinnen als Medikamente, als Diagnostika, als Zusatzstoffe in Nahrungsmitteln, Waschmitteln und dergleichen, als Forschungsreagenzien und für viele weitere Anwendungen zunehmend an kommerzieller Bedeutung. Der Bedarf an solchen Biomolekülen lässt sich - z.B. im Falle von Proteinen - in aller Regel nicht mehr durch Isolierung der Moleküle aus natürlichen Quellen befriedigen sondern erfordert den Einsatz biotechnologischer Produktionsmethoden.
Die biotechnologische Herstellung von Proteinen beginnt typischerweise mit der Isolierung der DNA, die für das gewünschte Protein kodiert, und deren Klonierung in einen geeigneten Expressionsvektor. Nach Transfektion des rekombinanten Expressionsvektors in geeignete prokaryontische oder eukaryontische Expressionszellen und anschließender Selektion transfizierter, rekombinanter Zellen werden letztere in Fermentern kultiviert und das gewünschte Protein zur Expression gebracht. Anschließend erfolgt die Ernte der Zellen bzw. des Kulturüberstandes und die Aufarbeitung und Reinigung des darin enthaltenen Proteins. Im Falle von Biopharmazeutika, wie etwa als Medikamente eingesetzten Proteinen, z.B. therapeutischen Antikörpern, ist die Produktausbeute entscheidend. Darüber hinaus ist auch die Abtrennung von Verunreinigungen von Bedeutung. Hierbei können prozess- und produktabhängige Verunreinigungen voneinander unterschieden werden. Die prozessabhängigen Verunreinigungen beinhalten Komponenten der Wirtszellen wie Proteine und Nukleinsäuren oder stammen aus der Zellkultur (wie Medienbestandteile) sowie aus der Aufarbeitung (wie etwa Salze oder abgelöste Chromatographie-Liganden). Darüber hinaus treten produktabhängige Verunreinigungen auf. Diese sind molekulare Varianten des Produkts mit abweichenden Eigenschaften. Hierzu zählen z.B. verkürzte Formen wie Vorläufer und hydrolytische Abbauprodukte, enzymatische Abspaltung von C-terminalen Aminosäureresten von Proteinen, aber auch modifizierte Formen, entstanden beispielsweise durch Desaminierungen, unterschiedliche Glykosylierungsmuster oder falsch verknüpfte Disulfidbrücken. Ebenso zu den produktabhängigen Varianten zählen Polymere und Aggregate. Als Kontaminanten werden alle weiteren Materialien chemischer, biochemischer oder mikrobiologischer Natur bezeichnet, die nicht direkt zum Herstellungsprozess gehören. Weitere Kontaminanten sind z.B. Viren, die unerwünschter Weise in Zellkulturen auftreten können.
Eine häufig beobachtet Produktvariante bei der Überexpression von rekombinanten Antikörpern oder Fc-Fusionsproteinen in Säugetierzellen zur Herstellung von neuen biopharmazeutischen Arzneimitteln beruht auf der Heterogenität am C-Terminus der schweren Kette von Immunoglobulinen durch enzymatische Abspaltung des C-terminalen Lysins. Zur exakten Beschreibung dieser Heterogenität müssen hoch auflösende analytische Methoden entwickelt werden. Für die Detektion und Quantifizierung der Ladungsheterogenität werden in der Qualitätskontrolle der pharmazeutischen Industrie folgende Methoden eingesetzt: Cation Ion Exchange Chromatography (CIEX), Isoelektrische Fokussierung (IEF) (nur Detektion), capillary Isoelectric Focusing (clEF) sowie Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCMS). Jede produzierte Charge muss unter anderem bezüglich dieser Modifizierung bewertet und freigegeben werden.
Bei vielen der auf dem Markt befindlichen Moleküle dieser Klasse sind diese Produktheterogenitäten am C-Terminus der schweren Kette beschrieben. Dabei wird zwischen Antikörpermonomeren mit vollständig abgespaltenen Lysin (LysO), mit einem abgespaltenen Lysin (Lys1 ) und ohne Lysinabspaltung (Lys2) am C- Terminus der schweren Kette unterschieden. Die verschiedenen unvollständig prozessierten Moleküle (Lys1 und Lys2) können bis zu 30% innerhalb einer Charge betragen (Santora et al. (1999) Analytical Biochemistry, 275(1 ): p. 98- 108). Bei dem Herstellungsprozess von Remicade® (Infliximab) betrug die Heterogenität während der Fermentation ca. 20% (LysO und Lys1 ) und 80% (Lys2) (FDA, Product Review on Remicade, 1998). Weitere Beispiele für C-terminale Lysin-Prozessierung bei monoklonalen Antikörpern siehe Tabelle (Harris, RJ, (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1 ), pp. 129-134).
Protein Aminosäure Zelllinie/Quelle Referenz rCD4-lgG Lys transfizierte CHO RJ. Harris, K.L. Wagner and M.W. Spellman, Eur J Biochem , 194 ( 1990) 61 1 -620
rhu MabHER2 Lys transfizierte CHO R,J. Harris, A.A. Murnane, S. L. Utter, K.L,
Wagner, E. T. Cox, G. Polastri, J.C. Helder and
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1297 OKT3 Mab Lys Hybridoma P. Rao, A. Williams, A. Baldwin-Ferro, E.
Hanigan, D. Kroon, M. Makowski, E. Meyer, V.
Numsuwan, E. Rubin and A. Tran, BioPhαrm, 4
( 1991 ) 38-43. OKT3 Mab Lys Hybridoma P. Rao, A. Williams, A. Baldwin-Ferro, E.
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Numsuwan, E. Rubin and A. Tran, BioPhαrm, 4
( 1991 ) 38-43.
CEM231 Mab Lys Hybridoma J. P. McDonough, T. C. Furman, R. M. Bartholomew and R.A. Jue, US Pαt 5 126 250 ( 1992)
CEM231 Mab Lys Hybridoma J. P. McDonough, T. C. Furman, R. M. Bartholomew and R.A. Jue, US Pαt 5 126 250 ( 1992)
Hu-anti-Tac Mab Lys transfizierte SP2/0 D. A. Lewis, A.W. Guzzetta, W.S. Hancock and M.
Costello, Anal Chem , 66 ( 1994) 585-595.
2-Chain tPA Arg transfizierte CHO
2-Chain tPA Arg Melanoma hu EPO Arg humanes Urin M. A. Recny, H.A. Scoble and Y. Kim, J Biol Chem , 262 ( 1987) 17156- 17163 rhu EPO Arg transfizierte CHO M. A. Recny, H.A. Scoble and Y. Kim, J Biol Chem , 262 ( 1987) 17156- 17163
Quelle: Harris, RJ. (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1 ), pp. 129-134 Die Ursache für diese Produktheterogenität ist bisher nicht bekannt. Es ist unklar, ob die Struktur der Kette, die Wirtszelle oder die Fermentationsbedingungen und damit unterschiedliche metabolische Prozesse in der Zelle einen wesentlichen Einfluss nehmen. Weiterhin ist bisher unbekannt, an welche Stelle der Produktherstellung in der Zelle (co-translational, post-translational), an welchem Ort und durch welche Carboxypetidase die Abspaltung des Lysins erfolgt. Mögliche Chargenschwankungen können somit nicht verhindert werden und Gegensteuerung ist somit nicht gezielt möglich. Produktheterogenitäten können auch durch andere C-terminale Aminosäure- Deletionen verursacht werden, wie z. B. durch eine Deletion des C-terminalen Arginins bei den Proteinen tPA oder EPO (Harris, RJ, (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1 ), pp. 129-134).
Als Ausgangspunkt für die Bewertung der Produktionscharge dienen die physikochemikalischen Produkteigenschaften, die Reinheit, die Homogenität sowie die Wirksamkeit und Sicherheit des Produkts.
Elektrophoretische (IEF) bzw. chromatographische (IEC, SEC, RP) Trennverfahren sowie massenspektroskopische Verfahren (MS, ESI, MALDI) dienen zur Bewertung der Produktreinheit und Produktheterogenität .
Die Kontrolle der Produktreinheit stellt die ausreichende Abreicherung von Verunreinigungen und die Entfernung von im Herstellungsverfahren durch enzymatische, mechanische oder chemische Vorgänge entstandenen Spaltprodukten und aggregierten Proteinmolekülen sicher. Die Bewertung der Produkthomogenität erfolgt primär anhand der Abweichungen im Glykosylierungsmuster und der Ladungsheterogenität. Die Wirksamkeit eines Produktes beschreibt dessen biologische Aktivität, die sich bei Antikörpern aus Eigenschaften wie das Antigenbindungsvermögen, die Induktion von Effektorfunktionen, Serum-Halbwertszeit u.a. zusammensetzt. Bestimmende Faktoren für die Produktsicherheit sind u.a. die Sterilität und die bakterielle Endotoxinbelastung der Produktcharge. Aufgrund der Vielzahl an Kontroll werten, die bei einer erzeugten Produktionscharge für dessen Freigabe gewährleistet bzw. eingehalten werden müssen, ist eine Reduktion der Kontrollwerte, z. B. durch Eliminierung des die Charge beeinflussenden Parameters, erstrebenswert.
Weiterhin ist bei der biotechnologischen Herstellung von Proteinen ein hoher Produkttiter und eine hohe spezifische Produktivität der Zellen wünschenswert.
Es ergibt sich somit die Aufgabe, einen verbesserten Herstellprozess bereit zu stellen. Hinsichtlich der Produktexpression, der Produktreinigung und Produktstabilität dürfen bei der Herstellung keine negativen Einflüsse auftreten.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe überraschend durch ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, welches eine gesteigerte Ausbeute ermöglicht, indem bereits auf DNA-Ebene das C-terminal kodierende Kodon (z.B. Lysin) entfernt und anschließend ein Stopp-Kodon eingefügt wird. Dieses Verfahren ermöglicht eine Steigerung des Proteintiters, insbesondere von Antikörpern, die eine C-terminale Lysin-Deletion an den schweren Ketten aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt rekombinante DNA Konstrukte von Proteinen, insbesondere von Antikörpermolekülen wie IgGI , lgG2, lgG3, lgG4 und Fc-Fusionskonstrukte, die eine Deletion des C-terminalen Lysins aufweisen. Durch die durchgeführte Änderung des Expressionskonstruktes und die Deletion des C- terminalen Lys-Kodons werden nur noch Moleküle mit einem homogen C- Terminus der schweren Kette hergestellt.
Bei der Überexpression von beispielsweise rekombinanten Antikörpern oder Fc-
Fusionsproteinen in Säugetierzellen zur Herstellung von neuen biopharmazeutischen Arzneimittel treten häufig Moleküle auf, die am C-Terminus der schweren Kette Heterogen itäten aufweisen. Das gereinigte Endprodukt weist bezüglich des C-Terminus der schweren Kette drei unterschiedliche Spezies auf: 1 ) vollständige Ketten mit C-terminalem Lysin gemäß der DNA Sequenz (Lys 2) oder 2) unvollständige Kette (Lys 1 ) und 3) Deletion des C-terminalen Lysins an beiden Ketten (Lys 0). Die Anteile der beiden Spezies sind nicht vorhersagbar. Somit können Unterschiede je nach Zelle, Fermentationsbedingungen und Herstellcharge auftreten. Es ist unklar, ob die Antikörperstruktur einen Einfluss auf diese intrazelluläre enzymatische Abspaltung des Lysins hat. Bei den bisher auf dem Markt befindlichen Molekülen wurde derart verfahren, dass die komplette DNA-Sequenz der schweren Kette exprimiert wird und auftretende Heterogen itäten am C- Terminus mit hohem Aufwand analysiert und dokumentiert werden. Zur Charakterisierung des Produktes müssen somit exakte Methoden zur Analyse des C-Terminus entwickelt werden und alle Chargen bezüglich dieses Merkmals analysiert werden (Alexandru C. Lazar et al; Rapid Commun. Mass Spectrum. 2004; 18: 239-244, Lintao Wang et al; Pharmaceutical Research, Vol.22, No.8, 2005). Der Aufwand zur Analyse der auftretenden Produktheterogenitäten ist somit hoch. Eine Reduktion des Analysenaufwandes und der Analysekosten wäre wünschenswert.
Die Ursache der beschriebenen Produktheterogenität ist bisher nicht bekannt. Es ist unklar, ob die Struktur der Kette, die Wirtszelle oder die
Fermentationsbedingungen und damit unterschiedliche metabolische Prozesse in der Zelle einen wesentlichen Einfluss nehmen. Weiterhin ist bisher unbekannt, an welcher Stelle der Produktherstellung in der Zelle (co-translational, post- translational), an welchem Ort und durch welches Enzym die Abspaltung des Lysins erfolgt. Mögliche Chargenschwankungen können somit nicht verhindert werden und Gegensteuerung ist somit nicht gezielt möglich.
Es gibt bisher keinen Hinweis, dass bei der Applikation dieser Produkte aufgrund der Heterogenität im C-Terminus nachteilige Effekte, wie z.B. immunopathologische Nebenwirkungen, auftreten. Daher scheint auch die nicht native Sequenz ohne C-terminales Lysin hinsichtlich der klinischen Wirksamkeit und Verträglichkeit unbedenklich und der nativen Sequenz gleichwertig zu sein.
Bisher sind jedoch keine Konstrukte für therapeutische Proteine, insbesondere Antikörper oder Fc-Fusionskonstrukte, mit der Deletion des C-terminalen Lys- Kodons beschrieben, denn das C-terminale Lysin in der schweren Kette von IgGs ist hoch konserviert.
Abweichend von dem Stand der Technik wurde bei der vorliegenden Erfindung bereits auf DNA-Ebene am 3' Ende das Kodon für Lysin beim Expressionskonstrukt für die schwere Kette von Antikörpern deletiert. Bei allen IgG Subtypen ist der C-Terminus der schweren Kette sehr konserviert und das Lysin am C-Terminus ist zum Beispiel sowohl bei humanen als auch Maus Antikörpern immer vorhanden. Aufgrund dieses Sachverhaltes ist zu erwarten, dass das Lysin für die Expression, Faltung oder Sekretion eine wesentliche Bedeutung hat. Überraschender weise konnte in unseren Experimenten mit unterschiedlichen IgG Klassen jedoch erstmalig gezeigt werden, dass trotz Deletion des C-terminalen Lysins die Moleküle in tierischen Zellkultursystemen exprimiert werden und die native P rote in struktur ins Medium sezerniert wird. Besonders überraschend hierbei ist die beobachtete und vollkommen unerwartete Steigerung der Produkttiter beim Einsatz dieser Konstrukte. Dies ist im Hinblick auf die hohe Konservierung der C-terminalen Lysin-Position in den bevorzugt humanen Immunoglobulinen unerwartet. Der Produkttiter ist beim Einsatz dieser Expressionskonstrukte um mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 20% und besonders bevorzugt um mindestens 50% gesteigert.
Die Vermeidung der Produktheterogenität durch die Lys-Kodondeletion konnte zudem durch die Analyse produzierter Antikörper-Isotypen qualitativ und quantitativ belegt werden. Für zwei verschiedene Isotypen (IgGI und lgG4) wurden zum Vergleich der Wildtyp-Antikörper und die entsprechende Lysin- Deletionsmutante exprimiert und gereinigt. Im Anschluss erfolgte die Proteincharakterisierung. Darüber hinaus konnte entgegen den Erwartungen gezeigt werden, dass die Produkttiter um mindestens 10-20% gesteigert werden konnte. Für die Aufarbeitung des Produktes (Protein A Affinitätschromatographie) und die Proteincharakterisierung wurden keine nachteiligen Effekte der Lysin- Kodondeletion festgestellt. Die weitere Analyse des Reinigungsverfahrens und der Produktcharakterisierung (Produktausbeute, Aggregationsverhalten) ergab ebenfalls keinen nachteiligen Einfluss der Lys-Deletionsmutanten. Aufgrund der höheren Robustheit für den Herstellprozess, der Reduktion des analytischen Aufwandes und der gesteigerten Produkttiter ist dieses neue Verfahren dem bisherigem Stand der Technik deutlich überlegen.
Der wesentliche Vorteil zum jetzigen Stand der Technik ist, dass unter Verwendung dieser Konstrukte nur die Variante des C-Terminus ohne Lysin für die schweren Kette auftreten kann. Somit entfällt eine Möglichkeit für Chargenschwankungen und der Anteil an Produktcharakterisierungsarbeiten. Besonders überraschend ist bei der vorliegenden Erfindung, dass die Konstrukte ohne C-terminales Lysin zu gesteigerten Produkttitern führen, was für eine hohe Ausbeute besonders vorteilhaft ist.
Die vorliegende Erfindung lässt sich bevorzugt auf Prozesse zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern und/oder Fc-Fusionsproteinen anwenden. Die vorliegende Erfindung lässt sich jedoch auch auf andere Moleküle anwenden, die C-terminale Aminosäuredeletionen aufweisen. Beispiele hierfür sind EPO und tPA, bei denen C-terminale Arginin-Deletionen auftreten.
Die Erfindung betrifft die verbesserte Produktion und Reinigung von optimierten Proteinen, deren Bestandteil u.a. die Immunoglobulin-Domäne CH3 ist. Ein oftmals beobachteter Effekt bei diesen Proteinen ist die Abspaltung des C-terminalen Lysins. Diese zumeist unvollständige Prozessierung der schweren Kette führt zu Produktheterogenität. Zur Vermeidung dieser Produktheterogenität wurde mittels rekombinanter DNA Technologie das entsprechende Kodon des C-terminalen Lysins der schweren Antikörperkette deletiert. Diese Deletion im optimierten Antikörper führt überraschender weise nicht zu einem Nachteil bei der Expression bzw. intrazellulären Proteinprozessierung sondern zu einem, im Vergleich zum Wildtyp, erhöhten Produkttiter. Zusätzlich erweisen sich die optimierten Antikörper als vorteilhaft in der Reinigung durch ein besseres Elutionsverhalten aufgrund der reduzierten Ladungsheterogenität und sie zeichnen sich durch eine verbesserte Homogenität aus. Zudem ist vorteilhaft, dass bei der Reinigung des Proteins von Interesse eine niedrigere Salzkonzentration zum Einsatz kommt im Vergleich zur Aufreinigung eines Proteins ohne die Deletion der C-terminalen Aminosäure.
Die vorliegende Erfindung ergibt sich nicht aus dem Stand der Technik. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt muss die Produktheterogenität für jede Produktionscharge analysiert werden bevor eine Freigabe erfolgen kann. Für die qualitative und quantitative Bestimmung der Heterogenität von Lysinresten am C- Terminus der schweren Kette müssen arbeits- und kostenintensive Analysemethoden eingesetzt werden.
Als etablierte Methoden zur quantitativen Bestimmung der Antikörperisoformen werden in der Qualitätskontrolle der pharmazeutischen Industrie säulenchromatographische Trennmethoden (schwache Kationentauscher, WCX) z.T. in Kombination mit Massenspektroskopie (LC-MS) oder elektrophoretische Trennmethoden eingesetzt (kapillare Isoelektrische Fokussierung, CIEF). Die gel- isoelektrophoretische Fokussierung erlaubt lediglich eine qualitative Bewertung der Lysin-Heterogenität.
Ein Ansatz zur Reduzierung der Ladungsheterogenität durch C-terminale Lysinreste der schweren Antikörperkette ist in bestehenden Verfahren zur
Verringerung der Heterogenität von monoklonalen Antikörpern beschrieben
(EP0361902, US5126250). Eine Reduzierung der Heterogenität wird hier durch verschiedenen Methoden bewirkt, wie der pH-Wertabsenkung, der enzymatischen
Abspaltung C-terminaler Lysinreste durch Carboxypeptidase oder die Zugabe von Ascitesflüssigkeit. Bei dem enzymatischen Verfahren erfolgt die Reduktion der Ladungsheterogenität über die Abspaltung von C-terminalen Lysinresten der schweren Kette von Immunoglobulin Antikörpern mittels des Enzyms Carboxypeptidase. Dieses Verfahren erreicht allerdings nur eine Umwandlung von 95% der Antikörper in die homogene Antikörperform (LysO). Weitere Verfahren bestehen in der Inkubation der heterogenen Antikörperformen mit Ascitesflüssigkeit in verschiedenen Verhältnissen (2:1 bis 1 :10) oder in der pH-Wert Absenkung des Kulturmediums. Die Effizienz dieser Verfahren zur C-terminalen Lysin Abspaltung beträgt ebenfalls nur ca. 95%. Alle Verfahren sind zudem zeitaufwändig (>24h).
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
ABBILDUNG 1: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER REKOMBINANTEN
VEKTOREN Die hier dargestellten Vektoren werden zur Expression der monoklonalen Antikörper vom IgGI - und lgG4-lsotyp in CHO-DG44 Zellen eingesetzt. Bei „P/E" handelt es sich um eine Kombination aus CMV-Enhancer und Hamster Ub/S27a- Promotor, bei „CMV" um eine Kombination aus CMV-Enhancer und -Promotor, bei „P" lediglich um ein Promotorelement und bei „T" um ein Terminationssignal für die Transkription, das zur Polyadenylierung der transkribierten mRNA benötigt wird. Die Position und Richtung der Transkriptionsinitiation innerhalb jeder Transkriptionseinheit wird durch einen Pfeil angezeigt. Der amplifizierbare Selektionsmarker Dlhydrofolat-Reduktase ist mit „dhfr" abgekürzt. Der Selektionsmarker Neomycin-Phosphotransferase ist mit „npt" gekennzeichnet und die durch Punktmutation F240I erzeugte Neomycin-Phosphotransferase-Mutante mit „npt F240I". „lgG1 HC" kodiert für die schwere Kette des Wildtyp F19- Antikörpers vom IgGI Isotyp und „lgG1 -Lys" für die schwere Kette dieses Antikörpers mit einer C-terminalen Lysin-Deletion. „lgG4 HC" kennzeichnet das Gene für die schwere Kette des lgG4-Wildtyps und „lgG4-Lys" wiederum die schwere Kette des lgG4s mit einer C-terminalen Lysin-Deletion. „LC" kodiert für die leichte Kette des IgGI - bzw. lgG4-Antikörpers. ABBILDUNG 2: EINFLUSS DER C-TERMINALEN LYSIN-DELETION AUF
DIE TRANSIENTE EXPRESSION EINES IGG1 -ANTIKÖRPERS Zur Prüfung, ob das konservierte C-terminale Lysin der schweren Kette einen Einfluss auf die Expression oder Sekretion des IgGI Moleküls hat, wird eine Co- Transfektion von CHO-DG44 Zellen mit den Plasmidkombinationen pBID/F19HC und pBIN/F19LC (IgGI mit C-terminalem Lysin, karierter Balken) bzw. BID/lgG1 - Lys und pBIN/F19LC (IgGI mit C-terminaler Lysin-Deletion, gepunkteter Balken) durchgeführt. Gleichzeitig wird ein SEAP-Expressionsplasmid (= sezernierte alkalische Phosphatase) co-transfiziert, um einen Abgleich der Transfektionseffizienz vorzunehmen. 48 h nach Transfektion werden die Zellkulturüberstände abgenommen und die IgGI -Titer mittels ELISA sowie die SEAP-Aktivität bestimmt. Der IgGI -Titer wird hinsichtlich der Transfektionseffizienz korrigiert. Die Abbildung zeigt den Mittelwert aus jeweils 10 Parallelpools mit vergleichbaren Produktmengen für beide Varianten.
ABBILDUNG 3: EXPRESSION VON IGG1 -WILDTYP UND IGG1 -LYSIN-
DELETIONSMUTANTE IN STABILEN UNAMPLIFIZIERTEN ZELLPOOLS In stabil transfizierten Zellen wird der Einfluss der C-terminalen Lysin-Deletion auf die Expression eines IgGI Antikörpers untersucht. Dazu werden CHO-DG44 Zellen mit den Plasmidkombinationen pBID/F19HC und pBIN/F19LC (IgGI mit C- terminalem Lysin = IgGI -WT) bzw. BID/lgG1 -Lys und pBIN/F19LC (IgGI mit C- terminaler Lysin-Deletion = IgGI -Lys) transfiziert. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools, jeweils 10 pro Plasmidkombination, in Hypoxanthin /Thymidin-freiem Medium mit Zusatz von G418 wird die Konzentration des produzierten IgGI Antikörpers im Zellkulturüberstand durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag berechnet. Die Balken repräsentieren die Mittelwerte der spezifischen Produktivität (gepunktete Balken) bzw. des Titers (gestreifte Balken) aller Pools im Test aus jeweils 3 - 4 Kultivierungspassagen in 75cm2 Zellkulturflaschen.
ABBILDUNG 4: EXPRESSION VON IGG1 -WILDTYP UND IGG1 -LYSIN- DELETIONSMUTANTE IN STABILEN AMPLIFIZIERTEN
ZELLPOOLS
CHO-DG44 Zellen werden mit den Plasmidkombinationen pBID/F19HC und pBIN/F19LC (IgGI mit C-terminalem Lysin = IgGI -Wildtyp) bzw. BID/lgG1 -Lys und pBIN/F19LC (IgGI mit C-terminaler Lysin-Deletion = IgGI -Lysin) transfiziert. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools (jeweils 10 Pools pro Plasmidkombination) in Hypoxanthin /Thymidin-freiem Medium mit Zusatz von G418 wird nachfolgend eine DHFR-vermittelte Genamplifikation durch Zusatz von 100 nM Methotrexat (MTX) zum Kultivierungsmedium durchgeführt. Die Konzentration des produzierten IgGI Antikörpers im Zellkulturüberstand wird durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag berechnet. Die Balken repräsentieren zum einen die Mittelwerte der spezifischen Produktivität (gepunktete Balken) bzw. des Titers (gestreifte Balken) jedes einzelnen Pools im Test aus jeweils 6 Kultivierungspassagen in 75cm2 Zellkulturflaschen. Zum anderen ist auch der Mittelwert (MW) aus allen Pooldaten angegeben.
In Abbildung 4A sind die Daten der mit dem IgGI -Wildtyp transfizierten Zellpools dargestellt, in Abbildung 4B die Daten der mit der lgG1-Lysin-Deletionsvariante transfizierten Zellpools. Letztere produzieren im Durchschnitt 86 % mehr Antikörper bei 120 % höherer spezifischer Produktivität als die mit dem IgGI - Wildtyp transfizierten Zellpools.
ABBILDUNG 5: EINFLUSS DER C-TERMINALEN LYSIN-DELETION AUF
DIE TRANSIENTE EXPRESSION EINES IGG4-ANTI- KÖRPERS Zur Prüfung, ob das konservierte C-terminale Lysin der schweren Kette einen Einfluss auf die Expression oder Sekretion des lgG4 Moleküls hat, wird eine Co- Transfektion von CHO-DG44 Zellen mit den Plasmidkombinationen pBIDa/lgG4 HC und pBIN8a/lgG4 LC (lgG4 mit C-terminalem Lysin, karierter Balken) bzw. BIDa/lgG4-Lys und pBIN8a/lgG4 LC (lgG4 mit C-terminaler Lysin-Deletion, gepunkteter Balken) durchgeführt. Gleichzeitig wird ein SEAP- Expressionsplasmid (= sezernierte alkalische Phosphatase) co-transfiziert, um einen Abgleich der Transfektionseffizienz vorzunehmen. 48 h nach Transfektion werden die Zellkulturüberstände abgenommen und die lgG4-Titer mittels ELISA sowie die SEAP-Aktivität bestimmt. Der lgG4-Titer wird hinsichtlich der Transfektionseffizienz korrigiert. Die Abbildung zeigt den Mittelwert aus jeweils 10 Parallelpools mit sogar etwas höhereren Produkttitern des lgG4-Antikörpers mit C- terminaler Lysin-Deletion.
ABBILDUNG 6: EXPRESSION VON IGG4-WILDTYP UND IGG4-LYSIN-
DELETIONSMUTANTE IN STABILEN AMPLIFIZIERTEN ZELLPOOLS
CHO-DG44 Zellen werden mit den Plasmidkombinationen pBIDa/lgG4 HC und pBIN8a/lgG4 LC (lgG4 mit C-terminalem Lysin = lgG4-Wildtyp) bzw. BIDa/lgG4- Lys und pBIN8a/lgG4 LC (lgG4 mit C-terminaler Lysin-Deletion = lgG4-Lysin) transfiziert. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools (jeweils 10 Pools pro Plasmidkombination) in Hypoxanthin /Thymidin- freiem Medium mit Zusatz von G418 wird nachfolgend eine DHFR-vermittelte Genamplifikation durch Zusatz von 100 nM Methotrexat (MTX) zum Kultivierungsmedium durchgeführt, wobei hier für den lgG4-Wildtyp 4 und für die lgG4-Lysin-Deletionsvariante 6 erfolgreich amplifizierte Zellpools erhalten werden. Die Konzentration des produzierten lgG4 Antikörpers im Zellkulturüberstand wird durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag berechnet. Die Balken repräsentieren zum einen die Mittelwerte der spezifischen Produktivität (gepunktete Balken) bzw. des Titers (gestreifte Balken) jedes einzelnen Pools im Test aus jeweils 6 Kultivierungspassagen in 75cm2 Zellkulturflaschen. Zum anderen ist auch der Mittelwert (MW) aus allen Pooldaten angegeben. In Abbildung 6A sind die Daten der mit dem lgG4-Wildtyp transfizierten Zellpools dargestellt, in Abbildung 6B die Daten der mit der lgG4-Lysin-Deletionsvariante transfizierten Zellpools. Letztere produzieren im Durchschnitt 63 % mehr Antikörper bei 70 % höherer spezifischer Produktivität als die mit dem lgG4- Wildtyp transfizierten Zellpools.
ABBILDUNG 7: EXPRESSION VON IGG4-WILDTYP UND IGG4-LYSIN-
DELETIONSMUTANTE IN ZELLPOOLS NACH ZWEITER GENAMPLIFIKATIONSRUNDE CHO-DG44 Zellen werden mit den Plasmidkombinationen pBIDa/lgG4 HC und pBIN8a/lgG4 LC (lgG4 mit C-terminalem Lysin = lgG4-Wildtyp) bzw. BIDa/lgG4- Lys und pBIN8a/lgG4 LC (lgG4 mit C-terminaler Lysin-Deletion = lgG4-Lysin) transfiziert. Zunächst erfolgt eine zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools (jeweils 10 Pools pro Plasmidkombination) in Hypoxanthin /Thymidin-freiem Medium mit Zusatz von G418. Nachfolgend wird eine stufenweise DHFR-vermittelte Genamplifikation durchgeführt. Im ersten Schritt wird dem Kultivierungsmedium 100 nM Methotrexat (MTX) zugesetzt. Mit diesen aus dieser Genamplifikation hervorgegangen stabilen Zellpools wird eine zweite Genamplifikationsrunde durch Zusatz von 400 nM MTX zum Kultivierungssmedium durchgeführt. Hierbei werden für den lgG4-Wildtyp 4 und für die lgG4-Lysin-Deletionsvariante 6 erfolgreich amplifizierte Zellpools erhalten. Die Konzentration des produzierten lgG4 Antikörpers im Zellkulturüberstand wird durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag berechnet. Die Balken repräsentieren zum einen die Mittelwerte der spezifischen Produktivität (gepunktete Balken) bzw. des Titers (gestreifte Balken) jedes einzelnen Pools im Test aus jeweils 4 Kultivierungspassagen in 75cm2 Zellkulturflaschen. Zum anderen ist auch der Mittelwert (MW) aus allen Pooldaten angegeben. In Abbildung 7A sind die Daten der mit dem lgG4-Wildtyp transfizierten Zellpools dargestellt, in Abbildung 7B die Daten der mit der lgG4-Lysin-Deletionsvariante transfizierten Zellpools. Letztere produzieren im Durchschnitt 53 % mehr Antikörper bei 66 % höherer spezifischer Produktivität als die mit dem lgG4- Wildtyp transfizierten Zellpools.
ABBILDUNG 8: QUANTIFIZIERUNG DER PRODUKTAUSBEUTE MITTELS PROTEIN A HPLC
Die ermittelten Werte für die Produktausbeute von IgGI und lgG4 liegen unabhängig von der Lysindeletion bei über 90%. Der Monomeranteil der Isotypen und der entsprechenden Lysin-Deletionsvarianten liegt im Bereich von 89,23 bis 97,93 %. Sowohl die Ausbeute als auch der Monomerengehalt sind beim IgGI -Lys höher als bei der WT-Variante.
ABBILDUNG 9: ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF) DER ISOTYPEN
IGG1 UND IGG4 Die Antikörper wurden in vitro mit Carboxypeptidase B inkubiert um vorhandenes C-terminales Lysin abzuspalten. Der Isotyp IgGI (+Lysin ) (= IgGI -Wildtyp) weist nach der Inkubation mit Carboxypeptidase B eine geringere Anzahl an Proteinbanden auf (Abspaltung der C-terminalen Lysine bei Lys2 und Lys1 => LysO). Der Isotyp IgGI (-Lysin) (= C-terminale Lysindeletionsvariante) weist ein identisches Bandenmuster unabhängig von der Carboxypeptidase B Inkubation auf. IEF Markerbanden finden sich bei 8.8 kDa und 8.6 kDa.
ABBILDUNG 10: NACHWEIS DES C-TERMINALEN LYSINS MITTELS LC-MS Für den Isotyp lgG4 (+Lysin) (= lgG4-Wildtyp) liegt der Anteil an schwerer Kette (HC) mit C-terminalem Lysin bei 20% (hellgrauer Balken HC mit Lysin), bei der Variante lgG4 (-Lysin) (=C-terminale Lysindeletionsvariante) bei 0%. Die dunkelgrauen Balken repräsentieren die Anteile an schweren Ketten (HC) ohne Lysin. ABBILDUNG 11 : AUFTRENNUNG DER ANTIKÖRPER MITTELS WCX Auftrennung des IgGI -WT (A) und IgGI -Lysin (B) mittles weak cationic exchange (WCX). Die enzymatische Lysinabspaltung mittels Carboxypeptidase B zeigt bei dem WT IgGI eine Reduktion der basischen Peaks 1 und 2. Der Overlay (C) von IgGI WT ohne CpB (obere Linie) und IgGI WT +CpB (untere Linie) zeigt die Reduktion der basischen Peakflächen um insgesamt 9,8%. Der Overlay (D) von IgGI -Lys ohne CpB (obere Linie) und IgGI -Lys +CpB (untere Linie) zeigt keine Reduktion der basischen Peakfläche (-unter 1 %).
ABBILDUNG 12: QUANTIFIZIERUNG DES C-TE RM I NAL E N LYSINS MITTELS
LC-MS
Quantifizierung des C-terminalen Lysinanteils an der schweren Antikörperkette von lgG4 mittels LC-MS (lgG4 WT: gepunktete (obere) Linie und lgG4-Lys: durchgezogenen (untere) Linie). Nach Reduktion und chromatographischer Trennung wurde der quantitative Anteil der schweren Kette mit C-terminalen Lysin (HC 1 - 447 mit Lysin) bzw. ohne Lysin (HC 1 - 446 ohne Lysin) bestimmt. Die Pfeile kennzeichnen den durch die Lysinabspaltung verursachten Massenshift in Abhängigkeit vom Glykosylierungszustand. Markierte Peaks kennzeichnen Glykosylierungen der schweren Kette (schwarz: HC mit C-terminalen Lysin, grau hinterlegt: HC ohne C-terminales Lysin).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITIONEN
Im Rahmen dieser Erfindungsbeschreibung verwendete Begriffe und Bezeichnungen haben folgende im Anschluss definierte Bedeutungen. Die allgemeinen Ausführungsformen „enthaltend" oder „enthält" schließt die speziellere Ausführungsform „bestehend aus" mit ein. Ferner werden „Einzahl" und „Mehrzahl" nicht begrenzend verwendet.
Der Begriff „Titer" ist eine Angabe der Produktkonzentration in einem definiertem Volumen, z.B. ng/mL, mg/mL, mg/L, g/L. Mit dem Begriff „spezifische Produktivität" ist die von der Zelle produzierte Menge an Protein in pg pro Zelle und Tag gemeint. Sie wird mit der Formel pg/((Ct-Co) t / In (Ct-Co)) berechnet, wobei Co und Ct die Zellzahl bei Aussaat bzw. Ernte und t die Kultivierungsdauer angibt. Den Begriff „Ausbeute" beschreibt die prozentuale Widerfindung der jeweiligen Produktvarianten nach Auftrennung mittels Chromatographie an einer Matrix, z.B. einer Protein A Matrix.
Produktkonzentration von Proteinen, die von einer ausgewählten Nukleotidsequenz kodiert werden, können mit einem ELISA bestimmt werden aber auch durch andere Methoden, wie z.B. durch Protein A HPLC, Western Blot, Radioimmunassay, Immunpräzipitation, Nachweis der biologischen Aktivität des Proteins, Immunfärbung des Proteins mit nachfolgender FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie, direkte Detektion eines fluoreszierenden Proteins mittel FACS-Analyse oder durch Spektrophotometrie.
Gen von Interesse:
Das im erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthaltene „Gen von Interesse" umfasst eine Nukleotidsequenz beliebiger Länge, die für ein Produkt von Interesse kodiert. Das Genprodukt oder auch „Produkt von Interesse" ist in der Regel ein Protein, Polypeptid, Peptid bzw. Fragment oder Derivat davon. Es kann aber auch RNA oder antisense RNA sein. Das Gen von Interesse kann in voller Länge, in verkürzter Form, als Fusionsgen oder markiertes Gen vorliegen. Es kann sich um genomische DNA oder vorzugsweise cDNA bzw. entsprechende Fragmente oder Fusionen handeln. Das Gen von Interesse kann die native Gensequenz darstellen, mutiert oder auf sonstige Weise modifiziert sein. Derartige Modifikationen schließen Kodon-Optimierungen zur Anpassung an eine bestimmte Wirtszelle und eine Humanisierung ein. Das Gen von Interesse kann z.B. für ein sekretiertes, zytoplasmatisches, kernlokalisiertes, membrangebundenes oder zelloberflächengebundenes Polypeptid kodieren. Der Ausdruck „Nukleinsäure", „Nukleotidsequenz" oder „Nukleinsäuresequenz" bezeichnet ein Oligonukleotid, Nukleotide, Polynukleotide und deren Fragmente sowie DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die als Einzeloder Doppelstrang vorliegen und den kodierenden oder den nicht-kodierenden Strang eines Gens repräsentieren kann. Zur Modifikation von Nukleinsäuresequenzen können Standardtechniken, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder PCR-vermittelte Mutagenese, eingesetzt werden.
Unter „kodieren" versteht man die Eigenschaft oder Fähigkeit einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure, beispielsweise einem Gen in einem Chromosom oder einer mRNA, als Matrize für die Synthese von anderen Polymeren und Makromolekülen wie z.B. rRNA, tRNA, mRNA, anderen RNA- Molekülen, cDNA oder Polypeptiden in einem biologischen Prozess zu dienen. Demnach kodiert ein Gen für ein Protein, wenn durch Transkription und nachfolgende Translation der mRNA das gewünschte Protein in einer Zelle oder einem anderen biologischen System produziert wird. Sowohl der kodierende Strang, dessen Nukleotidsequenz identisch mit der mRNA-Sequenz ist und normalerweise auch in Sequenzdatenbanken, z.B. EMBL oder GenBank, angegeben wird, als auch der als Matrize für die Transkription dienende nicht- kodierende Strang eines Gens oder cDNA kann dabei als kodierend für ein Produkt oder Protein bezeichnet werden. Eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, schließt auch Nukleinsäuren mit ein, die auf Grund des degenerierten genetischen Codes eine andere Nukleotidsequenzabfolge aufweisen, aber in der gleichen Aminosäuresequenz des Proteins resultieren. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, können auch Introns enthalten.
Mit dem Ausdruck „cDNA" werden Desoxyribonukleinsäuren bezeichnet, die durch reverse Transkription und Synthese des zweiten DNA-Strangs aus einer von einem Gen produzierten mRNA oder anderen RNA hergestellt werden. Liegt die cDNA als doppelstränges DNA-Molekül vor, dann enthält sie sowohl einen kodierenden als auch einen nicht-kodierenden Strang. Protein/Produkt von Interesse:
Biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide umfassen z.B. Antikörper bzw. Immunoglobuline, Enzyme, Cytokine, Lymphokine, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt. Im Allgemeinen sind alle Polypeptide bedeutsam, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können. Andere Proteine von Interesse sind beispielsweise Proteine/Polypeptide, die zur Veränderung der Eigenschaften von Wirtszellen im Rahmen des sogenannten „Cell Engineering" verwendet werden, wie z.B. anti- apoptotische Proteine, Chaperone, Stoffwechselenzyme, Glykosylierungsenzyme sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck „Polypeptide" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser
Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttranslational durch Reaktionen wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder
Proteinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertion von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden. Zudem können die Polypeptide multimerisieren und Homo- und
Heteromere bilden.
„Immunoglobuline", oder auch „Antikörper" sind Proteine (Eiweiße) aus der Klasse der Globuline, die als Reaktion des Wirtsorganismus auf einen Fremdstoff (= Antigen) von ausdifferenzierten B-Lymphozyten (Plasmazellen) gebildet werden. Sie dienen der spezifischen Abwehr dieser Fremdstoffe. Es gibt verschiedene Klassen von Immunoglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG1IgM, IgYJgW. Die Begriffe Immunoglobulin und Antikörper werden gleichbedeutend verwendet. Beispiele für therapeutische Antikörper sind monoklonale, polyklonale, multispezifische und einzelkettige (Single chain) Antikörper bzw. Immunoglobuline und Fragmente davon, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Fc und Fc'-Fragmente, leichte (L) und schwere (H) Immunglobulinketten und deren konstante, variable oder hypervariable Regionen sowie Fv- und Fd-Fragmente. Die Antikörper können humanen oder nicht-humanen Ursprungs sein. Auch humanisierte und Chimäre Antikörper kommen in Frage.
Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer
Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonierung. Weitere Antikörperfragmente sind
F(ab')2-Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.
Durch Genklonierung können auch verkürzte Antikörperfragmente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment variable = Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv-Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv-Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv-Antikörpern sind bekannt und beschrieben.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multimere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Multimerisierung der scFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die CH3-Region eines IgGs oder Helixstrukturen („coiled coil structure") wie die Leucin-Zipper- Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL-Regionen des scFv-Fragments für eine Multimerisierung genutzt (z.B. Dia-, Tri- und Pentabodies). Als „Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv- Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10 Aminosäuren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VHA/L-Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur. Als „Minibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv- Derivat. Es besteht aus einem Fusionsprotein, das die CH3-Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt IgGI , als Dimehsierungsregion enthält. Diese verbindet die scFv-Fragmente über eine Hinge-Region, ebenfalls von IgG, und eine Linker-Region. Mit „Thabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homotrimeres scFv- Derivat. Die direkte Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren.
Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi-, tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv-Fragmenten. Die Multimerisierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere „coiled coil"-Strukturen erzielt.
Herstellung erfindungsgemäßer Expressionsvektoren:
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors kann grundsätzlich nach herkömmlichen, dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen. Dort findet sich auch eine Beschreibung der funktionellen Komponenten eines Vektors, z.B. geeigneter Promotoren, Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale, Antibiotikaresistenzgene, Selektionsmarker, Replikationsstartpunkte und Spleisssignale. Zur Herstellung können herkömmliche Klonierungsvektoren verwendet werden, z.B. Plasmide, Bacteriophagen, Phagemide, Cosmide oder virale Vektoren wie Baculovirus, Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren und Herpes Simplex-Virus, aber auch künstliche oder artifizielle oder Mini- Chromosomen. Die eukaryontischen Expressionsvektoren enthalten typischerweise auch prokaryontische Sequenzen wie z.B. Replikationsursprung und Antibiotikaresistenzgene, die die Vermehrung und Selektion des Vektors in Bakterien ermöglichen. Eine Vielzahl von eukaryontischen Expressionsvektoren, die multiple Klonierungsstellen zur Einführung einer Polynukleotidsequenz enthalten, sind bekannt und einige sind kommerziell bei verschiedenen Firmen wie Stratagene, La JoIIa, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, Wl, USA oder BD Biosciences Clontech, PaIo Alto, CA, USA erhältlich.
Grundsätzlich kann die Expression der Gene innerhalb eines Expressionsvektors von einer oder mehreren Transkriptionseinheiten aus erfolgen. Als „Transkriptionseinheit" wird dabei eine Region definiert, die ein oder mehr zu transkribierende Gene enthält. Dabei sind die Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit funktionell derart miteinander verknüpft, dass alle Gene innerhalb einer solchen Einheit unter der transkriptionellen Kontrolle desselben Promotors oder Promotors/Enhancers stehen. Als Resultat dieser transkriptionellen Verknüpfung von Genen kann mehr als ein Protein oder Produkt von einer Transkriptionseinheit aus transkribiert und somit exprimiert werden. Jede Transkriptionseinheit enthält dabei die regulatorischen Elemente, die für die Transkription und die Translation der in ihr enthaltenen Gensequenzen erforderlich sind. Jede Transkriptionseinheit kann dabei die gleichen oder verschiedene regulatorische Elemente enthalten. Für die funktionelle Verknüpfung der Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit können IRES-Elemente oder Introns verwendet werden. Der Expressionsvektor kann eine einzige Transkriptionseinheit zur Expression des Gens oder der Gene von Interesse und beispielsweise Selektionsmarkergene enthalten. Alternativ können diese Gene auch in zwei oder mehr Transkriptionseinheiten angeordnet sein. Dabei sind verschiedene Kombinationen der Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit möglich. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann mehr als ein Expressionsvektor, bestehend aus ein, zwei oder mehr Transkriptionseinheiten, in eine Wirtszelle durch Co-Transfektion oder in aufeinanderfolgenden Transfektionen in beliebiger Reihenfolge eingeführt werden. Jede Kombination von regulatorischen Elementen und Genen auf jedem Vektor kann gewählt werden, so lange eine ausreichende Expression der Transkriptionseinheiten gewährleistet ist. Falls erforderlich können weitere regulatorische Elemente und Gene, wie z.B. zusätzliche Gene von Interesse oder Selektionsmarker, auf den Expressionsvektoren positioniert werden.
Wirtszellen:
Zur Transfektion mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor werden eukaryontische Wirtzellen verwendet, vorzugsweise Säugerzellen und insbesondere Nagerzellen wie z.B. Mäuse-, Ratten- und Hamster-Zelllinien. Die erfolgreiche Transfektion der entsprechenden Zellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor resultiert in transformierten, genetisch modifizierten, rekombinanten oder transgenen Zellen, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Wirtszellen sind Hamsterzellen wie z.B. BHK21 , BHK TK", CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 und CHO-DG44 Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Besonders bevorzugt sind CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NSO und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- , Vogel- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.
Die Transfektion der eukaryontischen Wirtszellen mit einem Polynukleotid oder einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektor, erfolgt nach üblichen Methoden. Geeignete Transfektionsmethoden sind z.B. die Liposomen-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Copräzipitation, Elektroporation, Polykationen (z.B. DEAE-Dextran)-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und virale Infektionen. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine stabile Transfektion durchgeführt, wobei die Konstrukte entweder in das Genom der Wirtszelle oder ein artifizielles Chromosom/Minichromosom integriert werden oder in stabiler Weise episomal in der Wirtszelle enthalten sind. Die Transfektionsmethode, die die optimale Transfektionsfrequenz und Expression des heterologen Gens in der jeweiligen Wirtszelle ermöglicht, ist dabei bevorzugt. Per Definition wird jede Sequenz oder jedes Gen, das in eine Wirtszelle eingebracht wird, in Bezug auf die Wirtszelle als „heterologe Sequenz" oder „heterologes Gen" bezeichnet. Selbst dann, wenn die einzubringende Sequenz oder das einzubringende Gen identisch zu einer endogenen Sequenz oder einem endogenen Gen der Wirtszelle ist. Beispielsweise ist ein Hamster Aktingen, das in eine Hamster-Wirtszelle eingebracht wird, per Definition ein heterologes Gen.
Bei der rekombinanten Herstellung heteromerer Proteine, wie z.B. monoklonaler Antikörper (mAk), kann die Transfektion geeigneter Wirtszellen prinzipiell auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Derartige mAk sind aus mehreren Untereinheiten, den schweren und leichten Ketten, aufgebaut. Für diese Untereinheiten kodierende Gene können in unabhängigen oder in multicistronischen Transkriptionseinheiten auf einem einzigen Plasmid untergebracht werden, mit dem dann die Wirtszelle transfiziert wird. Dies soll die stöchiomethsche Repräsentanz der Gene nach Integration in das Genom der Wirtszelle sichern. Allerdings muss hierbei im Falle unabhängiger Transkriptionseinheiten sichergestellt werden, dass die mRNAs, die für die verschiedenen Proteine kodieren, die gleiche Stabilität, Transkriptions- und Translationseffizienz aufweisen. Im zweiten Fall erfolgt die Expression der Gene innerhalb einer multicistronischen Transkriptionseinheit durch einen einzigen Promotor und es entsteht nur ein Transkript.
Durch Verwendung von IRES-Elementen wird eine recht effiziente interne Translationsinitiation der Gene in dem zweiten und den nachfolgenden Cistrons ermöglicht. Dennoch sind die Expressionsraten für diese Cistrons geringer als die des ersten Cistrons, dessen Translationsinitiation über einen sogenannten „cap"- abhängigen Prä-Initiationskomplex wesentlich effizienter ist als die IRES- abhängige Translationsinitiation. Um eine tatsächlich äquimolare Expression der Cistrons zu erreichen, können beispielsweise noch zusätzliche intercistronische Elemente eingeführt werden, die im Zusammenwirken mit den IRES-Elementen für einheitliche Expressionsraten sorgen.
Eine andere und erfindungsgemäß bevorzugte Möglichkeit der simultanen Herstellung mehrerer heterologer Proteine ist die Co-Transfektion, bei der die Gene getrennt in verschiedene Expressionsvektoren integriert werden. Dies hat den Vorteil, dass bestimmte Verhältnisse der Gene und Genprodukte zueinander eingestellt werden können, wodurch Unterschiede in der mRNA-Stabilität sowie in der Transkriptions- und Translationseffizienz ausgeglichen werden können. Außerdem sind die Expressionsvektoren wegen ihrer geringeren Größe stabiler und sowohl bei der Klonierung als auch bei der Transfektion einfacher handhabbar.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden daher die Wirtszellen zusätzlich mit einem oder mehreren Vektoren mit Genen, die für ein oder mehrere andere Proteine von Interesse kodieren, transfiziert, bevorzugt co-transfiziert. Der oder die zur Co-Transfektion verwendeten weiteren Vektoren kodieren z.B. für das oder die anderen Proteine von Interesse unter der Kontrolle des gleichen Promotors, bevorzugt unter der Kontrolle der gleichen Promotor/Enhancer- Kombination sowie für zumindest einen Selektionsmarker, z.B. die Dihydrofolat- Reduktase.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die Wirtszellen mit zumindest zwei eukaryontischen Expressionsvektoren co- transfiziert, wobei zumindest der eine der beiden Vektoren zumindest ein Gen, das zumindest Protein von Interesse kodiert, enthält und der andere Vektor ein oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren in beliebiger Kombination, Position und Orientierung enthält, und optional auch für zumindest ein Gen (von Interesse kodiert, und diese erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ihre transkriptions- bzw. expressionssteigernde Wirkung auf die Gene von Interesse, die auf dem anderen co-transfizierten Vektor lokalisiert sind, via Co- Integration mit dem anderen Vektor vermitteln.
Erfindungsgemäß werden die Wirtszellen vorzugsweise unter serumfreien Bedingungen etabliert, adaptiert und kultiviert, gegebenenfalls in Medien, die frei von tierischen Proteinen /Peptiden sind. Beispiele für im Handel erhältliche Medien sind Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serumfreies CHO- Medium (Sigma) und proteinfreies CHO-Medium (Sigma). Jedes dieser Medien kann gegebenenfalls mit verschiedenen Verbindungen ergänzt werden, z.B. Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z.B. Insulin, Transferrin, epidermalem Wachstumsfaktor, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor), Salzen (z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium, Phosphat), Puffern (z.B. HEPES), Nukleosiden (z.B. Adenosin, Thymidin), Glutamin, Glukose oder anderen äquivalenten Nährstoffen, Antibiotika und/oder Spurenelementen. Obwohl erfindungsgemäß serumfreie Medien bevorzugt sind, können zur Züchtung der Wirtszellen auch Medien verwendet werden, die mit einer geeigneten Menge an Serum versetzt wurden. Zur Selektion von genetisch modifizierten Zellen, die ein oder mehrere Selektionsmarkergene exprimieren, wird dem Medium ein oder mehrere geeignete Selektionsmittel zugefügt.
Als „Selektionsmittel" wird eine Substanz bezeichnet, die das Wachstum oder das Überleben von Wirtszellen mit einer Defizienz für das jeweilige Selektionsmarkergen beeinträchtigt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise Geneticin (G418) als Mediumzusatz zur Selektion heterologer Wirtszellen, die ein Wildtyp- oder vorzugsweise ein modifiziertes Neomycin- Phosphotransferase-Gen tragen, verwendet. Sollten die Wirtzellen mit mehreren Expressionsvektoren transfiziert werden, z.B. wenn separat mehrere Gene von Interesse in die Wirtszelle eingebracht werden sollen, so verfügen diese meist über verschiedene Selektionsmarkergene.
Ein „Selektionsmarkergen" ist ein Gen, das die spezifische Selektion von Zellen, die dieses Gen erhalten, durch Zugabe eines entsprechenden Selektionsmittels in das Kultivierungsmedium ermöglicht. Zur Verdeutlichung, ein Antibiotika- Resistenzgen kann als positiver Selektionsmarker verwendet werden. Nur Zellen, die mit diesem Gen transformiert wurden, können in der Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums wachsen und somit selektioniert werden. Nichttransfomierte Zellen hingegen können unter diesen Selektionsbedingungen nicht wachsen oder überleben. Es gibt positive, negative und bifunktionale Selektionsmarker. Positive Selektionsmarker ermöglichen die Selektion und damit Anreicherung von transformierten Zellen durch Vermittlung einer Resistenz gegenüber dem Selektionsmittel oder durch Kompensierung eines metabolischen oder katabolischen Defekts der Wirtszelle. Im Gegensatz dazu können durch negative Selektionsmarker Zellen, die das Gen für den Selektionsmarker erhalten haben, selektiv eliminiert werden. Ein Beispiel hierfür ist das Thymidinkinasegen des Herpes Simplex Virus, dessen Expression in Zellen bei gleichzeitiger Gabe von Acyclovir oder Gancyclovir zu deren Elimination führt. Die in dieser Erfindung verwendeten Selektionsmarker, einschließlich der amplifzierbaren Selektionsmarker, schließt gentechnologisch veränderte Mutanten und Varianten, Fragmente, funktionelle Äquivalente, Derivate, Homologe und Fusionen mit anderen Proteinen oder Peptiden ein, solange der Selektionsmarker seine selektiven Eigenschaften beibehält. Solche Derivate weisen eine beträchtliche Homologie in der Aminosäuresequenz in den Bereichen oder Domänen auf, denen die selektive Eigenschaft zugeschrieben wird. In der Literatur sind eine Vielzahl von Selektionsmarkergenen, einschließlich bifunktionaler (positiv/negativ) Marker, beschrieben. Beispiele für Selektionsmarker, die für gewöhnlich in eukaryontischen Zellen verwendet werden, beinhalten die Gene für Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH), Hygromycin-Phosphotransferase (HYG), Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Thymidinkinase (TK), Glutamin- Synthetase, Asparagin-Synthetase und Gene, die Resistenz gegenüber Neomycin (G418), Puromycin, Histidinol D, Bleomycin, Phleomycin und Zeocin vermitteln.
Amplifizierbares Selektionsmarkergen:
Ferner können die erfindungsgemäßen Zellen optional auch einem oder mehreren Genamplifikationsschritten unterzogen werden, in dem sie in Gegenwart eines Selektionsmittels kultiviert werden, das zu einer Amplifikation eines amplifzierbaren Selektionsmarkergens führt. Voraussetzung ist, dass die Wirtszellen zusätzlich mit einem Gen transfiziert werden, das für einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert. Denkbar ist, dass das Gen, welches für einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert, auf einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren vorhanden ist oder aber mit Hilfe eines weiteren Vektors in die Wirtszelle eingebracht wird.
Das amplifizierbare Selektionsmarkergen kodiert gewöhnlich für ein Enzym, das für das Wachstum von eukaryontischen Zellen unter bestimmten Kultivierungsbedingungen erforderlich ist. Beispielsweise kann das amplifizierbare Selektionsmarkergen für Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) kodieren. In diesem Fall wird das Gen amplifiziert, wenn man eine damit transfizierte Wirtszelle in Gegenwart des Selektionsmittels Methotrexat (MTX) kultiviert. Der DHFR-Marker ist bei der Verwendung von DHFR-negativen Grundzellen wie CHO-DG44 oder CHO-DUKX besonders gut zur Selektion und nachfolgenden Amplifikation geeignet, da diese Zellen kein endogenes DHFR exprimieren und somit nicht in Purin-freiem Medium wachsen. Deshalb kann hier das DHFR-Gen als dominanter Selektionsmarker eingesetzt werden und die transformierten Zellen werden in Hypoxanthin/Thymidin-freiem Medium selektioniert.
Weitere erfindungsgemäß verwendbare amplifizierbare Selektionsmarkergene sind beispielsweise Glutamin-Synthetase , Methallothionein, Adenosin- Deaminase, AMP-Deaminase, UMP-Synthase, Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase und Thymdilat-Synthetase.
Genexpression und Selektion hoch produzierender Wirtszellen:
Der Ausdruck „Genexpression" oder „Expression" bezieht sich auf die
Transkription und/oder Translation einer heterologen Gensequenz in einer Wirtszelle. Die Expressionsrate kann hierbei allgemein bestimmt werden, entweder auf Basis der Menge der entsprechenden mRNA, die in der Wirtszelle vorhanden ist, oder auf Basis der produzierten Menge an Genprodukt, das von dem Gen von Interesse kodiert wird. Die Menge der durch Transkription einer ausgewählten Nukleotidsequenz erzeugten mRNA kann beispielsweise durch Northern Blot Hybridisierung, Ribonuklease-RNA-Protektion, in situ Hybridisierung von zellulärer RNA oder durch PCR-Methoden (z.B. quantitativer PCR) bestimmt werden. Proteine, die von einer ausgewählten Nukleotidsequenz kodiert werden, können ebenfalls durch verschiedene Methoden, wie z.B. durch ELISA, Protein A HPLC, Western Blot, Radioimmunassay, Immunpräzipitation, Nachweis der biologischen Aktivität des Proteins, Immunfärbung des Proteins mit nachfolgender FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie, direkte Detektion eines fluoreszierenden Proteins mittel FACS-Analyse oder durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden.
Mit „Titer- oder Produktivitätssteigerung" wird die Steigerung der Expression, Synthese oder Sekretion einer in eine Wirtszelle eingebrachten heterologen Sequenz, beispielsweise eines für ein therapeutisches Protein kodierenden Gens, im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, beispielsweise Mutanten-Protein versus Wildtyp-Protein, bezeichnet. Eine Titer- oder Produktivitätssteigerung liegt vor, wenn eine erfindungsgemäße Zelle nach einem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird, und wenn diese Zelle mindestens eine Steigerung der spezifischen Produktivität oder des Titers um 10 % aufweist. Eine Titer- oder Produktivitätssteigerung liegt auch dann vor, wenn eine erfindungsgemäße Zelle nach einem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird, und wenn diese Zelle mindestens eine Steigerung der spezifischen Produktivität oder des Titers um 20 % bzw. mindestens 50% bzw. mindestens 75% aufweist. Eine Titer- oder Produktivitätssteigerung liegt insbesondere auch dann vor, wenn eine erfindungsgemäße Zelle nach einem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird, und wenn diese Zelle mindestens eine Steigerung der spezifischen Produktivität oder des Titers um 10- 500 % aufweist, bevorzugt 20-300%, besonders bevorzugt 50-200%.
Eine Titer- oder Produktivitätssteigerung kann sowohl durch Verwendung einer der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren als auch durch Anwendung eines der erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden.
Die entsprechenden Verfahren können mit einer durch FACS gestützten Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die als weiteren Selektionsmarker beispielsweise ein (oder mehrere) Fluoreszenzprotein(e) (z.B. GFP) oder einen Zelloberflächenmarker enthalten, kombiniert werden. Andere Methoden zur Erzielung einer verstärkten Expression, wobei auch eine Kombination verschiedener Methoden möglich ist, beruhen beispielsweise auf der Verwendung von c/s-aktiven Elementen zur Manipulation der Chromatinstruktur (z.B. LCR, UCOE, EASE, Isolatoren, S/MARs, STAR-Elemente), Verwendung von (artifiziellen) Transkriptionsfaktoren, Behandlung der Zellen mit natürlichen oder synthetischen Agenzien zur Hochregulation endogener oder heterologer Genexpression, Verbesserung der Stabilität (Halbwertszeit) der mRNA oder des Proteins, Verbesserung der mRNA-Translationsinitiation, Erhöhung der Gendosis durch Verwendung von episomalen Plasmiden (basierend auf der Verwendung von viralen Sequenzen als Replikationsursprung, z.B. von SV40, Polyoma, Adenovirus, EBV oder BPV), Einsatz von amplifikationsfördernden Sequenzen oder auf DNA-Kon katemeren basierenden in vitro Amplifikationssystemen.
Weiterhin erfindungsgemäß ist ein Verfahren, bei dem Produktionszellen vermehrt und zur Herstellung des kodierenden Genprodukt von Interesse verwendet werden. Hierzu werden die selektionierten hoch produzierenden Zellen vorzugsweise in einem serumfreien Kulturmedium und vorzugsweise in Suspensionskultur unter Bedingungen gezüchtet, die eine Expression des Gens von Interesse erlauben. Das Protein/Produkt von Interesse wird dabei vorzugsweise als sekretiertes Genprodukt aus dem Zellkulturmedium gewonnen. Bei Expression des Proteins ohne Sekretionssignal kann das Genprodukt aber auch aus Zelllysaten isoliert werden. Um ein reines, homogenes Produkt zu erhalten, das im Wesentlichen frei ist von anderen rekombinanten Proteinen und Wirtszellproteinen, werden übliche Reinigungsschritte durchgeführt. Hierzu entfernt man häufig zunächst Zellen und Zelltrümmer aus dem Kulturmedium oder Lysat. Das gewünschte Genprodukt kann dann von kontaminierenden löslichen Proteinen, Polypeptiden und Nukleinsäuren befreit werden, z.B. durch Fraktionierung an Immunaffinitäts- und lonenaustauschsäulen, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC oder Chromatographie an Sephadex, Silica oder Kationenaustauscherharzen wie DEAE. Methoden, die zur Reinigung eines von rekombinanten Wirtszellen exprimierten heterologen Proteins führen, sind dem Fachmann bekannt und sind in der Literatur beschrieben.
ERFINDUNGSGEMÄSSE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung des Titers eines
Proteins von Interesse einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass a. in einer Nukleinsäuresequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale
Aminosäure kodiert, b. die Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, welcher die veränderte Nukleinsäure aus a) enthält und c. die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Produktion des Proteins von Interesse erlaubt.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des Titers eines Antikörpers einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass in einer Nukleinsäuresequenz, die für die schwere Kette des Antikörpers kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale Aminosäure Lysin kodiert, die Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, welcher die veränderte Nukleinsäure enthält, und die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Produktion des Antikörpers von Interesse erlaubt.
Die vorliegende Erfindung betrifft bevorzugt ein Verfahren zur Steigerung der spezifischen Produktivität eines Proteins von Interesse einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass in einer Nukleinsäuresequenz, die für das Protein von
Interesse kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale
Aminosäure kodiert, die Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, welcher die veränderte Nukleinsäure enthält, und die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Produktion des Proteins von Interesse erlaubt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der spezifischen Produktivität eines Antikörpers einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass in einer Nukleinsäuresequenz, die für die schwere Kette des Antikörpers kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale Aminosäure Lysin kodiert, die Zelle mit einem ersten Vektor transfiziert wird, welcher die veränderte Nukleinsäure enthält, die Zelle mit einem zweiten Vektor co-transfiziert wird, welcher die leichte Kette eines Antikörpers enthält, und die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Produktion des Antikörpers erlaubt. In einem weiteren bevorzugten Verfahren werden die modifizierte schwere Kette und die leichte Kette, bzw. die Untereinheiten eines heteromeren Proteins, in aufeinander folgenden Transfektionen in beliebiger Reihenfolge eingeführt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der spezifischen Produktivität eines Antikörpers oder eines beliebigen heteromeren Proteins von Interesse einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass in einer Nukleinsäuresequenz, die für die schwere Kette des Antikörpers kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale Aminosäure Lysin kodiert, die Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, welcher sowohl die veränderte Nukleinsäure für die schwere Kette eines Antikörpers enthält als auch die leichten Kette eines Antikörpers, und die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Produktion des Antikörpers erlaubt. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der Vektor, mit welchem die Zelle transfiziert wird, ein bi- oder multicistronischer Vektor. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der Vektor, mit welchem die Zelle transfiziert wird, ein Vektor, welcher die schwere und leichte Antikörperkette als separate Transkriptionseinheiten enthält,
Es kann überraschender Weise gezeigt werden, dass z.B. ein IgGI -Molekül trotz der Deletion des C-terminalen Lysins in CHO-Zellen exprimiert und sezerniert wird und die Produktmengen vergleichbar mit der von IgGI Wildtyp transfizierten Zellen ist (Abb. 2). Weiterhin zeigt sich überraschender Weise, dass Zellen, die die Lysin-Deletionsvariante des IgGI exprimieren, durchschnittlich sogar 27% höhere Titer bzw. 32% höhere spezifische Produktivitäten erzielen als Zellen, die den IgGI -Wildtyp exprimieren (Abb. 3). Dieser Produktionsvorteil der Lysin- Deletionsvariante ist auch dann noch gegeben, wenn in diesen Zellpools durch Zugabe von 100 nM MTX eine DHFR-basierte Genamplifikation induziert wird. Die Titer und spezifischen Produktivitäten sind durchschnittlich um 86% bzw. 120% höher (Abb. 4). Ähnliches kann überraschender Weise auch für ein lgG4-Molekül gezeigt werden. Das lgG4-Molekül wird trotz der Deletion des C-terminalen Lysins in CHO-Zellen sogar etwas besser exprimiert und sezerniert als der lgG4 Wildtyp (Abb. 5). Überraschender Weise zeigt sich, dass Zellen, die die Lysin-Deletionsvariante des lgG4s exprimieren, durchschnittlich sogar 63 % höhere Titer bzw. 70 % höhere spezifische Produktivitäten erzielen als Zellen, die den lgG4-Wildtyp exprimieren (Abb. 6). Dieser Produktionsvorteil der Lysin-Deletionsvariante ist auch bei dem nachfolgenden Amplifikationsschritt mit 400 nM MTX gegeben. Hier werden im Durchschnitt 53% höhere Titer und 66% höhere spezifischen Produktivitäten erzielt (Abb. 7).
In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Titer und /oder die spezifische Produktivität um 10-500 %, bevorzugt 20-300%, besonders bevorzugt 50-200% gesteigert in Bezug auf den Vergleichswert des Proteins ohne die Deletion der C-terminalen Aminosäure. In einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Titer und /oder die spezifische Produktivität um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 20 %, weiterhin bevorzugt um mindestens 50 %, und besonders bevorzugt um mindestens 75 % gesteigert in Bezug auf den Vergleichswert des Proteins ohne die Deletion der C-terminalen Aminosäure. In einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die spezifische Produktivität mindestens 5 pg/Zelle/Tag.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung eines Expressionsvektors zur gesteigerten Produktion eines Proteins von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass in der Nukleinsäuresequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C- terminale Aminosäure kodiert, und die so modifizierte Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor eingeführt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung einer Zelle mit gesteigertem Titer und / oder gesteigerter spezifischer Produktivität eines
Proteins von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird und anschließend eine Einzelzellklonierung vorgenommen wird, z.B. über Verdünnungsklonierung oder FACS basierte Einzellzellablage.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass eine Gruppe von Zellen gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird, diese Zellen in Anwesenheit zumindestens eines Selektionsdrucks selektioniert werden, optional eine Einzelzellklonierung vorgenommen wird und das Protein von Interesse aus den Zellen oder dem Kulturüberstand gewonnen wird.
Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung mindestens eines Proteins von Interesse ist dadurch gekennzeichnet, dass die zur Herstellung verwendeten Zellen nach dem Selektionsschritt mittels Selektionsmittel zusätzlich einem Genamplifikationsschritt unterzogen werden.
Eine spezifische Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys) oder Arginin (Arg) ist, bevorzugt Lys.
Eine weitere spezifische Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse ein Antikörper, ein Fc-Fusionsprotein, EPO oder tPA ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse eine schwere Kette eines Antikörpers ist und die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys).
Eine spezielle Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette des Antikörpers vom Typ IgGI , lgG2, lgG3 oder lgG4 ist, bevorzugt vom Typ IgGI , lgG4 oder lgG2. Eine spezifische Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse ein monoklonaler, polyklonaler, Säugetier-, Maus-, chimärer, humanisierter, Primaten- oder ein humaner Antikörper ist oder ein Antikörperfragment oder -derivat einer schweren Kette eines Immunoglobulin Antikörpers ist oder eines Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc Fusionsproteins, Fv, Single chain Fv, Single domain Fv, tetravalenten Single chain Fv, Disulfid-verknüpften Fv, Domänen-deletierten Antikörpers, eines Minibodys, Diabodys, oder eines Fusionspolypeptides eines der genannten Fragmente mit einem anderen Peptid oder Polypeptid ist oder ein Fc-Peptid Fusionsprotein, ein Fc-Toxin Fusionsprotein oder ein Scaffold-Protein ist.
Eine weitere spezifische Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in Suspensionskultur kultiviert wird. Eine spezielle Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle serumfrei kultiviert wird. Eine weitere spezielle Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in chemisch definiertem Medium kultiviert wird. Eine bevorzugte Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in proteinfreiem Medium kultiviert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine eukaryotische Zelle ist, z.B. aus Hefe, Pflanzen, Würmern, Insekten, Vögeln, Fischen, Reptilien oder Säugern. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Säugerzelle ist. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine CHO Zelle ist. Eine weitere spezielle Ausführungsform der genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die CHO Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe: CHO wild type, CHO K1 , CHO DG44, CHO DUKX-B11 und CHO Pro-5. Besonders bevorzugt ist eine CHO DG44 Zelle.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Expressionsvektor mit gesteigerter Expression eines Gens von Interesse generierbar nach einem der genannten erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle generierbar nach einem der genannten erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Produktion und Reinigung eines Proteins von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine C- terminale Aminosäure des entsprechenden Gens von Interesse deletiert ist und das erhaltene Protein von Interesse eine verringerte Heterogenität aufweist im Vergleich zum Wildtyp-Protein ohne Deletion.
Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys) oder Arginin (Arg) ist, bevorzugt Lys. Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse ein Antikörper, ein Fc- Fusionsprotein, EPO oder tPA ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse eine schwere Kette eines Antikörpers ist und die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys). Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette des Antikörpers vom Typ IgGI , lgG2, lgG3 oder lgG4 ist, bevorzugt vom Typ IgGI , lgG2 oder lgG4. Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass für die Produktion Zellen in Suspensionskultur kultiviert werden. Eine weitere spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass für die Produktion Zellen serumfrei kultiviert werden. Eine weitere spezielle Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in chemisch definiertem Medium kultiviert wird. Eine bevorzugte Ausführungsform aller genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in proteinfreiem Medium kultiviert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Säugerzellen sind.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen CHO Zellen sind, bevorzugt CHO DG44 Zellen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass bei der Reinigung des Proteins von Interesse eine niedrigere Salzkonzentration zum Einsatz kommt im Vergleich zur Reinigung eines Wildtyp-Proteins ohne Deletion.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers dadurch gekennzeichnet, dass in einer Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines Antikörpers kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C- terminale Aminosäure Lysin kodiert, die Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, welcher die so veränderte Nukleinsäure enthält, und die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Expression des Antikörpers erlaubt.
Im folgenden wird die Erfindung anhand nicht-beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert.
BEISPIELE
ABKÜRZUNGEN
AP: alkalische Phosphatase Asp (=D): Asparaginsäure bp: Basenpaar CHO: Chinese Hamster Ovary
CpB: Carboxypeptidase B
DHFR: Dihydrofolat-Reduktase
ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay
HT: Hypoxanthin/Thymidin
IgG: Immunoglobulin G
He (=l): Isoleucin kb: Kilobase
Lys: Lys in mAk: monoklonaler Antikörper
MTX: Methotrexat
MW: Mittelwert
NPT: Neomycin-Phosphotransferase
PCR: Polymerase chain reaction
Phe (=F): Phenylalanin
SEAP: secreted alkaline Phosphatase
WT: Wildtyp
METHODEN
Zellkultur und Transfektion
Die Zellen CHO-DG44/dhfr"Λ werden permanent als Suspensionszellen in serumfreiem und mit Hypoxanthin und Thymidin (HT) supplementiertem CHO-S-SFMII Medium (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) in Zellkulturflaschen bei 37°C in feuchter Atmosphäre und 5% CO2 kultiviert. Die Zellzahlen sowie die Viabilität werden mit einem Cedex (Innovatis) bestimmt und die Zellen dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert. Zur Transfektion von CHO-DG44 wird Lipofectamine Plus Reagenz (Invitrogen) eingesetzt. Pro Transfektionsansatz wird dabei insgesamt 1 ,0 - 1 ,1 μg Plasmid- DNA, 4 μL Lipofectamine und 6 μL Plus-Reagenz nach den Angaben des Herstellers gemischt und in einem Volumen von 200 μL zu 6x105 Zellen in 0,8 ml HT-supplementiertem CHO-S-SFMII Medium gegeben. Nach dreistündiger Inkubation bei 37°C in einem Zellinkubator erfolgt eine Zugabe von 2 ml_ HT- supplementiertem CHO-S-SFMII Medium. Nach einer Kultivierungszeit von 48 Stunden werden die Transfektionsansätze entweder geerntet (transiente Transfektion) oder einer Selektion unterworfen. Da der eine Expressionsvektor einen DHFR- und der andere einen NPT-Selektionsmarker enthält, werden die co- transfizierten Zellen zur DHFR- und NPT-basierten Selektion 2 Tage nach Transfektion in CHO-S-SFMII Medium ohne Hypoxanthin- und Thymidinzusatz transferiert und dem Medium außerdem noch G418 (Invitrogen) in einer Konzentration von 400 μg/mL zugesetzt.
Eine DHFR-basierte Genamplifikation der integrierten heterologen Gene wird durch Zugabe des Selektionsagens MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) in einer Konzentration von 5 - 2000 nM zu einem HT-freien CHO-S-SFMII Medium erreicht.
Expressionsvektoren
Zur Expressionsanalyse werden eukaryontische Expressionsvektoren eingesetzt, die auf dem pAD-CMV Vektor basieren und die Expression eines heterologen Gens über die Kombination CMV Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotor (WO 97/15664) oder CMV Enhancer/CMV Promotor vermitteln. Während der Basisvektor pBID das dhfr-Minigen enthält, das als amplifzierbarer Selektionsmarker dient, ist im Vektor pBIN das dhfr-Minigen durch ein NPT-Gen ersetzt. Hierzu wurde der NPT-Selektionsmarker, inklusive SV40 early Promotor und TK-Polyadenylierungssignal, aus dem kommerziellen Plasmid pBK-CMV (Stratagene, La JoIIa, CA, USA) als 1640 bp Bsu36l-Fragment isoliert. Nach einer Auffüllreaktion der Fragmentenden durch Klenow-DNA-Polymerase wurde das Fragment mit dem 3750 bp Bsu36l/Stul-Fragment des Vektors pBID, das ebenfalls mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt wurde, ligiert. In beiden Vektoren wird die Expression des heterologen Gens über die Kombination CMV Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotor gesteuert. Der Vektor pBINδa ist ein Derivat des Vektors pBIN und enthält ein modifiziertes NPT-Gen. Es handelt sich dabei um die NPT-Variante F240I (Phe240lle), deren Klonierung in WO2004/050884 beschrieben ist. In diesem Vektor wie auch in dem Vektor pBIDa, einem Derivat des Vektors pBID, steht die Expression des heterologen Gens unter der Kontrolle der CMV Enhancer/ Promotor-Kombination.
ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)
Die Quantifizierung der exprimierten Antikörper (IgGI , lgG2 oder lgG4) in den
Überständen von stabil transfizierten CHO-DG44 Zellen erfolgt mittels ELISA nach Standardprotokollen, wobei zum einen ein Ziege anti Human IgG Fc-Fragment (Dianova, Hamburg, DE) und zum anderen ein AP-konjugierter Ziege anti Human Kappa light chain Antikörper (Sigma) eingesetzt wird. Als Standard dient gereinigter Antikörper vom jeweils gleichen Isotyp wie die exprimierten Antikörper. Produktivitäten (pg/Zelle/Tag) werden dabei mit der Formel pg/((Ct-Co) t / In (Ct- Co)) berechnet, wobei Co und Ct die Zellzahl bei Aussaat bzw. Ernte und t die Kultivierungsdauer angibt.
SEAP-Assay
Der SEAP-Titer in Kulturüberständen von transient transfizierten CHO-DG44 Zellen wird unter Verwendung des SEAP Reporter Gene Assays nach den Protokollvorgaben des Herstellers quantifiziert (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE).
BEISPIEL 1 : KLONIERUNG UND EXPRESSION VON IGG1 MIT C- TERMINALER LYSINDELETION
Die schwere Kette des monoklonalen humanisierten F19 Antikörpers (IgGI /kappa) wird als 1 ,5 kb Nael/Hindlll-Fragment aus dem Plasmid pG1 D105F19HC (NAGENESEQ: AAZ32786) isoliert und in den mit EcoRI (mit Klenow-DNA- Polymerase aufgefüllt) und Hindlll-verdauten Vektor pBID kloniert, wobei der Vektor pBID/F19HC resultiert (Abb.1 ). Die leichte Kette hingegen wird als 1 ,3 kb Hindlll/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pKN100F19LC (NAGENESEQ: AAZ32784) isoliert und in die entsprechenden Schnittstellen des Vektors pBIN kloniert, wodurch der Vektor pBIN/F19LC entsteht (Abb.1 ).
Die Deletion des C-terminalen Lysins an der schweren Kette des F19-Antikörpers erfolgt mittels PCR unter Verwendung des mutagenen Primers F19HC-Lys rev gacgtctaga tcaacccgga gacagggaga ggc (SEQ ID NO:1 ) mit komplementärer Sequenz zur Gensequenz, die für die letzten Aminosäuren der schweren Kette im C-terminalen Bereich kodiert. Allerdings ist das Kodon des C-terminalen Lysins durch ein Stopp-Kodon ersetzt. Zudem schließt sich nachfolgend noch eine Xbal- Restriktionsschnittstelle an, die für die spätere Klonierung genutzt wird. Dieser mutagene Primer wird in Kombination mit dem Primer F19 heavy4 atctgcaacg tgaatcacaa gc (SEQ ID NO:2) verwendet, der Komplementahtät zu einer weiter stromaufwärts gelegenen Sequenz in der konstanten Region der schweren Kette aufweist. Als Template für die PCR-Mutagenese dient dabei der Vektor pBID/F19HC. Das resultierende PCR-Produkt von 757 bp wird mit BmgBI (einer stromabwärts von der Primerposition F19 heavy4 gelegenen endogenen Schnittstelle) und Xbal verdaut und das 547 bp Restriktionsfragment dazu verwendet, um den entsprechenden Sequenzbereich im Vektor pBID/F19HC zu ersetzen. Daraus resultiert der Vektor pBID/lgG1 -Lys, der für eine schwere Kette des F19-Antikörpers mit deletierter C-terminaler Aminosäure Lysin kodiert (Abb.
1 )-
Durch transiente Transfektion von CHO-DG44 Zellen wird zunächst überprüft, ob das deletierte C-terminale Lysin, das bei allen IgG-Subtypen eine hoch konservierte Aminosäure ist, eine essentielle Bedeutung für die Expression oder Sekretion des IgGI -Moleküls hat. Es wird eine Co-Transfektion mit folgenden Plasmidkombinationen durchgeführt:
a) Kontrollplasmide pBID/F19HC und pBIN/F19LC, die für den monoklonalen Antikörper F19 in seiner Wildtypkonfiguration, also inklusive des C- terminalen Lysins an der schweren Kette, kodieren b) pBID/lgG1 -Lys und pBIN/F19LC, die für einen F19-Antikörper kodieren, dessen schwere Kette eine C-terminale Lysin-Deletion aufweist
Pro Kombination werden jeweils 10 Pools transfiziert, wobei in jeder Co- Transfektion äquimolare Mengen beider Plasmide eingesetzt werden. Nach 48 h Kultivierung in einem Gesamtvolumen von 3 ml_ erfolgt die Ernte und die Bestimmung des IgGI -Titers im Zellkulturüberstand mittels ELISA. Unterschiede in der Transfektionseffizienz werden durch Co-Transfektion mit einem SEAP- Expressionsplasmid (Zugabe von jeweils 100 ng Plasmid-DNA pro Transfektionsansatz) und nachfolgende Messung der SEAP-Aktivität korrigiert.
Überraschender Weise kann gezeigt werden, dass das IgGI -Molekül trotz der Deletion des C-terminalen Lysins in CHO-Zellen exprimiert und sezerniert wird und die Produktmengen vergleichbar mit der von IgGI Wildtyp transfizierten Zellen sind (Abb. 2).
Für eine stabile Transfektion von CHO-DG44 Zellen wird eine Co-Transfektion mit den gleichen Plasmidkombinationen wie oben beschrieben durchgeführt, wobei pro Kombination jeweils 10 Pools erzeugt werden. Als Negativkontrolle werden 2 Mock-transfizierter Pools mitgeführt, d.h. gleich behandelt, aber ohne DNA- Zugabe im Transfektionsansatz. Die Selektion stabil transfizierter Zellen erfolgt zwei Tage nach der Transfektion in HT-freiem Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418. Nach erfolgter Selektion wird der IgGI -Titer und die spezifische Produktivität der Zellpools über einen Zeitraum von 3 - 4 Passagen ermittelt (Passagierungsrhythmus 2-2-3 Tage). Überraschender Weise zeigt sich, dass Zellen, die die Lysin-Deletionsvariante des IgGI exprimieren, durchschnittlich sogar 27% höhere Titer bzw. 32% höhere spezifische Produktivitäten erzielen als Zellen, die den IgGI -Wildtyp exprimieren (Abb. 3). Dieser Produktionsvorteil der Lysin-Deletionsvariante ist auch dann noch gegeben, wenn in diesen Zellpools durch Zugabe von 100 nM MTX eine DHFR-basierte Genamplifikation induziert wird. Die Titer und spezifischen Produktivitäten sind durchschnittlich um 86% bzw. 120% höher (Abb. 4).
BEISPIEL 2: KLONIERUNG UND EXPRESSION VON IGG4 MIT C- TERMINALER LYSINDELETION
Zur Expression eines monoklonalen humanisierten lgG4 Antikörpers (lgG4/kappa) wird die schwere Kette als 2,2 kb BamHI/Smal-Fragment in das mit EcoRI (aufgefüllte Schnittstelle durch Behandlung mit Klenow-DNA-Polymerase)- und BamHII-verdaute Plasmid pBIDa kloniert, wobei das Plasmid pBIDa/lgG4 HC resultiert (Abb. 1. Die leichte Kette hingegen wird als 1 ,1 kb BamHI/EcoRI- Fragment in die Schnittstellen BamHI/EcoRI des Plasmids pBINa kloniert, wodurch das Plasmid pBIN8a/lgG4 LC entsteht (Abb. 1 ).
Die Deletion des C-terminalen Lysins an der schweren Kette des lgG4-Antikörpers erfolgt mittels PCR unter Verwendung des mutagenen Primers lgG4HC-Lys rev gacgtctaga tcaacccaga gacagggaga ggct (SEQ ID NO:3) mit komplementärer Sequenz zur Sequenz, die für die letzten Aminosäuren der schweren Kette im C- terminalen Bereich kodiert. Allerdings ist das Kodon des C-terminalen Lysins durch ein Stopp-Kodon ersetzt. Zudem schließt sich nachfolgend noch eine Xbal- Restriktionsschnittstelle an, die für die spätere Klonierung genutzt wird. Dieser mutagene Primer wird in Kombination mit dem Primer HC forδ cccctgacct aagcccaccc (SEQ ID NO:4) verwendet, der Komplementarität zu einer weiter stromaufwärts gelegenen Sequenz in der konstanten Region der schweren Kette aufweist. Als Template für die PCR-Mutagenese dient dabei der Vektor pBIDa/lgG4 HC. Das resultierende PCR-Produkt von 1013 bp wird mit BmgBI (einer stromabwärts von der Primerposition HC forδ gelegenen endogenen Schnittstelle) und Xbal verdaut und das 644 bp Restriktionsfragment dazu verwendet, um den entsprechenden Sequenzbereich im Vektor pBIDa/lgG4 HC zu ersetzen. Daraus resultiert der Vektor pBIDa/lgG4-Lys, der für eine schwere Kette des F19-Antikörpers mit deletierter C-terminaler Aminosäure Lysin kodiert (Abb.
1 )- Durch transiente Transfektion von CHO-DG44 Zellen wird zunächst überprüft, ob das deletierte C-terminale Lysin, das bei allen IgG-Subtypen eine hoch konservierte Aminosäure ist, eine essentielle Bedeutung für die Expression oder Sekretion des Moleküls hat. Es wird eine Co-Transfektion mit folgenden Plasmidkombinationen durchgeführt:
a) Kontrollplasmide pBIDa/lgG4 HC und pBIN8a/lgG4 LC, die für den monoklonalen lgG4 Antikörper in seiner Wildtypkonfiguration, also inklusive des C-terminalen Lysins an der schweren Kette, kodieren
b) pBIDa/lgG4-Lys und pBIN8a/lgG4 LC, die für einen monoklonalen lgG4- Antikörper kodieren, dessen schwere Kette eine C-terminale Lysin-Deletion aufweist
Pro Kombination werden jeweils 10 Pools transfiziert, wobei in jeder Co- Transfektion äquimolare Mengen beider Plasmide eingesetzt werden. Nach 48 h Kultivierung in einem Gesamtvolumen von 3 mL erfolgt die Ernte und die Bestimmung des lgG4-Titers im Zellkulturüberstand mittels ELISA. Unterschiede in der Transfektionseffizienz werden durch Co-Transfektion mit einem SEAP- Expressionsplasmid (Zugabe von jeweils 100 ng Plasmid-DNA pro Transfektionsansatz) und nachfolgende Messung der SEAP-Aktivität korrigiert.
Überraschender Weise kann gezeigt werden, dass das lgG4-Molekül trotz der Deletion des C-terminalen Lysins in CHO-Zellen sogar etwas besser produziert wird als der lgG4 Wildtyp (Abb. 5).
Für eine stabile Transfektion von CHO-DG44 Zellen wird eine Co-Transfektion mit den gleichen Plasmidkombinationen wie oben beschrieben durchgeführt, wobei pro Kombination jeweils 10 Pools erzeugt werden. Als Negativkontrolle werden 2
Mock-transfizierter Pools mitgeführt, d.h. gleich behandelt, aber ohne DNA- Zugabe im Transfektionsansatz. Die Selektion stabil transfizierter Zellen erfolgt zwei Tage nach der Transfektion in HT-freiem Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418. Nach erfolgter Selektion wird durch Zugabe von 100 nM MTX eine DHFR- basierte Genamplifikation induziert wird. Die lgG4-Titer und die spezifische Produktivität der Zellpools werden über einen Zeitraum von 3 - 4 Passagen ermittelt (Passagierungsrhythmus 2-2-3 Tage). Insgesamt resultieren nach der Selektion und Amplifikation aus den mit lgG4 Wildtyp-transfizierten Zellen 4 und aus den mit der Lysin-Deletionsvariante transfizierten Zellen 6 stabil exprimierende Zellpools.. Überraschender Weise zeigt sich, dass Zellen, die die Lysin-Deletionsvariante des lgG4s exprimieren, durchschnittlich sogar 63 % höhere Titer bzw. 70 % höhere spezifische Produktivitäten erzielen als Zellen, die den lgG4-Wildtyp exprimieren (Abb. 6). Dieser Produktionsvorteil der Lysin- Deletionsvariante ist auch bei dem nachfolgenden Amplifikationsschritt mit 400 nM MTX gegeben. Hier werden im Durchschnitt 53% höhere Titer und 66% höhere spezifischen Produktivitäten erzielt (Abb. 7).
BEISPIEL 3: KLONIERUNG UND EXPRESSION VON IGG2, IGG3, FC-
FUSIONSPROTEINEN UND ANDEREN BIOMOLEKÜLEN MIT C-TERMINALER AMINOSÄUREDELETION Zur Deletion des C-terminalen Lysins bei den schweren Ketten der Antikörper- Isotypen lgG2 und lgG3 wird die PCR-Mutagenese, wie schon in Beispiel 1 und 2 für die Isotypen 1 und 4 beschrieben, herangezogen. Auf gleiche Weise werden auch C-terminale Lysindeletionen an Fc-Fusionsproteinen (bivalent oder bispezifisch), bei denen Biomoleküle wie Zytokine, lösliche Rezeptoren etc. Bestandteil eines Fc-Fusionsproteins sind (Beispiele: Alefacept, LFA-3-Fc, Etanercept TNFR-Fc), vorgenommen.
Eine Erweiterung des Konzepts der Kodondeletion von C-terminalen Aminosäuren ist denkbar für Biomoleküle wie z.B. Erythropoetin (EPO) und tissue Plasminogen Activator (tPA), bei denen eine proteolytische Abspaltung des C-terminalen Arginins bekannt ist (M.A. Recny, H.A. Scoble and Y. Kim, J. Biol. Chem., 262 (1987) 17156-17163; Harris, RJ. (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1 ), pp. 129-134). Voraussetzung dabei ist die Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität oder wie z.B. im Fall von tPA die weiterhin intakte proteolytischen Prozessierung.
In transienten Transfektionen wird zunächst geprüft, ob die Deletion der C- terminalen Aminosäure einen Einfluss auf die Expression und Sekretion hat. Danach werden stabile Transfektionen durchgeführt und die spezifischen Produktivitäten und Titer von Zellpools, die mutierte Proteine oder Wildtyp- Proteine exprimieren, miteinander verglichen.
BEISPIEL 4: REINIGUNG VON IGG1 WT UND IGG1 -LYS
Für den Isotyp IgGI bzw. die WT- und die Lysin-Deletionsvariante ist die Aufarbeitung identisch. Die Protein A Affinitätschromatogrphie (MabSelect, GE) erfolgt gemäß den Angaben des Herstellers. Die Quantifizierung der Produktausbeute nach ProteinA Chromatographie erfolgt mittels ProteinA HPLC. Die Ausbeuten liegen bei beiden Varianten des Isotyps IgGI unabhängig von der Lysin-Kodondeletion bei über 90% (Abb. 8). Die Lysindeletion hat keinen negativen Einfluss auf die Affinitätschromatographie bzw. die Produktausbeute. Die Produktheterogen ität bzgl. des C-terminalen Lysins wird sowohl qualitativ im isoelectric focusing (IEF) als auch quantitativ per weak cationic exchange (WCX) bestimmt (siehe Abb. 9 und 11 ). Um die durch C- terminales Lysin verursachte Ladungsheterogenität qualitativ mittel IEF zu bestimmen, werden die Antikörper mit Carboxypeptidase B inkubiert. Bei 37°C werden 10 μg Carboxypeptidase B in 100 μL und einer Antikörperkonzentration von 1 mg/mL für 2 h inkubiert. In Abb.9 zeigt sich für den WT-Antikörper (IgGI ) nach enzymatischer Abspaltung mit Carboxypeptidase B (CpB) eine Reduktion in der Anzahl der Banden.
Die Kationaustauschchromatographie (ProPac WCX-10 / 4 x 250 mm) erfolgt mit einer Flussrate von 1 mL/min und einem Gradienten von 5-10% über 40 min (PufferA 2OmM MES-Puffer pH 6,7; PufferB: 2OmM , 1 M NaCI pH6,7). Die Säule wird mit jeweils 40 μg Antikörper beladen. Der WT und die -Lys Variante werden jeweils mit bzw. ohne enzymatische CpB Behandlung analysiert. Im Elutionsprofil bzw. Overlay des IgGI WT sind die Zustände Lys1 und Lys2 durch die basischen Peaks 1 und 2 gekennzeichnet. Ihr Produktanteil beträgt -10 %. Das Elutionsprofil bzw. Overlay der Variante mit Lysindeletion weist eine sehr geringe Heterogenität im basischen Bereich auf. Der Produktanteil liegt unter 1 % (Abb.11 ).
BEISPIEL 5: REINIGUNG VON IGG4 WT UND IGG4 -LYS Für den Isotyp lgG4 bzw. die WT- und die Lysin-Deletionsvariante ist die Aufarbeitung identisch zum IgGL Die Protein A Affinitätschromatogrphie (MabSelect, GE) erfolgt gemäß Angaben des Herstellers.
Die Quantifizierung der Produktausbeute nach ProteinA Chromatographie erfolgt mittels ProteinA HPLC. Die Ausbeuten liegen bei beiden Varianten des Isotyps lgG4 unabhängig von der Lysin-Kodondeletion ebenfalls bei über 90% (Abb. 8). Für den Isotyp lgG4 bzw. dessen Lysin-Codondeletion bestätigt sich wie bei IgGI der nicht vorhandene negative Einfluss auf die Affinitätschromatographie bzw. die Produktausbeute. Die Produktheterogenität bzgl. des C-terminalen Lysins wird quantitativ per LC-MS bestimmt (siehe Abb. 10 und 12). Zur Bestimmung der C- terminalen Lysinverteilung werden die Antikörperproben zunächst mit DTT reduziert. Im Anschluss werden die reduzierte leichte Kette und die reduziete schwere Kette (HC 1 -446 ohne Lys bzw. HC1 -447 mit Lys) über HPSEC getrennt und in sich anschließender (in-line) ESI-TOF-MS analysiert. Die Verteilung des C- terminalen Lysins basiert auf den Peakflächen für die HC 1 -446 bzw. HC 1 -447. Im Massenspektrogramm der schweren Kette zeigt sich der Massenshift durch das Lysin in Abhängigkeit von der Glykosylierung (GO, G1 , G2) (Abb. 12). Der ermittelte Produktanteil von Antikörpermolekülen (lgG4 WT) mit C-terminalen Lysinen in der schweren Kette (Lys1 und Lys2) beträgt ca. 20% (Abb. 10). BEISPIEL 6: THERMISCHE STABILITÄT
Die Bestimmung der thermischen Stabilität mittels intrinsischer Fluoreszenz (Tryptophan) zeigt keinen Einfluss des C-terminalen Lysins (IgGI WT und -Lys Tm 69°C; bzw. lgG4 WT und -Lys 64°C). Die Anregungswellenlänge liegt bei 295 nm. Das jeweilige Emissionsspektrum wird in 1 °C Inkrementen über einen Bereich von 25°C bis 85°C vermessen. Die Emissionsspektren werden über einen Wellenlängenbereich von 300 nm bis 450 nm aufgenommen. Weitere technische Daten: Fluoreszenzspektrometer LS55 Perkin Eimer, Spaltbreite 4 nm für anregungs- und emissionsseitig, Temperaturmessung/PT100- in der Probe.
Die Proteinkonzentrationen betragen 0,1 mg/mL in PBS-Puffer. Die Untersuchung zeigt, dass das C-terminale Lysin der schweren Antikörperkette keinen Einfluss auf die thermische Stabilität des Antikörpermoleküls hat.
Schon frühere Untersuchungen zeigten bereits, dass kein Einfluss des C- terminalen Lysins der schweren Antikörperkette auf die thermischen Stabilität des Antikörpermoleküle besteht (Liu et al. Immunol. Lett. 2006, 106 (2), 144-153).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Steigerung des Titers eines Proteins von Interesse einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass a. in einer Nukleinsäuresequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale
Aminosäure kodiert, b. die Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, welcher die veränderte
Nukleinsäure aus a) enthält und c. die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Produktion des
Proteins von Interesse erlaubt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Titer um mindestens 10%, 20%, 50%, bevorzugt 75% gesteigert ist in Bezug auf den Vergleichswert des Proteins ohne die Deletion der C-terminalen
Aminosäure.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Produktivität der Zelle um mindestens 10%, 20%, 50%, bevorzugt 75% gesteigert ist in Bezug auf den Vergleichswert des Proteins ohne die Deletion der C-terminalen Aminosäure.
4. Verfahren zur Erzeugung eines Expressionsvektors zur gesteigerten Produktion eines Proteins von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass a. in der Nukleinsäuresequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale Aminosäure kodiert, und b. die so modifizierte Nukleinsäuresequenz aus a) in einen Expressionsvektor eingeführt wird.
5. Verfahren zur Erzeugung einer Zelle mit gesteigertem Titer eines Proteins von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass a. eine Gruppe von Zellen gemäß einem Verfahren nach Anspruch 1 behandelt wird und b. anschließend eine Einzelzellklonierung vorgenommen wird.
6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse in einer Zelle dadurch gekennzeichnet, dass a. eine Gruppe von Zellen gemäß einem Verfahren nach Anspruch 1 behandelt wird, b. diese Zellen aus a) in Anwesenheit zumindestens eines Selektionsdrucks selektioniert werden, c. optional eine Einzelzellklonierung vorgenommen wird und d. das Protein von Interesse aus den Zellen oder dem Kulturüberstand gewonnen wird.
7. Verfahren zur Herstellung mindestens eines Proteins von Interesse nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass die zur Herstellung verwendete Zellen nach Durchführung von Schritt b) zusätzlich einem Genamplifikationsschritt unterzogen werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys) oder Arginin (Arg) ist, bevorzugt Lys.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse ein Antikörper, ein Fc-Fusionsprotein, EPO oder tPA ist.
10.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse eine schwere Kette eines Antikörpers und die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys) ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass die schwere
Kette des Antikörpers vom Typ IgGI , lgG2, lgG3 oder lgG4 ist, bevorzugt vom Typ IgGI , lgG2 oder lgG4.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse ein monoklonaler, polyklonaler, Säugetier-,
Maus-, chimerer, humanisierter, Primaten- oder ein humaner Antikörper ist oder ein Antikörperfragment oder -derivat einer schweren Kette eines
Immunoglobulin Antikörpers ist oder eines Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc
Fusionsproteins, Fv, Single chain Fv, Single domain Fv, tetravalenten Single chain Fv, Disulfid-verknüpften Fv, Domänen-deletierten Antikörpers, eines
Minibodys, Diabodys, oder eines Fusionspolypeptides eines der genannten
Fragmente mit einem anderen Peptid oder Polypeptid ist oder ein Fc-Peptid
Fusionsprotein, ein Fc-Toxin Fusionsprotein oder ein Scaffold-Protein.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in Suspensionskultur kultiviert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle serumfrei kultiviert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine eukaryotische Zelle ist, z.B. aus Hefe, Pflanzen, Würmern, Insekten, Vögeln, Fischen, Reptilien oder Säugern.
16. Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine
Säugerzelle ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine CHO Zelle ist, bevorzugt eine CHO DG44 Zelle.
18. Expressionsvektors mit gesteigerter Expression eines Gens von Interesse generierbar nach einem Verfahren gemäß Anspruch 4.
19.ZeIIe generierbar nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5.
20. Verfahren zur Produktion und Reinigung eines Proteins von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass a. in einer Nukleinsäuresequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, mindestens das Kodon deletiert wird, das für die C-terminale Aminosäure kodiert, und b. das erhaltene Protein von Interesse eine verringerte Heterogenität aufweist im Vergleich zum Protein ohne die Deletion der C- terminalen Aminosäure.
21. Verfahren nach Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, dass die C- terminale Aminosäure Lysin (Lys) oder Arginin (Arg) ist, bevorzugt Lys.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 21 dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse ein Antikörper, ein Fc-Fusionsprotein, EPO oder tPA ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22 dadurch gekennzeichnet, dass das Protein von Interesse eine schwere Kette eines Antikörpers ist und die C-terminale Aminosäure Lysin (Lys).
24. Verfahren nach Anspruch 23 dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette des Antikörpers vom Typ IgGI , lgG2, lgG3 oder lgG4 ist, bevorzugt vom Typ IgGI , lgG2 oder lgG4.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24 dadurch gekennzeichnet, dass bei der Reinigung des Proteins von Interesse eine niedrigere Salzkonzentration zum Einsatz kommt im Vergleich zur Aufreinigung eines Proteins ohne die Deletion der C-terminalen Aminosäure.
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