MX2007014148A

MX2007014148A - Composiciones y metodos para incrementar la estabilidad de anticuerpos.

Info

Publication number: MX2007014148A
Application number: MX2007014148A
Authority: MX
Inventors: Grace C Chu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2005-05-19
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2008-01-11
Also published as: AU2006247039B2; EP1888637A2; JP5053264B2; CA2607663C; US8858935B2; WO2006125207A3; WO2006125207A2; JP2008540684A; US20060269543A1; CA2607663A1; AU2006247039A1

Abstract

La invencion abarca composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo y metodos para formular anticuerpos. La region variable de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo puede tener ciertas caracteristicas. En algunas modalidades, el anticuerpo puede comprender un sitio de N-glicano en una region variable de cadena pesada y/o ligera. Las composiciones pueden comprender un agente amortiguador, y opcionalmente, un azucar y/o una sal.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INCREMENTAR LA ESTABILIDAD DE ANTICUERPOS i I I Campo de la Invención | La invención esta en el campo de métodos y composiciones para estabilizar anticuerpos.

Antecedentes de la Invención En muchas aplicaciones en las cuales se usan anticulerpos , es deseable formular anticuerpos tal que se mantenga de forma estable durante un intervalo de tiempo su estructura fisica y su actividad biológica. Los usos actuales de anticuerpos incluyen uso en investigación amplia) y uso como productos terapéuticos y de diagnóstico I en humanos, entre otros muchos usos. Los anticuerpos, como una cljase de proteinas, comparte mucha similitudes, pero diferentes anticuerpos poseen diferentes estructuras i físicas diferentes actividades biológicas Las preparaciones de un anticuerpo individual pueden ser heterogéneas debido a las diferencias en, por ejemplo, glicosilación, modificación de aminoácidos, o estructura terciaria. La presente invención se refiere a composiciones y métodos para estabilizar un grupo particular de anticuerpos y métodos para usar estas composiciones para tratar varias enfermedades.

REF..187504 Breve Descripción de la Invención La invención abarca composiciones estables que comprenden anticuerpos y métodos para estabilizar anticuerpos. En modalidades particulares, las composiciones pueden comprender anticuerpos de entre grupos descritos de i anticuerpos, y composiciones que tienen un pH dentro de ciertos intervalos y/o que comprenden un agente amortiguador particplar, tal como por ejemplo histidina, acetato de sodio, I o citrato de sodio. En otras modalidades, la I invención proporciona composiciones que incluyen una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal que compre de variantes estructurales plurales, por ejemplo, una prepar ción que comprende al menos 2, 3, 4 ó 5 diferentes isoforijnas de un anticuerpo. La invención abarca además métodos para estabilizar anticuerpos, preparaciones opcionalmente codificadas de anticuerpos monoclonales que comprenden variantes estructurales plurales. Las variantes estructurales pueden ser isoformas debido a sialilación heterogénea de un N-glicano unido a una región variable de un anticuerpo. Las variantes estructurales pueden ser isoformas debido a sialilación heterogénea de cualquier glicano unido a un anticuerpo. , En un aspecto, la invención incluye una composición farmacéutica estable que tiene un pH de aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 6.5 que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal e histidina, acetato de sodio, o citrato de sodio, en donde el anticuerpo tiene al menos una característica seleccionada del grupo que consiste de caracteristicas que consisten de: (a) el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ó 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO:| 30; (b) el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ¡98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ IDi NO: 16, o SEQ ID NO: 31; (c) el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que incluye un sitio de N-glic no; (d) el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que incluye un sitio de N-glicano; (e) el i I anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que incluye una CDR3 de cadena pesada que tiene una i secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (i) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 7 i de los aminoácidos de SEQ ID NO: 36 en el mismo orden y espaciado como se presenta en SEQ ID NO: 36 y (ii) una secuen ia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 37; (f) el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que ifcluye una CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (i)| SEQ ID NO: 43 y (ii) SEQ ID NO: 44; (g) el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada al menos aproximadamente 80 %, 85 % o 90 % idéntica a aquella codificada por el segmento 5-51 de VH genómico humano (SEQ ID NO: 58) o 5-a (SEQ ID NO: 59); y h) el anticuerpo compreide una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente 80 %, 85 % o 90 % idéntica a aquella codificada por el segmento VKIII/A27 de VL genómica humana (SEQ JD NO: 60) . En un aspecto adicional, el anticuerpo I puede comprender una región variable de cadena pesada que incluye: una CDRl que comprende SEQ ID NO: 34; una CDR2 que comprejide SEQ ID NO: 35; y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37. En aun otro aspecto, el anticuerpo puede comprehder una región variable de cadena ligera que incluye: una CDRl que comprende SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40; una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42; y na CDR3 que comprende SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.

En algunas modalidades, la región variable pesada puede comprender las siguientes secuencias: una CDRl que comprende al menjos 4 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 34 en el mismo i orden y espaciado como se presenta en SEQ ID NO: 34; una CDR2 que comprende al menos 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 35 en el mismo orden y espaciado como se presenta en SEQ ID NO: 35; una CDR3 que comprende al menos 5, 6 ó 7 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 en el mismo orden y espaciado como se presenta en SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37. En algunas modalidades, la región variable y ligera puede comprender las siguientes secuencias: una CDRl que comprende al menos 9, 10 u 11 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, o SEQ ID ejempl<b, una IgGl, una IgG2 e IgG3, o un anticuerpo de IgG4. La composición puede comprender una azúcar, tal como sorbitol o sacarosa, y/o una sal. El pH de la composición í puede ¡ser de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3 o puede ser aproximadamente 6.0. El anticuerpo puede ser un anticu rpo humano o humanizado y puede unirse a interferon-gamma (IFN-?) . La invención proporciona una composición I farmacéutica que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal y un agente amortiguador, en donde la composición esta a un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5 y en donde la preparación purificada comprende al menos tres diferentes isoformas del anticuerpo. El pH de la composición puede ser de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3 o puede ser aproximadamente 6.0, y la composición puede ser un liquido. El anticuerpo puede comprender un sitio de N-glicano en una región variable de cadenai ligera y/o pesada y puede tener una región variable de cad¡ena pesada al menos 80 % , 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o una región variable de cadena ligera es al menos 8i0 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:| 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 31. El anticuerpo puede [comprender: una región variable de cadena pesada que incluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 35, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 36 o SÉQ ID NO: 37; y/o una región variable de cadena ligera que incluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 41 o i SEQ ID|NO: 42, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO:! 44. El agente amortiguador puede ser histidina, acétat? de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio o citrato de sodio, y la composición puede comprender además un azúcar, tal como por ejemplo, sorbitol, un carbohidrato y/o una sal. El anticuerpo se puede producir en una célula CHO. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de IgG humano o humanizado, opcionalmente un anticuerpo de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo puede unirse a intervalos interferon-gamma, opcionalmente interferon-gamma humano. Al menos 90 % o 95 % de la proteina detectable en la preparación purificada puede estar en el pico de monómero como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Adicionalmente, la invención proporciona un método I i para elstabilizar una preparación purificada de un anticuerpo monoclpnal que comprende formular la preparación purificada en una composición que comprende un agente amortiguador, en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5 y en donde la preparación purificada comprende al menos tres diferentes isoformas del anticuerpo. El anticuerpo puede tener un sitio de N-glicano en una región] variable de cadena pesada y/o ligera. La región variable de cadena pesada del anticuerpo puede ser al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ó 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:! 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o la región variable de cadena ligera del anticuerpo puede ser al menos 80 %, |90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 31. El anticuerpo puede 'comprender: una región variable de cadena pesada que incluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 35, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37; y/o una región variable de cadena ligera que inlcluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42, una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. El agente amortiguador puede ser histidina, acetato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio o citrato de sodio. La composición puede comprender además un azúcar, tal como por ejemplo, sorbitol, un carbohidrato y/o una sal. El anticuerpo se puede hacer en una célula CHO y puede ser un anticuerpo de IgG, opcionalmente IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo puede ser humano o humanizado. El pH de la composición puede ser de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3 o de aproximadamente 6.0. Al menos 90 % i o 95 % de la proteina detectable en la preparación purificada puede estar en el pico de monómero como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . I En otra modalidad, la invención incluye una composición que comprende histidina y una preparación purifijcada de un anticuerpo monoclonal, en donde la preparación purificada comprende al menos tres isoformas del anticuerpo y en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. De manera alternativa, la composición puede comprender acetato de sodio j y una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal, en donde la preparación purificada comprende al menos 'tres isoformas del anticuerpo y en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 6. El anticuerpo puede comprender un sitio de N-glicano en una región variable de cadena pesada y/o ligera y puede comprender una región variable de cadena pesada al menos 80 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 1¡0, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o una región variable de cadena ligera al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 %! idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 31. El anticuerpo puede comprender: una región variable de cadena pesada que incluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 35, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37; y/o una región variable de cadena ligera que incluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. La composición puede comprender además un azúcar, tal como por ejemplo, sorbitol, un carbohidrato y/o una sal. El anticuerpo se puede ¡hacer en una célula CHO y puede ser un anticuerpo de IgG, ?pcionalmente IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo puede !se humano o humanizado. El pH de la composición puede ser dle aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3, o aproximadamente 6.0. La composición puede ser un líquido o puede estar congeljjado o liofilizado. La composición puede comprender además una azúcar, tal como por ejemplo, sorbitol, un carboh idrato y/o una sal. Al menos 90 % o 95 % de la proteína detectable en la preparación purificada puede estar en el pico de monómero como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . En otra modalidad, la invención comprende un método! para estabilizar una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal que comprende formular el anticuerpo en una composición que comprende histidina, en donde la purificada comprende al menos tres isoformas del y en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. De manera alternativa, la composición puede comprender acetato de sodio, i y una preparación purificada de un anticuerpo monocl?nal, en donde la preparación purificada comprende al menos tres isoformas del anticuerpo, y en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 6. La i composición puede comprender además un azúcar, tal como por ejemplo, sorbitol, un carbohidrato y/o una sal. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada ¡ al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a i SEQ ID¡N0: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o una región variable de cadena ligera es al menos 80 %, 90 %, 95, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 31. El anticuerpo puede comprender: una región variable de cadena pesada que incluye una CDRl que comprende SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 35, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37; y/o una región variable de cadena ligera que incluya una CDRl que comprende SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 o SEQ 'ID NO: 40, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO:1 42, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 441. Al menos 90 % o 95 % de la proteína detectable en la preparación purificada puede estar en el pico de monómero como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . | | La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal e histidina, en donde la composición farmacéutica tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 o tiene un pH de aproximadamente 6. La preparación purificada puede comprender al menos 3 isoformas I del anticuerpo. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 °s, 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos I de SEQl ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: y/o¡ una región variable de cadena ligera es al menos aproximadamente 80 %, 85 % 90 %, 95 % o 100 % idéntica a la i secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID ¡NO: 16 o SEQ ID NO: 31. La composición también puede compre der sorbitol. La invención incluye además una composición farmacéutica que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal y acetato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio, en donde la preparación farmacéutica tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 o tiene un pH de aproximadamente 6. La preparación purificada puede comprender al menos tres isoformas del anticuerpo. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % , 95 % o 100 - idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente 80 %, 85 i % 90 %!, 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de EQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: ! 31. La composición también puede comprender sorbit'pl. ' La invención incluye además una composición i farmacéutica que comprende una composición purificada de un anticuerpo monoclonal y citrato de sodio, en donde la composjición farmacéutica tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 o tiene un pH en aproximadamente 6. La preparación purificada puede comprender al menos 3 isoformas del anticuerpo. El anticuerpo puede comprender una región variabjle de cadena pesada al menos aproximadamente 80 %, 90 %, 95 | % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ IC NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o una región variable de cadena ligera es al menos aproximadamente 80 %, 85 % 90 %, 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 31. La composición también puede comprender sorbitol. En otro aspecto, la invención proporciona una compos ¡ición farmacéutica estable, que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que se une específicamente a un antígeno humano, histidina, acetato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio o citrato de sodio, y una sal y/o una azúcar, en donde ¡el anticuerpo tiene un sitio de N-glicano en su región variable de cadena pesada y/o ligera. En otra modalidad, la I invención proporciona una composición farmacéutica estable que comprende una preparación purificada de un anticuerpo I monoclbnal humano o humanizado que se une específicamente a un antígeno humano, un agente amortiguador, y una sal y/o I una azúcar, en donde el anticuerpo comprende un N-glicano en I su región variable de cadena pesada y/o ligera y en donde el pH de la composición es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. Opcionalmente, el pH de la composición puede ¡ser de aproximadamente de 5.7 a aproximadamente 6.3 o puede ¡ser aproximadamente 6. Adicionalmente, la invención abarca) una composición farmacéutica estable que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que se une específicamente a un antígeno humano, un agente amortiguador, por ejemplo histidina, citrato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, o citrato de sodio, y una sal y/o un azúcar, en donde el anticuerpo es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, y/o SEQ ip NO: 30. El pH de la composición puede ser de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. En un aspecto adicional, la invención incluye una composición farmacéutica estable que comprende una preparación purificada de un anticu rpo monoclonal humano humanizado que se une específicamente un antígeno humano, un agente amortiguador, por ejemplo histidina, acetato de sodio, fosfato de sodio, fosfató de potasio o citrato de sodio, y una sal; y/o un azúcar; en donde el anticuerpo es al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQJID NO: 12, SEQ ID NO: 16, y/o SEQ ID NO: 31. El pH de la composición puede ser de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. Opcionalmente, el pH de la composición I puede ¡ser de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3 o I puede 'ser aproximadamente 6. La composición puede ser i líquida, y si es así, puede no haber sido anteriormente liofililzada . De manera alternativa, la composición se puede liofilizar . La invención también incluye un método para estabilizar un anticuerpo que comprende los pasos de: seleccionar una preparación purificada de un anticuerpo monocljonal que tiene un sitio de N-glicano en su región I variab'le de cadena ligera y/o pesada y formular la preparjación purificada en una solución que comprende histidina, acetato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, o citrato de sodio, y que tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. La solución puede comprender además un azúcar, tal como sorbitol o sacarosa, y/o unja sal. El pH de la solución puede ser aproximadamente 6.0. ¡El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID, NO: 30. De manera alternativa o además, el anticuerpo puede pomprender una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 % 9¡0 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ i ID NO:' 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 31. | Finalmente, la invención proporciona un método para e-3tabilizar una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal humano o humanizado, que se une a un antígeno humano, en donde la preparación purificada comprende variantes estructurales plurales del anticuerpo monoclonal, que comprende seleccionar una mezcla de al menos dos, tres o cuatro variantes estructurales, en donde las variantes estructurales son debido a glicosilación heterogénea de un sitio 'de N-glicano, y formular la mezcla en una composición que comprende un agente amortiguador, por ejemplo histidina, fosfato, citrato, o acetato y una azúcar y/o una sal a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5. La composición puede comprender además sorbitol o sacarosa. j Breve Descripción de las Figuras | Las Figuras ÍA a 1G son diagramas que representan i las estructuras de una estructura de núcleo de N-glicano (ÍA), | un N-glicano biantenario disialilado sin ramificaciones que comprende más de una unidad de N-acetilglucosamina más galactosa (LacNAc) (IB), un N-glicano triantenario disialilado (1C), un N-glicano triantenario disialilado con una ramificación que comprende dos unidades Lac-NAc (ID), un N-glicano tetraantenario tetrasialilado (1E), un N-glicano tetraantenario trisialilado con una ramificación que comprende dos unidades LacNAc (1F) y un N-glicanf tetraantenario trisialilado con dos ramificaciones que comprenden dos unidades LacNAc (1G) . Los símbolos representan los siguientes residuos de azúcar: cuadro relleno, N-acetilglucosamina (GlcNAc) ; círculo abierto, I mannosa (Man); diamante abierto, galactosa (Gal); diamante relleno, ácido siálico (Sia) ; y triángulo abierto, fucosa La Figura 2 muestra un perfil de ilusión que muestria densidad óptica a 280 nanómetros (OD2eo) de una column!a de intercambio catiónico en el cual se ha cargado una preparación purificada de un anticuerpo que tiene un sitio de N-glicano en su región variable de cadena pesada. Se detectaron al menos ocho diferentes variantes de isoformas cargadas. La Figura 3 muestra un conjunto de perfiles de columna OD2?5 de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) revestida de muestras formuladas en fosfato de sodio 10 mM, pH 8, sorbitol al 5 % después de 3 meses de almacenamiento 37°C. Las Figuras 4A-4E muestran el por ciento de anticuerpo total que esta en la forma de monómero como se detectó por SEC nativa para los Picos -2, -1, 0, +1, y +2 de isoforma purificada y FPB como una función del tiempo, temperatura de almacenamiento y pH . Cada panel muestra el por ciento de monómeros en puntos de tiempo desde cero a tres rreses tanto a 4°C (símbolos rellenos) y 37°C (símbolos abiertos) para pH 4 (Figura 4A) , pH 5 (Figura 4B) , pH 6 (Figurb 4C) pH 7 (Figura 4D) , y pH 8 (Figura 4E) . Las muestras se formularon como sigue: pH 4, sorbitol al 5 %, acetato de sodio 10 mM; pH 5: sorbitol al 5 %, acetato de sodio ¡al 10 mM; pH 6, sorbitol al 5 %, histidina 10 mM; y pH i 7 y 8, sorbitol al 5 %, fosfato de sodio 10 mM. Las Figuras 5A-5B muestran el por ciento de especie de bajo peso molecular y alto peso molecular (LMW y HMW, respectivamente) formadas en los Picos -2, -1, 0, +1 y +2 de ¡ isoforma purificada y FPB después de 3 meses de almacenamiento a 4°C (Figura 5A) y 37°C (Figura 5B) a varios pH, como se indica. Las especies de LMW y HMW se detectaron por SEC. Las muestras se formularon como en Isa Figuras 4A-4E. I ' Las Figuras 6A-6B muestran la proporción de la cantidad total de anticuerpo en el material de los Picos -2, -1, O,' +1 y +2 de isoforma purificada y FPB que fueron dímeros (Figura 6A) y agregados (Figura 6B) como se detecta por SEC después de 3 meses de incubación a 37 °C a varios pH, como sé índica. Las muestras se formularon como en la Figura 4. Las Figuras 7A-7B muestran perfiles de columna de cromatografía de fase inversa (RPC) de OD2i5 revestida de material de Picos -2, -1, 0, +1 y +2 de isoforma purificada y FPB,¡ como se índica a la figura, almacenado durante 3 meses a 4°C (Figura 7A) o a 37°C (Figura 7B) a pH 8 en una formulación que contiene fosfato de sodio 10 mM y sorbitol al 5 %j ¡ Las Figuras 8A-8B muestran los efectos del pH en el por¡ ciento de anticuerpo total en el pico principal (Figurja 8A) y en una especie de recorte hidrófila (Figura 8B) en los Picos -2, -1, 0, +1 y +2 de isoforma purificada y FPB, como se indica en la figura, después de 3 meses de incubación a 37 °C a varios pH, como se indica. La detección es porj RPC. Las muestras se formularon como las Figuras 4A-4b. | La Figura 9 muestra la relación de la intensidad fluore ¡scente intrínseca a la longitud de onda de emisión de 326 nm con relación a aquella de 338 nm para formulaciones de los Picos -2, -1, 0, +1 y +2 y FPB, como se indica en la Figura, después de 3 meses de incubación a 37 °C a varios pH. La longitud de onda de excitación es de 280 nm. Las muestras se for :mmularon como en la Figura 4. ¡ La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos codifi ada por el segmento 5-51 de VH humano. | La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el segmento 5-a de VH humano. j La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el segmento VKIII/A27 de V? humano. | La Figura 13 muestra el por ciento de monómero como sé mide por SEC en muestras en acetato de sodio 10 mM l—I, histidina 12222, fosfato de potasio BSSJ, fosfato de sodio citrato de sodio ^3 con (panel izquierdo) o sin (panel | derecho) sorbitol al 5 % en el punto de tiempo cero.

Todas las mezclas con un pH objetivo de 4 se muestran, aunque i algunas no están a pH . Ver Ejemplo 3, Tabla 4. Se omiten todas las otras muestras que no están dentro de 0.4 unidades de pH del pH objetivo. La Figura 14 muestra el por ciento de monómero como se mide por SEC en muestras incubadas en acetato de sodio 10 mM I—I, histidina E223, fosfato de potasio ÍSS3, fosfata de sodio EB3-1, o citrato de sodio •=!, con (panel izquierdo) o sin (panel derecho) sorbitol al 5 % después de 12 semanas estático a 37 °C. Diferente de las muestras a pH 4 objetijvo, se emiten todas las muestras no dentro de 0.4 unidades de pH del pH objetivo. I La Figura 15 muestra el por ciento de monómero como se determina por SEC como una función del tiempo a 37 °C en muejstras en acetato de sodio 10 mM con (panel izquierdo) o sin ¡(panel derecho) sorbitol al 5 % . Las designaciones de muestra en las figuras son como en la Tabla 4 (Ejemplo 3) . Se omi¡ten las muestras no dentro de 0.4 unidades de pH del pH obj tivo. La Figura 16 muestra el por ciento de monómero como sé determina por SEC como una función del tiempo a 37 °C en mue'stras en histidina 10 mM con (panel izquierdo) o sin (panel derecho) sorbitol al 5 % . Las designaciones de muestra en las figuras son como en la Tabla 4 (Ejemplo 3) . ' La Figura 17 muestra el por ciento de monómero como se determina por SEC como una función del tiempo a 37 °C en muéstras en citrato de sodio 10 mM con (panel izquierdo) y sin (panel derecho) sorbitol al 5 % . Las designaciones de muestra en las figuras son como en la Tabla 4 (Ejemplo 3) . Se omiten las muestras no dentro de 0.4 unidades de pH del pH objetivo. La Figura 18 muestra el por ciento de monómero como s determina por SEC como una función del tiempo a 37 °C i en muestras en fosfato de potasio 10 mM con (panel izquierdo) y sin (panel derecho) sorbitol al 5 % . Las designaciones de muestra en las Figuras son como en la Tabla 4 (Ejemplo 3) . La Figura 19 muestra el por ciento de monómero como se determina por SEC como una función del tiempo a 37 °C en muestras en fosfato de sodio 10 mM con (panel izquierdo) y sin ¡panel derecho) sorbitol al 5 Las designaciones de muestra en las Figuras son como en la Tabla 4 (Ejemplo I 3) . 1 La Figura 20 muestra el por ciento de monómero como se determina por SEC después de 12 semanas de incuba ión estática a 37°C como una función del pH objetivo.

Se mue tran todas muestras a pH objetivo de 4, pero todas las otras muestras que están más de 0.4 unidades de pH del pH objetivo se omiten. Las muestras en el panel izquierdo contienen sorbitol al 5 %, y las muestras en el panel derecho no contiene sorbitol. Se designan diferentes agentes amortiguadores, que están presentes a una concentración de 10 mM como sigue: •, acetato de sodio; V, histidina; B, fosfató de potasio; ?, fosfato de sodio; y K , citrato de I ! sodio. I La escala del eje y es diferente en los paneles izquierdo y derecho. I I La Figura 21 muestra el por ciento de especie de bajo pleso molecular, LMW 1 y LMW 2, como se determina por SEC deepués de 12 semanas de incubación estática a 37 °C como una función de pH objetivo en muestras con (panel izquierdo) y sin I (panel derecho) sorbitol al 5 %. Diferentes agentes amortiguadores, que están presentes a una concentración de 10 mM, se designan como se describe en la descripción de la Figura, 20. Se omiten las muestras, diferentes de aquellas de pH 4 objetivo, que están más de 0.4 unidades de pH del pH objetivo. ¡ La Figura 22 muestra el por ciento de dímero como se detjermina por SEC después de 12 semanas de incubación estática a 37°C como una función del pH objetivo muestras i con (p¿nel izquierdo) y sin (panel derecho) sorbitol al 5 %. Diferentes amortiguadores, que están presentes a una concentración de 10 mM, se designan como sigue: •, acetato de sodio; V, histidina; •, fosfato de potasio; A, fosfato de sodio; y X, citrato de sodio. Se omiten las muestras, diferentes de aquellas de pH 4 objetivo, que están más 0.4 unidades de pH del pH objetivo. Las líneas a lo largo del fondo de la figura representan el por ciento del dímero en el punto de tiempo cero para varias muestras, que fueron todas muy similares. | La Figura 23 muestra el por ciento de monómero como se determina por SEC como una función del pH objetivo para muestras que contienen ya sea FPB (panel izquierdo) o la mezcla IsoBulk (panel derecho, descrito en detalle en el Ejemplo 4 y Tabla 5) después de 12 semanas de incubación estática a ya sea 4°C (círculos cerrados) o 37°C (círculos abiertos). Todas las muestras contuvieron sorbitol. El pH objetivo estuvo muy cerca al pH real. Las muestras a pH 4 y se formularon en acetato de sodio 10 mM. Las muestras a pH 6 se formularon a histidina 10 mM. Las muestras a pH 7 y 8 se formularon en fosfato de sodio 10 mM. ¡ La Figura 24 muestra la pérdida neta en el por ciento! de monómero como se determina por SEC después de ocho semanas I de incubación estática a 37 °C para muestras i individuales que contienen ya sea una isoforma purificada individual o mezclas de dos, tres, cuatro, cinco u ocho diferentes isoformas, como se indica. Todas las muestras se formularon en sorbitol al 5 %, acetato de sodio y 10 mM, pH . Los¡ datos para isoformas purificadas individuales son de los experimentos descritos en el Ejemplo 2. Los datos para i las mezclas de isoformas se derivan de experimentos descritos en los Ejemplos 3 y 4. El número cerca de los puntos de datos para las muestras que contienen uno o dos isofortias indican que las isoformas incluyen en la muestra. Hay muestras que contienen tres, cuatro y cinco isoforjnas son A5S (-1, -2, -3), A5S (1, 2, 3, 4), y A5S (IsoBulk), respectivamente. Estas se describen en el Ejemplo 4 y Tabla 5. La muestra que contiene ocho isoformas es FPB. La Figura 25 muestra la pérdida neta en el por ciento de monómero como se indica por SEC después de ocho semanas de incubación estática a 37 °C para muestras individuales que contienen ya sea una isoforma purificada individual o mezcla de dos, tres, cuatro, cinco u ocho diferentes isoformas, como se indica. Todas las muestras se formularon en sorbitol al 5 %, histidina a 10 mM, pH 6. Los datos ¡para isoformas purificadas individuales son de los experimentos descritos en el Ejemplo 2. Los datos para las mezcla? se derivan de experimentos descritos en los ejemplos 3 y 4 ' Los números cerca de los puntos de datos para las muestras contienen una o dos isoformas indican que las isoformas se incluyen en la muestra. Las muestras que contienen tres y cinco isoformas son H6S (-1, -2, -3) y H6S I (IsoBulk), respectivamente. Estas se describen en el Ejemplo 4 y Tabla 5. La muestra que contiene ocho isoformas es FPB. ! ¡ Breve Descripción de los Listados de Secuencia Tabla 1 No. de Id. de Breve Descripción Secue ncia SEQ I D NO: La secuencia de aminoácidos codificada por el 3 segmento 5-a de VH humano SEQ I D NO: La secuencia de aminoácidos codificada por el 60 segmento VKIII/A27 de V? humano I I Descripción Detallada de la Invención Se puede formular un anticuerpo para estabilizar su estructura física y actividad biológica. Un aspecto particularmente importante para estabilizar un anticuerpo es inhibir o prevenir la agregación del anticuerpo puesto que los anticuerpos agregados pueden ser más inmunogénicos que los mo'nómeros. Ver, por ejemplo, Hermeling et al. (2004), Pharm. Res. 21(6): 897-903. Las respuestas inmunitarias a i un producto terapéutico pueden introducir efectos secundarios indeseados o disminuir la efectividad del anticuerpo. La presente invención proporciona composiciones y métobos para la formulación de anticuerpos, opcionalmente composiciones y métodos para la formulación de preparaciones purificadas de anticuerpos monoclonales que son heterogéneas, por ejemplo, debido a diferencias en la glicosilación. ' Los parámetros importantes para la estabilización de anticuerpos incluida en la pureza y grado de heterogeneidad del anticuerpo, el pH, y el agente amortiguador. Otros atributos de una composición, tal como sales, i carbohidratos y/o azúcares, aminoácidos, y/o muchos otros ¡ingredientes, también pueden afectar la estabilidad del anticuerpo. También puede afectar la estabilidad, la concentración del anticuerpo. Diferentes anticuerpos pueden ser sensibles a algunos atributos de una composición y no a i otros.. La invención se refiere a métodos para estabilizar i preparaciones purificadas de anticuerpos monoclonales, composiciones estables que comprenden estos anticuerpos, y a métodos para usar estas composiciones para tratar ciertas enfermedades . ¡ En algunas modalidades, los anticuerpos de la invenc-.ón son "heterogéneos". Una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal es heterogénea, como significa en la presente, se comprende "variantes estructurales" plurales, aunque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y sustancialmente todas las moléculas del anticuerpo en la preparación purificada tengan secuencias de aminoácidos idénticas. La heterogeneidad puede surgir, por ejemplo, de glicosilación heterogénea, heterogeneidad en formación de enlace de disulfuro, y/o heterogeneidad en plegado de proteínas, entre otras posibilidades. No incluidas entre "varia?tes estructurales", como se propone en la presente, están las variantes con diferentes secuencias de aminoácidos tal cómo por ejemplo, variantes que carecen de usinas C-terminales o glutaminas N-terminales ciclisadas. Ver por ejemplo, Moorhouse et al. (1997), J. Pharmaceut. Biomed.

Analysis 16:593-603. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal heterogéneo puede ser un anticuerpo de IgG que tiene un sitio |de N-glicano o sitio de O-glicano diferente del sitio de N-glicano altamente conservado en el dominio CH2 de la cadena pesada de IgG. Este sitio de N-glicano conservado está ivirtualmente sin sialilar y es importante para funciones efectoras de un anticuerpo. Ver por ejemplo, Wright y Morrison (1997), TIBTECH 15: 26-32; Tao y Morrison (1989)¡, J. Immunol. 143: 2595-2601; Sheeley et al. (1997), Analytical Biochem. 247: 102-10. Pueden presentarse otros sitios! de N-glicano o sitios de O-glicano en otra parte de la sequencia de aminoácidos en anticuerpo, opcionalmente en una región variable de cadena pesada o ligera o en las regiones CL, CHi, CH2, o CH3, y se pueden sialilar a grados variables, generando de esta manera diferentes variantes estructurales con diferentes cargas. Estas variantes diferentemente cargadas se refieren en la presente como "isoformas". De manera alternativa, una preparación heterogénea de anticuerpo puede comprender variantes estructurales que están plegadas de manera diferente, y las variantes diferentemente plegadas pueden tener diferentes patrones de unión de disulfuro y pueden ser separables por cromatografía en columna. Una preparación heterogénea de anticu rpo puede exhibir diferentes características de estabilidad que una preparación homogénea, y diferentes preparaciones homogéneas que comprenden variantes estructurales aisladas pueden exhibir diferentes i características de estabilidad entre sí. De esta manera, las composiciones que comprenden sólo una variante estructural o combinaciones de variantes estructurales pueden ser composiciones estables adecuadas para comercilalización. Para determinar si la heterogeneidad observada de una preparación purificada de anticuerpo es debida a glicosiilación heterogénea entre N-glicanos, se pueden analizar muestras de una preparación purificada de anticuerpo por cromatografía de intercambio catiónico, como se describe en el Ejemplo 1, tanto con como sin digestión con péptidos: N-glicosiladas F (PNGasa F) . Debido a que la I PNGasa F remueve los N-glicanos de una proteína, la muestra digerida por N-glicanasa se esperará que exhiba poca o ninguna heterogeneidad en comparación a la muestra no digerida si la heterogeneidad observada en la muestra no digeriqa fue debida a glicosilación heterogénea. Se puede llevar ¡ a cabo la digestión con PNGasa esencialmente como se recomienda por un fabricante, por ejemplo, New England Biolabs (Massachussets, EUA) . New England Biolabs suministra un amortiguador de reacción 10X G7 y recomienda incubar la reacción a 37 °C en amortiguador de reacción IX (fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5) más NP-40 al 1 % . Otras enzimas que remueven específicamente los N-glicanos, tal como N-glicanasa, también se pueden usar con condiciones de reacci .ip.n apropi.ad,as para estas enzimas. I La secuencia primaria puede ser un determinante estructura del anticuerpo. En algunas ecuencia de aminoácidos de una región pesada de un anticuerpo de la invención puede ser al menos aproximadamente 80 %, opcionalmente al menos ^aproximadamente 85 % , 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, y/o SÉQ ID NO: 30. La secuencia de aminoácidos de una región] variable de cadena ligera de un anticuerpo de la invención puede ser al menos 80 % , opcionalmente al menos 85 %, 87 '%, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 8, | SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, y/o SEQ ID NO: 31. Las regiones de identidad, como se define más adelante, en cualquiera de estas comparaciones de secuencia puede ser al menos aproximadamente de 40, 50, 60, 70, 80, 90, ó 100 aminoácidos de largo. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede comprender una CDR3 de cadena pesada que I tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 7 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 36 en el mismo orden y espaciado como se presenta en SEQ ID NO: 36; o que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 37. Un "anticuerpo", como significa en la presente, se refiere a una proteína que comprende una o más cadenas de polipéptido que incluyen toda o parte de una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera y un anticuerpo, donde el anticuerpo puede unirse a un antígeno. Se describen numerosos anticuerpos que se presentan de forma natural en por ejemplo Kabat et al . (1991, Sequences of Proteins of I munological Interest, Public, Health Service N.I.H., Bethesda, MD) . Un anticuerpo puede ser capaz de modular, por ejemplo, agonizar o antagonizar, la actividad biológica del antígeno. Los "anticuerpos" incluyen anticuerpos que se presentan de forma natural, que se describen más adelante, que incluyen anticuerpos que contienen dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, así como fragmentos de anticuerpo tal como F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadena individual, y anticuerpos que comprenden regiones variables de cadena ligera o pesada individuales sin otros dominios encontrados en anticuerpos que se presentan de forma natural. Los anticuerpos de cadena individual, quiméricos, humanizados, humanos, policlonales y monocl nales son anticuerpos como significa en la presente, En ciertas modalidades, se producen anticuerpos por técnicas de ADN recombinante. En modalidades adicionales, se producen anticuerpos por escisión enzimática o química de anticuerpos que se presentan de forma natural. Los anticuerpos pueden ser de los isotipos IgG (que incluyen las subclases IgGi, IgG2, IgG3, e IgG4) , IgA (que incluyen las subclases IgAi e IgA2) , IgM, IgD, o IgE y pueden comprender cadena ligera tipo kappa o lambda. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o humanizado, un anticuerpo murino, un anticuerpo de conejo, un anticuerpo de dromedario, o cualquier anticuerpo de mamífero. Los anticuerpos usados en las composiciones y métodos de la invención son, en algunas modalidades, "anticuerpos monoclonales". Como significa en la presente, una pr paración de "anticuerpo monoclonal" contiene, para la i mayor 'parte, anticuerpos que tienen la misma secuencia de aminoácidos. En algunos casos, puede presentarse variación de secuencia de un anticuerpo monoclonal debido a eventos de post-traducción, que incluyen, por ejemplo modificación o escisián de aminoácidos. En contraste, las preparaciones de anticuerpo policlonal, que se pueden purificar, por ejemplo, de muestras sanguíneas de animales inoculados, comprenden anticuerpos con muchas secuencias diferentes de aminoácidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden hacer con cualquier medio apropiado. Por ejemplo, se pueden aislar anticuerpos monoclbnales a partir de líneas de células de hibridoma que producen un anticuerpo con una secuencia individual de aminoácidos. Estas líneas de hibridomas se pueden aislar por ell método de Kohler y Milstein (1975, Na ture 256: 495) y cultivar ya sea in vivo o in vi tro . De manera alternativa, se puelden producir anticuerpos monoclonales como sigue. Se puedeni introducir ácidos nucleicos que codifican para un anticuerpo en una línea de células hospedadoras que no i producen normalmente un anticuerpo, por ejemplo, una línea de células bacterianas, de levadura, de insecto o de i mamífero. Si la línea de células es una línea de células de mamífero, puede ser por ejemplo, una línea de células de ovario! de hámster chino (CHO) o una línea de células VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, mieloma (por ejemplo, NSO, NSl), PC12, o WI38. La línea de células que contiene los ácidos nucleicos que codifican para el anticuerpo se puede cultivar, y el anticuerpo se puede recolectar del medio de cultivo o las células. I Una "preparación purificada de un anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación en la cual al menos aproximadamente 80 %, opcionalmente al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 %, de la proteína detectable en la preparación está en el pico de monómero i (como se define más adelante) como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . El método de SEC se explica en el Ejemplo 2 y Figura 3. El pico de monómero detectado en el Ejemplo 2 contiene un anticuerpo tetramérico que comprende dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas. Sin embargo, los picos de monómero que contienen otras clases de anticuerpos (como se define anteriormente) se contemplan en la definición que es una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal. í ¡ Un "scFv" es un anticuerpo de cadena individual que ccjmprende una región variable de cadena pesada (VH) y i una rejgión variable de cadena ligera (VL) y que no comprende una región constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, los scFv también pueden comprender un ligador de longitud variable entre las regiones variables de cadena pesada) y ligera. Aunque un scFv se puede fusionar a otras secuencias de aminoácidos, la porción de una proteína referidia como un scFv no comprende de manera preferente ninguna cantidad sustancial de secuencia de aminoácidos diferente de una región VH, una región de VL y opcionalmente, un ligador que une estas secuencias. ' Una "región de Fc" de un anticuerpo es un fragmento de cadena pesada que comprende un dominio CH2 y CH3 I y una ¡región de articulación (o una porción de la misma) o una variante de este fragmento, y que no comprende un dominio CH1 o un dominio VH. Ver, por ejemplo, Kuby, Immun?logy, Second Edition, p. 110-11, W.H. Freeman y Co., New York (1994). Un fragmento de Fc puede ser del isotipo IgA, IgD, IgE, IgG, o IgA, incluyendo IgGi, IgG2, IgG3, IgG4 u otras subclases. Un "scFv-Fc" es un anticuerpo que contiene un scFv fusionado a una región de Fc . En general, los anticuerpos que se presentan de forma natural para la mayoría de los mamíferos comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Una cadena pesada comprende tres o cuatro dominio constantes, los dominios CHi, CH2 y CH3, y los anticuerpos IgE e IgM, también el dominio CH4. Una cadena pesada comprende un dominio variable, el dominio VH. Una cadena ligera comprende un dominio constante, el dominio CL, y un dominio variable, la región] VL. Las regiones variables de cadena ligera pueden corresponder a ya sea la familia lambda o la familia kappa, i que son dos grupos de cadena ligeras que se relacionan en secuenpia. Un dominio variable de cadena pesada o ligera I comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, también conocidas como regiones hipervariables, designadas CDRl, CDR2 y CDR3 por Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Healthj Service N.I.H., Bethesda, MD; ver también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Naturel 342: 877-83) incrustadas dentro de una región de estrucjtura (designadas regiones de estructuras 1-4, FR1, FR2, ER3 y FR4, por Kabat et al., supra ; ver también Chothia y Les!:, supra ) . Las CDR y los segmentos de estructura se intercalan como sigue, iniciando en el término amino de la región! variable: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos humanos o humanizados que tienen regiones de estructura humana. Las regiones variables de anticuerpo se pueden i identificar en general como tales por su secuencia primaria de aminoácidos. Las secuencias primarias de las regiones de estructura de las regiones variables de anticuerpo tienen un puñado de residuos que se conservan de manera universal a través¡ de los filos. Además, muchos residuos están altamente conservados a través de los filos y/o dentro de especi s y/o filos, y muchas posiciones dentro de los anticu rpos usualmente se ocupan por uno de un grupo conocido de aminoácidos. Ver Kabat et al., supra . De manera alternativa, o además, se puede reconocer una secuenbia como un anticuerpo por su estructura terciaria prevista. La estructura terciaria de las regiones variables, que comprende 9 hebras ß que forman una estructura conocida como un barril ß de llave griega, está extremadamente bien conservada, y las posiciones de las CDR dentro de esa estructura también están altamente conservadas. Ver, por ejemplo, Bork et al., 1994, J. Mol.

Biol. 242: 309-20; Hunkapiller y Hood, 1989, Adv. Immunol. 44: 1-63; Williams y Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405; Chothia y Lesk, supra ; Kabat et al., supra . I Las secuencias genómicas que codifican para I regiones variables de cadena pesada se han correlacionado y secuenciado. Ver, por ejemplo, Cook y Tomlinson (1995), Immunol. Today 16(5): 237-42. En la naturaleza, una región variable de cadena pesada se codifica por ADN que comprenden tres segmentos de ADN de línea germinal dispar, los segmemnttoos VH, D y JH, que se ponen conjuntamente por eventos de re-,arreglo de ADN en células que producen anticuerpo. La mayoríja de la longitud de una región variable de cadena pesada que se presenta de forma natural que codifica para el segmento de VH, que codifica aproximadamente 94 de un total de aprloximadamente 108 aminoácidos de una región variable de cadena! pesada humana. De esta manera, se puede determinar I un grupo de segmentos de VH de línea germinal, uno de los cuales! codifica parcialmente para una región variable de cadena¡ pesada particular en cuestión, en base a la similitud I de sequencia a segmentos de VH conocidos. En algunos casos, la similitud de secuencia puede apuntar a un segmento de VH de línea germinal individual como que codifica para un i anticuerpo en cuestión. Hay aproximadamente cincuenta y un segmentos de VH de línea germinal humanos funcionales, que se clarifican en siete familias por similitud de secuencias.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son i al menos aproximadamente 80 %, opcionalmente al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 95 % o 98 % idénticos a la secuenicia de aminoácidos codificada por un segmento de VH de línea germinal humano de la familia 5, opcionalmente el segmenlito 5-51 o 5-a de VH. Ver, por ejemplo, Cook y Tomlinbon (1995), Immunol . Today 16(5): 237-42. De manera altern tiva, los anticuerpos de la invención pueden ser al menos aproximadamente 80 %, opcionalmente al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, o 98 % idénticos a la secuencia de aminoácidos codificada por un segmento de VH de línea germinal humana de la familia 1, 2, 3, 4, 6 ó 7. De manera similar, el ADN que se presenta de ¡ manera' natural que codifica para una región variable de cadena! ligera humana resulta normalmente de eventos de rearreglo de ADN en células productoras de anticuerpo que se untamente en un segmento de VL de línea germinal y un segmento de JL. Se encuentran segmentos de VL y JL humanos en dos sitios o locus genéticos, uno en el cromosoma 2 y otro en el cromosoma 22, que contienen secuencias que codifican para las cadenas kappa y cadenas lambda, respectivamente. Hay aproximadamente 31 segmentos V*. humanos funcionales (que son segmentos de VL que se I codifican para cadenas ligeras tipo lambda) , que caen en las diez familias (VLl a VL10) en base a las similitudes de í secuencia. Williams et al. (1996), J. Mol. Biol. 264: 220-32. Hay aproximadamente 40 segmentos de V? de línea germinal funcionales (que son segmentos de VL que codifican I para cadena ligeras tipo kappa) , que caen en siete familias, VKI a VKVII. Los anticuerpos de la invención pueden comprender una cadena ligera kappa o lambda, opcionalmente una que comprende una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente 80 %, opcionalmente al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, o 98 % idéntica a la secuenbia de aminoácidos codificada por un segmento de V? de línea igerminal en la familia VKIII, tal como por ejemplo, VKIII/A27. De manera alternativa, la región variable de cadenat ligera puede ser al menos aproximadamente 80 %, 90 %, 95 ° / o 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por un segmento de V? en las familias VKI , VKII, VKIV, VKV, VKVI o VKVII. i Como significa en la presente, un "monómero", I cuando¡ se refiere a un anticuerpo, es un anticuerpo comple¡to, que puedes comprender más de una cadena de polipéptido. Por ejemplo, un monómero de muchos anticuerpos que s^ presentan de forma natural consiste de dos cadenas pesada^ y dos cadenas ligeras, es decir, cuatro cadenas de t polipéiptido en conjunto. Además, un monómero de algunos anticuerpos de cadena individual (un scFv que comprende una regióri variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera) es una cadena de polipéptido individual. Sin embargo, los scFv pueden dimerizarse espontáneamente debido a la longitud del ligador entre las regiones variables de cadena! pesada y ligera. En estos casos, un monómero puede ser u? scFv dimérico (o diacuerpo) . De manera similar, un monómejro de un anticuerpo de dromedario que se presenta de forma 'natural, que comprende dos cadenas pesadas y ninguna cadena ligera (Muldermans et al . , 2001, J. Biotechnol . 74:277-302; Desmyter et al . , 2001, J. Biol . Chem . 276:26285-90) o un scFv-Fc es un dímero. En resumen, un monómero es un anticuerpo completo, completo con todas las moléculas que son pa|rte del anticuerpo. Los anticuerpos "humanos" son anticuerpos que se codifican por secuencias que finalmente se derivan de una fuente humana. Por ejemplo, un anticuerpo aislado de sangre humanal es un anticuerpo humano. Un anticuerpo de una línea de cédulas de hibridoma que es una fusión de una célula productora de anticuerpo humano con una célula inmortalizada es un ¡anticuerpo humano. Además, los anticuerpos aislados de bibliotecas de fagos de ADN humano que codifica para region s variables de anticuerpo son anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos también incluyen anticuerpos con secuencias humanas producidas por animales transgénicos en las cuales las secuencias que codifican para anticuerpos humanos han remplazado al menos algunas de las secuencias que codifican para anticuerpos en el animal transgénico, tal como aquéllas descritas en por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 5,625,126 y 6,075,181. Adiciojnalmente, se puede producir un anticuerpo humano por células hospedadoras en las cuales se han introducido ácidos nucleicos de origen humano que codifican para el anticuerpo. Un antígeno "humano" es una mol'écula presente en un humano, tal como por ejemplo, una proteína expresada en un humano o un azúcar o carbohidratos encontrados en humanos, entre otras posibilidades. ¡ Los "anticuerpos humanizados" son anticuerpos en los cuales las regiones de estructura de las regiones variables de un anticuerpo son de origen humano, y las CDR se ori'ginan en otra parte. Los anticuerpos humanizados se describen en por ejemplo, patente de los Estados Unidos I número! 5,693,761. | Los anticuerpos pueden tener glicanos N- u 0-enlazados unidos a los mismos. Los glicanos O-enlazados se adicionan a algunos pero no todos los residuos de serina o treoniíjia. No hay secuencia de consenso para predecir qué I serina? o treoninas se glicosilarán, aunque se conocen I alguno^ factores predictivos. Ver Essentials of Glycobiology, Varki et al., eds., Capítulo 8, Cold Spring Harbor! Laboratory Press, New York (1999). Se adicionan glicanos N-enlazados a residuos de asparagina que se prese-nnlttaann eenn eell contexto de secuencia Asn-Xxx-Ser/Thr, donde Xxx es cualquier aminoácidos excepto prolina. Esta secuencia se refiere en la presente como un sitio de N-glicano o un sitio de N-glicosilación. Essentials of Glycobíology, Varki et al., eds., Capítulo 7, Cold Spring Harborj Laboratory Press, New York (1999). Una prolina que sigue ¡la secuencia Asn-Xxx-Ser/Thr disminuye sustancialmente la frepuencia con la cual se glicosila la asparagina. Gavel y von jleijne (1990), Protein Eng. 3(5): 433-42. I Los N-glicanos pueden tener una estructura compleja y heterogénea. Como se muestra en la Figura 1, los N-glicanos pueden tener, por ejemplo, ninguna ramificación (referido como oligosacárido de alto contenido de mannosa) , o dos, tres o cuatro ramificaciones, cada una de las cuales puede ¡terminar o no con un residuo de ácido siálico. Son posibl s estructuras diferentes de aquéllas mostradas en la Figura! 1. Las ramificaciones pueden variar en longitud. Por ejjemplo, una ramificación individual puede comprender dos o más unidades (llamadas unidades de LacNAc) que comprenden N-acetil-glucosamina y galactosa o sólo una unidad de LacNAc. Ver figuras IB a 1G. Puesto que los residuos de ácido siálico en general están cargados negativamente, se pueden separar en base a la carga los anticuerpos que comprenden diferentes números de residuos de ácido siálico, por ejemplo, por cromatografía de intercambio catión ico a aniónico. Esta heterogeneidad también se puede detectar usando geles de foco isoeléctrico, posiblemente usando electroforesis capilar. Las variantes estructurales que tienen diferentes cargas debido a diferentes números de residuos de ácido siálico se refieren en la presente como "isoformas" . Un dominio de CH2 de todas las clases de anticuerpos que se presentan de forma natural puede contener, y usualmente contiene, un sitio de glicano N-enlazado. Tao y Morrison (1989), J. Immunol. 143: 2595-2601; Wright y Morrison (1997), Trends in Biotechnol (TIBTEtH) 15: 26-32; Riott et al., IMMUNOLOGY, 3rd Edition, Mosby, , 1993. Sin embargo, el ácido siálico raramente se encuentra por arriba de las cantidades traza en anticuerpos de IgG recombinantes, sugiriendo que el sitio de N-glicano de CH2i está raramente, si está, sialilado. Harris et al. (2004) t Drug Dev. Res. 62: 137-54. Los anticuerpos de las I composiciones y métodos de la invención pueden tener un i sitio J de glicano N-enlazado en su región de Fc . Adicioijialmente, los anticuerpos usados en las composiciones y métodos de la invención pueden tener un sitio de glicano N-enlazado en otra parte, por ejemplo en un dominio ¡ variable, opcionalmente en dominio VH y/o VL, que puede tener I una va'riedad de N-glicanos unidos a éste que se pueden sialilár a grados variables. Esta glicosilación de región variable puede afectar la afinidad de unión para el antígeno, producción del anticuerpo, vida media in vivo, y dirección al órgano objetivo. Coloma et al. (1999), J. Immunol. 162: 2162-70; Gala y Morrison (2004), J. Immunol. 172: 5489-94. Los anticuerpos de los isotipos IgA, IgE, IgM e IgD en general están más altamente glicosilados que los anticuerpos de IgG. Riott et al., supra . Por lo tanto, las I preparaciones de anticuerpos monoclonales de estas subclases probablemente van a comprender variantes estructurales plurales debido a las diferencias en glicosilación, incluyendo diferencias en la sialilación. Otra manera en la cual las variantes estructurales pueden surgir es a través de formación diferencial de enlaces de disulfuro. Los anticuerpos que se presentan de forma ¡natural contienen en general enlaces de disulfuro, ambos dentro y entre cadenas de polipéptido. Por ejemplo, cada dominio constante y variable de las cadenas pesada y ligera comprende residuos de cisteína altamente conservados que pueden formar enlaces de disulfuro intra-cadena, cada i uno dej los cuales encierra un circuito de aproximadamente 60 I a 70 aminoácidos. Adicionalmente, pueden existir enlaces de | disulfúro inter-cadena entre las cadenas pesada y ligera y entre Idos cadenas pesadas. La mayoría de los anticuerpos que se presentan de forma natural pueden tener uno o más enlaces de disulfuro inter-cadena entre dos cadenas pesadas mediante residuos de cisteína en la región de articulación.

Los enlaces de disulfuro pueden formarse entre una variedad de diferentes pares de residuos de cisteína, dando variantes estructurales con diferentes patrones de enlaces de ¡ disulfµro. Estas variantes estructurales que tienen diferentes patrones de unión de disulfuro se pueden separar ¡ entre 'sí, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto desempeño de intercambio iónico (HPLC) o HPLC de fase inversa . i Los anticuerpos de la invención pueden tener características físicas particulares tal como aquéllas descritas en detalle en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos número US 2005/0004353 Al, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Entre los anticuerpos descritos en esta solicitud, hay cinco anticuerpos referidos por los números 1118, 1118*, 1119, 1121, ?y 1121*. Las secuencias de estos anticuerpos y porciones de los mismos se describen en el listado anexo de secuencias, y la identidad de las secuencias en el listado ! de sec encias se explica brevemente en la Tabla 1. En un i aspecto, un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas y dos cabenas ligeras puede ser de un isotipo IgG, IgM, IgE, IgM o gA. Si un anticuerpo es un anticuerpo de IgG, puede ser un anticuerpo de IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4. Un anticuerpo de la invención puede comprender una región variable de cadena pesada que es al menos 80 %, opcionalmente al menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 %, idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, y/o SEQ ID NO: 30. Un anticuerpo de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que es al menos 80 %, opcionalmente al menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 31. En otro aspecto, un anticuerpo de la tener secuencias particulares para sus CDR. Por ejemplo, un anticuerpo puede tener una CDR3 de cadena pesada que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: (a) una secuencia de aminoácidos que comprende al menbs 7 de los aminoácidos de SEQ ID NO: 36 en el mismo orden y espaciado como se presenta en SEQ ID NO: 36; o (b) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 37. Como se usa en la presente, cuando una primera secuencia consiste de, por ejemplo, 10 aminoácidos de la secuencia RASQSVSSSY (SEQ ID NO: 56), otra secuencia tiene 7 aminoáóidos en el "mismo orden y espaciado" como se presenta en la primera secuencia si los 7 aminoácidos son idénticos a aquéllos de la secuencia y se presentan en las mismas posicifnes relativas como se presentan en la secuencia. Por ejemplo, una secuencia RAAAAVSSSY (SEQ ID NO: 57) tiene 7 aminoácidos en el mismo orden y espaciado como se presentan en RASQSVSSSY (SEQ ID NO: 56) . En contraste, esto no es ¡ "Identidad" se refiere a una comparación entre pares de moléculas de ácido nucleico o aminoácido. Los método^ para determinar la identidad de secuencia se conoce-}-. Un programa de computadora preferido de ejemplo es el programa versión 10.0 del paquete Wisconsin de Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wl), "GAP" (Devereux et al . , 1984, INuc-Z . Acids . Res . 12: 387; Smith y Waterman, 1981, i Adv. Appl . Ma th , 2:482-489). Los parámetros por omisión i I preferidos para el programa "GAP" incluyen: (1) la impleméntación GCG de una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación de aminoácidos ponderados de Gribskov y Burgess, Nucí . Acids Res . 1X6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Págs. 353-358, 1979; u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalidad de 30 para cada separación y una penalidad adicional de 1 para cada ¡símbolo en cada separación para secuencias de aminoácidos, o penalidad de 50 para cada separación y una penalidad adicional de 3 para cada símbolo en cada separación para secuencias de nucleótidos; (3) ninguna penalidad para separaciones terminales; y (4) ninguna penalidad máxima para separaciones largas. Al determinar la GAP, se pueden alinear dos secuencias sobre parte jo toda su longitud. Esta porción alineada se refiere en la presente como una "región de identidad". Los polipéptidos "sustancialmente similares", como significa en la presente, son al menos aproximadamente 90 % idénticos entre sí en la secuencia de aminoácidos y mantienien o alteran de una manera deseable la actividad biológica del polipéptido no alterado. Una "proteína recombinante" o "anticuerpo recombinante" es una proteína o anticuerpo producido por células hospedadoras que no se producen naturalmente por las células. Las células hospedadoras producen la proteína o anticuerpo recombinante como resultado de la introducción de secuencias de ácido nucleico que permiten la expresión de la proteína o anticuerpo en células hospedadoras usando métodos de "ingeniería genética", tal como infección viral con un virus recombinante, transfección, transformación, bombardeo con mlicroproyectiles revestidos con ácidos nucleicos, electroporación, entre otros métodos para introducir ácidos nucleicos en células. i En algunas modalidades, un anticuerpo puede unirse específicamente a IFN-?, opcionalmente IFN-? humano. El anticuerpo también puede unirse a otros antígenos, que I pueden1 ser o no proteínas. Los anticuerpos contenidos en i las composiciones de la invención pueden ser idénticos o i sustan|cialmente similares a un anticuerpo que se presenta de i forma i natural y/o pueden ser, o no, una proteína I recombinante. Opcionalmente, el antígeno al cual se une el anticuerpo puede comprender un polipéptido humano, un fragmento del mismo, o un polipéptido sustancialmente similar que es al menos de 10 aminoácidos de longitud. I En general, los métodos y composiciones de la invención son útiles para estabilizar anticuerpos que se I unen a1 cualquier molécula, por ejemplo, todo o parte de uno de los siguientes polipéptidos. Un ligando flt3 (como se describe en la Solicitud Internacional WO 94/28391, incorporada en la presente como referencia) , un ligando CD40 (como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,087,329 incorporada en la presente como referencia), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, Tek, Tek-delta, Tie-2, leptina, IL-2, angiopoyetina-2 (como se describe por I Maisonpierre et al. (1997), Science 277 (5322): 55-60, incorporada en la presente como referencia) , ligando Fas, ligando para activador de receptor de NF-kappa B (RANKL, como s e describe en la solicitud Internacional 29 01/36637, incorporada en la presente como referencia) , ligando inductor de apóptosis relacionado a factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, como se describe en la Solicitud Internacional WO 97/01633, incorporada en la presente como referencia) , linfopoyetina derivada de estroma químico, factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, como se describe en la Patente Australiana No. 5888191, incorporada en la presente como referencia) , factor de crecimiento de células cebadas, factor de crecimiento de células madre (como se describe por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 6,204,363, incorporada en la presente como referencia) , factor de crecimiento epidérmico, factor i I de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento y I desarrollo de megacariocitos, RANTES, hormona de I crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento tipo insulina, hormona paratiroide, interferones ! que incluyen a-interferones, ?-interferón, e interferones de consenso (tal como aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,695,623 y 4,897,471, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia) factor de crecimiento de nervios, factor neurotrófico derivado del cerebro, factores neurotróficos derivados de células guales que incluyen GDNF, proteínas tipo sinaptotagmina (SLP 1-5) , neurotrofina-3, glucagon, interieucinas 1 hasta 18, factores estimuladores de colonias, linfotoxina-ß, factor de necrosis tumoral (TNF) , factor inhibitorio de leucemia, oncostatina-M, y ' varios ligandos para las moléculas de superficie celular ELK y Hek (tal como los ligandos para las cinasas relacionadas a eph o LERKS) . Las descripciones de polipéptidos que se pueden producir de acuerdo a los métodos inventivos se pueden encontrar por ejemplo en Human Cytokines; Handbook for basic and Clinical Research, Vol. II (Aggarwal y gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 19,98); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, ¡eds., Oxford University Press, Inc., New York, 1993); y The ^ytokine Handbook (A.W. Thompson, ed. Academic Press, i San Diego, CA, 1992), todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. . Otros antígenos a los cuales los anticuerpos i usados ¡ en las composiciones o métodos de la invención se i pueden ¡ unir incluyen toda o parte de la secuencia de i aminoácidos de un receptor para cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente o un antagonista a este receptor, incluyendo lo siguiente: ambas formas de receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR, referido como p55 y !p75, como se describe en la Patente de los Estados i I Unidos No. 5,395,760 y Patente de los Estados Unidos No. 5,610,279, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia, incluyendo la proteína de fusión etanercept, que se comercializa como ENBRELMR, receptores de Interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; descritos en la Patente EP No|. 0,460,846, Patente de los Estados Unidos No. 4,968,607 y Patente de los Estados Unidos No. 5,767,064, I todas ! las cuales se incorporan en la presente como referencia) , antagonistas de receptor de IL-1 tal como i aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No.

I 6,337,072, incorporada en la presente como referencia), antagonistas o inhibidores de IL-1 (tal como aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. i 5,981,713, 6,096,728 y 5,075,222, todas las cuales incorporadas en la presente como referencia) , receptores de i IL-2, receptores de IL-4 (como se describe en la Patente EP No. 0,367,566 y Patente de los Estados Unidos No. 5,856,296, I I ambas ¡de las cuales se incorporan en la presente como referencia), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptor de factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos, receptor de factor estimulador de colonia de granulocitos, receptores para ! oncostatina-M y factor inhibidor de leucemia, activador de I receptor para NF-kappa B (RANK, descrito en la WO 01/36637 y la Pate¡nte de los Estados Unidos No. 6,271,349, ambas de las cuales se incorporan como referencia) , osteoprotegerina (descrita por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 6,315,938, incorporada como referencia), receptores para i TRAIL '(incluyendo los receptores 1, 2, 3 y 4 de TRAIL) , y receptores que comprenden dominios muertos, tal como el I Receptor Inductor de apóptosis o Fas (AIR) . Otros antígenos a los cuales los anticuerpos usados, en las composiciones o métodos de la invención pueden i unirse) comprenden toda o parte de la secuencia de aminoácidos de antígenos de diferenciación (referidos como polipéptidos de CD) o sus ligandos o polipéptidos sustanbialmente similares a cualquiera de estos. Estos antígemos se describen en Leukocyte Typing VI ( Proceedings of t?e VIth Interna tional Workshop and Conference, Kishim?to, Kikutani et al., eds., Kobe, Japón, 1996, que se incorpora como referencia) . Estos polipéptidos de CD se describen en trabajos subsiguientes. Los ejemplos de estos antíge?os incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos a éstoá (ligando de CD27, ligando de CD30, etc.). Varios de i los antígenos de CD son miembros de la familia de receptores de TNF, que también incluye 41BB y OX40. Los ligandos son frecuentemente miembros de la familia de TNF, como son el ligando 41BB y el ligando 0X40. Por consiguiente, los miembros de las familias de TNF y TNFR también pueden ser antígenos a los cuales pueden unirse los anticuerpos estabilizados por los métodos de la invención. Los anticuerpos estabilizados por los métodos y composiciones de la invención también pueden unirse para activar enzimáticamente polipéptidos o sus ligandos. Los ejemplos incluyen polipéptidos que comprenden todos o parte de uno de los siguientes polipéptidos o sus ligandos o un polipé tido sustancialmente similar a uno de éstos: miembros de la| familia de metaloproteinasa-disintegrina, varias cinasaf, glucocerobrocidasa, superóxido-dismutasa, activador I de pl|asminógeno de tejido, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, Enzima Converíidota de TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y numerosas enzimas diferentes y sus ligandos. i Las composiciones y métodos de la invención se pueden i usar adicionalmente para estabilizar anticuerpos que se unen los siguientes antígenos CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1) , CD86 (B7.2) , CD147, IL-la, IL-lß, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-Í IL-10, receptor de IL-2, receptfr de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunic^ades del receptor de IL-18, PDGF-ß y análogos de los mismos ¡ (tal como aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,272,064 y 5,149,792), VEGA, TGF, TGF-ß2, TGF-ßl, receptor de EGF (incluyendo aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6,235,883 Bl, incorporada como referencia) , receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligandos de osteoprotegerina, interf ron-gamma, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1, y zTNF4; ver Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), complemento de C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumora-. MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con cáncer de pulmón), HER-2, una glicoproteína asociada a tumor TAG-72, el antígeno SK-1, epitopos asociados a tumor que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epitopos asociados a cáncer o polipéptidos expresados en células de cáncer de mama, colon, células escamonas, próstata, pancreático, pulmón y/o riñon y/o en células de melanona, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina-alfa 4-beta 7, la integrina VLA-4, ' integrinas B2, c-MET, MET, receptores 1, 2, 3 y 4 de TRAIL, | RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM) , molécula-3 de adhesión intracelular (ICAM-3), adhesina de I leucoi?tegrina, la glicoproteína gp Ilb/IIIa de plaquetas, cadena ! pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroide, rNAPc2 , (que es un inhibidor del factor Vlla-factor de tejido!), MHC I, antígeno carcinoembriónico (CEA), alfa-fetoproteína (AFP) , factor de necrosis tumoral (TNF) , CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxico) , el receptor de Fc-?-1, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, L-selectina, Virus Sincitial Respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de hepatitis B (HBV) , Streptococcus mutans, y Staphlycoccus aureus . Los anticuerpos estabilizados por los métodos y composiciones de la invención pueden ser anticuerpos anti-idiotípicos, incluyendo anticuerpos anti-idiotípicos contra: un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliosido GD3; un anticuerpo contra el ganlgliosido GD2; o anticuerpos sustancialmente similares a éstos. i Una composición farmacéutica de la invención se considfra que es "estable", como significa en la presente, i I el anticuerpo retiene esencialmente su estructura química y i física I de inicio y actividad biológica de inicio después del almacenamiento a 4°C durante 2 años. Se puede medir la estructura física y actividad biológica en una variedad de formas,1 por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño,! cromatografía de fase inversa, ensayo A549, y/o emisión de fluorescencia, como se explica en el Ejemplo 2, entre 'otros muchos posibles ensayos. Un método o composición es "estabilizador" si promueve la retención sustancial de las características del material de inicio como sb mide por al menos uno de estos métodos. I Una composición farmacéutica "liofilizada" que es una composición secada por congelación, se puede describir como i que contiene ciertas moléculas en ciertas concentraciones y/o que está a un cierto pH. Como significa comprende al menos un agente amortiguador y un anticuerpo, y opcionalmente, al menos un compuesto estabilizante, tal como por ejemplo, un azúcar, un carbohidrato, una sal, un aminoácido, o un agente tensioactivo. Un experto en la i técnica está consciente de qué componentes diferentes de un i agente! amortiguador frecuentemente están contenidos dentro de una! composición farmacéutica que comprende un anticuerpo. Por ejemplo, una composición farmacéutica frecuentemente es tal las Una composición isotónica tiene en general una presión osmótica de aproximadamente 250 a aproximadamente 350 mOsm. Se pueden usar varias clases de solutos, por ejemplo azúcares, polisacáridos, carbohidratos, o sales, para hacer una solución isotónica, es decir, para tonificarla. El agente amortiguador puede ser, por ejemplo, cualquíiera de los siguientes o sales de los mismos: succinato, histidina, acetato, gluconato, citrato, ácido tartárico, ácido málico, ácido láctico, ácidos orgánicos, Tris, ! bis-Tris, mono-Tris, ácido pirofosfórico, fosfato, propionato, ácido carbónico, sulfato, ácido 3- (N-morfolino) propanpsulfónico (MOPS), ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinaetanosulfónico (HEPES, N-tris (h?droximetil)metilglicina (TRICINA) , N,N-bis(2-hidroxietil) glicina (BICINA) , ácido N-(2-acetamido) iminodiacético (ADA), ácido N- (2-acetamido) -2-aminoetanosulfónico (ACES) , imidazol, aminoetanosulfonato o derivafo del mismo (tal como sulfonato de i tris (hidroximetil) -metil-2-aminoetano, también conocido como TES, o* un ácido 2-morfolinoetanosulfónico, también conocido como MES) , aminopropanosulfonato o un derivado del mismo, ácido foxálico, ácido fumárico, y dietanolamina. Las sales de los agentes amortiguadores mencionados anteriormente ¡ pueden ¡ incluir sales de sodio, magnesio, calcio, cloruro y/o potasio, entre otras. Por ejemplo, se incluyen fosfato de sodio, ' fosfato de potasio, cloruro de histidina, Tris-HCl, , I acetato de sodio, acetato de potasio, succinato de sodio, succinato de potasio, dentro del alcance de los agentes de amortiguadores contemplados en la presente. El pH de la composición puede ser de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 9, opcionalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.5, e aproximadamente 4.5 a aproximadamente 6.5, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.5, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.5, de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3, aproximadamente 5 o aproximadamente 6. La concentración del agente amortiguador puede ser al menos aproximadamente 0.5 mM y no más que aproximadamente 300 mM. En algunas modalidades, la concentración del agente amortiguador puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM. i ; Una composición de la invención puede comprender una sajl, un carbohidrato, un agente tensioactivo y/o un i azúcar,¡ entre otras posibilidades, que pueden servir para tonificar la formulación. Las sales de ejemplo incluyen sales ble sodio, potasio, magnesio y calcio, tal como por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio o cloruro de calcio, entre otras. Se pueden usar sales a concentraciones de al menos aproximadamente 1, 5 ó mM y no más de aproximadamente 300, 200, 100, 50 ó 30 mM. Se contemplan concentraciones de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 175 mM y de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 150 mM. I Los azucares, polisacáridos y/o carbohidratos de ejemplo incluyen sacarosa, dextrosa, sorbitol, mannitol, xilitoµ., eritritol, treitol, glicerol, polietilenglicol, ácidos! de azúcares, glucosa, fructosa, mañosa, maltosa, maltro :r?losa, lactosa, lactulosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa, rafinosa, polisacáridos tal como dextrano, alginatos, ácido hyalurónico, o celulosa, entre otros. Sus azúcares, polisacáridos y/o carbohidratos se pueden usar a varias concentraciones incluyendo, por ejemplo, desde aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 25 %, desde aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % . Los agentes tensioactivos de ejemplo incluyen polisorbatos, incluyendo polisorbato 20 y polisorbato 80, y poliaxmeros, incluyendo poliaxmero 188. Esto se puede usar a concentraciones desde aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 0.1 %, opcionalmente desde aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.01 %. El pH y/o el agente amortiguador específico de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo puede afectar la estabilidad de la composición. Diferentes pH y/o agentes amortiguadores pueden estabilizar diferentes anticuerpos o diferentes variantes estructurales o combinaciones de variantes estructurales de un anticuerpo individual. Se pueden medir varias propiedades físicas y biológicas de un anticuerpo. Por ejemplo, la cromatografía de exclusión de tamaño puede determinar si un anticuerpo se ha escandido en piezas más pequeñas que el tamaño completo o se ha agregado en dímeros o agregados de mayor orden. La cromatografía de fase inversa también puede proporcionar información de si un anticuerpo se ha escindido en fragmentos más pequeños. Además, la longitud de onda de emisión fluorescente máxima (que se puede expresar como una I relación entre dos longitudes de onda) se puede determinar por espectroscopia de fluorescencia. Los cambios en esta longitud de onda pueden indicar un cambio en la estructura secundaria o terciaria de un anticuerpo. Los cambios del pH i pueden afectar diferentes aspectos de la estructura física de diferentes maneras. Además, los efectos en la actividad ! biológica pueden mostrar o no una clara relación a los efectos en la estructura física. Se puede medir la actividad biológica por la unión a un antígeno, por ejemplo usando , un ensayo de ELISA, usando un ensayo in vi tro basado en células, o usando un ensayo in vivo .

| La unión específica a interferon-gamma, se puede medir ¡esencialmente como se describe por Fishwild et al . , 1996 Na ture Biotechnology 1_4_: 845-851. De forma breve, se pueden revestir placas de microtítulo usando aproximadamente 50 µl/cavidad de una solución de IF?-? a una concentración de aproximadamente 1-2 µg/ml en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y bloquear usando suero de pollo al 5 % en PBS. i Las placas entonces se pueden incubar de manera subsiguiente con los anticuerpos que se prueban para la unión y con anticuerpos que se unen a los anticuerpos que se prueban (por ejemplo, un anticuerpo de Fc anti-IgGl humana se un^rá a los anticuerpos de prueba de IgGl de longitud completa humana) conjugados a peroxidasa de rábano. Finalmente, se puede adicionar un sustrato detectable de peroxidasa de rábano tal como ácido 2, 2' -azino-bis [3-etilbehziazoleno-6-sulfónico] (ABTS) , y se puede medir la absorbancia 490 y 415 nm. La absorbancia 490 nm se sustrae de aquella a 415 nm. Es deseable un pH y/o un agente amortiguador que aumente al máximo la cantidad de anticuerpo que tiene actividad biológica, actividad de unión, o la cantidad de anticuerpo en forma de monómero. Las placas se pueden! lavar extensivamente entre los pasos con Tween 20 al 0.5 % en PBS. Se puede usar este ensayo bien conocido (ELISA) para la unión del antígeno para probar la unión a casi c alquier antígeno. i Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser composiciones líquidas, liofilizadas o congeladas. Una composición líquida o congelada puede haber sido anteriormente liofilizada o no. Una composición líquida puede haber sido congelada o no. El IFN-? es un regulador positivo importante de algunos aspectos de la función inmunitaria. La inhibición de la actividad biológica del interferon-gamma por lo tanto puede I ser de una manera para contrarrestar varias enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias. Se conocen en la técnica varios anticuerpos de IFN-? que pueden inhibir su actividad biológica. Las solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2005/0004353 y 2003/0049647. Estos anticuerpos pueden ser útiles al tratar varias enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias. Ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,036,956, 6,333,032 y 1 En la técnica son bien conocidos numerosos métodos para producir y purificar anticuerpos, y se puede usar cualquiera de éstos para producir los anticuerpos usados en los métodos y composiciones de la invención. Los métodos de ejemplo se describen por ejemplo en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0004353. Por ejemplo, los anticuerpos usados en los métodos y composiciones de la invención se pueden producir al inocular un mamífero con un antígeno y al recolectar anticuerpos policlonales contra el antígeno de la sangre. De manera alternativa, se pueden recolectar células del vaso del mamífero inoculado y fusionar las células inmortalizadas para producir líneas de hibridoma que producen y segregan anticuerpos monoclonales.

Estas líneas se pueden seleccionar de líneas que producen anticuerpos que se unen al antígeno. Adicionalmente, se pueden clonar en bacterias ácidos nucleicos que codifican para el anticuerpo. En algunas modalidades, los anticuerpos se pueden producir por las bacterias. De manera alternativa, se puede introducir ADN que codifica para el anticuerpo en una célula hospedadora o eucariótica, tal como i una célula de levadura, o de mamífero, de planta o de insecto, y el anticuerpo se puede producir por la célula de mamífero. Si la célula es una célula de mamífero, puede ser I una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula VERO, ¡BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, ! mieloma (por ejemplo, NSO, NSl, PC12 o W138. Se pueden purificar anticuerpos por cualquiera de una combinación de los muchos métodos conocidos en la i técnica de purificación de proteínas. Ver, por ejemplo Protein Purification Applications, A Practical Approach, Harris y angal, eds., IRL Press at Oxford University Press, 1990; Wheelwright, Proteina Purification: Design and Scale up of! Downstream Processing, Hanser Publishers, 1991; Scopesi, Protein Purification, Principies and Practice, Third Edition, Springer Verlag, 1993; Gagnon, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems, Inc., 1996. Un método muy común de purificación para anticuerpos es cromatografía de proteína A. r Las composiciones de la invención se pueden usar como tratamientos para una variedad de trastornos. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a interferón-gamma se pueden usar para tratar lupus eritematoso, y varias enfermedades autoinmunitarias incluyendo esclerosis múltiple, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, artritis psoriática, enfermedades inflamatorias del intestino tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. Ver Patentes de los Estados ! Unidos! Nos. 6,036,956, 6,333,032 y 6,558,661. Se conocen en la técnica muchos otros usos de otros anticuerpos, tal como por ejemplo, el uso de anticuerpos anti-receptor de TNF para tratar) artritis reumatoide o el uso de anticuerpos anti-receptpr de EGF para tratar cáncer. Se pueden usar anticu rpos para tratar canceres que incluyen, por ejemplo, osteosarcomas, glioblastomas, gliomas, melanomas, y meningjlomas, y cánceres de pulmón, mama, cabeza y cuello, I vejigal ovario, piel, próstata, cervical, gástrico, células renal,' pancreático, colorectal, endometrial y esofagial. Como se usa en la presente, "cáncer gastrointestinal" abarca I cáncer s gástrico, esofágico, pancreático y colorectal. También tratable usando los métodos de la invención son los cánceres hematológicos. El tratamiento de una enfermedad abarca el alivio I I de al menos un síntoma del trastorno, una reducción en la severidad de la enfermedad, o retraso o prevención del progreso a una enfermedad más seria que se presenta con alguna frecuencia después de la condición tratada. Tratamiento no significa que se cure totalmente la enfermedad. Un agente terapéutico útil necesita sólo reducir la severidad de una enfermedad, reducir la severidad de los síntomas asociados con la enfermedad o su i tratamiento, o retrasar el comienzo de una enfermedad más seria que pueda presentarse con alguna frecuencia después de la condición tratada. Como significa en la presente, se puede ¡valorar la severidad de la enfermedad por métodos conocidos en la técnica y usar para valorar la severidad de la enfermedad en ambientes clínicos. Las composiciones se pueden administrar por I cualquier ruta adecuada. Se pueden inyectar, por ejemplo, ') de forma subcutánea, intramuscularmente, intraarXicularmente, de manera intramuscular, intraarXerialmente, de forma intraperitoneal o directamente en un área afectada del cuerpo tal como por ejemplo, una articulación o un tumor. La composición se puede I administrar por infusión o por inyección de bolo, En algunaf modalidades, se puede administrar una composición por absorción a través de una membrana mucosa, tal como administración nasal, rectal, gástrica o vaginal o por inhalahión. Se pueden administrar de manera trasdérmica, i como supositorios insertados en una cavidad corporal, o como gotas ¡para ojos. De manera alternativa, se pueden tomar oralmente. i Las composiciones de la invención se pueden administrar a una "dosis terapéuticamente efectiva", es decir, a cualquier dosis, frecuencia y duración que puede ser efjectiva para tratar la condición que se trata. Un experto en la técnica caerá en la cuenta que esto depende de la naturaleza molecular del anticuerpo, la concentración in i vivo bel antígeno al cual se une, y la naturaleza y I severibad del trastorno que se trata, entre otras consideraciones. Se puede continuar el tratamiento en tanto que se necesario para lograr los resultados deseados. Se pueden | administrar moléculas terapéuticas de la invención como una dosis individual o una serie de dosis dadas periódicamente, incluyendo múltiples veces por día, i diariamente, cada día diferente, dos veces por semana, tres veces por semana, semanalmente, cada semana diferente, mensualmente, cada mes diferente, cada 10 semanas y cada 12 semanas entre otros posibles regímenes de dosis. La periodicidad del tratamiento puede ser constante o no a todo lo largo de la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede presentarse inicialmente en intervalos semanales y presentarse finalmente cada semana diferente, los tratamientos que tienen duraciones de días, semanas, meses ¡o años se abarcan por la invención. Se puede descontinuar el tratamiento y luego restaurar. Se pueden dosis de mantenimiento después de un tratamiento Las composiciones de la invención se pueden administrar ya sea solas o en combinación con otros i tratamientos, específicamente tratamientos que normalmente se administran para tratar la enfermedad. ! La dosis se puede medir como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro 'cuadrado de supervisión de piel (mg/m2) o como una i dosis fija, a pesar de la altura o peso. Todas éstas son unidade Is estándar de dosis en la técnica. El área superficial de la piel de una persona se calcula de su altura ' y peso usando una fórmula estándar. Cada dosis puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente. Opcionálmente, la dosis puede ser de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 0.01 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg o aproximadamente 1.0 mg/kg. Un experto en la técnica está consciente que la concentrada . En algunas modalidades, las composiciones y métodos de la invención requieren que los anticuerpos estén a una ¡concentración de menos de aproximadamente 50 mg/ml, opcionalmente menos de o igual a aproximadamente 45, 40, 35, , 25, 10, 5, 1 ó 0.1 mg/mL. De manera alternativa, o además,¡ las composiciones y métodos de la invención pueden requerir que los anticuerpos estén a una concentración mayor I que o ¡igual a aproximadamente 0.01, 0.1, 1.5, 10, ó 50 mg/ml, opcionalmente, mayor que o igual a aproximadamente 75 mg/ml, ¡ aproximadamente 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, o 250 mg/ml. Un experto en la técnica está consciente que las composiciones de mayor o menor concentración pueden ser apropiadas para ciertas rutas diferentes de administración para anticuerpos particulares. Adicionalmente, la concentración del anticuerpo puede afectar qué formulación puede ser óptima para un anticuerpo, De esta manera, diferentes formulaciones pueden ser apropiadas para el mismo anticuerpo a diferentes concentraciones. Las dosis efectivas requeridas para diferentes anticuerpos pueden ser muy diferentes, dependiendo de factores tal como afinidad de unión, | constante de disociación, y la abundancia del antígeno al cual se une el anticuerpo. Por lo tanto, las composiciones que tienen diferentes concentraciones de anticuerpos serán apropiadas en diferentes casos. Adicionalmente, cuando se administra subcutáneamente un anticuerpo, se limita el volumen que se puede administrar de esta manera. Por lo tanto, una composición de anticuerpo que se administra de manera subcutánea puede estar más concentrada que una composición del mismo anticuerpo que se administra por ejemplo por infusión intravenosa. La invención que se ha descrito, los siguientes ejemplos ofrecen a manera de ilustración y no de limitación. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad.

Ejemplqs Ejemplo 1: Purificación de Isoformas En los siguientes experimentos, el anticuerpo usado fue un anticuerpo de IgGl humano de longitud completa contra IFN-? humano que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras producidas por células de mamífero cultivadas (células CHO) , y sus secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera se describen en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de sitios de N-glicano en los aminoácidos NO: 17, y en las regiones de VH y CH2, respectivamente. En este ejemplo, se aislaron isoformas que tienen diferentes números de ácidos siálicos por molécula. El material de anticuerpo en volumen se refiere a preparaciones de anticuerpo en volumen (referidas en la t I presente como FPB) purificadas, filtradas, que se han purifisado usando varios pasos de cromatografía en columna en los cuales las varias variantes estructurales, incluyendo las isoformas, no se han separado una de la otra. Se purificó material de anticuerpo en volumen (FPB) en tres pasos de cromatografía en columna de ! sobrenadantes de células de mamífero cultivadas y se aplicó una columna de intercambio catiónico débil (CEX) , que separa las moléculas de acuerdo a la carga, y se eluyó usando una fase móvil que contiene fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2 que contiene NaCl desde 0-250 mM. En la Figura 2 se muestra un perfil de esta columna. Se recolectaron y concentiraron las fracciones que comprenden las isoformas, que .dntienen diferentes números de residuos de ácido siáliccj. De manera concomitante, las fracciones se intercambiaron con amortiguador a acetato de sodio 10 mM, pH 5. La pureza de cada una de las soluciones finales concentradas de isoformas se determinó por su perfil correspondiente de cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) de CEX, que contuvo predominantemente un pico de CEX con eli tiempo de elusión comparable a aquél antes de la purifibación . El porcentaje de pureza se cuantificó por el área del pico de CEX principal dividido por el área total bajo todos los picos incluyendo cualquier pico menor de CEX detectajdo tanto a 215 como 280 nm. La pureza típica de cada solución de isoforma fue 93 % a 96 % . Tabla 2. La ! absorbancia de cada solución purificada de isoforma se midió a 280 n , y se derivó de esto la concentración de cada solucipn de isoforma. La Tabla 2 (posterior) muestra el por ciento de pureza, la concentración, y el número total de cada s.olución purificada de isoformas, así como el por ciento¡ de FPB total que cada isoforma comprende. Este i último ¡ número se calcula al dividir el área bajo cada pico detectado en la columna de intercambio catiónico por la suma de las áreas bajo todos los picos. Los picos -3, +3, y +4, que no se incluyen en la Tabla 2, comprenden conjuntamente el 6 restante del FPB total.

Ejemplo 2: Formulación de las Isoformas y FPB a Diferentes pH y valoración de su Estabilidad ¡ El siguiente experimento compara la estabilidad de las isjoformas purificadas y de FPB a una variedad de pH como a 37°C. Cada una de las isoformas unto con el FPB, se formuló en los siguientes a una concentración final de 1 mg/mL: acetato mM, pH 4; acetato de sodio 10 mM, pH 5; histid-.na 10 mM, pH 6; fosfato de sodio 10 mM, pH 7 ; y fosfato de sodio 10 mM, pH 8. Todas las muestras también se contuvieron 5 % de sorbitol (p/v) . Todas las soluciones formuladas de anticuerpo y los placebos correspondientes, es decir, soluciones formuladas que carecen de anticuerpos, se esterilizaron por filtración a través de membranas de 0.2 µm antes de que se tomen en alícuotas en microtubos estériles con tapas de anillo tórico, que se usaron para impedir la evaporación. El volumen total para cada muestra fue de aproximadamente 300 µL a 350 µL. Un conjunto de soluciones formuladas de anticuerpo y los placebos correspondientes se incubó a 4°C, en tanto que otro se incubó a 37 °C, ambos bajo condiciones estáticas. La estabilidad biofísica y bioquímica de cada muestra se evaluó en los puntos de tiempo 0, 2 semanas, 1 mes y ¡3 meses usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , , HPLC de fase inversa, y espectroscopia de I fluorescencia, entre otras técnicas. Se usó ultracentrifugación analítica (AUC) para determinar el peso I molecular aproximado de las especies de HMW detectadas por SEC. Se valoró la bioactividad de las muestras que se han I incubadlo durante 3 meses en formulación de pH 5. Cada solución formulada de proteína, así como cada placebo, que se ha ¡almacenado a 4°C y 37°C se inspeccionó para especies solubles y claridad. Después de 3 meses a ya sea 4°C o 37°C, ¡todas las muestras, tanto con y sin anticuerpos, permanecieron incoloras, translúcidas y sin materia en partículas.

; Usando dos columnas de SEC conectadas en tándem, la SEC proporcionó la cuantificación de los niveles de monómero (en este caso, anticuerpos tetraméricos que tienen I dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) , las especies de alto peso molecular (HMW) (por ejemplo, dímeros y I agregados) , y de bajo peso molecular (LMW) . Cada muestra de columna fue de 20 µg a concentración de 1 mg/mL. Se ¡ corrieron múltiples muestras para asegurar reproducibilidad. Las longitudes de onda de detección se ajustaron a 215 y 280 nm. En la mayoría de las muestras, la mayoría del material eluyó como un pico dominante individual en SEC. Este pico contiene monómeros. En este contexto, donde el anticuerpo es un ' anticuerpo de IgG, los monómeros son anticuerpos i tetraméricos que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas1 ligeras con un peso molecular de aproximadamente 150, OOQ daltones. Sin embargo, cuatro picos perceptibles ¡ diferentes del pico principal de monómero se observaron entre las muestras de formulaciones incubadas a 37 °C. Los perfiles de columna de SEC de las muestras que contienen FPB ! y diferentes isoformas individuales purificadas formuladas a pH 8 ¡en fosfato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % y almacenadas a 37°C durante tres meses se muestran en la Figura i 3. Todas estas muestras mostraron un pico principal predominante, que contiene monómeros, y dos picos de mayor peso molecular más dos picos de menor peso molecular. Las dos especies de bajo peso molecular se designaron LMW1 y LMW2. Las especies de más alto peso molecular se designaron y las especies siguientes en elusión se designaron como dímeros (que significan dímeros que I comprenden dos anticuerpos tetraméricos) . Estas designaciones se basaron en los pesos moleculares determinados por ultracentrifugaciones analíticas (AUC) y SDS-PAGE. Se usó AUC para determinar el peso molecular aproximado de las especies de HMW detectadas por SEC bajo condiciones no reductoras. La SDS-PAGE bajo condiciones reductóras, es decir, bajo condición en la cual se rompen los enlaces de disulfuro, se usó para valorar el tamaño de las especies de HMW. ¡ Las Figuras 4A-4E muestran el por ciento del I material total que permaneció como monómeros como se mide por SE|C en cada punto de tiempo. En todas las muestras incubaqas a 4°C a todos los pH, la mayoría del material permaneció como monómeros de anticuerpo durante al menos tres meses. Sin embargo, las muestras almacenadas a 37°C mostraion pérdida considerable de especies monoméricas, particularmente entre las muestras de pH 5 (Figura 4B) . El material del pico -2 y pico 0 de isoforma almacenado a 37 °C a pH 5 perdió más monómeros que cualquier otra muestra, y las muestras del pico -2 y pico 0 de isoforma estuvieron entre las muestras de menor puntuación para el por ciento de monóme o en la mayoría de los otros pH probados. Como un grupo y de manera individual, la muestra de pH 5 a 37 °C mostró mucha menor pérdida de monómeros que las muestras incubabas a cualquier otro pH y temperatura. Como un grupo y de manera individual, las muestras incubadas a pH 6 a 37°C contuvieron mayores porcentajes de monómeros que cualquier otra muestra de 37°C. Figuras 4A-4E. I I Estos experimentos también revelaron diferencias I entre I las diferentes isoformas y FPB, que fueron particularmente evidentes en las muestras de 37°C a pH 4 y . Elj FPB estuvo consistentemente entre las muestras que tienen las más altas cantidades de monómero a todos los pH .

Figura I 4A-4E. A pH 4 y 5, el FPB fue más estable que cualquier isoforma purificada, sugiriendo que una combiné.ción de isoformas estabiliza la mezcla. Figuras 4A- 4B. A ! pH 7 y 8, el FPB es consistentemente tan estable como la isoforma purificada más estable y más estable que las issooffoorr.mas -2, -1, +1 y 0, que conjuntamente comprenden cerca | de 85 °s del anticuerpo total contenido en el FPB. Figuras I 4D-4E. A pH 6, el FPB y las isoformas +2, +1 y 0 son aproxim ¡adamente igualmente estables, y las isoformas -1 y -2 son ligeramente menos estables. Figura 4C. Si cada isoforma en la mezcla de isoformas en FPB tiene la misma estabilidad en FPB como lo tiene en una forma purificada, se esperará que el FPB tenga una estabilidad entre aquélla de las isoformas menos y más estables. Esto no es el caso a cualquier pH . De esta manera, estos datos se pueden interpretar para querer decir que la mezcla de isoformas en el FPB ejerce una influencia estabilizadora. ! Las Figuras 5A-5B muestran el porcentaje del área total bajo el perfil de la columna de SEC entre muestras incubadas a 4°C (Figura 5A) y 37°C (Figura 5B) que es una especie de alto peso molecular (por arriba de la línea horizoijital, marcada S HMW) , es decir, dímeros y agregabos, y la especie de bajo peso molecular (por debajo de la |línea horizontal, marcada S LMW), es decir, LMW1 y LM 2. Son similares las muestras incubadas a 4°C a diferentes pH. Sin embargo, las muestras de FPB incubadas a 4°C tienen consistentemente menores niveles de especies de HMW que otras muestras a través de todos los pH, y las muestras del pico +2 de isoforma tienen consistentemente i mayores niveles de especies de HMW que otras muestras. Las i muestras incubadas a 37 °C difieren radicalmente entre sí, y las muestras de pH 5, particularmente las muestras de pico 0 y -2 dé isoforma, contuvieron una proporción muy sustancial de díméros y agregados en comparación a muestras incubadas a otros pH. Las muestras incubadas a pH 4 , 7 y 8 contuvieron un bajo porcentaje de especies de HMW, pero las muestras de pH 6 contuvieron el más bajo porcentaje de especies de HMW entre ias muestras de 37°C. Además, las muestras de pH 7 y 8 incubadas a 37 °C tienen ligeramente mayores cantidades de LMWl LMW2 que las muestras de 37 °C a otros pH . Figura 5B. I ' Las Figuras 6A-6B muestran el porcentaje del área total bajo el perfil de columna de SEC entre las muestras incubadas a 37 °C que fueron dímeros (Figura 6A) o agregados de mayor orden (Figura 6B) . Las muestras incubadas a pH 5 tienen , un porcentaje sustancialmente mayor de dímeros y agregabos que las muestras incubadas a otros pH. Entre las muestras de pH 5, las muestras de pico -2 y pico 0 de isoforna contuvieron un mayor porcentaje de agregados que otras muestras. Las muestras incubadas a pH 4 , 7 y 8 contuvieron un bajo porcentaje de agregados y dimeros, pero las muestras de pH 6 contuvieron los más bajos porcentajes de dímeros y agregados. De esta manera, los datos en las figuras 4-6 indican que las muestras de pH 6 incubadas a 37 °C contuvieron menos especies de alto peso molecular que otras muestras de 37 °C. La formación de agregados es de interés particular en formulaciones de anticuerpo debido a que sé conoce que los agregados son inmunogénicos. plegado del anticuerpo. Además, la cromatografía de fase inversa puede detectar la formación de péptidos hidrófilos o hidrófobos que pueden formarse mediante medición del anticu rpo durante el almacenamiento. La columna de fase inversa se cargó en una mezcla 30:70 de soluciones B y A y se eluyó en un gradiente que fue de 30 % de solución B a 50 % de solución B. La solución A fue ácido trifluoroacético al 0.1! 2% (TFA), y la solución B fue 60 % de isopropanol, 30 % de acetonitrilo, 0.12 % de TFA. Las Figuras 7A y 7B i muestran un grupo de perfiles de columna de OD2?s de fase inversa de muestras incubadas durante 3 meses a 4°C (Figura 7A) y 37°C (Figura 7B) en fosfato de sodio 10 mM, pH 8, sorbitfl al 5 %. Se observa un pico pequeño de manera temprana en el perfil de la columna de las muestras de 37 °C, que es presumiblemente un péptido hidrófilo pequeño que se escindf del anticuerpo. Este pico no se presenta en las muestr s de 4°C. La mayoría del material a ambas ] temperaturas migra como un pico único, que sin embargo, es | más amplio en las muestras de 37°C que en las muestras de i 4°C. Figura 7. ¡ La Figura 8 muestra el porcentaje del área total i bajo los perfiles de columna de fase inversa de muestras de 37 °C a varios pH indicados que es una parte del pico principal (Figura 8A) o una parte de las especies recortadas de elufeión temprana (Figura 8B) . Se observan más especies recortadas a pH 8 que a cualquier otro pH probado. Las muestras a pH 5 a pH 7 tienen los más bajos porcentajes de especies recortadas y los más altos porcentajes de material en el pico principal. Las diferencias entre las isoformas y el FPB son mayores a pH 8. Los picos -2 y 0 de isoforma, que produjeron la mayoría del agregado, tienen también los recortes más hidrófilos a pH 8. El FPB tiene menos recortes que los picos -2 y 0 de isoforma pero más que los picos -1, +1 y +2 de isoforma a pH 8. Se evaluaron por espectroscopia de fluorescencia los cambios en las estructuras terciarias y secundarias de las muestras en cada punto de tiempo. Se diluyeron las muestras con su correspondiente amortiguador de formulación a una concentración final de 0.18 mg/mL. Se obtuvieron i medicio !nes fluorescentes intrínsecas de un espectrofluorímetro de haz de doble emisión Photon Technology Internacional que opera en un modo de exploración de emisión con cámara de muestra a 23°C. Se tomaron exploraciones de emisión entre 300 y 425 nm con longitud de onda dé excitación a 280 nm para valorar la fluorescencia debido ¡ a los residuos de tirosina y triptofano. También se tomarorji exploraciones de emisión con longitud de onda de excitación a 293 nm para valorar la fluorescencia debida principalmente residuos de triptofano. Los resultados indicaron que la longitud de onda de la emisión máxima de fluorescencia estaba a 326 nm para todas las muestras en el punto de tiempo cero, para todas las muestras de 4°C y para las muestras de 37°C a pH 6, 7 y 8 después de 3 meses de almacenamiento. Sin embargo, la longitud de onda de la emisión máxima de fluorescencia para las muestras de 37 °C a pH 4 y 5 fue de 338 nm. No se muestran los datos al natural. Estos datos se presentan en la Figura 9 como relaciones entre la emisión a 326 nm y 338 nm. ijjos resultados indican que los espectros de emisión tienen desplazamientos en las muestras de pH 4 y pH 5 i incubabas a 37 °C tal que la relación de 326 nm/328 nm es aproximadamente 1 o menos, no claramente mayor que 1 como en las muestras de pH 6, 7 u 8 a 37°C. Los datos indican un cambio en la estructura terciaria del anticuerpo en las muestras de pH 4 y 5 incubadas a 37°C. Puesto que la fluores Icencia detectada es debida a los residuos de I triptoíjano y tirosina, los datos también indican mayor i exposición de estos aminoácidos en las muestras de anticuerpo a pH 4 y 5 incubadas a 37 °C. I Se valoró la actividad biológica usando el ensayo basado ¡ en células in vi tro . Este ensayo utiliza células pulmonares A549. La proliferación de las células A549 se puede inhibir por IFN-?. El ensayo mide la proliferación al teñir ¡las células con ALAMARBLUEMR (AccuMed Internacional, Inc., ¿hicago, Illinois). La concentración de anticuerpos, necesaria para liberar la inhibición de proliferación por IFN-? a la mitad (IC50) se indica en la Tabla 3. Este ensayo se explica en más detalle en la solicitud de patente de los Estados Unidos número 2005/0004353, que se incorpora en la presente como referencia. Se probaron muestras de isoformas purificadas y FPB almacenado durante tres meses a pH 5 a las temperaturas indicadas en la Tabla 3.

Tabla 3 Estos datos no indican una clara relación entre las propiedades físicas de las muestras descritas anteriormente y la actividad biológica como se mide aquí. Dadas las cantidades sustanciales de dímeros y agregados formados a pH 5 a 37 °C, estos datos parecen sugerir que la formación de dímeros y agregados no afecta la función biológica como se mide aquí. Sin embargo, en otros experimentos, se ha demostrado que la dilución puede invertir al menos parcialmente la formación de los agregados solubles y dímeros presentes en las muestras de pH 5. Datos no mostrados. Puesto que las muestras se diluyen para hacer este exPer*-men't°. no es posible hacer alguna conclusión acerca ¡de los efectos de la formación de agregados y dímeros en la actividad biológica a partir de este experimento. En resumen, todas las muestras son biológicamente activas, al menos ese aspecto de actividad biológica probado aquí. No I se valora la inmunogenicidad de las muestras. I Tomandos conjuntamente los datos de SEC, de fase inversa y de emisión de fluorescencia, los resultados sugieren que las condiciones de almacenamiento de pH 6 conservan la estructura del anticuerpo mejor que otras condiciones probadas. En particular, los datos de emisión de fluorescencia indican que las condiciones de pH 6, 7 y 8 fueron comparables y superiores a las condiciones de pH 4 y 5. Los datos de fase inversa indicaron que las condiciones de pH ¡ 5, 6 y 7 fueron comparables y superiores a las condiciones a pH 4 y 8. Finalmente, los datos de SEC indicarlon que las condiciones de pH 6 fueron las más favorables para FPB y todas las isoformas individuales a 37°C, seguido por las condiciones de pH 4, 7 y 8. En las condiciones de pH 5, se observó una mayor proporción de agregados y dímeros a 37 °C. Una medición del pH de las muestrals de FPB en cada una de las formulaciones descritas ! en la presente después de casi 2 años a 4°C mostró que el pH no cambió para cada una de las formulaciones. Las muestras que se| formularon a pH 6, 7 y 8 y se incubaron a 37 °C durante 3 meses y se almacenaron posteriormente a 4°C durante casi 21 meses también tuvieron pH sin cambio, en tanto que las muestras similarmente tratadas formuladas a pH 4 y 5 i sufrieron un incremento de casi una unidad de pH. Datos no mostrados. El incremento en el pH de las muestras formuladas a pH 4 y 5 puede ser debido a la degradación de la proteína y/o alguna propiedad del lote particular del agente ¡amortiguador usado. Los datos también muestran que el FPB es tan i estable o más estable que la isoforma individual más estable i en cada una de las condiciones probadas. Ver Figuras 4A-4E.

Si las! isoformas individuales tienen estabilidad idéntica I cuando , se incuban en aislamiento y como un constituyente de FPB, en ¡tonces se esperaría que el FPB fuera intermedio en estabilidad entre las isoformas más y menos estables. El hecho que esto no es el caso, sugiere que una combinación de isoforpias puede estabilizar una composición.

Ejemplo 3: Formulaciones que Usan Varios Amortiguadores a un Intervalo de pH con y sin Sorbitol ' El siguiente experimento se realizó para distinguir entre los efectos del pH y los efectos del agente i amortiguador particular usado en la estabilidad de una composición que contiene FPB, que, como se describe anteriormente, contiene las varias isoformas del anticuerpo descritas en el Ejemplo 1. Además, se compararon ejemplos con y sin sorbitol para determinar el efecto de sorbitol en la estabilidad. Cada muestra se formuló a una concentración final qe aproximadamente 1 mg/mL a pH objetivo de 4 , 5, 6, 7 i u 8 en1 citrato de sodio 10 mM, fosfato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, o histidina. Las soluciones de formulación estuvieron constituidas con todos los I componentes diferentes del anticuerpo a las concentraciones finales y con el pH tan cerca al pH objetivo como sea agentes amortiguadores. La Tabla 4 describe las muestras y da los pH reales de las formulaciones finales después de la adición del anticuerpo. Se determinó la concentración de proteína de cada formulación completa al medir la densidad óptica a 280 nanómetros (OD28o) usando un espectrofotómetro NANODROPMR (NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, EUA) y calculando la concentración de proteína usando un coeficiente de extinción de 1.5 µg/mL/OD28o- Se incubaron muestras bajo condiciones estáticas a 4°C a 37°C. Todas las soluciones de anticuerpo formuladas y los placebos correspondientes, es decir, soluciones formuladas que carecen de anticuerpos, se esterilizaron por filtración a través de membranas a 0.2 µm antes de la formación en alícuotas en microtubos estériles con capas de anillo I tórico, que se usaron para impedir la evaporación. El volµmen total para cada muestra fue aproximadamente 650 µL.

¡ Se valoró la estabilidad después de 0, 4, 8 y 12 semanas de almacenamiento usando SEC, como se explica en el Ejemplo 2. La Figura 13 muestra el por ciento de monómeros como se mide por SEC en el punto de tiempo cero con (panel izquierdo) y sin (panel derecho) sorbitol. En la Figura 13 y siguientes figuras, el pH listado es el pH obj que es algo diferente del pH real (que se lista en la Tabla 4) en algunos casos, como se explica anteriormente. Los puntos de datos donde el pH de la formulación se desvía sustancialmente del pH objetivo (diferente del pH objetivo 4, que se incluyeron todos) se omiten de las figuras. Todas las formulaciones, con y sin sorbitol, tuvieron por ciento comparable de monómero (de aproximadamente 98 %) en el tiempo cero. Figura 13. La Figura 14 muestra el por ciento de monomero después de 12 semanas a 37 °C en la presencia (panel izquierdo) y ausencia (panel derecho) de sorbitol. Las muestras a un pH objetivo de 4 tienen en general aproximadamente 95 % de monómero o menos, como lo hacen las muestras de citrato de sodio a un pH objetivo de 5 y las i muestras de fosfato de sodio y fosfato de potasio a pH ! objetivos de 7 y 8 y muestras de histidina sin sorbitol a pH objetivo de 8. Los datos para muestras con y sin sorbitol fueron en general comparables, aunque el sorbitol muestra un efecto i protector en pocos casos. Después de 12 semanas a 37°C, las mejores muestras en histidina, acetato de sodio y citrato de sodio más sorbitol tuvieron cerca de 97 % de monómeiío, en tanto que las mejores muestras en fosfato de sodio | o potasio más sorbitol tuvieron un por ciento ligeramente menor de monómero. Figura 14. Las muestras con sorbitol más cualquiera de los agentes amortiguadores probados incubados a 4°C no mostraron esencialmente cambio en el por ciento de monómero después de 12 semanas. Datos no mostrados. 1 Para muestras que contienen histidina o acetato de I sodio, con o sin sorbitol, las muestras de pH 6 tienen el más alto por ciento de monómero entre todas las muestras en el mismo agente amortiguador después de 12 semanas a 37 °C. Figuras 15 y 16. Lo mismo es cierto para muestras que contienen fosfato de potasio con sorbitol. Figura 18. En las muestras restantes (citrato de sodio y fosfato de sodio con y sin sorbitol y fosfato de potasio sin sorbitol) , la 1 muestra de pH 6 fue una de las dos muestras con el más alto y aproximadamente igual por ciento de monómero después de 12 semanal a 37°C. Figuras 17-19. De esta manera, el pH 6 fue ya sea' el mejor pH o uno de los dos mejores pH para i establecer el anticuerpo, a pesar del agente amortiguador usado. : La Figura 20 muestra el por ciento de monómero para tpdos los agentes amortiguadores y los pH probados, con y sin sorbitol después de 12 semanas a 37°C. Se indica que la estabilidad del anticuerpo es mucho más dependiente' del agente ¡ amortiguador usado a los pH diferentes de aproximadamente pH 6, puesto que el por ciento de monómero para tDdos los amortiguadores probados estuvo muy cerca de pH 6, pero no a otros pH . También ilustra el efecto protector de sorbitol, particularmente en muestras a pH 8. Sin embargo, diferentes agentes amortiguadores fueron efectivos sobre diferentes intervalos de pH. Por ejemplo, el fosfato de sodio y el fosfato de potasio fueron más efectivos a pH objetivo de 5 y 6, pero tuvo mucho menor por ciento de monómero a pH objetivo de 7 y 8 que lo que hace histid:.na y citrato. La histidina fue efectiva a pH objetivo de 5-7, aunque fue mejor a pH objetivo de 6. El acetatf de sodio se desempeñó bien a pH objetivo de 5-6, y el citrato de sodio no fue efectivo a pH objetivo de 6-7. También, el citrato de sodio tiene muy bajo por ciento de monómefo a pH objetivo de 4 en comparación a otros agentes | La Figura 21 muestra el por ciento de las especies de bajó peso molecular (LMW 1 y LMW 2) como se determina por SEC (como se explica en el Ejemplo 2) para muestras con y sin so::bitol. Cuando se ve en unión con la Figura 20, la Figura | 21 indica que la mayoría de la pérdida de monómeros es debida a la formación de especies de bajo peso molecular en muestras con y sin sorbitol. La Figura 22 muestra el por ciento de la muestra total due fueron dímeros como se mide por SEC después de 12 semanas de incubación estática a 37 °C. Las muestra incubadas a pH 7 u 8 tienen un mayor porcentaje de dímero, particularmente muestras en fosfato de sodio o potasio. El sorbitol tiene un ligero efecto protector en muestras de histidina a pH 8. De esta manera, la formación de dímero da cuenta i de algo de la disminución en el por ciento de i monómetfo vista en las muestras en fosfato de sodio o fosfato de potasio a pH 7 u 8. ' Tomados conjuntamente, estos datos indican que el anticuerpo es relativamente estable a aproximadamente pH 6 en una¡ variedad de agentes amortiguadores. El sorbitol tiene iin efecto estabilizador bajo algunas condiciones. La mayoría de la pérdida en el por ciento de monómero en las muestras incubadas a 37 °C fue debida a la formación de I | especies de bajo peso molecular, aunque la formación de dímeros también contribuyó en algunas múltiples a pH 7 y 8. i Una medición del pH de todas las muestras, con y sin sorbitol, después del almacenamiento a 37 °C durante 12 semanas no mostró cambio en el pH de aquél medido en el tiempo ¡cero. Datos no mostrados.

Ejemplo 4: Prueba de Mezclas de Isoformas Purificadas para Estábilidad | En el Ejemplo 2 se mostraron diferentes isoformas i purifiqadas (descritas en el Ejemplo 1) que tienen diferentes estabilidades, y el FPB (que contiene todas las isoformas) fue en general tan estable como la más estable de las isoformas purificadas. Una posible explicación de esta observación es que algún elemento presente en las muestras de FPB se remueve durante el aislamiento de las isoformas individuales . Si esto es cierto, entonces se esperaría que una mezcla de isoformas en aproximadamente la misma relación como sé encuentra en FPB (tal como la muestra de IsoBulk descrita en la Tabla 5 posterior) sea menos estable que FPB. En el experimento descrito más adelante, se probaron para estabilidad varias combinaciones de , isoforimas purificadas. Además, las mezclas de las isoforjmas -2, -1, 0, 1 y 2 en aproximadamente las mismas relaciones como se presenta en FPB (llamado IsoBulk) se probaron para determinar si estas mezclas se comportarían como FPB. FPB contiene cantidades menores de tres especies, es decir, 3, 4 y -3, además de aquéllas usadas para hacer IsoBulk. Ver Figura 2 La Tabla 5 describe las muestras. Tabla 5: Descripción de las muestras ! La Figura 23 muestra una comparación de FPB (panel izquierdo) con IsoBulk (panel derecho) a pH 4 a 8 en formulaciones que comprenden 5 % de sorbitol más un agente amortiguador con buena capacidad de amortiguamiento al pH seleccionado después de 12 semanas de incubación a 4 C o 37 °C. ¡ El por ciento de monómero se determinó por SEC como se explica en el Ejemplo 2. El acetato de sodio fue el agente amortiguador usado a pH 4 y 5, se usó histidina a pH 6, y se usó fosfato de sodio a pH 7 y 8. Las muestras tanto de FPB como de IsoBulk incubadas a 4°C (Figura 23, círculos cerrad?s) fueron sustancialmente las mismas como las muestras en el punto de tiempo cero. Datos no mostrados. Todas |.as muestras de IsoBulk incubadas a 4°C tuvieron un porcentaje ligeramente menor de monómero (aproximadamente 98 %) en comparación a aquél observado para muestras de FPB incubadas a 4°C (aproximadamente 99 %). Las muestras de FPB incubadas a 37 °C tuvieron un por ciento ligeramente mayor de monómero que la muestra de IsoBulk a pH 4, 5 y 6 y un por ciento notablemente mayor de monómero a pH 7 y 8. Las diferehcias entre el por ciento de inicio de monómero y el por ciento de monómero después de 12 semanas a 37 °C a pH 4, 5 ó 6 para FPB versus IsoBulk fueron aproximadamente las mismas L De esta manera, FPB e IsoBulk son aproximadamente estables de forma igual a pH 4 , 5 ó 6. Los datos también indican que IsoBulk es menos estable que FPB a pH 7 y 8. De esta manera, al menos a pH 4-6, los resultados observados en I la Figura 4 no pueden explicar la eliminación de un elemento ! estabilizador en FPB durante la purificación de las isoformas. Esta explicación puede dar cuenta potencialmente de la estabilidad disminuida de IsoBulk en comparación a FPB a pH 7 ¡y 8. I Las Figuras 24 y 25 muestran el por ciento neto de pérdida de monómero como se determina por SEC (como se describe anteriormente) de muestras individuales que contienen isoformas purificadas o mezclas de isoformas después de ocho semanas de incubación estática a 37 °C. Las muestras se formularon en ya sea 5 % de sorbitol, acetato de sodio |10 mM a pH 5 (Figura 24) o en 5 % de sorbitol, histidjina 10 mM a pH 6 (Figura 25) . Las muestras que contienen isoformas purificadas individuales tienen las más grandes pérdidas en por ciento de monómero, seguido por las muestras que contienen mezclas de dos isoformas purificadas. Esto f e cierto en ambas formulaciones probadas. Figuras 24 y 25. Las muestras que contienen mezclas de tres o más isoformas tienen pérdida comparable en el por ciento de monómero, que fue en general menor que aquél observado para las isoformas individuales o mezcla de dos isoformas. Una mezcla) de dos probadas (isoformas 2 y -2) fue comparable en las me ¡zclas de 3 o más isoformas. Estos datos indican que las m "1ezclas que contienen tres más isoformas se estabilizan en comparación a las mezclas que contienen menos isoformas i I Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la . i práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir ¡de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Composición farmacéutica que incluye una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal y un agente amortiguador, caracterizada porque ' la composición está a un pH de 5.5 a 6.5, I en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:6, JSEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:30 y/o la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:31, y , en donde el anticuerpo se une de manera específica a intefferón-gamma humano. 2. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la preparación purificada comprende al menos tres diferentes isoformas del anticuerpo . 3. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el anticuerpo comprejide un sitio de N-glicano en la región variable de cadena pesada y/o ligera 4. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porquej la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: ¡10, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 30 y/o la secuencia de ! aminoácidos de la región variable de cadena ligera es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:16, ¡ o SEQ ID NO:31. | 5. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID NO: 6, SEQ ID i NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 30 y/o la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO:12,,SEQ ID NO:16 o SEQ ID N0:31. ! 6. Composición farmacéutica de conformidad con de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada ¡ la región variable de cadena pesada comprende: una
I CDRl q¡ue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 34; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ id NO: 35; y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37, y/o en donde la región1 variable de cadena ligera comprende: una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 0; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO:44.
7. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el agente amortiguador es histidina, acetato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio o citrato de sodio.
8. Composición farmacéutica de conformidad con la I reivindicación 7, caracterizada porque el agente amortiguador es histidina. 1
9. Composición farmacéutica de conformidad con la I reivindicación 7, caracterizada porque el agente i amorti Jguador es acetato de sodio.
10. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada I porque ! el agente amortiguador está presente en una concentración de al menos 0.5 mM y no más de 300 mM. j
11. Composición farmacéutica de conformidad con la I reivindicación 10, caracterizada porque el agente amortiguador está presente a una concentración de 1 mM a 100 ! mM. ¡
12. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el agente amortiguador está presente a una concentración de 5 mM a 50 mM.
13. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque la composición comprende además un azúcar, un carbohi-drato, y/o una sal.
14. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende sorbitol.
15. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque el anticuerpo se produce por una célula de mamífero.
! 16. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el anticuerpo se producf Por una célula CHO. !
17. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada i porque ¡el pH de la composición es de 5.7 a 6.3. i ¡
18. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque ¡ la composición es un líquido.
19. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo de IgG humano humanizado. !
20. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque al menos 90 % de la proteína detectable en la preparación purificada está en el pico de monómero como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) .
21. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque al menos 95 % de la proteína detectable en la preparación purificada está en el pico de monómero como se valora por SEC. ¡
22. Método para estabilizar una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque comprende formular la preparación purificada en una composición que comprende un agente amortiguador, en donde la composición tiene un pH de 5.5 a 6.5, ! en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región j variable de cadena pesada y una región variable de cadena ' ligera, ¡ ' en donde la secuencia de aminoácidos de la región ! variable de cadena pesada es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:6, ¡SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:30 y/o la i secuenóia de aminoácidos de la región variable de cadena i ligera) es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO-12, |SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:31, y j en donde el anticuerpo se une de manera específica a inte^ferón-gamma humano. j
23. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la preparación purificada comprende al menos tres diferentes isoformas del anticuerpo.
24. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo tiene un sitio de N-glicanó en la región variable de cadena pesada y/o ligera.
25. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es al menos 95 % idéntica a N0:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:14, o SEQ IDj NO: 30 y/o la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO:31. I
26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 o SEQ1 ID NO: 30 y/o la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO:31. i I
27. Método de conformidad con cualquiera de las | reivindicaciones 22 a 26, caracterizado porque la región variable de cadena I pesada i comprende : una CDRl que comprende SEQ ID NO:34; una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 35; y una CDR3 que comprende SEQ ID¡NO:36 o SEQ ID NO:37, y en donde la región variable de cadena ligera comprende: una CDRl que comprende SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 o SEQ tED NO: 40; una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 44.
28. Método de conformidad con cualquiera de las I reivindicaciones 22 a 27, caracterizado porque el agente amortiguador es histidina, acetato de sodio, fosfato de i sodio, | fosfato de potasio o citrato de sodio. I
29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el agente amortiguador es i histidina . ¡
30. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el agente amortiguador es acetato de sodio. I
31. Método de conformidad con cualquiera de las caracterizado porque el agente en una concentración de al menos !
32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el agente amortiguador está presente a una concentración de 1 mM a 100 mM.
33. Método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente amortiguador está presentje a una concentración de 5 mM a 50 mM.
34. Método de conformidad con cualquiera de las se hace por una célula CHO. i 36. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 35, caracterizado porque el anticuerpo es un .anticuerpo de IgG. 37. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 36, caracterizado porque la I composición tiene un pH de 5.7 a 6.3. i 38. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 37, caracterizado porque al menos 90 % de la proteína detectable en la preparación purificada está en el ¡pico de monómero como se valora por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . 39. Una composición farmacéutica que comprende una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal e histidina, caracterizada porque la preparación purificada comprende al menos tres isoformas del anticuerpo, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ¡ligera, ' en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es al menos 95 % idéntica a SEQ ID N0:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:14, y/o SEQ ID NO:30 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera, es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID N0:12, ' SEQ ID NO: 16, y/o SEQ ID N0:31, ¡ en donde el anticuerpo se une específicamente a interferón-gamma humano, y en donde el pH de la composición es de 5.5 a 6.5. | 40. Composición farmacéutica de conformidad con la I I reivindicación 39, caracterizada porque la composición comprende además un azúcar, un carbohidrato, y/o una sal. . 41. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, caracterizada porque el pH de la composición es de 5.7 a 6.3. 42. Composición farmacéutica de conformidad con la i reivindicación 40 ó 41, caracterizada porque comprende sorbitól . I 43. Composición farmacéutica de conformidad con I cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID'NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:31. 44. Un método para estabilizar una preparación purifidada de un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque comprende formular el anticuerpo monoclonal en una composición que comprende histidina, en donde la preparación purificada comprende al menos tres isoformas del anticuerpo, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variab-Je de cadena pesada es al menos 95 % idéntica a SEQ ID N0:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, y/o SEQ ID NO:30 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera ¡ es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, ¡SEQ ID NO:16, y/o SEQ ID NO:31, I en donde la composición está a un pH de 5.5 a 6.5, y ; ¡ en donde el anticuerpo se une específicamente a interferón-gamma humano. 45. Método de conformidad con la reivindicación i 44, caracterizado porque la composición comprende además un azúcar, un carbohidrato y/o una sal. 46. Una composición farmacéutica que comprende una I preparación purificada de un anticuerpo monoclonal y acetato de sodio o citrato de sodio, caracterizada porque la preparación purificada comprende al menos tres isoformas del anticuerpo, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO:6, ¿EQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, y/o SEQ ID NO:30 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:31, en donde el pH de la composición es de 5.5 a 6.5 y en donde el anticuerpo se une específicamente a interferón-gamma humano. 47. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque comprende además un azúcar, un carbohidrato y/o una sal. I 1 48. Composición farmacéutica de conformidad con la I reivindicación 46 ó 47, caracterizada porque el pH de la composición es de 5.7 a 6.3. I 49. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, caracterizada porque comprende sorbitol . i 50. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:14 o SEQ ID NO:30 y la secuenbia de aminoácidos del anticuerpo comprende SEQ ID N0:8, 3EQ ID N0:12, SEQ ID NO:16 o SEQ ID N0:31. 51. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 50, caracterizada porque comprende acetato de sodio. 52. Composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 50, caracterizada porque comprende citrato de sodio. 53. Un método para estabilizar una preparación purificada de un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque comprende formular el anticuerpo monoclonal en una composición que comprende acetato de sodio o citrato de sodio, ¡ ¡ en donde la preparación purificada comprende al menos ires isoformas del anticuerpo, ¡ en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región ¡ variable de cadena pesada y una región variable de cadena , ligera, i en donde la secuencia de aminoácidos de la región i i variable de cadena pesada es al menos 95 % idéntica a SEQ ID I NO: 6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO:30 y la | secuenqia de aminoácidos de la región variable de cadena I ligera ¡ es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:12, IsEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:31, I en donde el pH de la composición es de 5.5 a 6.5 y en donde el anticuerpo se une específicamente a interferón-gamma humano. 54. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la composición comprende además un azúcar, un carbohidrato y/o una sal.