KR20100046219A - 단백질 역가를 증가시키는 방법 - Google Patents

단백질 역가를 증가시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100046219A
KR20100046219A KR1020107004046A KR20107004046A KR20100046219A KR 20100046219 A KR20100046219 A KR 20100046219A KR 1020107004046 A KR1020107004046 A KR 1020107004046A KR 20107004046 A KR20107004046 A KR 20107004046A KR 20100046219 A KR20100046219 A KR 20100046219A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
cells
interest
antibody
cell
Prior art date
Application number
KR1020107004046A
Other languages
English (en)
Inventor
도로테 암브로시우스
바르바라 에넨켈
크리슈티안 에커만
Original Assignee
베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게 filed Critical 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게
Publication of KR20100046219A publication Critical patent/KR20100046219A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세포 내에서 관심있는 단백질을 역가를 증가시키는 방법뿐만 아니라, 이의 한가지 성분이 도메인 CH3인 최적화된 생물분자의 개선된 생산 및 정제에 관한 것이다. 생물분자에서, C-말단 아미노산(들), 예를 들어, C-말단 리신이 빈번하게 분열된다. 예를 들어, 항체의 중쇄의 통상적으로 불완전한 처리는 생성물 불균일성을 유도한다. 이러한 생성물 불균일성을 피하기 위해서, 항체 중쇄의 C-말단 리신의 상응하는 코돈은 재조합 DNA 기술에 의해서 결실된다. 이들 최적화된 항체는 야생형에서보다 더 높은 생성물 역가를 유도한다. 또한, 이들 최적화된 항체는 감소된 전하 불균일성의 결과로 개선된 용출특징을 가짐으로써 정제 공정 중에 유리하다.

Description

단백질 역가를 증가시키는 방법{Methods for increasing protein titers}
본 발명은 최적화된 단백질, 특히 항체 Fc 단편, 또는 Fc 융합 단백질 및 증진된 활성을 갖는 이들 최적화된 항체 및 Fc 융합 단백질의 제조 또는 생물약제학적 생산을 위한 방법뿐만 아니라 단백질을 생산 및 정제하는 방법 (여기에서, 생산된 생물분자는 C-말단 리신에 관해서 완전히 균질하다)에 관한 것이다.
단백질, 폴리뉴클레오타이드, 폴리사카라이드 등과 같은 생물분자는 의약으로서, 진단용 약제로서, 식품, 세제 등에 대한 첨가물로서, 연구용 시약으로서, 및 그 밖의 다른 다수의 적용을 위해서 상업적 중요성이 점차 증가하고 있다. 이러한 생물분자에 대한 필요성은 통상적으로 - 예를 들어, 단백질의 경우에는 - 천연 공급원으로부터 분자를 분리함으로써는 더 이상 충족될 수 없으며, 생물공학적 생산방법의 사용을 필요로 한다.
단백질의 생물공학적 제조는 일반적으로, 원하는 단백질을 암호화하는 DNA의 분리, 및 적합한 발현 벡터 내로의 이의 클로닝에 의해서 시작된다. 재조합 발현 벡터를 적합한 원핵성 또는 진핵성 발현 세포 내에 형질감염시키고, 이어서 형질감염된 재조합 세포를 선택한 후에, 후자의 세포를 발효기 내에서 배양하고, 원하는 단백질을 발현시킨다. 그 후, 세포 또는 배양 상청액을 수거하고, 그 안에 함유된 단백질을 후처리하고 정제한다.
예를 들어, 의약으로 사용된 단백질과 같은 생물약제학적 제제, 예를 들어 치료학적 항체의 경우에는, 생성물의 수율이 중요하다. 불순물의 분리도 또한, 중요하다. 공정- 및 생성물-의존적 불순물 사이에 구별을 지을 수 있다. 공정-의존적 불순물은 단백질 및 핵산과 같은 숙주 세포의 성분을 함유하거나, 세포 배양물로부터 (예를 들어, 배지 구성성분) 및 후처리로부터 (예를 들어, 염 또는 용해된 크로마토그래피 리간드) 유래한다. 또한, 생성물-의존적 불순물도 나타난다. 이들은 상이한 특성을 갖는 생성물의 분자 변이체이다. 이들은 예를 들어, 전구체 및 가수분해적 분해산물과 같은 단축된 형태, 단백질의 C-말단 아미노산 그룹의 절단뿐만 아니라, 예를 들어, 탈아미노화, 상이한 글리코실화 패턴 또는 잘못 연결된 디설파이드 브릿지에 의해서 생산된 변형된 형태를 포함한다. 생성물-의존적 변이체는 중합체 및 응집체를 포함한다. 용어 오염물은 제조공정에 직접적으로 속하지 않는 화학적, 생화학적 또는 미생물학적 성질의 모든 다른 물질을 나타낸다. 추가의 오염물질은 예를 들어, 세포 배양물 내에 바람직하지 않게 나타날 수 있는 바이러스이다.
새로운 생물약제학적 의약의 생산을 위한 포유동물에서의 재조합 항체 또는 Fc 융합 단백질의 과발현 시에 빈번하게 관찰되는 생성물 변이체는 C-말단 리신의 효소적 절단에 의한 면역글로불린의 중쇄의 C-말단에서의 불균일성을 기초로 한다. 이러한 불균일성을 정확하게 기술하기 위해서, 고-해상도 분석방법이 개발되어야 한다. 전하 불균일성의 검출 및 정량화를 위해서는 다음의 방법이 제약산업에서의 품질관리에 사용된다: 양이온 교환 크로마토그래피 (CIEX), 등전점 집중법 (isoelectric focusing; IEF) (검출의 경우만), 모세관 등전점 집중법 (cIEF) 및 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LCMS). 생산된 각각의 배취 (batch)는 그 중에서도 특히 이 변형에 관해서 평가되고, 통과되어야 한다.
시판되고 있는 이 카테고리의 다수의 분자에서는, 중쇄의 C-말단에서 이들 생성물 불균일성이 관찰된다. 중쇄의 C-말단에서 완전히 절단된 리신 (Lys0)을 갖거나, 절단된 리신 (Lys1)을 갖거나, 절단성 리신 (Lys2)이 없는 항체 단량체들 사이에서 구별을 지을 수 있다. 다양한 불완전하게 처리된 분자 (Lys1 및 Lys2)는 전하 내에서 30%까지를 차지할 수 있다 [Santora et al . (1999) Analytical Biochemistry, 275(1): p. 98-108]. 레미케이드 (Remicade®) (인플릭시마브 (Infliximab))를 제조하는 방법에서, 발효 중의 불균일성은 약 20% (Lys0 및 Lys1) 및 80% (Lys2)였다 [FDA, Product Review on Remicade, 1998]. 모노클로날 항체에서 C-말단 리신 처리의 추가의 예는 표 [Harris, R.J., (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1), pp. 129-134]에서 찾을 수 있다.
Figure pct00001
이 생성물 불균일성의 원인은 현재 알려지지 않았다. 쇄의 구조, 숙주 세포 또는 발효 조건 및 따라서, 세포 내에서 상이한 대사과정이 주된 영향을 갖는지 여부는 불명료하다. 또한, 세포에서 생성물의 제조 시에 어떤 시점 (공동-해독, 해독-후)에서, 어디에서, 그리고 어떤 카복시펩티다제를 사용하여 리신의 절단이 수행되는지도 현재는 알려지지 않았다. 따라서, 배취들 사이에서 있을 수 있는 변이는 예방될 수 없고, 표적화된 역-조절은 불가능하다. 생성물 불균일성은 또한, 예를 들어, 단백질 tPA 또는 EPO에서 C-말단 아르기닌의 결실에 의한 것과 같은 다른 C-말단 아미노산 결실에 의해서 야기될 수도 있다 [Harris, R.J., (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1), pp. 129-134].
생산 배취를 평가하기 위한 출발점은 물리화학적 생성물 품질, 생성물의 순도, 균일성 및 유효성 및 안전성이다. 전기영동적 (IEF) 또는 크로마토그래피 (IEC, SEC, RP) 분리방법 및 질량-분석방법 (MS, ESI, MALDI)이 생성물의 순도 및 불균일성을 평가하기 위해서 사용된다. 생성물 순도를 모니터링하는 것은 불순물의 적절한 제거 및 효소적, 기계적 또는 화학적 방법에 의해서 형성된 절단 생성물 및 응집된 단백질 분자의 제거를 보장한다. 생성물 균일성은 우선적으로, 글리코실화 패턴 및 전하 불균일성에서의 편향을 이용하여 평가한다. 생성물의 유효성은 항체의 경우에 이의 항원 결합능, 효과기 기능의 유도, 혈청 반감기 등과 같은 특성으로 이루어진 이의 생물학적 활성을 설명한다. 생성물 안전성에 대한 결정인자에는 특히, 생성물의 배취의 무균성 및 세균 내독소 부하량이 포함된다. 생성물 배취에서 이것이 방출되도록 할 수 있도록 보증되거나 고수되어야 하는 제어 값의 수로 인하여, 예를 들어, 배취에 영향을 미치는 파라미터를 제거함으로써 제어 값을 감소시키는 것이 바람직하다.
더구나, 단백질의 생물공학적 제조에서는 높은 생성물 역가 및 세포의 높은 비생산성이 바람직하다.
따라서, 문제는 개선된 제조방법을 제공하는 것에서 기인한다. 생성물 발현, 생성물 정제 및 생성물 안정성에 관해서, 제조 중에 부정적인 영향을 나타나지 않아야 한다.
놀랍게도, 본 발명은 DNA 수준에서 C-말단 암호화 코돈 (예를 들어, 리신)을 제거한 다음에, 종결 코돈을 삽입함으로써 단백질을 증가된 수율로 수득하도록 하는 단백질의 제조방법에 의해서 이 문제를 해결한다. 이 방법은 특히, 중쇄 상에 C-말단 리신 결실을 갖는 항체의 단백질 역가를 상승시킬 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 C-말단 리신의 결실을 포함하는 단백질의 재조합 DNA 구조물, 특히 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 항체 분자와 Fc 융합 구조물을 기술한다. 발현 구조물에 대한 이러한 변화 및 C-말단 Lys 코돈의 결실은 중쇄의 균일한 C-말단을 갖는 분자만이 제조됨을 의미한다.
예를 들어, 새로운 생물약제학적 의약을 제조하기 위한 포유동물 세포에서의 재조합 항체 또는 Fc 융합 단백질의 과발현시에, 중쇄의 C-말단에서 불균일성을 갖는 분자가 종종 나타난다. 정제된 최종 생성물은 중쇄의 C-말단에 관해서 3 가지 상이한 종을 갖는다: 1) DNA 서열에 따라 C-말단 리신을 갖는 완전한 쇄 (Lys2) 또는 2) 불완전한 쇄 (Lys1) 및 3) 두 가지 쇄 상에서 C-말단 리신의 결실 (Lys0). 두 가지 종의 비율은 예측할 수 없다. 따라서, 차이는 세포, 발효 조건 및 제조 배취에 따라서 나타날 수 있다. 항체 구조가 리신의 이러한 세포내 효소적 절단에 영향을 미치는지 여부는 불명료하다. 현재까지 시판되고 있는 분자를 사용한 절차는 중쇄의 완전한 DNA 서열을 발현시키고, 큰 비용을 들여서 C-말단에서 나타나는 어떤 불균일성을 분석하고 입증하는 것이었다. 따라서, 생성물을 특정화하기 위해서는 C-말단을 분석하는 정확한 방법이 개발되어야 하고, 모든 배취는 이 특징에 관하여 분석되어야 한다 [Alexandru C. Lazar et al; Rapid Commun. Mass Spectrum. 2004; 18: 239-244, Lintao Wang et al; Pharmaceutical Research, Vol. 22, No .8, 2005]. 따라서, 나타난 생성물 불균일성을 분석하는 비용은 상당하다. 분석하는 노력 및 경비를 감소시키는 것이 바람직할 것이다.
기술된 생성물 불균일성의 원인은 현재 알려지지 않았다. 쇄의 구조, 숙주 세포 또는 발효 조건 및 따라서, 세포 내에서 상이한 대사과정이 주된 영향을 갖는지 여부는 불명료하다. 또한, 세포에서 생성물의 제조 시에 어떤 시점 (공동-해독, 해독-후)에서, 어디에서, 그리고 어떤 효소에 의해서 리신의 절단이 수행되는지도 현재는 알려지지 않았다. 따라서, 배취들 사이에서 있을 수 있는 변동은 예방될 수 없고, 따라서 표적화된 역-조절은 불가능하다.
지금까지, 이들 생성물의 사용이 예를 들어, C-말단에서의 불균일성의 결과로 면역병리학적 부작용과 같은 어떤 유해한 효과를 발생시킨다는 징후는 없었다. 따라서, C-말단 리신이 없는 비-천연 서열도 또한, 임상적 효능 및 내성의 면에서 허용될 수 있고, 천연 서열과 동등한 것으로 보인다.
그러나, 현재까지, IgG의 중쇄에서 C-말단 리신은 고도로 보존되기 때문에, C-말단 Lys 코돈의 결실이 있는 치료학적 단백질에 대한 구조물, 특히 항체 또는 Fc 융합 구조물은 기술되지 않았다. 선행기술로부터의 출발 시에, 본 발명에서 항체의 중쇄에 대한 발현 구조물 내의 리신에 대한 코돈은 3' 말단에서 DNA 수준에서 이미 결실되었다. 모든 IgG 서브타입에서, 중쇄의 C-말단은 고도로 보존되며, C-말단에서의 리신은 예를 들어, 인간 및 쥐 항체 둘 다에서 항상 존재한다. 이러한 상황에 비추어, 리신이 발현, 폴딩 (folding) 또는 분비에 특히 중요한 것으로 예상된다. 그러나, 놀랍게도 다양한 카테고리의 IgG를 사용한 본 발명자의 실험은 최초로, C-말단 리신의 결실에도 불구하고 분자는 동물세포 배양 시스템에서 발현되고, 천연 단백질 구조가 배지 내로 분비된다는 것을 밝혀내었다. 특히 놀라운 관점은 이들 구조물이 사용되는 경우에 생성물 역가에서 관찰된 전혀 예상치 못한 증가이다. 이것은 바람직하게는 인간 면역글로불린에서 C-말단 리신 위치의 고도의 보존에 비추어 예상된다. 생성물 역가는 이들 발현 구조물이 사용되는 경우에 적어도 10%까지, 바람직하게는 적어도 20%까지, 특히 바람직하게는 적어도 50%까지 증가된다.
또한, 생성된 항체 이소타입을 분석함으로써 Lys 코돈의 결실의 결과인 생성물 불균일성의 회피의 정성적 및 정량적 증거를 제공할 수 있었다. 두 가지의 상이한 이소타입 (IgG1 및 IgG4)에 대해서는 비교로서 야생형 항체 및 상응하는 리신 결실 돌연변이체가 발현되고, 정제되었다. 그 후, 딘백질 특정화가 수행되었다. 더구나, 예상과는 반대로, 생성물 역가는 적어도 10 내지 20%까지 증가될 수 있었던 것으로 나타났다. 생성물의 후처리 (단백질 A 친화성 크로마토그래피) 및 단백질 특정화 시에, 리신 코돈의 결실은 어떤 유해한 영향을 미치는 것으로 밝혀지지 않았다. 정제방법 및 생성물 특정화 (생성물 수율, 응집 특징)에 대한 다시 한번의 추가의 분석으로 Lys 결실 돌연변이체가 어떤 부정적인 영향도 갖는 것으로 나타나지 않았다. 제조방법, 분석 작업의 감소 및 증가된 생성물 역가에 대한 더 큰 견고성 (robustness)에 비추어, 이 새로운 방법은 명백하게 선행기술보다 우수하다.
현행 선행기술에 비해서 주된 이점은 이들 구조물을 사용하는 경우에 리신이 없는 C-말단의 변이체만이 중쇄에 대해서 나타날 수 있다는 점이다. 따라서, 배취들 사이의 변동 및 생성물 특정화 작업의 양이 있을 가능성은 없다. 본 발명의 특히 놀라운 점은 C-말단 리신이 없는 구조물이 높은 수율에 특히 유리한 증가된 생성물 역가를 유도한다는 점이다.
본 발명은 바람직하게는, 재조합 항체 및/또는 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법에 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한, C-말단 아미노산 결실을 포함하는 다른 분자에 적용될 수도 있다. 이들의 예는 C-말단 아르기닌 결실이 일어난 EPO 및 tPA이다.
본 발명은 이의 한가지 성분이 특히 면역글로불린 도메인 CH3인 최적화된 단백질의 개선된 생산 및 정제에 관한 것이다. 이들 단백질의 빈번하게 관찰되는 효과는 C-말단 리신의 절단이다. 중쇄의 이러한 통상적으로 불완전한 처리는 생성물 불균일성을 유도한다. 이러한 생성물 불균일성을 피하기 위해서, 항체 중쇄의 C-말단 리신의 상응하는 코돈은 재조합 DNA 기술에 의해서 결실되었다. 최적화된 항체에서의 이러한 결실은 놀랍게도, 발현 또는 세포내 단백질 처리에서 불리한 점을 야기하지 않지만, 야생형에 비해서 증가된 생성물 역가를 제공한다. 또한, 최적화된 항체는 감소된 전하 불균일성으로 인하여 더 우수한 용출 공정에 의해 정제 시에 유리한 것으로 입증되었으며, 개선된 균일성을 특징으로 한다. 또 다른 이점은 관심있는 단백질의 정제 시에 C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질의 정제에 비해서 더 낮은 염 농도가 사용된다는 점이다.
본 발명은 선행기술로부터 유래하지 않는다. 현재, 생성물 불균일성은 이것이 방출될 수 있기 전에 각각의 생산 배취에 대해서 분석되어야 한다. 노동-집약적이고 고비용의 분석 방법이 중쇄의 C-말단에서 리신 그룹의 불균일성의 정성적 및 정량적 측정을 위해서 사용될 수 있다. 항체 이소타입의 정량적 측정을 위해서 사용된 확립된 방법은, 때때로 질량분석법 (LC-MS) 또는 전기영동적 분리방법 (모세관 등전점 집중법, CIEF)과 협력한 칼럼 크로마토그래피적 분리방법 (약한 양이온 교환기, WCX)과 같은 제약산업에서 품질 조절에 사용되는 방법이다. 겔-등전전기영동적 집중화만이 리신 불균일성의 정량적 평가를 허용한다.
항체 중쇄의 C-말단 리신 그룹을 이용하여 전하 불균일성을 감소시키기 위한 한가지 접근방법은 모노클로날 항체의 불균일성을 감소시키는 기존의 방법에 기술되어 있다 (EP0361902, US5126250). 불균일성의 감소는 여기에서, pH의 저하, 카복시펩티다제에 의한 C-말단 리신 그룹의 효소적 절단 또는 복수액의 첨가와 같은 다양한 방법에 의해서 달성된다.
효소적 방법에서, 전하 불균일성의 감소는 효소 카복시펩티다제를 이용하여 면역글로불린 항체의 중쇄의 C-말단 리신 그룹을 절단시킴으로써 수득된다. 그러나, 이 방법은 단지 항체의 95%의 균일한 항체 형태 (Lys0)로의 전환을 달성한다. 다른 방법은 다양한 비율 (2:1 내지 1:10)로 복수액을 갖는 불균일한 항체의 배양 또는 배양 배지의 pH의 감소에 존재한다. C-말단 리신 절단에 대한 이들 방법의 효율은 또한 단지 약 95%이다. 모든 방법은 또한, 시간-소모성 (>24시간)이다.
도 1: 재조합 벡터의 개략적 표현
여기에 나타낸 벡터는 CHO-DG44 세포에서 IgG1- 및 IgG4-이소타입의 모노클로날 항체의 발현을 위해서 사용된다. "P/E"는 CMV-인핸서 (enhancer)와 햄스터 Ub/S27a-프로모터의 조합을 나타내며, "CMV"는 CMV-인핸서와 -프로모터의 조합을 나타내고, "P"는 단순히 프로모터 요소를 나타내며, "T"는 전사에 대한 종결 시그널이고, 이것은 전사된 mRNA의 폴리아데닐화를 위해서 필요하다. 각각의 전사 유니트 내에서 전사 개시의 위치 및 방향은 화살표로 표시된다. 증폭가능한 선택적 마커 디하이드로폴레이트-리덕타제는 "dhfr"로 약칭한다. 선택적 마커 네오마이신-포스포트랜스퍼라제는 "npt"로 명시되며, 점돌연변이 F240I에 의해서 생산된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 돌연변이체는 "npt F240I"로 표시된다. "IgG1 HC"는 IgG1 이소타입의 야생형 F19-항체의 중쇄를 암호화하고, "IgG1-Lys"는 C-말단 리신 결실이 있는 이 항체의 중쇄를 암호화한다. "IgG4 HC"는 IgG4-야생형의 중쇄에 대한 유전자를 나타내고, "IgG4-Lys"는 또한, C-말단 리신 결실이 있는 IgG4의 중쇄를 나타낸다. "LC"는 IgG1- 또는 IgG4-항체의 경쇄를 암호화한다.
도 2: IgG1-항체의 일시적 발현에 대한 C-말단 리신 결실의 영향
중쇄의 보존된 C-말단 리신이 IgG1 분자의 발현 또는 분비에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해서, 플라스미드 조합 pBID/F19HC 및 pBIN/F19LC (C-말단 리신을 갖는 IgG1, 그물코 모양 (cross-hatched)의 막대) 또는 BID/IgG1-Lys 및 pBIN/F19LC (C-말단 리신 결실이 있는 IgG1, 점을 찍은 막대)에 의한 CHO-DG44 세포의 공동-형질감염이 수행된다. 동시에, 형질감염 효율을 비교하기 위해서 SEAP 발현 플라스미드 (= 분비된 알칼리성 포스파타제)를 공동-형질감염시킨다. 형질감염시킨 지 48시간 후에, 세포 배양 상청액을 제거하고, IgG1 역가를 ELISA에 의해서 측정하고, SEAP 활성을 측정한다. IgG1-역가는 형질감염 효율에 관해서 보정된다. 이 도면은 두 가지 변이체 모두에 대한 생성물의 동등한 양을 갖는 각각의 경우에서 10개의 유사한 풀 (pool)의 평균을 나타낸다.
도 3: 안정한 비증폭된 세포 풀에서 IgG1-야생형 및 IgG1-리신-결실 돌연변이체의 발현
안정하게 형질감염된 세포에서, IgG1 항체의 발현에 대한 C-말단 리신 결실의 영향을 조사한다. 이를 위해서, CHO-DG44 세포를 플라스미드 조합 pBID/F19HC 및 pBIN/F19LC (C-말단 리신을 갖는 IgG1 = IgG1-WT) 또는 BID/IgG1-Lys 및 pBIN/F19LC (C-말단 리신 결실이 있는 IgG1 = IgG1-Lys)로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포 풀의 2 내지 3주 선택 후, 각각의 경우에 G418을 첨가한 하이포크산틴/티미딘-부재 배지 내의 플라스미드 조합당 10개에서 세포 배양 상청액 내에서 생산된 IgG1 항체의 농도를 ELISA에 의해서 결정하고, 세포당 및 1일당 비생산성을 계산한다. 막대는 75 ㎠ 세포 배양 플라스크 내에서의 각각의 경우에 3 내지 4 배양 계대로 구성된 시험에서 모든 풀의 비생산성 (점을 찍은 막대) 또는 역가 (줄무늬가 있는 막대)의 평균값을 나타낸다.
도 4: 안정한 증폭된 세포 풀에서 IgG1-야생형 및 IgG1-리신 결실 돌연변이체의 발현
CHO-DG44 세포를 플라스미드 조합 pBID/F19HC 및 pBIN/F19LC (C-말단 리신을 갖는 IgG1 = IgG1-야생형) 또는 BID/IgG1-Lys 및 pBIN/F19LC (C-말단 리신 결실이 있는 IgG1 = IgG1-리신)로 형질감염시킨다. G418을 첨가한 하이포크산틴/티미딘-부재 배지 내에서 형질감염된 세포 풀 (각각의 경우에, 플라스미드 조합당 10개의 풀)의 2 내지 3주 선택 후에, 이어서 배양 배지에 100 nM 메토트렉세이트 (MTX)를 첨가함으로써 DHFR-매개된 유전자 증폭을 수행한다. 세포 배양 상청액 내에 생산된 IgG1 항체의 농도를 ELISA에 의해서 결정하고, 세포당 및 1일당 비생산성을 계산한다. 막대는 한편으로는, 75 ㎠ 세포 배양 플라스크 내에서의 각각 6회의 배양 계대를 포함하는 시험에서 각각의 개개 풀의 비생산성 (점이 있는 막대) 또는 역가 (줄무늬가 있는 막대)의 평균값을 나타낸다. 다른 한편으로, 모든 풀 데이터의 평균값 (MW)도 또한 제시된다.
도 4A는 IgG1 야생형으로 형질감염된 세포 풀의 데이터를 나타내는 반면에, 도 4B는 IgG1-리신-결실 변이체로 형질감염된 세포 풀의 데이터를 나타낸다. 후자는 IgG1-야생형으로 형질감염된 세포 풀보다 120% 더 큰 비생산성으로 평균하여 86% 더 많은 항체를 생산한다.
도 5: IgG4-항체의 일시적 발현에 대한 C-말단 리신 결실의 영향
중쇄의 보존된 C-말단 리신이 IgG4 분자의 발현 또는 분비에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해서, 플라스미드 조합 pBIDa/IgG4 HC 및 pBIN8a/IgG4 LC (C-말단 리신을 갖는 IgG4, 그물코 모양의 막대) 또는 BIDa/IgG4-Lys 및 pBIN8a/IgG4 LC (C-말단 리신 결실이 있는 IgG1, 점을 찍은 막대)에 의한 CHO-DG44 세포의 공동-형질감염이 수행된다. 동시에, 형질감염 효율을 비교하기 위해서 SEAP 발현 플라스미드 (= 분비된 알칼리성 포스파타제)를 공동-형질감염시킨다. 형질감염시킨 지 48시간 후에, 세포 배양 상청액을 제거하고, IgG4 역가를 ELISA에 의해서 측정하고, SEAP 활성을 측정한다. IgG4 역가는 형질감염 효율에 관해서 보정된다. 이 도면은 각각의 경우에 10개의 유사한 풀의 평균을 나타내며, 여기에서 C-말단 리신 결실을 갖는 IgG4-항체의 생성물 역가가 다소 더욱 크다.
도 6: 안정한 증폭된 세포 풀에서 IgG4-야생형 및 IgG4-리신 결실 돌연변이체의 발현
CHO-DG44 세포를 플라스미드 조합 pBIDa/IgG4 HC 및 pBIN8a/IgG4 LC (C-말단 리신을 갖는 IgG4 = IgG4-야생형) 또는 BIDa/IgG4-Lys 및 pBIN8a/IgG4 LC (C-말단 리신 결실이 있는 IgG4 = IgG4-리신)로 형질감염시킨다. G418을 첨가한 하이포크산틴/티미딘-부재 배지 내에서 형질감염된 세포 풀 (각각의 경우에, 플라스미드 조합당 10개의 풀)의 2 내지 3주 선택 후에, 이어서 배양 배지에 100 nM 메토트렉세이트 (MTX)를 첨가함으로써 DHFR-매개된 유전자 증폭을 수행하여 IgG4-야생형에 대해서 4개 및 IgG4-리신 결실 변이체에 대해서 6개의 성공적으로 증폭된 세포 풀을 수득한다. 세포 배양 상청액 내에 생산된 IgG4 항체의 농도를 ELISA에 의해서 결정하고, 세포당 및 1일당 비생산성을 계산한다. 막대는 한편으로는, 75 ㎠ 세포 배양 플라스크 내에서의 각각 6회의 배양 계대를 포함하는 시험에서 각각의 개개 풀의 비생산성 (점이 있는 막대) 또는 역가 (줄무늬가 있는 막대)의 평균값을 나타낸다. 다른 한편으로, 모든 풀 데이터의 평균값 (MW)도 또한 제시된다.
도 6A는 IgG4 야생형으로 형질감염된 세포 풀의 데이터를 나타내는 반면에, 도 6B는 IgG4-리신-결실 변이체로 형질감염된 세포 풀의 데이터를 나타낸다. 후자는 IgG4-야생형으로 형질감염된 세포 풀보다 70% 더 큰 비생산성으로 평균하여 63% 더 많은 항체를 생산한다.
도 7: 유전자 증폭의 제2 라운드 (round) 후의 세포 풀에서 IgG4-야생형 및 IgG4-리신-결실 돌연변이체의 발현
CHO-DG44 세포를 플라스미드 조합 pBIDa/IgG4 HC 및 pBIN8a/IgG4 LC (C-말단 리신을 갖는 IgG4 = IgG4-야생형) 또는 BIDa/IgG4-Lys 및 pBIN8a/IgG4 LC (C-말단 리신 결실이 있는 IgG4 = IgG4-리신)로 형질감염시킨다. 우선 첫째로, 형질감염된 세포 풀의 2 내지 3주 선택을 G418을 첨가한 하이포크산틴/티미딘-부재 배지 내에서 수행한다 (각각의 경우에, 플라스미드 조합당 10개의 풀). 그 후, 단계적 DHFR-매개된 유전자 증폭을 수행한다. 제1 단계에서는, 100 nM 메토트렉세이트 (MTX)를 배양 배지에 첨가한다. 이 유전자 증폭으로부터 제공되는 이들 안정한 세포 풀을 사용하여, 배양 배지에 400 nM의 MTX를 첨가함으로써 제2 라운드의 유전자 증폭을 수행한다. 6개의 성공적으로 증폭된 세포 풀을 IgG4-리신 결실 변이체에 대해서, 및 4개의 세포 풀을 IgG4-야생형에 대해서 수득한다. 세포 배양 상청액 내에 생산된 IgG4 항체의 농도를 ELISA에 의해서 결정하고, 세포당 및 1일당 비생산성을 계산한다. 막대는 한편으로는, 75 ㎠ 세포 배양 플라스크 내에서의 각각 4회의 배양 계대를 포함하는 시험에서 각각의 개개 풀의 비생산성 (점이 있는 막대) 또는 역가 (줄무늬가 있는 막대)의 평균값을 나타낸다. 다른 한편으로, 모든 풀 데이터의 평균값 (MW)도 또한 제시된다.
도 7A는 IgG4 야생형으로 형질감염된 세포 풀의 데이터를 나타내는 반면에, 도 7B는 IgG4-리신-결실 변이체로 형질감염된 세포 풀의 데이터를 나타낸다. 후자는 IgG4-야생형으로 형질감염된 세포 풀보다 66% 더 큰 비생산성으로 평균하여 53% 더 많은 항체를 생산한다.
도 8: 단백질 A HPLC에 의한 생성물 수율의 정량화
IgG1 및 IgG4 l의 생성물 수율에 대해서 측정된 값은 리신 결실과는 무관하게 90% 이상이다. 이소타입 및 상응하는 리신 변이체 내의 단량체의 비율은 89.23 내지 97.93%의 범위이다.
수율 및 단량체 함량은 둘 다 WT 변이체의 경우보다 IgG1-Lys의 경우에 더 크다.
도 9: 이소타입 IgG1 및 IgG4의 등전점 집중법 (IEF)
항체는 시험관 내에서, 존재하는 어떤 C-말단 리신이라도 절단시키기 위해서 카복시펩티다제 B와 함께 항온처리한다. 이소타입 IgG1 (+리신) (= IgG1-야생형)은 카복시펩티다제 B와 함께 항온처리한 후에 더 적은 수의 단백질 밴드를 갖는다 (Lys2 및 Lys1에서 C-말단 리신의 절단 => Lys0). 이소타입 IgG1 (-리신) (= C-말단 리신 결실 변이체)은 카복시펩티다제 B 항온처리와는 관계없이 동일한 밴드 패턴을 갖는다. IEF 마커 밴드는 8.8 kDa 및 8.6 kDa에서 찾을 수 있다.
도 10: LC-MS에 의한 C-말단 리신의 검출
이소타입 IgG4 (+리신) (= IgG4-야생형)의 경우에, C-말단 리신을 갖는 중쇄 (HC)의 비율은 20%이고 (리신을 갖는 HC는 연한-회색 막대), 변이체 IgG4 (-리신) (=C-말단 리신 결실 변이체)에서 이것은 0%이다. 진한-회색 막대는 리신이 없는 중쇄 (HC)의 비율을 나타낸다.
도 11: WCX에 의한 항체의 분리
약양이온 교환 (WCX)에 의한 IgG1-WT (A) 및 IgG1 리신 (B)의 분리. 카복시펩티다제 B를 사용한 리신의 효소적 절단은 WT IgG1에서 염기성 피크 1 및 2의 감소를 나타낸다. CpB가 없는 IgG1 WT (상부 라인) 및 IgG1 WT +CpB (하부 라인)의 오버레이 (overlay) (C)는 염기성 피크 면적에서 총 9.8%까지의 감소를 나타낸다. CpB가 없는 IgG1-Lys (상부 라인) 및 IgG1-Lys +CpB (하부 라인)의 오버레이 (D)는 염기성 피크 면적의 감소를 나타내지 않는다 (약 1% 이하).
도 12: LC-MS에 의한 C-말단 리신의 정량화
LC-MS에 의한 IgG4의 항체 중쇄에서 C-말단 리신의 비율의 정량화 (IgG4 WT: 점선 (상부) 및 IgG4-Lys: 실선 (하부)). 환원 및 크로마토그래피 분리 후에, C-말단 리신이 있는 중쇄 (리신이 있는 HC 1-447) 또는 리신이 없는 중쇄 (리신이 없는 HC 1-446)의 정량적 양을 측정한다. 화살표는 글리코실화 상태에 따른 리신 절단에 의한 질량 이동을 나타낸다. 표시된 피크는 중쇄의 글리코실화를 특정화한다 (흑색: C-말단 리신을 갖는 HC, 회색 배경: C-말단 리신이 없는 HC).
정의
본 발명의 이 설명의 범위 내에서 사용된 용어 및 명칭은 이하에 정의되는 다음의 의미를 갖는다. 일반적인 용어 "함유하는" 또는 "함유한다"는 더욱 특정한 용어 "~로 구성되는"을 포함한다. 또한, 용어 "단수" 및 "복수"는 제한적으로 사용되지 않는다.
용어 "역가"는 규정된 용적 내의 생성물 농도의 명시, 예를 들어, ng/㎖, ㎎/㎖, ㎎/ℓ, g/ℓ이다.
용어 "비생산성 (specific productivity)"은 세포당 및 1일당, pg로 나타낸 것으로, 세포에 의해서 생산된 단백질의 양을 의미한다. 이것은 수학식 pg/((Ct-Co) t / ln (Ct-Co))를 사용하여 계산되며, 여기에서 Co 및 Ct는 접종 또는 수거 시의 세포의 수를 나타내고, t는 배양기간이다.
용어 "수율"은 매트릭스, 예를 들어, 단백질 A 매트릭스 상에서 크로마토그래피에 의해 분리한 후에 다양한 생성물 변이체의 회수 백분율을 설명한다.
선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해서 암호화된 단백질의 생성물 농도는 ELISA에 의해서 측정될 수 있지만, 단백질 A HPLC, 웨스턴 블롯 (Western Blot), 방사선면역측정법, 면역침강법, 단백질의 생물학적 활성의 검출, 단백질의 면역 염색에 이은 FACS 분석 또는 형광 현미경검사, FACS 분석 또는 분광광도법에 의한 형광 단백질의 직접적인 검출과 같은 다른 방법에 의해서도 측정될 수 있다.
관심있는 유전자:
본 발명에 따르는 발현 벡터 내에 함유된 관심있는 유전자는 관심있는 생성물을 암호화하는 어떤 길이의 뉴클레오타이드 서열이라도 포함한다. 유전자 생성물 또는 "관심있는 생성물"은 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 그러나, 이것은 또한, RNA 또는 안티센스 RNA일 수도 있다. 관심있는 유전자는 이의 전체 길이로, 단축된 형태로, 융합 유전자로서, 또는 표지된 유전자로서 존재할 수 있다. 이것은 게놈 DNA 또는 바람직하게는 cDNA 또는 상응하는 단편 또는 융합물일 수 있다. 관심있는 유전자는 천연 유전자 서열일 수 있거나, 이것은 돌연변이되거나 다른 식으로 변형될 수 있다. 이러한 변형에는 특정한 숙주 세포에 적용시키기 위한 코돈 최적화 및 인간화가 포함된다. 관심있는 유전자는 예를 들어, 분비되거나, 세포질성이거나, 핵-위치하거나, 막-결합되거나, 세포 표면-결합된 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
용어 "핵산", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편뿐만 아니라 일본쇄 또는 이본쇄로 나타나고, 유전자의 암호화 또는 비-암호화 쇄를 나타낼수 있는 게놈성 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 핵산 서열은 부위-특이적 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술을 사용하여 변형될 수 있다.
"암호화"는 예를 들어, 생물학적 과정에서의 rRNA, tRNA, mRNA, 그 밖의 다른 RNA 분자, cDNA 또는 폴리펩타이드와 같은 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 매트릭스로서 작용하는 핵산 내의 뉴클레오타이드의 특정한 서열, 예를 들어, 염색체 내의 유전자 또는 mRNA의 특성 또는 능력을 의미한다. 따라서, 원하는 단백질이 mRNA의 전사 및 후속 해독에 의해서 세포 또는 또 다른 생물학적 시스템에서 생산된다면, 유전자는 단백질을 암호화한다. 이의 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하며, 통상적으로 또한, 서열 데이터뱅크, 예를 들어, EMBL 또는 진뱅크 (GenBank)에서 제공되는 암호화 쇄, 및 또한 전사를 위한 매트릭스로 작용하는 유전자 또는 cDNA의 비-암호화 쇄는 둘 다 생성물 또는 단백질을 암호화한 것으로 언급될 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 또한, 변성 유전자 암호를 기준으로 하여 상이한 순서의 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 단백질의 동일한 아미노산 서열을 제공하는 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산은 또한, 인트론 (intron)을 함유할 수 있다.
용어 "cDNA"는 유전자로부터 생산된 mRNA 또는 다른 RNA로부터의 제2 DNA 쇄의 역전사 및 합성에 의해서 제조된 데옥시리보핵산을 나타낸다. cDNA가 이본쇄 DNA 분자로 존재한다면, 이것은 암호화 및 비-암호화 쇄 둘 다를 함유한다.
관심있는 단백질/생성물
생물약제학적 중요성을 갖는 단백질/폴리펩타이드는 예를 들어, 항체 또는 면역글로불린, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 효능제 또는 길항제로 작용하고/하거나 치료학적 또는 진단적 용도를 갖는 모든 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 관심있는 다른 단백질은 예를 들어, 소위 "세포 조작 (Cell Engineering)"의 범위 내에서 숙주 세포의 특성을 변경하기 위해서 사용되는 단백질/폴리펩타이드, 예를 들어, 항-아폽토시스 단백질, 샤페론 (chaperone), 대사적 효소, 글리코실화 효소 및 이들의 유도체 또는 단편이지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 서열 또는 단백질에 대해서 사용되며, 모든 길이의 아미노산의 중합체를 나타낸다. 이 용어는 또한, 글리코실화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 처리와 같은 반응에 의해서 후-해독으로 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는 예를 들어, 이의 생물학적 활성을 유지하면서 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 및 다른 단백질과의 융합에 의해서 변형될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 다량체화할 수 있고, 호모머 및 헤테로머를 형성할 수 있다.
"면역글로불린" 또는 "항체"는 분화된 B-림프구 (형질세포)로부터의 외인성 물질 (= 항원)에 대한 숙주 유기체의 반응으로 형성되는 글로불린 중에서 선택되는 단백질이다. 이들은 특히 이들 외인성 물질에 대해서 방어하는 작용을 한다. 여기에는 다음의 다양한 클래스의 면역글로불린이 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW. 용어 면역글로불린 및 항체는 상호 교환적으로 사용된다.
치료학적 항체의 예는 모노클로날, 폴리클로날, 다중특이성 및 단일 쇄 항체 또는 면역글로불린 및 이의 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc' 단편, 경쇄 (L) 및 중쇄 (H) 면역글로불린 및 이의 불변, 가변 또는 과가변 부분뿐만 아니라 Fv 및 Fd 단편이다. 항체는 인간 또는 비-인간 기원의 것일 수 있다. 인간화 및 키메릭 항체도 또한 가능하다.
Fab 단편 (fragment antigen binding = Fab)은 인접한 불변 부분에 의해서 함께 유지되는 두 개의 쇄의 가변 부분으로 구성된다. 이들은 예를 들어, 통상적인 항체로부터 파파인과 같은 프로테아제로 처리하거나, DNA 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 그 밖의 다른 항체 단편은 펩신에 의한 단백분해적 분해에 의해서 생산될 수 있는 F(ab')2 단편이다.
유전자 클로닝에 의해서, 또한 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 부분만으로 구성된 단축된 항체 단편을 제조할 수 있다. 이들은 Fv 단편 (fragment variable = 가변 부분의 단편)으로 공지되어 있다. 불변 쇄의 시스테인 그룹을 통한 공유결합은 이들 Fv 단편 내에서 있을 수 없기 때문에, 이들은 종종 몇 가지의 다른 방법에 의해서 안정화된다. 이러한 목적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 종종 약 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 짧은 펩타이드 단편을 이용하여 함께 결합된다. 이것은 VH 및 VL이 펩타이드 링커에 의해서 함께 결합된 단일 폴리펩타이드 쇄를 생산한다. 이러한 항체 단편은 또한 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)으로 불린다. scFv 항체의 예는 공지되고 기술되어 있다.
지난 몇 년 동안, 다량체성 scFv 유도체를 생산하기 위한 다양한 방법이 개발되었다. 목적은 개선된 약력학적 특성 및 증가된 결합 친화성을 갖는 재조합 항체를 생산하는 것이다. scFv 단편의 다량체화를 달성하기 위해서, 이들은 다량체화 도메인과의 융합 단백질로서 생산된다. 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG 또는 류신 지퍼 도메인 (Leucine Zipper domain)과 같은 나선 구조 ("꼬인 코일 구조 (coiled coil structure)")의 CH3 부분일 수 있다. 다른 방법에서는, scFv 단편의 VH 및 VL 부분 사이의 상호작용이 다량체화를 위해서 사용된다 (예를 들어, 디아-, 트리- 및 펜타바디).
용어 "디아바디 (diabody)"는 본 기술분야에서 2가 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내기 위해서 사용된다. scFv 분자에서 펩타이드 링커를 5 내지 10개의 아미노산으로 단축시키는 것은 VH/VL 쇄를 중첩시킴으로써 동종이량체의 형성을 제공한다. 디아바디는 추가로, 삽입된 디설파이드 브릿지에 의해서 안정화될 수 있다. 디아바디의 예는 문헌에서 찾을 수 있다.
용어 "미니바디 (minibody)"는 본 기술분야에서 2가 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내기 위해서 사용된다. 이것은 이량체화 부분으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 부분을 함유하는 융합 단백질로 구성된다. 이것은 또한 IgG의 힌지 (hinge) 부분, 및 링커 부분을 이용하여 scFv 단편을 연결시킨다.
용어 "트리아바디 (triabody)"는 본 기술분야에서 3가 동종삼량체성 scFv 유도체를 나타내기 위해서 사용된다. 링커 서열의 사용이 없는 VH-VL의 직접 융합은 삼량체의 형성을 유도한다.
2가, 3가 또는 4가 구조를 갖는 미니 항체로서 본 기술분야에서 공지된 단편은 또한 scFv 단편의 유도체이다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체성 꼬인 코일 구조를 이용하여 달성된다.
본 발명에 따르는 발현 벡터의 제조:
본 발명에 따르는 발현 벡터는 이론적으로는, 본 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해서 제조될 수 있다. 여기에는 또한, 벡터의 기능적 구성요소, 예를 들어, 적합한 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 항생제 내성 유전자, 선택적 마커, 복제 개시점 및 스플라이싱 시그널 (splicing signal)이 기술된다. 통상적인 클로닝 벡터를 사용하여 이들, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파아지, 파지미드 (phagemid), 코스미드 (cosmid), 또는 배큘로바이러스 (baculovirus), 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노-연관된 바이러스 및 단순포진 바이러스와 같은 바이러스성 벡터뿐만 아니라 합성 또는 인공적 염색체 또는 미니-염색체를 생산할 수 있다. 진핵성 발현 벡터는 일반적으로, 또한 예를 들어, 세균 내에서 벡터의 복제 및 선택을 허용하는 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자와 같은 원핵성 서열을 함유한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입을 위한 다수의 클로닝 부위를 함유하는 다수의 진핵성 발현 벡터는 공지되어 있으며, 몇 가지는 다양한 회사 (예를 들어, Stratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI, USA; 또는 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 상업적으로 수득할 수 있다.
근본적으로, 발현 벡터 내에서 유전자의 발현은 하나 또는 그 이상의 전사 유니트로부터 출발하여 일어날 수 있다. 용어 전사 유니트는 전사되는 하나 또는 그 이상의 유전자를 함유하는 부분으로 정의된다. 전사 유니트 내의 유전자는 이러한 유니트 내의 모든 유전자가 동일한 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 전사 조절 하에 있도록 하는 방식으로 서로 기능적으로 연결된다. 유전자의 이러한 전사적 연결의 결과로, 하나 이상의 단백질 또는 생성물이 전사 유니트로부터 전사되고, 이에 따라 발현될 수 있다. 각각의 전사 유니트는 그 안에 함유된 유전자 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절요소를 함유한다. 각각의 전사 유니트는 동일하거나 상이한 조절요소를 함유할 수 있다. IRES 요소 또는 인트론 (intron)이 전사 유니트 내에서 유전자의 기능적 연결을 위해서 사용될 수 있다.
발현 벡터는 예를 들어, 관심있는 유전자 (또는 유전자들) 및 선택적 마커 유전자를 발현시키기 위한 단일 전사 유니트를 함유할 수 있다. 대신으로, 이들 유전자는 또한, 두 개 또는 그 이상의 전사 유니트 내에 배열될 수도 있다. 전사 유니트 내에서 유전자의 다양한 조합이 있을 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서는, 하나, 둘 또는 그 이상의 전사 유니트로 구성된 하나 이상의 발현 벡터가 공동-형질감염에 의해서, 또는 원하는 어떤 순서로든 연속적 형질감염에 의해서 숙주 세포 내에 삽입될 수 있다. 각각의 벡터 상에서 조절요소와 유전자의 어떤 조합이라도 선택될 수 있지만, 단 전사 유니트의 적절한 발현이 보장되어야 한다. 필요한 경우에, 다른 조절요소 및 유전자, 예를 들어, 관심있는 추가의 유전자 또는 선택적 마커가 발현 벡터 상에 위치할 수 있다.
숙주 세포:
본 발명에 따르는 발현 벡터에 의한 형질감염을 위해서는 진핵성 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및 더욱 특히는, 마우스, 랫트 및 햄스터 세포주와 같은 설치류 세포가 사용된다. 본 발명에 따르는 발현 벡터에 의한 상응하는 세포의 성공적인 형질감염은 역시 본 발명의 대상인 형질감염, 유전적 변형, 재조합체 또는 유전자이식 세포를 제공한다.
본 발명의 목적에 바람직한 숙주 세포는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44 세포와 같은 햄스터 세포 또는 이들 세포주의 유도체/자손이다. 특히 바람직한 것은 CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21 세포, 특히 CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포이다. 또한 적합한 것은 마우스로부터의 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포, 및 이들 세포주의 유도체/자손이다. 그러나, 이들 세포주, 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 설치류를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다른 포유동물 세포, 또는 효모, 곤충, 조류 및 식물 세포를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 진핵성 세포의 유도체 및 자손도 또한 생물약제학적 단백질의 생산을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따르는 발현 벡터 중의 하나에 의한 진핵성 숙주 세포의 형질감염은 통상적인 방법에 의해서 수행된다. 형질감염의 적합한 방법에는 예를 들어, 리포좀-매개된 형질감염, 인산칼슘 공침전, 전기천공, 다양이온 (polycation)- (예를 들어, DEAE 덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질 융합, 미세주사 및 바이러스 감염이 포함된다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 구조물이 숙주 세포의 게놈 또는 인공적 염색체/미니염색체 내로 통합되거나, 숙주 세포 내에 안정한 방식으로 에피좀적으로 함유되는 안정한 형질감염이 수행된다. 해당하는 숙주 세포 내에서 이종 유전자의 최적 형질감염 빈도 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 바람직하다. 정의상, 숙주 세포 내에 삽입된 모든 서열 또는 모든 유전자는 숙주 세포와 관련하여 "이종 서열" 또는 "이종 유전자"로 불린다. 이것은 비록 도입될 서열 또는 도입될 유전자가 숙주 세포의 내인성 서열 또는 내인성 유전자와 동일하더라도 적용된다. 예를 들어, 햄스터 숙주 세포 내에 도입된 햄스터 액틴 유전자는 정의상 이종 유전자이다.
예를 들어, 모노클로날 항체 (mAb)와 같은 헤테로머성 단백질의 재조합체 생산 시에, 적합한 숙주 세포의 형질감염은 이론적으로는 두 가지 상이한 방법에 의해서 수행될 수 있다. 이러한 종류의 mAb는 다수의 서브유니트, 중쇄 및 경쇄로 구성된다. 이들 서브유니트를 암호화한 유전자는 단일 플라스미드 상의 독립적이거나 멀티시스트로닉 (multicistronic) 전사 유니트 내에 수용될 수 있으며, 따라서 이에 의해 숙주 세포가 형질감염된다. 이것은 숙주 세포의 게놈 내로 통합시킨 후에 유전자의 화학량론적 표시를 보장하고자 하는 것이다. 그러나, 독립적인 전사 유니트의 경우에, 이에 의해서 상이한 단백질을 암호화하는 mRNA가 동일한 안정성 및 전사 및 해독 효율을 나타내는 것이 보장되어야 한다. 두 번째 경우에, 유전자의 발현은 단일 프로모터를 이용하여 멀티시스트로닉 전사 유니트 내에서 일어나며, 단지 하나의 전사물이 형성된다.
IRES 요소를 사용함으로써, 유전자의 매우 효율적인 해독 개시가 제2 및 후속 시스트론 (cistron)에서 수득된다. 그러나, 이들 시스트론에 대한 발현속도는 이의 해독 개시가 소위 "cap"-의존적 전-개시 컴플렉스를 이용함으로써 IRES-의존적 해독 개시보다 실질적으로 더 효율적인 제1 시스트론의 경우보다 더 낮다. 시스트론의 정확한 동몰량의 발현을 달성하기 위해서, 예를 들어, IRES 요소와 함께 균일한 발현 속도를 보장하는 추가의 시스트론내 요소가 도입될 수 있다.
본 발명에 따라 바람직한, 다수의 이종 단백질을 동시에 생산하는 또 다른 가능한 방법은 유전자가 상이한 발현 벡터에 별도로 통합되는 공동-형질감염이다. 이것은 유전자 및 유전자 생성물의 서로에 대한 특정의 비율을 선택할 수 있고, 이에 의해서 mRNA 안정성 및 전사 및 해독의 효율에 있어서의 어떤 차이라도 균형이 잡히도록 할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 발현 벡터는 그들의 작은 크기로 인하여 더 안정하며, 클로닝 중 및 형질감염 중에 모두 취급하기가 더 용이하다.
따라서, 본 발명의 한가지 특정한 구체예에서, 숙주 세포는 관심있는 하나 또는 그 이상의 다른 단백질을 암호화된 유전자를 갖는 하나 또는 그 이상의 벡터에 의해서 추가로 형질감염, 바람직하게는 공동-형질감염된다. 공동-형질감염을 위해서 사용된 다른 벡터 또는 벡터들은 예를 들어, 동일한 프로모터의 조절 하의, 바람직하게는 동일한 프로모터/인핸서 조합의 조절 하의 관심있는 다른 단백질 또는 단백질들에 대해서, 및 적어도 하나의 선택적 마커, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제를 암호화한다.
본 발명의 또 다른 특정한 구체예에서, 숙주 세포는 적어도 두 개의 진핵성 발현 벡터에 의해서 공동-형질감염되며, 두 개의 벡터 중의 적어도 하나는 적어도 관심있는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 함유하는 한편 다른 벡터는 어떤 조합, 위치 및 배향으로나 본 발명에 따르는 하나 또는 그 이상의 핵산을 함유하고, 임의로 또한, 관심있는 적어도 하나의 유전자를 암호화하고, 이들 본 발명에 따르는 핵산은 다른 벡터와의 공동-통합에 의해서, 다른 공동-형질감염된 벡터 상에 위치하는 관심있는 유전자에 그들의 전자- 또는 발현-증진 활성을 부여한다.
본 발명에 따르면, 숙주 세포는 바람직하게는, 무혈청 조건 하에, 임의로 동물 단백질/펩타이드가 없는 배지 내에서 정착되고, 순화되고, 배양된다. 상업적으로 입수할 수 있는 배지의 예로는 햄스 (Ham's) F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브 (Iscove's) 변형된 둘베코 배지 (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), 무혈청 CHO-배지 (Sigma) 및 단백질-부재 CHO-배지 (Sigma)가 포함된다. 이들 각각의 배지에는 임의로 다양한 화합물, 예를 들어, 호르몬 및/또는 다른 성장인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자, 인슐린-유사 성장인자), 염류 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코즈 또는 그 밖의 다른 동등한 영양소, 항생제 및/또는 미량원소가 보충될 수 있다. 비록 무혈청 배지가 본 발명에 따라 바람직하지만, 숙주 세포는 또한, 적합한 양의 혈청과 혼합된 배지를 사용하여 배양될 수도 있다. 하나 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 세포를 선택하기 위해서는, 하나 또는 그 이상의 선택제 (selecting agent)가 배지에 첨가된다.
용어 "선택제"는 해당하는 선택적 마커 유전자에 대한 결핍이 있는 숙주 세포의 성장 또는 생존에 영향을 미치는 물질을 나타낸다. 본 발명의 범위 내에서는, 제네티신 (G418)이 야생형 또는 바람직하게는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 보유하는 이종 숙주 세포의 선택을 위한 배지 첨가제로서 바람직하게 사용된다. 숙주 세포가 다수의 발현 벡터에 의해서 형질감염되는 경우에, 예를 들어, 관심있는 몇 개의 유전자가 숙주 세포에 별도로 도입되는 경우에, 이들은 일반적으로 상이한 선택적 마커 유전자를 갖는다.
"선택적 마커 유전자"는 배양 배지에 상응하는 선택제를 첨가함으로써 이 유전자를 함유하는 세포의 특이적 선택이 가능하게 하는 유전자이다. 일례로서, 항생제 내성 유전자가 양성 선택적 마커로 사용될 수 있다. 이 유전자에 의해서 형질전환된 세포만이 상응하는 항생제의 존재 하에서 성장할 수 있고, 이에 따라서 선택될 수 있다. 반면에, 형질전환되지 않은 세포는 이들 선택조건 하에서 성장하거나 생존할 수 없다. 여기에는 양성, 음성 및 이중기능성 선택적 마커가 있다. 양성 선택적 마커는 선택제에 대한 내성을 부여함으로써, 또는 숙주 세포에서의 대사적 또는 이화적 결함을 보상함으로써 형질전환된 세포의 선택, 및 이에 따른 증량을 허용한다. 대조적으로, 선택적 마커에 대한 유전자를 받아들인 세포는 음성 선택적 마커에 의해서 선택적으로 제거될 수 있다. 이것의 예는, 아시클로비르 또는 간시클로비르의 동시 첨가에 의한 세포 내에서의 이의 발현이 이의 제거를 유도하는 단순포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자이다. 증폭가능한 선택적 마커를 포함하는 본 발명에서 사용되는 선택적 마커에는 유전적으로 변형된 돌연변이체 및 변이체, 단편, 기능적 등가물, 유도체, 동족체, 및 다른 단백질 또는 펩타이드와의 융합물이 포함되지만, 단 선택적 마커는 이의 선택적 특질을 보유하여야 한다. 이러한 유도체는 선택적인 것으로 생각되는 부분 또는 도메인에서 아미노산 서열의 상당한 상동성을 나타낸다. 문헌은 이중기능성 (양성/음성) 마커를 포함한 다수의 선택적 마커 유전자를 기술하고 있다. 진핵 세포에서 통상적으로 사용되는 선택적 마커의 예로는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 (APH), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 신테타제, 아스파라긴 신테타제, 및 네오마이신 (G418), 퓨로마이신, 히스티디놀 D, 블레오마이신, 플레오마이신 및 제오신에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다.
증폭가능한 선택적 마커 유전자:
또한, 본 발명에 따르는 세포는 임의로, 또한 이들을 증폭가능한 선택적 마커 유전자의 증폭을 유도하는 선택제의 존재 하에서 배양하는 하나 또는 그 이상의 유전자 증폭단계에 적용될 수도 있다.
전제조건은 숙주 세포가 증폭가능한 선택적 마커를 암호화하는 유전자에 의해서 추가로 형질감염되어야 하는 것이다. 이것은 본 발명에 따르는 발현 벡터 중의 하나 상에 존재하거나, 또 다른 벡터를 이용하여 숙주 세포에 도입될 증폭가능한 선택적 마커를 암호하는 유전자의 경우에 생각할 수 있다.
증폭가능한 선택적 마커 유전자는 통상적으로, 특정의 배양조건 하에서 진핵 세포의 성장에 필요한 효소를 암호화한다. 예를 들어, 증폭가능한 선택적 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 암호화할 수 있다. 이 경우에, 유전자는 이것과 함께 형질감염된 숙주 세포가 선택제 메토트렉세이트 (MTX)의 존재 하에서 배양되는 경우에 증폭된다.
DHFR 마커는 CHO-DG44 또는 CHO-DUKX와 같은 DHFR-음성 기본 세포를 사용하는 경우의 선택 및 후속 증폭에 특히 적합한데, 이는 이들 세포가 내인성 DHFR을 발현하지 않고, 따라서 퓨린-부재 배지 내에서 성장하지 않기 때문이다. 따라서, 여기에서 DHFR 유전자는 우선 선택적 마커로 사용될 수 있으며, 형질전환된 세포는 하이포크산틴/티미딘-부재 배지 내에서 선택된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 그 밖의 다른 증폭가능한 선택적 마커 유전자는 예를 들어, 글루타민-신테타제, 메탈로티오네인, 아데노신-데아미나제, AMP-데아미나제, UMP-신타제, 크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라제 및 티미딜레이트-신테타제이다.
고-생산성 숙주 세포의 유전자 발현 및 선택:
용어 "유전자 발현" 또는 "발현"은 숙주 세포 내에서 이종 유전자 서열의 전사 및/또는 해독에 관한 것이다. 발현 속도는 일반적으로, 숙주 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기초로 하여, 또는 관심있는 유전자에 의해서 암호화된, 생산된 유전자 생성물의 양을 기초로 하여 결정될 수 있다. 선택된 뉴클레오사이드 서열의 전사에 의해서 생산된 mRNA의 양은 예를 들어, 노던 블롯 하이브리드화 (northern blot hybridisation), 리보뉴클레아제-RNA-보호, 세포내 RNA의 동소 하이브리드화 (in situ hybridisation)에 의해서, 또는 PCR 방법 (예를 들어, 정량적 PCR)에 의해서 결정될 수 있다. 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해서 암호화된 단백질은 또한, 예를 들어, ELISA, 단백질 A HPLC, 웨스턴 블롯 (western blot), 방사선면역측정법, 면역침강법, 단백질의 생물학적 활성의 검출, 단백질의 면역 염색에 이은 FACS 분석 또는 형광 현미경검사, FACS 분석 또는 현광 현미경검사에 의한 형광 단백질의 직접적인 검출과 같은 다양한 방법에 의해서도 결정될 수도 있다.
"증가된 역가 또는 생산성"은 적합한 대조군, 예를 들어, 돌연변이체 단백질 대 야생형 단백질과의 비교하여 숙주 세포 내에 도입된 이종 서열의, 예를 들어, 치료학적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현, 합성 또는 분비가 증가한 것을 의미한다. 여기에서, 증가된 역가 또는 생산성은 본 발명에 따르는 세포가 여기에 기술된 본 발명에 따르는 방법에 따라 배양된 경우, 및 이 세포가 비생산성 또는 역가의 적어도 10% 증가를 갖는 경우이다. 여기에서 또한, 증가된 역가 또는 생산성은 본 발명에 따르는 세포가 여기에 기술된 본 발명에 따르는 방법에 따라 배양된 경우, 및 이 세포가 비생산성 또는 역가의 적어도 20% 또는 적어도 50% 또는 적어도 75% 증가를 갖는 경우이다. 여기에서 또한, 특히 증가된 역가 또는 생산성은 본 발명에 따르는 세포가 여기에 기술된 본 발명에 따르는 방법에 따라 배양된 경우, 및 이 세포가 비생산성 또는 역가의 적어도 10 내지 500%, 바람직하게는 20 내지 300%, 특히 바람직하게는 50 내지 200% 증가를 갖는 경우이다.
증가된 역가 또는 생산성은 본 발명에 따르는 발현 벡터 중의 하나를 사용함으로써, 및 또한 본 발명에 따르는 방법 중의 하나를 사용함으로써 모두 수득될 수 있다.
상응하는 방법은 추가의 선택적 마커로서 하나 또는 그 이상의 형광 단백질 (예를 들어, GFP) 또는 세포 표면 마커를 함유하는 재조합 숙주 세포의 FACS-보조 선택과 조합될 수 있다. 증가된 발현을 수득하는 다른 방법, 및 상이한 방법의 조합이 사용될 수도 있으며, 예를 들어, 크로마틴 구조를 조작하기 의한 시스-활성 요소 (예를 들어, LCR, UCOE, EASE, 격리체 (isolator), S/MAR, STAR 요소)의 사용, (인공적) 전사인자, 내인성 또는 이종 유전자 발현을 상향-조절하거나, mRNA 또는 단백질의 안정성 (반감기)을 개선시키거나, mRNA 해독의 개시를 개선시키거나, 에피좀성 플라스미드의 사용에 의해 유전자 용량을 증가시키기 위한 (복제 오리진으로서 바이러스성 서열, 예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, EBV 또는 BPV의 사용을 기초로) 천연 또는 합성 인자에 의한 세포의 처리의 사용, 증폭-촉진성 서열 또는 DNA 연쇄체 (concatemer)를 기초로 하는 시험관내 증폭 시스템의 사용을 기초로 한다.
또한, 관심있는 암호화 유전자 서열을 제조하기 위해서 생산 세포를 복제 및 사용하는 방법이 본 발명에 따라 바람직하다. 이를 위해서, 선택된 고생산성 세포를 바람직하게는, 관심있는 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 무혈청 배양 배지 내에서, 바람직하게는 현탁 배양으로 배양한다. 관심있는 단백질/생성물은 바람직하게는, 분비된 유전자 생성물로서 배양 배지로부터 수득된다. 그러나, 단백질이 분비 시그널이 없이 발현된다면, 유전자 생성물은 또한 세포 용해물로부터 분리될 수도 있다. 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 순수한 균질한 생성물을 수득하기 위해서, 통상적인 정제과정이 수행된다. 우선 첫째로, 세포 및 세포 파편을 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 그 후, 원하는 유전자 생성물을 예를 들어, 면역친화성 및 이온교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 또는 세파덱스 (Sephadex), 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해서 오염성인 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터 분리시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포에 의해서 발현된 불균일한 단백질의 정제를 야기하는 방법은 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있다.
본 발명에 따르는 구체예
본 발명은
a. 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산을 암호화하는 코돈을 결실시키고,
b. 세포를 a)로부터의 변형된 핵산을 함유하는 벡터로 형질감염시키고,
c. 상기 세포를 관심있는 단백질의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하여, 세포의 관심있는 단백질의 역가를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산 리신을 암호화하는 코돈을 결실시키고, 세포를 변형된 핵산을 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 세포를 관심있는 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하여, 세포의 항체의 역가를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게는, 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산을 암호화하는 코돈을 결실시키고, 세포를 변형된 핵산을 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 세포를 관심있는 단백질의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하여, 세포의 관심있는 단백질의 비생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산 리신을 암호화하는 코돈을 결실시키고, 세포를 변형된 핵산을 함유하는 제1 벡터로 형질감염시키고, 세포를 항체의 경쇄를 함유하는 제2 벡터로 공동-형질감염시키고, 세포를 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하여, 세포의 항체의 비생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 방법에서, 변형된 중쇄 및 경쇄, 또는 헤테로머성 단백질의 서브유니트는 어떤 원하는 순서로든 연속 형질감염으로 혼입된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산 리신을 암호화하는 코돈을 결실시키고, 세포를 항체의 중쇄 및 또한, 항체의 중쇄에 대한 변형된 핵산 둘 다를 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 세포를 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하여, 항체 또는, 세포의 관심있는 모든 헤테로머성 단백질의 비생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법의 바람직한 구체예에서, 세포를 형질감염시킨 벡터는 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 벡터이다. 이 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 세포를 형질감염시킨 벡터는 별도의 전사 유니트로서 항체 중쇄 및 경쇄를 함유하는 벡터이다.
놀랍게도, 예를 들어, IgG1 분자는 C-말단 리신의 결실에도 불구하고 CHO-세포에서 발현 및 분비되고, 생성물의 양은 IgG1 야생형 형질감염 세포의 경우와 동등한 것으로 나타날 수 있다 (도 2). 또한, 놀랍게도 IgG1의 리신 결실 변이체를 발현하는 세포는 평균적으로 IgG1 야생형을 발현하는 세포보다 27%까지 더 큰 역가 또는 32% 더 큰 비생산성을 달성하는 것으로 밝혀졌다 (도 3). 리신 결실 변이체의 이러한 생산 이점은 DHFR-기본 유전자 증폭이 100 nM MTX의 첨가에 의해서 이들 세포 풀 내에 유도되는 경우에도 여전히 존재한다. 역가 및 비생산성은 평균하여 86% 또는 120% 더 크다 (도 4).
유사한 결과는 놀랍게도, IgG4 분자에 대해서도 나타날 수 있다. C-말단 리신의 결실에도 불구하고, IgG4 분자는 CHO-세포 내에서 IgG4 야생형보다 오히려 더 잘 발현 및 분비된다 (도 5). 놀랍게도, IgG4 분자의 리신 결실 변이체를 발현하는 세포는 평균하여, IgG4-야생형을 발현하는 세포보다 실제로 63% 더 큰 역가 또는 70% 더 큰 비생산성을 달성하는 것으로 밝혀졌다 (도 6). 리신 결실 변이체의 이러한 생산 이점은 또한, 400 nM MTX에 의한 이후의 증폭단계에도 존재한다. 평균하여 53% 더 큰 역가 및 66% 더 큰 비생산성이 수득된다 (도 7).
본 발명에 따르는 방법의 특별한 구체예에서, 역가 및/또는 비생산성은 C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질의 비교값에 비해서 10 내지 500%, 바람직하게는 20 내지 300%, 특히 바람직하게는 50 내지 200%까지 증가한다. 본 발명에 따르는 방법의 또 다른 특별한 구체예에서, 역가 및/또는 비생산성은 C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질의 비교값에 비해서 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 특히 바람직하게는 적어도 75%까지 증가한다.
본 발명에 따르는 방법의 또 다른 특별한 구체예에서, 비생산성은 적어도 5 pg/세포/일이다.
본 발명은 또한, 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 적어도 C-말단 아미노산을 암호화하는 코돈을 결실시키고, 이렇게 변형된 핵산 서열을 발현 벡터 내에 삽입하는 것을 특징으로 하여, 관심있는 단백질의 증가된 생산을 위한 발현 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 세포를 본 발명에 따르는 방법을 사용하여 처리한 다음에, 예를 들어, 희석 클로닝 또는 FACS-기본 단일 세포 침착에 의해서 단일 세포 클로닝을 수행하는 것을 특징으로 하여, 관심있는 단백질의 증가된 역가 및/또는 증가된 비생산성을 갖는 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 세포의 그룹을 본 발명에 따르는 방법을 사용하여 처리하고, 이들 세포를 적어도 하나의 선택 압력의 존재 하에서 선택하고, 임의로 단일 세포 클로닝을 수행하고, 관심있는 단백질을 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득하는 것을 특징으로 하여, 세포에서 관심있는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
관심있는 적어도 하나의 단백질을 제조하는 본 발명에 따르는 방법의 특별한 구체예는 제조를 위해서 사용된 세포를 선택제를 사용한 선택단계 후에 추가로 유전자 증폭단계에 적용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 특정의 구체예는 C-말단 아미노산이 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg), 바람직하게는 Lys인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 또 다른 특정의 구체예는 관심있는 단백질이 항체, Fc 융합 단백질, EPO 또는 tPA인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 바람직한 구체예는 관심있는 단백질이 항체의 중쇄이고, C-말단 아미노산이 리신 (Lys)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 특별한 구체예는 항체의 중쇄가 타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 타입 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄임을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 특정의 구체예는 관심있는 단백질이 모노클로날, 폴리클로날, 포유동물, 쥐, 키메릭, 인간화, 영장류 또는 인간 항체 또는 항체 단편, 또는 면역글로불린 항체의 중쇄 또는 Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일 쇄 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일 쇄 Fv, 디설파이드-연결된 Fv, 도메인-결실된 항체의 유도체, 미니바디, 디아바디, 또는 상기 언급된 단편 중의 하나와 또 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드 또는 Fc-펩타이드 융합 단백질, Fc-독소 융합 단백질 또는 스캐폴드 (scaffold) 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 또 다른 특정의 구체예는 세포가 현탁 배양으로 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 특별한 구체예는 세포가 무혈청 조건 하에서 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 또 다른 특별한 구체예는 세포가 화학적으로 한정된 배지 내에서 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 바람직한 구체예는 세포가 단백질-부재 배지 내에서 배양되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 바람직한 구체예는 세포가 예를 들어, 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물로부터 유래하는 진핵 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 또 다른 바람직한 구체예는 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 특히 바람직한 구체예는 세포가 CHO 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 언급된 방법의 또 다른 특별한 구체예는 CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11 및 CHO per-5의 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 특히 바람직하게는, 이것은 CHO DG44 세포이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 언급된 방법 중의 하나에 따라 생성될 수 있는 관심있는 유전자의 증가된 발현을 갖는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 언급된 방법 중의 하나에 따라 생성될 수 있는 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 관심있는 상응하는 유전자의 적어도 하나의 C-말단 아미노산이 결실되고, 생성된 관심있는 단백질은 결실이 없는 야생형 단백질에 비해서 감소된 불균일성을 갖는 것을 특징으로 하여, 관심있는 단백질의 생산 및 정제를 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르는 방법의 특별한 구체예는 C-말단 아미노산이 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg), 바람직하게는 Lys인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 또 다른 특별한 구체예는 관심있는 단백질이 항체, Fc 융합 단백질, EPO 또는 tPA인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 구체예는 관심있는 단백질이 항체의 중쇄이고, C-말단 아미노산이 리신 (Lys)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 또 다른 바람직한 구체예는 항체의 중쇄가 타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 타입 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄임을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 특별한 구체예는 생산을 위해서 세포가 현탁 배양으로 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르는 방법의 또 다른 특별한 구체예는 생산을 위해서 세포가 무혈청 조건 하에서 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 또 다른 특별한 구체예는 세포가 화학적으로 한정된 배지 내에서 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 기술된 모든 방법의 바람직한 구체예는 세포가 단백질-부재 배지 내에서 배양되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 구체예는 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 또 다른 바람직한 구체예는 세포가 CHO 세포, 바람직하게는 CHO DG44 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 방법의 특히 바람직한 구체예는 관심있는 단백질의 정제 동안에, 결실이 없는 야생형 단백질의 정제와 비교하여 더 낮은 염 농도가 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산에서 적어도 C-말단 아미노산 리신을 암호화하는 코돈을 결실시키고, 세포를 이렇게 변형된 핵산을 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 세포를 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 특징으로 하여, 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 이하에서 예로서 비-제한적 구체예에 의해 더 충분하게 설명된다.
실시예
약어:
AP: 알칼리성 포스파타제
Asp (=D): 아스파르트산
bp: 염기쌍
CHO: 챠이니즈 햄스터 난소
CpB: 카복시펩티다제 B
DHFR: 디하이드로폴레이트-리덕타제
ELISA: 효소-연결된 면역흡착시험
HT: 하이포크산틴/티미딘
IgG: 면역글로불린 G
Ile (=I): 이소류신
kb: 킬로베이스
Lys: 리신
mAk: 모노클로날 항체
MTX: 메토트렉세이트
MW: 평균값
NPT: 네오마이신-포스포트랜스퍼라제
PCR: 폴리머라제 연쇄반응
phe (=F): 페닐알라닌
SEAP: 분비된 알칼리성 포스파타제
WT: 야생형
방법
세포 배양 및 형질감염
세포 CHO-DG44/dhfr-/-는 습한 대기 및 5% CO2 하에 37℃에서 세포 배양 플라스크 내의 하이포크산틴 및 티미딘 (HT)을 보충한 무혈청 CHO-S-SFMII 배지 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) 내에서 현탁 세포로 영구 배양한다. 세포 수 및 생존도를 세덱스 (Cedex) (Innovatis)에 의해서 결정한 다음에, 세포를 1 내지 3×105/㎖의 농도로 접종하고, 매 2 내지 3일 마다 처리한다.
CHO-DG44의 형질감염을 위해서, 리포펙타민 플러스 시약 (Invitrogen)이 사용된다. 각각의 형질감염 배취에 대해서, 총 1.0 내지 1.1 ㎍ 플라스미드-DNA, 4 ㎕ 리포펙타민 및 6 ㎕ 플러스 (Plus) 시약을 제조자의 설명서에 따라 혼합시키고, 200 ㎕의 용적으로 0.8 ㎖ HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지 내에 6×105 세포로 첨가한다. 세포 배양기 내에서 37℃로 3시간 배양한 후에, 2 ㎖의 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지를 첨가한다. 48시간의 배양기간 후에, 형질감염 혼합물을 수거하거나 (일시적 형질감염), 선택에 적용한다. 하나의 발현 벡터는 DHFR 선택 마커를 함유하고, 다른 하나는 NPT 선택 마커를 함유하기 때문에, 형질감염시킨지 2일 후에 공동-형질감염된 세포를 DHFR- 및 NPT-기본 선택을 위해 하이포크산틴 및 티미딘을 첨가하지 않은 CHO-S-SFMII 배지에 이동시키고, G418 (Invitrogen)을 또한 400 ㎍/㎖의 농도로 배지에 첨가한다.
통합된 이종 유전자의 DHFR-기본 유전자 증폭은, 선택제 MTX (Sigma, Deisenhofen, DE)를 5 내지 2000 nM의 농도로 HT-부재 CHO-S-SFMII 배지에 첨가함으로써 수행된다.
발현 벡터
발현 분석을 위해서, pAD-CMV 벡터를 기본으로 하며, CMV 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 (WO 97/15664) 또는 CMV 인핸서/CMV 프로모터의 조합을 통해서 이종 유전자의 발현을 매개하는 진핵성 발현 벡터가 사용된다. 기본 벡터 pBID는 증폭가능한 선택적 마커로서 작용하는 dhfr 미니유전자 (minigene)를 함유하는 반면에, 벡터 pBIN에서 dhfr-미니유전자는 NPT 유전자에 의해서 대체된다. 이를 목적으로, SV40 조기 프로모터 (early promoter) 및 TK-폴리아데닐화 시그널을 포함한 NPT 선택 마커를 1640 bp Bsu36I 단편으로서 상업적 플라스미드 pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, USA)로부터 분리하였다. 단편을 보충하는 반응을 클레노우 (Klenow) DNA 폴리머라제에 의해서 종결시킨 후에, 단편을 역시 클레노우 DNA 폴리머라제로 처리한 벡터 pBID의 3750 bp Bsu36I/StuI 단편과 연결시켰다. 두 가지 벡터 모두에서, 이종 유전자의 발현은 CMV 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터의 조합에 의해서 조정된다.
벡터 pBIN8a는 벡터 pBIN의 유도체이며, 변형된 NPT 유전자를 함유한다. 이것은 NPT 변이체 F240I (Phe240Ile)이며, 이의 클로닝은 WO2004/050884에 기술되어 있다. 이 벡터 및 또한, 벡터 pBID의 유도체인 벡터 pBIDa에서, 이종 유전자의 발현은 CMV 인핸서/프로모터 조합의 조절 하에 둔다.
ELISA (효소-연결된 면역흡착시험)
안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 상청액 내에서 발현된 항체 (IgG1, IgG2 또는 IgG4)의 정량화는 한편으로는 염소 항-인간 IgG Fc 단편 (Dianova, Hamburg, DE)을 사용하고, 다른 한편으로는 AP-접합된 염소 항-인간 카파 경쇄 항체 (Sigma)를 사용하는 표준 과정에 따른 ELISA를 사용하여 수행한다. 사용된 표준품은 각각의 경우에 발현된 항체와 동일한 이소타입의 정제된 항체이다.
생산성 (pg/세포/일)은 수학식 pg/((Ct-Co) t / ln (Ct-Co))에 의해서 계산되며, 여기에서 Co 및 Ct는 접종 또는 수거 시의 세포수를 나타내고, t는 배양기간을 나타낸다.
SEAP 시험
일시적으로 형질감염된 CHO-DG44 세포로부터의 배양 상청액 내의 SEAP 역가는 제조자의 운용 설명서 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)에 따라 SEAP 리포터 (Reporter) 유전자 시험을 사용하여 정량화한다.
실시예 1: C-말단 리신 결실을 갖는 IgG1의 클로닝 및 발현
모노클로날 인간화된 F19 항체의 중쇄 (IgG1/카파)를 플라스미드 pG1D105F19HC (NAGENESEQ: AAZ32786)로부터 1.5 kb NaeI/HindIII 단편으로서 분리하고, EcoRI (클레노우-DNA-폴리머라제에 의해서 보충됨) 및 HindIII에 의해서 분해된 벡터 pBID 내에 클로닝하여 벡터 pBID/F19HC를 생성시킨다 (도 1). 다른 한편으로는, 경쇄를 플라스미드 pKN100F19LC (NAGENESEQ: AAZ32784)로부터 1.3 kb HindIII/EcoRI 단편으로서 분리하고, 벡터 pBIN의 상응하는 절단부위에 클로닝함으로써 벡터 pBIN/F19LC을 생성시킨다 (도 1).
F19의 중쇄 상에서 C-말단 리신의 결실은 C-말단 부분에서 중쇄의 마지막 아미노산을 암호화하는 유전자 서열에 대한 상보적 서열을 갖는 돌연변이원성 프라이머 F19HC-Lys rev gacgtctaga tcaacccgga gacagggaga ggc (서열번호 1)를 사용하는 PCR에 의해서 수행된다. 반드시, C-말단 리신의 코돈은 종결 코돈에 의해서 대체된다. 또한, 그 후 이것에 뒤이어 이후의 클로닝을 위해서 사용되는 XbaI 제한 절단부위가 존재한다. 이러한 돌연변이원성 프라이머를 중쇄의 불변 부분에서 더 상류에 위치하는 또 다른 서열과의 상보성을 갖는 프라이머 F19 heavy4 atctgcaacg tgaatcacaa gc (서열번호 2)와 함께 사용한다. 벡터 pBID/F19HC는 PCR 돌연변이유발을 위한 주형으로 작용한다. 생성된 757 bp의 PCR 생성물을 BmgBI (프라이머 위치 F19heavy4의 하류에 위치하는 내인성 절단부위) 및 XbaI에 의해서 분해시키고, 547 bp 제한 단편을 사용하여 벡터 pBID/F19HC 내의 상응하는 서열 부분을 대체시킨다. 이렇게 하여, 결실된 C-말단 아미노산 리신을 갖는 F19 항체의 중쇄를 암호화하는 벡터 pBID/IgG1-Lys를 제공한다 (도 1).
우선 첫째로, CHO-DG44 세포의 일시적 형질감염에 의한 체크를 수행하여 모든 IgG 서브타입에서 고도로 보존된 아미노산인 결실된 C-말단 리신이 IgG1 분자의 발현 또는 분비에 대해서 필수적인 중요성을 갖는지 여부를 확인한다. 공동-형질감염은 이하의 플라스미드 조합을 사용하여 수행된다:
a) 이의 야생형 배열에서, 즉 중쇄 상에 C-말단 리신을 포함하는 모노클로날 항체 F19를 암호화하는 대조 플라스미드 pBID/F19HC 및 pBIN/F19LC
b) 이의 중쇄가 C-말단 리신 결실을 포함하는 F19-항체를 암호화하는 pBID/IgG1-Lys 및 pBIN/F19LC
조합당 10개의 풀을 형질감염시키는 한편, 두 개의 플라스미드를 동몰량으로 각각의 공동-형질감염에 사용한다. 총 용적 3 ㎖로 48시간 배양한 후에, 세포 배양 상청액 내에서 IgG1-역가의 수거 및 측정은 ELISA에 의해서 수행된다. 형질감염 효율에서의 차이는 SEAP 발현 플라스미드 (각각의 경우에 형질감염 혼합물당 100 ng의 플라스미드-DNA를 첨가)에 의한 공동-형질감염 및 SEAP 활성의 후속 측정에 의해서 보정된다.
놀랍게도, IgG1 분자는 C-말단 리신의 결실에도 불구하고 CHO 세포 내에서 발현 및 분비되며, 생성물의 양은 IgG1 야생형 형질감염 세포의 경우와 동등한 것으로 나타날 수 있다 (도 2).
CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염을 위해서, 공동-형질감염은 상술한 바와 동일한 플라스미드 조합을 사용하여 수행함으로써 각각의 조합에 대해서 10개의 풀을 생성시킨다. 음성 대조군으로서, 2개의 모의-형질감염된 풀을 또한 사용하는데, 즉 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가함이 없이 동일한 방식으로 처리한다. 안정하게 형질감염된 세포의 선택은 400 ㎍/㎖의 G418을 첨가하여 HT-부재 배지 내에서 형질감염시킨 지 2일 후에 시행한다. 일단 선택이 시행되면, 세포 풀의 IgG1 역가 및 비생산성은 3 내지 4 계대 (계대 속도 2-2-3일)의 기간에 걸쳐서 측정된다. 놀랍게도, IgG1의 리신 결실 변이체를 발현하는 세포는 평균하여 IgG1 야생형을 발현하는 세포보다 27%까지 더 큰 역가 또는 32% 더 큰 비생산성을 달성하는 것으로 확인된다 (도 3). 리신 결실 변이체의 이러한 생산 이점은 DHFR-기본 유전자 증폭이 100 nM MTX의 첨가에 의해서 이들 세포 풀 내에 유도되는 경우에도 여전히 존재한다. 역가 및 비생산성은 평균하여 각각 86% 및 120% 더 크다 (도 4).
실시예 2: C-말단 리신 결실이 있는 IgG4의 클로닝 및 발현
모노클로날 인간화된 IgG4 항체 (IgG4/카파)를 발현시키기 위해서, 중쇄를 EcoRI (클레노우-DNA-폴리머라제에 의한 처리에 의해서 보충된 절단부위) 및 BamHII에 의해서 분해된 플라스미드 pBIDa 내에 2.2 kb BamHI/SmaI 단편으로서 클로닝하여 플라스미드 pBIDa/IgG4 HC를 생성시킨다 (도 1). 다른 한편으로는, 경쇄를 플라스미드 pBINa의 BamHI/EcoRI 절단부위 내에 1.1 kb BamHI/EcoRI-단편으로 클로닝함으로써 플라스미드 pBIN8a/IgG4 LC를 생성시킨다 (도 1).
IgG4 항체의 중쇄 상에서 C-말단 리신의 결실은 C-말단 부분에서 중쇄의 마지막 아미노산을 암호화하는 유전자 서열에 대한 상보적 서열을 갖는 돌연변이원성 프라이머 IgG4HC-Lys rev gacgtctaga tcaacccaga gacagggaga ggct (서열번호 3)를 사용하는 PCR에 의해서 수행된다. 그러나, C-말단 리신의 코돈은 종결 코돈에 의해서 대체된다. 또한, 이것에 뒤이어 이후의 클로닝을 위해서 사용되는 XbaI 제한 절단부위가 존재한다. 이러한 돌연변이원성 프라이머를 중쇄의 불변 부분에서 더 상류에 위치하는 서열과의 상보성을 갖는 프라이머 HC for8 cccctgacct aagcccaccc (서열번호 4)와 함께 사용한다. 벡터 pBIDa/IgG4 HC는 PCR 돌연변이유발을 위한 주형으로 작용한다. 생성된 1013 bp의 PCR 생성물을 BmgBI (프라이머 위치 HC for8의 하류에 위치하는 내인성 절단부위) 및 XbaI에 의해서 분해시키고, 644 bp 제한 단편을 사용하여 벡터 pBIDa/IgG4 HC 내의 상응하는 서열 부분을 대체시킨다. 이렇게 하여, 결실된 C-말단 아미노산 리신을 갖는 F19 항체의 중쇄를 암호화하는 벡터 pBIDa/IgG4-Lys를 제공한다 (도 1).
우선 첫째로, CHO-DG44 세포의 일시적 형질감염에 의한 체크를 수행하여 모든 IgG 서브타입에서 고도로 보존된 아미노산인 결실된 C-말단 리신이 분자의 발현 또는 분비에 대해서 필수적인 중요성을 갖는지 여부를 확인한다. 공동-형질감염은 이하의 플라스미드 조합을 사용하여 수행된다:
a) 이의 야생형 배열에서, 즉 중쇄 상에 C-말단 리신을 포함하는 모노클로날 항체 IgG4 항체를 암호화하는 대조 플라스미드 pBIDa/IgG4 HC 및 pBIN8a/IgG4 LC
b) 이의 중쇄가 C-말단 리신 결실을 포함하는 모노클로날 IgG4-항체를 암호화하는 pBIDa/IgG4-Lys 및 pBIN8a/IgG4 LC
조합당 10개의 풀을 형질감염시키는 한편, 두 개의 플라스미드를 동몰량으로 각각의 공동-형질감염에 사용한다. 총 용적 3 ㎖로 48시간 배양한 후에, 세포 배양 상청액 내에서 IgG4 역가의 수거 및 측정은 ELISA에 의해서 수행된다. 형질감염 효율에서의 차이는 SEAP 발현 플라스미드 (각각의 경우에 형질감염 혼합물당 100 ng의 플라스미드-DNA를 첨가)에 의한 공동-형질감염 및 SEAP 활성의 후속 측정에 의해서 보정된다.
놀랍게도, IgG4 분자는 CHO 세포 내에서 C-말단 리신의 결실에도 불구하고 IgG4 야생형보다 오히려 훨씬 더 잘 생산되는 것으로 나타날 수 있다 (도 5).
CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염을 위해서, 공동-형질감염은 상술한 바와 동일한 플라스미드 조합을 사용하여 수행함으로써 각각의 조합에 대해서 10개의 풀을 생성시킨다. 음성 대조군으로서, 2개의 모의-형질감염된 풀을 또한 사용하는데, 즉 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가함이 없이 동일한 방식으로 처리한다. 안정하게 형질감염된 세포의 선택은 400 ㎍/㎖의 G418을 첨가하여 HT-부재 배지 내에서 형질감염시킨 지 2일 후에 시행한다. 일단 선택이 시행되면, 100 nM의 MTX를 첨가함으로써 DHFR-기본 유전자 증폭을 유도한다. 세포 풀의 IgG4 역가 및 비생산성은 3 내지 4 계대 (계대 속도 2-2-3일)의 기간에 걸쳐서 측정된다. 모두 합쳐서, IgG4 야생형에 의해서 형질감염된 세포로부터의 선택 및 증폭 후에, 4개의 안정적 발현성 세포 풀이 수득되며, 리신 결실 변이체에 의해서 형질감염된 세포로부터는 6개의 안정적 발현성 세포 풀이 수득된다. 놀랍게도, IgG4의 리신 결실 변이체를 발현하는 세포는 평균하여 IgG4 야생형을 발현하는 세포보다 63%까지 더 큰 역가 또는 70% 더 큰 비생산성을 달성하는 것으로 확인된다 (도 6). 리신 결실 변이체의 이러한 생산 이점은 400 nM MTX를 사용한 후속 증폭단계에서도 여전히 수득된다. 평균하여 53% 더 큰 역가 및 66% 더 큰 비생산성이 수득된다 (도 7).
실시예 3: C-말단 아미노산 결실이 있는 IgG2, IgG3, Fc 융합 단백질 및 다른 생물분자의 클로닝 및 발현
항체 이소타입 IgG2 및 IgG3의 중쇄 상의 C-말단 리신을 결실시키기 위해서, PCR 돌연변이유발이 이소타입 1 및 4에 대해서 실시예 1 및 2에 전술한 바와 같이 사용된다. 동일한 방법으로, C-말단 리신 결실이 또한, Fc 융합 단백질 (2가 또는 이중특이성)에 대해서 수행되는데, 여기에서 사이토카인, 가용성 수용체 등과 같은 생물분자가 Fc 융합 단백질의 구성요소이다 (예: 알레파셉트 (Alefacept), LFA-3-Fc, 에타너셉트 (Etanercept) TNFR-Fc).
C-말단 아미노산의 코돈 결실의 개념은 예를 들어, 에리트로포이에틴 (EPO) 및 조직 플라스미노센 활성화제 (tPA)와 같은 생물분자에까지 확대될 수 있는 것으로 생각될 수 있으며, 여기에서 C-말단 아르기닌의 단백분해적 절단은 공지되어 있다 [M.A. Recny, H.A. Scoble and Y. Kim, J. Biol . Chem ., 262 (1987) 17156-17163; Harris, R.J. (1995) Journal of Chromatography A, 705 (1), pp. 129-134]. 전제조건은 생물학적 활성이 유지되거나, tPA의 경우에서와 같이, 예를 들어, 단백분해적 처리가 온전하게 남아있어야 하는 것이다.
일시적 형질감염에서는, 무엇보다도 먼저 C-말단 아미노산의 결실이 발현 및 분비에 영향을 미치는지 여부를 발견하기 위한 시험이 수행된다. 그 후, 안정한 형질감염이 수행되고, 돌연변이된 단백질 또는 야생형 단백질을 발현하는 세포 풀의 비생산성 및 역가를 서로 비교한다.
실시예 4: IgG1 WT 및 IgG1-Lys의 정제
후처리는 이소타입 IgG1 또는 WT 및 리신 결실 변이체에 대해서 동일하다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (MabSelect, GE)를 제조자의 설명서에 따라서 수행한다.
단백질 A 크로마토그래피 이후의 생성물 수율의 정량화는 단백질 A HPLC를 사용하여 수행된다. 리신 코돈 결실과는 무관하게 이소타입 IgG1의 두 가지 변이체에 대한 수율은 90% 이상이다 (도 8). 리신 결실은 친화성 크로마토그래피 또는 생성물 수율에 대해서 부정적인 영향을 미치지 않는다. C-말단 리신에 관한 생성물 불균일성은 등전점 집중법 (IEF)에서 정성적으로, 및 또한, 약양이온 교환 (WCX)에 의해서 정량적으로 둘 다에 의해 결정된다 (참조: 도 9 및 11). C-말단 리신에 의해서 야기된 전하 불균일성을 IEF를 사용하여 정성적으로 측정하기 위해서, 항체를 카복시펩티다제 B와 함께 항온처리한다. 37℃에서, 10 ㎍의 카복시펩티다제 B를 100 ㎕ 중에서 1 ㎎/㎖의 항체 농도로 2시간 동안 항온처리한다. 도 9에서는, 카복시펩티다제 B (CpB)에 의한 효소적 절단 후에 WT 항체 (IgG1)에 대한 밴드의 수에 있어서의 감소가 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 (ProPac WCX-10 / 4×250 ㎜)를 40분에 걸쳐서 1 ㎖/분의 유속 및 5 내지 10%의 구배 (완충액 A 20mM MES-완충액 pH 6.7; 완충액 B: 20mM, 1M NaCl pH 6.7)로 수행한다. 칼럼을 각각의 경우에 40 ㎍의 항체로 충진시킨다. WT 및 -Lys 변이체는 각각 효소적 CpB 처리의 존재 또는 부재 하에서 분석한다.
IgG1 WT의 용출 프로필 또는 오버레이에서, Lys1 및 Lys2의 상태는 염기성 피크 1 및 2에 의해서 표시된다. 생성물의 비율은 약 10%이다. 리신 결실이 있는 변이체의 용출 프로필 또는 오버레이는 염기성 부분에서 매우 약한 불균일성을 나타낸다. 생성물의 비율은 1% 미만이다 (도 11).
실시예 5: IgG4 WT 및 IgG4-Lys의 정제
이소타입 IgG4 또는 WT 및 리신 결실 변이체에 대한 후처리는 IgG1의 경우와 동일하다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (MabSelect, GE)를 제조자의 설명서에 따라서 수행한다.
단백질 A 크로마토그래피 이후의 생성물 수율의 정량화는 단백질 A HPLC를 사용하여 수행된다. 리신 코돈 결실과는 무관하게 이소타입 IgG4의 두 가지 변이체에 대한 수율도 또한 90% 이상이다 (도 8). 이소타입 IgG4 및 이의 리신 코돈 결실의 경우에, IgG1에서와 같이 친화성 크로마토그래피 또는 생성물 수율에 대해서 부정적인 영향은 없는 것으로 확인된다. C-말단 리신에 관한 생성물 불균일성은 LC-MS에 의해서 정량적으로 결정된다 (참조: 도 10 및 12). C-말단 리신 분포를 측정하기 위해서, 항체 샘플을 우선 DTT에 의해서 환원시킨다. 그 후, 환원된 경쇄 및 환원된 중쇄 (Lys가 없는 HC 1-446 또는 Lys가 있는 HC 1-447)를 HPSEC에 의해서 분리하고, 후속 (인-라인) ESI-TOF-MS에서 분리 및 분석한다. C-말단 리신의 분포는 HC 1-446 또는 HC 1-447에 대한 피크 면적을 기초로 한다. 중쇄의 질량 스펙토그램 (spectrogram)은 글리코실화의 작용으로 리신에 의해서 야기된 질량 이동을 나타낸다 (G0, G1, G2) (도 12). 중쇄에서 C-말단 리신 (Lys1 및 Lys2)에 의해서 측정된 항체 분자 (IgG4 WT)의 생성물 비율은 약 20%이다 (도 10).
실시예 6: 열안정성 (thermal stability)
고유 형광 (트립토판)을 사용한 열안정성의 측정은 C-말단 리신의 부분에 대한 영향이 없음을 나타낸다 (IgG1 WT 및 -Lys Tm 69℃; 또는 IgG4 WT 및 -Lys 64℃). 여기 파장은 295 ㎚이다. 특정한 방출 스펙트럼은 25℃ 내지 85℃의 범위에 걸쳐서 1℃씩 증가시키면서 측정된다. 방출 스펙트럼은 300 ㎚ 내지 450 ㎚의 파장 범위에 걸쳐서 기록된다. 그 밖의 다른 기술적 데이터: 형광 분광계 LS55 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), 샘플에서 여기 및 방출 사이드/PT100에 대한 온도 측정을 위한 슬롯 (slot) 폭 4 ㎚.
단백질 농도는 PBS 완충액 중에서 0.1 ㎎/㎖였다. 조사는 항체 중쇄의 C-말단 리신이 항체 분자의 열안정성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
초기 조사에서는 이미, 항체 중쇄의 C-말단 리신이 항체 분자의 열안정성에 영향이 없음을 나타내었다 [Liu et al . Immunol. Lett. 2006, 106 (2), 144-153].
<110> Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & CO. KG <120> Methods for increasing protein titers <130> P01-2274 <150> EP 07115227.6 <151> 2007-08-29 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer F19HC-Lys rev <400> 1 gacgtctaga tcaacccgga gacagggaga ggc 33 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer F19 heavy 4 <400> 2 atctgcaacg tgaatcacaa gc 22 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer IgG4HC-Lys rev <400> 3 gacgtctaga tcaacccaga gacagggaga ggct 34 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer HC for8 <400> 4 cccctgacct aagcccaccc 20

Claims (25)

  1. a. 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산을 암호화하는 코돈을 결실시키고,
    b. 세포를 a)로부터의 변형된 핵산을 함유하는 벡터로 형질감염시키고,
    c. 상기 세포를 관심있는 단백질의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양함을 특징으로 하는, 세포의 관심있는 단백질의 역가를 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 역가가 C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질의 비교값에 비해서 적어도 10%, 20%, 50%, 바람직하게는 75%까지 증가하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포의 비생산성이 C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질의 비교값에 비해서 적어도 10%, 20%, 50%, 바람직하게는 75%까지 증가하는 방법.
  4. a. 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 적어도 C-말단 아미노산을 암호화하는 코돈을 결실시키고,
    b. 이렇게 변형된 a)로부터의 핵산 서열을 발현 벡터 내에 삽입함을 특징으로 하는, 관심있는 단백질의 증가된 생산을 위한 발현 벡터를 생산하는 방법.
  5. a. 세포의 그룹을 제1항에 따르는 방법에 의해서 처리하고,
    b. 그 후에 단일 세포 클로닝을 수행함을 특징으로 하는, 관심있는 단백질의 증가된 역가를 갖는 세포를 생산하는 방법.
  6. a. 세포의 그룹을 제1항에 따르는 방법에 의해서 처리하고,
    b. 이들 세포를 적어도 하나의 선택 압력의 존재 하에서 a)로부터 선택하고,
    c. 임의로, 단일 세포 클로닝을 수행하고,
    d. 관심있는 단백질을 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득함을 특징으로 하는, 세포에서 관심있는 단백질을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제조를 위해서 사용된 세포를 추가로, 단계 b)를 수행한 후에 유전자 증폭단계에 적용함을 특징으로 하는, 관심있는 적어도 하나의 단백질을 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 아미노산이 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg), 바람직하게는 Lys임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질이 항체, Fc 융합 단백질, EPO 또는 tPA임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질이 항체의 중쇄이고, C-말단 아미노산이 리신 (Lys)임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항체의 중쇄가 타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 타입 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질이 모노클로날, 폴리클로날, 포유동물, 쥐, 키메릭, 인간화, 영장류 또는 인간 항체 또는 항체 단편, 또는 면역글로불린 항체의 중쇄 또는 Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일 쇄 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일 쇄 Fv, 디설파이드-연결된 Fv, 도메인-결실된 항체의 유도체, 미니바디, 디아바디, 또는 상기 언급된 단편 중의 하나와 또 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드 또는 Fc-펩타이드 융합 단백질, Fc-독소 융합 단백질 또는 스캐폴드 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 현탁 배양으로 배양됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 무혈청 조건 하에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 예를 들어, 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물로부터 유래하는 진핵 세포임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세포가 포유동물 세포임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 세포가 CHO 세포, 바람직하게는 CHO DG44 세포임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제4항에 따르는 방법에 따라 생성될 수 있는, 관심있는 유전자의 증가된 발현을 갖는 발현 벡터.
  19. 제5항에 따르는 방법에 의해서 생성될 수 있는 세포.
  20. a. 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에서 적어도 C-말단 아미노산을 암호화하는 코돈을 결실시키고,
    b. 생성된 관심있는 단백질이 C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질에 비해서 감소된 불균일성을 가짐을 특징으로 하는, 관심있는 단백질을 생산 및 정제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, C-말단 아미노산이 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg), 바람직하게는 Lys임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 관심있는 단백질이 항체, Fc 융합 단백질, EPO 또는 tPA임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질이 항체의 중쇄이고, C-말단 아미노산이 리신 (Lys)임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 항체의 중쇄가 타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 타입 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 관심있는 단백질의 정제 동안에, C-말단 아미노산의 결실이 없는 단백질의 정제와 비교하여 더 낮은 염 농도가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
KR1020107004046A 2007-08-29 2008-08-28 단백질 역가를 증가시키는 방법 KR20100046219A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07115227A EP2031064A1 (de) 2007-08-29 2007-08-29 Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
EP07115227.6 2007-08-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100046219A true KR20100046219A (ko) 2010-05-06

Family

ID=39107125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107004046A KR20100046219A (ko) 2007-08-29 2008-08-28 단백질 역가를 증가시키는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20100297697A1 (ko)
EP (2) EP2031064A1 (ko)
JP (1) JP2010536396A (ko)
KR (1) KR20100046219A (ko)
CA (1) CA2696809A1 (ko)
WO (1) WO2009027471A1 (ko)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
CN101479381B (zh) 2006-03-31 2015-04-29 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
EP1878747A1 (en) * 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
TWI563002B (en) 2007-09-26 2016-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region mutant
ES2834741T3 (es) 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
CN103251948A (zh) 2008-04-11 2013-08-21 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP3674317A1 (en) 2009-03-19 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2455403A1 (en) * 2010-11-23 2012-05-23 Pierre Fabre Medicament Homogeneous humanized antibodies against JAM-A that inhibit proliferation
CN107973851A (zh) 2010-11-30 2018-05-01 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
EP2702164B8 (en) 2011-04-29 2016-03-16 Biocon Research Limited A method for reducing heterogeneity of antibodies and a process of producing the antibodies thereof
JP2020141710A (ja) * 2011-07-06 2020-09-10 ゲンマブ エー／エス 抗体重鎖のｃ末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節
JP6454547B2 (ja) * 2011-07-06 2019-01-16 ゲンマブ エー／エス 抗体重鎖のｃ末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節
WO2013009648A2 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Cell culture process
HUE037811T2 (hu) 2011-10-28 2018-09-28 Prothena Biosciences Ltd Alfa-szinukleint felismerõ humanizált antitestek
WO2013112945A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
EP2841589B1 (en) * 2012-04-23 2018-09-12 DSM IP Assets B.V. Polypeptide expression method
MY174248A (en) 2012-04-30 2020-04-01 Biocon Ltd Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
KR20150043523A (ko) 2012-09-02 2015-04-22 애브비 인코포레이티드 단백질 불균일성의 제어 방법
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
EP2970512B1 (en) 2013-03-12 2018-10-10 Biocon Limited Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
CA2902026C (en) 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
US9850302B2 (en) 2013-07-12 2017-12-26 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
US9951131B2 (en) 2013-07-12 2018-04-24 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
PT3050896T (pt) 2013-09-27 2021-08-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Processo para a produção de heteromultímeros de polipéptidos
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
EP3071974A2 (en) 2013-11-19 2016-09-28 Prothena Biosciences Limited Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms
TW201623331A (zh) 2014-03-12 2016-07-01 普羅帝納生物科學公司 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法
JP2017512772A (ja) 2014-03-12 2017-05-25 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド Ｌｇ１〜３に特異的な抗ラミニン４抗体
JP6728053B2 (ja) 2014-03-12 2020-07-22 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗ｍｃａｍ抗体及び関連する使用方法
KR20160131073A (ko) 2014-03-12 2016-11-15 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체
US10562973B2 (en) 2014-04-08 2020-02-18 Prothena Bioscience Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
TWI711631B (zh) 2015-01-28 2020-12-01 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI786505B (zh) 2015-01-28 2022-12-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI718121B (zh) 2015-01-28 2021-02-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
CN108290928B (zh) 2015-09-01 2022-03-29 安可Qr Ml有限公司 卷曲螺旋连接体
WO2017046774A2 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis
JP2018530540A (ja) 2015-09-16 2018-10-18 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 巨細胞動脈炎、リウマチ性多発筋痛症又は高安動脈炎の処置又は予防のための抗ｍｃａｍ抗体の使用
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
WO2017149513A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
WO2017153953A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases
WO2017153955A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases
CU24538B1 (es) 2016-05-02 2021-08-06 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 16g7
CA3022515A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
HUE060258T2 (hu) 2016-05-02 2023-02-28 Prothena Biosciences Ltd Tau immunterápia
WO2017208210A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
WO2018007923A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
JP7076711B2 (ja) 2016-07-02 2022-05-30 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗トランスサイレチン抗体
JP7017013B2 (ja) 2016-07-02 2022-02-08 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗トランスサイレチン抗体
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
BR112019022906A2 (pt) 2017-05-02 2020-05-26 Prothena Biosciences Limited Anticorpos que reconhecem tau
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
JP2021502955A (ja) 2017-09-28 2021-02-04 プロセナ・バイオサイエンシズ・リミテッド シヌクレイン病の治療のための投与レジメン
KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2020-11-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
JP7405764B2 (ja) 2018-03-30 2023-12-26 アムジエン・インコーポレーテツド Ｃ末端抗体改変体
US11208482B2 (en) 2018-11-26 2021-12-28 Forty Seven, Inc. Humanized antibodies against c-Kit
PE20212324A1 (es) 2019-03-03 2021-12-14 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
AR119303A1 (es) 2019-07-01 2021-12-09 Eisai R&D Man Co Ltd Anticuerpo anti-epha4 humano
CA3195085A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutic pharmaceutical composition for amyotrophic lateral sclerosis
IL303223A (en) 2020-12-24 2023-07-01 Eisai R&D Man Co Ltd Anti-Apa4 antibody
CA3235297A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-epha4 antibody

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ230786A (en) * 1988-09-28 1991-11-26 Lilly Co Eli A method of reducing the heterogeneity of secreted monoclonal antibodies
IL158376A0 (en) * 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
ATE525395T1 (de) * 2003-06-12 2011-10-15 Lilly Co Eli Fusions proteine von glp-1-analoga
US20060024272A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Large Scale Biology Corporation C-terminally truncated interferon
WO2006068910A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Eli Lilly And Company Glp-1 analog fusion protein formulations
CN102875681A (zh) * 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP2031064A1 (de) 2009-03-04
CA2696809A1 (en) 2009-03-05
EP2195431A1 (de) 2010-06-16
US20100297697A1 (en) 2010-11-25
JP2010536396A (ja) 2010-12-02
WO2009027471A1 (de) 2009-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20100046219A (ko) 단백질 역가를 증가시키는 방법
JP5481478B2 (ja) 新規調節エレメント
MX2009000781A (es) Elementos reguladores de acido nucleico.
US9708636B2 (en) Artificial introns
US9243053B2 (en) Heterologous intron within an immunoglobulin domain
US20120100553A1 (en) Cho/cert cell lines
US20140248665A1 (en) Novel intron sequences
EP2938726B1 (en) Heterologous intron within a signal peptide
RU2780629C1 (ru) Способ получения мультиспецифических антител
US20110229903A1 (en) Determination of immunoglobulin encoding nucleic acid

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid