EA008831B1 - Слитые белки аналогов glp-1 - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении описаны специфические аналоги GLP-1, слитые со специфическими производными IgG4-Fc. Эти слитые белки обладают повышенным периодом полужизни, пониженной иммуногенностью и пониженной активностью эффектора. Слитые белки могут использоваться при лечении диабета, ожирения, синдрома раздраженной толстой кишки и других состояний, на которые оказывает благотворное воздействие снижение глюкозы в крови, ингибирование двигательной функции желудка или моторики кишечника и ингибирование желудочного и/или кишечного опорожнения либо ингибирование потребления пищи.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к аналогам глюкагонподобного пептида, слитым с белками, которые обладают эффектом продления периода полужизни пептидов ίη νίνο. Эти слитые белки могут быть использованы для лечения диабета, а также целого ряда других состояний или расстройств.

Уровень техники

Аналоги и производные глюкагонподобного пептида-1 (СЬР-1) хорошо показали себя в клинических испытаниях при лечении диабета II типа. СЬР-1 стимулирует многочисленные биологические эффекты, такие как стимулирование секреции инсулина, ингибирование секреции глюкагона, ингибирование опорожнения желудка, ингибирование моторики желудка или моторики кишечника и стимулирование снижения массы тела. Существенной характеристикой СЬР-1 является его способность стимулировать секрецию инсулина в отсутствие связанной с этим опасности гипогликемии, которая наблюдается при проведении инсулинотерапии или некоторых видов лечения полости рта, которые действуют за счет повышения экспрессии инсулина.

Методы лечения с применением пептидов СЬР-1 ограничены тем, что СЬР-1(1-37) проявляет слабую активность, а два встречающихся в природе усеченных пептида, СЬР-1 (7-3 7)ОН и СЬР-1 (7-3 6)ΝΗ₂, быстро очищаются ίη νίνο и имеют чрезвычайно короткий период полужизни ίη νίνο. Известно, что полученная эндогенно дипептидил-пептидаза IV (ϋΡΡ-ΐν) инактивирует циркуляцию пептидов СЬР-1 за счет удаления Ν-концевых остатков гистидина и аланина и является основной причиной короткого периода полужизни ίη νίνο.

Предлагались различные методы продления периода полу выведения пептида СЬР-1 из плазмы или выведения пептида из организма при одновременном сохранении биологической активности. Один из таких подходов заключается в слиянии пептида СЬР-1 с частью Рс иммуноглобулина. Как правило, иммуноглобулины обладают длительным периодом полужизни ίη νίνο.

Например, молекулы иммуноглобулина С могут иметь период полужизни в человеческом организме до 23 дней. За эту устойчивость ίη νίνο частично отвечает часть Рс иммуноглобулина. Слитые белки СЬР-1-Рс обладают устойчивостью, которая также обеспечивается частью Рс иммуноглобулина, сохраняя при этом биологическую активность молекулы СЬР-1.

Хотя этот метод осуществим при терапии с применением СЬР-1 (см. публикацию XV О 02/46227), существует проблема, связанная с антигенными свойствами различных слитых белков при многократном введении препаратов в течение продолжительных периодов времени. Эта проблема особенно актуальна при терапии слитыми белками СЬР-1-Рс, поскольку пациент, страдающий диабетом, должен проходить курс лечения на протяжении всей своей жизни после того, как поставлен диагноз болезни. Кроме того, терапия слитыми белками Рс может вызвать нежелательный эффект, если часть Рс сохраняет функции эффектора.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является решение проблем, связанных с потенциальной иммуногенностью и активностью эффектора, которые обусловлены введением вставок СЬР-1-Рс, путем идентификации специфических слитых белков СЬР-1-Рс, у которых снижена способность вызывать иммунный ответ после их многократного и продолжительного введения и которые не обладают функцией эффектора. Эти специфичные слитые белки имеют замены в различных положениях в части СЬР-1, а также части Рс молекулы. Описываемые здесь замены приводят к получению повышенной эффективности, повышенной устойчивостью ίη νίνο, устраняют функцию эффектора и снижают вероятность того, что молекула будет распознаваться адаптивными элементами иммунной системы.

Соединения согласно настоящему изобретению включают в себя гетерологичные слитые белки, содержащие аналог СЬР-1, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из

a) (8ЕЦ Ш N0: 1)

Н18-Хаа₀-61и-С1у-ТИг-РЬе-Т11г-5ег-Азр-Уа1-Зег-Йег-Туг-Ьеи01и-С1и-01п-А1а-А1а-Ьуз-е1и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-ЕузС1у-(31у-(31у где Хаа§ выбирают из С1у и Уак

b) (8ЕЦ Ш N0: 2)

Н1з-Хаа₈-(31и-С1у-Т11г-Р11е-ТЬг-5ег-Азр-Уа1-Еег-8ег-Туг-Ьеи’ С1и-С1и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьуз-Азп51у-<51у-С1у где Хаа§ выбирают из С1у и Уак

c) (8ЕЦ Ш N0: 3)

Н1з-Хаа_а-О1и-01у-ТЬг-РЬе-Ткг-5ег-Азр-Уа1-5ег-8ег-Туг-Ьеи01и-С1и-С1п-А1а-А1а-Ъув-С1и-Р1те-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ъуз01у-61у-Рго

- 1 008831 где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;

ά) (8Εζ) ГО N0: 4)

Н1з~Хаа₀-С1и-31у-ТЬг-РЬе-Т}1г-Зег-А5р-7а1-Зег-Бег-Туг-Ье1101и-31и-О1п-А1а-А1а-Ьуз-01и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьув-АзпО1у-01у-Рго где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;

е) (8Εζ) ГО N0: 5)

Н1з-Хаа₈-С1и-С1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-Зег-Азр-7а1-5ег-8ег-Гуг-ЬеиО1и-С1и-01п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-^,7а1-Ьу8<Э1у-01у где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;

ί) (8Εζ) ГО N0: 6)

Н1з-Хаав-01и-(31у-ТЬг-Рке-Ткг-8ег-Азр-Уа1-8ег-8ег-Туг-Ьеи0111-0111-С1п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-РЬе-Не-А1а-Тгр-Ьеи-Ьуз-Анп01у-01у где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;

слитый с частью Ес иммуноглобулина, содержащего последовательность 8Εζ) ГО N0: 7

А1а-С1и-Зег-Ьуз-Туг-С1у-Рго-Рго-Суз-Рго-Рго-Суз-Рго-А1а-РгоХаа1₆-Хаа17-Хаа1е-О1у-О1у-Рго-Зег-Уа1-Рке-Ьеи-Рке-Рго-Рго-Ьуз-РгоЬуз-Азр-ТЬг-Ьеи-МеЬ-11е-Бег-Агд-ТЬг-Рго-С1и-Уа1-Ткг-Суз-7а1Уа1-7а1-Азр-Уа1-Зег-01п-01и-Азр-Рго-01и-Уа1-01п-Р}1е-Азп-ТгрТуг-Уа1-Азр-С1у-Уа1'С1и-Уа1-Н15-Азп-А1а-:ьуз-Т11г-Ъу5-Рго-АгдС1и-01и-С1п-Р11е-Хаа_во-Зег-Т11г-Туг-Агд-Уа1-7а1-8ег-Уа1-Ьеи-Т}1гУа1-Ьеи-Н18-01п-Азр-Тгр-Ьеи-Азп-01у-Ъуз-01и-Туг-Ьуз-Суз-ЬуБ7а1-Зег-А8п-Ьуз-01у-Ьеи-Рго-Бег-8ег-11е-С1и-Ьуз-ТЬг-11е-8егЬуз-А1а - Ьуз - С1у-01п~ Рго - Агд - 0111 - Рго - Οίη-νβΐ-Туг-Т11г-Ьеи-РгоРго-Зег-01п-С1и-01и-МеЕ-Т11г-Ьу8-Азп-С1п-7а1-Бег-Ьеи-ТЬг-СузЬеи-\7а1-Ьуз-С1у-Р11е-Туг-Рго-Зег-Азр-11е-А1а-Уа1-О1и-Тгр-О1иЗег-Азп-51у-С1п-Рго-01и-Азп-Азп-Туг-Ьуз-ТЬг-ТЬг-Рго-Рго-Уа1Ьеи-Азр-Зег-Азр-01у-8ег-РЬе-РЬе-Ьеи-Туг-5ег-Агд-Ьеи-тЬг-Уа1А8р-Ьуз-Зег-Агд-Тгр-О1п-С1и-О1у-Азп-Уа1-РЬе-Эег-Суз-Бег-Уа1МеЬ-Н1з-01и-А1а-Ьеи-Н1з-Авп-Н1з-Туг-ТЬг-01п-Ьу8-Зег-Ьеи-ЗегЬеи-Бег-Ьеи-С1у-Хаа₂₃₍₎ (8Ξζ) Ιϋ N0:7) где Хаа в положении 16 означает Рго или С1и;

Хаа в положении 17 означает РЬе, Уа1 или А1а;

Хаа в положении 18 означает Ьеи, С1и или А1а;

Хаа в положении 80 означает Акп или А1а и

Хаа в положении 230 означает Ьук либо отсутствует.

С-конец части аналога СЬР-1 и Ν-конец части Ес гетерологичных слитых белков по изобретению предпочтительно подвергают слиянию при помощи 1, 1,5 или 2 повторов С-богатого пептидного линкера, имеющего последовательность С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 8).

В настоящем изобретении также описаны полинуклеотиды, кодирующие гетерологичные слитые белки по изобретению, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие такие полинуклеотиды. Методы лечения пациентов, страдающих инсулиннезависимым сахарным диабетом, а также инсулинзависимым сахарным диабетом, ожирением и различными иными нарушениями и состояниями, которые заключаются во введении описываемых здесь гетерологичных слитых белков, также охватываются настоящим изобретением.

Гетерологичные слитые белки по изобретению содержат часть аналога СЬР-1 и часть Ес. Часть аналога СЬР-1 и часть Ес содержат замены по отношению к последовательности нативного СЬР-1 и последовательности человеческого 1§С4 соответственно, которые приводят к получению белка с повышенной активностью и устойчивостью ίη νίνο по сравнению с нативным СЬР-1 или аналогами СЬР-1 аиа1о§к, не

-2008831 слитыми с последовательностью Ес, при этом снижающие возможность стимулировать образование антител после продолжительного и многократного введения в человеческий организм.

Нативный СЬР-1 обрабатывают ίη νινο так, что первые шесть аминокислот отщепляются от молекулы. Таким образом, как хорошо известно из уровня техники, амино концу СЬР-1 присваивается номер 7, а карбоксильному концу - номер 37. Другие аминокислоты в полипептиде нумеруются последовательно, как показано в §Εζ) ГО N0: 9. Например, положение 8 представляет собой аланин, а положение 22 глицин. Обработанный пептид можно подвергнуть дальнейшей модернизации ίη νινο так, что остаток Сконцевого глицина удаляется и замещается амидной группой. Таким образом, ОЬР-1(7-37)ОН и СЬР-1(736)амид представляют собой две нативные формы молекулы. СЬР-1 (7-3 7)ОН имеет аминокислотную последовательность §Εζ) ГО N0: 9:

⁷Н18-А1а-С1и-¹⁰С1у-Т11г-Р11е-Т11г-Зег-¹⁵Авр-'Ца1-Зег-5ег-Туг-^гоЬеи<31и-С1у-С1п-А1а-^г5А1а-Ьу5-С1и-Р11в- 11е-³⁰А1а-Тгр-Ьеи-Ца1-Ьуй ³⁵О1у-Агд-³⁷О1у (3Εζ5 10 N0:9)

Часть аналога СЬР-1 гетерологичного слитого белка включает в себя три первичных замены в положениях 8, 22 и 36 относительно нативного СЬР-1(7-37). Замена в положении 8 понижает скорость, при которой эндогенный фермент дипептидил-пептидаза IV (ΌΡΡ-ΐν) инактивирует аналог. ΌΡΡ-ΙV расщепляет нативный СЬР-1 между 2 и 3 аминокислотами (между положением 8 и 9), и полученная молекула является менее активной. Поэтому гетерологичные слитые белки в соответствии с настоящим изобретением резистентны к ЬРР-ΙV. Замена в положении 22 снижает вероятность того, что молекула образует агрегаты, и повышает активность молекулы. Замена в положении 36 в контексте аналога с изменениями в положении 8 и 22, а также в контексте целого слитого белка снижает опасность того, что слитый белок будет вызывать нейтрализующий иммунный ответ после многократного и продолжительного введения в человеческий организм.

Центральным событием в генерации как гуморальных, так и клеточно-опосредованных иммунных ответов является активация и клональное расширение Т-клеток-хелперов (Т_н). Активация клеток Т_н начинается посредством взаимодействия комплекса рецептора Т-клеток (ТСЯ)-СОЗ с обработанным антигенным пептидом, связанным с молекулой главной тканевой совместимости (МНС) II класса, в присутствии антиген-презентирующей клетки (АПК). Взаимодействие клетки Т_н с антигеном инициирует каскад биохимических событий, которые вызывают состояние покоя клетки Т_н для вхождения в клеточный цикл (переход от С_о к Οι). Активированная Т-клетка проходит клеточный цикл, размножаясь и дифференцируя в клетки памяти или эффекторные клетки.

Для идентификации потенциальных эпитопов (антигенных детерминант) анализировали следующую последовательность:

Н1з-С1у-С1и-С1у-ТЬг-РЬе-Т11г-Зег-Аер-Уа1-Зег-Зег-Туг-Ьеи-С1иС1и-<31п-А1а-А1а-Ъув-О1и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-7а1-Ьуз-С1у-Агд01у-Ц1у-С1у-а1у-е1у-5ег-а1у-61у-а1у-61у-5ег-а1у-а1у-01у-й1у5ег-С1у-С31у-<31у-С1у-5ег-С1у-С1у-С1у-С1у-5ег-С1у-а1у-(31у-О1у5ег-А1а-С1и-5ег-Ьуз-Туг-С1у-Рго-Рго-Сув-Рго (8Е0 ΙΏ N0:10).

Эта последовательность представляет собой последовательность аналога СЬР-1 с изменениями в положениях 8 и 22 относительно нативной последовательности с последующими 2 копиями С-богатой линкерной последовательности, за которой следуют первые 10 аминокислот области Ес, полученные от человеческого иммуноглобулина С4. Эпитоп, как используется в данном описании, относится к области молекулы белка, с которой может связываться антитело. Иммуногенный эпитоп определяется как часть белка, которая выявляет иммунный ответ, когда целый белок представляет собой иммуноген. Картирование эпитопов заключается в сканировании последовательностей окна сравнения с девятью аминокислотами с использованием методики статистического анализа, позволяющей получать информацию, содержащуюся в этих образцах. Для анализа последовательности и идентификации пептидов, которые, весьма вероятно, провоцируют иммунный ответ в присутствии Т-клеток, используют пакет программ, известный как Ер1Ма1пх™. При анализе на взаимодействие с рецептором МНС II класса используют восемь общих аллелей. Эти аллели включают ϋΚΒ1*0101, ϋΚΒ1*0301, ϋΚΒ1*0401, ϋΚΒ1*0701, ϋΚΒ1*0801, ΟΚΒ1*1101,ΌΚΒ1*1301 ηϋΚΒ1*1501.

Прогнозируют, что сильный эпитоп находится в месте соединения С-конца части аналога СЬР-1 и начала линкера. Последовательность этого эпитопа представляет собой Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу8-С1у-Агд-С1уС1у-С1у (§Εζ) ГО N0: 11), которая взаимодействует с ϋΚΒ1*0801. В настоящем изобретении решается задача обнаружения способности этого эпитопа элиминировать путем изменения С-конца аналога СЬР-1 на одну из следующих последовательностей:

-3 008831

Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу5-01у-01у-51у (5ΞΟ Ιϋ

N0:12); Тгр-Ьеи-Ьуз-Авп-Е1у-а1у-С1у (ΞΕΟ Ιϋ N0:13); Тгр-ЬеиУа1-Ьуз-01у-(31у-Рго (ΞΕζ) Ю N0:14); Тгр-Ьеи-Ьуз-Азп-С1у-С1у-Рго (ЗЕО Ю N0:15); Тгр-Ьеи-Уа1-Ъу5-01у-С1у (ЗЕО 10 N0:16); и ТгрЕеи-Ьуз-Азп-01у-01у (ЗЕО Ю N0:17).

Гетерологичные слитые белки по изобретению содержат часть Ес, взятую из человеческого 1дС4, при этом содержат одно или несколько замещений по сравнению с человеческой последовательностью дикого типа. В соответствии с настоящим описанием часть Ес иммуноглобулина имеет значение, общепринятое в области иммунологии. Конкретно этот термин относится к фрагменту антитела, который не содержит две антигенсвязующие области (фрагмента ЕаЬ) из антитела. Часть Ес состоит из постоянной области антитела, состоящей как из тяжелых цепей, которые ассоциируются через посредство нековалентных взаимодействий, так и дисульфидных связей. Часть Ес может включать шарнирные области и простираться через домены СН2 и СНЗ до С-конца антитела. Часть Ес может также включать один или несколько сайтов гликозилирования.

Существует пять типов человеческих иммуноглобулинов с различными эффекторными функциями и фармакокинетическими свойствами. 1дС является наиболее устойчивым из пяти типов, имеющим период полужизни в сыворотке человека около 23 дней. Существует четыре подкласса 1дС (01, 02, 03 и 04), каждый из которых имеет разные биологические функции, известные как эффекторные функции. Эти эффекторные функции обычно опосредованы взаимодействием с рецептором Ес (ЕсуВ.) или посредством комплемента связи С1с| и фиксации. Связывание с ЕсуЯ может привести к антителозависимому комплементопосредованному цитолизу, тогда как связывание с комплементными факторами может привести к лизису клеток. При конструировании гетерологичных слитых белков Ес, в которых часть Ес используется исключительно благодаря ее способности продлевать период полужизни, важно минимизировать эффекторную функцию. Поэтому гетерологичные слитые белки по изобретению получают из области Ес человеческого 1дС4 благодаря ее слабой способности связываться с ЕсуЯ и комплементными факторами по сравнению с другими подтипами 1§С. Однако 1дС4 продемонстрировал способность элиминировать клетки-мишени у человека Рзвасз с! а1., (1996) С1ш. Ехр. 1ттипо1. 106:427-433]. Поскольку гетерологичные слитые белки по изобретению инициируют бета-клетки в поджелудочной железе на стимулирование экспрессии инсулина, используя 1дС4-производную область в слитом белке Ес, можно инициировать иммунный ответ на панкреатическую бета-клетку посредством взаимодействия слитого белка с рецептором СЬР-1, присутствующим в панкреатических бета-клетках. Таким образом, область Ес 1дС4, представляющая собой часть гетерологичных слитых белков по изобретению, содержит замещения, устраняющие эффекторную функцию. Область Ес 1дС4 гетерологичных слитых белков по изобретению может содержать одно или несколько следующих замещений: замена глутамата на пролин в остатке 233, фенилаланина на аланин или валин в остатке 234 и лейцина на аланин или глутамат в остатке 235 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза; КаЬа1, Е.А. с! а1. (1991) 8сс|испссз оГ Рго1сшз о£ 1тпшпо1ощса1 1п1сгсз1. 5⁴¹¹ Еб. И.8. Оер1. оГ НсаНН апб Ншпап 8сг\1ссз. Всбюзба. МЛ, ΝΙΗ РиЬНсабоп по. 91-3242). Эти остатки соответствуют положениям 16, 17 и 18 в последовательности 8Εζ) ГО N0: 7. Кроме того, удаление Ν-связанного сайта гликозилирования в области Ес иммуноглобулина С4 путем замены Азп на А1а в положении остатка 297 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза), который соответствует положению 80 последовательности 8Εζ) ГО N0: 7, представляет собой другой способ обеспечения того, что остаточная активность эффектора устраняется в контексте гетерологичного слитого белка.

Помимо этого часть Ес 1дС4 гетерологичных слитых белков по изобретению содержит замену, которая стабилизирует образование димера тяжелой цепи и препятствует образованию полу-Ес 1дС4 цепей. Гетерологичные слитые белки по изобретению предпочтительно существуют в виде димеров, соединенных друг с другом дисульфидными связями и различными нековалентными взаимодействиями. 1дС4 дикого типа содержит звено Рго-Рго-Суз-Рго-Зег-Суз (8Εζ) ГО N0: 18), начинающееся у остатка 224 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза). Это звено в простой цепи аналога СгЬР-1 и Ес образует дисульфидные связи с соответствующим звеном в другой цепи аналога СгЬР-1 и Ес. Однако присутствие серина в звене вызывает образование одноцепочечных слитых белков. Настоящее изобретение охватывает гетерологичные слитые белки Ес, в которых последовательность 1дС4 подвергается дальнейшему видоизменению так, что серин в положении 228 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза) заменен на пролин (аминокислотный остаток 11 в последовательности 8Εζ) ГО N0: 7).

С-концевой остаток лизина, присутствующий в нативной молекуле, может быть удален в части производного Ес 1дС4 гетерологичных слитых белков, описанных в настоящем изобретении (положение 230 в последовательности 8Εζ) ГО N0: 7; удаленный лизин упомянут как без-К). Слитые белки, экспрессируемые в некоторых клеточных типах (таких как клетки N80), в которых лизин кодируется Суконцевым кодоном, являются гетерологичными в том смысле, что определенная часть молекулы имеет

-4008831 лизин в виде С-концевой аминокислоты, а в другой части лизин удален. Делеция обусловлена действием протеазы во время экспрессии в некоторых типах клеток млекопитающих. Поэтому во избежание этой гетерогенности предпочтительно, чтобы в конструкциях экспрессии слияния Ес отсутствовал С-концевой кодон для лизина.

Предпочтительно, чтобы С-концевая аминокислота части аналога СЬР-1, обсуждаемого в данном описании, сливалась с Ν-концом части аналога Ес 1дС4 посредством линкера, богатого глицином. Функция и устойчивость ίη νίνο гетерологичных слитых белков по изобретению могут быть оптимизированы путем добавления небольших пептидных линкеров с целью предотвращения потенциально нежелательных взаимодействий доменов. Кроме того, линкер, богатый глицином, предоставляет некоторую структурную гибкость так, что часть аналога СЬР-1 может эффективно взаимодействовать с рецептором СЬР1 в клетках-мишенях, таких как β-клетки поджелудочной железы. Однако эти линкеры могут значительно повышать опасность того, что слитый белок будет иммуногенным ίη νίνο. Поэтому предпочтительно, чтобы его длина не была больше необходимой для предотвращения нежелательных взаимодействий доменов и/или оптимизации биологической активности и/или устойчивости. Предпочтительный линкер, богатый глицином, содержит последовательность С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1уС1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 8). Хотя в гетерологичных слитых белках по изобретению можно использовать больше копий этого линкера, предпочтительно, чтобы использовалась одна копия этого линкера для минимизации опасности иммуногенности, связанной с продолжительным и повторным введением в организм.

Предпочтительные гетерологичные слитые белки СЬР-1-Ес настоящего изобретения включают следующие белки:

С1у^а-С1и²²С1у³⁶-СЬР-1 (7-37) -1Ь-1дС4 (5228Р) , С1у^в-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37) 1Ь-1дС4 (3228Р, Г234А, Ь235А) , С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37) -1Ь1дС4 (5228Р, Ν297Α), С1у^е-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α) , С1у⁸-С1и^2г-С1у³⁶-СЬР-1 (7 - 3 7) -1.5Ь-1дС4 (5228Р) , С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37) -1.5Ь-1дС4 (5228Р, Р234А,

Б235А) , С1у⁸-С1и²²-С1у^зй-СЬР-1 (7-37) -1.5Ь-1дС4 (5228Р, Ν297Α) ,

С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37)-1.5Ь-1дС4 (Й228Р, Е234А, Б235А,

Ν297Α) , С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37) -2Ь-1дС4 (5228Р) , С1у^а-С1и²²С1у^зе-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, К234А, Ь235А), С1у^а-С1и²²С1у^э6-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Ν297Α) и С1у^в-С1и^г2-С1у³⁶-СЬР1(7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Е234А, Ь235А, Ν297Α), а также Уа1⁸ и формы с1с5-1< всех вышеприведенных белков.

Терминология, используемая в данном описании в отношении конкретных гетерологичных слитых белков, определяется следующим образом. Специфические замены в части СЬР-1 слитого белка указываются с использованием конкретной заменяемой аминокислоты с последующим номером остатка. СЬР1(7-37) указывает, что часть СЬР-1 зрелого слитого белка начинается с Ηίδ в положении 7 и заканчивается С1у в положении 37. Ь относится к линкеру с последовательностью С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1уС1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 8). Число, непосредственно предшествующее Ь, относится к числу линкеров, отделяющих часть СЬР-1 от части Ес. Линкер, указанный как 1.5Ь, относится к последовательности С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 19). 1дС4 относится к аналогу последовательности Ес человеческого 1дС4, указанной как 8Εζ) ГО N0: 7. Замены в части Ес 1дС4 гетерологичного слитого белка заключены в скобки. Аминокислоту дикого типа определяют с помощью ее общепринятого сокращения с последующим номером положения в контексте всей последовательности 1дС4, используя систему нумерации в соответствии с директивой Европейского союза, за которым следует аминокислота, замещенная в этом положении, которая определяется с помощью ее общепринятого сокращения.

Хотя гетерологичные слитые белки по изобретению могут быть получены с помощью целого ряда различных методов, по причине размера слитого белка предпочтительны рекомбинантные методы. Для целей настоящего изобретения, которое раскрывается и заявляется в данном описании, ниже определены следующие общие термины и сокращения в области молекулярной биологии.

Пара нуклеотидов или и.и., как используется в данном описании, относится к ДНК или РНК. Сокращения А, С, С и Т соответствуют 5'-монофосфатным формам дезоксирибонуклеозидов (дезокси)аденозина, (дезокси)цитидина, (дезокси)гуанозина и тимидина соответственно, когда они встречаются в молекулах ДНК. Сокращения и, С, С и А соответствуют 5'-монофосфатным формам рибонуклеозидов

-5008831 уридина, цитидина, гуанозина и аденозина соответственно, когда они встречаются в молекулах РНК. В двухцепочечной ДНК пара нуклеотидов может относиться к партнерству А с Т или С с С. В ДНК/РНК гетеродуплексная пара нуклеотидов может относиться к партнерству А с и или С с С (см. определение комплементарный, ш1га.).

Расщепление или рестрикция ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции (рестриктазой), который действует только в некоторых последовательностях ДНК (эндонуклеазы, специфические к последовательностям). Различные ферменты рестрикции, используемые в данном описании, доступны для приобретения, и условия их реакции, кофакторы и другие требования были использованы, как если бы были известны среднему специалисту в данной области. Соответствующие буферные растворы и количества субстратов для конкретных ферментов рестрикции определены изготовителем или могут быть без труда найдены в литературе.

Лигирование относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между двумя двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты. Если не указано иное, лигирование можно осуществлять, используя известные буферные растворы и условия, с ДНК-лигазой, такой как ДНК-лигаза Т4.

Плазмида относится к внехромосомному (обычно), самореплицирующемуся генетическому элементу.

Клонирующий вектор рекомбинантной ДНК, как используется в данном описании, относится к любому автономно реплицирующемуся агенту, включая (но не ограничиваясь) плазмиды и бактериофаги, включающему молекулу ДНК, к которой могут быть или были добавлены один или несколько дополнительных ДНК-сегментов.

Экспрессирующий вектор рекомбинантной ДНК, как используется в данном описании, относится к любому клонирующему вектору рекомбинантной ДНК, в который введен промотор в целях управления транскрипцией вставленной ДНК.

Транскрипция относится к способу, посредством которого информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности ДНК, передается комплементарной последовательности РНК.

Трансфекция относится к поглощению экспрессирующего вектора клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются или нет в действительности любые кодирующие последовательности. Специалистам в данной области известны многочисленные методы трансфекции, например соосаждение в фосфате кальция, липосомная трансфекция и электропорация (электрошоковое открытие клеточных пор). Успешная трансфекция как правило признается в случае, если любое указание действия этого вектора имеет место в пределах клетки-хозяина.

Трансформация относится к введению ДНК в организм так, что ДНК имеет возможность реплицироваться или как внехромосомный элемент, или под действием интеграции хромосом. В данной области хорошо известны методы трансформации бактериальных и эукариотических хозяев, и многие из этих методов, таких как ядерная инъекция, слияние протопластов или кальциевая обработка с использованием хлористого кальция, суммированы в работе 1. 8ашЬгоок, с( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, (1989). Как правило, при введении ДНК в дрожжи термин «трансформация» используется как противопоставление термину «трансфекция».

Трансляция, как используется в данном описании, относится к способу, посредством которого генетическая информация матричной (информационной) РНК (мРНК) используется для конкретизации и направления синтеза полипептидной цепи.

Вектор относится к соединению нуклеиновой кислоты, используемому для трансфекции и/или трансформации клеток в манипулировании генами с полинуклеотидными последовательностями, соответствующими подходящим молекулам белка, который при объединении с соответствующими регулярными последовательностями придает специфические свойства трансфицируемой и/или трансформируемой клетке-хозяину. Пригодными векторами являются плазмиды, вирусы и бактериофаг. Искусственные векторы строят путем разрезания и соединения молекул ДНК из различных источников с использованием ферментов рестрикции и лигаз. Термин вектор, как используется в данном описании, включает клонирующие векторы рекомбинантной ДНК и экспрессирующие векторы рекомбинантной ДНК.

Комплементарный или комплементарность, как используется в данном описании, относится к парам оснований (пуринам и пиримидинам), которые образуют ассоциации посредством водородных связей в двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Комплементарными являются следующие пары оснований: гуанин и цитозин; аденин и тимин и аденин и урацил.

Праймер относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует в качестве инициирующего субстрата для ферментативной или синтетической элонгации.

Промотор относится к последовательности ДНК, которая направляет транскрипцию ДНК в РНК.

Зонд относится к соединению нуклеиновой кислоты или его фрагменту, который гидролизуется с другим соединением нуклеиновой кислоты.

Лидерная последовательность относится к последовательности аминокислот, которая может быть ферментативно или химически удалена с получением желательного полипептида.

Сигнальная последовательность секреции относится к последовательности аминокислот, как правило, присутствующей в Ν-конечной области более крупного полипептида, функционирующая в целях

- 6 008831 инициации связывания этого полипептида с отделениями клеточной мембраны наподобие эндоплазматического ретикулума и секреции этого полипептида по мембране плазмы.

Белки человеческого иммуноглобулина С4 дикого типа можно получить из целого ряда источников. Например, эти белки можно получить из библиотеки кДНК, полученной из клеток, которые экспрессируют мРНК на обнаруживаемом уровне. Библиотеки можно скринировать с помощью зондов, построенных с использованием опубликованной последовательности ДНК или белка, для конкретного белка. Например, постоянные области легких или тяжелых цепей иммуноглобулина описаны в работах Абатк. с1 а1. (1980) Вюсйепййгу 19:2711-2719; Οοιίβΐιοί. с1 а1. (1980) Вюсйепйкйу 19:2702-2710; Оо1Ьу, с1 а1. (1980) Ртос. №И. Асаб. 8с1. Ь8А 77:6027-6031; Шее е! а1. (1982) Ртос. N811. Асаб. δει. Ь8А 79:7862-7862; Ра1киет, с1 а1. (1982) Майне 298:286-288 и Моткой, с1 а1. (1984) Аил. Γεν. 1ттшю1. 2:239-256.

Скрининг кДНК или геномной библиотеки с помощью отобранного зонда можно осуществлять с использованием стандартных методик, таких, которые описаны в работе 8ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1ат С1оиίη§: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, Со1б 8рпп§ НатЬот ЬаЬогаЮгу Ртекк, ΝΥ (1989). Альтернативным способом выделения гена, кодирующего иммуноглобулиновый белок, является использование методологии РСК (полимеразно-цепьевая реакция) [8ашЬгоок с1 а1., кирта; ΌίοΓΓοηόηεΙι с1 а1., РСК Рптсг: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, Со1б 8рпп§ НатЬот ЬаЬогаЮгу Ртекк, ΝΥ (1995)]. Праймеры РСК можно построить на основании опубликованных последовательностей.

Обычно последовательности дикого типа, имеющие полную длину, которые клонированы из определенной библиотеки, могут служить в качестве матрицы для создания фрагментов аналога Рс 1§С4 согласно изобретению, которые сохраняют способность придавать аналогу СЬР-1 более длительный период полувыведения из плазмы, причем указанный аналог СЬР-1 является частью слитого белка. Фрагменты аналога Рс 1§С4 могут быть получены с использованием методик РСК с помощью праймеров, построенных для гибридизации с последовательностями, соответствующими желательным концам фрагмента. Праймеры РСК также могут быть спроектированы для создания сайтов ферментов рестрикции, способствующих клонированию в экспрессирующие векторы.

ДНК, кодирующую аналоги СЬР-1 по изобретению, можно получить различными способами, включая методы клонирования, наподобие тех, которые описаны выше, а также с помощью химически синтезированной ДНК. Химический синтез может быть привлекательным, учитывая незначительную длину кодируемого пептида. Аминокислотная последовательность СЬР-1 опубликована наряду с последовательностью гена препроглюкагона [Ьорег, с1 а1. (1983) Ртос. ΝηΙΙ. Асаб. δει., Ь8А 80:5485-5489; Ве11, е! а1. (1983) Майне, 302:716-718; Неишсй, 6., е! а1. (1984) Еибоспио1, 115:2176-2181; 6Ы§1юие, М., е! а1. (1984) 01аЬе!о1о§1а 27:599-600]. Поэтому праймеры можно строить на основе нативной последовательности с получением ДНК, кодирующей описываемые здесь аналоги СЬР-1.

Ген, кодирующий слитый белок, можно затем построить путем лигирования ДНК, кодирующей аналог СЬР-1 внутри рамки считывания, с ДНК, кодирующей белок Ес 1§С по изобретению. ДНК, кодирующая СЬР-1 дикого типа, и фрагменты Ес 1§С4 можно мутировать либо перед лигированием, либо в контексте кДНК, кодирующей целый слитый белок. В данной области техники хорошо известны разнообразные методики мутагенеза. Ген, кодирующий аналог СЬР-1, и ген, кодирующий фрагмент аналога Ес 1§С4, можно также соединить в рамке считывания посредством ДНК, кодирующей С-обогащенный линкерный пептид. Предпочтительная последовательность ДНК, кодирующей один из предпочтительных гетерологичных слитых белков по изобретению, С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1(7-37)-1Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А, бек К), представлена в виде 8Εζ) Ш ΝΟ: 20:

САСЙЙСЙАЙЙЙСАССТТСАССТССЙАССТСТССТССТАТСТСОАЙСАОСАЙЙССЙССААЙЙМ

ТТСАТССССТСССТОСТСААбСССОССОССбСТСбТСеТСССТССССАСССаСССССТСТССТ

ОЙСЙЙТСЙСАССССТСАСТССАААТАТСЙТСССССАТССССАСССТССССАЙСАССТСАОЙСС

ССССЙСОСАССАТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААОСАСАСТСТСАТЙАТСТССССС

АССССТЙАЙЙТСАСОТЙСЙТбСтааТЙЙАСЙТЙАЙССАЙЙААСАССССЙАСЙТССАОТТСААС

ТЙЙТАСЙТССАТаССаТСЙАаОтаСАТААТЙССААЙАСАААЙССйСССЙАЙЗАЙСАСТТСААС

АОСАССТАССЙТЙТЙСТСАаСйТССТСАССйТССТЙСАССАЙЙАСТЙЙСТЙААСйЙСААЙЙАа

ТАСААЙТЙСААЙОТСТССААСАААааССТСССЙТССТССАТСйАСААААССАТСТССАААЙСС

АААС(ЗаСАаСССССАСАОССАСА(3(ЗтаТАСАСССТ<ЗСССССАТСССАОаАОаАЙАТСАССААС

ААССАсатсАосстоАсстасстйстсАААоасттстАссссАассАСАТсассатааАотйа

ОАААССААТСОССАСССЙЙАОААСААСТАСААЙАССАССССТСССатаСТСЙАСТССЙАСООС

ТССТТСТТССТСТАСАССАСССТААСССТСЗСАСААСАССАСйТСаСАССАСйайААТСТСТТС

ТСАТЙСТСССТЙАТЗСАТОАаОСТСТССАСААССАСТАСАСАСАОААСАЙССТСТСССТОТСТ

СТСЙЙТ (8Ξ0 ю N0:20)

-7 008831

Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют с помощью описываемых здесь экспрессирующих или клонирующих векторов в целях производства и культивирования гетерологичных слитых белков в традиционных питательных средах, модифицированных надлежащим образом для индуцирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Условия культивирования, такие как среды, температура, рН и подобное, могут быть легко выбраны средним специалистом в данной области техники. Принципы, протоколы и практические методики максимального повышения продуктивности клеточных культур можно найти в работах Маштакам Се11 Вю1ескпо1оду: А Ргас!юа1 Арргоасй, М. Ви!1ег, ей. (1ВЬ Ргекк, 1991) и 8атЬгоок, е! а1., выше. Методы трансфекции известны среднему специалисту, например, СаРО₄ и электропорация. Общие аспекты трансформаций системы млекопитающая клетка-хозяин описаны в патенте США № 4399216. Трансформации в дрожжи обычно осуществляют в соответствии с методом уаи 8о1шдеи е! а1., 1 Вас!. 130(2): 946-7 (1977) и Нк1ао е! а1., Ргос. №111. Асай. 8ск И8А 76(8): 3829-33 (1979). Тем не менее, можно использовать другие методы введения ДНК в клетки, такие как ядерная микроинъекция, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками или поликатионами, например полибреном или полиомитином. В отношении различных методик трансформации клеток млекопитающих см. 1<ео\уп. е! а1., Ме11юйк ίη Еп/уто1оду 185: 527-37 (1990) и Маикоиг, е! а1., ЫаШге 336 (6197): 348-52 (1988).

Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессии нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в векторах, включают дрожжи или высшие эукариотические клетки.

Эукариотические микробы, такие как нитевидные грибки и дрожжи, являются пригодными клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов слитых белков. 8ассйаготусек сегеу181ае является обычно используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином. Другие включают 8с1ихокасскаготусек ротЬе [Веасй аий Ыигке, Ыа!иге 290: 140-3 (1981); ЕР 139,383, публикация 2 мая 1995 г.]; хозяева Миууеготусек [патент США № 4943529; Е1еег, е! а1., Вю/Тесйио1оду 9(10): 968-75 (1991)], такие как, например, К 1аскк (М^98-8С, СВ8683, СВ84574) [йе Еоиуеисоий е! а1., 1. Вас!егю1. 154(2): 737-42 (1983)]; К. йадШк (АТСС 12,424), К. Ьи1дапсик (АТСС 16,045), К мчскегати (АТСС 24,178), К \νη11ίί (АТСС 56,500), К. йгокорййагит (АТСС 36.906) [Уаи йеи Вегд е! а1., Вю/Тесйио1оду 8(2): 135-9 (1990)]; К. !йегто!о1егаи8 и К. татаиик; уагго\\та (ЕР 402,226); РкЫа рак!ог1к (ЕР 183,070) [8геекпккпа е! а1., 1. Ваыс МюгоЬюк 28(4): 265-78 (1988)]; Саий1й; Тпскойегта гееыа (ЕР 244,234); Ыеигозрога сгакка [Сазе, е! а1., Ргос. №Н1. Асай 8сг И8А 76(10): 5259-63 (1979)]; 8скетаии1отусе8, такие как 8ск\\ш1шотусек осайеЩикк (ЕР 394,538, публикация 31 октября 1990 г.); и нитевидные грибки, такие как, например, Ыеигокрога, РешсШшт, То1урос1айшт (\УО 91/00357, публикация 10 января 1991), и хозяева АкрегдШик, такие как А. шйи1аик [Ва11аисе е! а1., Вюскет. Вюркук. Век. Сотт. 112(1): 284-9 (1983)]; Т11Ьиги, е! а1., Оеие 26(2-3): 205-21 (1983); Уе1!ои, е! а1., Ргос. ЫаИ. Асай. 8с1. И8А 81(5): 1470-4 (1984)] и А. тдег [Ке11у аий Нуиек, ЕМВО 1. 4(2): 475-9 (1985)]. Метилотропные дрожжи выбирают из видов, состоящих из НаикеиШа, Саий1йа, К1оескега, РюЫа, 8ассйаготусек, Тоги1орк1к и Вйойо!огша. Перечень конкретных видов, представляющих этот класс дрожжей, можно найти в работе С. Аи!оиу, Тйе ВюскешМгу ок Ме1ку1о1горкк 269 (1982).

Клетки-хозяева, пригодные для экспрессии слитых белков по изобретению, получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых, такие как Эгокоркйа 82 и 8ройор!ега 8р, 8ройор!ега Ыдй5, а также клетки растений. Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки миеломы N80, яичника китайского хомячка (СНО), 8Р2 и клетки СО8. Более конкретные примеры включают линию почек обезьяны СУ1, трансформированную с помощью 8У40 (СО8-7, АТСС СВЬ 1651); линию почек человеческого зародыша [клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Сгайат, е! а1., 1. Оеи У1го1., 36(1): 59-74 (1977)]; клетки яичника китайского хомячка/-ЭНЕВ [СНО, иг1аиЬ аий Сйакш, Ргос. №111. Асай. 8сг И8А, 77(7): 4216-20 (1980)]; клетки сертоли мыши [ТМ4, Ма1йег, Вю1. Вергой. 23(1):243-52 (1980)]; клетки человеческого легкого (^138, АТСС ССЬ 75); клетки человеческой печени (Нер 02, НВ 8065) и клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССБ51). Предпочтительной линией клеток для продукции слитых белков Ес по изобретению является линия клеток миеломы №О, имеющаяся в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС, каталог #85110503) и описанная в работах Сайге, О. аий Мйк!еш, С. ((1981) Ме!йойк ш Епхуто1оду 73(13): 3-46; и Ргерагайои ой Моиос1оиа1 АийЬой1ек: 8!га!ед1ек аий Ргосейигек, Асайетю Ргекк, Ν.Υ., Ν.Υ.).

Слитые белки по изобретению могут быть получены рекомбинантными методами непосредственно или в виде белка, имеющего сигнальную последовательность или другие дополнительные последовательности, которые создают специфическое место расщепления у Ν-конца зрелого слитого белка. Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или частью ДНК, кодирующей слитый белок, которая вставлена в вектор. Для секреции дрожжей сигнальная последовательность может быть, например, лидером инвертазы дрожжей, лидером альфа-фактора (включая лидеры сс-фактора 8ассйаготусек и К1иууеготусек, причем последние описаны в патенте США № 5010182), или лидером кислотной фосфатазы, лидером глюкоамилазы С. а1Ь1саик (ЕР 362,179), либо сигналом, описанным в \УО 90/13646. При экспрессии клеток млекопитающих сигнальные последовательности млекопитающих могут быть

- 8 008831 использованы для направления секреции белка, например, сигнальные последовательности из секретированных полипептидов того же или родственного вида, а также лидеры вирусной секреции.

Экспрессирующие и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая дает возможность вектору реплицироваться в одном или нескольких выбранных клеткаххозяевах. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например неомицину, метотрексату или тетрациклину, (Ь) комплементируют автотрофные недостатки или (с) поставляют жизненно важные питательные вещества, недоступные из сложных сред, например, ген, кодирующий Ό-аланин рацемазу для Вас1Ш.

Примерами селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются гены, которые обеспечивают идентификацию клеток, отвечающих за «принятие» нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, такой как ΌΗΡΒ или тимидин-киназа. Подходящей клеткой-хозяином при использовании ΌΗΡΒ дикого типа является линия клеток СНО с отсутствующей активностью ΌΗΡΒ, полученная и размноженная в соответствии с описанием [иг1аиЬ апб Скайп, Ргос. №11. Лсаб. 8с1. И8Л, 77(7): 4216-20 (1980)]. Пригодным геном селекции для использования в дрожжах является ген !гр1, присутствующий в дрожжевой плазмиде УКр7 [8!шсйсотЬ, е! а1., №1ите 282(5734): 39-43 (1979); Кшдктап, е! а1., Оепе 7(2): 141-52 (1979); Тксйитрет, е! а1., Оепе 10(2): 157-66 (1980)]. Ген !гр1 предоставляет маркер селекции для мутантного штамма дрожжей с отсутствующей способностью расти в триптофане, например АТСС Νο. 44076 или РЕРС1 [1опе§, Оепейск 85: 23-33 (1977)].

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, для направления синтеза мРНК. Промоторы, распознаваемые разнообразными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны в данной области техники. Примеры пригодных промотирующих последовательностей для использования в дрожжевых хозяевах включают промоторы для 3-фосфоглицерат-киназы [Нй/етап, е! а1., 1. Βίο1. СНет. 255(24): 12073-80 (1980)] или другие гликолитические ферменты [Не§8 е! а1., 1. Αάν. Епхуше Вед. 7: 149 (1968); Но11апб, ВюсНеппйгу 17(23): 4900-7 (1978)], такие как энолаза, глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируват киназа, триозефосфатизомераза, фосфоглюкозаизомераза и глукокиназа. Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцируемыми промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями роста, включают промоторные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, разлагающихся ферментов, ассоциированных с азотным метаболизмом, металлотионеина, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за использование мальтозы и галактозы. Пригодные векторы и промоторы для использования при экспрессии в дрожжах описаны в ЕР 73,657. Транскрипцией мРНК, кодирующей слитые белки, из векторов в клетки-хозяева млекопитающих можно управлять, например, при помощи промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы домашней птицы, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус обязьян (8У40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, и из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.

Транскрипцию полинуклеотида, кодирующего слитый белок, посредством высших эукариотов можно повысить путем вставки последовательности энхансера в вектор. Энхансерами являются цисдействующие элементы ДНК, обычно имеющие от 10 до 300 пар нуклеотидов, которые воздействуют на промотор, повышая его транскрипцию. В настоящее время известны многие последовательности энхансера из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, а-кетопротеин и инсулин). Однако обычно используют энхансер от вируса эукариотической клетки. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне начала репликации (100-270 пар нуклеотидов), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне начала репликации и энхансеры аденовируса. Энхансер можно подвергнуть сплайсингу в вектор в положении 5' или 3' к последовательности, кодирующей слитый белок, однако, он предпочтительно расположен на участке 5' от промотора.

Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетки дрожжей, грибков, насекомых, растений, животных, людей или нуклеиновые клетки из других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для завершения транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доставляются из 5' и в ряде случаев 3' нетранслированных областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной области мРНК, кодирующей слитый белок.

Различные формы слитого белка можно восстановить из культуральной среды или из лизатов клеток-хозяев. Если они связаны посредством мембраны, их можно высвободить из мембраны с использованием пригодного раствора детергента (например, Тритон-Х 100) или посредством ферментативного гидролиза. Клетки, используемые при экспрессии слитого белка, можно разрушить при помощи различ

- 9 008831 ных физических или химических средств, таких как цикл замораживания-оттаивания, воздействие ультразвуком, механическое разрушение или с помощью агентов клеточного лизиса.

После экспрессии гетерологичных слитых белков по изобретению в подходящей клетке-хозяине аналоги можно выделить и очистить. Следующие процедуры являются примерами методик очистки: фракционирование на карбоксиметилцеллюлозе; гель-фильтрация, такая как Сефадекс С-75; анионообменная смола, такая как БЕЛЕ или Мопо-О; катионообменная смола, такая как СМ или Моио-8; металлохелатные колонки для связывания эпитоп-меченых форм полипептида; обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР); хроматофокусирование; силикагель; осаждение этанолом и осаждение сульфатом аммония.

Можно использовать различные методы очистки белков, и такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в работах Беийсйег, МеИобк ίη Еихуто1оду 182: 83-9 (1990) и 8еорс5. Рго1еш РипПсайои: Рппар1е5 аиб Ргасбсе, 8ргшдег-Уег1ад, ΝΥ (1982). Стадия (стадии) очистки зависит от характера производственного процесса и конкретного слитого белка. Например, слитые белки, содержащие фрагмент Ес, могут быть эффективно очищены с использованием аффинной матрицы протеина А или протеина С. Буферные растворы с низким или высоким рН могут быть использованы для элюирования слитого белка из аффинной матрицы. Мягкие условия элюирования содействуют предотвращению необратимой денатурации слитого белка.

Гетерологичные слитые белки по изобретению могут приготовляться с содержанием одного или нескольких наполнителей. Слитые белки по изобретению могут быть объединены с фармацевтически приемлемым буферным раствором, а величина рН отрегулирована для получения допустимой устойчивости и величины, приемлемой для введения, такого как парентеральное введение. По выбору можно добавлять одно или несколько фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными противомикробными средствами являются мета-крезол и фенол. Для регулирования ионной силы или тоничности можно добавлять одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Для регулирования изотоничности состава можно добавлять один или несколько наполнителей. Глицерин является примером наполнителя, регулирующего изотоничность. Фармацевтически приемлемые средства, предназначенные для введения людям и животным, не содержат токсичных элементов или нежелательных загрязнителей и не сказываются на активности активных соединений.

Гетерологичные слитые белки по изобретению можно приготавливать в виде раствора или лиофилизированного порошка, который можно восстанавливать с помощью подходящего растворителя. Лиофилизированная лекарственная форма представляет собой форму, в которой слитый белок устойчив, обладает или не обладает буферной способностью для поддержания рН раствора на протяжении предполагаемого периода полужизни восстановленного продукта. Предпочтительно, чтобы раствор, содержащий описываемые здесь гетерологичные слитые белки, перед лиофилизацией был, по существу, изотоническим, что способствует образованию изотонических растворов после восстановления.

Настоящее изобретение включает форму фармацевтически приемлемой соли гетерологичных слитых белков. Кислоты, обычно используемые для образования кислых аддитивных солей, являются неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и так далее, а также органическими кислотами, такими как р-толуолсульфокислота, метансульфокислота, щавелевая кислота, рбромфенилсульфокислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и так далее. Предпочтительными кислыми аддитивными солями являются такие, которые образуются с минеральными кислотами, такими как хлористо-водородная кислота и бромистоводородная кислота.

Основные аддитивные соли включают такие, которые происходят от неорганических оснований, таких как аммоний или щелочные гидроксиды земельных металлов, углекислые соли, бикарбонаты или двууглекислые соли и тому подобное. Такие основы используются для приготовления солей настоящего изобретения, включая, каустическую соду, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и тому подобное.

Гетерологичные слитые белки по изобретению проявляют биологическую активность. Биологическая активность относится к способности слитого белка связываться с рецептором СЬР-1, активировать его ίη у|уо и вызывать ответ. Ответы включают (однако, не ограниваются) секрецию инсулина, подавление глюкагона, ингибирование аппетита, потерю веса, индуцирование инсулина, ингибирование апоптоза, индукцию размножения панкреатических β-клеток и дифференциацию панкреатических β-клеток. Показательное число слитых белков СЬР-1 испытывали на активность ίη У11го, а также ίη νί\Ό. В примерах 1 и 2 представлена активность ίη νίΙΐΌ на основе способности слитого белка взаимодействовать с рецептором человеческого СЬР-1 и активировать последний. В обеих сериях экспериментов использовали клетки НЕК293, сверхэкспрессирующие рецептор человеческого СЬР-1. Активация рецептора СЬР-1 в этих клетках вызывает активацию аденилилциклазы, которая в свою очередь индуцирует экспрессию гена-репортера, движимую элементом ответа циклического АМФ (СКЕ). В примере 1 (табл. 1) приведены данные, причем геном-репортером является β-лактамаза, а в примере 2 (табл. 2) приведены данные,

- 10 008831 причем геном-репортером является люцифераза. В примере 3 приводятся данные, полученные после введения крысам одного из гетерологичных слитых белков по изобретению. Вместе эти данные показывают, что слитые белки способны связываться с рецептором СЬР-1 и активировать его, причем они являются более сильными ίη уйго, чем Уа1⁸-СЬР-1 (7-37)ОН. Кроме того, данные, полученные после введения крысам, показывают, что слитые белки активны ίη νίνο и имеют более длительный период полужизни, чем нативный СЬР-1.

Введение гетерологичных слитых белков по изобретению можно осуществлять любым способом, известным врачу, обладающему средними познаниями в данной области. Одним таким способом является периферическое парентеральное введение. В медицинской литературе под парентеральным введением обычно понимается инъекция лекарственной формы с помощью стерильного шприца или какого-то другого механического устройства, например инфузионного насоса. Периферические парентеральные способы могут включать внутривенный, внутримышечный, подкожный и внутрибрюшинный способы введения.

Гетерологичные слитые белки по изобретению могут также подлежать введению пероральным, ректальным, назальным или низшим респираторным способами, которые являются не парентеральными способами введения. Среди этих не парентеральных способов предпочтительны низший респираторный и пероральный способы.

Слитые белки по изобретению могут использоваться при лечении широкого круга заболеваний. Слитые белки по изобретению главным образом проявляют свои биологические эффекты, действуя на рецептор, упоминаемый как «рецептор СЬР-1». Пациенты, на состоянии которых благоприятно отражается стимуляция рецепторов СЬР-1 или введение соединений СЬР-1, могут проходить курс лечения с использованием слитых белков СЬР-1 по изобретению. Можно сказать, что эти пациенты нуждаются в лечении соединениями СЬР-1 или нуждаются в стимулировании рецептором СЬР-1. Среди таких пациентов люди, страдающие инсулиннезависимым сахарным диабетом, инсулинзависимым сахарным диабетом, ожирением (см. публикацию XV О 00/16797), инфарктом миокарда (см. публикацию XVО 98/08531), ожирением (см. публикацию XVО 98/19698), катаболическими изменениями после хирургии (см. патент США № 6006753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженной толстой кишки (слизистый колит) (см. публикацию ΧνΟ 99/64060). В такой же степени это относится к пациентам, нуждающимся в профилактическом лечении соединением СЬР-1, например, пациенты группы риска в отношении развития инсулиннезависимого сахарного диабета (см. публикацию νΟ 00/07617). Пациенты с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак, пациенты, чей вес превышает на 25% нормальный вес тела по причине роста и телосложения, пациенты с резекцией поджелудочной железы, пациенты, имеющие одного или несколько родителей, страдающих инсулиннезависимым сахарным диабетом, пациенты, которые страдали сахарным диабетом, обусловленным беременностью, и пациенты, которые страдали острым или хроническим панкреатитом, относятся к группе риска в отношении развития инсулиннезависимого сахарного диабета.

Эффективным является количество описываемых здесь слитых белков СЬР-1-Ре, которое приводит к получению желательного терапевтического и/или профилактического эффекта при отсутствии побочных эффектов при введении пациенту, нуждающемуся в стимулировании рецептора СЬР-1. Желательный терапевтический эффект заключается в следующем: 1) менее выраженное проявление симптомов заболевания или состояния; 2) более редкое проявление симптомов заболевания или состояния; 3) возросшая продолжительность жизни при проведении лечения и 4) более высокое качество жизни при проведении лечения. Например, эффективное количество слитого белка СЬР-1-Ре для лечения сахарного диабета представляет собой количество, которое привело бы к повышенному контролю за концентрацией глюкозы в крови, результатом чего является задержка диабетических осложнений, таких как ретинопатия, невропатия или заболевание почек. Эффективное количество слитого белка СЬР-1-Ре для предотвращения сахарного диабета представляет собой количество, которое привело бы к задержке, повышения уровней глюкозы в крови, что требует лечения с помощью таких противогипогликемических препаратов, как сульфонил-мочевины, тиазолидиндионы, инсулин и/или бисгуанидины.

Доза слитого белка, эффективная для нормализации глюкозы в крови пациента, зависит от ряда факторов, среди которых пол, вес и возраст пациента, степень неспособности регулировать уровень глюкозы в крови, способ введения и биологическая доступность, фармакокинетический профиль слитого белка, действенность и рецептура. Диапазон дозы может составлять от 0,01 до 1 мг/кг веса тела, предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/кг веса тела.

Предпочтительно вводить слитые белки по изобретению или один раз каждые две недели, или раз в неделю. В зависимости от заболевания может возникнуть необходимость введения слитого белка чаще, например 2-3 раза в неделю.

Настоящее изобретение поясняется приведенными ниже примерами, которые не ограничивают объем изобретения.

- 11 008831

Примеры

Пример 1. Анализ активации рецептора СЬР-1 ίη νίΐτο.

Используя систему СКЕ-ВЬАМ, клетки НЕК-293, экспрессирующие рецептор человеческого ΠΕΡΙ, высевают с интенсивностью 20000-40000 клеток на лунку в 100 мкл среды ϋΜΕΜ с помощью 10% сыворотки плода коровы (ЕВ 8) в черный планшет из 96 лунок с прозрачным дном и покрытием из полисе лизина. Через день после высевания среду удаляют и добавляют 80 мкл среды ОМ ЕМ. не содержащей плазму. На третий день после высевания в каждую лунку добавляют 20 мкл среды ОМ ЕМ. не содержащей плазму, вместе с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (В 8А), содержащим различные концентрации гетерологичного слитого белка СЬР-1-Ес, в целях получения кривой доза-эффект. Как правило, для получения кривой доза-эффект используют 14 разведений с содержанием 3-30 нмоль гетерологичного слитого белка СЬР-1-Ес, и на основе этой кривой определяют значения ЕС50. Через 5 ч инкубации со слитым белком в среду добавляют 20 мкл субстрата на основе β-лактамазы (ССЕ2/АМ, РапУега ЬЬС) и инкубацию продолжают в течение 1 ч, за это время флуоресценцию определяют на цитофлуорографе. Анализ также описан в работе 21окагшк, с( а1. (1998), 8с1еисе, 278:84-88. Исследуют различные слитые белки СЬР-1-Ес, и значения ЕС₅₀ представлены в табл. 1. Значения соотносятся со значениями, определенными для соединения Уа1⁸-СЬР-1(7-37)ОН, которое используют в качестве внутреннего контроля при проведении каждого эксперимента.

Соединение

Уа1^й-<ЗЬР-1·.

С1у⁸-01и²²-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (322ΘΡ, Р234А, Ь235А) :

С1у^й-С1и²²-СЬ₽-1 (7-37)-1.5Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Ь235А):

О1у^е-С1и²²-<ЗЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (Ξ228Ρ, Р234А, Ь235А):

С1у^в-С1и²²-С1у²⁶-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (322ВР, Р234А, Ь235А) :

Таблица 1

Активность Ст. откл.

100%	99
301%
45
314%
468%	120
441%	35

Пример 2. Анализ активации рецептора СЬР-1 ίη νίΐτο.

Используя систему СКЕ-люцифераза, клетки НЕК-293, устойчиво экспрессирующие рецептор человеческого СЬР-1, высевают в планшет из 96 лунок с интенсивностью 30000 клеток на лунку в 800 мкл среды ЬМЕМ Е12 с низким содержанием сыворотки. Через день после высевания 20 мкл аликвоты исследуемого белка, растворенного в 0,5% В 8А, смешивают и инкубируют с клетками в течение 5 ч. Как правило, для получения кривой доза-эффект используют 12 разведений с содержанием от 3 пмоль до 3 нмоль гетерологичного слитого белка СЬР-1-Ес при концентрации 5Х для каждого исследуемого белка перед его добавлением в клетки и на основе этой кривой определяют значения ЕС50. После инкубации 100 мкл реагента люциферазы добавляют непосредственно в каждый планшет и осторожно перемешивают в течение 2 мин. Планшеты помещают в люминометр Тп-1их и производят расчет мощности света в результате экспрессии люциферазы. Исследуют различные слитые белки СЬР-1-Ес, и значения ЕС₅₀ представлены в табл. 2. Значения соотносятся со значениями, определенными для соединения Уа1⁸-СЬР1(7-37)ОН, которое используют в качестве внутреннего контроля при проведении каждого эксперимента. Поскольку исследуемые слитые белки являются димерами, значения корректируют с учетом 2-кратной разницы в молярности.

Таблица 2

Соединение	Актив-	Ст.
	ность	откл .
Уа1е-СЬР-1:	100%
С1уе-С1и22-СЬР-1(7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Ь235А) :	535%	240
О1ув-С1и2г-СЬР-1(7-37)-1.5Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Б235А) :	595%	43
С1уй-С1и22-СЬР-1(7-37)-1Ь-1дС4 (522ВР, Е234А, Ь235А):	1119%	128
С1ув-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Г234А, Ъ235А) :	398%	62
С1ув-С1и22-С1уЗЕ-СЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Б235А):	417%	140
Пример 3. Исследование толерантности к внутривенному введению глюкозы крысам. Слитый белок Ес, С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1(7-37)-Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А), оценивают при исследовании толерантности к внутривенному введению глюкозы крысам (ΙΥΟΤΤ). В каждой из трех групп

исследуются по меньшей мере четыре крысы. Крысы в группе I получают носитель (табл. 3), крысы в группе II получают 1,79 мг/кг С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЬР-1 (7-37)-Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А) в форме однократной подкожной инъекции (табл. 4) и крысы в группе III получают 0,179 мг/кг С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶СЬР-1(7-37)-Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А) в форме однократной подкожной инъекции (табл. 5). Подкожную инъекцию крысам осуществляют утром 1 дня. Через 24 ч после первой инъекции проводят ин-12008831 фузию 1 мкл глюкозы (050) на 1 г массы тела в форме шарика. Пробы крови отбирают через 2, 4, 6, 10, 20 и 30 мин после проведения инфузии глюкозы.

Носитель:Крыса 1 Крыса 2 Крыса 3 Крыса 4 Крыса 5

Инсулин АиС (нг*мин/мл)

0-2	11	9,4
2-4	18,1	9,7
4-6	13,4	7
6-10	7,9	3,5
10-20	3,7	3
20-30	2	0
Итого	56,1	32,6

7	11	9,6	Среднее
5,6	10,6	8,8
3,4	9,6	5,9
2,5	6	2,9
2,4	3	2,4
0	0	2,4
20, 9	40,2	32	36,4

Таблица 3

БЕМ*

5, е

СЬР-1-Рс (1,79мг/кг) Крыса 1Крыса 2Крыса

Инсулин Аис (нг*мин/мл)

Таблица 4

Крыса 4 Крыса 5

0-2	12,3	17,4	16
2-4	21,9	13,3	13,2
4-6	16,8	6,5	9,8
6-10	7,6	3,8	9,2
10-20	3	0	0
20-30	0	0	0
Итого	61,6	41	48,2

	Среднее БЕМ*
14	13
13,9	13,6
11,1	11,7
5,8	7,4
3,2	5,6
0	0
48	51,3	50 3,4

СЬР-1-Гс (0,179мг/

кг)	Крыса 1	Крыса 2	Крыса
ИнсулинАЦС (нг*мин/мл)
0-2	14,4	29,2	25,4
2-4	13,8	26,3	21,2
4-6	11,2	19,4	16,4
6-10	6,4	10,6	10,5
10-20	3,6	5,8	5,2
20-30	0	0	0
Итого	49,4	91,3	78,7

Таблица 5

Крыса 4

23,2

21,8

15, 7

73,7

БЕМ*

ЗЕМ* = сканирующая электронная микроскопия

Пример 4. Фармакокинетическое исследование после проведения однократной подкожной инъекции обезьянам Супото1§и8.

Исследование проводят с целью получения характеристики фармакокинетики (ФК) слитого белка Ес, 61у⁸-61и²²-61у^3б-6ЕР-1(7-37)-Е-1§64 (8228Р, Е234А, Б235А) при введении самцам обезьян суиошо1§и§ в форме подкожной инъекции (ПИ) в количестве 0,1 мг/кг. Антитело радио иммуноанализа (РИА) является специфическим относительно средней части СЬР. Твердофазный иммуноферментный анализ

-13 008831 (ЕЫ8А) основан на использовании иммобилизованного антитела, специфического к Ν-концу, и идентифицирующего антитела, специфического к Ес. Полученные концентрации плазмы в результате проведения и ЕЫ8А, и РИА используют для определения представленных значений фармакокинетических параметров.

Значения полученных ФК параметров сведены в табл. 6. ФК однократной ПИ в результате РИА ассоциируется со средним С_тах, равным 446,7 нг/мл, при соответствующем Т_тах, равным 17,3 ч. Средний период полувыведения из плазмы составляет примерно 79,3 ч (3,3 дня). ФК в результате ЕЫ8А ассоциируется со средним Стах, равным 292,2 нг/мл, при соответствующем Т_тах, равным 16,7 ч. Средний период полувыведения из плазмы составляет примерно 51,6 ч (2,2 дня).

Таблица 6

РИА
Доза (мг/кг)	Животное №	Г * (нг/мл)	(ч)	Аис0.щ с (нг*ч/мл)	(Ч)	СЬ/Р (мл/ч/кг)	(мл/кг)
0,1	96051	461,0	4,0	37770,5	81,0	2,7	309,2
	96071	430,0	24,0	43150,2	74,2	2,3	248,1
	96091	449,0	24,0	62271,1	82,9	1,6	191,9
РИА	Среднее	446,7	17,3	47730,6	79,3	2,2	249,8
	СО	15,6	11,5	12876,5	4,5	0,5	58,7
ЕЫ5А
	96051	315,4	2,0	9062,3	55,2	11,0	979,4
	96071	289,4	24,0	16653,0	50,3	6,0	436,0
	96091	271, 9	24,0	19907,4	49,3	5,0	357,0
ЕЫЗА	Среднее	292,2	16,7	15207,6	51,6	7,3	557,5
	СО	21,9	12,7	5565,2	3,2	3,2	281,6

^а Максимальная концентрация плазмы.

^ь Время максимальной концентрации плазмы.

^с Площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени, измеренная от 0 до бесконечности. ^а Период полувыведения из плазмы.

^е Общее очищение организма в зависимости от биологической доступности.

^г Объем распределения в зависимости от биологической доступности.

СО = стандартное отклонение.

Пример 5. Оценка потенциального образования антител после проведения повторных подкожных инъекций.

Определенные пробы сыворотки от обезьян супошо1ди8 исследуют на образование антител против С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЕР-1(7-37)-Е-1дС4 (8228Р, Е234А, Ь235А), используя прямой формат ЕЬ18А. Планшеты микротитратора покрывают С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЕР-1(7-37)-Е-1дС4 (8228Р, Е234А, Ь235А) при концентрации 0,1 мкг/мл. Пробы сыворотки обезьян разбавляют 50, 500, 1000 и 5000 раз в блокирующем растворе и пробы в количестве 0,05 мл на лунку инкубируют приблизительно один час. Вторичное антитело, козлиную <человеческую ЕаЬ'2>-пероксидазу (имеющая 75% перекрестную реактивность в отношении человека), разбавляют 10000 раз в блокирующем растворе, добавляют в количестве 0,05 мл на лунку и инкубируют приблизительно 1 ч. Проявление цвета при использовании субстрата тетраметилбензидин (ТМБ) считывают при оптической плотности 450-630 нм. Сдвоенные показания усредняют. Антитело СЬР-1 используют в качестве положительного контрольного значения и конъюгат козлиная<кроличья>(Н+Е)-пероксидаза используют для определения в качестве вторичного антитела. Точечные пробы сыворотки собирают перед дозированием, через 24 ч после введения второй дозы и через 168 ч после введения первой и второй подкожных доз для оценки потенциальной иммуногенности. Присутствие титров антитела к С8Е22-СЕХ-Ь-ЫдС4 интерпретируют путем сравнения с пробами сыворотки перед дозированием (ПД) и положительным контрольным значением. Соответствующие результаты приведены в табл. 7.

-14008831

Таблица 7

Доза 1 Животное №	Полож. Контр,	107774		107777		107779		107780
Проба Время:		пд	168 ч	ПД	168ч	ПД	168 ч	пд	168 ч
50х	2,854	0,268	0,268	0,160	0,128	0,144	0,152	0,264	0,224
500х	2,270	0,117	0,133	0,052	0,069	0,065	0,061	0,067	0,061
ЮООх	1,610	0,091	0,075	0,034	0,051	0,047	0,045	0,138	0,049
ЗОООх	0,525	0,056	0,048	0,032	0,037	0,029	0,033	0,051	0,039
Доза 2 Животное №	Полож. Контр.	Ю7774		107777		107779		107780
Проба Время:		пд	24 ч	ПД	24 ч	пд	24ч	пд	24 ч
50х	3,056	0,298	0,231	0,164	0,159	0,227	0,176	0,211	0,192
500х	2,247	0,120	0,119	0,048	0,045	0.061	0,060	0,056	0.057
ЮООх	1,673	0,090	0,086	0,039	0,041	0,046	0,045	0,043	ОЖ
5000х	0,534	0,039	0,042	0,030	0,034	0,033	0,036	0,033	0,034
До1а 2 Животное №	Полож. Контр,	107774		107777		107779		107780
Проба Время:		пд	168 ч	ПД	168ч	ПД	168 ч	ПД	168 ч
50х	3,075	0,413	0,270	0,174	0,182	0,185	0,190	0,224	0,191
500х	2,173	0,097	0,103	0.042	0,051	0,056	0,05?	0,048	0,053
ЮООх	1,510	0,066	0,067	0,038	0,040	0,037	0,046	0,043	0,043
5000х	0,474	0,042	0,042	0,033	0,046	0,033	0,033	0,036	0,041

Пример 6. Фармакодинамическое исследование после однократной подкожной инъекции обезьянам Суиото1ди8 в состоянии натощак и во время постепенной внутривенной инфузии глюкозы.

В фазе 1 (первый день исследования) осуществляют подкожную инъекцию носителя. Затем сразу после инъекции носителя осуществляют постепенную внутривенную инфузию глюкозы (20% декстроза) со скоростью 5, 10 и 25 мг/кг/мин. В фазе 2 (третий день исследования) осуществляют подкожную инъекцию слитого белка СЬР-1 (0,1 мг/кг). В фазе 3 постепенную внутривенную инфузию глюкозы осуществляют приблизительно через 96 ч после инъекции слитого белка СЬР-1.

Процедуры постепенной внутривенной инфузии глюкозы осуществляют на седативных обезьянах после 16-часового ночного голодания. Для обоих внутривенных инфузии глюкозы каждые 10 мин на 20 мин отбирают базисные пробы для определения исходных данных. Ступенчатую инфузию глюкозы начинают через каждые 20 мин со скоростью 5 мг/кг/мин с последующей инфузией со скоростью 10 и 25 мг/кг/мин. Каждую инфузию осуществляют в течение 20 мин. Пробы крови отбирают с 10-минутными интервалами для измерения глюкозы, инсулина и глюкагона. Приблизительно 1,0 мл крови собирают в промежутках, равных -20, -10, 0 (предглюкозная инфузия) и 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин, после инфузии глюкозы для фаз 1 и 3.

Соответствующие данные приведены в табл. 8.

-15 008831

Глюкоза	лис
Группа	Животное	лис (мин*мг/дл)	Группа	Животное	лис (мин*мг/дл)
СЪР-Рс	9423	7447	носитель	9423	8077
	9424	7470		9424	15006
	9510	5153		9510	7116
	9513	6303		9513	74 5 9
	9516	5413		9516	8728
	9530	5240		9530	7863
				Нет	6
	Среднее	6171		Среднее	9041
	со	1078		со	2973
	СО	440		СО	1214
инсулин лис
		лис			лис
Группа	Животное	(мин*нг/мл)	Группа	Животное	(мин*нг/мл)
<зьр- гс	9423	129	носитель	9423	38
	9424	138		9424	29
	9510	357		9510	69
	9513	161		9513	64
	9516	376		9516	38
	9530	215		9530	68
	Среднее	229		Среднее	51
	СО	111		СО	18
	СО	45		СО	7

Таблица 8

Уровни глюкагона не имели статистического различия на примере обезьян, получивших дозу носителя и слитого белка СЬР-1.

Пример 7. Фармакодинамическое исследование после однократной подкожной инъекции трех различных доз крысам в состоянии натощак и во время постепенной внутривенной инфузии глюкозы.

Хронически канюлированных крыс распределяют либо по контрольной группе с носителем (солевой раствор), либо по одной из трех лечебных групп (слитый белок СЬР-1; 0,0179 мг/кг, 0,179 мг/кг или 1,79 мг/кг). Слитый белок СЬР-1 и носитель вводят путем подкожной инъекции. Через 24 ч после лечения крыс, подвергнутых ночному голоданию (16 ч), подвергают исследованию на постепенное внутривенное вливание глюкозы. Исследование на постепенное внутривенное вливание глюкозы заключается в проведении инфузии базового солевого раствора (20 мин) с последующими двумя 30-минутными инфузиями глюкозы со скоростью 5 и 15 мг/кг/мин соответственно. Пробы плазмы собирают в промежутках, равных -20, -10, 0 (предглюкозная инфузия) и 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин.

Соответствующие данные приведены в табл. 9.

Таблица 9

	5 мг/кг/мин	15 мг/кг/мин
Носитель	4,3 + 0,2 (п=1В)	12,7 ± 0,9 (п=18)
0,0179 мг/кг	5,6 ± 0,4 (П=4)	15,9 + 1,8 (п=4)
0,179 мг/кг	9,0 ± 1,1* (п=6)	28,0 ± 3,8* (п=6)
1,79 мг/кг	20,5 ± 3,0 * (п=4)	52,7 ± 7,2* (п=4)

*Р < 0,05 в сопоставлении с носителем

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Гетерологичный слитый белок, содержащий аналог ОЬР-1, включающий последовательность, выбранную из группы, состоящей из

   a) (БЕР ГО N0:1)

   Н1в-Хаа5-С1ц-С1у-ТЪг-Р11е-Т]1г-5ег-А8р-Уа1-5ег-8ег-Туг-ЬеиС1и-С1и-61п-А1а-А1а-Ьуз-01и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьуз-е1уС1у-С1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;

   b) (БЕР ГО N0:2)

   Н1з-Хаа_а-Е1и-(31у-Т11г-Р11е-Т11г-Еег-Аер’Уа1-Зег-Зег-Туг-ЬеиС1и-а1и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-<31и-Р11е-11.е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьуз-Азп-01уС1у-С1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;

   c) (БЕР ГО N0:3)

   Н1з-Хаа₀-С31и-О].у-Т11г-₽11е-Т11г-Еег-Азр-Уа1-Зег-Еег-Туг-ЬеиС1и-01и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-(31и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьуз-С1уС1у-Рго где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;

   ά) (БЕР ГО N0:4)

   Н18-Хаа_а-С1и-С1у-ТЬг-Р11е-Т}1г-Зег-Азр-Уа1-Бег-Зег-Туг-ЬеиС1и-С1и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-Р11е-11е“А1а-Тгр-Ьеи-Ьу5-Аз11-61уС1у-Рго где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;

   е) (БЕР ГО N0:5)

   Н13-Хаа_в-С1и-С1у-ТЬг-Р11е-Т11г-8ег-Азр-Уа1-Зег-5ег-Туг-ЬеиС1и-О1и- 01п-А1а-А1а-Ьуз-С11и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу8а1у-<з1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;

   £) (БЕР ГО N0:6)

   Н1з-Хаа_в-С1и-С1у-ТЬг-Р11е-ТИг-5ег-Азр-Уа1-Зег-Еег-Туг-Ьеи(31и-01и- С1п-А1а-А1а-Ьуз-01и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьув-АзпС1у-С1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;

   слитый с частью Ес иммуноглобулина, содержащего последовательность БЕр ГО N0:7

   А1а-С1и-5ег-Ьуз-Туг-С1у-Рго-Рго-Су8-Рго-Рго-Сув-Рго-А1а-РгоХаа1б-Хаа17-Хаа1₈-С1у-81у-Рго-Зег-Уа1 -РБе-Ьеи-РБе-Рго-Рго-Ьуз-РгоЬуз-Азр-Т11г-Ьеи-МеЬ-11е-Вег-Агд-Т11г-Рго-С1и-'У^,а1-ТЬг-С?уз-Уа1Уа1-Уа1-Азр-Уа1-Зег-С1п~С1и-А8р-Рго-С1и-Уа1-О1п-Р11е-Азп-ТгрТуг-Уа1-Азр-а1у-Уа1-О1и-Уа1-Н1з-Азп-А1а-Ьуз-Т11г-Ьуз-Рго-АгдС1и-<31и-б1п-Рке-Хаа_йо-8ег-Т’11г-Туг-Агд-Уа1-Уа1-Зег-Уа1-Ьеи-ТЬгУа1-Ьеи-Н18-С1п-Азр-Тгр~Ьеи-А5п-С1у-Ьу8-01и.-Туг-Ьуз-Суз-ЬузУа1-5ег-Азп-Ьу8-С1у-Ьеи-Рго-Зег-Зег-11е-С1и-Ьуз-ТЬг-11е-ЗеГ’

   Ьу8-А1а-Ьу8-а1у-01п-Рго-Агд-а1и-Рго-С1п-Уа1-Туг-ТЬг-Ьеи-РгоРго-8ег-С1п-(31и-С1и“Ме(:-Тйг-Ьу8-Азп-С1п-Уа1-5ег-Ьеи-ТЬг-Су8Ьеи-Уа1-Ьу8-О1у-Рке-Туг-Рго-Зег-Азр-11е-А1а-7а1-С1и-Тгр-01и5ег-А8п-а1у-С1п-Рго-Е1и-Азп-Азп-Туг-Ьуз-Т}1г-Ткг-Рго-Рго-Уа1Ьеи-Азр-5ег-Азр-<31у-5ег-РЪе-Рке-Ьеи-Туг-Зег-Агд-Ьеи-ТЬг-Уа1Азр-Ьуз-Зег-Агд-Тгр-а1п-01и-С1у-Азп-Уа1-Р11е-5ег-Суэ-Зег-Уа1МеЬ-Н1з-С1и-А1а-Ьеи-Н13-А8П-Н18-Туг-ТЬг-01п-Ьуз-5ег-Ьеи-8егЪои-Зах*-Ъаи-С1_у-Хаа₂₂о (ЗΕ^ Ιϋ Ν0ι7) где Хаа в положении 16 означает Рго или 01и;

   - 17008831

   Хаа в положении 17 означает РЬе, Уа1 или А1а;

   Хаа в положении 18 означает Ьеи, С1и или А1а;

   Хаа в положении 80 означает Аки или А1а и

   Хаа в положении 230 означает Ьу§ либо отсутствует.
2. 2. Гетерологичный слитый белок по п.1, отличающийся тем, что С-концевой остаток глицина аналога СгЬР-1 слит с Ν-концевым остатком аланина части Ес посредством пептидного линкера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

   a) 61у-О1у-С1у-О1у-£ег-О1у-С1у-С1у-С1у-5ег-31у-а1у-С1у-01у-

   Зег (5ЕС Ιϋ N0:8);

   b) 61у-Зег-С1у-С1у-С1у-С1у-Зег-С1у-С1у-б1у-С1у-Зег-С1у-Й1уО1у-О1у-Зег-С1у-С1у-О1у-О1у-Зег (ЗЕО 1Б N0:19); и

   c) С1у-01у-а1у-01у-8ег-01у-С1у-01у-О1у-8ег-С1у-С1у-01у-С1уЗег-С1у-е1у-С1у-С1у-Зег-С1у-61у-С1у-61у-Зег-О1у-С1у-(31у-<Э1у-5е1· (5Е<2 1Б N0:21) .
3. 3. Гетерологичный слитый белок по п.2, отличающийся тем, что линкер содержит последовательность §Εζ) Ю N0:8.
4. 4. Гетерологичный слитый белок по любому из пи. 1-3, отличающийся тем, что Хаа в положении 8 аналога 6ЬР-1 представляет собой 61у.
5. 5. Гетерологичный слитый белок по любому из пи. 1-3, отличающийся тем, что Хаа в положении 8 аналога ОЬР-1 представляет собой Уа1.
6. 6. Гетерологичный слитый белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что аналог СгЬР-1 содержит последовательность §Εζ) Ю N0:1.
7. 7. Гетерологичный слитый белок, выбранный из группы, состоящей из:

   а) О1у^е-01и²²-01у^зв-0ЬР-1 (7-37)-1Ь-1дО4 ( 52 2 8Р) ; Ь)

   01у^а-О1и²²-01у³⁶-СЬР-1 (7-37) -1Ь-1д04 (3228Р, Р234А, Ь235А) ; с)

   С1у⁸-С1и²²-С1у³⁶-СЪР-1 (7-37) -1Ь-1дС4 (3228Р, Ν297Α) ; (1) 01у³-01и²²О1у³⁶-ОЬР-1(7-37)-1Ь-1дС4 (3228Р, Г234А, Ь235А, Ν297Α); е) 01у⁸01и^г2-С1у³⁶~ОЬР-1 (7-37)-1.5Ь-1дС4 (3228Р); £) С1у⁸-С1и²²-51у^3!:-СЬР1(7-37)-1.5Ь-1д<34 (3228Р, Р234А, Ь23 5А) ; д) С1у^в-01и²²-01у³⁶-ОЬР1(7-37)-1.5Ь-1дО4 (5228Р, Ν297Α); И) 01у^в-О1и²²-а1у³⁶-0ЬР-1 (7-37)1.5Ъ-1дС4 (3228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α) ; ί) О1у⁸-О1и²²-01у³⁵-СЬР1 (7-37) -2Ь-1дС4 (8228Р) ; ]) С1у^а-01и²²-С1у³⁶-0ЬР- 1 (7-37) - 2Ь-1дС4 (3228Р, Р234А, Е235А) ; к) С1у^в-С1и²²-01у^за-0ЬР-1 (7-37) -2Ь-1д04 (Е228Р, Ν297Α); 1) 01у^а-01и²²-а1у³⁶-0ЬР-1 (7-37)-2Ь-1д04 (8228Р,

   Г234А, Б235А, Ν297Α); и его сЗез-К форм.
8. 8. Гетерологичный слитый белок, выбранный из группы, состоящей из:

   а) Уа1^в-С1и²²-01у³⁶-СЬР-1 (7-37)-1Б-1д04 (8228Р) ; Ь)

   Уа1^в-О1и²²-01у^3€-СЬР~1 (7-37)-1Ь-1д04 (8228Р, Р234А, Б2 35А) ; с)

   Уа1⁸-О1и²²-01у^3€-0ЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (8228Р, Ν297Α) ; ά) Уа1^э-С1и²²01у³⁶-0ЬР-1(7-37)-1Ь-1дО4 (8228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α); е) Уа1^а01и²²-01у^зе-0ЬР-1(7-37) -1.5Ь-1дО4 (8228Р) ; £) Уа1^е-01и²²-01у³⁶-СЬР1 (7-37)-1.5Ь-1д04 (8228Р, Р234А, Σ235Α) ; д) Уа1⁰-С1и²²-О1у³⁶-СЬР1(7-37) -1.5Ь-1дО4 (3228Р, Ν297Α) ; Ь) Уа1⁸-01и²²-С1у³⁶-ОЬР-1 (7-37)1.5Ь-1дС4 (Б228Р, Р234А, Ь235А, Ν2 97Α) ; ί) Уа1⁸-С1и²²“01у³⁶-0ЬР1 (7-37) -2Ь-1д54 (Б228Р) ; ]) Уа1⁸-С1и²²-01у³⁵-СЬР-1 (7-37) -2Ь-1дО4 (8228Р, Р234А, Ь2 35А) ; к) Уа1⁸-С1и²²-01у³⁶-СЬР-1 (7-37 ) -2Ь-1дС4 (5228Р, Ν297Α) ; 1) Уа1⁸-01и²²-О1у³⁶-0ЬР-1 (7-37)-2Е-1дС4 (3228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α); и его йеа-К форм.
9. 9. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пи. 1-8 в качестве лекарственного средства.
10. 10. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пи. 1-8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета.

    -18008831
11. 11. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения ожирения или стимулирования снижения массы тела у пациента с избытком массы тела.

    Список последовательностей <110> Е1г 1дИу апб Сотрапу <120> Гибридные белки аналогов (ЗЕР-1 <130> Х-15984 <150> 60/477880 <151> 2003-06-12 <160> 21 <170> Ра1еп11п легзюп 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> Белок <213* Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <220>

    <221> Различающийся признак <222> (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает С1у или \/а1 <400> 1

    Ηίδ Хаа 61ц СИу ТНг РЬе ТЬг бег Авр \/а1 бег бег Туг Ьеи О1и 61ц 15 10 15

    ΘΙη А!а А!а Ьуз 6(и РЬе 1!е А1а Тгр Ьеи \/а11_уз С1у С1у С1у

    20 25 30 <210> 2 <211= 31 <212=· Белок <213=· Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <220>

    <221 > Различающийся признак <222> (2)..(2)

    -19008831 <223> Хаа в положении 2 означает С1у или \/а1 <400> 2

    Ηί5 Хаа С1и С!у ТЬг РИе ТНг Зег Азр \/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и О1и 15 10 15

    С1п А1а А1а Ьуз СЮ РЬе Не А1а Тгр Ьеи Ьуз Азп 6!у С1у С!у

    20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> Белок <213> Искусственный <220* <223> Синтетическая конструкция <220>

    <221> Различающийся признак <222> (2),.(2) <223> Хаа в положении 2 означает С!у или \/а1 <400> 3

    ΗΪ3 Хаа С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр \/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1и

    15 10 15

    С!п А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Х/а! Ьуз С1у С!у Рго 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <220>

    <221> Различающийся признак <222> ¢2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает С1у или Уа1 <400> 4

    -20008831

    Нгз Хаа 6)и С1у ТИг РИе ТНг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Беи С1и С1и 15 10 15

    С1п А1а А1а Буз С1и РКе Пе А1а Тгр Беи Буз Азп С31у 0)у Рго

    20 25 30 <210= 5 <211=- 30 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <220>

    <221> Различающийся признак <222> (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает С!у или Х/а1 <400> 5

    Ηίβ Хаа С1и С1у ТИг РОе ТИг Зег Азр Уа! Зег Зег Туг Беи <31и СИи

    15 10 15

    С1п А1а А1а Буз С1и Рпе Не А1а Тгр Беи Уа! Буз С1у 6)у

    20 25 30 <210=· 6 <211> 30 <212> Белок <213= Искусственный <220= <223= Синтетическая конструкция <220>

    <221 > Различающийся признак <222= (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает СИу или Уа1 <400= 6

    Нгз Хаа 5Ю <31у ТИг Рпе Τϊιτ Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Беи 61и 6!и 15 10 15

    -21 008831

    ΟΙπ А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у 61у

    20 25 30 <210> 7 <211> 230 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <220 <221> Различающийся признак <222> (16)..(16) <223> Хаа в положении 16 означает Рго или С1и <220>

    <221> Различающийся признак <222> (17)..(17) <223> Хаа в положении 17 означает РЬе, \/а1, или А1а <220>

    <221> Различающийся признак <222> (18)..(18) <223> Хаа в положении 18 означает Ьеи, С1и, или А!а <220>

    <221> Различающийся признак <222> (80)..(80) <223> Хаа в положении 80 означает Азп или А1а <220>

    <221> Различающийся признак <222> (230)..(230) <223> Хаа в положении 230 означает Ьуз или отсутствует <400> 7

    А!а СЮ Зег Ьуз Туг <31у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А!а Рго Хаа

    1 5 1015

    Хаа Хаа О1у 61у Рго Зег \/а1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуэ Рго Ьуз Азр

    20 2530

    ТЬг Ьеи Ме( Не Зег Агд ТЬг Рго С1и \/а1 ТЬг Суз \/а1 \/а1 \/а1 Азр 35 4045

    -22008831 \/а1 Зег ΟΙη 01 и Авр Рго О1и \/а1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у 50 5560 \/а1 С1и Х/а( Ηίδ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и Б1и С51п РЬе Хаа

    65 70 7580

    Зег ТЬг Туг Агд \/а1 Х/а1 Зег \/а1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηΐδ О)п Αδρ Тгр

    85 9095

    Ьеи Азп О1у Ьуз <31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго 100 105110

    Зег Зег Не О1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и 115 120125

    Рго ΘΙπ \/а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и Ме1 ТЬг Ьуз Азп 130 135140

    С1п λ/а! Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Х/а1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не

    145 150 155160

    А1а \/а1О1и Тгр С!и Зег Азп О!у О)п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг

    165 170175

    ТЬг Рго Рго \/а1 Ьеи Азр Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд 180 135190

    Ьеи ТЬг \/а1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр О1п 01 и С1у Азп Уа! РЬе Зег Суз 195 200205

    Зег \/а1 Ме1 Ηίβ О1и А1а Ьеи Ηί3 Азп Ηίδ Туг ТЬг ΟΙη Ьуз Зег Ьеи 210 215220

    Зег Ьеи Зег Ьеи О!у Хаа

    225230 <210* 8 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственный

    -23 008831 <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 8

    О1у С1у С1у С1у Зег О1у С1у С1у С1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 1 5 .10 15 <210> 9 <211> 31 <212> Белок <213> Ното зар^епе <400* 9

    Ηΐδ А1а С!и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр \/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у 15 10 15

    С31п А1а А!а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз <31у Агд С1у

    20 25 30 <210> 10 <211> 71 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 10

    Н18 С31у ΘΙυ С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Х/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1и 15 1015

    С1п А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Х/а! Ьуз С1у Агд С1у О1у 20 2530

    О1у С1у 6!у Зег О1у С1у <31у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у <31у 35 4045 (31у С1у Зег С1у О1у <31у С1у Зег С1у С1у С(у О1у Зег А1а О1и Зег 50 5560

    Ьуз Туг С1у Рго Рго Суз Рго

    -24008831 <210> 11 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 11

    Тгр Ьеи Уа1 Ьу5 С1у Агд 61у С1у 61у
12. 1 5 <210> 12 <211=· 7 <212> Белок <213=· Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 12

    Тгр Ьеи Уа1 Ьуз О1у О1у С1у

    1 5 <210> 13 <211> 7 <212> Белок <213= Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 13

    Тгр Ьеи Ьуз Азп О1у С1у С1у

    1 5 <210> 14 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223= Синтетическая конструкция

    -25 008831 <400> 14

    Тгр Ьеи Ч/а! Ьуз С!у С1у Рго

    1 5 <210> 15 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 15

    Тгр Ьеи Ьуз Авп С1у С1у Рго

    1 5 <210> 16 <211*· 6 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 16

    Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С!у С1у

    1 5 <210> 17 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223> Синтетическая конструкция <400> 17

    Тгр Ьеи Ьуз Азп О1у С1у

    1 5 <210> 18 <211> 6 <212> Белок

    -26008831 <213= Нотозар:епз <400* 18

    Рго Рго Суз Рго Зег Суз <210> 19 <211» 22 <212> Белок <213> Искусственный <220>

    <223* Синтетическая конструкция <400> 19

    С1у Зег (31у С!у С1у С!у Зег С!у СИу СИу С1у Зег С1у С1у СИу С!у

    Зег С1у 61у С1у <31у Зег <210> 20 <211> 825 <212> ДНК <213=* Нотозар^епз <400> 20 сасддсдадд дсассйсас с1ссдасд(д 1сс1сс1а(с (сдаддадса ддссдссаад 60 даайса(сд сс(ддс1дд1 даадддсддс ддсдд1дд(д д!ддс1ссдд аддсддсддс 120 1с1дд1ддсд д1ддсадсдс (дадГссааа 1а1дд1сссс са(дсссасс сГдсссадса 180 сйдаддссд ссдддддасс а!сад(сйс с(дйссссс саааасссаа ддасас1с1с 240 а(да1йссс ддасссс1да дд1сасд1дс д1дд1дд1дд асд(дадсса ддаадасссс 300 дадд1ссад11саас(дд1а сд1дда1ддс д1ддадд1дс а1аа!дссаа дасааадссд 360 сдддаддадс адйсаасад сасд1ассд( д1дд1садсд 1сс1сассд( сс1дсассад 420 дас1ддс1да асддсаадда д(асаад1дс аадд1с(сса асаааддсй сссд1сс(сс 480 а1сдадаааа сса1с(ссаа адссаааддд садссссдад адссасадд( д(асассйд 540 ссссса1ссс аддаддада! дассаадаас саддЮадсс 1дасс1дсс1 дд(саааддс 600

    -27008831 ййасссса дсдасаЮдс сд1ддад1дд дааадсаа1д ддсадссдда даасаайас 660 аадассасдс с(сссд(дс( ддас(ссдас ддйссНс! (сс1с(асад саддс1аасс 720 д(ддасаада дсадд1ддса ддаддддаа( д1сйс(са1 дйссд1да1 дса1даддй 780 сЛдсасаасс айасасаса даададсс1с (ссс1д1йс 1ддд1 825 <210 21 <211= 30 <212=· Белок <213=· Искусственный <220= <223= Синтетическая конструкция <400> 21

    О1у <31у С!у С1у 8ег С1у <31у С1у С1у Зег С1у 61у С1у С1у Зег 61у 15 10 15

    О1у С1у С1у Зег С1у С1у О1у С1у Зег С1у С1у С1у (Э1у Зег

    20 25 30