WO2004050879A1 - Expressionsvektor, verfahren zur herstellung von heterologen genprodukten und selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante zellen - Google Patents

Expressionsvektor, verfahren zur herstellung von heterologen genprodukten und selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante zellen Download PDF

Info

Publication number
WO2004050879A1
WO2004050879A1 PCT/EP2003/013225 EP0313225W WO2004050879A1 WO 2004050879 A1 WO2004050879 A1 WO 2004050879A1 EP 0313225 W EP0313225 W EP 0313225W WO 2004050879 A1 WO2004050879 A1 WO 2004050879A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
protein
cells
expression
cell
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/013225
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Barbara Enenkel
Jürgen FIEDER
Ralf Otto
Stefanos Grammatikos
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg
Priority to EP03767642A priority Critical patent/EP1567648A1/de
Priority to BR0316510-8A priority patent/BR0316510A/pt
Priority to NZ540950A priority patent/NZ540950A/en
Priority to AU2003292102A priority patent/AU2003292102A1/en
Priority to MXPA05005482A priority patent/MXPA05005482A/es
Priority to CA002507714A priority patent/CA2507714A1/en
Priority to JP2004556182A priority patent/JP2006507829A/ja
Publication of WO2004050879A1 publication Critical patent/WO2004050879A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector

Definitions

  • the invention relates to a selection process for high-producing recombinant cells, a process for the production of heterologous gene products and expression vectors and thus transfected host cells which can be used in these processes.
  • Mammalian cells are the preferred host cells for the production of complex biopharmaceutical proteins since the post-translational ones are carried out
  • Modifications are human-compatible in both functional and pharmacokinetic terms.
  • Commercially relevant cell types are hybridomas,
  • Myelomas CHO (Chinese Hamster Ovary) cells and BHK (Baby Hamster Kidney) -
  • Host cells are increasingly cultivated under serum and protein-free production conditions. The reasons for this are the related
  • CHO cells Protein as well as the reduction of the potential to introduce pathogens (e.g. prions, viruses).
  • pathogens e.g. prions, viruses.
  • the heterologous gene is usually introduced into the desired cell line together with a selectable marker gene, such as neomycin phosphotransferase, by transfection.
  • a selectable marker gene such as neomycin phosphotransferase
  • the heterologous gene and the selectable marker gene can either be expressed together from a single vector or from separate vectors that are co-transfected become.
  • the cells are transferred to medium which contains a selection agent, for example G418 using the neomycin phosphotransferase gene, and cultured for a few weeks under these selective conditions.
  • the high-growing resistant cells can then be isolated and examined for the expression of the desired gene product.
  • a population of cells Due to the arbitrary and undirected integration into the host cell genome, a population of cells is obtained which have completely different expression rates of the heterologous gene. These may also include non-expressing cells in which the selection marker is expressed, but not the gene of interest. To identify cell clones that have a very high expression of the heterologous gene of interest, a large number of clones must therefore be checked and tested, resulting in a high expenditure of time, labor and costs.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • CHO Chinese Hamster Ovary
  • the transfectants are then selected in a medium without glycine, hypoxanthine and thymidine.
  • the amplification and thus the establishment of high-producing cell lines is achieved by the increasing addition of methotrexate (MTX), an inhibitor of dihydrofolate reductase (Kaufman et al., 1982; US 4,656,134).
  • MTX methotrexate
  • the subsequent selection of the highly producing cells obtained is also subject to the random principle and is based on probabilities, which makes this selection step extremely labor-intensive and time-consuming.
  • Various methods have been developed for better and faster tracking of gene transformation and expression.
  • reporter molecules such as chloramphenicol acetyl transferase, luciferase, ß-galactosidase or fusion proteins which contain the coding regions of ß-galactosidase or luciferase.
  • the disadvantage of these corresponding reporter gene assays is that the cells have to be fixed or lysed and incubated with exogenously added substrates and co-factors. Further cultivation of the analyzed cells is therefore excluded.
  • a newer method based on the co-expression of the E.
  • coli enzyme ß-galactosidase enables a sorting of living cells using a FACS device (Nolan et al., 1988), but here the cell is loaded with the fluorogenic substrate requires hypotonic pretreatment. This activity has to be inhibited before the FACS-based sorting.
  • GFP green fluorescent protein
  • This method involves the co-transfection of cells by a DNA molecule that contains the coding sequence for the protein of interest and a second DNA molecule that encodes the GFP gene.
  • the GFP-expressing cells are then selected.
  • Gubin et al. (1997) examined the stability of GFP expression in CHO cells in the absence of selective growth conditions. The cells were transfected with a plasmid that contained both GFP and neomycin phosphotransferase.
  • Mosser et al. (1997) used a plasmid that contains a bicistronic expression cassette to identify and select cells that expressed inducible product, coding for GFP and a target gene (or also called gene of interest). The target gene was under the control of an adjustable promoter.
  • Coupling of GFP and target gene expression was accomplished using a viral IRES ("Infernal Ribosome Entry Site") element, which expressed a bicistronic mRNA encoding GFP and the protein of interest.
  • the plasmid used contained the plasmid used itself no selectable marker gene, which was therefore introduced by a second plasmid in a co-transfection or in a subsequent transfection, whereas Levenson et al.
  • Vectors have also been described which contain an IRES element from the Picornavirus family, the IRES element being positioned between the product gene and a selectable marker gene (Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992).
  • GFP has also been successfully merged with resistance marker genes.
  • Bennett et al. (1998) a GFP / Zeomycin fusion protein. This bifunctional selection marker was successfully used to identify and select transfected mammalian cells.
  • Primig et al. (1998), on the other hand, used a fusion protein made from GFP and neomycin phosphotransferase for their enhancer studies.
  • the best clones which were isolated using the combined selection using an amplifiable DHFR selection marker and GFP-based FACS sorting, expressed the protein of interest in a range of at most 3 to 4.5 pg per cell and day.
  • the experiments were carried out with adherent cells and in a medium containing serum, i.e. with cells and under conditions that are known to be significantly more robust and characterized by higher basic productivity.
  • the object of the present invention was therefore to develop a selection system for recombinant cells with increased productivity, which meets the following requirements:
  • Another object of the invention was to provide expression vectors and thus transfected host cells which can be used in this clone selection system are, and a method for producing heterologous gene products using these host cells.
  • these objects are achieved with the aid of an expression vector which has a gene which codes for a protein of interest (hereinafter also referred to as "gene of interest”) in functional linkage with a hamster ubiquitin / S27a promoter and a gene encoding a fluorescent protein.
  • gene of interest a protein of interest
  • the expression vector preferably also contains an amplifiable selection marker gene, e.g. the gene for dihydropholate reductase (DHFR). Furthermore, a preferred expression vector contains further regulatory elements, for example an enhancer in functional connection with the promoter. Furthermore, the expression vector preferably additionally contains an internal ribosome binding site (IRES) which enables the bicistronic expression of the gene which codes for a fluorescent protein and of the gene of interest.
  • IRES internal ribosome binding site
  • the invention also relates to base vectors which, instead of the gene of interest, have a multiple cloning site for the incorporation of such a gene, i.e. a sequence region with multiple interfaces for restriction endonucleases.
  • host cells that have been transfected with one of the expression vectors mentioned.
  • These are eukaryotic host cells, preferably mammalian cells, rodent cells such as hamster cells and in particular CHO cells or BHK cells being particularly preferred.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a heterologous gene product, in which a host cell transfected with the expression vector according to the invention is cultivated under conditions which allow expression of the gene product and the gene product is isolated from the culture or the culture medium.
  • the host cell is transfected, preferably co-transfected, with the expression vector according to the invention and additionally with one or more vectors with genes which code for one or more other proteins of interest.
  • the present invention provides a method for producing a heterodimeric protein, in which such a host cell, which has been co-transfected with expression vectors which code for different subunits of the heterodimeric protein, under conditions which allow expression of the enable heterodimeric protein, cultured and isolated the heterodimeric protein from the culture or the culture medium.
  • a special application for such a method is the production of antibodies and their subunits.
  • Another aspect of the present invention is a method for selecting a host cell that expresses a protein of interest, in which a population of host cells that have been transfected with an expression vector according to the invention is cultivated under conditions that allow expression of the protein of interest and of the fluorescent protein and identifying and / or selecting the cell (s) which show the highest expression levels of fluorescent protein.
  • the selection is preferably carried out with the aid of a fluorescence-activated line sorting device (FACS).
  • FACS fluorescence-activated line sorting device
  • Figure 1 shows a comparison of the achieved expression levels of recombinant cell clones in which the heterologous gene product is expressed either under the control of the CMV promoter or under that of the hamster ubiquitin / S27a promoter. Both promoters are functionally linked to the CMV enhancer and the termination sequence, BGH poly A, is identical in all cases.
  • CMV 1 it is a pcDNA3 (Invitrogen, Kaisruhe, DE)
  • CMV 2 it is a pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, US) and in CHO it is a pAD-CMV-based expression vector (Werner et al., 1998).
  • P / E is a combination of CMV enhancer and hamster ubiquitin / S27a promoter, "P” is only a promoter element and “T” is a termination signal for transcription that is used to polyadenylate the transcribed The position and direction of the transcription initiation within each transcription unit is indicated by an arrow.
  • mcs restriction endonucleases
  • the amplifiable selection marker dihydrofolate Reductase is abbreviated to "dhfr” and the selection marker neomycin phosphotransferase is abbreviated to "neo”.
  • the IRES element derived from the encephalomyocarditis virus serves as an internal ribosome binding site within the bicistronic transcription unit and enables the translation of the subsequent green fluorescent protein "GFP".
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the eukaryotic expression vectors, each coding for a biopharmaceutical protein and used for the transfection of CHO-DG44 cells.
  • P / E is a combination of CMV enhancer and hamster ubiquitin / S27a promoter
  • P is only a promoter element
  • T is a termination signal for transcription that is required for polyadenylation of the transcribed mRNA
  • the position and direction of the transcription initiation within each transcription unit is indicated by an arrow.
  • the amplifiable selection marker dihydrofolate reductase is abbreviated to "dhfr” and the selection marker neomycin phosphotransferase to "neo”.
  • the IRES element originating from the encephalomyocarditis virus serves as an internal ribosome binding site within the bicistronic transcription unit and enables the translation of the subsequent green fluorescent protein "GFP".
  • GFP green fluorescent protein
  • "SICAM” codes for the soluble intracellular adhesion molecule (US 5,412,216), whereas "F19HC” and “F19LC” code for the heavy or light chain of the humanized antibody F19 (EP 953 639).
  • Figure 4 shows the correlation between sICAM productivity and GFP fluorescence using the cell pool ZB1 as an example. This cell pool was obtained from the transfection with the vector pBIDG-sICAM, in which the therapeutic protein sICAM and GFP are expressed together by a bicistronic transcription unit.
  • the pool was subjected to a sequential GFP-based FACS sorting. After each sorting step (Sort), the concentration of the sICAM in the cell culture supernatant of the pool was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / c * d) was calculated. Each data point represents the average of at least three cultivation passages. A total of six sorts were carried out.
  • Figure 5 shows the isolation of highly expressive sICAM cells by GFP-based FACS sorting using the example of the cell pool ZB1.
  • This cell pool was obtained from the transfection with the vector pBIDG-sICAM, in which the therapeutic protein sICAM and GFP are expressed together by a bicistronic transcription unit.
  • the pool was subjected to a sequential GFP-based FACS sorting. After each sort, the concentration of the sICAM in the cell culture supernatant of the pool was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / c * d) was calculated. Each data point represents the average of at least three cultivation passages. A total of six sorts were carried out.
  • Figure 6 shows the increases in sICAM productivity achieved by combining a GFP-based selection with an MTX amplification step using the cell pool ZB1 as an example.
  • This cell pool which was obtained from the transfection with the vector pBIDG-sICAM, was subjected to a sequential GFP-based FACS sorting.
  • DHFR-mediated gene amplification was carried out by adding methotrexate (MTX) to the culture medium (5 nM, 50 nM, 500 nM or 2 // M MTX).
  • MTX methotrexate
  • the concentration of the sICAM in the cell culture supernatant of the pool was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / c * d) was calculated.
  • FIG. 7 shows the viability curve of cell pools after adding different high doses of methotrexate to the culture medium.
  • the cell pool ZB1 which was obtained from the transfection with the vector pBIDG-sICAM (Fig. 3), was subjected to a sequential GFP-based FACS sorting. After the fourth sort or sixth sort, a DHFR-mediated gene amplification was carried out by adding methotrexate (MTX) to the culture medium. The cell numbers and the viability were determined during the selection phase by trypan blue staining and monitored over several days of cultivation.
  • MTX methotrexate
  • Figure 8 shows the correlation between antibody productivity (mAb F19) and GFP fluorescence using the cell pool ZB1 as an example.
  • This cell pool was obtained from transfection with the vector combination pBIDG-F19HC and pBIN-F19LC (Fig.3).
  • the pool was subjected to a sequential GFP-based FACS sorting. After each sort, the concentration of the antibody F19 in the cell culture supernatant of the pool was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / c * d) was calculated. Each data point represents the average of at least three cultivation passages. A total of six sorts were carried out.
  • Figure 9 shows the isolation of highly expressing mAb F19 cell pools by GFP-based selection using FACS using the cell pool ZB1 as an example.
  • This cell pool which was obtained from the co-transfection with the vectors pBIDG-F19HC and pBIN-F19LC (FIG. 3), was subjected to a sequential GFP-based FACS sorting.
  • the concentration of the antibody F19 in the cell culture supernatant of the pool was determined after each sort by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / c * d) was calculated.
  • Each data point represents the average of at least three cultivation passages.
  • the expression vector according to the invention contains a gene which codes for a protein of interest (“gene of interest”), in functional association with a hamster ubiquitin / S27a promoter and a gene which codes for a fluorescent protein.
  • the expression vector preferably also contains an amplifiable selection marker gene.
  • the hamster ubiquitin / S27a promoter is a strong homologous promoter which is described in WO 97/15664.
  • a promoter preferably has at least one of the following features: GC-rich sequence region, Sp1 binding site, polypyrimidine element, absence of a TATA box.
  • a promoter which has an Sp1 binding site in the absence of a TATA box is particularly preferred.
  • such a promoter is preferred which is constitutively activated and is equally active, in particular, under serum-containing, serum-poor and serum-free cell culture conditions.
  • it is an inducible promoter, in particular a promoter that is activated by serum withdrawal.
  • a particularly advantageous embodiment is a promoter with a nucleotide sequence which is contained in FIG. 5 of WO 97/15664.
  • Promoter sequences are particularly preferred in which the sequence from position -161 to - 45 of FIG. 5 is contained.
  • the promoters used in the examples of the present patent description each contain a DNA molecule with the sequence from positions 1923 to 2406 of SEQ ID NO: 1 of the enclosed sequence listing. This sequence corresponds to fragment - 372 to + 111 from FIG. 5 of WO 97/15664 and represents the preferred promoter, ie a preferred promoter should encompass this sequence region.
  • Another suitable promoter fragment contains the sequence from positions 2134 to 2406 (corresponds to - 161 to + 111 in FIG. 5 of WO) 97/15664).
  • a promoter which only contains the sequence from position 2251 to 2406 is no longer functional (corresponds to position - 45 to + 111 in FIG. 5 of WO 97/15664).
  • An extension of the promoter sequence in the 5 'direction starting from position 2134 is possible.
  • a modified promoter preferably has a transcription activity which corresponds to that of the promoter fragment from positions 1923 to 2406 of the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 1 (- 372 to + 111 from FIG. 5 of WO 97/15664 ) corresponds.
  • a modified promoter proves to be suitable for the purposes of the invention if it has a transcription activity which is at least 50%, better at least 80%, even better at least 90%, and even more preferably at least 100% of the activity of the 1923 to 2406 fragment ( - 372 to + 111 fragments) in a comparative reporter gene assay.
  • Modified promoters which have a minimal sequence homology to the wild-type sequence SEQ ID NO: 1 of the hamster ubiquitin / S27a promoter of at least 80%, better at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferred are particularly preferred have at least 97% and have a corresponding promoter activity in a comparative reporter gene assay.
  • the promoter fragments to be tested are each cloned in front of a promoterless reporter gene which codes, for example, for luciferase, secreted alkaline phosphatase or green fluorescent protein (GFP).
  • a promoterless reporter gene which codes, for example, for luciferase, secreted alkaline phosphatase or green fluorescent protein (GFP).
  • GFP green fluorescent protein
  • These constructs are then introduced into the test cells, for example CHO-DG44, by means of transfection and the induction of reporter gene expression determined by the respective promoter fragment by determining the protein content of the reporter gene.
  • a corresponding test can also be found, for example, in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, updated.
  • the promoter sequence of the hamster ubiquitin / S27a promoter as well as the modified promoters, which can also include, for example, the 5'-untranslated region or selected fragments thereof, and the coding region of the ubiquitin / S27a gene or selected fragments thereof, can be from a person skilled in the art with knowledge of the sequence described in WO 97/15664 can be obtained using various standard methods, such as, for example, in Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994. Starting from the sequence described in WO 97/15664, for example a suitable section can be selected and an oligonucleotide probe can be chemically synthesized which contains the sequence of this section.
  • the ubiquitin / S27a gene or its 5'-untranslated region or other fragments can be cloned, for example by hybridization from a hamster genomic library.
  • the reporter gene assay described above the person skilled in the art is able to identify promoter-active fragments without considerable effort and to use them in the sense of the present invention.
  • the 5'-untranslated region or special fragments thereof can also easily be obtained by PCR amplification with appropriate primers from genomic DNA or a genomic library. Fragments of the 5 ' untranslated region can also be obtained from larger DNA fragments by limited exonuclease III digestion.
  • Such DNA molecules can also be chemically synthesized or generated from chemically synthesized fragments by ligation.
  • “Homologous” in the sense of the invention are genes, provided that their nucleotide sequence shows at least 70%, better at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferably at least 97% agreement with the nucleotide sequence of the gene to which it is homologous is.
  • the gene of interest contained in the expression vector according to the invention comprises a nucleotide sequence of any length which codes for a product of interest.
  • the gene product or "product of interest” is usually a protein, polypeptide, peptide or fragment or derivative thereof. However, it can also be RNA or antisense RNA.
  • the gene of interest can be in its entirety, in shortened form, as Fusion gene or labeled gene are present. It can be genomic DNA or preferably cDNA or corresponding fragments or fusions.
  • the gene of interest can represent the native gene sequence, be mutated or be modified in some other way. Such modifications include codon optimizations for adaptation a specific host cell and a humanization
  • the gene of interest can code, for example, for a secreted, cytoplasmic, nucleus-localized, membrane-bound or cell-surface-bound polypeptide.
  • nucleotide sequence or “nucleic acid sequence” denotes an oligonucleotide, nucleotides, polynucleotides and their fragments as well as DNA or RNA of genomic or synthetic origin, which are present as a single or double strand and can represent the coding or the non-coding strand of a gene.
  • Standard techniques such as, for example, site-specific mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis (for example described in Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1994) can be used to modify nucleic acid sequences.
  • Coding means the property or capability of a specific sequence of nucleotides in a nucleic acid, for example a gene in a chromosome or an mRNA, as a template for the synthesis of other polymers and macromolecules such as rRNA, tRNA, mRNA, other RNA To serve molecules, cDNA or polypeptides in a biological process. Accordingly, a gene codes for a protein if the desired protein is produced in a cell or another biological system by transcription and subsequent translation of the mRNA.
  • Nucleic acid encoding a protein also includes nucleins acids with one, which, because of the degeneracy of the genetic code, another of nucleotide sequence, but result in the same amino acid sequence of the protein. Nucleic acid sequences that code for proteins can also contain introns.
  • cDNA denotes deoxyribonucleic acids which are produced by reverse transcription and synthesis of the second strand of DNA from an mRNA or other RNA produced by a gene. If the cDNA is present as a double-stranded DNA molecule, then it contains both a coding as well as a non-coding strand.
  • intron denotes non-coding nucleotide sequences of any length. They occur naturally in many eukyaryotic genes and are removed from a previously transcribed mRNA precursor by a process called splicing. For this, an exact cutting out of the intron at 5 ' - and 3 ' end and a correct connection of the resulting mRNA ends is required so that a mature processed mRNA is produced with the correct reading frame for the successful protein synthesis. Many of the splice donor and splice acceptor involved in this splicing process Locations are those that are present at the exon-intron or intron-exon boundaries Sequences have now been characterized. For an overview, see Ohshima et al., 1987.
  • Biopharmaceutical proteins / polypeptides include e.g. Antibodies, enzymes, cytokines, lymphokines, adhesion molecules, receptors and their derivatives or fragments are, however, not restricted to these. In general, all polypeptides are important which act as agonists or antagonists and / or can find therapeutic or diagnostic use.
  • polypeptides is used for amino acid sequences or proteins and denotes polymers of amino acids of any length. This term also includes proteins which are post-translationally modified by reactions such as, for example, glycosylation, phosphorylation, acetylation or protein processing.
  • the structure of the polypeptide can be, for example, by substitutions , Deletions or insertion of amino acids, fusion with other proteins, while maintaining its biological activity.
  • therapeutic proteins are insulin, insulin-like growth factor, human growth hormone (hGH) and other growth factors, tissue plasminogen activator (tPA), erythropoietin (EPO), cytokines, for example interleukins (IL) such as IL-1, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 , IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) -alpha, beta, gamma, omega or tau, tumor necrosis factor (TNF) such as TNF-alpha, beta or gamma, TRAIL, G-CSF, GM- CSF, M-CSF, MCP-1 and VEGF.
  • IL interleukins
  • IFN interferon
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • the antibodies can be of human or non-human origin. Humanized and chimeric antibodies are also suitable.
  • Fab fragments (fragment antigen-binding Fab) consist of the variable regions of both chains, which are held together by the adjacent constant regions. They can, for example, be generated from conventional antibodies by treatment with a protease, such as papain, or else by DNA cloning.
  • Other antibody fragments are F (ab ') 2 fragments, which can be produced by proteolytic digestion with pepsin.
  • variable region of the heavy and light chain are frequently linked to one another by means of a short peptide fragment of approx. 10-30 amino acids, particularly preferably 15 amino acids. This creates a single polypeptide chain in which VH and VL are linked by a peptide linker.
  • scFv single-chain Fv fragment
  • multimeric scFv derivatives have been developed in recent years to produce multimeric scFv derivatives.
  • the intention is to generate recombinant antibodies with improved pharmacokinetic properties and increased binding avidity.
  • these are produced as fusion proteins with multimerization domains.
  • multimerization domains e.g. the CH3 region of an IgG or coiled coil structure act like the leucine zipper domains.
  • the interaction between the VH and VL regions of the scFv fragment is used for multimerization (eg slide , Tri- and pentabodies).
  • a person skilled in the art refers to a bivalent homodimeric scFv derivative as “diabody”.
  • the shortening of the peptide linker in the scFv molecule to 5-10 amino acids results in the formation of homodimers through the superposition of VH / VL chains.
  • the diabodies can also be stabilized by the introduction of disulfide bridges. Examples of diabodies can be found in the literature, for example in Perisic et al. (1994).
  • minibody as a bivalent, homodimeric scFv derivative. It consists of a fusion protein which contains the CH3 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgG1, as a dimerization region. This connects the scFv fragments via a hinge. Region, also from IgG, and a linker region, examples of such minibodies are described in Hu et al. (1996).
  • trimers the person skilled in the art describes a trivalent homotrimeric scFv derivative (Kortt et al., 1997). The direct fusion of VH-VL without using a linker sequence leads to the formation of trimers.
  • fragments which the person skilled in the art calls mini-antibodies and which have a bi-, tri- or tetravalent structure are also derivatives of scFv fragments.
  • the multimerization is achieved via di-, tri- or tetrameric “coiled coil” structures (Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993).
  • the expression vector according to the invention contains a gene coding for a fluorescent protein in functional association with the gene of interest and under the control of the hamster ubiquitin / S27a promoter, a modified hamster ubiquitin / S27a promoter or a homologue thereof.
  • the fluorescent protein can be, for example, a green, blue-green, blue, yellow or other-colored fluorescent protein.
  • GFP green fluorescent protein
  • a special example is the green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victoria or Renilla reniformis and mutants developed from it; see, for example, Bennet et al. (1998); Chalfie et al. (1994); WO 01/04306 and the literature cited there. Further fluorescent proteins and genes coding therefor are described in WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 and WO 01/27150, which are incorporated herein by reference.
  • fluorescent proteins are fluorophores from non-bioluminescent organisms of the species Anthozoa, for example from Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. "Red”, Discosoma sp. "Green”, Discosoma sp. “Magenta”, Anemonia sulcata.
  • the fluorescence proteins used according to the invention also include natural or genetically engineered mutants and variants, their fragments, derivatives or e.g. Variants fused with other proteins or peptides.
  • the mutations introduced can change, for example, the excitation or emission spectrum, the formation of chromophores, the extinction coefficient or the stability of the protein. Codon optimization can also improve expression in mammalian cells or other species.
  • the fluorescent protein can also be used in fusion with a selection marker, preferably with an amplifiable selection marker such as, for example, dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the fluorescence emitted by the fluorescent proteins enables the detection of the proteins e.g. by flow cytometry with a fluorescence activated cell sorter (FACS) or by fluorescence microscopy.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the hamster ubiquitin / S27a promoter can be brought into functional relationship with other regulatory sequences in order to increase / regulate the transcription activity in an expression cassette.
  • the promoter can be functionally linked to enhancer sequences in order to increase the transcription activity. This can be done by one or more Enhancers and / or multiple copies of an enhancer sequence can be used, for example a CMV or SV40 enhancer.
  • enhancer denotes a polynucleotide sequence which acts in cis localization on the activity of a promoter and thus stimulates the transcription of a gene functionally linked to this promoter.
  • the action of the enhancers is position and orientation independent and can thus be positioned in front of or behind a transcription unit, within an intron or even within the coding region.
  • the enhancer can be located both in the immediate vicinity of the transcription unit and at a considerable distance from the promoter. A physical and functional overlap with the promoter is also possible.
  • enhancers are known to the person skilled in the art from various sources (and are stored in databases such as GenBank, for example SV40 enhancer, CMV enhancer, polyoma enhancer, adenovirus enhancer) and are available as independent elements or elements cloned within polynucleotide sequences (e.g. deposited at ATCC or from commercial and individual sources).
  • a variety of promoter sequences also include enhancer sequences, e.g. the commonly used CMV promoter.
  • the human CMV enhancer is one of the strongest enhancers identified to date.
  • An example of an inducible enhancer is the metallothionein enhancer, which can be stimulated by glucocorticoids or heavy metals.
  • the promoter sequences can also be combined with regulatory sequences which allow control / regulation of the transcription activity. In this way, the promoter can be made repressible / inducible. This can be done, for example, by linking to sequences that represent binding sites for positive or negative regulating transcription factors.
  • the above-mentioned transcription factor SP-1 for example, has a positive influence on the transcription activity.
  • Another example is the binding site for the activator protein AP-1, which can have a positive as well as a negative effect on the transcription.
  • the activity of the AP-1 can be determined by various factors, such as growth factors, cytokines and serum, can be controlled (Faisst et al., 1992, and references therein).
  • the transcription efficiency can also be increased by changing the promoter sequence by mutation (substitution, insertion or deletion) of one, two, three or more bases and then determining in a reporter gene assay whether this increases the promoter activity.
  • the additional regulatory elements include promoters other than the hamster ubiquitin / S27a promoter, enhancers, termination and polyadenylation signals and other expression control elements. Both inducible and constitutive regulatory sequences are known for the different cell types. "Transcription regulatory elements" usually include a promoter upstream of the gene sequence to be expressed, transcription initiation and termination sites, and a polyadenylation signal.
  • a “promoter” is a polynucleotide sequence that enables and controls the transcription of the genes or sequences functionally linked to it.
  • a promoter contains recognition sequences for the binding of the RNA polymerase and the initiation site of the transcription (transcription initiation site).
  • transcription initiation site For the expression of a desired sequence in A suitable, functional promoter must be selected in each case for a specific cell type or a host cell.
  • the person skilled in the art knows a large number of promoters from various sources, including constitutive, inducible and repressible promoters. They are stored in databases, for example GenBank, and can be used as stand-alone or within elements cloned from polynucleotide sequences can be obtained from commercial or individual sources.
  • inducible promoters the activity of the promoter can be reduced or enhanced in response to a signal.
  • An example of an inducible pro motor is the tetracycline (tet) promoter.
  • tet tetracycline
  • tetO tetracycline operator sequences
  • tTA tetracycline-regulated transactivator protein
  • jun, fos, metallothionine and heat shock promoters see also Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994).
  • the SV40 early promoter, the adenovirus major late promoter, the mouse metallothionin-I promoter, the long terminal repeat region of the Rous Sarcoma virus and the early promoter of the human cytomegalovirus are particularly well suited for high expression in eukaryotes.
  • heterologous mammalian promoters are the actin, immunoglobulin, or heat shock promoter (s).
  • transcription initiation site refers to a nucleic acid in the construct that corresponds to the first nucleic acid that is incorporated into the primary transcript, i.e., the mRNA precursor.
  • the transcription initiation site may overlap with the promoter sequences.
  • transcription termination site refers to a nucleotide sequence that is normally present at the 3 'end of the gene of interest or of the gene segment to be transcribed and which causes the transcription to be terminated by RNA polymerase.
  • polyadenylation signal is a signal sequence which causes the cleavage at a specific site at the 3 'end of the eukaryotic mRNA and the post-transcriptional incorporation of a sequence of about 100-200 adenine nucleotides (polyA tail) at the cleaved 3' end.
  • the polyadenylation signal comprises the sequence AATAAA about 10-30 nucleotides upstream of the cleavage site and a downstream sequence.
  • Various polyadenylation elements are known, for example tk polyA, SV40 late and early polyA or BGH polyA (described for example in US Pat. No. 5,122,458).
  • each transcription unit has a promoter or a promoter / enhancer element, a gene of interest and / or a marker gene, and also a transcription termination element.
  • the transcription unit contains further translation regulatory units.
  • “Translation regulatory elements” include a translation initiation site (AUG), a stop codon, and a polyA signal for each polypeptide to be expressed.
  • the gene of interest usually contains a signal sequence encoding a signal precursor peptide that transports the synthesized polypeptide to and through the ER membrane, often, but not always, on the amine oterminus of the secreted protein and is cleaved by signal peptidases after the protein has been passed through the ER membrane.
  • the gene sequence will usually, but not necessarily, contain its own signal sequence. If the native signal sequence is not present, a heterologous signal sequence can be introduced in a known manner. Numerous such signal sequences are known to the person skilled in the art and are stored in sequence databases such as GenBank and EMBL.
  • IRES element comprises a sequence which functions the translation initiation independently of a 5'-terminal methylguanosinium cap (CAP structure) and the upstream gene and in an animal cell the translation of two cistrons (open reading frame) from a single transcript
  • the IRES element provides an independent ribosome binding site for the translation of the open reading frame immediately downstream, in contrast to bacterial mRNA, which can be multicistronic, ie can code for several different polypeptides or products that are successively translated by the mRNA , most animal cell mRNAs are monocistronic and encode only a single protein or product, and a multicistronic transcript in a eukaryotic cell would translate from upstream of the closest translation initiation site and terminated by the first stop codon, whereupon the transcript would be released from the ribosome.
  • a multicistronic transcript with an IRES element that is functionally linked to the second or further open reading frames in the transcript enables the subsequent translation of the downstream open reading frame so that in the eukaryotic cell two or more polypeptides encoded by the same transcript or products are produced.
  • the IRES element can be of different lengths and of different origins and e.g. from the encephalomyocarditis virus (EMCV) or other picornaviruses.
  • EMCV encephalomyocarditis virus
  • Various IRES sequences and their use in the construction of vectors have been described in the literature; see e.g. Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996, Mosser et al., 1997.
  • the downstream gene sequence is functionally linked to the 3 'end of the IRES element, i.e. the distance is chosen so that the expression of the gene is not influenced or is influenced only marginally or has an expression which is sufficient for the purpose.
  • the optimal and permissible distance between the IRES element and the start codon of the downstream gene for sufficient expression can be determined in simple experiments by varying the distance and determining the expression rate as a function of the distance with the aid of reporter gene assays.
  • a preferred vector according to the invention additionally contains an amplifiable selection marker gene which enables an amplification of the amplifiable marker gene and preferably the co-amplification of a transcription unit consisting of the hamster ubiquitin / S27a gene, the gene of interest and the gene for the fluorescent protein.
  • the host cells transfected with a corresponding expression vector are cultivated in the presence of a suitable selection agent, so that only those host cells can be reproduced which have several gene copies of at least the amplifiable selection marker gene. This is preferably achieved by gradually culturing the cells in the presence of increasing amounts of selection agent.
  • the amplifiable selection marker gene usually encodes an enzyme necessary for the growth of eukaryotic cells under certain cultivation conditions.
  • the amplifiable selection marker gene can code for dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the gene is amplified if a host cell transfected with it is cultivated in the presence of the selection agent methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • Table 1 below gives examples of further amplifiable selection marker genes which can be used according to the invention and the associated selection agents, which are described in an overview by Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-566 (1990).
  • a gene which codes for a polypeptide with the function of DHFR is preferred as the amplifiable selection marker gene Fusion protein from the fluorescent protein and DHFR.
  • DHFR is required for the biosynthesis of purines. Cells that lack the DHFR gene cannot grow in purine-deficient media. The DHFR gene is therefore a useful selection marker for the selection and amplification of genes in cells which are cultivated in a purine-free medium.
  • the selection agent used in conjunction with the DHFR gene is methotrexate (MTX).
  • the present invention therefore includes a method of producing high-production recombinant host cells, comprising the following steps: (i) transfection of the host cells with genes encoding at least one protein of interest, a fluorescent protein and DHFR, (ii) culturing the Cells under conditions that allow expression of the various genes, and (iii) amplification of these co-integrated genes by culturing the cells in the presence of a selection agent that allows the amplification of at least the amplifiable selectable marker gene, such as methotrexate.
  • the transfected cells are preferably cultivated in hypoxanthine / thymidine-free medium in the absence of serum and with the addition of increasing concentrations of MTX.
  • the concentration of MTX in the first amplification step is preferably at least 200 nM, in an even more preferred embodiment at least 500 nM and can be increased in steps up to 1 / M. In individual cases, concentrations of over 1 ⁇ M can also be used.
  • Mammalian cells preferably mouse myeloma and hamster cells, are preferred host cells for the use of DHFR as an amplifiable selection marker.
  • the cell lines CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) and CHO-DG44 (Urlaub et al., 1983) are particularly preferred since, due to the mutation, they do not have their own DHFR activity.
  • a mutated DHFR gene can be used in the transfection, which codes for a protein with a reduced sensitivity to methotrexate (Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982).
  • the expression vector according to the invention can in principle be prepared by conventional methods known to the person skilled in the art, such as, for example, in Sambrock et al. (1989). There is also a description of the functional components of a vector, eg suitable promoters (in addition to the hamster ubiquitin / S27a promoter), enhancers, termination and polyadenylation signals, antibiotic resistance genes, selection markers, replication starting points and splice signals.
  • cloning vectors can be used for the production, for example plasmids, bacteriophages, phagemids, cosmids or viral vectors such as baculovirus, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes simplex virus, but also artificial chromosomes / mini-chromosomes.
  • the eukaryotic expression vectors typically also contain prokaryotic sequences such as, for example, the origin of replication and antibiotic resistance genes, which enable the multiplication and selection of the vector in bacteria.
  • a variety of eukaryotic expression vectors containing multiple cloning sites for the introduction of a polynucleotide sequence are known and some are commercially available from various companies such as Stratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, Wl, USA or BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA available.
  • the hamster ubiquitin / S27a promoter, the gene of interest, the gene coding for a fluorescent protein preferably also the amplifiable selection marker gene, for example dihydrofolate reductase, and optionally additional regulatory elements such as the internal ribosome binding site ( IRES), enhancer or a polyadenylation signal introduced into the expression vector.
  • An expression vector according to the invention minimally contains an ubiquitin / S27a promoter, the gene of interest, and the gene coding for a fluorescent protein.
  • the expression vector preferably also contains an amplifiable selection marker gene.
  • modified ubiquitin / S27a promoters for example like the modified ubiquitin / S27a promoters described in the present application, is also in accordance with the invention.
  • a promoter / enhancer is functionally linked to a coding gene sequence if it can control or modulate the transcription of the linked gene sequence in the cis position.
  • functionally linked DNA sequences are in close proximity and, if two coding gene sequences are linked or in the case of a secretion signal sequence, in the same reading frame.
  • a functionally linked promoter is generally upstream of the coding gene sequence, it does not necessarily have to be closely adjacent.
  • Enhancers also do not have to be in close proximity, as long as they favor transcription of the gene sequence. For this purpose, they can be both upstream and downstream of the gene sequence, possibly at some distance.
  • a polyadenylation site is functionally linked to a gene sequence if it is positioned at the 3 'end of the gene sequence in such a way that the transcription proceeds via the coding sequence up to the polyadenylation signal.
  • the linkage can be carried out using conventional recombinant methods, e.g. by means of the PCR technique, by ligation at suitable restriction sites or by splicing. If no suitable restriction sites are available, synthetic oligonucleotide linkers or adapters can be used in a manner known per se. According to the invention, the functional linkage preferably does not take place via intron sequences.
  • the ubiquitin / S27a promoter or a modified form thereof, the gene of interest and the gene coding for a fluorescent protein are functionally linked to one another.
  • the functional linkage takes place via an IRES element, so that a bicistronic mRNA is synthesized by both genes.
  • the expression vector according to the invention can additionally contain enhancer elements which act functionally on one or more promoters.
  • An expression vector in which the ubiquitin / S27a promoter or a modified form thereof is linked to an enhancer element for example an SV40 enhancer or a CMV enhancer element, is particularly preferred.
  • the genes can be expressed within an expression vector from one or more transcription units.
  • a region that contains one or more genes to be transcribed is defined as a “transcription unit”.
  • the genes within a transcription unit are functionally linked to one another such that all genes within such a unit are under the transcriptional control of the same promoter or promoter / enhancer.
  • IRES elements or introns can be used for the functional linking of the genes within a transcription unit.
  • the expression vector can contain a single transcription unit for expressing the gene of interest, the gene for the fluorescent protein and the amplifiable selection marker. Alternatively, these genes can also be arranged in two or more transcription units. Different combinations of the genes are possible within a transcription unit. In a further embodiment of the present invention, more than one expression vector, consisting of one, two or more transcription units, can be introduced into a host cell by co-transfection or in successive transfections in any order. Any combination of regulatory elements and genes on each vector can be chosen as long as sufficient expression of the transcription units is ensured. If necessary, further regulatory elements and genes, such as additional genes of interest or selection markers, can be positioned on the expression vectors.
  • the expression vector according to the invention can contain the gene which codes for a fluorescent protein and the amplifiable selection marker gene in one or in two separate transcription units.
  • Each transcription unit can transcribe and express one or more gene products. If both genes are contained in a transcription unit, they are under the control of the same promoter or promoter / enhancer, preferably using an IRES element to ensure the functional linkage of all components.
  • the gene encoding a fluorescent protein and the amplifiable selection marker gene are contained in two separate transcription units, they can be under the control of the same or different promoters / enhancers.
  • the one (bicistronic) transcription unit contains the gene of interest and the gene coding for a fluorescent protein, while the other transcription unit contains the amplifiable selection marker gene.
  • Each transcription unit is preferably delimited at the 3 'end by a sequence which codes for a polyA signal, preferably tk polyA, BGH polyA or SV40 polyA.
  • nucleotide sequences for a wide variety of restriction endonucleases and the associated restriction endonucleases are known in the prior art. Sequences are preferably used which consist of at least 6 nucleotides exist as a recognition sequence. A list of suitable recognition sequences can be found, for example, in Sambrook et al. (1989).
  • Eukaryotic host cells are used for transfection with the expression vector according to the invention, preferably mammalian cells and in particular rodent cells such as e.g. Mouse, rat and hamster cell lines.
  • rodent cells such as e.g. Mouse, rat and hamster cell lines.
  • the successful transfection of the corresponding cells with an expression vector according to the invention results in transformed, genetically modified, recombinant or transgenic cells, which are also the subject of the present invention.
  • Host cells preferred in the context of the invention are hamster cells such as, for. BHK21, BHK TK “ , CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 and CHO-DG44 cells or derivatives / descendants of these cell lines.
  • CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 and BHK21 cells are particularly preferred, in particular CHO-DG44 and CHO-DUKX cells, mouse myeloma cells, preferably NS0 and Sp2 / 0 cells and derivatives / descendants of these cell lines are also suitable.
  • hamster and mouse cells examples include human, mouse, rat, monkey, rodent, or eukaryotic cells, including but not limited to yeast, insect, and plant cells, can also be used as host cells Production of biopharmaceutical proteins can be used.
  • the eukaryotic host cells are transfected with a polynucleotide or one of the expression vectors according to the invention by customary methods (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Suitable transfection methods are e.g. liposome-mediated transfection, calcium phosphate coprecipitation, electroporation, polycations (e.g. DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection and viral infections. According to the invention, a stable transfection is preferably carried out, the constructs either being integrated into the genome of the host cell or an artificial chromosome / minichromosome or are contained in a stable manner episomally in the host cell.
  • each sequence or gene that is introduced into a host cell is referred to as a “heterologous sequence” or “heterologous gene” with respect to the host cell. Even if the sequence or gene to be introduced is identical to an endogenous sequence or an endogenous gene of the host cell.
  • a hamster actin gene that is introduced into a hamster host cell is by definition a heterologous gene.
  • heterodimeric proteins such as monoclonal antibodies (mAbs)
  • mAbs monoclonal antibodies
  • the transfection of suitable host cells can in principle be carried out in two different ways.
  • Such mAbs are made up of several subunits, the heavy and light chains. Genes coding for these subunits can be found in independent or in multicistronic transcription units a single plasmid, which is then used to transfect the host cell. This is to ensure the stoichiometric representation of the genes after integration into the genome of the host cell.
  • independent transcription units it must be ensured that the mRNAs that code for the different proteins have the same stability, transcription and translation efficiency.
  • the expression of the genes within a multicistronic transcription unit is carried out by a single promoter and only one transcript is produced.
  • the use of IRES elements enables a quite efficient internal translation initiation of the genes in the second and subsequent cistrons. Nevertheless, the expression rates for these cistrons are lower than that of the first cistron, whose translation initiation via a so-called “cap” -dependent pre-initiation complex is much more efficient than the IRES-dependent translation initiation.
  • additional intercistronic elements are introduced which, in cooperation with the IRES elements, ensure uniform expression rates (WO 94/05785).
  • Another possibility preferred according to the invention for the simultaneous production of several heterologous proteins is co-transfection, in which the genes are integrated separately into different expression vectors.
  • This has the advantage that certain ratios of the genes and gene products to one another can be set, as a result of which differences in the mRNA stability and in the transcription and translation efficiency can be compensated for.
  • the expression vectors are more stable and easier to handle both in cloning and in transfection.
  • the host cells are therefore additionally transfected, preferably co-transfected, with one or more vectors with genes which code for one or more other proteins of interest.
  • the other vector (s) used for the co-transfection code for example, for the other protein (s) of interest under the control of the same Promoter / enhancer combination and for at least one further selection marker, for example neomycin phosphotransferase.
  • the host cells are preferably established, adapted and cultivated under serum-free conditions, if appropriate in media which are free from animal proteins / peptides.
  • media which are free from animal proteins / peptides.
  • Examples of commercially available media are Ham 's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove ' s Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Ca., USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serum-free CHO medium (Sigma) and protein-free CHO medium (Sigma).
  • Each of these media can optionally be supplemented with various compounds, e.g. hormones and / or other growth factors (e.g. insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor), salts (e.g. sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate), buffers (e.g. HEPES) , Nucleosides (eg adenosine, thymidine), glutamine, glucose or other equivalent nutrients, antibiotics and / or trace elements.
  • growth factors e.g. insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor
  • salts e.g. sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate
  • buffers e.g. HEPES
  • Nucleosides eg adenosine, thymidine
  • glutamine glucose or other equivalent nutrients
  • antibiotics and / or trace elements e.g., antibiotics and / or trace elements.
  • serum-free media are preferred according to the invention, media which have been
  • a “selection agent” is a substance that affects the growth or survival of host cells with a deficiency for the respective selection marker gene.
  • the antibiotic Geneticin G4108 is used as a medium additive to select for the presence of an expressed antibiotic resistance gene such as the neomycin phosphotransferase
  • the selection agent can also be a substance which triggers an amplification of the selection marker gene if the gene used is an amplifiable selection marker (see Table 1), for example methotrexate is a selection agent which is suitable for the amplification of the DHFR gene Examples of other selection agents which trigger amplification are listed in Table 1.
  • a “selection marker gene” is a gene which enables the specific selection of cells which receive this gene by adding an appropriate selection agent to the culture medium.
  • an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker. Only cells that contain this Genes that have been transformed can grow and therefore be selected in the presence of the corresponding antibiotic. Non-transformed cells, on the other hand, cannot grow or survive under these selection conditions.
  • the selection markers used in this invention include genetically engineered mutants and variants, fragments, functional equivalents, derivatives, homologues and fusions with other proteins or peptides, as long as the selection marker maintains its selective properties.
  • Such derivatives have considerable homology in the amino acid sequence in the regions or domains to which the selective property is ascribed.
  • selection marker genes including bifunctional (positive / negative) markers, have been described in the literature (see, for example, WO 92/08796 and WO 94/28143).
  • selection markers commonly used in eukaryotic cells include the genes for aminoglycoside phosphotransferase (APH), hygromycin phosphotransferase (HYG), dihydrofolate reductase (DHFR), thymidine kinase (TK), glutamine synthetase, asparagine synthetase and genes that confer resistance to neomycin (G418), puromycin, histidinol D, bleomycin, phleomycin and zeocin.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • HAG hygromycin phosphotransferase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • TK thymidine kinase
  • G418 puromycin,
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Bacterial ß- Galactosidase, cell surface markers or fluorescent proteins e.g. green fluorescent protein (GFP) and its variants of Aequorea victoria and Renilla reniformis or other species, red fluorescent protein and proteins fluorescent in other colors and their variants of non-bioluminescent organisms such as Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.
  • GFP green fluorescent protein
  • red fluorescent protein and proteins fluorescent in other colors and their variants of non-bioluminescent organisms such as Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.
  • the use of the DHFR gene is preferred for the selection of genetically modified (recombinant) host cells as amplifiable selection marker gene.
  • DHFR-negative basic cells such as CHO-DG44 or CHO-DUKX
  • this marker is particularly suitable for selection and subsequent amplification, since these cells do not express endogenous DHFR and therefore do not grow in a purine-free medium. Therefore, the DHFR gene can be used as the dominant selection marker and the transformed cells are selected in hypoxanthine / thymidine-free medium.
  • Methotrexate (MTX) is used to achieve DHFR-mediated gene amplification. The growth properties are significantly influenced by the addition of MTX.
  • recombinant host cells can be enriched by the clone selection system according to the invention, which show a considerably more robust behavior towards high MTX concentrations (see Fig. 7).
  • host cells that were identified and sorted out using a fluorescence-activated line sorter (FACS) could be cultivated and amplified in the presence of 500 nM, preferably in the presence of 1 // M MTX, which led to a significant increase in productivity.
  • FACS fluorescence-activated line sorter
  • a method for the selection of highly producing host cells is considered to be particularly according to the invention, in which host cells which are transfected with an expression vector according to the invention and at least express the gene of interest, the fluorescent protein and a DHFR gene, are sorted out using FACS sorting, and at least be subjected to a gene amplification step in the presence of at least 500 nM, preferably 1 ⁇ M MTX.
  • “Fermentation robustness” means growth properties of the cells such as, for example, adherence to certain growth rates, robustness towards “upscaling” (larger dimensions of the bioreactors) and reaching high cell numbers and vitalities in the stock keeping, in order to do justice to the industrial passenger rates during “upscaling”.
  • expression refers to the transcription and / or translation of a heterologous gene sequence in a host cell.
  • the expression rate can be determined generally, either on the basis of the amount of the corresponding mRNA that is present in the host cell or on the basis of the one produced Amount of
  • a gene product encoded by the gene of interest The amount of through
  • Transcription of a selected nucleotide sequence generated mRNA can be determined, for example, by Northern blot hybridization, ribonuclease RNA protection, in situ hybridization of cellular RNA or by PCR methods
  • Nucleotide sequence can also be encoded by various methods, such as by ELISA, Western blot, radioimmunoassay, immunoprecipitation, detection of the biological activity of the protein or by immunostaining
  • Protein with subsequent FACS analysis can be determined (Sambrook et al., 1989;
  • High expression level (rate) means the persistent and sufficiently high expression or synthesis of a heterologous sequence introduced into a host cell, for example a gene coding for a therapeutic protein, designated.
  • Enhanced or high expression or a high expression level (rate) or high productivity is present if a cell according to the invention is cultivated according to a method according to the invention described here and if this cell is at least more than approximately 5 pg of the desired gene product produced per day (5 pg / day / cell).
  • An increased or high expression or a high expression level (rate) or high productivity is also present if the cell of the invention produces at least more than about 10 pg of the desired gene product per day (10 pg / day / cell).
  • Enhanced or high expression or a high level (s) of expression or high productivity is particularly present when the cell according to the invention produces at least more than about 15 pg of the desired gene product per day (15 pg / day /Cell).
  • Enhanced or high expression or a high level (s) of expression or high productivity is present in particular if the cell according to the invention produces at least more than about 20 pg of the desired gene product per day (20 pg / day /Cell).
  • a particularly increased or high expression or a particularly high expression level (rate) or a particularly high productivity is present when the cell according to the invention produces at least more than about 30 pg of the desired gene product per day (30 pg / day / cell).
  • a high or increased expression, a high productivity or a (e) high expression level (rate) in the sense of the present invention can be achieved in different ways.
  • a gene for an amplifiable selection marker By co-expressing the gene of interest with a gene for an amplifiable selection marker, cells can be selected and identified that express the heterologous gene to a high degree.
  • the amplifiable selection marker enables not only the selection of stably transfected host cells but also the gene amplification of the heterologous gene of interest.
  • the integration of the additional copies of the nucleic acids can take place in the genome of the host cells, in additional artificial / mini-chromosomes or in episomally localized polynucleotides.
  • This procedure can be combined with a FACS-assisted selection of recombinant host cells which contain, for example, one (or more) fluorescent protein (s) (eg GFP) or a cell surface marker as a further selection marker.
  • fluorescent protein eg GFP
  • Other methods of achieving increased expression, and a combination of different methods is also possible, are based, for example, on the use of (artificial) transcription factors, treatment of the cells with natural or synthetic agents for upregulating endogenous or heterologous gene expression, improvement of the stability (half-life) of the mRNA or protein, improvement of mRNA Translation initiation, increasing the gene dose by using episomal plasmids (based on the use of viral sequences as the origin of replication, for example SV40, polyoma, adenovirus, EBV or BPV), using amplification-promoting sequences (Hemann et al., 1994) or on DNA Concatener-based in vitro amplification systems (Monaco et al., 1996).
  • a coupled transcription of the gene of interest and the gene which codes for the fluorescent protein Both the protein of interest and the fluorescent protein are expressed from the resulting bicistronic mRNA. Due to this coupling of the expression of the protein of interest and the fluorescent protein, it is easily possible according to the invention to select and isolate high-producing recombinant host cells via the expressed fluorescent protein, e.g. by sorting with the aid of a fluorescence-activated line sorting device (FACS).
  • FACS fluorescence-activated line sorting device
  • the selection of recombinant host cells that show a high vitality and an increased expression rate of the desired gene product is a multi-stage process.
  • the host cells transfected with the expression vector according to the invention or optionally a further vector, for example co-transfected, are examined at least for the expression of the gene coupled to the gene of interest which codes for a fluorescent protein in order to identify and select the cell / cell population, that show the highest expression levels of fluorescent protein.
  • Preferably, only the cells that belong to the 10% cells with the highest expression rate of fluorescent protein are sorted out and further cultivated. In practice, this means that the brightest 10% of the fluorescent cells are sorted out and further cultivated.
  • the brightest 5%, preferably the brightest 3%, or even the brightest 1% of the fluorescent cells of a cell mixture can be sorted out and multiplied.
  • only the brightest 0.5% or the brightest 0.1% of the fluorescent cells are sorted out and multiplied.
  • the cells previously transformed with the expression vector according to the invention are cultivated in a selection medium which optionally also contains a selection agent specific for the amplifiable selection marker. Gradually increased concentrations of selection agent can be used to exert a gradually increased selection pressure.
  • the selection step can be carried out on cell pools or with pre-sorted cell pools / cell clones.
  • One or more, preferably two or more and in particular three or more sorting steps can be carried out, with the cells between the individual sorting steps over a certain period of time, e.g. about two weeks at pools, cultivated and propagated.
  • the host cells can be subjected to one or more gene amplification steps in order to increase the number of copies of at least the gene of interest and the amplifiable selectable marker gene.
  • Methods for stepwise gene amplification using methotrexate are described by way of example in US Pat. No. 5,179,017. According to the high productivity that can be achieved is not tied to an increased number of gene copies. Rather, it is an expression of the increased stability and fermentation robustness of the high-performance clones. It is therefore possible to reduce the number of gene amplification steps required and e.g. perform only one gene amplification.
  • a method for the selection of cells comprises the following steps: i) transformation of suitable host cells at least with one of the vectors according to the invention, the DNA of the expression vectors preferably being stably incorporated into the host cell genome or into artificial chromosomes / minichromosomes; ii) the transformed cells are cultured under conditions that allow expression of the gene of interest and the fluorescent protein; iii) the cells are cultivated in the presence of at least one selection agent, so that only those cells are grown which can grow in the presence of said selection agent; iv) sorting out cells from a cell mixture which show the highest expression rate of fluorescent protein, the cells being detected and sorted with the aid of a fluorescence-activated line sorting device (FACS); v) the cultivation of the sorted cells with the highest expression rates for the fluorescent protein.
  • FACS fluorescence-activated line sorting device
  • steps ii) - v) can be repeated one or more times with the cells obtained after step v).
  • the transformed cells can optionally also be subjected to one or more gene amplification tests in which they are cultivated in the presence of a selection agent which leads to an amplification of the amplifiable selectable marker gene. This step can be carried out both with cells that have not yet been sorted and with cells that have already been pre-sorted once or several times.
  • the selected high-producing cells are preferably grown in a serum-free culture medium and preferably in suspension culture under conditions which allow expression of the gene of interest.
  • the protein of interest is preferably obtained as a secreted gene product from the cell culture medium. If the protein is expressed without a secretion signal, the gene product can also be isolated from cell lysates. In order to obtain a pure, homogeneous product which is essentially free of other recombinant proteins and host cell proteins, usual cleaning steps are carried out. To do this, cells and cell debris are often first removed from the culture medium or lysate.
  • the desired gene product can then be freed from contaminating soluble proteins, polypeptides and nucleic acids, for example by fractionation on immunoaffinity and ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC or chromatography on Sephadex, silica or cation exchange resins such as DEAE.
  • Methods used to Purification of a heterologous protein expressed by recombinant host cells are known to the person skilled in the art and are described in the literature, for example by Harris et al. (1995) and Scopes (1988).
  • alkaline phosphatase bp base pair
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • FAP fibroblast activated protein
  • GFP green fluorescent protein
  • HRPO horseradish peroxidase
  • IRES infernal ribosomal entry site kb: Kilobase mAb: monoclonal antibody
  • PCR polymerase chain reaction sICAM: soluble intracellular adhesion molecule
  • the cells CHO-DG44 / DHFR - / - (Urlaub et al., 1983) were permanently suspended cells in serum-free and hypoxanthine and thymidine supplemented CHO-S-SFMII medium (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, DE) in cell culture bottles at 37 ° C cultivated in a humid atmosphere and 5% C0 2 .
  • the cell counts as well as the viability were checked with a CASY1 Cell Counter (sharpness System, DE) or by trypan blue staining and the cells are then sown in a concentration of 1 - 3 x10 5 / mL and passaged every 2 - 3 days.
  • Lipofectamine Plus reagent (Invitrogen GmbH) was used to transfect CHO-DG44.
  • a total of 1 ⁇ g plasmid DNA, 4 ⁇ L lipofectamine and 6 ⁇ L plus reagent according to the manufacturer's instructions were mixed and mixed in a volume of 200 ⁇ L with 6 ⁇ 10 5 exponentially growing CHO-DG44 cells in 0.8 mL HT- supplemented CHO-S-SFMII medium. After three hours of incubation at 37 ° C in a cell incubator, 2 mL of HT-supplemented CHO-S-SFMII medium was added.
  • DHFR-based selection of stably transfected CHO-DG44 the cells were transferred 2 days after transfection in CHO-S-SFMII medium without addition of hypoxanthine and thymidine, the medium being changed every 3 to 4 days.
  • the medium was also G418 (Invitrogen) in a concentration of 400 ⁇ g / mL added.
  • DHFR-based gene amplification of the integrated heterologous genes was achieved by adding the selection agent MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) in a concentration of 5 - 2000 nM to the HT-free CHO-S-SFMII medium.
  • MTX Sigma, Deisenhofen, DE
  • Expression Vectors For expression analysis, eukaryotic expression vectors based on the pAD-CMV vector (Werner et al., 1998) and the constitutive expression of a heterologous gene via the combination of CMV enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter (WO 97/15664) were used. convey. While the base vector pBID contains the DHFR minigen, which serves as an amplifiable selection marker (see, for example, EP 0 393 438), the DHFR minigen in the vector pBIN has been replaced by a neomycin resistance gene (Fig. 2).
  • the selection marker neomycin phosphotransferase including SV40 early promoter and TK polyadenylation signal, from the commercial plasmid pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, USA) isolated as a 1640 bp Bsu36l fragment. After a filling reaction of the fragment ends by Klenow DNA polymerase, the fragment was ligated with the 3750 bp Bsu36l / Stul fragment of the vector pBID, which was also treated with Klenow DNA polymerase. In the bicistronic base vector pBIDG (Fig.
  • the IRES-GFP gene region was isolated from the vector plRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, USA) and brought under the control of the CMV enhancer / promoter in the vector pBID, that the multiple cloning site between promoter region and IRES element was preserved.
  • the procedure was as follows. In a PCR mutagenesis, the plasmid plRES2-EGFP being used as a template, the HindIII-AAGCTT interface within the IRES sequence was converted into the sequence sequence ATGCTT by the use of mutagenic primers and thus removed.
  • an Xbal interface was introduced by means of a primer with complementarity to the 5 ' end of the IRES sequence and a Spel interface with complementarity to the 3 ' end of the GFP sequence.
  • the resulting PCR fragment which included the complete IRES and GFP sequence, was digested with Xbal and Spei and cloned into the singular Xbal site at the 3 ' end of the multiple cloning site of the vector pBID.
  • the human sICAM gene was isolated as a HindIII / SalI fragment from pAD-sICAM (Werner et al., 1998) and cloned into the corresponding interfaces of the vector pBIDG, resulting in the vector pBIDG-sICAM (Fig. 3).
  • the heavy chain was isolated as a 1.5 kb Nael / Hindlll fragment from the plasmid pG1D105F19HC (NAGENESEQ: AAZ32786) and in the vector digested with EcoRI (filled in with Klenow DNA polymerase) and Hindlll pBIDG cloned, resulting in the vector pBIDG-F19HC (Fig.3).
  • the flow cytometric analyzes and sorting were carried out with a Coulter Epics Altra device.
  • the FACS is equipped with a helium-argon laser with an excitation wavelength of 488 nm.
  • the fluorescence intensity is recorded at a wavelength that is adequate for the fluorescence protein and processed using the connected software Coulter Expo32.
  • the sorting was carried out at a rate of 8000 - 10000 events / second.
  • the suspended cells were centrifuged off (5 min at 180 ⁇ g) and adjusted to a cell concentration of 1-1.5 ⁇ 10 7 / mL in HBSS.
  • the cells were then sorted according to their fluorescent protein signal.
  • the cells were taken up in tubes with the culture medium provided, centrifuged and, depending on the number of cells sorted out, sown into corresponding culture vessels.
  • sICAM titers in supernatants from stably transfected CHO-DG44 cells were quantified by ELISA according to standard protocols (Ausubel et al., 1994, updated), using two sICAM-specific mAbs developed in-house (for example in US Pat. No. 5,284,931 and US 5,475,091). One of the two antibodies is an HRPO-conjugated antibody. Purified sICAM protein was used as the standard.
  • the F19 mAb in the supernatants of stably transfected CHO-DG44 cells was quantified using ELISA according to standard protocols (Ausubel et al., 1994, updated), using a goat anti-human IgG Fc fragment (Dianova, Hamburg, DE) and on the other hand an AP-conjugated goat anti human kappa light chain antibody (Sigma) was used. Purified F19 antibodies served as standard. Productivities (pg / cell / day) were calculated using the formula pg / ((Ct-Co) t / In (Ct-Co)), where Co and Ct indicate the number of cells when sowing or harvesting and t the cultivation time.
  • Example 1 Comparison of CMV and hamster ubiquitin / S27a promoter activity
  • CHO-DG44 cells were transfected with various recombinant vectors.
  • the heterologous gene product on the one hand a lysosomal enzyme and on the other hand an IgG1 antibody, was expressed either under the control of the CMV promoter or under that of the hamster ubiquitin / S27a promoter. Both promoters were functionally linked to the CMV enhancer.
  • the BGH polyA was used as the termination signal for the heterologous gene.
  • the expression vectors which contained the CMV promoter were based either on a modified pcDNA3 ("CMV 1 ", Invitrogen) or pBluescript vector ("CMV 2 ", Stratagene) and additionally coded for the amplifiable selection marker dihydrofolate reductase.
  • the expression vector with the hamster promoter is based on the pAD-CVM vector (Werner et al., 1998).
  • a co-transfection with a second vector was carried out, which contained a neomycin resistance gene as a selection marker.
  • the CMV enhancer can also be replaced by the SV40 enhancer.
  • cell clones in HT-free medium were selected and isolated after the transfection.
  • Cell clones with the highest productivity with regard to the recombinant protein were subjected to a step-by-step DHFR-based gene amplification by gradually increasing the methotrexate concentration from 5 nM to 50 nM, 500 nM to 2 ⁇ M, in each case combined with a dilution cloning. About 20 to 30 clones with the highest productivity were selected at each amplification stage.
  • the hamster promoter proved to be more powerful. Both in the expression of the lysosomal enzyme and in the expression of the antibody, productivities or titers were achieved which were 2 to 5 times higher than in the cells in which the heterologous gene was expressed under the control of the CMV promoter.
  • the relative titers and relative are exemplary specific productivities of the best cell clones at the respective amplification level, the expression based on the CMV promoter being set as 1 for the respective heterologous gene (CMV 1 for the lysosomal enzyme, CMV 2 for the antibody).
  • Example 2 Isolation of highly expressive sICAM cells by GFP-based FACS sorting
  • sICAM intercellular adhesion molecule
  • the therapeutic protein sICAM and GFP were expressed together by a bicistronic and the DHFR by a separate transcription unit. Two to three weeks after the first selection in HT-free CHO-S-SFMII medium, the 5% of the cells with the highest GFP fluorescence were sorted out. After approximately two weeks of cultivation, the 5% cells with the highest GFP fluorescence were again isolated. In total, this sequential sorting was carried out six times. A good correlation between sICAM productivity and GFP fluorescence was shown (Fig. 4). The FACS-based selection alone, without any MTX amplification step, quickly isolated cell pools with high specific productivities of up to 16 pg / cell / day (Fig. 5).
  • productivity could even be increased to over 30 pg / cell / day (Fig. 6).
  • Example 3 Isolation of cells with high expression of the mAb F19 by GFP-based FACS sorting
  • CHO-DG44 cells were transfected with the plasmid combination pBIDG-F19HC and pBIN-F19LC (Fig.3).
  • the expressed humanized antibody F19 is directed against the surface molecule FAP, which is synthesized by reactive stroma fibroblasts (see also patent EP 0 953 639).
  • the two protein chains of the antibody are each expressed by their own vector, which additionally codes for a DHFR or neomycin phosphotransferase selection marker in a separate transcription unit.
  • the vector pBIDG-F19HC also contains a further selection marker, the GFP.
  • the co-transfection of CHO-DG44 with the vectors pBIDG-F19HC / pBIN-F19LC enabled cells with a high expression of the antibody F19 in a short time are isolated that the cells with a high GFP content were selected by sequential FACS sorting.
  • FACS sorting After a first two to three week selection of the transfected cell pools in HT-free CHO-S-SFMII medium with the addition of 400 ⁇ g / mL G418 sorted out the 5% of the cells with the highest GFP fluorescence by FACS. This sorting was carried out up to six times in total, with a cultivation period of approximately 2 weeks between each sorting.

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Ein Expressionsvektor für eukaryontische Zellen umfassend ein Gen, das für ein Protein von Interesse kodiert, in funktioneller Verknüpfung mit einem Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor und einem Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert. Vorzugsweise enthält der Expressionsvektor noch ein amplifizierbares Selektionsmarkergen. Beschrieben werden ferner mit dem Expressionsvektor transfizierte Wirtszellen, vorzugsweise Säugerzellen, Verfahren zur Herstellung heterologer Genprodukte und ein Verfahren zur Selektion hochproduzierender Zellen.

Description

EXPRESSIONSVEKTOR, VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON
HETEROLOGEN GENPRODUKTEN UND SELEKTIONSVERFAHREN FÜR
HOCHPRODUZIERENDE REKOMBINANTE ZELLEN
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen, ein Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten sowie Expressionsvektoren und damit transfizierte Wirtszellen, die in diesen Verfahren verwendbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Säugerzellen sind die bevorzugten Wirtszellen zur Produktion komplexer biopharmazeutischer Proteine, da die post-translational durchgeführten
Modifikationen sowohl in funktionaler als auch in pharmakokinetischer Hinsicht humankompatibel sind. Kommerziell relevante Zelltypen sind Hybridomas,
Myelomas, CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen und BHK (Baby Hamster Kidney)-
Zellen. Die Kultivierung der Wirtszellen erfolgt zunehmend unter serum- und proteinfreien Produktionsbedingungen. Gründe hierfür sind die damit verbundene
Kostenreduktion, die geringere Interferenz bei der Aufreinigung des rekombinanten
Proteins sowie die Reduktion des Potentials zur Einführung von Pathogenen (z.B. Prionen, Viren). Der Einsatz von CHO-Zellen als Wirtszellen findet dabei immer mehr
Verbreitung, da diese Zellen sich an Suspensionswachstum in serum- und proteinfreiem Medium adaptieren lassen und sie zudem von den regulatorischen
Behörden als sichere Produktionszellen angesehen und akzeptiert werden.
Zur Erzeugung einer stabilen Säugerzelllinie, die ein heterologes Gen von Interesse exprimiert, wird das heterologe Gen in der Regel gemeinsam mit einem selektierbaren Markergen, wie z.B. Neomycin-Phosphotransferase, durch Transfektion in die gewünschten Zelllinie eingebracht. Das heterologe Gen und das selektierbare Markergen können dabei entweder gemeinsam von einem einzelnen Vektor oder von jeweils separaten Vektoren, die co-transfiziert werden, exprimiert werden. Zwei bis drei Tage nach der Transfektion werden die Zellen in Medium überführt, das ein Selektionsmittel enthält, z.B. G418 bei Verwendung des Neomycin-Phosphotransferase-Gens, und für einige Wochen unter diesen selektiven Bedingungen kultiviert. Die hochwachsenden resistenten Zellen können dann isoliert und hinsichtlich der Expression des gewünschten Genprodukts untersucht werden. Bedingt durch die willkürliche und ungerichtete Integration in das Wirtszellgenom erhält man eine Population von Zellen, die völlig unterschiedliche Expressionsraten des heterologen Gens aufweisen. Darunter können auch nicht-exprimierende Zellen sein, bei denen zwar der Selektionsmarker exprimiert wird, aber nicht das Gen von Interesse. Zur Identifizierung von Zellklonen, die eine sehr hohe Expression des heterologen Gens von Interesse aufweisen, muss deshalb eine Vielzahl von Klonen überprüft und getestet werden, resultierend in einem hohen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand.
Genamplifikation ist ein weitverbreitetes Phänomen in tierischen Zellkulturen, das für die Produktion rekombinanter biopharmazeutischer Proteine genutzt wird. Durch die Genamplifikation wird die ursprünglich relativ geringe Produktivität vieler Säugerzelllinien drastisch verbessert. Eine weit verbreitete Amplifikationstechnik stellt das Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-basierte Genamplifikationssystem dar, das sehr häufig in DHFR-defizienten Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen Verwendung findet. Dabei werden die DHFR-defizienten CHO-Zellen, z.B. CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) oder CHO-DG44 (Urlaub et al., 1983), mit einem geeigneten Vektorsystem, das für DHFR und das Protein von Interesse kodiert, transfiziert. Daraufhin werden die Transfektanten in einem Medium ohne Glycin, Hypoxanthin und Thymidin selektioniert. Die Amplifikation und somit die Etablierung von hochproduzierenden Zelllinien wird über die steigende Zugabe von Methotrexat (MTX), einem Inhibitor der Dihydrofolat-Reduktase, erreicht (Kaufman et al., 1982; US 4,656,134). Die anschließende Selektion der erhaltenen hochproduzierenden Zellen unterliegt auch hierbei dem Zufallsprinzip und basiert auf Wahrscheinlichkeiten, wodurch dieser Selektionsschritt überaus arbeits- und zeitintensiv ist. Zur besseren und schnelleren Verfolgung der Gentransformation und -expression wurden verschiedenste Methoden entwickelt. Diese beinhalteten zunächst die Verwendung von Reportermolekülen wie z.B. Chloramphenicol-Acetyltransferase, Luciferase, ß-Galactosidase oder von Fusionsproteinen, die die Kodierregionen von ß-Galactosidase oder Luciferase enthalten. Der Nachteil dieser entsprechenden Reportergen-Assays besteht allerdings darin, dass die Zellen fixiert oder lysiert und mit exogen hinzugefügten Substraten und Co-Faktoren inkubiert werden müssen. Eine Weiterkultivierung der analysierten Zellen ist somit ausgeschlossen. Eine neuere Methode, basierend auf der Co-Expression des E.coli Enzyms ß-Galacto- sidase, ermöglicht zwar eine Sortierung von lebenden Zellen mittels eines FACS- Geräts (Nolan et al., 1988), allerdings ist hier zur Beladung der Zellen mit dem fluorogenen Substrat eine hypotonische Vorbehandlung erforderlich. Diese Aktivität muss vor dem FACS-basierten Sortierung noch inhibiert werden.
Mit der Einführung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) aus Aequorea victo a und den daraus entwickelten GFP-Mutanten als Reportermolekül wurde die Identifizierung von Zellen, die ein heterologes Gen exprimieren, erheblich erleichtert. Die Co-Expression von GFP ermöglichte eine in vivo Echtzeit-Analyse und das Sortieren von Transfektanten auf Basis ihrer Fluoreszenz, ohne dass zusätzliche Substrate oder Co-Faktoren benötigt werden. Der Einsatz von GFP als Reportermolekül zur Verfolgung des Gentransfers wurde in verschiedenen Publikationen beschrieben. Chalfie et al. beschreiben in den Patenten US 5,491,084 und US 6,146,826 eine Methode zur Selektion von Zellen, die ein Protein von Interesse exprimieren. Diese Methode beinhaltet die Co-Transfektion von Zellen durch ein DNA-Molekül, das die kodierende Sequenz für das Protein von Interesse enthält, und einem zweiten DNA-Molekül, das das GFP-Gen kodiert. Nachfolgend werden die GFP-exprimierenden Zellen selektioniert. Gubin et al. (1997) untersuchten die Stabilität der GFP-Expression in CHO-Zellen in Abwesenheit von selektiven Wachstumsbedingungen. Die Zellen wurden dabei mit einem Plasmid, das sowohl GFP als auch Neomycin-Phosphotransferase enthielt, transfiziert. Mosser et al. (1997) verwendeten zur Identifierung und Selektion von Zellen, die induzierbares Produkt exprimierten, ein Plasmid, das eine bicistronische Expressionskassette, kodierend für GFP und ein Zielgen (oder auch Gen von Interesse genannt), enthielt. Das Zielgen stand dabei unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors. Die Kopplung der GFP- und der Zielgenexpression wurde durch die Verwendung eines viralen IRES („Infernal Ribosome Entry Site")-Elements erreicht, wodurch eine bicistronische mRNA, die für GFP und das Protein von Interesse kodierte, exprimiert wurde. Das hierbei verwendete Plasmid enthielt selbst kein selektierbares Markergen. Dieses wurde deshalb durch ein zweites Plasmid in einer Co- Transfektion oder in einer nachfolgenden Transfektion eingebracht. Hingegen verwendeten Levenson et al. (1998) retrovirale Vektoren mit einer bicistronischen Expressionskassette, in der vor der IRES-Sequenz das Gen von Interesse kloniert werden kann. Die auf die IRES-Sequenz folgende Sequenz kodierte hingegen für ein selektionierbares Markergen, wobei es sich dabei entweder um einen Marker handelte, der Resistenz gegen G418, Puromycin, Hygromycin B, Histidinol D oder Phleomycin vermittelte, oder um GFP.
Es wurden auch bereits Vektoren beschrieben, die ein IRES-Element aus der Familie der Picornaviren enthielten, wobei das IRES-Element zwischen dem Produktgen und einem selektionierbaren Markergen positioniert war (Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992).
GFP wurde auch erfolgreich mit Resistenzmarkergenen fusioniert. Zum Beispiel beschreibt Bennett et al. (1998) ein GFP/Zeomycin-Fusionsprotein. Dieser bifunktionale Selektionsmarker konnte erfolgreich zur Identifizierung und Selektion von transfizierten Säugerzellen eingesetzt werden. Primig et al. (1998) hingegen setzten ein Fusionsprotein aus GFP und Neomycin-Phosphotransferase für ihre Enhancer-Studien ein.
In der Publikation von Meng et al. (2000) und in der internationalen Patentanmeldung WO 01/04306 wurde zur Selektion und Identifizierung von Zellen mit hoher Expression eines rekombinanten Proteins ein Expressionssystem eingesetzt, in dem das Gen von Interesse zusammen mit dem amplifizierbaren Selektionsmarkergen DHFR und einem GFP-Gen von einem einzigen Vektor aus exprimiert wurde. Die drei Gene waren dabei entweder in einer Transkriptionseinheit zusammengefasst oder auf zwei Einheiten verteilt. Durch diese räumliche und transkriptionelle Verknüpfung aller drei Gene in einem einzigen Expressionsvektor sollte deren Wahrscheinlichkeit einer Co-Amplifikation unter Selektionsdruck erhöht werden und somit Hochproduzenten-Klone identifiziert und selektioniert werden. Die besten Klone, die durch Anwendung der kombinierten Selektion mittels amplifizierbarem DHFR-Selektionsmarker und GFP-basierter FACS-Sortierung isoliert wurden, exprimierten das Protein von Interesse in einer Größenordnung von maximal 3 bis 4.5 pg pro Zelle und Tag. Dabei wurden die Experimente mit adhärenten Zellen und in serumhaltigem Medium durchgeführt, also mit Zellen und unter Bedingungen, die bekanntermaßen wesentlich robuster und durch höhere Grundproduktivitäten gekennzeichnet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Entwicklung eines Selektionssystems für rekombinante Zellen mit erhöhter Produktivität, das folgende Anforderungen erfüllt:
(1) Verkürzung der Zeit für die Entwicklung von hochproduzierenden Zellen zur Herstellung biopharmazeutischer Proteine bei gleichzeitiger Senkung der
Entwicklungskosten;
(2) Hoher Durchsatz bei der Selektion von hochproduzierenden Zellen bei geringem Kapazitätsaufwand;
(3) Einsatz von „fermentationsrobusten" hochproduzierenden Zellen, die z.B. eine geringere Wachstumsbeeinträchtigung bei erhöhten Methotrexat-Konzentrationen zeigen;
(4) Transfektion, Selektion und Kultivierung der suspensionsadaptierten Zellen vorzugsweise in serumfreiem Medium;
(5) Reduktion der erforderlichen Genamplifikationsschritte.
Aufgabe der Erfindung war ferner die Bereitstellung von Expressionsvektoren und damit transfizierten Wirtszellen, die in diesem Klonselektionssystem verwendbar sind, sowie eines Verfahrens zur Herstellung von heterologen Genprodukten unter Verwendung dieser Wirtszellen.
Diese Aufgaben werden gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung mit Hilfe eines Expressionsvektors gelöst, der ein Gen, das für ein Protein von Interesse kodiert (im folgenden auch: „Gen von Interesse"), in funktioneller Verknüpfung mit einem Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor und einem Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, umfasst.
Der Expressionsvektor enthält vorzugsweise noch ein amplifizierbares Selektionsmarkergen, z.B. das Gen für die Dihydropholat-Reduktase (DHFR). Ferner enthält ein bevorzugter Expressionsvektor weitere regulatorische Elemente, beispielsweise einen Enhancer in funktioneller Verknüpfung mit dem Promotor. Ferner enthält der Expressionsvektor vorzugsweise zusätzlich eine interne Ribosomenbindungsstelle (IRES), welche die bicistronische Expression des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des Gens von Interesse ermöglicht.
Die Erfindung betrifft auch Basisvektoren, die anstelle des Gens von Interesse eine multiple Klonierungsstelle zum Einbau eines solchen Gens aufweisen, d.h. einen Sequenzbereich mit multiplen Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einem der genannten Expressionsvektoren transfiziert worden sind. Hierbei handelt es sich um eukaryontische Wirtszellen, vorzugsweise Säugerzellen, wobei Nagerzellen wie Hamsterzellen und insbesondere CHO-Zellen oder BHK-Zellen besonders bevorzugt sind.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Genprodukts, bei dem eine mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfizierte Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression des Genprodukts ermöglichen, kultiviert und das Genprodukt aus der Kultur oder dem Kulturmedium isoliert wird. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor sowie zusätzlich mit einem oder mehreren Vektoren mit Genen, die für ein oder mehrere andere Proteine von Interesse kodieren, transfiziert, bevorzugt co-transfiziert.
In diesem Zusammenhang stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterodimeren Proteins zur Verfügung, bei dem man eine derartige Wirtszelle, die mit Expressionsvektoren, welche für unterschiedliche Untereinheiten des heterodimeren Proteins kodieren, co-transfiziert worden ist, unter Bedingungen, die eine Expression des heterodimeren Proteins ermöglichen, kultiviert und das heterodimere Protein aus der Kultur oder dem Kulturmedium isoliert. Ein spezieller Anwendungsfall für ein solches Verfahren ist die Herstellung von Antikörpern und deren Untereinheiten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Selektion einer Wirtszelle, die ein Protein von Interesse exprimiert, bei dem eine Population von Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfiziert worden sind, unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Expression des Proteins von Interesse und des fluoreszierenden Proteins ermöglichen, und die Zelle(n) identifiziert und/oder selektiert werden, welche die höchsten Expressionsraten an fluoreszierendem Protein zeigen. Die Selektion erfolgt dabei vorzugsweise mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zeilsortiergeräts (FACS).
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass mit dem erfindungsgemäß bereitgestellten System in kürzester Zeit Zellpools isoliert werden können, die ohne Genamplifikationsschritt durchschnittliche spezifische Produktivitäten von über 15 pg (einzelkettiges Protein) bzw. 10 pg (humanisierter Antikörper) rekombinantes Protein pro Zelle und Tag exprimieren. Durch einen einzigen DHFR-basierten Genamplifikationsschritt konnten die spezifischen Produktivitäten noch auf über 30 pg pro Zelle und Tag gesteigert werden. Die bei den Zellpools erzielten Produktivitäten liegen damit um den Faktor 8 bis 10 höher als die maximalen Produktivitäten der besten bisher publizierten Zellklone. Erstaunlicherweise besteht auch eine sehr gute Korrelation zwischen der Expression des Proteins von Interesse und des fluoreszierenden Proteins. Diese ist sogar bei einer Co-Transfektion gegeben, wenn - wie im Fall eines exprimierten Antikörpers- beide Immunglobulinketten jeweils von einem eigenen Vektor exprimiert werden und bei der FACS-Sortierung nur auf die Expression der einen Kette, bedingt durch" deren transkriptionelle Kopplung mit dem fluoreszierenden Protein, selektioniert werden kann. Die hohen Expressionsraten des fluoreszierenden Proteins haben dabei keinerlei negativen Einfluss auf Zellwachstum und -Vitalität. Zudem kann die Entwicklungszeit zur Selektion von hochproduzierenden Zellen im Vergleich zu einer konventionellen stufenweisen Genamplifikationsstrategie zumindest um die Hälfte reduziert werden, einhergehend mit einer signifikanten Reduktion der Entwicklungskapazitäten und -kosten.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der erzielten Expressionslevel von rekombinanten Zellklonen, in denen das heterologe Genprodukt entweder unter der Kontrolle des CMV-Promotors oder unter der des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors exprimiert wird. Beide Promotoren sind dabei funktionell mit dem CMV-Enhancer verknüpft und die Terminationssequenz, BGH poly A, ist in allen Fällen identisch. Im Fall von CMV1 handelt es sich um einen pcDNA3- (Invitrogen, Kaisruhe, DE), in CMV2 um einen pBluescript- (Stratagene, La Jolla, CA, US) und bei CHO um einen pAD-CMV- basierten Expressionsvektor (Werner et al., 1998). Bei der Expression des lysosomalen Enzyms enthalten sämtliche Expressionsvektoren den amplifizierbaren Selektionsmarker Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) und die Expression des heterologen Gens wurde durch nachfolgende Amplifikationsschritte mit Methotrexat (MTX) gesteigert. Zur Expression der beiden Ketten des Antikörpers (Ak) wurde eine Co-Transfektion mit einem zweiten Vektor, der als Selektionsmarker ein Neomycin- Resistenzgen enthält, durchgeführt. Die erzielten Titer bzw. spezifischen Produktivitäten sind in Relation zur CMV Promotor-basierten Expression, die als 1 gesetzt wurde (CMV1 für Enzym, CMV2 für Ak), angegeben. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der Basisvektoren, die zur Expression der rekombinanten Proteine in CHO-DG44 Zellen verwendet wurden. Bei „P/E" handelt es sich um eine Kombination aus CMV-Enhancer und Hamster- Ubiquitin/S27a-Promotor, bei „P" lediglich um ein Promotorelement und bei „T" um ein Terminationssignal für die Transkription, das zur Polyadenylierung der transkribierten mRNA benötigt wird. Die Position und Richtung der Transkriptionsinitiation innerhalb jeder Transkriptionseinheit wird durch einen Pfeil angezeigt. Zur Klonierung der heterologen Gene ist nach dem Promotorelement ein Sequenzbereich mit multiplen Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (multiple cloning sites - mcs) eingefügt.. Der amplifizierbare Selektionsmarker Dihydrofolat- Reduktase ist mit „dhfr" und der Selektionsmarker Neomycin-Phosphotransferase mit „neo" abgekürzt. Das aus dem Encephalomyocarditis-Virus stammende IRES- Element dient als interne Ribosomenbindungsstelle innerhalb der bicistronischen Transkriptionseinheit und ermöglicht die Translation des nachfolgenden grünen fluoreszierenden Proteins „GFP".
Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der eukaryontischen Expressionsvektoren, die jeweils für ein biopharmazeutisches Protein kodieren und zur Transfektion von CHO-DG44 Zellen eingesetzt wurden. Bei „P/E" handelt es sich um eine Kombination aus CMV-Enhancer und Hamster Ubiquitin/S27a Promotor, bei „P" lediglich um ein Promotorelement und bei „T" um ein Terminationssignal für die Transkription, das zur Polyadenylierung der transkribierten mRNA benötigt wird. Die Position und Richtung der Transkriptionsinitiation innerhalb jeder Transkriptionseinheit wird durch einen Pfeil angezeigt. Der amplifizierbare Selektionsmarker Dihydrofolat-Reduktase ist mit „dhfr" und der Selektionsmarker Neomycin-Phosphotransferase mit „neo" abgekürzt. Das aus dem Encephalomyocarditis-Virus stammende IRES-Element dient als interne Ribosomenbindungsstelle innerhalb der bicistronischen Transkriptionseinheit und ermöglicht die Translation des nachfolgenden grünen fluoreszierenden Proteins „GFP". „sICAM" kodiert für das lösliche intrazelluläre Adhäsionsmolekül (US 5,412,216), wohingegen „F19HC" und „F19LC" für die schwere bzw. leichte Kette des humanisierten Antikörpers F19 kodieren (EP 953 639). Abbildung 4 zeigt die Korrelation zwischen der sICAM-Produktivität und der GFP- Fluoreszenz am Beispiel des Zellpools ZB1. Dieser Zellpool wurde aus der Transfektion mit dem Vektor pBIDG-sICAM erhalten, bei dem das therapeutische Protein sICAM und GFP gemeinsam von einer bicistronischen Transkriptionseinheit exprimiert werden. Der Pool wurde einem sequentiellen GFP-basierten FACS- Sortierung unterzogen. Nach jedem Sortierungsschritt (Sort) wurde die Konzentration des sICAMs im Zellkulturüberstand des Pools durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/c*d) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens drei Kultivierungspassagen dar. Insgesamt wurden sechs Sorts durchgeführt.
Abbildung 5 zeigt die Isolierung von hochexprimierenden sICAM Zellen durch GFP- basierte FACS-Sortierung am Beispiel des Zellpools ZB1. Dieser Zellpool wurde aus der Transfektion mit dem Vektor pBIDG-sICAM erhalten, bei dem das therapeutische Protein sICAM und GFP gemeinsam von einer bicistronischen Transkriptionseinheit exprimiert werden. Der Pool wurde einer sequentiellen GFP-basierten FACS- Sortierung unterzogen. Nach jedem Sort wurde die Konzentration des sICAMs im Zellkulturüberstand des Pools durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/c*d) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens drei Kultivierungspassagen dar. Insgesamt wurden sechs Sorts durchgeführt.
Abbildung 6 zeigt die durch Kombination einer GFP-basierten Selektion mit einem MTX-Amplifikationsschritt erzielten Steigerungen in der sICAM-Produktivität am Beispiel des Zellpools ZB1. Dieser Zellpool, der aus der Transfektion mit dem Vektor pBIDG-sICAM erhalten wurde, wurde einer sequentiellen GFP-basierten FACS- Sortierung unterzogen. Nach dem vierten Sort bzw. sechsten Sort wurde eine DHFR- vermittelte Genamplifikation durch Zusatz von Methotrexat (MTX) zum Kultivierungsmedium durchgeführt (5 nM, 50 nM, 500 nM oder 2 //M MTX). Die Konzentration des sICAMs im Zellkulturüberstand des Pools wurde durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/c*d) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens drei Kultivierungspassagen dar. Abbildung 7 zeigt den Viabilitätsverlauf von Zellpools nach Zugabe von unterschiedlichen hohen Dosen an Methotrexat zum Kultivierungsmedium. Der Zellpool ZB1 , der aus der Transfektion mit dem Vektor pBIDG-sICAM (Abb.3) erhalten wurde, wurde einer sequentiellen GFP-basierten FACS-Sortierung unterzogen. Nach dem vierten Sort bzw. sechsten Sort wurde eine DHFR-vermittelte Genamplifikation durch Zusatz von Methotrexat (MTX) zum Kultivierungsmedium durchgeführt. Die Zellzahlen sowie die Viabilität wurden während der Selektionsphase durch Trypanblau-Färbung bestimmt und über mehrere Kultivierungstage (die) hinweg verfolgt.
Abbildung 8 zeigt die Korrelation zwischen der Antikörper-Produktivität (mAk F19) und der GFP-Fluoreszenz am Beispiel des Zellpools ZB1. Dieser Zellpool wurde aus der Transfektion mit der Vektorkombination pBIDG-F19HC und pBIN-F19LC (Abb.3) erhalten. Der Pool wurde einer sequentiellen GFP-basierten FACS-Sortierung unterzogen. Nach jedem Sort wurde die Konzentration des Antikörpers F19 im Zellkulturüberstand des Pools durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und, Tag (pg/c*d) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens drei Kultivierungspassagen dar. Insgesamt wurden sechs Sorts durchgeführt.
Abbildung 9 zeigt die Isolierung von hochexprimierenden mAk F19 Zellpools durch eine GFP-basierte Selektion mittels FACS am Beispiel des Zellpools ZB1. Dieser Zellpool, der aus der Co-Transfektion mit den Vektoren pBIDG-F19HC und pBIN- F19LC (Abb.3) erhalten wurde, wurde einem sequentiellen GFP-basierten FACS- Sorting unterzogen. Die Konzentration des Antikörpers F19 im Zellkulturüberstand des Pools wurde nach jedem Sort durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/c*d) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens drei Kultivierungspassagen dar. Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor enthält ein Gen, das für ein Protein von Interesse kodiert („Gen von Interesse"), in funktioneller Verknüpfung mit einem Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor und einem Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert. Vorzugsweise enthält der Expressionsvektor noch ein amplifizierbares Selektionsmarkergen.
Hamster-Ubiguitin/S27a-Promotor
Der Ubiquitin/S27a-Promotor des Hamsters ist ein starker homologer Promotor, der in der WO 97/15664 beschrieben ist. Ein solcher Promotor weist vorzugsweise mindestens eines der folgenden Merkmale auf: GC-reicher Sequenzbereich, Sp1- Bindungsstelle, Polypyrimidinelement, Abwesenheit einer TATA-Box. Besonders bevorzugt ist ein Promotor, der eine Sp1 -Bindungsstelle bei Abwesenheit einer TATA-Box aufweist. Ferner ist ein solcher Promotor bevorzugt, der konstitutiv aktiviert ist und insbesondere unter serumhaltigen, serumarmen und serumfreien Zellkulturbedingungen gleichermaßen aktiv ist. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich um einen induzierbaren Promotor, insbesondere um einen Promotor, der durch Serumentzug aktiviert wird.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform ist ein Promotor mit einer Nukleotidsequenz, die in Fig. 5 der WO 97/15664 enthalten ist. Besonders bevorzugt sind dabei Promotorsequenzen, in denen die Sequenz von Position -161 bis - 45 von Fig. 5 enthalten ist.
Die in den Beispielen der vorliegenden Patentbeschreibung verwendeten Promotoren beinhalten jeweils ein DNA-Molekül mit der Sequenz von Position 1923 bis 2406 der SEQ ID NO: 1 des beiliegenden Sequenzprotokolls. Diese Sequenz entspricht dem Fragment - 372 bis + 111 aus Fig. 5 der WO 97/15664 und repräsentiert den bevorzugten Promotor, d.h. ein bevorzugter Promotor sollte diesen Sequenzbereich umfassen. Ein anderer geeignetes Promotorfragment enthält die Sequenz von Position 2134 bis 2406 (entspricht - 161 bis + 111 in Fig. 5 der WO 97/15664). Ein Promotor, der lediglich die Sequenz von Position 2251 bis 2406 beinhaltet, ist nicht mehr funktionsfähig (entspricht Position - 45 bis + 111 in Fig. 5 der WO 97/15664). Eine Verlängerung der Promotorsequenz in 5'-Richtung ausgehend von Position 2134 ist möglich.
Es können auch funktioneile Subfragmente der vollständigen Hamster- Ubiquitin/S27a-Promotorsequenz sowie funktioneile Mutanten/Varianten der vollständigen Sequenz oder Subfragmente hiervon eingesetzt werden, die z.B. durch Substitutionen, Insertionen oder Deletionen modifiziert worden sind. Entsprechende Subfragmente, Mutanten oder Varianten werden nachfolgend auch als „modifizierter Promotor" bezeichnet.
Ein modifizierter Promotor, gegebenenfalls kombiniert mit weiteren regulatorischen Elementen, weist vorzugsweise eine Transkriptionsaktivität auf, die der des Promotorfragments von Position 1923 bis 2406 der in SEQ ID NO:1 angegebenen Nukleotidsequenz (- 372 bis + 111 aus Fig. 5 der WO 97/15664) entspricht. Ein modifizierter Promotor erweist sich als tauglich im Sinne der Erfindung, wenn er über eine Transkripitionsaktivität verfügt, die mindestens 50%, besser mindestens 80%, noch besser mindestens 90%, und noch mehr bevorzugt mindestens 100% der Aktivität des 1923 bis 2406 Fragments (- 372 bis + 111 Fragments) in einem vergleichenden Reportergen-Assay aufweist. Insbesondere bevorzugt sind modifizierte Promotoren, die eine minimale Sequenzhomologie zur Wildtyp-Sequenz SEQ ID NO:1 des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors von mindestens 80%, besser mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 97% aufweisen und über eine entsprechende Promotoraktivität in einem vergleichenden Reportergen-Assay verfügen.
In einem entsprechenden vergleichenden Reportergen-Assay werden die zu testenden Promotorfragmente einschließlich der Referenzsequenz jeweils vor ein promotorloses Reportergen kloniert, das z.B. für Luciferase, sezernierte Alkalische Phosphatase oder grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert. Diese Konstrukte (Promotorsequenz + Reportergen) werden anschließend in die Testzellen, z.B. CHO- DG44, mittels Transfektion eingeführt und die Induktion der Reportergenexpression durch das jeweilige Promotorfragment über die Bestimmung des Proteingehalts des Reportergens ermittelt. Ein entsprechender Test findet sich beispielhaft auch in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, updated.
Die Promotorsequenz des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors sowie die modifizierter Promotoren, die z.B. auch die 5'-untranslatierte Region bzw. ausgewählte Fragmente hiervon umfassen können, und die kodierende Region des Ubiquitin/S27a-Gens bzw. ausgewählte Fragmente hiervon, können von einem Fachmann in Kenntnis der in der WO 97/15664 beschriebenen Sequenz mit verschiedenen Standardmethoden erhalten werden, wie z.B. in Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994 beschrieben. Ausgehend von der in WO 97/15664 beschriebenen Sequenz kann beispielsweise ein geeigneter Abschnitt ausgewählt und eine Oligonukleotid-Sonde chemisch synthetisiert werden, die die Sequenz dieses Abschnitts enthält. Mit einer solchen Sonde kann z.B. durch Hybridisierung aus einer genomischen Bibliothek des Hamsters das Ubiquitin/S27a-Gen bzw. dessen 5'-untranslatierte Region oder sonstige Fragmente kloniert werden. Mittels des oben beschrieben Reportergen-Assays ist der Fachmann in der Lage, ohne erheblichen Aufwand promotoraktive Fragmente zu identifizieren und im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Die 5'-untranslatierte Region bzw. spezielle Fragmente davon können auch leicht durch PCR-Amplifikation mit entsprechenden Primern aus genomischer DNA oder einer genomischen Bibliothek erhalten werden. Fragmente der 5'-untranslatierten Region können auch durch limitierten Exonuklease Ill-Verdau aus größeren DNA-Fragmenten erhalten werden. Solche DNA-Moleküle können auch chemisch synthetisiert oder aus chemisch synthetisierten Fragmenten durch Ligation erzeugt werden.
Deletions-, Insertions- und Substitutionsmutanten lassen sich mittels „ortsspezifischer Mutagenese" und/oder „PCR-basierten Mutagenese-Techniken" erzeugen. Entsprechende Methoden sind beispielhaft in Lottspeich und Zorbas (1998) (Kapitel 36.1), mit weiteren Verweisen, aufgeführt.
Es ist auch möglich über Kreuzhybridisierung mit Sonden aus dem 5'- untranslatierten Bereich des Hamster-Ubiquitin/S27a-Gens oder aus dem S27a- Anteil des Hamster-Ubiquitin/S27a-Gens geeignete Promotorsequenzen aus korrespondierenden homologen Genen anderer, bevorzugt Säugerspezies, zu identifizieren und zu isolieren. Entsprechende Techniken sind beispielhaft in Lottspeich und Zorbas (1998) (Kapitel 23) beschrieben. „Homolog" im Sinne der Erfindung sind Gene, sofern ihre Nukleotidsequenz mindestens 70%, besser mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 97% Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz des Gens zeigt, zu dem es homolog ist.
Gen von Interesse
Das im erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthaltene Gen von Interesse umfasst eine Nukleotidsequenz beliebiger Länge, die für ein Produkt von Interesse kodiert. Das Genprodukt oder auch „Produkt von Interesse" ist in der Regel ein Protein, Polypeptid, Peptid bzw. Fragment oder Derivat davon. Es kann aber auch RNA oder antisense RNA sein. Das Gen von Interesse kann in voller Länge, in verkürzter Form, als Fusionsgen oder markiertes Gen vorliegen. Es kann sich um genomische DNA oder vorzugsweise cDNA bzw. entsprechende Fragmente oder Fusionen handeln. Das Gen von Interesse kann die native Gensequenz darstellen, mutiert oder auf sonstige Weise modifiziert sein. Derartige Modifikationen schließen Codon-Optimierungen zur Anpassung an eine bestimmte Wirtszelle und eine Humanisierung ein. Das Gen von Interesse kann z.B. für ein sekretiertes, zytoplasmatisches, kernlokalisiertes, membrangebundenes oder zelloberflächen- gebundenes Polypeptid kodieren.
Der Ausdruck „Nukleotidsequenz" oder „Nukleinsäuresequenz" bezeichnet ein Oligonukleotid, Nukleotide, Polynukleotide und deren Fragmente sowie DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die als Einzel- oder Doppelstrang vorliegen und den kodierenden oder den nicht-kodierenden Strang eines Gens repräsentieren kann. Zur Modifikation von Nukleinsäuresequenzen können Standardtechniken, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder PCR-vermittelte Mutagenese ( z.B. in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1994 beschrieben), eingesetzt werden. Unter „kodieren" versteht man die Eigenschaft oder Fähigkeit einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure, beispielsweise einem Gen in einem Chromosom oder einer mRNA, als Matrize für die Synthese von anderen Polymeren und Makromolekülen wie z.B. rRNA, tRNA, mRNA, anderen RNA-Molekülen, cDNA oder Polypeptiden in einem biologischen Prozess zu dienen. Demnach kodiert ein Gen für ein Protein, wenn durch Transkription und nachfolgende Translation der mRNA das gewünschte Protein in einer Zelle oder einem anderen biologischen System produziert wird. Sowohl der kodierende Strang, dessen Nukleotidsequenz identisch mit der mRNA-Sequenz ist und normalerweise auch in Sequenzdatenbanken, z.B. EMBL oder GenBank, angegeben wird, als auch der als Matrize für die Transkription dienende nicht-kodierende Strang eines Gens oder cDNA kann dabei als kodierend für ein Produkt oder Protein bezeichnet werden. Eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, schließt auch Nukleinsäuren mit ein, die auf Grund des degenerierten genetischen Codes eine andere Nukleotidsequenzabfolge aufweisen, aber in der gleichen Aminosäuresequenz des Proteins resultieren. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, können auch Introns enthalten.
Mit dem Ausdruck „cDNA" werden Desoxyribonukleinsäuren bezeichnet, die durch reverse Transkription und Synthese des zweiten DNA-Strangs aus einer von einem Gen produzierten mRNA oder anderen RNA hergestellt werden. Liegt die cDNA als doppelstränges DNA-Molekül vor, dann enthält sie sowohl einen kodierenden als auch einen nicht-kodierenden Strang.
Mit dem Ausdruck „Intron" werden nicht-kodierende Nukleotidsequenzen beliebiger Länge bezeichnet. Sie kommen natürlicherweise in vielen eukyaryontischen Genen vor und werden von einem zuvor transkribierten mRNA-Vorläufer durch einen als Spleissen bezeichneten Prozess entfernt. Hierfür ist ein exaktes Herausschneiden des Introns am 5'- und 3'-Ende und eine korrekte Verbindung der entstehenden mRNA-Enden erforderlich, damit eine reife prozessierte mRNA mit dem für die erfolgreiche Proteinsynthese richtigen Leseraster hergestellt wird. Viele der an diesem Spleissing-Prozess beteiligten Spleiss-Donor- und Spleiss-Akzeptor-Stellen, das sind die unmittelbar an den Exon-Intron- bzw. Intron- Exon-Grenzen vorliegenden Sequenzen, sind mittlerweile charakterisiert worden. Für einen Überblick siehe Ohshima et al., 1987.
Protein von Interesse
Biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide umfassen z.B. Antikörper, Enzyme, Cytokine, Lymphokine, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt. Im allgemeinen sind alle Polypeptide bedeutsam, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können.
Der Ausdruck „Polypeptide" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttranslational durch Reaktionen wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder Proteinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertion von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden.
Beispiele für therapeutische Proteine sind Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon (hGH) und andere Wachstumsfaktoren, Gewebe- plasminogenaktivator (tPA), Erythropoetin (EPO), Cytokine, beispielsweise Interleukine (IL) wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon (IFN)-alpha, beta, gamma, omega oder tau, Tumornekrosefaktor (TNF) wie z.B. TNF-alpha, beta oder gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF. Weitere Beispiele sind monoklonale, polyklonale, multispezifische und einzelkettige (Single chain) Antikörper und Fragmente davon, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Fc und Fc'-Fragmente, leichte (L) und schwere (H) Immunglobulinketten und deren konstante, variable oder hypervariable Regionen sowie Fv- und Fd-Fragmente (Chamov et al., 1999). Die Antikörper können humanen oder nicht-humanen Ursprungs sein. Auch humanisierte und chimäre Antikörper kommen in Frage. Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonierung. Weitere Antikörperfragmente sind F(ab')2- Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.
Durch Genklonierung können auch verkürzte Antikörperfragmente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment variable = Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv-Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv- Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv- Antikörpem sind bekannt und beschrieben, siehe z.B. Huston et al. (1988).
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multimere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Multimerisierung der scFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die CH3-Region eines IgGs oder Helixstrukturen („coiled coil structure") wie die Leucin-Zipper-Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL- Regionen des scFv-Fragments für eine Multimerisierung genutzt (z.B. Dia-, Tri- und Pentabodies).
Als „Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv-Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10 Aminosäuren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VH/VL-Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur, z.B. bei Perisic et al. (1994).
Als „Minibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv-Derivat. Es besteht aus einem Fusionsprotein, das die CH3-Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt lgG1 , als Dimerisierungsregion enthält. Diese verbindet die scFv-Fragmente über eine Hinge-Region, ebenfalls von IgG, und eine Linker-Region. Beispiele solcher Minibodies sind bei Hu et al. (1996) beschrieben.
Mit „Triabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homotrimeres scFv-Derivat (Kortt et al., 1997). Die direkte Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren.
Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi-, tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv- Fragmenten. Die Multimersierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere „coiled coil"- Strukturen erzielt (Pack et al., 1993 und 1995; Lovejoy et al., 1993).
Gen. das für ein fluoreszierendes Protein kodiert
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor enthält ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen in funktioneller Verknüpfung mit dem Gen von Interesse und unter der Kontrolle des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors, eines modifizierten Hamster- Ubiquitin/S27a-Promotors oder eines Homologen hiervon.
Bei dem fluoreszierenden Protein kann es sich z.B. um ein grün, blaugrün, blau, gelb oder andersfarben fluoreszierendes Protein handeln. Ein spezielles Beispiel ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequorea victoria oder Renilla reniformis und daraus entwickelte Mutanten; siehe z.B. Bennet et al. (1998); Chalfie et al. (1994); WO 01/04306 und die dort zitierte Literatur. Weitere fluoreszierende Proteine und dafür kodierende Gene sind in WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 und WO 01/27150 beschrieben, die durch Bezugnahme hierin inkorporiert werden. Bei diesen fluoreszierenden Proteinen handelt es sich um Fluorophore von nicht-biolumineszierenden Organismen der Spezies Anthozoa, beispielsweise von Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. „red", Discosoma sp. "green", Discosoma sp. "Magenta", Anemonia sulcata.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzproteine beinhalten neben den Wildtyp-Proteinen auch natürliche oder gentechnologisch hergestellte Mutanten und -Varianten, deren Fragmente, Derivate oder z.B. mit anderen Proteinen oder Peptiden fusionierte Varianten. Die eingebrachten Mutationen können dabei beispielsweise das Exzitations- oder Emissionsspektrum, die Chromophorenbildung, den Extinktionskoeffizienten oder die Stabilität des Proteins verändern. Durch Codon-Optimierung kann zudem die Expression in Säugerzellen oder anderen Spezies verbessert werden. Erfindungsgemäß kann das fluoreszierende Protein auch in Fusion mit einem Selektionsmarker, bevorzugterweise mit einem amplifzierbaren Selektionsmarker wie beispielsweise der Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), eingesetzt werden.
Die von den fluoreszierenden Proteinen emittierte Fluoreszenz ermöglicht die Detektion der Proteine z.B. durch Durchflusszytometrie mit einem Fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) oder durch Fluoreszenzmikroskopie.
Weitere regulatorische Elemente
Der Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor kann zur Steigerung/Regulierung der Transkriptionsaktivität in einer Expressionskassette in funktioneilen Zusammenhang mit weiteren regulatorischen Sequenzen gebracht werden.
Beispielsweise kann der Promotor mit Enhancer-Sequenzen funktionell verknüpft werden, um die Transkriptionsaktivität zu steigern. Hierzu können ein oder mehrere Enhancer und/oder mehrere Kopien einer Enhancer-Sequenz verwendet werden, beispielsweise ein CMV- oder SV40-Enhancer.
Mit dem Ausdruck „Enhancer" wird eine Polynukleotidsequenz bezeichnet, die in cis- Lokalisierung auf die Aktivität eines Promotors einwirkt und so die Transkription eines mit diesem Promotor funktionell verknüpften Gens stimuliert. Im Gegensatz zu Promotoren ist die Wirkung der Enhancer positions- und orientierungsunabhängig und können somit vor oder hinter eine Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns oder selbst innerhalb der Kodierregion positioniert werden. Der Enhancer kann dabei sowohl in unmittelbarer Nähe der Transkriptionseinheit als auch in beträchtlichem Abstand zum Promotor lokalsiert sein. Auch eine physikalische und funktioneile Überlappung mit dem Promotor ist möglich. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Enhancem aus verschiedenen Quellen bekannt (und in Datenbanken wie GenBank hinterlegt, z.B. SV40 Enhancer, CMV Enhancer, Polyoma Enhancer, Adenovirus Enhancer) und als eigenständige oder innerhalb von Polynukleotidsequenzen klonierte Elemente verfügbar (z.B. bei ATCC hinterlegt oder aus kommerziellen und individuellen Quellen). Eine Vielzahl von Promotorsequenzen beinhalten auch Enhancersequenzen, wie z.B. der häufig verwendete CMV Promotor. Der humane CMV-Enhancer gehört dabei zu den stärksten bisher identifizierten Enhancem. Ein Beispiel für einen induzierbaren Enhancer ist der Metallothionein-Enhancer, der durch Glucocorticoide oder Schwermetalle stimuliert werden kann.
Eine weitere mögliche Modifikation ist z.B. die Einführung multipler Sp1- Bindungsstellen. Die Promotorsequenzen können ferner mit regulatorischen Se- quenzen kombiniert werden, die eine Steuerung/Regulierung der Transkriptionsaktivität gestatten. So kann der Promotor reprimierbar/induzierbar gemacht werden. Dies kann beispielsweise durch die Verknüpfung mit Sequenzen geschehen, die Bindungsstellen für positiv oder negativ regulierende Transkriptionsfaktoren darstellen. Der oben genannte Transkriptionsfaktor SP-1 beispielsweise hat einen positiven Einfluß auf die Transkriptionsaktivität. Ein weiteres Beispiel ist die Bindungsstelle für das Aktivatorprotein AP-1 , das sowohl in positiver als auch in negativer Weise auf die Transkription einwirken kann. Die Aktivität des AP-1 kann durch verschiedenste Faktoren, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Zytokine und Serum, gesteuert werden (Faisst et al., 1992, und Referenzen darin). Die Transkriptionseffizienz kann auch dadurch gesteigert werden, dass die Promotorsequenz durch Mutation (Substitution, Insertion oder Deletion) von einer, zwei, drei oder mehr Basen verändert wird und dann in einem Reportergen-Assay bestimmt wird, ob sich dadurch die Promotoraktivität erhöht.
Grundsätzlich umfassen die zusätzlichen regulatorischen Elemente andere Promotoren als den Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor, Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale und weitere Expressionskontrollelemente. Für die verschiedenen Zelltypen sind sowohl induzierbare als auch konstitutive regulatorische Sequenzen bekannt. „Transkriptionsregulatorische Elemente" umfassen gewöhnlich einen Promotor stromaufwärts von der zu exprimierenden Gensequenz, Transkriptionsinitiations- und -terminationsstellen sowie ein Polyadenylierungssignal.
Als „Promotor" wird eine Polynukleotidsequenz bezeichnet, die die Transkription der mit ihr funktionell verknüpften Gene oder Sequenzen ermöglicht und kontrolliert. Ein Promotor enthält Erkennungssequenzen für die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiationsstelle der Transkription (Transkriptionsinitiationsstelle). Zur Expression einer gewünschten Sequenz in einem bestimmten Zelltyp oder einer Wirtszelle muss jeweils ein geeigneter, funktionaler Promotor gewählt werden. Der Fachmann kennt eine Vielzahl von Promotoren aus verschiedenen Quellen, einschließlich konstitutiver, induzierbarer und reprimierbarer Promotoren. Sie sind in Datenbanken, z.B. GenBank, hinterlegt und können als eigenständige oder innerhalb von Polynukleotidsequenzen klonierte Elemente von kommerziellen oder individuellen Quellen bezogen werden. In induzierbaren Promotoren kann die Aktivät des Promotors in Reaktion auf ein Signal reduziert oder verstärkt werden. Ein Beispiel für einen induzierbaren Promotor stellt der Tetracyclin (tet)-Promotor dar. Dieser enthält Tetracyclin-Operatorsequenzen (tetO), die durch ein Tetracyclin-reguliertes Transaktivatorprotein (tTA) induziert werden können. In der Anwesenheit von Tetracyclin wird die Bindung von tTA an tetO inhibiert. Beispiele für weitere induzierbare Promotoren sind der jun-, fos-, Metallothionin- und Hitzeschockpromotor (siehe auch Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994). Unter den Promotoren, die für eine hohe Expression in Eukaryonten besonders gut geeignet sind, befinden sich der SV40 early Promotor, der Adenovirus major late Promotor, der Maus Metallothionin-I Promotor, die lange terminale Repeatregion des Rous Sarcoma Virus und der early Promotor des humanen Cytomegalie-Virus. Beispiele für andere heterologe Säugerpromotoren sind der/die Aktin-, Immunglobulin-, oder Hitzeschockpromotor(en).
Der Ausdruck „Transkriptionsinitiationsstelle" bezieht sich auf eine Nukleinsäure in dem Konstrukt, die der ersten Nukleinsäure entspricht, welche in das primäre Transkript, d.h. den mRNA-Precursor, inkorporiert wird. Die Transkriptions- initiationsstelle kann mit den Promotorsequenzen überlappen.
Der Ausdruck „Transkriptionsterminationsstelle" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die normalerweise am 3'-Ende des Gens von Interesse oder des zu transkribierenden Genabschnitts vorhanden ist und die den Abbruch der Transkription durch RNA-Polymerase bewirkt.
Das „Polyadenylierungssignal" ist eine Signalsequenz, welche die Spaltung an einer spezifischen Stelle am 3'-Ende der eukaryontischen mRNA und den posttranskrip- tionellen Einbau einer Sequenz von etwa 100-200 Adeninnukleotiden (polyA- Schwanz) am gespaltenen 3'-Ende verursacht. Das Polyadenylierungssignal umfasst die Sequenz AATAAA etwa 10-30 Nukleotide stromaufwärts von der Spaltstelle sowie eine stromabwärts gelegene Sequenz. Es sind verschiedene Poly- adenylierungselemente bekannt, z.B. tk polyA, SV40 late und early polyA oder BGH polyA (z.B. beschrieben in US 5,122,458).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verfügt jede Transkriptionseinheit über einen Promotor oder ein Promotor/Enhancer-Element, ein Gen von Interesse und/oder ein Markergen, sowie über ein Transkriptionterminationselement. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform enthält die Transkriptionseinheit weitere translationsregulatorische Einheiten. „Translationsregulatorische Elemente" umfassen eine Translationsinitiationsstelle (AUG), ein Stoppcodon und ein polyA-Signal für jedes zu exprimierende Polypeptid. Für eine optimale Expression kann es günstig sein, 5'- und/oder 3'-nichttranslatierte Bereiche der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz zu entfernen, hinzuzufügen oder zu ändern, um potentielle zusätzliche ungeeignete Translationsinitiationscodons oder andere Sequenzen, welche die Expression auf dem Niveau der Transkription oder Expression beeinträchtigen können, zu eliminieren. Um die Expression zu fördern, kann man alternativ ribosomale Konsensus-Bindungsstellen unmittelbar stromaufwärts vom Startcodon insertieren. Um ein sekretiertes Polypeptid zu produzieren, enthält das Gen von Interesse gewöhnlich eine Signalsequenz, welche für ein Signalvorläuferpeptid kodiert, die das synthetisierte Polypeptid zu und durch die ER-Membran transportiert. Die Signalsequenz befindet sich oft, jedoch nicht immer, am Aminoterminus des sekretierten Proteins und wird durch Signal- Peptidasen abgespalten, nachdem das Protein durch die ER-Membran geschleust wurde. Die Gensequenz wird gewöhnlich, jedoch nicht notwendigerweise, eine eigene Signalsequenz enthalten. Wenn die native Signalsequenz nicht vorhanden ist, kann in bekannter Weise eine heterologe Signalsequenz eingeführt werden. Dem Fachmann sind zahlreiche solcher Signalsequenzen bekannt und in Sequenzdatenbanken wie GenBank und EMBL hinterlegt.
Ein erfindungsgemäß besonderes bedeutsames regulatorisches Element ist die interne Ribosomenbindungsstelle (IRES). Das „IRES-Element" umfasst eine Sequenz, welche die Translationsinitiation unabhängig von einer 5'-terminalen Methylguanosiniumkappe (CAP-Struktur) sowie dem stromaufwärts gelegenen Gen funktionell bewerkstelligt und in einer tierischen Zelle die Translation zweier Cistrone (offener Leseraster) von einem einzigen Transkript ermöglicht. Das IRES-Element stellt eine unabhängige Ribosomenbindungsstelle für die Translation des unmittelbar stromabwärts gelegenen offenen Leserasters zur Verfügung. Im Gegensatz zu bakterieller mRNA, die multicistronisch sein kann, d.h. für mehrere verschiedene Polypeptide oder Produkte kodieren kann, die nacheinander von der mRNA translatiert werden, sind die meisten mRNAs von Tierzellen monocistronisch und kodieren nur für ein einziges Protein oder Produkt. Bei einem multicistronischen Transkript in einer eukaryontischen Zelle würde die Translation von der stromaufwärts am nächsten gelegenen Translationsinitiationsstelle initiiert und vom ersten Stoppcodon beendet werden, worauf das Transkript aus dem Ribosom freigesetzt würde. Bei der Translation entstünde somit nur das erste von der mRNA kodierte Polypeptid oder Produkt. Dagegen ermöglicht ein multicistronisches Transkript mit einem IRES-Element, das mit dem zweiten oder weiteren offenen Leserastern in dem Transkript funktionell verknüpft ist, die anschließende Translation des stromabwärts gelegenen offenen Leserasters, so dass in der eukaryontischen Zelle zwei oder mehr, von demselben Transkript kodierte Polypeptide oder Produkte produziert werden.
Das IRES-Element kann von verschiedener Länge und von verschiedenem Ursprung sein und z.B. vom Encephalomyocarditisvirus (EMCV) oder anderen Picornaviren stammen. In der Literatur sind verschiedene IRES-Sequenzen und deren Anwendung bei der Konstruktion von Vektoren beschrieben worden; siehe z.B. Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991 ; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996, Mosser et al., 1997.
Die stromabwärts gelegene Gensequenz ist mit dem 3'-Ende des IRES-Elements funktionell verknüpft, d.h. der Abstand wird so gewählt, dass die Expression des Gens nicht oder nur marginal beeinflusst wird bzw. eine für den Zweck ausreichende Expression aufweist. Der optimale und zulässige Abstand zwischen dem IRES- Element und dem Startcodon des stromabwärts gelegenen Gens für eine noch ausreichende Expression lässt sich in einfachen Versuchen durch Variation des Abstands und Bestimmung der Expressionsrate als Funktion des Abstandes mit Hilfe von Reportergen-Assays ermitteln.
Durch die geschilderten Maßnahmen kann eine optimierte Expressionskassette erhalten werden, die von hohem Nutzen für die Expression heterologer Genprodukte ist. Eine durch eine oder mehrere solcher Maßnahmen erhaltene Expressions- kassette ist daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Amplifizierbares Selektionsmarkergen
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Vektor enthält zusätzlich ein amplifizierbares Selektionsmarkergen, das eine Amplifikation des amplifizierbaren Markergens und vorzugsweise die Co-Amplifikation einer Transkriptionseinheit, bestehend aus dem Hamster-Ubiquitin/S27a-Gens, dem Gen von Interesse und dem Gen für das fluoreszierende Protein, ermöglicht. Hierzu werden die mit einem entsprechenden Expressionsvektor transfizierten Wirtszellen in Gegenwart eines geeigneten Selektionsmittels kultiviert, so dass sich nur solche Wirtszellen vermehren (lassen), die über mehrere Genkopien zumindest des amplifizierbaren Selktionsmarkergens verfügen. Vorzugsweise wird dies durch eine stufenweise Kultivierung der Zellen in Gegenwart steigender Mengen an Selektionsmittel erreicht.
Das amplifizierbare Selektionsmarkergen kodiert gewöhnlich für ein Enzym, das für das Wachstum von eukaryontischen Zellen unter bestimmten Kultivierungsbedingungen erforderlich ist. Beispielsweise kann das amplifizierbare Selektionsmarkergen für Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) kodieren. In diesem Fall wird das Gen amplifiziert, wenn man eine damit transfizierte Wirtszelle in Gegenwart des Selektionsmittels Methotrexat (MTX) kultiviert.
In der folgenden Tabelle 1 sind Beispiele für weitere erfindungsgemäß verwendbare amplifizierbare Selektionsmarkergene und die dazugehörigen Selektionsmittel angegeben, die in einem Überblick bei Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537- 566 (1990) beschrieben sind.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Als amplifizierbares Selektionsmarkergen wird erfindungsgemäß ein Gen bevorzugt, das für ein Polypeptid mit der Funktion von DHFR kodiert, z.B. für DHFR oder ein Fusionsprotein aus dem fluoreszierenden Protein und DHFR. DHFR ist für die Biosynthese von Purinen erforderlich. Zellen, denen das DHFR-Gen fehlt, können in Purin-defizientem Medium nicht wachsen. Das DHFR-Gen ist deshalb ein nützlicher Selektionsmarker zur Selektion und Amplifikation von Genen in Zellen, die in Purin- freiem Medium kultiviert werden. Das Selektionsmittel, das in Verbindung mit dem DHFR-Gen verwendet wird, ist Methotrexat (MTX). Die vorliegende Erfindung schließt deshalb eine Methode zur Herstellung von hochproduzierenden rekombinanten Wirtszellen ein, wobei sie folgende Schritte enthält: (i) Transfektion der Wirtszellen mit Genen, die zumindest für ein Protein von Interesse, ein fluoreszierendes Protein und DHFR kodieren, (ii) Kultivierung der Zellen unter Bedingungen, die eine Expression der verschiedenen Gene ermöglichen, und (iii) die Amplifikation dieser co-integrierten Gene durch Kultivierung der Zellen in Gegenwart eines Selektionsmittels, das die Amplifikation zumindest des amplifizierbaren selektionierbaren Markergens erlaubt, wie z.B. Methotrexat. Bevorzugt werden die transfizierten Zellen hierbei in Hypoxanthin/Thymidin-freiem Medium in der Abwesenheit von Serum und unter Zugabe steigender Konzentrationen an MTX kultiviert. Verzugsweise beträgt die Konzentration an MTX bei dem ersten Amplifikationsschritt zumindest 200 nM, in einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform zumindest 500 nM und kann stufenweise auf bis zu 1 /M gesteigert werden. Im Einzelfall können auch Konzentration von über 1μM verwendet werden.
Säugerzellen, vorzugsweise Mausmyeloma- und Hamsterzellen, sind bevorzugte Wirtszellen für den Einsatz von DHFR als amplifizierbaren Selektionsmarker. Besonders bevorzugt sind die Zelllinien CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) und CHO- DG44 (Urlaub et al., 1983), da sie bedingt durch Mutation keine eigene DHFR- Aktivität aufweisen. Um die DHFR-bedingte Amplifikation auch in anderen Zelltypen anwenden zu können, die über eine eigene endogene DHFR-Aktivität verfügen, kann bei der Transfektion ein mutiertes DHFR-Gen verwendet werden, das für ein Protein mit einer reduzierten Sensitivität gegenüber Methotrexat kodiert (Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982).
Herstellung erfindungsgemäßer Expressionsvektoren Die Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors kann grundsätzlich nach herkömmlichen, dem Fachmann geläufigen Methoden, wie z.B. bei Sambrock et al. (1989), beschrieben, erfolgen. Dort findet sich auch eine Beschreibung der funktionellen Komponenten eines Vektors, z.B. geeigneter Promotoren (zusätzlich zum Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor), Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale, Antibiotikaresistenzgene, Selektionsmarker, Replikations- startpunkte und Spleisssignale. Zur Herstellung können herkömmliche Klonierungs- vektoren verwendet werden, z.B. Plasmide, Bacteriophagen, Phagemide, Cosmide oder virale Vektoren wie Baculovirus, Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren und Herpes simplex-Virus, aber auch künstliche Chromosomen/Mini- Chromosomen. Die eukaryontischen Expressionsvektoren enthalten typischerweise auch prokaryontische Sequenzen wie z.B. Replikationsursprung und Antibiotikaresistenzgene, die die Vermehrung und Selektion des Vektors in Bakterien ermöglichen. Eine Vielzahl von eukaryontischen Expressionsvektoren, die multiple Klonierungsstellen zur Einführung einer Polynukleotidsequenz enthalten, sind bekannt und einige sind kommerziell bei verschiedenen Firmen wie Stratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, Wl, USA oder BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA erhältlich.
Auf eine dem Fachmann geläufige Weise werden der Hamster-Ubiquitin/S27a- Promotor, das Gen von Interesse, das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen, vorzugsweise auch das amplifizierbare Selektionsmarkergen, z.B. Dihydrofolat- Reduktase, sowie gegebenenfalls zusätzliche regulatorische Elemente wie die interne Ribosomenbindungsstelle (IRES), Enhancer oder ein Polyadenylierungssignal in den Expressionsvektor eingeführt. Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor enthält minimal einen Ubiquitin/S27a- Promotor, das Gen von Interesse, und das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen. Vorzugsweise enthält der Expressionsvektor noch ein amplifizierbares Selektionsmarkergen. Erfindungsgemäß ist hierbei auch die Verwendung modifizierter Ubiquitin/S27a-Promotoren, z.B. wie die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen modifizierten Ubiquitin/S27a-Promotoren. Besonders bevorzugt ist ein Expressionsvektor, bei dem der Ubiquitin-Promotor, das Gen von Interesse und das Gen, welches für ein fluoreszierendes Protein kodiert, funktionell miteinander verknüpft sind oder in funktioneller Verknüpfung stehen.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck „funktioneile Verknüpfung" bzw. „funktionell verknüpft" auf zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen oder -teilsequenzen, die so positioniert sind, dass sie ihre beabsichtigte Funktion ausüben können. Beispielsweise ist ein Promotor/Enhancer funktionell mit einer kodierenden Gensequenz funktionell verknüpft, wenn er in cis- Stellung die Transkription der verknüpften Gensequenz kontrollieren oder modulieren kann. Im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, befinden sich funktionell verknüpfte DNA-Sequenzen in enger Nachbarschaft und, sofern zwei kodierende Gensequenzen verknüpft werden oder im Falle einer Sekretionssignalsequenz, im gleichen Leseraster. Obwohl sich ein funktionell verknüpfter Promotor im Allgemeinen stromaufwärts von der kodierenden Gensequenz befindet, muss er nicht notwendigerweise eng benachbart sein. Enhancer müssen ebenfalls nicht in enger Nachbarschaft vorliegen, solange sie die Transkription der Gensequenz begünstigen. Zu diesem Zweck können sie sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts von der Gensequenz vorliegen, gegebenenfalls in einigem Abstand. Eine Polyadenylierungsstelle ist funktionell mit einer Gensequenz verknüpft, wenn sie am 3'-Ende der Gensequenz derart positioniert ist, dass die Transkription über die kodierende Sequenz bis hin zum Polyadenylierungssignal fortschreitet. Die Verknüpfung kann nach üblichen rekombinanten Methoden erfolgen, z.B. mittels der PCR-Technik, durch Ligation an geeigneten Restriktionsschnittstellen oder durch Spleissen. Wenn keine geeigneten Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, können in an sich bekannter Weise synthetische Oligonukleotid-Linker oder Adaptoren verwendet werden. Erfindungsgemäß erfolgt die funktioneile Verknüpfung vorzugsweise nicht über Intronsequenzen.
In einer der beschrieben Ausführungsformen sind Ubiquitin/S27a-Promotor bzw. eine modifizierte Form hiervon, das Gen von Interesse und das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen funktionell mit einander verknüpft. Dies meint z.B. das sowohl das Gen von Interesse als auch das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen ausgehend von dem selben Ubiquitin/S27a-Promotor bzw. einer modifizierten Form hiervon, exprimiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die funktioneile Verknüpfung über ein IRES-Element, so dass von beiden Genen eine bicistronische mRNA synthetisiert wird. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann zusätzlich Enhancer-Elemente enthalten, die funktionell auf einen oder mehrere Promotoren wirken. Besonders bevorzugt ist ein Expressionsvektor, bei dem der Ubiquitin/S27a-Promotor bzw. eine modifizierte Form hiervon mit einem Enhancer-Element, z.B. einen SV40-Enhancer oder einem CMV-Enhancer-Element verknüpft ist.
Grundsätzlich kann die Expression der Gene innerhalb eines Expressionsvektors von einer oder mehreren Transkriptionseinheiten aus erfolgen. Als „Transkriptionseinheit" wird dabei eine Region definiert, die ein oder mehr zu transkribierende Gene enthält. Dabei sind die Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit funktionell derart miteinander verknüpft, dass alle Gene innerhalb einer solchen Einheit unter der transkriptioneilen Kontrolle desselben Promotors oder Promotors/Enhancers stehen. Als Resultat dieser transkriptionellen Verknüpfung von Genen kann mehr als ein Protein oder Produkt von einer Transkriptionseinheit aus transkribiert und somit exprimiert werden. Jede Transkriptionseinheit enthält dabei die regulatorischen Elemente, die für die Transkription und die Translation der in ihr enthaltenen Gensequenzen erforderlich sind. Jede Transkriptionseinheit kann dabei die gleichen oder verschiedene regulatorische Elemente enthalten. Für die funktionelle Verknüpfung der Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit können IRES-Elemente oder Introns verwendet werden.
Der Expressionsvektor kann eine einzige Transkriptionseinheit zur Expression des Gens von Interesse, des Gens für das Fluoreszenzprotein und des amplifzierbaren Selektionsmarker enthalten. Alternativ können diese Gene auch in zwei oder mehr Transkriptionseinheiten angeordnet sein. Dabei sind verschiedene Kombinationen der Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit möglich. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann mehr als ein Expressionsvektor, bestehend aus ein, zwei oder mehr Transkriptionseinheiten, in eine Wirtszelle durch Co-Transfektion oder in aufeinanderfolgenden Transfektionen in beliebiger Reihenfolge eingeführt werden. Jede Kombination von regulatorischen Elementen und Genen auf jedem Vektor kann gewählt werden, so lange eine ausreichende Expression der Transkriptionseinheiten gewährleistet ist. Falls erforderlich können weitere regulatorische Elemente und Gene, wie z.B. zusätzliche Gene von Interesse oder Selektionsmarker, auf den Expressionsvektoren positioniert werden.
Demnach kann der erfindungsgemäße Expressionsvektor das Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und das amplifizierbare Selektionsmarkergen in einer oder in zwei separaten Transkriptionseinheiten enthalten. Jede Transkriptionseinheit kann ein oder mehrere Genprodukte transkribieren und exprimieren. Wenn beide Gene in einer Transkriptionseinheit enthalten sind, stehen sie unter der Kontrolle desselben Promotors oder Promotors/Enhancers, wobei vorzugsweise ein IRES-Element verwendet wird, um die funktioneile Verknüpfung aller Komponenten zu gewährleisten. Wenn das Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und das amplifizierbare Selektionsmarkergen in zwei separaten Transkriptionseinheiten enthalten sind, können sie unter der Kontrolle desselben oder verschiedener Promotoren/Enhancer stehen. Vorzugsweise verwendet man jedoch für das Selektionsmarkergen seinen natürlichen oder einen schwächeren heterologen Promotor, z.B. den SV40 early Promotor, und setzt vorzugsweise auch keinen Enhancer ein. Expressionsvektoren mit zwei separaten Transkriptionseinheiten sind im Rahmen der Erfindung bevorzugt. Hierbei enthält die eine (bicistronische) Transkriptionseinheit das Gen von Interesse und das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen, während die andere Transkriptionseinheit das amplifizierbare Selektionsmarkergen enthält. Vorzugsweise ist jede Transkriptionseinheit am 3'-Ende durch eine Sequenz begrenzt, die für ein polyA- Signal, vorzugsweise tk polyA, BGH polyA oder SV40 polyA kodiert.
Erfindungsgemäß sind auch solche Vektoren, die anstelle des Gens von Interesse lediglich eine multiple Klonierungsstelle aufweisen, die die Klonierung des Gens von Interesse über Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen ermöglicht. Im Stand der Technik sind zahlreiche Erkennungssequenzen für die verschiedensten Restriktionsendonukleasen, sowie die hierzu gehörigen Restriktionsendonukleasen bekannt. Bevorzugt werden Sequenzen verwendet, die aus zumindest 6 Nukleotiden als Erkennungssequenz bestehen. Eine Auflistung geeigneter Erkennungssequenzen finden sich beispielsweise in Sambrook et al. (1989).
Wirtszellen
Zur Transfektion mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor werden eukaryontische Wirtzellen verwendet, vorzugsweise Säugerzellen und insbesondere Nagerzellen wie z.B. Mäuse-, Ratten- und Hamster-Zelllinien. Die erfolgreiche Transfektion der entsprechender Zellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor resultiert in transformierten, genetisch modifizierten, rekombinanten oder transgenen Zellen, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Wirtszellen sind Hamsterzellen wie z.,B. BHK21 , BHK TK", CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 und CHO-DG44 Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Besonders bevorzugt sind CHO- DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NS0 und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien.
Beispiele für Hamster- und Mäusezellen, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.
Tabelle 2: Hamster- and Mäuse-Produktionszelllinien
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Die Transfektion der eukaryontischen Wirtszellen mit einem Polynukleotid oder einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektor erfolgt nach üblichen Methoden (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Geeignete Transfektionsmethoden sind z.B. die Liposomen-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Copräzipitation, Elektroporation, Polykationen (z.B. DEAE-Dextran)-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und virale Infektionen. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine stabile Transfektion durchgeführt, wobei die Konstrukte entweder in das Genom der Wirtszelle oder ein artifizielles Chromosom/Minichromosom integriert werden oder in stabiler Weise episomal in der Wirtszelle enthalten sind. Die Transfektionsmethode, die die optimale Transfektionsfrequenz und Expression des heterologen Gens in der jeweiligen Wirtszelle ermöglicht, ist dabei bevorzugt. Per Definition wird jede Sequenz oder jedes Gen, das in eine Wirtszelle eingebracht wird, in Bezug auf die Wirtszelle als „heterologe Sequenz" oder „heterologes Gen" bezeichnet. Selbst dann, wenn die einzubringende Sequenz oder das einzubringende Gen identisch zu einer endogenen Sequenz oder einem endogenen Gen der Wirtszelle ist. Beispielsweise ist ein Hamster-Aktingen, das in eine Hamster- Wirtszelle eingebracht wird, per Definition ein heterologes Gen.
Bei der rekombinanten Herstellung heterodimerer Proteine, wie z.B. monoklonaler Antikörper (mAk), kann die Transfektion geeigneter Wirtszellen prinzipiell auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Derartige mAk sind aus mehreren Untereinheiten, den schweren und leichten Ketten, aufgebaut. Für diese Untereinheiten kodierende Gene können in unabhängigen oder in multicistronischen Transkriptionseinheiten auf einem einzigen Plasmid untergebracht werden, mit dem dann die Wirtszelle transfiziert wird. Dies soll die stöchiometrische Repräsentanz der Gene nach Integration in das Genom der Wirtszelle sichern. Allerdings muss hierbei im Falle unabhängiger Transkriptionseinheiten sichergestellt werden, dass die mRNAs, die für die verschiedenen Proteine kodieren, die gleiche Stabilität, Transkriptions- und Translationseffizienz aufweisen. Im zweiten Fall erfolgt die Expression der Gene innerhalb einer multicistronischen Transkriptionseinheit durch einen einzigen Promotor und es entsteht nur ein Transkript. Durch Verwendung von IRES- Elementen wird eine recht effiziente interne Translationsinitiation der Gene in dem zweiten und den nachfolgenden Cistrons ermöglicht. Dennoch sind die Expressionsraten für diese Cistrons geringer als die des ersten Cistrons, dessen Translationsinitiation über einen sogenannten „cap"-abhängigen Prä- Initiationskomplex wesentlich effizienter ist als die IRES-abhängige Translationsinitiation. Um eine tatsächlich äquimolare Expression der Cistrons zu erreichen, können beispielsweise noch zusätzliche intercistronische Elemente eingeführt werden, die im Zusammenwirken mit den IRES-Elementen für einheitliche Expressionsraten sorgen (WO 94/05785).
Eine andere und erfindungsgemäß bevorzugte Möglichkeit der simultanen Herstellung mehrerer heterologer Proteine ist die Co-Transfektion, bei der die Gene getrennt in verschiedene Expressionsvektoren integriert werden. Dies hat den Vorteil, dass bestimmte Verhältnisse der Gene und Genprodukte zueinander eingestellt werden können, wodurch Unterschiede in der mRNA-Stabilität sowie in der Transkriptions- und Translationseffizienz ausgeglichen werden können. Außerdem sind die Expressionsvektoren wegen ihrer geringeren Größe stabiler und sowohl bei der Klonierung als auch bei der Transfektion einfacher handhabbar.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden daher die Wirtszellen zusätzlich mit einem oder mehreren Vektoren mit Genen, die für ein oder mehrere andere Proteine von Interesse kodieren, transfiziert, bevorzugt co-transfiziert. Der oder die zur Co-Transfektion verwendeten weiteren Vektoren kodieren z.B. für das oder die anderen Proteine von Interesse unter der Kontrolle der gleichen Promotor/Enhancer-Kombination sowie für zumindest einen weiteren Selektionsmarker, beispielsweise Neomycin-Phosphotransferase.
Erfindungsgemäß werden die Wirtszellen vorzugsweise unter serumfreien Bedingungen etabliert, adaptiert und kultiviert, gegebenenfalls in Medien, die frei von tierischen Proteinen/Peptiden sind. Beispiele für im Handel erhältliche Medien sind Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Ca., USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serumfreies CHO-Medium (Sigma) und proteinfreies CHO-Medium (Sigma). Jedes dieser Medien kann gegebenenfalls mit verschiedenen Verbindungen ergänzt werden, z.B. Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z.B. Insulin, Transferrin, epidermalem Wachstumsfaktor, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor), Salzen (z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium, Phosphat), Puffern (z.B. HEPES), Nukleosiden (z.B. Adenosin, Thymidin), Glutamin, Glukose oder anderen äquivalenten Nährstoffen, Antibiotika und/oder Spurenelementen. Obwohl erfindungsgemäß serumfreie Medien bevorzugt sind, können zur Züchtung der Wirtszellen auch Medien verwendet werden, die mit einer geeigneten Menge an Serum versetzt wurden. Zur Selektion von genetisch modifizierten Zellen, die ein oder mehrere Selektionsmarkergene exprimieren, wird dem Medium ein oder mehrere geeignete Selektionsmittel zugefügt.
Als „Selektionsmittel" wird eine Substanz bezeichnet, die das Wachstum oder das Überleben von Wirtszellen mit einer Defizienz für das jeweilige Selektionsmarkergen beeinträchtigt. Beispielsweise wird zur Selektion auf die Anwesenheit eines exprimierten Antibiotikaresistenzgens wie z.B. der Neomycin-Phosphotransferase das Antibiotikum Geneticin (G418) als Mediumzusatz verwendet. Das Selektionsmittel kann auch ein Stoff sein, der eine Amplifikation des Selektionsmarkergens auslöst, wenn es sich beim dem verwendeten Gen um einen amplifizierbaren Selektionsmarker handelt (siehe Tabelle 1). Methotrexat ist z.B. ein Selektionsmittel, das sich zur Amplifikation des DHFR-Gens eignet. Beispiele für andere amplifikationsauslösende Selektionsmittel sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Ein „Selektionsmarkergen" ist ein Gen, das die spezifische Selektion von Zellen, die dieses Gen erhalten, durch Zugabe eines entsprechenden Selektionsmittels in das Kultivierungsmedium ermöglicht. Zur Verdeutlichung, ein Antibiotika-Resistenzgen kann als positiver Selektionsmarker verwendet werden. Nur Zellen, die mit diesem Gen transformiert wurden, können in der Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums wachsen und somit selektioniert werden. Nichttransfomierte Zellen hingegen können unter diesen Selektionsbedingungen nicht wachsen oder überleben. Es gibt positive, negative und bifunktionale Selektionsmarker. Positive Selektionsmarker ermöglichen die Selektion und damit Anreicherung von transformierten Zellen durch Vermittlung einer Resistenz gegenüber dem Selektionsmittel oder durch Kompensierung eines metabolischen oder katabolischen Defekts der Wirtszelle. Im Gegensatz dazu können durch negative Selektionsmarker Zellen, die das Gen für den Selektionsmarker erhalten haben, selektiv eliminiert werden. Ein Beispiel hierfür ist das Thymidinkinasegen des Herpes Simplex Virus, dessen Expression in Zellen bei gleichzeitiger Gabe von Acyclovir oder Gancyclovir zu deren Elimination führt. Die in dieser Erfindung verwendeten Selektionsmarker, einschließlich der amplifzierbaren Selektionsmarker, schließt gentechnologisch veränderte Mutanten und Varianten, Fragmente, funktioneile Äquivalente, Derivate, Homologe und Fusionen mit anderen Proteinen oder Peptiden ein, solange der Selektionsmarker seine selektiven Eigenschaften beibehält. Solche Derivate weisen eine beträchtliche Homologie in der Aminosäuresequenz in den Bereichen oder Domänen auf, denen die selektive Eigenschaft zugeschrieben wird. In der Literatur sind eine Vielzahl von Selektionsmarkergenen, einschließlich bifunktionaler (positiv/negativ) Marker, beschrieben (siehe z.B. WO 92/08796 und WO 94/28143). Beispiele für Selektionsmarker, die für gewöhnlich in eukaryontischen Zellen verwendet werden, beinhalten die Gene für Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH), Hygromycin-Phosphotransferase (HYG), Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Thymidinkinase (TK), Glutamin-Synthetase, Asparagin-Synthetase und Gene, die Resistenz gegenüber Neomycin (G418), Puromycin, Histidinol D, Bleomycin, Phleomycin und Zeocin vermitteln.
Eine Selektion von transformierten Zellen ist auch durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) möglich. Hierzu werden beispielsweise bakterielle ß- Galaktosidase, Zelloberflächenmarker oder fluoreszierende Proteine (z.B. grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und dessen Varianten von Aequorea victoria und Renilla reniformis oder anderer Spezies, rote fluoreszierende Protein und in anderen Farben fluoreszierende Proteine und deren Varianten von nicht-biolumineszierenden Organismen wie z.B. Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.) zur Selektion von transformierten Zellen eingesetzt.
In der vorliegenden Erfindung wird für die Selektion von genetisch modifizierten (rekombinanten) Wirtszellen als amplifizierbares Selektionsmarkergen der Einsatz des DHFR-Gens bevorzugt. Dieser Marker ist bei der Verwendung von DHFR- negativen Grundzellen wie CHO-DG44 oder CHO-DUKX besonders gut zur Selektion und nachfolgenden Amplifikation geeignet, da diese Zellen kein endogenes DHFR exprimieren und somit nicht in Purin-freiem Medium wachsen. Deshalb kann hier das DHFR-Gen als dominanter Selektionsmarker eingesetzt werden und die transformierten Zellen werden in Hypoxanthin/Thymidin-freiem Medium selektioniert. Zur Erzielung einer DHFR-vermittelten Genamplifikation wird Methotrexat (MTX) eingesetzt. Die Wachstumseigenschaften werden maßgeblich durch die Zugabe von MTX beeinflusst. Hierbei ist üblicherweise eine wesentliche Verschlechterung der Fermentationsrobustheit der Zellen mit zunehmender MTX-Konzentration und Amplifikationsstufe zu beobachten. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass über das erfindungsgemäße Klonselektionssystem rekombinante Wirtszellen angereichert werden können, die ein erheblich robusteres Verhalten gegenüber hohen MTX-Konzentrationen zeigen (siehe Abb. 7). So konnten Wirtszellen, die mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zeilsortiergeräts (FACS) identifiziert und aussortiert wurden, in Gegenwart von 500 nM, vorzugsweise in Gegenwart von 1 //M MTX, kultiviert und amplifiziert werden, was zu einer deutlichen Steigerung der Produktivität führte. Somit gilt ein Verfahren zur Selektion von hochproduzierenden Wirtszellen als besonders erfindungsgemäß, bei dem Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfiziert werden und zumindest das Gen von Interesse, das fluoreszierende Protein und ein DHFR-Gen exprimieren, über FACS-Sortierung aussortiert werden, und zumindest einem Genamplifikationsschritt in Gegenwart von zumindest 500 nM, vorzugsweise 1 μM MTX unterzogen werden. Unter „Fermentationsrobustheit" versteht man hierbei Wachstumseigenschaften der Zellen wie z.B. das Einhalten bestimmter Wachstumsraten, Robustheit gegenüber „Upscaling" (größere Dimensionierung der Bioreaktoren) und Erreichen hoher Zellzahlen und Vitalitäten in der Stammhaltung, um den industriellen Passagierungsraten beim „Upscaling" gerecht zu werden.
Expression
Der Ausdruck „Expression" bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation einer heterologen Gensequenz in einer Wirtszelle. Die Expressionsrate kann hierbei allgemein bestimmt werden, entweder auf Basis der Menge der entsprechenden mRNA, die in der Wirtszelle vorhanden ist, oder auf Basis der produzierten Menge an
Genprodukt, das von dem Gen von Interesse kodiert wird. Die Menge der durch
Transkription einer ausgewählten Nukleotidsequenz erzeugten mRNA kann beispielsweise durch Northern Blot Hybridisierung, Ribonuklease-RNA-Protektion, in situ Hybridisierung von zellulärer RNA oder durch PCR-Methoden bestimmt werden
(Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Proteine, die von einer ausgewählten
Nukleotidsequenz kodiert werden, können ebenfalls durch verschiedene Methoden, wie z.B. durch ELISA, Western Blot, Radioimmunassay, Immunpräzipitation, Nachweis der biologischen Aktivität des Proteins oder durch Immunfärbung des
Proteins mit nachfolgender FACS-Analyse, bestimmt werden (Sambrook et al., 1989;
Ausubel et al., 1994).
Mit „hohem Expressionslevel (-rate)", „hoher Expression", „verstärkter Expression" oder „hoher Produktivität" wird die anhaltende und ausreichend hohe Expression oder Synthese einer in eine Wirtszelle eingebrachten heterologen Sequenz, beispielsweise eines für ein therapeutisches Protein kodierenden Gens, bezeichnet. Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt vor, wenn eine erfindungsgemäße Zelle nach einem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird, und wenn diese Zelle zumindest mehr als ungefähr 5 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (5 pg/Tag/Zelle). Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt auch dann vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle zumindest mehr als ungefähr 10 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (10 pg/Tag/Zelle). Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt insbesondere auch vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle zumindest mehr als ungefähr 15 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (15 pg/Tag/Zelle). Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt insbesondere dann vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle zumindest mehr als ungefähr 20 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (20 pg/Tag/Zelle). Eine besondes verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) besonders hohe(r) Expressionslevel (- rate) oder eine besonders hohe Produktivität liegt dann vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle zumindest mehr als ungefähr 30 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (30 pg/Tag/Zelle).
Eine hohe oder verstärkte Expression, eine hohe Produktivität oder ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) im Sinne der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene Weisen erzielt werden. Beispielsweise können durch die Co-Expression des Gens von Interesse mit einem Gen für einen amplifizierbaren Selektionsmarker Zellen selektioniert und identifiziert werden, die das heterologe Gen in hohem Maße exprimieren. Der amplifzierbare Selektionsmarker ermöglicht dabei nicht nur die Selektion von stabil transfizierten Wirtszellen sondern auch die Genamplifikation des heterologen Gens von Interesse. Die Integration der zusätzlichen Kopien der Nukleinsäuren kann dabei in das Genom der Wirtszellen, in zusätzliche artifizielle/Mini-Chromosomen oder in episomal lokalisierte Polynukleotide erfolgen. Diese Vorgehensweise kann mit einer durch FACS gestützten Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die als weiteren Selektionsmarker beispielsweise ein (oder mehrere) Fluoreszenzprotein(e) (z.B. GFP) oder einen Zelloberflächenmarker enthalten, kombiniert werden. Andere Methoden zur Erzielung einer verstärkten Expression, wobei auch eine Kombination verschiedener Methoden möglich ist, beruhen beispielsweise auf der Verwendung von (artifiziellen) Transkriptionsfaktoren, Behandlung der Zellen mit natürlichen oder synthetischen Agentien zur Hochregulation endogener oder heterologer Genexpression, Verbesserung der Stabilität (Halbwertszeit) der mRNA oder des Proteins, Verbesserung der mRNA- Translationsinitiation, Erhöhung der Gendosis durch Verwendung von episomalen Plasmiden (basierend auf der Verwendung von viralen Sequenzen als Replikationsursprung, z.B. von SV40, Polyoma, Adenovirus, EBV oder BPV), Einsatz von amplifikationsfördemden Sequenzen (Hemann et al., 1994) oder auf DNA- Konkatemeren basierenden in vitro Amplifikationssystemen (Monaco et al., 1996).
Erfindungsgemäß ist eine gekoppelte Transkription des Gens von Interesse und des Gens, das für das fluoreszierende Protein kodiert. Von der resultierenden bicistronischen mRNA werden sowohl das Protein von Interesse als auch das fluoreszierende Protein exprimiert. Aufgrund dieser Kopplung der Expression des Proteins von Interesse und des fluoreszierenden Proteins ist es erfindungsgemäß leicht möglich, hochproduzierende rekombinante Wirtszellen über das exprimierte fluoreszierende Protein zu selektionieren und zu isolieren, z.B. durch Sortieren mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zeilsortiergeräts (FACS).
Die Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die eine hohe Vitalität und eine erhöhte Expressionsrate des gewünschten Genprodukts zeigen, ist ein mehrstufiger Prozess. Die mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfizierten oder gegebenenfalls einem weiteren Vektor z.B. co-transfizierten Wirtszellen werden zumindest auf die Expression des mit dem Gen von Interesse gekoppelten Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, untersucht, um die Zellen/Zellpopulation zu identifizieren und zu selektionieren, die die höchsten Expressionsraten an fluoreszierendem Protein zeigen. Vorzugsweise werden nur die Zellen aussortiert und weiter kultiviert, die zu den 10% Zellen mit der höchsten Expressionsrate an fluoreszierendem Protein gehören. In der Praxis bedeutet dies, dass die hellsten 10% der fluoreszierenden Zellen heraussortiert und weiter kultiviert werden. Entsprechend können auch die hellsten 5%, vorzugsweise die hellsten 3%, oder auch nur die hellsten 1% der fluoreszierenden Zellen eines Zellgemisches heraussortiert und vermehrt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden lediglich die hellsten 0.5% bzw. die hellsten 0,1% der fluoreszierenden Zellen heraussortiert und vermehrt. Hierzu kultiviert man die zuvor mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierten Zellen in einem Selektionsmedium, das gegebenenfalls auch ein für den amplifizierbaren Selektionsmarker spezifisches Selektionsmittel enthält. Dabei können schrittweise erhöhte Konzentrationen an Selektionsmittel verwendet werden, um einen stufenweise erhöhten Selektionsdruck auszuüben.
Der Selektionsschritt kann an Zellpools oder mit bereits vorsortierten Zellpools/ Zellklonen durchgeführt werden. Es können ein oder mehrere, vorzugsweise zwei oder mehr und insbesondere drei oder mehr Sortierungsschritte durchgeführt werden, wobei zwischen den einzelnen Sortierungsschritten die Zellen über einen bestimmten Zeitraum, z.B. etwa zwei Wochen bei Pools, kultiviert und vermehrt werden.
Gegebenenfalls kann man die Wirtszellen einem oder mehreren Genamplifikations- schritten unterziehen, um die Kopienzahl zumindest des Gens von Interesse und des amplifizierbaren selektionierbaren Markgens zu erhöhen. Verfahren zur stufenweise Genamplifikation mit Hilfe von Methotrexat sind beispielhaft in US 5,179,017 beschrieben. Erfindungsgemäß ist die erzielbare hohe Produktivität nicht an eine erhöhte Anzahl von Genkopien gebunden. Sie ist vielmehr Ausdruck einer erhöhten Stabilität und Fermentationsrobustheit der Hochleistungsklone. Es ist daher möglich, die Anzahl der erforderlichen Genamplifikationsschritte zu reduzieren und z.B. nur eine einzige Genamplifikation durchzuführen.
Demnach ist ein Verfahren zur Selektion von Zellen erfindungsgemäß, das folgende Schritte enthält: i) Transformation geeigneter Wirtszellen zumindest mit einem der erfindungsgemäßen Vektoren, wobei die DNA der Expressionsvektoren vorzugsweise stabil in das Wirtszellgenom oder in artifizielle Chromosomen/Minichromosomen eingebaut wird; ii) die transformierten Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des Gens von Interesse und des fluoreszierenden Proteins erlauben; iii) die Zellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, so- dass nur solche Zellen vermehrt werden, die in Gegenwart des besagten Selektionsmittel wachsen können; iv)das Aussortieren von Zellen aus einem Zellgemisch, die die höchste Expressions- rate an fluoreszierendem Protein zeigen, wobei die Zellen mit Hilfe eines Fluores- zenz-aktivierten Zeilsortiergeräts (FACS) detektiert und sortiert werden; v) die Kultivierung der aussortierten Zellen mit den höchsten Expressionsraten für das fluoreszierende Protein.
Optional können die Schritte ii) - v) mit den nach Schritt v) gewonnenen Zellen einfach oder mehrfach wiederholt werden. Ferner können die transformierten Zellen optional auch zusätzlich einem oder mehreren Genamplifikationsscfiritten unterzogen werden, in dem sie in Gegenwart eines Selektionsmittels kultiviert werden, dass zu einer Amplifikation des amplifizierbaren selektierbaren Markergens führt. Dieser Schritt kann sowohl mit noch nicht sortierten Zellen als auch mit bereits einfach oder mehrfach vorsortierten Zellen erfolgen.
Weiterhin erfindungsgemäß ist ein Verfahren, bei dem entsprechend aussortierte Zellen vermehrt werden und zur Herstellung des kodierenden Genprodukt von Interesse verwendet wird. Hierzu werden die selektionierten hoch-produzierenden Zellen vorzugsweise in einem serumfreien Kulturmedium und vorzugsweise in Suspensionskultur unter Bedingungen gezüchtet, die eine Expression des Gens von Interesse erlauben. Das Protein von Interesse wird dabei vorzugsweise als sekretiertes Genprodukt aus dem Zellkulturmedium gewonnen. Bei Expression des Proteins ohne Sekretionssignal kann das Genprodukt aber auch aus Zelllysaten isoliert werden. Um ein reines, homogenes Produkt zu erhalten, das im Wesentlichen frei ist von anderen rekombinanten Proteinen und Wirtszellproteinen, werden übliche Reinigungsschritte durchgeführt. Hierzu entfernt man häufig zunächst Zellen und Zelltrümmer aus dem Kulturmedium oder Lysat. Das gewünschte Genprodukt kann dann von kontaminierenden löslichen Proteinen, Polypeptiden und Nukleinsäuren befreit werden, z.B. durch Fraktionierung an Immunaffinitäts- und lonenaustauschsäulen, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC oder Chromatographie an Sephadex, Silica oder Kationenaustauscherharzen wie DEAE. Methoden, die zur Aufreinigung eines von rekombinanten Wirtszellen exprimierten heterologen Proteins führen, sind dem Fachmann bekannt und sind in der Literatur beschrieben, z.B. bei Harris et al. (1995) und Scopes (1988).
Im folgenden wird die Erfindung anhand nicht-beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert.
BEISPIELE
Abkürzungen
AP: alkalische Phosphatase bp: Basenpaar
CHO: Chinese hamster ovary
DHFR: Dihydrofolat-Reduktase
ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay
FACS: fluorescence-activated cell sorter
FAP: Fibroblasten-aktiviertes Protein
GFP: grünes fluoreszierendes Protein
HBSS: Hanks Balanced Salt Solution
HT: Hypoxanthin/Thymidin
HRPO: horseradish peroxidase
IRES: infernal ribosomal entry site kb: Kilobase mAk: monoklonaler Antikörper
MTX: Methotrexat
PCR: polymerase chain reaction sICAM: soluble intracellular adhesion molecule
Methoden
1. Zellkultur und Transfektion
Die Zellen CHO-DG44/DHFR-/- (Urlaub et al., 1983) wurden permanent als Suspensionzellen in serum-freiem und mit Hypoxanthin und Thymidin supplementiertem CHO-S-SFMII Medium (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) in Zellkulturflaschen bei 37°C in feuchter Atmosphäre und 5% C02 kultiviert. Die Zellzahlen sowie die Viabilität wurden mit einem CASY1 Cell Counter (Schaerfe System, DE) oder durch Trypanblau-Färbung bestimmt und die Zellen dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert.
Zur Transfektion von CHO-DG44 wurde Lipofectamine Plus Reagenz (Invitrogen GmbH) eingesetzt. Pro Transfektionsansatz wurden dabei insgesamt 1 μg Plasmid- DNA, 4 μL Lipofectamine und 6 μL Plus-Reagenz nach den Angaben des Herstellers gemischt und in einem Volumen von 200 μL zu 6 x105 exponentiell wachsenden CHO-DG44 Zellen in 0,8 mL HT-supplementiertem CHO-S-SFMII Medium gegeben. Nach dreistündiger Inkubation bei 37°C in einem Zellinkubator erfolgte eine Zugabe von 2 mL HT-supplementiertem CHO-S-SFMII Medium. Zur DHFR-basierten Selektion von stabil transfizierten CHO-DG44 wurden die Zellen 2 Tage nach Transfektion in CHO-S-SFMII Medium ohne Hypoxanthin- und Thymidinzusatz transferiert, wobei das Medium alle 3 bis 4 Tage gewechselt wurde. Bei einer DHFR- und Neomycin-Phosphotransferase-basierten Selektion im Falle einer Co- Transfektion, in der der eine Expressionsvektor einen DHFR- und der andere Expressionsvektor einen Neomycin-Phosphotransferase-Selektionsmarker enthielt, wurde dem Medium außerdem noch G418 (Invitrogen) in einer Konzentration von 400μg/mL zugesetzt.
Eine DHFR-basierte Genamplifikation der integrierten heterologen Gene wurde durch Zugabe des Selektionsmittels MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) in einer Konzentration von 5 - 2000 nM zum HT-freien CHO-S-SFMII Medium erreicht.
2. Expressionsvektoren Zur Expressionsanalyse wurden eukaryontische Expressionsvektoren eingesetzt, die auf dem pAD-CMV Vektor (Werner et al., 1998) basieren und die konstitutive Expression eines heterologen Gens über die Kombination CMV Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotor (WO 97/15664) vermitteln. Während der Basisvektor pBID das DHFR-Minigen enthält, das als amplifizierbarer Selektionsmarker dient (siehe z.B. EP 0 393 438), ist im Vektor pBIN das DHFR-Minigen durch ein Neomycin- resistenzgen ersetzt worden (Abb.2). Hierzu wurde der Selektionsmarker Neomycin- Phosphotransferase, inklusive SV40 early Promotor und TK-Polyadenylierungs- signal, aus dem kommerziellen Plasmid pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, USA) als 1640 bp Bsu36l-Fragment isoliert. Nach einer Auffüllreaktion der Fragmentenden durch Klenow-DNA-Polymerase wurde das Fragment mit dem 3750 bp Bsu36l/Stul- Fragment des Vektors pBID, das ebenfalls mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt wurde, ligiert. Im bicistronischen Basisvektor pBIDG (Abb.2) wurde die IRES-GFP-Genregion aus dem Vektor plRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, USA) isoliert und in einer Weise unter die Kontrolle des CMV Enhancer/Promotors im Vektor pBID gebracht, dass die multiple Klonierungsstelle zwischen Promotorregion und IRES-Element erhalten blieb. Dabei wurde wie folgt vorgegangen. In einer PCR-Mutagenese, wobei das Plasmid plRES2-EGFP als Template diente, wurde zum einen die Hindlll- Schnittstelle AAGCTT innerhalb der IRES-Sequenz durch den Einsatz mutagener Primer in die Sequenzabfolge ATGCTT umgewandelt und somit entfernt. Zum anderen wurde mittels eines Primers mit Komplementarität zum 5'Ende der IRES- Sequenz eine Xbal-Schnittstelle und bzw. mit Komplementarität zum 3'Ende der GFP-Sequenz eine Spel-Schnittstelle eingeführt. Das resultierende PCR-Fragment, das die komplette IRES- und GFP-Sequenz umfasste, wurde mit Xbal und Spei verdaut und in die singuläre Xbal-Schnittstelle am 3 'Ende der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pBID kloniert.
Das humane sICAM-Gen wurde als Hindlll/Sall Fragment aus pAD-sICAM (Werner et al., 1998) isoliert und in die entsprechenden Schnittstellen des Vektors pBIDG kloniert, wobei der Vektor pBIDG-sICAM resultierte (Abb.3).
Zur Expression des monoklonalen humanisierten F19 Antikörpers wurde die schwere Kette als 1 ,5 kb Nael/Hindlll-Fragment aus dem Plasmid pG1D105F19HC (NAGENESEQ: AAZ32786) isoliert und in den mit EcoRI (mit Klenow-DNA- Polymerase aufgefüllt) und Hindlll-verdauten Vektor pBIDG kloniert, wobei der Vektor pBIDG-F19HC resultierte (Abb.3). Die leichte Kette hingegen wurde als 1 ,3 kb Hindlll/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pKN100F19LC (NAGENESEQ: AAZ32784) isoliert und in die entsprechenden Schnittstellen des Vektors pBIN kloniert, wodurch der Vektor pBIN-F19LC entstand (Abb.3). 3. FACS
Die flowcytometrischen Analysen und Sorting wurden mit einem Coulter Epics Altra- Gerät durchgeführt. Das FACS ist mit einem Helium-Argon-Laser mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm ausgestattet. Die Fluoreszenzintensität wird bei einer dem Fluoreszenzprotein adäquaten Wellenlänge aufgenommen und mittels der angeschlossenen Software Coulter Expo32 prozessiert. Das Sorting wurde mit einer Rate von 8000 - 10000 Events/Sekunde duchgeführt. Die suspendierten Zellen wurden abzentrifugiert (5 min bei 180xg) und in HBSS auf eine Zellkonzentration von 1 - 1 ,5 x107/mL eingestellt. Anschließend erfolgte ein Sorting der Zellen entsprechend ihres Fluoreszenzprotein-Signals. Die Zellen wurden in Röhrchen mit vorgelegtem Kultivierungsmedium aufgenommen, abzentrifugiert und abhängig von der aussortierten Zellzahl in entsprechende Kultivierungsgefäße eingesät.
4. ELISA Die sICAM-Titer in Überständen von stabil transfizierten CHO-DG44 Zellen wurden mittels ELISA nach Standardprotokollen quantifiziert (Ausubel et al., 1994, updated), wobei zwei im Haus entwickelte sICAM-spezifische mAk verwendet wurden (z.B. in US 5,284,931 und US 5,475,091 beschrieben). Bei einem der beiden Antikörper handelt es sich dabei um einen HRPO-konjugierten Antikörper. Als Standard wurde gereinigtes sICAM-Protein eingesetzt.
Die Quantifizierung des F19 mAks in den Überständen von stabil transfizierten CHO- DG44 Zellen erfolgte mittels ELISA nach Standardprotokollen (Ausubel et al., 1994, updated), wobei zum einen ein Ziege anti-Human IgG Fc-Fragment (Dianova, Hamburg, DE) und zum anderen ein AP-konjugierter Ziege anti Human Kappa light chain Antikörper (Sigma) eingesetzt wurde. Als Standard diente gereinigter F19 Antikörper. Produktivitäten (pg/Zelle/Tag) wurden dabei mit der Formel pg/((Ct-Co) t / In (Ct-Co)) berechnet, wobei Co und Ct die Zellzahl bei Aussaat bzw. Ernte und t die Kultivierungsdauer angibt. Beispiel 1 : Vergleich der CMV- und der Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotoraktivität
Um die Aktivität des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors mit der des häufig in eukaryontischen Expressionsvektoren verwendeten CMV-Promotors zu vergleichen, wurden CHO-DG44 Zellen mit diversen rekombinanten Vektoren transfiziert. Das heterologe Genprodukt, zum einen ein lysosomales Enzym, zum anderen ein lgG1- Antikörper, wurde dabei entweder unter der Kontrolle des CMV-Promotors oder unter der des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors exprimiert. Beide Promotoren waren dabei funktionell mit dem CMV-Enhancer verknüpft. Als Terminationssignal für das heterologe Gen wurde das BGH polyA verwendet. Die Expressionsvektoren, die den CMV-Promotor beinhalteten, basierten dabei entweder auf einem modifizierten pcDNA3- („CMV1", Invitrogen) oder pBluescript-Vektor (,,CMV2",Stratagene) und kodierten zusätzlich für den amplifizierbaren Selektionsmarker Dihydrofolat- Reduktase. Der Expressionsvektor mit dem Hamster-Promotor basiert hingegen auf dem pAD-CVM Vektor (Werner et al., 1998). Zur Expression der schweren und leichten Kette des Antikörpers wurde eine Co-Transfektion mit einem zweiten Vektor durchgeführt, der als Selektionsmarker ein Neomycin-Resistenzgen enthielt. Der CMV-Enhancer kann aber auch durch den SV40-Enhancer ersetzt werden.
Durch limitierte Verdünnung in 96Well-Platten wurden nach der Transfektion Zellklone in HT-freiem Medium (im Falle der Co-Transfektion noch Zusatz von 400 μg/mL G418) selektioniert und isoliert. Zellklone mit der höchsten Produktivität hinsichtlich des rekombinanten Proteins wurden einer stufenweisen DHFR-basierten Genamplifikation durch schrittweise Erhöhung der Methotrexat-Konzentration von 5 nM über 50 nM, 500 nM auf 2 μM unterzogen, jeweils verbunden mit einer Verdünnungsklonierung. Auf jeder Amplifikationsstufe wurden dabei ca. 20 bis 30 Klone mit der jeweils höchsten Produktivität ausgewählt.
Generell erwies sich der Hamster-Promotor als leistungsstärker. Sowohl bei der Expression des lysosomalen Enzyms als auch bei der Expression des Antikörpers wurden Produktivitäten bzw. Titer erzielt, die um den Faktor 2 bis 5 höher lagen als bei den Zellen, in denen das heterologe Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert wurde. In Abbildung 1 sind beispielhaft die relativen Titer und relativen spezifischen Produktivitäten der jeweils besten Zellklone auf der jeweiligen Amplifikationsstufe dargestellt, wobei die auf den CMV-Promotor basierte Expression für das jeweilige heterologe Gen als 1 gesetzt wurde (CMV1 für das lysosomale Enzym, CMV2 für den Antikörper).
Beispiel 2: Isolierung von hochexprimierenden sICAM-Zellen durch GFP-basiertes FACS-Sorting
Die lösliche Form des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM1 , sICAM, ist ein mögliches Therapeutikum bei Erkältungen, da es mit dem ICAM-Rezeptor um die Bindung von Rhinoviren kompetiert und auf diese Weise deren Interaktion mit dem ICAM-Rezeptor, Voraussetzung für den Eintritt in die Zellen und die nachfolgende Infektion (Bella et al., 1999; Marlin et al., 1990), reduzieren oder sogar verhindern kann. sICAM wurde als Beispiel für die Expression eines einzelkettigen Proteins (480 Aminosäuren) in CHO-Zellen gewählt. Dazu wurden CHO-DG44 mit pBIDG-sICAM transfiziert (Abb.3). Die zusätzliche Expression von GFP in pBIDG-sICAM transfizierten Zellen ermöglichte die Anwendung einer FACS-basierten Selektionsstrategie. Das therapeutische Protein sICAM und GFP wurden dabei gemeinsam von einer bicistronischen und das DHFR von einer separaten Transkriptionseinheit exprimiert. Zwei bis drei Wochen nach der ersten Selektion in HT-freiem CHO-S-SFMII Medium wurden die 5% der Zellen mit der höchsten GFP- Fluoreszenz heraussortiert. Nach ca. zweiwöchiger Kultivierung wurden wiederum die 5% Zellen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz isoliert. Insgesamt wurde diese sequentielle Sortierung sechsmal durchgeführt. Dabei konnte eine gute Korrelation zwischen sICAM-Produktivität und GFP-Fluoreszenz gezeigt werden (Abb. 4). Allein durch die FACS-gestützte Selektion, ohne jeglichen MTX-Amplifikationsschritt, wurden so in kürzester Zeit Zellpools mit hohen spezifischen Produktivitäten von bis zu 16 pg/Zelle/Tag isoliert (Abb. 5). Durch Kombination der GFP-basierten Selektion mit einem einzigen nachfolgenden MTX-Amplifikationsschritt war sogar eine Steigerung der Produktivität auf über 30 pg/Zelle/Tag möglich (Abb. 6). Diese Produktivitäten wurden sowohl bei einer Amplifikation eines Pools nach dem vierten Sorting mit 500 nM MTX als auch bei der Amplifikation eines Pools nach dem sechsten Sorting mit 2 μM MTX erreicht. Im Gegensatz zu einer stufenweise Amplifikation, bei der in der Regel mit sehr geringen MTX-Konzentrationen im Bereich von 5 - 20 nM MTX begonnen wird, musste hier zur Erzielung eines Amplifikationseffekts eine von Anfang an höhere MTX- Konzentration eingesetzt werden. So resultierte aus der Zugabe von 5 oder 50 nM MTX zu Zellen aus dem vierten Sorting beziehungsweise 500 nM zu Zellen aus dem sechsten Sorting keine signifikante Steigerung der Produktivität (Abb. 6). Offensichtlich war der in den Ausgangspools vorliegende Level an DHFR schon so hoch, dass nur mit einer hohen MTX-Dosis eine komplette DHFR-Inhibierung erzielt werden konnte. Außerdem überstanden die vorsortierten Zellpools trotz der hohen initialen MTX-Dosis die Selektionsphase viel besser, d.h. es wurde in kürzerer Zeit wieder eine Zellpopulation mit hoher Vitalität erhalten als bei der konventionellen stufenweisen Genamplifikationsstrategie (Abb. 7).
Beispiel 3: Isolierung von Zellen mit hoher Expression des mAks F19 durch GFP- basiertes FACS-Sorting
In einer Co-Transfektion wurden CHO-DG44 Zellen mit der Plasmidkombination pBIDG-F19HC und pBIN-F19LC transfiziert (Abb.3). Der exprimierte humanisierte Antikörper F19 ist dabei gegen das Oberflächenmolekül FAP gerichtet, das von reaktiven Stroma-Fibroblasten synthetisiert wird (siehe dazu auch Patent EP 0 953 639). In den eingesetzten Vektorkonfigurationen werden die beiden Proteinketten des Antikörpers jeweils von einem eigenen Vektor, der zusätzlich noch für einen DHFR- bzw. Neomycin-Phosphotransferase-Selektionsmarker in einer separaten Transkriptionseinheit kodiert, exprimiert. Zusätzlich ist im Vektor pBIDG- F19HC ein weiterer Selektionsmarker, das GFP, enthalten. Durch die transkriptionelle Verknüpfung der Expression des GFPs und der schweren Kette mittels eines IRES-Elements konnten bei der Co-Transfektion von CHO-DG44 mit den Vektoren pBIDG-F19HC/pBIN-F19LC in kurzer Zeit Zellen mit einer hohen Expression des Antikörpers F19 allein dadurch isoliert werden, dass mittels sequentiellem FACS-Sorting die Zellen mit einem hohen GFP-Gehalt selektioniert wurden. Hierzu wurden nach einer ersten zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools in HT-freiem CHO-S-SFMII Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418 die 5% der Zellen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz durch FACS heraussortiert. Dieses Sorting wurde insgesamt bis zu sechsmal durchgeführt, wobei zwischen jedem Sorting eine Kultivierungsperiode von ca. 2 Wochen lag. Erstaunlicherweise konnte dabei eine gute Korrelation zwischen F19-Produktivität und GFP-Fluoreszenz gezeigt werden (Abb. 8), obwohl beide Proteinketten jeweils von einem eigenen Vektor aus exprimiert wurden und beim GFP-basierten FACS- Sorting zudem auch nur auf die Expression der schweren Kette, bedingt durch deren transkriptionelle Kopplung mit GFP, selektioniert werden konnte. Die Produktivitäten konnten auf bis zu 10 pg/Zelle/Tag gesteigert (Abb. 9) und durch einen einzigen nachfolgenden MTX-Amplifikationsschritt, ausgehend von dem Zellpool aus dem fünften Sorting, durch Zugabe von 1000 nM MTX zum Selektionsmedium noch auf durchschnittlich 37 pg/Zelle/Tag erhöht werden. Vergleichbare Daten konnten auch bei einer funktionellen Verknüpfung des Hamster-Promotors mit dem SV40-Enhancer anstelle des CMV-Enhancers erzielt werden. Gleichzeitig konnte dadurch auch die Entwicklungszeit zur Selektion von hoch-produzierenden Zellen im Vergleich zu einer konventionellen stufenweisen Genamplifikationsstrategie, die in der Regel 4 Stufen umfasst, um die Hälfte auf ca. 120 Tage reduziert werden, einhergehend mit einer signifikanten Reduktion der Entwicklungskapazitäten und -kosten.
LITERATUR
Adam, M.A. et al., J Wro/1991, 65, 4985 - 4990
Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in molecular biology. New York : Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. 1994 (updated)
Bella, J. et al., J. Struct. Biol. 1999, 128, 69 - 74
Bennett, R.P. et al., BioTechniques 1998, 24, 478 - 482
Chalfie, M. et al., Science 1994, 263, 802 - 805
Chamov, S.M. et al., Antibody Fusion Proteins, Wiley-Liss Inc., 1999 Davies, M.V. et al., J l//ro/1992, 66, 1924 - 1932
Faisst, S. et al., Nucleic Acids Research 1992, 20, 3 - 26
Gossen, M. et al., Curr Opi Biotech 1994, 5, 516 - 520
Gubin, A.N. et al., Biochem Biophys RΘS Commun 1997, 236, 347 - 350 Haber, D.A. et al., Somatic Cell Genetics 1982, 8, 499 - 508
Harris et al., Protein Purification : A Practical Approach, Pickwood and Harnes, eds., IRL Press, 1995
Hemann, C. et al., DNA Cell Biol 1994, 13 (4), 437 - 445 Huston, C. et al., Proc Natl Acad Sei USA 1988, 85 (16), 5879 - 5883
Hu, S. et al., CancerRes. 1996, 56 (13), 3055 - 3061
Jang, S.K. et al., J Virol 1989, 63, 1651 - 1660
Kaufman, R.J. et al., J Mol Biol 1982, 159, 601 - 621
Kaufman, R.J., Methode in Enzymology 1990, 185, 537 - 566 Kortt, A.A. et al., Protein Engineering 1997, 10 (4), 423 - 433
Levenson, VN. et al., Human Gene Therapy 1998, 9, 1233 - 1236
Lottspeich F. and Zorbas H. eds., Bioanalytic, Spektrum Akad. Verl., 1998
Lovejoy, B. et al., Science 1993, 259, 1288 - 1293
Marlin, S.D. et al., Nature 1990, 344, 70 - 77 Meng, Y.G. et al., Gene 2000, 242, 201 - 207
Monaco, L. et al., Gene 1996, 180, 145 - 150
Morgan, R.A. et al., NucleicAcids Research 1992, 20, 1293 - 1299
Mosser, D.D. et al., BioTechniques 1997, 22, 150 - 161
Νolan, G.P. et al., Proc Natl Acad Sei USA 1988, 85, 2603 - 2607 Ohshima, Y. et al., J Mol Biol 1987, 195, 247 - 259
Pack, P. et al., Biotechnology 1993, 11 , 1271 - 1277
Pack, P. et al., J Mol Biol 1995, 246 (11 ), 28 - 34
Pelletier, J. et al., Nature 1988, 334, 320 - 325
Perisic, O. et al., Structure 1994, 2, 1217 - 1226 Primig, M. et al., Gene 1998, 215, 181 - 189
Ramesh, Ν. et al., NucleicAcids Research 1996, 24, 2697 - 2700
Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989
Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, 1988 Simonson, C.C. et al., Proc Natl Acad Sei USA 1983, 80, 2495 - 2499
Sugimoto et al., Biotechnology 1994, 12, 694 - 698
Urlaub, G. et al., Ce// 1983, 33, 405 - 412 Werner, R.G. et al., Arzneim.-Forsch./Drug.Res. 1998, 48, 870 - 880 Wigler, M. et al., Proc Natl Acad Sei USA 1980, 77, 3567 - 3570

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Expressionsvektor umfassend ein Gen, das für ein Protein von Interesse kodiert, in funktioneller Verknüpfung mit einem Hamster-Ubiquitin/S27a- Promotor und einem Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert.
2. Expressionsvektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass er ein amplifizierbares Selektionsmarkergen enthält.
3. Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er einen oder mehrere Enhancer in funktioneller Verknüpfung mit dem oder den Promotoren umfasst.
4. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich eine interne Ribosomenbindungsstelle
(IRES) enthält, welche die bicistronische Expression des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des Gens, das für ein Protein/Produkt von Interesse kodiert, ermöglicht.
5. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und das amplifizierbare Selektionsmarkergen in einer oder in zwei separaten Transkriptionseinheiten befinden.
6. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die funktioneile Verknüpfung nicht über Intronsequenzen erfolgt.
7. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- zeichnet, dass das amplifizierbare Selektionsmarkergen für Dihydrofolat-
Reduktase (DHFR) oder ein Fusionsprotein aus dem fluoreszierenden Protein und DHFR kodiert.
8. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Enhancer ein CMV- oder SV40-Enhancer ist.
9. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn- zeichnet, dass er zusätzlich zumindest ein Polyadenylierungssignal aufweist.
10. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er anstelle des Gens, das für ein Protein/Produkt von Interesse kodiert, eine multiple Klonierungsstelle zum Einbau eines Gens, das für ein Protein von Interesse kodiert, umfasst.
1 1. Eukaryontische Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transfiziert worden ist.
12. Wirtszelle nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Säugerzelle, vorzugsweise eine CHO-Zelle, handelt.
13. Wirtszelle nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mit einem oder mehreren Vektoren mit Genen, die für ein oder mehrere andere Proteine/Produkte von Interesse sowie zumindest einen weiteren Selektionsmarker kodieren, transfiziert worden ist.
14. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Genprodukts, bei dem eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13 unter Bedingungen, die eine Expression des Genprodukts ermöglichen, kultiviert und das Genprodukt aus der Kultur oder dem Kulturmedium isoliert wird.
15. Verfahren zur Herstellung eines heteromeren Proteins/Produkts, bei dem eine Wirtszelle nach Anspruch 13, die mit Expressionsvektoren, welche für unterschiedliche Untereinheiten des heteromeren Proteins/Produkts kodieren, co-transfiziert worden ist, unter Bedingungen, die eine Expression des heteromeren Proteins/Produkts ermöglichen, kultiviert und das heteromere Protein/Produkt aus der Kultur oder dem Kulturmedium isoliert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das heteromere Protein ein Antikörper ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle einem oder mehreren Genamplifikationsschritten unterzogen wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der amplifizierbare Selektionsmarker DHFR und das Amplifikationsmittel
Methotrexat ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle lediglich einem Genamplifikationsschritt mit Methotrexat unterzogen wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem serumfreien Kulturmedium durchgeführt wird.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle in Suspensionskultur kultiviert wird.
22. Verfahren zur Selektion einer Wirtszelle, die ein Protein/Produkt von Interesse exprimiert, bei dem eine Population von Wirtszellen nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13 unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Expression des Proteins/Produkts von Interesse und des fluoreszierenden Proteins ermöglichen, und die Zelle(n) identifiziert und/oder selektiert werden, welche den höchsten Expressionslevel an fluoreszierendem Protein zeigen.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zeilsortiergeräts (FACS) erfolgt.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die entsprechend selektierten Wirtszellen einem oder mehreren zusätzlichen Genamplifikationsschritten unterzogen werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der amplifizierbare Selektionsmarker DHFR und das Amplifikationsmittel Methotrexat ist.
PCT/EP2003/013225 2002-11-29 2003-11-25 Expressionsvektor, verfahren zur herstellung von heterologen genprodukten und selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante zellen WO2004050879A1 (de)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03767642A EP1567648A1 (de) 2002-11-29 2003-11-25 Expressionsvektor, verfahren zur herstellung von heterologen genprodukten und selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante zellen
BR0316510-8A BR0316510A (pt) 2002-11-29 2003-11-25 Vetor de expressão, processo para a preparação de produtos gênicos heterólogos e processo de seleção para células recombinantes de alta produção
NZ540950A NZ540950A (en) 2002-11-29 2003-11-25 Expression vector, methods for the production of heterologous gene products, and selection method for high-producing recombinant cells
AU2003292102A AU2003292102A1 (en) 2002-11-29 2003-11-25 Expression vector, methods for the production of heterologous gene products, and selection method for high-producing recombinant cells
MXPA05005482A MXPA05005482A (es) 2002-11-29 2003-11-25 Vector de expresion, procedimiento para la preparacion de productos genicos heterologos y procedimiento de seleccion para celulas recombinantes de alta produccion.
CA002507714A CA2507714A1 (en) 2002-11-29 2003-11-25 Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
JP2004556182A JP2006507829A (ja) 2002-11-29 2003-11-25 発現ベクター、異種遺伝子生成物の製造方法およびこのような生成物を高濃度で製造する組換え細胞の選別方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10256083A DE10256083A1 (de) 2002-11-29 2002-11-29 Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen
DE10256083.8 2002-11-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004050879A1 true WO2004050879A1 (de) 2004-06-17

Family

ID=32403676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2003/013225 WO2004050879A1 (de) 2002-11-29 2003-11-25 Expressionsvektor, verfahren zur herstellung von heterologen genprodukten und selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante zellen

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1567648A1 (de)
JP (1) JP2006507829A (de)
KR (1) KR100820035B1 (de)
CN (1) CN1717486A (de)
AR (1) AR042244A1 (de)
AU (1) AU2003292102A1 (de)
BR (1) BR0316510A (de)
CA (1) CA2507714A1 (de)
DE (1) DE10256083A1 (de)
MX (1) MXPA05005482A (de)
TW (1) TWI321152B (de)
WO (1) WO2004050879A1 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008012142A1 (de) * 2006-07-26 2008-01-31 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Regulatorische nukleinsäureelemente
WO2009080720A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Novartis Ag Mammalian expression vector
WO2013061010A1 (fr) * 2011-10-28 2013-05-02 Lfb Biotechnologies Unites de transcription et leur utilisation dans des vecteurs d'expression
WO2020227206A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-12 Amgen Inc. Vectors and expression systems for producing recombinant proteins

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5801207B2 (ja) 2009-02-27 2015-10-28 ノバルティス アーゲー ２種類の選択マーカーを含む発現ベクター系
KR101239495B1 (ko) * 2011-01-21 2013-03-05 경상대학교산학협력단 αΑ-크리스탈린 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 및 이를 이용한 망막혈관 질환의 유전자 치료
TWI545196B (zh) 2011-05-25 2016-08-11 國立大學法人岡山大學 Ｒｅｉｃ表現腺病毒載體
LT3412684T (lt) 2013-07-31 2022-07-11 Novartis Ag Nauji atrankos vektoriai ir eukariotinių ląstelių šeimininkių atrankos metodai
CN104404072B (zh) * 2014-11-24 2018-04-27 浙江大学 用标记基因预测外源基因表达量及筛选转基因家蚕的方法
CN106442685B (zh) * 2016-10-25 2019-03-26 山东大学 一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法
SG11202013191TA (en) * 2018-07-13 2021-01-28 Lonza Ag Methods for improving production of biological products by reducing the level of endogenous protein

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5122458A (en) 1984-08-24 1992-06-16 The Upjohn Company Use of a bgh gdna polyadenylation signal in expression of non-bgh polypeptides in higher eukaryotic cells
WO1997015664A1 (de) 1995-10-24 1997-05-01 Dr. Karl Thomae Gmbh Starker homologer promotor aus hamster
WO1998032869A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
WO2001004306A1 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 Genentech, Inc. Expression vectors and methods

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) * 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5491084A (en) * 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
AU694745B2 (en) * 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
EP1258255A1 (de) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Konjugate eines Antikörpers zu CD44 und eines Maytansinoids

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5122458A (en) 1984-08-24 1992-06-16 The Upjohn Company Use of a bgh gdna polyadenylation signal in expression of non-bgh polypeptides in higher eukaryotic cells
WO1997015664A1 (de) 1995-10-24 1997-05-01 Dr. Karl Thomae Gmbh Starker homologer promotor aus hamster
WO1998032869A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
WO2001004306A1 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 Genentech, Inc. Expression vectors and methods

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAILEY CHARLES G ET AL: "High-throughput clonal selection of recombinant CHO cells using a dominant selectable and amplifiable metallothionein-GFP fusion protein.", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 80, no. 6, 20 December 2002 (2002-12-20), pages 670 - 676, XP002273807, ISSN: 0006-3592 *
BENNETT R P ET AL: "Fusion of green fluorescent protein with the Zeocin-resistance marker allows visual screening and drug selection of transfected eukaryotic cells", BIOTECHNIQUES, EATON PUBLISHING, NATICK, US, vol. 24, no. 3, March 1998 (1998-03-01), pages 478 - 482, XP002114401, ISSN: 0736-6205 *
KIM NO SOO ET AL: "Key determinants in the occurrence of clonal variation in humanized antibody expression of CHO cells during dihydrofolate reductase mediated gene amplification", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 17, no. 1, January 2001 (2001-01-01), pages 69 - 75, XP002273808, ISSN: 8756-7938 *
LIU XUEDONG ET AL: "Generation of mammalian cells stably expressing multiple genes at predetermined levels", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA, US, vol. 280, no. 1, 10 April 2000 (2000-04-10), pages 20 - 28, XP002187203, ISSN: 0003-2697 *
MENG G ET AL: "GREEN FLUORESCENT PROTEIN AS A SECOND SELECTABLE MARKER FOR SELECTION OF HIGH PRODUCING CLONES FROM TRANSFECTED CHO CELLS", GENE: AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES AND GENOMES, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, BARKING, GB, vol. 242, no. 1/2, January 2000 (2000-01-01), pages 201 - 207, XP004196520, ISSN: 0378-1119 *
MOSSER D D ET AL: "USE OF A DICISTRONIC EXPRESSION CASSETTE ENCODING THE GREEN FLUORESCENT PROTEIN FOR THE SCREENING AND SELECTION OF CELLS EXPRESSING INDUCIBLE GENE PRODUCTS", BIOTECHNIQUES, EATON PUBLISHING, NATICK, US, vol. 22, no. 1, January 1997 (1997-01-01), pages 150 - 152,154,156,158-161, XP000919498, ISSN: 0736-6205 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101485853B1 (ko) 2006-07-26 2015-01-23 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게 조절 핵산 요소
US9708626B2 (en) 2006-07-26 2017-07-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Regulatory nucleic acid elements
EA016880B1 (ru) * 2006-07-26 2012-08-30 Бёрингер Ингельхайм Фарма Гмбх Унд Ко. Кг Элементы нуклеиновых кислот, обладающие регуляторной функцией
WO2008012142A1 (de) * 2006-07-26 2008-01-31 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Regulatorische nukleinsäureelemente
US9045776B2 (en) 2006-07-26 2015-06-02 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Regulatory nucleic acid elements
EP3075858A1 (de) * 2007-12-21 2016-10-05 Novartis Ag Säuger-expressionsvektor
RU2494147C2 (ru) * 2007-12-21 2013-09-27 Новартис Аг Вектор экспрессии млекопитающих
US9422574B2 (en) 2007-12-21 2016-08-23 Novartis Ag Mammalian expression vector
WO2009080720A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Novartis Ag Mammalian expression vector
EP3680337A1 (de) * 2007-12-21 2020-07-15 Novartis AG Säuger-expressionsvektor
USRE49347E1 (en) 2007-12-21 2022-12-27 Novartis Ag Mammalian expression vector
FR2981946A1 (fr) * 2011-10-28 2013-05-03 Lfb Biotechnologies Unites de transcription et leur utilisation dans des vecteurs d'expression (yb2/0)
WO2013061010A1 (fr) * 2011-10-28 2013-05-02 Lfb Biotechnologies Unites de transcription et leur utilisation dans des vecteurs d'expression
US9551009B2 (en) 2011-10-28 2017-01-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Transcription unit and use thereof in expression vectors
WO2020227206A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-12 Amgen Inc. Vectors and expression systems for producing recombinant proteins

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006507829A (ja) 2006-03-09
BR0316510A (pt) 2005-10-04
AR042244A1 (es) 2005-06-15
KR20050085203A (ko) 2005-08-29
EP1567648A1 (de) 2005-08-31
CN1717486A (zh) 2006-01-04
TW200502388A (en) 2005-01-16
MXPA05005482A (es) 2005-07-25
CA2507714A1 (en) 2004-06-17
KR100820035B1 (ko) 2008-04-10
AU2003292102A1 (en) 2004-06-23
TWI321152B (en) 2010-03-01
DE10256083A1 (de) 2004-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1567652B1 (de) Neue neomycin-phosphotransferase-gene und verfahren zur selektion von hochproduzierenden rekombinanten zellen
EP2049671B1 (de) Regulatorische nukleinsäureelemente
US8975391B2 (en) Regulatory elements
EP1658365B1 (de) Verfahren zur reklonierung von produktionszellen
US20090162900A1 (en) Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such of such products
WO2004050879A1 (de) Expressionsvektor, verfahren zur herstellung von heterologen genprodukten und selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante zellen
DE10330686A1 (de) Neue Neomycin-Phosphotransferase-Gene und Verfahren zur Selektion von Hochproduzierenden rekombinanten Zellen
NZ540950A (en) Expression vector, methods for the production of heterologous gene products, and selection method for high-producing recombinant cells

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003767642

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2151/DELNP/2005

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: PA/a/2005/005482

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 168807

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2507714

Country of ref document: CA

Ref document number: 1020057009693

Country of ref document: KR

Ref document number: 2004556182

Country of ref document: JP

Ref document number: 20038A44261

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003292102

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 540950

Country of ref document: NZ

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020057009693

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003767642

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0316510

Country of ref document: BR