CN116528899A - 抗EphA4抗体 - Google Patents

抗EphA4抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN116528899A
CN116528899A CN202180081671.3A CN202180081671A CN116528899A CN 116528899 A CN116528899 A CN 116528899A CN 202180081671 A CN202180081671 A CN 202180081671A CN 116528899 A CN116528899 A CN 116528899A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
epha
heavy chain
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180081671.3A
Other languages
English (en)
Inventor
川胜智生
山田章夫
中谷亚季
井上英二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai Co Ltd
Original Assignee
Eisai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai Co Ltd filed Critical Eisai Co Ltd
Publication of CN116528899A publication Critical patent/CN116528899A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Abstract

提供了能够与EphA4结合并增强EphA4的切割的抗EphA4抗体以及包含该抗体作为活性成分的药物组合物。该抗EphA4抗体包含如下重链和如下轻链，该重链包含SEQ ID NO：30的重链CDR1；SEQ ID NO：31的重链CDR2；和SEQ ID NO：32的重链CDR3；并且该轻链包含SEQ ID NO：33的轻链CDR1；SEQ ID NO：34的轻链CDR2；和SEQ ID NO：35的轻链CDR3；或者该重链包含SEQ ID NO：42的重链CDR1；SEQ ID NO：31的重链CDR2；和SEQ ID NO：43的重链CDR3；并且该轻链包含SEQ ID NO：44的轻链CDR1；SEQ ID NO：34的轻链CDR2；和SEQ ID NO：35的轻链CDR3。

Description

抗EphA4抗体
[技术领域]
本披露涉及与EphA4结合的抗体、编码该抗体的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的细胞、用于产生该抗体的方法、以及包含该抗体的药物组合物。
[背景技术]
EphA4是受体酪氨酸激酶家族成员。已知肝配蛋白A型和肝配蛋白B型为EphA4的配体。EphA4与其配体肝配蛋白结合而诱导去粘附(de-adhesion)信号。先前已提出，EphA4参与阿尔茨海默病(以下也称为“AD”)的病理学病症(非专利文献1-4)。据报告，EphA4与肝配蛋白之间的结合的抑制可帮助改善淀粉样蛋白β(Aβ)(1-42)低聚物介导的神经传递功能障碍(专利文献1)。在AD中，由过度磷酸化τ蛋白(tau)形成的聚集体(神经原纤维缠结)被认为参与神经细胞死亡(非专利文献5)。还报告了，抑制τ蛋白磷酸化抑制突触丧失的神经退行(非专利文献6和非专利文献7)，并改善记忆缺陷或认知功能障碍(非专利文献8-11)。有报告提出，CDK5的活化为引起τ蛋白磷酸化的原因(非专利文献12和非专利文献13)。
EphA4在海马体和大脑皮质上高度表达，并以神经活性依赖性方式被基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM(去整合素和金属蛋白酶)和γ分泌酶切割。已知EphA4的这种切割反应稳定作为神经功能重要结构的树突棘(spine)(非专利文献14)。已报告，AD的树突棘密度降低(非专利文献15)。此外，还确认了在NFT V级和VI级的AD中EphA4切割片段的数目减少，表明EphA4的切割反应参与AD病理学病症(非专利文献16)。已知作为AD临床症状的认知功能障碍与树突棘密度降低有关(非专利文献15和非专利文献17)。此外，还报告了，在阿尔茨海默病模型中树突棘的稳定化(树突棘密度增加)改善了认知功能(非专利文献18)，表明树突棘的稳定化具有治疗AD的潜力。
KYL肽、化合物1等已知为现有的EphA4抑制剂(专利文献2、非专利文献19和非专利文献20)。然而，还没有关于具有增强EphA4切割活性的抗体的报告。
[引证文献清单]
[专利文献]
[专利文献1]WO 2016/019280 A1
[专利文献2]WO 2012/156351 A1
[非专利文献]
[非专利文献1]Vargas LM et al.，，PLoS One.2014 Mar 21；9(3)
[非专利文献2]Fu AK et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2014 Jul 8；111(27)：9959-64
[非专利文献3]Rosenberger AF et al.，Acta Neuropathol Commun.2014 Jul16；2：79
[非专利文献4]Huang TY et al.，J Exp Med.2017 Dec 4；214(12)：3669-3685.
[非专利文献5]SantaCruz et al.，Science.2005 Jul 15；309(5733)：476-81
[非专利文献6]Seo J et al.，J Neurosci.2017 Oct 11；37(41)：9917-9924
[非专利文献7]Patrick GN et al.，Nature.1999 Dec 9；402(6762)：615-22.
[非专利文献8]Onishi T et al.，J Neurochem.2011 Dec；119(6)：1330-40
[非专利文献9]Belfiore R et al.，Aging Cell.2019 Feb；18(1)：e12873.
[非专利文献10]Webster SJ et al.，Front Genet.2014 Apr 23；5：88.
[非专利文献11]Grayson B et al.，Behav Brain Res.2015 May 15；285：176-93.
[非专利文献12]Cancino GI et al.，Neurobiol Aging.2011 Jul；32(7)：1249-61.
[非专利文献13]Vargas LM et al.，Biochim Biophys Acta Mol BasisDis.2018 Apr；1864：1148-1159.
[非专利文献14]Inoue E et al.，J Cell Biol.2009 May 4；185(3)：551-64
[非专利文献15]Boros et al.，Ann Neurol.2017 Oct；82(4)：602-614
[非专利文献16]Matsui C et al.，Brain Pathol.2012 Nov；22(6)：776-87.doi：10.1111/j.1750-3639
[非专利文献17]Akrama A et al.，Neurobiol Aging.2008 Sep；29(9)：1296-1307
[非专利文献18]Suzuki K et al.，Science.2020 Aug 28；369(6507)：eabb4853
[非专利文献19]Goldshmit et al.，PLoS one.2011；6(9)：e24636
[非专利文献20]Van Hoecke et al.，Nature Medicine.2012 Sep；18(9)：1418-22，2012
[发明内容]
[技术问题]
本披露的目的是提供能够与EphA4结合并增强EphA4的切割的抗EphA4抗体以及包含该抗体作为活性成分的药物组合物。
[问题的解决方案]
本发明诸位发明人为了达到该目的，经过深入研究，最终完成了能够与EphA4结合并增强EphA4的切割的目的抗EphA4抗体。
(1)一种抗EphA4抗体，其包含如下重链和如下轻链，
该重链包含：
(a)由SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(b)由SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和
(c)由SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且
该轻链包含：
(d)由SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(e)由SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和
(f)由SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；或者
该重链包含：
(g)由SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(h)由SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和
(i)由SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且
该轻链包含：
(j)由SEQ ID NO：44中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(k)由SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和
(1)由SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
(2)如(1)所述的抗EphA4抗体，其中
该抗EphA4抗体为人类抗体。
(3)如(1)或(2)所述的抗EphA4抗体，其中
该抗EphA4抗体与EphA4特异性结合并增强EphA4的切割。
(4)如(1)至(3)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该抗EphA4抗体与EphA4特异性结合并抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合。
(5)如(1)至(4)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链包含由SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列组成的可变区，并且
该轻链包含由SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成的可变区。
(6)如(1)至(5)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区和该轻链的恒定区各自包含源自人类抗体的氨基酸序列。
(7)如(6)所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区为人IgG的恒定区。
(8)如(7)所述的抗EphA4抗体，其中
该人IgG的恒定区为人IgG2的恒定区。
(9)如(8)所述的抗EphA4抗体，其中
该人IgG2的恒定区包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列。
(10)如(1)至(4)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链包含由SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列组成的可变区，并且
该轻链包含由SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列组成的可变区。
(11)如(1)至(4)和(10)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区和该轻链的恒定区各自包含源自人类抗体的氨基酸序列。
(12)如(11)所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区为人IgG的恒定区。
(13)如(12)所述的抗EphA4抗体，其中
该人IgG的恒定区为由人IgG1与人IgG2的组合组成的人IgG的恒定区。
(14)如(13)所述的抗EphA4抗体，其中
该由人IgG1与人IgG2的组合组成的人IgG的恒定区包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。
(15)如(6)至(9)和(11)至(14)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该轻链的恒定区为人Igλ的恒定区。
(16)如(15)所述的抗EphA4抗体，其中
该人Igλ的恒定区包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。
(17)一种抗EphA4抗体，其包含
如下重链和如下轻链，其中
该重链包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，
该轻链包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并且
该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。
(18)如(17)所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的C末端赖氨酸缺失。
(19)一种抗EphA4抗体，其包含
如下重链和如下轻链，其中
该重链包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，
该轻链包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并且
该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。
(20)如(19)所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的C末端赖氨酸缺失。
(21)一种分离核酸，其编码如(1)至(20)中任一项所述的抗EphA4抗体。
(22)一种载体，其包含如(21)所述的核酸。
(23)一种宿主细胞，其包含如(22)所述的载体。
(24)一种用于产生抗EphA4抗体的方法，其包括培养如(23)所述的宿主细胞的步骤。
(25)一种药物组合物，其包含如(1)至(20)中任一项所述的抗EphA4抗体。
(26)如(25)所述的药物组合物，其进一步包含至少一种药学上可接受的载剂。
[本发明的有益效果]
本披露提供了能够与EphA4结合并增强EphA4的切割的抗EphA4抗体、编码该抗体的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的细胞、用于产生该抗体的方法、以及包含该抗体作为活性成分的药物组合物。
[附图说明]
[图1]图1表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)对人EphA4的结合亲和力。
[图2]图2表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)的人EphA4-人配体结合抑制活性。
[图3]图3表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)对每种人Eph受体的选择性。
[图4]图4表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)与小鼠、大鼠、猴或人EphA4的反应性。
[图5]图5表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)与人EphA4胞外结构域(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤维粘连蛋白III型结构域1(FN1)和纤维粘连蛋白III型结构域2(FN2)的反应性。
[图6]图6表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)在海马神经元中的EphA4切割增强活性。
[图7]图7表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)在海马神经元中的EphA4切割增强活性。
[图8]图8表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A和B)对海马神经元的树突棘数的增加作用。
[具体实施方式]
由本说明书中使用的SEQ ID NO定义或编码的区域如下：
本披露涉及与EphA4结合的抗EphA4抗体。
根据本披露的抗EphA4抗体是能够识别EphA4并与其结合的抗体。如下所述，该抗体可以是完整抗体或可以是合成抗体(例如重组抗体、嵌合抗体和人源化抗体)，只要具有与EphA4的结合亲和力。在本说明书中，EphA4可理解为源自人类、小鼠、大鼠或猴的EphA4。源自人类、小鼠、大鼠或猴的EphA4可获得自登记有序列信息的公共数据库，如国家生物技术信息中心(美国)所提供的GenBank。可替代地，可通过基于密切相关的动物物种的EphA4的碱基序列信息设计引物，并且然后从所需动物物中提取的RNA进行克隆来获得EphA4基因的序列信息。例如，人类、小鼠、大鼠或猴的EphA4的碱基序列信息分别以GenBank登录号NM_004438.5、NM_007936.3、NM_001162411.1和NM_001260870.1登记在数据库中。
在一方面，抗EphA4抗体是与EphA4特异性结合的抗体。术语“特异性结合”是本领域技术人员熟知的术语，并且用于确定抗体或其抗原结合片段与抗原或表位的特异性结合的方法也是众所周知的。在一个实施例中，“特异性结合”可理解为意指与其他靶分子的结合相比，抗EphA4抗体能够以更大的结合亲和力和结合活性，更迅速和/或持续更长时间地通过免疫学反应与EphA4结合。这并不意指与EphA4特异性结合的抗体不与另一种靶分子结合。在另一实施例中，“特异性结合”可由具有至少大约10-7M、或至少大约10-8M、或至少大约10-9M、或更低的针对EphA4的Kd的抗体指示。在另外的替代性实施例中，“特异性结合”可理解为通过免疫学反应与EphA4结合，但基本上不与Eph受体的其他家族成员分子结合。
在一方面，抗EphA4抗体是与EphA4的胞外结构域结合的抗体。在一个实施例中，抗EphA4抗体是与EphA4的胞外结构域中的配体结合结构域(LBD)结合的抗体。
在一个实施例中，抗EphA4抗体可以与EphA4特异性结合并增强EphA4的切割。在特定的实施例中，抗EphA4抗体可以与EphA4特异性结合并通过基质金属蛋白酶(MMP)或ADAM(去整合素和金属蛋白酶)增强EphA4胞外结构域的切割。
在一个实施例中，抗EphA4抗体可以与EphA4特异性结合并抑制EphA4与其配体肝配蛋白之间的结合。
在另一实施例中，抗EphA4抗体可以与EphA4特异性结合并增加海马神经元中的树突棘数目或使海马神经元中的树突棘稳定。
在一个实施例中，本披露涵盖可以与人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4和猴EphA4中的至少一种特异性结合并抑制其与其配体的结合的抗EphA4抗体。在另一实施例中，本披露涵盖可以与人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4和猴EphA4中的两种或更多种特异性结合并抑制其与其配体的结合的抗EphA4抗体。在另外的替代性实施例中，本披露涵盖可以与人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4和猴EphA4中所有特异性结合并抑制其与其配体的结合的抗EphA4抗体。
本领域技术人员熟知的方法可用作测量抗EphA4抗体的抗原结合特性(例如结合亲和力和跨物种反应性)的方法。例如，可通过使用Biacore(R)生物传感器、KinExA生物传感器、闪烁接近分析法、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司(IGEN International，Inc.))、流式细胞术、荧光淬灭、荧光转移、酵母展示、和/或免疫染色(但不限于这些)来测量结合亲和力。可通过使用Biacore(R)生物传感器、ELISA、和/或流式细胞术(但不限于这些)来测量抗EphA4抗体对EphA4与其配体之间的结合的中和活性。
根据本披露的抗EphA4抗体可以是单克隆抗体，只要其与EphA4结合。
根据本披露的抗EphA4抗体可为如IgG、IgA或IgM(或其亚类)等任何类别，并且不限于特定类别。免疫球蛋白根据其重链(可称为H链)恒定区的抗体氨基酸序列而分为不同类别。有5种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的一些可进一步分为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等亚类(同种型)。不同类别免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链(可称为L链)类型为λ链和κ链。
根据本披露的抗EphA4抗体可以是IgG抗体，例如可以是IgG1抗体或IgG2抗体。此外，根据本披露的抗EphA4抗体在一些情况下可以是单体、二聚体或多聚体。
根据本披露的抗EphA4抗体可以是不同亚类的IgG抗体的组合，例如可以是由IgG1与IgG2的组合组成的人IgG抗体(在本披露中，也称为人IgG1/2)。
根据本披露的抗体的可变区可意指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区，并且抗体的恒定区可意指抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。重链和轻链的可变区各自由经由也称为互补决定区的三个CDR连结的四个框架区(FR)组成。各链中的CDR通过FR保留在附近，并与其他链中的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。Kabat编号***(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列]，第5版，1991，National Institutes of Health[美国国立卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达)(一种基于跨物种序列变异性的方法)用作用于确定CDR的技术。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体包含源自人类抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区。
在本说明书中，单克隆抗体可意指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体。特别地，该群体中含有的单个抗体是相同的，除了可能少量存在的天然突变之外。单克隆抗体针对单个抗原位点，并且非常具有特异性。与靶向不同抗原或不同表位的典型多克隆抗体相反，每种单克隆抗体靶向抗原的单个表位。修饰语“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体中获得的抗体的特性，而不应限定性地解释为需要通过特定方法产生抗体。
在本披露中，人类抗体意指具有源自人免疫球蛋白序列的可变区序列和恒定区序列的抗体，并且涵盖包含允许含有所需修饰的序列的抗体，只要它源自人免疫球蛋白序列，该修饰例如为经工程化以提高对靶标的结合亲和力、或降低免疫原性、或增加稳定性，以及经工程化以减少由非人细胞产生的抗体的不均匀性。
根据本披露的抗EphA4抗体还包括通过适当的工程化(例如抗体的修饰，或抗体的氨基酸序列的部分取代、附加和/或缺失)衍生自人类抗体的抗体，使得该抗体保持其功能(或该抗体被赋予功能或该抗体的功能改善)。更特别地，为了修饰抗体的效应子功能而具有工程化的恒定区氨基酸序列的抗体也包括在本披露的范围内。例如为了降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性的、衍生自人IgG2抗体的、第234位(Eu编号)缬氨酸(Val)取代为丙氨酸(Ala)并且第237位甘氨酸(Gly)取代为丙氨酸(Ala)的抗体也包括在本披露的范围内。此外，有具有根据本披露的抗EphA4抗体的CDR序列的抗原结合位点和与不同抗原结合的抗原结合位点两者的双特异性抗体(Kontermann(2012)，mAbs 4，182-97)也包括在本披露的范围内。
人类抗体可通过本领域已知的方法产生。本披露的人类抗体可作为重组抗体产生，例如，通过从已知的噬菌体展示人类抗体文库(初始文库、合成文库等)获得与EphA4具有结合亲和力的抗体、确定其可变区的序列、以及将这些序列与所需人恒定区的序列的组合转移至非人动物细胞。
可替代地，可通过用EphA4抗原对多种非人转基因动物(其基因组中含有人免疫球蛋白重链和轻链的基因座中的一些或全部)中的任一种进行免疫来产生人类抗体。在一个实施例中，含有人免疫球蛋白基因的非人动物为具有人免疫球蛋白“小基因座(minigeneloci)”的动物(例如GenPharm International公司)。在一些实施例中，可使用XenoMouse(R)小鼠(安根尼克斯公司(Abgenix，Inc.)，弗里蒙特，加利福尼亚州)、HuMAb-Mouse(R)小鼠(梅达瑞克斯公司(Medarex，Inc.))、VelocImmune(R)小鼠(再生元制药公司(RegeneronPharmaaceuticals，Inc.))、AlivaMab小鼠(Ablexis公司)等来产生人类抗体。
如果需要，可对根据本披露的抗EphA4抗体进行修饰。抗EphA4抗体的修饰可为改变以下的修饰：(a)修饰区域中的氨基酸序列的三维结构(如折叠构象或螺旋构象)；(b)靶位点分子的电荷或疏水性的状态；或(c)修饰对维持侧链体积的作用；或者可以是无法清楚地观察到这些变化的修饰。
根据本披露的抗EphA4抗体的修饰可通过例如组成氨基酸残基的取代、缺失、和/或添加来实现。
在本说明书中，氨基酸以其最广泛的含义使用，并且包括天然的氨基酸，例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)，以及非天然氨基酸，如氨基酸变体和衍生物。考虑到这种宽泛的定义，本领域技术人员自然理解，本说明书中的氨基酸的实例包括：L-氨基酸；D-氨基酸；经化学修饰的氨基酸，如氨基酸变体和氨基酸衍生物；不作为构成体内蛋白质的材料的氨基酸，如正亮氨酸、β-丙氨酸和鸟氨酸；以及具有本领域技术人员熟知的氨基酸特性的化学合成的化合物。非天然氨基酸的实例包括：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸(D-天冬氨酸、D-谷氨酸等)、组氨酸样氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸等)、侧链上有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)和侧链中的羧酸官能基氨基酸被磺酸基团取代的氨基酸(磺基丙氨酸等)。
例如根据共同的侧链特性，天然存在的氨基酸残基可被分成以下几组：
(1)疏水残基：Met、Ala、Val、Leu和Ile；
(2)中性亲水性残基：Asn、Gln、Cys、Ser和Thr；
(3)酸性残基：Asp和Glu；
(4)碱性残基：His、Lys和Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly和Pro；以及
(6)芳香族残基：Trp、Tyr和Phe。
构成抗体的氨基酸序列的非保守取代可通过将属于这些组之一的氨基酸替换成属与任何其他组的氨基酸来进行。更保守的取代可通过将属于这些组之一的氨基酸替换成属于同一组的另一种氨基酸来进行。同样地，可适当进行氨基酸序列的缺失或取代。
构成抗体的一个或多个氨基酸的修饰可为翻译后修饰，如用糖的糖基化、乙酰化或磷酸化。抗体可以在其恒定区中的保守位置被糖基化。抗体的糖基化通常为N-连接型或O-连接型。N-连接的糖基化意指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、以及天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中，X为脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于使碳水化合物部分酶促地添加至天冬酰胺侧链的识别序列。当抗体中存在这些三肽序列中的任一种时，存在潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化可为N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖与羟基氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)的结合，或者在一些情况下可为其与5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的结合。根据该目的，本领域技术人员可以适当选择糖基化的条件(在使用生物学手法进行糖基化的情形时，例如宿主细胞和细胞培养基的类型和pH)。
根据本披露的抗EphA4抗体可基于本领域技术人员众所周知的常见技术知识，通过使用其他修饰方法单独地或组合地进行进一步修饰。
根据本披露的抗EphA4抗体可通过本领域技术人员众所周知的方法产生。例如，将编码根据本披露的抗EphA4抗体的核酸整合至表达载体。将表达载体转移至宿主细胞。可以培养宿主细胞，以产生抗体。因此，本披露涵盖编码抗EphA4抗体的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞的步骤的用于产生抗EphA4抗体的方法。
根据本披露的编码抗EphA4抗体的核酸可具有编码信号序列的DNA，并且可以在编码重链可变区的DNA以及编码轻链可变区的DNA的每个5′端具有编码信号序列的DNA。信号序列是分泌蛋白或整合膜蛋白在核糖体上合成后通过脂双层所需的位于蛋白质的N末端的氨基酸残基。根据本披露的信号序列不受特别限制，只要该序列具有此功能即可。可以包含在根据本披露的抗EphA4抗体中的信号序列的实例包括源自以下的信号序列：人类、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、狗、猫、酵母等。
根据本披露的抗EphA4抗体可根据本领域技术人员众所周知的方法分离或纯化。
在本说明书中，术语“分离”或“纯化”意指人为地从自然状态中分离或纯化。当天然存在的分子或组合物被改变或移除(从其原始环境中)或两者时，该分子或组合物被“分离”或“纯化”。分离或纯化方法的实例包括电泳法、分子生物学方法、免疫学方法和色谱法，并且特别地包括，但不限于离子交换色谱、疏水色谱、反相HPLC色谱、等电聚焦电泳、和碱提法。
在一个实施例中，抗EphA4抗体包含以下CDR：
(a)由SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(b)由SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；
(c)由SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；
(d)由SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(e)由SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和
(f)由SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在一个实施例中，抗EphA4抗体包含以下CDR：
(g)由SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(h)由SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；
(i)由SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；
(j)由SEQ ID NO：44中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(k)由SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和
(1)由SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在一个实施例中，抗EphA4抗体为人类抗体。
在另一实施例中，抗EphA4抗体包含重链和轻链。该重链包含由SEQ ID NO：7或11中所示的氨基酸序列组成的可变区，和/或该轻链包含由SEQ ID NO：8或12中所示的氨基酸序列组成的可变区。在此实施例中，重链可变区和/或轻链可变区可包含通过一个或多个氨基酸的取代、添加和/或缺失的，源自SEQ ID NO：7或11中所示的氨基酸序列和/或SEQ IDNO：8或12中所示的氨基酸序列的氨基酸序列。在该上下文中，关于EphA4所用的术语“或多个(或更多个)”不受限制，只要保持对EphA4的结合亲和力并增强EphA4的切割。术语“或多个(或更多个)”是2个至15个、或2个至10个，例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个，或氨基酸序列中的氨基酸数量的10％以内，例如9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内或1％以内。
在特定的实施例中，抗EphA4抗体包含重链和轻链。该重链包含由SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列组成的可变区，并且该轻链包含由SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成的可变区。
在特定的实施例中，抗EphA4抗体包含重链和轻链。该重链包含由SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列组成的可变区，并且该轻链包含由SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列组成的可变区。
在一个实施例中，抗EphA4抗体的重链包含人IgG2的恒定区。在特定的实施例中，人IgG2的恒定区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
在另一实施例中，抗EphA4抗体的重链包含由人IgG1与IgG2的组合组成的人IgG的恒定区。在特定的实施例中，由人IgG1与IgG2的组合组成的人IgG的恒定区包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗EphA4抗体的轻链包含人Igλ的恒定区。在特定的实施例中，人Igλ的恒定区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，且抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列。
在另一实施例中，抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并且重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。
在特定的实施例中，抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并且重链的C末端赖氨酸缺失。
在一个实施例中，抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，且抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。
在另一实施例中，抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并且重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。
在特定的实施例中，抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并且重链的C末端赖氨酸缺失。
在替代性实施例中，抗EphA4抗体可以缺失位于重链C末端(羧基末端)的赖氨酸，因为例如，由产生抗体的细胞产生的抗体的不均匀性降低(美国专利申请公开第2010/0297697；和Liu H等人，MAbs.2014年9月-10月；6(5)：1145-1154)。在本披露中，重链C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体还包括通过基因工程化使重链C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体和通过羧基肽酶等翻译后切割使重链C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体等。在本披露中，重链C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体还包括两条重链中的C末端赖氨酸均缺失的抗EphA4抗体、以及仅一条重链中的C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体。
在一方面，本披露涉及编码抗EphA4抗体的分离核酸。编码抗EphA4抗体的分离核酸是指编码抗EphA4抗体的重链和/或轻链的一种或多种核酸分子。在一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的重链。在另一实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的轻链。在另外的替代性实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的重链和轻链。根据本披露的核酸还包括编码抗EphA4抗体的重链的第一核酸分子和编码抗EphA4抗体的轻链的第二核酸分子。
在另一方面，本披露涉及包含编码抗EphA4抗体的分离核酸的载体。根据本披露的载体是指包含编码抗EphA4抗体的分离核酸的一种或多种载体。在一个实施例中，根据本披露的载体是包含编码抗EphA4抗体的重链的核酸和编码抗EphA4抗体的轻链的核酸的载体。在另一实施例中，根据本披露的载体是包含编码抗EphA4抗体的重链和轻链的核酸的载体。在另外的替代性实施例中，根据本披露的载体包括包含编码抗EphA4抗体的重链的核酸的第一载体、和包含编码抗EphA4抗体的轻链的核酸的第二载体。根据本披露的载体可以是，但不特定限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，病毒载体(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体)也包括在根据本披露的载体中。
在另外的替代性方面，本披露还包括包含根据本披露的载体的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞的步骤的用于产生抗EphA4抗体的方法。根据本披露的宿主细胞可以是，但不特定限于大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞等。在一个实施例中，用于产生抗EphA4抗体的方法包括以下步骤：培养宿主细胞；和回收由该宿主细胞(或宿主细胞的培养基)分泌的抗EphA4抗体。
在一方面，本披露涉及包含抗EphA4抗体的药物组合物。根据本披露的药物组合物可根据已知方法，例如日本药典(JP)、美国药典(USP)或欧州药典(EP)中所述的方法产生。
根据本披露的抗EphA4抗体可用于治疗阿尔茨海默病。特别地，在一方面，本披露涵盖包含抗EphA4抗体的用于治疗阿尔茨海默病的药物组合物。在另一方面，涵盖用于治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括向患有阿尔茨海默病的受试者施用治疗上有效量的抗EphA4抗体的步骤。在替代性方面，本披露涵盖抗EphA4抗体用于产生阿尔茨海默病的治疗药的用途。在替代性方面，本披露涵盖用于在治疗阿尔茨海默病中使用的抗EphA4抗体。
根据本披露的抗EphA4抗体可在治疗方法中单独使用或与其他药物或组合物组合使用。例如根据本披露的抗EphA4抗体可与其他药物在同一时间或不同时间施用。这样的组合疗法包括组合施用(同一配制品或分开的配制品中含有2种或更多种药物)和分开施用(例如同时或连续)。在分开施用两种或更多种药物的情况下，根据本披露的抗EphA4抗体的施用可在相关治疗法之前或之后施用。
施用根据本披露的药物组合物的受试者并无限定，并且该药物组合物可用于例如人类或非人哺乳动物(猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马、山羊等)。
用于将根据本披露的药物组合物施用于受试者的方法(施用途径、剂量、每日给药次数、施用时间等)并无限定，并且本领域技术人员(例如医生)可根据受试者的健康状态、疾病严重程度、组合使用的药物类型等适当确定。
本领域技术人员应当理解，除非引起技术矛盾，否则可通过本说明书中描述的所有方面中的任一个或者两个或更多个的适当组合来实施本披露。此外，本领域技术人员应当理解，除非引起技术矛盾，否则可以通过本说明书中描述的所有优选或有利方面的适当组合来优选地实施本披露。
本说明书中引用的文献应解释为通过引用以其全文并入本文。本领域技术人员可以根据本说明书的上下文，在不脱离本披露的精神和范围的情况下，理解为将这些文献中的相关披露内容通过引用作为本说明书的一部分。
本说明书中引用的文献仅为披露本申请申请日之前的相关技术的目的而提供。不应解释为本发明诸位发明人承认由在先发明或其他任何原因而无权优先于这样的披露。这些文献的全部陈述均基于本申请人已掌握的信息，且不承认这些陈述的内容是准确的。
本说明书中使用的术语是用于说明特定的实施例，并非意在限定本发明。
除非上下文明显要求有不同的理解，否则本说明书中使用的术语“包含(comprise)”意指存在物品(成员、步骤、要素或数字等)，且不排除存在其他物品(成员、步骤、要素或数字等)。术语“由......组成(consist of)”涵盖术语“由......组成(consistof)”和/或“基本上由......组成(consist essentially of)”所述的方面。
本说明书中使用的术语“中和活性”意指抑制EphA4与其配体之间的结合的活性和/或抑制人体中通过EphA4与其配体之间的结合而诱导的信号传递或细胞的分子表达应答或功能性变化的活性。
除非另有定义，否则本文所用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本披露所属领域的技术人员广义上理解的相同的含义。除非另有定义，否则本文使用的术语应解释为具有与本说明书和相关技术领域中的含义一致的含义并且不应理想化或过于正式的理解。
术语如“第一”或“第二”用于表述各种要素。然而，需理解这些要素不应被这些术语本身限定。这些术语仅用于区别一个要素与其他要素。例如，在不脱离本披露的范围的情况下，第一要素可描述为第二要素，反之亦然。
在本说明书中，除非另外说明，否则应理解，用于表示成分含量、数值范围等的数值用术语“大约”修饰。例如，除非另外说明，否则“4℃”解释为“大约4℃”。本领域技术人员依据技术常识和本说明书的上下文自然可以合理地理解其范围。
应理解，除非上下文明显需要不同的解释并且除非引起技术矛盾，否则在本说明书和权利要求书中以单数形式表示的每个方面可以是复数形式，反之亦然。
在下文中，将参考实例更加详细地描述本披露。然而，本披露可以通过各种方面来体现并且不旨在受本文所述的实例限制。本领域技术人员在不脱离本披露的精神或范围的情况下可以通过各种改变或修饰、添加、缺失、取代等来实现本披露。
[实例]
实例1：人抗EphA4单克隆抗体的制备
为了制备与人EphA4(GenBank登录号NP_004429.1，SEQ ID NO：1)结合的单克隆抗体，按照以下步骤制备与分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和组氨酸标签融合的人EphA4的胞外结构域(第20-547位)(SEQ ID NO：2)的蛋白(以下称为“人EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白”，SEQ ID NO：3)、与人IgG1的Fc区(Fc)和组氨酸标签融合的人EphA4的胞外结构域的蛋白(以下称为“人EphA4胞外结构域-Fc-His蛋白”，SEQ ID NO：4)以及与麦芽糖结合蛋白(MBP)和组氨酸标签融合的人EphA4的胞外结构域的蛋白(以下称为“人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白”，SEQ ID NO：5)。
首先，构建pcDNA3.1-人EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体、pcDNA3.1-人EphA4胞外结构域-Fc-His表达载体和pcDNA3.4-人EphA4胞外结构域-MBP-His表达载体。首先，使用源自人脑的总RNA通过RT-PCR扩增编码人EphA4的信号序列(SEQ ID NO：6)与胞外结构域的DNA序列，并将其克隆至具有编码SEAP和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司(Invitrogen)/生命技术公司(Life Technologies Corp.))或具有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/生命技术公司)的SalI/NotI位点。随后，通过使用Gateway***(英杰公司/生命技术公司)的LR反应将编码人EphA4的信号序列与胞外结构域、SEAP和组氨酸标签的DNA序列或编码人EphA4的信号序列与胞外结构域、Fc和组氨酸标签的DNA序列转移至pcDNA3.1_rfcB载体，以构建pcDNA3.1-人EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体和pcDNA3.1-人EphA4胞外结构域-Fc-His表达载体。对于pcDNA3.4-人EphA4胞外结构域-MBP-His表达载体，通过PCR扩增编码人EphA4的信号序列与胞外结构域的DNA序列，并将其克隆至具有编码MBP和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)，以构建人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白表达载体。使用Expi293表达***(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))，用上述每种表达载体转染Expi293F细胞(赛默飞世尔科技公司)。4天后，通过去除细胞回收并澄清每种培养液。使用TALON树脂(宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.))纯化所得培养液，并通过透析将缓冲液置换成PBS(富士胶片和光纯药株式会社(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.))。
使用人EphA4蛋白和全人抗体合成噬菌体文库进行筛选，以获得与人EphA4特异性结合的人类抗体片段(scFv)。使用Dynabeads磁珠(赛默飞世尔科技公司)或镍板(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology Inc.))捕获人EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白，并添加全人抗体合成噬菌体文库。1小时或2小时后，使用PBS-Tween(0.1％v/v)或PBS，通过一系列洗涤循环去除未结合的噬菌体。将结合的噬菌体颗粒洗脱并且然后经由感染大肠杆菌TG1宿主细胞扩增。收获感染的TGI细胞，将其接种在板上，并在30℃下孵育。使用扩增的噬菌体再进行2次此淘选处理。
三轮淘选后，将富集噬菌体感染的TGI细胞的单个菌落接种在96孔板中的培养基上。通过添加IPTG诱导加FLAG标签的scFv的表达，随后在3℃下振荡培养过夜。旋转沉降TG1细胞，并使用含有scFv的大肠杆菌培养上清液，获得具有与人EphA4的反应性的孔。
使用人EphA4胞外结构域-Fc-His蛋白或人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白，按照以下的步骤，通过ELISA评价与人EphA4的反应性。将96孔板(Nunc)的每个孔用抗FLAG抗体(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))涂布。在4℃下培养过夜后，在室温下，将每个孔用2％脱脂乳(美国BD公司(Becton Dickinson and Company))封闭2小时。在用0.02％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque公司)洗涤3次后，将人EphA4胞外结构域-Fc-His蛋白或人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白(最终浓度20nM)和含有scFv的大肠杆菌培养上清液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。在洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗His抗体(株式会社医学生物学研究所(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.))并将其在室温下孵育1小时。洗涤5次后，向每个孔中添加TMBZ(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，Kirkegaard&Perry Laboratories公司)溶液，并将其在室温下孵育15至20分钟。向每个孔中添加等量的反应终止溶液(1N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)。使用酶标仪(赛默飞世尔科技公司)读取450nm的吸光度。按照筛选的结果，选择人EphA4特异性的人类抗体片段，并通过测序确定各片段的基因序列。
将编码每个获得的人类抗体片段(scFv)的可变区的DNA序列亚克隆至用于表达抗体重链和轻链恒定区的载体，以将克隆从scFv形式转变成IgG形式。使用Expi293表达***(赛默飞世尔科技公司)，用含有编码人抗EphA4单克隆抗体的基因序列的表达载体(pcDNA3.4)转染Expi293F细胞(赛默飞世尔科技公司)。回收上清液，并使用MabSelectSuRe(思拓凡公司(Cytiva))获得人抗EphA4单克隆抗体。从对EphA4的切割增强活性、对EphA4的特异性、EphA4信号的下游分子的磷酸化状态、免疫原性等观点，缩小由此获得的人抗EphA4单克隆抗体候选物的范围。使用EpiScreen(R)(Abzena plc公司)评价免疫原性。在这一系列的评价中，还制备了通过人抗EphA4单克隆抗体的重链与轻链改组获得的抗体和CDR发生突变的抗体，并评估了共300或更多种人抗EphA4单克隆抗体。
使用大鼠海马神经元评价每种获得的人抗EphA4单克隆抗体的EphA4切割增强活性。按照以下的步骤制备大鼠海马神经元。自妊娠18天的大鼠(日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))中取出胎鼠，切开头部取出脑。在立体显微镜下从中切除海马区，并将其放入消化液(137mM NaCl(富士胶片和光纯药株式会社)、5mMKCI(富士胶片和光纯药株式会社)、7mM Na2HPO4(富士胶片和光纯药株式会社)、25mM Hepes(同仁化学研究所(Dojindo Laboratories))、0.5mg/mL DNA酶(西格玛奥德里奇公司)和0.25％胰蛋白酶(生命技术公司))中，并在37℃下振荡10分钟。去除溶液，并将20％胎牛血清/Hanks缓冲溶液(西格玛奥德里奇公司)添加至残余物中。去除液体并用Hanks缓冲溶液洗涤2次后，将海马组织移液至Hanks缓冲溶液中以制备细胞悬浮液。将细胞接种在含有培养液(神经元基础培养基(生命技术公司)、1×B-27补充剂(生命技术公司)、0.5mM L-谷氨酰胺(生命技术公司))的聚-L赖氨酸涂布的96孔培养皿(福尔肯公司(Falcon))中。
按照以下步骤进行使用海马神经元的EphA4切割增强活性评价。将接种在96孔培养皿(福尔肯公司)中的大鼠海马神经元用抗EphA4单克隆抗体(20nM)和γ分泌酶抑制剂化合物E(50nM，恩佐生命科学公司(Enzo Life Sciences，Inc.))处理，并在24小时后，用PBS(富士胶片和光纯药株式会社)洗涤。通过添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.))、5％2-巯基乙醇(伯乐实验室有限公司))收获细胞并煮沸5分钟。使用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司(Abnova))进行通过SDS-PAGE和蛋白质印迹的分析或使用全自动Western***Jess(ProteinSimple公司)的分析。量化条带强度，然后计算EphA4C末端片段/全长EphA4的值。
通过上述EphA4切割增强活性的评价，获得作为具有增强EphA4的切割的活性的人抗EphA4单克隆抗体的抗体A和抗体B。抗体A和抗体B是不会引起EphA4信号的下游分子的磷酸化且免疫原性低(T细胞增殖和IL-2产生均为10％或更少)的抗体。
由金斯瑞公司(GenScript)全合成编码抗体A和抗体B的全长重链和轻链的基因。抗体A的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，并且其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。作为编码抗体A的氨基酸序列的基因序列，重链可变区使用SEQ ID NO：9中所示的核酸序列，并且轻链可变区使用SEQ ID NO：10中所示的核酸序列。抗体B的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，并且其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列。作为编码抗体B的氨基酸序列的基因序列，重链可变区使用SEQ ID NO：13中所示的核酸序列，并且轻链可变区使用SEQ ID NO：14中所示的核酸序列。人IgG2的恒定区(SEQ ID NO：15)用作抗体A的重链恒定区，具有人IgG1 CH1和铰链以及人IgG2 CH2和CH3的人IgG1/2恒定区(SEQ ID NO：16)用作抗体B的重链恒定区。人Igλ(SEQ ID NO：17)用作抗体A和抗体B的轻链恒定区。作为编码抗体A的氨基酸序列的基因序列，重链恒定区使用SEQ ID NO：18中所示的核酸序列，并且轻链恒定区使用SEQ ID NO：19中所示的核酸序列。抗体A的全长重链的氨基酸序列(不含信号序列)为SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，并且其全长轻链的氨基酸序列(不含信号序列)为SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列。编码抗体A的全长重链的核酸序列为SEQ ID NO：22中所示的核酸序列，并且编码其全长轻链的核酸序列为SEQ ID NO：23中所示的核酸序列。作为编码抗体B的氨基酸序列的基因序列，重链恒定区使用SEQ ID NO：24中所示的核酸序列，并且轻链恒定区使用SEQ ID NO：25中所示的核酸序列。抗体B的全长重链的氨基酸序列(不含信号序列)为SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，并且其全长轻链的氨基酸序列(不含信号序列)为SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。编码抗体B的全长重链的核酸序列为SEQ ID NO：28中所示的核酸序列，并且编码其全长轻链的核酸序列为SEQ ID NO：29中所示的核酸序列。将Expi293F细胞(赛默飞世尔科技公司)或CHOK1SV细胞(龙沙公司(Lonza))使用Expi293表达***(赛默飞世尔科技公司)或GS***(龙沙公司)用含有编码抗体A或抗体B的氨基酸序列的基因序列的表达载体(pcDNA3.4或pEE6.4和pEE12.4)转染。回收上清液，并使用MabSelectSuRe(思拓凡公司)纯化作为人抗EphA4单克隆抗体的抗体A和抗体B。
依据用于鉴定CDR的Kabat定义(Kabat编号***)确定抗体A和抗体B的CDR。抗体A的CDR的氨基酸序列与核酸序列分别示于表1与表2中。抗体B的CDR的氨基酸序列与核酸序列分别示于表3与表4中。
[表1]
抗体A的CDR的氨基酸序列
名称 序列
重链CDR1 SYAMS(SEQ ID NO：30)
重链CDR2 AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：31)
重链CDR3 DSYYYWWLYYYFDY(SEQ ID NO：32)
轻链CDR1 QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：33)
轻链CDR2 GKNNRPS(SEQ ID NO：34)
轻链CDR3 QSSYSSSYSYV(SEQ ID NO：35)
[表2]
抗体A的CDR的核酸序列
[表3]
抗体B的CDR的氨基酸序列
名称 序列
重链CDR1 SFAMS(SEQ ID NO：42)
重链CDR2 AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：31)
重链CDR3 DDYYPYWWYYYYFDY(SEQ ID NO：43)
轻链CDR1 QGDSLRSYFAS(SEQ ID NO：44)
轻链CDR2 GKNNRPS(SEQ ID NO：34)
轻链CDR3 QSSYSSSYSYV(SEQ ID NO：35)
[表4]
抗体B的CDR的核酸序列
实例2：人抗EphA4单克隆抗体与人EphA4的结合亲和力
通过表面等离子体共振(SPR法)使用Biacore T200(思拓凡公司)确定抗体A和抗体B与人EphA4的结合亲和力。首先，将抗His抗体(思拓凡公司，28-9950-56)固定在传感器芯片CM5上。通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法进行固定。使用乙醇胺进行封闭(传感器芯片或固定用试剂均由思拓凡公司制造)。将抗体用固定用缓冲溶液(10mM乙酸钠，pH 4.5)稀释成3μg/mL并按照Biacore T200附带的方案固定在传感器芯片上。将人EphA4胞外结构域-SEAP-His10用运行缓冲溶液HBS-EP+(思拓凡公司，BR-1001-69)稀释，注射至流动池中持续120秒并捕获(抗体捕获量：大约6RU)。随后，将使用HBS-EP+在100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0nM的范围内连续稀释的抗体A或抗体B添加至传感器芯片上，持续120秒。在添加时(缔合相，120秒)和添加完成后(解离相，600秒)依次观察结合反应曲线。在各观察完成后，通过添加3M MgCl2(60秒)来再生传感器芯片。使用1：1结合模型和***附带的软件BIA评估对获得的结合反应曲线进行拟合分析，以计算对人EphA4的结合亲和力(KD＝kd/ka)。上述实验进行3次，并计算各参数的平均值。
抗体A和抗体B与人EphA4的结合亲和力(KD值)分别为4.67×10-10M和1.56×10-10M(图1)。抗体A和抗体B具有相同水平的对人EphA4的结合亲和力。图1表示作为实例的典型结合反应曲线。
实例3：人抗EphA4单克隆抗体的人EphA4-人配体结合抑制活性
按照以下步骤评价抗体A和抗体B对人EphA4与其人配体之间的结合的抑制活性。将96孔板(Nunc)的每个孔用抗碱性磷酸酶抗体(赛默飞世尔科技公司)涂布。在4℃下孵育过夜后，在4℃下，将每个孔用1％BlockAce(KAC公司)封闭过夜。在用0.02％Tween 20/PBS洗涤3次后，将人EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白(最终浓度10nM)接种在每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将配体与连续稀释的抗体A或抗体B(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)添加至孔中。使用的配体是生物素化人肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&D***公司(R&D Systems，Inc.，)，最终浓度0.7nM)和生物素化人肝配蛋白B3-Fc嵌合体(R&D***公司，最终浓度2.3nM)。在室温下孵育1小时，随后洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(通用医疗日本集团(GE Healthcare Japan Corp.))，并将其在室温下孵育1小时。洗涤3次后，向每个孔中添加TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，Kirkegaard&Perry Laboratories公司)溶液，并将其在室温下孵育15至20分钟。向每个孔中添加等量的反应终止溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)。使用酶标仪(赛默飞世尔科技公司)读取450nm的吸光度。
抗体A和抗体B以浓度依赖性方式抑制人EphA4与其人配体之间的结合。抗体A对人肝配蛋白A5和肝配蛋白B3结合的IC50值分别为3.9nM和3.0nM，并且抗体B对人肝配蛋白A5和肝配蛋白B3结合的IC50值分别为4.8nM和4.1nM。因此，发现抗体A和抗体B抑制人EphA4与人配体之间的结合(图2)。
实例4：人抗EphA4单克隆抗体对人Eph受体的选择性
按照以下步骤评价抗体A和抗体B对每种人Eph受体的结合活性。将96孔板(Nunc)的每个孔用兔抗6-His抗体(Bethyl实验室)涂布。在室温下孵育1小时或在4℃下孵育过夜后，在室温下，将每个孔用1％BlockAce(KAC公司)封闭1小时。用0.02％Tween 20/PBS洗涤3次后，将每种人Eph受体胞外结构域-His蛋白(Creative BioMart公司，最终浓度1nM)接种在每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将抗体A或抗体B(10μg/mL)添加至每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.))并将其在室温下孵育1小时。洗涤3次后，向每个孔中添加TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，Kirkegaard&Perry Laboratories公司)溶液。向每个孔中添加等量的反应终止溶液(2NH2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)。使用酶标仪(赛默飞世尔科技公司)读取450nm的吸光度。
发现抗体A和抗体B与人Eph受体家族成员中的人EphA4特异性结合(图3)。
实例5：人抗EphA4单克隆抗体与小鼠、大鼠、猴或人EphA4的反应性
按照以下步骤制备小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白。由GenScript日本公司合成编码SEAP-His以及小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外结构域的基因。首先，将编码SEAP-His的合成基因片段克隆至pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)。将小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外结构域的基因片段中的每个均克隆至构建的pcDNA3.4-SEAP-His表达载体，以构建小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体。载体构建中使用的人EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中，并且其胞外结构域示于SEQ ID NO：2中。猴EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO：51中，并且其胞外结构域示于SEQ ID NO：52中。大鼠EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO：53中，并且其胞外结构域示于SEQ ID NO：54中。小鼠EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO：55中，并且其胞外结构域示于SEQ ID NO：56中。使用人EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体、猴EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体、大鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体和小鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体制备各种EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白。使用Expi293表达***(赛默飞世尔科技公司)，用每种表达载体转染Expi293F细胞(赛默飞世尔科技公司)。4天后，通过去除细胞回收并澄清每种培养液。使用TALON树脂(宝生物工程株式会社)纯化所得培养液，并通过透析将缓冲液置换成PBS(富士胶片和光纯药株式会社)。
按照以下步骤评价抗体A和抗体B对每种EphA4的结合活性。将96孔板(Nunc)的每个孔用兔抗6-His抗体(Bethyl实验室)涂布。在室温下孵育1小时后在4℃下，将每个孔用1％BlockAce(KAC公司)封闭过夜。用0.02％Tween 20/PBS洗涤3次后，将小鼠、大鼠、猴和人EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白(最终浓度1nM)接种在每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将抗体A或抗体B(0、0.00013、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10μg/mL)添加至每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室公司)并将其在室温下孵育1小时。洗涤3次后，向每个孔中添加TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，Kirkegaard&Perry Laboratories公司)溶液。向每个孔中添加等量的反应终止溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)。使用酶标仪(赛默飞世尔科技公司)读取450nm的吸光度。
抗体A和抗体B对小鼠EphA4、大鼠EphA4、猴EphA4和人EphA4均具有相同水平的结合活性(图4)。
实例6：人抗EphA4单克隆抗体与人EphA4胞外结构域、配体结合结构域、纤维粘连 蛋白III型结构域1、纤维粘连蛋白III型结构域2的反应性
按照以下步骤制备与麦芽糖结合蛋白(MBP)和组氨酸标签融合的人EphA4的胞外结构域(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤维粘连蛋白III型结构域1(FN1)或纤维粘连蛋白III型结构域2(FN2)的蛋白(以下称为“人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白”、“人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白”、“人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白”和“人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白”)。首先，构建pcDNA3.4-人EphA4胞外结构域、配体结合结构域、纤维粘连蛋白III型结构域1或纤维粘连蛋白III型结构域2-MBP-His表达载体。首先，通过PCR扩增编码人EphA4的信号序列(SEQ ID NO：6)或前原胰蛋白酶的信号序列(SEQ ID NO：57)以及人EphA4的各结构域的DNA序列，并将其克隆至具有编码MBP和组氨酸标签以及AAA或G4S接头的DNA序列的pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)，以构建人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白、人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白、和人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白的表达载体。载体构建中使用的人EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中；其胞外结构域示于SEQ ID NO：2中；配体结合结构域示于SEQ ID NO：58中；纤维粘连蛋白III型结构域1示于SEQ ID NO：59中纤维粘连蛋白III型结构域2示于SEQ ID NO：60中。MBP和组氨酸标签(MBP-His蛋白)示于SEQ ID NO：61中。使用Expi293表达***(赛默飞世尔科技公司)，用每种表达载体转染Expi293F细胞(赛默飞世尔科技公司)。4天后，通过去除细胞回收并澄清每种培养液。使用TALON树脂(宝生物工程株式会社)纯化人EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白或人EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白，并通过透析将缓冲液置换成PBS(富士胶片和光纯药株式会社)。使用直链淀粉树脂(新英格兰生物实验室公司(New England BiolabsInc.))纯化人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白和人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白，并使用AKTA Explore 10s/Superdex 20010/300 GL(思拓凡公司)分离并纯化单体级分。
按照以下步骤评价抗体A、抗体B、和人IgG(西格玛奥德里奇公司)对每种EphA4的结合活性。将96孔板(Nunc)的每个孔用兔抗6-His抗体(Bethyl实验室)涂布。在室温下孵育1小时后，在4℃下，将每个孔用1％BlockAce(KAC公司)封闭过夜。用0.02％Tween 20/PBS洗涤3次后，将人EphA4胞外结构域、人EphA4配体结合结构域、人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域1、和人EphA4纤维粘连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白或MBP-His蛋白(最终浓度1nM)中的每个接种在每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将抗体A、抗体B、或人IgG(10nM)添加至每个孔中并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，添加辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室公司)并将其在室温下孵育1小时。洗涤3次后，向每个孔中添加TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，Kirkegaard&Perry Laboratories公司)溶液。向每个孔中添加等量的反应终止溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)。使用酶标仪(赛默飞世尔科技公司)读取450nm和650nm的吸光度。
抗体A和抗体B对人EphA4胞外结构域(ECD)和配体结合结构域(LBD)具有结合活性(图5)。它们都不与纤维粘连蛋白III型结构域1(FN1)和纤维粘连蛋白III型结构域2(FN2)反应。因此，发现抗体A和抗体B与人EphA4胞外结构域的配体结合结构域特异性结合。
实例7：人抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中的EphA4切割增强活性
按照以下的步骤制备大鼠海马神经元。自妊娠18天的大鼠(日本查尔斯河实验室公司)中取出胎鼠，切开头部取出脑。在立体显微镜下从中切除海马区，并将其放入消化液(137mM NaCl(富士胶片和光纯药株式会社)、5mM KCl(富士胶片和光纯药株式会社)、7mMNa2HPO4(富士胶片和光纯药株式会社)、25mM Hepes(同仁化学研究所)、0.5mg/mL DNA酶(西格玛奥德里奇公司)和0.25％胰蛋白酶(赛默飞世尔科技公司))中，并在37℃下振荡10分钟。去除溶液，并将20％胎牛血清/Hanks缓冲溶液(西格玛奥德里奇公司)添加至残余物中。去除液体并用Hanks缓冲溶液洗涤2次后，将海马组织移液至Hanks缓冲溶液中以制备细胞悬浮液。将细胞进一步悬浮在培养液(神经元基础培养基(生命技术公司)、1×B-27补充剂(赛默飞世尔科技公司)、0.5mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司))中并且然后接种在聚-L-赖氨酸涂布的96孔培养皿(福尔肯公司)中。
按照以下步骤，使用海马神经元评估实例1中获得的抗体A和抗体B的EphA4切割增强活性。使溶剂(PBS(富士胶片和光纯药株式会社))、人IgG、抗体A或抗体B(2.0、6.7、和20nM)以及γ分泌酶抑制剂化合物E(50nM，恩佐生命科学公司)作用于接种在96孔培养皿(福尔肯公司)的大鼠海马神经元24小时。用PBS(富士胶片和光纯药株式会社)洗涤后，通过添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐实验室有限公司)、2.5％2-巯基乙醇(伯乐实验室有限公司))收获细胞并煮沸5分钟。利用全自动Westem***Jess分析此样品。分析时，使用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司(Abnova Corp.))。定量EphA4C末端片段与全长EphA4的信号，计算EphA4C末端片段/(全长EphA4+EphA4C末端片段)的值。
抗体A和抗体B在海马神经元中以浓度依赖性方式增强EphA4切割反应(图6)。
实例8：人抗EphA4单克隆抗体的人EphA4切割增强活性
首先，由GenScript日本公司合成具有编码人EphA4的DNA序列和编码HA标签的DNA序列的pCAHA载体后。然后，将编码人EphA4的DNA序列***pCAHA载体的SalI/NotI，以构建pCA-人EphA4-HA表达载体。
按照以下的步骤制备大鼠海马神经元。自妊娠18天的大鼠(日本查尔斯河实验室公司)中取出胎鼠，切开头部取出脑。在立体显微镜下从中切除海马区，并将其放入消化液(137mM NaCl(富士胶片和光纯药株式会社)、5mM KCI(富士胶片和光纯药株式会社)、7mMNa2HPO4(富士胶片和光纯药株式会社)、25mM Hepes(同仁化学研究所)、0.5mg/mL DNA酶(西格玛奥德里奇公司)和0.25％胰蛋白酶(赛默飞世尔科技公司))中，并在37℃下振荡10分钟。去除溶液，并将20％胎牛血清/Hanks缓冲溶液(西格玛奥德里奇公司)添加至残余物中。去除液体并用Hanks缓冲溶液洗涤2次后，将海马组织移液至Hanks缓冲溶液中以制备细胞悬浮液。
按照以下步骤，评估实例1中获得的抗体A和抗体B对人EphA4的切割增强活性。使用Nucleofector(瑞士龙沙集团(Lonza Group AG))将pCA-人EphA4-HA表达载体转移至大鼠海马神经元。将细胞悬浮在培养液(神经元基础培养基(生命技术公司)、I×B-27补充剂(赛默飞世尔科技公司)、0.5mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司))中并且然后接种在聚-L-赖氨酸涂布的96孔培养皿(福尔肯公司)中。使溶剂(PBS(富士胶片和光纯药株式会社))、人IgG、抗体A或抗体B(6.7、20和67nM)以及γ分泌酶抑制剂化合物E(50nM，恩佐生命科学公司)作用于接种的大鼠海马神经元过夜。用PBS洗涤后，通过添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐实验室有限公司)、5％2-巯基乙醇(伯乐实验室有限公司))收获细胞并煮沸5分钟。将此样品进行SDS-PAGE并进行蛋白质印迹分析(使用大鼠抗HA单克隆抗体(罗氏公司(Roche)))。量化条带强度，然后计算人EphA4C末端片段/(全长人EphA4+人EphA4C末端片段)的值。
抗体A和抗体B增强海马神经元中的人EphA4切割反应(图7)。
实例9：人抗EphA4单克隆抗体对海马神经元的树突棘密度的增加作用
如实例7中所述的制备大鼠海马神经元。使用Nucleofector(瑞士龙沙集团)将EGFP基因转移至大鼠海马神经元。将细胞与未转染的神经元混合，并接种在放有盖玻片(松浪玻璃工业公司(Matsunami Glass Ind.，Ltd.))后的聚-L赖氨酸涂布的24孔板(富尔肯公司)上。
按照以下的步骤，用海马神经元计数树突棘。将接种在放有盖玻片(松浪玻璃工业公司)的聚-L-赖氨酸涂布的24孔板(富尔肯公司)上的培养15天的大鼠海马神经元用对照抗体(人IgG2；西格玛奥德里奇公司)、抗体A或抗体B(6.7和20nM)处理24小时。然后，将盖玻片转移至2％PFA(富士胶片和光纯药株式会社)/4％蔗糖(富士胶片和光纯药株式会社)/PBS中并静置20分钟，以使细胞固定。将盖玻片从固定液中取出，转移至PBS中并洗涤3次。然后添加0.25％Triton X-100(富士胶片和光纯药株式会社)/PBS，并进行15分钟细胞渗透处理。将盖玻片转移至2％BSA(西格玛奥德里奇公司)/0.25％Triton X-100/OPTI-MEM(吉布科公司(GIBCO))中，封闭1小时，并且然后与抗GFP抗体(Nacalai Tesque公司)和抗Math2抗体(Abcam plc公司)在室温下反应1小时至1.5小时。去除第一抗体溶液，并将盖玻片用PBS洗涤3次，然后与第二抗体在室温下避光反应1小时。去除第二抗体溶液，并将盖玻片用PBS洗涤3次，然后用Prolong Gold抗荧光衰减封片剂(Prolong Gold antifade reagent)(分子探针公司(Molecular Probes，Inc.))封闭，随后在LSM800(卡尔·蔡司公司(Carl ZeissAG))下观察并获取分析图像。进行3次上述实验。从每个实验的2枚盖玻片上提取Math2阳性的锥体细胞样神经元，并通过图像分析软件Imaris(R)(Bitplane公司)计数其各自树突上的树突棘。计算各神经元每10μm的树突棘数。
抗体A和抗体B增加海马神经元的树突棘密度(图8)。此结果表明抗体A和抗体B具有稳定海马神经元树突棘的能力。

Claims (24)

1.一种抗EphA4抗体，其包含如下重链和如下轻链，
该重链包含：
(a)由SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(b)由SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和
(c)由SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且
该轻链包含：
(d)由SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(e)由SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和
(f)由SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；或者
该重链包含：
(g)由SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；
(h)由SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和
(i)由SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且
该轻链包含：
(j)由SEQ ID NO：44中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；
(k)由SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和
(1)由SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的抗EphA4抗体，其中
该抗EphA4抗体为人类抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗EphA4抗体，其中
该抗EphA4抗体与EphA4特异性结合并增强EphA4的切割。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该抗EphA4抗体与EphA4特异性结合并抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链包含由SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列组成的可变区，并且
该轻链包含由SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成的可变区。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区和该轻链的恒定区各自包含源自人类抗体的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区为人IgG的恒定区。
8.如权利要求7所述的抗EphA4抗体，其中
该人IgG的恒定区为人IgG2的恒定区。
9.如权利要求8所述的抗EphA4抗体，其中
该人IgG2的恒定区包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列。
10.如权利要求1至4中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链包含由SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列组成的可变区，并且
该轻链包含由SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列组成的可变区。
11.如权利要求1至4和10中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区和该轻链的恒定区各自包含源自人类抗体的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的恒定区为人IgG的恒定区。
13.如权利要求12所述的抗EphA4抗体，其中
该人IgG的恒定区为由人IgG1与人IgG2的组合组成的人IgG的恒定区。
14.如权利要求13所述的抗EphA4抗体，其中
该由人IgG1与人IgG2的组合组成的人IgG的恒定区包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。
15.如权利要求6至9和11至14中任一项所述的抗EphA4抗体，其中
该轻链的恒定区为人Igλ的恒定区。
16.如权利要求15所述的抗EphA4抗体，其中
该人Igλ的恒定区包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。
17.一种抗EphA4抗体，其包含
如下重链和如下轻链，其中
该重链包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，
该轻链包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，并且
该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。
18.如权利要求17所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的C末端赖氨酸缺失。
19.一种抗EphA4抗体，其包含
如下重链和如下轻链，其中
该重链包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，
该轻链包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并且
该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。
20.如权利要求19所述的抗EphA4抗体，其中
该重链的C末端赖氨酸缺失。
21.一种分离核酸，其编码如权利要求1至20中任一项所述的抗EphA4抗体。
22.一种载体，其包含如权利要求21所述的核酸。
23.一种宿主细胞，其包含如权利要求22所述的载体。
24.一种用于产生抗EphA4抗体的方法，其包括培养如权利要求23所述的宿主细胞的步骤。
CN202180081671.3A 2020-12-24 2021-12-22 抗EphA4抗体 Pending CN116528899A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-214958 2020-12-24
JP2020214958 2020-12-24
PCT/JP2021/047534 WO2022138708A1 (ja) 2020-12-24 2021-12-22 抗ＥｐｈＡ４抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116528899A true CN116528899A (zh) 2023-08-01

Family

ID=82157006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180081671.3A Pending CN116528899A (zh) 2020-12-24 2021-12-22 抗EphA4抗体

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20230357386A1 (zh)
EP (1) EP4269588A1 (zh)
JP (1) JPWO2022138708A1 (zh)
KR (1) KR20230123923A (zh)
CN (1) CN116528899A (zh)
AR (1) AR124467A1 (zh)
AU (1) AU2021410893A1 (zh)
CA (1) CA3192342A1 (zh)
CL (1) CL2023001651A1 (zh)
CO (1) CO2023005482A2 (zh)
IL (1) IL303223A (zh)
MX (1) MX2023004850A (zh)
TW (1) TW202241949A (zh)
WO (1) WO2022138708A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2031064A1 (de) 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
WO2012081502A1 (ja) * 2010-12-17 2012-06-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 ゼラチナーゼによるEphA4の切断反応を指標としたスクリーニング方法
GB201107996D0 (en) 2011-05-13 2011-06-29 Vib Vzw EphA4 is a diease modifier in motor neuron disease
JP6811706B2 (ja) * 2014-07-31 2021-01-13 ザ ホンコン ユニヴァーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー Ｅｐｈａ４に対するヒトモノクローナル抗体及びそれらの使用
KR20180041136A (ko) * 2015-09-08 2018-04-23 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-epha4 항체

Also Published As

Publication number Publication date
CO2023005482A2 (es) 2023-05-19
US20230357386A1 (en) 2023-11-09
TW202241949A (zh) 2022-11-01
JPWO2022138708A1 (zh) 2022-06-30
KR20230123923A (ko) 2023-08-24
CL2023001651A1 (es) 2023-12-15
AR124467A1 (es) 2023-03-29
CA3192342A1 (en) 2022-06-30
AU2021410893A1 (en) 2023-06-08
EP4269588A1 (en) 2023-11-01
IL303223A (en) 2023-07-01
MX2023004850A (es) 2023-05-10
WO2022138708A1 (ja) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107847595B (zh) 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法
JP6641305B2 (ja) 微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片
RU2536247C2 (ru) Применение антитела против tau ps422 для лечения заболеваний головного мозга
KR20200029619A (ko) 인지증 치료제 또는 예방제
JP7072114B2 (ja) 抗ＥｐｈＡ４抗体
WO2018030405A1 (ja) Ｈｍｇｂ１に対する抗体、及びそれを含有するアルツハイマー病を治療又は予防するための組成物
JP2021119781A (ja) 微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片
EP4269588A1 (en) Anti-epha4 antibody
WO2022138707A1 (ja) 筋萎縮性側索硬化症の治療用医薬組成物
EA039569B1 (ru) Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40092741

Country of ref document: HK