EA030481B1 - Ингибиторы аргининметилтрансферазы и их применения - Google Patents

Ингибиторы аргининметилтрансферазы и их применения Download PDF

Info

Publication number
EA030481B1
EA030481B1 EA201591531A EA201591531A EA030481B1 EA 030481 B1 EA030481 B1 EA 030481B1 EA 201591531 A EA201591531 A EA 201591531A EA 201591531 A EA201591531 A EA 201591531A EA 030481 B1 EA030481 B1 EA 030481B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
methyl
mmol
compound according
ethyl
compound
Prior art date
Application number
EA201591531A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591531A1 (ru
Inventor
Ричард Чесуорт
Лорна Хелен Митчелл
Гидеон Шапиро
Керрен Калаи Суингер
Original Assignee
Эпизим, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эпизим, Инк. filed Critical Эпизим, Инк.
Publication of EA201591531A1 publication Critical patent/EA201591531A1/ru
Publication of EA030481B1 publication Critical patent/EA030481B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4155—1,2-Diazoles non condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/08—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing alicyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/08—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing alicyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems

Abstract

В изобретении описываются соединения формулы (I), где все значения заместителей такие, как в формуле изобретения, их фармацевтически приемлемые соли и их фармацевтические композиции. Описанные в изобретении соединения являются применимыми для ингибирования аргининметилтрансферазной активности. Также описываются способы применения соединений для лечения опосредованных аргининметилтрансферазой нарушений.

Description

настоящее изобретение каким-либо образом.
Способы синтеза
Общие способы и экспериментальные процедуры получения и характеристики соединений по настоящему изобретению приведены ниже. Во всех случаях, если это было необходимым, реакции нагревали с помощью стандартной нагревательной плиты, или нагревателя колб, или оборудования с микроволновым излучением. Реакции проводили при перемешивании или без него, при атмосферном или повышенном давлении либо в открытых, либо в закрытых емкостях. Прохождение реакции контролировали с помощью традиционных методик, таких как TLC, HPLC, UPLC или LCMS, используя оборудование и способы, описанные ниже. Реакции гасили и неочищенные соединение выделяли с помощью традиционных способов, как описано в конкретных приведенных примерах. Удаление растворителя осуществляли с нагреванием или без него, при атмосферном или пониженном давлении, используя либо роторный, либо центробежный испаритель.
Очистку соединений проводили при необходимости, используя разные стандартные методики, в том числе без ограничения препаративную хроматографию в кислых, нейтральных или щелочных условиях, используя HPLC либо с нормальной фазой, либо с обращенной фазой, или колонки для флешхроматографии, либо пластины для препаративной TLC. Подтверждение чистоты и массы соединения проводили с помощью оборудования для стандартной HPLC и/или UPLC, и/или MS-спектрометрии, и/или LCMS, и/или GC (например., в том числе следующее оборудование: Waters Alliance 2695 с детектором 2996 PDA, соединенны с детектором ZQ и источником ESI; Shimadzu LDMS-2020; Waters Acquity класса Н с детектором PDA, соединенным с детектором SQ и источником ESI; Agilent 1100 Series с детектором PDA; Waters Alliance 2695 с детектором 2998 PDA; AB SCIEX API 2000 с источником ESI; Agilent 7890 GC). Иллюстративные соединения растворяли либо в МеОН, либо в MeCN до концентрации, составляющей приблизительно 1 мг/мл, и анализировали путем введения 0,5-10 в соответствующую систему для LCMS с помощью способов, приведенных в следующей таблице:
- 131 030481
- 132 030481
Способ Колонка Подвижная фаза A Подвижная фаза В Скорость потока (мл/мин.) Профиль градиента Температура MS термблока (°C) Напряжение MS детектора (кВ)
Η Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 100% В в течение 2,20 минуты, 100% В в течение 1,00 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 0,95
I Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA От 5% до 100% В в течение 1,20 минуты, 100% В в течение 1,00 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 0,95
J Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 70% В в течение 3,20 минуты, 70% В в течение 0,75 минуты, от 70% до 5% В в течение 0,35 минуты, затем остановка 250 0,95
к Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 80% В в течение 3,00 минуты, 80% В в течение 0,8 минуты, от 80% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 1,5
L Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA От 5% до 100% В в течение 3,00 минуты, 100% В в течение 0,8 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 1,5
Способ Μ N О Ρ Q Колонка Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Zorbax Eclipse Plus C18, 4,6 x 100 мм Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Подвижная фаза A Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Подвижная фаза В ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA Скорость потока (мл/мин.) 1 1 1 1 Профиль градиента От 5% до 100% В в течение 2,20 минуты, 100% В в течение 1,00 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 80% В в течение 2,20 минуты, 80% В в течение 1,0 минуты, от 80% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 70% В в течение 8,00 минуты,70% В в течение 2,0 минуты, затем остановка От 5% до 65% В в течение 3,00 минуты, 65% В в течение 0,80 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 60% В в течение 2,50 минуты, 60% В в течение 0,7 минуты, от 60% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка Температура MS термблока (°C) 250 250 250 250 250 Напряжение MS детектора (кВ) 1,5 1,5 1,5 1,5 0,95
R Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 50% В в течение 2,50 минуты, 50% В в течение 0,7 минуты, 250 0,95
133
030481
Способ Колонка Подвижная фаза А Подвижная фаза В Скорость потока (мл/мин.) Профиль градиента Температура MS термблока (°C) Напряжение MS детектора (кВ)
от 50% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка
s XBridge C18, 3,5 мкм, 3,0 x 50 мкм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 95% В в течение 2,20 минуты, 95% В в течение 1,00 минуты, от 95% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 0,9
τ Shim-pack XR-ODS, 1,6 мкм, 2,0 x 50 мм Вода/0,05% FA ACN/0,05% FA 0,7 От 5% до 100% В за 2,0 минуты, 100% В в течение 1,1 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 0,85
и Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0x50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 40% В в течение 2,50 минуты, 40% В в течение 0,7 минуты, от 40% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 0,95
V Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 60% В в течение 4,20 минуты, 60% В в течение 1,0 минуты, от 60% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 200 1,05
w Способ Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 x 50 мм Колонка Вода/0,05% TFA Подвижная фаза А ACN/0,05% TFA Подвижная фаза В 1 Скорость потока (мл/мин.) От 5% до 100% В в течение 2,20 минуты, 100% В в течение 1,00 минуты, от 100% до 5% В в течение Профиль градиента 0,1 минуты, затем остановка 200 Температура MS термблока .СО 0,95 Напряжение MS детектора (кВ)
X Y Ζ Al Shim-pack XR-ODS, 1,6 мкм, 2,0 х 50 мм Ecliplis Plus С18, 3,5 мкм, 4,6 х 50 мкм Ecliplis Plus С18, 3,5 мкм, 4,6 х 50 мкм Shim-pack XR-ODS, 2,2 мкм, 3,0 х 50 мм Вода/0,05% FA Вода/0,05% TFA Вода/10 мМ аммония карбонат Вода/0,05% TFA ACN/0,05% FA ACN ACN/5% воды ACN 0,7 1 1 От 5% до 100% В за 2,0 минуты, 100% В в течение 1,1 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 100% В в течение 2,0 минуты, 100% В в течение 1,0 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 100% В в течение 2,0 минуты, 100% В в течение 1,0 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 100% В в течение 2,0 минуты, 100% В в течение 1,0 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 200 250 250 250 0,85 1 U 1
Α2 Ecliplis Plus С18, 3,5 мкм, 4,6 х 50 мкм Вода/10 мМ аммония ацетат ACN От 5% до 100% В в течение 2,0 минуты, 100% В в течение 1,4 минуты, от 100% до 5% В в течение 250 0,95
134
030481
Способ Колонка Подвижная фаза A Подвижная фаза В Скорость потока (мл/мин.) Профиль градиента Температура MS термблока (°C) Напряжение MS детектора (кВ)
0,1 минуты, затем остановка
АЗ Acquity ВЕН С18, 1,7 мкм, 2,1 X 50 мм Вода/5 мМ аммония ацетат/0,1% FA ACN/0,1% FA 0,55 5% В в течение от 0,01 мин. до 0,4 мин., 35% В в течение от 0,8 мин., 55% В в течение 1,2 мин., 100% В в течение 1,3 минуты, в течение от 2,5 мин. до 3,30 мин., 5% В в течение от 3,31 мин. до 4,0 мин., затем остановка
А4 Shim-pack XR-ODS 3,0 X 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 От 5% до 30% В в течение 8,0 минуты, 30% В в течение 2,0 минуты, затем остановка 250 1,5
А5 Shim-pack XR-ODS 3,0 х 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA От 5% до 100% В в течение 2,2 минуты, 100% В в течение 1,0 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка 250 1,5
А6 Atlantis HILIC 3,0 х 100 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 0,8 От 95% до 60% В в течение 4,0 минуты, 60% В в течение 4,0 минуты, затем остановка 250 1,5
А7 Shim-pack XR-ODS 3,0 x 50 мм Вода/0,05% TFA ACN/0,05% TFA 1 5% В в течение 0,5 минуты, от 5% до 75% В в течение 2,2 минуты, 100% В в 250 1,5
Способ А8 А9 А10 АП Колонка Zorbax SBi C18 5 мкм, 4,6 x 150 мм Shim-pack XR-ODS 3,0 x 50 мм Atlantis T3 3 мкм, 4,6 x 100 мм Shim-pack XR-ODS, 3,0 x 50 мм Подвижная фаза А Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Вода/0,05% TFA Подвижная фаза В ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA ACN/0,05% TFA Скорость потока (мл/мин.) 1,2 1 1 1 Профиль градиента течение 1,0 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка От 5% до 70% В в течение 10,0 минуты, 70% В в течение 5,0 минуты, затем остановка От 5% до 40% В в течение 4,4 минуты, 40% В в течение 0,9 минуты, затем остановка От 5% до 50% В в течение 8,0 минуты, 50% В в течение 2,0 минуты, затем остановка 5% В в течение 0,5 минуты, от 5% до 100% В в течение 1,7 минуты, 100% В в течение 1,0 минуты, от 100% до 5% В в течение 0,1 минуты, затем остановка Температура MS термблока (°C) 250 250 200 250 Напряжение MS детектора (кВ) 1,05 0,95 1,05 1,50
Проверку структуры соединений проводили с использованием стандартных ЯМР-спетрометров на 300 или 400 МГц с NGe (ядерным эффектом Оверхауза) при необходимости.
135
030481
Сокращение Значение
ACN Ацетонитрил
атм. Атмосфера
DCM дихлорметан
DHP Дигидропиран
DIBAL Диизобутил алюминия гидрид
DIEA Диизопропилэтиламин
DMF Диметилформамид
DMF-DMA Диметил формамид-диметилацеталь
DMSO Диметилсульфоксид
dppf 1,1 '-бис(дифенилфосфино)ферроцен
ЕА Этилацетат
ESI Ионизация элетрораспылением
EtOH Этанол
FA Муравьиная кислота
GC Газовая хроматография
ч. Час
Hex Гексаны
HMDS Г ексаметилдисилазид
ПРЕС Высокоэффективная жидкостная хроматография
IPA Изопропанол
LCMS Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
MeOH Метанол
мин. Минуты
NBS А-бромсукцинимид
NCS А-хлорсукцинимид
NIS А-йодсукцинимид
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
NOe Ядерный эффект Оверхауза
Преп. Препаративная
PTSA пара-толуол сульфонова кислота
Rf Коэффициент удерживания
K. T, Комнатная температура
RT Время удерживания
нас. насыщенный
SGC Хроматография с силикагелем
TBAF Тетрабутил аммония фторид
TEA Триэтил амин
TFA Трифторукусная кислота
THF Т етрагидрофуран
TLC Тонкослойная хроматография
UPLC Сверхпроизводительная жидкостная хроматография
LiHMDS Лития гексаметилдисилазид
TMAD Тетраметилазокарбоксамид
Синтез промежуточных соединений
Синтез промежуточного соединения трет-бутил (2-(((3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)карбамата
Стадия 1. трет-Бутил (2-(((3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил) амино)этил)карбамат
- 136 030481
Смесь 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида (3,2 г, 10,45 ммоль, 1,00 эквив.), третбутил ^[2-(метиламино)этил]карбамата (2,2 г, 12,63 ммоль, 1,21 эквив.) и NaBH(OAc)3 (6,65 г, 31,38 ммоль, 3,00 эквив.) в дихлорэтане (30 мл) перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакцию гасили с помощью 50 мл насыщенного водного раствора натрия бикарбоната. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3x200 мл дихлорметана. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке силикагеля, проводя элюирование с помощью 30-100% этилацетата в петролейном эфире, с получением 4,05 г (83%) трет-бутил (2-(((3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино) этил)карбаматав виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,48 (s, 1H), 5,35-5,30 (m, 1H), 4,13-4,03 (m, 1H), 3,71-3,63 (m, 1H), 3,36 (s, 2H), 3,26-3,25 (m, 2H), 2,52-2,49 (m, 2H), 2,21 (s, 3H), 2,092,01 (m, 3H), 1,68-1,58 (m, 3H), 1,44 (s, 9H) ppm. LCMS (способ С, ESI): RT = 0,58 мин, масса/заряд = 465,0 [M+H]+.
Синтез промежуточного соединения трет-бутил (2-(((3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)(метил)карбамата
Стадия 1. Этил 3-йод-Ш-пиразол-4-карбоксилат
В перемешиваемый раствор этил 3-амино-Ш-пиразол-4-карбоксилата (10 г, 64,45 ммоль, 1,00 эквив.) в 50% серной кислоте (90 мл) при 5°С добавляли по каплям раствор NaNO2 (7,4 г, 107,25 ммоль, 1,66 эквив.) в воде (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при 5°С в течение дополнительных 30 мин Раствор KI (32,1 г, 193,37 ммоль, 3,00 эквив.) в воде (15 мл) добавляли по каплям при 5°С. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 5°С в течение 1 ч, а затем гасили добавлением 50 мл воды. Осадок собирали фильтрацией, а затем растворяли в 150 мл этилацетата. Полученный в результате раствор последовательно промывали 1x100 мл насыщенного раствора Na2SO3, 1x100 мл насыщенного раствора натрия бикарбоната и 1x100 мл солевого раствора. Органический слой сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом с получением 10,8 г (63%) этил 3-йод-Ш-пиразол-4карбоксилата в виде желтого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 8,18 (s, 1H), 4,38-4,29 (m, 2H), 1,41-1,33 (m, 3H) ppm. LCMS (способ В, ESI): RT = 1,36 мин, масса/заряд = 267,0 [М+Н]+.
Стадия 2. Этил 3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-карбоксилат
Раствор этил 3-йод-Ш-пиразол-4-карбоксилата (10,8 г, 40,60 ммоль, 1,00 эквив.), 3,4-дигидро-2Hпирана (10 г, 118,88 ммоль, 2,93 эквив.) и TsOH (780 мг, 4,53 ммоль, 0,11 эквив.) в THF (100 мл) перемешивали в течение 2 ч при 60°С. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и гасили добавлением 100 мл насыщенного раствора натрия бикарбоната. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 2x80 мл дихлорметана. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:20), с получением 13 г (91%) этил 3-йод1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбоксилата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 8,04 (s, 1H), 5,40-5,38 (m, 1H), 4,34-4,29 (m, 2H), 4,08-4,05 (m, 1H), 3,73-3,70 (m, 1H), 2,07-1,98 (m, 3H), 1,69-1,62 (m, 3H), 1,39-1,32 (m, 3H) ppm. LCMS (способ С, ESI): RT = 1,53 мин, масса/заряд = 351,0 [M+H]+.
- 137 030481
Стадия 3. 3-Йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-карбоновая кислота
В раствор этил 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбоксилата (85 г, 242,75 ммоль, 1,00 эквив.) в THF (300 мл) и метанола (300 мл) добавляли раствор LiOH (17,5 г, 730,69 ммоль, 3,01 эквив.) в воде (400 мл). Полученный в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрировали под вакуумом для удаления органического растворителя. Полученный в результате раствор разбавляли с помощью 400 мл H2O, а затем подкисляли до pH 6,0 с помощь 1М хлористоводородной кислоты. Смесь экстрагировали с помощью 3x200 мл дихлорметана. Объединенные органические слои промывали с помощью 3x1000 мл солевого раствора, сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом с получением 75 г (96%) 3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4карбоновой кислоты в виде беловатого твердого вещества. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,23 мин, масса/заряд = 323,0 [М+Н]+.
Стадия 4. (3-Йод-1 -(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол^-ил^етанол
В раствор 3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4-карбоновой кислоты (28 г, 86,93 ммоль, 1,00 эквив.) в безводном THF (300 мл) в атмосфере азота при 5°С добавляли по каплям 1М раствора ВНз в THF (300 мл) при перемешивании. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, а затем гасили добавлением 300 мл насыщенного раствора NH4O. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3x1000 мл дихлорметана. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:1), с получением 12,67 г (47%) этил 3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метанола в виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 7,73 (s, 1H), 5,37-5,34 (m, 1H), 4,92 (s, 1H), 4,20 (d, J= 3,6 Гц, 2H), 3,89-3,88 (m, 1H), 3,653,57 (m, 1H), 2,09-2,00 (m, 1H), 1,99-1,90 (m, 2H), 1,69-1,61 (m, 1H), 1,49-1,46 (m, 2H) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT = 1,16 мин, масса/заряд = 309,0 [М+Н]+.
Стадия 5. 3 -Йод-1-(тетрагидро-2 Ш-пиран^-ил)- Ш-пиразол^-карбальдегид
250-мл 3-х горлую круглодонную колбу продували и. В перемешиваемый раствор оксалихлорида (18,576 г, 146,35 ммоль, 3,01 эквив.) в безводном дихлорметане (300 мл) в атмосфере азота при -78°С добавляли по каплям DMSO (15,138 г, 193,75 ммоль, 3,98 эквив.). Реакционную смесь перемешивали при -65°С в течение 30 мин Затем раствор (3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метанола (15,0 г, 48,68 ммоль, 1,00 эквив.) в дихлорметане (100 мл) добавляли по каплям при -65°С и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительных 60 мин при -65°С. Триэтиламин (40,6 мл) добавляли по каплям при -65°С и реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при -65°С. Реакционную смесь нагревали до °С, а затем гасили добавлением 100 мл насыщенного раствора NH4O. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3x400 мл дихлорметана. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:20), с получением 13,48 г (90%) 3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4-карбальдегида в виде золотистого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 9,69 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 5,49 (dd, J= 2,7 Гц, 9,9 Гц, 1H), 3,95-3,91 (m, 1H), 3,68-3,62 (m, 1H), 2,11-2,01 (m, 3H), 1,69-1,62 (m, 3H) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT = 1,35 мин, масса/заряд = 307,0 [M+H]+.
Стадия 6. трет-Бутил (2-(((3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил) амино)этил)(метил)карбамат
- 138 030481
Смесь 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида (21,5 г, 70,42ммоль, 1,00 эквив.), третбутил Х-метил-Б1-(2-(метиламино)этил)карбамата (20 г, 106,23 ммоль, 1,51 эквив.) и NaBH(OAc)3 (29,8 г, 137,98 ммоль, 1,96 эквив.) в дихлорэтане (300 мл) перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли с помощью 300 мл дихлорметана, а затем промывали 3x300 мл солевого раствора. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 0-7% метанола в дихлорметане, с получением 31 г (92%) трет-бутил (2-(((3-йод-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)(метил)карбамата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,62 (s, 1H), 5,34-5,30 (m, 1H), 4,06-4,02 (m, 1H), 3,68-3,62 (m, 1H), 3,42-3,38 (m, 4H), 2,85 (s, 4H), 2,62-2,53 (m, 2H), 2,47-2,46 (m, 2H), 2,13-1,97 (m, 3H), 1,74-1,69 (m, 3H), 1,46 (s, 9H) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT - 1,17 мин, масса/заряд = 479,0 [М+Н]+.
Соединение 23. N1-((3 -(4-Фторфенэтил)- Ш-пиразол-4-ил)метил)-А-метилэтан-1,2-диамин
Стадия 1. (R/S) (E)-3-(4-Фторстирил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-карбальдегид
Смесь (R/S) 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида (800 мг, 2,61 ммоль, 1,00 эквив.), 1этенил-4-фторбензола (957 мг, 7,84 ммоль, 3,00 эквив.), Pd(PPh3)4 (302 мг, 0,26 ммоль, 0,10 эквив.) и калия карбоната (1082 мг, 7,83 ммоль, 3,00 эквив.) в ^^диметилформамиде (10 мл) перемешивали в атмосфере азота при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем гасили добавлением 100 мл воды. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3x100 мл этилацетата. Объединенные органические слои промывали 3x100 мл солевым раствором, сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 1-15% этилацетата в петролейном эфире, с получением 220 мг (28%) (Е)-3-(4-фторстирил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-карбальдегида в виде желтого масла. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,49 мин, масса/заряд = 301,0 [М+Н]+.
Стадия 2. (R/S) (Е)-трет-Бутил 2-(((3-(4-фторстирил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4ил)метил)(метил)амино)этил)карбамат
В раствор (R/S) (E)-3-(4-фторстирил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-карбальдегида (220 мг, 0,73 ммоль, 1,00 эквив.) и трет-бутил №[2-(метиламино)этил] карбамата (153 мг, 0,88 ммоль, 1,20 эквив.) в 1,2-дихлорэтане (10 мл) добавляли NaBH(OAc)3 (311 мг, 1,44 ммоль, 1,97 эквив.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем разбавляли с помощью 100 мл этилацетата. Полученную в результате смесь промывали 3x100 мл солевым раствором, сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 20-60% этилацетата в петролейном эфире, с получением 220 мг (65%) (R/S) (Е)-трет-бутил 2-(((3-(4-фторстирил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил) (метил)амино)этил)карбамата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 8,20 (br s, 1H), 7,517,36 (m, 3H), 7,05 (t, J= 8,7Гц, 2H), 6,90 (d, J= 15,9Гц, 1H), 5,38 (t, J= 2,7Гц, 1H), 4,12 (s, 2H), 3,75-3,68 (m, 1H), 3,51 (br s, 2H), 2,98 (br s, 1H), 2,60 (br s, 2H), 2,19-2,08 (m, 6H), 1,72-1,62 (m, 3H) ppm. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,31мин, масса/заряд = 459,2 [M+H]+.
Стадия 3. (R/S) трет-Бутил 2-(((3-(4-фторфенэтил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил) метил)(метил)амино)этил)карбамат
- 139 030481
Смесь (R/S) (Е)-трет-бутил 2-(((3-(4-фторстирил)-1-(тeтрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил) метил)(метил)амино)этил)карбамата (220 мг, 0,48 ммоль, 1,00 эквив.) и Ni Ренея (20 мг) в метаноле (50 мл) перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 4 ч Катализатор удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 1-7% этилацетата в петролейном эфире, с получением 150 мг (68%) (R/S) трет-бутил 2-(((3 -(4-фторфенил)- 1-(тeтрагидро-2H-пиран-2-ил)-1 H-пиразол-4-ил)мeтил)(мeтил) амино)этил)карбамата в виде бесцветного масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,11 (t, J= 7,8Гц, 2H), 6,94 (t, J= 8,7Гц, 2H), 5,31 (d, J= 6,6Гц, 1H), 4,08 (d, J= 11,4Гц, 1H), 3,69 (t, J= 11,4Гц, 1H), 3,44 (br s, 4H), 3,002,85 (m, 4H), 2,12-2,09 (m, 3H), 1,76-1,52 (m, 6H), 1,45 (s, 9H) ppm. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,29 мин, масса/заряд = 461,2 [M+H]+.
Стадия 4. 0-((3-(4-Фторфенэтил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)-0-метилэтан-1,2-диамин (соединение 23)
Раствор (R/S) трет-бутил 2-(((3-(4-фторфeнэтил)-1-(тeтрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил) метил)(метил)амино)этил)карбамата (150 мг, 0,33 ммоль, 1,00 эквив.) в 3N хлористоводородной кислоте (20 мл) перемешивали в течение ночи при 60°C. Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры и промывали 3x20 мл дихлорметана. Водный слой концентрировали под вакуумом и неочищенный продукт очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (Prep-HPLC-025): колонка, XBridge Prep Phenyl OBD Column, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 10 ммольми NH4HCO3 и MeCN (от 20,0% MeCN до 30,0% в течение 10 мин, до 95,0% в течение 1 мин, удерживание при 95,0% в течение 1 мин, снижением до 20,0% в течение 2 мин); детектор, УФ 254/220 нм с получением 42,9 мг (26%) 0-((3-(4-фторфенэтил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)-0-метилэтан-1,2-диаминтрифторацетата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O) δ: 7,70 (s, 1H), 6,98-6,86 (m, 4H), 3,86 (s, 2H), 3,30 (s, 4H), 2,97-2,80 (m, 4H), 2,58 (s, 3H) ppm. LCMS (способ G, ESI): RT = 1,22 мин, масса/заряд = 277,1 [М+Н]+.
Соединение 28. N1 -((3 -Изобутил-Ш-пиразол-4-ил)метил)-0-метилэтан-1,2-диамин
Стадия 1. трет-Бутил 2-(((3-изобутил-1-(тeтрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)мeтил)(мeтил) амино)этил)карбамат
Смесь (R/S) трет-бутил ^[2-([[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил](метил)амино)этил] карбамата (400 мг, 0,86 ммоль, 1,00 эквив.), (2-метилпропил)бороновой кислоты (168 мг, 1,65 ммоль, 1,50 эквив.), K3PO4-3H2O (877 мг, 3,00 эквив.) и A-Phos-PdCl2 (77,8 мг, 0,10 эквив.) в диметиловом эфире этиленгликоля (20 мл) и H2O (2 мл) перемешивали в атмосфере азота при 100°C в течение ночи. Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (1#-Pre-HPLC-005 (Waters)): колонка, XBridge Shield RP18 OBD Column, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 10 ммольми NH4HCO3 и CH3CN (от 18% CH3CN до 58% в течение 10 мин, до 95% в течение 1 мин, снижение до 18% в течение 2 мин); детектор, УФ 254/220 нм с получением 50 мг (15%) трет-бутил 2-(((3-изобутил-1-(тeтрагидро-2Hпиран-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)карбамата в виде бесцветного масла. LCMS (способ А, ESI): RT = 1,27 мин, масса/заряд = 395,0 [М+Н]+.
- 140 030481
Стадия 2. 0-((3-Изобутил-Ш-пиразол-4-ил)метил)-М1-метилэтан-1,2-диамин (соединение 28)
Раствор трет-бутил 2-(((3 -изо-бутил-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол-4-ил)метил)(метил) амино)этил)карбамата(50 мг, 0,13 ммоль, 1,00 эквив.) в THF (10 мл) и 12N хлористо-водородную кислоту (2 мл) перемешивали в течение ночи при 25°C. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли с помощью 5 мл тетрагидрофурана и значение pH раствора доводили до 9 с помощью 10% раствора натрия карбоната. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом и остаток растворяли в 5 мл метанола, затем очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (1#-Pre-HPLC-005 (Waters)): колонка, XBridge Shield RP18 OBD Column, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 10 ммольми NH4HCO3 и CH3CN (от 18% CH3CN до 58% в течение 10 мин, до 95% в течение 1 мин, снижение до 18% в течение 2 мин); детектор, УФ 254/220 нм с выходом 6 мг (23%) N1-((3-изобутил-1H-пиразол-4-ил)метил)-N-метилэтан-1,2-диамина в виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CD3OD) 7,49 (s, 1H), 3,44 (s, 2H), 2,84-2,80 (m, 2H), 2,56-2,50 (m, 4H), 2,21 (s, 3H), 2,03-1,93 (m, 1H), 0,95-0,92 (m, 6H) ppm. LCMS (способ АА1 ESI): RT = 1,02 мин, масса/заряд = 211,0 [М+Н]+.
Соединение 37. N1-Метил-N1-((3-(4-метилциклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)этан-1,2-диамин
Стадия 1. (R/S) трет-Бутил 2-(метил((3-(4-метилциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-
Смесь (R/S) трет-бутил Х-[2-([[3-йод-1-(оксан-2-из)-111-11иразол-4-ил|\1етил|(\'1етил)амипо)')тил| карбамата (50 мг, 0,11 ммоль, 1,00 эквив.), калия карбоната (45 мг, 0,33 ммоль, 3,02 эквив.), 4,4,5,5тетраметил-2-(4-метилциклогекс-1-ен-1-ил)-1,3,2-диоксаборолана (36 мг, 0,16 ммоль, 1,51 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (8 мг, 0,01 ммоль, 0,10 эквив.) в воде (1 мл) и 1,4-диоксане (10 мл) перемешивали в атмосфере азота при 100°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 0-50% этилацетата в петролейном эфире, с получением 30 мг (64%) (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4метилциклогекс-1 -енил)- 1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата в виде коричневого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,29 (s, 1H), 6,14-6,13 (m, 1H), 5,36-5,32 (m, 1H), 4,16-4,07 (m, 2H), 3,70-3,27 (m, 2H), 2,54-2,29 (m, 6H), 2,54-2,29 (m, 4H), 2,22 (s, 3H), 2,13-2,07 (m, 3H), 1,86-1,56 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,46-1,38 (m, 3H) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT = 1,31 мин, масса/заряд = 433,0 [M+H]+.
Стадия 2. (R/S) трет-Бутил 2-(метил((3-(4-метилциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-
Смесь (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4-метилциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата (200 мг, 0,46 ммоль, 1,00 эквив.) и 10% катализатора палладий на угле (30 мг) в метаноле (20 мл) перемешивали при 20 атм водорода в 50-мл реакторе высокого давления при 25°C в течение 2 дней. Катализатор удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 200 мг неочищенного (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4-метилциклогексил)-1(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата в виде желтого масла. Неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. LCMS (способ С, ESI): RT = 0,77 мин, масса/заряд = 435,0 [М+Н]+.
Стадия 3. N1-метил-N1-((3-(4-метилциклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)этан-1,2-диамин (соединение 37)
- 141 030481
Раствор (R/ S) трет-бутил 2-(метил((3 -(4-метилциклогексил)- 1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1 Hпиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата (200 мг, 0,46 ммоль, 1,00 эквив.) в 4N хлористоводородной кислоте (10 мл) перемешивали при 60°C в течение 2 ч Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (2H-Waters 2767-2(HPLC-08)): колонка, XBridge Shield RP 18, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 50 ммольми CF3COOH и CH3CN (от 10,0% CH3CN до 28,0% в течение 2 мин, до 46,0% в течение 10 мин, до 100,0% в течение 1 мин, снижение до 10,0% в течение 1 мин); детектор, УФ 254 нм с выходом 62,3 мг (28%) ^-метил-^-((3-(4-метилциклогексил)-Ш-пиразол4-ил)метил)этан-1,2-диаминтрифторацетата в виде бесцветного полутвердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,78 (s, 1H), 4,28 (s, 2H), 3,47-3,31 (m, 4H), 2,79-2,60 (s, 4H), 2,74-2,70 (m, 1H), 1,90-1,25 (m, 8H), 0,89 (d, J= 7,2 Гц, 3H) ppm. LCMS (способ V, ESI): RT= 1,51 мин, 9,12 мин, масса/заряд = 251,1 [M+H]+.
Соединение 38. N1-((3-(4,4-Диметилциклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-N1-метилэтан-1,2диамина
Стадия 1. (R/S) трет-Бутил 2-(((3-(4,4-диметилциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)карбамат
Смесь (R/S) трет-бутил N-[2-([[3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4-ил]метил](метил)амино)этил] карбамата (300 мг, 0,65 ммоль, 1,00 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (52 мг, 0,07 ммоль, 0,11 эквив.), 2-(4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана (229 мг, 0,97 ммоль, 1,50 эквив.) и калия карбоната (268 мг, 1,94 ммоль, 3,00 эквив.) в 1,4-диоксане (20 мл) и воде (4 мл) перемешивали в атмосфере азота при 100°C в течение ночи. Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 1-41% этилацетата в петролейном эфире, с получением 250мг (87%) (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4,4-метилциклогекс-1 -енил)-1 -(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол-4-ил)метилХметил) амино)этил)карбамата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,50 (s, 1H), 6,14-6,13 (m, 1H), 5,36-5,32 (m, 1H), 4,18-4,07(m, 2H), 3,74-3,67 (m, 1H), 3,41-3,25 (m, 4H), 2,51-2,50 (m, 3H), 2,20-2,02 (m, 6H), 1,73-1,71 (m, 3H), 1,70-1,66 (m, 6H), 1,47(s, 9H), 1,28-1,26 (m, 4H) ppm. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,33 мин, масса/заряд = 447,0 [M+H]+.
Стадия 2. (R/S) трет-Бутил 2-(((3-(4,4-диметилциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)карбамат
Смесь (R/S) трет-бутил 2-(((3-(4,4-диметилциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этилкарбамата (250 мг, 0,56 ммоль, 1,00 эквив.) и 10% катализатора палладий на угле (30 мг) в метаноле (20 мл) перемешивали при 20 атм. водорода в а 50-мл реакторе высокого давления при 25°C в течение 2 дней. Катализатор удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 250 мг неочищенного (R/S) трет-бутил 2-(((3-(4,4-диметилциклогексил)-1(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)карбамата в виде желтого масла. Неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. LCMS (способ С, ESI): RT = 0,80 мин, масса/заряд = 449,0 [М+Н]+.
Стадия 3: ^-((3-(4,4-Диметилциклогексил^Ш-пиразол^-и^метилХ^-метилэтанП,2-диамин (со- 142 030481
единение 38)
Раствор (R/S) трет-бутил 2-(((3-(4,4-диметилциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)карбамата (250 мг, 0,56 ммоль, 1,00 эквив.) в 4N хлористо-водородной кислоте (10 мл) перемешивали при 60°C в течение 2 ч Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (2H-Waters 2767-2(HPLC-08)): колонка, XBridge Shield RP 18,5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 50 ммоль CF3COOH и CH3CN (от 10,0% CH3CN до 28,0% в течение 2 мин, до 46,0% в течение 10 мин, до 100,0% в течение 1 мин, снижение до 10,0% в течение 1 мин); детектор, УФ 254 нм с выходом 171,2 мг (62%) Х-метил-Х-((3-(4,4-диметилциклогексил)-Ш-пиразол-4ил)метил)-^-метилэтан-1,2-диамин трифторацетата виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,75 (s, 1H), 4,30 (s, 2H), 3,47-3,35 (m, 4H), 2,77 (s, 3H), 2,68-2,58 (m, 1H), 1,71-1,53 (m, 4H), 1,491,37 (m, 2H), 1,31-1,17 (m, 2h), 1,89 (s, 3H), 1,87 (s, 3H) ppm. LCMS (способ M, ESI): RT =1,15, масса/заряд = 265,1 [M+H]+.
Соединение 39. №((3-(1-Изобутилпиперидин-4-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)-Х^2-диметилэтан-1,2диамин
Стадия 1. (R/S) трет-Бутил 2-(((3-(1-изобутилпиперидин-4-ил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил)(метил)карбамат
В раствор (R/S) трет-бутил №метил-Щ2-[метил([[1-(оксан-2-ил)-3-(пиперидин-4-ил)-Ш-пиразол-4ил]метил])амино]этил]карбамата (250 мг, 0,57 ммоль, 1.00 эквив.) и 2-метилпропаналя (62 мг, 0,86 ммоль, 1,50 эквив.) в 1,2-дихлорэтане (15 мл) добавляли NaBH(OAc)3 (364 мг, 3,00 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрировали под вакуумом с получением 160 мг неочищенного (R/S) трет-бутил 2-(((3-(1-изобутилпиперидин-4ил)-1 -(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1 H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил(метил)карбамата в виде светло-желтого масла. LCMS (способ A, ESI): RT = 1,52 мин, масса/заряд = 492,2 [М+Н]+.
Стадия 2. Х-((3-(1-Изобутилпиперидин-4-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)-Х,^-диметилэтан-1,2диамин (соединение 39)
Раствор трет-бутил 2-(((3 -(1 -изобутилпиперидин-4-ил)- 1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-111-пиразол-4ил)метил)(метил)амино)этил)(метил)карбамата (130 мг, 0,26 ммоль, 1,00 эквив.) в этаноле (2 мл), 1,4диоксане (4 мл) и 3N хлористоводородной кислоты (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи.
Реакционную смесь концентрировали под вакуумом и остаток очищали с помощью Pre-HPLC при следующих условиях (1#-Pre-HPLC-005(Waters)): колонка, SunFire Prep С18 OBD Column, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, фаза А: вода с 0,05% TFA; фаза В: MeCN (от 5% CH3CN до 17% в течение 10 мин, снижение до 0% в течение 0 мин); детектор, УФ 254/220 нм с получением 39,5 мг (28%) N1-((3-(1изобутилпиперидин-4-ил)- Ш-пиразол-4-ил)метил)-^,^-диметилэтан-1,2-диаминтрифторацетата в виде бесцветного твердого вещества. Ш-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,81 (s, 1H), 4,32 (s, 2H), 3,71-3,35 (m, 7H), 3,15-2,89 (m, 4H), 2,82-2,68 (m, 6H), 2,22-1,92 (m, 5H), 0,93 (d, J= 6,8 Гц, 6H) ppm. LCMS (способ U, ESI): масса/заряд = 308,2 [M+H]+.
Соединение 40. 3-Метил-1-(4-(4-((метил(2-(метиламино)этил)амино)метил)-Ш-пиразол-3-ил)пиперидин-1-ил)бутан-1-она
- 143 030481
Стадия J. (R/S) Бензил 4-(4-(((2-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)этилXметил)амино)метил)-J(тетрагидро-2H-пиран-2-иI)-1H-пиразоI-3-иI)-5,6-дигидропиридин-1(2H)-карбоксиIата
Смесь (R/S) трет-бутил N-[2-([[4-йод-J-(оксан-2-ил)-JH-пиррол-3-ил]метил](метил)амино)этил]-Nметилкарбамата (3Д5 г, 6,60 ммоль, J,00 эквив.), бензил 4-(тетраметил-J,3,2-диоксаборолан-2-ил)-J,2,3,6тетрагидропиридинП-карбоксилата (2,5 г, 7,28 ммоль, J,J0 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (J,39 г, J,90 ммоль, 0,29 эквив.) и калия карбоната (2,72 г, J9,68 ммоль, 2,98 эквив.) в ^4-диоксане (30 мл) и воде (3 мл) перемешивали в атмосфере азота при J00°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем гасили добавлением 30 мл воды. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3x250 мл этилацетата. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 0-J5% этилацетата в петролейном эфире, с получением 2,J г (56%) (R/S) бензил 4-(4-(((2(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)этил)(метил)амино)метил)- J -(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- JHпиразол-3-ил)-5,6-дигидропиридин-1(2H)-карбоксилата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,58-7,49 (m, JH), 7,49-7,35 (m, 4H), 7,35-7,30 (m, JH), 5,33-5,30 (m, JH), 5,20 (s, 2H), 4,25-4,00 (m, 3H), 3,70-3,69 (m, 3H), 3,39-3,3j (m, 3H), 2,84 (m, 3H), 2,66 (m, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 2,08-2,07 (m, 3H), J,73-J,62 (m, 4H), J,46 (s, 9H), J,3J-J,27 (m, JH) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT = 0,74 мин, масса/заряд = 568,0 [M+H]+.
Стадия 2. (R/S) трет-Бутил метил(2-(метил((3-(пиперидин-4-ил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата
Смесь бензил 4-(4-(((2-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)этил)(метил)амино)метил)- П(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-3-ил)-5,6-дигидропиридин-1(2H)-карбоксилата (2 г, 3,52 ммоль, J,00 эквив.) и J0% катализатора палладий на угле (2 г) в метаноле (J00 мл) перемешивали при давлении водорода J атмосфера при комнатной температуре в течение 6 ч Катализатор удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали под вакуумом с выходом j,j г (72%) (R/S) трет-бутил метил(2-(метил((3(пиперидин-4-ил)- 1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата в виде коричневого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDQ3): δ 7,46 (s, JH), 5,33-5,32 (m, JH), 4,24-4,06 (m, JH), 3,753,66 (m, JH), 3,5J (s, JH), 3,4J-3,J5 (m, 6H), 2,95-2,70 (m, 6H), 2,62-2,40 (m, 2H), 2,22 (s, 3H), J,55-J,4J (m, J0H), J,35-J,2J (m, JH) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT = J,49 мин, масса/заряд = 436,2 [М+Н]+.
Стадия 3. (R/S) трет-Бутил метил(2-(метил((3-(J-(3-метилбутаноил)пиперидин-4-ил)-J-(тетрагидро2^пиран-2-ил)- JH-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамат
В раствор (R/S) трет-бутил метил(2-(метил((3-(пиперидин-4-ил)-J-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-JHпиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата (200 мг, 0,46 ммоль, J,00 эквив.) и триэтиламина (J,J4 г, JJ,26 ммоль, 24,52 эквив.) в дихлорметане (J5 мл) добавляли 3-метилбутаноил хлорид (67 мг, 0,56 ммоль, J,2J эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч Реакционную смесь затем гасили добавлением 2 мл воды. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом с получением 250 мг неочищенного (R/S) трет-бутил ме- J44 030481
тил(2-(метил((3-(1 -(3 -метилбутаноил)пиперидин-4-ил)-1 -(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол-4ил)метил)амино)этил)карбамата в виде желтого твердого вещества. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,22 мин, масса/заряд = 520,0 [М+Н]+.
Стадия 4. 3-метил-1-(4-(4-((метил(2-(метиламино)этил)амино)метил)-1Ш-пиразол-3-ил)пиперидин1-ил)бутан-1-он (соединение 40)
Раствор трет-бутил метил(2-(метил((3-(1 -(3 -метилбутаноил)гашеридин-4-ил)-1 -(тетрагидро-2Hпиран-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата (110 мг, 0,21 ммоль, 1.00 эквив.) в этаноле (2 мл), 1,4-диоксан (4 мл) и 12N хлористо-водородной кислоты (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом и остаток очищали с помощью Pre-HPLC при следующих условиях (1#-Pre-HPLC-005(Waters)): колонка, XBridge Shield RP18 OBD Column, 5 мкм, 19 x 150 мм; подвижная фаза, вода с 10 ммольрным NH4HCO3 и CH3CN (от 18% CH3CN до 58% в течение 10 мин, до 95% в течение 1 мин, снижение до 18% в течение 2 мин); детектор, УФ 254/220 нм с получением 17,7 мг (25%) 3-метил-1-(4-(4-((метил(2-(метиламино)этил)амино)метил)-Ш-пиразол-3-ил)пиперидин-1-ил)бутан-1-она в виде бесцветного твердого вещества. А-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,53 (s, 1H), 4,50-4,40 (m, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 3,44 (s, 2H), 3,25-3,10 (m, 1H), 3,09-2,95 (m, 1H), 2,80-2,65 (m, 3H), 2,53-2,43 (m, 2H), 2,40-2,20 (m, 5H), 2,13 (s, 3H), 2,00-1,75 (m, 3H), 1,72-1,43 (m, 2H), 0,88 (d, J= 6,8 Гц, 6H) ppm. LCMS (способ R, ESI): RT = 1,26 мин, масса/заряд = 336,2 [M+H]+.
Соединение 43. N1-Метил-N1-((3-(4-морфолиноциклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)этан-1,2диамин
Стадия 1. (R/S) трет-Бутил 2-(метил((3-(4-морфолиноциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2ил)-1 H-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамат
Смесь (R/S) трет-бутил N-[2-([[3-йод-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-4-ил]метил](метил)амино)этил] карбамата (400 мг, 0,86 ммоль, 1,00 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (66 мг, 0,09 ммоль, 0,10 эквив.), калия карбонат (356 мг, 2,58 ммоль, 2.99 эквив.) и 4-[4-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-ен-1-ил]морфолин (379 мг, 1,29 ммоль, 1,50 эквив.) в 1,4-диоксане (20 мл) и воде (2 мл) перемешивали в условиях азота при 100°C в течение ночи. Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 0-3% метанола в дихлорметане, с получением 320 мг (74%) (R/S) трет-бутил 2-(метил((3(4-морфолиноциклогекс-1 -енил)-1 -(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразолХ-ил^етилХминоХилХарбамата в виде коричневого масла. А-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,52 (s, 1H), 6,13-6,12 (m, 1H), 5,35-5,31 (m, 1H), 4,18-4,11 (m, 2H), 3,80-3,78 (m, 5H), 3,45-3,43 (m, 2H), 3,26-3,25 (m, 2H), 2,69-2,63 (m, 5H), 2,542,48 (m, 4H), 2,25-2,20 (m, 4H), 2,13-2,02 (m, 4H), 1,67-1,61 (m, 4H), 1,47 (s, 9H) ppm. LCMS (способ A, ESI): RT = 1,00 мин, масса/заряд = 504,0 [M+H]+.
Стадия 2. (R/S) трет-Бутил 2-(метил((3-(4-морфолиноциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-
Смесь (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4-морфолинциклогекс-1-енил)-l-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)1H-пиразол-4-ил)метил)амино)этил)карбамата(300 мг, 0,60 ммоль, 1,00 эквив.) и 10% катализатора палладий на угле (20 мг) в уксусной кислоте (15 мл) перемешивали при давлении водорода 20 атм в 50-мл
- 145 030481
реакторе высокого давления при 25°C в течение 3 дней. Катализатор удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 300 мг неочищенного (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4морфолинциклогексил)- 1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1 H-пиразол-4-ил)метил)амино)этил) карбамата в виде желтого масла. Неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. LCMS (способ A, ESI): RT = 1,01 мин, масса/заряд = 506,0 [М+Н]+.
Стадия 3. ^-Метил-^-((3-(4-морфолиноциклогексил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)этан-1,2-диамин (соединение 43)
Раствор (R/S) трет-бутил 2-(метил((3-(4-морфолиноциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-4-ил)метил)амино)этил) карбамата (300 мг, 0,59 ммоль, 1,00 эквив.) в 4N хлористо-водородной кислоте (15 мл) перемешивали при 60°C в течение 2 ч Полученную в результате смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (Waters 2767-2(HPLC-08)): колонка, XBridge Shield RP 18, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 50 ммоль CF3COOH и CH3CN (от 10,0% CH3CN до 28,0% в течение 2 мин, до 46,0% в течение 10 мин, до 100,0% в течение 1 мин, снижение до 10,0% в течение 1 мин); детектор, УФ 254 нм с выходом 36,5 мг (11%) ^-метил-^-((3-(4-метилциклогексил)-Ш-пиразол-4ил)метил)этан-1,2-диаминтрифторацетата в виде белого полутвердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CD3OD): δ 7,47 (s, 1H), 3,78-3,71 (m, 4H), 3,47 (s, 2H), 2,88-2,80 (m, 2H), 2,80-2,70 (m, 1H), 2,70-2,62 (m, 4H), 2,57-2,50 (m, 2H), 2,45-2,27 (m, 1H), 2,23 (s, 3H), 2,16-1,93 (m, 4H), 1,75-1,57 (m, 2H), 1,50-1,34 (m, 2H) ppm. LCMS (способ М, ESI): масса/заряд = 322,2 [M+H]+.
Соединение 44. ^-Метил-^-((4-(4-морфолиноциклогексил)-Ш-пиразол-3-ил)метил)этан-1,2диамин
Стадия 1. 4-Морфолиноциклогекс-1-енил трифторметансульфонат
о
Q
В перемешиваемый раствор 4-(морфолин-4-ил)циклогексан-1-она (920 мг, 5,02 ммоль, 1,00 эквив.) в безводном тетрагидрофуране (20 мл) в атмосфере азота при -78°C добавляли по каплям 1М раствор LiHMDS (6 мл) в тетрагидрофуране. После перемешивания в течение 1 ч при -78°C добавляли раствор 1,1,1-трифтор-№фенил-№(трифторметан)сульфонилметан-сульфонамида(1,97 г, 5,51 ммоль, 1,10 эквив.) в тетрагидрофуране (6 мл). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч Полученный в результате раствор концентрировали под вакуумом и остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 50-100% этилацетата в петролейном эфире, с получением 420 мг (27%) 4-морфолиноциклогекс-1-енил трифторметансульфоната в виде желтого масла. 1HЯМР (300 МГц, CDCI3): δ 5,80-5,70 (m, 1H), 3,90-3,75 (m, 4H), 2,75-2,00 (m, 10H), 1,70-1,50 (m, 1H) ppm.
Стадия 2. 4-(4-(4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-енил)морфолин
О
жLU
Смесь 4-морфолиноциклогекс-1-енил трифторметансульфоната (4 г, 12,69 ммоль, 1,00 эквив.), 4,4,5,5-тетраметил-2-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,3,2-диоксаборолана (3,87 г, 15,24 ммоль, 1,20 эквив.), калия ацетата (3,73 г, 38,01 ммоль, 3,00 эквив.) и Pd(dppf)Cl2 (930 мг, 1,27 ммоль, 0,10 эквив.) в 1,4-диоксане (100 мл) перегоняли в атмосфере азота в течение 12 ч Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 50-100% этилацетата в петролейном эфире, с получением 3,2 г (86%) 4-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)огекс-3-енил)морфолина в виде желтого масла. 1И-ЯМР (300 МГц, CDCL): δ 6,60-6,55 (m, 1H), 3,80-3,66 (m, 4H), 2,70-2,25 (m, 8H), 2,20-1,90 (m, 4H), 1,25 (s, 12H) ppm.
Стадия 3. (R/S) 4-(4-Морфолиноциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразоле-3карбальдегид
- 146 030481
Смесь 4-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-енил)морфолина (293 мг, 1,00 ммоль, 1,00 эквив.), (R/S) 4-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-3-карбальдегида (306 мг, 1,00 ммоль, 1,00 эквив.), K3PO4 (640 мг, 3,02 ммоль, 3,02 эквив.) и Pd(dppf)Cl2 (65,1 мг, 0,10 ммоль, 0,10 эквив.) в диметиловом эфире этиленгликоля (5 мл) перемешивали в атмосфере азота при 85°C в течение 12 ч Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование с помощью 50-100% этилацетата в петролейном эфире, с получением 280 мг г (81%) (R/S) 4-(4-морфолиноциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1Hпиразол-3-карбальдегида в виде коричневого масла. LCMS (способ С, ESI): RT = 0,70 мин, масса/заряд = 346,2 [М+Н]+.
Стадия 4. (R/S) трет-Бутил 2-(метил((4-(4-морфолиноциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2ил)-111-11иразол-3-ил)метил)амино)этил)карбамат
В раствор (R/S) 4-(4-морфолиноциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-3карбальдегид (500 мг, 1,45 ммоль, 1,00 эквив.) и трет-бутил ^[2-(метиламино)этил]карбамата (378 мг, 2,17 ммоль, 1,50 эквив.) в 1,2-дихлорэтане (20 мл) добавляли NaBH(OAc)3 (612 мг, 2,89 ммоль, 1,99 эквив.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч, а затем гасили насыщенным раствором NaHCO3 (10 мл). Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводя элюирование помощью 20-100% этилацетата в петролейном эфире, с получением 300 мг (41%) (R/S) трет-бутил 2(метил((4-(4-морфолиноциклогекс-1 -енил)- 1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)- Ш-пиразол-3 -ил)метил) амино) этил)карбамата в виде коричневого масла. LCMS (способ A, ESI): RT = 0,66 мин, масса/заряд = 504,4 [М+Н]+.
Стадия 5. (R/S) трет-Бутил 2-(метил((4-(4-морфолиноциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)Ш-пиразол-3 -ил)метил)амино)этил)карбамат
Смесь (R/S) трет-бутил 2-(метил((4-(4-морфолиноциклогекс-1-енил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)Ш-пиразол-3-ил)метил)амино)этил)карбамата (252 мг, 0,50 ммоль, 1,00 эквив.) и 10% катализатора палладий на угле (25 мг) в уксусной кислоте (10 мл) перемешивали в 30-мл реакторе под давлением водорода 20 атм. при 25°C в течение 12 ч Катализатора удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали с получением 250 мг (99%) (R/S) трет-бутил 2-(метил((4-(4-морфолиноциклогексил)-1-(тетрагидро-2Hпиран-2-ил)-Ш-пиразол-3-ил)метил)амино)этил)карбамата в виде желтого масла. LCMS (способ С, ESI): RT = 0,66 мин, масса/заряд = 506,4 [М+Н]+.
Стадия 6. ^-Метил-^-((4-(4-морфолиноциклогексил)-Ш-пиразол-3-ил)метил)этан-1,2-диамин (соединение 44)
Смесь (R/S) трет-бутил 2-(метил((4-(4-морфолиноциклогексил)-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H- 147 030481
пиразол-3-ил)метил)амино)этил)карбамата (253 мг, 0,50 ммоль, 1,00 эквив.) в насыщенном растворе хлороводорода в 1,4-диоксане (20 мл) перемешивали при 25°С в течение 24 ч Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом и неочищенный продукт (150 мг) очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (Prep-HPLC-005): колонка, XBridge Prep С18 OBD Column, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, вода с 10 ммоль NH4HCO3 и MeCN (удерживание в 4% MeCN в течение 5 мин, до 5% в течение 10 мин); детектор, УФ 254/220 нм с получением 30 мг (19%) ^-метил-^-((4-(4морфолиноциклогексил)-Ш-пиразол-3-ил)метил)этан-1,2-диамина в виде бесцветного масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CD3OD): δ 7,40 (s, 1H), 3,75-3,65 (m, 4H), 3,58 (s, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,69-2,27 (m, 8H), 2,19 (s, 3H), 2,12-1,93 (m, 4H), 1,55-1,28 (m, 4H) ppm. LCMS (способ W): масса/заряд = 322,2 [M+H]+.
Соединение 106. Метил [2-(метиламино)этил]([3-[(5R,8R)-1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]Ш-пиразол-4-ил]метил)амина
Стадия 1. 1,4,10-Триоксадиспиро[4.2.48.25]тетрадекан-9-он
В 500-мл 3-х горлую круглодонную колбу помещали THF (150 мл), LDA (1,3 эквив., получали из 36 мл H-BuLi (2,5 М в гексане) вступала в реакцию с 13,8 мл диизопропиламина в течение 30 мин при 50°С). Затем этил 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-карбоксилат (15 г, 70,01 ммоль, 1,0 эквив.) добавляли и перемешивали в течение 30 мин при -70°С, затем добавляли оксиран (0,22 г/мл в THF, 28 мл) при -78°С. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 2 ч при -70°С. Реакционную смесь гасили 100 мл NH4Cl (нас. водн.), затем обрабатывали с помощью 100 мл EtOAc. Органическую фазу отделяли, а затем промывали с помощью 150 мл солевого раствора. Органическую фазу сушили и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:2) с получением 4,5 г (30%) 1,4,10-триоксадиспиро
[4.2.48.25]тетрадекан-9-она в виде желтого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 4,28 (t, J= 6,6 Гц, 2H), 4,10-3,85 (m, 4H), 2,17 (t, J= 6,6 Гц, 2H), 2,15-1,85 (m, 4H), 1,80-1,50 (m, 4H).
Стадия 2. 2-[8-(2-Гидроксиэтил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил]пропан-2-ол HQ HOV
К перемешиваемому раствору 1,4,10-триоксадиспиро[4.2.48.25]тетрадекан-9-она (3,18 г, 14,98 ммоль, 1,0 эквив.) в THF (100 мл) при 0°С добавляли по каплям раствор MeMgBr (1M в эфире, 75 мл, 5,0 эквив.). Полученный в результате раствор оставляли для нагревания до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили 40 мл NH4Cl (нас. водн.), затем обрабатывали с помощью 300 мл EtOAc. Органическую фазу отделяли, затем промывали 100 мл солевого раствора, а потом сушили над безводным Na2SO4-Полученная при пониженном давлении составляла 4,9 г (неочищенное) 2-[8-(2-гидроксиэтил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил]пропан-2-ола в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 4,00-3,90 (m, 4H), 3,80-3,40 (m, 4H), 1,95-1,50 (m, 10H), 1,40-1,10 (m, 6H).
Стадия 3. 9,9-Диметил-1,4,10-триоксадиспиро[4.2.48.25]тетрадекан
В 250-мл круглодонную колбу помещали 2-[8-(2-гидроксиэтил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил] пропан-2-ол (4,91 г, 20,10 ммоль, 1,00 эквив.), дихлорметан (60 мл), 4-диметиламинопиридин (300 мг, 2,46 ммоль, 0,12 эквив.) и триэтиламин (20 мл). Добавляли тозилхлорид (5,34 г, 28,01 ммоль, 1,39 эквив.) и полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, затем концентрировали при пониженном давлении до высыхания. Остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:2) с получением 3,5 г (77%) 9,9-диметил-1,4,10-триоксадиспиро [4.2.48.25]тетрадекана в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 3,84 (s, 4H), 3,66 (t, J= 7,5 Гц, 2H), 2,51 (t, J= 7,5 Гц, 2H), 1,70-1,25 (m, 8H), 0,99 (s, 6H).
Стадия 4. 1,1-Диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-он
- 148 030481
о
В 100-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали атмосферу азота, помещали 9,9-диметил-1,4,10-триоксадиспиро[4.2.48.25]тетрадекан (1,765 г, 7,80 ммоль, 1,00 эквив.), тетрагидрофуран (16 мл) и хлористо-водородную кислоту (12N, 16 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре, а затем экстрагировали с помощью 3x50 мл этилацетата. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом с получением 1,259 г (89%) 1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-она в виде светло-желтого твердого вещества.
Стадия 5. 1,1-Диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфонат /—О
OTf
В раствор 1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-она (1,695 г, 9,30 ммоль, 1,00 эквив.) в THF (50 мл) при -70°С в сухом азоте добавляли по каплям раствор LiHMDS (1М в THF, 14 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -70°С, затем обрабатывали с помощью 1,1,1-трифтор-Л-фенил-П(трифторметан)сульфонилметансульфонамида (3,490 г, 9,77 ммоль, 1,05 эквив.) и перемешивали при 70°С в течение дополнительных 0,5 ч The полученный в результате раствор оставляли, чтобы он нагрелся до комнатной температуры, и перемешивали в течение дополнительных 12 ч, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (2:1) с получением 2,458 г (84%) 1,1-диметил-2-оксаспиро [4.5]дец7-ен-8-ил трифторметансульфоната в виде бесцветного масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 5,80-5,70 (m, 1H), 3,95-3,80 (m, 2H), 2,50-2,35 (m, 2H), 2,30-2,15 (m, 1H), 2,10-1,50 (m, 5H).
Стадия 6. 2-[1,1-Диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан г—о
A
В 50-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали с помощью азота инертную атмосферу, помещали 1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфонат (1,472 г, 4,68 ммоль, 1,00 эквив.), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би(1,3,2-диоксаборолан) (1,786 г), 1,4-диоксан (20 мл), калия ацетат (1,378 г, 14,04 ммоль, 3,00 эквив.) и PdCl2(dppf) (343 мг). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при 100°C, затем гасили добавлением 10 мл воды/льда. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 200 мл этилацетата и объединенные органические слои промывали с помощью 50 мл солевого раствора, сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (2:1) с получением 715 мг (52%) 2-[1,1диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксабороланав виде белого твердого вещества.
Стадия 7. (R/S) трет-Бутил П-(2-[[(3-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-
В 50-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали с помощью азота инертную атмосферу, помещали 2-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил1,3,2-диоксаборолан (1,164 г, 3,98 ммоль, 1,00 эквив.), трет-бутил П-[2-([[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Шпиразол-4-ил]метил](метил)амино)этил]-П-метилкарбамат (2,096 г, 4,38 ммоль, 1,10 эквив.), калия карбонат (1,650 г, 11,94 ммоль, 3,00 эквив.), 1,4-диоксан (20 мл), воду (2 мл) и PdCl2(dppf) (292 мг). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 16 ч при 100°C, затем гасили добавлением 10 мл
- 149 030481
воды/льда. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 100 мл этилацетата и органический слой промывали с помощью 50 мл солевого раствора, сушили над безводным натрия сульфатом, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетат/петролейный эфир (1:1) с получением 1,081 г (53%) (R/S) трет-бутил №(2-[[(3-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1Нпиразол-4у1)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамата в виде желтого масла.
Стадия 8. (R/S) трет-Бутил №(2-[[(3-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1Нпиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамат
В 100-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали с помощью азота инертную атмосферу, помещали (R/S) трет-бутил №(2-[[(3-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]дец-7-ен8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1Н-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамат (1,081 г, 2,09 ммоль, 1,00 эквив.), тетрагидрофуран (25 мл) и 10% Pd(OH)2/C (400 мг, 2,85 ммоль, 1,36 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре в водороде при давлении 3 атмосферы. Полученную в результате смесь фильтровали и фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 860 мг (79%) (R/S) трет-бутил №(2-[[(3-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан2-ил)-1Н-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-№метилкарбамата в виде светло-желтого масла.
Стадия 9. Метил [2-(метиламино)этил]([3-[(5R,8S)-1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Hпиразол-4-ил]метил)амин (соединение 106)
Раствор (R/S) трет-бутил ^(2-[[(3-[1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1Нпиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамат(400 мг, 1.20 ммоль, 1,00 эквив.) в метаноле (6 мл) обрабатывали с помощью хлористоводородной кислоты (12N, 2 мл) и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в течение дополнительных 2 ч при 50°C. Затем реакцию гасили добавлением 20 мл натрия бикарбоната (нас. вод.) и полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом для удаления большей части метанола. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 2x30 мл дихлорметана и органические слои объединяли и сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт (200 мг) очищали с помощью хиральной prep-IIPLC. Колонка: IC 4,6x100 нм, размер: 0,46x10 см, 5 мкм; подвижная фаза: Гекс. (0,2% IPA): IPA = 85:15; поток: 1,0 мл/мин; детектор: УФ - 220 нм; устройство: LC-05; температура: 25°C. В результате получали 32,6 мг метил [2-(метиламино)этил]([3-[(5R,8R)-1,1-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]1Н-пиразол-4-ил]метил)амин в виде бесцветного твердого вещества. *Н-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,50 (s, 1Н), 3,76 (t, J= 7,5Гц, 2Н), 3,42 (s, 2Н), 2,80-2,45 (m, 5Н), 2,31 (s, 3Н), 2,12 (s, 3Н), 2,01 (t, J= 7,5Гц, 2Н), 1,80-1,25 (m, 8Н), 1,05 (s, 6Н) ppm. LCMS (способ A11, ESI): RT = 1,44 мин, масса/заряд = 335,0 [М+Н]+.
Соединение 133 и 134. Метил[2-(метиламино)этил]([3-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан8-ил]-1Н-пиразол-4-ил]метил)амин и метил [2-(метиламино)этил]([3-[(5г,8г)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5] декан-8-ил]-1Н-пиразол-4-ил]метил)амин
Стадия 1. 3-(Бензилокси)-2,2-диметилпропан-1-ол
ИО-УС08"
В 250-мл круглодонную колбу помещали 2,2-диметилпропан-1,3-диол (10,4 г, 99,86 ммоль) и N,Nдиметилформамид (100 мл). После чего добавляли частями при 0°C 60% натрия гидрид (4 г, 100,00 ммоль). К смеси добавляли (бромметил)бензол (13,68 г, 79,98 ммоль) при 0°C. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, а затем разбавляли 200 мл NKiCl (нас. вод). Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 2x200 мл этилацетата, и органические слои объединяли и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом.
- 150 030481
Остаток на колонке с силикагелем с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:10) с получением 12 г (62%) 3-(бензилокси)-2,2-диметилпропан-1-ола в виде светло-желтого масла. 1Н ЯМР (300 МГц, DMSOde): δ 7,43-7,24 (m, 5H), 4,51-4,41 (m, 3H), 3,25-3,15 (m, 4H), 0,84 (s, 6H) ppm.
Стадия 2. [(3-Иод-2,2-диметилпропокси)метил]бензол
В 250-мл круглодонную колбу помещали 3-(бензилокси)-2,2-диметилпропан-1-ол (4 г, 20,59 ммоль), имидазол (2,80 г, 41,18 ммоль), трифенилфосфин (8,1 г, 30,88 ммоль) и тетрагидрофуран (100 мл). Затем частями при 0°C добавляли йод (7,85 г, 30,93 ммоль). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, а затем в течение дополнительных 4 ч при 80°C, а потом концентрировали под вакуумом. Остаток очищали при помощи колонки с силикагелем, используя петролейный эфир для получения 6 г (96%) [(3-йод-2,2-диметилпропокси)метил]бензол в виде бесцветного масла. 1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 7,42-7,20 (m, 5H), 4,49 (s, 2H), 3,30 (s, 2H), 3,24 (s, 2H), 1,00 (s, 6H) ppm.
Стадия 3. 8-[3 -(Бензилокси)-2,2-диметилпропил]- 1,4-диоксаспиро[4.5] декан-8-ол
В 250-мл 3-х гордую круглодонную колбу, в которой поддерживали атмосферу азота, помещали тетрагидрофуран (30 мл). Посоле этого добавляли по каплям m-BuLi (1,3М в пентане, 40 мл) при перемешивании при -78°C. К этой смеси добавляли по каплям, перемешивая при -78°C, раствор [(3-йод-2,2диметилпропокси)метил]бензола (6,08 г, 20,00 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) и полученную в результате смесь перемешивали при -78°C в течение 1 ч К смеси по каплям, перемешивая при -78°C, добавляли раствор 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-она (4,69 г, 30,00 ммоль, 1,50 эквив.) в тетрагидрофуране (30 мл). Полученный в результате раствор перемешивали 1 ч при -78°C, а затем медленно нагревали до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляли с помощью 120 мл NH4Cl (нас. вод.). Органически слой отбирали, а водный слой экстрагировали с помощью 2x100 мл этилацетата и органические слои объединяли, сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток наносили на колонку с гелем С18 с H2O/CH3CN (3:7) с получением 3,5 г (52%) 8-[3-(бензилокси)-2,2диметилпропил]-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ола в виде светло-желтого масла. 1Н ЯМР (400 МГц, DMSO-de): δ 7,42-7,20 (m, 5H), 4,46 (s, 2H), 3,92 (s, 1H), 3,82 (s, 4H), 3,21 (s, 2H), 1,80-1,67 (m, 2H), 1,661,55 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 2H), 1,5-1,35 (m, 4H), 1,00 (s, 6H) ppm.
Стадия 4. 8-(3-Гидрокси-2,2-диметилпропил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ол
В 100-мл круглодонную колбу помещали 8-[3-(бензилокси)-2,2-диметилпропил]-1,4-диоксаспиро
[4.5]декан-8-ол (3,35 г, 10,02 ммоль), тетрагидрофуран (40 мл), и 10% палладий/уголь (0,34 г). После этого добавляли по каплям при перемешивании муравьиную кислоту (3,5 мл). Затем водород (3 атм.) использовали по отношению к реакционной смеси и полученный в результате раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Твердые вещества удаляли фильтрацией и раствор концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, проводят элюирование с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:1) с получением 1,5 г (61%) 8-(3-гидрокси-2,2-диметилпропил)-1,4диоксаспиро[4.5]декан-8-ола в виде белого твердого вещества. ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 4,85 (t, J= 5,4 Гц, 1H), 4,48 (s, 1H), 3,82 (s, 4H), 3,17(d, J= 5,4 Гц, 2H), 1,83-1,58 (m, 4H), 1,58-1,35 (m, 6H), 0,90 (s, 6H) ppm.
Стадия 5. 11,11-Диметил-1,4,9-триоксадиспиро[4.2.4л[8].2л[5]]тетрадекан
В 250-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали атмосферу азота, помещали 8-(3-гидрокси-2,2-диметилпропил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ол (4 г, 16,37 ммоль), трибутилфосфан (6,62 г, 32,72 ммоль) и тетрагидрофуран (60 мл). Раствор TMAD (5,64 г, 32,75 ммоль) в тетрагидрофуране (80 мл) добавляли по каплям с перемешиванием при -40°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -40°C, а затем дополнительных 12 ч при комнатной температуре. Получен- 151 030481
ную в результате смесь концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем с использованием этилацетата/петролейного эфира (1:4) для получения 3,2 г (86%) 11,11-диметил-1,4,9триоксадиспиро[4.2.4Л[8].2Л[5]]тетрадекана в виде бесцветного масла. 1Н ЯМР (400 МГц, DMSG-d6): 63,83(s, 4Н), 3,38(s, 2Н), 1,78-1,63 (m, 4Н), 1,63-1,42 (m, 6Н), 1,03 (s, 6Н) ppm.
Стадия 6. 3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-он
о
В 100-мл круглодонную колбу помещали 11,11-диметил-1,4,9-триоксадиспиро[4.2.4Л[8].2Л[5]]тетрадекан (2,0 г, 8,84 ммоль, 1,00 эквив.), тетрагидрофуран (45 мл) и хлористо-водородный раствор (15 мл 3M раствора в тетрагидрофуране). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре, а затем тетрагидрофуран удаляли под вакуумом. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 3x50 мл этилацетата и объединенные органические слои промывали с помощью 1x25 мл Na2CG3 (нас. вод.), сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом с получением 1,4 г (87%) 3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-она в виде светло-желтого масла. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 3,58(s, 2Н), 2,78-2,60 (m, 2Н), 2,32-2,17 (m, 2Н), 2,17-2,05 (m, 2Н), 1,921,75 (m, 2Н), 1,88 (s, 2Н) 1,15 (s, 6Н) ppm.
Стадия 7. 3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфонат
OTf
В 250-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали I.iIIMDS (12 мл 1 М раствора в тетрагидрофуране). Раствор 3,3-диметил-1оксаспиро[4.5]декан-8-она (1,46 г, 8,01 ммоль) в тетрагидрофуране (10 мл) добавляли при -50°С и реакционную смесь перемешивали при -50°С в течение 15 мин К данной смеси добавляли раствор 1,1,1трифтор-^фенил-^(трифторметан)сульфонилметансульфонамида (2,86 г, 8,01 ммоль) в тетрагидрофуране (30 мл) при -50°С. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 1 ч при -50°С, а затем в течение дополнительного 1 ч при комнатной температуре. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, используя этилацетат/петролейный эфир (1:9), с получением 1,23 г (49%) 3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфоната в виде светло-желтого масла. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 5,64(d, J= 2,7 Гц, 1Н), 3,57-3,50 (m, 2Н), 2,69-2,50 (m, 1Н), 2,50-2,22 (m, 3Н), 2,01-1,87 (m, 1Н), 1,85-1,72 (m, 1Н), 1,72-1,51 (m, 2Н), 1,12 (s, 6Н) ppm.
Стадия 8. 2-[3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан
BPin
В 50-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали с помощью азота инертную атмосферу, помещали 3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфонат (1,26 г, 4,01 ммоль), 4,4,5,5-тетраметил-2-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,3,2-диоксаборолан (1,22 г, 4,80 ммоль), 1,4-диоксан (15 мл), калия ацетат (1,18 г, 12,02 ммоль) и PdCl2(dppf)CH2Cl2 (327 мг, 0,40 ммоль). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 15 ч при 100°С, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, используя этилацетат/петролейный эфир (10:1), с получением 0,97 г (83%) 2-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5тетраметил-1,3,2-диоксаборолана в виде желтого масла. 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ6,46 (d, J=1,6 Гц, 1Н), 3,52 (s, 2Н), 2,50-2,07 (m, 4Н), 1,80-1,54 (m, 4Н), 1,26 (s, 12Н), 1,11 (s, 6Н) ppm.
Стадия 9. 3-[3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1Н-пиразол-4-карбальдегид
- 152 030481
В 20-мл запаянную пробирку, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегид (964 мг, 3,15 ммоль), 2-[3,3диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (920 мг, 3,15 ммоль), CS2CO3 (3080 мг, 9,45 ммоль), 1,4-диоксан/112O (объем/объем = 10:1) (10 мл) и PdCl2(dppf)CH2Cl2 (257 мг, 0,31 ммоль). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 15 ч при 100°С, а затем концентрировали под вакуумом. Полученный в результате остаток разбавляли с помощью 50 мл H2O, а затем смесь экстрагировали с помощью 2 x 30 мл этилацетата и органические слои объединяли и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, используя этилацетат/петролейный эфир (1:2), с получением 630 мг (58%) 3-[3,3-диметил-1оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида в виде желтого масла. LCMS: масс/заряд = 345,2[М+1]; 1H ЯМР (400 МГц, CDO3): δ9,90 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 6,30-6,20 (m, 1H), 5,405,30 (m, 1H), 4,15-4,00 (m, 1H), 3,78-3,64 (m, 1H), 3,57 (s, 2H), 2,86-2,30 (m, 4H), 2,20-1,86 (m, 4H), 1,861,60 (m, 6H), 1,13 (s, 6H)ppm.
Стадия 10. трет-Бутил №(2-[[(3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Шпиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)^-метилкарбамат
В 100-мл круглодонную колбу помещали 3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегид (630 мг, 1,83 ммоль), трет-бутил №метил^-[2-(метиламино)этил]карбамат (516 мг, 2,74 ммоль), ClCH2CH2Cl (20 мл) и NaBH(AcO)3 (3,1 г, 14,62 ммоль). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 5 ч при 0°C, а затем гасили добавление 30 мл Na2CO3 (нас. вод.). Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 3x50 мл этилацетата, и органические слои объединяли и сушили над безводный натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток на колонке с силикагелем, используя этилацетат/петролейный эфир (3:2), с получением 720 мг (76%) трет-бутил №(2-[[(3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил] (метил^мино^тил^Ьметилкарбамата в виде светло-желтого масла. LCMS: масс/заряд = 517,5[М+1]; 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ7,46 (s, 1H), 6,07 (s, 1H), 5,45-5,35 (m, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 3,72-3,62 (m, 1H), 3,60-3,50 (m, 2H), 3,45-3,20 (m, 4H), 2,83 (s, 3H), 2,77-2,64 (m, 1H), 2,64-2,28 (m, 5H), 2,22 (s, 3H), 2,13-1,96 (m, 3H), 1,90-1,52 (m, 7H), 1,32 (s, 9H), 1,13 (s, 3H), 1,11 (s, 3H) ppm.
Стадия 11. трет-Бутил №(2-[[(3-[3,3-Диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]-этил)^-метилкарбамат
В 30-мл реактор высокого давления помещали трет-бутил N-(2-[[(3-[3,3-диметил-2-оксаспиро
[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)^-метилкарбамат (720 мг, 1,39 ммоль), уксусную кислоту (10 мл) и 10% палладий/уголь (100 мг). На реакционную смесь затем воздействовали газом водородом (давление 10 атм) и перемешивали в течение 6 ч при 50°С. Твердые вещества удаляли фильтрацией и раствор концентрировали под вакуумом с получением 1 г (97%) трет-бутил №(2-[[(3-[3,3-диметил-2-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино] этил)^-метилкарбамата в виде светло-желтого масла.
Стадия 12. Метил [2-(метиламино)этил]( [3-[(5s,8s)-3,3-Диметил-1 -оксаспиро [4.5] декан-8-ил]- Ш-пиразол-4-ил]метил)амин и метил[2-(метиламино)этил]([3-[(5к,8к)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8ил]-Ш-пиразол-4-ил]метил)амин (соединение 134 и соединение 135)
В 50-мл круглодонную колбу помещали трет-бутил №(2-[[(3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)^-метилкарбамат (1 г, 1,93 ммоль), и хлороводород/метанол (насыщенный, 10 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (Prep-HPLC-045): Column, Jupiter 4u Proteo 90A, AXIA Packed, 21,2x250 мм, 4 мкм, 9 нм; подвижная фаза, вода с 0,05%TFA и ACN (от 5,0% ACN до 30,0% в течение 8
- 153 030481
мин, удерживание 30,0% в течение 2 мин); детектор, УФ 220 нм. В результате получили 480,8 мг трифторацетатной соли (44%) метил[2-(метиламино)этил] ([3-[(5s,8s)-3,3-диметил-1-оксаспиро [4.5]декан-8ил]-Ш-пиразол-4-ил]метил)амина в виде белого полутвердого вещества; LCMS: масс/заряд = 335,2 [М+1]; 1H ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,73 (s, 1H), 4,28 (s, 2H), 3,50-3,40 (m, 6H), 2,74-2,68 (m, 7H), 1,90-1,86 (m, 2H), 1,68-1,42 (m, 8H) 1,00 (s, 6H) ppm. И 152,6 мг трифторацетатной соли (14%) метил[2(метиламино)этил]([3-[(5r,8r)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1H-пиразол-4-ил]метил)амина в виде белого полу-твердого вещества; LCMS: масса/заряд = 335,2 [М+1]; ]; 1H ЯМР (300 МГц, D2O): δ7,73 (s, 1H), 4,28 (s, 2H), 3,46-3,34 (m, 6H), 2,74-2,69 (m, 7H), 1,83-1,75 (m, 4H), 1,70 (m, 2H), 1,57-1,46 (m, 4H), 1,00 (s, 6H) ppm.
Соединение 158. Гидрохлоридная соль ([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогексил]-Ш-пиразол-4-ил]метил)(метил)[2-(метиламино)этил] амина
Стадия 1. Этил 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-карбоксилата
В 500-мл круглодонную колбу помещали этил 4-оксоциклогексан-1-карбоксилат (150 г, 881,29 ммоль, 1,00 эквив.), циклогексан (300 мл), H2NSO3H (3 г) и этан-1,2-диол (65,7 г, 1,06 моля, 1,20 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при 100°С, а затем разбавляли с помощью 300 мл этилацетата. Полученную в результате смесь промывали с помощью 2x200 мл солевого раствора, а затем концентрировали под вакуумом. В результате получали 152 г (80%) этил 1,4-диоксаспиро
[4.5]декан-8-карбоксилата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 4,05 (q, J= 7,1Гц, 2H), 3,95 (s, 4H), 2,44-2,23 (m, 1H), 2,00-1,70 (m, 6H), 1,65-1,47(m, 2H), 1,25(t, J= 7,1Гц, 3H) ppm.
Стадия 2. 8,8-Диэтил 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8,8-дикарбоксилат
В 2-л 3-х горлую круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали тетрагидрофуран (1500 мл). Затем н-BuLi (2,5М в гексане, 179,8 мл) добавляли по каплям при -50°С. В полученной в результате смеси проходила реакция в течение 30 мин при -50°С. Затем этил 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-карбоксилат (80 г, 373,38 ммоль, 1,00 эквив.) добавляли в смесь при -78°С. Через 1 час хлор(этокси)метанон (60 г, 552,87 ммоль, 1,48 эквив.) добавляли по каплям при -78°С. Полученный в результате раствор перемешивали в течение дополнительных 30 мин при -78°С. Реакцию затем гасили путем добавления 500 мл воды. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 3x800 мл этилацетата, и органические слои объединяли и концентрировали под вакуумом. В результате получали 82 г (77%) 8,8-диэтил 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8,8-дикарбоксилата в виде светло-желтого масла. Щ-ЯМР (400 МГц, CDClз): δ 4,18 (q, J= 7,1Гц, 4H), 3,94 (s, 4H), 2,18 (t, J= 6,2Гц, 4H), 1,69 (t, J= 6,2Гц, 4H), 1,25(t, J= 7,1Гц, 6H) ppm.
Стадия 3. [8-(Гидроксиметил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил]метанол
В 2500-мл 3-х горлую круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали LiAlH4 (47,9 г, 1,26 моля, 4,02 эквив.) и тетрагидрофуран (1 мл). После этого добавляли 8,8-диэтил 1,4-диоксаспиро[4.5]декане-8,8-дикарбоксилата (90 г, 314,33 ммоль, 1,00 эквив.) в тетрагидрофуране (200 мл) по каплям с перемешиванием при -20°С. Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию затем гасили добавлением 500 г Na2SO4.10H2O. Твердые вещества отфильтровывали. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом с получением 35 г (55%) [8-(гидроксиметил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8- 154 030481
ил]метанолав виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, MeOD): δ 3,94 (s, 4H), 3,49 (s, 4H), 1,691,59 (m, 4H), 1,59-1,44(m, 4H) ppm.
Стадия 4. 8,8-бис(Этоксиметил)-1,4-диоксаспиро[4.5] декан
В 1000-мл 3-х горлую круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали [8-(гидроксиметил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил]метанол (35 г, 173,06 ммоль, 1,00 эквив.) и Ν,Ν-диметилформамид (400 мл). После этого частями добавляли натрия гидрид (21 г, 525,00 ммоль, 3,03 эквив., 60%) частями при 0°C. Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. К данной смеси по каплям с перемешиванием добавляли йодэтан (108 г, 692,46 ммоль, 4,00 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию затем гасили путем добавления 300 мл воды. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 3x800 мл этилацетата и органические слои объединяли. Полученную в результате смесь промывали с помощью 300 мл солевого раствора. Смесь сушили над безводный натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:20). В результате получили 30 г (67%) 8,8-бис(этоксиметил)-1,4диоксаспиро [4.5] декана в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ : 3,93 (s, 4H), 3,46(q, J= 7,0Гц, 4H), 3,29 (s, 4H), 1,65-1,50 (m, 8H), 1,16(t, J= 7,0Гц, 6H) ppm.
Стадия 5. 4,4-бис(Этоксиметил)циклогексан-1-он
В 1000-мл круглодонную колбу помещали 8,8-бис(этоксиметил)-1,4-диоксаспиро[4.5]декан (30 г, 116,12 ммоль, 1,00 эквив.), FeCl3-6H2O (62 г, 230,48 ммоль, 1,98 эквив.) и дихлорметан (300 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученную в результате смесь промывали с помощью 3x150 мл воды и 150 мл Na2CO3 (нас. водн.). Полученную в результате смесь промывали с помощью 150 мл солевого раствора. Смесь сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом с получением 22,8 г (92%) 4,4-бис(этоксиметил)циклогексан-1-онав виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ : 3,46 (q, J= 7,0Гц, 4H), 3,37 (s, 4H), 2,36 (t, J= 14,1 Гц, 4H), 1,77 (t, J= 14,1 Гц, 4H), 1,18 (t, J= 7,0 Гц, 6H) ppm.
Стадия 6. 4,4-бис(Этоксиметил)циклогекс-1-ен-1-ил трифторметансульфонат
В 1-л 3-х гордую круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали 4,4-бис(этоксиметил)циклогексан-1-он (22,8 г, 106,39 ммоль, 1,00 эквив.) и THF (400 мл). После этого по каплям с перемешиванием при -50°C добавляли LiHMDS (1M в THF, 117,2 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 1 ч при -30°C. К данному раствору по каплям с перемешиванием при -30°C добавляли раствор 1,1,1-трифтор-№фенил-№(трифторметан)сульфонилметансульфонамида (41,8 г, 117,00 ммоль, 1,10 эквив.) в тетрагидрофуране. Полученный в результате раствор вступал в реакцию при перемешивании в течение дополнительных 4 ч при комнатной температуре. Реакцию затем гасили путем добавления 100 мл NH4Cl (нас. вод.). Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 2x100 мл этилацетата и органические слои объединяли. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем, используя петролейный эфир (100%), с получением 29 г (79%) 4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1ен-1-или трифторметансульфоната в виде коричневого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ : 5,78-5,61(m, 1H), 3,44(q, J= 7,0Гц, 4H), 3,27(q, J= 7,0Гц, 4H), 2,49-2,21(m, 2H), 2,20-2,00(m, 2H), 1,74(t, J= 6,5Гц, 2H), 1,18(t, J= 7,0Гц, 6H) ppm.
Стадия 7. 2-[4,4-бис(Этоксиметил)циклогекс-1-ен-1-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан
- 155 030481
В 100-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали 4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1-ен-1-ил трифторметансульфонат (29 г, 83,8 ммоль, 1,00 эквив.), KOAc(32,4 г, 331 ммоль, 3,95 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (6,13 г, 8,38 ммоль, 0,10 эквив.), 4,4,5,5-тетраметил-2-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,3,2-диоксаборолан (25,5 г, 100,6 ммоль, 1,19 эквив.) и 1,4-диоксан (300 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при 100°С в масляной бане. Реакцию затем гасили путем добавления 200 мл воды. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 3x100 мл этилацетата и органические слои объединяли и сушили над безводным натрия сульфатом. Твердые вещества отфильтровывали и раствор концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:20). В результате получали 22 г (81%) 2-[4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1-ен-1-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолана 1И-ЯМР (300 МГц, CDCb) δ: 6,67-6,35(m, 1H), 3,44(q, J= 7,0Гц, 4H), 3,24(q, J= 7,0Гц, 4H), 2,18-2,05(m, 2H), 2,03-1,84(m, 2H), 1,50(t, J= 6,3Гц, 2H), 1,15(t, J= 7,0Гц, 6H) ppm.
Стадия 8. трет-Бутил ^[2-[([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1 -ен-1 -ил]-1 -(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил)(метил)амино]этил]-Ы-метилкарбамат
В 1-л круглодонную колбу, которую продували и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали 2-[4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1 -ен-1 -ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (22 г, 67,85 ммоль, 1,00 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (3,38 г, 4,62 ммоль, 0,07 эквив.), калия карбонат (19,2 г, 138,92 ммоль, 2,05 эквив.), воду (50 мл), трет-бутил ^[2-([3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил (метил)амино)этил]-Ы-метилкарбамат (18 г, 37,63 ммоль, 0,55 эквив.) и 1,4-диоксан (500 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при 100°C в масляной бане. Твердые вещества отфильтровывали. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем с помощью этилацетата/петролейного эфира (50%). В результате получали 18 г (48%) трет-бутил ^[2-[([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1-ен-1-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил] метил)(метил)амино]этил]-№-метилкарбамата в виде коричневого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ : 7,46(s, 1H), 6,08(s, 1H), 5,40-5,22(m, 1H), 4,12-4,00(m, 1H), 3,76-3,60(m, 1H), 3,58-3,20(m, 8H), 2,83(s, 3H), 2,57(s, 3H), 2,45(s, 2H), 2,15-1,95(m, 4H), 1,82-1,52(m, 6H), 1,44(s, 6H), 1,35(s, 9H), 1,15(t, J= 7,0Гц, 6H) ppm.
Стадия 9. трет-Бутил ^[2-[([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогексил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил] метил)(метил)амино]этил]-№-метилкарбамат
В 1-л круглодонную колбу помещалитрет-бутил ^[2-[([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогекс-1-ен-1ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метилХметил)амино]этил]-№-метилкарбамат (18,0 г, 32,85 ммоль, 1,00 эквив.), 10% Pd(OH)2/C (20 г) и тетрагидрофуран (400 мл). Водород (3 атм) затем использовали по отношению к реакционной смеси. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 7 ч при комнатной температуре. Твердые вещества отфильтровывали и раствор концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем с помощью дихлорметана/метанола (3,5%). В результате получали 8,8 г (49%) трет-бутил ^[2-[([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогексил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4ил]метил)(метил)амино]этил]-№-метилкарбамата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ : 7,36(s, 1H), 5,30-5,10(m, 1H), 4,00-3,85(m, 1H), 3,68-3,50(m, 2H), 3,56-3,46(m, 6H), 3,35-3,27(m, 4H), 3,14(s, 2H), 2,77(s, 3H), 2,69-2,37(m, 3H), 1,94(s, 3H), 1,80-1,46(m, 9H), 1,37(s, 9H), 1,30-1,15(m, 4H), 1,10(t, J= 7,0Гц, 6H) ppm.
Стадия 10. Гидрохлоридная соль ([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогексил]-Ш-пиразол-4-ил]метил) (метил)[2-(метиламино)этил] амина (соединение 158)
В 500-мл круглодонную колбу помещали трет-бутил ^[2-[([3-[4,4-бис(этоксиметил)циклогексил]1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метилХметил)амино]этил]-№-метилкарбамат (8,8 г, 15,98 ммоль, 1,00
- 156 030481
эквив.) и дихлорметан (300 мл). Реакционную смесь барботировали газом хлороводородом. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре, а затем концентрировали под вакуумом. Полученный в результате остаток промывали с помощью 1 л гексана. Твердые вещества отбирали фильтрацией. В результате получали 5,90 г (84%) гидрохлоридной соли ([3-[4,4-бис (этоксиметил)циклогексил]-Ш-пиразол-4-ил]метил)(метил)[2-(метиламино)этил]амина в виде беловатого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O) δ : 7,75(s, 1H), 4,30(s, 2H), 3,57-3,43(m, 10H), 3,23(s, 2H), 2,80-2,67(m, 7H), 1,64-1,54(m, 6H), 1,35-1,20(m, 2H), 1,15-1,05(m, 6H) ppm. LCMS (способ М, ESI), RT=1,25 мин, масса/заряд =367,3 [M-2HCl+H]+.
Соединение 182. 9-[4-({Метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3-ил]спиро[4.5]декан-6-ол
Стадия 1. 1,4-Диоксаспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-он.
В раствор 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-она (5 г, 32,01 ммоль) в толуоле (90 мл) добавляли mBuOK (632,26 мг, 5,63 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин Добавляли 1,4-дибромбутан (4 мл, 33,62 ммоль) и реакционную смесь нагревали с перегонкой в течение 20 ч. Реакционную смесь контролировали с помощью TLC (гептан^ЮЛс 80/20, РМА). Реакционную смесь охлаждали при комнатной температуре, гасили водным насыщенным раствором NH4Cl, а затем разбавляли с помощью EtOAc. Два слоя разделяли и водный слой дополнительно экстрагировали с помощью EtOAc (1x). Объединенные органические слои промывали водой (1x) и солевым раствором (1x), сушили (MgSO4) и концентрировали с получением неочищенного масла. Данный продукт растворяли в минимальном количестве DCM и загружали в 340g SNAP KP колонку, и элюировали гептаном :EtOAc от 6% до 40% в Biotage с получением: 3,9 г (58%) 1,4-диоксаспиро[4.1.47.35] тетрадекан-12-она. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 4,02-3,88 (m, 4H), 2,59 - 2,50 (m, 2H), 2,05 (dd, J= 7,9, 4,7 Гц, 2H), 1,99-1,95 (m, 2H), 1,93 (s, 2H), 1,60-1,46 (m, 6H).
Стадия 2. 1,4-Диоксаспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-ол
Раствор 1,4-диоксаспиро[4.1.47.35] тетрадекан-12-она (3,9 г, 18,55 ммоль) в МеОН (100 мл) охлаждали до 0°C. Небольшими частями добавляли NaBH4 (1,75 г, 46,37 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 0°C в течение 1 ч, а затем гасили водой. Полученную в результате смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем разбавляли с помощью воды и EtOAc. Водный слой подвергали обратной экстракции с помощью EtOAc и объединенные органические слои промывали водой (1x) и солевым раствором (2x), сушили (MgSO4), фильтровали и фильтрат концентрировали in vacuo с получением масла, 2,96 г (75%) 1,4-диоксаспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-ола. Данный материал использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,93 (s, 4H), 3,52 (dd, J= 6,7, 2,4 Гц, 1H), 1,90-1,76 (m, 3H), 1,77-1,42 (m, 12H).
Стадия 3. трет-Бутил({ 1,4-диоксаспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-илокси})диметилсилан
В раствор 1,4-диоксаспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-ола (2,96 г, 13,94 ммоль) в DMF (40 мл) добавляли трет-бутил(хлор)диметилсилан (2,31 г, 15,34 ммоль) и Ш-имидазол (1,9 г, 27,89 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали с помощью эфира 3x). Объединенные органические слои промывали водой (2x) и солевым раствором (2x), сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали с получением масла. Масло очищали путем растворения в минимальном количестве DCM, загружая 25g KP SNAP колонку, проводя элюирование с помощью 5-35% EtOAc в гептане с получением 3,73 г (82%) трет-бутил({1,4диоксадиспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-илокси})диметилсилана. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,97 - 3,83 (m, 4H), 3,44 (dd, J= 5,5, 2,2 Гц, 1H), 1,89 (td, J= 12,1, 4,0 Гц, 1H), 1,83 (d, J= 13,5 Гц, 1H), 1,79 - 1,46 (m, 9H), 1,43-1,30 (m, 3H), 0,89 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
Стадия 4. 10-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]декан-7-он
- 157 030481
В раствор трет-бутил({1,4-диоксадиспиро[4.1.47.35]тетрадекан-12-илокси})диметилсилана (3,7 г, 11,33 ммоль) в DCM (120 мл) добавляли трихлорпирона гексагидрат (15,31 г, 56,65 ммоль) и полученную в результате суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакцию контролировали с помощью TLC (9:1 гептан/EtOAc, окрашивание DNP). Реакционную смесь разбавляли с помощью DCM, отстаивали для удаления большей части твердых неорганических веществ и промывали водным насыщенным NaHCO3 (1х), водой (1х), солевым раствором (1х), сушили над MgSO4, фильтровали и фильтрат концентрировали in vacuo с получением прозрачного масла: 3,22 г (99%) 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4,5]декан-7-она. Этот материал использовали непосредственно в следующей стадии. 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,62 (t, J= 3,3 Гц, 1H), 2,67-2,54 (m, 2H), 2,16 (dtd, J= 14,2, 4,6,
2.1 Гц, 1H), 2,06 (d, J= 13,4 Гц, 1H), 1,90 (dt, J= 8,1, 4,2 Гц, 2H), 1,76-1,48 (m, 5H), 1,38 (ddd, J= 12,1, 6,7,
5.2 Гц, 1H), 1,28 (ddd, J= 19,8, 7,7, 4,8 Гц, 2H), 0,92 (s, 9H), 0,10 (d, J= 2,9 Гц, 6H).
Стадия 5. 10-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-6-ен-7-ил трифторметансульфонат и 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси] спиро [4.5] дец-7-ен-7-ил трифторметансульфонат
Раствор 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]декан-7-она (3,2 г, 11,33 ммоль) в THF (45 мл) охлаждали до -78°C в атмосфере азота. Добавляли 2М раствор LDA в гептанах-THF (7,9 мл) и полученный в результате раствор перемешивали при -78°C в течение 1 ч. 1,1,ГТрифтор-\-фенил-\-|(трифторметил)сульфон]метансульфонамид (4,45 г, 12,46 ммоль) добавляли при -78°C в реакционную смесь в виде раствора в THF (15 мл) и реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 1 ч, а затем оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакцию гасили добавлением воды и разбавлением с помощью EtOAc (2 л). Объединенные органические слои промывали водой (1х) и солевым раствором (2х), сушили (MgSO4), фильтровали и фильтрат концентрировали in vacuo с получением масла. Данный материал растворяли в минимальном количестве DCM и и загружали в 100g KP SNAP колонку, проводя элюирование с помощью гептана-EtOAc от 0 до 25%, с получением 2,81 г (60%) смеси 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-6-ен-7-ил трифторметансульфоната и 10[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-7-ен-7-ил трифторметансульфоната в виде прозрачного масла. С помощью ЯМР показали, что соотношение двух изомеров составляло 9:1. 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 5,59 (t, J= 3,8 Гц, 0,9H), 5,53 (s, 0,1H), 3,60 (dd, J= 6,2, 3,3 Гц, 0,1H), 3,56 (t, J= 4,2 Гц, 0,9H), 2,46-2,40 (m, 1H), 2,40-2,32 (m, 1H), 2,13 (ddq, J= 17,9, 4,2, 2,2 Гц, 1H), 2,07 (d, J= 16,6 Гц, 1H), 1,701,57 (m, 5H), 1,46-1,32 (m, 3H), 0,87 (s, 9H), 0,06 (d, J= 4,3 Гц, 6H).
Стадия 6. трет-Бутилдиметил{[9-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)спиро[4.5]дец-8-ен-6-ил] окси}силан и трет-бутилдиметил {[9-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)спиро[4.5]дец-9-ен-6-ил]окси}силан
Суспензию 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-6-ен-7-ил трифторметансульфоната и 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-7-ен-7-ил трифторметансульфоната (0,74 г, 2,89
ммоль), калия ацетата (1,78 г, 18,09 ммоль), бис[3-(дифенилфосфанил)циклопента-2,4-диен-1-ил]железа; дихлорметана, дихлорпалладия (99 мг, 0,12 ммоль) в 1,4-диоксане (10 мл) продували азотом в течение 5 мин, а затем нагревали при 80°C в пробирке для высокого давления в течение ночи. Смесь оставляли для охлаждения до комнатной температуры и разбавляли с помощью EtOAc, и фильтровали через Celite®. Фильтрат промывали водой (1х), солевым раствором (1х) и сушили над MgSO4. Растворитель выпаривали и остаток очищали на 50g KP SNAP колонке в Biotage, проводя элюирование в градиенте гептана: EtOAc (от 0% до 20%), с получением 0,41 г (43%) смеси трет-бутилдиметил {[9-(тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил)спиро[4.5]дец-8-ен-6-ил]окси}силана и трет-бутилдиметил {[9-(тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил)спиро[4.5]дец-9-ен-6-ил]окси}силана , 409 мг (43%) с соотношением 9:1, как было показано с помощью NMR. ^-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 6,45-6,38 (m, 0,9H), 6,28 (t, J= 1,8 Гц, 0,1H), 3,67-3,57 (m, 1H), 2,29 (dtt, J=18,7, 4,2, 2,0 Гц, 1H), 2,20 (dd, J=17,4, 1,7 Гц, 1H), 2,12-2,01 (m, 1H), 1,94 (dt, J=17,5, 2,5 Гц, 1H), 1,71-1,45 (m, 8H), 1,26 (s, 12H), 0,87 (s, 9H), 0,02 (d, J= 3,7 Гц, 6H).
Стадия 7А. трет-Бутил №[2-({[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил}(метил)амино)этил]-№ метилкарбамат
- 158 030481
В раствор 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида (7,42 г, 24,25 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (160 мл) добавлялитрет-бутил ^метил-Х[2-(метиламино)этил]карбамат (90%, 6,14 г, 29,34 ммоль) с последующим добавлением NaBH(OAc)3 (10,28 г, 48,49 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли с помощью DCM, промывали солевым раствором (2x), сушили над MgSO4 и сушили in vacuo. Путем очищения с помощью флешхроматографии, используя систему Biotage Isolera с картриджем 100 г KP SNAP, проводя элюирование в градиенте МеОН в DCM (от 0 до 10%,), получали трет-бутил ^[2-({[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4ил]метил}(метил)амино)этил]-Хметилкарбамат в виде белого твердого вещества после кристаллизации из гептана -эфира 8,4 г (72%). Ή ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,88-7,35 (m, 1H), 5,32 (dd, J= 9,5, 2,6 Гц, 1H), 4,09-3,99 (m, 1H), 3,72-3,58 (m, 1H), 3,55-3,23 (m, 4H), 2,85 (s, 3H), 2,69-2,43 (m, 2H), 2,39-2,16 (m, 3H), 2,14-1,92 (m, 3H), 1,73-1,49 (m, 3H), 1,44 (s, 9H).
Стадия 7В. трет-Бутил ^(2-{[(3-{10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-7-ен-7-ил}-1-
Суспензию трет-бутил ^[2-({[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил}(метил)амино)этил]Хметилкарбамата (488 мг, 1.02 ммоль), трет-бутилдиметил{[9-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)спиро[4.5]дец-8-ен-6-ил ]окси}силана и трет-бутилдиметил{[9-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)спиро
[4.5]дец-9-ен-6-ил ]окси}силана (400 мг, 1,02 ммоль) в 1,4-диоксане (2 мл) и водный 2М натрия карбонат (1.53 мл) дегазировали с помощью барботирования азотом в течение 5 мин Добавляли бис[3-(дифенилфосфанил)циклопента-2,4-диен-1-ил]железо, дихлорметан и дихлорпалладий (42 мг, 0,05 ммоль) и реакционную смесь нагревали при 80°C в течение ночи. Реакционную смесь оставляли для охлаждения до комнатной температуры, а затем разбавляли с помощью EtOAc, фильтровали через Celite® и твердые вещества промывали с помощью EtOAc. Объединенные фильтраты промывали водой (1x) и солевым раствором (2x), сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали с получением оранжевого масла. Данный материал очищали путем загрузки в виде раствора в DCM на колонку 25g SNAP в Biotage и проводили элюирование в градиенте гептана-EtOAc, от 35 до 100%, с получением трет-бутил N-(2-{[(3-{10[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-7-ен-7-ил}-1-(оксан-2-ил)пиразол-4-ил)метил](метил) амино}этил)-Хметилкарбамата, 0,45 г (72%) LC-MS: 2,42 мин (3 мин способ), масса/заряд = 617,35. JHЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,41 (d, J= 3,9 Гц, 1H), 5,91 (d, J= 21,6 Гц, 1H), 5,26 (dd, J= 8,9, 2,8 Гц, 1H), 4,04-3,97 (m, 1H), 3,69-3,56 (m, 2H), 3,27 (d, J= 49,4 Гц, 4H), 2,77 (s, 3H), 2,53-2,37 (m, 3H), 2,33 (d, J= 18,3 Гц, 1H), 2,25 (d, J= 16,6 Гц, 1H), 2,17 (s, 3H), 2,14-2,05 (m, 1H), 1,98 (dd, J= 10,2, 2,9 Гц, 3H), 1,67-1,46 (га, 11H), 1,38 (s, 9H), 0,84-0,80 (m, 9H), 0,00 (s, 6H).
Стадия 8. трет-Бутил ^(2-{[(3-{10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]декан-7-ил}-1-(оксан2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-Хметилкарбамат
Суспензию трет-бутил ^(2-{[(3-{10-[{трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]дец-7-ен-7-ил}-1(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)Х-метилкарбамата (453 мг, 0,73 ммоль) и Pd/C (10%, 156 мг, 0,147 ммоль) в EtOH (10 мл) перемешивали при комнатной температура в течение 2 дней. Реакционную смесь фильтровали через Celite® и фильтрат концентрировали с получением масла, которое очищали на Biotage с использованием колонки SNAP KP 25g, проводя элюирование в градиенте гептана - EtOAc, от 25 до 100%, с получением трет-бутил ^(2-{[(3-{10-[(трет-бутилдиметилсилил) окси]спиро[4.5]декан-7-ил}-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)Х-метилкарбамата, 120 мг (26%). LC-MS: 2,16 мин (3 мин способ), масса/заряд = 619,35. М-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,46 (d, J= 10,4 Гц, 1H), 5,31-5,24 (m, 1H), 4,05 (d, J= 11,5 Гц, 1H), 3,67 (td, J= 11,2, 2,2 Гц, 1H), 3,48-3,21 (m, 5H), 2,88-2,73 (m, 4H), 2,55-2,38 (m, 2H), 2,22 (s, 3H), 2,07-1,88 (m, 6H), 1,70-1,48 (m, 12H), 1,43 (d, J= 10,5 Гц, 11H), 0,92 (s, 9H), 0,05 (s, 6H).
Стадия 9. 9-[4-({Метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3-ил]спиро[4.5]декан-6-ол (соединение 182)
- 159 030481
Суспензию трет-бутил N-(2-{[(3-{ 10-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[4.5]декан-7-ил}-1(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-^метилкарбамат (77 мг, 0,12 ммоль) в водном 6М HCl (0,56 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Суспензию разбавляли водой и экстрагировали с помощью DCM (2x). Объединенные органические слои концентрировали с получением маслянистого остатка, который растворяли в 1 мл DMSO - CH3CN (1:1), и очищали на Gilson3, используя способ prep-HPLC при высоком pH, с получением 9-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино} метил)-Ш-пиразол-3-ил]спиро[4.5]декан-6-ола, 13 мг (33%), в виде белого твердого вещества. LC-MS:
4,3 мин (7 мин, высокое pH), масс/заряд = 321,3. Ή-ЯМР (500 МГц, Метанол-64) δ 7,47 (s, 0,1H), 7,42 (s, 0,9H), 3,49 (s, 1H), 3,42 (s, 2H), 2,93 (tt, J= 12,7, 3,4 Гц, 1H), 2,71 (t, J= 6,5 Гц, 2H), 2,52 (t, J= 6,5 Гц, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 1,99-1,85 (m, 2H), 1,86-1,72 (m, 3H), 1,72-1,50 (m, 6H), 1,47-1,30 (m, 3H).
Соединения 183 и 184. Рацемическая смесь (^^)-4-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3-ил]спиро[5.5]ундекан-1-ола (соединение 183)
Рацемическая смесь (^^)-4-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3-ил]спиро[5.5]ундекан-1-ола (соединение 184)
Стадия 1. 1,4-Диооксаспиро[4.1.57.35]пентадекан-13-он
В раствор 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-она (5 г, 32,01 ммоль) и 1,5-дибромпентана (7,36 г, 32 ммоль) в толуоле (120 мл) добавляли mBuOK (3,59 г, 32 ммоль) при RT. Раствор подвергали перегонке в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до RT и и гасили с помощью HCl (0,5N, 10 мл). Фазы разделяли и водную фазу экстрагировали с помощью DCM (3x30 мл). Органические экстракты объединяли и сушили над Na2SO4, и выпаривали досуха. Остаток очищали на Biotage (SNAP 340g, элюент гептан/EtOAc от 95/5 до 60/40) с получением 2,35 г титульного соединения (33%) в виде светлого бесцветного масла. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 4,08-3,91 (m, 4H), 2,61-2,42 (m, 2H), 2,01-1,95 (m, 2H), 1,93 (s, 2H), 1,83-1,72 (m, 2H), 1,58-1,38 (m, 7H), 1,38-1,28 (m, 1H). Rf= 0,47 (гептан /EtOAc 7/3).
Стадия 2. 1,4-Диохадиспиро[4.1.57.35]пентадекан-13-ол
Натрия борогидрид (0,99 г, 26,19 ммоль) добавляли при 0°С и атмосфере азота в 1,4-диохадиспиро [4.1.57.35]пентадекан-13-он (2,35 г, 10,48 ммоль) в МеОН (120 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C до завершения (6 ч). Реакционную смесь медленно гасили водой (100 мл). Добавляли DCM (50 мл) и разделяли слои. Водный слой экстрагировали с помощью DCM (2x50 мл). Органические слои объединяли, сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением 2,18 г требуемого 1,4-диоксадиспиро [4.1.57.35]пентадекан-13-ола(92%). Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,97-3,86 (m, 4H), 3,52-3,44 (m, 1H), 1,90-1,79 (m, 3H), 1,77-1,62 (m, 2H), 1,61-1,34 (m, 10H), 1,35-1,18 (m, 2H). Rf = 0,35 (гептан/EtOAc 7/3).
Стадия 3. трет-Бутил({1,4-диоксадиспиро[4.1.57.35]пентадекан-13-илокси})диметилсилана
В раствор 1,4-диоксадиспиро[4.1.57.35]пентадекан-13-ола (2,18 г, 9,63 ммоль) в DMF (20 мл) добавляли трет-бутил(хлор)диметилсилан (2,18 г, 14,45 ммоль) и Ш-имидазол (1,32 г, 19,27 ммоль). Реакци- 160 030481
онную смесь перемешивали при RT в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали с помощью EtOAc (3 x 50 мл). Объединенные органические слои сушили (Na2SO4) и концентрировали. Остаток очищали на Biotage (SNAP 100g, элюент гептан/EtOAc, от 95/5 до 80/20) с получением 2,45 г требуемого материала. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 4,02 -3,80 (m, 4H), 3,49-3,38 (m, 1H), 1,89 (td, J= 12,2, 4,2 Гц, 1H), 1,84-1,71 (m, 2H), 1,64 -1,15 (m, 13H), 0,89 (s, 9H), 0,04 (d, J= 2,2 Гц, 6H). Rf = 0,60 (EtOAc/гептан 10/90).
Стадия 4. 5-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]спиро[5.5]ундекан-2-он
В раствор трет-бутил({1,4-диоксадиспиро[4.1.57.35]пентадекан-13-илокси})диметилсилана (2,45 г, 7,19 ммоль) в DCM (100 мл) добавляли железа трихлорид гексагидрат (1,94 г, 7,19 ммоль). Через 2 ч, при проведении анализа с помощью TLC, исходный материал не выявляли. Реакционную смесь промывали водой (50 мл), вод. нас. NaHCO3 (50 мл), солевым раствором (50 мл), органический слой сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха с получением 2,08 г кетона в виде прозрачного масла (97%). Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,67 (s, 1H), 2,67 - 2,48 (m, 2H), 2,26-2,11 (m, 2H), 2,00 (dddd, J= 14,5, 12,2, 5,4, 2,5 Гц, 1H), 1,87 (ddt, J= 14,2, 7,1, 3,7 Гц, 1H), 1,64-1,17 (m, 10H), 0,92 (s, 9H), 0,10 (t, J= 2,9 Гц, 6H). Rf = 0,40 (EtOAc/гептан 10/90).
Стадия 5. 5-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]спиро[5.5]ундец-2-ен-2-ил трифторметансульфоната
Перемешиваемый раствор 5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[5.5]ундекан-2-она (2 г, 6,8 ммоль) растворяли в сухом THF (160 мл) и охлаждали до -78°C. К данной смеси по каплям добавляли 0,18М LHMDS в THF (73,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 45 мин и раствор N-(5хлорпиридин-2-ил)-1,1,1-трифтор-Л-[(трифторметил)сульфонил]метан сульфонамида (5 г, 12,75 ммоль) в THF (60 мл) добавляли по каплям в течение 10 мин, реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 1 ч, затем оставляли для нагревания до RT в течение 3 ч Реакционную смесь гасили добавлением нас. NH4Cl (100 мл). Добавляли EtOAc (100 мл) и отделяли органический слой. Водный слой промывали (2x100 мл EtOAc) и органические слои объединяли, сушили (Na2SO4), фильтровали и растворитель удаляли при пониженном давлении с получением 8,4 г желтого неочищенного материала. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (картридж Biotage SNAP-HP 100g, сухая загрузка, элюент rem^^OAc, от 99:1 до 9:1) с получением 2,16 г целевого материала в виде бесцветного свободно растекающегося масла (71%, чистота 95%). Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 5,54 (d, J=4,1 Гц, 1H), 3,51 (t, J= 3,9 Гц, 1H), 2,48-2,30 (m, 2H), 2,16-2,06 (m, 2H), 1,64 - 1,17 (m, 10H), 0,88 (s, 9H), 0,05 (s, 6H). Rf = 0,61 (EtOAc/гептан 5/95). LC-MS: 2,72 мин (способ гидрофобной LC-MS), без ионизации.
Стадия 6. трет-Бутилдиметил{[4-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)спиро[5.5]ундец-3-ен-1-ил] окси}силан
5-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]спиро[5.5]ундец-2-ен-2-ил трифторметансульфонат (90%, 500 мг, 1,05 ммоль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би-1,3,2-диоксаборолан (320 мг, 1,26 ммоль), Pd(dppf)Cl2 (43 мг, 0,05 ммоль) и калия ацетат (770 мг, 7,87 ммоль) суспендировали в диоксане (5 мл). Раствор дегазировали азотом в течение 10 мин, а затем нагревали до 80°C. Через 2 ч, при проведении анализа с помощью LCMS не выявляли SM, но следовые количества по прежнему выявляли при проведении анализа с помощью TLC. Реакционную смесь оставляли для охлаждения до RT и перемешивали O/N. Добавляли воду (10 мл) и реакционную смесь экстрагировали с помощью EtOAc (2x20 мл). Объединенные органические слои промывали водой (10 мл) и сушили над Na2SO4, и выпаривали досуха. Остаток очищали на Biotage (SNAP 50g, элюент гептан/EtOAc, от 100/0 до 90/10) с получением 310 мг требуемого сложного боронового эфира (65%) в виде бесцветного масла. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 6,57 (s, OH), 6,45-6,32 (m, 1H), 3,58-3,40 (m, 1H), 2,36 (dd, J= 17,6, 1,9 Гц, 1H), 2,30 - 2,20 (m, 1H), 2,05 (ddd, J= 18,8, 5,9, 3,1 Гц, 1H), 1,79 (dd, J= 17,6, 2,2 Гц, 1H), 1,60-1,06 (m, 22H), 0,91- 0,83 (m, 9H), 0,01 (d, J= 1,4 Гц, 6H). Rf = 0,47 (EtOAc/гептан 5/95). LC-MS: 2,85 мин (способ гидрофобной LC-MS), без ионизации.
Стадия 7. трет-Бутил №(2-{[(3-{5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро[5.5]ундец-2-ен-2-ил}-1(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-Л-метилкарбамат
- 161 030481
трет-Бутилдиметил{[4-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)спиро[5.5]ундец-3-ен-1-ил] окси} силан (90%, 200 мг, 0,44 ммоль), трет-бутил^-(2-{[(3-йод-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-№ метилкарбамат (140 мг, 0,29 ммоль), Pd(dppf)Cl2 (24 мг, 29 мкмоль) и дикалия карбонат (122 мг, 0,88 ммоль) суспендировали в смеси диоксана (14 мл) и воды (1 мл). Реакционную смесь дегазировали азотом в течение 10 мин, а затем нагревали до 100°C в атмосфере азота. После ночи анализы с помощью TLC и LCMS показали присутствие требуемого материала. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали с помощью Biotage (SNAP 50g, элюент гептан/EtOAc, от 83/17 до 0/100) с получением 140 мг требуемого алкена (87%) в виде желтого масла. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,56-7,40 (m, 1H), 6,00-5,85 (m, 1H), 5,32 (dd, J= 9,2, 2,9 Гц, 1H), 4,06 (d, J= 9,9 Гц, 1H), 3,72-3,64 (m, 1H), 3,60 (t, J= 5,4 Гц, 1H), 3,43-3,21 (m, 3H), 2,82 (s, 2H), 2,62 (d, J= 14,6 Гц, 1H), 2,46 (s, 2H), 2,34 (d, J= 17,8 Гц, 1H), 2,19 (d, J= 19,2 Гц, 4H), 1,93 (d, J= 15,1 Гц, 1H), 1,76-1,34 (m, 18H), 1,24 (s, 9H), 0,88 (s, 9H), 0,04 (d, J= 2,3 Гц, 6H). LCMS: 1,59 мин (2 мин способ), масса/заряд = 631,25 .Rf = 0,30 (гептан/EtOAc, 3/7, UV и РМА).
Стадия 8. Рацемический трет-бутил N-{2-[({3-[(2S,5S)-5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро
[5.5]ундекан-2-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}^-метилкарбамат и рацемический трет-бутил N-{2-[({3-[(2S,5R)-5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро [5.5]ундекан-2-ил]-1(оксан-2-ил)-111-11иразол-4-ил }метил)(метил)амино]этил^N-метилкарбамат
Трет-бутил N-(2-{ [(3-{ 5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]спиро [5.5]ундец-2-ен-2-ил }-Ш-пиразол-4ил)метил](метил)амино}этил)^-метилкарбамат (140 мг, 0,26 ммоль) и палладий на угле (10%) (27 мг, 0,26 ммоль) суспендировали в EtOH (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при RT в атмосфере водорода. После перемешивания в течение ночи анализ с помощью LCMS показал лишь присутствие исходного материала. Раствор фильтровали через целит и промывали с помощью МеОН (2x10 мл). Фильтрат выпаривали и остаток растворяли в EtOH (5 мл), и добавляли палладий на угле (10%) (27 мг, 0,26 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при RT в атмосфере водорода в течение 36 ч Раствор фильтровали через целит и промывали с помощью МеОН (2x10 мл). Фильтрат выпаривали и остаток очищали с помощью Biotage (SNAP HP 10g, элюент гептан/EtOAc, от 95/5 до 0/100) с получением 40 мг дезаминированного побочного продукта (43%) в виде желтого масла, 10 мг изомера 1 (7%) в виде желтого масла и 40 мг изомера 2 (28%) в виде желтого масла. Дезаминированный побочный продукт: Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,30-7,27 (m, 1H), 5,31-5,23 (m, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 3,73-3,62 (m, 1H), 3,56-3,50 (m, 1H), 2,97-2,85 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,06-1,96 (m, 4H), 1,85-1,72 (m, 2H), 1,72-1,62 (m, 4H), 1,62-1,51 (m, 4H), 1,43 (dd, J= 10,3, 5,5 Гц, 4H), 1,40-1,19 (m, 4H), 0,91 (d, J= 3,3 Гц, 9H), 0,05 (d, J= 3,9 Гц, 6H). Rf = 0,80 (гептан/EtOAc 3/7). LC-MS: 2,73 мин (способ гидрофобной LC-MS), масс/заряд = 447,2.
Изомер 1: Л-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,53-7,39 (m, 1H), 5,35-5,22 (m, 1H), 4,04 (d, J= 9,9 Гц, 1H), 3,75-3,61 (m, 1H), 3,56 - 3,21 (m, 5H), 2,96-2,78 (m, 4H), 2,61- 2,38 (m, 2H), 2,30-2,15 (m, 3H), 2,111,88 (m, 5H), 1,84 - 1,50 (m, 12H), 1,50-1,39 (m, 14H), 1,30 -1,16 (m, 13H), 0,92 (s, 9H), 0,0-0,00 (m, 6H). Rf = 0,44 (гептан/EtOAc 3/7). LC-MS: 1,72 мин (2,5 мин LC-MS способ), масса/заряд= 633,25. Изомер 2: 1HЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,56-7,37 (m, 1H), 5,32-5,24 (m, 1H), 4,04 (d, J= 9,9 Гц, 1H), 3,67 (td, J= 10, 1, 8,9, 4,3 Гц, 1H), 3,55-3,18 (m, 5H), 2,90 (t, J= 12,9 Гц, 1H), 2,82 (s, 3H), 2,58-2,39 (m, 2H), 2,29-2,18 (m, 3H), 2,05-1,91 (m, 4H), 1,83-1,50 (m, 9H), 1,50-1,39 (m, 13H), 1,36-1,20 (m, 5H), 0,92 (s, 9H), 0,05 (d, J= 4,9 Гц, 6H). Rf = 0,35 (гептан/EtOAc 3/7). LC-MS: 1,66 мин (2,5 мин LC-MS способ), масса/заряд= 633,25.
Стадия 9 (изомер 2). Рацемическая смесь.
(^^)-4-[4-({Метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3-ил]спиро[5.5]ундекан-1-ола (соединение 183)
Трет-бутил N-(2- {[(3 - { 5 - [(трет-бутилдиметилсилил)окси] спиро [5.5]ундекан-2-ил }-1-(оксан-2-ил)Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)^-метилкарбамат (40 мг, 0,06 ммоль) растворяли в диоксане
- 162 030481
(J мл) и добавляли HCl (6М, J мл). Контроль реакции проводили с помощью LCMS. Через 2 ч больше не оставалось исходного материала и устанавливали полный переход в требуемую массу (лишь следовые количества при хроматомасспектрометрии). Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали с помощью колонки SCX (2g), проводя элюирование с помощью МеОН (J0 мл), затем с помощью МеОНЖН3 (J0 мл) до получения 20 мг (85%) требуемого материала с чистотой 90% (определено с помощью Л-ЯМР). Л-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,40 (s, JH), 3,67 (s, JH), 3,36 (s, 2H), 2,99 (tt, J= J3,0, 3,7 Гц, JH), 2,68 (t, J= 6,0 Гц, 2H), 2,50 (t, J= 5,9 Гц, 2H), 2,4J (s, 3H), 2,J8-2,J5 (m, JH), 2,J4 (s, 3H), 2,09-J,97 (m, JH), J,95-J,84 (m, JH), J,83-J,69 (m, 3H), J,62 (d, J= J0,2 Гц, 4H), J,54-J,26 (m, 9H).
Стадия 9 (изомер J). Рацемическая смесь.
(JS,4S)-4-[4-({Метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-JH-пиразол-3-ил]спиро[5.5]ундекан-J-ола (соединение J84)
Аналогичным образом, 5 мг титульного соединения выделяли из J0 мг реакционной смеси (выход 85%, чистота 80%). Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,47-7,32 (m, JH), 3,68 (s, JH), 3,4J-3,34 (m, 2H), 3,05-2,9J (m, JH), 2,89-2,75 (m, 3H), 2,64-2,55 (m, 2h), 2,53-2,44 (m, 3H), 2,3J-2,20 (m, JH), 2Д9-2Д4 (m, 2H), 2,084,96 (m, JH), J,94-J,83 (m, JH), J,8J-J,70 (m, 2H), J,70-J,55 (m, 4H), J,55-J,J9 (m, J0H).
Соединение J 85. 2,2-Диметил-5-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-JH-пиразол-3-ил]
циклогексан-Нол
Стадия J. 5,5-Диметил-7-оксабицикло[4.J.0]гептан-2-он
о
В ледяной раствор 4,4-диметилциклогекс-2-енона (J,00 г, 8,05 ммоль) в метаноле (8 мл) добавляли 35% пероксида водорода (4,6 мл, 40,9J ммоль) с последующим добавлением 0,5N NaOH (2,2 мл, J,J ммоль). Смесь перемешивали при 0°C в течение 5 ч, хранили в морозильной камере (4°C) в течение ночи, а затем перемешивали при 0°C в течение следующих 5 ч После этого периода времени реакционную смесь концентрировали in vacuo, затем добавляли воду (J5 мл) и смесь экстрагировали с помощью дихлорметана (3 x 50 мл). Органические слои объединяли, промывали с помощью J0% Na2SO3 (2x40 мл) и солевого раствора, сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 5,5-диметил-7-окса-бицикло[4.J.0 ]гептан-2-она в виде бесцветного масла (J,J8 г, колич): MS (ESI+) для C8HJ2O2 масса/заряд J4J,0 (М+Н)+.; чистота согласно HPLC 88% (вр. удержив., J,00 мин); JHЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,23 (d, J= 4,0 Гц, JH), 3,J8 (dd, J= 4,0, J,J Гц, JH), 2,4J (ddd, J= J8,9, 6,4, 3,0 Гц, JH), 2,J9 (ddd, J= J8,9, JJ,7, 7,0 Гц, JH), J,9J (ddd, J= J3,5, JJ,9, 6,4 Гц, JH), J,34 (dddd, J= J3,6, 7,0, 3,0, J,2 Гц, JH), J,22 (s, 3H), J,07 (s, 3H).
Стадия 2. 3-Гидрокси-4,4-диметилциклогексан-J-он
о
н3с сн3
Металлический литий (палочки) (74,27 мг, J0,70 ммоль) добавляли в раствор нафталина (J,83 г, J4,27 ммоль) в сухом THF (25 мл) при RT и перемешивали до растворения металла (~ 3 ч) перед охлаждением до -78°C. Затем раствор 5,5-диметил-7-оксабицикло[4.J.0]гептан-2-она (0,50 г, 3,57 ммоль) в сухом THF (J0 мл) добавляли и перемешивали в течение 20 мин Воду (5 мл) добавляли и реакционную смесь оставляли нагреваться до RT. Воду (20 мл) добавляли к реакционной смеси и продукт экстрагировали с помощью Et2O (2x50 мл). Продукт сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 25 г KP-Sil SNAP, проводя элюирование с помощью EtOAc:гептаны + J% TEA (J:9-9:J), получали требуемый продукт в виде бесцветного масла (2J0 мг, 4J%): Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,72 (dd, J= 8,J, 4,3 Гц, JH), 2,67 (ddd, J= J4,9, 4,3, J,0 Гц, JH), 2,48-2,40 (m, JH), 2,39 -2,32 (m, 2H), J,89 (dt, J= J3,3, 6,6 Гц, JH), J,5J (ddd, J= J4,3, 8,3, 6,4 Гц, JH), J,J5 (s, 3H), J,J0 (s, 3H).
Стадия 3. 3-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогексан-J -он
- J63 030481
Трет-бутилдиметилсилилхлорид (0,43 г, 2,84 ммоль) добавляли в раствор 3-гидрокси-4,4диметилциклогексан-1-она (0,34 г, 2,37 ммоль) и имидазола (0,39 г, 5,69 ммоль) в DCM (10 мл) при RT и перемешивали в течение двух выходных. Реакционную смесь разбавляли с помощью DCM (50 мл) и промывали водой (50 мл), а затем солевым раствором (50 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vocuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 25 г KP-Sil SNAP, проводя элюирование с помощью ЕЮАс:гептаны (1:9-2:8I), получали требуемый продукт в виде бесцветного масла (193 мг, 31%): 1Ы-ЯМР (500 МГц, Хлороформd) δ 3,64 (dd, J= 7,4, 4,2 Гц, 1H), 2,59-2,52 (m, 1H), 2,39-2,25 (m, 3H), 1,90-1,81 (m, 1H), 1,47-1,40 (m, 1H), 1,07 (s, 3H), 1,01 (s, 3H), 0,88 (s, 9H), 0,05 (d, J= 6,0 Гц, 6H).
Стадия 4. 5-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил трифторметансульфонат
2 М LDA в THF (0,96 мл, 1,92 ммоль) добавляли в раствор 3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4диметилциклогексан-1-она (0,35 г, 1,37 ммоль) в сухом THF (10 мл) при -78°C и перемешивали в течение 1 ч в атмосфере N2. 1,1,1-Трифтор-N-фенил-H-[(трифторметил)сульфон]метансульфонамид (0,59 г, 0,53 ммоль) добавляли в реакционную смесь в виде раствора в THF (1 мл) и реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 1 ч, а затем оставляли нагреваться до RT и перемешивали в течение ночи. Реакцию гасили добавлением воды и разбавлением с помощью этилацетата (30 мл). Реакционную смесь промывали водой (30 мл), затем солевым раствором (30 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo с получением масла. Данное масло растворяли в минимальном количестве DCM и загружали в колонку 25g KP SNAP, и элюировали с помощью гептана-EtOAc, от 0 до 6%, с получением 335 мг (62%) требуемого продукта в виде бесцветного масла: Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 5,62-5,48 (m, 1H), 3,54-3,44 (m, 1H), 2,50-2,42 (m, 1H), 2,24-2,15 (m, 1H), 2,11-2,03 (m, 1H), 1,85-1,77 (m, 1H), 0,85-0,81 (m, 15H), -0,01 (d, J= 7,3 Гц, 6H).
Стадия 5. трет-Бутил({[6,6-диметил-3-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-ен-1 -ил] окси }) диметилсилан
Суспензию 5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил трифторметансульфоната (0,34 г, 0,86 ммоль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би-1,3,2-диоксаборолана (0,33 г, 1,29 ммоль) и KOAc(0,59 г, 6,04 ммоль) в 1,4-диоксане (5 мл) дегазировали барботированием азотом в течение 10 мин, перемешивая в то же время при RT. Бис[3-(дифенилфосфанил)циклопента-2,4-диен-1-ил]железо, дихлорметан и дихлор палладия (0,07 г, 0,09 ммоль) добавляли в суспензию и перемешивали при 90°C в течение 3,5 ч перед тем, как оставить для охлаждения до RT в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью EtOAc (10 мл) и воды (10 мл). Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали с помощью EtOAc (10 мл). Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 25 г KP-Sil SNAP, проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (0I), получали требуемый продукт в виде бесцветного масла (250 мг, 79%): Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформd) δ 6,49-6,15 (m, 1H), 3,52-3,42 (m, 1H), 2,32-2,21 (m, 1H), 2,12-1,98 (m, 2H), 1,93-1,83 (m, 1H), 1,25 (d, J=
3,3 Гц, 12H), 0,91 (s, 3H), 0,87 (d, J= 3,8 Гц, 9H), 0,82 (d, J= 3,4 Гц, 3H), 0,07 - -0,02 (m, 6H).
Стадия 6. трет-Бутил №(2-{[(3-{5-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1ил }-1-(оксан-2-ил)- Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино) этил)-№метилкарбамат
- 164 030481
Суспензию трет-бутил({[6,6-диметил-3-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-ен-1-ил] окси})диметилсилана (0,15 г, 0,41 ммоль), трет-бутил. N-[2-( {[3-йод-Г(оксап-2-ил)-111-пиразол-4ил]метил}(метил)амино)этил]-№-метилкарбамата (0,13 г, 0,27 ммоль) и KOAc (0,11 г, 0,82 ммоль) в 1,4диоксане (10 мл) и воде (1 мл) дегазировали путем барботирования азотом в течение 10 мин, осуществляя в то же время перемешивание. Pd(dppf)Cl2.DCM (0,02 г, 0,03 ммоль) добавляли в реакционную смесь, которую затем перемешивали при 100°C в течение 18 ч в запаянной пробирке. Реакционную смесь оставляли для охлаждения до RT и выпаривали in vocuo. Остаток абсорбировали на силикагеле (~ 5 мл). При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 25 г KP-Sil SNAP, проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (+1% TEA 1:9 - 1), получали требуемый продукт в виде желтого масла (120 мг, 75%): MS (ESI+) для C32H58N4O4Si масса/заряд 591,25 (М+И)+; чистота согласно HPLC 100% (вр. удержив., 1,39 мин); 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,68-7,40 (m, 1H), 6,06-5,73 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 1H), 4,09-4,02 (m, 1H), 3,72-3,64 (m, 1H), 3,61 (dd, J= 8,0, 5,4 Гц, 1H), 3,48-3,31 (m, 2H), 3,27 (s, 1H), 3,18-3,05 (m, 1H), 2,94-2,75 (m, 3H), 2,71-2,61 (m, 1H), 2,54 -2,40 (m, 2H), 2,40-2,30 (m, 1H), 2,27-2,16 (m, 2H), 2,13-1,95 (m, 5H), 1,66 (d, J= 8,9 Гц, 2H), 1,49-1,39 (m, 9H), 0,96-0,79 (m, 15H), 0,13 - -0,01 (m, 6H).
Стадия 7. трет-Бутил №(2-{[(3-{3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогексил}-1(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-№-метилкарбамат
Смесь трет-бутил N-(2-{[(3- {3 - [(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1 -ен-1-ил}1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-№-метилкарбамата (120 мг, 0,20 ммоль) и 10% Pd-C (0,01 г) в EtOH (10 мл) перемешивали в атмосфере водорода в течение 18 ч Смесь фильтровали и в нее повторно добавляли другую часть 10% Pd-C и водорода, и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 10 г KP-Sil SNAP, проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (1:9-I), получали требуемый продукт в виде бесцветных кристаллов (49 мг, 40%): MS (ESI+) для C32H60N4O4Si масса/заряд 593,25 (М+И)+; чистота согласно HPLC 99% (вр. удержив., 1,41 мин); Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,44 (d, J= 25,2 Гц, 1H), 5,34 - 5,23 (m, 1H), 4,09-4,00 (m, 1H), 3,74-3,62 (m, 1H), 3,53-3,22 (m, 5H), 2,91-2,78 (m, 3H), 2,74-2,63 (m, 1H), 2,45 (s, 2H), 2,19 (d, J= 19,7 Гц, 3H), 2,07-1,96 (m, 3H), 1,76 (tt, J= 13,0, 7,9 Гц, 3H), 1,70-1,48 (m, 5H), 1,48-1,39 (m, 10H), 1,34-1,16 (m, 3H), 0,95-0,90 (m, 7H), 0,86 (s, 9H).
Стадия 8. 2,2-Диметил-5-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3-ил]циклогексан-1-ол (соединение 185)
6N HCl (2 мл) добавляли в раствор трет-бутил №(2-{[(3-{3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4диметилциклогексил}-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино}этил)-№-метилкарбамата (49 мг, 0,08 ммоль) в 1,4-диоксане (2 мл) при 0°C и перемешивали, позволяя в то же время нагреться до RT. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, затем выпаривали досуха, затем выпаривали из МеОН (2x10 мл). Продукт растворяли в МеОН (5 мл) и элюировали в картридже 2 г Isolute SCX-2. Затем элюировали с помощью МеОН (2x10 мл), затем извлекали продукт с помощью 7N NH3 в МеОН (2x10 мл). Его выпаривали досуха с получением -20 мг продукта. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 10 г KP-Sil SNAP, проводя элюирование с помощью DCM:MeOH (1:9), а затем с помощью 7N NH3 в MeOH:DCM (1:99-l :9), получали требуемый продукт в виде бесцветных кристаллов (16 мг, 66%): Ή-ЯМР (500 МГц, Метанол^4) δ 7,44
- 165 030481
(s, 1H), 3,43 (d, J= 8,9 Гц, 2H), 3,40-3,35 (m, 1H), 2,84 (ddt, J= 12,5, 7,9, 4,0 Гц, 1H), 2,76-2,64 (m, 2H), 2,52 (td, J= 6,5, 2,5 Гц, 2H), 2,38 (d, J= 6,3 Гц, 3H), 2,20 (d, J= 3,4 Гц, 3H), 1,76 (ddd, J= 24,8, 12,4, 4,2 Гц, 3H), 1,63-1,50 (m, 2H), 1,41-1,26 (m, 2H), 1,04 (d, J=7,1 Гц, 3H), 0,98 (d, J= 4,2 Гц, 3H); MS (ESI+), C16H30N4O масса/заряд 295,05 (M+H)+.
Соединение 200. Соль метил[2-(метиламино)этил]([4-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8ил]-Ш-пиразол-3-ил]метил)амин трифторуксусной кислоты
Стадия 1. (К^)-4-[3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-3-карбальдегид
В 50-мл круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, добавляли 2-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (500 мг, 1,71 ммоль, 1,00 эквив.), 4-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-3-карбальдегид (523 мг, 1,71 ммоль, 1,00 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (124 мг, 0,17 ммоль, 0,10 эквив.), K3PO4 (1,087 г, 5,12 ммоль, 2,99 эквив.), диметиловый эфир этиленгликоля (10 мл) и воду (1 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при 75°C в масляной бане. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:4) с получением 270 мг (R/S) 4-[3,3-диметил-1-оксаспиро
[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-3-карбальдегида в виде желтого масла.
Стадия 2. (R/S) трет-Бутил №(2-[[(4-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)Ш-пиразол-3-ил)метил](метил)амино]этил)-№метилкарбамата
В 50-мл круглодонную колбу помещали 4-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5^ес-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2ил)-Ш-пиразол-3-карбальдегид (270 мг, 0,78 ммоль, 1,00 эквив.), трет-бутил №метил^-[2-(метиламино) этил]карбамат (220 мг, 1,17 ммоль, 1,49 эквив.) и дихлорэтан (10 мл). NaBH(OAc)3 (496 мг, 2,34 ммоль, 2,98 эквив.) добавляли порциями и полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию гасили с помощью 15 мл воды и экстрагировали с помощью 3x15 мл дихлорметана. Объединенные органические слои промывали с помощью 20 мл солевого раствора и сушили над безводный натрия сульфатом, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента дихлорметан/метанол (20:1) с получением 300 мг (74%) (R/S) трет-бутил №(2-[[(4-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5] дец-7-ен-8-ил]-1 -(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-3-ил)метил](метил)амино]этил)-№метилкарбамата в виде бесцветного масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDO3): δ 7,43 (s, 1H), 5,78-5,50 (m, 1H), 4,79-4,58 (m, 1H), 4,15-3,77 (m, 2H), 3,77-3,40 (m, 4H), 3,40-3,05 (m, 2H), 3,00-2,68 (m, 4H), 2,68-1,99 (m, 10H), 1,99-1,82 (m, 2H), 1,821,50 (m, 6H), 1,44 (s, 9H), 1,13 (s, 6H) ppm.
Стадия 3. (R/S) трет-Бутил №[2-[[(4-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Шпиразол-3-ил)метил](метил)амино]этил)^-метилкарбамат
В 100-мл круглодонную колбу помещалитрет-бутил ^(2-[[(4-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-3-ил)метил](метил)амино]этил)-№метилкарбамат (300 мг, 0,58 ммоль, 1,00 эквив.), 10% Pd(OH)2/C (300 мг) и тетрагидрофуран (30 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре в водороде при давлении 3 атмосферы. Реакционный сосуд продували инертным газом и смесь фильтровали под защитным слоем инертного
- 166 030481
газа. Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 300 мг (100%) (R/S) трет-бутил N-(2-[[(4[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-3-ил)метил](метил)амино]этил)-Nметилкарбамата в виде бесцветного масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,45 (s, 1H), 5,74-5,53 (m, 1H), 4,10-3,98 (m, 1H), 3,40-3,25 (m, 3H), 2,79 (s, 3H), 2,60-2,30 (m, 5H), 2,30-2,15 (m, 3H), 1,99-1,75 (m, 8H), 1,75-1,50 (m, 10H), 1,42 (s, 9H), 1,10 (s, 6H).
Стадия 4. Соль метил[2-(метиламино)этил]([4-[(5R,8S)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]Ш-пиразол-3-ил]метил)амин трифторуксусной кислоты (соединение 200)
В 50-мл круглодонную колбу помещали(Я^) трет-бутил №(2-[[(4-[3,3-диметил-1-оксаспиро
[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-1H-пиразол-3-ил)метил](метил)амино]этил)-N-метилкарбамат (300 мг, 0,58 ммоль, 1,00 эквив.), трифторукусную кислоту (5 мл) и дихлорметан (5 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт (307 мг) очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (Waters 2767-2(HPLC-005)): колонка, Atlantis Prep OBD T3 Column, 19x150 мм, 5 мкм; подвижная фаза, вода с 0,05% трифторукусной кислотой и CH3CN (до 3,0% в течение 10 мин, до 100% в течение 1 мин, удерживание при 100% в течение 1 мин); детектор, УФ 220 нм. В результате получали 154,5 мг (50%) соли (R/S) метил[2-(метиламино)этил]([4-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-3ил]метил) амин трифторукусной кислоты в виде бесцветного твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O) δ: 7,71 (s, 1H), 4,49 (s, 2H), 3,70-3,50 (m, 6H), 2,94 (s, 3H), 2,80 (s, 3H), 2,62-2,49 (m, 1H), 2,05-1,87 (m, 2H), 1,79-1,52 (m, 8H), 1,10 (s, 6H) ppm.
Соединение 205. Метил([1-метил-3-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол4-ил]метил)[2-(метиламино)этил]амина гидрохлорид
Стадия 1. 3-[3,3-Диметил-1 -оксаспиро [4.5]дец-7-ен-8-ил]-1 -метил-111-11иразод-4-карбальдегид
К перемешиваемой смеси 3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-Ш-пиразол-4-карбальдегида (2 г, 7,68 ммоль, 1,00 эквив.) и калий карбоната (3,18 г, 23,01 ммоль, 2,99 эквив.) в CH3CN (40 мл) при 0°С по каплям добавляли CH3I (5,46 г, 38,47 ммоль, 5,01 эквив.). Полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуры, а затем концентрировали под вакуумом. Полученный в результате остаток растворяли в Н2О (30 мл) и экстрагировали с помощью 3x20 мл дихлорметана. Объединенные органические слои промывали с помощью 3x20 мл солевого раствора, а затем сушили над безводным натрия сульфатом. Остаток частично очищали с помощью флеш-хроматографии на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (градиент: 1:9-1:2). Полученный в результате материал повторно очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях: Колонка: XBridge С18, 19x150 мм, 5 мкм; подвижная фаза А: вода/0,05% NH4HCO3, подвижная фаза В: ACN; скорость потока: 30 мл/мин; градиент: от 20% В до 85% В в течение 10 мин; 254 нм. В результате получали 1,04 г (49%) 3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-метил-Шпиразол-4-карбальдегид в виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 9,88(s, 1H), 7,86(s, 1H), 6,18-6,16(m, 1H), 3,90(s, 3H), 3,59-3,54(m, 3H), 2,78-2,70(m, 1H), 2,59-2,35(m, 3H), 2,63-2,56(m, 1H), 1,96-1,90(m, 1H), 1,75-1,61(m, 2H), 1,13(s, 6H) ppm. И другой изомер, 0,45 г (21,2%) 3-[3,3-диметил1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-2-метилпиразол-4-карбальдегида. Ή-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 9,70(s, 1H), 7,91(s, 1H), 5,84-5,82(m, 1H), 3,80(s, 3H), 3,60-3,54(m, 3H), 2,57-2,26(m, 4H), 2,01-1,94(m, 1H), 1,851,80(m, 1H), 1,78-1,60(m, 1H), 1,15(s, 6H) ppm.
Стадия 2. трет-Бутил N-(2-[[(3-[3,3 - Диметил-1-оксаспиро [4.5] дец-7-ен-8-ил]-1 -метил-Ш-пиразол-4ил)метил](метил)амино]этил)-N-метилкарбамат
- 167 030481
В раствор 3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-метил-1Н-пиразол-4-карбальдегид (1,04 г, 3,79 ммоль, 1,00 эквив.) и трет-бутил ^метил-^[2-(метиламино)этил]карбамата (1,07 г, 5,68 ммоль, 1,50 эквив.) в дихлорэтане (20 мл) частями добавляли NaBI I(OAc)3 (2,41 г). Полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи при 50°С в масляной бане, затем охлаждали до комнатной температуры, гасили добавлением 5 мл N114С1 (нас. вод.). Полученную в результате смесь растворяли в дихлорметане (40 мл) и промывали с помощью солевого раствора 3x20 мл, затем сушили над безводным натрия сульфатом. Остаток очищали с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси дихлорметана/метанола (20:1) с получением 1,50 мг (89%) трет-бутил N(2-[[(3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-метил-1Н-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)N-метилкарбамата в виде желтого масла, 1Н-ЯМР (300 МГц, D2G) δ : 8,12 (s, 1Н), 5,72-5,70(m, 1Н), 4,253,94(m, 4Н), 3,75-3,34(m, 5Н), 3,16-2,88(m, 4Н), 2,51-2,04(m, 7Н), 1,93-1,62(m, 5Н), 1,45(s, 9Н), 1,13(s, 6Н).
Стадия 3. ^Метил^-[2-[метил([1-метил-3-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-4-ил]метил)амино]этил]карбамат
В 250-мл круглодонную колбу помещалитрет-бутил ^(2-[[(3-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]дец-7ен-8-ил]-1-метил-1Н-пиразол-4-ил)метил] (метил)амино]этил)-№метилкарбамат (1,50 г, 3,36 ммоль, 1,00 эквив.), тетрагидрофуран (30 мл) и 10% Pd(GH)2 /С (1,50 г). Полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в водороде при давлении 3 атмосферы. Полученную в результате смесь фильтровали, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток частично очищали с помощью флеш-хроматографии на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента дихлорметана/метанола (20:1). Частично очищенный материал затем подвергали повторной очистке при следующих условиях: Колонка: XBridge С18, 19x150 мм, 5 мкм; подвижная фаза А: вода/0,05% NH4HCG3, подвижная фаза В: АС^ скорость потока: 30 мл/мин; градиент: от 20% В до 85% В в течение 10 мин; 254 нм. В результате получали 1,0 г (66%) трет-бутил ^метил-№[2-[метил([1-метил-3-[^^)-3,3диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-4-ил]метил)амино]этил]карбамат в виде желтого масла. 1Н-ЯМР (400 МГц, CDзC1) δ : 7,14(s, 1Н), 3,80-3,78(m, 4Н), 3,51(s, 3Н), 3,36-3,28(m, 3Н), 2,85(s, 3Н), 2,58-2,46(m, 2Н), 2,28-2,22(m, 3Н), 2,01-1,84(m, 4Н), 1,68-1,53(m, 4Н), 1,55(s, 2Н), 1,43(s, 9Н), 1,13(s, 6Н).
Стадия 4. Метил ([1-метил-3-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-4-ил] метил)[2-(метиламино)этил] амина гидрохлорид (соединение 205)
В 25-мл круглодонную колбу помещалитрет-бутил N-метил-N-[2-[метил([1-метил-3-[(5S,8S)-3,3диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-4-ил]метил)амино]этил]карбамат (230 мг, 0,51 ммоль, 1.00 эквив.) и дихлорметан (10 мл). Реакционную смесь барботировали газом хлороводородом. Реакционную смесь затем перемешивали в течение 0,5 ч при комнатной температуре, затем экстрагировали с помощью 3x10 мл воды, и водные слои объединяли и концентрировали под вакуумом. В результате получали 131 мг (61%) метил([1-метил-3-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-4ил]метил)[2-(метиламино)этил]амина гидрохлорида в виде бесцветного твердого вещества. 1Н-ЯМР (400 МГц, D2g): 7,66 (s, 1Н), 4,25 (s, 2Н), 3,74 (s, 3Н), 3,50-3,40 (m, 6Н), 2,74 (s, 3Н), 2,70 (s, 3Н), 2,64-2,54 (m, 1Н), 2,60 (s, 1Н), 1,89 (d, 2Н, J= 16 Гц), 1,70-1,42 (m, 8Н), 0,99 (s, 6Н). ^MS (способ А5, ESI): RT =1,33 мин, масса/заряд = 349,2 [М+Н]+.
Соединение 206. Метил ([1-метил-3-[(5R,8S)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1H-пиразол4-ил]метил)[2-(метиламино)этил] амина гидрохлорид
- 168
030481
Стадия 1. Метил ([1-метил-3-[(5R,8S)-3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1H-пиразол-4-ил] метил)[2-(метиламино)этил] амина гидрохлорид (соединение 206)
В 25-мл круглодонную колбу помещалитрет-бутил N-метил-N-[2-[метил([1-метил-3-[(5R,8R)-3,3диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-4-ил]метил)амино]этил]карбамат (80 мг, 178,32 ммоль, 1,00 эквив.) и дихлорметан (10 мл). Реакционную смесь барботировали хлороводородом (газом). Реакционную смесь затем перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, а затем экстрагировали с помощью воды 3x10 мл, и водные слои объединяли и концентрировали под вакуумом. В результате получали 23,1 мг метил([1 -метил-3-[(5R,8R)-3,3-диметил-1 -оксаспиро[4.5]декан-8-ил]- Ш-пиразол-4-ил] метил)[2-(метиламино)этил] амина гидрохлорида в виде бесцветного твердого вещества. Ή-ЯМР (400 МГц, D2O) δ : 7,66 (s, 1H), 4,25 (s, 2H), 3,74 (s, 3H), 3,50-3,40 (m, 6H), 2,74 (s, 3H), 2,70 (s, 3H), 2,67-2,55 (m, 1H), 1,87-1,68 (m, 6H), 1,52-1,42 (m, 4H), 1,02 (s, 6H). LCMS (способ A5, ESI): RT =1,32 мин, масса/заряд = 349,15 [M+H]+.
Соединение 245. Соль метил ([2-[метил([1-метил-5-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8ил]-Ш-пиразол-4-ил]метил)амино]этил])амина трифторуксусной кислоты
Стадия 1. 3-Йод-Ш-пиразол-4-карбальдегид
К перемешиваемому раствору 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида (3 г, 9,80 ммоль, 1,00 эквив.) в дихлорметане (10 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (10 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре, затем концентрировали под вакуумом и полученный в результате остаток обрабатывали с помощью достаточного количества натрия карбоната (нас. вод.), чтобы получить смесь с pH 8. Полученный в результате раствор экстрагировали с помощью 50 мл дихлорметана, и органические слои промывали солевым раствором (3x50 мл), и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флешхроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан/петролейный эфир (1:3), с получением 1,4 г (64%) 3-йод-Ш-пиразол-4-карбальдегидав виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3)j δ 9,89 (s, 1H), 8,04(s, 1H) ppm.
Стадия 2. 5-Йод-1-метил-Ш-пиразол-4-карбальдегид
К перемешиваемому раствору 3-йод-Ш-пиразол-4-карбальдегида (1,4 г, 6,31 ммоль, 1,00 эквив.) в CH3CN (20 мл) при 0°C добавляли калия карбонат (2,5 г, 18,09 ммоль, 2,87 эквив.) с последующим добавлением по каплям CH3I (980 мг, 6,90 ммоль, 1,09 эквив.). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуры, а затем фильтровали и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан/петролейный эфир (1:10), с получением 400 мг (27%) 5-йод-Ш-пиразол-4-карбальдегида в виде белого твердого вещества. 'H-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 9,61 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 3,92 (s, 3H) ppm.
Стадия 3. 5- [3,3-Диметил-1 -оксаспиро [4.5] дец-7-ен-8-ил]-1 -метил-1 H-пиразол-4-карбальдегид
В 50-мл 3-х горлую круглодонную колбу, которую продували азотом и в которой поддерживали инертную атмосферу азота, помещали 2-[3,3-диметил-1-оксаспиро[1,4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (686 мг, 2,35 ммоль, 1,00 эквив.), 1,4-диоксан (20 мл), 5-йод-1-метил-Ш-пиразол-4-карбальдегид (370 мг, 1,57 ммоль, 0,67 экв.), Pd(dppf)Cl2 (115 мг, 0,16 ммоль, 0,07 экв.), воду (2 мл) и калия карбонат (650 мг, 4,70 ммоль, 2,00 экв.). Полученную в результате смесь перемешивали в тече- 169 030481
ние ночи при 80°С, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:7) с получением 340 мг (53%) 5-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5 ]дец-7-ен-8-ил]-1-метил-Ш-пиразол-4-карбальдегида в виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDClз): δ 9,70 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 5,84-5,83 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,60 (s, 2H), 2,57-2,26 (m, 4H), 2,04-1,68 (m, 4H), 1,21-1,10 (m, 6H) ppm.
Стадия 4. (5-[3,3-Диметил-1 -оксаспиро[4.5]декан-8-ил]- 1-метил-111-1шразол-4-ил)\-1ета.1 юл
В 50-мл круглодонную колбу помещали 5-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-метил-Шпиразол-4-карбальдегид (340 мг, 1,23 ммоль, 1,00 эквив.), тетрагидрофуран (20 мл) и 10% Pd(OH)2Y (680 мг). Полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в водороде под давлением 3 атмосферы, затем фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением 340 мг (5-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-метил-Ш-пиразол-4-ил)метанола в виде светложелтого масла.
Стадия 5. трет-Бутил ^[2-[[(5-[3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-метил-Ш-пиразол-4ил)метил](метил)амино]этил)-№-метилкарбамат
В раствор (5-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-метил-Ш-пиразол-4-ил)метанола (340 мг, 1,22 ммоль, 1,00 эквив.) и триэтиламина (371 мг, 3,67 ммоль, 3,00 эквив.) в дихлорметане (8 мл) при 0°С по каплям при перемешивании добавляли метансульфонила хлорид (167,3 мг). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем обрабатывали с помощью трет-бутил ^метил-Ы-[2-(метиламино)этил]карбамата (276 мг, 1,47 ммоль, 1,20 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем гасили добавлением 20 мл воды. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3x50 мл дихлорметана, и органические слои объединяли и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом с получением 128 мг (23%) трет-бутил ^(2-[[(5-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-метил-Шпиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-Ы-метилкарбамата в виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDзOD): δ 7,30 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,53 (s, 2H), 3,43-3,31 (m, 4H), 2,91-2,83 (m, 4H), 2,53-2,50 (m, 2H), 2,25-2,07 (m, 5H), 1,97-1,93 (m, 2H), 1,63-1,49 (m, 15H), 1,18-1,10 (m, 6H) ppm.
Стадия 6. Соль метил ([2-[метил([1-метил-5-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Шпиразол-4-ил]метил)амино]этил])амин трифторуксусной кислоты (соединение 245)
В 8-мл запаянную пробирку помещали трет-бутил ^(2-[[(5-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8ил]-1-метил-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-Ш-метилкарбамат (37 мг, 0,08 ммоль, 1,00 эквив.), дихлорметан (1 мл) и CFзCOOH (1 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем концентрировали под вакуумом. Полученный в результате остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой при следующих условиях: Колонка: Sunfire С18, 19x150 мм, 5 мкм; подвижная фаза А: вода/0,05% TFA, подвижная фаза В: ACN; скорость потока: 30 мл/мин; градиент: от 5 В до 55% В в течение 10 мин; 254 нм. В результате получали 18,9 мг соли (40%) метил ([2-[метил([1-метил-5-[^^)-3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-4-ил]метил) амино]этил])амин трифторуксусной кислоты в виде бесцветного масла. N-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,53 (s, 1H), 4,33 (s, 2H), 3,81 (s, 3H), 3,52-3,40 (m, 6H), 2,91-2,69 (m, 7H), 2,00-1,72 (m, 4H), 1,69-1,45 (m, 6H), 1,00 (s, 6H). LCMS (способ W, ESI): RT - 1,37 мин, масса/заряд = 349,1 [М+Н].
Соединение 217. 4-[4-([Метил[2-(метиламино)этил]амино]метил)-Ш-пиразол-3-ил]циклогексан-1ол трифторацетат
Стадия 1. 1,4-Диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфонат
- 170 030481
В раствор 1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-она (80 г, 512,23 ммоль, 1,00 эквив.) в THF (500 мл) при 78°C добавляли по каплям в течение примерно 25 мин LiHMDS (615 мл 1 М раствора в THF), затем перемешивали в течение 2 ч при -40°C. Реакционную смесь затем охлаждали до -78°C и обрабатывали с помощью добавления по каплям 1,1,1-трифтор-^фенил-^(трифторметан)сульфонилметансульфонамида (220 г, 615,82 ммоль, 1,20 эквив.). Полученный в результате раствор оставляли, чтобы он нагрелся до комнатной температуры, и перемешивали в течение ночи, затем гасили добавлением 100 мл NH4Cl (нас. вод.). Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 500 мл этилацетата, и органический экстракт промывали солевым раствором 3x500 мл, и сушили над безводным натрия сульфатом. Неочищенный продукт частично очищали с помощью флеш-хроматографии на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (градиент: от 1 до 3% ЕА) с получением 166 г 1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфоната в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ,68-5,64 (m, 1H), 3,99(s, 4H), 2,56-2,51(m, 2H), 2,42-2,41(m, 2H), 1,90(t, J=6,6F4, 2H) ppm.
Стадия 2. 2-[1,4-Диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан
В 3-л 4-горлую круглодонную колбу помещали 1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил трифторметансульфонат (80 г, 277,55 ммоль, 1,00 эквив.), В2Рт2 (85 г, 334,65 ммоль, 1,21 эквив.), Pd(dppf)Cl2 (20 г, 27,33 ммоль, 0,10 эквив.), KOAc (82 г, 835,54 ммоль, 3,01 эквив.) и 1,4-диоксан (800 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение ночи при 80°C, используя масляную баню, затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток экстрагировали с помощью 1 л этилацетата и органический слой промывали с помощью солевого раствора 3x1 л солевого раствора, и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток частично очищали с помощью флеш-хроматографии на колонке с силикагелем, используя этилацетат/петролейный эфир (градиент: от 5% до 10% этилацетата), с получением 36 г (49%) 2-[1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана в виде желтого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ,46-6,47 (m, 1H), 3,98(s, 4H), 2,39-2,35(m, 4H), 1,73(t, J=4,8r4, 2H), 1,26(s, 12H) ppm.
Стадия 3. 3-[1,4-Диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразоле-4-карбальдегид
В 2-л 4-горлую круглодонную колбу помещали 2-[1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-4,4,5,5тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (44 г, 165,33 ммоль, 1,00 эквив.) и 3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4карбальдегид (45,5 г, 148,64 ммоль, 0,90 эквив.). После этого добавляли Pd(dppf)Cl2 (12 г, 16,40 ммоль, 0,10 эквив.). К этой смеси добавляли K3PO4 (105 г, 494,66 ммоль, 2,99 эквив.), диметиловый эфир этиленгликоля (500 мл) и воду (50 мл). Полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи при 75°C в масляной бане, затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток экстрагировали с помощью 500 л этилацетата и органический слой промывали с помощью солевого раствора 3x500 мл солевого раствора, и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток частично очищали с помощью флеш-хроматографии на колонке с силикагелем, используя этилацетат/петролейный эфир в качестве элюента (градиент: от 20 до 30% ЕА) с получением 35,5 г (67%) (R/S) 3-[1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида в виде светло-желтого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): 9,91(s, 1H), 8,26(s, 1H), 6,296,26(m, 1H), 5,38-5,34 (m, 1H), 4,09-4,01(m, 5H), 3,74-3,63(m, 1H), 2,79-2,74(m, 2H), 2,50-2,49(d, Ш3,бГц, 2H), 2,12-1,89(m, 5H), 1,72-1,60(m, 3H) ppm.
Стадия 4. (R/S) трет-Бутил ^(2-[[(3-[1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-^метилкарбамат
- 171 030481
К перемешиваемому раствору (R/S) 3-[1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-карбальдегида(25 г, 78,53 ммоль, 1,00 эквив.) и трет-бутил ^метил^-[2-(метиламино)этил]карбамата (17,7 г, 94,02 ммоль, 1,20 эквив.) в дихлорэтане (250 мл) при 0°C добавляли частями NaBH(OAc)3 (50 г, 235,91 ммоль, 3,00 эквив.). Полученную в результате смесь оставляли, чтобы она нагрелась до комнатной температуры, и перемешивали в течение ночи, а затем гасили добавлением 50 мл NH4Cl (нас. вод.). Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 500 мл CH2Cl2 и органическую фазу промывали солевым раствором 3x500 мл, и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:2) с получением 30,3 г (79%) (R/S) трет-бутил №(2-[[(3-[1,4-оксаспиро[4.5]дец-7-ен-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил) амино]этил)-№метилкарбамата в виде желтого масла. N-ЯМР (300 МГц, CDCl3): 7,50(s, 1H), 6,26 (br, 1H), 5,38-5,34 (m, 1H), 4,09-3,99(m, 5H), 3,74-3,69(m, 1H), 3,42(br, 2H), 2,86(s, 3H), 2,84-2,07(m, 8H), 2,04(s, 3H), 1,85(t, Ш6,бГц, 2H), 1,68-1,52(m, 6H), 1,58(s, 9H) ppm.
Стадия 5. (R/S) трет-Бутил ^(2-[[(3-[1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4ил)метил](метил)амино]этил)^-метилкарбамата
В 1-л круглодонную колбу помещали (R/S) трет-бутил ^(2-[[(3-[1,4-диоксаспиро[4.5]дец-7-ен-8ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамат (15 г, 30,57 ммоль, 1,00 экв.), THF (500 мл) и 10% Pd(OH)2/C (9 г). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в водороде при давлении 3 атмосферы. Полученную в результате смесь фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением 11,5 г (76%) (R/S) трет-бутил N-(2-[[(3-[1,4диоксасииро[4.5]декан-8-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамата в виде желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3) : 7,41(s, 1H), 5,30-5,25 (m, 1H), 4,11-3,95(m, 5H), 3,70-3,62(m, 1H), 3,36(br, 4H), 2,83(s, 3H), 2,74-2,66(m, 1H), 2,47(s, 3H), 2,04(s, 3H), 2,04-1,82(m, 10H), 1,68-1,52(m, 6H), 1,48(s, 9H) ppm.
Стадия 6. (R/S) трет-Бутил ^метил-П-[2-[метил([[1-(оксан-2-ил)-3-(4-оксоциклогексил)-Ш-пиразол-4-ил]метил])амино]этил]карбамат
В 250-мл круглодонную колбу помещали трет-бутил ^(2-[[(3-[1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил)метил](метил)амино]этил)-П-метилкарбамат (13,5 г, 27,40 ммоль, 1,00 эквив.), дихлорметан (130 мл) и FeCl3-6H2O (26 г, 96,30 ммоль, 3,51 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем экстрагировали с помощью дихлорметана (200 мл). Органическую фазу последовательно промывали с помощью 3x100 мл солевого раствора, 3x100 мл натрия бикарбоната (нас. вод.), а затем снова 3x100 мл солевого раствора. Смесь сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток частично очищали с помощью флеш-хроматографии на колонке с силикагелем, используя метанол/дихлорметан (градиент: от 1 до 5% MeOH) с получением 7,5 г (61%) трет-бутил №метил-№[2-[метил([[1-(оксан-2-ил)-3-(4оксоциклогексил)-Ш-пиразол-4-ил]метил])амино]этил]карбамата в виде желтого масла.
Стадия 7. (R/S) ^[2-([[3-(4-Гидроксициклогексил)-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил](метил) амино)этил]-№метилкарбамат
172 030481
К перемешиваемому раствору (R/S) трет-бутил ^метил-АШ-[2-[метил([[1-(оксан-2-ил)-3-(4-оксоциклогексил)-Ш-пиразол-4-ил]метил])амино]этил]карбамата (500 мг, 1,11 ммоль) в метаноле (5 мл) при 0°C добавляли по частям NaBH4 (85 мг, 2,24 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем гасили добавление 5 мл NH4Cl (нас. вод.). Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом с получением 380 мг (76%) (R/S) трет-бутил N-[2-([[3(4-гидроксициклогексил)-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил](метил)амино)]-№-метилкарбамата в виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (400 МГц, CDCf): δ 7,41 (s, 1H), 5,28 (t, J= 6,0 Гц, 1H), 4,05 (d, J= 8,0 Гц, 1H), 3,74-3,62 (m, 2H), 3,41-3,25 (m, 3H), 2,84(s, 3H), 2,68-2,56 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 2,09-1,82 (m, 6H), 1,74-1,52 (m, 7H), 1,51-1,29 (m, 13H) ppm.
Стадия 8. трет-Бутил 2-(((3-((18,48)-4-гидроксициклогексил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино) этил(метил)карбамат
Раствор (R/S) трет-бутил №[2-([[3-(4-гидроксициклогексил)-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил] (метил)амино)этил]-№-метилкарбамата (380 мг, 0,84 ммоль, 1,00 эквив.) в метаноле (30 мл) обрабатывали с помощью водного раствора хлористо-водородной кислоты (12N, 0,06 мл) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Значение pH раствора доводили до 7-8 с помощью аммиака и смесь сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой при следующих условиях: Колонка: Sunfire C18, 19x150 мм, 5 мкм; подвижная фаза А: вода/0,05% аммония гидроксида, подвижная фаза В: ACN; скорость потока: 30 мл/мин; градиент: от 5% В до 55% В в течение 10 мин; детектор: 254 нм. В результате получали цис-изомер - 30 мг трет-бутил 2-(((3-((^^)-4-гидроксициклогексил)-Ш-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил(метил) карбамата. LCMS (способ D, ESI): RT = 1,12 мин, масса/заряд = 367,0 [М+Н]+. И транс-изомер - 130 мг трет-бутил 2-(((3-((1 S,4S)-4-гидроксициклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино)этил(метил) карбамата в виде светло-желтого масла.
Стадия 9. 4-[4-([Метил[2-(метиламино)этил]амино]метил)-Ш-пиразол-3-ил]циклогексан-1-ол трифторацетат (соединение 217)
Раствор трет-бутил 2-(((3-((1 S,4S)-4-гидроксициклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино) этил(метил)карбамата (30 мг, 0,08 ммоль, 1.00 эквив.) в дихлорметане (2 мл) обрабатывали с помощью трифторуксусной кислоты (2 мл) и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Полученную в результате смесь концентрировали под вакуумом с получением 28,6 мг (71%) соли 4-[4([метил[2-(метиламино)этил]амино]метил)-Ш-пиразол-3-ил]циклогексан-1-ол трифторацетата в виде светло-желтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,70 (s, 1H), 4,30 (s, 2H), 4,70-4,00 (m, 1H), 3,51-3,40 (m, 4H), 2,82-2,66 (m, 7H), 1,86-1,52 (m, 8H) ppm. LCMS (способ A6, ESI): RT = 2,78 мин, масса/заряд = 267,05 [M+H]+.
Соединение 227. 4-[4-([Метил[2-(метиламино)этил]амино]метил)-1Н-пиразол-3-ил]циклогексан-1ол трифторацетат
Стадия 1. 4-[4-([Метил[2-(метиламино)этил]амино]метил)-Ш-пиразол-3-ил]циклогексан-1-ол трифторацетат (соединение 227)
Раствор трет-бутил 2-(((3-((1R,4R)-4-гидроксициклогексил)-1H-пиразол-4-ил)метил)(метил)амино) этил(метил)карбамата (130 мг, 0,35 ммоль, 1,00 эквив.)) в дихлорметане (2 мл) обрабатывали с помощью трифторуксусной кислоты (2 мл) и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Полу- 173 030481
ченную в результате смесь концентрировали под вакуумом с получением 120,9 мг (69%) 4-[4-([метил[2(метиламино)этил]амино]метил)-Ш-пиразол-3-ил]циклогексан-1-ол трифторацетата в виде светложелтого масла. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,70 (s, 1H), 4,30 (s, 2H), 3,71-3,60 (m, 1H), 3,51-3,41 (m, 4H), 2,78-2,60 (m, 7H), 2,01-1,91 (m, 2H), 1,87-1,75 (m, 2H), 1,61-1,45 (m, 2H), 1,40-1,22 (m, 2H) ppm. LCMS (способ А6, ESI): RT = 2,83 мин, масса/заряд = 267,1 [M+H]+.
Соединение 263. (15)-2,2-Диметил-5-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-Ш-пиразол-3ил ]-N-(3 -метилбутил )циклогексан-1-карбоксамид
Стадия 1. (25)-2-(Метоксиметил)-М-метилиденпирролидин-1-амин
В ледяной раствор (25)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-амина (5,0 г, 38,41 ммоль) в DCM (75 мл) добавляли параформальдегид (1,38 г, 46,09 ммоль). Смесь оставляли перемешиваться при RT в течение двух выходных дней. Добавляли воду (25 мл) и разделяли фазы. Водную фазу экстрагировали с помощью DCM (3x30 мл). Объединенные органические слои промывали водой (20 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали досуха. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г КР-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью EtOAc: гептана (1:99-4:6), получали требуемый продукт в виде бесцветного масла (4,19 мг, 76%): MS (ESI+) в течение C7H14N2O масса/заряд 143,0 (М+H)*; чистота согласно HPLC 100 % (время, удержив., 0,81 мин); 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 6,13 (d, J= 11,6 Гц, 1H), 6,02 (d, J= 11,6 Гц, 1H), 3,62-3,51 (m, 2H), 3,49-3,42 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 3,33 (ddd, J= 9,9, 7,3, 3,4 Гц, 1H), 2,83 (q, J= 7,9 Гц, 1H), 2,04-1,87 (m, 3h), 1,86-1,75 (m, 1H).
Стадия 2. (3S)-3-[(E)-N-[(2S)-2-(Метоксиметил)пирролидин-1-ил]карбоксимидоил]-4,4-диметилциклогексан-1-она
В охлажденный (-78°C) раствор 4,4-диметилциклогекс-2-ен-1-она (4,57 г, 36,83 ммоль) в сухом THF (100 мл) последовательно добавляли трет-бутил(диметил)силил трифторметансульфонат (7,45 мл, 32,41 ммоль) и предварительно охлажденный (-78°C) (2S)-2-(метоксиметил)-N-метилиденпирролидин-1-амин (4.19 г, 29,47 ммоль) в атмосфере N2. Через 45 мин добавляли 1М ^^№трибутилбутан-1-алюминия фторид (44,20 мл, 44,20 ммоль) и смесь оставляли нагреваться до RT, и перемешивали до тех пор, пока анализ LC/MS не показал общий расход простой силиловый эфир енола (в течение ночи). Реакционную смесь разбавляли т-бутилметиловым эфиром (100 мл) и промывали водой (2x100 мл). Водный слой затем экстрагировали с помощью т-бутилметилового эфира (100 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (100 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo с получением темно-коричневого масла. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 340 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью EtOAc:гептана (1:9-6:4), получали требуемый продукт в виде желтого масла (4,6 г, 59%): MS (ESI+) для С15Н26^О2 масса/заряд 266,95 (М+H)*; чистота согласно HPLC 100% (вр. удержив., 1,11 мин); fl-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-Ш) δ 6,60-6,51 (m, 1H), 3,56-3,49 (m, 1H), 3,47-3,41 (m, 1H), 3,40-3,28 (m, 5H), 2,73 (q, J= 8,0 Гц, 1H), 2,56-2,25 (m, 5H), 2,01-1,84 (m, 3H), 1,83-1,70 (m, 2H), 1,67-1,60 (m, 1H), 1,07 (d, J= 11,2 Гц, 6H).
Стадия 3. 3(^)-2,2-Диметил-5-оксоциклогексан-1-карбальдегид
Раствор (3S)-3-(E)-N-[(2S)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-ил]карбоксимидоил]-4,4-диметилциклогексан-1-он (13,7 г, 51,43 ммоль) в DCM (250 мл) охлаждали до -78°C и проводили барботирование сухим озоном до появления постоянной зеленого/синего окрашивания (~4 ч), и продолжали еще в течение дополнительных 30 мин. Реакционную смесь барботировали азотом в течение 20 мин добавляли диме- 174 030481
тилсульфид (3,9 мл, 62,13 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при RT в течение 30 мин перед выпариванием in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 340 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью ЕЮАс:гептаны (1:9-7:3), получали требуемый продукт в виде желтого масла (4,02 г, 46%): 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 9,85 (d, J= 1,5 Гц, 1H), 2,67-2,62 (m, 1H), 2,61- 2,54 (m, 1H), 2,48-2,40 (m, 1H), 2,392,29 (m, 2H), 1,78-1,71 (m, 2H), 1,32 (s, 3H), 1,15 (s, 3H).
Стадия 4. (^)-2,2-Диметил-5-оксоциклогексан-1-карбоновая кислота
(^)-2,2-диметил-5-оксоциклогексан-1-карбальдегид (4,02 г, 23,46 ммоль) в простом эфире (200 мл) охлаждали до -30°C и обрабатывали с помощью 2М триоксида хрома - серной кислоты (1:1) (58,66 мл, 117,31 ммоль, реагент Джонса). Через 30 мин при -30°C смесь перемешивали в течение дополнительных 2 ч, позволяя при этом нагреться до RT. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и ощелачивали с помощью 1N NaOH (~ 650 мл) и промывали с помощью m-бутилметилового эфира (~2x500 мл). Водный слой подкисляли с помощью 2N H2SO4 (~ 160 мл) до кислого pH и продукт экстрагировали с помощью EtOAc (3x800 мл). Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (1:99-1:9), получали требуемый продукт в виде желтого масла (3,04 г, 76%): 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 2,73-2,57 (m, 2H), 2,51-2,40 (m, 2H), 2,38-2,31 (m, 1H), 1,95-1,86 (m, 1H), 1,72-1,63 (m, 1H), 1,22 (s, 3H), 1,17 (s, 3H).
Стадия 5. Метил (^)-2,2-диметил-5-оксоциклогексан-1-карбоксилат
Mel (1,22 мл, 19,65 ммоль) добавляли в суспензию (15)-2,2-диметил-5-оксоциклогексан-1-карбоновой кислоты (3,04 г, 17,86 ммоль) и K2CO3 (2,72 г, 19,65 ммоль) в ацетоне (45 мл) и нагревали до 60°C в течение 18 ч Смеси позволяли остыть до RT, фильтровали с использованием дополнительного DCM 2x20 мл и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (1:9-I), получали требуемый продукт в виде бесцветного масла (2,80 мг, 85%): 1И-ЯМР (250 МГц, Хлороформ-d) δ 3,69 (s, 3H), 2,73-2,54 (m, 2H), 2,53-2,24 (m, 3H), 1,95-1,80 (m, 1H), 1,74-1,59 (m, 1H), 1,16 (s, 3H), 1,11 (s, 3H).
Стадия 6. Метил (^)-6,6-диметил-3-(трифторметансульфонилокси)циклогекс-3-ен-1-карбоксилат
В холодный [0°C] раствор метил (^)-2,2-диметил-5-оксоциклогексан-1-карбоксилата (1,7 г, 9,27 ммоль) в 1,2-дихлорэтан (50 мл) добавляли 2,6-ди-трет-бутилпиридин (2,28 мл, 10,15 ммоль) с последующим медленным добавлением раствора Tf2O (1,65 мл, 9,79 ммоль). Реакционной смеси позволяли нагреться до RT в течение ночи. Растворитель выпаривали и остаток разделяли между водой (50 мл) и тбутилметиловым эфиром - EtOAc (120 мл, -10:1). Органический слой отделяли, промывали водой (25 мл), нас. NaHCO3 (25 мл), солевым раствором (25 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток абсорбировал на силикагель и очищали колоночной хроматографией на силикагеле, проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (0-1:4), с получением требуемого продукта в виде желтого масла (2,1 г, 72%): Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 5,71 (t, J= 3,9 Гц, 1H), 2,73-2,62 (m, 1H), 2,60-2,53 (m, 1H), 2,50-2,39 (m, 1H), 2,12-2,04 (m, 2H), 1,04 (s, 3H), 1,01 (s, 3H).
Стадия 7. Метил (15)-6,6-диметил-3 -(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-ен-1 -карбоксилат
Суспензию метил (15)-6,6-диметил-3 -(трифторметансульфонилокси)циклогекс-3-ен-1-карбоксилата (2,10 г, 6,64 ммоль), KOAc(4,89 г, 49,80 ммоль) и 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би-1,3,2-диоксаборолана (2,02 г, 7,97 ммоль) в 1,4-диоксане (120 мл) дегазировали в течение 10 мин путем барботирования азотом
- 175 030481
при RT. Pd(dppf).Cl2 (0,04 г, 0,05 ммоль) добавляли в реакционную смесь и перемешивали при 90°C в течение 3 ч, затем оставляли перемешиваться, охлаждая до RT. Реакционную смесь разбавляли с помощью EtOAc (130 мл) и промывали водой (130 мл). Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc (130 мл), объединенный органические слои промывали солевым раствором (50 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью EtOAc: гептанов (1:99-3:7), получали требуемый продукт в виде белого твердого вещества (1,62 г, 83%): ’H-ЯМР (250 МГц, Хлороформ-d) δ 6,59-6,39 (m, 1H), 3,64 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 2,07-1,90 (m, 2H), 1,25 (s, 12H), 0,96 (d, J= 4,2 Гц, 6H).
Стадия 8. Метил (^)-3-(4-{[(2-{[(трет-бутокси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)амино]метил}1-(оксан-2-ил)-1И-пиразол-3-ил)-6,6-диметилциклогекс-3-ен-1 -карбоксилат
Суспензию метил (1 S)-6,6-диметил-3-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-3-ен-1-карбоксилата (1,62 г, 5,51 ммоль), трет-бутил №[2-({[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил}(метил) амино)этил]-№метилкарбамата(2,63 г, 5,51 ммоль), K2CO3 (2,30 г, 16,63 ммоль) и Pd(dppf)Cl2.DCM (0,45 г, 0,55 ммоль) в 1,4-диоксане (100 мл) и воде (10 мл) перемешивали в потоке N2 в течение 10 мин при RT. Суспензию затем нагревали до 90°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере N2. Реакционную смесь оставляли для охлаждения до RT перед выпариванием досуха. МеОН (2x20 мл) добавляли к остатку и выпаривали досуха in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью ТНБ: гептанов (1:99-12:88), получали требуемый продукт в виде рыжеватого масла (1,89 г, 57%): MS (ESI+) для C28H46N4O5 мacca/заряд 519,10 (М+И)+; чистота согласно HPLC 86% (вр. удержив., 1,14 мин); ’H-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d, δ 7,56-7,38 (m, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,34-5,23 (m, 1H), 4,05 (d, J= 10,0 Гц, 1H), 3,733,59 (m, 4H), 3,45-3,22 (m, 4H), 2,82 (s, 3H), 2,77-2,63 (m, 2H), 2,57-2,39 (m, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,16-1,95 (m, 5H), 1,73-1,56 (m, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,03 (m, 6H).
Стадия 9. Метил (^)-5-(4-{[(2-{[(трет-бутокси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)амино]метил}1-(оксан-2-ил)-1И-пиразол-3-ил)-2,2-диметилциклогексан-1-карбоксилат
10% Pd-C (189 мг) добавляли в раствор метил (^)-3-(4-{[(2-{[(трет-бутокси)карбонил](метил)амино } этил)(метил)амино] метил }-1-(оксан-2-ил)-1 H-пиразол-3 -ил)-6,6-диметилциклогекс-3-ен-1 -карбоксилата (1,89 мг, 3,13 ммоль) в EtOH (30 мл) и перемешивали в атмосфере водорода в течение 3 ч Добавляли дополнительные 189 мг 10% Pd-C и реакцию продолжали в течение ночи. После перемешивания в течение ночи добавляли дополнительные 189 мг 10% Pd-C и реакцию продолжали в течение 3 ч Смесь затем фильтровали и повторно обрабатывали с помощью 10% Pd-C (190 мг) и водорода в течение 4 ч Реакционную смесь фильтровали и оставляли на два выходных дня. Реакционную смесь затем обрабатывали с помощью 10% Pd-C (0,5 г) и водорода в течение дополнительных 48 ч перед фильтрованием через целит и выпариванием досуха. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью ТНР:гептанов (1:9-I), получали требуемый продукт в виде бесцветного масла (1,11 мг, 68%): MS (ESI+) для C28H48N4O5 масса/заряд 521,30 (М+И)+; чистота согласно HPLC 95% (вр. удержив., 1,07 мин); ’H-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,41 (s, 1H), 5,28 (dt, J= 9,3, 4,2 Гц, 1H), 4,05 (d, J= 10,1 Гц, 1H), 3,71-3,64 (m, 1H), 3,64 (s, 3H), 3,31 (d, J= 31,3 Гц, 4H), 2,83 (s, 3H), 2,66 (ddt, J= 12,5, 7,4, 3,7 Гц, 1H), 2,46 (s, 2H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,20 (s, 3H), 2,13-1,95 (m, 4H), 1,92-1,76 (m, 3H), 1,75-1,49 (m, 5H), 1,44 (s, 9H), 1,03 (d, J= 7,0 Гц, 6H).
Стадия 10. трет-Бутил ^{2-[({3-[(35)-4,4-диметил-3-[(3-метилбутил)карбамоил]циклогексил]-1(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат
- 176 030481
В раствор 2М МезАJ в толуоле (230 мкл, 0,46 ммоль) добавляли раствор 3-метилбутан-J-амина (53,5 мкл, 0,46 ммоль) в толуоле (J мл) в запаянной пробирке. Через 5 мин добавляли раствор метил (JS)5-(4-{[(2-{ [(трет-бутокси)карбонил](метил)амино } этил )(метил)амино] метил }4-(оксан-2-ил)- J Н-пиразол3-ил)-2,2-диметилциклогексан-J-карбоксилата (200 мг, 0,0,38 ммоль) в толуоле (3 мл). Реакционную смесь герметизировали и нагревали до JJ0°C в течение J8 ч Реакционную смесь оставляли для охлаждения до RT и добавляли МеОН (25 мл). Смесь перемешивали при RT, фильтровали через целит (~5 г) и подушку промывали с помощью МеОН (J0 мл). Фильтраты концентрировали. Неочищенный продукт абсорбировали на силикагеле (2 мл). При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж J0 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью ТНР: гептаны (J:9-I), получали требуемый продукт в виде бесцветных кристаллов (J60 мг, 72%): MS (ESI+) для C32H57N5O4 масса/заряд 576,3 (М+Н)+; чистота согласно HPLC J00% (вр. удержив., J,J4 мин); JHЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,57-7,34 (m, JH), 5,84-5,39 (m, JH), 5,28 (s, JH), 4,05 (d, J= JJ,9 Гц, JH), 3,72-3,62 (m, JH), 3,4J-3,J4 (m, 4H), 2,82 (s, 2H), 2,77-2,36 (m, 2H), 2,J8 (s, 2H), 2,03 (d, J= J7,2 Гц, 5h), J,92-J,73 (m, 2H), J,66 (s, 3H), J,55 (s, 9H), J,52-J,42 (m, 9h), J,4J-J,30 (m, 3H), J,J3-J,06 (m, 2H), J,03 (s, 3H), 0,93-0,86 (m, 6H).
Стадия J J. (JS)-2,2-Диметил-5-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-JH-пиразол-3-ил]-N(3-метилбутил)циклогексан4-карбоксамид (соединение 263)
6N HCl (2 мл) добавляли в раствор трет-бутил N-{2-[({3-[(3R)-4,4-диметил-3-[(3-метилбутил)карбамоил]циклогексил]-J-(оксан-2-ил)-JH-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-N-метилкарбамата (J60 мг, 0,28 ммоль) в J,4-диоксане (J мл) при 0°C и перемешивали в течение 5 мин Затем смесь продолжали перемешивать при RT в течение J8 ч перед выпариванием in vacuo. MeOH (2xJ0 мл) добавляли к остатку и снова выпаривали досуха. МеОН (5 мл) добавляли к остатку и данный раствор пропускали через картридж Isolute SCX 2 (2 г) с последующим пропусканием МеОН (2x5 мл). Продукт элюировали с помощью 7N NH3 в МеОН (J5 мл). Выпаривали досуха с получением 90 мг (83%, 8:J, смесь цис:транс) требуемого продукта в виде бесцветных кристаллов: MS (ESI+) в течение C22H4JN5O масса/заряд 392,2 (М+Н)+; чистота согласно HPLC J00% (время, удержив., 2,47 мин); Ή-ЯМР (500 МГц, Метанол44) δ 7,43 (s, JH), 3,42 (d, J= 4,5 Гц, 2H), 3,27-3,J8 (m, JH), 3,J8-3,08 (m, JH), 2,85-2,75 (m, JH), 2,7J (t, J= 6,5 Гц, 2H), 2,52 (t, J= 6,5 Гц, 2H), 2,44-2,35 (m, 3H), 2,24-2,J3 (m, 4H), 2,07 (q, J= J2,8 Гц, JH), J,90-J,78 (m, JH), J,75-J,58 (m, 3H), J,58-J,5J (m, JH), J,49-J,3J (m, 3H), J,JJ (d, J= 6,8 Гц, 3H), J,00 (d, J= J8,6 Гц, 3H), 0,93 (s, 3H), 0,92 (s, 3H).
Соединение 27 J. (J S,5R)-N-(3-Метоксипропил)-2,2-диметил-5-[4-({ метил [2-(метиламино)этил] амино } метил)4 Н-пиразол-3 -ил]циклогексан4-карбоксамид
Стадия J. трет-Бутил N-[2-[({3-[(3S)-3-[(3-метоксипропил)карбамоил]-4,4-диметилциклогексил]-J(оксан-2-ил)-JH-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-N-метилкарбамат
В раствор 2М Me3Al в толуоле (230 мкл, 0,46 ммоль) добавляли раствор 3-метоксипропиламина
- J77 030481
(47,0 мкл, 0,46 ммоль) в толуоле (1 мл) в запаянной пробирке. Через 5 мин добавляли раствор метил (1S)5-(4-{[(2-{ [(трет-бутокси)карбонил](метил)амино } этил)(метил)амино] метил }-1-(оксан-2-ил)-1 H-пиразол3-ил)-2,2-диметилциклогексан-1-карбоксилата (200 мг, 0,38 ммоль) в толуоле (3 мл). Реакционную смесь герметизировали и нагревали до 110°С в течение 18 ч Реакционную смесь оставляли для охлаждения до RT и добавляли МеОН (25 мл). Смесь перемешивали при RT и фильтровали через целит (~5 г), и подушку промывали с помощью МеОН (10 мл). Фильтраты концентрировали. Неочищенный продукт абсорбировали на силикагеле (2 мл). При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 25 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с помощью ТНР : гептанов (1:9-1), получали требуемый продукт в виде бесцветных кристаллов (130 мг, 58%): MS (ESI+) для C31H55N5O5 масса/заряд 578,35 (М+И)+; чистота согласно HPLC 100% (вр. удержив., 1,11 мин); 1И-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,67-7,30 (m, 1H), 5,37-5,18 (m, 1H), 4,04 (d,J= 11,0 Гц, 1H), 3,67 (t,J= 11,4 Гц, 1H), 3,45 (t, J= 5,5 Гц, 2H), 3,39-3,20 (m, 8H), 3,02-2,77 (m, 3H), 2,70 (s, 1H), 2,46 (s, 2H), 2,19 (s, 2H), 2,101,96 (m, 5H), 1,85 (s, 1H), 1,80-1,73 (m, 3H), 1,72-1,62 (m, 3H), 1,57 (s, 6H), 1,45 (s, 9H), 1,09 (s, 3H), 1,061,01 (m, 3H).
Стадия 2. (1S,5R)-N-[3-метоксипропил)-2,2-диметил-5-[4-({метил[2-(метиламино)этил]амино}метил)-1И-пиразол-3-ил]циклогексан-1-карбоксамид (соединение 271)
6N HCl (2 мл) добавляли в раствор трет-бутил №{2-[({3-[^)-3-[(3-метоксипропил)карбамоил]-4,4диметилциклогексил]-1 -(оксан-2-ил)- Ш-пиразол-4-ил } метил)(метил)амино]этил J-N-метилкарбамата (130 мг, 0,23 ммоль) в 1,4-диоксане (1 мл) при 0°С и перемешивали в течение 5 мин Затем смесь продолжали перемешивать при RT в течение 18 ч перед выпариванием in vacuo. MeOH (2x10 мл) добавляли к остатку и снова выпаривали досуха. МеОН (5 мл) добавляли к остатку и данный раствор пропускали через картридж Isolute SCX 2 (2 г) с последующим пропусканием МеОН (2x5 мл). Продукт элюировали с помощью 7N NH3 в МеОН (15 мл). Выпаривали досуха с получением 69 мг (78%) требуемого продукта в виде бесцветных кристаллов. Диастереоизмоеры отделяли с помощью prep-HPLC при условиях высокого pH с получением 3 мг требуемого продукта: MS (ESI+) для C21H39N5O2 масса/заряд 394.5 (М+И)+.; чистота согласно HPLC 91% (время, удержив. 1,00 мин); ’H-ЯМР (500 МГц, МетанолХ) δ 7,43 (s, 1H), 3,69 (s, 1H), 3,51-3,39 (m, 4H), 3,32 (d, J= 1,0 Гц, 3H), 3,31-3,24 (m, 1H), 3,22-3,12 (m, 1H), 2,92 (t, J= 5,8 Гц, 2H), 2,63-2,50 (m, 5H), 2,20 (d, J= 10,8 Гц, 4H), 2,15-1,99 (m, 2H), 1,87-1,65 (m, 5H), 1,38-1,27 (m, 1H), 1,13 (s, 3H), 0,99 (s, 3H) (плюс 51 мг (1S,5S)-H-(3-метоксипропил)-2,2-диметил-5-[4-({метил[2-(метиламино) этил] амино } метил)- Ш-пиразол-3 -ил] циклогексан-1 -карбоксамида).
Соединение 273. ({3-[(3R)-4,4-диметил-3-(оксан-4-илметокси)циклогексил]-1H-пиразол-4-ил}ме-
Стадия 1. (^^)-5,5-диметил-7-оксабицикло[4.1.0]гептан-2-он
(^^)-1,2-дифенилэтан-1,2-диамин (3.42 г, 16.11 ммоль) и трифторуксусную кислоту (1,2 мл, 16,11 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (150 мл). Раствор перемешивали в течение 30 мин перед добавлением 4,4-диметилциклогекс-2-ен-1-она (10 г, 80,53 ммоль) и пероксида водорода (10,58 мл, 120,79 ммоль 35% в воде). Реакционную смесь перемешивали и нагревали до 50°C в течение 72 ч, после этого периода времени реакцию гасили с помощью NH4Cl (насыщенный, 100 мл). Раствор экстрагировали с помощью DCM (4x100 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха с получением 12,5 г требуемого материала (содержащего -10% 1,4-диоксана, вес/вес). ’H-ЯМР (250 МГц, Хлороформ-d) δ 3,23 (d, J= 4,0 Гц, 1H), 3,17 (dd, J= 4,0, 1,2 Гц, 1H), 2,41 (ddd, J= 18,8, 6,5, 3,2 Гц, 1H), 2,19 (ddd, J= 18,7, 11,5, 6,9 Гц, 1H), 1,90 (td, J= 12,5, 11,5, 6,5 Гц, 1H), 1,35 (dtd, J= 9,9, 3,1, 1,2 Гц, 1H), 1,22 (s, 3H), 1,06 (s, 3H). Rf = 0,30 (3% 7N NH3 в MeOH в DCM).
Стадия 2. (3R)-3-гидрокси-4,4-диметилциклогексан-1-он
- 178 030481
При RT в атмосфере азота литий (1,63 г, 235 ммоль) добавляли в раствор нафталена (40 г, 314 ммоль) в сухой THF (600 мл). Раствор быстро приобретал темно-зеленую окраску и реакционную смесь перемешивали при RT до полного растворения лития (5 ч). Раствор охлаждали до -78°C и добавляли раствор (18,68)-5,5-диметил-7-оксабицикло[4.1.0]гептан-2-она (11 г, 78,47 ммоль) в сухом THF (300 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч, затем гасили водой (30 мл) и и оставляли нагреваться до RT. Дополнительно добавляли 300 мл и раствор экстрагировали с помощью Et20 (2х500 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали на Biotage (SNAP 340g, элюент гептан/EtOAc, от 90/10/1 до 10/90/1) с получением 5,81 г титульного соединения (52%) в виде оранжевого масла. Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,77-3,62 (m, 1H), 2,64 (ddd, J= 14,9, 4,3, 1,0 Гц, 1H), 2,46-2,36 (m, 1H), 2,36-2,25 (m, 2H), 1,94-1,82 (m, 1H), 1,83-1,76 (m, 1H), 1,54-1,44 (m, 1H), 1,13 (s, 3H),1,07 (s, 3H). Rf = 0,30 (EtOAc/гептан/NEtз (6/4/0,1).
Стадия 3. (3R)-3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогексан-1-он
(3R)-3-гидрокси-4,4-диметилциклогексан-1-он (5,81 г, 40,86 ммоль), трет-бутил(хлор)диметилсилан (9,24 г, 61,29 ммоль) и Ш-имидазол (6,95 г, 102,15 ммоль) растворяли в DMF (50 мл). Реакционную смесь перемешивали при RT в течение ночи; при анализе с помощью TLC исходный материал не выявили. Реакцию гасили насыщенным водным раствором аммония хлорида (30 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3х30 мл); объединенные органические слои промывали водой (30 мл) и сушили над Na2SO4, выпаривали и выпаривали совместно с толуолом (4х50 мл) досуха с получением 8,4 г титульного соединения, выделенного в виде желтого масла (80%). Ш-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 3,64 (dd, J= 7,4, 4,1 Гц, 1H), 2,63-2,49 (m, 1H), 2,39-2,25 (m, 3H), 1,95-1,78 (m, 1H), 1,43 (dt, J= 13,8, 7,1 Гц, 1H), 1,07 (s, 3H), 1,01 (s, 3H), 0,88 (s, 9H), 0,04 (d, J= 6,0 Гц, 6H). Rf = 0,53 (гептан/EtOAc 85/15).
Стадия 4. (3R)-3-[(трет-Бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил трифторметансульфонат
(3R)-3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогексан-1-он (3 г, 11,7 ммоль) растворяли в сухом THF (250 мл). Раствор охлаждали до -78°C и медленно добавляли 1М литий 1,1,1,3,3,3гексаметилдисилазан-2-ид (23,4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 45 мин и медленно добавляли раствор №(5-хлорпиридин-2-ил)-1,1,1-трифтор-М-[(трифторметил)сульфонил]метансульфонамид (8,59 г, 21,88 ммоль) в сухом THF (60 мл). Реакционную смесь оставляли нагреться до RT и перемешивали в течение 3 ч Реакцию гасили с помощью NH4Cl (насыщенный, 100 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3х100 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха, и остаток остаток очищали в Biotage (SNAP HP 100 g, элюент: гептан/EtOAc, от 100/0 до 90/10) с получением 3,1 г титульного соединения в виде смеси изомеров 1:1 (61%). Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 5,74-5,52 (m, 1H), 3,57 (t, J= 5,3 Гц, 1H), 2,53 (dd, J= 17,3, 2,2 Гц, 1H), 2,32-2,21 (m, 1H), 2,13 (ddt, J= 17,6, 4,4, 2,5 Гц, 1H), 1,88 (ddt, J= 17,5, 4,4, 2,4 Гц, 1H), 0,96-0,84 (m, 15H), 0,06 (d, J= 7,4 Гц, 6H).
Стадия 5. трет-Бутил( {[(1 R)-6,6-диметил-3-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-2-ен-1ил] окси }) диметилсилан
Суспензию (3R)-3 -[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1 -ен-1-ил трифторметансульфоната (90%, 3,11 г, 7,2 ммоль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би-1,3,2-диоксаборолана (2,74 г, 10,81 ммоль) и калия ацетата (3,15 мл, 50,43 ммоль) в 1,4-диоксане (100 мл) дегазировали с помощью барботирования N2 течение 10 мин, перемешивая в то же время при RT. бис[3-(Дифенилфосфанил)циклопента-2,4-диен-1-ил]железо; дихлорметан; дихлорпалладий (0,59 г, 0,72 ммоль) добавляли в данную суспензию и перемешивали при 90°C в течение 3,5 ч перед охлаждением до RT в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью EtOAc (50 мл) и воды (50 мл). Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали с помощью EtOAc (3х50 мл). Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и выпаривали in vacuo. При очистке с помощью колоночной хроматографии на силикагеле в системе Biotage Isolera, используя картридж 100 г KP-Sil SNAP и проводя элюирование с по- 179 030481
мощью EtOAc: гептанов (0-5:95), получали требуемый продукт в виде оранжевого масла (2,02 мг, 76%): Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 6,50-6,12 (m, 1H), 3,90-3,41 (m, 1H), 2,34-2,18 (m, 1H), 2,18-1,96 (m, 2H), 1,96-1,82 (m, 1H), 1,25 (d, J= 3,2 Гц, 12H), 0,95-0,80 (m, 15H), 0,11-0,01 (m, 6H).
Стадия 6. трет-Бутил N-{2-[({3-[(3R)-3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1ен-1 -ил] -1 -(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат
трет-Бутил({[(^)-6,6-диметил-3-(тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)циклогекс-2-ен-1 -ил] окси}) диметилсилан (2 г, 5,46 ммоль), трет-бутил №[2-({[3-йод-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил]метил}(метил) амино)этил]-№метилкарбамат (2,61 г, 5,46 ммоль) и калия карбонат (2,26 г, 16,37 ммоль) суспендировали в 1,4-диоксане/воде (240 мл, 7/1). Раствор дегазировали с помощью азота в течение 10 мин и добавляли Pd(dppf)Cl2 (0,45 г, 0,55 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 100°C. После ночи растворители выпаривали. Остаток очищали в Biotage (SNAP HP 100g, элюент гептан/EtOAc (+1% NEt3), от 95/5 до 60/40) с получением 2,5 г титульного соединения в виде желтого масла (62%; с чистотой 80%). Ή-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,61-7,36 (m, 1H), 6,14-5,72 (m, 1H), 5,43-5,23 (m, 1H), 4,08-3,92 (m, 1H), 3,76-3,57 (m, 1H), 3,51-3,19 (m, 5H), 2,99-2,62 (m, 6H), 2,60-2,30 (m, 3H), 2,28-2,14 (m, 3H), 2,13-1,94 (m, 4H), 1,761,51 (m, 6H), 1,51-1,37 (m, 9H), 1,00-0,79 (m, 18H), 0,13- -0,03 (m, 6H). Rf = 0,29 (EtOAc/гептан 7/3 +l% NEt3).
Стадия 7. трет-Бутил N-{2-[({3-[(3R)-3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогексил]1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил }метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат
Раствор трет-бутил ЛА-{2-[({3-[(3 Ш)-3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогекс-1ен-1-ил]-1-(оксан-2-ил)-Ш-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамата (80%, 1 г, 1,35 ммоль) в EtOH (10 мл) осторожно добавляли в продуваемую [азотом] суспензию катализатора никель Ренея (2,5 мл) в EtOH (20 мл). Полученный в результате раствор продували азотом (3x), водородом (2x) и оставляли в атмосфере водорода при RT. После ночи проведение анализа аликвоты показало, тем не менее, присутствие исходного материала. Дополнительно добавляли 7,5 мл катализатора и и реакционную смесь оставили перемешиваться в атмосфере водорода в течение 6 ч, после этого проведение анализа с помощью LCMS показало полное превращение в требуемый продукт. Раствор фильтровали через целит и подушку промывали с помощью EtOAc (150 мл). Фильтрат выпаривали при пониженном давлении и совместно выпаривали с толуолом с получением 870 мг титульного соединения в виде светложелтого масла (92%). N-ЯМР (250 МГц, Хлороформ-d) δ 7,45 (d, J= 11,3 Гц, 1H), 5,41- 5,17 (m, 1H), 4,06 (d, J= 8,3 Гц, 1H), 3,67 (t, J= 11,2 Гц, 1H), 3,34 (d, J= 8,8 Гц, 6H), 2,85 (d, J= 12,0 Гц, 5H), 2,68 (s, 1H), 2,47 (s, 2H), 2,20 (d, J= 9,2 Гц, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,93-1,36 (m, 13H), 1,25 (d, J= 6,2 Гц, 2H), 1,06 - 0,79 (m, 15H), 0,02 (d, J= 7,0 Гц, 6H).
Стадия 8. трет-Бутил N-{2-[({3-[(3R)-3-гидрокси-4,4-диметилциклогексил]-1-(оксан-2-ил)-1Н-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат
Трет-бутил N-{2-[({3- [(3R)-3 -[(трет-бутилдиметилсилил)окси]-4,4-диметилциклогексил]-1 -(оксан-2ил)-Ш-пиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат (85%, 870 мг, 1,25 ммоль) растворяли в 1 М TBAF в THF (12 мл). Реакционную смесь нагревали до 60°C и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь гасили водой (10 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3x20 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Остаток очищали в Biotage (SNAP 50 г, элюент DCM/MeOH, от 100/0 до 90/10) с получением 450 мг титульного соединения в виде светложелтого масла (60%). Ή-ЯМР (250 МГц, Хлороформ-d) δ 7,53-7,31 (m, 1H), 5,30-5,13 (m, 1H), 3,98 (d, J= 10,3 Гц, 1H), 3,60 (td, J= 11,1, 2,8 Гц, 1H), 3,31 (dd, J= 12,4, 6,8 Гц, 9H), 2,89 (dd, J= 10,3, 6,5 Гц, 1H), 2,78 (d, J= 13,1 Гц, 9H), 2,50-2,29 (m, 2H), 2,12 (s, 3H), 1,91 (d, J= 20,2 Гц, 4H), 1,77-1,47 (m, 8H), 1,37 (d, J= 7,5
- 180 030481
Гц, 26Н), 1,24-1,12 (m, 2Н), 1,04-0,83 (m, 8Н). Rf = 0,14 (DCM/MeOH 95/5).
Стадия 9. трет-Бутил N-{2-[({3-[3R)-4,4-диметил-3-(оксан-4-илметокси)циклогексил]-1-(оксан-2ил)-1Н-пиразол-4-ил }метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат
Калия гексаметилдисилазид (3,44 мл, 0,91 М в TIIF) и 18-краун-6 (17 мг, 0,06 ммоль) добавляли в раствор трет-бутил N- {2-[({3-[(3R)-3-гидрокси-4,4-диметилциклогексил]-1 -(оксан-2-ил)- 1Н-пиразол-4ил}метил)(метил)амино]этил}-1Н-метилкарбамата (300 мг, 0,63 ммоль) в сухом толуоле (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при RT в течение 1 ч, затем добавляли 4-(бромметил)тетрагидро-2Н-пиран (250 мкл, 1,88 ммоль) и раствор нагревали до 70°C, проводяи при этом контроль с помощью LCMS. Дополнительные аликвоты калия гексаметидисилазида (1,5 мл, 0,91 М в ТОР) и 4-(бромметил)тетрагидро2Н-пирана (100 мкл, 0,75 ммоль) добавляли через 16 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч Реакцию останавливали через 1 неделю. Раствор промывали водой (25 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3x30 мл). Объединенные органические экстракты сушили над Na2SO4 и выпаривали досуха. Неочищенный остаток очищали с помощью prep-I IPLC при низком pH в трех введениях; богатые продуктом фракции объединяли (выпаривали совместно с толулом) с получением 7 мг алкилированного продукта (2 %). Также извлекали 60 мг исходного материала. ХН-ЯМР (500 МГц, Хлороформ-d) δ 7,89-7,43 (m, 1Н), 5,40-5,20 (m, 1Н), 4,15-3,86 (m, 3Н), 3,81-3,62 (m, 2Н), 3,61-3,31 (m, 7Н), 3,16-3,05 (m, 1Н), 2,97-2,71 (m, 5Н), 2,68-2,50 (m, 2Н), 2,48-2,22 (m, 3Н), 2,13-1,92 (m, 4Н), 1,89-1,18 (m, 21Н), 1,02 (s, 3Н), 0,95 (s, 3Н). LC-MS: 1,24 мин (2,5 мин LC-MS способ), масса/заряд= 577,35.
Стадия 10. ({3-[(3R)-4,4-Диметил-3-(оксан-4-илметокси)циклогексил]-1 Н-пиразол-4-ил}метил)(метил)[2-(метиламино)этил]амин (соединение 273)
Трет-бутил N- {2- [({3 - [(3 R)-4, 4-диметил-3 -(оксан-4-илметокси)циклогексил]-1 -(оксан-2-ил)-1 Нпиразол-4-ил}метил)(метил)амино]этил}-№метилкарбамат (7 мг, 0,01 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (2 мл) и добавляли НО (6N, 1 мл). После 2 ч перемешивания при RT растворитель удаляли при пониженном давлении с получением 4 мг титульного соединения (84%). ХН-ЯМР (500 МГц, Метанол^4 δ 8,44 (s, 1Н), 4,68-4,43 (m, 2Н), 3,92 (d, J= 11,5 Гц, 2Н), 3,84-3,57 (m, 4Н), 3,51 (dd, J= 8,8, 6,2 Гц, 1Н), 3,46-3,37 (m, 2Н), 3,28-3,16 (m, 2Н), 2,93 (d, J= 4,3 Гц, 3Н), 2,80 (s, 3Н), 2,24-2,13 (m, 1Н), 1,87-1,48 (m, 8Н), 1,411,25 (m, 2Н), 1,06 (d, J= 2,6 Гц, 3Н), 1,00 (s, 3Н). LC-MS: 2,47 мин (7 мин способ), масса/заряд = 393,2.
Соединение 274. ^-((4-(4-Фторфенил)изоксазол-5-ил)метил)-^-метилэтан-1,2-диамин трифторацетат
Стадия 1. 3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-илиден](трет-бутокси)карбогидразид
Вое
В 50-мл круглодонную колбу помещали гексан (10 мл), (трет-бутокси)карбоксиангидрид (2,64 г, 19,98 ммоль, 1,00 эквив.) и 3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-он (3,65 г, 20,03 ммоль, 1,00 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 15 ч при 75°C, а затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Твердые вещества собирали фильтрацией с получением 4 г (67%) 3,3диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-илиден](отрет-бутокси)карбогидразидав виде белого твердого вещества. 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-cto): δ 9,52 (s, 1Н), 3,43 (s, 2Н), 2,48-2,09 (m, 4Н), 1,86-1,46 (m, 6Н), 1,42 (s, 9Н), 1,06 (s, 6Н) ppm.
Стадия 2. 3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил](трет-бутокси)карбогидразид
- 181 030481
В 250-мл круглодонную колбу помещалиЗ,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-илиден](трет-бутокси)карбоксигидразид (3,5 г, 11,81 ммоль, 1,00 эквив.), этанол (60 мл) и 10% палладий/на угле (0,35 г). Водород (3 атм.) затем использовали по отношению к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре. Твердые вещества фильтровали и раствор концентрировали под вакуумом. В результате получали 3,5 г (99%) 3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8ил](трет-бутокси)карбоксигидразидав виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, DMSO-ttf): δ 8,15 (s, 1H), 4,12 (s, 1H), 3,36 (s, 2H), 2,79-2,56 (m, 1H), 1,80-1,60 (m, 2H), 1,46-1,34 (m, 3H), 1,34-1,20 (m, 14H), 1,02 (s, 6H) ppm.
Стадия 3. Гидрохлоридная соль [3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]гидразина
В 100-мл круглодонную колбу помещали 3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил](трет-бутокси) карбогидразид (3,5 г, 11,73 ммоль, 1,00 эквив.) и раствор насыщенного газа хлороводорода в метаноле (35 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре, а затем концентрировали под вакуумом. В результате получали 2,7 г (98%) гидрохлоридной соли [3,3диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]гидразина в виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 3,43 (s, 2H), 3,18-3,00 (m, 1H), 2,10-1,75 (m, 4H), 1,75-1,25 (m, 6H), 1,00 (s, 6H) ppm.
Стадия4. 1-[3,3-Диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-карбальдегид
В 100-мл круглодонную колбу помещали [3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]гидразина гидрохлорид (1,0 г, 4,26 ммоль, 1,00 эквив.), [(1Е)-4,4-диметокси-3-оксобут-1-ен-1-ил] диметиламин (740 мг, 4,27 ммоль, 1,00 эквив.) и метанол (25 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 15 ч при 70°С, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли с помощью THF (10 мл) и хлористоводородной кислоты (IN, 15 мл), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч THF удаляли под вакуумом и остаток экстрагировали с помощью этилацетата 3x30 мл, и органические слои объединяли и сушили над безводным натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали на колонке с силикагелем с помощью этилацетата/петролейного эфира (2:3). В результате получали 250 мг (22%) 1-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-карбальдегида в виде белого твердого вещества. Ή-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 9,85 (s, 1H), 7,54 (d, J= 2,1 Гц, 1H), 6,87 (d, J= 2,1 Гц, 1H), 5,05-4,90 (m, 1H), 3,51 (s, 2H), 2,45-2,25 (m, 2H), 2,05-1,90 (m, 2H), 1,90-1,75 (m, 2H), 1,65-1,50 (m, 4H), 1,10 (s, 6H) ppm.
Стадия 5. трет-Бутил N-(2-[[(1-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1H-пиразол-5-ил)метил] (метил)амино]этил)-№метилкарбамат
В 250-мл круглодонную колбу помещали 1-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол5-карбальдегид (524 мг, 2,00 ммоль, 1,00 эквив.), трет-бутил N-метил-N-[2-(метиламино)этил]карбамат (590 мг, 3,13 ммоль, 1,57 эквив.), С1СН2СН2С1 (50 мл). Затем порциями при 0°С добавляли NaBH(OAc)3 (3,39 г, 16,00 ммоль, 8,01 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 3 ч при 0°С. Реакцию затем гасили путем добавления 50 мл Na2CO3 (нас. вод.). Полученный в результате раствор экс- 182 030481
трагировали с помощью 3x50 мл этилацетата, и органические слои объединяли и сушили над безводный натрия сульфатом, и концентрировали под вакуумом. Остаток наносили на колонку С18 с силикагелем, проводя элюирование с помощью С13СХ/112G (4:1). В результате получали 650 мг (75%) трет-бутил N(2-[[(1-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-5-ил)метил](метил)амино]этил)-№ метилкарбамат в виде светло-желтого масла.
Стадия 6. ^-((4-(4-Фторфенил)изоксазол-5-ил)метил)-№метилэтан-1,2-диамин трифторуксусная кислота (соединение 274)
В 50-мл круглодонную колбу помещалитрет-бутил тУ-(2-[[(1-[3,3-диметил-1-оксаспиро[4.5]декан8-ил]-1Н-пиразол-5-ил)метил](метил)амино]этил)-ЛА-метилкарбамат (600 мг, 1,38 ммоль, 1,00 эквив.) и раствор насыщенного газа хлороводорода в метаноле (6 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре, а затем концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях ^^-№^-025): колонка, XBridge Shield RP18 GBD Со1ишп, 5 мкм, 19*150 мм; подвижная фаза, Water с 10 ммольми TFA и MeCN (5,0% MeCN до 21,0% в течение 6 мин, 21,0% в течение 7 мин); детектор, УФ 254/220 нм. В результате получали 550 мг (71%) соли ^-((4-(4-фторфенил)изоксазол-5-ил)метил)-^-метилэтан-1,2-диамин трифторуксусной кислоты в виде бесцветного масла. 1Н-ЯМР (300 МГц, CDC13): δ 7,60 (d, J= 1,8 Гц, 1Н), 6,53 (d,J= 1,8 Гц, 1Н), 4,57 (s, 2Н), 4,32-4,15 (m, 1Н), 3,61-3,41 (m, 2Н), 2,81 (s, 3Н), 2,70 (s, 3Н), 2,15-1,85 (m, 4Н), 1,77-1,45 (m, 6Н), 0,98 (s, 6Н) ppm. ^MS (способ A, ESI): RT = 4,73 мин, масса/заряд = 335 [М+Н]+.
Соединение 275. Метил [2-(метиламино)этил][(1-[спиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-5-ил)метил] амина трифторацетат
Стадия 1. Спиро [4.5] декан-8-илиден(трет-бутокси)карбогидразид
В 100-мл круглодонную колбу помещали спиро[4.5]декан-8-он (1,52 г, 9,98 ммоль, 1,00 эквив.), (трет-бутокси)карбогидразид (1,32 г, 9,99 ммоль, 1,00 эквив.), гексан (20 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при 75°С, затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток смешивали с 1x5 мл гексана и твердые вещества собирали фильтрацией с получением 2,13 г (80%) спиро[4.5]декан-8-илиден(трет-бутокси)карбогидразида в виде белого твердого вещества. 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSG-d6): δ 9,49 (s, 1Н), 2,29 (d, J= 6,3 Гц, 2Н), 2,18 (d, J= 6,3 Гц, 2Н), 1,67-1,32 (m, 21Н) ppm.
Стадия 2. Спиро [4.5] декан-8-илгидразина гидрохлорид
В раствор спиро[4.5]декан-8-илиден(трет-бутокси)карбогидразида (2 г, 7,51 ммоль, 1,00 эквив.) в тетрагидрофуране (10 мл) при -40°С в атмосфере сухого азота добавляли по каплям в течение примерно 20 мин раствор борана (1М в ГИБ; 8,3 мл, 1,10 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем обрабатывали хлористоводородной кислотой (6N, 5 мл), добавляя ее по каплям при перемешивании. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, а затем концентрировали под вакуумом. Остаток смешивали с 1x50 мл эфира и твердые вещества собирали фильтрацией с получением 2,5 г (неочищенного) спиро[4.5]декан-8илгидразина гидрохлорида в виде белого твердого вещества. 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSG-d6): δ2,94-2,80 (m, 1Н), 1,95-1,80 (m, 2Н), 1,45-1,45 (m, 6Н), 1,45-1,29 (m, 6Н), 1,29-1,15 (m, 2Н) ppm.
Стадия 3. 1-[Спиро[4.5]декан-8-ил]-1Н-пиразол-5-карбальдегид
- 183 030481
В 100-мл круглодонную колбу помещали спиро[4.5]декан-8-илгидразина гидрохлорид (1,64 г, 8,01 ммоль, 1,00 эквив.), [(1£)-4,4-диметокси-3-оксобут-1-ен-1-ил] диметиламин (2,08 г, 12,01 ммоль, 1,50 эквив.), метанол (40 мл). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при 75°C, затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли с помощью 10 мл хлористоводородной кислоты (6 N) и 30 мл THF, и полученный в результате раствор перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученную в результате смесь экстрагировали с помощью 3 x 50 мл этилацетата и объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:10) с получением 160 мг (9%) 1[спиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-карбальдегида в виде светло-желтого масла, 'H-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 9,86 (s, 1H), 7,56 (d, J= 1,8 Гц, 1H), 6,89 (d,J=1,8rtf, 1H), 5,05-4,90 (m, 1H), 2,16-1,95 (m, 2H), 1,95-1,80 (m, 2H), 1,75-1,35 (m, 12H) ppm.
Стадия 4. трет-Бутил ^метил-Н-(2-[метил[(1-[спиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-ил)метил]амино] этил)карбамат
В раствор 1-[спиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразоле-5-карбальдегида (210 мг, 0,90 ммоль, 1,00 эквив.) и трет-бутил ^метил-Ы-[2-(метиламино)этил]карбамата (340 мг, 1,81 ммоль, 2,00 эквив.) в DCE (20 мл) добавляли порциями NaBH(OAc)3 (1,54 г, 7,26 ммоль, 8,04 эквив.). Полученный в результате раствор перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, а затем гасили с помощью 20 мл натрия карбоната (нас. вод). Органический слой отбирали и водный слой экстрагировали с помощью 2x20 мл этилацетата, и органические слои объединяли. Объединенные органические слои сушили над безводным натрия сульфатом и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали флеш-хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента этилацетата/петролейного эфира (1:1) с получением 240 мг (66%) трет-бутил ^метил-Н-[2-[метил[(1-[спиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-ил)метил]амино] этил)карбамата в виде светло-желтого масла. 'H-ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,44 (s, 1H), 6,08 (s, 1H), 4,284,11 (m, 1H), 3,50 (s, 2H), 3,42-3,20 (m, 2H), 2,83 (s, 3H), 2,61-2,41 (m, 2H), 2,23 (s, 3H), 2,12-1,98 (m, 2H), 1,85-1,72 (m, 2H), 1,70-1,51 (m, 6H), 1,51-1,32 (m, 15H) ppm.
Стадия 5. Метил[2-(метиламино)этил][(1-[спиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-ил)метил]амин трифторацетат (соединение 275)
В 50-мл круглодонную колбу помещали трет-бутил ^метил-Ы-(2-[метил[(1-[спиро[4.5]декан-8-ил]Ш-пиразол-5-ил)метил]амино]этил)карбамат (210 мг, 0,52 ммоль, 1,00 эквив.), который затем растворяли в растворе насыщенного газа хлороводорода в 1,4-диоксане (10 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре и полученный в результате осадок собирали фильтрацией. Неочищенный продукт очищали с помощью Prep-HPLC при следующих условиях (Prep-HPLC-025): колонка, XBridge Shield RP18 OBD колонка, 5 мкм, 19x150 мм; подвижная фаза, Water с 10 ммольми TFA и MeCN (5,0% MeCN до 36,0% в течение 10 мин); детектор, УФ 254/220 нм. Получали 200 мг (72%) метил[2-(метиламино)этил][(1-[спиро[4.5]декан-8-ил]-Ш-пиразол-5-ил)метил]амина трифторацетата в виде белого полутвердого вещества. 'H-ЯМР (300 МГц, D2O): δ 7,58 (d, J= 2,1 Гц, 1H), 6,50 (d, J= 2,1 Гц, 1H), 4,54 (s, 2H), 4,22-4,16 (m, 1H), 3,61-3,36 (m, 8H), 2,88 (s, 3H), 2,67 (s, 3H), 1,98-1,75 (m, 2H), 1,74-1,57 (m, 2H), 1,57-1,20 (m, 12H). LCMS (способ A, ESI): RT = 1,09 мин, масса/заряд = 305,4 [М+1]+.
Биологические способы Биохимический анализ PRMT1
Общие материалы S-Аденозилметионин (SAM), S-аденозилгомоцистеин (SAH), бицин, Tween 20, диметилсульфоксид (DMSO), желатин кожи крупного рогатого скота (BSG) и раствор трис(2карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) с наивысшим уровнем возможной чистоты закупали у Sigma-Aldrich. 3H-SAM со специфичной активностью 80 Ки/ммоль закупали у American Radiolabeled Chemicals. 384-Луночные покрытые стрептавидином Flashplates закупали у PerkinElmer.
- 184 030481
Субстраты
Типичный пептид остатков 36-50 гистона Н4 человека синтезировали с N-концевым мотивом линкер-аффинная метка и С-концевым амидным кэппированием в 21st Century Biochemicals. Пептид очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) до чистоты более 95% и подтверждали жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS). Последовательность представляла собой BiotAhx-RLARRGGVKRISGLI-амид (SEQ ID NO:1).
Молекулярная биология
Клон изоформы 1 транскрипта полноразмерной человеческой PRMT1 (NM001536.5) амплифицировали из библиотеки кДНК HEK 293 с включением фланкирующей 5'-последовательности, кодирующей метку FLAG (MDYKDDDDK) (SEQ ID NO:2), гибридизованную непосредственно с Met 1 из PRMT1. Амплифицированный ген субклонировали в pFastBacI (Life Technologies), модифицированную с тем, чтобы кодировать N-концевую метку GST и последовательность расщепления TEV
(MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLP YYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSK DFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPM CLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDENLYF QGGNS)(SEQ ID N0:3)
гибридизованную с Asp метки Flag из PRMT1.
Экспрессия белков [00457]
Рекомбинантные бакуловирусы получали в соответствии с инструкциями к набору Bac-to-Bac kit (Life Technologies). Сверхэкспрессии белков достигали путем инфицирования экспоненциально растущей клеточной культуры насекомых High Five при 1,5x10 клеток/мл с разведением вируса 1:100. Инфицирование осуществляли при 27°C в течение 48 ч, собирали центрифугированием и хранили при -80°C для очистки.
Очистка белков
Экспрессированный полноразмерный GST-меченный белок PRMT1 человека очищали от клеточной массы аффинной хроматографией с глутатионсефарозой после уравновешивания смолы 50 мМ фосфатным буфером, 200 мМ NaCl, 5% глицерином, Р-меркаптоэтанолом, pH 7,8 (буфер А). GST-меченный PRMT1 элюировали с помощью 50 мМ Tris, 2 мМ глутатиона, pH 7,8, подвергали диализу в буфере А и концентрировали до 1 мг/мл. Чистота извлеченного белка составляла 73%. Ссылки: Wasilko, D.J. and S.E. Lee: "TIPS: titerless infected-cells preservation and scale-up" Bioprocess J., 5 (2006), pp. 29-32.
Предсказанные трансляции GST-меченный PRMT1 (SEQ ID N0:4)
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKL TQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEML KMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKS SKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDENLYFQGGNSDYKDDDDKMAAAEAANCIMENFVATLANGM SLQPPLEEVSCGQAESSEKPNAEDMTSKDYYFDSYAHFGIHEEMLKDEVRTLTYRNSMFHNRHLF KDKVVL DVGS GT GIL CMFAAKAGARKVIGIECSSIS D YAVKIVKANKLDHVVT11KGKVE EVEL P VEKVDIIISEWMGYCLFYESMLNTVLYARDKWLAPDGLIFPDRATLYVTAIEDRQYKDYKIHWWE NVYGFDMS CIKDVAIKE PLVDVVDPKQLVTNACLIKEVDIYTVKVEDLT FT S PFCLQVKRNDYVH ALVAYFNIEFTRCHKRTGFSTSPESPYTHWKQTVFYMEDYLTVKTGEEIFGTIGMRPNAKNNRDL DFTIDLDFKGQLCELSCSTDYRMR
Общая процедура анализов фермента PRMT1 на пептидных субстратах
Все анализы выполняли в буфере, содержащем 20 мМ бицин (pH 7,6), 1 мМ ТСЕР, 0,005% BSG и 0,002% Tween 20, приготовленном в день применения. Соединения в 100% DMSO (1 мкл) вносили в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием Platemate Plus, оснащенного 384-канальной головкой (Thermo Scientific). Добавляли DMSO (1 мкл) в колонки 11, 12, 23, 24, ряды А-Н для контроля максимального сигнала, и 1 мкл SAH, известный продукт и ингибитор PRMT5/PRMT1 добавляли в колонки 11, 12, 23, 24, ряды I-P для контроля минимального сигнала. Смесь (40 мкл), содержащую фермент PRMT1, добавляли с помощью Multidrop Combi (Thermo-Fisher). Соединения инкубировали с PRMT1 в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли смесь (10 мкл), содержащую 3H-SAM и пептид, для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Конечные концентрации компонентов были следующими: концентрация PRMT1 составляла 0,5 нМ, 3H-SAM составляла 200 нМ, SAM без радиоактивной метки составляла 1,5 мкМ, пептида составляла 20 нМ, SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, а концентрация DMSO составляла 2%. Реакции останавливали путем добавления SAM без радиоактивной метки (10 мкл) до конечной концентрации 300 мкМ, при этом разбавляли 3H-SAM до уровня, при котором его включение в пептидный субстрат больше не обнаруживалось. Затем 50 мкл реакционной смеси в 384-луночном полипропиленовом планшете переносили в 384-луночный Flashplate и обеспечивали связывание биотинилированных пептидов с покрытой стрептавидином поверхностью по меньшей мере в течение 1 часа перед однократным промы- 185 030481
ванием с помощью 0,1% Tween 20 в устройстве для промывания планшетов Biotek ELx405. Затем планшеты считывали на устройстве для считывания планшетов PerkinElmer TopCount для измерения количества замеченного пептида, связанного с поверхностью Flashplate, измеряемого как дезинтеграции в минуту (dpm) или, в качестве альтернативы, называемого как число импульсов в минуту (cpm).
Вычисление % ингибирования
ο/οΗΗΓ.= 100-(^-Ζ^)χ100 \dpmMaKC - dpmMlw/
где dpm = дезинтеграции в минуту, cmpd = сигнал в аналитической лунке, а min и max являются типичными контролями максимального и минимального сигнала.
Четырех-параметрическая подгонка IC50
(Низ — Верх)
Y = Низ +
4- коэффициент Хилла
Где верхняя часть и нижняя часть, как правило, обеспечиваются со смещением, но могут быть фиксированными на 100 или 0, соответственно, при 3-параметрической подгонке. Коэффициент Хилла, как правило, представленный со смещением, также может быть фиксированным при 1 в 3-параметрической подгонке. Y представляет собой % ингибирования, а X представляет собой концентрацию соединения.
Биохимический анализ PRMT6 Общие материалы
S-аденозилметионин (SAM), S-аденозилгомоцистеин (SAH), бицин, Tween 20, диметилсульфоксид (DMSO), желатин кожи крупного рогатого скота (BSG), натрия бутират и раствор трис(2карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) при наивысшем уровне возможной чистоты закупали у Sigma-Aldrich. H-SAM со специфичной активностью 80 Ки/ммоль закупали у American Radiolabeled Chemicals. 384-Луночные покрытые стрептавидином Flashplates закупали у PerkinElmer.
Субстраты
Типичный пептид остатков 36-50 гистона Н4 человека синтезировали с N-концевым мотивом линкер-аффинная метка и С-концевым амидным кэппированием в 21st Century Biochemicals. Пептид очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) до чистоты более 95% и подтверждали жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS). Последовательность представляла собой BiotAhx-RLARRGGVKRISGLI-амид и содержала монометилированный лизин в положении 44 (SEQ ID NO:5).
Молекулярная биология
Клонированный участок последовательности полноразмерной PRMT6 (NM_018137.2) человека амплифицировали из библиотеки кДНК НЕК 293, встраивая фланкирующую 5' последовательность, которая кодирует метку FLAG (MDYKDDDDK) (SEQ ID NO:6), гибридизованную непосредственно с Ser 2 из PRMT6, и 3' последовательность, кодирующую шесть остатков His (EGHHHHHH) (SEQ ID NO:17), гибридизованную непосредственно с Asp 375. Амплифицированный ген субклонировали в pFastBacMam (Viva Biotech).
Экспрессия белков [00457]
Рекомбинантные бакуловирусы получали в соответствии с инструкциями к набору Bac-to-Bac kit (Life Technologies). Сверхэкспрессии белка достигали путем инфицирования культуры клеток HEK 293F в фазе экспоненциального роста при 1,3x106клеток/мл вирусом (MOI = 10) в присутствии 8 мМ натрия бутирата. Инфицирование осуществляли при 37°C в течение 48 ч, собирали центрифугированием и хранили при -80°C для очистки.
Очистка белков
Экспрессированный полноразмерный Flag-и His-меченный белок PRMT6 человека очищали от клеточной массы аффинной хроматографией с помощью агарозы NiNTA после уравновешивания смолы буфером, содержащим 50 мМ Tris, 300 мМ NaCl, 10% глицерин, pH 7,8 (Буфер Ni-A). Колонку промывали с помощью 20 мМ имидазола в том же буфере и Flag-PRMT6-His элюировали с помощью 150 мМ имидазола. Объединенные фракции подвергали диализу против буфера Ni-A и дополнительно очищали аффиной хроматографией с помощью антитела anti-flag M2. Flag-PRMT6-His элюировали с помощью 200 мкг/мл пептида FLAG в том же буфере. Объединенные фракции подвергали диализу в 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 10% глицерине и 5 мМ Р-меркаптоэтаноле, pH 7,8. Чистота извлеченного белка составляла 95%.
Предсказанные трансляции Flag-PRMT6-His (SEQ ID NO: 7)
MDYKDDDDKSQPKKRKLESGGGGEGGEGTEEEDGAEREAALERPRRTKRERDQLYYECYSDVSVH EEMIADRVRTDAYRLGILRNWAALRGKTVLDVGAGTGILSIFCAQAGARRVYAVEASAIWQQARE VVRFNGLEDRVHVLPGPVETVELPEQVDAIVSEWMGYGLLHESMLSSVLHARTKWLKEGGLLLPA SAELFIAPISDQMLEWRLGFWSQVKQHYGVDMSCLEGFATRCLMGHSEIVVQGLSGEDVLARPQR FAQLELSRAGLEQELEAGVGGRFRCSCYGSAPMHGFAIWFQVTFPGGESEKPLVLSTSPFHPATH WRQALLYLNEPVQVEQDTDVSGEITLLPSRDNPRRLRVLLRYKVGDQEEKTKDFAMEDHHHHHH
- 186 030481
Общая процедура анализов фермента PRMT6 на пептидных субстратах
Все анализы выполняли в буфере, содержащем 20 мМ бицин (pH 7,6), 1 мМ ТСЕР, 0,005% BSG и 0,002% Tween 20, приготовленном в день применения. ^еди^ния в 100% DMSO (1 мкл) вносили в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием Platemate Plus, оснащенного 384-канальной головкой (Thermo Scientific). Добавляли DMSO (1 мкл) в колонки 11, 12, 23, 24, ряды А-Н для контроля максимального сигнала, и 1 мкл SAH, известный продукт и ингибитор PRMT5/PRMT6 добавляли в колонки 11, 12, 23, 24, ряды I-P для контроля минимального сигнала. Смесь (40 мкл), содержащую фермент PRMT6, добавляли с помощью Multidrop Combi (Thermo-Fisher). Соединения инкубировали с PRMT6 в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли смесь (10 мкл), содержащую 3H-SAM и пептид, для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Конечные концентрации компонентов были следующими: концентрация PRMT6 составляла 1 нМ, 3H-SAM составлял 200 нМ, SAM без радиоактивной метки составляла 250 нМ, пептида составляла 75 нМ, SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, а концентрация DMSO составляла 2%. Реакции останавливали путем добавления SAM без радиоактивной метки (10 мкл) до конечной концентрации 400 мкМ, при этом разбавляли H-SAM до уровня, при котором его включение в пептидный субстрат больше не обнаруживалось. Затем 50 мкл реакционной смеси в 384-луночном полипропиленовом планшете переносили в 384-луночный Flashplate и обеспечивали связывание биотинилированных пептидов с покрытой стрептавидином поверхностью по меньшей мере в течение 1 часа перед однократным промыванием с помощью 0,1% Tween 20 в устройстве для промывания планшетов Biotek ELx405. Затем планшеты считывали на устройстве для считывания планшетов PerkinElmer TopCount для измерения количества 3Hмеченного пептида, связанного с поверхностью Flashplate, измеряемого как дезинтеграции в минуту (dpm) или, в качестве альтернативы, называемого как число импульсов в минуту (cpm).
Вычисление % ингибирования
% ИНГ. = 100100
\dpmMaKC
где dpm = дезинтеграции в минуту, empd = сигнал в аналитической лунке, а min и max являются типичными контролями максимального и минимального сигнала.
Четырех-параметрическая подгонка IC50
Где верхняя часть и нижняя часть, как правило, обеспечиваются со смещением, но могут быть фиксированными на 100 или 0, соответственно, при 3-параметрической подгонке. Коэффициент Хилла, как правило, представленный со смещением, также может быть фиксированным при 1 в 3-параметрической подгонке. Y представляет собой % ингибирования, а X представляет собой концентрацию соединения.
Биохимический анализ PRMT8 Общие материалы
S-аденозилметионин (SAM), S-аденозилгомоцистеин (SAH), бицин, Tween 20, диметилсульфоксид (DMSO), желатин кожи крупного рогатого скота (BSG), изопропил-р-Б-тиогалактопиранозид (IPTG) и раствор Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) при наивысшем уровне возможной чистоты закупали у Sigma-Aldrich. 3H-SAM со специфичной активностью 80 Ки/ммоль закупали у American Radiolabeled Chemicals. 384-Луночные покрытые стрептавидином Flashplates закупали у PerkinElmer.
Субстраты
Типичный пептид остатков 31-45 гистона Н4 человека синтезировали с N-концевым мотивом линкер-аффинная метка и С-концевым амидным кэппированием в 21st Century Biochemicals. Пептид очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) до чистоты более 95% и подтверждали жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS). Последовательность представляла собой BiotAhx-KPAIRRLARRGGVKR-амид (SEQ ID NO:8).
Молекулярная биология
Клонированный участок последовательности изоформы 1 полноразмерной PRMT8 (NM_019854.4) человека амплифицировали из библиотеки кДНК НЕК 293 и субклонировали в pGEX-4T-l (GE Life Sciences). Полученная в результате конструкция кодирует N-концевую метку GST и расщепляемую тромбином последовательность
(MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLP YYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSK DFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPM CLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRG SPEF) (SEQ ID N0:9)
гибридизированную непосредственно с Met 1 из PRMT8.
- 187 030481
Экспрессия белков
Е. coli (BL21(DE3) Gold, Stratagene), которая приобрела компетентность с помощью способа с использованием CaCb, трансформировали конструкцией PRMT8 и использовали ампициллин в качестве маркера для отбора. Сверхэкспрессии белка достигали путем выращивания клона Е. coli, экспрессирующего PRMT8, и индуцирования экспрессии с помощью 0,3 мМ IPTG при 16°C. Культуру выращивали в течение 12 часов, собирали центрифугированием и хранили при -80°C для очистки.
Очистка белков
Экспрессированный полноразмерный GST-меченный белок PRMT8 человека очищали от клеточной массы аффинной хроматографией с глутатионсефарозой после уравновешивания смолы 50 мМ фосфатным буфером, 200 мМ NaCl, 5% глицерином, 5 мМ β-меркаптоэтанолом, pH 7,8 (Буфер А). GSTмеченный PRMT8 элюировали с помощью 50 мМ Tris, 2 мМ глутатиона, pH 7,8. Объединенные фракции расщепляли тромбином (10 Ед) и диализировали в буфере А. GST удаляли путем повторной загрузки образца расщепленного белка на колонку с глутатионсефарозой и PRMT8 собирали в элюированных фракциях. PRMT8 дополнительно очищали с помощью хроматографии с керамическим гидроксиапатитом. Колонку промывали с помощью 50 мМ фосфатного буфера, 100 мМ NaCl, 5% глицерина, 5 мМ βмеркаптоэтанола, pH 7,8, и PRMT8 элюировали с помощью 100 мМ фосфата в том же буфере. Белок концентрировали и замещение буфера на буфер, содержащий 50 мМ Tris, 300 мМ NaCl, 10% глицерин, 5 мМ β-меркаптоэтанол, pH 7,8 проводили путем ультрафильтрации. Чистота извлеченного белка составляла 89%.
Предсказанные трансляции GST-меченный PRMT8 (SEQ ID N0:10)
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKL TQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEML KMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKS SKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSPEFMGMKHSSRCLLLRRKMAENAAESTEVNSPPS QPPQPVVPAKPVQCVHHVSTQPSCPGRGKMSKLLNPEEMTSRDYYFDSYAHFGIHEEMLKDEVRT LTYRNSMYHNKHVFKDKVVLDVGSGTGILSMFAAKAGAKKVFGIECSSISDYSEKIIKANHLDNI ITIFKGKVEEVELPVEKVDIIISEWMGYCLFYESMLNTVIFARDKWLKPGGLMFPDRAALYVVAI EDRQYKDFKIHWWENVYGFDMTCIRDVAMKEPLVDIVDPKQVVTNACLIKEVDIYTVKTEELSFT SAFCLQIQRNDYVHALVTYFNIEFTKCHKKMGFSTAPDAPYTHWKQTVFYLEDYLTVRRGEEIYG TISMKPNAKNVRDLDFTVDLDFKGQLCETSVSNDYKMR
Общая процедура анализов фермента PRMT8 на пептидных субстратах
Все анализы выполняли в буфере, содержащем 20 мМ бицина (pH 7,6), 1 мМ ТСЕР, 0,005% BSG и 0,002% Tween 20, приготовленном в день применения. Соединения в 100% DMSO (1 мкл) вносили в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием Platemate Plus, оснащенного 384-канальной головкой (Theraio Scientific). Добавляли DMSO (1 мкл) в колонки 11, 12, 23, 24, ряды А-Н для контроля максимального сигнала, и 1 мкл SAH, известный продукт и ингибитор PRMT5/PRMT8 добавляли в колонки 11, 12, 23, 24, ряды I-P для контроля минимального сигнала. Смесь (40 мкл), содержащую фермент PRMT8, добавляли с помощью Multidrop Combi (Thermo-Fisher). Соединения инкубировали с PRMT8 в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли смесь (10 мкл), содержащую 3H-SAM и пептид, для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Конечные концентрации компонентов были следующими: концентрация PRMT8 составляла 1,5 нМ, 3H-SAM составлял 50 нМ, SAM без радиоактивной метки составляла 550 нМ, пептида составляла 150 нМ, SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, а концентрация DMSO составляла 2%. Реакции останавливали путем добавления SAM без радиоактивной метки (10 мкл) до конечной концентрации 400 мкМ, при этом происходило разбавление 3H-SAM до уровня, при котором его включение в пептидный субстрат больше не обнаруживалось. Затем 50 мкл реакционной смеси в 384-луночном полипропиленовом планшете переносили в 384-луночный Flashplate и обеспечивали связывание биотинилированных пептидов с покрытой стрептавидином поверхностью по меньшей мере в течение 1 часа перед однократным промыванием с помощью 0,1% Tween 20 в устройстве для промывания планшетов Biotek ELx405. Затем планшеты считывали на устройстве для считывания планшетов PerkinElmer TopCount для измерения количества ^-меченного пептида, связанного с поверхностью Flashplate, измеряемого как дезинтеграции в минуту (dpm) или, в качестве альтернативы, называемого как число импульсов в минуту (cpm).
Вычисление % ингибирования
%инг.= 1ОО-АРтСОеД~0"ИЙхЮО
\dp772MaKC
где dpm = дезинтеграции в минуту, cmpd = сигнал в аналитической лунке, а min и max являются типичными контролями максимального и минимального сигнала.
- 188 030481
Четырех-параметрическая подгонка IC50
(Низ — Верх)
Y = Низ Τ(Д -|_ коэффициент Хилла
Где верхняя часть и нижняя часть, как правило, обеспечиваются со смещением, но могут быть фиксированными на 100 или 0, соответственно, при 3-параметрической подгонке. Коэффициент Хилла, как правило, представленный со смещением, также может быть фиксированным при 1 в 3-параметрической подгонке. Y представляет собой % ингибирования, а X представляет собой концентрацию соединения.
Биохимический анализ PRMT3
Общие материалы S-аденозилметионин (SAM), S-аденозилгомоцистеин (SAH), бицин, Tween 20, диметилсульфоксид (DMSO), желатин кожи крупного рогатого скота (BSG), изопропил-β-В-тиогалактопиранозид (IPTG) и раствор Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) при наивысшем уровне возможной чистоты закупали у Sigma-Aldrich. 3H-SAM со специфичной активностью 80 Ки/ммоль закупали у American Radiolabeled Chemicals. 384-Луночные покрытые стрептавидином Flashplates закупали у PerkinElmer.
Субстраты
Пептид, содержащий мотив субстрата для классической RMT, синтезировали с N-концевым мотивом линкер-аффинная метка и С-концевым амидным кэппированием в 21st Century Biochemicals. Пептид очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) до чистоты более 95% и подтверждали жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS). Последовательность представляла собой Biot-Ahx-GGRGGFGGRGGFGGRGGFG-амид (SEQ ID NO: 11).
Молекулярная биология
Клонированный участок последовательности изоформы 1 полноразмерной PRMT3 (NM_005788.3) человека амплифицировали из библиотеки кДНК НЕК 293 и субклонировали в pGEX-KG (GE Life Sciences). Полученная в результате конструкция кодирует N-концевую метку GST и расщепляемую тромбином последовательность
(MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLP YYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSK DFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPM CLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRG S) (SEQ ID N0:12)
гибридизованную непосредственно с Cys 2 из PRMT3.
Экспрессия белков
Е. coli (BL21(DE3) Gold, Stratagene), которая приобрела компетентность с помощью способа с использованием CaCb, трансформировали конструкцией PRMT3 и использовали ампициллин в качестве маркера для отбора. Сверхэкспрессии белка достигали путем выращивания клона Е. coli, экспрессирующего PRMT3, и индуцирования экспрессии с помощью 0,3 мМ IPTG при 16°С. Культуру выращивали в течение 12 часов, собирали центрифугированием и хранили при -80°C для очистки.
Очистка белков
Экспрессированный полноразмерный GST-меченный белок человека PRMT3 очищали от клеточной массы аффинной хроматографией с глутатионсефарозой после уравновешивания смолы 50 мМ фосфатным буфером, 200 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 5 мМ Р-меркаптоэтанолом, pH 6,5 (Буфер А). GST-меченный PRMT3 элюировали с помощью 50 мМ Tris, 2 мМ глутатиона, pH 7,1 и 50 мМ Tris, 20 мМ глутатиона, pH 7,1. Объединенные фракции подвергали диализу в 20 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5% глицерине, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, pH 7,5 (буфер В) и наносили на колонку Q Sepharose Fast Flow. GST-меченный PRMT3 элюировали с помощью 500 мМ NaCl в буфере В. Объединенные фракции подвергали диализу в 25 мМ фосфатном буфере, 100 мМ NaCl, 5% глицерине, 2 мМ DTT, pH 6,8 (буфер С) и загружали в колонку с керамическим гидроксиапатитом. GST-меченный PRMT3 элюировали с помощью 25-400 мМ фосфата в буфере С. Белок концентрировали и замещение буфера на буфер, содержащий 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, 5 мМ 0-меркаптоэтанол, pH 7,8 проводили путем ультрафильтрации. Чистота извлеченного белка составляла 70%.
Предсказанные трансляции GST-меченный PRMT3 (SEQ ID N0:13)
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKL
TQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEML
KMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKS
- 189 030481
SKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSCSLASGATGGRGAVENEEDLPELSDSGDEAAWED EDDADLPHGKQQTPCLFCNRLFTSAEETFSHCKSEHQFNIDSMVHKHGLEFYGYIKLINFIRLKN PTVEYMNSIYNPVPWEKEEYLKPVLEDDLLLQFDVEDLYEPVSVPFSYPNGLSENTSWEKLKHM EARALSAEAALARAREDLQKMKQFAQDFVMHTDVRTCSSSTSVIADLQEDEDGVYFSSYGHYGIH EEMLKDKIRTESYRDFIYQNPHIFKDKVVLDVGCGTGILSMFAAKAGAKKVLGVDQSEILYQAMD IIRLNKLEDTITLIKGKIEEVHLPVEKVDVIISEWMGYFLLFESMLDSVLYAKNKYLAKGGSVYP DICTISLVAVSDVNKHADRIAFWDDVYGFKMSCMKKAVIPEAVVEVLDPKTLISEPCGIKHIDCH TTSISDLEFSSDFTLKITRTSMCTAIAGYFDIYFEKNCHNRWFSTGPQSTKTHWKQTVFLLEKP FSVKAGEALKGKVTVHKNKKDPRSLTVTLTLNNSTQTYGLQ
Общая процедура анализов фермента PRMT3 на пептидных субстратах Все анализы выполняли в буфере, содержащем 20 мМ бицина (pH 7,6), 1 мМ ТСЕР, 0,005% BSG и
0,002% Tween 20, приготовленном в день применения. Соединения в 100% DMSO (1 мкл) вносили в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием Platemate Plus, оснащенного 384-канальной головкой (Thermo Scientific). Добавляли DMSO (1 мкл) в колонки 11, 12, 23, 24, ряды А-Н для контроля максимального сигнала, и 1 мкл SAH, известный продукт и ингибитор PRMT5/PRMT3 добавляли в колонки 11, 12, 23, 24, ряды I-P для контроля минимального сигнала. Смесь (40 мкл), содержащую фермент PRMT3, добавляли с помощью Multidrop donbi (Thermo-Fisher). Соединения инкубировали с PRMT3 в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли смесь (10 мкл), содержащую 3H-SAM и пептид, для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Конечные концентрации компонентов были следующими: концентрация PRMT3 составляла 0,5 нМ, 3H-SAM составляла 100 нМ, SAM без радиоактивной метки составляла 1,8 мкМ, пептида составляла 330 нМ, SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, а концентрация DMSO составляла 2%. Реакции останавливали добавлением калия хлорида (10 мкл) до конечно концентрации 100 мМ. Затем 50 мкл реакционной смеси в 384-луночном полипропиленовом планшете переносили в 384-луночный Flashplate и обеспечивали связывание биотинилированных пептидов с покрытой стрептавидином поверхностью по меньшей мере в течение 1 часа перед однократным промыванием с помощью 0,1% Tween 20 в устройстве для промывания планшетов Biotek ELx405. Затем планшеты считывали на устройстве для считывания планшетов PerkinElmer TopA^t для измерения количества ^-меченного пептида, связанного с поверхностью Flashplate, измеряемого как дезинтеграции в минуту (dpm) или, в качестве альтернативы, называемого как число импульсов в минуту (cpm).
Вычисление % ингибирования
% ИНГ. = 100 - А'11^ - х юо
\dpmMaKC ^ртмин/
где dpm = дезинтеграции в минуту, cmpd = сигнал в аналитической лунке, а min и max являются типичными контролями максимального и минимального сигнала.
Четырех-параметрическая подгонка IC50
Где верхняя часть и нижняя часть, как правило, обеспечиваются со смещением, но могут быть фиксированными на 100 или 0, соответственно, при 3-параметрической подгонке. Коэффициент Хилла, как правило, представленный со смещением, также может быть фиксированным при 1 в 3-параметрической подгонке. Y представляет собой % ингибирования, а X представляет собой концентрацию соединения.
Биохимический анализ CARM1
Общие материалы S-аденозилметионин (SAM), S-аденозилгомоцистеин (SAH), бицин, Tween 20, диметилсульфоксид (DMSO), желатин кожи крупного рогатого скота (BSG), натрия бутират и раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (ТСЕР) при наивысшем уровне возможной чистоты закупали у Sigma-Aldrich. 3H-SAM со специфичной активностью 80 Ки/ммоль закупали у American Radiolabeled Chemicals. 384-Луночные покрытые стрептавидином Flashplates закупали у PerkinElmer.
Субстраты
Типичный пептид остатков 16-30 гистона H3 человека синтезировали с N-концевым мотивом линкер-аффинная метка и С-концевым амидным кэппированием в 21st Century Biochemicals. Пептид очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLQ до чистоты более 95% и подтверждали жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LAMS). Последовательность представляла собой BiotAhx-PRKQLATKAARKSAP-амид и содержала монометилированный аргинин в положении 26 (SEQ ID NO:14).
Молекулярная биология
Клонированный участок последовательности CARM1 (PRMT4) (NM199141.1) человека амплифицировали из библиотеки кДНК НЕК 293, встраивая фланкирующую 5' последовательность, которая кодирует метку FLAG (MDYKDDDDK) (SEQ ID NO:6), гибридизованную непосредственно с Ala 2 из CARM1, и 3' последовательность из шести His остатков (EGHHHHHH) (SEQ ID NO:15), гибридизован- 190 030481
ную непосредственно с Ser 608. Последовательность гена, кодирующая изоформу 1, которая содержит делецию аминокислот 539-561, в дальнейшем амплифицировали и субклонировали в pFastBacMam (Viva Biotech).
Экспрессия белков [00457]
Рекомбинантные бакуловирусы получали в соответствии с инструкциями к набору Bac-to-Bac kit (Life Technologies). Сверхэкспрессии белка достигали путем инфицирования культуры клеток НЕК 293F в фазе экспоненциального роста при 1,3х106клеток/мл вирусом (MOI = 10) в присутствии 8 мМ натрия бутирата. Инфицирование осуществляли при 37°C в течение 48 ч, собирали центрифугированием и хранили при -80°C для очистки.
Очистка белков
Экспрессированный полноразмерный Flag-и His-меченный белок CARM1 человека очищали от клеточной массы аффинной хроматографией с помощью антитела anti-flag M2 со смолой, уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, pH 7,8. Колонку промывали с помощью 500 мМ NaCl в буфере А и Flag-CARMl-His элюировали с помощью 200 мкг/мл пептида FLAG в буфере А. Объединенные фракции подвергали диализу в 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 5% глицерине и 1 мМ DTT, pH 7,8. Чистота извлеченного белка составляла 94.
Предсказанные трансляции Flag-CARMl-His (SEQ ID N0:16)
MDYKDDDDKAAAAAAVGPGAGGAGSAVPGGAGPCATVSVFPGARLLTIGDANGEIQRHAE
QQALR
LEVRAGPDSAGIALYSHEDVCVFKCSVSRETECSRVGKQSFIITLGCNSVLIQFATPNDFCSFY
N
ILKTCRGHTLERSVFSERTEESSAVQYFQFYGYLSQQQNMMQDYVRTGTYQRAILQNHTDFK
DKI
VLDVGCGSGILSFFAAQAGARKIYAVEASTMAQHAEVLVKSNNLTDRIVVIPGKVEEVSLPE
QVD
IIISEPMGYMLFNERMLESYLHAKKYLKPSGNMFPTIGDVHLAPFTDEQLYMEQFTKANFWY
QPS
FHGVDLSALRGAAVDEYFRQPVVDTFDIRILMAKSVKYTVNFLEAKEGDLHRIEIPFKFHML
HSG
LVHGLAFWFDVAFIGSIMTVWLSTAPTEPLTHWYQVRCLFQSPLFAKAGDTLSGTCLLIANK
RQS
YDISIVAQVDQTGSKSSNLLDLKNPFFRYTGTTPSPPPGSHYTSPSENMWNTGSTYNLSSGMA
VA
GT.nn.TAYDLSSVIASGSSVGHNNLIPLGSSGAQGSGGGSTSAHYAVNSQFTMGGPAISMASP
MSIP
TNTMHYGSEGHHHHHH
Общая процедура анализов фермента CARM1 на пептидных субстратах
Все анализы выполняли в буфере, содержащем 20 мМ бицина (pH 7,6), 1 мМ ТСЕР, 0,005% BSG и 0,002% Tween 20, приготовленном в день применения. Соединения в 100% DMSO (1 мкл) вносили в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием Platemate Plus, оснащенного 384-канальной головкой (Thermo Scientific). Добавляли DMSO (1 мкл) в колонки 11, 12, 23, 24, ряды А-Н для контроля максимального сигнала, и 1 мкл SAH, известного продукта и ингибитора PRMT5/CARM1, добавляли в колонки 11, 12, 23, 24, ряды I-P для контроля минимального сигнала. Смесь (40 мкл), содержащую фермент CARM1, добавляли с помощью Multidrop Combi (Thermo-Fisher). Соединения инкубировали с CARM1 в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли смесь (10 мкл), содержащую 3H-SAM и пептид, для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Конечные концентрации компонентов были следующими: концентрация CARM1 составляла 0,25 нМ, 3H-SAM составлял 30 нМ, пептида составляла 250 нМ, SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, а концентрация DMSO составляла 2%. Реакции останавливали путем добавления SAM без радиоактивной метки (10 мкл) до конечной концентрации 300 мкМ, при этом происходило разбавление 3H-SAM до уровня, при котором его включение в пептидный субстрат больше не обнаруживалось. Затем 50 мкл реакционной смеси в 384-луночном полипропиленовом планшете переносили в 384-луночный Flashplate и обеспечивали связывание биотинилированных пептидов с покрытой стрептавидином поверхностью по меньшей мере в течение 1 часа перед однократным промыванием с помощью 0,1% Tween 20 в устройстве для промывания планшетов Biotek ELx405. Затем планшеты считывали на устройстве для считывания планшетов PerkinElmer TopCount для измерения количества 3И-меченного пептида, связанного с поверхностью Flashplate, измеряемого как дезинтеграции в минуту (dpm) или, в качестве альтернативы, называемого как число импульсов в минуту (cpm).
Вычисление % ингибирования
% ИНГ. = 1ОО-0т^-^0X100
WpmMaKC с(рл1мин/
где dpm = дезинтеграции в минуту, cmpd = сигнал в аналитической лунке, а min и max являются ти- 191 030481
пичными контролями максимального и минимального сигнала.
Четырех-параметрическая подгонка IC50
(Низ — Верх)
Y = Низ +
Μ 6 Л А коэффициент ICcr,
Хилла
Где верхняя часть и нижняя часть, как правило, обеспечиваются со смещением, но могут быть фиксированными на J00 или 0, соответственно, при 3-параметрической подгонке. Коэффициент Хилла, как правило, представленный со смещением, также может быть фиксированным при J в 3-параметрической подгонке. Y представляет собой % ингибирования, а X представляет собой концентрацию соединения.
Таблица 2. Биохимическая ICso
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
1 А А В D В
2 А А В С В
3 - А в D с
4 А А в Е в
5 А А в С в
6 А А в D в
7 А А в D А
8 А А в D В
9 А А в D с
10 В В с Е Е
11 А А в С А
12 С С Е Е Е
13 А А В D В
14 А В в D В
15 А А в С В
16 А В в D в
17 А А в С А
Таблица 2. Би охимическая 1С50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
18 А А А С А
19 В В С D D
20 А А В С В
21 С В D Е Е
22 А А В D D
23 А А В D С
24 А В В Е -
25 В В С - -
26 - В D - -
27 - с Е - -
28 В А С - -
29 в В С - -
30 - в D - -
31 - D Е - -
32 в А С - -
33 А А В - -
34 А А В - -
35 А А В - -
36 А А В - -
37 А А В - -
38 А А В - -
39 - А В - -
40 - А В - -
41 А А D - -
42 А А В - -
43 - А - - -
44 С В - - -
45 А А - - -
46 А А - - -
- J92 030481
Таблица 2. Биохимическая IC50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
47 А А - - -
48 А А - -
49 А А - - -
50 А А - - -
51 А А - -
52 А А - -
53 А А - -
54 А А - - -
55 А А - - -
56 А А - -
57 А А - - -
58 А А - -
59 А В - - -
60 А в - - -
61 А А - -
62 А А А - -
63 А А А -
64 - - -
65 А А А - -
66 - -
67 А А А - -
68 -
69 - -
70 А А А -
71 - - - - -
72 -
73
74 - -
75 - - - - -
Таблица 2. Би □химическая 1С50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
76 - - - -
77 - - - -
78 - - - - -
79 - - - -
80 - - - -
81 - - - -
82 - - - - -
83 - - - - -
84 - - - - -
85 - - -
86 С D D - -
87 В D С - -
88 - - - - -
89 - - - -
90 А В В - -
91 А А А - -
92 А А А - -
93 А А А - -
94 - - - - -
95 А А А - -
96 - - - -
97 - - - -
98 - - -
99 - - -
100 - - - -
101 - - - - -
102 - - - -
103 - - - - -
104 А А А - -
- 193 030481
Таблица 2. Биохимическая IC50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
105 - - - -
106 А А А -
107 А В А - -
108 А В В -
109 А В А
110 А А А - -
111 А А А -
112 А А А -
113 А А В - -
114 В А В - -
115 А А В
116 А А А - -
117 А А В - -
118 С Е Е - -
119 В С В - -
120 А А А -
121 А А А -
122 В Е D -
123 А А А -
124 А А А -
125 А А А - -
126 А А А -
127 А А А - -
128 А А А - -
129 А А А - -
130 А А А - -
131 В Е С - -
132 В D D - -
133 А А А -
Таблица 2. Биохимическая IC50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
134 А А А
135 А А А -
136 А А А -
137 А А А - -
138 В С С -
139 А А В - -
140 А А А - -
141 А А А - -
142 А А А - -
143 А А А
144 А А А -
145 А А - -
146 А А - - -
147 А А - - -
148 А А -
149 А А - - -
150 А А - - -
151 А А - - -
152 А А - - -
153 А А - - -
154 А А - - -
155 А А - -
156 А А - - -
157 А А - - -
158 А А - -
159 А А - -
160 А В - - -
161 А А А - -
162 А А А - -
- 194 030481
Таблица 2. Биохимическая IC50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
163 А А А - -
164 А А А - -
165 А В А - -
166 А А А - -
167 А А А - -
168 А А А - -
169 А А А - -
170 А А А - -
171 А А - - -
172 А А - - -
173 А А - - -
174 А А - - -
175 А А А - -
176 А А А - -
177 А В В - -
178 А А А - -
179 А А А - -
180 А А - - -
181 А А - - -
182 А А А - -
183 А А А - -
184 А В А - -
185 А А А - -
186 В В А - -
187 В В В - -
188 В С С - -
189 в с В - -
190 в в в - -
191 А в в - -
Таблица 2. Биохимическая IC50
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
192 В В В - -
193 А А А - -
194 А А А - -
195 А А А - -
196 В В В - -
197 А А А - -
198 D D D - -
199 А А А - -
200 А А А - -
201 А В А - -
202 ' А А А - -
203 А А А - -
204 А А А - -
205 А А А - -
206 А В А - -
207 А А А - -
208 А А А - -
209 А А А - -
210 А А А - -
211 А А А - -
212 А А А - -
213 А А В - -
214 А А А - -
215 А А А - -
216 А А А - -
217 А А А - -
218 А А А - -
219 А А А - -
220 А А А - -
- 195 030481
"-" означает, что данные не предоставлены.
- 196 030481
В табл. 2 "А" означает, что IC50 составляет < 0,100 мкМ, "В" означает, что IC50 составляет 0,101-1,00 мкМ, "С" означает, что IC50 составляет 1,01-3,00 мкМ, "D" означает, что IC50 составляет 3,01-10 мкМ, и IC50 составляет > 10,01 мкМ.__________
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
1 0,01 0,07 0,39 6,83 0,26
2 0,01 0,04 0,17 3,00 0,11
3 - 0,02 0,95 9,40 1,23
4 0,02 0,02 0,59 >10 0,50
5 0,01 0,00 0,42 1,45 0,31
6 0,04 0,03 0,24 3,94 0,57
7 0,01 0,02 0,52 5,91 0,09
8 0,02 0,04 0,36 5,81 0,37
9 0,01 0,01 0,76 8,93 3,00
10 0,39 0,31 1,92 >10 >10
11 0,01 0,05 0,25 1,58 0,05
12 1,58 1,08 >10 >10 >10
13 0,01 0,01 0,30 3,62 0,20
14 0,09 0,93 0,66 6,77 0,51
15 0,05 0,04 0,70 2,34 0,31
16 0,02 0,15 0,69 5,79 0,11
17 0,01 0,05 0,41 2,36 0,09
18 0,00 0,01 0,04 1,75 0,10
19 0,19 0,17 2,30 7,74 3,78
20 0,02 0,02 0,47 2,34 0,25
21 1,49 0,67 9,56 >10 >10
22 0,01 0,02 0,30 6,46 3,77
23 0,01 0,01 0,28 9,65 2,78
24 0,02 0,18 0,30 >10 -
25 0,25 0,29 2,86 - -
26 - 0,51 5,63 - -
27 - 2,41 >10 - -
28 0,18 0,08 1,68
29 0,29 3,81 - -
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
30 - 6,59 >10
31 0,11 0,03 1,15 - -
32 0,02 0,02 0,77 -
33 0,02 0,02 0,50 - -
34 0,02 0,03 0,44 -
35 0,00 0,01 0,14 - -
36 0,00 0,01 0,28
37 0,01 0,01 0,13 - -
38 0,00 0,01 0,26 - -
39 - 0,01 0,36 -
40 0,02 0,02 7,01
41 0,01 0,00 0,35 -
42 - 0,02 0,0300 -
43 - 0,00 0,0116 -
44 - 0,02 0,0624 -
45 0,0028 0,0056 0,0053 - -
46 0,0079 0,0122 0,0062 -
47 0,0043 0,0173 0,0125 - -
48 0,0074 0,0178 0,0083 -
49 0,0043 0,0199 0,0073 -
50 0,0086 0,0206 0,0112 - -
51 0,0094 0,0239 0,0214 -
52 0,0047 0,0243 0,0104 - -
53 0,0105 0,0380 0,0128 - -
54 0,0080 0,0382 0,0247
55 0,0128 0,0404 0,0247 -
56 0,0138 0,0618 0,0320 - -
57 0,0186 0,0694 0,0301
58 0,0265 0,1077 0,0721 - -
- 197 030481
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
59 0,0196 0,1277 0,0484 - -
60 0,0275 0,1549 0,1286 -
61 0,0205 0,0491 - - -
62 0,01187 0,02902 0,02 - -
63 0,0090 0,0121 0,0120 - -
64 - - - - -
65 0,00965 0,04193 0,01355 - -
66 - - - -
67 0,0078 0,0180 0,0119 -
68 - - - -
69 - - - -
70 0,0092 0,0440 0,0242 -
71 - *
72 - - - - -
73 * -
74 - - - -
75 * - - -
76 - - - - -
77 - - - -
78 - - -
79 - -
80 - *
81 - - - -
82 - - - - -
83 - - -
84 - - -
85 - - - - -
86 1,94296 3,40906 3,96737
87 0,56419 3,72633 1,01384 - -
Таблица 2а. Биохимическая 1С5о (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
88 - - - -
89 - - - -
90 0,0344 0,12244 0,11687 - -
91 0,01668 0,06307 0,02896 - -
92 0,0209 0,04904 0,04206 - -
93 0,03128 0,07193 0,08812 - -
94 - - - - -
95 0,00935 0,0692 0,01887 -
96 - - - -
97 - - - -
98 - - - -
99 - - - - -
100 - - - - -
101 - - - -
102 - - - -
103 - - - -
104 0,00804 0,04046 0,01158 - -
105 - - - -
106 0,0095 0,01348 0,0145 - -
107 0,0212 0,1296 0,0554 - -
108 0,0610 0,3255 0,2521 - *
109 0,0267 0,1243 0,0560 -
110 0,0131 0,0294 0,0429 - -
111 0,0224 0,0455 0,0599 - -
112 0,0189 0,0574 0,0692 * -
113 0,0572 0,0669 0,1193 - -
114 0,1009 0,0926 0,3400 - -
115 0,0887 0,0627 0,1964 -
116 0,0098 0,0187 0,0118 - -
- 198 030481
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARMI
117 0,0386 0,0962 0,1428 - -
118 2,1552 > 10,0 > 10,0 - -
119 0,1239 2,7522 0,7278
120 0,0101 0,0428 0,0251 - -
121 0,0152 0,0977 0,0326 - -
122 0,4207 > 10,0 8,3743 - -
123 0,0088 0,0180 0,0247 - -
124 0,0064 0,0262 0,0108
125 0,0053 0,0131 0,0090
126 0,0040 0,0094 0,0065 - -
127 0,0165 0,0223 0,0478 - -
128 0,0052 0,0131 0,0082 - -
129 0,0236 0,0297 0,0837
130 0,0034 0,0042 0,0045
131 0,2699 > 10,0 1,9689 - -
132 0,6264 5,4954 4,3316 - -
133 0,0059 0,0124 0,0091 - -
134 0,0139 0,0351 0,0248 - -
135 0,0121 0,0349 0,0317 - -
136 0,0029 0,0072 0,0068
137 0,0073 0,0233 0,0162
138 0,3486 1,2075 1,4305 - -
139 0,0305 0,0226 0,1157 - -
140 0,0156 0,0240 0,0339 - -
141 0,0107 0,0230 0,0297 - -
142 0,0072 0,0199 0,0159 - -
143 0,0106 0,0220 0,0330 - -
144 0,0216 0,0356 0,0784 - -
145 0,0262 0,0380 - - -
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
146 0,0140 0,0217 - -
147 0,0183 0,0327 - - -
148 0,0048 0,0081 - -
149 0,0045 0,0072 - - -
150 0,0440 0,0556 - -
151 0,0369 0,0477 - -
152 0,0142 0,0352 - - -
153 0,0232 0,0284 - -
154 0,0177 0,0443 * -
155 0,0315 0,0608 - -
156 0,0172 0,0578 - - -
157 0,0185 0,0479 - -
158 0,0202 0,0910 - -
159 0,0197 0,0538 -
160 0,0218 0,1121 - - -
161 0,0256 0,0729 0,0374 - -
162 0,0389 0,0610 0,0927 - -
163 0,0173 0,0657 0,0158 -
164 0,0197 0,0708 0,0191 - -
165 0,0176 0,1204 0,0181 - -
166 0,0180 0,0486 0,0230 -
167 0,0110 0,0315 0,0130 - -
168 0,0198 0,0451 0,0281 - -
169 0,0065 0,0178 0,0102 - -
170 0,0210 0,0578 0,0237 - -
171 0,0147 0,0411 - - -
172 0,0230 0,0458 - - -
173 0,0232 0,0899 - -
174 0,0155 0,0844 - -
- 199 030481
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
соединения
175 0,0133 0,0376 0,0296 - -
176 0,0102 0,0364 0,0286 -
177 0,0276 0,1129 0,1499 - -
178 0,0058 0,0157 0,0205 - -
179 0,0159 0,0629 0,0573 - -
180 0,0049 0,0147 - -
181 0,0047 0,0279 - - -
182 0,01161 0,0735 0,03227 - *
183 0,01348 0,08768 0,03943 - -
184 0,01977 0,10057 0,04732 - -
185 0,01421 0,03518 0,02442 - -
186 0,11047 0,10652 0,08958 - -
187 0,19316 0,26079 0,18533 - -
188 0,27493 1,23016 1,53507 -
189 0,10809 1,47313 0,47825 - -
190 0,12394 0,15596 0,35151 -
191 0,0504 0,10664 0,15195 -
192 0,21645 0,17268 0,45873 - -
193 0,0284 0,09512 0,06882 - -
194 0,01446 0,02273 0,03525 - -
195 0,01444 0,05169 0,0356 - -
196 0,14877 0,11139 0,41502 - -
197 0,00827 0,01065 0,01563 - -
198 10 8,53693 10 - -
199 0,01683 0,03653 0,03833 - -
200 0,01152 0,04163 0,01623 -
201 0,02286 0,13436 0,03183
202 0,01266 0,06637 0,02686 - -
203 0,02837 0,03683 0,08436 - -
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARMI
соединения
204 0,01837 0,06361 0,05164 - -
205 0,01283 0,07151 0,01537 - -
206 0,01946 0,2066 0,02894 - -
207 0,00568 0,01846 0,00913 - -
208 0,00694 0,04527 0,01276 - -
209 0,02776 0,05208 0,04385 - -
210 0,01313 0,03166 0,02286 - -
211 0,00828 0,01138 0,01002 - -
212 0,00557 0,01357 0,00828 - -
213 0,05388 0,09132 0,16503 - -
214 0,01978 0,05049 0,02743 - -
215 0,01406 0,0306 0,02297 - -
216 0,01208 0,0205 0,01779 - -
217 0,03018 0,03404 0,05952 - -
218 0,0417 0,03035 0,06702 - -
219 0,00896 0,03189 0,01499
220 0,00929 0,01841 0,01294 - -
221 0,00644 0,01915 0,01545 -
222 0,04299 0,02131 0,09002 - -
223 0,00665 0,01575 0,00865 - -
224 0,00927 0,01805 0,01018 - -
225 0,00762 0,01164 0,01389 - -
226 0,03311 0,04149 0,05758 - -
227 0,0168 0,01782 0,03576 - -
228 0,069 0,01848 0,10005 -
229 0,01084 0,02912 0,01595 - -
230 0,01346 0,02307 0,02574 - -
231 0,00649 0,01474 0,00932 - -
232 0,00911 0,01937 0,02101 - -
- 200 030481
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
233 0,02075 0,04787 0,04267 - -
234 0,01611 0,08411 0,04276 - -
235 0,02571 0,03408 0,04404 - -
236 0,02903 0,06239 0,05783 - -
237 0,04219 0,04098 0,08329 - -
238 0,0296 0,05387 0,08009 - -
239 0,00655 0,00775 0,01319 - -
240 0,0061 0,00672 0,01091 - -
241 0,0224 0,03276 0,04894 - -
242 0,02834 0,04166 0,08368 - -
243 0,03244 0,01514 0,07082 - -
244 0,03978 0,05482 0,11313 - -
245 0,01854 0,06216 0,01834 - -
246 0,01258 0,0283 0,02378 - -
247 0,01107 0,02018 0,01644 - -
248 0,01319 0,03262 0,02818 - -
249 0,02419 0,08278 0,08453 - -
250 0,02396 0,01435 0,04241 - -
251 0,01305 0,01711 0,02073 - -
252 0,03086 0,04826 0,05152 - -
253 0,00715 0,01335 0,01168 - -
254 0,01728 0,01764 0,044 - -
255 0,01016 0,02765 0,02448 - -
256 0,02367 0,03851 0,04405 - -
257 0,02982 0,15318 0,03096 - -
258 0,00759 0,01798 0,01083 - -
259 0,01579 0,0331 0,01706 - -
260 0,02021 0,08314 0,03733 - -
261 0,013 0,03165 0,01668 - -
Таблица 2а. Биохимическая IC50 (количественное, мкМ)*
№ соединения PRMT1 PRMT6 PRMT8 PRMT3 CARM1
262 0,03373 0,0812 0,07236 - -
263 0,01915 0,0638 0,03513 - -
264 0,07798 0,1327 0,18082 - -
265 0,05883 0,17447 0,17058 - -
266 0,0193 0,07899 0,0631 - -
267 3,4983 10 5,91407 - -
268 0,06863 ' 0,14146 0,20985 - -
269 0,05127 0,10664 0,15456 - -
270 0,06247 0,14863 0,20383 - -
271 0,03706 0,1208 0,10019 - -
272 0,01236 0,07387 0,02578 - -
273 0,01145 0,04045 0,02257 -
274 0,00819 0,10255 0,01193 - -
275 0,00462 0,01859 0,01038 - -
* В табл. 2а количественные значения представляют данные одного эксперимента или среднее значение нескольких экспериментов.
Анализ метилирования RKO
Адгезивные клетки RKO закупали у АТСС (Американская коллекция типовых культур), Манассас, Вайоминг, США. Среду RPMI/Glutamax, пенициллин-стрептомицин, термоинактивированную фетальную бычью сыворотку и D-PBS закупали у Life Technologies, Грэнд Айленд, Нью-Йорк, США. Блокирующий буфер Odyssey, антитело козы к IgG кролика (H+L) 800CW и инфракрасный сканер Licor Odyssey закупали у от Licor Biosciences, Линкольн, Небраска, США. Антитело к монометилированному арги- 201 030481
нину закупали у Cell Signaling Technology, Денвере, Массачусетс, США. Метанол закупали у VWR, Френклин, Массачусетс, США. 10% Tween 20 закупали у KPL, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд, США. DRAQ5 закупали у Biostatus Limited, Лестершир, Соединенное Королевство.
Адгезивные клетки RKO поддерживали в ростовой среде (среда DMEM/Glutamax, дополненная 10% объем/объем термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой и 100 единицами/мл пенициллина-стрептомицина) и культивировали при 37°C в 5% CO2.
Обработка клеток, анализ In Cell Western (ICW) для выявления содержания монометиларгинина и ДНК. Клетки Z-138 высевали в аналитическую среду при концентрации 20000 клеток на мл в 384луночный планшет, покрытый поли-d-лизином, для клеточной культуры при 50 мкл на лунку. Соединение (100 нл) из 96-луночного исходного планшета добавляли непосредственно в 384-луночный планшет с клетками. Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 72 ч. После трех дней инкубации планшеты выдерживали при комнатной температуре вне термостата в течение десяти мин и клеточную среду удаляли путем выятряхивания на бумажные полотенца. 50 мкл ледяного 100% метанола добавляли непосредственно в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Через 30 мин планшеты переносили в устройство для промывания планшетов Biotek 405 и 2 раза промывали 100 мкл на лунку буфером для промывания (1X PBS). Затем в каждый планшет добавляли 60 мкл на лунку блокирующего буфера Odyssey (буфер Odyssey с 0,1% Tween 20 (об./об.))и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Блокирующий буфер удаляли и добавляли 20 мкл на лунку первичного антитела (к монометилированному аргинину, разбавленного 1:200 буфером Odyssey с 0,1% Tween 20 (объем/объем)) и планшеты инкубировали в течение ночи (16 ч) при 4°C. Планшеты 5 раз промывали 100 мкл на лунку буфера для промывания. Затем добавляли 20 мкл на лунку вторичного антитела (1:200 антитела козы к IgG кролика (Н+L) 800CW, 1:1000 DRAQ5 (Biostatus limited) в буфере Odyssey с 0,1% Tween 20 (объем/объем)) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты 5 раз промывали 100 мкл на лунку буфера для промывания, затем 2 раза 100 мкл на лунку воды. Обеспечивали высыхание планшетов при комнатной температуре, затем получали изображения на устройстве Licor Odyssey, которое измеряет интенсивность встраивания при длинах волн 700 нм и 800 нм. Сканировали каналы и 700, и 800.
Расчеты
Сначала определяли отношение для каждой лунки с помощью:
(монометил-аргинин 800 нм значение^
DRAQ5 700 нм значение J
Каждый планшет имел четырнадцать контрольных лунок, обработанных только DMSO (минимальное активирование), а также четырнадцать контрольных лунок для максимального активирования, обработанных 20 мкМ эталонного соединения (фоновые лунки). Вычисляли среднее значений соотношения для каждого типа контроля и использовали для определения процента активации для каждой тестируемой лунки в планшете. Эталонное соединение серийно разбавляли в три раза с помощью DMSO всего для девяти тестируемых концентраций, начиная с 20 мкМ. Определяли процент ингибирования и строили кривые для IC30 с использованием лунок в трех повторностях на концентрацию соединения.
Процент активации = юо
{ртирцгенпе в отдельном тестов ДМ а5р.131{е)-(отношенио минимальной лвтнвнпети ) (отношен! и.· максимальной актин а ции)- (отношение минимапьнон актииацнн)
Таблица 3. In Cell Western
№ соединения ЕСзо № соединения ЕСзо JVсоединения ЕСзо
9 В 106 А 193 А
10 С 107 - 194 А
21 с 108 В 195 В
22 А 109 А 196 В
23 А 110 А 197 А
24 А 111 А 198 А
25 В 112 - 199 А
26 С 113 В 200 А
27 С 114 - 201 А
28 в 115 А 202 А
29 с 116 В 203 А
30 с 117 - 204 А
31 с 118 В 205 А
32 А 119 А 206 А
33 В 120 А 207 А
34 А 121 - 208 А
35 А 122 А 209 А
36 А 123 А 210 А
37 А 124 А 211 А
38 А 125 А 212 А
- 202 030481
Таблица 3. In Cell Western
№ соединении ЕСзо гп № соединения ЕСзо Ха соединения ЕСзо
39 А 126 А 213 А
40 А 127 А 214 А
41 С 128 А 215 А
42 С 129 А 216 А
43 А 130 - 217 А
44 В 131 - 218
45 А 132 А 219 А
46 А 133 А 220 А
47 - 134 А 221 А
48 А 135 А 222 А
49 - 136 А 223 А
50 А 137 А 224 А
51 А 138 - 225 А
52 - 139 А 226 А
53 А 140 А 227 А
54 А 141 А 228 -
55 А 142 А 229 А
56 - 143 А 230 А
57 А 144 А 231 А
58 - 145 А 232 А
59 - 146 А 233 А
60 А 147 В 234 А
61 А 148 А 235 А
62 А 149 А 236 А
63 А 150 А 237 А
64 - 151 А 238 А
65 А 152 А 239 А
66 - 153 А 240 А
67 Таблица 3.1 № соединения 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 А n Cell Westei ЕС30 А А А А А 154 А 241 А
Ха соединения 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 ЕСзо В А А А А А В В А А А А А А А А В А А С А А А Ха соединения 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 ЕСзо А А А А А А А А А А А А А А А А А
92 А 179 А 266
93 - 180 А 267 -
94 - 181 А 268
95 А 182 А 269 -
96 - 183 А 270 -
- 203 030481
"-" означает, что данные не предоставлены.
В табл. 3 "А" означает ЕС30 <<< 3,00 мкМ, "В" означает ЕС30 3,01-12,00 мкМ и "С" означает EC30 > 12,01 мкМ. _
Таблица За. In Cell Western (количественное, мкМ)*
№ соединения ЕСзо № соединения ЕСзо № соединения ЕСзо
9 5,61 106 0,0227 193 1,43822
10 >20 107 - 194 1,1848
21 >20 108 8,5466 195 4,88623
22 1,24 109 2,4785 196 4,8862
23 1,61 110 2,5472 197 0,40624
24 2,40 111 0,9130 198 0,4062
25 11,83 112 - 199 0,80245
26 >20 113 7,3455 200 0,02034
27 >20 114 - 201 0,15455
28 11,10 115 0,0189 202 0,32701
29 >20 116 8,8958 203 0,3270
30 >20 117 - 204 1,55419
31 >20 118 9,5749 205 0,01445
Таблица За. In Cell Western (количественное, мкМ)*
№ соединения ЕСзо № соединения ЕСзо № соединения ЕСзо
32 2,35 119 0,0773 206 0,07648
33 3,33 120 0,0098 207 0,01212
34 1,15 121 - 208 0,06719
35 0,73 122 0,3455 209 0,91597
36 0,63 123 0,0440 210 0,27952
37 0,26 124 0,0214 211 0,15488
38 0,13 125 0,0876 212 0,43283
39 0,50 126 0,6376 213 0,4328
40 0,87 127 0,0292 214 0,09582
41 >20 128 1,0750 215 0,16359
42 >20 129 0,0045 216 0,11104
43 2,60 130 - 217 0,1110
44 4,57 131 - 218 -
45 0,0540 132 0,0038 219 0,29433
46 0,0080 133 0,0438 220 0,2188
47 0,0520 134 0,0332 221 0,4903
48 0,0140 135 1,0140 222 2,60878
49 0,0500 136 0,0350 223 0,27538
50 0,0270 137 0,0150 224 0,08472
51 0,0520 138 - 225 0,64935
52 0,0410 139 0,6270 226 1,53074
53 0,0170 140 0,1640 227 1,5307
54 0,0870 141 0,1320 228 -
55 0,0630 142 0,0520 229 0,68908
56 0,0960 143 0,0590 230 1,31527
57 0,0250 144 0,0630 231 0,09668
58 0,9780 145 2,3000 232 0,95704
59 0,3570 146 0,1600 233 1,05613
60 2,8410 147 8,6000 234 1,0561
- 204 030481
Таблица За. In Cell Western (количественное, мкМ)*
№ соединения ЕС30 № соединения ЕСзо № соединения ЕСзо
61 0,1490 148 0,0160 235 0,81272
62 0,16924 149 0,1060 236 0,8127
63 1,0852 150 0,2560 237 1,43678
64 - 151 0,7050 238 2,15067
65 0,07752 152 0,1190 239 2,1507
66 - 153 0,1290 240 1,17758
67 0,0810 154 1,7890 241 1,1776
68 - 155 4,0850 242 -
69 - 156 1,3570 243 -
70 0,0500 157 2,4890 244 2,52536
71 - 158 0,0080 245 -
72 - 159 0,0630 246 0,0799
73 - 160 0,1660 247 0,6979
74 - 161 5,0200 248 1,3093
75 - 162 6,6800 249 0,6585
76 - 163 0,0660 250 -
77 - 164 0,0780 251 1,4511
78 - 165 0,5100 252 0,2673
79 • 166 0,0830 253 0,0566
80 - 167 0,0180 254 1,33631
81 - 168 0,0850 255 0,21397
82 - 169 0,0160 256 0,31583
83 - 170 - 257 0,10322
84 - 171 0,1920 258 0,30272
85 - 172 4,4570 259 0,40841
86 0,0168 173 0,4080 260 0,20696
87 2,5254 174 0,0850 261 0,28926
88 - 175 >20 262 0,2893
89 - 176 2,1420 263 -
Таблица За. In Cell Western (количественное, мкМ)*
№ соединения ЕСзо № соединения ЕСзо № соединения ЕСзо
90 0,3158 177 0,5710 264 -
91 2,05655 178 0,0760 265 -
92 2,17333 179 0,4760 266 -
93 - 180 0,0190 267 -
94 - 181 0,1070 268 -
95 0,12166 182 0,41111 269 -
96 - 183 0,31865 270 -
97 - 184 0,45829 271 -
98 - 185 0,45302 272 -
99 - 186 - 273 -
100 187 3,1603 274 0,01681
101 - 188 - 275 0,084
102 - 189 6,62284
103 - 190 6,6228
104 0,01166 191 9,24747
105 - 192 9,2475
* В табл. 3 а количественные значения представляют данные одного эксперимента или среднее значение нескольких экспериментов.
Другие варианты осуществления
Все вышеупомянутое является описанием определенных неограничивающих вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть выполнены различные изменения и модификации настоящего описания без отступления от идеи или объема настоящего изобретения, определенного следующей формулой изобретения.
- 205 030481
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Эпизайм, Инк. Чесуорт, Ричард Мичелл, Лорна Хелен Шапиро, Гидеон
<120> ИНГИБИТОРЫ АРГИНИНМЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> E0501.70011WO00
<140> <141> PCT/US2014/029710 2014-03-14
<150> <151> US 61/876034 2013-09-10
<150> <151> US 61/781,051 2013-03-14
<160> 17
<170> PatentIn версия 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический полипептид
<220> <221> <222> <223> Иные_характеристики (1)..(1) Xaa представляет собой Acp
<400> 1
Xaa Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Gly Leu Ile 1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 2 8 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический полипептид
<400> 2
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> <211> <212> <213> 3 230 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 206 030481
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 3
Met 1 Ser Pro Ile Leu Gly Tyr 5 Trp Lys Ile 10 Lys Gly Leu Val Gln 15 Pro
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Glu Asn Leu Tyr
210 215 220
Phe Gln Gly Gly Asn Ser
225 230
- 207
030481
<210> 4
<211> 609
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 4
Met 1 Ser Pro Ile Leu 5 Gly Tyr Trp
Thr Arg Leu Leu 20 Leu Glu Tyr Leu
Tyr Glu Arg 35 Asp Glu Gly Asp Lys 40
Gly Leu 50 Glu Phe Pro Asn Leu 55 Pro
Leu 65 Thr Gln Ser Met Ala 70 Ile Ile
Met Leu Gly Gly Cys 85 Pro Lys Glu
Gly Ala Val Leu 100 Asp Ile Arg Tyr
Lys Asp Phe 115 Glu Thr Leu Lys Val 120
Met Leu 130 Lys Met Phe Glu Asp 135 Arg
Gly 145 Asp His Val Thr His 150 Pro Asp
Val Val Leu Tyr Met 165 Asp Pro Met
Val Cys Phe Lys 180 Lys Arg Ile Glu
Leu Lys Ser 195 Ser Lys Tyr Ile Ala 200
Lys Ile 10 Lys Gly Leu Val Gln 15 Pro
Glu 25 Glu Lys Tyr Glu Glu 30 His Leu
Trp Arg Asn Lys Lys 45 Phe Glu Leu
Tyr Tyr Ile Asp 60 Gly Asp Val Lys
Arg Tyr Ile 75 Ala Asp Lys His Asn 80
Arg Ala 90 Glu Ile Ser Met Leu 95 Glu
Gly 105 Val Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser
Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu
Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn
Phe Met Leu 155 Tyr Asp Ala Leu Asp 160
Cys Leu 170 Asp Ala Phe Pro Lys 175 Leu
Ala 185 Ile Pro Gln Ile Asp 190 Lys Tyr
Trp Pro Leu Gln Gly 205 Trp Gln Ala
- 208
030481
Thr Phe 210 Gly Gly Gly Asp His 215 Pro Pro Lys Ser Asp 220 Glu Asn Leu Tyr
Phe Gln Gly Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala
225 230 235 240
Ala Ala Glu Ala Ala Asn Cys Ile Met Glu Asn Phe Val Ala Thr Leu
245 250 255
Ala Asn Gly Met Ser Leu Gln Pro Pro Leu Glu Glu Val Ser Cys Gly
260 265 270
Gln Ala Glu Ser Ser Glu Lys Pro Asn Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys
275 280 285
Asp Tyr Tyr Phe Asp Ser Tyr Ala His Phe Gly Ile His Glu Glu Met
290 295 300
Leu Lys Asp Glu Val Arg Thr Leu Thr Tyr Arg Asn Ser Met Phe His
305 310 315 320
Asn Arg His Leu Phe Lys Asp Lys Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly
325 330 335
Thr Gly Ile Leu Cys Met Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val
340 345 350
Ile Gly Ile Glu Cys Ser Ser Ile Ser Asp Tyr Ala Val Lys Ile Val
355 360 365
Lys Ala Asn Lys Leu Asp His Val Val Thr Ile Ile Lys Gly Lys Val
370 375 380
Glu Glu Val Glu Leu Pro Val Glu Lys Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu
385 390 395 400
Trp Met Gly Tyr Cys Leu Phe Tyr Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Leu
405 410 415
Tyr Ala Arg Asp Lys Trp Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Phe Pro Asp
420 425 430
Arg Ala Thr Leu Tyr Val Thr Ala Ile Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp
435 440 445
Tyr Lys Ile His Trp Trp Glu Asn Val Tyr Gly Phe Asp Met Ser Cys
450 455 460
- 209
030481
Ile 465 Lys Asp Val Ala Ile 470 Lys Glu Pro Leu Val 475 Asp Val Val Asp Pro 480
Lys Gln Leu Val Thr Asn Ala Cys Leu Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr
485 490 495
Thr Val Lys Val Glu Asp Leu Thr Phe Thr Ser Pro Phe Cys Leu Gln
500 505 510
Val Lys Arg Asn Asp Tyr Val His Ala Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile
515 520 525
Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Arg Thr Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu
530 535 540
Ser Pro Tyr Thr His Trp Lys Gln Thr Val Phe Tyr Met Glu Asp Tyr
545 550 555 560
Leu Thr Val Lys Thr Gly Glu Glu Ile Phe Gly Thr Ile Gly Met Arg
565 570 575
Pro Asn Ala Lys Asn Asn Arg Asp Leu Asp Phe Thr Ile Asp Leu Asp
580 585 590
Phe Lys Gly Gln Leu Cys Glu Leu Ser Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met
595 600 605
Arg
<210> 5
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<220>
<221> Иные_характеристики
<222> (1)..(1)
<223> Xaa представляет собой Acp
<400> 5
Xaa Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Gly Leu Ile 1 5 10 15
<210> 6
- 2Ю
030481
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 6
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 7
<211> 389
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 7
Met 1 Asp Tyr Lys Asp 5 Asp Asp Asp
Leu Glu Ser Gly 20 Gly Gly Gly Glu
Asp Gly Ala 35 Glu Arg Glu Ala Ala 40
Arg Glu 50 Arg Asp Gln Leu Tyr 55 Tyr
His 65 Glu Glu Met Ile Ala 70 Asp Arg
Gly Ile Leu Arg Asn 85 Trp Ala Ala
Val Gly Ala Gly 100 Thr Gly Ile Leu
Ala Arg Arg 115 Val Tyr Ala Val Glu 120
Arg Glu 130 Val Val Arg Phe Asn 135 Gly
Pro 145 Gly Pro Val Glu Thr 150 Val Glu
Lys Ser 10 Gln Pro Lys Lys Arg 15 Lys
Gly 25 Gly Glu Gly Thr Glu 30 Glu Glu
Leu Glu Arg Pro Arg 45 Arg Thr Lys
Glu Cys Tyr Ser 60 Asp Val Ser Val
Val Arg Thr 75 Asp Ala Tyr Arg Leu 80
Leu Arg 90 Gly Lys Thr Val Leu 95 Asp
Ser 105 Ile Phe Cys Ala Gln 110 Ala Gly
Ala Ser Ala Ile Trp 125 Gln Gln Ala
Leu Glu Asp Arg 140 Val His Val Leu
Leu Pro Glu 155 Gln Val Asp Ala Ile 160
- 211
030481
Val Ser Glu Trp Met 165 Gly Tyr Gly Leu Leu 170 His Glu Ser Met Leu 175 Ser
Ser Val Leu His Ala Arg Thr Lys Trp Leu Lys Glu Gly Gly Leu Leu
180 185 190
Leu Pro Ala Ser Ala Glu Leu Phe Ile Ala Pro Ile Ser Asp Gln Met
195 200 205
Leu Glu Trp Arg Leu Gly Phe Trp Ser Gln Val Lys Gln His Tyr Gly
210 215 220
Val Asp Met Ser Cys Leu Glu Gly Phe Ala Thr Arg Cys Leu Met Gly
225 230 235 240
His Ser Glu Ile Val Val Gln Gly Leu Ser Gly Glu Asp Val Leu Ala
245 250 255
Arg Pro Gln Arg Phe Ala Gln Leu Glu Leu Ser Arg Ala Gly Leu Glu
260 265 270
Gln Glu Leu Glu Ala Gly Val Gly Gly Arg Phe Arg Cys Ser Cys Tyr
275 280 285
Gly Ser Ala Pro Met His Gly Phe Ala Ile Trp Phe Gln Val Thr Phe
290 295 300
Pro Gly Gly Glu Ser Glu Lys Pro Leu Val Leu Ser Thr Ser Pro Phe
305 310 315 320
His Pro Ala Thr His Trp Lys Gln Ala Leu Leu Tyr Leu Asn Glu Pro
325 330 335
Val Gln Val Glu Gln Asp Thr Asp Val Ser Gly Glu Ile Thr Leu Leu
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Asn Pro Arg Arg Leu Arg Val Leu Leu Arg Tyr Lys
355 360 365
Val Gly Asp Gln Glu Glu Lys Thr Lys Asp Phe Ala Met Glu Asp His
370 375 380
His His His His His
<210> 8 <211> 16 <212> БЕЛОК
385
- 212
030481
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<220>
<221> Иные_характеристики
<222> (1)..(1)
<223> Xaa представляет собой Acp
<400> 8
Xaa Lys Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg 1 5 10 15
<210> 9
<211> 229
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 9
Met 1 Ser Pro Ile Leu 5 Gly Tyr Trp
Thr Arg Leu Leu 20 Leu Glu Tyr Leu
Tyr Glu Arg 35 Asp Glu Gly Asp Lys 40
Gly Leu 50 Glu Phe Pro Asn Leu 55 Pro
Leu 65 Thr Gln Ser Met Ala 70 Ile Ile
Met Leu Gly Gly Cys 85 Pro Lys Glu
Gly Ala Val Leu 100 Asp Ile Arg Tyr
Lys Asp Phe 115 Glu Thr Leu Lys Val 120
Met Leu 130 Lys Met Phe Glu Asp 135 Arg
Lys Ile 10 Lys Gly Leu Val Gln 15 Pro
Glu 25 Glu Lys Tyr Glu Glu 30 His Leu
Trp Arg Asn Lys Lys 45 Phe Glu Leu
Tyr Tyr Ile Asp 60 Gly Asp Val Lys
Arg Tyr Ile 75 Ala Asp Lys His Asn 80
Arg Ala 90 Glu Ile Ser Met Leu 95 Glu
Gly 105 Val Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser
Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu
Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn
- 213
030481
Gly Asp 145 His Val Thr His 150 Pro Asp Phe Met Leu 155 Tyr Asp Ala Leu Asp 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Pro Glu Phe
225
<210> 10
<211> 623
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 10
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
- 214
030481
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Pro Glu Phe Met Gly Met Lys His Ser Ser Arg Cys Leu Leu
225 230 235 240
Leu Arg Arg Lys Met Ala Glu Asn Ala Ala Glu Ser Thr Glu Val Asn
245 250 255
Ser Pro Pro Ser Gln Pro Pro Gln Pro Val Val Pro Ala Lys Pro Val
260 265 270
Gln Cys Val His His Val Ser Thr Gln Pro Ser Cys Pro Gly Arg Gly
275 280 285
Lys Met Ser Lys Leu Leu Asn Pro Glu Glu Met Thr Ser Arg Asp Tyr
290 295 300
Tyr Phe Asp Ser Tyr Ala His Phe Gly Ile His Glu Glu Met Leu Lys
305 310 315 320
Asp Glu Val Arg Thr Leu Thr Tyr Arg Asn Ser Met Tyr His Asn Lys
325 330 335
His Val Phe Lys Asp Lys Val Val Leu Asp Val Gly Ser Gly Thr Gly
340 345 350
Ile Leu Ser Met Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Lys Lys Val Phe Gly
355 360 365
- 215
030481
Ile Glu 370 Cys Ser Ser Ile Ser Asp 375 Tyr Ser Glu Lys 380 Ile Ile Lys Ala
Asn His Leu Asp Asn Ile Ile Thr Ile Phe Lys Gly Lys Val Glu Glu
385 390 395 400
Val Glu Leu Pro Val Glu Lys Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu Trp Met
405 410 415
Gly Tyr Cys Leu Phe Tyr Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Ile Phe Ala
420 425 430
Arg Asp Lys Trp Leu Lys Pro Gly Gly Leu Met Phe Pro Asp Arg Ala
435 440 445
Ala Leu Tyr Val Val Ala Ile Glu Asp Arg Gln Tyr Lys Asp Phe Lys
450 455 460
Ile His Trp Trp Glu Asn Val Tyr Gly Phe Asp Met Thr Cys Ile Arg
465 470 475 480
Asp Val Ala Met Lys Glu Pro Leu Val Asp Ile Val Asp Pro Lys Gln
485 490 495
Val Val Thr Asn Ala Cys Leu Ile Lys Glu Val Asp Ile Tyr Thr Val
500 505 510
Lys Thr Glu Glu Leu Ser Phe Thr Ser Ala Phe Cys Leu Gln Ile Gln
515 520 525
Arg Asn Asp Tyr Val His Ala Leu Val Thr Tyr Phe Asn Ile Glu Phe
530 535 540
Thr Lys Cys His Lys Lys Met Gly Phe Ser Thr Ala Pro Asp Ala Pro
545 550 555 560
Tyr Thr His Trp Lys Gln Thr Val Phe Tyr Leu Glu Asp Tyr Leu Thr
565 570 575
Val Arg Arg Gly Glu Glu Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Met Lys Pro Asn
580 585 590
Ala Lys Asn Val Arg Asp Leu Asp Phe Thr Val Asp Leu Asp Phe Lys
595 600 605
Gly Gln Leu Cys Glu Thr Ser Val Ser Asn Asp Tyr Lys Met Arg
610 615 620
- 216
030481
<210> 11
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<220>
<221> Иные_характеристики
<222> (1)..(1)
<223> Xaa представляет собой Acp
<400> 11
Xaa Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg 1 5 10 15
Gly Gly Phe Gly 20
<210> 12
<211> 226
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 12
Met 1 Ser Pro Ile Leu Gly 5 Tyr Trp Lys Ile 10 Lys Gly Leu Val Gln 15 Pro
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
- 217
030481
Lys Asp Phe 115 Glu Thr Leu Lys Val 120 Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu
Met Leu 130 Lys Met Phe Glu Asp 135 Arg Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn
Gly 145 Asp His Val Thr His 150 Pro Asp Phe Met Leu 155 Tyr Asp Ala Leu Asp 160
Val Val Leu Tyr Met 165 Asp Pro Met Cys Leu 170 Asp Ala Phe Pro Lys 175 Leu
Val Cys Phe Lys 180 Lys Arg Ile Glu Ala 185 Ile Pro Gln Ile Asp 190 Lys Tyr
Leu Lys Ser 195 Ser Lys Tyr Ile Ala 200 Trp Pro Leu Gln Gly 205 Trp Gln Ala
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser 225
<210> 13
<211> 756
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 13
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
- 2J8
030481
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp 100 Ile Arg Tyr Gly 105 Val Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Cys Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Ala Val
225 230 235 240
Glu Asn Glu Glu Asp Leu Pro Glu Leu Ser Asp Ser Gly Asp Glu Ala
245 250 255
Ala Trp Glu Asp Glu Asp Asp Ala Asp Leu Pro His Gly Lys Gln Gln
260 265 270
Thr Pro Cys Leu Phe Cys Asn Arg Leu Phe Thr Ser Ala Glu Glu Thr
275 280 285
Phe Ser His Cys Lys Ser Glu His Gln Phe Asn Ile Asp Ser Met Val
290 295 300
His Lys His Gly Leu Glu Phe Tyr Gly Tyr Ile Lys Leu Ile Asn Phe
305 310 315 320
Ile Arg Leu Lys Asn Pro Thr Val Glu Tyr Met Asn Ser Ile Tyr Asn
325 330 335
- 219
030481
Pro Val Pro Trp 340 Glu Lys Glu Glu Tyr 345 Leu Lys Pro Val Leu 350 Glu Asp
Asp Leu Leu Leu Gln Phe Asp Val Glu Asp Leu Tyr Glu Pro Val Ser
355 360 365
Val Pro Phe Ser Tyr Pro Asn Gly Leu Ser Glu Asn Thr Ser Val Val
370 375 380
Glu Lys Leu Lys His Met Glu Ala Arg Ala Leu Ser Ala Glu Ala Ala
385 390 395 400
Leu Ala Arg Ala Arg Glu Asp Leu Gln Lys Met Lys Gln Phe Ala Gln
405 410 415
Asp Phe Val Met His Thr Asp Val Arg Thr Cys Ser Ser Ser Thr Ser
420 425 430
Val Ile Ala Asp Leu Gln Glu Asp Glu Asp Gly Val Tyr Phe Ser Ser
435 440 445
Tyr Gly His Tyr Gly Ile His Glu Glu Met Leu Lys Asp Lys Ile Arg
450 455 460
Thr Glu Ser Tyr Arg Asp Phe Ile Tyr Gln Asn Pro His Ile Phe Lys
465 470 475 480
Asp Lys Val Val Leu Asp Val Gly Cys Gly Thr Gly Ile Leu Ser Met
485 490 495
Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Lys Lys Val Leu Gly Val Asp Gln Ser
500 505 510
Glu Ile Leu Tyr Gln Ala Met Asp Ile Ile Arg Leu Asn Lys Leu Glu
515 520 525
Asp Thr Ile Thr Leu Ile Lys Gly Lys Ile Glu Glu Val His Leu Pro
530 535 540
Val Glu Lys Val Asp Val Ile Ile Ser Glu Trp Met Gly Tyr Phe Leu
545 550 555 560
Leu Phe Glu Ser Met Leu Asp Ser Val Leu Tyr Ala Lys Asn Lys Tyr
565 570 575
Leu Ala Lys Gly Gly Ser Val Tyr Pro Asp Ile Cys Thr Ile Ser Leu
580 585 590
- 220
030481
Val Ala Val 595 Ser Asp Val Asn Lys 600 His Ala Asp Arg Ile 605 Ala Phe Trp
Asp Asp Val Tyr Gly Phe Lys Met Ser Cys Met Lys Lys Ala Val Ile
610 615 620
Pro Glu Ala Val Val Glu Val Leu Asp Pro Lys Thr Leu Ile Ser Glu
625 630 635 640
Pro Cys Gly Ile Lys His Ile Asp Cys His Thr Thr Ser Ile Ser Asp
645 650 655
Leu Glu Phe Ser Ser Asp Phe Thr Leu Lys Ile Thr Arg Thr Ser Met
660 665 670
Cys Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Phe Asp Ile Tyr Phe Glu Lys Asn Cys
675 680 685
His Asn Arg Val Val Phe Ser Thr Gly Pro Gln Ser Thr Lys Thr His
690 695 700
Trp Lys Gln Thr Val Phe Leu Leu Glu Lys Pro Phe Ser Val Lys Ala
705 710 715 720
Gly Glu Ala Leu Lys Gly Lys Val Thr Val His Lys Asn Lys Lys Asp
725 730 735
Pro Arg Ser Leu Thr Val Thr Leu Thr Leu Asn Asn Ser Thr Gln Thr
740 745 750
Tyr Gly Leu Gln 755
<210> 14
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<220>
<221> Иные_характеристики
<222> (1). .(1)
<223> Xaa представляет собой Acp
<400> 14
Xaa Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro
1 5 10 15
- 221
030481
<210> 15
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 15
Glu Gly His His His His His His 1 5
<210> 16
<211> 601
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 16
Met 1 Asp Tyr Lys Asp 5 Asp Asp Asp
Gly Pro Gly Ala 20 Gly Gly Ala Gly
Pro Cys Ala 35 Thr Val Ser Val Phe 40
Gly Asp 50 Ala Asn Gly Glu Ile 55 Gln
Arg 65 Leu Glu Val Arg Ala 70 Gly Pro
Ser His Glu Asp Val 85 Cys Val Phe
Glu Cys Ser Arg 100 Val Gly Lys Gln
Asn Ser Val 115 Leu Ile Gln Phe Ala 120
Tyr Asn 130 Ile Leu Lys Thr Cys 135 Arg
Phe 145 Ser Glu Arg Thr Glu 150 Glu Ser
Lys Ala 10 Ala Ala Ala Ala Ala 15 Val
Ser 25 Ala Val Pro Gly Gly 30 Ala Gly
Pro Gly Ala Arg Leu 45 Leu Thr Ile
Arg His Ala Glu 60 Gln Gln Ala Leu
Asp Ser Ala 75 Gly Ile Ala Leu Tyr 80
Lys Cys 90 Ser Val Ser Arg Glu 95 Thr
Ser 105 Phe Ile Ile Thr Leu 110 Gly Cys
Thr Pro Asn Asp Phe 125 Cys Ser Phe
Gly His Thr Leu 140 Glu Arg Ser Val
Ser Ala Val 155 Gln Tyr Phe Gln Phe 160
- 222
030481
Tyr Gly Tyr Leu Ser Gln Gln Gln Asn Met Met Gln Asp Tyr Val 175 Arg
165 170
Thr Gly Thr Tyr Gln Arg Ala Ile Leu Gln Asn His Thr Asp Phe Lys
180 185 190
Asp Lys Ile Val Leu Asp Val Gly Cys Gly Ser Gly Ile Leu Ser Phe
195 200 205
Phe Ala Ala Gln Ala Gly Ala Arg Lys Ile Tyr Ala Val Glu Ala Ser
210 215 220
Thr Met Ala Gln His Ala Glu Val Leu Val Lys Ser Asn Asn Leu Thr
225 230 235 240
Asp Arg Ile Val Val Ile Pro Gly Lys Val Glu Glu Val Ser Leu Pro
245 250 255
Glu Gln Val Asp Ile Ile Ile Ser Glu Pro Met Gly Tyr Met Leu Phe
260 265 270
Asn Glu Arg Met Leu Glu Ser Tyr Leu His Ala Lys Lys Tyr Leu Lys
275 280 285
Pro Ser Gly Asn Met Phe Pro Thr Ile Gly Asp Val His Leu Ala Pro
290 295 300
Phe Thr Asp Glu Gln Leu Tyr Met Glu Gln Phe Thr Lys Ala Asn Phe
305 310 315 320
Trp Tyr Gln Pro Ser Phe His Gly Val Asp Leu Ser Ala Leu Arg Gly
325 330 335
Ala Ala Val Asp Glu Tyr Phe Arg Gln Pro Val Val Asp Thr Phe Asp
340 345 350
Ile Arg Ile Leu Met Ala Lys Ser Val Lys Tyr Thr Val Asn Phe Leu
355 360 365
Glu Ala Lys Glu Gly Asp Leu His Arg Ile Glu Ile Pro Phe Lys Phe
370 375 380
His Met Leu His Ser Gly Leu Val His Gly Leu Ala Phe Trp Phe Asp
385 390 395 400
Val Ala Phe Ile Gly Ser Ile Met Thr Val Trp Leu Ser Thr Ala Pro
- 223
030481
405 410 415
Thr Glu Pro Leu Thr His Trp Tyr Gln Val Arg Cys Leu Phe Gln Ser
420 425 430
Pro Leu Phe Ala Lys Ala Gly Asp Thr Leu Ser Gly Thr Cys Leu Leu
435 440 445
Ile Ala Asn Lys Arg Gln Ser Tyr Asp Ile Ser Ile Val Ala Gln Val
450 455 460
Asp Gln Thr Gly Ser Lys Ser Ser Asn Leu Leu Asp Leu Lys Asn Pro
465 470 475 480
Phe Phe Arg Tyr Thr Gly Thr Thr Pro Ser Pro Pro Pro Gly Ser His
485 490 495
Tyr Thr Ser Pro Ser Glu Asn Met Trp Asn Thr Gly Ser Thr Tyr Asn
500 505 510
Leu Ser Ser Gly Met Ala Val Ala Gly Met Pro Thr Ala Tyr Asp Leu
515 520 525
Ser Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Ser Val Gly His Asn Asn Leu Ile
530 535 540
Pro Leu Gly Ser Ser Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Ser
545 550 555 560
Ala His Tyr Ala Val Asn Ser Gln Phe Thr Met Gly Gly Pro Ala Ile
565 570 575
Ser Met Ala Ser Pro Met Ser Ile Pro Thr Asn Thr Met His Tyr Gly
580 585 590
Ser Glu Gly His His His His His His
595 600
<210> 17
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 17
His His His His His His 1 5
- 224
030481
Соединение формулы (I)

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    или его фармацевтически приемлемая соль,
    где X представляет собой N, Z представляет собой NR4 и Y представляет собой CR5; или
    X представляет собой NR4, Z представляет собой N и Y представляет собой CR5; или
    X представляет собой CR5, Z представляет собой NR4 и Y представляет собой N; или
    X представляет собой CR5, Z представляет собой N и Y представляет собой NR4;
    Rx представляет собой С^алкил или C3-4циклоалкил;
    LJ представляет собой связь или насыщенную или ненасыщенную CJ-6 углеводородную цепь;
    RW представляет собой карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, при условии, что, если LJ представляет собой связь, RW не представляет собой арил или гетероарил, где карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, -CN, -ОН, -ORaa, -N(Rbb)2, -C(=O)Raa, -CO2H, -CHO, -CO2Raa, -OC(=O)Raa, -OCO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -OC(=O)N(Rbb)2, -NRbbC(=O)Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC(=O)N(Rbb)2, С^алкила, CJ-6пергалогеналкила, ^^алкенила, ^^алкинила, C3-6карбоциклила, 3-6-членного гетероциклила, фенила и 5-6-членного гетероарила, или два атома водорода, присоединенных к одному атому углерода, замещены группой =O, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, фенил и гетероарил независимо замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rdd;
    R3 представляет собой водород, С^алкил или C3-4циклоалкил;
    R4 представляет собой водород, С^алкил или C3-4циклоалкил;
    R5 представляет собой водород, С^алкил или C3-4циклоалкил;
    Raa в каждом случае независимо выбран из CJ-балкила, CJ-бпергалогеналкила, ^^алкенила, Щ-6алкинила, C3-бкарбоциклила, 3-6-членного гетероциклила, фенила и 5-6-членного гетероарила, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетроциклил и гетроарил независимо замещен 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rdd;
    Rbb в каждом случае независимо выбран из водорода, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, С^алкила, С^пергалогеналкила, ^^алкенила, ^^алкинила, C3-бкарбоциклила, 3-6-членного гетероциклила, фенила и 5-6-членного гетероарила или две группы Rbb соединены вместе с образованием 3-6-членного гетроциклического или 5-6-членного гетероарильного кольца, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rdd;
    Rcc в каждом случае независимо выбран из водорода, CJ-балкила, CJ-бпергалогеналкила, Щ-6алкенила, ^^алкинила, C3-бкарбоциклила, 3-6-членного гетероциклила, фенила и 5-6-членного гетероарила, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, фенил и гетероарил независимо замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rdd;
    Rdd в каждом случае независимо выбран из галогена, -CN, -NO2, -N3, -ОН, -ORee, -N(Rff)2, -C(=O)Ree, -CO2H, -CO2Ree, -OC(=O)Ree, -OCO2Ree, -C(=O)N(Rff)2, -OC(=O)N(Rff)2, -NRffC(=O)Ree, -NRffCO2Ree, -NRffC(=O)N(Rff)2, CJ-балкила, CJ-бпергалогеналкила, ^^алкенила, Щ^кинила, C3-Joкарбоциклила, 3-J0членного гетероциклила, ^.^арила и 5-Ю-членного гетероарила или две группы Rdd, присоединенные к одному атому углерода, замещены группой =O, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил независимо замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rgg;
    Ree в каждом случае независимо выбран из С^алкила, CJ-бпергалогеналкила, ^^алкенила, (';-6;υкинила, C3-бкарбоциклила, 3-6-членного гетероциклила, фенила и 5-6-членного гетероарила, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, фенил и гетероарил независимо замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rgg;
    Rff в каждом случае независимо выбран из ^^алкила, CJ-бпергалогеналкила, ^^алкенила, C2-6 алкинила, C3-бкарбоциклила, 3-6-членного гетероциклила, фенила и 5-6-членного гетероарила, где каждый алкил, алкенил, алкинил, карбоциклил, гетероциклил, фенил и гетероарил независимо замещены 0, J, 2, 3, 4 или 5 группами Rgg;
    Rgg в каждом случае независимо выбран из галогена, -ОН, -OCJ-балкила, -C(=O)(CJ-балкила), -CO2(CJ-балкила), -OC(=O)(CJ-балкила), ^^алкила, С^пергалогеналкила, ^^алкенила и Щ^кинила или две группы Rgg, присоединенные к одному атому углерода, замещены группой =O;
    где, если не указано иное,
    гетероциклил или гетероциклический относится к радикалу 3-J4-членной неароматической кольце- 225 030481
    вой системы с кольцевыми атомами углерода и 1-4 кольцевыми гетероатомами, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы;
    карбоциклил или карбоциклический относится к радикалу неароматической циклической углеводородной группы с 3-14 кольцевыми атомами углерода и без гетероатомов в неароматической кольцевой системе;
    арил относится к радикалу моноциклической или полициклической ароматической кольцевой системы с 6-14 кольцевыми атомами углерода и без гетероатомов в ароматической кольцевой системе;
    гетероарил относится к радикалу 5-10-членной моноциклической или бициклической 4n+2 ароматической кольцевой системы с кольцевыми атомами углерода и 1-4 кольцевыми гетероатомами в ароматической кольцевой системе, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы.
    2. Соединение по п.1, где соединение характеризуется формулой (II)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    3. Соединение по п.1, где соединение характеризуется формулой (III)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    4. Соединение по п.1, где соединение характеризуется формулой (IV)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    5. Соединение по п.1, где соединение характеризуется формулой (V)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    6. Соединение по любому из пп.1-5, где -L1 представляет собой связь и RW представляет собой необязательно замещенный карбоциклил.
    7. Соединение по п.6, где RW представляет собой необязательно замещенный циклогексил.
    8. Соединение по любому из пп.1-5, где -L1 представляет собой связь и RW представляет собой необязательно замещенный гетероциклил.
    9. Соединение по п.8, где RW представляет собой необязательно замещенный пиперидин.
    10. Соединение по любому из пп.1-5, где L1 представляет собой С1-4алкилен, a RW представляет собой необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил.
    или ее фармацевтически приемлемой солью, где кольцо А представляет собой необязательно заме- 226 030481
    щенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил.
    12. Соединение по п.11, где соединение характеризуется формулой (VI-a)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    13. Соединение по п.12, где соединение характеризуется формулой (VI-b)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    14. Соединение по п.11, где соединение характеризуется формулой (VI-c)
    или ее фармацевтически приемлемой солью.
    15. Соединение по п.11, где соединение характеризуется формулой (VI-i)
    или ее фармацевтически приемлемой солью, где p равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
    16. Соединение по любому из пп.11-15, где кольцо А представляет собой необязательно замещенный гетероарил.
    17. Соединение по любому из пп.11-15, где кольцо А представляет собой необязательно замещенный карбоциклил.
    18. Соединение по любому из пп.11-15, где кольцо А представляет собой необязательно замещенный гетероциклил.
    19. Соединение по любому из пп.11-15, где кольцо А представляет собой необязательно замещенный бициклический карбоциклил.
    20. Соединение по любому из пп.11-15, где кольцо А представляет собой необязательно замещенный бициклический гетероциклил.
    21. Соединение по любому из пп.1-20, где R3 представляет собой водород.
    22. Соединение по любому из пп.1-20, где R3 представляет собой С1-4алкил.
    23. Соединение по п.22, где R3 представляет собой метил, этил, пропил или бутил.
    24. Соединение по любому из пп.1-20, где R3 представляет собой циклопропил или циклобутил.
    25. Соединение по любому из пп.1-24, где R4 представляет собой водород.
    26. Соединение по любому из пп.1-24, где R4 представляет собой С1-6алкил.
    27. Соединение по п.26, где R4 представляет собой метил.
    28. Соединение по любому из пп.1-27, где R5 представляет собой водород.
    29. Соединение по любому из пп.1-27, где R5 представляет собой С1-4алкил.
    30. Соединение по п.29, где R5 представляет собой метил.
    31. Соединение по любому из пп.1-30, где Rx представляет собой С1-4алкил.
    32. Соединение по п.31, где Rx представляет собой метил.
    33. Соединение по п.31, где Rx представляет собой этил.
    34. Соединение по п.31, где Rx представляет собой изопропил.
    35. Соединение по любому из пп.1-30, где Rx представляет собой С3-4пиклоалкил.
    - 227 030481
    36. Соединение по п.35, где Rx представляет собой циклопропил.
    37. Соединение по п.1, где соединение выбрано из группы, состоящей следующих соединений:
    - 228 030481
    - 229 030481
    - 230 030481
    - 231 030481
    - 232 030481
    и их фармацевтически приемлемых солей.
    38. Соединениепо п.1, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:
    - 233 030481
    - 234 030481
    - 235 030481
    - 236 030481
    - 237 030481
    76 Η а "Ύ 1 Χ,Ν Υη 77 °γ> Η 1 С" Υη 78 Η 1 χ% Υη 79 ,Νΐ=Τ ΗΝ J, Ο 1 -ν^νΗ F-Л 80 Η ^ιΥ 1 V-N Υη °\> °Υ) 81 Η /Ύ ^Ί\Υ 1 V" Υη
    - 238 030481
    - 239 030481
    - 240 030481
    - 241 030481
    - 242 030481
    - 243 030481
    - 244 030481
    118 Η V V"r «/ 119 0~sηιΥ w 121 Η 0 ^NH 122 Λ °ryV Η '0 FTE — N-, O0 3 123 Η /Ν. p Xh
    - 245 030481
    - 246 030481
    - 247 030481
    - 248 030481
    - 249 030481
    - 250 030481
    - 251 030481
    - 252 030481
    - 253 030481
    - 254 030481
    - 255 030481
    - 256 030481
    - 257 030481
    - 258 030481
    - 259 030481
    - 260 030481
    - 261 030481
    - 262 030481
    - 263 030481
    - 264 030481
    и их фармацевтически приемлемых солей.
    39. Сосдинение, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:
    и их фармацевтически приемлемых солей.
    40. Сосдинение, выбранное из группы, состоящей из следующих соединений:
    - 265 030481
    19 νη2 N \ Νί з Н νη2 21 о N Н >—N \ νη2 27 N Н ,- νη2 28 Ά N Н νη2 29 /—N \ 1\Г Н νη2 30 К N Н —Ν \
    и их фармацевтически приемлемых солей. 41. Соединение формулы
    или его фармацевтически приемлемая соль.
    43. Соединение по п.41, представляющее собой фармацевтически приемлемую соль соединения формулы
    44. Соединение формулы
    - 266 030481
    HN
    Η
    Ν
    или его фармацевтически приемлемая соль.
    45. Соединение по п.44 формулы
    HN'
    46. Соединение по п.44, представляющее собой фармацевтически приемлемую соль соединения формулы
    ΗΝ
    47. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по любому из пп.1-40 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    48. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.41 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    49. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.42 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    50. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.43 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    51. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.44 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    52. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.45 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    53. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.46 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
    54. Способ ингибирования аргининметилтрансферазы (RMT), включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством соединения по любому из пп.1-41 и 44.
    55. Способ по п.54, где аргининметилтрансфераза представляет собой PRMT1.
    56. Способ по п.54, где аргининметилтрансфераза представляет собой PRMT6.
    57. Способ по п.54, где аргининметилтрансфераза представляет собой PRMT3.
    58. Способ по п.54, где аргининметилтрансфераза представляет собой PRMT8.
    59. Способ по п.54, где аргининметилтрансфераза представляет собой CARM1.
    60. Способ модулирования генной экспрессии, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством соединения по любому из пп.1-41 и 44.
    61. Способ модулирования транскрипции, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством соединения по любому из пп.1-41 и 44.
    62. Способ по любому из пп.54-61, где клетка находится in vitro.
    63. Способ по любому из пп.54-61, где клетка находится в субъекте.
    64. Способ лечения опосредованного RMT нарушения, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-41 и 44 или фармацевтической композиции по любому из пп.47, 48 и 51.
    65. Способ по п.64, где опосредованное RMT нарушение представляет собой опосредованное PRMT1 нарушение.
    - 267 030481
    66. Способ по п.64, где опосредованное RMT нарушение представляет собой опосредованное PRMT6 нарушение. 67. Способ по п.64, где опосредованное RMT нарушение представляет собой опосредованное PRMT3 нарушение. 68. Способ по п.64, где опосредованное RMT нарушение представляет собой опосредованное PRMT8 нарушение. 69. Способ по п.64, где опосредованное RMT нарушение представляет собой опосредованное
    CARM1 нарушение.
    70. Способ по п.64, где нарушение представляет собой пролиферативное нарушение.
    71. Способ по п.70, где нарушение представляет собой рак.
    72. Способ по п.71, где рак представляет собой лейкоз.
    73. Способ по п.72, где лейкоз представляет собой острый миелоцитарный лейкоз.
    74. Способ по п.64, где нарушение представляет собой неврологическое нарушение.
    75. Способ по п.74, где нарушение представляет собой амиотрофический латеральный склероз.
    76. Способ по п.64, где нарушение представляет собой мышечную дистрофию.
    77. Способ по п.64, где нарушение представляет собой аутоиммунное нарушение.
    78. Способ по п.64, где нарушение представляет собой сосудистое нарушение.
    79. Способ по п.64, где нарушение представляет собой метаболическое нарушение.
    80. Способ по любому из пп.54-79, где соединение представляет собой
    или его фармацевтически приемлемую соль.
    81. Способ по любому из пп.54-79, где соединение представляет собой
    или его фармацевтически приемлемую соль.
EA201591531A 2013-03-14 2014-03-14 Ингибиторы аргининметилтрансферазы и их применения EA030481B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361781051P 2013-03-14 2013-03-14
US201361876034P 2013-09-10 2013-09-10
PCT/US2014/029710 WO2014153226A1 (en) 2013-03-14 2014-03-14 Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591531A1 EA201591531A1 (ru) 2016-02-29
EA030481B1 true EA030481B1 (ru) 2018-08-31

Family

ID=50483598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591531A EA030481B1 (ru) 2013-03-14 2014-03-14 Ингибиторы аргининметилтрансферазы и их применения

Country Status (25)

Country Link
US (4) US9598374B2 (ru)
EP (1) EP2970132B1 (ru)
JP (1) JP6581076B2 (ru)
KR (2) KR102028793B1 (ru)
CN (2) CN105339351B (ru)
AU (2) AU2014236146B2 (ru)
BR (1) BR112015022785A2 (ru)
CA (1) CA2903394C (ru)
CY (1) CY1123637T1 (ru)
DK (1) DK2970132T3 (ru)
EA (1) EA030481B1 (ru)
ES (1) ES2837034T3 (ru)
HK (1) HK1219736A1 (ru)
HR (1) HRP20202008T1 (ru)
HU (1) HUE052926T2 (ru)
IL (2) IL241368B (ru)
LT (1) LT2970132T (ru)
MX (1) MX2015012850A (ru)
PL (1) PL2970132T3 (ru)
PT (1) PT2970132T (ru)
RS (1) RS61231B1 (ru)
SG (1) SG11201506972PA (ru)
SI (1) SI2970132T1 (ru)
WO (1) WO2014153226A1 (ru)
ZA (1) ZA201507441B (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9604930B2 (en) 2012-12-21 2017-03-28 Epizyme, Inc. Tetrahydro- and dihydro-isoquinoline PRMT5 inhibitors and uses thereof
WO2014100716A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
EP2935247B1 (en) 2012-12-21 2019-08-28 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US8940726B2 (en) 2012-12-21 2015-01-27 Epizyme, Inc. PRMT5 inhibitors and uses thereof
CA2894126A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US20160031839A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
EP2970133B1 (en) 2013-03-14 2018-10-24 Epizyme, Inc. Pyrazole derivatives as prmt1 inhibitors and uses thereof
WO2014153214A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Epizyme, Inc. Arginine methyl transferase inhibtors and uses thereof
WO2014153235A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
JP2016518336A (ja) 2013-03-14 2016-06-23 エピザイム，インコーポレイティド Ｐｒｍｔ１阻害剤としてのピラゾール誘導体およびその使用
EP2970181B1 (en) 2013-03-14 2017-06-07 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
EP2970135B1 (en) 2013-03-14 2018-07-18 Epizyme, Inc. Pyrazole derivatives as prmt1 inhibitors and uses thereof
SG11201506972PA (en) 2013-03-14 2015-10-29 Epizyme Inc Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US9776972B2 (en) 2013-03-14 2017-10-03 Epizyme Inc. Pyrazole derivatives as arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US9120757B2 (en) 2013-03-14 2015-09-01 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US9346802B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Epizyme, Inc. CARM1 inhibitors and uses thereof
US9718816B2 (en) 2013-03-15 2017-08-01 Epizyme, Inc. 1-phenoxy-3-(alkylamino)-propan-2-ol derivatives as CARM1 inhibitors and uses thereof
CA2903813C (en) 2013-03-15 2023-08-29 Epizyme, Inc. Carm1 inhibitors and uses thereof
US10653693B2 (en) 2014-08-04 2020-05-19 Epizyme, Inc. PRMT5 inhibitors and uses thereof
WO2016044576A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Epizyme, Inc. Salts, co-crystals, amorphous forms, and crystalline forms of an arginine methyltransferase inhibitor
KR20190090822A (ko) * 2016-12-01 2019-08-02 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 조합 요법
BR112019011388A2 (pt) * 2016-12-01 2019-10-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd terapia de combinação
CN110225983A (zh) * 2016-12-01 2019-09-10 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 治疗癌症的方法
CN111867584A (zh) * 2018-03-01 2020-10-30 德州大学***董事会 作为蛋白质精氨酸甲基转移酶的抑制剂的乙二胺-杂环衍生物
CN112469441A (zh) * 2018-05-31 2021-03-09 葛兰素史克知识产权开发有限公司 用icos结合蛋白和精氨酸甲基转移酶抑制剂的组合疗法
WO2020182018A1 (zh) * 2019-03-12 2020-09-17 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 氮杂环化合物、其制备方法及用途
EP3947387A4 (en) * 2019-03-25 2022-11-30 California Institute Of Technology PRMT5 INHIBITORS AND USES THEREOF
WO2021023609A1 (en) * 2019-08-02 2021-02-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination of a type i protein arginine methyltransferase (type i prmt) inhibitor and a methionine adenosyltransferase ii alpha (mat2a) inhibitor
CN110950841A (zh) * 2019-11-22 2020-04-03 济南大学 一类新型***类化合物的合成及应用
KR102219251B1 (ko) 2020-03-03 2021-02-22 김명수 전문가 추천 플랫폼을 제공하는 서버 및 그 운용방법
CN111481532B (zh) * 2020-06-28 2020-09-22 南京中澳转化医学研究院有限公司 化合物28d在制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008008286A2 (en) * 2006-07-12 2008-01-17 Merck & Co., Inc. Substituted pyrazoles as ghrelin receptor antagonists
WO2008104077A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Methylgene Inc. Small molecule inhibitors of protein arginine methyltransferases (prmts)
WO2010094609A1 (de) * 2009-02-20 2010-08-26 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend hemmstoffe der proteinmethyltransferase i und deren verwendung zur behandlung von tumorerkrankungen

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH085859B2 (ja) 1986-07-01 1996-01-24 日本バイエルアグロケム株式会社 新規アルキレンジアミン類
EP0352581A3 (de) 1988-07-28 1990-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Aethylendiaminmonoamid-Derivate
US5204482A (en) 1988-07-28 1993-04-20 Hoffman-Laroche Inc. Compounds for treating and preventing cognitive diseases and depression and methods of making same
EP0796270A2 (en) 1994-12-02 1997-09-24 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Peptide compounds for prevention and/or treatment of no-mediated diseases
SE9902765D0 (sv) 1999-07-21 1999-07-21 Astra Pharma Prod Novel compounds
CN1331326A (zh) * 2000-06-30 2002-01-16 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人精氨酸甲基转移酶(hrmt)32.12和编码这种多肽的多核苷酸
US20020090627A1 (en) 2000-10-05 2002-07-11 Rachel Meyers 27419, a novel human arginine-N-methyl transferase and uses thereof
DE10149370A1 (de) 2001-10-06 2003-04-10 Merck Patent Gmbh Pyrazolderivate
NZ534830A (en) 2002-03-13 2005-08-26 Janssen Pharmaceutica Nv Compounds with histone deacetylase HDAC inhibiting activity and oral bioavailability useful for treating proliferative diseases
GB0219961D0 (en) 2002-08-28 2002-10-02 Pfizer Ltd Oxytocin inhibitors
AU2003288994A1 (en) 2002-12-10 2004-06-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Nitrogen-containing heterocyclic compounds and medicinal use thereof
US7135575B2 (en) 2003-03-03 2006-11-14 Array Biopharma, Inc. P38 inhibitors and methods of use thereof
DE10315572A1 (de) 2003-04-05 2004-10-14 Merck Patent Gmbh Substituierte Pyrazole
GB0309637D0 (en) 2003-04-28 2003-06-04 Cancer Rec Tech Ltd Pyrazole compounds
WO2004098634A2 (en) 2003-04-30 2004-11-18 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Protein arginine n-methyltransferase 2 (prmt-2)
US20050032794A1 (en) 2003-08-05 2005-02-10 Padia Janak K. Diamine derivatives of quinone and uses thereof
DE102004008807A1 (de) 2004-02-20 2005-09-08 Bayer Cropscience Ag Pyrazolopyrimidine
SI1725537T1 (sl) 2004-03-15 2011-11-30 Janssen Pharmaceutica Nv Nove spojine kot modulatorji opioidnih receptorjev
ME01309B (me) 2004-08-26 2013-12-20 Pfizer Pirazolom supstituirani heteroarilni spojevi kao inhibitori proteinskih kinaza
WO2006025832A1 (en) 2004-08-31 2006-03-09 University Of North Carolina At Chapel Hill Dot1 histone methyltransferases as a target for identifying therapeutic agents for leukemia
WO2006033995A2 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Valeant Research And Development Thiazolidin-4-ones having anti-hepatitis b activity
JP2008515950A (ja) 2004-10-13 2008-05-15 バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト 泌尿器系障害の処置用の冷メントール受容体−１（ｃｍｒ−１）アンタゴニストとしての４−置換ベンジルオキシ−フェニルメチルアミド誘導体
WO2006063356A1 (en) 2004-12-10 2006-06-15 Isis Phamaceuticals, Inc. Regulation of epigenetic control of gene expression
US20070060589A1 (en) 2004-12-21 2007-03-15 Purandare Ashok V Inhibitors of protein arginine methyl transferases
BRPI0606455A (pt) 2005-01-21 2008-03-11 Astex Therapeutics Ltd compostos farmacêuticos
WO2006113458A1 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Heterocyclic inhibitors of protein arginine methyl transferases
US8063071B2 (en) 2007-10-31 2011-11-22 GlaxoSmithKline, LLC Chemical compounds
SG140147A1 (en) 2005-08-19 2008-03-28 Aventis Pharma Inc Combination of a hypnotic agent and substituted bis aryl and heteroaryl compound and therapeutic application thereof
EP1985620A4 (en) 2006-02-07 2012-08-15 Taisho Pharmaceutical Co Ltd COMPOUND 10a-AZALIDE
WO2007149782A2 (en) 2006-06-23 2007-12-27 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Selective inhibitors for transferases
EP2035436B1 (en) 2006-06-26 2011-05-25 UCB Pharma S.A. Fused thiazole derivatives as kinase inhibitors
CN101511802A (zh) 2006-09-13 2009-08-19 阿斯利康(瑞典)有限公司 螺唑烷酮化合物及其作为代谢型谷氨酸受体增效剂的用途
NZ575689A (en) 2006-09-15 2011-12-22 Celgene Corp N-methylaminomethyl isoindole compounds and compositions comprising and methods of using the same
US20080312298A1 (en) 2007-04-11 2008-12-18 Kenneth William Foreman Methods for Identification of Modulators of Carm1 Methyl Transferase Activity
US20090062286A1 (en) 2007-05-04 2009-03-05 Kenneth William Foreman Crystal Structure of SMYD3 Protein
US20090012031A1 (en) 2007-07-03 2009-01-08 The Regents Of The University Of Michigan EZH2 Cancer Markers
US8133904B2 (en) 2007-09-07 2012-03-13 Jenrin Discovery, Inc. Cannabinoid receptor antagonists/inverse agonists useful for treating obesity
EP2226315A4 (en) 2007-12-28 2012-01-25 Carna Biosciences Inc 2-AMINOQUINAZOLINE DERIVATIVE
JP2009179616A (ja) 2008-01-31 2009-08-13 Kowa Co ３−ナフチルピラゾール化合物
ES2557281T3 (es) 2008-02-29 2016-01-25 Evotec Ag Compuestos amida, composiciones y usos de los mismos
WO2009126537A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Syndax Pharmaceuticals, Inc. Administration of an inhibitor of hdac and an hmt inhibitor
US8512944B2 (en) 2008-08-27 2013-08-20 Oncotherapy Science, Inc. PRMT1 for target genes of cancer therapy and diagnosis
WO2010034737A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Basf Se Pyrazole compounds for controlling invertebrate pests
US8323918B2 (en) 2008-12-12 2012-12-04 University Of South Carolina Chloroacetamidine based inhibitors and activity based probes for the protein arginine methytransferases
WO2010094009A2 (en) 2009-02-13 2010-08-19 Children's Hospital Medical Center Methods and compositions for the treatment of ras associated disorders
US20130345268A1 (en) 2009-02-13 2013-12-26 The Trustees Of Dartmouth College Methods and Compositions for the Treatment of RAS Associated Disorders
RU2011141121A (ru) * 2009-03-11 2013-04-20 Окленд Юнисервисиз Лимитед Пролекарственные формы ингибиторов киназ и их применение в терапии
IN2012DN00352A (ru) 2009-06-16 2015-08-21 Bikam Pharmaceuticals Inc
US20110021362A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Constellation Pharmaceuticals Agents for stimulating activity of methyl modifying enzymes and methods of use thereof
US9044432B2 (en) 2009-12-22 2015-06-02 Ohio State Innovation Foundation Compositions and methods for cancer detection and treatment
WO2011082098A1 (en) 2009-12-30 2011-07-07 The Rockefeller University Lysine and arginine methyltransferase inhibitors for treating cancer
WO2011096210A1 (en) 2010-02-03 2011-08-11 Oncotherapy Science, Inc. Prmt1 and prmt6 for target genes of cancer therapy and diagnosis
EP2531598A4 (en) 2010-02-03 2013-05-22 Oncotherapy Science Inc WHSC1 AND WHSC1L1 FOR TARGET GENES TO CANCER THERAPY AND DIAGNOSIS
US20110251216A1 (en) 2010-02-19 2011-10-13 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting ezh2
JP5864545B2 (ja) 2010-05-07 2016-02-17 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ インドール
US8637509B2 (en) 2010-05-07 2014-01-28 Glaxosmithkline Llc Azaindazoles
KR102061353B1 (ko) 2010-09-10 2020-01-02 에피자임, 인코포레이티드 인간 ｅｚｈ2의 억제제 및 이의 사용 방법
WO2012060760A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fujirebio Diagnostics Ab Molecular marker for cancer
WO2012068589A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Constellation Pharmaceuticals Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
ES2607064T3 (es) 2010-12-01 2017-03-29 Glaxosmithkline Llc Indoles
WO2012082436A2 (en) 2010-12-03 2012-06-21 Epizyme, Inc. Modulators of histone methyltransferase, and methods of use thereof
BR112013013659B8 (pt) 2010-12-03 2024-02-27 Epizyme Inc Compostos moduladores de enzimas epigenéticas, composição farmacêutica compreendendo ditos compostos e usos da dita composição farmacêutica para tratar câncer, câncer hematológico ou leucemia
EP2646441B1 (en) 2010-12-03 2015-12-02 Epizyme, Inc. Carbocycle-substituted purine and 7-deazapurine compounds
KR20130124959A (ko) 2010-12-03 2013-11-15 에피자임, 인코포레이티드 히스톤 메틸전달효소의 7-데아자퓨린 조절제 및 그의 사용방법
AU2012223448B2 (en) 2011-02-28 2017-03-16 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
TW201733984A (zh) 2011-04-13 2017-10-01 雅酶股份有限公司 經取代之苯化合物
JO3438B1 (ar) 2011-04-13 2019-10-20 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
US9458174B2 (en) 2012-05-23 2016-10-04 Stemergie Biotechnology Sa Inhibitors of the activity of complex (III) of the mitochondrial electron transport chain and use thereof
WO2014034750A1 (ja) 2012-08-30 2014-03-06 国立大学法人 東京大学 内部寄生虫防除剤
EP3143994A1 (en) 2012-08-30 2017-03-22 The University of Tokyo Endoparasite control agent and use thereof
WO2014100716A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US8940726B2 (en) 2012-12-21 2015-01-27 Epizyme, Inc. PRMT5 inhibitors and uses thereof
EP2935247B1 (en) 2012-12-21 2019-08-28 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
CA2894126A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US9604930B2 (en) 2012-12-21 2017-03-28 Epizyme, Inc. Tetrahydro- and dihydro-isoquinoline PRMT5 inhibitors and uses thereof
WO2014100764A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. Methods of inhibiting prmt5
EP2970135B1 (en) 2013-03-14 2018-07-18 Epizyme, Inc. Pyrazole derivatives as prmt1 inhibitors and uses thereof
US9776972B2 (en) 2013-03-14 2017-10-03 Epizyme Inc. Pyrazole derivatives as arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US20160031839A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
SG11201506972PA (en) 2013-03-14 2015-10-29 Epizyme Inc Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
JP2016518336A (ja) 2013-03-14 2016-06-23 エピザイム，インコーポレイティド Ｐｒｍｔ１阻害剤としてのピラゾール誘導体およびその使用
EP2970133B1 (en) 2013-03-14 2018-10-24 Epizyme, Inc. Pyrazole derivatives as prmt1 inhibitors and uses thereof
US9120757B2 (en) 2013-03-14 2015-09-01 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
WO2014153214A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Epizyme, Inc. Arginine methyl transferase inhibtors and uses thereof
WO2014153235A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
EP2970181B1 (en) 2013-03-14 2017-06-07 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US9346802B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Epizyme, Inc. CARM1 inhibitors and uses thereof
CA2903813C (en) 2013-03-15 2023-08-29 Epizyme, Inc. Carm1 inhibitors and uses thereof
US9718816B2 (en) 2013-03-15 2017-08-01 Epizyme, Inc. 1-phenoxy-3-(alkylamino)-propan-2-ol derivatives as CARM1 inhibitors and uses thereof
US20170210751A1 (en) 2014-06-25 2017-07-27 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
EP3160477A4 (en) 2014-06-25 2018-07-04 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US10653693B2 (en) 2014-08-04 2020-05-19 Epizyme, Inc. PRMT5 inhibitors and uses thereof
WO2016044641A2 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Epizyme, Inc. Carm1 inhibitors and uses thereof
US20170291905A1 (en) 2014-09-17 2017-10-12 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US20170305922A1 (en) 2014-09-17 2017-10-26 Epizyme, Inc. Carm1 inhibitors and uses thereof
WO2016044585A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
EP3200588A4 (en) 2014-09-17 2018-04-25 Epizyme, Inc. Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US20170283440A1 (en) 2014-09-17 2017-10-05 Epizyme, Inc. Carm1 inhibitors and uses thereof
WO2016044576A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Epizyme, Inc. Salts, co-crystals, amorphous forms, and crystalline forms of an arginine methyltransferase inhibitor
JP2017527594A (ja) 2014-09-17 2017-09-21 エピザイム，インコーポレイティド コアクチベーター関連アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ｃａｒｍ１）阻害剤の塩、共結晶、非晶質形態、および結晶形態
WO2017136699A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Epizyme, Inc Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
US20190083482A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Epizyme, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008008286A2 (en) * 2006-07-12 2008-01-17 Merck & Co., Inc. Substituted pyrazoles as ghrelin receptor antagonists
WO2008104077A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Methylgene Inc. Small molecule inhibitors of protein arginine methyltransferases (prmts)
WO2010094609A1 (de) * 2009-02-20 2010-08-26 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend hemmstoffe der proteinmethyltransferase i und deren verwendung zur behandlung von tumorerkrankungen

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
8 November 2011, CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US, article N H: "RN -1342545-59-8 ZREGISTRY 1,2-Ethanediamine, N1,N2-dimethyl-N1-[(1,3,5-trimethyl-1H-pyrazol-4- yl)methyl]-", XP055127174 *
DATABASE REGISTRY [Online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; 3 November 2011 (2011-11-03), "1,2-Ethanediamine, N1-[(5-chloro-1,3-dimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl]-N1,N2-dimethyl-", XP055127173, Database accession no. 1340581-60-3, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102158756B1 (ko) 2020-09-23
JP2016516067A (ja) 2016-06-02
SG11201506972PA (en) 2015-10-29
PL2970132T3 (pl) 2021-04-06
CN105339351A (zh) 2016-02-17
IL268189A (en) 2019-09-26
BR112015022785A2 (pt) 2017-07-18
US20170267642A1 (en) 2017-09-21
CN109265400B (zh) 2022-10-04
IL241368B (en) 2019-07-31
DK2970132T3 (da) 2020-12-21
MX2015012850A (es) 2016-06-24
CN109265400A (zh) 2019-01-25
KR20160003648A (ko) 2016-01-11
US20190100496A1 (en) 2019-04-04
HUE052926T2 (hu) 2021-05-28
EA201591531A1 (ru) 2016-02-29
SI2970132T1 (sl) 2021-02-26
JP6581076B2 (ja) 2019-09-25
AU2018203056A1 (en) 2018-07-19
CN105339351B (zh) 2018-11-06
IL241368A0 (en) 2015-11-30
HK1219736A1 (zh) 2017-04-13
PT2970132T (pt) 2020-12-30
KR20190112334A (ko) 2019-10-04
CA2903394C (en) 2021-08-31
CY1123637T1 (el) 2022-03-24
US11512053B2 (en) 2022-11-29
US10081603B2 (en) 2018-09-25
WO2014153226A1 (en) 2014-09-25
US10800743B2 (en) 2020-10-13
AU2018203056B2 (en) 2020-05-21
US20210078951A1 (en) 2021-03-18
LT2970132T (lt) 2021-01-11
CA2903394A1 (en) 2014-09-25
KR102028793B1 (ko) 2019-10-07
ES2837034T3 (es) 2021-06-29
HRP20202008T1 (hr) 2021-02-19
EP2970132A1 (en) 2016-01-20
EP2970132B1 (en) 2020-09-23
RS61231B1 (sr) 2021-01-29
AU2014236146B2 (en) 2018-05-17
AU2014236146A1 (en) 2015-09-10
ZA201507441B (en) 2021-01-27
US20160024016A1 (en) 2016-01-28
IL268189B (en) 2022-02-01
US9598374B2 (en) 2017-03-21
WO2014153226A9 (en) 2015-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030481B1 (ru) Ингибиторы аргининметилтрансферазы и их применения
US10961255B2 (en) Imidazoles as histone demethylase inhibitors
DK3110810T3 (en) PYRAZOLAMIDE DERIVATIVES
WO2016044626A1 (en) Arginine methyltransferase inhibitors and uses thereof
CN110036009A (zh) 经取代的吡咯烷及其在治疗囊性纤维化中的用途
KR20170035993A (ko) 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성제로서의 헤테로사이클릭 카복실산
WO2009122034A2 (fr) Nouveaux derives de carbazole inhibiteurs d&#39;ηsp90, compositions les contenant et utilisation
TW201920194A (zh) 大環ｍｃｌ-１抑制劑及使用方法
EP3140296A1 (en) Pyrrolidine gpr40 modulators for the treatment of diseases such as diabetes
WO2012174342A1 (en) Trpv4 antagonists
EP3140294A1 (en) Pyrrolidine gpr40 modulators
WO2014157382A1 (ja) スフィンゴシンキナーゼ阻害剤
EP3140297A1 (en) Pyrrolidine gpr40 modulators for the treatment of diseases such as diabetes
TW201620886A (zh) 經芳基取代之雜環碸
CN112105605A (zh) 作为nop抑制剂的取代的环己基化合物
EP4171547A1 (en) Tlr2 modulator compounds, pharmaceutical compositions and uses thereof
TW202333663A (zh) Rxfp1促效劑