EA030462B1

EA030462B1 - Агонисты fgfr1 и способы их применения

Info

Publication number: EA030462B1
Application number: EA201391540A
Authority: EA
Inventors: Юничиро Сонода; Янь У
Original assignee: Дженентек, Инк.
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2018-08-31
Also published as: AR090017A1; AU2012255881B2; US20210087283A1; SI2710035T1; PT2710035T; US9085626B2; HRP20170815T1; RS56090B1; ES2628385T3; CL2013003296A1; KR20140012150A; MX2019014654A; MX2013013291A; EP2710035B1; US20240076388A1; US20120294861A1; HUE033584T2; CA2834879A1; US9845359B2; SG194917A1

Abstract

Изобретение относится к агонистическому антителу к рецептору 1 фактора роста фибробластов (FGFR1), связывающемуся с пептидом #26 KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28) или пептидом #28 FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29), а также к его применению для лечения метаболического заболевания или состояния, например диабета. Изобретение также предусматривает выделенную нуклеиновую кислоту, клетку-хозяина, способ получения указанного антитела, а также фармацевтическую композицию, предусматривающую его использование.

Description

030462

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в кодировке ASCII в системе EFS-Web и который полностью вводится в изобретение посредством отсылки. Текстовый файл с указанной ASCII копией, созданный 27 апреля 2012 г., объёмом 26083 байт озаглавлен P4653RUS.txt.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент США 61/486731, поданной 16 мая 2011 г., и заявке на патент США 61/536936, поданной 20 сентября 2011 г., полное описание которых включено в настоящее изобретение посредством ссылки.

Область техники

Изобретение относится к агонистам FGFR1 и способам их применения.

Уровень техники

Невозможность контролировать уровень глюкозы в крови лежит в основе ряда метаболических заболеваний. Диабет представляет собой гипергликемический синдром, возникающий в результате нарушения секреции инсулина в ответ на глюкозу (диабет типа 1 и типа 2) и пониженной эффективности инсулина при стимулировании усвоения глюкозы скелетными мышцами и ограничении выработки глюкозы в печени (диабет типа 2). Диабет является широко распространённым заболеванием, и хотя возможные методы лечения доступны для некоторых диабетиков, острая потребность в новых методах лечения существует.

Фактор роста фибробластов 21 (FGF21) является членом подсемейства эндокринных FGF, которое включает FGF19 и FGF23, и он был идентифицирован как агент, предположительно, смягчающий заболевание, способствуя регрессии ожирения и вызванных ожирением гепатостеатоза (жировой дистрофии печени) и гипергликемии (см., например, Kharitonenkov and Larsen, Trends Endocrinol. Metab. 22(3): 81-6 (2011); Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. 115: 1627-35 (2005); Международная заявка WO 2010/042747). Эндокринный FGF21 белок связывается с тремя FGF рецепторами (FGFR 1-3) и улучшает инсулинорезистентность и типа 2 диабета с помощью этих рецепторов вместе с их мембраносвязанным корецептором бета-Клото. Однако его разработке препятствовала плохая фармакокинетика и слабое понимание биологического механизма действия. Антитела к антагонистам FGFR1 также предлагались для лечения диабета (международная заявка WO 2005/037235). Однако не было найдено, особенности которого из трёх FGFR опосредуют благотворную метаболическую активность FGF21.

Сущность изобретения

Основанием для изобретения, частично, является открытие того, что активация FGFR1 уменьшает интенсивность диабета. Изобретение предусматривает агонисты FGFR1, включая агонистические антитела к FGFR1, и способы их применения. В одном аспекте изобретение предусматривает способ лечения метаболического заболевания или состояния у индивидуума, включающий введение этому индивидууму эффективного количества агонистического антитела к рецептору 1 фактора роста фибробластов (FGFR1), где метаболическое заболевание выбрано из группы, состоящей из синдрома поликистозных яичников (PCOS, СПКЯ), метаболического синдрома (MetS), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH, НАСГ), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD, НЖБП), гиперлипидемии, гипертонии, диабета типа 2, диабета не типа 2, диабета типа 1, латентного аутоиммунного диабета (LAD) и диабета зрелого возраста у молодых (MODY). Согласно некоторым вариантам изобретения агонист FGFR1 не активирует FGFR2 или FGFR3. Согласно некоторым вариантам изобретения агонист FGFR1 представляет собой антитело к FGFR1. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело к FGFR1 имеет два сайта связывания с FGFR1, например полноразмерное антитело или фрагмент F(ab')2. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело связывается с пептидом #26 KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28) или пептидом #28 FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело связывается как с пептидом #26, так и с пептидом #28. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело к FGFR1 связывается как с FGFR1b, так и с FGFR1c. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело является биспецифическим антителом. Согласно некоторым вариантам изобретения биспецифическое антитело связывается также с бета-Клото.

В другом аспекте изобретение предусматривает выделенное антитело, которое связывается с FGFR1, причём это антитело является агонистом FGFR1 активности. Согласно некоторым вариантам изобретения антителом не является агонистом FGFR2 или FGFR3. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело является моноклональным антителом. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело является человеческим, гуманизированным или химерным антителом. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает (а) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16), SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17), EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18), TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) и GTDVMDY (SEQ ID NO: 20), (б) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 23), и (в) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG, где X₁ означает А или G, Х₂ означает D или Е, X₃ означает D или Y, X₄ означает N или Y, X₅ означает А или D и X₆ означает D или Y (SEQ ID NO: 24), и

- 1 030462

X1IX2PX3DGX4TX5YADSVKG, где X₁ означает D или Е, X₂ означает D или Y, Х₃ означает N или Y, Х₄означает А или D, и X₅ означает D или Y (SEQ ID NO: 25). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅, где X₁ означает S или Т, X₂ означает N или S, X₃ означает N или Т, X₄ означает W или Y, X₅ означает Н или S (SEQ ID NO: 26), (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG, где X₁ означает А или G, Х₂ означает D или Е, Х₃означает D или Y, Х₄ означает N или Y, X₅ означает А или D, и X₆ означает D или Y (SEQ ID NO: 24), и X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG, где X₁ означает D или Е, Х₂ означает D или Y, Х₃ означает N или Y, Х₄означает А или D, и Х5 означает D или Y (SEQ ID NO: 25), и (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16), SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17), EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18), TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) и GTDVMDY (SEQ ID NO: 20). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTSTWiS (SEQ ID NO: 7), (б) HVRH2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GEIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10) и EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11), и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16) и SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSNNYIH (SEQ ID NO: 8), (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ADIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 12), и DIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 13), и (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTSNWIS (SEQ ID NO: 9), (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из AEIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 14) и EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 15), и (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) и GTDVMDY (SEQ ID NO: 20). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело дополнительно включает (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 21); (б) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 22); и (в) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 23). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает VH последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3 и 4. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело включает VL последовательность SEQ ID NO: 6.

Согласно некоторым вариантам изобретения антитело к FGFR1 имеет два FGFR1-связывающих сайта, например полноразмерное антитело или фрагмент F(ab')₂. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело по изобретению является мультиспецифическим антителом. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело также связывается с бета-Клото. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело является IgG1 антителом. Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по изобретению. Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту по п.24. Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.23 с тем, чтобы продуцировалось антитело. Согласно некоторым вариантам изобретения этот способ дополнительно включает выделение антитела с использованием клетки-хозяина.

Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает антитело по изобретение для применения в качестве лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело по изобретению предназначено для применения в терапии метаболического заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из: синдрома поликистозных яичников (PCOS), метаболического синдрома (MetS), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гиперлипидемии, гипертонии, диабета типа 2, диабета не типа 2, диабета типа 1, латентного аутоиммунного диабета (LAD) и диабета зрелого возраста у молодых (MODY). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело по изобретению предназначено для применения с целью повышения чувствительности индивидуума к инсулину.

Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает применение антитела по изобретению для получения лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам изобретения лекарственное средство предназначено для лечения метаболического заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из синдрома поликистозных яичников (PCOS), метаболического синдрома (MetS), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гиперлипидемии, гипертонии, диабета типа 2, диабета не типа 2, диабета типа 1, латентного аутоиммунного диабета (LAD) и диабета зрелого возраста у молодых (MODY). Согласно некоторым вариантам изобре- 2 030462

тения лекарственное средство предназначено для повышения чувствительности индивидуума к инсулину. Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает способ лечения диабета у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по изобретению. Согласно некоторым вариантам изобретения способ дополнительно предусматривает введение индивидууму другого агента для лечения диабета при условии, что другой агент не является инсулином. Согласно некоторым вариантам изобретения способ дополнительно предусматривает введение индивидууму агента для лечения сердечно-сосудистого заболевания.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А показано измеряемое методом ELISA связывание антител к FGFR1 с очищенными ECD фрагментами FGFR;

на фиг. 1B - определённые с помощью поверхностного плазмонного резонанса константы связывания для RIMAbl и R1MAb2;

на фиг. 1С - GAL-Elk1 люциферазный анализ в крысиных клетках L6. Клетки котрансфицировали с помощью экспрессионных векторов для указанной FGFR изоформы совместно с GAL-Elk1, SV40-геном люциферазы Renilla и Gal-отвечающим репортёрным геном люциферазы светлячка. Перед люциферазным анализом трансфицированные клетки инкубировали со средой, содержащей увеличивающиеся концентрации R1Mab или кислого FGF (aFGF: позитивный контроль) в течение 6 ч. Активацию транскрипции оценивали с помощью относительной активности гена люциферазы светлячка, нормализованной по активности гена люциферазы renilla и выражаемой в относительных световых единицах (RLU);

на фиг. 1D иллюстрируется эксперимент, аналогичный эксперименту на фиг. 1С за исключением того, что клетки L6 экспрессировали как FGFR1c, так и KLB;

на фиг. 1E - эксперимент, аналогичный эксперименту на фиг. 1С, за исключением того, что использовали клетки HEK293;

на фиг. 1F показан иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг, Вестерн блот анализ) адипоцитов 3T3-L1, обработанных указанным белком в концентрации 0.5 мкг/мл в течение указанного времени;

на фиг. 1G - WAT (белая жировая ткань), собранная при использовании тощих мышей C57BL/6 через указанное время после интраперитонеальной (и.п.) инъекции 1 mpk (мг/кг) R1Mab (+) или контрольного IgG (-), и подвергнутые Вестерн блот анализу;

на фиг. 2А - содержание глюкозы в крови (слева) и масса тела (справа) db/db мышей после однократной и.п. инъекции (показана стрелкой) R1Mab1 или контрольного IgG в указанных дозах. Статистическая значимость наблюдалась в содержании глюкозы (по сравнению с контрольным IgG) в период между 1 и 30 днём для всех групп, а по массе (по сравнению с контрольным IgG) на 8 день для всех групп и между 12 и 18 днём для группы 50 mpk. N=6~14, *p<0.05, **p<0.01;

на фиг. 2В - содержание глюкозы в крови мышей, получавших нерегулярное питание и не получавших еду в течение ночи (наверху), и уровни сывороточного инсулина после ночного голодания (натощак) и через 30 мин после и.п. инъекции 1 г/кг глюкозы (внизу). N=6~14, *р<0.05, **р<0.01;

на фиг. 2С - содержание глюкозы в крови (слева) и масса тела (справа) мышей Ins2Akita после однократной и.п. инъекции R1Mab1 или контрольного IgG в дозе 3 mpk. (мг/кг). N=10. *р<0.01;

на фиг. 2D - потребление корма (слева), содержание глюкозы в крови (в центре) и масса тела (справа) линии мышей db/db после однократной и. п. инъекции R1Mab1 или контрольного IgG в дозе 1 мг/кг (mpk). PF: получающие одинаковый корм для группы, пролеченной с помощью R1Mab. N=7. #р<0.001 (vs IgG), *p<0.001 (vs PF-IgG);

на фиг. 2Е даны количественные показатели площади инсулина в фиксированных срезах ткани поджелудочной железы. Ткани отбирали на 7 день после однократной и.п. инъекции дозы 3 мг/кг (слева) или 1 мг/кг (справа) R1Mab1 и окрашивали на инсулин и глюкагон. N=4~7. **р<0.002. ***р<0.001;

на фиг. 3А показана активация МАРК-пути передачи сигнала в тканях мышей. Указанные ткани собирали через 15 мин (25 мкг/мышь FGF21: вверху) или через 1 ч (1 мг/кг R1Mab1: внизу) после и. п. инъекции C57BL/6 мышам и проводили Вестерн блот анализ. В качестве негативного контроля применяли PBS (вверху) и контрольный IgG (внизу);

на фиг. 3B-D - характерное Н&Е (гематоксилин и эозин) окрашивание печени (В), печёночных липидов (С) и сывороточных липидов (D). Образцы отбирают на 7 день после однократной и.п. инъекции R1Mab1 в дозе 1 мг/кг (1 mpk). Контрольные мыши получали одинаковый корм для нормализации массы тела. N=7, *р<0.05, **р<0.001;

на фиг. 3Е - метаболические параметры линии мышей ob/ob или трансгенных мышей линии ap2SREBP1c (srebp), инъецированных с помощью 1 мг/кг (mpk) Ab. Контрольные группы получали одинаковый корм для нормализации массы тела. Глюкозу и инсулин для расчётов индекса HOMA-IR определяли на 3 день натощак через 3 ч после еды. GTT (тест на толерантность к глюкозе) проводили на 4 день натощак (после ночного голодания), инъецируя и. п. 1 г/кг глюкозы. Массу ткани определяли на 5 день. N=7, *р<0.05, ***р<0.01;

на фиг. 3F - метаболические параметры линии мышей ap2-SREBP с имплантированным подкожно осмотическим насосом для инфузии FGF21 (12 нг/день). ITT тест (тест на толерантность к инсулину) проводили на 4 день, инъецируя инсулин и.п. в дозе 1 ЕД/кг. Сыворотку собирали на 6 день. N=6~8;

- 3 030462

на фиг. 4 А - экспрессия мРНК (красный: повышенная экспрессия и синий: пониженная экспрессия) в ВАТ (бурой жировой ткани) для генов, принадлежащих к указанному в KEGG метаболическому пути. Образцы собирали на 4 день после однократной и.п. инъекции мышам, которых кормили одинаково, 1 мг/кг RIMabl или контрольного IgG;

на фиг. 4В - экспрессия мРНК в ВАТ, определяемая методом qPCR (количественной ПЦР). N=6, *р<0.05, **р<0.001;

на фиг. 4С - люциферазный анализ в клетках HEK293. На графике видно, что как FGF21, так и R1MAb1 индуцируют транскрипцию UAS-стимулируемого репортёрного гена в клетках HEK293 через CREB, слитый с GAL4 ДНК-связывающим доменом (GAL-CREB) (две левые панели), или транскрипцию CRE-стимулируемого гена-репортёра люциферазы (две правые панели) в зависимости от дозы. Некоторые клетки были также котрансфицированы для экспрессии FGFR1c и KLB (красный; верхняя кривая на графиках). Результаты показывают среднее из трёх повторов (трёх экспериментов) для люциферазной активности, нормализованной по активности renilla;

на фиг. 4D - WAT, взятые через 15 мин после в.в. инъекции 25 мкг FGF21 (+) или PBS (-), и подвергнутые иммуноблоттингу (Вестерн-блоттингу);

на фиг. 4Е - Вестерн-блоттинг дифференцированных первичных человеческих адипоцитов, обработанных FGF21 с концентрацией 1 мкг/мл в течение 30 мин;

на фиг. 4F - модель пути передачи сигнала, посредством которого FGF21 и R1Mab активируют программу PGC-1 альфа в жировых тканях;

на фиг. 5 - гепарин-независимая и FGFR1-зависимая агонистическая активность R1MAb1. GALElk1 люциферазный анализ в HEK293 клетках. Клетки котрансфицировали с использованием или без использования экспрессионных векторов для FGFR1c, как указано, совместно с GAL-Elk1, SV40-renilla люциферазой и Gal-отвечающим геном-репортёром люциферазы светлячка. Трансфицированные клетки инкубировали в средах, содержащих увеличивающиеся концентрации R1Mab1 в присутствии или в отсутствие 25 мг/л свиного гепарина, как указано, в течение 6 ч перед люциферазными анализами. Активацию транскрипции оценивали с помощью относительной активности люциферазы светлячка, нормализованной по активности люциферазы renilla и выражаемой в относительных световых единицах (RLU);

на фиг. 6А - приём пищи (слева), масса тела (в центре), и содержание глюкозы в крови (справа) мышей линии db/db после однократной и.п. инъекции R1Mab2 или контрольного IgG в дозах 3 мг/кг в день 0. Контрольные мыши получали одинаковый корм (PF) для корректировки приёма пищи до 11 дня. На 11 день приём пищи у мышей, получавших R1MAb2, вернулся к обычному, и, следовательно, на 11 день всех мышей кормили вволю (AL). N=7~12. р<0.001;

на фиг. 6В - уровень глюкозы в крови мышей с произвольным питанием, используемых на фиг. 2A на 26 день;

на фиг. 6С - GTT, проводимый на тех же мышах на 28 день; на фиг. 6D - ITT, проводимый на тех же мышах на 37 день;

на фиг. 7А - содержание глюкозы в крови (слева) и масса тела (справа) линии мышей ob/ob после однократной и.п. инъекции R1Mab1 или контрольного IgG в дозе 1мг/кг в день 0. Контрольные мыши и группа R1Mab получали одинаковый корм (PF). N=7. *р<0.05 (vs PF- IgG);

на фиг. 7В - содержание глюкозы в крови (слева) и масса тела (справа) получавших корм с высоким содержанием жира (HFD) линии мышей C57BL/6 после однократной и.п. инъекции R1Mab1 или контрольного IgG в дозе 1 мг/кг в день 0. N=7~9. *р<0.05;

на фиг. 7С - тест GTT, проводимый на мышах, получавших HFD корм, используемых в S3B, на 8 день после инъекции Ab. Мышам инъецировали и.п. глюкозу в дозе 1 г/кг после ночного голодания (натощак). Средняя масса тела составляла 28.6±0.6 (R1MAb1) и 32.1±0.8 (контрольный IgG) (p<0.01). N=7;

на фиг. 7D - содержание глюкозы в крови (слева) и масса тела (справа) линии мышей Ins2Akita на 5 день после однократной и.п. инъекции of R1Mab1 или контрольного IgG в дозе 1 мг/кг. Контрольные мыши получали одинаковый корм (PF-IgG) для нормализации массы тела. * р<0.05;

на фиг. 8А - характерное окрашивание панкреатического островка линии мышей db/db, анализируемых на фиг. 4Е. Красный: инсулин, зелёный: глюкагон, синий: ядра. Следует отметить, что R1Mab не влияет на общую морфологию островков;

на фиг. 8В - распределение "инсулинпозитивной" области (%) в каждом островке каждого животного;

на фиг. 9А представлено схематическое изображение IgG и "одноплечного" (ОА) IgG. Синий: тяжёлая цепь, зелёный: лёгкая цепь. Красной звёздочкой показано положение остатков, изменившихся в DANA мутанте;

на фиг. 9В показан GAL-Elk люциферазный анализ в клетках HEK293, экспрессирующих FGFR1c, для сравнения R1MAb2 и ДНК мутанта R1MAb2 (R1MAb2 DANA);

на фиг. 9С - содержание глюкозы в крови мышей линии db/db до (pre) и через 7 дней после и.п. инъекции указанного Ab в дозе 1 мг/кг. Контрольные мыши получали одинаковый корм для нормализации массы тела;

на фиг. 9D - полученные методом ELISA результаты количественного определения связывания ан- 4 030462

титела с очищенными FGFR ECD фрагментами. OA-RlMAbl: ОА-вариант RIMabl; на фиг. 9Е - результаты GAL-Elk люциферазного анализа, аналогичного S5B;

на фиг. 9F - иммуноблоттинг 3T3-L1 адипоцитов, обработанных указанным белком в концентрации 0.5 мкг/мл в течение указанного времени;

на фиг. 9G - содержание глюкозы в крови (слева) и масса тела (справа) мышей линии db/db после однократной и.п. инъекции указанного Ab на день 0 (стрелка). N=7. *р<0.05 (контрольный IgG vs 3 мг/кг R1MAb1), **p<0.0005 (контрольный IgG vs 3 мг/кг R1MAb1 и контрольный IgG vs 1 мг/кг R1MAb1);

на фиг. 9Н - печёночные и сывороточные липиды из образцов, собранных на 7 день после инъекции Ab. N=7. *р<0.05, **р<0.0005 (vs контрольный IgG);

на фиг. 10 - экспрессия мРНК изоформ KLB и FGFR в печени и в WAT. Получавшим (обычный) корм и HFD-корм мышам линии C57BL/6 было 25 недель. Мыши получали HFD-корм в течение 21 недели. *р<0.05 или **р<0.001. N=6;

на фиг. 11 - необходимость активности FGF21 и R1Mab для нормальной функции жировой ткани. Потребление пищи (слева), содержание глюкозы в крови (в центре) и масса тела (справа) линии мышей ob/ob или трансгенных ap2-srebpR мышей после однократной и.п. инъекции R1Mab1 или контрольного IgG в дозе 1 мг/кг в дозе 0. Те же самые мыши описаны на фиг. 3E. N=7. #р<0.001 (vs IgG), *p<0.001 (vs PF-IgG). Последующие (после обработки) измерения проводили в 1 день после инъекции;

на фиг. 12А проиллюстрирован анализ люциферазной активности (люциферазный анализ) в клетках HEK293. Клетки котрансфицировали с использованием экспрессионных векторов для указанных GALслитых белков, SV40-renilla люциферазы и GAL-отвечающего репортёрного гена люциферазы. Некоторые клетки также котрансфицировали указанным экспрессионным вектором для KLB. Трансфицированные клетки инкубировали со средами, представляющими собой кондиционированную среду, полученную при культивировании клеток HEK293, трансфицированных экспрессионным вектором для FGF21 или указанным контрольным пустым вектором. После инкубации в течение 6 ч определяли люциферазную активность клеток (люциферазный анализ). Активацию транскрипции оценивали с помощью относительной активности люциферазы светлячка, нормализованной по активности люциферазы renilla, и выражали как -кратную индукцию;

на фиг. 12В показан аналогичный люциферазный анализ, в котором некоторые клетки совместно обрабатывали следующими ядерными рецепторными лигандами: 1 MM Wy 14643 (PPARa), 5 нМ GW101516 (PPAR[’>). 50 нМ розиглитазона (PPARy), 50 нМ Т0901317 (LXRa), 5 нМ T3 (TRP), 30 MM CDCA (FXR). Следует отметить, что FGF21 не влиял на активность ни одного из тестированных в данной заявке ядерных рецепторов с обработкой или без обработки "своим" лигандом;

на фиг. 12С - иммуноблоттинг клеток HEK293, обработанных FGF21 с концентрацией 0.5 мкг/мл в течение 10 мин. Некоторые клетки предварительно обрабатывали ингибитором для FGFR (100 нМ PD173074), mTOR (100 нМ рапамицина), MEK1/2 (10 мкМ U0126), PI3K (1 мкМ вортманнина), как указано;

на фиг. 12D - "downstream" гены (гены, регулирующие последующие звенья сигнальных каскадов), участвующие в окислительном метаболизме в жировых тканях;

на фиг. 13 - содержание глюкозы в крови (верхний график) и масса тела (нижний график) мышей db/db после однократной и.п. инъекции R1MAb2 (помеченной как 182.2), R1MAb3 (помеченной как 182.5) или контрольного IgG (антитело к Her2) в указанных дозах. N=6, *р<0.05, **р<0.005, ***р<0.0005. R1MAb3 включает VH, содержащую SEQ ID NO: 6, и VH, содержащую SEQ ID NO: 4;

на фиг. 14А суммарное потребление пищи, содержание глюкозы в крови и изменение массы тела тощих C57BL/6 мышей после однократной внутрибрюшинной (интраперитонеальной) инъекции R1MAb1 или контрольного IgG в дозе 0.5 мг/кг. Мышам также в день 0 подкожно имплантировали осмотический мининасос для непрерывной инфузии (c.i.) рекомбинантного FGF21 в дозе 1.2 мг/кг/день или контрольный носитель (PBS). На 3 день мыши голодали в течение ночи, после чего на 4 день (стрелка), проводили тест на толерантность к глюкозе (GTT);

на фиг. 14В - тесты на толерантность к глюкозе, проведённые с помощью интраперитонеальной инъекции 2 г/кг глюкозы на 4 день после ночного голодания;

на фиг. 14С приводится анализ сыворотки мышей, показанных на фиг. 2С, S10A и S10B. Образцы сыворотки брали натощак на 5 день после 4-часового голодания. Данные, полученные с помощью непарного двуххвостового t-теста Стьюдента (n.s. = незначимый), представляют собой среднее ±SEM при n=6 мышей в группе; *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 vs. PBS (c.i.) + IgG контроль;

на фиг. 15 показан анализ экспрессии генов с применением мРНК, выделенной из печёночной ткани мышей на фиг. 2С и S10. Образцы ткани брали на 5 день после 4-часового голодания. Данные, полученные с помощью непарного двуххвостового t-теста Стьюдента (n.s. = незначимый), представляют собой среднее ±SEM при n=6 мышей в группе; *р<0.05, ***р<0.001 vs. PBS (c.i.) + IgG контроль;

на фиг. 16 - анализ экспрессии генов с применением мРНК, выделенной из бурой жировой ткани мышей на фиг. 2С, S10 и S11. Образцы ткани брали на 5 день после 4-часового голодания. Данные, полученные с помощью непарного двуххвостового t-теста Стьюдента (n.s. = незначимый), представляют со- 5 030462

бой среднее ±SEM при n=6 мышей в группе; *р<0.05, ***р<0.001 vs. PBS (c.i.) + IgG контроль;

на фиг. 17 А - результаты измерений связывания антитела с фрагментами биотинилированного пептида методом ELISA;

на фиг. 17В - аминокислотные последовательности FGFR1 (аминокислоты 161-212; SEQ ID NO: 27), аминокислотные последовательности пептида #26 (SEQ ID NO: 28) и пептида #28 (SEQ ID NO: 29) наряду с аминокислотами, соответствующими пептиду #26 из FGFR2 (SEQ ID NO: 30), FGFR3 (SEQ ID NO: 31) и FGFR4 (SEQ ID NO: 32), и аминокислоты, соответствующие пептиду #28 из FGFR2 (SEQ ID NO: 33), FGFR3 (SEQ ID NO: 34) и FGFR4 (SEQ ID NO: 35). Различия между последовательностями пептида #26 и пептида #28 в FGFR1 и соответствующей областью FGFR2-4 заключены в прямоугольные рамки;

на фиг. 17С - полученные методом ELISA результаты определения связывания меченного His FGFR1 с белком FGF2 в присутствии R1MAb1 или контрольного IgG в различных концентрациях. Результаты выражены в % связывания FGFR1-His и представляют собой среднее ±SEM (n=3);

на фиг. 17D - связывание иодированного FGF21 с клетками HEK293, стабильно экспрессирующими как KLB, так и FGFR1c в присутствии немеченого R1MAb1 или FGF21 в различных концентрациях (реакционная смесь содержала также BSA (10 мг/мл) и контрольный IgG (350 мМ) для блокирования неспецифического связывания. Результаты выражены в % связанного FGF21 от общего меченного радиоактивной меткой FGF21 в реакционной смеси.

Подробное описание изобретения

I. Определения.

"Каркасный участок акцепторного человеческого антитела" в контексте настоящего изобретения означает каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена лёгкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельного домена лёгкой цепи (VL), полученную из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусной последовательности каркасного участка человеческого антитела, как описано ниже. Каркасный участок акцепторного человеческого антитела, "полученный из" каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусной последовательности каркасного участка человеческого иммуноглобулина, может содержать ту же самую аминокислотную последовательность или он может содержать аминокислотные замены. Согласно некоторым вариантам изобретения число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. Согласно некоторым вариантам изобретения каркасный участок VL акцепторного человеческого антитела идентичен последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или консенсусной последовательности каркасного участка человеческого иммуноглобулина.

"Аффинность" относится к сумме всех нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его (антитела) партнёром по взаимодействию (например, антигеном). Если не указано иначе, в настоящем изобретении "аффинность связывания" относится к собственной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитело и антиген). Аффинность молекулы X к его партнёру Y, как правило, можно представить с помощью константы диссоциации (Kd). Аффинность можно определять количественно обычными методами, известными в уровне техники, включая методы, описанные в настоящей заявке. Конкретные пояснительные характерные варианты количественного определения аффинности связывания описаны ниже.

Термин "агонистическое антитело (антитело-агонист) к (против) FGFR1" относится к антителу, способному связывать FGFR1 с аффинностью, достаточной для того, чтобы это антитело было эффективно в качестве терапевтического агента для активации FGFR1. Согласно одному варианту изобретения степень связывания антитела к FGFR1 с неродственным, не^ОБК]. белком составляет, примерно, менее, 10% связывания этого антитела с FGFR1 по определению, например, радиоиммуноанализом (RIA). Согласно некоторым вариантам изобретения антитело, которое связывается с FGFR1, имеет константу диссоциации (Кб)<1мкМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ, <0.1 нМ, <0.01 нМ или <0.001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например от 10 М до 10 М).

Термин "антитело" применяется в настоящем изобретении в самом широком смысле и охватывает антитела с различной структурой, включая, но без ограничения, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют заданную антиген-связывающую активность.

"Фрагмент антитела" относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит участок интактного антитела, который связывает антиген, связывающийся с интактным антителом. Примеры фрагментов антитела включают, но без ограничения, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образуемые при использовании фрагментов антител.

Термин "химерное" антитело относится к антителу, в котором участок тяжёлой и/или лёгкой цепи получен из конкретного источника или вида, тогда как остальная часть тяжёлой и/или лёгкой цепи получена из другого источника или вида.

- 6 030462

Термин "класс" антитела относится к типу константного домена или константной области, которые содержит его тяжёлая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут дополнительно делиться на подклассы (изотипы) например e.g., IgGi, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgAi и IgAz.

Константные домены тяжёлой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Выражение "эффекторные функции" относится к биологическим активностям, которые можно отнести за счёт Fc области антитела, которая меняется с изменением изотипа антитела. Примеры эффекторных функций включают: связывание C1q субкомпонента и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc рецепторами; антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даунрегуляцию (отрицательную, понижающую регуляцию) рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора) и активацию B-клеток.

"Эффективное количество" агента, например фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение времени, необходимых для достижения нужного терапевтического или профилактического результата.

Термин "Fc область" в настоящей заявке применяется для определения С-концевой области тяжёлой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, участок константной области. Термин включает Fc области нативной последовательности вариантные Fc области. Согласно одному варианту изобретения Fc область тяжёлой цепи человеческого IgG имеет протяжённость от Cys226, или от Pro230, до карбоксильного конца тяжёлой цепи. Однако C-концевой остаток лизина (Lys447) Fc области может присутствовать или отсутствовать. Если в данном описании не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков в Fc области или в константной области соответствует EU системе нумерации, также называемой EU индекс, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Каркасный участок" или "FR" относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырёх FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно располагаются в VH (или VL) в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины "полноразмерное антитело (антитело полной длины)", "интактное антитело" и "целое антитело" применяются в настоящей заявке как синонимы по отношению к антителу, имеющему структуру, практически аналогичную структуре нативного антитела, или имеющему тяжёлые цепи, которые содержат Fc область по определению в настоящей заявке.

Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" применяются как синонимы и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые охватывают первичную трансформированную клетку и полученное из неё потомство вне зависимости от числа пассажей. Потомство может быть полностью идентичным родительской клетке по нуклеотидному составу, но может содержать мутации. Настоящая заявка включает мутантное потомство, которое имеет туже функцию или биологическую активность, что и прошедшая скрининг или отобранная в первоначально трансформированной клетке.

"Человеческое антитело" означает антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, вырабатываемого в человеческом организме или в человеческой клетке, или взятого из источника нечеловеческого происхождения, который использует спектр человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Это определение человеческого антитела определённо исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения.

"Консенсусная каркасная последовательность человеческого антитела" означает последовательность каркасного участка, которая содержит аминокислотные остатки, чаще всего встречающиеся при отборе VL или VH каркасных последовательностей. Как правило, отбор человеческих иммуноглобулиновых VL или VH последовательностей проводят из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Обычно подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу из Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NTH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Согласно одному варианту изобретения для VL подгруппа является подгруппой каппа I в Kabat et al., supra. Согласно одному варианту изобретения для VH подгруппа является подгруппой каппа III в Kabat et al., supra.

"Гуманизированное" антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR нечеловеческого происхождения и аминокислотные остатки из человеческих FR. Согласно некоторым вариантам изобретения гуманизированное антитело содержит, по существу, все из по меньшей мере одного, и как правило из двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVRs (например, CDRs) соответствуют этим областям антитела нечеловеческого происхождения, а все или по существу все участки FRs соответствуют таким участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело, при необходимости, может содержать по меньшей мере участок константной области

- 7 030462

антитела, полученной из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например антитела нечеловеческого происхождения, относится к антителу, которое претерпело процедуру гуманизации.

Термин "гипервариабельная область" или "HVR," по настоящей заявке, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или образующих структурно определённые петли ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные четырёхцепочечные антитела содержат шесть HVRs; три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). HVRs обычно содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из "областей, определяющих комплементарность" (CDRs), причём последние являются областями с наивысшей вариабельностью последовательностей и/или участвуют в узнавании антигенов. Характерные гипервариабельные петли содержат аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (Н3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987).) Типичные области CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) содержат аминокислотные остатки 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 3135В в H1, 50-65 в H2 и 95-102 в H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) За исключением CDR1 в VH области CDR обычно содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. Области CDR содержат также "остатки, определяющие специфичность", или "SDR", которые представляют собой остатки, вступающие в контакт с антигеном. Остатки SDR находятся в областях CDR, называемых короткие (abbreviated) CDRs, или a-CDRs. Примеры a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) включают аминокислотные остатки 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35В в H1, 50-58 в H2 и 95-102 в H3. (См. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619- 1633 (2008).) Если не указано иначе, HVR остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) имеют в данной заявке нумерацию в соответствии с Kabat et al., supra.

"Иммуноконъюгат" означает антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичных молекул.

"Индивидуум" или "субъект" означает млекопитающее. Млекопитающие включают, но без ограничения, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, человека и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). Согласно некоторым вариантам изобретения индивидуумом или субъектом является человек. "Выделенное" антитело означает антитело, которое отделено от компонентов, составляющих его естественную среду. Согласно некоторым вариантам изобретения степень чистоты очищенного антитела составляет более 95 или 99% по определению, например, электрофоретическими (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (IEF, ИЭФ), капиллярным электрофорезом) или хроматографическими (например, ионообменной или обращённо-фазовой ВЭЖХ (HPLC)) методами. Обзор методов определения степени чистоты антитела см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79- 87 (2007).

"Выделенная" нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты (нуклеотидной молекуле), которая очищена от компонентов, составляющих её естественную среду. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащейся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в положении на хромосоме, отличном от её естественного положения на хромосоме.

"Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к FGFR1" относится к молекулам одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих тяжёлую и лёгкую цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(-ие) нуклеотидную(-ые) молекулу(-ы) в одном векторе или в отдельных векторах и такую(-ие) нуклеотидную(-ые) молекулу(-ы) в одном или более местоположений в клетке-хозяине. Термин "моноклональное антитело" в настоящей заявке относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих естественные мутации или образующиеся при получении препарата антитела, причём такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, специфичные к различным детерминантам (эпитопам), причём каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антител специфично к одной детерминанте на антигене. Следовательно, определение "моноклональный" указывает на особенность антитела как полученного из практически гомогенной популяции антител, а не на то, что антитело следует получать каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением, можно получать различными методами, включая, но без ограничения, метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть человеческих иммуноглобулиновых локусов, причём такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител описаны в настоящей заявке. "Нативные антитела" относятся к молекулам природного иммуноглобулина с различной структурой. Например, нативные IgG антитела представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 Да, состоящие из двух идентичных лёгких цепей и двух идентичных тяжёлых цепей, связанных дисульфидной связью. От N-конца к C-концу каждая

- 8 030462

тяжёлая цепь содержит вариабельную область (VH), также называемую вариабельным доменом тяжёлой цепи, а затем три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Аналогично, от N-конца к C-концу каждая лёгкая цепь содержит вариабельную область (VL), также называемую вариабельным доменом лёгкой цепи, а затем константный домен лёгкой цепи (CL). Лёгкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (к) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности её константного домена.

Термин "листок-вкладыш (аннотация)" относится к инструкциям, обычно вкладываемым в продажную упаковку терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, относящихся к применению таких терапевтических продуктов.

"Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" относительно контрольной полипептидной последовательности определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, идентичных аминокислотным остаткам в контрольной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимальной идентичности последовательностей в процентах, и без учёта каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения идентичности аминокислотных последовательностей в процентах можно проводить различными методами, известными специалисту в данной области техники, с применением общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения значения идентичности аминокислотных последовательностей в % получают, используя компьютерную программу сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана компанией Genentech, Inc., и исходный код был подан вместе с документацией для пользователей в Ведомство по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, где он был зарегистрирован под регистрационным номером U.S. Copyright Registration No.TXU510087. Программа ALIGN2 является общедоступной в Genentech, Inc., South San Francisco, California, или её можно скомпилировать с помощью исходного кода. Программу ALIGN-2 следует компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и не меняются.

В тех случаях, когда программа ALIGN-2 применяется для сравнения аминокислотных последовательностей, процентное отношение (%) идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А аминокислотной последовательности, с аминокислотной последовательностью или против данной аминокислотной последовательности В (что в качестве альтернативы можно выразить как "конкретный %, на который данная аминокислотная последовательность А идентична аминокислотной последовательности, с аминокислотной последовательностью или против аминокислотной последовательности В) рассчитывается следующим образом:

100 умножить на соотношение X/Y,

где X означает число аминокислотных остатков, с помощью программы выравнивания последовательностей ALIGN-2 в этой программе выравнивания A и B определённых как попарно тождественные, и где Y означает общее число аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что в тех случаях, когда длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности В, идентичность аминокислотной последовательности A аминокислотной последовательности B в % не будет равна идентичности аминокислотной последовательности B аминокислотной последовательности A в %. Если конкретно не указано иначе, все значения идентичности аминокислотных последовательностей, выраженные в %, используемые в настоящей заявке, получают как описано в предыдущем абзаце с применением компьютерной программы ALIGN-2. Термин "фармацевтическая композиция" относится к составу, который находится в форме, допускающей, чтобы биологическая активность находящегося в композиции активного ингредиента была действенной, и который не содержит дополнительных компонентов с неприемлемой токсичностью по отношению к субъекту, которому эта композиция должна вводиться.

"Фармацевтически приемлемый носитель" относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, нетоксическому по отношению к субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но без ограничения, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Если не указано иначе, термин "Рецептор Фактора Роста Фибробластов 1, или FGFR1," применяемый в настоящей заявке, относится к любому нативному FGFR1 любого позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы). Термин охватывает "полноразмерные", непроцессированные FGFR1, а также любую форму FGFR1, которая является результатом процессинга в клетке. Термин также охватывает природные варианты FGFR1, например варианты, полученные в результате сплайсинга, или аллельные варианты. Аминокислотные последовательности типичного человеческого FGFR1b и типичного человеческого FGFR2b, соответственно, при- 9 030462

водятся ниже

NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPD HRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQ AGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKHSG INSSDAEVLTLFNVTEAQSGEYVCKVSNYIGEANQSAWLTVTRPVAKALEERPAVM TS (SEQ ID NO: 1); и

NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPD HRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQ AGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAG VNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTS (SEQ ID NO: 5).

Применяемый в настоящей заявке термин "лечение (терапия)" (и его грамматические варианты, такие как "лечить") относится к клиническому вмешательству с целью изменить естественное течение заболевания у подлежащего лечению индивидуума и может осуществляться либо профилактически, либо в течение наблюдаемой клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но без ограничения, предупреждение заболевания или рецидива заболевания, частичное снятие симптомов, уменьшение любых непосредственных или опосредованных болезнью последствий заболевания, замедление прогрессирования заболевания, ослабление или временное улучшение болезненного состояния и более благоприятный прогноз. Согласно некоторым вариантам изобретения антитела по изобретению применяются для приостановки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжёлой цепи или лёгкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжёлой цепи и лёгкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причём каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (участка) (FRs) и три гипервариабельных области (участка) (HVRs). (См., например, Kindt et al., Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Единственного VH или VL домена может быть достаточно для придания антиген-связывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, можно выделять, используя VH или VL домен антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL или VH доменов соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880- 887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

Термин "вектор", применяемый в настоящей заявке, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной реплицировать, "размножать" другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся нуклеотидную структуру, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введён. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящей заявке называются "экспрессионными векторами".

I. Композиции и методы.

В одном аспекте изобретение опирается, частично, на открытие агонистических антител к FGFR1 и на терапевтическую активность таких антител. Антитела по изобретению применимы, например, для лечения метаболических заболеваний, включая диабет.

А. Примеры антител к FGFR1.

В одном аспекте изобретение предусматривает выделенные антитела, которые связываются с FGFR1. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело к FGFR1 связывается с FGFR1b и/или FGFR1c и выступает как агонист FGFR1 активности.

В одном аспекте изобретение предусматривает антитело к FGFR1 , содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVRs, выбранных из (a) HVR-Ш, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20; (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело к FGFR1 может быть полностью человеческим, гуманизированным или иметь происхождение, отличное от человеческого. Согласно одному варианту изобретения антитело к FGFR1 содержит HVRs по любому из вышеописанных вариантов и, кроме того, содержит каркасный участок акцепторного человеческого антитела, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или консенсусную последовательность каркасного участка (каркасную консенсусную последовательность).

В другом аспекте антитело к FGFR1 содержит последовательность вариабельного домена тяжёлой цепи (VH), которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична указанной ниже аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 3 или 4

- 10 030462

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTWISWVPGKGLEWVGEIDPYDGDTY YADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCASSGYGGSDYAMDYWGQ (SEQ Ш N0:2),

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNNYIHWVPGKGLEWVADIYPNDGDTD YADS VKGRrTiSADTSKNLQAiNSLRAEDTAVYYCAREHFDA Vv'VHYYVAiDY v'v'GQ (SEQ ID NO: 3), и

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNWISWVPGKGLEWVAEIDPYDGATD YADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYWGQ (SEQ ID NO:

4)·

Согласно некоторым вариантам изобретения последовательность VH, последовательность которой идентична по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с контрольной последовательностью, но антитело к FGFR1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с FGFR1 и обладать агонистической активностью. Согласно некоторым вариантам изобретения в общей сложности в SEQ ID NO: 2, 3 или 4 было сделано от 1 до 10 аминокислотных замен, инсерции и/или делеций. Согласно некоторым вариантам изобретения замены, инсерции или делеции встречаются в областях вне HVRs (т.е. в FRs). При необходимости антитело к FGFR1 содержит VH последовательность в SEQ ID NO: 2, 3 или 4, включающую пост-трансляционные модификации этой последовательности.

В другом аспекте изобретения предусматривается антитело к FGFR1, которое содержит вариабельный домен лёгкой цепи (VL), имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% представленной ниже аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 6).

Согласно некоторым вариантам изобретения последовательность VL с идентичностью по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с контрольной последовательностью, но антитело к FGFR1, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с FGFR1. Согласно некоторым вариантам изобретения в общей сложности в SEQ ID NO: 6 было сделано от 1 до 10 аминокислотных замен, инсерций и/или делеций. Согласно некоторым вариантам изобретения замены, инсерций или делеций встречаются в областях вне HVRs (т.е. в FRs). При необходимости антитело к FGFR1 содержит VL последовательность в SEQ ID NO: 6, включающую пост-трансляционные модификации этой последовательности.

В другом аспекте предусматривается антитело к FGFR1, которое содержит VH по любому из представленных выше вариантов и VL по любому из представленных выше вариантов. Согласно одному варианту изобретения антитело содержит последовательности VH и VL в SEQ ID NO: 2, 3 или 4 и SEQ ID NO: 6, соответственно, включающие пост-трансляционные модификации этих последовательностей. В другом аспекте изобретения антитело к FGFR1 по любому из вышеописанных вариантов представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Согласно одному варианту изобретения антитело к FGFR1 представляет собой фрагмент антитела, например, фрагмент Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или фрагмент F(ab')2. Согласно другому варианту изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное IgG1 антитело или антитело другого класса или изотипа по определению в настоящей заявке.

В другом аспекте антитело к FGFR1 по любому из вышеописанных вариантов может включать любые из признаков, индивидуально или в комбинации, описанных ниже, в разделах 1-7.

1. Аффинность антител.

Согласно некоторым вариантам изобретения антитело по настоящему изобретению имеет константу диссоциации (Kd) <1 мкМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ, <0.1 нМ, < 0.01 нМ или <0.001 нМ (например, 10⁸ М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например от 10^-9М до 10^-13 М).

Согласно одному варианту изобретения Kd определяют анализом связывания с антигеном, меченным радиоактивной меткой (RIA), осуществляемым с использованием Fab варианта соответствующего антитела и его антигена, как описано ниже. Аффинность связывания Fabs с антигеном в растворе определяли, уравновешивая Fab с (¹²⁵I). меченным антигеном в минимальной концентрации в присутствии немеченого антигена для "серийного титрования", а затем улавливали связанный антиген на планшете с иммобилизованным антителом к Fab (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Чтобы создать условия для анализа, многолуночные планшеты MICROTITER® (Thermo Scientific) в течение ночи покрывали улавливающим антителом к Fab в концентрации 5 мкг/мл (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9.6), а затем блокировали 2% (вес./об.) раствором альбумина бычьей сыворотки

- 11 030462

в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (около 23°C). В планшете без адсорбента (Nunc #269620) 100 или 26 пМ [¹²⁵1]-антигена смешивали с серийными разведениями соответствующего Fab (например, соответствующего характеристике антитела к VEGF, Fab-12, в Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Затем соответствующий Fab инкубировали в течение ночи; однако инкубация может продолжаться дольше (например, около 65 ч) для гарантии достижения равновесия. Затем смеси переносили в улавливающий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Раствор удаляли и планшет отмывали восемь раз 0.1% раствором полисорбата 20 (TWEEN-20®) в PBS. После высушивания планшетов добавляли сцинтилляционную жидкость (150 мкл/лунка, MICROSCINT-20™; Packard) и проводили подсчёт сцинтилляций с помощью гамма-счётчиков TOPCOUNT™ (Packard) в течение 10 мин. Концентрации каждого Fab, которые показывали менее или равные 20% от максимального связывания, выбирали для применения в конкурентных анализах связывания.

Согласно другому варианту изобретения величину Kd определяли методом поверхностного плазмонного резонанса на приборах BIACORE®-2000 или BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с применением чипов с иммобилизованным на них антигеном СМ5 при ~10 единицах ответа (RU). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, BIACORE, Inc.) активировали гидрохлоридом ^этил-№-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и Nгидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводили 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ), а затем впрыскивали при скорости потока 5 мкл/минута до достижения около 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Для того чтобы блокировать непрореагировавшие группы, после инжекции антигена вводили 1М раствор этаноламина. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (от 0.78 до 500 нМ) вводили (инжекция) в PBS с 0.05% поверхностно-активного полисорбата 20 (TWEEN-20™) (PBST) при 25°C и при скорости потока около 25 мкл/мин. Константы скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитывали, используя модель простого ленгмюровского связывания один-один (программа BIACORE® Evaluation Software version 3.2) одновременной подгонкой сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как отношение k_off/k_on. См., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865- 881 (1999). Если константа скорости ассоциации превышает 10⁶ М^-1 с^-1 по определению методом поверхностного плазмонного резонанса, см. выше, тогда её можно определить методом тушения флуоресценции, который позволяет количественно определять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C 20 нМ антитела к антигену (Fab формы) в PBS, pH 7.2, в присутствии повышающихся концентраций антигена измерением на спектрометре, таком как спектрофотометр с остановкой потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр серии 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) с кюветой с перемешиванием.

2. Фрагменты антитела.

Согласно некоторым вариантам антитело по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают, но без ограничения, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv и другие фрагменты, описанные ниже. Обзор, посвященный некоторым фрагментам антитела, см. в Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Обзор, посвященный scFv фрагментам, см., например, Pluckthun, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (SpringerVerlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. Также Международную заявку на патент WO 93/16185; и заявки на патент США №№ 5571894 и 5587458. Дискуссию по фрагментам Fab и F(ab')₂, содержащим остатки для связывания с эпитопом рецептора-мусорщика (утилизатора) и имеющим повышенный период полужизни in vivo, см. патент США № 5869046.

Диатела представляют собой фрагменты антитела с двумя антиген-связывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными, или биспецифическими. См., например, Европейский патент EP 404097; Международную заявку на патент WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в статье Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антитела, содержащие весь вариабельный домен тяжёлой цепи или его часть или весь вариабельный домен лёгкой цепи или часть вариабельного домена лёгкой цепи антитела. Согласно некоторым вариантам изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, патент США № 6248516 B1).

Фрагменты антитела можно получать различными методами, включая, но без ограничения, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получение с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е.^Н или фага), как описано в настоящей заявке.

3. Химерные и гуманизированные антитела.

Согласно некоторым вариантам антитело по изобретению представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567; и в статье Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). В одном примере химерное антитело содержит вариа- 12 030462

бельную область антитела нечеловеческого происхождения (например, вариабельную область антитела мыши, крысы, хомячка, кролика или отличного от человека примата, такого как обезьяна) и константную область человеческого антитела. В другом примере химерное антитело представляет собой антитела с "переключённым изотипом", класс или подкласс которых был изменён по сравнению с классом или подклассом исходного антитела. Химерные антитела включают их антиген-связывающие фрагменты.

Согласно некоторым вариантам изобретения химерное антитело является гуманизированным антителом. Как правило, антитело нечеловеческого происхождения гуманизируется с целью понизить иммуногенность по отношению к людям, в то же время сохраняя специфичность и аффинность исходного антитела нечеловеческого происхождения. Обычно гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVRs, например, CDRs, (или их участки) получены из антитела нечеловеческого происхождения, a FRs (или их участки) получены из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело, при необходимости, содержит также часть человеческой константной области. Согласно некоторым вариантам изобретения некоторые FR остатки в последовательности гуманизированного антитела заменены на соответствующие остатки последовательности антитела нечеловеческого происхождения (например, антитела, из которого получены HVR остатки), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности.

Гуманизированные антитела и методы их получения описаны, например, в обзоре Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), и, кроме того, в статьях Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); в патентах США №№ 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; в статьях: Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (описывается SDR-(aCDR) прививка); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (описывается "изменение поверхности" вариабельного домена); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (описывается "FR шаффлинг"); и Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252- 260 (2000) (описывается метод FR шаффлинга с "управляемым отбором").

Человеческие каркасные участки, которые можно использовать для гуманизации, включают, но без ограничения: каркасные участки, выбранные с применением метода "наилучшего приближения" (см., например, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)); каркасные участки консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей лёгкой или тяжёлой цепи (см., например, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); и Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)); человеческие зрелые (соматически мутированные) каркасные участки или каркасные участки человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); и каркасные участки, полученные при скрининге FR библиотек (см., например, Васа et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).

4. Человеческие антитела.

Согласно некоторым вариантам антитело по изобретению представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать различными методами, известными в уровне техники. Человеческие антитела в целом описаны в статьях van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

Человеческие антитела можно получать, вводя иммуноген в трансгенное животное, которое было модифицировано таким образом, чтобы в ответ на антигенный стимул вырабатывать интактные человеческие антитела или интактные антитела с вариабельными областями человеческого происхождения. Такие животные обычно содержат все человеческие иммуноглобулиновые локусы или часть человеческих иммуноглобулиновых локусов, которые заменяют эндогенные иммуноглобулиновые локусы, или которые присутствуют экстрахромосомно или были случайно интегрированы в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные иммуноглобулиновые локусы обычно инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител с использованием трансгенных животных см. в Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США №№ 6075181 и 6150584, в которых описана технология XENOMOUSE™; патент США № 5770429, в котором описывается технология HuMAB®; патент США № 7041870, в котором описывается технология K-M MOUSE®, и опубликованную заявку США на патент US 2007/0061900, в которой описывается технология VELOCIMOUSE®). Человеческие вариабельные области интактных антител, полученные при использовании таких животных, можно дополнительно модифицировать, например, связывая с другой человеческой константной областью.

Человеческие антитела можно получать методом гибридом. Описаны линии клеток миеломы человека и клеток гибридной гетеромиеломы типа мышь-человек для продуцирования человеческих моноклональных антител. (См., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные методом гибридом на основе В- клеток, описаны также в статье Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Другие методы включают методы, описанные, например, в патенте США № 7189826 (описывающем продуцирование моноклональных человеческих IgM при использовании гибридомной линии клеток) и в статье Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (описывающей гибридомы типа человек-человек). Гибридомная тех- 13 030462

нология на основе человеческой гибридомы (триомная технология) описана также в статьях Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Человеческие антитела можно также получать, выделяя последовательности вариабельного домена Fv клона. Такие последовательности вариабельного домена можно затем объединять с заданным человеческим константным доменом. Методы отбора человеческих антител с использованием библиотек антител описаны ниже.

5. Антитела, полученные с использованием библиотек.

Антитела по изобретению можно выделять скринингом комбинаторных библиотек на антитела с заданной активностью или с заданными активностями. Например, в уровне техники известны различные методы получения фаг-дисплейных библиотек и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие заданными характеристиками связывания. Обзор таких методов представлен, например, в Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и, кроме того, эти методы описаны, например, в McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624- 628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NT, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 1246712472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004). В некоторых методах фагового дисплея совокупность генов VH и VL по отдельности клонируют с применением полимеразной цепной реакцией (ПЦР, PCR) и осуществляют случайную рекомбинацию фаговых библиотек, а затем проводят скрининг этих библиотек на антиген-связывающий фаг, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг обычно обнаруживает фрагменты антитела либо в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, либо в виде Fab фрагментов. Библиотеки, полученные с использованием иммунизированных источников, предоставляют антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости конструировать гибридомы. Или же можно клонировать клетки с совокупностью (репертуаром) наивных антител (наивные библиотеки) (например, человеческих антител), чтобы получить один источник антител к широкому ряду несобственных (чужеродных) антигенов и собственных антигенов (аутоантигенов) без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки можно получать синтетическими методами, клонируя нереаранжированные V- генные сегменты с помощью стволовых клеток и используя ПЦР (PCR)-праймеры со случайной последовательностью для кодирования высоковариабельных CDR3 областей и для осуществления реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описываются фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например: патент США № 5750373 и опубликованные заявки на патент США №№ 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, рассматриваются в настоящей заявке как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.

6. Мультиспецифические антитела.

Согласно некоторым вариантам антитело по настоящему изобретению является мультиспецифическим антителом, например биспецифическим антителом. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными сайтами. Согласно некоторым вариантам изобретения одна из специфичностей связывания представляет собой специфичность связывания с FGFR1, а другая представляет собой специфичность связывания с любым другим антигеном, например с бета-Клото. Согласно некоторым вариантам изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами на FGFR1. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител.

Методы получения мультиспецифических антител включают, но без ограничения, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжёлая цепь-лёгкая цепь иммуноглобулина, обладающих разными специфичностями (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), Международную заявку WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и технологию "выступ-во-впадину" (см., например, патент США №5,731,168). Мультиспецифические антитела можно также получать, используя электростатические взаимодействия для получения Fc-гетеродимерных антител (международная заявка WO 2009/089004 A1); сшивание двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); используя лейциновую "застёжку-молнию" для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); используя технологию "диатела" для получения биспецифических фрагментов антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); и используя димеры одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); и получая триспецифические антитела как описано, например, в Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Сконструированные антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания с антигеном, в том числе "антитела Octopus", также включены в настоящее изобретение (см., например, заявку на

- 14 030462

патент США 2006/0025576 А1). Антитело или фрагмент по настоящему изобретению также включает "Fab с двойственной функцией" или "DAF", содержащий антиген-связывающий сайт, который связывается с FGFR1, а также с другим, отличным, антигеном например, Клото-бета (см, например, заявку на патент США US 2008/0069820).

7. Варианты антител.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения предусмотрены варианты аминокислотных последовательностей антител, описанных в данной заявке. Например, может быть желательно повысить аффинность (сродство к связыванию) и/или улучшить другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела могут быть получены за счёт соответствующих модификаций нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело, или путём пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции аминокислот и/или инсерции (вставки) в аминокислотные последовательности антитела, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Получение конечного конструкта может быть осуществлено при любой комбинации делеций, инсерции и замен при условии, что полученный конечный конструкт обладает желательными характеристиками, например антигенсвязывающей способностью.

а) Варианты замен, инсерции и делеций.

Согласно некоторым аспектам данного изобретения предусмотрены варианты антител, имеющих одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для механизмов возникновения замен, включают HVRs и FRs. Примеры консервативных замен показаны в табл. 1 под заголовком "консервативные замены". Более существенные изменения показаны в табл. 1 под заголовком "примеры замен" и описаны далее при характеристике классов боковых цепей аминокислот. В антитело, представляющее интерес, могут быть введены аминокислотные замены, и полученные продукты могут быть подвергнуты скринингу на желательную активность, например сохранившуюся/повышенную способность к связыванию антигена, сниженную иммуногенность или повышенную ADCC или CDC.

Таблица1

В соответствии со свойствами боковых цепей аминокислоты подразделяются на следующие группы:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) аминокислоты с остатками, которые влияют на ориентацию цепей: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

- 15 030462

Неконсервативные замены включают в себя обмен члена одного из указанных классов на член другого класса.

Один вид варианта замен включает замену одного или более остатков гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Обычно полученный (-ые) вариант (-ы) антитела, отобранного для проведения дальнейших исследований, будет (будут) иметь некоторые изменённые (например, улучшенные) биологические свойства (например, повышенную аффинность, сниженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или будут обладать по существу сохранившимися некоторыми биологическими свойствами родительского антитела. Примером варианта замен является получение антитела с созревшей аффинностью, например, при помощи методов аффинного созревания с использованием фагового дисплея, таких как описанные в данной заявке. Вкратце, этот метод состоит в том, получают мутацию одного или более остатков в гипервариабельной области HVR, и вариантные антитела проявляются фагом и затем подвергаются скринингу на желательную биологическую активность (например, связывающую способность).

Изменения (например, замены) могут быть осуществлены в HVRs, например, с целью повышения аффинности антитела. Такие изменения могут производиться в "гипервариабельных участках" вариабельных областей (HVR), т. е. в остатках, которые кодированы кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или SDRs (a-CDRs), полученный вариант VH или VL тестируют для определения аффинности. Был описан метод созревания аффинности путём конструирования и повторной селекции при помощи вторичных библиотек, см., например, Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) В соответствии с некоторыми вариантами созревания аффинности по данному изобретению в вариабельных генах, выбранных для созревания, любым из методов (например, методом ПЦР с внесением ошибок, методом перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза) генерируют разнообразие. Затем создаётся вторичная библиотека. После этого проводят скрининг этой библиотеки для идентификации любых вариантов антитела с желательной аффинностью. Другой метод введения разнообразия включает подходы с использованием HVR, когда несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один приём) рандомизируются. Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, могут быть специфически идентифицированы, например, с помощью сканирующего аланином мутагенеза или моделирования. Особенно часто мишенями являются CDR-H3 и CDR-L3.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения замены, инсерции или делеции могут происходить в одной или более HVRs, до тех пор, пока такие изменения не снижают существенно способность антитела связывать антиген. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены, описанные в данной заявке), которые не снижают существенно связывающую способность, могут быть осуществлены в HVRs. Такие изменения могут находиться вне гипервариабельных участков HVR или SDRs. Согласно некоторым вариантам изобретения в вариантных последовательностях VH и VL, полученных как описано выше, каждая HVR или остаётся без изменений, или содержит не более одной, двух или трёх аминокислотных замен.

Один из методов идентификации остатков или областей антитела, которые могут быть выбраны для осуществления мутагенеза, называется "сканирующий аланином мутагенез", который описан в публикации Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Согласно этому методу остаток или группа, являющиеся мишенями (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu), идентифицируются и заменяются нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (например, аланином или полиаланином) с целью определения влияния на взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замены могут быть произведены в местах локации аминокислот, что демонстрирует функциональную чувствительность к первоначальным заменам. Альтернативно или дополнительно, для идентификации точек контакта между антителом и антигеном может быть использована кристаллическая структура комплекса антиген-антитело. Такие контактирующие остатки и соседние остатки могут являться мишенями или могут быть удалены как кандидаты для замены. Варианты могут быть подвергнуты скринингу для того, чтобы определить, обладают ли они желательными свойствами.

Инсерции аминокислотных последовательностей включают слияния на амино- и/или карбоксильном концах, отличающиеся по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции одного или многих остатков аминокислот в последовательности. Примеры концевых инсерции включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие варианты инсерции в молекулу антитела включают слияние по N-концу или С-концу антитела с ферментом (например, ферментом ADEPT) или полипептидом, который увеличивает период полужизни в сыворотке антитела.

б) Варианты гликозилирования.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения осуществляют модификацию антитела, описанного в данной заявке, с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования. Добавление или делеция сайтов гликозилирования в антитело может быть легко осуществлена путём такого изменения аминокислотной последовательности, чтобы она содержала или же не содержала один или более сайтов гликозилирования.

- 16 030462

Когда антитело содержит область Fc, может быть осуществлено изменение углевода, присоединённого к этой области. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвлённый двухантенный олигосахарид, который, как правило, присоединён при помощи N-связи к Asn297 домена CH2 в области Fc. См., например, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать звенья различных углеводов, например, маннозы, N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), галактозы и сиаловой кислоты, а также звенья фукозы, присоединённые к GlcNAc в "стволе" структуры двухантенного олигосахарида. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения модификации олигосахарида в антителе по изобретению могут быть осуществлены для того, чтобы получить варианты антитела с некоторыми улучшенными свойствами.

Согласно одному из вариантов данного изобретения получают варианты антитела, содержащие олигосахарид со структурой, в которой нет звеньев фукозы, присоединённых (непосредственно или косвенно) к области Fc. Например, количество звеньев фукозы в таком антителе может быть равным от 1 до 80%, от 1 до 65%, от 5 до 65% или от 20 до 40%. Количество фукозы можно определить путём определения отношения среднего количества фукозы в сахарной цепи в остатке Asn297 к сумме всех гликоструктур, присоединённых к Asn297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы) с помощью метода масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано, например, в международной заявке WO 2008/077546. Обозначение Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному около положения 297 в области Fc (номенклатура EU для остатков в области Fc); однако остаток Asn297 может быть также расположен примерно на ±3 аминокислотных остатка ближе или дальше в направлении 5'-3' или в направлении 3'-5' от положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за незначительной вариации последовательностей в антителах. Такие варианты фукозилирования могут обладать повышенной ADCC. См., например, опубликованные заявки США на патент №2003/0157108 (Presta, L.); 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к "дефукозилированным" вариантам антителе или к вариантам антитела "с дефицитом фукозы", включают заявку США на патент № 2003/0157108; международные заявки WO 2000/61739; WO 2001/29246; заявки США на патент №№ 2003/0115614; 2002/0164328; 2004/0093621; 2004/0132140; 2004/0110704; 2004/0110282; 2004/0109865; международные заявки WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; публикации Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, которые способны продуцировать дефукозилированные антитела, включают клеточную линию Lec13 СНО с дефицитом фукозилирования белка (см. Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявку США на патент №2003/0157108 A1, Presta L.; и международную заявку WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно пример 11 в этой заявке), и линии клеток с нокаутом гена, такого как ген альфа-1,6фукозилтрансферазы, FUT8, линии клеток СНО с нокаутированным геном (см., например, YamaneOhnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и международную заявку WO 2003/085107). Данное изобретение предусматривает также антитела с разделёнными олигосахаридами, например антитела, в которых двухантенный олигосахарид, присоединённый к области Fc антитела, разделён GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженную степень фукозилирования и/или повышенную ADCC. Примеры таких вариантов антитела описаны, например, в международной заявке WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); в патенте США № 6602684 (Umana et al.); и в заявке США на патент № 2005/0123546 (Umana et al). Предусмотрены также варианты антитела с по меньшей мере одним остатком галактозы в олигосахариде, который присоединён к области Fc. Такие варианты антител могут обладать повышенной CDC. Такие варианты антитела описаны, например, в международных заявках WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju S.); и WO 1999/22764 (Raju S.).

в) Варианты Fc-области.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения в Fc-область антитела по изобретению могут быть введены одна или более аминокислотных модификаций, при этом образуется вариант Fc-области. Вариант Fc-области может включать последовательность человеческой Fc-области (например, Fcобласти человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более положении аминокислоты.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения предусмотрен также вариант антитела, который обладает несколькими, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для областей применения, в которых период ш vivo полужизни антитела является важным, а некоторые эффекторные функции (такие как комплемент-зависимая цитотоксичность и клеточноопосредованная цитотоксичность(ADCC)) не являются необходимыми или являются вредными. Могут быть проведены in vitro и/или in vivo определения цитотоксичности для того, чтобы подтвердить уменьшение/элиминацию CDC и/или ADCC. Например, может быть проведён анализ связывания с рецептором Fc (FcR) для того, чтобы убедиться в том, что у антитела отсутствует способность к связыванию Fc/R (и при этом, вероятно, отсутствует ADCC), но сохраняется способность к связыванию FcRn. Первичные клетки, которые медиируют ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcR III, в то время как моноциты экспрессируют Fc RI, FcR II и FcR III. Экспрессия FcR в гематопоетических клетках показана в табл. 3 на

- 17 030462

стр. 464 публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991).

Неограничивающие примеры методов in vitro анализа для оценки ADCC молекулы, представляющей интерес, описаны в патенте США № 5500362 (см. например, Hellstrom I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); патент США №5821337 (см. Bruggemann M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Или же можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный метод анализа цитотоксичности ACTI™ с помощью проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); и нерадиоактивный метод анализа цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Эффекторные клетки, пригодные для проведения таких анализов, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC молекулы, представляющей интерес, можно определить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в публикации Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Может быть проведено определение связывания C1q для подтверждения того, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, не обладает комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). См., например, описание связывания C1q и С3с, определённого методом ELISA, в международных заявках WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно применять определение CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Можно также провести определение связывания FcRn и in vivo определение клиренса/периода полужизни методами, известными из уровня техники (см., например, Petkova S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)). Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела, содержащие замены одного или более остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc-области (патент США №6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутанты с заменами в двух или более положениях 265, 269, 270, 297 и 327 аминокислот, включая так называемый "DANA" Fcмутант с заменой остатков в положениях 265 и 297 на аланин (патент США №7332581).

Описаны также некоторые варианты антител с увеличенной или уменьшенной способностью к связыванию FcRs. (См., например, патент США №6737056; WO 2004/056312, и публикацию Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) Согласно некоторым вариантам изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, с заменами в положениях 298, 333 и/или 334 в Fc-области (EU система нумерации остатков).

Согласно некоторым вариантам в Fc-области проводятся изменения, которые приводят к изменённой (т.е. или увеличенной, или уменьшенной) способности к связыванию C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, изменения, описанные, например, в патенте США №6194551, WO 99/51642, и в публикации Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Антитела с увеличенным периодом полужизни и повышенной способностью к связыванию неонатального Fc-рецептора (FcRn), который отвечает за передачу материнского IgGs плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в заявке США на патент №2005/0014934А1 (Hinton et al.). Такие антитела содержат Fc-область с одной или более заменами, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами одного или более остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка в положении 434 в Fc-области (патент США №7371826). См., также публикацию Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821; и заявку WO 94/29351, которые касаются других примеров вариантов Fc-области.

г) Варианты сконструированного антитела с цистеиновыми заменами.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения может быть желательно получить сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, например "тиoMAbs", в которых один или более остатков антитела заменены остатками цистеина. Согласно конкретным вариантам изобретения заменяемые остатки находятся в доступных сайтах антитела. Путём замены этих остатков цистеиновыми остатками реакционноспособные тиольные группы локализируются в доступных сайтах антитела и могут быть использованы для соединения антитела с другими молекулами, такими как молекулы лекарства или молекулы комплекса линкер-лекарство, для получения иммуноконъюгата, как описано далее. Согласно некоторым вариантам изобретения любой один или любые несколько остатков могут быть заменены цистеиновым остатком: V205 (нумерация по Кабату) лёгкой цепи; А118 (EU нумерация) тяжёлой цепи; и S400 (EU нумерация) тяжёлой цепи Fc-области. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами могут быть получены, как описано, например, в патенте США № 7521541.

д) Производные антитела.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения предусмотрено антитело, описанное в данной заявке, которое модифицировано путём введения небелковых фрагментов, известных из уровня техники и являющихся легко доступными. Такие вещества, пригодные для получения производных антитела, включают, но без ограничения, растворимые в воде полимеры. Неограничивающие примеры растворимых в воде полимеров включают, но без ограничения, полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленг- 18 030462

ликоля с пропиленгликолем, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена с малеиновым ангидридом, полиаминокислоты (или гомополимеры, или статистические сополимеры) и декстран или сополимер поливинилпирролидона с полиэтиленгликолем, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида с этиленоксидом, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и смеси вышеуказанных полимеров. При получении таких производных может быть предпочтительным сополимер полиэтиленгликоля с пропионовым альдегидом благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвлённым или неразветвлённым. Количество полимеров, присоединённых к антителу, может меняться, и, если присоединено более одного полимера, они могут быть разными или одинаковыми молекулами. В целом, количество и/или тип полимеров, используемых для получения производных антитела, могут быть определены на основе ряда факторов, включающих, но без ограничения, конкретные свойства или функции антитела, которые должны быть улучшены, если производное антитела будет использовано в терапии в определённых условиях, и т.д.

Согласно другому варианту изобретения получают конъюгаты антитела и небелкового вещества, которые могут быть селективно нагреты при действии облучения. Согласно одному из вариантов небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Облучение проводится при любой длине волны и включает, но без ограничения, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые позволяют нагреть небелковый фрагмент до температуры, при которой клетки, проксимальные к конъюгату антитело-небелковый фрагмент, погибают.

В. Рекомбинантные методы и композиции.

Антитела могут быть получены с помощью рекомбинантных методов и композиций, например, как описано в патенте США №4816567. Согласно одному из вариантов данного изобретения получают выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело к FGFR1, описанное в данной заявке. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, лёгкой и/или тяжёлой цепей антитела). Согласно другому варианту получают один или более векторов (например, векторов экспрессии), которые содержат такую нуклеиновую кислоту. Согласно ещё одному варианту изобретения получают клетку хозяина, содержащую такую нуклеиновую кислоту. Согласно одному из таких вариантов клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела и второй вектор, включающий аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. Согласно одному из вариантов клетка хозяина представляет собой эукариотную клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, клетку YO, NSO, Sp20). Согласно одному из вариантов предусмотрен способ получения антитела к FGFR1, при этом этот способ включает культивирование клетки хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела и, возможно, для выделения антитела из клетки хозяина(или из культуральной среды для клетки хозяина).

Для рекомбинантного получения антитела к FGFR1, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, например, как описано выше, выделяется и инсерцируется в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в хозяйской клетке. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с использованием обычных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжёлые и лёгкие цепи антитела).

Хозяйские клетки, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотные или эукариотные клетки, описанные в данной заявке. Например, антитела могут быть продуцированы бактериями, в особенности, когда не нужны гликозилирование и эффекторная функция Fc. Экспрессия фрагментов антитела и полипептидов в бактериях описаны, например, в патентах США №№ 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также публикацию Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, в которой описана экспрессия фрагментов антитела в Е. coli). После экспрессии антитело может быть выделено в растворимой фракции пасты бактериальных клеток и затем очищено.

В дополнение к прокариотам эукариотные микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, пригодны для клонирования или экспрессии хозяев для векторов, кодирующих антитело, включая штаммы грибов и дрожжей, у которых были "гуманизированы" сигнальные пути гликозилирования, что привело к продуцированию антитела с частично или полностью человеческим паттерном гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Хозяйские клетки, подходящие для экспрессии гликозилированного антитела, могут также получаться из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные штаммы баку- 19 030462

ловирусов, которые могут быть использованы в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Культуры клеток растений также могут быть использованы в качестве хозяев. См., например, патенты США №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (в них описана технология PLANTIBODIES™ для продуцирования антител в трансгенных растениях).

Клетки позвоночных организмов также могут быть использованы в качестве хозяев. Например, клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы для выращивания в суспензии, могут также применяться. Другие примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают линию клеток почки обезьян CV1, трансформированную при помощи SV40 (COS-7); линию клеток почки человеческого эмбриона (клетки 293 или 293, описанные, например, в публикации Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977); клетки почки новорождённого хомячка (BHK); мышиные клетки Сертоли (ТМ4 клетки, описанные, например, в публикации Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зелёной обезьяны (VERO-76); клетки карциномы шейки матки (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крыс линии Buffalo (BRL 3А); клетки лёгкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы (ММТ 060562); TRI клетки, описанные, например, в публикации Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие пригодные линии хозяйских клеток млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR" CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и линии клеток миеломы, таких как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий хозяйских клеток, подходящих для получения антител, приведён, например, в публикации Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

C. Методы анализа.

Антитела к FGFR1, описанные в данной заявке, могут быть идентифицированы и подвергнуты скринингу для определения их физических/химических свойств и/или видов биологической активности методами анализа, которые хорошо известны из уровня техники.

1. Определение связывающей способности и другие анализы.

В соответствии с одним аспектом изобретения антитело по изобретению тестируется на его антигенсвязывающую активность известными методами, такими как метод ELISA, вестерн-блоттинг и т.п.

2. Определение активности.

Согласно одному аспекту изобретения предусмотрены методы анализа для идентификации антител к FGFR1, обладающих агонистической активностью. Например, биологическая активность может включать способность активировать сигнальную трансдукцию конкретных сигнальных путей, которая может быть определена путём измерения уровней фосфо-FRS2a, фосфо-MEK, фосфо-ERK/MAPK, фосфоSTAT3 или с помощью методов с применением люциферазного анализа, основанных на использовании GAL-Elk1, описанных в данной заявке (см. также, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 5; 282(40):29069-72 (2007) и Wu et al., PLoS One 18;6(3):el7868 (2011)). Предусмотрены также антитела, обладающие такой in vivo и/или in vitro активностью.

D. Иммуноконъюгаты.

Данное изобретение предусматривает также иммуноконъюгаты, включающие антитело к FGFR1, конъюгированное с одним или более цитотоксичными агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарства, агенты, ингибирующие рост, токсины (например, белковые токсины, токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения с ферментативной активностью или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

Согласно одному из вариантов иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более лекарствами, включая, но без ограничения, майтанзиноид (см. патенты США №5208020, 5416064 и европейский патент ЕР 0425235 В1); ауристатин, такой как фрагменты DE и DF монометилауристатина (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США №№ 5635483 и 5780588, а также 7498298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. патенты США №№ 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; публикации Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:15291532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и патент США №6630579); метотрексат; виндесин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тесетаксел и ортатаксел; трихотецен и CC1065.

Согласно другому варианту иммуноконъюгат включает антитело, описанное в данной заявке, конъюгированное с токсином, обладающим ферментативной активностью, или его фрагментом, включая, но без ограничения, цепь дифтерии (фрагмент А), несвязывающие активные фрагменты токсина дифтерии, цепь экзотоксина А (из Pseudomonas aeruginosa), цепь рицина А, цепь абрина А, цепь модецина А, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAPS), ингибитор momordica charantia (момордика харантская), курцин, кротин, ингибитор sapaonaria offici- 20 030462

nalis (мыльнянка лекарственная), гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. Согласно ещё одному варианту иммуноконъюгат включает антитело, описанное в данной заявке,

конъюгированное с радиоактивным элементом с образованием радиоконъюгата. Для получения радио211 131 125

конъюгатов можно применять различные радиоактивные изотопы. Примеры включают At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi , P , Pb и радиоактивные изотопы Lu. Когда радиоконъюгат применяют для детекции, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc-99m или I-123, или спиновую метку для получения изображений с помощью ядерного магнитного резонанса (NMR) (известного также как магнитно-резонансная томография MRI), такую как опятьтаки йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, угдерод-13, азот-15, кислород-17, изотопы гадолиния, марганца или железа.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены при помощи различных агентов сочетания с белками, таких как ^сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (SPDP), сукцинимидил4-^-мальимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипинат HCl), активные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидные соединения (такие как бис-(пазидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуилен-2,6-диизоцианат) и активные дифторсодержащие соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано в публикации Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Примером хелатирующего агента для конъюгирования радионуклида с антителом является меченный углеродом-14 1-изотиоцианатбензил3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA). См. международную заявку WO 94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", который способствует высвобождению цитотоксического лекарства в клетке. Например, он может быть кислотно-расщепляемым линкером, линкером, чувствительным к действию пептидазы, фотолабильным линкером, диметильным линкером или линкером, содержащим дисульфидные связи (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США №5208020).

Иммуноконъюгаты или комплексы антитело-препарат (ADCs), заявленные по данному изобретению, включают, но не без ограничения, такие конъюгаты, которые получены с помощью кросс-линкеров, включающих, но без ограничения, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, в Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA).

E. Способы диагностики и детекции и применяемые при этом композиции. Согласно некоторым вариантам любое из антител к FGFR1, предусмотренных данным изобретением, можно применять для детекции FGFR1 в биологическом образце. Термин "детекция", используемый в данной заявке, охватывает количественное или качественное обнаружение. Согласно некоторым вариантам биологический образец представляет собой клетку или ткань, такую как бурая жировая ткань, ткань поджелудочной железы, печёночная ткань, белая жировая ткань и опухолевая ткань. Согласно одному из вариантов изобретение предусматривает антитело к FGFR1 для применения в способе диагностики или детекции. Согласно другому аспекту изобретение предусматривает способ детекции наличия FGFR1 в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам данного изобретения этот способ включает контактирование биологического образца с антителом к FGFR1 при условиях, которые допускают связывание антитела к FGFR1 с FGFR1, и детекцию наличия комплекса, образовавшегося из антитела к FGFR1 и FGFR1. Такой способ может осуществляться in vitro или in vivo. Согласно одному из вариантов антитело к FGFR1 применяется для отбора субъектов, пригодных для проведения лечения с помощью антитела к FGFR1, например, когда FGFR1 является биомаркёром для отбора пациентов. Согласно некоторым вариантам изобретения предусмотрены меченые антитела к FGFR1. Метки включают, но без ограничения, метки или фрагменты, которые можно обнаружить непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронноплотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также вещества, такие как ферменты или лиганды, которые обнаруживаются косвенно, например, с помощью ферментативной реакции или молеку32 14 125 3

лярного взаимодействия. Примеры меток включают, но без ограничения, радиоизотопы Р, С, I, H, and ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (см. патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаров, например глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксатиноксидаза, соединённые с ферментом, который использует перекись водорода для окисления предшественника красителя, такого как HRP, лактопероксидазу или микропероксидазу, биотин/авидин, спин-метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т. п.

F. Фармацевтические формы.

Фармацевтические формы, содержащие антитело к FGFR1, описанное в данной заявке, получают в

- 21 030462

виде лиофилизированных составов или водных растворов путём смешения такого антитела с желательной степенью чистоты с одним или более возможными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Фармацевтически приемлемые носители в применяемых дозах и концентрациях обычно являются нетоксичными для реципиентов и включают, но без ограничения, буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и некоторые органические кислоты, антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, гексаметонийхлорид, бензалконийхлорид, бентонийхлорид, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол), низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Примеры фармацевтически приемлемых носителей согласно данному изобретению включают также диспергирующие агенты для лекарств от интерстициальных болезней, такие как растворимые в нейтральных условиях активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Некоторые sHASEGPs и способы их применения, включая применение rHuPH20, описаны в опубликованных заявках США на патент №2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному аспекту данного изобретения sHASEGP комбинируется с одной или более дополнительными гликозаминогликанами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных составов, содержащих антитела, описаны в патенте США №6267958. Водные составы, содержащие антитела, включают составы, которые описаны в патенте США №6171586 и заявке WO 2006/044908, последние составы включают гистидин-ацетатный буфер.

Состав по изобретению может также содержать более одного активного ингредиента, когда это необходимо для конкретной болезни, подвергаемой лечению, предпочтительно, когда эти ингредиенты обладают дополнительной активностью и эти активности не влияют отрицательно друг на друга. Например, может быть желательно добавить аналог glp-1 (например, антитело к GCGR) или лептин. Такие активные ингредиенты обычно содержатся в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, методом коацервации или путём межфазной поликонденсации, например в капсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и в микрокапсулы из полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарства (например, в липосомы, наночастицы и нанокапсулы) или эти ингредиенты могут содержаться в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть также получены препараты с пролонгированным высвобождением лекарства. Подходящие примеры препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твёрдых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом такие матрицы бывают в виде формованных изделий, например плёнок или микрокапсул.

Составы, которые должны применяться для in vivo введения, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, путём фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.

G. Терапевтические способы и композиции.

При осуществлении терапевтических способов согласно изобретению может быть использовано любое из агонистических антител к FGFR1.

Согласно одному из аспектов данного изобретения предусмотрено агонистическое антитело к FGFR1 для применения в качестве лекарственного средства. Согласно другим аспектам изобретение предусматривает агонистическое антитело к FGFR1 для применения при лечении метаболического заболевания. Согласно некоторым вариантам предусмотрено агонистическое антитело к FGFR1 для применения при осуществлении способа лечения. Согласно некоторым вариантам изобретение предусматривает агонистическое антитело к FGFR1 для применения при осуществлении способа лечения индивидуума, страдающего от метаболического заболевания, который включает введение этому индивидууму эффективного количества антитела к FGFR1. Согласно одному такому варианту этот способ включает также введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например аналога glp-1, синтетического амилина, антагониста рецептора глюкагона (например, антитела к GCGR) или лептина. Согласно любому из описанных выше вариантов "индивидуум" предпочтительно представляет собой человека.

Согласно ещё одному аспекту данное изобретение предусматривает применение агонистического антитела к FGFR1 при изготовлении или получении лекарственного средства. Согласно одному из вари- 22 030462

антов лекарственное средство предназначено для лечения метаболического заболевания. Согласно ещё одному варианту лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения метаболического заболевания, который включает введение индивидууму, страдающему от метаболического заболевания, эффективного количества лекарственного средства. Согласно одному такому варианту этот способ включает также введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, из числа, описанных ниже. Согласно любому из описанных выше вариантов "индивидуум" предпочтительно представляет собой человека.

Согласно ещё одному аспекту данное изобретение предусматривает способ лечения метаболического заболевания. В соответствии с одним вариантом этот способ включает введение индивидууму, страдающему от метаболического заболевания, эффективного количества агонистического антитела к FGFR1. Согласно одному такому варианту этот способ включает также введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, из числа описанных ниже. Согласно любому из описанных выше вариантов "индивидуум" предпочтительно представляет собой человека.

Согласно другому аспекту данное изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие любое из агонистических антител к FGFR1, заявленных в данной заявке, например, для применения при осуществлении любого из описанных терапевтических способов. Согласно одному из вариантов фармацевтическая композиция содержит любое из агонистических антител к FGFR1, заявленных в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно другому варианту фармацевтическая композиция содержит любое из агонистических антител к FGFR1, заявленных в данной заявке, и по меньшей мере один терапевтический агент из числа описанных ниже.

Антитела по изобретению могут быть использованы в терапии или сами по себе или в комбинации с другими агентами. Например, антитело по изобретению может вводиться вместе с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. В соответствии с некоторыми вариантами дополнительный терапевтический агент представляет собой аналог glp-1, синтетический амилин, антагонист рецептора глюкагона (например, антитело к GCGR) или лептин.

Такая комбинированная терапия, как описано выше, включает совместное введение (когда два или более терапевтических агента включены в один и тот же состав или в разные составы) и раздельное введение, при этом в последнем случаев введение антитела по изобретению может осуществляться до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитело согласно данному изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) могут быть введены любым подходящим способом, включая парентеральное введение, внутрилёгочное и интраназальное введение и, если это желательно при локальном лечении, введение внутрь поражённых тканей. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Введение осуществляют любым подходящим способом, например путём инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, каким является введение - кратковременным или длительным.

Данное изобретение предусматривает различные схемы лечения, включая, но без ограничения, однократное введение или многократное введение в разные моменты времени, введение болюсов и инфузию пульсирующей струёй.

Антитела согласно данному изобретению могут вводиться в состав лекарственных форм, дозироваться и вводиться в соответствии с надлежащей медицинской практикой. В этом контексте следует принимать во внимание такие факторы, как вид заболевания, подвергающегося лечению, вид млекопитающего, подвергающегося лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причина заболевания, место, куда доставляется активный агент, способ введения, схема введения и другие факторы, известные практикующим врачам.

При этом антитело не обязательно должно вводиться в состав вместе с одним или более другими агентами, применяемыми для профилактики или лечения данного заболевания. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, содержащегося в составе, вида расстройства или вида лечения и других факторов, которые обсуждались выше. Эти другие агенты обычно применяются в тех же дозах и вводятся таким же способами, которые описаны в данной заявке, или в количестве равном примерно от 1 до 99% от величин доз, указанных в данной заявке, или они вводятся в любых дозах и любыми способами введения, которые определяются эмпирически или клинически и считаются подходящими. Для профилактики или лечения заболевания соответствующая доза антитела по изобретению (применяемого в отдельности или в комбинации с одним или более другими терапевтическими агентами) будет зависеть от вида болезни, которая подвергается лечению, вида антитела, степени серьёзности и развития болезни, когда антитело вводится для профилактических или терапевтических целей, от предыдущего лечения, клинической истории болезни пациента и ответа на введение антитела и усмотрения лечащего врача. Антитело обычно вводится пациенту один раз или курсами. В зависимости от вида и степени серьёзности болезни возможная начальная доза антитела для введения пациенту может составлять от примерно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг), как, например, при однократном введении или нескольких отдельных введениях, так и путём непрерывной инфузии.

- 23 030462

Одна типичная величина дневной дозы может колебаться от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от факторов, упомянутых выше. При повторяющемся введении в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния пациента лечение обычно продолжается до тех пор, пока не произойдёт желательного подавления симптомов болезни. Одна примерная величина дозы антитела находится в пределах от 0,05 до 10 мг/кг. Таким образом, пациенту могут быть введены одна или несколько доз равных примерно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Такие дозы могут вводиться периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от примерно двух до примерно двадцати доз или, например, примерно шесть доз антитела).

Можно вводить пациенту вначале более высокую дозу и затем одну или несколько более низких доз. Однако можно применять и другие схемы лечения. За результатами такой терапии можно легко следить с помощью обычных методов анализа.

H. Изделия.

Согласно ещё одному аспекту данное изобретение предусматривает изделие, содержащее вещества, которые пригодны для лечения, профилактики и/или диагностики заболеваний, описанных выше. Изделие включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке на контейнере или связанной с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, упаковки с раствором для внутривенных инъекций и т.п. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию или её комбинацию с другой композицией, эффективной для лечения, профилактики и/или диагностики заболевания и может иметь стерильный доступ (например, контейнер может представлять собой упаковку с раствором для внутривенных инъекций или флакон, имеющий пробку, которую можно проткнуть иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции является антителом согласно изобретению. Этикетка или листовка-вкладыш содержит указание, что композиция может быть использована для лечения той или иной болезни. Более того, изделие может включать (а) первый контейнер с композицией, содержащейся в нём, при этом такая композиция содержит антитело по изобретению; и (б) второй контейнер с композицией, содержащейся в нём, при этом такая композиция содержит дополнительный цитотоксический агент или другой терапевтический агент. Согласно этому варианту изобретения контейнер может дополнительно содержать листовку-вкладыш, указывающую, что эти композиции могут быть применены для лечения конкретного заболевания. Альтернативно или дополнительно, изделие может также включать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может также включать другие компоненты, которые желательны с коммерческой точки зрения или с точки зрения пользователей, в том числе, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

III. Примеры.

Ниже следуют примеры способов и композиций по данному изобретению. Следует иметь в виду, что могут быть осуществлены и другие варианты при условии ознакомления с общим описанием, содержащимся в данной заявке.

Пример 1. Получение и определение характеристик антител к агонисту FGFR1.

Мы получали моноклональные антитела, специфические к FGFR1, с использованием технологии фагового дисплея и His-меченого IgD2-D3 человеческих FGFR1b и с в качестве антигенов. Для пэннинга использовали фаговые библиотеки человеческих антител с синтетическим разнообразием в выбранных определяющих комплементарность областях (H1, H2, H3, L3), имитирующих природный иммунный репертуар человеческих IgG. Бивалентные фрагменты Fab экспонировались на поверхности частиц бактериофага М13 (Lee et al., J. Immunol. Methods 284:119-32 (2004)).

Ранее был описан протокол такого пэннинга (Liang et al., J. Mol. Biol. 366:815-29 (2007)). После проведения скрининга при помощи иммуноферментного анализа (ELISA) фагов были идентифицированы многие клоны из множества библиотек, уникальные и специфичные фаговые антитела. Для определения аффинности связывания антител с человеческими FGFRs использовали стандартный протокол ELISA, с применением 2 мкг/мл химерных белков Fc FGFR1 ECD-человеческий Fc. Мы также определяли связывающую способность антител к FGFR1, применяя технологию Biacore/SPR при помощи прибора BIAcore™ T100, как описано в публикации (Liang et al., supra), со следующими изменениями. Вначале на чип BIAcore™ CM5 на основе карбоксиметилированного декстрана наносили мышиное антитело к человеческому Fc, используя прямое сочетание со свободными аминогруппами после процедуры, описанной производителем. Затем антитело захватывалось биосенсорными чипами СМ5 для достижения примерно 200 единиц ответа (RU) присоединённого антитела.

Определение связывания осуществляли, используя подвижный буфер, состоящий из 10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20 (буфер HBS-P). Серии двукратных разведений белка меченого ECD-His FGFR1 до 1,550 нМ инъецировали в буфер HBS Р со скоростью потока, равной 30 мкл/мин при температуре 25°C. Скорости ассоциации (K_on в мол/с) и скорости диссоциации (K_off, в с) вычисляли с использованием простой взаимно однозначной модели связывания Ленгмюра

- 24 030462

(программное обеспечение BIAcore™ Evaluation, версия 3.2). Равновесную константу диссоциации (Kd, в мол) вычисляли как отношение K_off/K_on.

Два из антител к FGFR1, которые были идентифицированы, как описано выше, при проведении независимых экспериментов (обозначенные в данной заявке как R1MAb1 и R1MAb2) связывали FGFR1b и FGFR1c с эквивалентной аффинностью, но этого не наблюдалось в случае других изоформ FGFR (фиг. 1А и 1В). Их сигнальная активность была определена с использованием методов, основанных на использовании люциферазы и Gal-Elk1 в клетках крысы L6, в которых отсутствуют эндогенные FGFRs, трансфицированных для экспрессии каждой изоформы FGFR (и KLB в случае необходимости). Эти антитела неожиданно оказались активными агонистами: оба R1Mabs индуцировали активность люциферазы в зависимости от дозы, но только в том случае, если клетки экспрессировали рекомбинантный FGFR1b или FGFR1c, что свидетельствовало о том, что R1Mabs действуют как специфические агонисты по отношению к FGFR1 (фиг. 1С). В этом формате анализа R1Mabs не влияют заметно на активность основного FGF (bFGF), классического лиганда FGFR1 (фиг. 1D). Однако R1Mabs and FGF21 проявляли аддитивный эффект, когда клетки экспрессировали FGFR1c и KLB (фиг. 1D). Двухвалентный фрагмент F(ab')2, но не Fab фрагмент R1MAb2 обнаружил FGFR1-зависимую агонистическую активность, что позволяет предположить, что R1Mabs проявляют свою агонистическую активность при промотировании гомодимеризации FGFR1 (фиг. 1E). Ранее сообщали об искусственном агонисте димеризации FGFR, содержащем FGFR1-связывающий пептид и лейциновый зиппер из c-jun. Эта молекула, называемая C19jun, связывается также с гепарином через домен c-jun и требует наличия гепарина для активации FGFR1 (Ballinger et al., Nature Biotechnol. 17: 1199-1204 (1999)). В противоположность этому гепарин не влияет на агонистическую активность R1MAb1 при проведении анализа с использованием люциферазы (фиг. 5). Независимая от гепарина агонистическая активность R1MAb1 затем была подтверждена путём исследования фосфорилирования ERK and MEK1/2, сигнальных компонентов в 5'-3'-направлении FGFRs, в культивированных мышиных адипоцитах 3T3-L1 (фиг. 1F) или в WAT мышей линии C57BL/6, которым вводили путём интраперитонеальной инъекции h R1Mab (фиг. 1G).

Мы проводили эксперименты для картирования эпитопа FGFR1, связанного R1Mab1 и R1MAb2. Мы синтезировали 30 пептидов, представленных частями последовательности FGFR1 с амино-концевой биотиновой меткой и применяли их для анализа связывания с помощью ELISA. Эти последовательности пептидов были следующими:

#1: SSSEEKETDNTKPNPVAPY (SEQ ID NO: 36); #2:

PVAPYWTSPEKMEKKLHAV (SEQ ID NO: 37); #3: KLHAVPAAKTVKFKCPSSG (SEQ ID NO: 38); #4: CPSSGTPNPTLRWLKNGKE (SEQ ID NO: 39); #5:

KNGKEFKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 40); #6: YKVRYATWSIIMDSVVPSD (SEQ ID NO: 41); #7: VVPSDKGNYTCIVENEYGS (SEQ ID NO: 42); #8:

NEYGSINHTYQLDVVERSP (SEQ ID NO: 43); #9: VERSPHRPILQAGLPANKT (SEQ ID NO: 44); #10: PANKTVALGSNVEFMCKVY (SEQ ID NO: 45); #11:

MCKVYSDPQPHIQWLKHIE (SEQ ID NO: 46); #12: LKHIEVNGSKIGPDNLPYV (SEQ ID NO: 47); #13: NLPYVQILKTAGVNTTDKE (SEQ ID NO: 48); #14:

TTDKEMEVLHLRNVSFEDA (SEQ ID NO: 49); #15: SFEDAGEYTCLAGNSIGLS (SEQ ID NO: 50); #16: SIGLSHHSAWLTVLEALEE (SEQ ID NO: 51); #17:

YWTSPEKMEKKLHAVPAAK (SEQ ID NO: 52); #18: EKMEKKLHAVPAAKTVKFK (SEQ ID NO: 53); #19: PAAKTVKFKCPSSGTPNPT (SEQ ID NO: 54); #20: KFKCPSSGTPNPTLRWLKN (SEQ ID NO: 55); #21: GTPNPTLRWLKNGKEFKPD (SEQ ID NO: 56); #22: TLRWLKNGKEFKPDHRIGG (SEQ ID NO: 57); #23: FKPDHRIGGYKVRYATWSI (SEQ ID NO: 58); #24: HRIGGYKVRYATWSIIMDS (SEQ ID NO: 59); #25: LHAVPAAKTVKFKCPSS (SEQ ID NO: 60); #26: KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28); #27: AVPAAKTVKFKCPSSG (SEQ ID NO:

61) ; #28: FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29); #29: KPDHRIGGYKVR (SEQ ID NO:

62) ; #30: GTPNPTLRWLKN (SEQ ID NO: 63).

Как показано на фиг. 17А, для обоих R1Mab1 и R1MAb2 самыми короткими петидами, в отношении которых они проявляли значительное связывание, были пептиды #26 и #28.

Пример 2. R1Mabs демонстрируют пролонгированную активность против диабета.

Было проверено, будут ли антитела к FGFR1 обладать антидиабетической активностью, для этой

цели использовали мышиные модели диабета. Все мыши были закуплены в лаборатории Jackson Laboratory и их выдерживали в виварии в условиях, свободных от патогенных возбудителей, при температуре 21°C при фиксированном 12-часовом цикле смены света и темноты, при этом крысы имели доступ к корму (стандартному корму для мышей (Labdiet 5010, 12,7% жировых калорий) или к корму с высоким

- 25 030462

содержанием жиров и высоким содержанием углеводов (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% жировых калорий) и свободный доступ к воде. Мыши линии db/db с фенотипом C57BLKS/J были самками, а остальные мыши были самцами. Для инъекций использовали мышей в возрасте 9-11 нед., за исключением мышей линии ap2-SREBP1c, возраст которых составлял 8 мес. (фиг. 3Е) или 4 мес. (фиг. 3F). Для подкожного введения белка FGF21 имплантировали подкожно осмотический насос (Alzet® 2001). Уровень глюкозы измеряли при помощи глюкометра OneTouch® Ultra®. Для определения уровня липидов печени липид экстрагировали методом Фолча и снова суспендировали в PBS, содержащем 5% Triton X-100. Общий уровень холестерина, уровни триглицеридов, β-гидроксибутилата (Thermo DMA) и неэтерифицированной жирной кислоты (Roche) определяли с помощью ферментативных методов. Уровень инсулина в сыворотке определяли методом ELISA (Crystal Chem).

In vitro и in vivo агонистическую активность R1Mabs определяли при инъекции 3, 10 и 50 мг/кг R1MAb1 гипергликемическим резистентным к лептину мышам линии db/db. Было обнаружено, что уровень глюкозы в крови нормализовался в течение недели при введении всех трёх доз, наблюдавшийся эффект снижения уровня глюкозы оказался неожиданно сильным и длительным, после одной инъекции уровень глюкозы оставался ниже, чем у контрольных мышей, в течение 30 дней (фиг. 2А). Это было связано с временным, но значительным снижением веса (фиг. 2А). Снижение уровня глюкозы, повидимому, было обусловлено повышением чувствительности к инсулину, так как после инъекции R1MAb1 уровень инсулина в сыворотке резко снижался (фиг. 2В). В случае R1MAb2 наблюдалось такое же снижение уровня глюкозы в крови, как после инъекции R1Mab (фиг. 6), то же происходило и в трёх дополнительных мышиных моделях с выраженной резистентностью к инсулину, мышей линии ob/ob с дефицитом лептина, мышей, получавших корм с высоким содержанием жира (FIFD) и мышей линии Ins2Akita (Hong et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 293:E1687-96 (2007)) (фиг. 2С и 7). Эксперименты с животными, получающими одинаковое кормление, показали, что потеря веса у мышей линии db/db и мышей линии Ins2Akita была вызвано снижением потребления пищи, однако наблюдаемое уменьшение уровня глюкозы в крови почти совершенно не зависит от потребления пищи (фиг. 2D и 6-7).

Инъекция R1MAb1 привела к увеличению количества положительных к инсулину областей в каждом панкреатическом островке по сравнению с контрольными мышами, или получающими одинаковое кормление, или не получающими одинакового кормления (фиг. 2Е и 8). FGFR1 экспрессируется в βклетках поджелудочной железы (Hart et al., Nature 408:864-68 (2000)) и FGF21 промотирует ex vivo функцию β-клеток (Wente et al., Diabetes 55:2470-78 (2006)); таким образом, активация FGFR1 в βклетках может непосредственно способствовать повышению уровня инсулина в поджелудочной железе.

Эти данные показывают, что активация FGFR1 (но не FGFR2 или FGFR3) является достаточной для возобновления антидиабетической и антилипидемической активности рекомбинантного FGF21.

Для анализа значения функциональностей IgG для активности R1Mabs были использованы два типа модификации. Двойная мутация (D265A/N297A; DANA) в Fc-участке приводит к исчезновению связывания с FcyRs и рекрутингу иммунных эффекторных клеток молекулой IgG (Gong et al., 2005). Введение DANA мутаций не влияет ни на агонистическую, ни на антидиабетическую активность R1MAb2, следовательно, эффекторная функция не играет никакой роли в антидиабетической активности R1MAb2 (фиг. 9А-С). Однако конструированная версия R1Mab1 с одним плечом (Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997)), в которой отсутствует один из Fab фрагментов (OA-R1MAb1) (фиг. 9А и D), обнаружила пониженный уровень агонистической активности (фиг. 9Е и F) и не вызывала снижения уровня глюкозы в крови, веса и уровней липидов в печени и в сыворотке у мышей линии db/db (фиг. 9G и H), что свидетельствует о том, что и агонистическая, и антидиабетическая активности R1Mabs зависят от бивалентности Ab (хотя были также использованы биспецифические антитела только с одним плечом (например, антитела к бета-Клото с одним плечом) и подтверждает, что они сохраняют благоприятные характеристики бивалентных R1Mabs к FGFR1). Такая корреляция позволяет предположить, что активация сигнальных путей FGFR1 в 5'-3'-направлении, индуцированная R1Mab, по всей видимости, опосредует его антидиабетическое действие.

MAbs обладают сильным терапевтическим воздействием при лечении ряда заболеваний у людей. Демонстрация высокоантигипергликемической и антилипидемической активности агонистического MAb к FGFR1 открывает новый путь к развитию терапевтического MAbs таргетирования комплексного рецептора, содержащего FGFR1 или FGFR1, при лечении диабета типа 2 и других хронических заболеваний, связанных с ожирением.

Таргетирование FGFR1 при помощи MAb имеет несколько преимуществ по сравнению с терапией, использующей рекомбинантный FGF21. Во-первых, по своей природе MAbs обладают предсказуемыми, регулируемыми и гораздо лучшими фармакокинетическими свойствами по сравнению с FGF21 или любым другим терапевтическим белком, не являющимся антителом. В действительности, мы показали, что однократная интраперитонеальная инъекция 1-3 мг/кг R1MAb1 или R1Mab2 мышам линии db/db привела к значительному длительному уменьшению интенсивности гипергликемии на протяжении 30 дн (фиг. 2 и 5). Такой длительный гликемический эффект до сих пор не был обнаружен ни у одного из ранее описанных антидиабетических агентов.

- 26 030462

Пример 3. Роль жировых тканей в процессе диабетического действия R1Mab и FGF21.

Ранее было предложено повышать чувствительность к инсулину жировых тканей и печени (Berglund et al., Endocrinology 150:4084-93 (2009); Li et al., FEBS Letters 583:3230-34 (2009)). Инъекция FGF21 мышам приводила к MEK и ERK фосфорилированию в четырёх типах тканей, в ткани печени, белой жировой ткани (WAT), бурой жировой ткани (ВАТ) и в ткани поджелудочной железы (фиг. 3А, верхняя часть), как уже сообщалось ранее (Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282: 26687-95 (2007); Xu et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297(5): E1105-14 (2009)). В противоположность этому, инъекция R1MAb1 приводила к фосфорилированию тех же самых рецепторов в 5'-3'-направлении в жировых тканях и поджелудочной железе, но не в печени (фиг. 4А, нижняя часть), что согласуется с очень низким уровнем экспрессии мРНК FGFR1 в печени (фиг. 10) (Fon Tacer et al., Mol. Endocrinol. 24(10): 2050-64 (2010)). Действительно, непосредственное сравнение экспрессии генов в печени привело к обнаружению того факта, что экспрессия двух идентифицированных ранее генов, нацеленных на FGF21 (лептинового рецептора (LepR) и суппрессора цитокиновых сигналов-2 (SOCS2); Coskun et al., Endocrinology 149:6018-27 (2008), Inagaki et al., Cell Metabolism 8:77-83 (2008)) была индуцирована FGF21, но не R1MAb1 (фиг. 15). С другой стороны, экспрессия в клетках печени известных регулируемых инсулином генов (генов ацетил-СоАкарбоксилазы 1 (АСС1), синтазы жирных кислот (FAS), элонгазы длинноцепочечных жирных кислот семейства 6 (Elovl6), фосфоенолпируваткарбоксикиназы (PEPCK)) была изменена как FGF21, так и R1MAb1, что предполагает возможность косвенного регулирования этих генов при гормональных (например, введением инсулина) или метаболических изменениях. Однократная инъекция R1MAb1 мышам линии db/db через 7 дн значительно снижала уровень липидов в печени и сыворотке крови, предположительно вследствие перераспределения липидов в жировых тканях (фиг. 3B-D). Инъекция R1MAb1 не вызывала фосфорилирования MEK или ERK в лёгких и в простате (фиг. 3А), в предрасположенных к злокачественным новообразованиям типах тканей, которые экспрессируют FGFR1. Эти наблюдения в совокупности позволяют предположить, что жировые ткани, но не печень, являются центральными для общей метаболической активности R1Mab и FGF21.

Для дальнейшего изучения этого вопроса использовали липоатрофических трансгенных мышей линии ap2-srebp1c, которые обладали ярко выраженной резистентностью к инсулину, дефицитом лептина и гепатомегалией вследствие отсутствия белых жировых тканей и аномальной функцией бурой жировой ткани (фиг. 3Е и 11) (Shimomura et al., Genes Dev. 12:3182-94 (1998); Shimomura et al., Nature 401:73-76 (1999)).

С учётом идеи о том, что нормальная функция жировой ткани требуется для метаболической активности R1MAb1, делали однократную интраперитонеальную инъекцию 1 мг/кг R1MAb1, которая улучшала индекс HOMA-IR и толерантность к глюкозе только у контрольных мышей линии ob/ob, но не у мышей линии ap2-srebp1c (фиг. 3Е). Инъекция R1MAb1 уменьшала потребление пищи как у мышей линии ob/ob, так и у трансгенных мышей линии ap2-srebp1c по сравнению с мышами, получившими одинаковое кормление, которым делали инъекцию контрольного IgG (фиг. 3Е). Кроме того, непрерывная инфузия рекомбинантного FGF21 также не привела к повышению толерантности к глюкозе у мышей линии ap2srebp1c, хотя наблюдались значительное увеличение содержания β-гидроксибутирата (т.е. кетонового тела) в сыворотке крови и уменьшение уровня холестерина (фиг. 3F).

Пример 4. Активация PGd-альфа в бурой жировой ткани при введении R1Mab.

В последнее время для активации белка транскрипционного ядерного коактиватора PGC-1a рецептора в жировых тканях и печени для индуцирования экспрессии генов в 5'-3'-направлении, связанной с окислительным метаболизмом, был предложен FGF21 (Chau et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 107:1255358 (2010); Hondares et al., Cell Metabolism 11:206-12 (2010); Potthoff et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 30; 106(26): 10853-8 (2009)).

В действительности при инъекции мышам линии ob/ob R1MAb1 значительно повышал уровень ВАТ экспрессии генов в ВАТ, вовлечённых в процесс окислительного фосфорилирования OXPHOS, и метаболизм жирных кислот, что показал метод анализа с применением ДНК-чипов с последующим проведением анализа обогащения набора генов (фиг. 4А). R1MAb1 (и FGF21) также повышали уровень экспрессии PGC-1 a, PGC-1 β и их основных мишеней CIDEA и UCP1 в бурых жировых тканях (измерен методом qPCR, количественной ПЦР; фиг. 4В и 16).

Транскрипция PGC-1a регулируется элементами ответа на cAMP (CREs) в участке промотора и транскрипционным фактором CREB, который связывается с CREs (Herzig et al., Nature 413:179-83 (2001); Karamitri et al., J. Biol. Chem. 284:20738-52 (2009); Muraoka et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E1430-39 (2009); Shi et al., J. biol. Chem. (2005)). При проведении скрининга для идентификации факторов транскрипции, связанных с метаболизмом, которые могут быть активированы FGF21 в клетках HEK293, экспрессирующих KLB, мы обнаружили, что белок слияния GAL-CREB может быть активирован FGF21 (фиг. 8А-В). Затем было обнаружено, что и FGF21, и R1MAb1 могут активировать репортёр GAL-CREB, а также репортёр CRE-люциферазы в зависимости от дозы в клетках HEK293 (фиг. 4С). В соответствии с предположением, что CREB функционирует как downstream (даунстрим)-эффектор, FGF21 приводил к повышению степени фосфорилирования CREB и p90RSK, upstream CREB киназы,

- 27 030462

регулируемой ERK, у мышей и белыми жировыми тканями (фиг. 4D), дифференцированного первичного адипоцита в организме человека (фиг. 4Е), и в клетках HEK293 (фиг. 12С). Таким образом, активация CREB обработкой FGF21 и R1Mab, по всей видимости, способствует индукции PGC-1a и набора downstream-генов, которые участвуют в процессе окислительного метаболизма в жировых тканях (фиг. 4F и 12D). Как сообщалось, в добавление к предполагаемой в данной заявке транскрипционной регуляции, FGF21 активирует PGC-1a пост-трансляционно путём активации AMPK (Chau et al., supra), хотя не удалось обнаружить доказательство активации AMPK in vitro или in vivo при обработке R1Mab (данные не показаны). Полученные результаты в совокупности подтверждают роль PGC-1a в жировых тканях в опосредовании антилипидного и антидиабетического действия FGF21 и R1Mab.

Пример 5. Тестирование биспецифических антител к FGFR1/бета-Клото.

Другим важным отличием R1Mabs от FGF21 является специфичность к рецептору мишени. FGF21 может действовать на FGFR1c, 2c и 3с, но его действие, вероятно, ограничено тканями, которые экспрессируют KLB (т. е. тканями печени, жировыми тканями и тканями поджелудочной железы) (Fon Tacer et al., supra; Kurosu et al., J. biol. Chem. 282:26687-95 (2007); Ogawa et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104:7432-37 (2007)). В противоположность этому, ткани-мишени для R1Mabs по изобретению определяются по экспрессии FGFR1 и распределению молекулы антитела в ткани, но вряд ли ограничиваются экспрессией KLB. Действительно, мы наблюдали умеренную гипофосфатемию у мышей, обработанных R1MAb1, что предполагает активацию FGF23/Клото-сигнального пути в почке. Соответственно, мы осуществляли получение биспецифических антител к KLB/FGFR1, используя метод фагового дисплея или метод гибридом (мыши линии BALBc иммунизованные клетками HEK293, которые экспрессируют FGFR1c и KLB) с целью получения отдельных антител к KLB, и технологию "выступ-во-впадину" (Merchant et al., Nature Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)). Была определена способность этих биспецифических антител к активации GAL-Elk1 экспрессии и было подтверждено, что при даунстрим (downstream) сигнальной активации сигнальных путей эта способность указанных антител зависит от присутствия и бетаКлото, и FGFR1. Мы также подтвердили, что одно из антител может повышать степень фосфорилирования промежуточных компонентов "даунстрим" сигнальных путей, MEK и ERK '/₂ в дифференцированных первичных адипоцитах человека.

Одно из этих биспецифических антител даёт перекрёстную реакцию с мышиными белками, и мы применяли это антитело для определения in vivo активности биспецифического антитела. Мы обнаружили, что это биспецифическое антитело снижает уровень глюкозы без повышения содержания в сыворотке FGF23, в то время как соответствующее контрольное антитело к FGFR1 (моноспецифическое антитело) снижало уровень глюкозы в такой же степени, но значительно увеличивало уровень FGF23 в сыворотке крови. Затем мы определяли способность этих биспецифических антител обеспечивать метаболические преимущества агонистических антител к FGFR1. Мы получали трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий корецептор бета-Клото (R1MAb1 и R1MAb2 каждый распознаёт мышиный FGFR1) и подтвердили, что биспецифические антитела к KLB/FGFR1, описанные выше, повышают толерантность к глюкозе в мышиных моделях, т. е. у трансгенных мышей hKLB, получавших корм с высоким содержанием жиров. Мы также получали антитела к бета-Клото, которые реагируют с белком в других животных моделях (например, крысы, кролика, яванского макака и макаки-резус) и также определяли способность биспецифических антител, конструированных с ними и антителами против FGFR1 для получения метаболических преимуществ.

Хотя настоящее изобретение было описано с некоторыми подробностями путём иллюстрации и приведения примеров для ясности понимания, описание и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объём этого изобретения. Все указанные в описании патентные документы и научные публикации включены полностью в данную заявку посредством отсылок.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. И др.

<120> АГОНИСТЫ FGFR1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> P4653R1WO

<140>

<141>

<150> 61/536,936

<151> 2011-09-20

<150> 61/486,731

<151> 2011-05-16

- 28 030462

<160> 63

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Pro

Val

Ala

Pro

Tyr 10

Trp

Thr

Ser

Pro

Glu 15

Lys

Asn 1

Thr

Lys

Pro

Asn 5

Met

Glu

Lys

Leu

His

Ala

Val

Pro

Ala

Lys

Thr

Val

Lys

Phe

20

25

30

Lys

Cys

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Asn

Pro

Thr

Leu

Arg

Trp

Leu

Lys

35

40

45

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Pro

Asp

His

Arg

Ile

Gly

Tyr

Lys

Val

50

55

60

Arg

Tyr

Ala

Thr

Trp

Ser

Ile

Met

Asp

Ser

Val

Pro

Ser

Asp

65

70

75

80

Lys

Gly

Asn

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Glu

Asn

Glu

Tyr

Gly

Ser

Ile

Asn

85

90

95

His

Thr

Tyr

Gln

Leu

Asp

Val

Glu

Arg

Ser

Pro

His

Arg

Pro

Ile

100

105

110

Leu

Gln

Ala

Gly

Leu

Pro

Ala

Asn

Lys

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ser

Asn

115

120

125

Val

Glu

Phe

Met

Cys

Lys

Val

Tyr

Ser

Asp

Pro

Gln

Pro

His

Ile

Gln

130

135

140

Trp

Leu

Lys

His

Ile

Glu

Val

Asn

Gly

Ser

Lys

Ile

Gly

Pro

Asp

Asn

145

150

155

160

Leu

Pro

Tyr

Val

Gln

Ile

Leu

Lys

His

Ser

Gly

Ile

Asn

Ser

Asp

165

170

175

Ala

Glu

Val

Leu

Thr

Leu

Phe

Asn

Val

Thr

Glu

Ala

Gln

Ser

Gly

Glu

180

185

190

Tyr

Val

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Tyr

Ile

Gly

Glu

Ala

Asn

Gln

Ser

Ala

195

200

205

- 29 030462

Trp Leu Thr Val Thr Arg Pro Val Ala Lys Ala Leu Glu Glu Arg Pro 210 215 220

Ala Val Met Thr Ser 225

<210> 2

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид"

<400> 2 Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly Leu 10

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Ser

Thr

20

25

30

Trp

Ile

Ser

Trp

Val

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Gly

Glu

Ile

35

40

45

Asp

Pro

Tyr

Asp

Gly

Asp

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

50

55

60

Phe

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Gly

85

90

95

Gly

Ser

Asp

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

<210> 3

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn

- 30 030462

20

25

30

Tyr

Ile

His

Trp

Val

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Asp

Ile

35

40

45

Tyr

Pro

Asn

Asp

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

50

55

60

Phe

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

His

Phe

Asp

85

90

95

Ala

Trp

Val

His

Tyr

Val

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

<210> 4

<211> 102

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 4

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly Leu 10

Val

Gln Pro Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Ser

Asn

20

25

30

Trp

Ile

Ser

Trp

Val

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Glu

Ile

35

40

45

Asp

Pro

Tyr

Asp

Gly

Ala

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

50

55

60

Phe

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Thr

Gly

Thr

Asp

Val

85

90

95

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

<210> 5

- 31 030462

<211> 227

<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens

<400> 5

Asn 1

Thr

Lys

Pro

Asn 5

Pro

Val

Ala

Pro

Tyr 10

Trp

Thr

Ser

Pro

Glu 15

Lys

Met

Glu

Lys

Leu

His

Ala

Val

Pro

Ala

Lys

Thr

Val

Lys

Phe

20

25

30

Lys

Cys

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Asn

Pro

Thr

Leu

Arg

Trp

Leu

Lys

35

40

45

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Pro

Asp

His

Arg

Ile

Gly

Tyr

Lys

Val

50

55

60

Arg

Tyr

Ala

Thr

Trp

Ser

Ile

Met

Asp

Ser

Val

Pro

Ser

Asp

65

70

75

80

Lys

Gly

Asn

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Glu

Asn

Glu

Tyr

Gly

Ser

Ile

Asn

85

90

95

His

Thr

Tyr

Gln

Leu

Asp

Val

Glu

Arg

Ser

Pro

His

Arg

Pro

Ile

100

105

110

Leu

Gln

Ala

Gly

Leu

Pro

Ala

Asn

Lys

Thr

Val

Ala

Leu

Gly

Ser

Asn

115

120

125

Val

Glu

Phe

Met

Cys

Lys

Val

Tyr

Ser

Asp

Pro

Gln

Pro

His

Ile

Gln

130

135

140

Trp

Leu

Lys

His

Ile

Glu

Val

Asn

Gly

Ser

Lys

Ile

Gly

Pro

Asp

Asn

145

150

155

160

Leu

Pro

Tyr

Val

Gln

Ile

Leu

Lys

Thr

Ala

Gly

Val

Asn

Thr

Asp

165

170

175

Lys

Glu

Met

Glu

Val

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Val

Ser

Phe

Glu

Asp

Ala

180

185

190

Gly

Glu

Tyr

Thr

Cys

Leu

Ala

Gly

Asn

Ser

Ile

Gly

Leu

Ser

His

195

200

205

Ser

Ala

Trp

Leu

Thr

Val

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Pro

Ala

Val

210

215

220

Met Thr Ser 225

- 32 030462

<210> 6

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 6

Gln Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp 1

Ile

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asp

Val

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Val

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ser

Ala

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Ser

Tyr

Thr

Pro

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

<210> 7

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Thr Ser Thr Trp Ile Ser 1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

- 33 030462

<223> /примечание="Описание пептид" <400> 8 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn	искусственной Tyr Ile His 10	последовательности	: Синтетический
1	5
<210>	9
<211>	10
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="Описание	искусственной	последовательности	: Синтетический
	пептид"
<400>	9
Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn	Trp Ile Ser
1	5	10
<210>	10
<211>	18
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="Описание	искусственной	последовательности	: Синтетический
	пептид"
<400>	10
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp	Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1	5	10	15

Lys Gly

<210> <211> <212> <213>	11 17 БЕЛОК Искусственная
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание=" ι
	пептид"
<400>	11
Glu Ile Asp Pro Tyr
1	5

10

15

Gly

<210> 12 <211> 18

- 34 030462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 12

Ala Asp Ile Tyr Pro Asn Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 13

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 13

Asp Ile Tyr Pro Asn Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 14

Ala Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 15

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

- 35 030462

15

пептид

<400>	15
Glu Ile Asp Pro	Tyr
1		5
Gly
<210>	16
<211>	13
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="
	пептид"
<400>	16
Ser Ser Gly Tyr	Gly
1		5
<210>	17
<211>	12
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="
	пептид"
<400>	17
Ser Gly Tyr Gly	Gly
1		5
<210>	18
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="
	пептид"
<400>	18
Glu His Phe Asp	Ala
1		5
<210>	19
<211>	8
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная
<220>
<221>	источник

10

Синтетический

- 36 030462

<223> /примечание="Описание искусственной пептид"

последовательности:

Синтетический

<400> 19

Thr Gly Thr Asp Val Met Asp Tyr 1 5

<210> 20

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: пептид"

<400> 20

Gly Thr Asp Val Met Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 21

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10

<210> 22

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 22

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

Синтетический

- 37 030462

<400> 23

Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5

<210> 24

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1)

<223> /заменить^Ю^

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(2)

<223> /заменить^Ы

<220>

<221> смеш_признак

<222> (1)..(2)

<223> /примечание="Остатки в последовательности не имеют предпочтения по отношению к примечаниям для указанных позиций"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (4)..(4)

<223> /примечание="Остаток в последовательности не имеет предпочтения по отношению к примечанию для указанной позиции"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (6)..(6)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (9)..(9)

<223> /заменить="Asp"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (9)..(9)

<223> /примечание="Остаток в последовательности не имеет предпочтения

- 38 030462

по отношению к примечанию для указанной позиции

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (11)..(11)

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (11)..(11)

<400> 24

Ala Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15

Lys Gly

<210> 25

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> /заменить^^Ю"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (1)..(1)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (3)..(3)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (5)..(5)

- 39 030462

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)..(8)

<223> /заменить="ЛБр"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (8)..(8)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (10)..(10)

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (10)..(10)

<400> 25

Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 26

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(5)

<223> /заменить="Thr

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6)

<223> /заменить="Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7)

<223> /заменить="Thr

<220>

<221> ВАРИАНТ <222> (8)..(8)

- 40 030462

<223> /заменить="Tyr"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (5)..(8)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (10)..(10)

<223> /заменить="Бег"

<220>

<221> смеш_признак

<222> (10)..(10)

<400> 26

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn Trp Ile His

1 5 10

<210> 27

<211> 53

<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens

<400> 27

Val

Lys 15

Phe

Met 1

Glu Lys

Lys

Leu His 5

Ala

Val

Pro Ala Ala 10

Lys

Thr

Lys

Cys

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Asn

Pro

Thr

Leu

Arg

Trp

Leu

Lys

20

25

30

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Pro

Asp

His

Arg

Ile

Gly

Tyr

Lys

Val

35

40

45

Arg Tyr Ala Thr Trp 50

<210> 28

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 28

Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro

1 5 10 15

<210> 29 <211> 14

- 41 030462

<212> <213>

БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <221> <223>

источник /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид"

<400> 29

Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr 1 5 10

<210> <211> <212> <213>

30 16 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <221> <223>

<400> 30

Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro

1	5 10 15
<210> <211> <212> <213>	31 16 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <221> <223>

<400> 31

Lys Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys Pro

1	5 10 15
<210> <211> <212> <213>	32 16 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220> <221> <223>

<400> 32

Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro

1	5 10 15
<210> <211> <212> <213>	33 14 БЕЛОК Искусственная последовательность

- 42 030462

<220> <221> источник <223> /примечание=" Описание	искусственной последовательности	: Синтетический
пептид" <400> 33 Phe Lys Gln Glu His	Arg Ile	Gly Gly Tyr Lys 10	Val	Arg Asn
1	5
<210>	34
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="	Описание	искусственной последовательности	: Синтетический
	пептид"
<400>	34
Phe Arg Gly Glu His	Arg Ile	Gly Gly Ile Lys	Leu	Arg His
1	5		10
<210>	35
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="	Описание	искусственной последовательности	: Синтетический
	пептид"
<400>	35
Phe His Gly Glu Asn	Arg Ile	Gly Gly Ile Arg	Leu	Arg His
1	5		10
<210>	36
<211>	19
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<221>	источник
<223>	/примечание="	Описание	искусственной последовательности	: Синтетический
	пептид"
<400>	36
Ser Ser Ser Glu Glu	Lys Glu	Thr Asp Asn Thr	Lys	Pro Asn Pro Val
1	5		10		15

Ala Pro Tyr

<210> 37

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

- 43 030462

<220>

<221> источник

<400> 37

Pro Val 1	Ala	Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu
5	10	15
His Ala	Val

<210> 38

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 38

Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Gly

<210> 39

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 39

Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn

1 5 10 15

Gly Lys Glu

<210> 40

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

- 44 030462

<400> 40

Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys 1 5 10 15

Val Arg Tyr

<210> 41

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 41

Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val

1 5 10 15

Pro Ser Asp

<210> 42

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 42

Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu

1 5 10 15

Tyr Gly Ser

<210> 43

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 43

Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu

1 5 10 15

Arg Ser Pro

- 45 030462

<210> 44

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 44

Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala

1 5 10 15

Asn Lys Thr

<210> 45

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 45

Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys

1 5 10 15

Lys Val Tyr

<210> 46

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 46

Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys

1 5 10 15

His Ile Glu

<210> 47 <211> 19 <212> БЕЛОК

- 46 030462

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 47

Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu

1 5 10 15

Pro Tyr Val

<210> 48

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 48

Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr

1 5 10 15

Asp Lys Glu

<210> 49

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 49

Thr Thr Asp Lys Glu Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe

1 5 10 15

Glu Asp Ala

<210> 50

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

- 47 030462

<400> 50

Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile 1 5 10 15

Gly Leu Ser

<210> 51

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 51

Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Glu Glu

<210> 52

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 52

Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro

1 5 10 15

Ala Ala Lys

<210> 53

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 53

Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val

1 5 10 15

- 48 030462

Lys Phe Lys

<210> 54

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 54

Pro	Ala	Ala Lys	Thr Val Lys	Phe Lys Cys	Pro Ser Ser Gly Thr Pro
1			5	10	15
Asn	Pro	Thr

<210> 55

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 55

Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp

1 5 10 15

Leu Lys Asn

<210> 56

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 56

Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe

1 5 10 15

Lys Pro Asp

<210> 57 <211> 19

- 49 030462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 57

Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg

1 5 10 15

Ile Gly Gly

<210> 58

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 58

Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr

1 5 10 15

Trp Ser Ile

<210> 59

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 59

His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile

1 5 10 15

Met Asp Ser

<210> 60

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

- 50 030462

пептид"

<400> 60

Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser 1 5 10 15

Ser

<210> 61

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 61

Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly

1 5 10 15

<210> 62

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 62

Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg

1 5 10

<210> 63

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<400> 63

Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn

1 5 10

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Агонистическое антитело к рецептору 1 фактора роста фибробластов (FGFR1), включающее:

(a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTSTWIS (SEQ ID NO: 7), GFTFSNNYIH (SEQ ID NO: 8), GFTFTSNWIS (SEQ ID NO: 9) или GFTFTSNYIS,

(b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GEIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10), EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11), ADIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 12),

- 51 030462

DIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 13), AEIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 14) или EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 15),

(c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16), SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17), EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18), TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) или GTDVMDY (SEQ ID NO: 20),

(d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 21);

(e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 22); и

(f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 23),

где антитело связывается с пептидом KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 28) или пептидом FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 29) и где антитело не является агонистом FGFR2 или FGFR3.
2. Антитело по п.1, которое представляет собой моноклональное антитело.
3. Антитело по любому из пп.1 или 2, которое представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.
4. Антитело по любому из пп.1-3, которое представляет собой IgG1 антитело.
5. Антитело по п.1, которое включает:

(a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTSTWIS (SEQ ID NO: 7),

(b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GEIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10) или EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11), и

(c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SSGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 16) или SGYGGSDYAMDY (SEQ ID NO: 17).
6. Антитело по п.1, которое включает:

(a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSNNYIH (SEQ ID NO: 8),

(b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность ADIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 12) или DIYPNDGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 13), и

(c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 18).
7. Антитело по п.1, которое включает:

(a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTSNWIS (SEQ ID NO: 9),

(b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность AEIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 14) или EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 15), и

(c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19) или GTDVMDY (SEQ ID NO: 20).
8. Антитело по п.1, где антитело включает:

(a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTSNYIS,

(b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11), и

(c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность TGTDVMDY (SEQ ID NO: 19).
9. Антитело по п.1, которое включает VH с последовательностью SEQ ID NO: 2, 3 или 4.
10. Антитело по любому из пп.5-9, которое включает VL с последовательностью SEQ ID NO: 6.
11. Антитело по любому из пп.1-10, где антитело связывается как с FGFR1b, так и с FGFR1c.
12. Антитело по любому из пп.1-11, где антитело представляет собой мультиспецифическое антитело.
13. Антитело по любому из пп.1-11, где антитело представляет собой биспецифическое антитело.
14. Антитело по п.12 или 13, где антитело связывается также с бета-Клото.
15. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп.1-14.
16. Клетка-хозяин для продуцирования антитела по любому из пп.1-14, где клетка-хозяин содержит нуклеиновую кислоту по п.15.
17. Способ получения антитела по любому из пп.1-14, включающий культивирование клеткихозяина по п.16 и выделение антитела из клетки-хозяина.
18. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, которое поддается лечению с помощью агониста к FGFR1, фармацевтическая композиция содержит антитело по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Применение антитела по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения метаболического заболевания или состояния.
20. Применение антитела по любому из пп.1-14 для лечения метаболического заболевания или состояния.
21. Применение по любому из пп.19, 20, где метаболическое заболевание или состояние представляет собой синдром поликистозных яичников (PCOS), метаболический синдром (MetS), ожирение, неалкогольный стеатогепатит (NASH), неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), гиперлипидемию, гипертонию, диабет типа 2, диабет не типа 2, диабет типа 1, латентный аутоиммунный диабет (LAD) и диабет зрелого возраста у молодых (MODY).
22. Применение по любому из пп.19, 20, где антитело применяется для повышения чувствительно- 52 030462

сти индивидуума к инсулину.
23. Применение антитела по любому из пп.1-14 для лечения диабета у индивидуума.
24. Применение антитела по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для лечения диабета у индивидуума.
25. Применение антитела по пп.1-14 для лечения диабета в сочетании с другим агентом для лечения диабета у индивидуума при условии, что другой агент не является инсулином.
26. Применение антитела по пп.1-14 для лечения диабета в сочетании с агентом для лечения сердечно-сосудистого заболевания у индивидуума.

R1MAb1

R1MAb2

FGFRIb

FGFRIc

FGFRIb

FGFRIc

2,7 x 10⁶3.£x10^r1.9x1Q⁶1.9 X10⁶

^ϋί!

(У¹)

1.6 x 10³2.2 x ΙΟ'³0.2 x 10’⁴

8.7 х 10'⁴

KD

ΐΜ)

5.9x10’¹⁰6.7x1 Г¹⁰4.4x10'¹⁰4.6x10'¹⁰