KR20140012150A - Fgfr1 효능제 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 효능작용 항-FGFR1 항체를 비롯한 FGFR1 효능제, 및 그의 사용 방법을 제공한다.
[대표도]
도 2a

Description

FGFR1 효능제 및 사용 방법 {FGFR1 AGONISTS AND METHODS OF USE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2011년 5월 16일에 출원된 미국 특허 출원 61/486,731 및 2011년 9월 20일에 출원된 61/536,936을 우선권 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 FGFR1 효능제 및 그의 사용 방법에 관한 것이다

혈액 글루코스 수준을 제어하지 못하는 것은 다양한 대사 상태의 원인이 된다. 당뇨병은 글루코스에 반응한 인슐린 분비의 결핍 (제1형 및 제2형 당뇨병) 및 골격근 글루코스 흡수의 자극 및 간 글루코스 생산의 제지에 있어 감소된 인슐린 효과 (제2형 당뇨병)로부터 초래된 고혈당 증후군이다. 당뇨병은 매우 보편적인 질환이며, 일부 당뇨병에 대한 치료 옵션이 이용가능하더라도, 추가의 요법이 신속히 요구되고 있다.

섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)은 FGF19 및 FGF23을 포함하는 내분비 FGF 서브패밀리의 구성원이고, 이는 비만 및 비만-유도 간지방증 및 고혈당증을 역전시키기 위한 잠재적인 질환-변형 작용제로서 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Kharitonenkov and Larsen, Trends Endocrinol. Metab. 22(3):81-6 (2011); Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. 115: 1627-35 (2005)]; WO 2010/042747 참조). 내분비 FGF21 단백질은 3개의 FGF 수용체 (FGFR 1-3)에 결합하고, 이들 수용체는 그의 막 결합된 보조-수용체 베타-클로토(Klotho)와 함께 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병을 개선한다. 그러나, 그의 개발은 그의 부족한 약동학 및 생물학적 작용 메카니즘에 대한 이해 부족으로 인해 방해를 받았다. 항-FGFR1 길항제 항체가 또한 당뇨병의 치료를 위해 제안되었다 (WO 2005/037235). 그러나, 3개의 FGFR 중 어느 것이 FGF21의 유익한 대사 활성을 조정하는지는 확인되지 않았다.

본 발명은 부분적으로 FGFR1의 활성화가 당뇨병을 개선한다는 발견에 기초한다. 본 발명은 효능제 항-FGFR1 항체를 비롯한 FGFR1 효능제 및 그의 사용 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-섬유모세포 성장 인자 수용체-1 (FGFR1) 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 대사 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대사 질환은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, FGFR1 효능제는 FGFR2 또는 FGFR3을 활성화시키지 않는다. 일부 실시양태에서, FGFR1 효능제는 항-FGFR1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 2개의 FGFR1-결합 부위, 예를 들어 전장 항체 또는 F(ab')2 단편을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 펩티드 #26 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열 28) 또는 펩티드 #28 FKPDHRIGGYKVRY (서열 29)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 펩티드 #26 및 펩티드 #28 둘 다에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 FGFR1b 및 FGFR1c 둘 다에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 또한 베타-클로토에 결합한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 FGFR1에 결합하며 FGFR1 활성의 효능제인 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 FGFR2 또는 FGFR3의 효능제가 아니다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) SSGYGGSDYAMDY (서열 16), SGYGGSDYAMDY (서열 17), EHFDAWVHYYVMDY (서열 18), TGTDVMDY (서열 19) 및 GTDVMDY (서열 20)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 23)를 포함하는 HVR-L3, 및 (c) X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG (여기서, X₁은 A 또는 G이고, X₂는 D 또는 E이고, X₃은 D 또는 Y이고, X₄는 N 또는 Y이고, X₅는 A 또는 D이고, X₆은 D 또는 Y임) (서열 24) 및 X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG (여기서, X₁은 D 또는 E이고, X₂는 D 또는 Y이고, X₃은 N 또는 Y이고, X₄는 A 또는 D이고, X₅는 D 또는 Y임) (서열 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅ (여기서, X₁은 S 또는 T이고, X₂는 N 또는 S이고, X₃은 N 또는 T이고, X₄는 W 또는 Y이고, X₅는 H 또는 S임) (서열 26)를 포함하는 HVR-H1, (b) X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG (여기서, X₁은 A 또는 G이고, X₂는 D 또는 E이고, X₃은 D 또는 Y이고, X₄는 N 또는 Y이고, X₅는 A 또는 D이고, X₆은 D 또는 Y임) (서열 24) 및 X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG (여기서, X₁은 D 또는 E이고, X₂는 D 또는 Y이고, X₃은 N 또는 Y이고, X₄는 A 또는 D이고, X₅는 D 또는 Y임) (서열 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SSGYGGSDYAMDY (서열 16), SGYGGSDYAMDY (서열 17), EHFDAWVHYYVMDY (서열 18), TGTDVMDY (서열 19) 및 GTDVMDY (서열 20)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GFTFTSTWIS (서열 7)를 포함하는 HVR-H1, (b) GEIDPYDGDTYYADSVKG (서열 10) 및 EIDPYDGDTYYADSVKG (서열 11)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SSGYGGSDYAMDY (서열 16) 및 SGYGGSDYAMDY (서열 17)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GFTFSNNYIH (서열 8)를 포함하는 HVR-H1, (b) ADIYPNDGDTDYADSVKG (서열 12) 및 DIYPNDGDTDYADSVKG (서열 13)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 EHFDAWVHYYVMDY (서열 18)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 GFTFTSNWIS (서열 9)를 포함하는 HVR-H1, (b) AEIDPYDGATDYADSVKG (서열 14) 및 EIDPYDGATDYADSVKG (서열 15)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) TGTDVMDY (서열 19) 및 GTDVMDY (서열 20)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 21)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 22)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 23)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 6의 VL 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 2개의 FGFR1-결합 부위, 예를 들어 전장 항체 또는 F(ab')2 단편을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 또한 베타-클로토에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 청구항 21의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 청구항 22의 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되도록 하는 것을 포함하는, 항체의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사 질환 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 개체를 인슐린에 대해 감작화시키는데 사용하기 위한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 의약은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사 질환 또는 상태의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 개체를 인슐린에 대해 감작화시키기 위한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 당뇨병을 치료하기 위한 또 다른 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 단 상기 다른 작용제는 인슐린이 아니다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 심혈관 질환을 치료하기 위한 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

도 1a는 정제된 FGFR ECD 단편에 대한 항-FGFR1 항체의 결합을 측정하는 ELISA를 보여준다.
도 1b는 R1MAb1 및 R1MAb2에 대한 표면 플라즈몬 공명 결합 상수를 보여준다.
도 1c는 래트 L6 세포에서의 GAL-Elk1 루시페라제 검정을 보여준다. 세포를 GAL-Elk1, SV40-레닐라 루시페라제, 및 Gal-반응성 반딧불이 루시페라제 리포터와 함께 지시된 FGFR 이소형에 대한 발현 벡터로 공형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 증가하는 농도의 R1Mab 또는 산성 FGF (aFGF: 양성 대조군)를 함유하는 배지와 루시페라제 검정 전에 6시간 동안 인큐베이션하였다. 전사 활성화는 레닐라 루시페라제 활성에 의해 정상화된 상대적 반딧불이 루시페라제 활성에 의해 평가하고, 상대적 루시페라제 단위 (RLU)로 표현하였다.
도 1d는 L6 세포가 FGFR1c 및 KLB를 둘 다 발현한다는 것을 제외하고는 1c와 유사한 실험을 보여준다.
도 1e는 HEK293 세포를 사용한다는 것을 제외하고는 1c와 유사한 실험을 보여준다.
도 1f는 0.5μg/ml의 지시된 단백질로 지시된 시간 동안 처리된 3T3-L1 지방세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 1g는 1mpk의 R1Mab (+) 또는 대조군 IgG (-)의 i.p. 주사 후에 지시된 시간에 마른 C57BL/6 마우스로부터 수확한 WAT, 및 이에 적용된 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 2a는 지시된 용량의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 (화살표) 후에 db/db 마우스의 혈액 글루코스 (좌측) 및 체중 (우측)을 보여준다. 모든 군에서 제1-30일 사이에 글루코스 (vs 대조군 IgG)에서 유의성이 관찰되었고, 모든 군에서 제8일에 50mpk 군에서 제12-18일 사이에 체중 (vs 대조군 IgG)에서 유의성이 관찰되었다. N=6~14, *p<0.05, **p<0.01.
도 2b는 무작위 급식 마우스 및 밤새 단식 마우스에서의 혈액 글루코스 (상부) 및 밤새 단식 후, 및 1g/kg 글루코스의 i.p. 주사 30분 후의 혈청 인슐린 수준 (하부)을 보여준다. N=6~14, *p<0.05, **p<0.01.
도 2c는 3mpk의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 후에 Ins2Akita 마우스의 혈액 글루코스 (좌측) 및 체중 (우측)을 보여준다. N=10. *p<0.01.
도 2d는 1mpk 용량의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 후에 db/db 마우스의 음식 섭취량 (좌측), 혈액 글루코스 (중앙) 및 체중 (우측)을 보여준다. PF: R1MAb-처리군에 대한 쌍-급식. N=7. #p<0.001 (vs IgG), *p<0.001 (vs PF-IgG).
도 2e는 고정된 췌장 절편에서 인슐린 양성 면적의 정량화를 보여준다. 조직을 3mpk (좌측) 또는 1mpk (우측)의 R1MAb1의 단일 i.p. 주사 7일 후에 수집하고, 인슐린 및 글루카곤에 대해 염색하였다. N=4~7. **p<0.002. ***p<0.001.
도 3a는 마우스 조직에서 MAPK 신호전달 활성화를 보여준다. 지시된 조직을 마른 C57BL/6 마우스의 i.p. 주사 15분 후 (25μg/마우스 FGF21: 상부) 또는 1시간 후 (1mpk R1Mab1: 하부)에 수확하고, 이에 웨스턴 블롯 분석을 적용하였다. PBS (상부) 및 대조군 IgG (하부)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3b-d는 간 (b), 간 지질 (c), 및 혈청 지질 (d)의 대표적인 H&E 염색을 보여준다. 샘플을 1mpk R1MAb1의 단일 i.p. 주사 7일 후에 수집하였다. 대조군 마우스에게 쌍-급식하여 체중을 정상화시켰다. N=7, *p<0.05, **p<0.001.
도 3e는 1mpk Ab를 주사한 ob/ob 또는 트랜스제닉 ap2-SREBP1c (srebp) 마우스의 대사 파라미터를 보여준다. 대조군에게 쌍-급식하여 체중을 정상화시켰다 (도 S7). HOMA-IR 계산을 위해 글루코스 및 인슐린을 3시간 단식 후에 제3일에 측정하였다. GTT를 밤새 단식 후에 제4일에 1g/kg i.p. 글루코스 주사를 이용하여 수행하였다. 조직 중량을 제5일에 측정하였다. N=7, *p<0.05, ***p<0.01
도 3f는 FGF21 (12ng/일)을 주입하기 위해 삼투 펌프를 피하 이식한 ap2-SREBP 마우스의 대사 파라미터를 보여준다. 1U/kg 인슐린 i.p. 주사를 이용하는 ITT를 제4일에 수행하였다. 혈청을 제6일에 수집하였다. N=6~8.
도 4a는 지시된 KEGG 경로에 속하는 유전자에 대한 BAT에서 mRNA 발현 (적색: 보다 높은 발현 및 청색: 보다 낮은 발현)을 보여준다. 1mpk R1MAb1의 단일 i.p. 주사 4일 후에 또는 대조군 IgG를 주사한 쌍-급식 마우스에서 샘플을 수집하였다.
도 4b는 qPCR에 의해 BAT에서의 mRNA 발현을 보여준다. N=6, *p<0.05, **p<0.001.
도 4c는 HEK293 세포에서 루시페라제 검정을 보여준다. 그래프는 FGF21 및 R1MAb1이 둘 다 GAL4 DNA 결합 도메인에 융합된 CREB (GAL-CREB)를 통해 HEK293 세포에서 UAS-구동 루시페라제 리포터 유전자 (좌측 2개 패널), 또는 CRE-구동 루시페라제 리포터 유전자 (우측 2개 패널)의 전사를 용량-의존성 방식으로 유도한다는 것을 보여준다. 일부 세포는 또한 FGFR1c 및 KLB (적색; 그래프에서 가장 높은 곡선)를 발현하도록 공형질감염시켰다. 결과는 레닐라 활성에 의해 정상화된 루시페라제 활성에 대한 3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 4d는 25μg의 FGF21 (+) 또는 PBS (-)로의 i.v. 주사 15분 후에 수확된 WAT, 및 이에 적용된 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 4e는 1μg/ml의 FGF21로 30분 동안 처리된 분화된 1차 인간 지방세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 4f는 FGF21 및 R1MAb가 지방 조직에서 PGC-1알파 프로그램을 활성화시키는 것을 통하는 신호전달 경로에 대한 모델을 보여준다.
도 5는 R1MAb1의 헤파린-비의존성 및 FGFR1-의존성 효능작용 활성을 보여준다. HEK293 세포에서의 GAL-Elk1 루시페라제 검정. 세포를 GAL-Elk1, SV40-레닐라 루시페라제, 및 Gal-반응성 반딧불이 루시페라제 리포터와 함께, 지시된 바와 같은 FGFR1c에 대한 발현 벡터로 또는 이러한 벡터 없이 공형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 루시페라제 검정 전에 6시간 동안 지시된 바와 같이 25 mg/L 돼지 헤파린과 함께 또는 이들 없이 증가하는 농도의 R1Mab1을 함유하는 배지에서 인큐베이션하였다. 전사 활성화는 레닐라 루시페라제 활성에 의해 정상화된 상대적 반딧불이 루시페라제 활성에 의해 평가하고, 상대적 루시페라제 단위 (RLU)로 표현하였다.
도 6a는 제0일에 3mpk 용량의 R1Mab2 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 후에 db/db 마우스의 음식 섭취량 (좌측), 체중 (중앙), 및 혈액 글루코스 (우측)를 보여준다. 대조군 마우스에게 쌍-급식 (PF)하여 제11일까지 음식 섭취량을 조정하였다. 제11일에, R1MAb2-처리된 마우스의 음식 섭취량은 정상으로 돌아갔으며, 이에 따라 모든 마우스에게 제11일 후에 자유식을 급식하였다 (AL). N=7~12. p<0.001.
도 6b는 제26일에 도 S2A에 사용된 마우스의 무작위 급식 혈액 글루코스 수준을 보여준다.
도 6c는 제28일에 동일한 마우스를 이용하여 수행한 GTT를 보여준다.
도 6d는 제37일에 동일한 마우스를 이용하여 수행한 ITT를 보여준다.
도 7a는 제0일에 1mpk 용량의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 후에 ob/ob 마우스의 혈액 글루코스 (좌측) 및 체중 (우측)을 보여준다. 대조군 마우스에게 R1MAb-처리군에 대해 쌍-급식 (PF)하였다. N=7. *p<0.05 (vs PF-IgG).
도 7b는 제0일에 1mpk의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 후에 HFD-급식 C57BL/6 마우스의 혈액 글루코스 (좌측) 및 체중 (우측)을 보여준다. N=7~9. *p<0.05.
도 7c는 Ab 주사 8일 후에 S3B에 사용된 HFD-급식 마우스로 수행한 GTT를 보여준다. 마우스에게 밤새 단식 후에 1g/kg 글루코스를 i.p. 주사하였다. 평균 체중은 28.6+/-0.6 (R1MAb1) 및 32.1+/-0.8 (대조군 IgG) (p<0.01)이었다. N=7.
도 7d는 1mpk의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 5일 후에 Ins2Akita 마우스의 혈액 글루코스 (좌측) 및 체중 (우측)을 보여준다. 대조군 마우스에게 쌍-급식 (PF-IgG)하여 체중을 정상화시켰다. *p<0.05.
도 8a는 도 4e에서 분석된 db/db 마우스에서의 췌장섬의 대표적인 염색을 보여준다. 적색: 인슐린, 녹색: 글루카곤, 청색: 핵. R1MAb는 췌장섬의 전반적인 형태에 영향을 미치지 않는다는 것에 주목한다.
도 8b는 각각의 동물에서 각각의 췌장섬에서의 인슐린 양성 면적의 분포 (%)를 보여준다.
도 9a는 IgG 및 1-아암 (OA) IgG의 개략적 표현을 보여준다. 청색: 중쇄, 녹색: 경쇄. 적색 별표는 DANA 돌연변이체에서 돌연변이된 잔기의 대략적인 위치를 나타낸다.
도 9b는 R1MAb2 및 R1MAb2의 DNA 돌연변이체 (R1MAb2 DANA)를 비교하기 위한 FGFR1c를 발현하는 HEK293 세포에서의 GAL-Elk 기반 루시페라제 검정을 보여준다.
도 9c는 1mpk의 지시된 Ab의 i.p. 주사 전에 (주사전) 및 주사 7일 후에 db/db 마우스의 혈액 글루코스를 보여준다. 대조군 마우스에게 쌍-급식하여 체중을 정상화시켰다.
도 9d는 정제된 FGFR ECD 단편에 대한 항체 결합을 측정하는 ELISA를 보여준다. OA-R1MAb1: R1MAb1의 OA-버전.
도 9e는 S5B와 유사한 GAL-Elk 기반 루시페라제 검정을 보여준다.
도 9f는 0.5μg/ml의 지시된 단백질로 지시된 시간 동안 처리된 3T3-L1 지방세포의 웨스턴 불롯 분석을 보여준다.
도 9g는 제0일 (화살표)에 지시된 Ab의 단일 i.p. 주사 후에 db/db 마우스의 혈액 글루코스 (좌측) 및 체중 (우측)을 보여준다. N=7. *p<0.05 (대조군 IgG vs 3mpk R1MAb1), **p<0.0005 (대조군 IgG vs 3mpk R1MAb1 및 대조군 IgG vs 1mpk R1MAb1).
도 9h는 Ab 주사 7일 후에 수집된 샘플로부터의 간 및 혈청 지질을 보여준다. N=7. *p<0.05, **p<0.0005 (vs 대조군 IgG).
도 10은 간 및 WAT에서 KLB 및 FGFR 이소형의 mRNA 발현을 보여준다. 사료-급식 및 HFD-급식 C57BL/6 마우스는 25주령이었다. HFD-급식 마우스는 21주 동안 HFD에 있었다. *p<0.05 또는 **p<0.001. N=6.
도 11은 FGF21 및 R1MAb의 활성을 위한 정상 지방 기능에 대한 필요성을 보여준다. 제0일에 1mpk 용량의 R1Mab1 또는 대조군 IgG의 단일 i.p. 주사 후의 ob/ob 또는 ap2-srebp1c 트랜스제닉 마우스의 음식 섭취량 (좌측), 혈액 글루코스 (중앙), 및 체중 (우측). 동일한 마우스가 도 3e에 기재된다. N=7. #p<0.001 (vs IgG), *p<0.001 (vs PF-IgG). 처리후 측정은 주사 1일 후에 수행하였다.
도 12a는 HEK293에서의 세포-기반 루시페라제 검정을 보여준다. 세포를 지시된 GAL-융합 단백질, SV40-레닐라 루시페라제, 및 GAL-반응성 루시페라제 리포터에 대한 발현 벡터로 공형질감염시켰다. 일부 세포는 또한 지시된 바와 같이 KLB에 대한 발현 벡터로 공형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 지시된 바와 같이 FGF21에 대한 발현 벡터 또는 대조군 공벡터로 형질감염된 HEK293 세포부터의 조건화 배지를 함유하는 배지와 인큐베이션하였다. 6시간 인큐베이션 후에, 세포에 루시페라제 검정을 적용하였다. 전사 활성화를 레닐라 루시페라제 활성에 의해 정상화된 상대적 반딧불이 루시페라제 활성에 의해 평가하고, 유도 배수로 표현하였다.
도 12b는 일부 세포를 하기 핵 수용체 리간드: 1μM Wy14643 (PPARα), 5nM GW101516 (PPAR ), 50nM 로시글리타존 (PPARγ), 50nM T0901317 (LXRα), 5nM T3 (TRβ), 30μM CDCA (FXR)로 공동처리한 유사한 루시페라제 검정을 보여준다. FGF21이 동족 리간드 처리와 함께 또는 이러한 처리 없이 여기서 시험된 임의의 핵 수용체의 활성에 영향을 미치지 않았다는 것에 주목한다.
도 12c는 0.5μg/ml의 FGF21로 10분 동안 처리된 HEK293 세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 일부 세포는 지시된 바와 같이 FGFR (100nM PD173074), mTOR (100nM 라파마이신) MEK1/2 (10μM U0126), PI3K (1μM 워트만닌)에 대한 억제제로 예비처리하였다.
도 12d는 지방 조직에서 산화 대사에 관련된 하류 유전자를 보여준다.
도 13은 지시된 용량에서 R1MAb2 (182.2로 라벨링됨), R1MAb3 (182.5로 라벨링됨) 또는 대조군 IgG (항-Her2)의 단일 i.p. 주사 후에 db/db 마우스의 혈액 글루코스 (상부) 및 체중 (하부)을 보여준다. N=6, *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005. R1MAb3은 서열 6을 포함하는 VH 및 서열 4를 포함하는 VH를 포함한다.
도 14a는 0.5 mpk의 R1MAb1 또는 대조군 IgG의 단일 복강내 주사 후에 마른 C57BL/6 마우스의 누적 음식 섭취량, 혈액 글루코스 및 체중 변화를 보여준다. 또한, 마우스에게 재조합 FGF21 (1.2 mpk/일) 또는 비히클 대조군 (PBS)의 연속 주입 (c.i.)을 위해 제0일에 삼투 미니-펌프를 피하 이식하였다. 제3일에, 마우스를 밤새 단식시켜 제4일 (화살표)에 글루코스 내성 검사 (GTT)를 수행하였다.
도 14b는 밤새 단식 후에 제4일에 2 g/kg 글루코스를 복강내 주사하여 수행된 글루코스 내성 검사를 보여준다.
도 14c는 도 2c, S10A 및 S10B에 도시된 마우스의 혈청 분석을 보여준다. 혈청 샘플은 4시간 단식 후에 제5일에 수집하였다. 데이터는 양측 비대응 스튜던트 t-검사에 의해 군당 n=6마리 마우스; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. PBS (c.i.) + IgG 대조군에서의 평균 ± SEM을 나타낸다 (n.s. = 유의하지 않음).
도 15는 도 2c 및 S10에 사용된 마우스의 간 조직으로부터 단리된 mRNA를 사용한 유전자 발현 분석을 보여준다. 조직 샘플은 4시간 단식 후에 제5일에 단리하였다. 데이터는 양측 비대응 스튜던트 t-검사에 의해 군당 n=6마리 마우스; *p<0.05, ***p<0.001 vs. PBS (c.i.) + IgG 대조군에서의 평균 ± SEM을 나타낸다 (n.s. = 유의하지 않음).
도 16은 도 2c, S10 및 S11에 사용된 마우스의 갈색 지방 조직으로부터 단리된 mRNA를 사용하는 유전자 발현 분석을 보여준다. 조직 샘플은 4시간 단식 후에 제5일에 단리하였다. 데이터는 양측 비대응 스튜던트 t-검사 (n.s. = 유의하지 않음)에 의해 군당 n=6마리 마우스; *p<0.05, ***p<0.001 vs. PBS (c.i.) + IgG 대조군에서의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 17a는 비오티닐화 펩티드 단편에 대한 항체 결합을 측정하는 ELISA 결과를 보여준다.
도 17b는 FGFR1 (아미노산 161-212; 서열 27)의 아미노산 서열, 펩티드 #26 (서열 28) 및 펩티드 #28 (서열 29)의 아미노산 서열을 FGFR2 (서열 30), FGFR3 (서열 31) 및 FGFR4 (서열 32)로부터의 펩티드 #26에 상응하는 아미노산 및 FGFR2 (서열 33), FGFR3 (서열 34) 및 FGFR4 (서열 35)로부터의 펩티드 #28에 상응하는 아미노산과 함께 보여준다. FGFR1 및 FGFR2-4의 상응하는 영역에서 펩티드 #26과 펩티드 #28 서열 사이의 차이는 박스 표시된다.
도 17c는 다양한 농도의 R1MAb1 또는 대조군 IgG의 존재 하에 FGF2 단백질에 대한 His-태그부착된 FGFR1 결합을 측정하는 ELISA 결과를 보여준다. 데이터는 % FGFR1-His 결합으로 표현하고, 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다.
도 17d는 다양한 농도의 비-표지된 R1MAb1 또는 FGF21의 존재 하에 KLB 및 FGFR1c를 둘 다 안정하게 발현하는 HEK293 세포에 대한 아이오다이드화 FGF21의 결합을 보여준다 (반응은 또한 BSA (10 mg/ml) 및 대조군 IgG (350 mM)를 함유하여 비-특이적 결합을 차단함). 데이터는 반응에서 총 방사성-표지된 FGF21의 % 결합된 FGF21로서 표현된다.

I. 정의

본원의 목적을 위해 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.

"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.

용어 "항-FGFR1 효능제 항체"는 항체가 FGFR1을 활성화시키는데 있어 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 FGFR1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-FGFR1 단백질에 대한 항-FGFR1 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 FGFR1에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, FGFR1에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.

"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.

"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.

작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 신장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.

"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 하기 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.

"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.

"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)].) VH 내의 CDR1을 제외하고는, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.

"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.

"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

"항-FGFR1 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.

"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.

용어 "포장 삽입물"은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:

X/Y의 분율 x 100

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.

용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "섬유모세포 성장 인자 수용체 1 또는 FGFR1"은 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FGFR1을 지칭한다. 용어는 "전장" 비프로세싱된 FGFR1 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 FGFR1의 임의의 형태를 포함한다. 용어는 또한 FGFR1의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 FGFR1b 및 FGFR2b의 아미노산 서열은 각각 하기 제시된다:

본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

II. 조성물 및 방법

한 측면에서, 본 발명은 부분적으로 항-FGFR1 효능작용 항체의 발견 및 이러한 항체의 치료 활성에 기초한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 당뇨병을 포함하는 대사 질환의 치료에 유용하다.

A. 예시적인 항-FGFR1 항체

한 측면에서, 본 발명은 FGFR1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 FGFR1b 및/또는 FGFR1c에 결합하고, FGFR1 활성에 효능작용을 한다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 17, 서열 18 또는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-FGFR1 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 완전 인간, 인간화 또는 비-인간 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 항-FGFR1 항체는 하기와 같은 서열 2, 3 또는 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다:

특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-FGFR1 항체는 FGFR1에 결합하고, 그의 활성에 효능작용을 하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 2, 3 또는 4에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-FGFR1 항체는 서열 2, 3 또는 4의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함).

또 다른 측면에서, 하기와 같은 서열 6의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-FGFR1 항체가 제공된다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR (서열 6). 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-FGFR1 항체는 FGFR1에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 6에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-FGFR1 항체는 서열 6의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함).

또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-FGFR1 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 2, 3 또는 4 및 서열 6의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).

본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-FGFR1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')₂ 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.

추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-FGFR1 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:

1. 항체 친화도

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.

한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트-20(MICROSCINT-20)™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.

또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 회합률이 10⁶ M^-1 s^-1을 초과하는 경우, 회합률은 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

2. 항체 단편

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.

디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).

항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

3. 키메라 및 인간화 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

4. 인간 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.

인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.

인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.

인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.

5. 라이브러리-유래 항체

본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.

6. 다중특이적 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 FGFR1에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 예를 들어 베타-클로토에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 FGFR1의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.

다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다

"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).

본원의 항체 또는 단편은 또한 FGFR1 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원, 예를 들어 클로토베타에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).

7. 항체 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 클래스에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.

<표 1>

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.

변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.

특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

b) 글리코실화 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.

한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.

이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 1개 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.

c) Fc 영역 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).

감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).

FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)

특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.

증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).

Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.

d) 시스테인 조작된 항체 변이체

특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

e) 항체 유도체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-FGFR1 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-FGFR1 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는 항-FGFR1 항체를 제조하는 방법이 제공된다.

항-FGFR1 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).

항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.

원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.

글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.

식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.

척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR^- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.

C. 검정

본원에 제공된 항-FGFR1 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.

1. 결합 검정 및 기타 검정

한 측면에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.

2. 활성 검정

한 측면에서, 효능작용 활성을 갖는 항-FGFR1 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 예를 들어, 생물학적 활성은 특정한 경로의 신호 전달을 활성화시키는 능력을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 포스포-FRS2a, 포스포-MEK, 포스포-ERK/MAPK, 포스포-STAT3의 수준을 결정하거나 본원에 기재된 GAL-Elk1-기반 루시페라제 검정을 이용함으로써 측정될 수 있다 (또한, 예를 들어 문헌 [Wu et al. J. Biol. Chem. 5;282(40):29069-72 (2007) 및 Wu et al. PLoS One 18;6(3):e17868 (2011)] 참조). 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.

D. 면역접합체

본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-FGFR1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이에 제한되지는 않은 하나 이상 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.

또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹², 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.

본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.

E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-FGFR1 항체는 생물학적 샘플에서 FGFR1의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 갈색 지방 조직, 췌장 조직, 간 조직, 백색 지방 조직 및 종양 조직을 포함한다.

한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-FGFR1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 FGFR1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항-FGFR1 항체와 생물학적 샘플을 FGFR1에 대한 항-FGFR1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것, 및 항-FGFR1 항체와 FGFR1 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 예를 들어 FGFR1이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-FGFR1 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.

특정 실시양태에서, 표지된 항-FGFR1 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

F. 제약 제제

본원에 기재된 바와 같은 항-FGFR1 항체의 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 제약상 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.

예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.

또한, 본원에서 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, glp-1 유사체, 합성 아밀린, 글루카곤 수용체 길항제 (예를 들어, 항-GCGR 항체) 또는 렙틴을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.

G. 치료 방법 및 조성물

본원에 제공된 임의의 효능작용 항-FGFR1 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.

한 측면에서, 의약으로 사용하기 위한 효능작용 항-FGFR1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 대사 질환의 치료에 사용하기 위한 효능작용 항-FGFR1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 효능작용 항-FGFR1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대사 질환을 앓는 개체에게 유효량의 항-FGFR1 항체를 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 효능작용 항-FGFR1 항체를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 glp-1 유사체, 합성 아밀린, 글루카곤 수용체 길항제 (예를 들어, 항-GCGR 항체) 또는 렙틴의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.

추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에 있어서 효능작용 항-FGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 대사 질환의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 대사 질환을 앓는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 대사 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 대사 질환의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 이러한 대사 질환을 앓는 개체에게 유효량의 효능작용 항-FGFR1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 효능작용 항-FGFR1 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 효능작용 항-FGFR1 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 효능작용 항-FGFR1 항체 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.

본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 glp-1 유사체, 합성 아밀린, 글루카곤 수용체 길항제 (예를 들어, 항-GCGR 항체) 또는 렙틴이다.

상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다.

본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.

본 발명의 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.

H. 제조품

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

III. 실시예

다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.

실시예 1. 항-FGFR1 효능제 항체의 생성 및 특성화.

본 발명자들은 파지 디스플레이 기술 및 항원으로서 인간 FGFR1b 및 c의 His-태그부착된 IgD2-D3을 사용하여 FGFR1에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하였다. 인간 IgG 레퍼토리의 천연 다양성을 모방한, 선택된 상보성 결정 영역 (H1, H2, H3, L3)에서 합성적 다양성을 갖는 인간 파지 항체 라이브러리를 패닝에 사용하였다. Fab 단편을 M13 박테리오파지 입자의 표면 상에 2가 디스플레이하였다 (문헌 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284:119-32 (2004)]). 패닝 프로토콜은 이전에 기재되어 있다 (문헌 [Liang et al., J. Mol. Biol. 366:815-29 (2007)]). 다중 라이브러리로부터 다수의 클론을 스크리닝한 후에, FGFR1의 b 및 c 이소형 둘 다에 결합하는 고유의 특이적 파지 항체를 파지 ELISA에 의해 확인하였다. 인간 FGFR에 대한 항체의 결합을 시험하기 위해, 2 μg/ml의 FGFR1 ECD-인간 Fc 키메라 단백질을 사용하여 종래의 ELISA 프로토콜을 이용하였다.

본 발명자들은 또한 하기와 같이 변형시킨 문헌 [Liang et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 비아코어™ T100 기기를 이용하는 비아코어/SPR에 의해 FGFR1에 대한 항-FGFR1 항체의 결합 친화도를 측정하였다. 마우스 항-인간 Fc 항체를 우선 제조업체에 의해 기재된 절차에 따라 유리 아미노산에 대한 직접적 커플링을 이용하여 비아코어™ 카르복시메틸화 덱스트란 CM5 칩 상에 코팅하였다. 이어서, 항체를 CM5 바이오센서 칩 상에 포획하여 대략 200 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 결합 측정은 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 (HBS-P 완충제)로 구성된 전개 완충제를 이용하여 수행하였다. FGFR1 ECD-His 단백질의 2-배 희석 연속물을 HBS P 완충제 중 1.550 nM의 범위에서 30 μL/분의 유량으로 25℃에서 주사하였다. 회합률 (Kon, mol/s당) 및 해리율 (Koff, s당)을 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어™ 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd, mol당)를 Koff / Kon의 비로 계산하였다.

독립적인 실험에서 상기 기재된 바와 같이 확인된 항-FGFR1 항체 중 2개 (여기서 R1MAb1 및 R1MAb2로 지칭됨)는 FGFR1b 및 FGFR1c에 유사한 친화도로 결합하였으나, 임의의 다른 FGFR 이소형에는 결합하지 않았다 (도 1a 및 b). 이들의 신호전달 활성을 내인성 FGFR은 결핍되었으나, 각각의 FGFR 이소형 (및 필요에 따라 KLB)을 발현하도록 형질감염된 래트 L6 세포에서 Gal-Elk1 기반 루시페라제 검정을 이용하여 시험하였다. 이들 항체는 놀랍게도 강력한 효능제였다: R1MAb는 둘 다 용량 의존성 방식으로, 그러나 단지 세포가 재조합 FGFR1b 또는 FGFR1c를 발현하는 경우에만 루시페라제 활성을 유도하였으며, 이는 R1MAb가 FGFR1에 특이적 효능제로서 작용한다는 것을 나타낸다 (도 1c). 이러한 검정 포맷에서, R1MAb는 통상의 FGFR1 리간드인 염기성 FGF (bFGF)의 활성에 주목할 만하게 영향을 미치지 않았다 (도 1d). 그러나, R1MAb 및 FGF21은 세포가 FGFR1c 및 KLB를 발현하는 경우에 추가의 효과를 나타내었다 (도 1d). F(ab')2는 FGFR1-의존성 효능작용 활성을 나타내었으나 R1MAb2의 Fab 단편은 그렇지 않았으며, 이는 R1MAb가 FGFR1의 동종이량체화를 촉진함으로써 그의 효능작용 활성을 나타낸다는 것을 시사한다 (도 1e). 이전에, FGFR1-결합 펩티드 및 c-jun 류신 지퍼 도메인을 함유하는 인공적인 FGFR 이량체화 효능제가 보고된 바 있다. C19jun으로 불리는 이 분자는 또한 c-jun 도메인을 통해 헤파린에 결합하고, FGFR1 활성화를 위해 헤파린을 필요로 한다 (문헌 [Ballinger et al., Nature Biotechnol. 17: 1199-1204 (1999)]). 대조적으로, 헤파린은 루시페라제 검정에서 R1MAb1의 효능작용 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 5). R1MAb1의 헤파린-비의존성 효능작용 활성은 또한 배양된 뮤린 3T3-L1 지방세포 (도 1f) 또는 R1MAb를 복강내 주사한 C57BL/6 마우스의 WAT (도 1g)에서 FGFR의 하류 신호전달 성분인 ERK 및 MEK1/2의 인산화를 조사함으로써 확인되었다.

본 발명자들은 R1MAb1 및 R1MAb2에 의해 결합된 FGFR1 에피토프를 맵핑하기 위한 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 아미노-말단 비오틴 태그를 갖는 FGFR1 서열의 일부를 나타내는 30개의 펩티드를 합성하고, 이들을 ELISA 결합 검정에 사용하였다. 이들 펩티드 서열은 다음과 같다:

도 17a에 나타난 바와 같이, R1MAb1 및 R1MAb2 둘 다의 경우에 이들이 유의한 결합을 입증한 최단 펩티드는 펩티드 #26 및 #28이었다.

실시예 2. R1MAb는 지속적인 항당뇨병 활성을 입증한다.

본 발명자들은 본 발명의 항-FGFR1 항체가 항당뇨병 활성을 갖는지 여부에 대해 당뇨병의 마우스 모델을 이용하여 시험하였다. 모든 마우스는 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)로부터 구입하고, 사료 (표준 설치류 사료 (랩다이어트(Labdiet) 5010, 지방으로부터 12.7% 칼로리) 또는 고지방, 고탄수화물 식이 (하를란 테클라드(Harlan Teklad) TD.03584, 지방으로부터 58.4% 칼로리) 및 물에 임의로 접근가능하도록 하면서 표준 12시간 광주기/12시간 암주기 하에 21℃에서 병원체-무함유 동물 설비에서 유지하였다. C57BLKS/J 백그라운드의 db/db 마우스는 암컷이고, 다른 마우스는 모두 수컷이었다. 모든 마우스는 대략 9-11주령에 주사에 사용하였으며, 예외로 ap2-SREBP1c 마우스는 8개월령 (도 3e) 또는 4개월령 (도 3f)에 사용하였다. FGF21 단백질의 연속 주입을 위해, 삼투 펌프 (알제트(Alzet)® 2001)를 피하 이식하였다. 글루코스 수준을 원터치(OneTouch)® 울트라(Ultra)® 혈당측정기를 이용하여 측정하였다. 간 지질 분석을 위해, 지질을 폴치(Folch) 방법에 따라 추출하고, 5% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, β-히드록시부티레이트 (써모 DMA(Thermo DMA)) 및 비에스테르화 지방산 (로슈(Roche))을 효소적 반응을 이용하여 결정하였다. 혈청 인슐린 수준을 ELISA (크리스탈 켐(Crystal Chem))에 의해 결정하였다.

본 발명자들은 고혈당 렙틴-저항성 db/db 마우스에게 3, 10, 및 50 mg/kg (mpk)의 R1MAb1을 주사함으로써 시험관내 및 생체내에서 R1MAb의 효능작용 활성을 시험하였다. 본 발명자들은 혈액 글루코스 수준이 모든 3가지 용량에서 1주일 초과 동안 정상화된다는 것을 관찰하였고, 관찰된 글루코스-저하 효과는 놀랍게도 강력하고 오래 지속되었는데, 단일 주사 후에 30일 초과 동안 대조군 마우스보다 낮은 글루코스 수준이 유지되었다 (도 2a). 이는 일시적이지만 유의한 체중 감소와 연관된다 (도 2a). 또한 혈청 인슐린 수준이 R1MAb1 주사에 의해 현저하게 감소되었으므로, 글루코스 저하 효과는 아마도 인슐린 감수성의 개선을 통할 수 있을 것이다 (도 2b). 본 발명자들은 R1MAb2로 (도 6), 및 현저한 인슐린 저항성을 갖는 3개의 추가의 마우스 모델, 렙틴-결핍 ob/ob 마우스, 고지방 식이 (HFD) 급식 마우스, 및 Ins2Akita 마우스 (문헌 [Hong et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 293:E1687-96 (2007)]) (도 2c 및 7)에서 혈액 글루코스 수준의 유사한 R1MAb-유도 감소를 관찰하였다. 쌍-급식 실험은 db/db 및 Ins2Akita 마우스에서의 R1MAb-유도 체중 감소가 음식 섭취량의 감소로 인한 것이라는 것을 보여주었으나, 관찰된 혈액 글루코스 감소는 음식 섭취량과 거의 관련이 없었다 (도 2d 및 6-7). 췌장에서, R1MAb1 주사는 쌍-급식 또는 비-쌍급식 대조군 마우스와 비교하여 각 췌장섬당 인슐린 양성 면적을 증가시켰다 (도 2e 및 8). FGFR1은 췌장 β 세포에서 발현되고 (문헌 [Hart et al., Nature 408:864-68 (2000)]), FGF21은 생체외 β 세포 기능을 촉진하며 (문헌 [Wente et al., Diabetes 55:2470-78 (2006)]); 이에 따라 β 세포에서 FGFR1의 활성화는 증가된 췌장 인슐린 수준에 직접적으로 기여할 수 있다. 이들 데이터는 FGFR1 (그러나 FGFR2 또는 FGFR3은 아님)의 활성화가 재조합 FGF21의 항당뇨병 및 항지질혈증 활성을 재현하기에 충분하다는 것을 입증한다.

R1MAb의 활성에 대한 IgG 기능성의 중요성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 2가지 유형의 변형을 이용하였다. Fc 영역에서의 이중 돌연변이 (D265A/N297A; DANA)는 FcγR에 대한 결합 및 IgG 분자에 의한 면역 이펙터 세포의 동원을 중지시켰다 (문헌 [Gong et al., 2005]). R1MAb2의 효능작용 또는 항당뇨병 활성은 DANA 돌연변이의 도입에 의해 전혀 영향을 받지 않았으며; 이에 따라 이펙터 기능은 R1MAb2의 항당뇨병 활성에서 어떠한 역할도 수행하지 않는다 (도 9a-c). 그러나, Fab 단편 중 하나가 결핍된 R1Mab1의 조작된 1-아암 (OA) 버전 (OA-R1MAb1) (도 9a 및 d) (문헌 [Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997)])은 감소된 효능작용 활성을 나타내었고 (도 9e 및 f), db/db 마우스에서 혈액 글루코스, 체중, 및 간 및 혈청 지질 수준을 감소시키는데 실패하였으며 (도 9g 및 h), 이는 R1MAb의 효능작용 및 항당뇨병성 활성이 둘 다 (본 발명자들이 또한 오직 1개의 항-FGFR1 아암 (예를 들어, 항-베타-클로토 아암)을 갖는 이중특이적 항체를 시험하고, 이들이 2가 항-FGFR1 R1MAb의 유익한 특성을 유지한다는 것을 확인하였을지라도) Ab 2가에 의존성이라는 것을 나타낸다. 이러한 상관관계는 FGFR1의 하류 신호전달 경로의 R1MAb-유도 활성화가 아마도 그의 항당뇨병 효과를 매개할 수 있을 것임을 강력하게 시사한다.

MAb는 다수의 인간 질환의 치료를 위한 강력한 치료 양식으로 대두되었다. 본 발명자들은 항-FGFR1 효능작용 MAb의 강력한 항고혈당 및 지질-저하 활성을 입증하여, 제2형 당뇨병 및 다른 비만-관련 만성 장애의 치료를 위한 FGFR1 또는 FGFR1-함유 수용체 복합체를 표적화하는 치료적 MAb의 개발을 향한 신규 경로를 열었다. FGFR1의 MAb-기반 표적화는 재조합 FGF21 요법에 비해 여러 유리한 특성을 제공한다. 우선, 이들의 특성에 의해, MAb는 FGF21 또는 임의의 다른 비-항체 치료 단백질과 비교하여 예측가능하고, 조정가능하며 훨씬 우수한 약동학을 제공한다. 실제로, 본 발명자들은 1-3 mpk의 R1MAb1 또는 R1Mab2를 db/db 마우스에 단일 i.p. 주사하면 30일 초과 동안 고혈당증이 두드러지게 지속적으로 개선된다는 것을 입증하였다 (도 2 및 5). 이러한 장기 혈당 효과는 이전에 기재된 어떠한 항당뇨병제에서도 전혀 보고된 적이 없다.

실시예 3. R1MAb 및 FGF21 의 당뇨병성 작용에서의 지방 조직의 중요성.

재조합 FGF21은 지방 조직 및 간을 통한 인슐린 감수성을 개선한다고 제안되었다 (문헌 [Berglund et al., Endocrinology 150:4084-93 (2009); Li et al., FEBS Letters 583:3230-34 (2009)]). 마우스로의 FGF21 주사는 이전에 보고된 바와 같이 4개의 KLB-발현 조직 유형, 간, 백색 지방 조직 (WAT), 갈색 지방 조직 (BAT), 및 췌장에서 MEK 및 ERK 인산화를 유도하였다 (도 3a, 상부) (문헌 [Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282: 26687-95 (2007); Xu et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297(5): E1105-14 (2009)]). 대조적으로, R1MAb1 주사는 지방 조직 및 췌장에서 동일한 하류 이펙터의 인산화를 유도하였으나 간에서는 그렇지 않았으며 (도 4a, 하부), 이는 간에서 매우 낮은 FGFR1 mRNA 발현과 일치한다 (도 10) (문헌 [Fon Tacer et al., Mol. Endocrinol. 24(10): 2050-64 (2010)]). 실제로, 간 유전자 발현의 병렬식 비교는 2개의 이전에 확인된 FGF21-표적화 유전자 (렙틴 수용체 (LepR) 및 시토카인 신호전달 저해제 2 (SOCS2); 문헌 [Coskun et al., Endocrinology 149:6018-27 (2008), Inagaki et al., Cell Metabolism 8:77-83 (2008)])의 발현이 FGF21에 의해 유도되었으나 R1MAb1에 의해서는 그렇지 않다는 것을 밝혀내었다 (도 15). 다른 한편, 공지된 인슐린 조절 유전자 (아세틸-CoA 카르복실라제 1 (ACC1), 지방산 신타제 (FAS), 장쇄 지방산 패밀리의 엘롱가제 6 (Elovl6), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)-결합 단백질 (IGFBP)-1, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 (PEPCK))의 간 발현은 FGF21 및 R1MAb1 둘 다에 의해 유사하게 변경되었으며, 이는 이들 유전자가 호르몬 (예를 들어, 인슐린) 또는 대사 변화를 통해 간접적으로 조절될 수 있다는 것을 제안한다. R1MAb1은 단일 주사 7일 후에 db/db 마우스에 주사되었을 때 간 및 혈청 지질을 현저하게 감소시켰으며, 이는 아마도 지방 조직을 통한 지질 재분할 효과 때문일 것이다 (도 3b-d). R1MAb1 주사는 FGFR1을 발현하는 2개의 호발암성 조직 유형인 폐 및 전립선에서 MEK 또는 ERK의 인산화를 유도하지 않았다 (도 3a). 이러한 관찰은 함께 지방 조직이 R1MAb 및 FGF21의 통상의 대사 활성에 중요하지만 간은 그렇지 않다는 것을 제안한다.

이러한 점을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 백색 지방 조직의 결핍 및 손상된 백색 지방 기능으로 인해 심각한 인슐린 저항성, 렙틴 결핍, 및 간비대를 나타내는 지방위축성 ap2-srebp1c 트랜스제닉 마우스를 이용하였다 (도 3e, 11) (문헌 [Shimomura et al., Genes Dev. 12:3182-94 (1998); Shimomura et al., Nature 401:73-76 (1999)]). 정상 지방 조직 기능이 R1MAb1의 대사 활성에 요구된다는 생각과 일치하게, 1mpk에서의 단일 i.p. 주사는 대조군 ob/ob 마우스에서만 HOMA-IR 및 글루코스 내성을 개선하였으나 ap2-srebp1c 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 3e). 음식 섭취량은 대조군 IgG를 주사한 쌍-급식 마우스와 비교하였을 때 ob/ob 마우스 및 ap2-srebp1c 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 R1MAb1 주사에 의해 감소하였다 (도 3e). 또한, 혈청 β-히드록시부티레이트 (즉, 케톤체)의 유의한 증가 및 콜레스테롤의 감소가 관찰되었으나, 재조합 FGF21의 연속 주입은 또한 ap2-srebp1c 마우스에서 인슐린 내성을 개선하는데 실패하였다 (도 3f).

실시예 4. R1MAb 에 의한 갈색 지방에서의 PGC1 -알파 활성화.

FGF21은 최근에 지방 조직 및 간에서 핵 수용체 전사 보조활성인자 PGC-1α 단백질을 활성화시켜 산화 대사와 연관된 하류 유전자의 발현의 유도하는 것으로 제안되었다 (문헌 [Chau et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 107:12553-58 (2010); Hondares et al., Cell Metabolism 11:206-12 (2010); Potthoff et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 30;106(26): 10853-8 (2009)]). 실제로, ob/ob 마우스에 주사하였을 때, R1MAb1은 DNA 마이크로어레이 분석에 이어 유전자-세트 풍부화 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 OXPHOS에 관여하는 유전자의 BAT 발현, 및 지방산 대사를 유의하게 증가시켰다 (도 4a). R1MAb1 (및 FGF21)은 또한 갈색 지방 조직에서 PGC-1α, PGC-1β, 및 이들의 주요 표적 CIDEA 및 UCP1의 발현을 증가시켰다 (qPCR에 의해 측정됨; 도 4b 및 16).

PGC-1α의 전사는 프로모터 영역에서의 cAMP 반응 요소 (CRE) 및 CRE에 결합하는 CREB 전사 인자를 통해 조절된다 (문헌 [Herzig et al., Nature 413:179-83 (2001); Karamitri et al., J. Biol. Chem. 284:20738-52 (2009); Muraoka et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E1430-39 (2009); Shi et al., J. Biol. Chem. (2005)]). KLB를 발현하는 HEK293 세포에서 FGF21에 의해 활성화될 수 있는 대사-관련 전사 인자를 확인하기 위한 스크린에서, 본 발명자들은 GAL-CREB 융합 단백질이 FGF21에 의해 활성화될 수 있다는 것을 발견하였다 (도 S8A-B). 이후에, 본 발명자들은 FGF21 및 R1MAb1이 둘 다 GAL-CREB 리포터 뿐만 아니라 CRE-루시페라제 리포터를 HEK293 세포에서 용량 의존성 방식으로 활성화시킬 수 있다는 것을 발견하였다 (도 4c). CREB가 하류 이펙터로서 기능한다는 생각과 일치하게, FGF21은 마우스 백색 지방 조직 (도 4d), 분화된 인간 1차 지방세포 (도 4e), 및 HEK293 세포 (도 12c)에서 CREB, 및 ERK에 의해 조절되는 상류 CREB 키나제인 p90RSK의 인산화를 증가시켰다. 따라서, FGF21 및 R1MAb에 의한 CREB 활성화는 아마도 PGC-1알파 및 지방 조직에서의 산화 대사에 관여하는 하류 유전자의 세트의 유도에 기여할 것이다 (도 4f 및 12d). 본 발명자들은 R1MAb에 의한 시험관내 또는 생체내 AMPK 활성화의 증거를 관찰하는데 실패하였으나 (데이터는 나타내지 않음), 여기서 제안된 전사 조절 뿐만 아니라 FGF21은 AMPK의 활성화를 통해 번역후에 PGC-1α를 활성화시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Chau et al., 상기 문헌]). 총괄적으로, 본 발명자들의 결과는 FGF21 및 R1MAb의 항지질 및 항당뇨병 효과를 매개하는데 있어 지방 조직에서의 PGC-1α의 역할을 제안한다.

실시예 5. 이중특이적 항-FGFR1/항-베타-클로토 항체 시험

본 발명자들의 R1MAb와 FGF21 사이의 또 다른 중요한 차이는 표적 수용체 특이성이다. FGF21은 FGFR1c, 2c, 및 3c에 작용할 수 있으나, 그의 효과는 아마도 KLB 발현 조직 (즉, 간, 지방, 및 췌장)으로 제한될 것이다 (문헌 [Fon Tacer et al., 상기 문헌; Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282:26687-95 (2007); Ogawa et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104:7432-37 (2007)]). 대조적으로, 본 발명자들의 R1MAb의 표적 조직은 FGFR1의 발현 및 항체 분자의 조직 분포에 의해 결정되지만, KLB 발현에 의해 제한되지 않을 것이다. 실제로, 본 발명자들은 R1MAb1로 처리된 마우스에서 경미한 저인산혈증을 관찰하였으며, 이는 신장에서 FGF23/클로토-경로의 활성화를 제안한다. 따라서, 본 발명자들은 파지 디스플레이 또는 하이브리도마 기술 (FGFR1c 및 KLB를 발현하는 HEK293 세포로 면역화된 BALBc 마우스)을 이용하여 이중특이적 항-KLB/FGFR1 이중특이적 항체를 생성함으로써 개별 항-KLB 항체 및 노브-앤드-홀(knob-and-hole) 기술을 생성하였다 (문헌 [Merchant et al. Nature Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)]). 본 발명자들은 이들 이중특이적 항체가 GAL-Elk1 발현을 활성화시키는 능력을 시험하였고, 이들 항체가 하류 신호 활성화를 위해 베타-클로토 및 FGFR1 둘 다의 존재에 의존한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 항체 중 하나가 분화된 1차 인간 지방세포에서 하류 신호전달 중간체, MEK 및 ERK ½의 인산화를 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 이중특이적 항체 중 하나는 뮤린 단백질과 교차 반응하고, 본 발명자들은 이 항체를 사용하여 이중특이적 항체의 생체내 활성을 시험하였다. 본 발명자들은 이러한 이중특이적 항체가 혈청 FGF23을 상승시키지 않고 혈액 글루코스 수준을 감소시키는 반면, 상응하는 대조군 항-FGFR1 (단일특이적) 항체는 비슷한 정도로 혈액 글루코스 수준을 감소시켰으나 혈청 FGF23 수준을 유의하게 상승시킨다는 것을 관찰하였다.

다음에 본 발명자들은 이들 이중특이적 항체가 항-FGFR1 효능작용 항체의 대사 이익을 제공하는 능력을 시험하였다. 본 발명자들은 인간 베타-클로토 (R1MAb1 및 R1MAb2는 각각 뮤린 FGFR1을 인식함)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성하고, 상기 기재된 항-KLB/FGFR1 이중특이적 항체가 마우스 모델, 예를 들어 고지방 식이 급식 hKLB 트랜스제닉 마우스에서 글루코스 내성을 개선한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 다른 모델 동물 (예를 들어, 래트, 토끼, 시노몰구스 및 레서스 원숭이)에서 단백질과 반응하는 항-베타-클로토 항체를 생성하고, 유사하게 이들 및 항-FGFR1 항체로 구축된 이중특이적 항체가 대사 이익을 제공하는 능력을 시험하였다.

상기 본 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> FGFR1 AGONISTS AND METHODS OF USE <130> P4653R1WO <140> <141> <150> 61/536,936 <151> 2011-09-20 <150> 61/486,731 <151> 2011-05-16 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Thr Lys Pro Asn Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys 1 5 10 15 Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe 20 25 30 Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys 35 40 45 Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val 50 55 60 Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val Pro Ser Asp 65 70 75 80 Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn 85 90 95 His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile 100 105 110 Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn 115 120 125 Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln 130 135 140 Trp Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn 145 150 155 160 Leu Pro Tyr Val 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Claims (36)

1. 개체에게 유효량의 항-섬유모세포 성장 인자 수용체-1 (FGFR1) 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 대사 질환 또는 상태를 치료하는 방법이며, 여기서 대사 질환은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, FGFR1 효능제는 FGFR2 또는 FGFR3을 활성화시키지 않는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, FGFR1 효능제가 항-FGFR1 항체인 방법.
3. 제2항에 있어서, 항-FGFR1 항체가 펩티드 #26 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열 28) 또는 펩티드 #28 FKPDHRIGGYKVRY (서열 29)에 결합하는 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 항-FGFR1 항체가 FGFR1b 및 FGFR1c 둘 다에 결합하는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 방법.
6. 제5항에 있어서, 항체가 또한 베타-클로토(Klotho)에 결합하는 것인 방법.
7. FGFR1에 결합하며, FGFR1 활성의 효능제인 단리된 항체.
8. 제7항에 있어서, FGFR2 또는 FGFR3의 효능제가 아닌 단리된 항체.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 #26 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열 28) 또는 펩티드 #28 FKPDHRIGGYKVRY (서열 29)에 결합하는 항체.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
12. (a) SSGYGGSDYAMDY (서열 16), SGYGGSDYAMDY (서열 17), EHFDAWVHYYVMDY (서열 18), TGTDVMDY (서열 19) 및 GTDVMDY (서열 20)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 23)를 포함하는 HVR-L3, 및 (c) X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG (여기서, X₁은 A 또는 G이고, X₂는 D 또는 E이고, X₃은 D 또는 Y이고, X₄는 N 또는 Y이고, X₅는 A 또는 D이고, X₆은 D 또는 Y임) (서열 24) 및 X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG (여기서, X₁은 D 또는 E이고, X₂는 D 또는 Y이고, X₃은 N 또는 Y이고, X₄는 A 또는 D이고, X₅는 D 또는 Y임) (서열 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-FGFR1 항체.
13. (a) 아미노산 서열 GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅ (여기서, X₁은 S 또는 T이고, X₂는 N 또는 S이고, X₃은 N 또는 T이고, X₄는 W 또는 Y이고, X₅는 H 또는 S임) (서열 26)를 포함하는 HVR-H1, (b) X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG (여기서, X₁은 A 또는 G이고, X₂는 D 또는 E이고, X₃은 D 또는 Y이고, X₄는 N 또는 Y이고, X₅는 A 또는 D이고, X₆은 D 또는 Y임) (서열 24) 및 X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG (여기서, X₁은 D 또는 E이고, X₂는 D 또는 Y이고, X₃은 N 또는 Y이고, X₄는 A 또는 D이고, X₅는 D 또는 Y임) (서열 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SSGYGGSDYAMDY (서열 16), SGYGGSDYAMDY (서열 17), EHFDAWVHYYVMDY (서열 18), TGTDVMDY (서열 19) 및 GTDVMDY (서열 20)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항-FGFR1 항체.
14. 제13항에 있어서, (a) 아미노산 서열 GFTFTSTWIS (서열 7)를 포함하는 HVR-H1, (b) GEIDPYDGDTYYADSVKG (서열 10) 및 EIDPYDGDTYYADSVKG (서열 11)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SSGYGGSDYAMDY (서열 16) 및 SGYGGSDYAMDY (서열 17)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
15. 제13항에 있어서, (a) 아미노산 서열 GFTFSNNYIH (서열 8)를 포함하는 HVR-H1, (b) ADIYPNDGDTDYADSVKG (서열 12) 및 DIYPNDGDTDYADSVKG (서열 13)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 EHFDAWVHYYVMDY (서열 18)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
16. 제13항에 있어서, (a) 아미노산 서열 GFTFTSNWIS (서열 9)를 포함하는 HVR-H1, (b) AEIDPYDGATDYADSVKG (서열 14) 및 EIDPYDGATDYADSVKG (서열 15)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) TGTDVMDY (서열 19) 및 GTDVMDY (서열 20)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 21)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 22)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QQSYTTPPT (서열 23)를 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
18. 제13항에 있어서, 서열 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 포함하는 항체.
19. 제18항에 있어서, 서열 6의 VL 서열을 추가로 포함하는 항체.
20. 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체인 항체.
21. 제20항에 있어서, 또한 베타-클로토에 결합하는 항체.
22. 제7항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 항체인 항체.
23. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
24. 제23항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
25. 제24항의 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되도록 하는 것을 포함하는, 항체의 생산 방법.
26. 제25항에 있어서, 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
27. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제.
28. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체.
29. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사 질환 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 항체.
30. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 개체를 인슐린에 대해 감작화시키는데 사용하기 위한 항체.
31. 의약의 제조에 있어서 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
32. 제31항에 있어서, 의약이 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 청소년의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사 질환 또는 상태의 치료를 위한 것인 용도.
33. 제31항에 있어서, 의약이 개체를 인슐린에 대해 감작화시키기 위한 것인 용도.
34. 개체에게 유효량의 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 당뇨병을 치료하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 개체에게 당뇨병을 치료하기 위한 또 다른 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 단 상기 다른 작용제가 인슐린은 아닌 것인 방법.
36. 제34항에 있어서, 개체에게 심혈관 질환을 치료하기 위한 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
    

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