CN103596980A

CN103596980A - Fgfr1激动剂及使用方法

Info

Publication number: CN103596980A
Application number: CN201280023217.3A
Authority: CN
Inventors: 园田纯一郎; 吴岩
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2032-05-15
Also published as: KR20140012150A; HRP20170815T1; CN103596980B; DK2710035T3; SI2710035T1; EP2710035A1; CA2834879A1; EA201391540A1; MX339662B; KR101623246B1; HUE033584T2; TW201300411A; TWI547500B; CY1119098T1; MX2019014654A; US20240076388A1; PT2710035T; JP5836481B2; AU2012255881A1; EA030462B1

Abstract

本公开内容提供FGFR1激动剂，包括激动性抗-FGFR1抗体，以及使用它们的方法。

Description

FGFR1激动剂及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年5月16日提交的美国专利申请61／486,731和于2011年9月20日提交的61／536,936的优先权的权益，上述每一件申请的全部内容通过引用完整引入本文。

发明领域

本发明涉及FGFR1激动剂及使用它们的方法。

背景

丧失控制血糖水平的能力是多种代谢病症的原因。糖尿病是一种高血糖综合征，其由响应葡萄糖的胰岛素分泌的缺陷(1型和2型糖尿病)和在刺激骨骼肌葡萄糖摄入和在保持肝葡萄糖产生中降低的胰岛素功效(2型糖尿病)导致。糖尿病是一种非常普遍的疾病，并且，尽管对一些糖尿病有可用的治疗选择，对另外的治疗仍存在紧迫的需求。

成纤维细胞生长因子21(FGF21)是内分泌FGF亚家族的一员(该亚家族包括FGF19和FGF23)，并且其已被鉴定为用于逆转肥胖和肥胖诱发的肝脂肪变性(hepatosteatosis)和高血糖的潜在的病性改变剂(参见，例如，Kharitonenkov和Larsen，Trends Endocrinol.Meatb.(内分泌代谢趋势)22(3)：81-6(2011)；Kharitonenkov等人，J. Clin.Invest.115：1627-35(2005)；WO 2010／042747)。内分泌FGF21蛋白结合三种FGF受体(FGFRs1-3)，并且通过这些受体以及其膜结合的共同受体β-Klotho改善胰岛素抵抗和2型糖尿病。然而，其开发已经受到其差的药物代谢动力学和对生物学作用机制的少的理解的阻碍。抗-FGFR1拮抗性抗体也已被提议用于糖尿病治疗(WO 2005／037235)。然而，还没有发现关于三种FGFRs中的哪一种调控FGF21的有益代谢活性性质。

概述

本发明部分地基于这一发现：激活FGFR1改善糖尿病。本发明提供FGFR1激动剂，包括激动性抗-FGFR1抗体，和使用它们的方法。

在一个方面，本发明提供治疗个体中的代谢疾病或病症的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的抗-成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)激动剂，其中所述代谢疾病选自由下列各项组成的组：***(polycystic ovary syndrome，PCOS)，代谢综合征(metabolicsyndrome，MetS)，肥胖(obesity)，非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，高脂血症(hyperlipidemia)，高血压(hypertension)，2型糖尿病(type2diabetes)，非2型糖尿病(non-type2diabetes)，1型糖尿病(type1diabetes)，隐匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes，LAD)和青年成年型糖尿病(maturity onset diabetesfothe young，MODY)。在一些实施方案中，所述FGFR1激动剂不激活FGFR2或FGFR3。在一些实施方案中，所述FGFR1激动剂是抗-FGFR1抗体。在一些实施方案中，所述抗-FGFR1抗体具有两个FGFR1-结合位点，例如，全长抗体或F(ab')2片段。在一些实施方案中，所述抗体结合肽#26KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)或肽#28FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，所述抗体结合肽#26和肽#28二者。在一些实施方案中，所述抗-FGFR1抗体结合FGFR1b和FGFR1c二者。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体还结合β-Klotho。

在另一个方面，本发明提供一种与FGFR1结合的分离的抗体，其中所述抗体是FGFR1活性的激动剂。在一些实施方案中，所述抗体不是FGFR2或FGFR3的激动剂。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人、人源化的或嵌合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)，SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)，EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)，TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)和GTDVMDY(SEQ ID NO：20)，(b)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)，和(c)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁为A或G，X₂为D或E，X₃为D或Y，X₄为N或Y，X₅为A或D，并且X₆为D或Y(SEQ ID NO：24)和X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁为D或E，X₂为D或Y，X₃为N或Y，X₄为A或D，并且X₅为D或Y(SEQ ID NO：25)。在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅，其中X₁为S或T，X₂为N或S，X₃为N或T，X₄为W或Y，X₅为H或S(SEQ ID NO：26)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁为A或G，X₂为D或E，X₃为D或Y，X₄为N或Y，X₅为A或D，并且X₆为D或Y(SEQ ID NO：24)和X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁为D或E，X₂为D或Y，X₃为N或Y，X₄为A或D，并且X₅为D或Y(SEQ ID NO：25)，和(c)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQID NO：16)，SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)，EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)，TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)和GTDVMDY(SEQ IDNO：20)。在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFTSTWIS(SEQ ID NO：7)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：GEIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)和EIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)，和(c)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)和SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)。在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFSNNYIH(SEQ ID NO：8)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：ADIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：12)和DIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：13)，和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)。在一些实施方案中，所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFTSNWIS(SEQ ID NO：9)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：AEIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：14)和EIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：15)，和(c)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)和GTDVMDY(SEQ ID NO：20)。在一些实施方案中，所述抗体还包含：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：21)；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：22)；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)。在一些实施方案中，所述抗体包含选自由SEQ ID NO：2，3和4组成的组的VH序列。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：6的VL序列。

在一些实施方案中，所述抗-FGFR1抗体具有两个FGFR1-结合位点，例如，全长抗体或F(ab')2片段。在一些实施方案中，本发明的抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体还结合β-Klotho。在一些实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本发明的抗体的分离的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含权利要求21的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供制备抗体的方法，所述方法包括培养权利要求22的宿主细胞，从而产生所述抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞中回收所述抗体。

在一些实施方案中，本发明提供一种包含本发明的抗体和药用载体的药物制剂。

在一些实施方案中，本发明提供本发明的抗体，其用作药物。在一些实施方案中，本发明的抗体用于治疗选自由下列各项组成的组的代谢疾病或病症：***(PCOS)，代谢综合征(MetS)，肥胖，非酒精性脂肪肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，高脂血症，高血压，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，隐匿性自身免疫性糖尿病(LAD)和青年成年型糖尿病(MODY)。在一些实施方案中，本发明的抗体用于使个体对胰岛素敏感。

在一些实施方案中，本发明提供本发明的抗体在制备药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物用于治疗选自由下列各项组成的组的代谢疾病或病症：***(PCOS)，代谢综合征(MetS)，肥胖，非酒精性脂肪肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，高脂血症，高血压，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，隐匿性自身免疫性糖尿病(LAD)和青年成年型糖尿病(MODY)。在一些实施方案中，所述药物用于使个体对胰岛素敏感。

在一些实施方案中，本发明提供治疗个体中的糖尿病的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本发明的抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括给所述个体施用另一种治疗糖尿病的药剂，条件是所述另一种药剂不是胰岛素。在一些实施方案中，所述方法还包括给所述个体施用一种治疗心血管病的药剂。

附图简述

图1A显示测量抗-FGFR1抗体与纯化的FGFR ECD片段结合的ELISA。

图1B显示关于R1MAb1和R1MAb2的表面等离子共振结合常数。

图1C显示在大鼠L6细胞中的GAL-Elk1荧光素酶测定。用关于所示的FGFR同种型以及GAL-Elk1、SV40-海肾(renilla)荧光素酶和Gal-反应性萤火虫荧光素酶报道子的表达载体共转染细胞。在荧光素酶测定之前，将转染的细胞用含有增加浓度的R1Mab或酸性FGF(aFGF：阳性对照)的培养基培养6小时。通过用海肾荧光素酶活性标准化的相对萤火虫荧光素酶活性测定转录激活并且表示为相对荧光素酶单位(RLU)。

图1D显示与1C相似的实验，不同在于L6细胞表达的FGFR1c和KLB二者。

图1E显示与1C相似的实验，不同在于使用HEK293细胞。

图1F显示用0.5μg/ml的所示蛋白处理指定时间的3T3-L1脂肪细胞的蛋白质印迹分析。

图1G显示在腹膜内(i.p.)注射1mpk R1Mab(+)或对照IgG(-)后在指定时间从瘦C57BL／6小鼠收集的WAT，并且进行蛋白质印迹分析。

图2A显示在单次腹膜内注射(箭头)指定剂量的R1Mab1或对照IgG后的db／db小鼠的血糖(左)和体重(右)。对所有组在第1-30天之间的葡萄糖(相对于对照IgG)观察到显著性，并且对于所有组在第8天观察到体重(相对于对照IgG)的显著性，并且对于50mpk组在第12-18天观察到显著性。N=6～14，*p<0.05，**p<0.01。

图2B显示在随机喂食和过夜禁食的小鼠的血糖(上)和在过夜禁食和腹膜内注射1g／kg葡萄糖后30分钟(下)的血清胰岛素水平。N=6～14，*p<0.05，**p<0.01。

图2C显示在单次腹膜内注射3mpk的R1Mab1或对照IgG后Ins2Akita小鼠的血糖(左)和体重(右)。N=10.*p<0.01。

图2D显示在单次腹膜内注射1mpk剂量的R1Mab1或对照IgG后db／db小鼠的食物摄入(左)、血糖(中)和体重(右)。PF：对R1MAb-处理组成对喂养。N=7.#p<0.001(vs IgG)，*p<0.001(vs PF-IgG)。

图2E显示在固定的胰切片中的胰岛素阳性区域的定量。在单次腹膜内注射3mpk(左)或1mpk(右)R1MAb1后第7天收集组织，并且对胰岛素和胰高血糖素染色。N=4～7.**p<0.002.***p<0.001。

图3A显示在小鼠组织中的MAPK信号传导激活。所示的组织在对瘦C57BL／6小鼠腹膜内注射后15分钟(25μg/小鼠FGF21：上)或1小时(1mpk R1Mab1：下)时收集，并且进行蛋白质印迹分析。PBS(上)和对照IgG(下)用作阴性对照。

图3B-D显示肝(B)、肝脏脂质(C)和血清脂质(D)的代表性的H&E染色。样品在单次腹膜内注射1mpk R1MAb1后第7天收集。对照小鼠成对饲养以使体重标准化。N=7，*p<0.05，**p<0.001。

图3E显示注射了1mpk Ab的ob／ob或转基因ap2-SREBP1c(srebp)小鼠的代谢参数。对照组成对饲养以使体重标准化(图S7)。在禁食3小时后的第3天测量葡萄糖和胰岛素用于HOMA-IR计算。在过夜禁食后的第4天用1g／kg腹膜内葡萄糖注射进行GTT。在第5天测量组织重量。N=7，*p<0.05，***p<0.01。

图3F显示皮下植入输注FGF21(12ng／天)的渗透泵的ap2-SREBP小鼠的代谢参数。在第4天使用1U／kg胰岛素腹膜内注射进行ITT。在第6天收集血清。N=6～8。

图4A显示BAT中关于属于所示的KEGG途径的基因的mRNA表达(红色：较高的表达，蓝色：较低的表达)。在单次腹膜内注射1mpkR1MAb1后第4天或在注射对照IgG的成对饲养的小鼠中收集样品。

图4B显示BAT中通过qPCR测量的mRNA表达。N=6，*p<0.05，**p<0.001。

图4C显示在HEK293细胞中的荧光素酶测定。该图表明FGF21和R1MAb1二者均在HEK293细胞中通过融合到GAL4DNA结合结构域的CREB(GAL-CREB)以剂量依赖性方式诱导UAS-驱动的荧光素酶报道基因的转录(左侧两图)，或以剂量依赖性方式诱导CRE-驱动的荧光素酶报道基因的转录(右侧两图)。一些细胞还被共转染以表达FGFR1c和KLB(红色；图中的上部曲线)。结果表示关于经由海肾活性标准化的荧光素酶活性的一式三份实验的平均值。

图4D显示在静脉内(i.V.)注射25μg FGF21(+)或PBS(-)后15分钟收集的WAT，并且进行蛋白质印迹分析。

图4E显示用1μg／ml FGF21处理30分钟的分化的人原代脂肪细胞的蛋白质印迹分析。

图4F显示关于信号传导途径的建模，通过该信号传导途径FGF21和R1MAb激活脂肪组织中的PGC-1α程序。

图5显示R1MAb1的肝素-非依赖性和FGFR1-依赖性激动剂活性。在HEK293细胞中的GAL-Elk1荧光素酶测定。细胞用或不用关于所示的FGFR1c以及GAL-Elk1、SV40-海肾荧光素酶和Gal-反应性萤火虫荧光素酶报道子的表达载体共转染。在荧光素酶测定之前，将转染的细胞在含有增加浓度的R1Mab1、含有或不含有25mg／L猪肝素(如图所示)的培养基中培养6小时。通过经由海肾荧光素酶活性标准化的相对萤火虫荧光素酶活性测定转录活性并且表示为相对荧光素酶单位(RLU)。

图6A显示在第0天单次腹膜内注射3mpk剂量的R1Mab2或对照IgG后db／db小鼠的食物摄入(左)、体重(中)和血糖(右)。对照小鼠成对饲养(PF)以调节食物摄入直到第11天。在第11天，R1MAb2-处理的小鼠的食物摄入恢复正常，因此在第11天后所有小鼠无限制喂养(ad libitum，AL)。N=7～12.p<0.001。

图6B显示图S2A中所用的小鼠在第26天的随机喂养血糖水平。

图6C显示在第28天使用相同的小鼠进行的GTT。

图6D显示在第37天使用相同的小鼠进行的ITT。

图7A显示在第0天在单次腹膜内注射1mpk剂量的R1Mab1或对照IgG后ob／ob小鼠的血糖(左)和体重(右)。对R1MAb-处理的组，对照小鼠成对饲养(pair-fed，PF)。N=7.*p<0.05(vs PF-IgG)。

图7B显示在第0天在单次腹膜内注射1mpk的R1Mab1或对照IgG后HFD-喂养的C57BL／6小鼠的血糖(左)和体重(右)。N=7～9.*p<0.05。

图7C显示在Ab注射后第8天在S3B中所用的HFD-喂养的小鼠进行的GTT。将小鼠在过夜禁食后腹膜内注射1g／kg葡萄糖。平均体重为28.6+／-0.6(R1MAb1)和32.1+／-0.8(对照IgG)(p<0.01)。N=7。

图7D显示在单次腹膜内注射1mpk的R1Mab1或对照IgG后第5天Ins2Akita小鼠的血糖(左)和体重(右)。对照小鼠成对饲养(PF-IgG)以使体重标准化。*p<0.05。

图8A显示在图4E中分析的db／db小鼠中胰岛的代表性染色。红色，胰岛素，绿色：胰高血糖素，蓝色：细胞核。注意R1MAb不影响胰岛的整体形态。

图8B显示在每只动物的每个胰岛中胰岛素阳性区域的分布(％)。

图9A显示IgG和单臂(One-Armed，OA)IgG的示意图。蓝色：重链，绿色：轻链。红色星形表示DANA突变体中突变的残基的大致位置。

图9B显示在表达FGFR1c的HEK293细胞中的基于GAL-E1k的荧光素酶测定，以比较R1MAb2和R1MAb2的DNA突变体(R1MAb2DANA)。

图9C显示在腹膜内注射1mpk所示的Ab之前(pre)或之后第7天db／db小鼠的血糖。对照小鼠成对饲养以使体重标准化。

图9D显示测量抗体与纯化的FGFR ECD片段结合的ELISA。OA-R1MAb1：R1MAb1的OA-版本。

图9E显示与S5B类似的基于GAL-Elk的荧光素酶测定。

图9F显示用0.5μg/ml所示的蛋白处理指定的时间的3T3-L1脂肪细胞的蛋白质印迹分析。

图9G显示在第0天(箭头)在单次腹膜内注射所示的Ab后db／db小鼠的血糖(左)和体重(右)。N=7。*p<0.05(对照IgG相对于3mpkR1MAb1)，**p<0.0005(对照IgG相对于3mpk R1MAb1和对照IgG相对于1mpk R1MAb1)。

图9H显示在Ab注射后第7天从样品收集肝脂质和血清脂质。N=7。*p<0.05，**p<0.0005(相对于对照IgG)。

图10显示在肝脏和WAT中的KLB和FGFR同种型的mRNA表达。食物(Chow)-喂养和HFD-喂养的C57BL／6小鼠为25周龄。HFD-喂养的小鼠以HFD为食持续21周。*p<0.05或**p<0.001。N=6。

图11显示正常的脂肪功能对于FGF21和R1MAb活性的需要。在第0天在单次腹膜内注射1mpk剂量的R1Mab1或对照IgG后ob／ob或ap2-srebp1c转基因小鼠的食物摄入(左)、血糖(中)和体重(右)。图3E中描述相同的小鼠。N=7.#p<0.001(vs IgG)，*p<0.001(vs PF-IgG)。在注射后1天进行处理后测量。

图12A显示在HEK293中的基于细胞的荧光素酶测定。将细胞共转染所示的GAL-融合蛋白、SV40-海肾荧光素酶和GAL-反应性荧光素酶报道子的表达载体。一些细胞还共转染所示的KLB的表达载体。转染的细胞用含有来自转染了关于FGF21的表达载体或所示的对照空载体转染的HEK293细胞的条件培养基的培养基培养。培养6小时后，细胞进行荧光素酶测定。通过经由海肾荧光素酶活性标准化的相对萤火虫荧光素酶活性测定转录活性并且表示为诱导倍数。

图12B显示相似的荧光素酶测定，其中一些细胞用下述核受体配体共同处理：1MM Wy14643(PPARα)，5nM GW101516(PPAR)，50nM罗格列酮(rosiglitazone)(PPARγ)，50nM T0901317(LXRα)，5nM T3(TRβ)，30MM CDCA(FXR)。注意：进行或不进行同源配体处理，FGF21都不影响这里所检测的任意核受体的活性。

图12C显示用0.5μg/ml FGF21处理10分钟的HEK293细胞的蛋白质印迹分析。一些细胞用所示的FGFR抑制剂(100nM PD173074)，mTOR的抑制剂(100nM雷帕霉素)MEK1／2抑制剂(10μM U0126)，PI3K抑制剂(1μM渥曼青霉素(wortmannin))预处理。

图12D显示参与脂肪组织氧化代谢的下游基因。

图13显示在单次腹膜内注射所示剂量的R1MAb2(标记为182.2)、R1MAb3(标记为182.5)或对照IgG(抗-Her2)后db／db小鼠的血糖(上)和体重(下)。N=6，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。R1MAb3包含含有SEQ ID NO：6的VH和含有SEQ ID NO：4的VH。

图14A显示在单次腹膜内注射0.5mpk的R1MAb1或对照IgG后瘦C57BL／6小鼠的累积的食物摄入、血糖和体重变化。在第0天小鼠还被皮下植入迷你渗透泵从而以1.2mpk／天持续输注(c.i.)重组FGF21或赋形剂对照(PBS)。在第3天，将小鼠禁食过夜以在第4天(箭头)进行葡萄糖耐量试验(GTT)。

图14B显示过夜禁食后在第4天腹膜内注射2g／kg葡萄糖进行的葡萄糖耐量试验。

图14C显示在图2C，S10A和S10B中所示的小鼠的血清分析。在4h禁食后在第5天收集血清样品。数据表示为平均值±SEM，n=6只小鼠／组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001相对于PBS(c.i.)+IgG对照，通过双尾不配对斯氏t-检验(two-tailed unpaired student's t-test)进行检验(n.s.=不显著的)。

图15显示使用从图2C和S10中所用的小鼠的肝组织分离的mRNA的基因表达分析。组织样品在4h禁食后在第5天分离。数据表示为平均值±SEM，n＝6只小鼠／组；*p<0.05，***p<0.001相对于PBS(c.i.)+IgG对照，通过双尾不配对斯氏t-检验进行检验(n.s.=不显著的)。

图16显示从图2C，S10和S11中所用的小鼠的棕色脂肪组织分离的mRNA的基因表达分析。组织样品在4h禁食后在第5天分离。数据表示为平均值±SEM，n=6只小鼠／组；*p<0.05，***p<0.001相对于PBS(c.i.)+IgG对照，通过双尾不配对斯氏t-检验进行检验(n.s.=不显著的)。

图17A显示测量抗体与生物素化的肽片段结合的ELISA结果。

图17B显示FGFR1的氨基酸序列(氨基酸161-212；SEQ ID NO：27)，肽#26的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)和肽#28的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)以及对应于肽#26的来自FGFR2的氨基酸(SEQ ID NO：30)、FGFR3的氨基酸(SEQ ID NO：31)和FGFR4的氨基酸(SEQ ID NO：32)，和对应于肽#28的来自FGFR2的氨基酸(SEQ ID NO：33)、FGFR3的氨基酸(SEQ ID NO：34)和FGFR4的氨基酸(SEQ ID NO：35)。肽#26与肽#28序列在FGFR1中和FGFR2-4相应区域的差异用方框表示。

图17C显示在存在不同浓度的R1MAb1或对照IgG的条件下测量His-标记的FGFR1与FGF2蛋白的结合的ELISA结果。数据表示为％FGFR1-His结合，并且表示为平均值±SEM(n=3)。

图17D显示在存在不同浓度的未标记的R1MAb1或FGF21的条件下碘化的FGF21与稳定表达KLB和FGFR1c二者的HEK293细胞的结合(反应还包含BSA(10mg／ml)和对照IgG(350mM)，以阻断非特异性结合)。数据表示为反应中总放射性标记的FGF21的结合FGF21的百分数。

本发明的实施方案的详述

I.定义

用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些方法。用于测量结合亲合力的具体说明性和示例性实施方案在下文中描述。

术语“抗-FGFR1激动性抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合FGFR1以使所述抗体能够用作激活FGFR1的治疗剂。在一个实施方案中，抗-FGFR1抗体与不相关的、非-FGFR1蛋白的结合程度小于所测量的(例如，通过放射性免疫测定(RIA)测量)所述抗体与FGFR1的结合的约10％。在特定的实施方案中，与FGFR1结合的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10^-8M以下，例如，10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。

“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab′，Fab'-SH，F(ab′)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和／或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和／或轻链来源于不同来源或物种。

抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中有几个类别可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

试剂例如药物制剂的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非本文另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***，其也被称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Pub1icHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文可互换地用于指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等人(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等人(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVRs(例如，CDRs)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FRs对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和／或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和／或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和／或参与抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性的a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102。(见Almagro和Fransson，Front.Biosci.(生物科学前沿)13：1619-1633(2008))。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(见上文)编号。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色***置的染色***置处。

“分离的编码抗-FGFR1抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和／或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。

“天然抗体”是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应证、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和／或关于使用这样的治疗产品的警告。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术人员已知的多种方法实现用于测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genemech，Inc.，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可从Genemech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作***、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比较参数并且不变。

在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性)如下计算：

100乘以X／Y比值

其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。

术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

除非另外指明，术语“成纤维细胞生长因子受体1或FGFR1”当用在本文中时，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然的FGFR1，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”未加工的FGFR1以及由细胞内的加工产生的任意形式的FGFR1。该术语还包括天然存在的FGFR1变体，例如，剪截变体或等位基因变体。示例性的人FGFR1b和FGFR2b的氨基酸序列分别显示如下：

NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKHSGINSSDAEVLTLFNVTEAQSGEYVCKVSNYIGEANQSAWLTVTRPVAKALEERPAVMTS(SEQ ID NO：1)；和

NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTS(SEQ ID NO：5)。

用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变被治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人KubyImmunology，6^th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J. Immunol.(免疫学杂志)150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature(自然)352：624-628(1991)。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够使与其相连的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

II.组合物和方法

在一个方面中，本发明是部分基于抗-FGFR1激动性抗体的发现以及所述抗体的治疗活性。本发明的抗体可用于，例如，治疗包括糖尿病的代谢疾病。

A.示例性抗-FGFR1抗体

在一个方面中，本发明提供结合FGFR1的分离的抗体。在某些实施方案中，抗-FGFR1抗体结合FGFR1b和／或FGFR1c并且激动FGFR1的活性。

在一个方面中，本发明提供抗-FGFR1抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQID NO：25的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQID NO：23的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗-FGFR1抗体可以是完全人的、人源化的或非人的。在一些实施方案中，抗-FGFR1抗体包含如在任意以上实施方案中的HVR，并且还包含接纳体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。

在另一方面中，抗-FGFR1抗体包含重链可变结构域(VH)序列，所述序列与下述SEQ ID NO：2，3或4的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTwISWVPGKGLEWVGEIDPYDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCASSGYGGSDYAMDYWGQ(SEQ IDNO：2)，

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNNYIHWVPGKGLEWVADIYPNDGDTDYADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAV YYCAREHFDAWVHYYVMDYWGQ(SEQ ID NO：3)，和

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNWISWVPGKGLEWVAEIDPYDGATDYADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYwGQ(SEQ ID NO：4)。

在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列相对于参比序列包含置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含所述序列的抗-FGFR1抗体保持结合FGFR1和激动其活性的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：2，3或4中，总计1至10个氨基酸被置换、***和／或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-FGFR1抗体包含SEQ ID NO：2，3或4中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。

在另一方面中，提供抗-FGFR1抗体，其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与下述SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：6)。

在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列相对于参比序列包含置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含所述序列的抗-FGFR1抗体保持结合FGFR1的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：6中，总计1至10个氨基酸被置换、***和／或缺失。在某些实施方案中，置换、***或缺失发生在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-FGFR1抗体包含SEQID NO：6中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。

在另一方面中，提供抗-FGFR1抗体，其中所述抗体包含如在任何以上提供的实施方案中的VH，和如在任何以上提供的实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：2，3或4和SEQ ID NO：6中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在本发明的另一个方面中，根据任何以上实施方案的抗-FGFR1抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗-FGFR1抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体或F(ab')₂片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。

在另一方面中，根据任何以上实施方案的抗-FGFR1抗体可以结合如在以下部分1-7中所述的任何特征(单独地或组合地)：

1.抗体亲合力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd通过用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量，如由以下测定所述的。Fab对抗原的溶液结合亲合力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999))。为了确定测定的条件，将

多孔板(Thermo Scientific)用5μg／ml的在50mM碳酸钠(pH9.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w／v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(与在Presta等人，CancerRes.(癌症研究)57：4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中以在室温进行温育(例如1小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(

)洗涤8次。当所述板已经干燥时，加入150μl／孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并将所述板在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。

根据另一个实施方案，Kd是通过表面等离子共振测定法使用

-2000或

-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片以～10个应答单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl／分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl／分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(

Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off／k_on计算。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发=295nm；发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab'-SH，F(ab')₂，Fv，和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，请参见Hudson等人Nat.Med.(自然医学)9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，The Pharmacology ofMonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，269-315页(1994)；还参见WO 93／16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvage receptor)结合表位残基并具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993／01161；Hudson等人，Nat.Med.(自然医学)9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.(自然医学)9：129-134(2003)中。

单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516 B1)。

抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。

3.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如美国专利号4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，81：6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例如CDRs(或其部分)源自非人抗体，且FRs(或其部分)是源自人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature(自然)332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods(方法)36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.(分子免疫学)28：489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall'Acqua等人，Methods36：43-60(2005)(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osbourn等人，Methods(方法)36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，83：252-260(2000)(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。

可用于人源化的人构架区包括，但不限于，使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993))；源自特定亚型的轻链或重链可变区的人抗体共同序列的构架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人生殖系构架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志）271：22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的多种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.(当前药学观点)5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.(当前免疫学观点)20：450-459(2008)。

可通过向已经经过修饰因而响应抗原攻击刺激产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。这些动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.(自然生物技术)23：1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181及6,150,584；描述

技术的美国专利号5,770,429；描述

技术的美国专利号7,041,870，及描述技术的美国专利申请公开号US 2007／0061900。这些动物产生的完整抗体的人可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合。

人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.(免疫学杂志)，133：3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProduction Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术及应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，147：86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中描述。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology andHistopathology(组织学和组织病理学)，20(3)：927-937(2005)，及Vollmers和Brandlein，Methods and Findingsin Experimental and Clinical Pharmacology(实验和临床药学方法和发现)，27(3)：185-91(2005)中描述。

也可通过分离选自源自人噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文描述自抗体文库选择人抗体的技术。

5.源自文库的抗体

可通过在组合文库中筛选具有一种或多种所需活性的抗体来分离本发明的抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O′Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature(自然)348：552-554；Clackson等人，Nature(自然)352：624-628(1991)；Marks等人，J. Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods inMolecularBiology(分子生物学方法)248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志）338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)中描述。

在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述在其中筛选抗原-结合噬菌体。噬菌体通常展示单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自被免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括例如：美国专利号5,750,373，及美国专利公开号2005／0079574、2005／0119455、2005／0266000、2007／0117126、2007／0160598、2007／0237764、2007／0292936和2009／0002360。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对FGFR1而另一种是针对任何其他抗原，例如β-Klotho。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至FGFR1的两个不同表位。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。

制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein及Cuello，Nature(自然)305：537(1983)；WO93／08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利号5,731,168)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体的静电导引作用(WO 2009／089004A1)；将两种或两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，及Brennan等人Science(科学)，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。

本文中也包括具有三个以上功能性抗原结合位点的经工程改造抗体，包括”章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US 2006／0025576A1)。

本文中的抗体或片段也包括包含结合至FGFR1以及另一不同抗原(例如，klothoβ)的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF'’(例如，参见US 2008／0069820)。

7.抗体变体

在某些实施方案中，涵盖本文中所提供抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要其来提高抗体的结合亲和力和／或其他生物特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基的缺失和／或***其中和／或对其进行置换。可进行缺失、***和置换的任何组合以获得最终构建体，其条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。

a)置换、***和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的相关位点包括HVRs和FRs。保守性置换显示在表1中的“保守性置换”的标题下。更多实质性变化于表1中的“示例性置换”的标题下提供且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。可将氨基酸置换引入相关抗体中并筛选具有所需活性，例如保持／提高的抗原结合、降低的免疫原性、或提高的ADCC或CDC的产物。

表1

可根据常见侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性：Asp，Glu；

(4)碱性：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香性：Trp，Tyr，Phe。

非保守性置换将需要将这些种类中的一种的成员换成另一种类。

一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体的某些生物学特性相对于亲本抗体将改变(例如提高)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和／或将实质上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变体抗体展示在噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。

可在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可于HVR“热点”也即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207：179-196(2008))；和／或于SDRs(a-CDRs)中进行，其中测试所得的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自第二文库重新选择而获得的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology(分子生物学方法)178：1-37(O′Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链重组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入经选择以供成熟的可变基因中。随后产生第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中随机选择数个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化特定地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些实施方案中，置换、***或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文中所提供的保守性置换)。这些改变可在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

适用于鉴别可靶向以供诱变的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham及Wells(1989)Science(科学)，244：1081-1085所述。在此方法中，残基或靶残基的组(例如诸如arg、asp、his、lys和glu的带电残基)经鉴别且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。

氨基酸序列***物包括长度在一个残基至含有一百个以上残基的多肽范围内的氨基端和／或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***物。末端***物的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合体。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体被糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。

若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接的分支链双触角寡糖。参见例如Wright等人，TIBTECH15：26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改良特性的抗体变体。

在一实施方案中，提供具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于根据MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn297连接的糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，例如如WO 2008／077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，也即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有提高的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003／0157108(Presta，L.)；US2004／0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开文本的实例包括US 2003／0157108；WO2000／61739；WO 2001／29246；US 2003／0115614；US 2002／0164328；US2004／0093621；US 2004／0132140；US 2004／0110704；US2004／0110282；US 2004／0109865；WO 2003／085119；WO 2003／084570；WO 2005／035586；WO 2005／035778；WO 2005／053742；WO2002／031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003／0157108A1，Presta，L；及WO 2004／056312A1，Adams等人，尤其实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)，94(4)：680-688(2006)；及WO 2003／085107)。

进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖经GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和／或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如于WO 2003／011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；及US 2005／0123546(Umana等人)中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体于例如WO 1997／30087(Patel等人)；WO1998／58964(Raju，S.)；及WO 1999／22764(Raju，S.)中描述。

c)Fc区域变体

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为某些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和／或体内细胞毒性测定以确认CDC和／或ADCC活性的降低／耗尽。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。FcR在造血细胞上的表达总结于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-492(1991)的第464页上的表3中。评定相关分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)166：1351-1361(1987))中描述。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，相关分子的ADCC活性可于体内评定，例如在例如Clynes等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA95：652-656(1998)中所公开的动物模型中评定。也可进行C1q结合测定以证明抗体无法结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006／029879及WO 2005／100402中的C1q及C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood(血液)101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.及M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及体内清除／半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.(国际免疫学)18(12)：1759-1769(2006))。

效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利号6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个以上位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述某些与FcRs的结合提高或减少的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004／056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2)：6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和／或334(残基的EU编号)处的置换。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致C1q结合和／或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(也即，提高或降低)，例如如美国专利号6,194,551、WO 99／51642和Idusogie等人，J.Immunol.(免疫学杂志)164：4178-4184(2000)中所述。

US2005／0014934A1(Hinto等人)中描述具有增加的半衰期及提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。那些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有置换(例如置换Fc区残基434)的那些Fc变体(美国专利号7,371,826)。

关于Fc区变体的其他实例，也参见Duncan及Winter，Nature(自然)322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及WO94／29351。

d)经半胱氨酸工程改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，经置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点处且可用于将抗体结合至其他结构部分，例如药物结构部分或接头-药物结构部分，以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，任一或多个以下残基可经半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述，产生经半胱氨酸工程改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的结构部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇／丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二

烷、聚-1，3，6-三

烷、乙烯／马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷／氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有制造优势。聚合物可以是任何分子量的，且可有分支或无分支。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，且若连接一种以上聚合物，则其可以是相同的或不同的分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物的数目和／或类型可以基于包括，但不限于，以下的考虑因素来确定：要提高的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。

在另一实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质结构部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA(美国国家科学院学：报)102：11600-11605(2005))。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质结构部分加热至可杀死抗体-非蛋白质结构部分附近的细胞的温度的波长。

B.重组方法和组合物

抗体可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗-FGFR1抗体的分离的核酸。该核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和／或包含其VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和／或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含该核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含该核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗-FGFR1抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生抗-FGFR1抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并***一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和／或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods inMolecular Biology(分子生物学方法)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌(E.coli)中的表达)。在表达后，抗体可以以可溶级分与细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是用于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gemgross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.(自然生物技术)24：210-215(2006)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等人，J.GenVirol.(遗传病毒学杂志)36：59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77：4216(1980))；并且骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2／0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，在Methods inMolecular Biology(分子生物学方法)，卷248(B.K.C.Lo，ed.，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

C.测定

本文中提供的抗-FGFR1抗体可以针对其物理／化学特性和／或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。

1.结合测定和其他测定

在一方面中，测试本发明的抗体的抗原结合活性，例如，通过已知方法如ELISA、蛋白印迹法等。

2.活性测定

在一方面中，提供用于鉴别具有激动性活性的抗-FGFR1抗体的测定法。例如，生物学活性可以包括，激活特定途径的信号转导的能力，这可以通过例如确定磷-FRS2a、磷-MEK、磷-ERK／MAPK、磷-STAT3的水平或使用本文所述的基于GAL-Elk1的荧光素酶测定进行测量(还参见，例如，Wu等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)5；282(40)：29069-72(2007)和Wu等PLoS One18；6(3)：e17868(2011))。还提供在体内和／或体外具有这样的生物学活性的抗体。

D.免疫缀合物

本发明也提供包含本文中的抗-FGFR1抗体与一或多种细胞毒性剂，例如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素缀合的免疫缀合物。

在一实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括，但不限于，美坦生类化合物(参见美国专利号5,208,020、5,416,064及欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥利司他汀(auristatin)，如单甲基奥利司他汀(monomethylauristatin)药物结构部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利号5,635,483及5,780,588，及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001及5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.(癌症研究)53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.(癌症研究)58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(参见Kratz等人，CurrentMed.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.(医学化学杂志)45：4336-4343(2002)；及美国专利号6,630,579)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特赛紫杉醇(tesetaxel)及奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(tricothecene)；及CC1065。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与酶促活性毒素或其片段缀合，酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与放射性原子缀合形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、pb²¹²及Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶合剂制得，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。举例来说，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science(科学)238：1098(1987)中所述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体结合的示例性螯合剂。参见WO 94／11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。举例来说，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文中的免疫缀合物或ADCs明确涵盖，但不限于，用交联剂试剂制备的这些缀合物，该等交联剂试剂包括，但不限于：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交联剂试剂可商购获得(例如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗-FGFR1抗体可以用于检测FGFR1在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如棕色脂肪组织，胰腺组织，肝组织，白脂肪组织和肿瘤组织。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗-FGFR1抗体。在另一个方面中，提供检测FGFR1在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗-FGFR1抗体在允许抗-FGFR1抗体与FGFR1结合的条件下接触，并检测在抗-FGFR1抗体和FGFR1之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗-FGFR1抗体被用于选择适合利用抗-FGFR1抗体的治疗的受试者，例如其中FGFR1是用于选择患者的生物标记物。

在某些实施方案中，提供标记的抗-FGFR1抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的结构部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用来间接检测。示例性标记包括但不限于，放射性同位素³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素／亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

F.药物制剂

如本文所述的抗-FGFR1抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备，制成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵；氯化六羟季铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和／或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(

BaXter International，Inc.)。某些示例性sHASEGPs及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005／0260186及2006／0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006／044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供glp-1类似物、合成的淀粉素、胰高血糖素受体拮抗剂(例如，抗-GCGR抗体)或瘦蛋白。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物传递***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)中。

可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以通过例如经由无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

G.治疗方法和组合物

任何本文提供的激动性抗-FGFR1抗体可以用于治疗方法。

在一方面中，提供用作药物的激动性抗-FGFR1抗体。在另一些方面中，提供用于治疗代谢疾病的激动性抗-FGFR1抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的激动性抗-FGFR1抗体。在某些实施方案中，本发明提供激动性抗-FGFR1抗体，所述激动性抗-FGFR1抗体用于治疗患有代谢疾病的个体的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-FGFR1抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，glp-1类似物、合成的淀粉素、胰高血糖素受体拮抗剂(例如，抗-GCGR抗体)或瘦蛋白。根据任何以上实施方案的“个体”优选是人。

在其他方面中，本发明提供激动性抗-FGFR1抗体在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗代谢疾病。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗代谢疾病的方法，所述方法包括向患有所述疾病的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。

在另一方面中，本发明提供一种用于治疗代谢疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述疾病的个体施用有效量的激动性抗-FGFR1抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。

在另一方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含任何本文提供的激动性抗-FGFR1抗体，例如，用于任何以上的治疗方法。在一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的激动性抗-FGFR1抗体和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗-FGFR1抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。

在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他试剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂一起共同给药。在某些实施方案中，另外的治疗剂是glp-1类似物、合成的淀粉素、胰高血糖素受体拮抗剂(例如，抗-GCGR抗体)或瘦蛋白。

这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明的抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和／或辅药的给药之前、同时和／或之后。

本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果需要局部治疗，进行病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。部分根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

本发明的抗体将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验／临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg／kg-15mg／kg(例如0.1mg／kg-10mg／kg)的抗体可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg／kg-100mg／kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长时间，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述抗体的一个示范性剂量应该在约0.05mg／kg-约10mg／kg范围内。因此，约0.5mg／kg、2.0mg／kg、4.0mg／kg或10mg／kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20或例如约6剂量的所述抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。然而，其他的给药方案也可以是有用的。该治疗的进展易于通过常规技术和测定来监测。

H.制品

在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和／或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和／或诊断所述病症的另一种组合物结合，对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗选择的病症。此外，所述制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

III.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。

实施例1.抗-FGFR1激动性抗体的产生和表征

我们使用噬菌体展示技术和人FGFR1b与c的His-标记的IgD2-D3作为抗原来产生对FGFR1特异性的单克隆抗体。在所选的互补决定区(H1，H2，H3，L3)具有合成多样性(模拟人IgG库的天然多样性)的人噬菌体抗体文库用来淘选。Fab片段以二价展示在M13噬菌体颗粒的表面(Lee等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284：119-32(2004))。淘选方案之前有记述(Liang等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)366：815-29(2007))。从多个文库中筛选了多个克隆后，通过噬菌体ELISA鉴定结合FGFR1的b和c同种型二者的独特的且特异性的噬菌体抗体。为了检测抗体与人FGFRs的结合，使用常规ELISA方案，该方案使用2μg／ml FGFR1ECD-人Fc嵌合蛋白进行。

我们还测量了抗-FGFR1抗体与FGFR1的结合亲和力，如所述(Liang等人，同上文)，使用BIAcoreTM T100仪器通过Biacore／SPR以下述改进进行测量。首先按照供应商所述的步骤利用与游离氨基的直接偶联将小鼠抗-人Fc抗体包被在BIAcoreTM羧甲基化的葡聚糖CM5芯片上。然后，抗体被捕获在CM5生物传感器芯片上以获得约200个应答单位(RU)。结合测量使用运行缓冲液进行，运行缓冲液由10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20组成(HBS-P缓冲液)。在25℃以30μL／分钟的流速注射在HBS P缓冲液中1.550nM范围内的FGFR1ECD-His蛋白的2-倍系列稀释液。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(BIAcore^TMEvaluation Software version3.2)计算缔合速率(Kon，per mol／s)和解离速率(Koff，per s)。以Koff／Kon的比率计算平衡解离常数(Kd，per mol)。

如上述在独立的实验中鉴定的抗-FGFR1抗体中有两种(此处指定为R1MAb1和R1MAb2)以相似的亲和力结合FGFR1b与FGFR1c，但是不与任何其他FGFR同种型结合(图1A和B)。使用基于Gal-Elk1的荧光素酶测定在缺乏内源性FGFRs但是转染表达每种FGFR同种型(需要时，并表达KLB)的大鼠L6细胞中检测其信号传导活性。这些抗体出人意料的为有效的激动剂：两种R1MAbs以剂量依赖性方式诱导荧光素酶活性，但是仅在细胞表达重组FGFR1b或FGFR1c时诱导，这表明R1MAbs作用为FGFR1的特异性激动剂(图1C)。在该种测定形式中，R1MAbs似乎不影响碱性FGF(bFGF，一种典型的FGFR1配体)的活性(图1D)。然而，当细胞表达FGFR1c和KLB时，R1MAbs和FGF21显示出叠加作用(图1D)。R1MAb2的F(ab')2而非Fab片段表现出FGFR1-依赖性激动剂活性，这表明R1MAbs通过促进FGFR1的同型二聚体化而发挥其激动剂活性(图1E)。之前已经报道了包含FGFR1-结合肽和c-jun亮氨酸拉链结构域的人工FGFR二聚体化激动剂。该种称为C19jun的分子还通过c-jun结构域结合肝素并且需要肝素进行FGFR1激活(Ballinger等人，／Nature Biotechnol.(自然生物技术)17：1199-1204(1999))。相比之下，在荧光素酶测定中，肝素不影响R1MAb1的激动剂活性(图5)。R1MAb1的肝素-不依赖性激动剂活性还通过下述得到证实：在培养的鼠3T3-L1脂肪细胞中(图1F)或在腹膜内注射R1MAb的C57BL／6小鼠的WAT中(图1G)检验ERK与MEK1／2的磷酸化，ERK与MEK1／2是FGFRs下游的信号传导成分。

我们进行了实验来绘制由R1MAb1和R1MAb2结合的FGFR1表位的图谱。我们合成了30种代表FGFR1序列部分的肽，该肽具有氨基端生物素标记，并且使用其进行ELISA结合测定。这些肽的序列如下：

#1：SSSEEKETDNTKPNPVAPY(SEQ ID NO：36)；#2：

PVAPYWTSPEKMEKKLHAV(SEQ ID NO：37)；#3：KLHAVPAAKTVKFKCPSSG(SEQID NO：38)；#4：CPSSGTPNPTLRWLKNGKE(SEQ ID NO：39)；#5：

KNGKE；FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：40)；#6：YKVRYATWSHMDSVVPSD(SEQID NO：41)；#7：VVPSDKGNYTCIVENEYGS(SEQ ID NO：42)；#8：

NEYGSINHTYQLDVVERSP(SEQ ID NO：43)；#9：VERSPHRPILQAGLPANKT(SEQ IDNO：44)；#10：PANKTVALGSNVEFMCKVY(SEQ ID NO：45)；#11：

MCKVYSDPQPHIQWLKHIE(SEQ ID NO：46)；#12：LKHIEVNGSKIGPDNLPYV(SEQIDNO：47)；#13：NLPYVQILKTAGVNTTDKE(SEQ ID NO：48)；#14：

TTDKEMEVLHLRNVSFEDA(SEQ ID NO：49)；#15：SFEDAGEYTCLAGNSIGLS(SEQID NO：50)；#16：SIGLSHHSAwLTVLEALEE(SEQ ID NO：51)；#17：

YWTSPEKMEKKLHAVPAAK(SEQ ID NO：52)；#18：EKMEKKLHAVPAAKTVKFK(SEQ ID NO：53)；#19：PAAKTVKFKCPSSGTPNPT(SEQ ID NO：54)；#20：

KFKCPSSGTPNPTLRWLKN(SEQ ID NO：55)；#21：GTPNPTLRWLKNGKEFKPD(SEQID NO：56)；#22：TLRWLKNGKEFKPDHRIGG(SEQ ID NO：57)；#23：

FKPDHRIGGYKVRYATWSI(SEQ ID NO：58)；#24：HRIGGYKVRYATwSIIMDS(SEQID NO：59)；#25：LHAVPAAKTVKFKCPSS(SEQ ID NO：60)；#26：

KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)；#27：AVPAAKTVKFKCPSSG(SEQ ID NO：

61)；#28：FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)；#29：KPDHRIGGYKVR(SEQ ID NO：

62)；#30：GTPNPTLRWLKN(SEQ ID NO：63)。

如在图17A中所示，对于R1MAb1和R1MAb2二者，它们针对其表现出显著结合的最短的肽为肽#26和#28。

实施例2.R1MAbs表现出持续的抗-糖尿病活性。

我们使用小鼠糖尿病模型来检测本发明的抗-FGFR1抗体是否具有抗-糖尿病活性。所有的小鼠购自Jackson实验室并且保持在无病原体的动物设施，在21℃，在标准的12hr光／12hr暗循环，能够无限制得到食物(标准啮齿动物食物(Labdiet5010，12.7％卡路里来自脂肪)或高脂肪、高碳水化合物饮食(Harlan Teklad TD.03584，58.4％卡路里来自脂肪))和水。有C57BLKS／J背景的db／db小鼠是雌性的，其他小鼠均为雄性的。除了ap2-SREBP1c小鼠为8月龄(图3E)或4月龄(图3F)之外，所有的小鼠在大约9-11周龄时用于注射。为了连续输注FGF21蛋白，皮下植入渗透泵(

2001)。使用One

血糖计测量葡萄糖水平。对于肝脏脂质分析，按照Folch方法提取脂质，并且重悬在含有5％Triton X-100的PBS中。通过使用酶反应确定总胆固醇、甘油三酯、β-羟基丁酸酯(Thermo DMA)和非酯化的脂肪酸(Roche)。通过ELISA(Crystal Chem)确定血清胰岛素水平。

我们通过给高血糖瘦蛋白-耐受性db／db小鼠注射3、10和50mg/kg(mpk)的R1MAb1而在体外和体内检测R1MAbs的激动剂活性。我们观察到，对于所有三个剂量，血糖水平正常化超过一周，并且观察到的葡萄糖降低作用出乎意料地强和持久，在单次注射后葡萄糖水平保持超过30天低于对照小鼠(图2A)。这与暂时的但是显著的体重减少相关(图2A)。血糖降低作用可能是通过提高胰岛素敏感性产生，因为通过R1MAb1注射血清胰岛素水平也显著降低(图2B)。使用R1MAb2(图6)，和在另外三个具有显著的胰岛素耐受性的小鼠模型(即，瘦蛋白-缺陷性ob／ob小鼠、高脂肪饮食(HFD)喂养的小鼠和Ins2Akita小鼠)中(Hong等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.293：E1687-96(2007))(图2C和7)，我们观察到类似的R1MAb-诱发的血糖水平减少。成对饲养实验表明，在db／db和Ins2Akita小鼠中R1MAb-诱发的体重减轻是由于食物摄入的减少；然而，所观察到的血糖减少在很大程度上独立于食物摄入(图2D和6-7)。在胰腺中，与成对饲养的或不成对饲养的对照小鼠相比较，R1MAb1注射增加每个胰岛中的胰岛素阳性面积(图2E和8)。FGFR1在胰腺β细胞中表达(Hart等人，Nature(自然)408：864-68(2000))，并且FGF21促进离体β细胞功能(Wente等人，Diabetes(糖尿病)55：2470-78(2006))；因此，激活β细胞中的FGFR1能够直接促进胰腺胰岛素水平增加。这些数据证明激活FGFR1(而不是激活FGFR2或FGFR3)足以重演重组FGF21的抗-糖尿病和抗-脂质活性。

为了揭示IgG功能性对于R1MAb活性的重要性，我们使用两种类型的修饰。在Fc区中的双重突变(D265A／N297A；DANA)消除IgG分子对FcγRs的结合和免疫效应细胞的募集(Gong等人，2005)。R1MAb2的激动剂和抗-糖尿病活性都不受引入DANA突变的影响；因此，效应子功能对R1MAb2的抗-糖尿病活性没有作用(图9A-C)。然而，经改造的单臂(OA)形式的R1Mab1(Atwell等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270：26-35(1997))，其缺少一个Fab片段(OA-R1MAb1)(图9A和D)，显示出减少的激动剂活性(图9E和F)，并且不能降低db／db小鼠的血糖、体重和肝脏脂质水平与血清脂质水平(图9G和H)，这表明R1MAbs的激动剂和抗-糖尿病活性是依赖于Ab的二价性(尽管我们还检测了仅具有一个抗-FGFR1臂(例如，具有抗-β-Klotho臂)的双特异性抗体并且证实其保留二价抗-FGFR1R1MAbs的有益性质)。这些相关性强烈表明B1MAb-诱导的FGFR1下游信号传导途径的激活可能介导其抗-糖尿病作用。

MAbs已经显现出用于治疗多种人类疾病的强治疗特征。我们对抗-FGFR1激动性MAb的有效的抗-高血糖和降低脂质活性的证实为开发用于治疗2型糖尿病和其他肥胖相关的慢性病症的靶向FGFR1或包含FGFR1的受体复合物的治疗性MAbs开创了新的途径。与重组FGF21治疗相比，FGFR1的基于MAb的靶向提供一些有利的特性。首先，与FGF21或任意其他的非抗体治疗性蛋白相比，在其本质上，MAbs提供可预测的、可调节的和优越得多的药物代谢动力学。事实上，我们证实了对db／db小鼠单次腹膜内注射1-3mpk的R1MAb1或R1Mab2导致超过30天的显著持久的高血糖改善(图2和5)。对于任一种之前已经描述的抗-糖尿病药剂，从未报道这样持久的血糖作用(glycemic effect)。

实施例3.脂肪组织在R1MAb和FGF21的糖尿病作用中的重要性。

已经表明重组FGF21通过脂肪组织和肝脏提高胰岛素敏感性(Berglund等人，Endocrinology(内分泌学)150：4084-93(2009)；Li等人，FEBS Letters583：3230-34(2009))。向小鼠注射FGF21在四种表达KLB的组织类型(肝、白脂肪组织(WAT)、棕色脂肪组织(BAT)和胰腺)中诱导MEK和ERK磷酸化，如之前所报道那样(图3A，上)(Kurosu等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)282：26687-95(2007)；Xu等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.(生理学、内分泌学和代谢学杂志)297(5)：E1105-14(2009))。相比之下，R1MAb1注射导致脂肪组织和胰腺中相同的下游效应子的磷酸化，而在肝脏中则没有(图4A，下)，这与肝脏中非常低的FGFR1mRNA表达相一致(图10)(Fon Tacer等人，Mol.Endocrinol.(分子内分泌学)24(10)：2050-64(2010))。事实上，肝基因表达的并行比较揭示两种之前鉴定的FGF21-靶向的基因(瘦蛋白受体(LepR)和细胞因子信号传导2的抑制基因(SOCS2)；Coskun等人，Endocrinology(内分泌学)149：6018-27(2008)，Inagaki等人，Cell Metabolism(细胞代谢)8：77-83(2008))的表达受FGF21诱导而不受R1MAb1诱导(图15)。在另一方面，已知的胰岛素调节基因(乙酰-CoA羧化酶1(ACC1)，脂肪酸合酶(FAS)，长链脂肪酸家族6的延长酶(elongase)(Elov16)，***(IGF)-结合蛋白(IGFBP)-1，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK))的肝表达被FGF21和R1MAb1类似地改变，这表明这些基因可能间接通过激素(例如，胰岛素)或代谢变化调节。当在单次注射后第7天注射到db／db小鼠中时，R1MAb1显著降低肝脂质和血清脂质，这可能是由于脂质通过脂肪组织的再分配作用(图3B-D)。在肺和***(两种表达FGFR1的癌症易发性组织类型)中，R1MAb1注射不诱导MEK或ERK的磷酸化(图3A)。这些观察综合起来表明脂肪组织而非肝脏是R1MAb和FGF21的共同代谢活性的中心。

为了进一步研究这一点，我们使用脂肪萎缩的ap2-srebp1c转基因小鼠，由于缺乏白脂肪组织和受损的棕色脂肪组织功能，该小鼠表现出严重的胰岛素耐受性，瘦蛋白缺乏，和肝大(图3E，11)(Shimomura等人，GenesDev.(基因和发育)12：3182-94(1998)；Shimomura等人，Nature(自然)401：73-76(1999))。与R1MAb1的代谢活性需要正常的脂肪组织功能的观念一致，单次腹膜内注射1mpk仅在对照ob／ob小鼠中改善HOMA-IR和葡萄糖耐受性，在ap2-srebp1c小鼠中则没有改善(图3E)。当与成对饲养的注射了对照IgG的小鼠相比较时，在ob／ob小鼠和ap2-srebp1c转基因小鼠中，R1MAb1注射减少食物摄入(图3E)。另外，在ap2-srebp1c小鼠中，尽管观察到血清β-羟基丁酸酯(即，酮体)的显著增加和胆固醇的减少，重组FGF21的连续输注也不能改善胰岛素耐受性(图3F)。

实施例4.R1MAb在棕色脂肪组织中的PGC1-α激活。

最近已经提议FGF21激活脂肪组织和肝脏中的核受体转录辅激活物PGC-1α蛋白，从而诱导与氧化代谢相关的下游基因的表达(Chau等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA107：12553-58(2010)；Hondares等人，CellMetabolism11：206-12(2010)；Potthoff等Proc.Nat′lAcad.Sci.USA30；106(26)：10853-8(2009))。事实上，通过DNA微阵列分析然后通过基因组富集分析揭示，当注射到ob／ob小鼠中时，R1MAb1显著增加参与OXPHOS和脂肪酸代谢的基因的BAT表达(图4A)。R1MAb1(和FGF21)还增加PGC-1α、PGC-1β及其在棕色脂肪组织中的主要靶标CIDEA与UCP1的表达(通过qPCR测量；图4B和16)。

PGC-1α的转录通过在启动子区的cAMP响应元件(CREs)和与CREs结合的CREB转录因子的调节(Herzig等人，Nature(自然)413：179-83(2001)；Karamitri等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)284：20738-52(2009)；Muraoka等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.296：E1430-39(2009)；Shi等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(2005))。在鉴定表达KLB的HEK293细胞中可以由FGF21激活的代谢相关的转录因子的筛选中，我们发现GAL-CREB融合蛋白可以被FGF21激活(图S8A-B)。随后，我们发现FGF21和R1MAb1二者都能够以剂量依赖性方式激活HEK293细胞中的GAL-CREB报道子以及CRE-荧光素酶报道子(图4C)。与CREB作用为下游效应子的观点一致，FGF21增加小鼠白脂肪组织(图4D)、分化的人原代脂肪细胞(图4E)和HEK293细胞(图12C)中的CREB和p90RSK(p90RSK是由ERK调节的上游CREB激酶)的磷酸化。因此，经由FGF21和R1MAb的CREB激活可能促进PGC-1α和一组参与脂肪组织中的氧化代谢的下游基因的诱导(图4F和12D)。除了此文提议的转录调节，还已经报道FGF21通过激活AMPK来翻译后激活PGC-1α(Chau等人，同上文)，尽管我们没有观察到体外或体内经由R1MAb的AMPK激活证据(数据未显示)。综上所述，我们的结果支持PGC-1α在脂肪组织中介导FGF21与R1MAb的抗-脂质和抗-糖尿病功效的作用。

实施例5.测试双特异性抗-FGFR1/抗-β-Klotho抗体

在我们的R1MAbs与FGF21之间的另一个重要的区别是靶受体特异性。FGF21可以作用在FGFR1c，2c和3c上，但是其作用可能局限于表达KLB的组织(即，肝、脂肪和胰腺)(Fon Tacer等人，同上文；Kurosu等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)282：26687-95(2007)；Ogawa等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA104：7432-37(2007))。相比之下，我们的R1MAbs的靶组织由FGFR1的表达和该抗体分子的组织分布确定，似乎不局限于KLB表达。事实上，我们在用R1MAb1处理的小鼠中观察到轻微的低磷血症(hypophosphatemia)，这表明肾脏中FGF23／Klotho-途径的激活。因此，我们使用噬菌体展示或产生分开的抗-KLB抗体的杂交瘤技术(用表达FGFR1c和KLB的HEK293细胞免疫BALBc小鼠)和凸起-与-孔洞技术(Merchant等Nature Biotechnol.(自然生物技术)16(7)：677-81(1998))产生双特异性抗-KLB／FGFR1双特异性抗体。我们测试了这些双特异性抗体激活GAL-Elk1表达的能力，并且证实这些抗体依赖于β-Klotho和FGFR1二者的存在进行下游信号激活。我们还证实这些抗体之一能够在分化的原代人脂肪细胞中增加下游信号传导中间物MEK和ERK1/2的磷酸化。这些双特异性抗体之一与鼠蛋白交叉反应，并且我们使用该抗体来测试双特异性抗体的体内活性。我们观察到该双特异性抗体降低血糖水平，而不升高血清FGF23，而相对应的对照抗-FGFR1(单特异性)抗体降低血糖水平至相似的程度但是显著升高血清FGF23水平。

然后，我们测试了这些双特异性抗体提供抗-FGFR1激动性抗体的代谢益处的能力。我们产生了表达人β-Klotho的转基因小鼠(R1MAb1和R1MAb2的每一个都识别鼠FGFR1)，并且证实上述抗-KLB／FGFR1双特异性抗体在小鼠模型中提高葡萄糖耐量，所述小鼠模型例如高脂肪饮食喂养的hKLB转基因小鼠。我们还产生了与其他模型动物(例如，大鼠、兔、食蟹猴和恒河猴)中的蛋白反应的抗-β-Klotho抗体，并且类似地测试用这些抗体和抗-FGFR1抗体构建的双特异性抗体提供代谢益处的能力。

虽然为了清楚的理解的目的，已经借助于示例和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚引入。

Claims

1.治疗个体中的代谢疾病或病症的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的抗-成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)激动剂，其中所述代谢疾病选自由下列各项组成的组：***(PCOS)，代谢综合征(MetS)，肥胖，非酒精性脂肪肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，高脂血症，高血压，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，隐匿性自身免疫性糖尿病(LAD)和青年成年型糖尿病(MODY)，其中所述FGFR1激动剂不激活FGFR2或FGFR3。

2.权利要求1的方法，其中所述FGFR1激动剂是抗-FGFR1抗体。

3.权利要求2的方法，其中所述抗-FGFR1抗体结合肽#26KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)或肽#28FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)。

4.权利要求2的方法，其中所述抗-FGFR1抗体结合FGFR1b与FGFR1c二者。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抗体是双特异性抗体。

6.权利要求5的方法，其中所述抗体还结合β-Klotho。

7.结合FGFR1的分离的抗体，其中所述抗体是FGFR1活性的激动剂。

8.权利要求7的分离的抗体，其中所述抗体不是FGFR2或FGFR3的激动剂。

9.权利要求7或8的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

10.权利要求7-9中任一项的抗体，其中所述抗体结合肽#26KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)或肽#28FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)。

11.权利要求7-10中任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

12.抗-FGFR1抗体，其中所述抗体包含：(a)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)，SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)，EHFDAWVHYYVMDY(SEQ IDNO：18)，TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)，和GTDVMDY(SEQ ID NO：20)，(b)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)，和(c)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁为A或G，X₂为D或E，X₃为D或Y，X₄为N或Y，X₅为A或D，并且X₆为D或Y(SEQ ID NO：24)，和X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁为D或E，X₂为D或Y，X₃为N或Y，X₄为A或D，并且X₅为D或Y(SEQ ID NO：25)。

13.抗-FGFR1抗体，其中所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅，其中X₁为S或T，X₂为N或S，X₃为N或T，X₄为W或Y，X₅为H或S(SEQ ID NO：26)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁为A或G，X₂为D或E，X₃为D或Y，X₄为N或Y，X₅为A或D，并且X₆为D或Y(SEQ ID NO：24)，和X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁为D或E，X₂为D或Y，X₃为N或Y，X₄为A或D，并且X₅为D或Y(SEQ ID NO：25)，和(c)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)，SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)，EHFDAWVHYYVMDY(SEQ IDNO：18)，TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)，和GTDVMDY(SEQ ID NO：20)。

14.权利要求13的抗体，其中所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFTSTWIS(SEQ ID NO：7)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：GEIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)和EIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)，和(c)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ IDNO：16)和SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)。

15.权利要求13的抗体，其中所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFSNNYIH(SEQ ID NO：8)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：ADIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：12)和DIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：13)，和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)。

16.权利要求13的抗体，所述抗体包含：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFTSNWIS(SEQ ID NO：9)，(b)HVR-H2，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：AEIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：14)和EIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：15)，和(c)HVR-H3，其包含选自由下列各项组成的组氨基酸序列：TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)和GTDVMDY(SEQ ID NO：20)。

17.权利要求12-16中任一项的抗体，所述抗体还包含：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：21)；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：22)；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)。

18.权利要求13的抗体，所述抗体包含选自由SEQ ID NO：2，3和4组成的组的VH序列。

19.权利要求18的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO：6的VL序列。

20.权利要求7-19中任一项的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。

21.权利要求20的抗体，其中所述抗体还结合β-Klotho。

22.权利要求7-21中任一项的抗体，其为IgG1抗体。

23.编码权利要求7-22中任一项的抗体的分离的核酸。

24.包含权利要求23的核酸的宿主细胞。

25.制备抗体的方法，所述方法包括培养权利要求24的宿主细胞，从而产生所述抗体。

26.权利要求25的方法，所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗体。

27.药物制剂，所述药物制剂包含权利要求7-22中任一项的抗体和药用载体。

28.权利要求7-22中任一项的抗体，所述抗体用作药物。

29.权利要求7-22中任一项的抗体，所述抗体用于治疗选自由下列各项组成的组的代谢疾病或病症：***(PCOS)，代谢综合征(MetS)，肥胖，非酒精性脂肪肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，高脂血症，高血压，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，隐匿性自身免疫性糖尿病(LAD)和青年成年型糖尿病(MODY)。

30.权利要求7-22中任一项的抗体，所述抗体用于使个体对胰岛素敏感。

31.权利要求7-22中任一项的抗体在制备药物中的用途。

32.权利要求31的用途，其中所述药物用于治疗选自由下列各项组成的组的代谢疾病或病症：***(PCOS)，代谢综合征(MetS)，肥胖，非酒精性脂肪肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，高脂血症，高血压，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，隐匿性自身免疫性糖尿病(LAD)和青年成年型糖尿病(MODY)。

33.权利要求31的用途，其中所述药物用于使个体对胰岛素敏感。

34.治疗个体中的糖尿病的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的权利要求7-22中任一项的抗体。

35.权利要求34的方法，所述方法还包括给所述个体施用另一种治疗糖尿病的药剂，条件是所述另一种药剂不是胰岛素。

36.权利要求34的方法，所述方法还包括给所述个体施用治疗心血管疾病的药剂。