TWI670283B - 抗體及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示之標的物提供結合KLB及FGFR1之抗體及其使用方法。在某些實施例中，本發明抗體包括結合至存在FGFR1上之表位(epitope)且結合至存在KLB上之表位的雙特異性抗體。

Description

抗體及使用方法
本發明係關於結合至β-Klotho(KLB)、纖維母細胞生長因子受體1(FGFR1)或二者之抗體及其使用方法。
纖維母細胞生長因子21(FGF21)及其最接近同源物FGF19係FGF超家族之成員。FGF21信號傳導需要FGF受體(FGFR)同種型及膜結合共受體Klotho-β(KLB)(Ogawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(18)：7432-37(2007)；US2010/0184665)。亦已顯示FGF19經由與KLB複合之FGFR同種型進行信號傳導(Wu等人，J.Biol.Chem.282(40)：29069-29072(2007))。在由哺乳動物物種編碼之FGFR之7種主要同種型(1b、2b、3b、1c、2c、3c及4)中，僅三種同種型FGFR1c、2c及3c可藉由藉助共受體KLB結合時之FGF19及FGF21二者轉導信號傳導，該共受體主要在肝、脂肪組織及胰臟中表現(Goetz及Mohammadi,Nature reviews.Molecular Cell Biology 14,166-180(2013))。在該等受體中，FGFR1c似乎在調介FGF21之代謝效應方面起主要作用。在不受限於具體理論的情況下，業內認為FGF21在膜結合共受體KLB存在下藉由誘導FGFR同種型之同源二聚化起作用。與其他FGF配體不同，FGF21展現對任何個別FGFR之極低親和力。然而，經由C末端尾區與KLB之高親和力結合會將FGF21招募至FGFR/KLB複合物，此容許FGF21與FGFR相互作用，但與單獨FGFR 之親和力較低。
在動物疾病模型中，FGF21鑑別為逆轉肥胖症及2型糖尿病之強效疾病改善蛋白劑(Kharitonenkov等人，J.Clin.Invest.115(6)：1627-35(2005))。已顯示，在缺乏瘦素信號傳導(ob/ob或db/db)之小鼠或飼餵高脂肪膳食(HFD)之小鼠中，重組FGF21會減少肝脂質，改良胰島素敏感性，並正規化血糖控制。亦已在每日經重組FGF21治療之肥胖及糖尿病恒河猴中觀察到血糖之減少及各種心血管風險因子之改良。已顯示，FGF21及FGF19皆活化肥胖的齧齒類動物中解偶蛋白1(UCP1)陽性脂肪組織(褐色及米色脂肪組織；BAT)之生熱功能(Fu等人，Endocrinology 145,2594-2603(2004)；Coskun等人，Endocrinology 149,6018-6027(2008)；Fisher等人，Genes & Development 26,271-281(2012))。
儘管目前正在測試重組FGF21或FGF19類似物治療代謝疾病之臨床應用，但對其治療性干預之研發已證實具有挑戰性。舉例而言，FGF21之血清半衰期(在非人類靈長類動物中為約2小時)太短而無法用於實踐性臨床應用，且循環中之剩餘FGF21蛋白可因蛋白水解裂解而快速失活。業內已致力於經由蛋白質改造來改良該等特性，但該等改質可增加免疫原性及其他改質特異性不利效應。另一重要挑戰係來自慢性FGF21介導之療法之長期不利效應之可能性。舉例而言，已報導FGF21經由誘導生長激素受體信號傳導之抑制劑SOCS2來誘導肝生長激素抗性(Inagaki等人，Cell Metab.8：77-83(2008))。在人類中，生長激素抗性或缺乏與兒童及成人中之低骨質量相關，且FGF21之轉基因過表現或使用重組FGF21持續兩週治療小鼠會導致骨礦物質密度顯著損失。業內尚未證實FGF21之骨相關不利效應可與有益的代謝效應去關聯。此外，FGF19之轉基因過量產生可經由活化FGF受體(FGFR)4而導致肝細胞致癌作用(Fu等人，Endocrinology 145,2594-2603 (2004)；Tomlinson等人，Endocrinology 143,1741-1747(2002)；French等人，PLoS One 7,e36713(2012))。
重組單株抗體(Ab)可起強治療模式作用，此乃因其可提供極佳靶選擇性、藥物動力學曲線及對於醫藥劑至關重要之其他特性(Chan及Carter,Nature reviews.Immunology 10,301-316(2010))。舉例而言，特異性針對FGFR1c之抗體拮抗劑經報導引起小鼠及猴之體重損失(WO2005/037235)，且在糖尿病小鼠中FGFR1c之激動性抗體介導之選擇性活化足以重演FGF21對胰島素之敏化(WO2012/158704；Wu等人，Science Translational Med.3(113)：1-10(2011))。結合至KLB/FGFR1c複合物之抗體係作為活化劑/治療劑提出(US 7,537,903；WO2011/071783；WO2012/158704)。他人已研究選擇性活化FGFR1c/KLB複合物(例如高親和力抗KLB抗體，稱為mimAb1)(Foltz等人，Sci.Transl.Med.4：162ral53(2012))及連接至人類血清白蛋白(HSA)之雙特異性抗FGFR1/KLB厄維體(Avimer)多肽C3201(US 8,372,952)之兩種替代性方式。
鑒於FGF19及FGF21在葡萄糖代謝中之重要作用，業內仍需要研發調節FGF19或FGF21介導之活性之治療性分子及方法。
本發明提供結合至KLB之抗體、結合至FGFR1之抗體及結合至KLB及FGFR1二者之雙特異性抗體及其使用方法。本發明係部分基於結合至KLB及FGFR1二者之雙特異性抗體之發現，該等抗體選擇性活化FGFR1c/KLB受體複合物且誘導預期來自FGF21樣活性之有益代謝變化，包括體重損失及葡萄糖及脂質代謝改良，而對肝並無顯著影響且無骨質量損失。
在某些實施例中，抗體係雙特異性抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明之經分離抗體可結合至β-Klotho(KLB)及纖維母細胞生 長因子受體1(FGFR1)二者，其中該抗體結合至KLB之C末端域。舉例而言而非以限制方式，本發明之經分離抗體結合至KLB及FGFR1c二者。在某些實施例中，抗體結合至KLB之包括胺基酸序列SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS(SEQ ID NO：142)之片段。在某些實施例中，抗體結合至FGFR1之包括胺基酸序列KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：143)或FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：144)之片段內之表位。
在某些實施例中，本發明抗體活化KLB/FGFR1c複合物。在某些實施例中，本發明抗體降低活體內血糖含量。在某些實施例中，抗體並不顯著影響骨密度。在某些實施例中，本發明抗體對肝並無顯著影響。在某些實施例中，抗體所誘導之肝中ERK及MEK磷酸化顯著低於FGF21誘導之量。在某些實施例中，抗體係以10-8M至10-13M之Kd結合至KLB。在某些實施例中，本發明抗體可以10-8M至10-13M之Kd結合至FGFR1蛋白。在某些實施例中，本發明抗體可以10-8M至10-13M之Kd結合至FGFR1c。在某些實施例中，抗體係以<10nM之Kd結合至KLB且以>300nM之Kd結合至FGFR1c。在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體可包括Kd為約10nM至約10μM之抗FGFR1臂。
在某些實施例中，本發明抗體結合至存在於KLB上之表位。舉例而言而非以限制方式，本發明提供與圖3A及B中所顯示之抗體結合相同表位之抗KLB抗體。在某些實施例中，本發明之抗KLB抗體與12A11或8C5抗體結合相同表位。在某些實施例中，抗KLB抗體結合至KLB之C末端域內之表位。在某些實施例中，抗KLB抗體結合至KLB之由胺基酸序列SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS(SEQ ID NO：142)組成之片段。
在某些實施例中，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體包括包含重鏈可變區及輕鏈可變區之第一抗體或其抗原結合部分，其中重 鏈可變區包括具有與SEQ ID NO：128中所闡釋之序列至少95%一致之序列的胺基酸，且輕鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：130中之序列至少95%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合部分包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：132中之序列至少95%一致之序列的胺基酸，且輕鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：134中之序列至少95%一致之序列的胺基酸。
在某些實施例中，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體包括包含重鏈區及輕鏈區之第一抗體或其抗原結合部分，其中重鏈區包括具有與示於SEQ ID NO：129中之序列至少95%一致之序列的胺基酸，且輕鏈區包括具有與示於SEQ ID NO：131中之序列至少95%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合部分包括重鏈區及輕鏈區，其中重鏈區包括具有與示於SEQ ID NO：133中之序列至少95%一致之序列的胺基酸，且輕鏈區包括具有與示於SEQ ID NO：135中之序列至少95%一致之序列的胺基酸。
本發明進一步提供包括以下各項之抗KLB抗體：(a)HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO：1-15組成之群之胺基酸序列，(b)HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO：79-93組成之群之胺基酸序列，及(c)HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO：16-31組成之群之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗KLB抗體包含(a)HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO：1-15組成之群之胺基酸序列，(b)HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO：16-31組成之群之胺基酸序列，及(c)HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO：32-47組成之群之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗KLB抗體進一步包含(a)HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO：48-62組成之群之胺基酸序列，(b)HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO：63-78組成之群之胺基酸序列，及(c)HVR-L3，其 包含選自由SEQ ID NO：79-93組成之群之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗KLB抗體包含(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列之HVR-L2，及(f)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，抗KLB抗體包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之HVR-L2，及(f)包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，抗KLB抗體包含(a)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之重鏈可變區及(b)包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之重鏈及(b)包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列的輕鏈。
在另一態樣中，本發明提供包含以下各項之抗KLB抗體：(a)與SEQ ID NO：128之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之重鏈可變區；(b)與SEQ ID NO：130之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈可變區；及(c)如(a)中之重鏈可變區及如(b)中之輕鏈可變區。
本發明進一步提供結合至FGFR1(例如FGFR1c)之抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明抗體包含結合至FGFR1之可變域。在某些實施例中，抗體結合至FGFR1之由胺基酸序列KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：143)或FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：144)組成之片段。在某些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之 HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之HVR-L2，及(f)包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之HVR-L3。在某些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之重鏈可變區及(b)包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之重鏈及(b)包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之輕鏈。在某些實施例中，本發明抗體結合至FGFR1c之由胺基酸序列KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：143)或FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：144)組成之片段。
在某些實施例中，本發明抗體係單株抗體。在某些實施例中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在某些實施例中，抗體具有降低的效應物功能。
在另一態樣中，本發明提供編碼本發明抗體之經分離核酸。在某些實施例中，本發明提供包含本發明核酸之宿主細胞。在某些實施例中，本發明提供產生抗體之方法，其包含培養本發明宿主細胞以產生抗體。在某些實施例中，此方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。
本發明進一步提供包括一或多種本發明抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。在某些實施例中，醫藥調配物包含另一治療劑。
在另一態樣中，本發明提供本發明抗體，其用作藥劑。在某些實施例中，抗體係用於治療代謝病症，例如多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。在某些實施例中，抗體係用於治療2型糖尿病。在某些實施例中，抗體係用於治療肥胖症。在某些實施例中，本發明提供用於治療以下疾病之抗體：巴比二氏症候群 (Bardet-Biedl syndrome)、普威二氏症候群(Prader-Willi syndrome)、阿姆斯壯氏症候群(Alstrom syndrome)、科漢氏症候群(Cohen syndrome)、奧爾布賴特氏遺傳性骨失養症(Albright's hereditary osteodystrophy)(假副甲狀腺低能症)、卡彭特症候群(Carpenter syndrome)、MOMO症候群、魯塔二氏症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)、X染色體易裂症候群及波-弗-萊症候群(Börjeson-Forssman-Lehman syndrome)。在某些實施例中，本發明提供用於活化KLB/FGFR1受體複合物(例如KLB/FGFR1c受體複合物)之抗體。
在另一態樣中，本發明提供本文所揭示抗體之用途，其用於製造用來治療以下疾病之藥劑：代謝病症，例如多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)；及老化及相關疾病，例如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)及ALS。在某些實施例中，代謝病症係2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病症係肥胖症。在某些實施例中，製造用於活化KLB/FGFR1c受體複合物之藥劑。
在另一態樣中，本發明提供治療患有選自由以下組成之群之疾病之個體的方法：多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)以及老化及相關疾病(例如阿茲海默氏病、帕金森氏病及ALS)，該方法包含向個體投與有效量之一或多種本發明抗體。在某些實施例中，疾病係糖尿病，例如2型糖尿病。在某些實施例中，疾病係肥胖症。在某些實施 例中，本發明提供治療患有選自由以下組成之群之疾病及/或病症之個體的方法：巴比二氏症候群、普威二氏症候群、阿姆斯壯氏症候群、科漢氏症候群、奧爾布賴特氏遺傳性骨失養症(假副甲狀腺低能症)、卡彭特症候群、MOMO症候群、魯塔二氏症候群、X染色體易裂症候群及波-弗-萊症候群。在某些實施例中，該方法進一步包括向個體投與另一治療劑。在某些實施例中，使用一或多種本發明抗體之方法並不影響個體之肝功能。在某些實施例中，本發明提供引起體重損失之方法，其包含向個體投與有效量之一或多種本發明抗體。
在另一態樣中，本發明提供活化個體之KLB-FGFR1c受體複合物之方法，其包含向個體投與有效量之本發明抗體。
圖1A繪示抗FGFR1抗體及抗體片段之激動活性。
圖1B繪示使用抗FGFR1抗體之結合競爭實驗之結果。
圖1C繪示FGFR1中對本揭示標的物之抗FGFR1抗體之結合至關重要之胺基酸殘基。圖1C按編排順序分別揭示SEQ ID NO：159、143及144。
圖1D繪示確定對本揭示標的物之抗FGFR1抗體之結合至關重要之胺基酸殘基之位點特異性誘變的結果。
圖1E繪示確定對本揭示標的物之抗FGFR1抗體之結合至關重要之胺基酸殘基之位點特異性誘變的結果。
圖1F繪示FGFR1之空間填充模型上對結合至關重要之殘基。
圖2A繪示兩種抗FGFR1抗體對FGFR1b及FGFR1c之親和力。
圖2B繪示抗FGFR1抗體與不同FGFR之結合。
圖2C繪示在基於GAL-ELK1(ETS樣轉錄因子1)之螢光素酶分析中在L6細胞中起FGFR1之特異性激動劑作用的抗FGFR1抗體。
圖2D繪示在基於GAL-ELK1之螢光素酶分析中在HEK293細胞中 起FGFR1之特異性激動劑作用之抗FGFR1抗體。
圖2E繪示在注射至糖尿病ob/ob小鼠中時抗FGFR1抗體正規化血糖含量。
圖3A及3B繪示17種抗KLB抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區序列。抗體之CDR H1序列按順序(11F1-8C5)係SEQ ID NO：1-15；CDR H2序列按順序係SEQ ID NO：16-31；CDR H3序列按順序係SEQ ID NO：32-47；CDR L1序列按順序係SEQ ID NO：48-62；CDR L2序列按順序係SEQ ID NO：63-78；且CDH L3序列按順序係SEQ ID NO：79-93。抗體之重鏈可變區序列按順序係SEQ ID NO：94-110；且輕鏈可變區序列按順序係SEQ ID NO：111-127。
圖4繪示在FACS圖中在不同抗KLB抗體與表現hKLB之293細胞之0.8μg/ml量測結合下觀察到之中值位移。
圖5繪示不同抗KLB抗體與hKLB-ECD-HIS蛋白之相對結合。
圖6A係表示本揭示標的物之抗體及用於信號活化之KLB/FGFR1c雙特異性Ab複合物形成之模型的示意圖。
圖6B繪示用於信號活化之FGFR1c-KLB-FGF21複合物形成之模型。
圖6C繪示使用缺乏FGFR1之HEK293細胞之FGF21及雙特異性抗體(BsAb)17活性之GAL-ELK1螢光素酶分析。細胞經轉染以表現所指示之受體。
圖6D繪示經所指示蛋白質(FGF21(100nM)或IgG(33nM))治療1hr之初級人類脂肪細胞之西方墨點(western blot)分析。用於每一治療之樣品為一式兩份。
圖7A繪示在基於GAL-ELK1之螢光素酶分析中具有抗FGFR1及抗KLB臂之不同雙特異性抗體的誘導。應注意，具有R1MAb1臂之雙特異性Ab展現顯著的非KLB依賴性活性，推測此乃因R1MAb1 Fab之激 動活性所致。使用具有R1MAb2或R1MAb3臂之雙特異性Ab未觀察到該活性。
圖7B繪示具有抗FGFR1及抗KLB臂之不同雙特異性抗體對信號傳導之誘導依賴於FGFR1c及KLB。
圖7C繪示在表現重組hFGFR1c及hKLB之細胞中、而非無KLB表現之細胞中以劑量依賴性方式誘導螢光素酶活性之具有抗FGFR1及抗KLB臂的雙特異性抗體。
圖8A係抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體之三種變體之示意圖。藍色：人類，及紅色：小鼠。寡糖鏈之N297處之大體位置在(1)中由^指示。無效應物之形式((2)及(3))因N297G突變所致缺少寡糖鏈。(2)中之星號指示D265A突變之大體位置。亦顯示隆凸對孔洞之取向。(1)表示BsAb10；(2)表示BsAb20；且(3)表示BsAb17。
圖8B繪示經BsAb10及其衍生物、對照IgG或FGF21治療10min之初級人類脂肪細胞之MSD pERK分析。數據表示平均值±SEM(N=3)。 bFKB1(1)表示BsAb10；bFKB1(2)表示BsAb20；且bFKB1(3)表示BsAb17。
圖9A繪示大鼠L6肌母細胞之GAL-ELK1螢光素酶分析。使用針對所指示受體之表現載體共轉染細胞。將經轉染細胞與不同濃度之BsAb10或陽性對照(FGF21、FGF19或R1MAb1)一起培育6h，然後進行螢光素酶分析。
圖9B及C繪示與圖9A中所顯示類似之GAL-ELK1螢光素酶分析。如所指示使用FGF21及BsAb17之組合來治療經轉染L6細胞。N=4。
圖9D繪示抗FGFR1抗體及抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(BsAB9及BsAb10)與表現KLB、FGFR1c或二者之細胞之結合。
圖10A繪示具有抗FGFR1及抗KLB臂之雙特異性抗體及抗FGFR1抗體與表現FGFR1c、KLB或二者之細胞之結合。
圖10B繪示BsAb10與表現不同人類及鼠類KLB/FGFR1組合之HEK293細胞結合的Kd。
圖11繪示200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM之BsAb10或預形成之BsAb10/KLB複合物與固定在晶片上之FGFR1-ECD-Fc融合蛋白的結合分析。為產生預形成之BsAb10/KLB複合物，以1：1比率預培育BsAb10與重組KLB-ECD蛋白。應注意，使用BsAb10/KLB複合物之解離速率慢於單獨使用BsAb10之解離速率，但僅在FGFR1c、而非FGFR1b捕獲於晶片上時如此，此指示形成三元複合物。
圖12A係TR-FRET實驗設計之示意圖。
圖12B繪示在添加所指示配體後15分鐘時在具或不具無標籤KLB的情況下，表現帶有SNAP標籤之經標記FGFR1c蛋白之COS7細胞之TR-FRET強度。BsAb17、FGF21、FGF1及FGF2分別係以67nM、50nM、62.5nM、12nM使用。數據表示665nm下之FRET強度除以620nm下之供體發射(FRET比率)及三個獨立實驗(N=3)之平均值±SEM。p<0.05(*)、<0.01(**)、<0.0001(***)對PBS對照。
圖13A繪示確定KLB之哪個部分對兩種抗KLB抗體之結合至關重要之實驗結果。KLB蛋白結構之示意圖顯示於頂部。每一條表示人類KLB、人類KLA、兔KLB、大鼠KLB、小鼠KLB或嵌合構築體，如由色彩所編碼。在右側，顯示基於FACS之KLBmAb1及對照KLBmAb2與瞬時表現每一構築體之HEK293細胞之結合。應注意，KLBmAb1並不與兔KLB結合，但替代相應的人類序列之34胺基酸片段(胺基酸805-838)賦予結合。
圖13B繪示具有信號序列之人類KLB蛋白之位置857-890區段的胺基酸序列(其對應於不包括信號序列之KLB蛋白之位置805-838處的胺基酸序列)及多種所指示物種中之相應序列。圖13B按編排順序分別揭 示SEQ ID NO：160-164。
圖14A繪示FGF21及FGF19藉助SPR與BsAb10/KLB複合物之結合。BsAb10捕獲於晶片上，且依序注射KLB-ECD蛋白及FGF蛋白(0.2μM、0.8μM或2μM)。
圖14B繪示大鼠L6肌母細胞中GAL-ELK1螢光素酶分析之結果。使用針對FGFR4及KLB二者之表現載體共轉染細胞。將經轉染細胞與不同濃度之所指示蛋白質一起培育6h，然後進行螢光素酶分析。
圖14C繪示經實施以監測H4IIE肝癌細胞中之ERK磷酸化之西方墨點。應注意，BsAb17並不阻斷FGF19活化FGFR4/KLB複合物之能力(圖14B)或誘導H4IIE肝癌細胞中之ERK磷酸化之能力(圖14C)。
圖15A繪示在以3mg/kg(精瘦)或5mg/kg(db/db)腹膜內(i.p.)單次注射BsAb17或對照IgG後，精瘦C57BL/6及db/db小鼠(n=7)之血糖含量(第7天)、體重變化%(第7天)及每日食物攝取(第0-3天)。
圖15B繪示在第0天及第6天(箭頭)時接受3mg/kg所指示IgG(BsAb20)之i.p.注射之膳食誘導型肥胖症(DIO)小鼠的體重及血糖含量。N=9。
圖15C繪示第14天時使用與15B中所使用相同之小鼠及抗體之葡萄糖耐受測試之結果。
圖15D繪示在第17天時15B-C中所顯示動物中之肝甘油三酯及血清標記物的量。
圖15E、F及G繪示在以10mg/kg(N=12)單次i.p.注射所指示IgG(BsAb17)後5天時，在使用DIO小鼠之高胰島素血症-正葡萄糖鉗夾期間量測之全身葡萄糖利用(E)、內源葡萄糖產生(F)及胰島素刺激之組織葡萄糖吸收(G)。在(E)及(F)中，水平軸表示血清胰島素含量。箭頭指示自基礎狀態至胰島素刺激狀態之變化方向。p<0.05(*)、<0.005(**)、<0.0001(***)對對照。
圖16A顯示小鼠KLB蛋白之N末端胺基酸序列(SEQ ID NO：165)，且顯示由KO小鼠之Klb對偶基因編碼之相應胺基酸序列(SEQ ID NO：166)。Klb基因之誤義突變導致KO對偶基因中第二胺基酸後之移碼，如使用紅色字母所顯示。
圖16B顯示野生型(+/+)及KLB敲除(-/-)小鼠中附睪白色脂肪組織中之KLB蛋白表現。
圖16C顯示KLB對BsAb20影響葡萄糖代謝至關重要。以3mpk接受BsAb20或對照IgG之四次每週注射之DIO小鼠中的葡萄糖耐受測試(GTT)。GTT係在第23天、最後一次注射後之3天實施。使小鼠在HFD上保持20週，然後進行GTT。*p<0.05。
圖16D繪示在i.p.注射50mg/kg之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體或R1MAb1或媒劑後第7天時，DIO小鼠中之血清參數。N=6。
圖17繪示在i.p.注射50mg/kg之BsAb17後第7天時，DIO小鼠血清中FGF23及無機磷之量。N=6。***p<0.0005。
圖18A繪示鉗夾實驗期間動脈血糖偏移之量。使DIO小鼠在鉗夾實驗前5天時接受10mg/kg之BsAb17或對照IgG。
圖18B繪示鉗夾實驗當天之體重。
圖18C繪示鉗夾實驗期間之葡萄糖輸注速率。p<0.05(*)、<0.001(**)對對照。
圖19A繪示在所指示時間下在21℃-22℃下接受10mg/kg IgG之單次i.p.注射之DIO小鼠的能量消耗增加(EE)(左圖)及呼吸商(RQ)(右圖)。N=7。
圖19B繪示在所指示時間下接受10mg/kg IgG之單次i.p.注射之精瘦小鼠的EE(上圖)及RQ(下圖)。將小鼠維持在21℃-22℃，然後在IgG注射後第6天時將籠溫度移位至適中溫度(29℃-30℃)。N=6-7。
圖19C繪示在單次i.p.注射10mg/kg之所指示IgG後40hr時，DIO 小鼠中之組織氟去氧葡萄糖(FDG)吸收。N=8。使小鼠禁食過夜，然後量測FDG吸收。
圖19D繪示在單次i.p.注射(BsAb17或對照IgG，10mg/kg)及手術植入滲透幫浦(CL316,243(0.75nmol/h)或媒劑)後第7天時收穫之ingWAT的西方墨點分析。
圖19E繪示經30nM所指示蛋白質治療48hr之初級人類皮下脂肪細胞中之Ucp1 mRNA表現。N=3。
圖19F繪示接受10mg/kg之BsAb17或對照IgG之DIO小鼠之核心體溫。N=7-8。
圖19G繪示以2mg/kg/天每天兩次接受單一10mg/kg IgG及FGF21或對照PBS達5天之DIO小鼠之iBAT中的基因表現概況。列示出BsAb17與對照之間或FGF21與對照之間顯著不同之所有基因。
圖19H繪示在第0天時接受10mg/kg之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體或對照IgG之單次i.p.注射及手術植入滲透幫浦(0.5nmol/h之CL-316,243或媒劑)的精瘦小鼠之EE(左圖)及RQ(右圖)。顯示所指示24h時段期間之平均值。
圖20A及B繪示圖19A及B中分別闡述之DIO小鼠之VO2(上圖)、VCO2(中圖)及總活性計數的量。藉由在由#所指示之時間下量測之體重值將VO2及VCO2值正規化。使DIO小鼠接受10mg/kg之BsAb17或對照IgG。
圖21A繪示間接量熱之平均EE值。平均增加之數量級顯示於圖表下。DIO 21℃：在圖19A所顯示之實驗中在IgG注射後D3-D6期間EE之平均值。精瘦21℃：在圖19B所顯示之實驗中在IgG注射後之D3-D6期間EE之平均值。轉換至30℃後之精瘦：在圖19B所顯示之實驗中在IgG注射後D6-D9(即，溫度轉換後之3天)期間EE之平均值。DIO 30℃：在適應適中溫度之DIO小鼠中在IgG注射後D3-D6期間EE之平均 值。
圖21B繪示在適中溫度下DIO小鼠中之EE變化。使DIO小鼠適應適中溫度達2週，然後單次i.p.注射(箭頭)10mg/kg之BsAb17或對照IgG。N=3-4。
圖21C繪示在正常實驗室溫度(21℃)下在手術植入滲透幫浦及藥物注射後D3-5期間DIO小鼠之平均EE及RQ。在D0時，使小鼠接受10mg/kg之BsAb17或對照IgG之i.p.注射。亦在D0時使FGF21組接受濃注2mg/kg FGF21 i.p.注射。亦在D0時向每一小鼠皮下植入滲透幫浦以60μg/天輸注FGF21或PBS對照。N=8-9。**p<0.005。
圖22繪示圖19F中所顯示之數據，其經重繪以顯示在研究時期內接受10mg/kg之BsAb17或對照IgG之DIO小鼠之間的核心體溫之擬合差。黑線係所估計之差，且藍線係該差之95%逐點信賴區間。在第13天時投與IgG(箭頭)。N=7-8。
圖23繪示附睪脂肪、腹股溝脂肪及肩胛間褐色脂肪以及胰臟中FGF21及BsAb20誘導之相似程度之ERK及MEK磷酸化。在以10mg/kg(BsAb20)或1mg/kg(FGF21)i.p.注***瘦C57BL/6只小鼠後1h(肝、胰臟及附睪白色脂肪組織(eWAT))或2h(iBAT或ingWAT)時收穫組織。總ERK及MEK用作負載對照。
圖24A及B繪示接受所指示劑量(mg/kg)之BsAb17之單次i.p.(A)或i.v.(B)注射的DIO小鼠((A),N=6)或食蟹猴((B),N=3)中之體重變化及血清HMW脂聯素含量。
圖24C繪示接受10mg/kg所指示IgG(BsAb17)之單次i.p.注射(箭頭)之DIO小鼠(左圖：wt及右圖：adipoq KO)之EE。N=5-6。
圖24D繪示接受10mg/kg所指示IgG(BsAb17)之單次i.p.注射之wt(+/+)及adipoq KO(-/-)DIO小鼠中的不同代謝參數。N=6。AUC：GTT或ITT之曲線下面積(T=0-2h)。p<0.1(#)、<0.05(*)、<0.005(**) 對對照。
圖25繪示使用qPCR自圖19G中所闡述之小鼠製備之總RNA。
圖26繪示小鼠組織中BsAb17對ERK磷酸化之程度。在向精瘦C57BL/6小鼠i.p.注射10mg/kg BsAb17或對照IgG後1h時收穫組織，且使其經歷使用特異性針對磷酸化ERK之抗體之免疫組織化學。顯示每一組之來自2只動物之代表影像。(1)胰臟，(2)含有上視束交叉核(箭頭)之冠狀腦切片，(3)含有最後區(經染色細胞之三角形集合)及中央管(箭頭)之冠狀腦切片，及(4)含有中突(箭頭)之冠狀腦切片。應注意，BsAb17誘導之信號在胰臟腺泡細胞中較為明顯，但在所檢查之任一腦切片中不明顯。
圖27繪示BsAb20對HFD誘導之肝細胞增殖之正規化。經BsAb20(1mg或3mg/kg/週)或對照IgG(3mg/kg/週)治療8週之DIO小鼠或對照精瘦C57BL/6小鼠中之肝BrdU納入。*p<0.05對經IgG治療之DIO小鼠(N=5-8)。
圖28A係圖28B所顯示實驗之示意圖。如所指示使DIO小鼠接受BsAb20(1mg或3mg/kg/週)或對照IgG(1mg/kg/週)達6週。對照精瘦C57BL/6小鼠未接受治療。
圖28B繪示BsAb20治療後之骨表型。對股骨及脛骨實施剖析且使其經歷μCT分析。(N=7-8)。應注意，在小樑骨及皮質骨中未觀察到多個骨參數(可能不包括皮質骨厚度)之負面效應，此顯示使用3mg/kg/週BsAb20治療之遞減趨勢，但未達到統計學顯著性。由於業內已報導在熱量受限小鼠中皮質骨厚度之減小並不影響小樑骨密度(11)，故所觀察到之效應可能與體重損失相關。p<0.001(***)、<0.01(**)、<0.05(*)、<0.1(#)、<0.2($)對經對照IgG治療之DIO小鼠。N=7-8。
圖29繪示BsAb17治療後小鼠中之皮質酮含量。血清皮質酮含量係在藉由斷頭術安樂死後授時時間(ZT)=3時量測。對照(CTRL)精瘦 小鼠未接受治療。在安樂死(ZT=0)前3hr時將脂多糖(LPS)以1mg/kg i.p.注射至精瘦小鼠中作為陽性對照(12)。如所指示在安樂死前5天時將IgG以5mg/kg或25mg/kg i.p.注射至DIO小鼠中。在不存在LPS組之情形下實施所指示統計學分析。N=12。
圖30顯示具有抗FGFR1及抗KLB臂之多種不同雙特異性抗體與表現FGFR1c或FGFR1c及KLB之細胞的結合。
圖31繪示藉由ELISA之YW182.5及YW182.5衍生物與FGFR1蛋白之結合。
為簡潔起見而非以限制方式，將本揭示標的物之詳細說明分成以下子部分：I.定義；II.抗體；III.使用方法；Ⅳ.醫藥調配物；及V.製品。
I. 定義
出於本文之目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在某些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在某些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合伴侶 (例如，抗原)之間之非共價相互作用之總強度。除非另外指明，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體與抗原)之間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對於其伴侶Y之親和力通常可表示為解離常數(Kd)。親和力可藉由業內已知之常用方法(包括彼等本文所述者)來量測。用於量測結合親和力之特定說明性及實例性實施例闡述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比，在一或多個超變區(HVR)中具有一或多個改變之抗體，該等改變可改良抗體對抗原之親和力。
除非另外指明，否則如本文所使用，術語「Klotho-β」、「KLB」及「β-Klotho」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然β-Klotho，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」KLB以及自處理細胞產生之KLB的任一形式。該術語亦涵蓋KLB之天然變體，例如剪接變體或對偶基因變體。本發明抗體所靶向之人類KLB胺基酸序列(不包括信號序列)之非限制性實例如下： (SEQ ID NO：145)。
在某些實施例中，KLB蛋白可包括具有胺基酸序列MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTG(SEQ ID NO：157)之N末端信號序列。
術語「KLB之C末端域」係指KLB之羧基末端糖苷酶樣域。舉例而言，SEQ ID NO：145中所顯示之實例性KLB蛋白之C末端域包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：155)。
術語「抗KLB抗體」及「結合至KLB之抗體」係指能夠以足夠親和力結合KLB、使得該抗體可用作靶向KLB之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一實施例中，抗KLB抗體與不相關非KLB蛋白結合之程度比該抗體與KLB結合之程度低約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至KLB之抗體之解離常數(Kd)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗KLB抗體結合至KLB之在來自不同物種之KLB中保守之表位。在某些實施例中，抗KLB抗體結合至KLB上處於蛋白質C末端部分中之表位。
除非另外指明，否則如本文所使用，術語「纖維母細胞生長因子受體1」或「FGFR1」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然FGFR1，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」FGFR1以及自處理細胞產生之FGFR1的任一形式。該術語亦涵蓋FGFR1之天然變體，例如剪接變體或對偶基因變體。人類FGFR1c胺基酸之非限制性實例顯示於下文中： (SEQ ID NO：146)。
術語「抗FGFR1c抗體」係指能夠以足夠親和力結合FGFR1c、使得該抗體可用作靶向FGFR1c之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一實施例中，抗FGFR1c抗體與不相關非FGFR1c蛋白結合之程度比該抗體與FGFR1c結合之程度低約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至FGFR1c之抗體之解離常數(Kd)為1M、100mM、10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。在某些實施例中，本文所揭示結合至FGFR1c之抗體之Kd可為10-3M或更低或10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M。在某些實施例中，抗FGFR1c抗體結合至FGFR1c之在來自不同物種之FGFR1c中保守之表位。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙價抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
與參考抗體「競爭結合之抗體」係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更多之抗體，且反之，在競爭分析中參考抗體將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更多。實例性競爭分析闡述於「Antibodies」，Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)中。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自具體來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「種類」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼類(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/ 或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應物功能」係指彼等可歸因於抗體之Fc區之生物學活性，其可隨抗體同型而變化。抗體效應物功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望治療或預防結果之量。舉例而言而非以限制方式，「有效量」可係指本文所揭示抗體之能夠緩和、最小化及/或預防疾病及/或病症之症狀、延長存活期及/或延長直至疾病及/或病症復發之時段的量。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之含有恆定區之至少一部分的C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在某些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，可存在或可不存在Fc區之C末端離胺酸(Lys447)。除非在本文中另有說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU指數)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所闡述。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變域殘基。可變域之FR通常係由4個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，且係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用，且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「經轉化細胞」，其包括原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可含有突變。本文包括如經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列選自可變域序列之亞組。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在某些實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人中之亞組κ I(參見上文)。在某些實施例中，對於VH而言，亞組係如Kabat等人中之亞組III(參見上文)。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有之至少一個、且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有之HVR(例如CDR)皆對應於非人類之HVR，且所有或實質上所有之FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體之「人類化形式」(例如非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
如本文所使用，術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變域之序列(「互補決定區」或「CDR」)超變及/或形成在結構上經定義之環 (「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之區中的每一者。除非另外指明，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人進行編號(參見上文)。通常，抗體包含6個HVR；3個在VH中(H1、H2、H3)，且3個在VL中(L1、L2、L3)。本文之實例性HVR包括：(a)出現在以下胺基酸殘基處之超變環：26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)出現在以下胺基酸殘基處之CDR：24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)；(c)出現在以下胺基酸殘基處之抗原觸點：27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
在某些實施例中，HVR殘基包含在圖3A或圖3B或本說明書別處鑑別之彼等。
「免疫偶聯物」係指偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
如在本文中可互換使用之「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例 中，個體係人類。
「經分離」抗體係已與其天然環境中之組份分離者。在某些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「經分離」核酸係指已與其天然環境中之組份分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗體之經分離核酸」(包括對特定抗體、例如抗KLB抗體之提及)係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或單獨載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中一或多個位置處之該(等)核酸分子。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，即構成該群之個別抗體相同及/或結合相同表位，但可能之變體抗體除外，例如含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，該等變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示如自抗體之實質上同源之群獲得之抗體特徵，且不應解釋為需要藉由任一具體方法產生抗體。舉例而言，欲根據本揭示標的物使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。
「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標 記偶聯之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異源四聚體糖蛋白，其係由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N末端至C末端，每一重鏈皆具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，隨後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，每一輕鏈皆具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，隨後為恆定輕鏈(CL)域。基於抗體恆定域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈指派為兩種類型中之一者，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
如本文所使用，術語「包裝插頁」係指通常包括於治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該等治療產品之使用之警告的資訊。
就參考肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分數(%)」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分數後，候選序列中與參考肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分數之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司設計，且源代碼與使用者文件已一起編入美國版權局，Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程 式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：100×分數X/Y
其中X係在A與B之此程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對B之胺基酸序列一致性%將不等於B對A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值皆係如前一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其所呈現形式允許其中所含活性成份之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性的額外組份。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所使用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程之臨床干預，且可出於預防目的或在臨床病理學病程期間實施。治療之合意效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在某些實施例中，可使用本發明抗體來延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中每一域皆包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman及Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合具體抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL域分離以分別篩選互補VL或VH域之文庫。例如，參見Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所使用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及納入已引入其之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
II. 抗體
在一態樣中，本發明係部分基於以下雙特異性抗體之發現：結合至KLB及FGFR1c二者且選擇性活化FGFR1c/KLB受體複合物並誘導預期來自FGF21樣活性之有益代謝變化(包括體重損失、及葡萄糖及脂質代謝改良)，而對肝並無顯著影響且無骨質量損失。
在某些實施例中，提供結合至KLB之抗體。本發明進一步提供抗FGFR1抗體，例如抗FGFR1c抗體。本發明進一步提供結合至KLB及FGFR1二者之雙特異性抗體(在本文中稱為抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)。在某些實施例中，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體結合至KLB及FGFR1c二者。在某些實施例中，本發明抗體包括不會阻斷FGF配體(例如FGF19及FGF21)與KLB/FGFR1c複合物之結合及/或相互作用之抗體。
在某些實施例中，本發明抗體對肝(例如肝功能)並無顯著影響。 在不受限於具體理論的情況下，本發明抗體並不活化肝中之FGFR1c/KLB受體複合物。在某些實施例中，與肝中FGF21蛋白對FGFR/KLB受體複合物之調節相比，本發明抗體並不調節肝中FGFR/KLB受體複合物之活性。在某些實施例中，本發明抗體並不抑制FGFR4/KLB複合物及/或不增加肝酶，例如(但不限於)ALT、AST、ALP及GLDH。在某些實施例中，本發明抗體並不發揮肝中FGFR2c/KLB複合物及/或FGFR3c/KLB複合物之激動劑之功能，此可活化肝中之MAPK信號傳導及/或改變Spry4及Dusp6之表現。在某些實施例中，與FGF21蛋白對MAPK信號傳導之活化相比，本發明抗體並不活化肝中之MAPK信號傳導。在某些實施例中，本發明抗體並不發揮肝中FGFR4/KLB複合物之激動劑之功能。
在某些實施例中，本發明抗體可為人類化抗體。在某些實施例中，本發明抗體包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。
在某些實施例中，本發明抗體可為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在某些實施例中，本發明抗體可係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙價抗體或F(ab')2片段。在某些實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。在某一實施例中，本發明抗體可單獨或以組合納入任一特徵，如下文所詳述之部分1-7中所闡述。
本發明抗體可用於例如診斷或治療代謝病症。代謝病症之非限制性實例包括多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿自體免疫糖尿病(LAD)、青少年成熟發病型糖尿病(MODY)以及老化及相關疾病(例如阿茲海默氏病、帕金森氏病及ALS)。
A. 實例性抗KLB抗體
在一態樣中，本發明提供結合至KLB蛋白之經分離抗體。在某些實施例中，本發明之抗KLB抗體結合至KLB之C末端域。在某些實施例中，本發明之抗KLB抗體結合至KLB之包含胺基酸序列SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS(SEQ ID NO：142)之片段。在某些實施例中，該抗體與本文所闡述之抗KLB抗體(例如8C5)結合至相同表位。
在某些實施例中，本發明之抗KLB抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：1-15中之任一者、例如12或15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16-31中之任一者、例如28或31之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：32-47中之任一者、例如44或47之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：48-62中之任一者、例如49或62之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：63-78中之任一者、例如75或78之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：79-93中之任一者、例如90或93之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本發明提供抗KLB抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：44之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：49之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：75之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：90之HVR-L3。在某些實施例中，本發明提供抗KLB抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：15之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO 31之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：47之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO 62之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：93之HVR-L3。
本發明進一步提供抗KLB抗體，其包含與SEQ ID NO：128之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，如下文所揭示之保守取代)、***或缺失，但包含此序列之抗KLB抗體保留結合至KLB之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：128中，總共有1至10個胺基酸已經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外部之區域中(即，在FR中)。或者或另外，抗KLB抗體包含SEQ ID NO：128中之VH序列，包括如下文所揭示之此序列的翻譯後修飾。在某些實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供抗KLB抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：130之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含此序列之抗KLB抗體保留結合至KLB之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：130中有總共1至10個胺基酸已經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外部之區域中(即，在FR中)。或者或另外，抗KLB抗體包含SEQ ID NO：130中之VL序列，包括此序列之翻譯後修飾。在某些實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含 SEQ ID NO：78之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之HVR-L3。
本發明進一步提供抗KLB抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在某些實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：128及SEQ ID NO：130中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。
在某些實施例中，抗KLB抗體結合至KLB之由胺基酸序列SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS(SEQ ID NO：142)組成之片段。
B. 實例性抗FGFR1抗體
在一態樣中，本發明提供結合至FGFR1蛋白之經分離抗體。在某些實施例中，本發明之抗FGFR1抗體結合至FGFR1c。在某些實施例中，本發明提供抗FGFR1抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：136之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：137之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：138之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：139之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：140之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：141之HVR-L3。
在某些實施例中，本發明之抗FGFR1抗體包含與SEQ ID NO：132之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含此序列之抗FGFR1抗體保留結合至FGFR1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：132中，總共有1至10個胺基酸已經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外部之區域中(即，在FR中)。或者或另外，抗 FGFR1抗體包含SEQ ID NO：132中之VH序列，包括此序列之翻譯後修飾。在某些實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之HVR-H3。
本發明進一步提供抗FGFR1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：134之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含此序列之抗FGFR1抗體保留結合至FGFR1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：134中有總共1至10個胺基酸已經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外部之區域中(即，在FR中)。或者或另外，抗FGFR1抗體包含SEQ ID NO：134中之VL序列，包括此序列之翻譯後修飾。在一具體實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中，提供抗FGFR1抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在某些實施例中，抗FGFR1抗體分別包含SEQ ID NO：132及SEQ ID NO：134中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。
在某些實施例中，本發明之FGFR1抗體結合至FGFR1c之由胺基酸序列KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：143)或FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：144)組成之片段。
C. 實例性抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體
本發明進一步提供結合至KLB及FGFR1二者之雙特異性抗體(即，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)。雙特異性抗體具有兩種不同的結合特異性，例如參見美國專利第5,922,845號及第5,837,243號；Zeilder(1999)J.Immunol.163：1246-1252；Somasundaram(1999)Hum.Antibodies 9：47-54；Keler(1997)Cancer Res.57：4008-4014。舉例而言而非以限制方式，本揭示之標的物提供具有針對存在於KLB上之第一表位之一個結合位點(例如，抗原結合位點)及針對存在於FGFR1上的第二表位之第二結合位點之雙特異性抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明提供以下抗體：一個臂結合KLB並包含本文所闡述之任一抗KLB抗體序列，且第二臂結合至FGFR1且包含本文所闡述之任一抗FGFR1抗體序列。在某些實施例中，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體具有針對存在於KLB上之第一表位之一個結合位點及針對存在於FGFR1c上的第二表位之第二結合位點。
在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指調節KLB/FGFR1c複合物活性之抗體。舉例而言，雙特異性抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體可發揮激動劑之功能且活化KLB/FGFR1c複合物。在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係使KLB/FGFR1c複合物之活性增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或99.9%之抗體。在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性可係使KLB/FGFR1c複合物之下游靶(例如MAPK及/或ERK)磷酸化之抗體。
在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指調節KLB/FGFR1c複合物活性且不會阻斷天然FGF配體(例如FGF19及FGF21)與KLB/FGFR1c複合物之相互作用及/或結合的抗體。在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指 在KLB不存在下不會阻斷天然FGF配體與FGF受體之活性及/或結合的抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體並不阻斷天然FGF配體與FGFR1/KLA複合物及/或單獨FGFR1之相互作用。在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指在FGFR1不存在下不會阻斷天然FGF配體與KLB之活性及/或結合的抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體並不阻斷天然FGF配體與FGFR4/KLB複合物、FGFR2c/KLB複合物及/或FGFR3c/KLB複合物之相互作用。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)或其抗原結合部分包括重鏈區及輕鏈區。在某些實施例中，全長重鏈包括具有與示於SEQ ID NO：129中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，全長輕鏈包括具有與示於SEQ ID NO：131中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，全長重鏈包括具有示於SEQ ID NO：129中之序列之胺基酸。在某些實施例中，全長輕鏈包括具有示於SEQ ID NO：131中之序列之胺基酸。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)或其抗原結合部分包括重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：128中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，輕鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：130中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，重鏈可變區包括具有示於SEQ ID NO：128中之 序列之胺基酸。在某些實施例中，輕鏈可變區包括具有示於SEQ ID NO：130中之序列之胺基酸。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：1-15中之任一者、例如12或15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16-31中之任一者、例如28或31之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：32-47中之任一者、例如44或47之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：48-62中之任一者、例如49或62之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：63-78中之任一者、例如75或78之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：79-93中之任一者、例如90或93之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：28之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：44之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：49之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：75之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：90之HVR-L3。在某些實施例中，本發明提供抗KLB抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各項之HVR：(a)包含SEQ ID NO：15之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：31之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：47之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：62之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：93之HVR-L3。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)包括包含CDR1、CDR2及CDR3域之重鏈可變區以及包含CDR1、CDR2及CDR3域之輕鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區CDR1域包括具有示於SEQ ID NO：1-15中之序列之胺 基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區CDR2域包括具有示於SEQ ID NO：16-31中之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區CDR3域包括具有與SEQ ID NO：32-47至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區CDR1域包括具有與SEQ ID NO：48-62至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區CDR2域包括具有與SEQ ID NO：63-78至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區CDR3域包括具有與SEQ ID NO：79-93至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸序列。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)包括包含CDR1、CDR2及CDR3域之重鏈可變區以及包含CDR1、CDR2及CDR3域之輕鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區CDR1域包括具有示於SEQ ID NO：1-15中之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區CDR2域包括具有示於SEQ ID NO：16-31中之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈可變區CDR3域包括具有示於SEQ ID NO：32-47中之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區CDR1域包括具有示於SEQ ID NO：48-62中之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區CDR2域包括具有示於SEQ ID NO：63-78中之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈可變區CDR3域包括具有示於SEQ ID NO：79-93中之序列之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)包括重鏈可變區CDR1，其具有示於SEQ ID NO：15中之序列；重鏈可變區CDR2，其具有示於SEQ ID NO：31中之序列；重鏈可變區CDR3，其具有示於SEQ ID NO：47中之序列；輕鏈可變區CDR1，其具有示於SEQ ID NO：62中之序列；輕鏈可變區CDR2，其具有示於SEQ ID NO：78中之序列；及輕鏈可變區CDR3，其具有示於SEQ ID NO：93中之序列。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體包括第一抗體或其抗原結合部分，且包括第二抗體或其抗原結合部分，其中第一抗體或其抗原結合部分結合至存在於KLB上之表位，且第二抗體或其抗原結合部分結合至存在於FGFR1(例如FGFR1c)上之表位。舉例而言而非以限制方式，第一抗體或其抗原結合部分可包括重鏈可變區及輕鏈可變區；且第二抗體或其抗原結合部分可包括重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施例中，第一抗體或其抗原結合部分之重鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：128中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，第一抗體或其抗原結合部分之輕鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：130中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合部分之重鏈可變區包括具有與示於SEQ ID NO：132中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合部分之輕鏈可變區包括具有與闡釋於中SEQ ID NO：134之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列的胺基酸。
在某些實施例中，本文提供與抗KLB抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與抗KLB抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體，該抗 KLB抗體包含SEQ ID NO：128之VH序列及SEQ ID NO：130之VL序列。在某些實施例中，提供結合至KLB之由胺基酸序列SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS(SEQ ID NO：142)組成之片段的抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。
在某些實施例中，提供結合至KLB之具有與示於SEQ ID NO：142中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的片段之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。
在某些實施例中，本文提供與抗KLB抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與抗KLB抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體，該抗KLB抗體包含SEQ ID NO：129之全長重鏈序列及SEQ ID NO：131之全長輕鏈序列。
在某些實施例中，本發明提供與本文所提供之抗FGFR1抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與抗FGFR1抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體，該抗FGFR1抗體包含SEQ ID NO：132之VH序列及SEQ ID NO：134之VL序列。在某些實施例中，提供結合至FGFR1c之包含胺基酸序列KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：143)或FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：144)之片段的抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。
在某些實施例中，本發明提供與本文所提供之抗FGFR1抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與抗FGFR1抗體結合至相同表位之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體，該抗FGFR1抗體包含SEQ ID NO：133之重鏈序列及SEQ ID NO：135之輕鏈序列。
在某些實施例中，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體結合至FGFR1c之具有與示於SEQ ID NO：143中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的片段。
在某些實施例中，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體結合至FGFR1c之具有與示於SEQ ID NO：144中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的片段。
在某些實施例中，提供以下抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體：結合至KLB具有與示於SEQ ID NO：142中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的片段，且結合至FGFR1c之具有與示於SEQ ID NO：143或144中之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的片段。
在某些實施例中，提供以下抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體：結合至KLB之具有示於SEQ ID NO：142中之胺基酸序列之片段，且結合至FGFR1c之具有示於SEQ ID NO：143或144中之胺基酸序列之片段。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本發明抗體之解離常數(Kd)可為1M、100mM、10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。在某些實施例中，本發明抗體之Kd可為約10-3M或更低或10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M。
在某些實施例中，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體可包括Kd為約10nM至約10μM之抗FGFR1臂。在某些實施例中，具有較低親和力之FGFR1臂之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體可降低在KLB不存在下抗 KLB/抗FGFR1雙特異性抗體與FGFR1緊密結合之風險，且防止其他FGF配體(例如(但不限於)FGF1、FGF2、FGF8及FGF23)結合及/或活化FGFR1。在某些實施例中，具有較低親和力之FGFR1臂可允許存在較高量之抗FGFR1雜質，例如(但不限於)抗FGFR1半隆凸抗體、非共價抗FGFR1二聚體、共價抗FGFR1二聚體及高分子量物質，而不產生臨床上顯著之副作用。舉例而言，在某些實施例中，在製備本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體時可存在約2%高分子量物質及1.5%抗FGFR1半抗體，而不產生不利的生物效應。
在某些實施例中，Kd可藉由經放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測。在某些實施例中，RIA可使用所關注抗體之Fab形式及其抗原來實施。舉例而言且不以限制方式，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下方式來量測：在滴定系列之未經標記抗原存在下，利用最低濃度之(125I)經標記抗原平衡，然後利用抗Fab抗體塗覆之板捕獲所結合抗原(例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立該分析之條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕獲用抗Fab抗體(Cappel Labs)將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)塗覆過夜，且隨後在室溫下(約23℃)用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白封阻2小時至5小時。在非吸附性板(Nunc編號269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與所關注Fab之連續稀釋物混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997))中對抗VEGF抗體(Fab-12)之評價一致)。然後將所關注Fab培育過夜；然而，可繼續培育較長時段(例如，約65小時)以確保達到平衡。然後，將混合物轉移至捕獲板中以在室溫下進行培育(例如，持續1小時)。然後去除溶液且用PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)將板洗滌8次。在板已乾燥時，添加150μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上將板計數10分鐘。選擇獲得小於或 等於20%之最大結合之每一Fab的濃度用於競爭性結合分析。
在某些實施例中，Kd可使用BIACORE®表面電漿子共振分析來量測。舉例而言且不以限制方式，在25℃下使用固定抗原CM5晶片以約10個反應單位(RU)實施使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)之分析。在某些實施例中，根據供應商之說明書使用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，然後以5μl/分鐘之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以封阻未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速注射Fab於含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋物(0.78nM至500nM)。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算締合速率(k締合)及解離速率(k解離)。平衡解離常數(Kd)可計算為比率k解離/k締合。例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若經上文表面電漿子共振分析締合速率(on-rate)超過106M-1s-1，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術係在25℃下在遞增濃度之抗原存在下量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增加或減小，如在光譜儀中所量測，例如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本發明抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段以及下文所述之其 他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；以及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
在某些實施例中，本發明抗體可為雙價抗體。雙價抗體係可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
在某些實施例中，本發明抗體可為單一域抗體。單一域抗體係包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一域抗體係人類單一域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；參見，例如美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由多種技術來製備抗體片段，該等技術包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)來產生，如本文所闡述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本發明抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於例如美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在某些實例中，本發明之嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類 動物(例如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體可係類別或子類已自親代抗體發生變化之「類別轉換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，本發明之嵌合抗體可係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，衍生出HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步闡述於例如以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(闡述FR改組之「引導選擇」方式)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源自具有輕鏈或重鏈可變區之具體亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類 成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自篩選用FR文庫之框架區(例如，參見Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本發明抗體可係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生具有因應抗原性激發之人類可變區的完整人類抗體或完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座會替代內源免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已失活。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可進一步藉由例如與不同人類恆定區組合來修飾由該等動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York，1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述來自雜交瘤細胞系之單株人類IgM抗體之產生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma technology)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自源自人類之噬菌體展示文庫之Fv純系可變域序列來產生。然後，該等可變域序列可與期望之人類恆定域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5. 源自文庫之抗體
可藉由篩選組合文庫之具有期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及篩選該等文庫之具有期望結合特徵之抗體的各種方法。該等方法綜述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且進一步闡述於例如以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜且在噬菌體文庫中將其隨機重組，然後可篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol,12：433-455(1994)中所闡述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自免疫化來源之文庫可向免疫原提供高親和力抗體而無需構築雜交瘤。或者，可選殖天然譜(例如，自人類)以向各種無任何免疫之非自體抗原亦及自體抗原提供單一抗體源，如由Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所闡述。在某些實施例中，亦可藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區並在活體外實現重排，如由Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所闡述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
在本文中將自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本發明抗體可係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係具有針對至少兩個不同表位之結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對存在於KLB上之表位，且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對存在於FGFR1上之表位，且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗體可結合KLB上之表位，且可結合FGFR1上之表位。在某些實施例中，本發明之雙特異性 抗體可結合KLB上之表位，且可結合FGFR1c上之表位。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製備。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚體分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(例如，參見，Kostelny等人，J.Immunol,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙價抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所闡述。
本文亦包括經改造具有三個或更多個功能抗原結合位點之抗體，包括「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576A1)。
7. 抗體變體
本揭示之標的物進一步提供所揭示抗體之胺基酸序列變體。例如，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適宜修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(但不限於)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或***及/或取代。可實施缺失、***及取代之任一組合以獲得最終構築體，前提係最終構築體(即經修飾)具有期望特徵，例如抗原結合。
a)取代、***及缺失變體
在某些實施例中，抗體變體可具有一或多個胺基酸取代。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。保守取代之非限制性實例顯示於表1中之「較佳取代」標題下。其他實質性變化之非限制性實例提供於表1中之「實例性取代」標題下，且參照胺基酸側鏈類別進一步闡述於下文中。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)經保留/改良之抗原結合、降低的免疫原性或經改良之補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
可根據常見側鏈特性將胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。
在某些實施例中，非保守取代需要將該等類別中之一者之成員交換為另一類別。
在某些實施例中，一類取代型變體涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)中之一或多個超變區殘基。通常，經選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物學特性(例如，增加的親和力、降低的免疫原性)方面具有修飾(例如，改良)及/或實質上保留親代抗體之某些生物學特性。取代變體之非限制性實例係親和力成熟抗體，其可方便地(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所闡述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選具體生物學活性(例如結合親和力)。
在某些實施例中，可對HVR進行改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點」(即，由在體細胞成熟過程期間經受高頻率突變之密碼子編碼的殘基)(例如，參見Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或接觸抗原之殘基中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由構築二級文庫及自該等文庫重新選擇來達成親和性成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等 人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之某些實施例中，藉由多種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任一者將多樣性引入經選擇用於成熟之可變基因中。然後建立二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任何抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方式，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可特異性地鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。具體而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、***或缺失可發生於一或多個HVR內，只要該等變化不會實質上減小抗體結合抗原之能力即可。例如，可對HVR作出不會實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。該等改變可在例如接觸HVR中之殘基之抗原外部。在上文所提供變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085中所闡述。在此方法中，已鑑別出殘基或目標殘基群(例如，帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並由中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望特性。
胺基酸序列***包括胺基及/或羧基末端融合物(長度介於一個殘基至含有上百或更多個殘基之多肽範圍內)以及單個或多個胺基酸殘基之序列內***。末端***之實例包括具有N末端甲二磺醯殘基之抗 體。抗體分子之其他***變體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，用於ADEPT)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化變體
在某些實施例中，改變本發明抗體以增加或降低抗體發生糖基化之程度。抗體糖基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以產生或去除一或多個糖基化位點來方便地完成。
在某些實施例中，當抗體包含Fc區時，可改變其所附接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含通常藉由N鏈接附接至Fc區之CH2域的Asn297之具支鏈、二分枝寡糖。例如，參見Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二分枝寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在某些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良特性之抗體變體。
在某些實施例中，提供具有缺少附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變體。舉例而言，該抗體中岩藻糖之量可為約1%至約80%、約1%至約65%、約5%至約65%或約20%至約40%及其間之值。
在某些實施例中，藉由計算相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複合物、雜合體及高甘露糖結構)之總量的Asn297處糖鏈內岩藻糖之平均量來測定岩藻糖的量，如藉由MALDI-TOF質譜所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中大約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體中具有微小序列變化，故Asn297亦可位於位置297上游或下游之大約±3個胺基酸處，即介於位置294與位置300之間。該等岩藻糖基化變體可具有經改良之ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號 (Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。與「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏」抗體變體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。
去岩藻糖基化抗體可在缺乏蛋白質岩藻糖基化之任何細胞系中產生。細胞系之非限制性實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因敲除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
抗體變體進一步提供有二等分寡糖，例如其中附接至抗體Fc區之二分枝寡糖由GlcNAc二等分。該等抗體變體可具有降低的岩藻糖基化及/或經改良之ADCC功能。該等抗體變體之非限制性實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。該等抗體變體可具有經改良之CDC功能。該等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明提供具有一些(但非所有)效應物功能之抗體變體，此使其成為許多應用之合意候選者，在該等應用中抗體之活體內半衰期至關重要，但某些效應物功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺少FcγR結合能力(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。調介ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞上之表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)之第464頁表3中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可使用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(Cell Technology公司，Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用於該等分析之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如)在諸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示者等動物模型中評價所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來確認抗體不能結合C1q且因此缺少 CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知之方法來實施FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。在某些實施例中，可對Fc區作出改變，從而改變(即，改良或減小)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所闡述。
具有降低效應物功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297處經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有經改良或降低之FcR結合的某些抗體變體。例如，參見美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
在某些實施例中，本發明之抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代(例如，Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代)的Fc區。
在某些實施例中，對本文所揭示抗體(例如雙特異性抗體)之Fc區作出之改變可產生具有延長的半衰期及與新生Fc受體(FcRn)(其負責將母體IgG轉移至胎中)(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))經改良之結合的變體抗體，此闡 述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。該等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及與Fc區變體有關之其他實例之WO 94/29351。
d).經半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可能期望產生經半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基出現在抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處，且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物，如本文進一步闡述。在某些實施例中，下列殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。經半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所闡述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本發明抗體可經進一步修飾以含有業內已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。適用於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚 (n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而有利於製造。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生所用聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之具體特性或功能、抗體衍生物是否將用於定義條件下之療法等。
在某些實施例中，提供抗體及非蛋白性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射下來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。在某些實施例中，輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)以下波長：其不危害正常細胞，但將非蛋白性部分加熱至將毗鄰抗體-非蛋白性部分之細胞殺死的溫度。
D. 產生抗體之方法
本文所揭示之抗體可使用任何業內可獲得或已知之技術來產生。舉例而言但不以限制方式，抗體可使用重組方法及組合物來產生，例如如美國專利第4,816,567號中所闡述。產生抗體之詳細程序闡述於下文實例中。
本揭示之標的物進一步提供編碼本文所揭示抗體之經分離核酸。舉例而言，該經分離核酸可編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在某些實施例中，經分離核酸可包括編碼具有示於SEQ ID NO：128中之序列之重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列及/或編碼具有示於SEQ ID NO：130中之序列之輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列。
在某些實施例中，核酸可存在於一或多個載體(例如表現載體) 中。如本文所使用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。一類載體為「質體」，其係指其他DNA區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已引入其之宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至該宿主細胞之基因組中，並藉此隨宿主基因組一同複製。此外，某些載體、表現載體能夠引導與其可操作連接之基因的表現。一般而言，在重組DNA技術中可用之表現載體通常呈質體(載體)形式。然而，所揭示標的物意欲包括該等提供等效功能之其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
在某些實施例中，可將編碼本發明抗體之核酸及/或一或多個包括該核酸之載體引入宿主細胞中。在某些實施例中，可藉由業內已知之任何方法將核酸引入細胞中，該方法包括(但不限於)轉染、電穿孔、顯微注射、使用含有核酸序列之病毒或細菌噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導之基因轉移、微細胞介導之基因轉移、球形質體融合等。在某些實施例中，宿主細胞可包括例如已轉化有以下各項者：(1)載體，其包含編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及包括抗體之VH之胺基酸序列的核酸，或(2)第一載體，其包含編碼包括抗體之VL之胺基酸序列的核酸；及第二載體，其包含編碼包括抗體之VH之胺基酸序列的核酸。在某些實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。
在某些實施例中，製備抗KLB抗體或抗FGFR1c之方法可包括在適於表現抗體之條件下培養其中已引入編碼該抗體之核酸之宿主細胞，及視情況自宿主細胞及/或宿主細胞培養基回收抗體。在某些實 施例中，經由層析技術自宿主細胞回收抗體。
為重組產生本發明抗體，可例如如上文所闡述分離編碼抗體之核酸並將其***一或多個載體中以進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。該核酸可容易地使用習用程序分離及測序(例如，藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所闡述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其在無需糖基化及Fc效應物功能時產生。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，可自細菌細胞團以可溶部分形式分離出抗體且可進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦係用於編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「人類化」從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦可源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾細胞。
在某些實施例中，可使用植物細胞培養物作為宿主細胞。例 如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(其闡述產生轉基因植物中之抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
在某些實施例中，亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言而非以限制方式，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之非限制性實例係藉由SV40轉化之猴腎CV1細胞系(COS-7)；人類胎腎細胞系(293或293細胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所闡述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠支持細胞(TM4細胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所闡述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人，Annals NY.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所闡述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
在某些實施例中，用於製備雙特異性及/或多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、PCT專利申請案第WO 93/08829號及Traunecker等人，EMBOJ.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚體分子 之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J.Immunol,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙價抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所闡述。
本發明之雙特異性及多特異性分子亦可使用化學技術(例如，參見Kranz(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、「多瘤」技術(例如，參見美國專利4,474,893)或重組DNA技術來製備。本揭示標的物之雙特異性及多特異性分子亦可使用業內已知之方法且如本文所闡述藉由偶聯成份結合特異性(例如第一表位及第二表位結合特異性)來製備。舉例而言而非以限制方式，雙特異性及多特異性分子之每一結合特異性可單獨產生且然後彼此偶聯。當結合特異性係蛋白質或肽時，可使用多種偶合或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑之非限制性實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、丙酸N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)(例如，參見Karpovsky(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)第78期，118-132；Brennan(1985)Science 229：81-83)、Glennie(1987)J.Immunol.139：2367-2375)所闡述之彼等。當結合特異性係抗體(例如，兩種人類化抗體)時，其可經由硫氫基鍵結兩條重鏈之C末端鉸鏈區來偶聯。在某些實施例中，鉸鏈區可經修飾以在偶聯之前含有奇數個硫氫基殘基，例如一個。
在某些實施例中，雙特異性抗體之兩種結合特異性可在同一載體中進行編碼且在相同宿主細胞中進行表現及組裝。此方法尤其可用於雙特異性及多特異性分子係MAb×MAb、MAb×Fab、Fab×F(ab')2或配體×Fab融合蛋白時。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗體可係單鏈分子，例如單鏈雙特異性抗體、包含一種單鏈抗體及結合決定簇之單鏈雙特異性分子或包含兩種結合決定簇之單鏈雙特異性分子。雙特異性及多特異性分子亦可係單鏈分子或可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性及多特異性分子之方法闡述於例如美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號中。本文亦包括經改造具有三個或更多個功能抗原結合位點(例如，表位結合位點)之抗體，包括「章魚抗體」(例如，參見US 2006/0025576A1)。
本發明進一步提供三特異性(例如三功能)抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明之三特異性抗體可與存在於KLB上之表位、存在於FGFR1上之表位及存在於第三蛋白質上之表位或抗原結合及/或相互作用，第三蛋白質係例如(但不限於)PCSK9、GCGR、AdipoR、ZnT8、ApoL1、MSTN、InsR或FABP4。
在某些實施例中，可使用動物系統來產生本發明抗體。一種製備雜交瘤之動物系統係鼠類系統。小鼠中之雜交瘤產生係經充分建立之程序。用於分離融合用經免疫脾細胞之免疫方案及技術為業內已知。融合伴侶(例如，鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦為業內已知(例如，參見Harlow及Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor New York)。
E. 分析
可藉由業內已知及本文所提供之各種分析來鑑別本文所提供之本發明抗體，篩選或表徵其物理/化學特性及/或生物學活性。
1. 結合分析及其他分析
在某些實施例中，可藉由已知方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或西方墨點分析)來測試本發明抗體之抗原結合活性。該等分析中之每一者通常藉由採用特異性針對所關注複合物之經標記試劑(例如，抗體)來檢測尤其受關注之蛋白質-抗體複合物的存在。舉例而言，可使用例如識別且特異性結合至抗體-KLB複合物之酶聯抗體或抗體片段來檢測KLB-抗體複合物。或者，可使用多種其他免疫分析中之任一者來檢測該等複合物。舉例而言，抗體可經放射性標記且用於放射免疫分析(RIA)中(例如，參見Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,1986年3月，該文獻以引用方式併入本文中)。可藉助例如使用Geiger計數器或閃爍計數器或藉由放射自顯影來檢測放射性同位素。
在某些實施例中，可使用競爭分析來鑑別與本發明之抗KLB抗體(例如12A11或8C5)競爭結合KLB之抗體。在某些實施例中，此一競爭性抗體結合至藉由12A11或8C5結合之相同表位(例如線性或構象表位)。定位抗體所結合表位之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在競爭分析之非限制性實例，可在包含結合至KLB之第一經標記抗體(例如，12A11或8C5)及測試其與第一抗體競爭結合KLB之能力之第二未經標記抗體的溶液中培育固定KLB。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育固定KLB。在允許第一抗體與KLB結合之條件下培 育後，去除過量未結合抗體，並量測與固定KLB締合之標記的量。若與固定KLB締合之標記之量在測試樣品中相對於對照樣品實質上減少，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合KLB。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2. 活性分析
本發明提供用於鑑別其具有生物活性之抗KLB抗體之分析。生物活性可包括例如活化KLB/FGFR1c受體複合物。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。在某些實施例中，分析可包括使本發明抗體結合至細胞(例如表現KLB之293T細胞)，及分析KLB-FGFR1c受體複合物之一或多個下游靶(例如ERK)之活性及/或磷酸化狀態。在某些實施例中，分析可包括向個體(例如非人類動物)投與本發明抗體，及分析抗體對個體之葡萄糖含量之效應。
F. 免疫偶聯物
本揭示之標的物進一步提供包含本文所揭示偶聯至一或多種細胞毒性劑之抗體的免疫偶聯物，該等細胞毒性劑係例如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。舉例而言，所揭示標的物之抗體或抗原結合部分可在功能上連接(例如，藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物。
在某些實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體係偶聯至一或多種藥物，該等藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235)；奧裡斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裡斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第 5,780,588號以及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環抗生素，例如道諾黴素或多柔比星(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲喋呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及歐他紫杉烷(ortataxel)；單端孢黴烯；及CC1065。
在某些實施例中，免疫偶聯物包含如本文所闡述與酶促活性毒素或其片段偶聯之抗體，該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。
在某些實施例中，免疫偶聯物包含如本文所闡述偶聯至放射性 原子以形成放射性偶聯物之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。非限制性實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在使用放射性偶聯物進行檢測時，其可包括用於閃爍法研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(同上)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所闡述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰酸根合苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑。參見WO94/11026。連接體可係促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接體」。例如，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫偶聯物或ADC明確地涵蓋(但不限於)使用包括(但不限於)以下交聯劑試劑製備之該等偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基- MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑皆可自市面購得(例如，可購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。
III.使用方法
本揭示之標的物進一步提供使用所揭示抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體之方法。在某些實施例中，該等方法係關於本揭示抗體之治療用途。在某些實施例中，該等方法係關於在診斷方法中使用所揭示抗體。
A. 診斷及檢測方法
在某些實施例中，本文所揭示具有針對KLB之特異性之抗體(例如上文所揭示之抗KLB抗體及/或抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)可用於檢測生物樣品中KLB之存在。在另一態樣中，本揭示之標的物提供使用本文所揭示之抗KLB抗體或抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體診斷及/或檢測疾病之方法。如本文所使用之術語「檢測」涵蓋定量及/或定性檢測。
在某些非限制性實施例中，生物樣品包括(但不限於)臨床樣品、一或多種細胞、培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶解物及組織樣品。樣品之來源可係固體組織(例如，來自新鮮、冷凍及/或存儲器官、組織樣品、生檢或抽吸物)或來自個體之細胞。在某些實施例中，生物樣品可包括一或多種來自肝(例如個體之肝)之細胞及/或組織。
在某些實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗KLB抗體。在另一態樣中，提供檢測生物樣品中KLB之存在之方法。在某些實施例中，診斷或檢測之方法包括在允許抗體與KLB結合之條件下使生物樣品與如本文所闡述結合存在於KLB上之表位的抗體接觸，及檢測在抗體與KLB之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法，例 如免疫螢光或西方墨點。在某些實施例中，使用抗KLB抗體來選擇適於使用抗KLB抗體之療法的個體，例如其中KLB係用於選擇患者之生物標記物。
在某些實施例中，用於所揭示方法之本發明抗體(例如抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)對肝(例如肝功能)並無顯著影響。在某些實施例中，與肝中FGF21蛋白對FGFR/KLB受體複合物之調節相比，本發明抗體並不調節肝中FGFR/KLB受體複合物之活性。在某些實施例中，本發明抗體並不抑制FGFR4/KLB複合物及/或不增加肝酶，例如(但不限於)ALT、AST、ALP及GLDH。在某些實施例中，本發明抗體並不發揮肝中FGFR2c/KLB複合物及/或FGFR3c/KLB複合物之激動劑之功能，此可活化肝中之MAPK信號傳導及/或改變Spry4及Dusp6之表現。在某些實施例中，與FGF21蛋白對MAPK信號傳導之活化相比，本發明抗體並不活化肝中之MAPK信號傳導。在某些實施例中，本發明抗體並不發揮肝中FGFR4/KLB複合物之激動劑之功能。
在某些實施例中，用於所揭示方法中之本發明抗體(例如抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)包括不會阻斷FGF配體(例如FGF19及FGF21)與KLB/FGFR1c複合物之結合及/或相互作用的抗體。在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指調節KLB/FGFR1c複合物活性且不會阻斷天然FGF配體(例如FGF19及FGF21)與KLB/FGFR1c複合物之相互作用及/或結合的抗體。在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指在KLB不存在下不會阻斷天然FGF配體與FGF受體之結合及/或活性之抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體並不阻斷天然FGF配體與FGFR1/KLA複合物或單獨FGFR1之相互作用。在某些實施例中，本文所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體係指在FGFR1不存在下不會阻斷天然FGF配體與KLB之結合及/或活性之抗 體。舉例而言而非以限制方式，本發明之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體並不阻斷天然FGF配體與FGFR4/KLB複合物、FGFR2c/KLB複合物及/或FGFR3c/KLB複合物之相互作用。
在某些實施例中，可對用於所揭示方法中之抗KLB抗體、抗FGFR1c及/或抗KLB/抗FGFR1(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)進行標記。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。標記之非限制性實例包括放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹醯、傘形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(參見美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶合)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、細菌噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。
B. 治療方法
在某些實施例中，可使用本揭示標的物之一或多種抗體來治療個體之疾病及/或病症。舉例而言但不以限制方式，疾病可為代謝病症。代謝病症之非限制性實例包括多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。在某些實施例中，代謝病症係2型糖尿病。
在某些實施例中，可使用本揭示標的物之一或多種抗體來治療巴比二氏症候群、普威二氏症候群、阿姆斯壯氏症候群、科漢氏症候群、奧爾布賴特氏遺傳性骨失養症(假副甲狀腺低能症)、卡彭特症候群、MOMO症候群、魯塔二氏症候群、X染色體易裂症候群及波-弗-萊症候群。在某些實施例中，可使用本揭示標的物之一或多種抗體來治療老化及相關疾病，例如阿茲海默氏病、帕金森氏病及ALS。
在某些實施例中，可使用本揭示標的物之一或多種抗體來治療心臟病、中風、心臟病發作、高胰島素血症、高血壓、冠狀動脈疾病、與肥胖症或顱高血壓直接相關之偏頭痛或頭痛、鬱血性心臟衰竭、贅瘤形成、異常血脂症、貧血、膽囊疾病、骨關節炎、退行性關節炎、退行性椎間盤、退行性關節疾病、關節置換、加速退行性關節疾病、氣喘、反覆性肺炎、反覆性胸膜炎、反覆性支氣管炎、肺受限、胃食道逆流(gerd)、面部及身體體毛過多(多毛症)、皮疹、慢性皮膚感染、多汗、頻繁酵母菌感染、壓力性尿失禁、月經不調、激素異常、多囊卵巢、不育症、癌瘤(例如乳癌、結腸癌及子宮癌)、睡眠呼吸暫停、腦假瘤、抑鬱症、心理/性功能障礙、社會歧視及過早死亡。
在某些實施例中，本發明提供用於治療方法中之抗體。舉例而言而非以限制方式，本發明提供用於治療患有以下疾病之個體之方法中的抗體(例如抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)：代謝病症(例如PCOS、MetS、肥胖症、NASH、NAFLD、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、LAD、MODY)以及老化及相關疾病(例如阿茲海默氏病、帕金森氏病及ALS)，該方法包括向個體投與有效量之本文所揭示抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有上述疾病或病症之個體之方法中的抗體(例如抗KLB/FGFR1雙特異性抗體)，該方法包括向個體投與有效量之該抗體。
在某些實施例中，該方法可進一步包括向個體投與有效量之至少一種其他治療劑。其他治療劑(例如第二治療劑)之非限制性實例闡述於下文中。
如在本文中可互換使用之「個體(individual)」、「患者」或「個體(subject)」係指哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual或subject)係人類。
本揭示之標的物進一步提供抗體(例如抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)，其用於活化例如個體之KLB/FGFR1c共受體複合物。舉例而言而非以限制方式，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體可係抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體。在某些實施例中，本發明提供抗體(例如抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)，其用於活化個體之KLB/FGFR1c共受體複合物之方法中。在某些實施例中，該方法包括向個體投與有效量之抗體來活化KLB/FGFR1c受體複合物。
本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言而非以限制方式，本發明抗體可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，第二/其他治療劑可包括抗糖尿病劑、抗肥胖劑或用於代謝病況之藥劑，例如(但不限於)抗高血壓藥劑及史他汀(statin)。第二/其他治療劑之非限制性實例包括二甲雙胍、吡格列酮(pioglitazone)、DPP4i、GLP1-類似物、磺醯脲、胰島素、瘦素類似物及氯卡色林(lorcaserin)(例如，Belviq®)。
本發明進一步提供抗體(例如抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體之用途，其用於製造或製備藥劑。在某些實施例中，藥劑係用於治療代謝病症，如上文所揭示。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如例如上文所闡述。在某些實施例 中，藥劑係用於活化KLB/FGFR1c共受體複合物。在某些實施例中，藥劑可用於活化個體之KLB/FGFR1c共受體複合物之方法中，該方法包含向個體投與一定量之藥劑以有效地活化KLB/FGFR1c受體複合物。
在某些實施例中，用於所揭示治療方法中之抗體可存在於醫藥組合物中。在某些實施例中，醫藥組合物可包括醫藥上可接受之載劑。在某些實施例中，醫藥組合物可包括一或多種本發明抗體。
另外或或者，醫藥組合物可包括第二治療劑。當一或多種所揭示抗體係與另一治療劑一起投與時，一或多種抗體及另一治療劑可按順序或同時投與。上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或單獨調配物中)及單獨投與(在此情形下，可在投與其他治療劑之前、同時及/或之後投與本發明抗體)。在一個實施例中，本發明抗體之投與及另一治療劑之投與彼此可在約一個月內、或約一週、兩週或三週內、或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。
本發明抗體(及任一其他治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內、以及(若需要用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑(例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射)給藥，此部分端視投與係簡短抑或慢性而定。本文涵蓋多種給藥方案，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本發明抗體應以符合良好醫療實踐之方式調配、投用及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個體患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。抗體不需要(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他 藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所論述之其他因素而定。該等藥劑通常係以相同劑量及如本文所述之投與途徑來使用，或以本文所述劑量之約1%至99%來使用，或以憑經驗/臨床確定適宜之任一劑量及任一途徑來使用。
對疾病之預防或治療而言，本發明抗體之適宜劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將端視欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。在某些實施例中，可視需要進行投與本發明抗體。在某些實施例中，可向患者一次性或在一系列治療內投與該抗體。舉例而言但不以限制方式，可向個體投與抗體及/或含有如本文所揭示抗體之醫藥調配物每天兩次、每天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次或每年一次。
在某些實施例中，端視疾病之類型及嚴重度，不論(例如)係藉由一或多次單獨投與抑或藉由連續輸注來投與，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體可係投與患者之初始候選劑量。端視上文所提及之因素，一種典型日劑量可介於約1μg/kg至100mg/kg或更高範圍內。在某些實施例中，日劑量可大於約100mg/kg。在某些實施例中，劑量可經調節以達成1-1000μg/ml之血漿抗體濃度且在一些方法中25-300μg/ml。
對於經若干天或更長時間重複投與時，端視病況，治療通常可持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一實例性劑量將介於約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。在某些實施例中，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中之一或多個劑量(或 其任一組合)。或者，抗體可以持續釋放調配物來投與，在該情形下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率可基於患者中抗體之半衰期而變化。在某些實施例中，該等劑量可間歇性投與，例如每週或每三週(例如，使得患者接受約兩次至約20次或(例如)約6次劑量之抗體)。可投與初始較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。
在某些實施例中，該方法可進一步包括監測個體及測定治療之有效性。舉例而言，此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。
Ⅳ. 醫藥調配物
本揭示之標的物進一步提供含有一或多種如本文所闡述之抗體與醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。在某些實施例中，醫藥組合物可包括本揭示標的物之多種(例如，兩種或更多種)抗體及/或其抗原結合部分之組合。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物可包括一或多種抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體。
在某些實施例中，所揭示之醫藥調配物可藉由組合具有期望純度之抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾調配物或水溶液形式製備。舉例而言但不以限制方式，凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。在某些實施例中，水性抗體調配物可包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及第WO2006/044908號中者，後一些調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。在某些實施例中，抗體之純度可大於約80%、大於約90%、大於約91%、大於約92%、大於約93%、大於約94%、大於約95%、大於約96%、大於約97%、大於約98%、大於約99%、大於約99.1%、大於約99.2%、大於約99.3%、大於約99.4%、大於約99.5%、大於約99.6%、大於約99.7%、大於約99.8%或大於約99.9%。
醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；氯化苄烷銨；氯化苄甲乙氧銨；酚、丁基醇或苄基醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺多糖酶(例如軟骨素酶)組合。
載劑可適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。端視投與途徑，可將活性化合物(即抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體)包覆於材料中，以保護化合物免於酸及可使化合物失活之其他天然條件的作用。
本發明之醫藥組合物亦可以組合療法、即與其他藥劑組合投與。在某些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物亦可含有一種以上視需要用於所治療之具體適應症之活性成份，例如彼此不會產生不利影 響之具有補充活性之彼等。在某些實施例中，醫藥配方可包括用於治療與第一治療劑所治療相同之疾病之第二活性成份。該等活性成份適宜地以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。舉例而言而非以限制方式，本發明調配物亦可含有一種以上視需要用於所治療之具體適應症之活性成份，較佳彼此不會產生不利影響之具有互補活性之彼等。舉例而言，可期望至進一步提供可用於治療同一疾病之第二治療劑。該等活性成份適宜地以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。
本發明組合物可藉由多種業內已知之方法來投與。投與途徑及/或模式端視期望結果而變化。活性化合物可利用保護該化合物免於快速釋放之載劑製備，該等載劑係例如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封遞送系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。許多用於製備該等調配物之方法闡述於例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York,1978中。在某些實施例中，醫藥組合物係在美國食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration)之良好製造實踐(GMP)條件下製造。
亦可製備含有所揭示抗體之持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固態疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物件形式，例如膜或微膠囊。在某些實施例中，活性成份可分別裝入例如藉由凝聚技術或界面聚合製備之微膠囊(例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗滴乳液(macroemulsions)中。該等技術揭示於Remington's Pharma-ceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
為藉由某些投與途徑投與本發明抗體，可能需要用某種材料塗 覆該化合物或與該化合物一起共投與以防止其不活化。舉例而言，可將化合物在適宜載劑(例如脂質體或稀釋劑)中投與個體。醫藥上可接受之稀釋劑包括鹽水及水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水型CGF乳液以及習用脂質體(Strejan等人，(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用為業內已知。除任何與活性化合物不相容之習用介質或藥劑以外，涵蓋其於本發明醫藥組合物中之用途。該等組合物中亦可納入補充之活性化合物。
通常，治療組合物必須無菌、實質上等滲且在製造及儲存條件下穩定。可將該組合物調配成溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。載劑可為溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)，及其適宜混合物。可例如藉由使用塗層(例如卵磷脂)、在分散液情形下藉由維持所需粒徑，及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情形下，較佳於組合物中包括等滲劑(例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)。可藉由組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來延長可注射組合物之吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下步驟來製備：將所需量之一或多種所揭示抗體納入含有上文所列舉成份中之一者或組合(視需要)之適宜溶劑中，然後進行無菌微濾，例如經由無菌過濾膜過濾。通常，藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自彼等上文所列舉者之所需其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌粉末來製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其可自預先經無菌過濾之溶液產生由活性成份加上任一其他期望成份構成之粉末。
治療組合物亦可與業內已知之醫療器件一起投與。舉例而言，本發明之治療組合物可使用無針皮下注射器件來投與，該等器件例如係例如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之器件。可用於本發明中之植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示用於以可控速率分配藥劑之可植入微輸注幫浦；美國專利第4,486,194號，其揭示用於經由皮膚投與藥劑之治療器件；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送藥劑之藥劑輸注幫浦；美國專利第4,447,224號，其揭示用於持續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多室隔室之滲透藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物遞送系統。已知許多其他該等植入物、遞送系統及模組。
對於治療組合物，本發明調配物包括彼等適於經口、經鼻、局部(包括經頰及舌下)、經直腸、經***及/或非經腸投與者。調配物可方便地存於單位劑型中且可藉由製藥領域中已知之任何方法來製備。可與載劑材料組合產生單一劑型之抗體的量將端視所治療之個體及具體投與模式而變化。可與載劑材料組合產生單一劑型之抗體之量通常可係產生治療效應之組合物之量。一般而言，以100%計，此量介於約0.01%至約99%活性成份、約0.1%至約70%、約1%至約30%範圍內。
用於局部或經皮投與本發明組合物之劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、洗液、凝膠、溶液、貼片及吸入劑。活性化合物可在無菌條件下與醫藥上可接受之載劑及與可能需要之任何防腐劑、緩衝液或推進劑混合。
片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」意指除經腸及局部投與外通常藉由注射之投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌 內、動脈內、鞘內、莢膜內、眶內、心內、真皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
該等醫藥組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序(參見上文)及藉由納入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者來確保防止微生物存在。亦可期望將等滲劑(例如糖、氯化鈉及諸如此類)納入該等組合物中。另外，可藉由納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射醫藥形式之吸收。
在某些實施例中，當本發明抗體係以醫藥形式投與人類及動物時，其可單獨給予或以含有例如約0.01%至約99.5%(或約0.1至約90%)之本文所述抗體與醫藥上可接受之載劑的組合之醫藥組合物形式給予。
V. 製品
本揭示之標的物進一步係關於含有可用於治療，預防及/或診斷上述病症之材料之製品。
在某些實施例中，該製品包括容器及位於該容器上或與該容器締合之標記或包裝插頁。適宜容器之非限制性實例包括瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。該容器可容納自身或與另一組合物組合時可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。
在某些實施例中，組合物中之至少一種活性劑係本揭示標的物之抗體。標記或包裝插頁可指示該組合物用於治療所選病況。
在某些實施例中，該製品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)含有組合物之第二容器，其中該 組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。在某些實施例中，製品可進一步包含指示組合物可醫藥治療具體病況之包裝插頁。
或者或此外，製品可另外係另一容器，例如第二或第三容器，其包括醫藥上可接受之緩衝液，例如(但不限於)抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。該製品可包括自商業及用戶角度考慮需要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
以下實例僅用於說明本揭示之標的物且不應解釋為以任何方式進行限制。
實例 實例1：抗FGFR1激動劑抗體之表徵
三種噬菌體源性抗FGFR1抗體YW182.2(在本文中亦稱為「R1MAb1」)、YW182.3(在本文中亦稱為「R1MAb2」)及YW182.5(在本文中亦稱為「R1MAb3」)先前已經闡述(WO 2012/158704，其以引用方式併入本文中))。在小鼠中，三種抗體中之每一者皆起強效FGFR1選擇性激動劑作用且展現胰島素敏化特性。
為進一步理解此激動活性，測試該等抗體之Fab片段激動FGFR1c之能力。在達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)+10%胎牛血清(FBS)中培養HEK293細胞，且使用FuGENE® HD轉染試劑(Roche)使用表現載體進行瞬時轉染，該等表現載體編碼海腎螢光素酶(pRL-SV40,Promega)、FGFR1c、轉錄活化劑(pFA2-Elk1或pFA2-CREB,Stratagene)及藉由GAL4結合位點驅動之螢火蟲螢光素酶報導基因(pFR-luc,Stratagene)。第二天，在無血清培養基中將經轉染細胞再培養6-8h，且在遞增濃度下測試YW182.5 IgG以及YW182.2、YW182.3及YW182.5中之每一者。使用Dual-Glo®螢光素酶分析系統(Promega)及EnVision®多標記讀數器(PerkinElmer)測 定細胞螢光素酶活性。將螢火蟲螢光素酶活性正規化至共表現海腎螢光素酶活性。令人驚訝的是，YW182.2 Fab而非YW182.3 Fab或YW182.5 Fab展現激動活性(圖1A)。
測定YW182.2及YW182.3對FGFR1b及FGFR1c之親和力，以評價抗FGFR1抗體之親和力差異是否解釋激動活性中所觀察到之差異。如具有以下修改之Liang等人，J.Mol.Biol.366(3)：815-29(2007)中所闡述，使用BIAcore® T100儀器實施Fab對FGFR1b或FGFR1c之結合親和力。首先，遵循製造商所闡述之程序利用直接偶合至游離胺基，將小鼠抗人類Fc抗體塗覆於BIAcore羧甲基化葡聚糖M5晶片上。然後在CM5生物感測器晶片上捕獲YW182.2或YW182.3，以達成約200個反應單位(RU)。使用由10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、0.005%表面活性劑P20(HBS-P緩衝液)構成之運行緩衝液實施結合量測。在25℃下以30μL/分鐘之流速以HBS P緩衝液中之1.5-50nM之範圍注射FGFR1c ECD-His蛋白之2倍稀釋系列。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIAcore評估軟體3.2版)計算締合速率(K締合，每mol/s)及解離速率(K解離，每s)。平衡解離常數(Kd，每mol)計算為k解離/k締合之比率。觀察到YW182.2及YW182.3之親和力極其相似，此指示親和力無法解釋兩種抗體之激動活性之間的差異(圖2A)。
為探究YW182.2 Fab而非YW182.3 Fab對FGFR1活化之差異的基礎，進一步表徵YW182.2與具有高親和力之YW182.3之比較以及與較低親和力抗FGFR1抗體YW182.5之比較。YW182.2及YW182.3二者與YW182.5競爭結合FGFR1細胞外域(ECD)，此指示所有3種抗體皆識別FGFR1之重疊區域。然而，YW182.5之相對親和力顯著弱於(IC50>30倍)YW182.2及YW182.3之相對親和力(圖1B)。在L6及HEK293細胞中使用基於GAL-ELK1(ETS樣轉錄因子1)之螢光素酶分析測試YW182.5特異性激動FGFR1之能力。對於螢光素酶分析，使用FuGENE HD轉 染試劑(Promega)使用表現載體瞬時轉染HEK293T或大鼠L6細胞，該等表現載體編碼CMV啟動子下之適宜受體、海腎螢光素酶(pRL-SV40,Promega)、GAL-ELK1轉錄活化劑融合物(pFA2-ELK1,Agilent)及由GAL4結合位點驅動之螢火蟲螢光素酶報導基因(pFR-luc,Agilent)。第二天，在含有不同濃度之適宜蛋白質配體之基於無血清DMEM之培養基中將經轉染細胞再培養6-8小時。使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)及EnVision多標記讀數器(PerkinElmer)測定細胞螢光素酶活性。將螢火蟲螢光素酶活性正規化至共表現之海腎螢光素酶活性，且顯示為平均值±SEM。與YW182.2及YW182.3一樣，YW182.5藉由ELISA顯示特異性結合至FGFR1(圖2B)，在基於GAL-ELK1(ETS樣轉錄因子1)之螢光素酶分析中在L6細胞(圖2C)及HEK293細胞(圖2D)中起FGFR1之特異性激動劑作用。
在糖尿病小鼠模型中亦測試YW182.5對血糖含量之效應。小鼠係購自Jackson Laboratory，且維持在無病原體之動物設施中在21℃下在標準12h光照/12h黑暗循環中，且隨意獲取飼料(LabDiet® 5010)及水，在C57BLKS/J背景下之db/db小鼠為雌性且其他小鼠皆為雄性。對於高脂肪膳食飼餵，使用高脂肪、高碳水化合物膳食(Harlan Teklad TD.03584,58.4%熱量來自脂肪)。藉由Cobas Integra® 400化學分析儀(Roche)測定血清無機磷酸鹽及鈣含量。藉由ELISA(Immutopics)測定血清FGF23含量。藉由Contour®葡萄糖計(Bayer)測定血糖含量。對於肝脂質分析，使用甘油三酯量化套組(MBL International)。藉由比色分析測定血清總膽固醇、甘油三酯、β-羥基丁酸酯(Thermo DMA)及游離脂肪酸(Roche)。使用ELISA來測定血清胰島素含量(Crystal Chem)、血清FGF23(Immutopics)、血清小鼠HMW脂聯素(Alpco)及血清猴HMW脂聯素(R&D systems)。藉由放射免疫分析(Vanderbilt Hormone Assay & Analytical Services Core)量測 皮質酮。
用於注射之所有小鼠皆為約2-4個月，但缺乏klb之小鼠除外，其在某些實驗中以7-8個月使用。以與YW182.2及YW182.3類似之方式，當注射至糖尿病ob/ob小鼠中時YW182.5使血糖含量正規化(圖2E)。
實例2：抗FGFR1抗體之表位定位
FGFR1 ECD係由三個Ig樣域(稱為D1至D3)組成。兩個非重疊肽(P26：KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：143)及P28：FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：144)皆存在於FGFR1之D2域內，且先前經鑑別結合至YW182.2及YW182.3二者(圖1C)(WO2012/158704，其以引用方式併入本文中)。為鑑別該等肽中之哪些殘基最能負責抗體結合，使在所鑑別表位區域內具有多個丙胺酸取代之全長FGFR1蛋白在HEK293細胞中表現，且藉由西方墨點測試抗體結合。如圖1D中所顯示，K175、K177、Y205、R208中之丙胺酸取代消除YW182.2及YW182.5之結合，但不影響表現，如藉由針對D1域(抗D1)之抗FGFR1所探測。R208A而非K175、K177或Y205取代阻止YW182.3之結合。
使用上文所闡述之GAL-ELK1分析測試活體內抗體活化FGFR1之丙胺酸取代突變體之能力。發現活化與該等突變體與每一抗FGFR1抗體之結合特性密切相關(圖1E)。該等結果表明，D2域內胺基酸之類似集合為YW182.2及YW182.5結合所必需，但具有不同親和力，而同一區域中胺基酸之不同集合對YW182.3結合至關重要。先前已闡述2：2FGFR ECD/FGF複合物之晶體結構(Plotnikov等人，Cell 98(5)：641-50(1999))。在2：2同二聚體FGFR1c ECD/FGF2結構中，一個D2域與另一個D2域相互作用，且每一FGF2皆結合至兩側之兩個D2域以穩定D2二聚體(圖1F)。在該等結構中，對YW182.2及YW182.5結合至關重要之丙胺酸取代(K175、K177、Y205及R208)位於D2二聚體內部。由於YW182.2 Fab起激動劑作用，故此表明YW182.2 Fab可同時結合至兩 側之兩個D2域以穩定D2二聚體，從而基本上起FGF配體之分子模擬物作用。基於丙胺酸取代分析，YW182.5 Fab可以類似方式結合，只是親和力比YW182.2 Fab低得多。
實例3：抗KLB抗體之分離及表徵
使用穩定表現hFGFR1c及hKLB蛋白之HEK293細胞對Balb/c小鼠實施免疫。12週後收穫脾且產生雜交瘤。藉由FACS分析使用用於免疫之HEK293細胞鑑別產生雜交瘤之抗hKLB抗體。簡言之，使用經稀釋之雜交瘤上清液對表現單獨hKLB、單獨hFGFR1或二者之293細胞進行染色，且PE偶聯之山羊抗小鼠IgG抗體(Jackson Labs)係FACS緩衝液(0.5% BSA於PBS中)。使用同一FACS緩衝液來洗滌經染色細胞。藉由FACScan(Becton Dickinson)及FlowJo FACS分析軟體(Tree Star)分析經染色細胞。將編碼IgG重鏈及輕鏈之cDNA選殖至表現載體中。所有重組單株抗體分子皆係在經瞬時轉染之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生且使用習用管柱層析進行純化。
鑑別產生抗KLB抗體之約20種不同雜交瘤。該等抗KLB抗體中之16者以及8C5之輕鏈序列顯示於圖3A中(11F1、6D12、11D4、8E1、46C3、8H7、21H3、25F7、14E6、14C6、24A1、5F8、6C1、12A1、12B8、14C10及8C5；分別為SEQ ID NO：111-127)。該等抗KLB抗體中之16者以及8C5之重鏈序列顯示於圖3B中(11F1、6D12、11D4、8E1、46C3、8H7、21H3、25F7、14E6、14C6、24A1、5F8、6C1、12A1、12B8、14C10及8C5；分別為SEQ ID NO：94-110))。該等抗體之CDR序列顯示於表2及3中。
基於在FACS圖中在抗體與表現hKLB之293細胞之0.8μg/ml量測結合下觀察到之中值位移，對大部分雜交瘤源性抗KLB抗體之以及一種噬菌體源性抗體(稱為Ph#5，其係使用重組hKLB-ECD-HIS蛋白(R&D Systems)藉由噬菌體淘選來獲得)分級(圖4)。一些抗體亦係藉由 ELISA進行分級。對於該等實驗，使用為具有鼠類可變區及hIgG1恆定區之嵌合重組IgG之抗KLB抗體來量測與hKLB-ECD-HIS蛋白之結合。所測試抗體之相對結合類似，只是14E6在ELISA條件下之結合似乎優於在FACS分析之結合(圖5)。
實例4：抗KLB抗體之KLB結合
為測試不同抗KLB抗體之間之競爭，使用ELISA。在一些實驗中，使用EZ連接之NHS-PEO固相生物素化套組(Pierce)對自對應於6D12、8C5及11F1之雜交瘤上清液純化之IgG抗體實施生物素化。在不同濃度之雜交瘤源性抗KLB存在下使用HRP偶聯之抗生蛋白鏈菌素測試與KLB-ECD-HIS蛋白之結合。在一些實驗中，在不同濃度之雜交瘤源性抗KLB存在下使用HRP偶聯之抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch公司)測試重組人類IgG與KLB-ECD-HIS蛋白之結合。觀察到11F1、11D4、8E1及46C3皆不與6D12競爭結合(其他未針對6D12進行測試)。抗KLB抗體14E6及12A11與8C5競爭結合，但11D4及14C10不與8C5競爭結合(其他未針對8C5進行測試)，且11D4與11F1競爭結合，但6D12,8E1及46C3不與11F1競爭結合(其他未針對11F1進行測試)。
實例5：抗KLB抗體之跨物種交叉反應性
使用選殖至瞬時轉染至HEK293T細胞中之pRK哺乳動物表現載體中的來自小鼠、大鼠、兔、食蟹猴及恒河猴之KLB cDNA藉由FACS分析來分析所揭示抗KLB抗體之物種交叉反應性。所表現KLB細胞外域多肽序列如下：
小鼠：
(SEQ ID NO：158)
大鼠(+N-ter FLAG)：
(SEQ ID NO：147)
兔(+N-ter FLAG)：
(SEQ ID NO：148)
食蟹猴(+N-ter FLAG)：
(SEQ ID NO：149)
恒河猴(+N-ter FLAG)：
(SEQ ID NO：150)
如表4中所顯示，發現大部分抗體(例如6D12、11D4及8E1)結合至兔、食蟹猴及恒河猴之KLB，且發現約一半的抗KLB抗體(例如8C5、14E6及14C6)結合至小鼠及大鼠KLB。
實例6：抗KLB抗體之表位定位
為確定抗KLB抗體是否不結合人類α-Klotho(hKLA)之細胞外域(ECD)，使用具有以下序列之構築體。
所表現之所預測多肽序列(具有C末端(細胞內)FLAG)：
(SEQ ID NO：151)。
KLA及KLB二者皆具有兩個糖苷酶樣域、一個N末端及一個C末端。為鑑別KLB抗KLB抗體所識別之區域，將hKLB、hKLA及包含hKLA N末端糖苷酶樣域及hKLB C末端糖苷酶樣域之嵌合構築體選殖至pCMV-標籤4A哺乳動物表現載體(Agilent)中。hKLA及hKLB之N及C末端域分別對應於SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：145之序列，如表5中所顯示。基於兩種蛋白質之間之序列同源性，將hKLA及hKLB之N末端域分為5個區段，且將C末端域分為5個區段。
使用本發明抗體實施FACS分析，且觀察到約一半的抗體識別hKLB之N末端糖苷酶樣域，而其他抗體識別C末端糖苷酶樣域(表6)。如表6中所顯示，兩種識別hKLB之N末端域之抗體結合至包含區段1之域部分，而其他抗體僅需要區段2-5來結合。
實例7：特異性活化FGFR1c/KLB複合物之雙特異性抗體之鑑別
基於R1MAb活化作為Fab之FGFR1之能力，產生將較低親和力R1MAb之系鏈納入較高親和力抗KLB抗體之分子以產生抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(圖6A；WO2012/158704)。在不受限於具體理論的情況下，提出FGF21介導之活化係經由將FGF21招募至FGFR1c/KLB複合物經由C末端KLB結合尾起作用，同時針對FGFR特異性之決定簇駐留於N末端區域中，其可能經由低親和力相互作用結合至FGFR(圖6B)(Yie等人，FEBS Lett.583(1)：19-24(2009))。因此，將親和力降低之R1MAb1系鏈至高親和力抗KLB Ab作為雙特異性抗體可產生KLB依賴性FGFR1激動劑。在不受限於具體理論的情況下，包括具有較低親和力之FGFR1臂之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體可降低在KLB不存在下抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體與FGFR1緊密結合之風險，且防止其他FGF配體(例如，FGF1、FGF2、FGF8及FGF23)結合及/或活化FGFR1。另外，具有較低親和力之FGFR1臂可允許存在較高量之抗FGFR1雜質，例如(但不限於)抗FGFR1半隆凸抗體、非共價抗FGFR1二聚體、共價抗FGFR1二聚體及高分子量物質，而不產生臨床上顯著之副作用。
如本文所使用，bFKB1通常係指本文所揭示之若干抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體中之任一者。關於圖中所揭示之特異性抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體之細節闡述於下文中。使用四種編碼抗FGFR1(YW182.2(R1MAb1)及YW182.3(R1MAb2))及上述抗KLB抗體之重鏈及輕鏈的表現載體之混合物共轉染HEK293細胞。抗FGFR1及抗KLB之重鏈分別帶有Flag肽及Oct-組胺酸標籤，以使得可藉由依序親和力純化自條件化培養基純化異源二聚體IgG。然後在基於GAL-ELK1之螢光素酶分析中分析經部分純化之異源二聚體IgG，以鑑別KLB依賴性激動劑。為最小化重鏈與輕鏈之錯配，使用人類Fab恆定區表現抗FGFR1，且使用小鼠Fab恆定區表現抗KLB。首先以粗製物形式使用3種抗R1MAb及18種抗KLB Ab之28種組合測試帶標籤之雙特異性IgG(表7)。YW182.2(R1MAb1)、YW182.3(R1MAb2)及YW182.5(R1MAb3)與18C5、12A11及14E6之某些雙特異性組合之數據顯示於圖7A中。在大多數情形下，觀察到與僅表現FGFR1c而非KLB之細胞相比，在共表現FGFR1c及KLB之細胞中雙特異性抗體對信號傳導之活化顯著較佳。
基於該等抗體在該等初始實驗中之活性，使用8種代表性抗KLBAb(Ph#5、8C5、12A11、14C10、6D12、11D4、6C1及作為陰性對照之14E6)產生含有YW182.5之無標籤之雙特異性抗體(藉由使用先前闡述之隆凸-孔洞技術進一步表徵(參見上文及例如Atwell等人，FEBS Lett.583(1)：19-24(2009))。如圖8A-B中所顯示，雙特異性抗體經產生具有人類IgG1恆定區(野生型，具有效應物功能(1))及含有N297G突變之人類IgG1恆定區以消除效應物功能(3)，或含有雙重[D265G/N297G]突變(DANG)之小鼠恆定區以消除效應物功能(2)。
下表7列示多種使用隆凸於孔洞中技術製備之雙特異性抗體。
所使用之同型對照IgG係抗豚草(鼠類IgG2a)或抗人類Her2曲妥珠單抗(trastuzumab，人類IgG1)。使Fab片段在大腸桿菌中表現且使用習用管柱層析來純化。重組FGF21係來自R&D systems(2539-FG/CF)，但放射性配體細胞結合分析除外，其係使用來自Phoenix Pharmaceuticals之碘化FGF21及內部產生之未經標記FGF21來實施。每一雙特異性組合(陰性對照除外)皆顯示依賴於FGFR1c及KLB二者之信號傳導。某些組合之數據顯示於圖7B中。另外，抗KLB臂與YW182.5(R1MAb3)臂之組合在表現FGFR1c而非KLB之細胞中顯示較低的背景信號傳導。
如圖6C中所顯示，在表現不同受體之缺乏FGFR1之HEK293細胞 中測試抗KLB/抗FGFR1c抗體(BsAb17)之活性。使用CRISPR-cas9方法使用引導RNA產生缺乏FGFR1之HEK293T細胞。觀察到抗KLB/抗FGFR1c抗體在共表現重組hFGFR1c及hKLB之細胞中誘導螢光素酶活性(圖6C)。
當在基於GAL-ELK1之螢光素酶分析中在表現FGFR1c之HEK293細胞中在具或不具KLB的情況下測試時(圖7C)，抗FGFR1及抗KLB臂(例如BsAb5、6、7、8、9、10)之多種雙特異性抗體組合在表現重組hFGFR1c及hKLB之細胞中而非無KLB表現之細胞中以劑量依賴性方式誘導螢光素酶活性，此指示該等雙特異性抗體起KLB依賴性FGFR激動劑作用，與FGF21恰好相同(圖6C及7C)。未觀察到與FGF21之協同作用(圖9B-C)。
藉由經放射性標記之配體結合分析量測兩種雙特異性抗體BsAb10及BsAb9(以及hFGF21)與表現人類、食蟹猴猴及小鼠KLB、人類FGFR1c或hFGFR1c及hKLB二者之HEK293細胞的溶液結合親和力(Kd)。對於放射性配體細胞結合分析，將穩定地共表現KLB及/或FGFR1c之HEK293細胞以100,000至200,000個細胞/0.2mL之密度置於96孔板中之結合緩衝液(DMEM，其含有1%牛血清白蛋白(BSA)、50mM HEPES(pH 7.2)、0.1%疊氮化鈉及350mM人類IgG)中。將50μL含有固定濃度之碘化FGF21(Phoenix Pharmaceuticals)或碘化BsAb及連續稀釋濃度之未經標記FGF21(Genentech)或未經標記之BsAb的競爭反應混合物添加至細胞中。在室溫下將競爭反應物與細胞一起培育2h。培育2h後，將競爭反應物轉移至Millipore Multiscreen過濾器板且用結合緩衝液洗滌四次，以分離游離與結合的碘化FGF21或抗體。在Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)上對過濾器進行計數。使用New Ligand軟體(Genentech)評估結合數據，該軟體使用Munson及Rodbard(3)之擬合算法來確定結合親和 力。如表8中所顯示，兩種抗體皆展現對僅表現KLB之細胞一定程度之良好反應性(以與先前所觀察一致之交叉物種模式)，但二者對僅表現hFGFR1c之細胞的結合較弱，且對表現hKLB及hFGFR1c二者之細胞的結合較強。使用FACS分析比較對穩定地表現hKLB、hFGFR1c或BsAb10及BsAb9二者之HEK293細胞之親和力與對具有兩個相應的抗FGFR1結合臂(YW182.5)之抗體的親和力，且獲得與上文之彼等類似之結果(圖9D)。
使用一種雙特異性抗體BsAb10(其具有作為抗FGFR1臂之YW182.5及作為抗KLB臂之8C5)及BsAb10之衍生物(BsAb11-20)實施其他實驗。如圖6C中所顯示，在HEK293細胞中表現鼠類受體，且顯示BsAb17在該等細胞中亦誘導螢光素酶活性，從而確認此Ab之物種交叉反應性。然後在缺少內源KLB及FGFR、但經轉染以表現hKLB及5種hFGFR同種型中之每一者之大鼠L6肌母細胞中測試BsAb10。發現BsAb10僅在表現FGFR1c及KLB二者之細胞中誘導螢光素酶活性，此指示BsAb10起FGFR1c/KLB複合物、而非KLB與其他FGFR之複合物的特異性激動劑作用(圖9A)。使用FGF21及FGF19作為對照，以展示在細胞表現KLB及FGFR1c、2c或3c中之任一者之組合時FGF21誘導螢光素酶活性，且FGF19在表現KLB及FGFR4之組合之細胞中誘導活性。重組FGF21係來自R&D systems(2539-FG/CF)，但放射性配體細胞結合分析除外，其係使用來自Phoenix Pharmaceuticals之碘化FGF21 及內部產生之未經標記FGF21來實施。將編碼人類FGFR1b、1c、2b、2c、3b、3c及4之細胞外域(ECD)之cDNA選殖至含有巨細胞病毒(CMV)啟動子之表現載體中以產生人類FGFR-人類Fc嵌合蛋白或帶有His標籤之FGFR蛋白。令人驚訝的是，儘管親代抗FGFR1c Ab、R1MAb3(YW182.5)可結合至FGFR1b(圖2B)，但在GAL-ELK1分析中在L6細胞中不與KLB相互作用且可活化FGFR1b之FGFR1同種型(圖2C)、FGFR1b及KLB之組合並不支持藉助BsAb10之活化(圖9A)。在不受限於具體理論的情況下，該等數據表明存在預形成之FGFR1/KLB複合物係BsAb10對FGFR1之KLB依賴性活化的先決條件。
實例8：BsAb10及其衍生物起FGF21之分子模擬物作用
BsAb10及其衍生物(BsAb11-20)以及FGF21之其他表徵揭露一些相似性及差異。為確定MAPK信號傳導中間體之磷酸化程度，使細胞生長於含有FBS、L-麩醯胺酸及GA-1000之前脂肪細胞基礎培養基-2中。鋪滿後，立即使皮下前脂肪細胞(自Lonza獲取)在含有***(dexamethasone)、吲哚美辛(indomethacin)及3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)之生長培養基中分化。對於基因表現分析，使細胞分化14天，且然後與所指示激動劑一起進一步再培養48h。對於MAPK信號傳導分析，使細胞分化10天，於無血清培養基中生長3h，且然後與所指示激動劑一起進一步再培養1h。如圖6D及8B中所顯示，BsAb10、BsAb17、BsAb20及FGF21顯示誘導初級人類脂肪細胞中之MAPK信號傳導中間體(例如MEK及ERK)磷酸化之相當活性，該等初級人類脂肪細胞代表用於FGF21之抗糖尿病活性之相關細胞類型，如藉由西方墨點所測定。用於西方墨點分析之抗體來自細胞信號傳導技術：pFRS2a(T196)(編號3864)、pMEK1/2(S217/221)(編號9154)、pERK1/2(T202/204)(編號4370)、ERK1/2(編號4695)、HSP90(編號4874)、β-肌動蛋白(編號5125)；來自abcam：UCP1(ab10983)；或來 自R&D Systems：KLB(AF2619)。
另外，BsAb10之親和力曲線與FGF21類似。當藉由FACS測試時，BsAb10顯示與表現hKLB之細胞(無論是否共表現FGFR1c)之強結合(圖10A)。令人驚訝的是，當細胞表現FGFR1c而非KLB時觀察到BsAb10之極少結合，此指示YW182.5臂之單價親和力極低(圖10A)。經放射性標記之配體分析指示BsAb10與表現FGFR1c及KLB二者之細胞之解離常數(Kd)為2.3nM，此接近以類似分析格式對hFGF21觀察到之5.3nM(圖10B)。該等值接近在GAL-ELK1分析中在HEK293細胞中對該等分子觀察到之EC50(對於BsAb10及FGF21分別為3.2nM及4.7nM)。當細胞僅表現人類KLB或僅表現小鼠KLB時，Kd分別為6.6nM及15.5nM。由於對FGFR1之親和力太低，故放射性標記配體分析無法可靠地測定BsAb10與僅表現FGFR1c之細胞的Kd，但估計其為>300nM(圖3B)。由於類似原因，BsAb10與FGFR1之結合動力學亦無法可靠地藉由SPR來測定。
此外，BsAb10會穩定FGFR1c-ECD與KLB-ECD蛋白之間之相互作用，如先前對FGF21所觀察到，此與BsAb10起FGFR1c-選擇性FGF-21模擬物作用之觀察一致(圖11)(Yie等人，Chemical Biology；Drug Design 79,398-410(2012))。在ProteOnTM XPR36(Bio-Rad Laboratories)儀器上在25℃下藉由表面電漿子共振(SPR)量測研究FGFR1/KLB/BsAb10相互作用。如製造商所闡述使用標準胺偶合程序，使pH4.5之FGFR1-HIS蛋白(20μg/ml)以表面密度(1000RU)固定在經活化ProteOnTM GLC感測器晶片上。以80μl/min之流速注射在含有0.005% v/v Tween®-20、0.3M NaCl之PBS(pH7.4)中之6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM或200nM之BsAb10及/或BsAb10及KLB-ECD之1：1混合物，且記錄締合及解離相之感測圖。持續300sec注射分析物且容許解離600sec。數據利用位點間(interspots)參照，進行處 理，且使用ProteOnTM管理軟體(3.0版，Bio-Rad)量測解離常數。BsAb10對FGFR1c/KLB複合物之活化表明藉由FGFR1c-ECD、KLB-ECD及BsAb10形成三元複合物。
亦觀察到BsAb10與重組KLB-ECD及FGF21或FGF19形成三元複合物(圖11)。在Octet RED(ForteBio)儀器上在25℃下藉由生物層干擾術(BLI)量測研究BsAb10/KLB/FGF相互作用。如製造商所闡述，將pH4.5之BsAb10(20μg/ml)固定在經活化胺反應性生物感測器尖端上。使含有0.005% v/v Tween®-20、0.3M NaCl之PBS(pH7.4)中之KLB-ECD(20μg/ml)捕獲至相同生物感測器尖端上，且在同一緩衝液中使用0μM、0.2μM、0.8μM或2μM FGF21(R&D Systems)量測。使用數據獲取軟體(ForteBio)處理定性數據。
如圖12中所顯示，細胞表面時間解析螢光共振能量轉移(TR-FRET)實驗表明當KLB亦存在於細胞中時，BsAb17及FGF21二者增強FGFR1c-ECD之二聚化。對於TR-FRET，共轉染COS7細胞以表現帶有SNAP標籤之FGFR1及無標籤KLB，且以100,000個細胞/孔接種於白底96孔板(Costar)中。在轉染後24h在37℃、5% CO2下，使用100nM供體偶聯之苄基鳥嘌呤SNAP-Lumi4-Tb(Cisbio)及1μM受體偶聯之苄基-鳥嘌呤SNAPAlexa647(NEB)將經轉染細胞標記1h。洗滌三次後，在添加配體後t=0及t=15min時使用Safire2板讀數器(Tecan)在343nm下雷射激發後在60μs延遲後分別在620nm及665nm下持續400μs記錄Lumi4-Tb發射及TR-FRET信號。在640nm下激發後使用相同板讀數器在682nm下檢測Alexa647之發射信號。然後將FRET強度計算為：(665nm下來自經SNAP供體及SNAP受體標記之細胞的信號)-(665nm下來自同一批次之經SNAP供體及未經標記之SNAP標記的經轉染細胞之信號)。結果顯示為FRET比率：FRET強度除以620nm下之供體發射。
另外，BsAb10結合至KLB-ECD之C末端一半，而認為FGF21及FGF19結合至KLB上N末端一半中之同一位點(Goetz等人，Mol.Cell.Biol.32(10)：1944-54(2012)；Foltz等人，Sci.Transl.Med.4：162ral53(2012))，此表明KLB上BsAb10之表位應不同於FGF21及FGF19結合位點。為定位針對BsAb10之KLB表位，8C5(BsAb10之KLB結合臂)與在HEK293細胞中表現之一系列嵌合抗原之結合。藉由融合人類KLB與人類Klotho α(KLA)蛋白(與人類KLB蛋白50%一致)或兔KLB(與人類KLB 86%一致)來構築每一嵌合體。如圖13A-B中所匯總，8C5結合KLB之C末端域、尤其含有KLB之C末端域中之34個胺基酸(SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS；SEQ ID NO：142)的區域。如圖13B中所顯示，SEQ ID NO：142之胺基酸序列可對應於包括信號序列、例如具有示於SEQ ID NO：157中之序列的52胺基酸序列之KLB蛋白之胺基酸857-890，或可係指不包括信號序列之KLB蛋白之胺基酸805-838。
儘管FGF21與BsAb10及其衍生物之間之下游作用類似，但KLB上之BsAb10表位不同於FGF21及FGF19結合位點(圖14A)，且BsAb17預處理並不阻斷表現FGFR4/KLB複合物之L6細胞(圖14B)或H4IIE肝癌細胞(圖14C)中之FGF19活性。該等數據指示，所揭示之抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體(例如抗KLB/抗FGFR1c雙特異性抗體)並不干擾FGF19或FGF21與KLB/FGFR1c複合物之相互作用。
實例9：BsAb10及其衍生物起活體內長效FGF21模擬物作用
BsAb10及其衍生物與鼠類受體複合物之交叉反應性(圖6C及10B)容許在小鼠模型中測試其活體內活性。為避免來自IgG效應物功能之潛在毒性，將雙重突變[D265A/N297G]引入BsAb20之阻止與FcgR之結合及免疫效應細胞之招募的Fc區中。另外，為避免來自IgG效應物功能之潛在毒性，將N297G引入BsAb17之阻止與FcgR之結合及免疫 效應細胞之招募的Fc區中。當以5mg/kg i.p.注射至糖尿病db/db小鼠中時，BsAb17會使血糖含量降低至類似程度，而不影響食物攝取或體重(圖15A)。經BsAb17治療之精瘦C57BL/6小鼠顯示降低的血糖，但並未達成毒性低血糖症(圖15A)。當在第0天及第6天以3mg/kg向飼餵高脂肪膳食之C57BL/6小鼠(膳食誘導型肥胖症，DIO)注射BsAb17時，觀察到顯著體重損失、血糖降低、葡萄糖耐受改良以及肝甘油三酯、血清胰島素、游離脂肪酸、甘油三酯及總膽固醇降低，如先前使用FGF21注射所觀察到(圖15B-D)。對於高脂肪膳食飼餵，使用高脂肪、高碳水化合物膳食(Harlan Teklad TD.03584，58.4%熱量來自脂肪)。
在單獨實驗中，如藉由GTT所量測，BsAb20會改良klb雜合小鼠而非缺乏klb之純合小鼠之葡萄糖耐受，此指示葡萄糖耐受之改良需要功能性KLB(圖16A-C)。對於葡萄糖耐受測試(GTT)，使小鼠禁食過夜，且i.p.注射2g/kg葡萄糖溶液。為產生缺乏Klb之(KO)小鼠，自Sigma-Aldrich獲得Klb特異性鋅指核酸酶(ZFN)對，且根據已建立之方法將其用於原核顯微注射。ZFN對靶向小鼠基因組中之以下Klb序列(以小寫字母表示之切割位點)，且KO小鼠缺少1bp缺失(以粗體表示之g)，從而導致框移：GTTACCGGCTTCtccggaGACGGGAAAGCAATATGG(SEQ ID NO：156)。圖16A顯示小鼠KLB蛋白之N末端胺基酸序列及缺乏KLB之小鼠中由KLB對偶基因編碼之相應的胺基酸序列。
另外，與改變血清FGF23及磷含量之抗FGFR1 R1MAb1不同(Wu等人，Sci Transl Med 3,113ral26(2011)及Wu等人，PLoS One 8,e57322(2013))，抗KLB/抗FGFR1雙特異性抗體並不影響該等血清參數，此指示不存在非KLB依賴性FGFR1激動活性(圖16D)。如圖17中所顯示，BsAb17並不改變為非KLB依賴性FGFR1之敏感性標記物之 血清FGF23或磷含量。藉由高胰島素-正葡萄糖鉗夾量測經BsAb17治療之小鼠中之胰島素作用。簡言之，使用異氟烷麻醉小鼠且分別對左頸總動脈及右頸靜脈***導管用於取樣及輸注。使導管之自由端在皮膚下穿隧至其中導管之鬆散端附接至由Micro-Renathane®(OD為0.033)製造之管的頸背部。在手術後將動物個別地圈養且每日記錄體重。所有代謝實驗係在手術後5天恢復時段後實施且先前已闡述。將清醒的不受限小鼠置於鋪襯有鋪墊物之1L塑膠容器中且在7：00am(t=-300min)時禁食。將小鼠立即連接至雙通道不銹鋼轉環(Instech Laboratories)以容許同時頸靜脈輸注及動脈血取樣。不對小鼠進行處置且容許其自由活動以消除壓力。在開始鉗夾前2h，給予頸靜脈(t=-120min)[3-3H]-D-葡萄糖之5μCi濃注，此係以0.05μCi/min之速率進行恆定輸注。在2h平衡時段後在t=0min(即，5h禁食)時，抽取基線動脈血樣品用於量測血糖、[3-3H]-D-葡萄糖、血球比容及血漿胰島素。然後開始145min高胰島素-正葡萄糖(4mU/kg/min)鉗夾。將[3-3H]-D-葡萄糖添加至用於維持血糖正常之可變葡萄糖輸注中，且中斷[3-3H]-D-葡萄糖之恆定輸注以鉗制動脈葡萄糖比活性處於恆定位準。用等體積之0.9%肝素化鹽水(血球比容為約50%)洗滌且重構來自C57B1/6J背景下之供體小鼠之紅血球，並以4μl/min之速率輸注研究之持續時間以更換在研究期間去除之血液。每10分鐘採集動脈血樣品以測定血糖含量。在t=80min、90min、100min及120min時，採集血液樣品以測定[3-3H]-D-葡萄糖。在t=120min時，將2-去氧[14C]葡萄糖([2-14C]DG)之13μCi濃注投與頸靜脈導管中。在t=122min、125min、130min、135min及145min時，對動脈血取樣以測定血糖、血漿[3-3H]-D-葡萄糖及[2-14C]DG。在100min及120min時量測動脈胰島素濃度。然後在t=145min時麻醉小鼠。將比目魚肌、腓腸肌、白色表淺性股外側肌(四頭肌)、肝、心臟、附睪及皮下白色脂肪組織、褐 色脂肪組織及腦切除、立即冷凍於液氮中，且儲存在-70℃下直至將來組織分析。使用Linco大鼠放射免疫分析套組(LincoResearch)分析免疫反應性胰島素。
為量測[3-3H]-D-葡萄糖，使用氫氧化鋇(Ba(OH)2)及硫酸鋅(ZnSO4)將血漿樣品去蛋白質，乾燥，且使用液體閃爍計數來測定放射性。使用高氯酸將切除之組織去蛋白質，且然後中和至約7.5之pH。對樣品之一部分計數([2-14C]DG及[2-14C]DG-G磷酸鹽([2-14C]DGP)，且用Ba(OH)2及ZnSO4處理一部分，並對上清液計數([2-14C]DG)。使用液體閃爍計數測定[2-14C]DG及[2-14C]DG-磷酸鹽([2-14C]DGP)放射性能級二者。使用非穩態方程式、假設一定分佈體積(130ml/kg)來評價葡萄糖通量率。如先前所闡述計算[2-14C]DG之組織特異性清除率(Kg)及葡萄糖吸收指數(Rg)(Kraegen等人，Am.J.Physiol.248,E353-362(1985))：Kg=[2-14C]DGP組織/AUC[2-14C]DG血漿，Rg=Kg×[葡萄糖]血漿，其中[2-14C]DGP組織係組織中之[2-14C]DGP放射性(dpm/g)，AUC[2-14C]DG血漿係血漿[2-14C]DG消失曲線下之面積(dpm/mL/min)，且[葡萄糖]血漿係實驗時段(t=102-125min)期間之平均血糖(μg/μl)。數據呈現為平均值±SEM。
如圖15E-F及18A中所顯示，在鉗夾之前5天在DIO小鼠中單次注射10mg/kg BsAb17顯著降低禁食葡萄糖及胰島素濃度而無明顯體重損失(圖18B)。另外，藉由BsAb17注射使穩態葡萄糖輸注速率增加64%(圖18C)。另外，BsAb17改良胰島素刺激之全身葡萄糖利用及內源葡萄糖產生之胰島素阻抑之速率(圖15E-F)。胰島素刺激之時段結束時之組織葡萄糖吸收(Rg)在心臟、骨骼肌肉、白色脂肪組織(WAT)及肩胛間BAT組織(iBAT)中得到增強，此指示藉助BsAb17之全身胰島素敏化(圖15G)。
使用FGF19或FGF21之藥理學劑量之先前研究已顯示增多的能量 消耗增加(EE)(Fu等人，Endocrinology 145,2594-2603(2004)；Coskun等人，Endocrinology 149,6018-6027(2008)；Wu等人，PLoS One 8,e57322(2013)；Lin等人，Cell Metab 17,779-789(2013))，因此將觀察到類似效應係合理的。使用以下方程式來計算EE及呼吸商(RQ)。EE=VO2×(3.815+1.232×RQ)，其中RQ=VCO2/VO2。實際上，在正常室溫(21℃)下向DIO或精瘦小鼠單次注射BsAb17可顯著增加每只經注射動物之O2消耗(VO2)、CO2產生(VCO2)及EE，而不顯著改變活性計數(圖19A-B、20及21A)。當籠溫度增加至適中溫度(29℃-30℃)時EE持續增加，此表明BsAb17誘導之褐色脂肪活化並不依賴於來自交感神經系統之適應性生熱輸入(圖20B及21A)。當測試適應適中室溫(29℃-30℃)之DIO小鼠達兩週時，EE亦明顯增加(圖21A-B)。意外的是，所觀察到之EE之15%-46%增加並不伴有呼吸商(RQ=VCO2/VO2)之顯著改變(圖19A-B)。EE在不改變RQ之情況下之類似增加係由向DIO小鼠中連續輸注FGF21所引起(圖21C)。相比之下，連續輸注β 3-特異性腎上腺素受體激動劑CL-316,243會如預期引起EE急劇增加及RQ降低(圖19H)。連續輸注FGF21或CL-316,243係使用皮下植入之滲透性微幫浦(Alzet 2001)來實施。因此，BsAb17-及FGF21誘導之EE係穩健的，但似乎比其他先前所闡述伴有促進脂質氧化及降低RQ之BAT活化機制(例如投與擬交感神經劑(去甲腎上腺素或β 3-特異性腎上腺素受體激動劑CL-316,243)、心利鈉肽或介白素-4)更具選擇性(Gerhart-Hines等人，Mol.Cell 44,851-863(2011)；Mattsson等人，American journal of physiology.Endocrinology and metabolism 299,E374-383(2010)；Nguyen等人，Nature 480,104-108(2011)；Birkenfeld等人，Diabetes 57,3199-3204(2008)；Bordicchia等人，J.Clin.Invest.122,1022-1036(2012)；及de Souza等人，Diabetes 46,1257-1263(1997))。
在不受限於具體理論的情況下，若干證據線索表明BAT活化在BsAb17之代謝作用中之主要作用。第一，BsAb17注射增加18F-氟去氧葡萄糖(FDG)於iBAT中之特異性吸收(圖19C)。第二，單次BsAb17注射誘導腹股溝WAT(ingWAT)中之UCP1蛋白表現，此指示脂肪組織褐變(圖19D)。在所培養經FGF21或BsAb17治療之初級脂肪細胞中亦觀察到UCP1表現之誘導，此指示對成熟脂肪細胞之直接作用(圖19E)。為測定UCP1表現，使用SUPERSCRIPT® VILO cDNA合成套組(ABI)使用總RNA合成cDNA。對於qPCR，在ViiA 7實時PCR儀器(Applied Biosystems)上以一式三份運行樣品。所用Applied Biosystems預先設計之TAQMAN®基因表現分析探針係UCP1(Hs01027785_m1)。對於每一樣品，將mRNA豐度正規化至TBP(Hs00427620_m1)及SDHA(Hs00188166_m1)轉錄本之量。
第三，使用遙測系統，在單次BsAb17注射後觀察到持續>26天之靜息核心體溫增加，然後逐漸返回至基線(圖19F及22)。使用手術植入腹腔中之TA-F10遞質(Data Sciences International,DSI)監測核心體溫。自手術恢復後，基於體重及核心體溫將小鼠隨機分成多組。使用DSI可植入遙測系統監測核心體溫及活動。另外，單次BsAb17注射引起類似於每天兩次注射FGF21之iBAT中之基因表現改變(圖19G)。最後，當注射至C57BL/6小鼠中時，FGF21及BsAb20二者誘導多種脂肪組織(包括iBAT及ingWAT)中之ERK及MEK磷酸化(圖23)。
在先前研究中，表明脂聯素有助於FGF21之全作用(Lin等人，Cell Metab 17,779-789(2013)；Holland等人，Cell Metab 17,790-797(2013))。實際上，向DIO小鼠(圖24A)或精瘦食蟹猴(圖24B)中單次注射BsAb17可增加血清高分子量(HMW)脂聯素含量以及相關體重損失。在單次注射BsAb17後，HFD上之脂聯素(Adipoq)KO小鼠在增加EE(25.3%增加對wt小鼠中之20.9%增加)以及減小體重及肝甘油三酯含 量方面展現穩健的反應(圖24C-D)。然而，在KO小鼠中葡萄糖耐受、胰島素耐受、血清胰島素及多種脂質之變化之反應皆稍微遲鈍(圖24D)，此與BsAb17在部分經由脂聯素功能調控全身營養素代謝方面起FGF21模擬物作用之觀點一致。BsAb10之加強的受體選擇性(圖9A)及先前所闡述IgG分子之低腦外顯率(Yu等人，Sci Transl Med 3,84ra44(2011))預測BsAb10及其衍生物與FGF21/19相比改變的安全性曲線。為確定胰島素耐受，使小鼠禁食4h，且i.p.注射1U/kg人類胰島素溶液(Humulin R、Eli Lilly and Company)。
與FGFR1在肝中之低表現量一致，FGF21而非BsAb17誘導典型FGFR靶基因Spry4及Dusp6在肝中之mRNA表現(圖25)。BsAb17或BsAb20增加多種脂肪組織及胰臟腺泡細胞、而非肝或多種腦切片(包括室周器官)中之磷酸-ERK信號(圖23及26)。另外，慢性BsAb20治療DIO小鼠達8週會使肝中之BrdU+細胞數減少至精瘦C57BL/6小鼠之程度，此與對FGF19樣活性所預期相反(圖27)。對於肝BrdU納入，在安樂死前2h時向小鼠腹膜內注射100mg/kg BrdU(BD Biosciences)。如所闡述(Nicholes,K.等人，Am.J.Pathol.160,2295-2307(2002))對抗BrdU實施染色，且藉由使用Ariol自動影像分析系統對BrdU陽性肝細胞進行計數。
基於微電腦斷層攝影，慢性BsAb20治療DIO小鼠達6週會使代謝參數產生預期變化，而脛骨小樑及股皮質骨之多個骨參數無任何負信號(圖28)。藉由SCANCO Medical(Basserdorf,Switzerland)μCT40微成像系統使股骨樣品成像，該系統利用70keV之x射線管能階及114微安電流操作。使用12μM之各向同性三維像素大小獲得鄰接軸影像切片。使用SCANCO Medical(Basserdorf,Switzerland)μCT40評估軟體實施股骨內之小樑骨之形態計量分析。使用半自動輪廓描繪來界定所關注體積(VOI)，包含於近端股骨生長板背側之二級小樑骨且延伸至 初級小樑骨遠端1.5mm。藉由將VOI邊界置於皮質骨之內部邊界內來排除皮質骨。在影像分割之前，將限制性三維(3D)Gaussian低通量過濾器施加至影像數據以阻抑雜訊(過濾器σ=0.5，過濾器支持=1)。施加全域臨限值(0.36gHA/cm3)以自VOI提取「二元樹」小樑結構。藉由目視檢查來自樣品之代表性子集之分割結果選擇小樑分割臨限值。藉由直接3D形態計量分析來量化小樑結構特徵。先前研究已顯示，藉由微電腦斷層攝影之小樑骨之形態計量分析與藉由組織形態測定製得之類似估計密切相關。
最後，向DIO小鼠中注射BsAb17並未使血清皮質酮含量增加超過對照(圖29)。現代社會中常見之慢性陽性能量平衡正驅動肥胖症大流行及特徵在於胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高脂血症及脂肪肝之相關代謝紊亂，此通常導致嚴重疾病，例如2型糖尿病、硬化、中風及心臟病。在2009年，報導成人中UCP1陽性BAT之存在及其在經由散熱驅動EE方面之功能顯著性，從而在BAT之治療性誘導及活化來治療肥胖症及相關代謝疾病方面引起極大關注(Yoneshiro及Saito,Ann.Med.,1-9(2014))。
然而，眾所周知之BAT活化機制亦誘導白色脂肪組織分解，此可能對心血管結果具有消極影響(Dong等人，Cell Metab.18,118-129(2013))。應注意，BAT移植會增加EE並引起體重損失而不改變RQ(Stanford等人，J.Clin.Invest.123,215-223(2013))。就此而言，本文所闡述之FGF21及抗FGFR1/KLB激動劑抗體呈現一種獨特方式來選擇性地誘導BAT中之生熱反應而不改變RQ，由此模擬BAT移植而非非特異***感神經活化(sympathoactivation)。另外，基於在小鼠中之觀察，設想抗體介導之FGFR1c/KLB複合物活化可提供用於抗肥胖及抗糖尿病療法之更安全且更有效之方式，此與藉由FGF21或FGF19類似物之較寬FGFR/KLB複合物活化相反。
實例10：抗KLB抗體8C5之人類化
將8C5之鼠類輕鏈CDR移植至人類κ2及κ4輕鏈框架中。除初級移植物外，亦各自產生點突變，使得輕鏈之位置4轉變成白胺酸(稱為「M4L」)。實施分析以鑑別表現最佳且不顯示顯著聚集之彼等。類似地，將重鏈CDR移植至人類H1、H2、H3及H4 IgG1重鏈框架中。使重鏈主鏈中之多個殘基如下突變：對於H1引入以下變化：K71R、N73T及V78A(親代稱為「KNV」且構築體稱為「RTA」)；對於H2引入以下變化：N73T(親代稱為「KNV」且構築體稱為「KTV」)；對於H3引入以下變化：K71R及V78L(親代稱為「KNV」且構築體稱為「RNL」)；且對於H4引入以下變化：K71V、N73T及V78F(親代稱為「KNV」且構築體稱為「VTF」)。
產生基於4條輕鏈及8條重鏈之所有成對組合(對於總共32種抗體)的抗體，且測試表現量及親和力。基於該等實驗，8C5源性輕鏈K4.M4L及重鏈H3.KNV展現表現量及期望親和力之最佳組合。
8C5.K4.M4L.H3.KNV可變區及全長抗體之序列如下：
8C5.K4.M4L.H3.KNV重鏈可變區
(SEQ ID NO：128)
8C5.K4.M4L.H3.KNV完整重鏈
(SEQ ID NO：129)
8C5.K4.M4L.H3.KNV輕鏈可變區
(SEQ ID NO：130)
8C5.K4.M4L.H3.KNV完整輕鏈
(SEQ ID NO：131)
實例11：YW182.3與YW182.5之間之抗FGFR1抗體雜合體的產生
YW182.5係在抗FGFR1臂不存在下不活化KLB/FGFR1c複合物之抗FGFR1臂，發現YW182.5在與8C5組合時給出良好結果，且具有色胺酸作為重鏈之易被氧化之位置33。似乎與YW182.5結合相同表位之YW182.2亦在重鏈之位置33處具有此一色胺酸。將若干突變引入此位置以避免此問題：對於YW182.5引入W33Y、W33H、W33F及W33L，且對於YW182.2引入W33Y及W33F。令人驚訝的是，所引入之突變在兩種抗體中具有不同效應。在YW182.2之情形下，觀察到該等突變並不顯著影響對FGFR1之親和力或激動活性，而對於YW182.5而言，該等突變極大地降低對FGFR1之親和力及激動活性(例如，參見圖31)。因此，使用兩種方式實施實驗以鑑別具有W33Y突變、但親和力接近YW182.5抗體之親和力的抗體。
在一方式中，對於YW182.2 W33Y重鏈序列，對整個CDR3實施丙胺酸掃描，從而使位置95、96、97、98、99、100、100a及100b突變成丙胺酸。分析所得抗體之親和力，且鑑別保留YW182.2 W33Y親代之極高親和力之彼等(表9)。
在第二方式中，混合且匹配來自YW182.2 W33Y抗體(具有極高親和力)及YW182.5 W33Y抗體(幾乎不具結合)之CDR。YW182.2 W33Y及YW182.5 W33Y抗體具有一致的輕鏈CDR序列(CDR-L1,RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：139)；CDR-L2,SASFLYS(SEQ ID NO：140)；與CDR-L3,QQSYTTPPT(SEQ ID NO：141)；CDR-H1之單一胺基酸差異(YW182.2 W33Y CDR-H1,STYIS(SEQ ID NO：152)與YW182.5 W33Y CDR-H1,SNYIS(SEQ ID NO：136))；在CDR-H2中或毗鄰其之三胺基酸差異(YW182.2 W33Y CDR-H2,EIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：137)與YW182.5 W33Y,EIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：153))；及CDR-H3序列的極大差異(YW182.2 W33Y,EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：154)與 YW182.5 W33Y GTDVMDY(SEQ ID NO：138))。構築且測試基於來自YW182.5 W33Y及YW182.2 W33Y之重鏈CDR之所有可能組合(包括兩種親代抗體之八種)的具有重鏈之抗體。大部分抗體具有與一者或另一者類似之親和力，但令人驚訝的是，一種組合展示與親代YW182.5抗體幾乎相同之結合。此抗體具有來自YW182.5 W33Y之CDR-H1及CDR-H3，但不具來自YW182.2 W33Y之CDR-H2。此抗體稱為「YW182.5 YGDY」以表示YW182.5序列中之以下變化：W33Y、A49G、A56D及D58Y。
YW182.5 YGDY抗體之序列如下：
YW182.5_YGDY重鏈可變區
(SEQ ID NO：132)。
YW182.5_YGDY完整重鏈
(SEQ ID NO：133)。
YW182.5_YGDY輕鏈可變區
(SEQ ID NO：134)。
YW182.5_YGDY完整輕鏈
(SEQ ID NO： 135)
實例12：測試具有人類化8C5及抗FGFR1變體之雙特異性抗體
在基於GAL-ELK1之螢光素酶分析中在表現FGFR1c之HEK293細胞中在具或不具KLB的情況下，測試8C5.K4H3.M4L.KNV與不同抗FGFR1臂之多種雙特異性抗體組合。如先前所觀察到，每一雙特異性抗體組合皆在表現重組hFGFR1c及hKLB之細胞中而非無KLB表現之細胞中以劑量依賴性方式誘導螢光素酶活性(圖30)。該等數據確認該等經修飾變體保留親代抗體(例如BsAb13)之優點。具有人類化8C5臂(8C5.K4.M4L.H3.KNV)及YW182.5_YGDY臂之抗KLB/抗FGFR1抗體對HEK293細胞表面上之人類、食蟹猴及小鼠KLB/FGFR1c複合物的結合親和力顯示於表10中。
除繪示及主張之多個實施例外，所揭示之標的物亦係關於具有本文所揭示及主張之特徵之其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之具體特徵可以所揭示標的物範疇內之其他方式彼此組合，使得所揭示之標的物包括本文所揭示特徵之任何適宜組合。出於說明及描述之目的，已呈現對所揭示標的物之特定實施例之先前描述。本文並不欲具有排他性或將所揭示之標的物限於所揭示之彼等實施例。
彼等熟習此項技術者將明瞭，可在不背離所揭示標的物之精神或範疇的情況下對所揭示標的物之組成及方法作出各種修改及變化。因此，所揭示標的物意欲包括在隨附申請專利範圍及其等效內容之範疇內的修改及變化。本文引用各種出版物、專利及專利申請案，其內容之全文皆以引用方式併入本文中。
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 131
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 132
<210> 133
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 133
<210> 134
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 134
<210> 135
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 135
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 136
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 137
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 138
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 139
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 140
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 141
<210> 142
<211> 34
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知之描述：β-Klotho肽
<400> 142
<210> 143
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知之描述：纖維母細胞生長因子受體1肽
<400> 143
<210> 144
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知之描述：纖維母細胞生長因子受體1肽
<400> 144
<210> 145
<211> 992
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
<210> 146
<211> 820
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
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<211> 948
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 147
<210> 148
<211> 949
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 148
<210> 149
<211> 950
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 149
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 150
<210> 151
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 151
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 152
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 153
<210> 154
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 154
<210> 155
<211> 455
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
<210> 156
<211> 36
<212> DNA
<213> 小鼠屬
<400> 156
<210> 157
<211> 52
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
<210> 158
<211> 938
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 158
<210> 159
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
<210> 160
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
<210> 161
<211> 34
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 161
<210> 162
<211> 34
<212> PRT
<213> 家鼠屬
<400> 162
<210> 163
<211> 34
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 163
<210> 164
<211> 34
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知之描述：兔多肽
<400> 164
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠屬
<400> 165
<210> 166
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 166

Claims (21)

  1. 一種雙特異性抗體或其抗原結合部分，其結合至β-Klotho(KLB)及纖維母細胞生長因子受體1c(FGFR1c)，其中該抗體或其抗原結合部分包含：(a)第一臂，其包含：重鏈可變區CDR1域，其包含示於SEQ ID NO：15中之胺基酸序列；重鏈可變區CDR2域，其包含示於SEQ ID NO：31中之胺基酸序列；重鏈可變區CDR3域，其包含示於SEQ ID NO：47中之胺基酸序列；輕鏈可變區CDR1域，其包含示於SEQ ID NO：62中之胺基酸序列；輕鏈可變區CDR2域，其包含示於SEQ ID NO：78中之胺基酸序列；及輕鏈可變區CDR3域，其包含示於SEQ ID NO：93中之胺基酸序列；及(b)第二臂，其包含：重鏈可變區CDR1域，其包含示於SEQ ID NO：136中之胺基酸序列；重鏈可變區CDR2域，其包含示於SEQ ID NO：137中之胺基酸序列；重鏈可變區CDR3域，其包含示於SEQ ID NO：138中之胺基酸序列；輕鏈可變區CDR1域，其包含示於SEQ ID NO：139中之胺基酸序列；輕鏈可變區CDR2域，其包含示於SEQ ID NO：140中之胺基酸序列；及輕鏈可變區CDR3域，其包含示於SEQ ID NO：141中之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其為單株抗體及/或為人類、人類化或嵌合抗體。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第一臂包含：(a)與示於SEQ ID NO：128中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之重鏈可變區；及(b)與示於SEQ ID NO：130中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈可變區。
  4. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第一臂包含：(a)重鏈可變區，其包含示於SEQ ID NO：128中之胺基酸序列，及(b)輕鏈可變區，其包含示於SEQ ID NO：130中之胺基酸序列。
  5. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第一臂包含：(a)與示於SEQ ID NO：129中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之重鏈；及(b)與示於SEQ ID NO：131中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈。
  6. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第一臂包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列，及(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第二臂包含：(a)與示於SEQ ID NO：132中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之重鏈可變區；及(b)與示於SEQ ID NO：134中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈可變區。
  8. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第二臂包含：(a)重鏈可變區，其包含示於SEQ ID NO：132中之胺基酸序列，及(b)輕鏈可變區，其包含示於SEQ ID NO：134中之胺基酸序列。
  9. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第二臂包含：(a)與示於SEQ ID NO：133中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之重鏈區；及(b)與示於SEQ ID NO：135中之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈區。
  10. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該第二臂包含：(a)重鏈，其包含示於SEQ ID NO：133中之胺基酸序列，及(b)輕鏈，其包含示於SEQ ID NO：135中之胺基酸序列。
  11. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體。
  12. 一種宿主細胞，其包含如請求項11之核酸。
  13. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項12之宿主細胞以產生該抗體，及視情況地自該宿主細胞回收該抗體。
  14. 一種醫藥調配物，其包含一或多種如請求項1至10中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  15. 如請求項14之醫藥調配物，其進一步包含另一治療劑。
  16. 一種如請求項1至10中任一項之抗體之用途，其係用於製造活化KLB/FGFR1受體複合物、治療代謝病症或治療選自由以下組成之群之病症的藥劑：多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)以及老化及相關疾病，例如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)及ALS、巴比二氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)、普威二氏症候群(Prader-Willi syndrome)、阿姆斯壯氏症候群(Alstrom syndrome)、科漢氏症候群(Cohen syndrome)、奧爾布賴特氏遺傳性骨失養症(Albright's hereditary osteodystrophy)(假副甲狀腺低能症)、卡彭特症候群(Carpenter syndrome)、MOMO症候群、魯塔二氏症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)、X染色體易裂症候群及波-弗-萊症候群(Borjeson-Forssman-Lehman syndrome)。
  17. 如請求項16之用途，其中該代謝病症或病症係糖尿病。
  18. 如請求項16之用途，其中該代謝病症或病症係2型糖尿病或NASH。
  19. 一種如請求項1至10中任一項之抗體之用途，其係用於製造治療選自由以下組成之群之代謝病症的藥劑：多囊卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)以及老化及相關疾病，例如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)及ALS、巴比二氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)、普威二氏症候群(Prader-Willi syndrome)、阿姆斯壯氏症候群(Alstrom syndrome)、科漢氏症候群(Cohen syndrome)、奧爾布賴特氏遺傳性骨失養症(Albright's hereditary osteodystrophy)(假副甲狀腺低能症)、卡彭特症候群(Carpenter syndrome)、MOMO症候群、魯塔二氏症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)、X染色體易裂症候群及波-弗-萊症候群(Borjeson-Forssman-Lehman syndrome)。
  20. 如請求項19之用途，其中該代謝病症係糖尿病。
  21. 如請求項19之用途，其中該代謝病症係2型糖尿病或NASH。
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