EA015591B1 - Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения - Google Patents

Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA015591B1
EA015591B1 EA200970308A EA200970308A EA015591B1 EA 015591 B1 EA015591 B1 EA 015591B1 EA 200970308 A EA200970308 A EA 200970308A EA 200970308 A EA200970308 A EA 200970308A EA 015591 B1 EA015591 B1 EA 015591B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
sequence
nucleic acid
phospholipase
activity
Prior art date
Application number
EA200970308A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970308A1 (ru
Inventor
Эйлин О'Донохью
Нельсон Р. Бартон
Original Assignee
Верениум Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Верениум Корпорейшн filed Critical Верениум Корпорейшн
Publication of EA200970308A1 publication Critical patent/EA200970308A1/ru
Publication of EA015591B1 publication Critical patent/EA015591B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6481—Phosphoglycerides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются новые полипептиды, обладающие фосфолипазной активностью, включая, например, активность фосфолипазы A, B, C и D, активность пататина, активность фосфатаз фосфатидной кислоты (PAP) и/или липидацилгидролазы (LAH), кодирующие их нуклеиновые кислоты и антитела, которые с ними связываются. Также предлагаются промышленные способы, например, дегуммирования масла и продукты, связанные с применением таких фосфолипаз.

Description

Настоящее изобретение, в общем, относится к ферментам фосфолипазам, полинуклеотидам, кодирующим ферменты, способам получения и применения таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к новым полипептидам, обладающим фосфолипазной активностью, кодирующим их нуклеиновым кислотам и антителам, которые их связывают. Также предлагаются промышленные способы и продукты, связанные с применением таких фосфолипаз.
Уровень техники
Фосфолипазы представляют собой ферменты, которые гидролизуют сложноэфирные связи фосфолипидов. В связи с важным значением в метаболизме фосфолипидов такие ферменты широко распространены среди прокариот и эукариот. Фосфолипазы влияют на метаболизм, построение и реорганизацию биологических мембран и вовлечены в каскады передачи сигналов. Известно несколько типов фосфолипаз, которые отличаются по своей специфичности в зависимости от положения атакуемой связи в молекуле фосфолипида. Фосфолипаза А1 (РЬА1) отщепляет жирную кислоту, действуя на положение 1, с образованием свободной жирной кислоты и 1-лизо-2-ацилфосфолипида. Фосфолипаза А2 (РЬА2) отщепляет жирную кислоту, действуя на положение 2, с образованием свободной жирной кислоты и 1-ацил-2-лизофосфолипида. Ферменты РЬА1 и РЬА2 могут быть внутриклеточными или внеклеточными, связанными с мембранами или растворимыми. Внутриклеточный РЬА2 найден почти в каждой клетке млекопитающих. Фосфолипаза С (РЬС) отщепляет остаток фосфата с образованием 1,2-диацилглицерина и сложного фосфатного эфира. Фосфолипаза Ό (РЬИ) образует 1,2-диацилглицерофосфат и группу основания. РЬС и РЬИ важны для функционирования клеток и передачи сигнала. РбЭ является преобладающей фосфолипазой в биологическом катализе (смотри, например, СобГгсу. Т. апб \Уез1 8. (1996) 1пбиз1па1 епхуто1оду, 299-300, 8!оск!оп Ргезз, Иете Уогк). Пататины представляют собой другой тип фосфолипаз, которые, как считают, работают как РЬА (смотри, например, НпзсбЬегд Н.1., е! а1., (2001), Еиг. 1. Вюсбет. 268(19): 5037-44).
Обычные масличные семена, такие как соевые бобы, семена рапса, семена подсолнечника, рисовые отруби, кунжут и арахис, используют в качестве источников масел и кормов. В процессе экстракции масла осуществляют механическую и термическую обработку семян. Масло отделяют от жмыха с помощью растворителя. Затем, используя дистилляцию, растворитель отделяют от масла и извлекают. Масло подвергают дегуммированию и рафинируют. Растворитель из жмыха можно выпарить термической обработкой в тостерах для удаления растворителя с последующей сушкой и охлаждением жмыха. После отделения растворителя с использованием дистилляции полученное неочищенной масло перерабатывают в пищевое масло, используя специальные способы дегуммирования и физическую рафинацию. Его также можно использовать в качестве промышленного сырья для получения жирных кислот и метиловых эфиров. Измельченный материал можно использовать в рационе животных.
Дегуммирование является первой стадией рафинирования растительного масла и предназначено для удаления загрязняющих фосфатидов, которые экстрагируются вместе с маслом, но мешают последующей обработке масла. Такие фосфатиды растворимы в растительном масле только в безводной форме и их можно осадить и удалить, если их просто гидратировать. Гидратацию обычно осуществляют непрерывным смешиванием небольшой части воды с, по существу, безводным маслом. Обычно количество воды составляет 75% от содержания фосфатидов, которое обычно составляет от 1 до 1,5%. Температура не является решающим фактором, хотя отделение гидратированных смол происходит лучше, когда вязкость масла понижена, при 50-80°С.
В настоящее время применяют множество способов дегуммирования масла. Способ дегуммирования масла может быть осуществлен ферментативно с использованием ферментов фосфолипаз. Фосфолипазы А1 и А2 применяли для дегуммирования масла в различных коммерческих способах, например дегуммирование ΕΝΖΥΜΛΧ'1™ (Ьигд1 ЫГе 8с1епсе Тесбпо1од1ез ОтЬН, Оегтапу). Фосфолипазу С (РЬС) также предлагали для дегуммирования масла, так как остаток фосфата, образуемый при ее действии на фосфолипиды, обладает высокой растворимостью в воде и легко удаляется, а диглицерид может оставаться в масле, и потери снижаются; смотри, например, ОобГгеу, Т. апб ^ез! 8. (1996) 1пбиз!йа1 Епхуто1оду, р. 299-300, 8!оск!оп Ргезз, Νον Υо^к; ОаЫке (1998) Ап еп/утабс ргосезз Гог !бе рбузюа1 гейшпд оГ зееб ойз, Сбет. Епд. Тесбпо1., 21: 278-281; С1аизеп (2001) Епгутайс ой бедитттд Ьу а поуе1 т1сгоЬ1а1 рбозрбобразе, Еиг. 1. Ыр1б 8ск Тесбпо1., 103: 333-340.
Масла с высоким содержание фосфатидов, такие как соевое масло, масло канолы и подсолнечника, обрабатывают по-другому, не так как другие масла, такие как пальмовое масло. В отличие от паровой обработки или способа физической рафинации, используемых для масел с низким содержанием фосфатидов, такие масла с высоким содержанием фосфора требуют химических и механических обработок для удаления фосфорсодержащих фосфолипидов. Такие масла обычно рафинируют химически способом, который приводит к нейтрализации свободных жирных кислот с образованием мыла и фракции нерастворимых смол. Способ нейтрализации является очень эффективным для удаления свободных жирных кислот и фосфолипидов, но такой способ также приводит к значительным потерям выхода продукта и ухудшению качества. В некоторых случаях неочищенное масло с высоким содержанием фосфатидов
- 1 015591 подвергают дегуммированию на стадии, предшествующей нейтрализации щелочью. Такой способ подходит для соевого масла, используемого для получения лецитина, когда масло сначала подвергают дегуммированию с использованием воды или кислоты.
Фитостерины (растительные стерины) являются представителями семейства природных продуктов тритерпенов, которое включает в себя более 100 разных фитостеринов и более 4000 других типов тритерпенов. В общем, считают, что фитостерины стабилизируют растительные мембраны, при этом увеличение соотношения стерин/фосфолипид приводит к увеличению жесткости мембран. Химически фитостерины очень похожи на холестерин по структуре, и предполагается, что они регулируют текучесть мембран растений, как и холестерин в мембранах животных. Основными фитостеринами являются β-ситостерин, кампестерин и стигмастерин. К другим фитостеринам относятся стигмастанол (β-ситостанол), ситостанол, десмостерин, дигидробрассикастерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин и брассикастерин.
Растительные стерины являются важными сельскохозяйственными продуктами для медицинской и пищевой промышленности. Они применимы как эмульгаторы в косметической промышленности и составляют большую часть промежуточных продуктов и предшественников стероидов для получения гормональных фармацевтических средств. Насыщенные аналоги фитостеринов и их сложные эфиры были предложены в качестве эффективных снижающих содержание холестерина средств, полезных в области кардиологии. Растительные стерины снижают уровни холестерина в сыворотке, ингибируя всасывание холестерина в просвете кишечника, и обладают иммуномодулирующими свойствами при чрезвычайно низких концентрациях, включая усиленный клеточный ответ Т-лимфоцитов и цитотоксическую способность клеток-природных киллеров, направленную против линии злокачественных клеток. Кроме того, показано их терапевтическое действие в клинических исследованиях при лечении туберкулеза легких, ревматоидного артрита, лечении зараженных ВИЧ пациентов и для подавления иммунного стресса у бегунов на длинные дистанции.
Сложные эфиры растительных стеринов, также называемые сложными эфирами фитостеринов, одобрены Администрацией по контролю за продуктами питания и лекарствами (ΡΌΑ) США как полностью безопасные ΟΚΑ.8 (Оеиега11у Ясеощпхсб Ак 8аРе) средства для применения в маргаринах и бутербродных пастах в 1999 году. В сентябре 2000 года ΡΌΑ также опубликовала внутренний регламент, который позволяет маркировать пищевые продукты, содержащие сложные эфиры фитостеринов, с указанием информации о пользе для здоровья. Следовательно, обогащение продуктов питания сложными эфирами фитостеринов особенно требуется для признания товара потребителем.
Соевое масло широко используют, и оно является важным пищевым продуктом, составляя ~30% продукции масла из семян и фруктов. Соевые бобы содержат только 20% масла, и экстракцию обычно осуществляют, используя растворитель, такой как гексан, в коммерческом масштабе. Признанное качество соевого масла и питательная ценность пищевого белка делает сою основной масличной культурой. Перед экстракцией соевые бобы необходимо очистить, раздробить и получить хлопья, так как для эффективной экстракции масла растворителем требуется, чтобы каждая содержащая масло клетка была разрушена, чтобы улучшить перенос вещества. Клеточные стенки, главным образом состоящие из целлюлозы в сочетании с гемицеллюлозами, пектиновыми веществами и лигнином, также могут быть разрушены с помощью ферментов, чтобы достичь значительного повышения выходов и скоростей экстракции.
Содержащее диацилглицерин (ΌΑΟ) масло является пищевым маслом, содержащим 80% или большее количество ΌΑΟ по сравнению с природными жирными кислотами. Показано, что у людей повышение уровня триглицеридов в хиломикронах после приема пищи заметно ниже после употребления в пищу эмульсии ΌΑΟ-масла по сравнению с ΤΑΟ-маслом со сходным составом жирных кислот. В исследованиях, проводимых на мужчинах японцах и мужчинах и женщинах американцах, длительное потребление ΌΑΟ-содержащего масла стимулировало потерю массы и уменьшение количеств жира в организме. В одном исследовании показано, что замена обычного масла для приготовления пищи ΌΑΟ-содержащим маслом снижает частоту ожирения и другие факторы риска.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8ЕО ΙΌ N0: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Ε41Α, Е41\\, Е41Р, Ε41Υ, Е41К, Е94Я. Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ш00У, Α104Ε, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Κ, Ό234Κ или Ц265К. на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более остатков, и в одном аспекте нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной (РЬ) активностью, например активностью фосфолипазы Α (ΡΕΑ), фосфолипазы С (РЬС) или фосфолипазы Ό (РЬО), или любой
- 2 015591 комбинацией фосфолипазных активностей, например активностью РБА, РБС и/или РББ в виде многофункциональной активности. В одном аспекте идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра.
В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8ЕО ΙΌ N0: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, 0100Б, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, 1)100\\\ А104Б, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, О171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Κ, Ό234Κ или Р265К на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более последовательных остатков, и в одном аспекте нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной (РБ) активностью, например активностью фосфолипазы А, С или Ό или любой комбинацией фосфолипазных активностей, например активностью РЬА, РЬС и/или РЕО в виде многофункциональной активности. В одном аспекте идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра.
В альтернативных аспектах изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий последовательность, которая указана в 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8ЕО ΙΌ N0: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Е4М, Е41К, Е94К, 1)10(4., Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Б, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Б171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Κ, Ό234Κ или Р265К. В одном аспекте такие полипептиды обладают фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В, С или Ό, или любой комбинацией фосфолипазных активностей, например активностью РЬА, РЬС и/или РББ в виде многофункциональной активности.
В одном аспекте алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм ВБА8Т, такой как алгоритм ВБА8Т в версии 2.2.2. В одном аспекте устанавливают параметры фильтрования -р Ыайр -й пг ра1аа -Е Р и все другие опции устанавливают по умолчанию.
В альтернативных аспектах изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности или последовательности пробелка или гомологичной промоторной последовательности; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью и дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность, или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или метку или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из ^концевого и/или С-концевого удлинения для направления к эндоплазматическому ретикулуму (ЕК) или внутриклеточным мембранам, или к эндоплазматическому ретикулуму (ЕК) или системе внутриклеточных мембран растений, или гетерологичная последовательность кодирует сайт рестрикции; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную промоторную последовательность, содержащую или состоящую из конститутивного или индуцируемого промотора или специфичного для клеток промотора, или специфичного для растений промотора, или специфичного для бактерий промотора.
В одном аспекте фосфолипазная активность заключается в катализе гидролиза глицерофосфатной сложноэфирной связи (т. е. расщепления глицерофосфатных сложноэфирных связей).
Фосфолипазная активность может заключаться в катализе гидролиза сложноэфирной связи в фосфолипиде растительного масла. Фосфолипид растительного масла может содержать фосфолипид семян масличных культур. Фосфолипазная активность может включать активность фосфолипазы С (РЬС); активность фосфолипазы А (РЬА), такую как активность фосфолипазы А1 или фосфолипазы А2; активность фосфолипазы Ό (РБО), такую как активность фосфолипазы Ό1 или фосфолипазы Ό2; активность фосфолипазы В (РБВ), например активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (БРТА), или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) и лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТА); или активность пататина или их комбинацию. Фосфолипазная активность может заключаться в гидролизе гликопротеида, например гликопротеида, обнаруженного в клубне картофеля. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя липидацилгидролазную (БАН) активность. В одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению может обладать многофункциональной
- 3 015591 активностью, например комбинацией одной или нескольких ферментативных активностей, описанных в настоящей публикации, например фосфолипаза согласно изобретению может обладать активностью РЬС и РЬЛ; активностью РЬВ и РЬЛ; активностью РЬС и РЬЭ; активностью РЬС и РЬВ; активностью РЬВ и пататина; активностью РЬС и пататина; РЬЭ и РЬЛ; активностью РЬЭ, РЬЛ, РЬВ и РЬС; или активностью РЬЭ, РЬЛ, РЬВ, РЬС и пататина; или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТЛ), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) и лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТЛ), или любой их комбинацией.
Например, в одном аспекте полипептид согласно изобретению является ферментативно активным, но не имеет липазной активности, например не имеет какой-либо ферментативной активности, которая оказывает влияние на нейтральную фракцию масла (триглицериды). Может быть желательным применение такого полипептида в конкретном способе, например в способе дегуммирования, при котором важно, чтобы нейтральная фракция масла не повреждалась (не уменьшалась, например не гидролизовалась). Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ дегуммирования, включающий в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности.
В одном аспекте изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, который является термостабильным. Например, полипептид согласно изобретению, например вариантные или измененные ферменты согласно изобретению, например конкретные варианты последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 2, 8Е0 ΙΌ N0: 175, 8Е0 ΙΌ N0: 175, 8Е0 ΙΌ N0: 177 и 8Е0 ΙΌ N0: 178, которые указаны в табл. 5 и в примерах 4 и 7, могут быть термостабильными. Термостабильный полипептид согласно изобретению может сохранять связывающую и/или ферментативную активность, например фосфолипазную активность, в условиях, включающих в себя температуру в диапазоне примерно от -100 до примерно -80°С, примерно от -80 до примерно -40°С, примерно от -40 до примерно -20°С, примерно от -20 до примерно 0°С, примерно от 0 до примерно 37°С, примерно от 0 до примерно 5°С, примерно от 5 до примерно 15°С, примерно от 15 до примерно 25°С, примерно от 25 до примерно 37°С, примерно от 37 до примерно 45°С, примерно от 45 до примерно 55°С, примерно от 55 до примерно 70°С, примерно от 70 до примерно 75°С, примерно от 75 до примерно 85°С, примерно от 85 до примерно 90°С, примерно от 90 до примерно 95°С, примерно от 95 до примерно 100°С, примерно от 100 до примерно 105°С, примерно от 105 до примерно 110°С, примерно от 110 до примерно 120°С или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. Термостабильные полипептиды согласно изобретению могут сохранять активность, например фосфолипазную активность, при температурах в диапазоне примерно от -100 до примерно -80°С, примерно от -80 до примерно -40°С, примерно от -40 до примерно -20°С, примерно от -20 до примерно 0°С, примерно от 0 до примерно 5°С, примерно от 5 до примерно 15°С, примерно от 15 до примерно 25°С, примерно от 25 до примерно 37°С, примерно от 37 до примерно 45°С, примерно от 45 до примерно 55°С, примерно от 55 до примерно 70°С, примерно от 70 до примерно 75°С, примерно от 75 до примерно 85°С, примерно от 85 до примерно 90°С, примерно от 90 до примерно 95°С, примерно от 95 до примерно 100°С, примерно от 100 до примерно 105°С, примерно от 105 до примерно 110°С, примерно от 110 до примерно 120°С или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. В некоторых вариантах термостабильные полипептиды согласно изобретению сохраняют активность, например фосфолипазную активность, при температуре в описанных выше диапазонах при значении рН, составляющем примерно рН 3,0, примерно рН 3,5, примерно рН 4,0, примерно рН 4,5, примерно рН 5,0, примерно рН 5,5, примерно рН 6,0, примерно рН 6,5, примерно рН 7,0, примерно рН 7,5, примерно рН 8,0, примерно рН 8,5, примерно рН 9,0, примерно рН 9,5, примерно рН 10,0, примерно рН 10,5, примерно рН 11,0, примерно рН 11,5, примерно рН 12,0 или более.
В другом аспекте изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, который является термоустойчивым. Например, полипептид согласно изобретению, например вариантные или измененные ферменты согласно изобретению, например конкретные варианты последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 2, 8ЕО ΙΌ N0: 175, 8ЕО ΙΌ N0: 175, 8ЕО ΙΌ N0: 177 и 8ЕО ΙΌ N0: 178, которые указаны в табл. 5 и в примере 4 и 7, могут быть термоустойчивыми или термоактивными. Термоустойчивые полипептиды согласно изобретению могут сохранять связывающую и/или ферментативную активность, например фосфолипазную активность, после воздействия условий, включающих в себя температуру в диапазоне примерно от -100 до примерно -80°С, примерно от -80 до примерно -40°С, примерно от -40 до примерно -20°С, примерно от -20 до примерно 0°С, примерно от 0 до примерно 5°С, примерно от 5 до примерно 15°С, примерно от 15 до примерно 25°С, примерно от 25 до примерно 37°С, примерно от 37 до примерно 45°С, примерно от 45 до примерно 55°С, примерно от 55 до примерно 70°С, примерно от 70 до примерно 75°С, примерно от 75 до примерно 85°С, примерно от 85 до примерно 90°С, примерно от 90 до примерно 95°С, примерно от 95 до примерно 100°С, примерно от 100 до примерно 105°С, примерно от 105 до примерно 110°С, примерно от 110 до примерно 120°С или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
- 4 015591
112, 113, 114, 115°С или выше. Термоустойчивые полипептиды согласно изобретению могут сохранять активность, например фосфолипазную активность, после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100 до примерно -80°С, примерно от -80 до примерно -40°С, примерно от -40 до примерно -20°С, примерно от -20 до примерно 0°С, примерно от 0 до примерно 5°С, примерно от 5 до примерно 15°С, примерно от 15 до примерно 25°С, примерно от 25 до примерно 37°С, примерно от 37 до примерно45°С, примерно от 45 до примерно 55°С, примерно от 55 до примерно 70°С, примерно от 70 до примерно75°С, примерно от 75 до примерно 85°С, примерно от 85 до примерно 90°С, примерно от 90 до примерно95°С, примерно от 95 до примерно 100°С, примерно от 100 до примерно 105°С, примерно от 105 до примерно 110°С, примерно от 110 до примерно 120°С или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. В некоторых вариантах термоустойчивые полипептиды согласно изобретению сохраняют активность, например фосфолипазную активность, после воздействия температуры в описанных выше диапазонах при значении рН, составляющем примерно рН 3,0, примерно рН 3,5, примерно рН 4,0, примерно рН 4,5, примерно рН 5,0, примерно рН 5,5, примерно рН 6,0, примерно рН 6,5, примерно рН 7,0, примерно рН 7,5, примерно рН 8,0, примерно рН 8,5, примерно рН 9,0, примерно рН 9,5, примерно рН 10,0, примерно рН 10,5, примерно рН 11,0, примерно рН 11,5, примерно рН 12,0 или более. В одном аспекте полипептид сохраняет фосфолипазную или другую активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 90 до примерно 95°С при рН 4,5.
В одном аспекте изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, которая указана в 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8ЕО ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41М, Е41Е, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Μ, А104Ь, Э111В, Т112В, Υ116Μ, Ι117Μ, Р118М, Е125К, 8168Ν, Э171У, Э171Е, Μ176Μ, Э230Н, Э230В, Ό234Μ, Э234У, Ό234Ο, Э234В, Э234К или 0265В, при этом нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью. Нуклеиновая кислота может иметь длину, составляющую по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, или длину остатков или иметь полную длину гена или транскрипта с сигнальной последовательностью, которая описана в настоящей публикации, или без нее. Условия жесткости могут представлять собой условия высокой жесткости, умеренной жесткости или низкой жесткости, которые описаны в настоящей публикации. Условия жесткости могут включать стадию промывки, например стадию промывки, которая заключается в промывке в 0,2х 88С при температуре около 65°С в течение примерно 15 мин.
В настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, применяемая в качестве зонда для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с ферментативной активностью, например фосфолипазной активностью, при этом зонд содержит по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или больше следующих друг за другом оснований последовательности согласно изобретению, например последовательности, которая указана в 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8ЕО ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41М, Е41Е, Ξ41Υ, Е41В, Е94В, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Μ, А104Ь, Э111В, Т112В, Υ116Μ, Ι117Μ, Р118М, Е125К, 8168Н Э171У, Э171Е, Μ176Μ, Э230Н, Э230В, Ό234Μ, Э234У, Ό234Ο, Э234В, Э234К или 0265В, и зонд позволяет идентифицировать нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий примерно 10100 следующих друг за другом оснований последовательности согласно изобретению или ее фрагментов или подпоследовательностей, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 оснований или более, или имеющий любую требуемую длину в пределах последовательности, которая указана в 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41М, Е41Е, Ξ41Υ, Е41В, Е94В, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Μ, А104Ь, Э111В, Т112В, Υ116Μ, Ι117Μ, Р118М, Е125К, 8168Н Э171У, Е41А, Е41М, Е41Е, Ξ41Υ, Е41В, Е94В, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Μ, А104Ь, Э111В, Т112В, Υ116Μ, Ι117Μ, Р118М, Е125К, 3168Н Э171У, Э171Е, Μ176Μ, Э230Н, Э230В, Ό234Μ, Э234У, Ό234Ο, Э234В, Э234К или 0265В.
В настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, применяемая в качестве зонда для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с ферментативной активностью, например фосфолипазной активностью, при этом зонд содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению, например нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41М, Е41Е, Β41Υ, Е41В, Е94В, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Μ, А104Ь, Э111В, Т112В, Υ116Μ, Ι117Μ, Р118М, Е125К, 8168Н Э171У, Е41А, Е41М, Е41Е, Ξ41Υ, Е41В, Е94В, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Μ, А104Ь, Э111В, Т112В, Υ116Μ, Ι117Μ, Р118М, Е125К, 8168Н Э171У, Э171Е, Μ176Μ, Э230Н, Э230В, Ό234Μ, Э234У, Ό234Ο, Э234В, Э234К или 0265В, или ее подпоследовательности на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более следующих друг за
- 5 015591 другом остатков; и в одном аспекте идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра.
В настоящем изобретении предлагается пара последовательностей амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, при этом пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность согласно изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно от 10 до 50 следующих друг за другом оснований последовательности или примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более следующих друг за другом оснований последовательности.
В настоящем изобретении предлагается пара праймеров для амплификации, при этом пара праймеров содержит первый член, имеющий последовательность, которая представлена первыми (5'-) примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и второй член, имеющий последовательность, которая представлена первыми (5'-) примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками комплементарной нити первого члена.
В настоящем изобретении предлагаются фосфолипазы, полученные посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы получения фосфолипазы посредством амплификации, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации согласно изобретению. В одном аспекте пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например библиотеки генов, такой как библиотека генов из окружающей среды.
В настоящем изобретении предлагаются способы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающие в себя амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с пары последовательностей праймеров для амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Парой праймеров для амплификации может быть пара праймеров для амплификации согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются кассеты экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или ее подпоследовательность. В одном аспекте кассета экспрессии может содержать нуклеиновую кислоту, которая оперативно связана с промотором. Промотор может представлять собой промотор вируса, бактерии, млекопитающего или растения. В одном аспекте растительным промотором может быть промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может быть конститутивным промотором. Конститутивным промотором может быть промотор СаМУ358. В другом аспекте промотор может быть индуцируемым промотором. В одном аспекте промотор может быть тканеспецифичным промотором или регулируемым факторами окружающей среды или регулируемым при развитии промотором. Таким образом, промотор может быть специфичным для семян, специфичным для листьев, специфичным для корней, специфичным для стебля или индуцируемым опаданием промотором. В одном аспекте кассета экспрессии может дополнительно содержать экспрессирующий вектор растения или вируса растений.
В настоящем изобретении предлагаются носители для клонирования, содержащие кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению или нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может представлять собой аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса. Носитель для клонирования может представлять собой бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, полученный на основе бактериофага Р1 вектор (РАС), дрожжевую искусственную хромосому (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих (МАС).
В настоящем изобретении предлагается трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту согласно изобретению, или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению, или носитель для клонирования согласно изобретению. В одном аспекте трансформированная клетка может быть клеткой бактерии, клеткой млекопитающего, клеткой гриба, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой. В одном аспекте растительная клетка может быть клеткой картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя.
В настоящем изобретении предлагаются трансгенные животные, отличные от человека, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению. В одном аспекте животным является мышь, крыса, коза, кролик, овца, свинья или корова или другое млекопитающее.
В настоящем изобретении предлагаются трансгенные растения, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению. Трансгенным растением может быть растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, рас
- 6 015591 тение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака. В настоящем изобретении предлагаются трансгенные семена, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению. Трансгенным семенем может быть семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса (растение канолы), семя сои, косточка пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, арахис, зерно риса или семя растения табака.
В настоящем изобретении предлагается антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования трансляции фосфолипазной матрицы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагается антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования трансляции фосфолипазной матрицы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Антисмысловой олигонуклеотид может иметь длину примерно от 10 до 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70, примерно от 40 до 80, примерно от 60 до 100, примерно от 70 до 110 или примерно от 80 до 120 оснований.
В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования трансляции фосфолипазы, например фосфолипазной матрицы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются двунитевые ингибирующие молекулы РНК (РНК1), содержащие подпоследовательность последовательности согласно изобретению. В одном аспекте РНК1 имеет длину примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше дуплексов нуклеотидов. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования экспрессии фосфолипазы, например фосфолипазы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке двунитевой ингибирующей РНК (ί-РНК), при этом РНК содержит подпоследовательность последовательности согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательностей с типичным полипептидом или пептидом согласно изобретению (например, последовательностями 8ЕО ГО N0: 175 или 8ЕО ГО N0: 176, имеющими одну или несколько мутаций Е41А, Е41А, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Τ, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, 0100А. А104Ь, Ό111Κ, Т112К, У116А, 1117А, Р118А, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, Е41А, Е41А, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Τ, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Α, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116Α, 1117А, Р118А, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, Ό171Ε, М176А, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234Α, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ, Ό234Κ, или Р265К, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 или больше остатков, или на протяжении полной длины полипептида; и в одном аспекте идентичности последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра.
В одном аспекте настоящего изобретения предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше, или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью 8ЕО ГО N0: 175 или 8ЕО ГО N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41 А, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Τ, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Α, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116Α, 1117А, Р118А, Е125К, 8168^ Ό171ν, Е41А, Е41А, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Τ, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100Α, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116Α, 1117А, Р118А, Е125К, 8168^ Ό171ν, Ό171Ε, Μ176Α, Ό230Η, Ό230Κ, П234А, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ, О234К или Р265К.
В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, кодируемые нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В альтернативных аспектах полипептид может иметь последовательность, которая указана в 8ЕО ГО N0: 175 или 8Е0 ГО N0: 176, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41А, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Τ, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, 0100А, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, У116А, 1117А, Р118А, Е125К, 8168^ Ό171ν, Е41А, Е41А, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Τ, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, П100А, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116Α, 1117А, Р118А, Е125К, 8168^ Ό171ν, Ό171Ε, Μ176Α, Ό230Η, Ό230Κ, П234А, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ,
- 7 015591
Ό234Κ или 0265К Полипептид может обладать фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В, С или Ό, или любой комбинацией фосфолипазной активности, например активностью РЬЛ, РЬС и/или РЬИ в виде многофункциональной активности. Например, в одном аспекте полипептид согласно изобретению является ферментативно активным, но не имеет липазной активности, например не имеет какой-либо ферментативной активности, которая оказывает влияние на нейтральную фракцию масла (триглицериды). В одном аспекте изобретения предлагается способ дегуммирования, включающий в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности, так чтобы в способе дегуммирования любая нейтральная фракция масла не повреждалась (не уменьшалась, не изменялась, не разрушалась, например, не гидролизовалась).
В альтернативных аспектах полипептиды согласно настоящему изобретению обладают фосфолипазной активностью, но не имеют сигнальной последовательности или последовательности пробелка; или обладают фосфолипазной активностью и дополнительно содержат гетерологичную аминокислотную последовательность, или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность. В одном аспекте гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или метку или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность; в одном аспекте гетерологичная (лидерная) сигнальная последовательность содержит или состоит из Ν-концевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматический ретикулум (ЕК) или внутриклеточную мембрану, или в эндоплазматический ретикулум (ЕК) или систему внутриклеточных мембран растения, или гетерологичная последовательность кодирует сайт рестрикции.
В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие полипептид согласно изобретению, не имеющий сигнальной последовательности. В одном аспекте полипептид, в котором отсутствует сигнальная последовательность, имеет по меньшей мере 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с остатками 30-287 последовательности 8Е0 Ш N0: 175 или 8Е0 Ш N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\У, Е41Е, Е41У, Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100№, А104Ь, Ό111Β, Т112К, Υ116№, 1117№, Р118№, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, Е41А, Е41№, Е41Е, Β41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100№, А104Ь, Ό111Β, Т112К, Υ116№, 1117№, Р118№, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, Μ176№, Ό230Η, Ό230Β, Ό234№, Ό234ν, Ό2346, Ό234Β, Ό234Κ или О265К. Идентичности последовательностей можно определить в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид или пептид, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 или больше следующих друг за другом оснований полипептидной или пептидной последовательности согласно изобретению, по существу, идентичных ей последовательностей и комплементарных им последовательностей. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, участок связывания) или активный участок.
В одном аспекте изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид согласно изобретению (с сигнальной последовательностью или без нее) обладает фосфолипазной активностью. В одном аспекте фосфолипазная активность заключается в катализе гидролиза глицерофосфатной сложноэфирной связи (т.е. расщепления глицерофосфатных сложноэфирных связей). Фосфолипазная активность может заключаться в катализе гидролиза сложноэфирной связи в фосфолипиде растительного масла. Фосфолипид растительного масла может содержать фосфолипид семян масличных культур. Фосфолипазная активность может включать в себя активность фосфолипазы С (РЬС); активность фосфолипазы А (РИА), такую как активность фосфолипазы А1 или фосфолипазы А2; активность фосфолипазы Ό (РЬИ), такую как активность фосфолипазы Ό1 или фосфолипазы Ό2; активность фосфолипазы В (РЬВ), например активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазытрансацилазы (ЬРТА), или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) и лизофосфолипазытрансацилазы (ЬРТА); или активность пататина или их комбинацию. Например, в одном аспекте фосфолипаза обладает комбинацией одной или нескольких ферментативных активностей, описанных в настоящей публикации, например фосфолипаза может обладать активностью РЬС и РИА; активностью РЬВ и РИА; активностью РЬС и РЬИ; активностью РЬС и РЬВ; активностью РЬВ и пататина; активностью РЬС и пататина; РЬИ и РИА; активностью РЬИ, РИА, РЬВ и РЬС; или активностью РЬИ, РИА, РЬВ, РЬС и пататина; или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТА), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) и лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТА), или любой их комбинацией.
Фосфолипазная активность может заключаться в гидролизе гликопротеида, например гликопротеида, обнаруженного в клубне картофеля. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя активность липидацилгидролазы (ЬАН).
- 8 015591
В одном аспекте изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид согласно изобретению, в котором отсутствует сигнальная последовательность. В одном аспекте изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид согласно изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность фосфолипазы или другого белка, отличного от фосфолипазы.
В одном аспекте настоящего изобретения предлагаются химерные белки, содержащие первый домен, включающий в себя сигнальную последовательность согласно изобретению, и, по меньшей мере, второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может включать в себя фермент. Ферментом может быть фосфолипаза.
В настоящем изобретении предлагаются химерные полипептиды, содержащие, по меньшей мере, первый домен, включающий в себя сигнальный пептид (8Р) согласно изобретению или каталитический домен (СЭ), или активный участок фосфолипазы согласно изобретению, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, при этом гетерологичный полипептид или пептид в природе не связан с сигнальным пептидом (8Р) или каталитическим доменом (СЭ). В одном аспекте гетерологичный полипептид или пептид не является фосфолипазой. Гетерологичный полипептид или пептид может быть расположен на аминоконце, карбоксильном конце или на обоих концах сигнального пептида (8Р) или каталитического домена (СЭ).
В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный полипептид, при этом химерный полипептид содержит, по меньшей мере, первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р) или каталитический домен (СЭ), или активный участок полипептида согласно изобретению, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, при этом гетерологичный полипептид или пептид в природе не связан с сигнальным пептидом (8Р) или каталитическим доменом (СЭ).
В одном аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности примерно при 37°С в диапазоне примерно от 10 до примерно 100 единиц на миллиграмм белка. В другом аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм, примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка. Альтернативно, фосфолипазная активность соответствует удельной активности при 37°С в диапазоне примерно от 100 до примерно 500 единиц на миллиграмм белка. В одном аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности при 37°С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на 1 миллиграмм белка. В другом аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности при 37°С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В другом аспекте термоустойчивость заключается в сохранении, по меньшей мере, половины удельной активности фосфолипазы при 37°С после нагревания до повышенной температуры. Альтернативно, термоустойчивость может заключаться в сохранении удельной активности при 37°С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры, такой как температура примерно от 0 до примерно 20°С, примерно от 20 до примерно 37°С, примерно от 37 до примерно 50°С, примерно от 50 до примерно 70°С, примерно от 70 до примерно 75°С, примерно от 75 до примерно 80°С, примерно от 80 до примерно 85°С, примерно от 85 до примерно 90°С, примерно от 90 до примерно 95°С, примерно от 95 до примерно 100°С, примерно от 100 до примерно 110°С или выше. Альтернативно, термоустойчивость может заключаться в сохранении удельной активности при 37°С в диапазоне примерно от 1 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка или примерно от 500 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры. В другом аспекте термоустойчивость может заключаться в сохранении удельной активности при 37°С в диапазоне примерно от 1 до примерно 500 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры, как описано выше.
В настоящем изобретении предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид согласно изобретению, при этом полипептид содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может быть Ν-связанным гликозилироваиием. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в Р. райопк или 8. рошЬе.
В настоящем изобретении предлагаются ферменты фосфолипазы и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют, имеющие последовательность любой из иллюстративных фосфолипаз согласно изобретению, с одним или несколькими или всеми измененными сайтами гликозилирования, которые описаны выше. Таким образом, изобретение относится к способам пслучения вариантов последовательностей, кодирующих фосфолипазы, имеющим повышенную экспрессию в клетке-хозяине, при этом способ включает в себя модификацию кодирующей фосфолипазу последовательности согласно изобретению, так что один, несколько или все мотивы, кодирующие Ν-связанные сайты гликозилирования, модифицируют с получением не гликозилируемого мотива. Изобретение также относится к кодирующей фосфолипазу последовательности, полученной таким способом, и к ферментам, кодируемым такой последовательностью.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения варианта кодирующей фосфолипазу последовательности, кодирующей фосфолипазу, имеющую повышенную резистентность к протеазам,
- 9 015591 включающие в себя модификацию аминокислоты, эквивалентной аминокислоте в положении 131 последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 175 или 8Е0 ΙΌ N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41А, Е41Е, Ε41Υ, Е41Я, Е94Я, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Э100Е, Э100А, Л104Ь, Ό111Κ, Т112Я, Υ116Α, Ι117Α, Р118А, Е125К, 8168Ν, Э171У, Е41А, Е41А, Е41Е, Е4ГТ, Е41Я, Е94Я, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Э100Е, Э100А, А104Ь, Ό111Κ, Т112Я, Υ116Α, Ι117Α, Р118А, Е125К, 8168Ν, Э171У, Э171Е, Μ176Α, Ό230Η, Ό230Κ, Э234А, Э234У, Э234С, Ό234Κ, Э234К или Р265Я, с получением одного, нескольких или всех из следующих остатков: лизина (К); серина (8); глицина (С); аргинина (Я); глутамина (Р); аланина (А); изолейцина (I); гистидина (Η); фенилаланина (Е); треонина (Т); метионина (Μ); лейцина (Ь). Изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным фосфолипазам, кодируемым последовательностью, полученной таким способом.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения варианта кодирующей фосфолипазу последовательности, кодирующей фосфолипазу, имеющую пониженную резистентность к протеазам, включающим в себя модификацию аминокислоты, эквивалентной аминокислоте в положении 131 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 175 или 8Е0 ΙΌ N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41А, Е41Е, Ξ41Υ, Е41Я, Е94Я, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Э100Е, Э100А, А104Ь, Ό111Κ, Т112Я, Υ116Α, Ι117Α, Р118А, Е125К, 8168^ Э171У, Е41А, Е41А, Е41Е, Е4ЕУ, Е41Я, Е94Я, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Э100Е, Э100А, А104Ь, Ό111Κ, Т112Я, Υ116Α, Ι117Α, Р118А, Е125К, 8168^ Э171У, Э171Е, Μ176Α, Ό230Η, Ό230Κ, Э234А, Э234У, Э234С, Ό234Κ, Э234К или О265Н с получением одного, нескольких или всех из следующих остатков: триптофана (А); глутамата (Е); тирозина (Υ). Изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным фосфолипазам, кодируемым последовательностью, полученной таким способом.
В настоящем изобретении предлагаются препараты белков, содержащие полипептид согласно изобретению, при этом препарат белка представляет собой жидкость, твердое вещество или гель.
В настоящем изобретении предлагаются гетеродимеры, содержащие полипептид согласно изобретению и второй белок или домен. Второй член гетеродимера может представлять собой другую фосфолипазу, другой фермент или другой белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид и гетеродимер может быть слитым белком. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются гомодимеры, содержащие полипептид согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются иммобилизованные полипептиды, обладающие фосфолипазной активностью, при этом полипептид содержит полипептид согласно изобретению, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению, или полипептид содержит полипептид согласно изобретению и второй домен (например, слитый белок). В одном аспекте полипептид согласно изобретению иммобилизован на клетке, везикуле, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, кристаллах, таблетке, пилюле, капсуле, порошке, агломерате, поверхности, пористой структуре, матрице или капиллярной трубке. В одном аспекте полипептид согласно изобретению иммобилизован на таком материале, как зерна, шелуха, кора, кожа, волос, эмаль, кость, раковина и полученные из них материалы или вещества корма животных, или их сочетания. Полипептиды согласно изобретению (например, фосфолипазы) также могут присутствовать отдельно или в виде смеси фосфолипаз или фосфолипаз и других гидролитических ферментов, таких как целлюлазы, ксиланазы, протеазы, липазы, амилазы или окислительновосстановительные ферменты, такие как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы или редуктазы. Они могут быть приготовлены в твердой форме, такой как порошок, лиофилизованные препараты, гранулы, таблетки, пластинки, кристаллы, капсулы, пилюли, подушечки, или в жидкой форме, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, взвесь, эмульсия вода/масло, в виде крема, капсулы, везикулярной или мицеллярной суспензии. В одном аспекте такие препараты согласно изобретению могут содержать любой из следующих ингредиентов или их сочетание: полиолы, такие как полиэтиленгликоли, поливиниловые спирты, глицерин, сахара, такие как сахароза, сорбит, трегалоза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, гелеобразующие агенты, такие как камеди, каррагинаны, альгинаты, декстраны, производные целлюлозы, пектины, соли, такие как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид цинка, сульфат цинка, соли жирных кислот и их производные, хелаторы металлов, такие как ЕЭТА, ЕСТА, цитрат натрия, противомикробные средства, такие как жирные кислоты, их производные, парабены, сорбаты, бензоаты, дополнительные соединения для блокирования действия протеаз, такие как белки-наполнители, такие как БСА, гидролизаты пшеницы, боратные соединения, эмульгаторы, такие как неионогенные и ионогенные детергенты, которые можно использовать по отдельности или в сочетании, фитостерины, витамины, аминокислоты, восстановители, такие как цистеин, или антиоксидантные соединения, такие как аскорбиновая кислота, также могут быть включены диспергирующие вещества.
В одном аспекте используют поперечное сшивание и модификацию белков, такую как пегилирование, модификация жирными кислотами и гликозилирование, чтобы повысить стабильность полипептида согласно изобретению (например, ферментативную стабильность). В одном аспекте полиолы и/или сахара составляют примерно от 5 до примерно 60% препарата или более, примерно от 10 до примерно 50%
- 10 015591 препарата, примерно от 20 до примерно 40% препарата или примерно от 5 до примерно 20% препарата. В другом аспекте гелеобразующие агенты составляют примерно от 0,5 до примерно 10% препарата, примерно от 1 до примерно 8% препарата, примерно от 2 до примерно 5% препарата или примерно от 0,5 до примерно 3% препарата. В другом аспекте соли, такие как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция и/или хлорид магния, составляют примерно от 1 до примерно 30% препарата, примерно от 2 до примерно 20% препарата, примерно от 5 до примерно 15% препарата или примерно от 1 до примерно 10% препарата. В другом аспекте хлорид цинка присутствует в препарате в концентрациях, составляющих примерно от 0,1 до примерно 20 мМ, примерно от 0,5 до примерно 10 мМ, примерно от 1 до примерно 5 мМ или примерно от 0,1 до примерно 5 мМ. В еще одном аспекте сульфат цинка присутствует в препарате в концентрациях, составляющих примерно от 0,1 до примерно 20 мМ, примерно от 0,5 до примерно 10 мМ, примерно от 1 до примерно 5 мМ или примерно от 0,1 до примерно 5 мМ. В другом аспекте соли жирных кислот и/или их производные составляют примерно от 5 до примерно 40% препарата, примерно от 10 до примерно 30% препарата, примерно от 15 до примерно 25% препарата или примерно от 5 до примерно 20% препарата. В другом аспекте хелаторы металлов, такие как ΕΌΤΆ, ЕСТА и/или цитрат натрия, присутствуют в препарате в концентрациях, составляющих от 0,1 до примерно 10 мМ, примерно от 0,5 до примерно 8 мМ, примерно от 1 до примерно 5 мМ или примерно от 0,1 до примерно 1 мМ. В другом аспекте противомикробные препараты, такие как парабены, сорбаты и/или бензоаты, составляют примерно от 0,01 до примерно 10% препарата, примерно от 0,05 до примерно 5% препарата, примерно от 0,1 до примерно 1% препарата или примерно от 0,05 до примерно 0,5% препарата. В еще одном аспекте белки-наполнители, такие как БСА и/или гидролизаты пшеницы, составляют примерно от 1 до примерно 20% препарата, примерно от 5 до примерно 15% препарата, примерно от 2,5 до примерно 7,5% препарата или примерно от 1 до примерно 5% препарата. В другом аспекте эмульгаторы, такие как неионогенные и/или ионогенные детергенты, присутствуют в препарате в концентрациях, составляющих примерно от 1 х критической концентрации мицеллообразования (СМС) до примерно 10х СМС, примерно от 2,5х СМС до примерно 7,5х СМС, примерно от 1х СМС до примерно 5х СМС или примерно от 3х СМС до примерно 6х СМС. В другом аспекте витамины, аминокислоты, восстановители и/или антиоксиданты составляют примерно от 0,1 до примерно 5% препарата, примерно от 0,5 до примерно 4% препарата, примерно от 1 до примерно 2,5% препарата или примерно от 0,1 до примерно 1% препарата.
В настоящем изобретении предлагаются матрицы, содержащие иммобилизованный полипептид, при этом полипептид представляет собой фосфолипазу согласно изобретению или является полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются матрицы, содержащие иммобилизованную нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается матрица, содержащая иммобилизованное антитело согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфично связываются с полипептидом согласно изобретению или с полипептид, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Антитело может быть моноклональным или поликлональным антителом. В настоящем изобретении предлагаются гибридомы, содержащие антитело согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются способы выделения или идентификации полипептида с фосфолипазной активностью, включающие в себя стадии: (а) получение антитела согласно изобретению; (Ь) получение образца, содержащего полипептиды; и (с) осуществление контакта образца со стадии (Ь) с антителом со стадии (а) в условиях, при которых антитело может специфично связываться с полипептидом, что приводит, таким образом, к выделению или идентификации фосфолипазы.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения антитела против фосфолипазы, включающие в себя введение животному, отличному от человека, нуклеиновой кислоты согласно изобретению или полипептида согласно изобретению в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать гуморальный иммунный ответ, получая таким образом антитело против фосфолипазы.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения рекомбинантного полипептида, включающие в себя стадии: (а) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, оперативно связанной с промотором; и (Ь) экспрессия нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии полипептида, с получением таким образом рекомбинантного полипептида. Нуклеиновая кислота может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 175 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\У, Е41Е, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Э100М. Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100№, А104Б, Ό111Β, Т112В, Υ116№, Ι117№, Р118№, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, М176№, Ό230Η, Ό230Β, Ό234^, Ό234ν, О234С, Ό234Β, Ό234Κ или Ρ265Β, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 100 остатков, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. Нуклеиновая кислота может представлять собой нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая указана в 8ЕС ΙΌ N0: 177 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 178, имеющей
- 11 015591 одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, 1)100\\'. А104Ь, Ό111Κ, Т112В, Υ116\, 1117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, М1АДУ. Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Κ, Ό234Κ или р265К Способ может дополнительно включать в себя трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а) с получением таким образом рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке. Способ может дополнительно включать в себя внедрение в организм животного-хозяина. отличного от человека. нуклеиновой кислоты со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а) с получением таким образом рекомбинантного полипептида в организме животного-хозяина. отличного от человека.
В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, включающие в себя следующие стадии: (а) получение полипептида согласно изобретению или полипептида. кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению. или его фрагмента или варианта, (Ь) получение субстрата фосфолипазы и (с) осуществление контакта полипептида или его фрагмента или варианта со стадии (а) с субстратом со стадии (Ь) и регистрации уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции свидетельствует о выявлении полипептида, обладающего фосфолипазной активностью. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью 8ЕО ГО N0: 177 или 8Е0 ГО N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Е41У, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, 1117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, Ό234Κ или Ο265Β, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 100 остатков, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, которая указана в 8Е0 ГО N0: 177 или 8Е0 ГО N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Е41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, 1117\, Р118\, Е125К, 8168^ Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, Ό234Κ или 0265В.
В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации субстрата фосфолипазы, включающие в себя следующие стадии: (а) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение тестируемого субстрата и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с тестируемым субстратом со стадии (Ь) и регистрацию уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует тестируемый субстрат как субстрат фосфолипазы.
В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может иметь по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью 8Е0 ГО N0: 177 или 8Е0 ГО N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Е4Ж Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, 1117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, Э234К или Ο265Β, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, которая указана в 8Е0 ГО N0: 177 или 8Е0 ГО N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Е4Ж Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, 1117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, П234К или Ο265Β.
В настоящем изобретении предлагаются способы определения того, связывается ли соединение специфично с фосфолипазой, включающие в себя следующие стадии: (а) экспрессия нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, обеспечивающих трансляцию нуклеиновой кислоты с образованием полипептида, при этом нуклеиновая кислота и вектор представляют собой нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению; или получение полипептида согласно изобретению (Ь) осуществление контакта полипептида с тестируемым соединением и (с) определение того, связывается ли тестируемое соединение специфично с полипептидом, что приводит, таким образом, к определению того, что соединение специфично связывается с фосфолипазой.
В альтернативных аспектах последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью 8Е0 ГО N0: 177 или 8Е0 ГО N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Е4Ж Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, П111В, Т112В, Υ116\, 1117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, О230В, Ό234\, 0234ν, Ό234Ο, П234В, П234К или 0265В, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизует
- 12 015591 ся в жестких условиях с последовательностью, которая указана в 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, 1)100\\'. А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, Ό234Κ или Ρ265Β, или ее подпоследовательностью.
В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации модулятора фосфолипазной активности, включающие в себя следующие стадии: (а) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение тестируемого соединения; (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с тестируемым соединением со стадии (Ь); и измерение фосфолипазной активности, при этом изменение фосфолипазной активности, измеренное в присутствии тестируемого соединения по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения позволяет определять, что тестируемое соединение модулирует фосфолипазную активность.
В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может иметь по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, Ό234Κ или Ο265Β, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 100 остатков, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может гибридизоваться в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, которые указаны в 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющих одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, Ό234Κ или Ο265Β или их подпоследовательности.
В одном аспекте фосфолипазную активность измеряют, обеспечивая субстрат фосфолипазы и выявляя увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как активатор фосфолипазной активности. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как ингибитор фосфолипазной активности.
В настоящем изобретении предлагается компьютерная система, содержащая процессор и устройство накопления данных, при этом указанное устройство накопления данных используют для хранения последовательности полипептида согласно изобретению или последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
В одном аспекте компьютерная система может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательности и устройство накопления данных, в котором сохранена по меньшей мере одна эталонная последовательность. Алгоритм сравнения последовательностей может включать в себя компьютерную программу, которая показывает полиморфизм. Компьютерная система может дополнительно включать в себя идентификатор, который позволяет выявлять один или несколько характерных признаков указанной последовательности.
В настоящем изобретении предлагаются машиночитаемые носители, на которых сохранена последовательность, включающая в себя последовательность полипептида согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации характерного признака в последовательности, включающие в себя стадии (а) прочтения последовательности с использованием компьютерной программы, которая выявляет один или несколько характерных признаков в последовательности, при этом последовательность включает в себя полипептидную последовательность согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и (Ь) идентификации одного или нескольких характерных признаков с помощью компьютерной программы.
В настоящем изобретении предлагаются способы сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающие в себя стадии (а) прочтения первой последовательности и второй последовательности с помощью компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, при этом первая последовательность содержит последовательность полипептида согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и (Ь) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. В одном аспекте стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью дополнительно включает в себя стадию идентификации полиморфизма. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя идентификатор (и применение идентификатора), который идентифицирует один или несколько характерных признаков последовательности. В одном аспекте способ
- 13 015591 включает в себя прочтение первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или нескольких характерных признаков последовательности.
В настоящем изобретении предлагаются способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды, включающие в себя стадии (а) получения пары последовательностей амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, при этом пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту согласно изобретению (например, последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 177 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Б, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Κ, Ό234Κ или Ц265К, или ее подпоследовательность и т.д.); (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца, взятого из окружающей среды, или обработки образца, взятого из окружающей среды, так чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с парой праймеров для амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты со стадии (Ь) с парой праймеров для амплификации со стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца, взятого из окружающей среды, что приводит, таким образом, к выделению или извлечению нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды. В одном аспекте каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации включает в себя олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно от 10 до 50 следующих друг за другом оснований последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В одном аспекте пара последовательностей амплифицирующих праймеров представляет собой пару праймеров для амплификации согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды, включающие в себя стадии (а) получения полинуклеотидного зонда, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее подпоследовательность; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца, взятого из окружающей среды, или обработки образца, взятого из окружающей среды, так чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с полинуклеотидным зондом со стадии (а); (с) объединения изолированной нуклеиновой кислоты или обработанного образца, взятого из окружающей среды, со стадии (Ь) с полинуклеотидным зондом со стадии (а); и (ά) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидным зондом со стадии (а), что приводит, таким образом, к выделению или извлечению нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды. В альтернативных аспектах образец, взятый из окружающей среды, представляет собой образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В альтернативных аспектах биологический образец получают из бактериальной клетки, клетки простейшего, клетки насекомого, дрожжевой клетки, растительной клетки, клетки грибов, клетки водорослей, клетки лишайника или клетки млекопитающего.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфолипазу, включающие в себя стадии (а) получения матричной нуклеиновой кислоты, включающей в себя нуклеиновую кислоту согласно изобретению; (Ь) модификации, делетирования или добавления одного или нескольких нуклеотидов в последовательность матрицы или сочетания указанных изменений с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты.
В одном аспекте способ дополнительно включает в себя экспрессию варианта нуклеиновой кислоты, чтобы получить вариант фосфолипазного полипептида. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводят посредством склонной к ошибкам ПЦР, перетасовку, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборку с использованием ПЦР, мутагенез с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР), мутагенез ίη νΐνο, кассетный мутагенез, множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, вторичную сборку генов, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (Ο88Μ), вторичную сборку по механизму синтеза с использованием реакции лигирования (8ЬК) и/или используя сочетание указанных способов. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводят способом, выбранным из группы, состоящей из рекомбинации, рекомбинации последовательностей, регулируемой по типу обратной связи, мутагенеза ДНК, модифицированной фосфотиоатом, мутагенеза с использованием урацилсодержащей матрицы, мутагенеза с использованием дуплекса с пробелами, мутагенеза по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенеза, связанного с недостаточностью функционирования системы репарации в хозяйском штамме, химического мутагенеза, радиогенного мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза на основе системы рестрикции-селекции, мутагенеза на основе системы рестрикцииочистки, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, создания мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты или их сочетания.
В одном аспекте способ многократно повторяют, пока не будет получена фосфолипаза, имеющая измененную или другую активность или измененную или другую стабильность по сравнению с фосфо
- 14 015591 липазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. В одном аспекте измененная или другая активность представляет собой фосфолипазную активность в кислых условиях, при этом фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна в кислых условиях. В одном аспекте измененная или другая активность представляет собой фосфолипазную активность при высокой температуре, при этом фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна при высокой температуре. В одном аспекте способ многократно повторяют, пока не будет получена последовательность, кодирующая фосфолипазу, имеющая измененное использование кодонов по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой. Способ можно многократно повторять, пока не будет получен ген фосфолипазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии или стабильности первичного транскрипта по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой.
В настоящем изобретении предлагаются способы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает в себя (а) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу; и (Ь) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте со стадии (а) и его замену предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, что и замененный кодон, при этом предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, что приводит, таким образом, к модификации нуклеиновой кислоты для увеличения ее экспрессии в клетке-хозяине.
В настоящем изобретении предлагаются способы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, при этом способ включает в себя (а) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу; и (Ь) идентификацию кодона в нуклеиновой кислоте со стадии (а) и его замену другим кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, что и замененный кодон, за счет чего достигается модификация кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу.
Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом описываемый способ включает в себя (а) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу, и (Ь) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (а), и его замену предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, при этом предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине.
Настоящее изобретение относится к способам модификации кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, для снижения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом описываемый способ включает в себя (а) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу; и (Ь) идентификацию по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (а), и его замену непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, при этом предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты для снижения уровня ее экспрессии в клетке-хозяине. В альтернативных аспектах клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, клетку грибов, клетку насекомого, дрожжевую клетку, растительную клетку, клетку водорослей, клетку лишайника или клетку млекопитающего.
Настоящее изобретение относится к способам получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фосфолипазы или сайтов связывания субстрата, при этом модифицированные активные сайты или сайты связывания субстрата получают из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный сайт или первый сайт связывания субстрата, при этом описываемый способ включает в себя (а) получение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный сайт или первый сайт связывания субстрата, при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению; (Ь) получение набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют встречающиеся в природе варианты аминокислот в нескольких целевых кодонах в первой нуклеиновой кислоте; и (с) использование набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих активный сайт или кодирующих сайт связывания субстрата, которые кодируют ряд вариантов аминокислот в каждом кодоне для аминокислоты, который подвергали мутагенезу, благодаря чему создают библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фосфолипазы и сайтов связывания субстрата. В альтернативных аспектах данный способ включает в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты со стадии (а) способом, включающим в себя систему оптимизи
- 15 015591 рованной направленной эволюции, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (С88М) и вторичную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (8ЬК). Указанный способ может также включать в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), или ее вариантов способом, включающим в себя склонную к ошибкам ПЦР, перетасовку, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборку с использованием ПЦР, мутагенез с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР), мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, вторичную сборку генов, генный мутагенез по механизму насыщения генных сайтов (С88М), вторичную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (8ЬК) и их сочетание. Указанный способ может дополнительно включать в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), или ее вариантов способом, включающим в себя рекомбинацию, рекомбинацию последовательностей, регулируемую по типу обратной связи, мутагенез ДНК, модифицированной фосфотиоатом, мутагенез с использованием урацилсодержащей матрицы, мутагенез с использованием дуплекса с пробелами, мутагенез по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенез, связанный с недостаточностью функционирования системы репарации в хозяйском штамме, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез на основе системы рестрикции-селекции, мутагенез на основе системы рестрикцииочистки, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, создание мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты и их сочетание.
Настоящее изобретение относится к способам получения малой молекулы, включающим в себя стадии (а) получения набора биосинтетических ферментов, способных осуществлять синтез или модификацию малой молекулы, при этом один из ферментов включает в себя фермент фосфолипазу, кодируемую нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получения субстрата по меньшей мере для одного фермента со стадии (а) и (с) осуществления взаимодействия субстрата со стадии (Ь) с ферментами, в условиях, которые способствуют осуществлению множества биокаталитических реакций, с образованием малой молекулы в результате серии биокаталитических реакций.
Настоящее изобретение относится к способам модификации малой молекулы, включающим в себя стадии (а) получения фермента фосфолипазы, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получения малой молекулы и (с) осуществления взаимодействия фермента, полученного на стадии (а), с малой молекулой, полученной на стадии (Ь), в условиях, способствующих протеканию ферментативной реакции, катализируемой ферментом фосфолипазой, что приводит к модификации малой молекулы за счет ферментативной реакции под действием фосфолипазы. В одном аспекте способ включает в себя получение множества малых молекул в качестве субстратов для фермента со стадии (а), за счет чего достигается создание библиотеки модифицированных малых молекул, образуемых в результате по меньшей мере одной ферментативной реакции, катализируемой фосфолипазой. В одном аспекте способ также включает в себя использование набора дополнительных ферментов в условиях, которые способствуют протеканию множества биокаталитических реакций с участием ферментов, с получением библиотеки модифицированных малых молекул, образуемых в результате множества ферментативных реакций. В одном аспекте данный способ дополнительно включает в себя стадию тестирования библиотеки с целью определения того, присутствует ли в данной библиотеке конкретная модифицированная малая молекула, которая проявляет требуемую активность. Стадия тестирования библиотеки также может дополнительно включать в себя стадии систематического исключения всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных малых молекул в данной библиотеке, посредством тестирования части модифицированных малых молекул в отношении наличия или отсутствия конкретной модифицированной малой молекулы с требуемой активностью и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, которая создает конкретную модифицированную малую молекулу с требуемой активностью.
Настоящее изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента фосфолипазы, включающим в себя стадии (а) получения фермента фосфолипазы, содержащего аминокислотную последовательность согласно изобретению, и (Ь) делетирования множества аминокислотных остатков из последовательности, полученной на стадии (а), и тестирование оставшейся подпоследовательности в отношении фосфолипазной активности, за счет чего достигается определение функционального фрагмента фермента фосфолипазы. В одном аспекте фосфолипазную активность измеряют с помощью субстрата фосфолипазы и выявления повышения количества субстрата или снижения количества продукта реакции. В одном аспекте снижение количества субстрата фермента или повышение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения позволяет идентифицировать тестируемое соединение как активатор фосфолипазной активности.
Настоящее изобретение относится к способам расщепления сложноэфирной связи глицерофосфата, включающим в себя следующие стадии: (а) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получе
- 16 015591 ние композиции, содержащей сложноэфирную связь глицерофосфата; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с композицией со стадии (Ь), в условиях, при которых полипептид расщепляет сложноэфирную связь глицерофосфата. В одном аспекте указанные условия включают в себя значения рН примерно от рН 5 до примерно 8,5 или примерно от рН 4,5 (или более кислых, т.е. рН<4,5) до примерно 9,0 (или более щелочных (т.е. рН>9)). В одном аспекте условия включают в себя температуру в диапазоне примерно от 40 до примерно 70°С. В одном аспекте композиция включает в себя растительное масло. В одном аспекте композиция включает в себя фосфолипид из семян масличных культур. В одном аспекте реакция расщепления может приводить к образованию экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида.
В настоящем изобретении предлагаются способы гидролиза, расщепления или разрушения содержащей фосфолипиды композиции, включающие в себя получение по меньшей мере одного полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, или полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, кодируемого по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно изобретению; получение композиции, содержащей фосфолипид; и осуществление контакта полипептида с композицией в условиях, при которых фосфолипаза гидролизует, расщепляет или разрушает содержащую фосфолипид композицию. В одном аспекте способ включает в себя применение перемешивания на мешалке с большими сдвиговыми усилиями с последующим перемешиванием с низкими сдвиговыми усилиями или без сдвиговых усилий композиции вместе по меньшей мере с одним полипептидом согласно изобретению, обладающим фосфолипазной активностью, чтобы обеспечить возможность соответствующего контактирования фосфолипидного субстрата с фосфолипазой. По меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, также может присутствовать на стадии смешивания с большими сдвиговыми усилиями. Способ может быть осуществлен на практике в любом масштабе, например в масштабе примерно от 1 грамма (г) до примерно 500, 1000, 2000, 2500, 5000 г или более, или в любом количестве в данном диапазоне.
В настоящем изобретении предлагаются способы дегуммирования масла, включающие в себя следующие стадии: (а) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептид кодируется нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей растительное масло; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с растительным маслом со стадии (Ь), в условиях, при которых полипептид может расщеплять сложноэфирные связи в растительном масле, благодаря чему осуществляют дегуммирование масла. В одном аспекте растительное масло представляет собой масло из семян масличных культур. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, пальмовое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, соевое масло, масло канолы, кунжутное масло, арахисовое масло или подсолнечное масло. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя добавление фосфолипазы согласно изобретению, другой фосфолипазы или их сочетания. В одном аспекте в способе добавляют более одного полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом по меньшей мере один полипептид является ферментом согласно изобретению. В одном аспекте ферменты добавляют в определенном порядке, например в определенном порядке добавляют РЬС с разными специфичностями, например, сначала добавляют фермент с активностью РС и РЕ (или вместе добавляют два фермента, один с активностью РС, а другой с активностью РЕ), затем добавляют фермент с активностью РЕРЬС или любое их сочетание.
В одном аспекте способа дегуммирования масла композиция, содержащая масло, содержит полученное из растения, животного, водоросли или рыбы масло или жир. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло или масло из пальмовых косточек, масло канолы, подсолнечное масло, кунжутное масло или арахисовое масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид в гидратируемом и/или негидратируемом фосфолипиде в композиции, содержащей масло. В одном аспекте полипептид может гидролизовать фосфатид по глицерилфосфоэфирной связи с образованием диглицерида и водорастворимого фосфатного соединения. В одном аспекте полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. В одном аспекте полипептид представляет собой фосфолипазу Ό, а также добавляют фермент фосфатазу.
В одном аспекте способа дегуммирования масла контактирование приводит к гидролизу гидратированного фосфолипида в масле. Условия гидролиза могут включать в себя щелочные условия, например, в одном аспекте условия включают в себя температуру в диапазоне примерно от 20 до 40°С при щелочном значении рН. Щелочные условия могут включать в себя значение рН примерно от рН 8 до 10 или выше. Условия гидролиза могут быть сделаны щелочными в любое время в ходе процесса, например, в одном аспекте фосфолипазу, такую как РЬС, добавляют до того, как условия становятся щелочными (например, нейтрализация каустическим средством масла, содержащего кислоту, такую как фосфатидная кислота).
В одном аспекте способа дегуммирования масла основание вызывает изомеризацию 1,2-ОЛС, образуемого с помощью РЬС, с образованием 1,3-ОЛС, который является более полезным для здоровья с пищевой точки зрения по сравнению с 1,2-ОЛС, например 1,3-ОЛС сжигается, давая энергию, а не хранится в виде жира (как 1,2-ОЛС). Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ щелоч
- 17 015591 ного рафинирования масла, при котором фосфолипазу, например, фермент согласно изобретению, включая РЬС, добавляют в начале процесса, т.е. перед добавлением какой-либо кислоты и каустического средства, например, как показано в примерном способе, изображенном на фиг. 13. Одним из последствий добавления РЬС в начале процесса щелочного рафинирования согласно изобретению (смотри дополнительное обсуждение ниже) и добавления кислоты и каустического средства после добавления РЬС является образование повышенного уровня 1,3-ЭАС (а не 1,2-ЭАС). Это может быть следствием катализируемой кислотой или основанием миграции ацила. С точки зрения питания 1,3-ЭАС лучше, чем 1,2ЭАС. Таким образом, изобретение включает в себя способ дегуммирования масла с использованием РЬС согласно изобретению, при этом конечный продукт в виде очищенного от смол масла содержит не менее чем примерно 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0% 1,3-ОАС.
В одном аспекте способа дегуммирования масла условия гидролиза могут включать в себя время реакции примерно от 3 до 10 или более минут. Условия гидролиза могут включать в себя гидролиз гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в масле при температуре примерно от 50 до 60°С, при рН примерно от рН 5 до 6,5, или от рН 5 до 7,5, или от рН 5 до 8,0, с использованием времени реакции примерно от 30 до 60 мин.
В одном аспекте способа дегуммирования масла полипептид связывают с фильтром и содержащий фосфолипид жир или масло пропускают через фильтр. Полипептид может быть добавлен к раствору, содержащему фосфолипидсодержащий жир или масло, и затем раствор пропускают через фильтр.
В одном аспекте способ дегуммирования масла дополнительно включает в себя физическое удаление смолы, образуемой в процессе дегуммирования, посредством добавления отверждающего вещества, например талька или эквивалента. В одном аспекте это увеличивает извлечение масла.
В изобретении также предлагаются способы превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающие в себя следующие стадии: (а) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей негидратируемый фосфолипид; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с негидратируемым фосфолипидом со стадии (Ь), в условиях, при которых полипептид может расщеплять сложноэфирные связи в негидратируемом фосфолипиде, за счет чего достигается превращение негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму.
Настоящее изобретение относится к способам дегуммирования масла, включающим в себя следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, включающей в себя жир или масло, содержащие фосфолипид; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) и композиции со стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может осуществлять дегуммирование фосфолипидсодержащей композиции (в условиях, при которых полипептид согласно изобретению может катализировать гидролиз фосфолипида).
В одном аспекте содержащая масло композиция включает в себя растительное, животное масло, масло из водорослей или рыбий жир. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, масло из пальмовых косточек, масло канолы, подсолнечное масло, кунжутное масло или арахисовое масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид в гидратируемом и/или негидратируемом фосфолипиде в композиции, содержащей масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид по глицерилфосфоэфирной связи с образованием диглицерида и водорастворимого фосфатного соединения. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С, В, А или Ό. В одном аспекте добавляют активность фосфолипазы Ό и фермент фосфатазу. Контактирование может приводить к гидролизу гидратированного фосфолипида в масле. Условия гидролиза могут включать в себя температуру в диапазоне примерно от 20 до 40°С при щелочном значении рН. Щелочные условия могут включать в себя значение рН примерно от рН 8 до 10. Условия гидролиза могут включать в себя время реакции примерно от 3 до 10 мин. Условия гидролиза могут включать в себя гидролиз гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в масле при температуре примерно 50-60°С при рН примерно от рН 5 до 6,5 с использованием времени реакции примерно от 30 до 60 мин. Полипептид может быть связан с фильтром, и содержащий фосфолипид жир или масло пропускают через фильтр. Полипептид может быть добавлен к раствору, содержащему фосфолипидсодержащий жир или масло, и затем раствор пропускают через фильтр.
Настоящее изобретение относится к способам превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающим в себя следующие стадии:
(а) получение композиции, содержащей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью согласно изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, включающей в себя негидратируемый фосфолипид; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) и композиции со стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид превращает негидратируемый фосфолипид в его гидратируемую форму. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы Ό, и при этом также может
- 18 015591 быть добавлен фермент фосфатаза.
Настоящее изобретение относится к способам каустического рафинирования фосфолипидсодержащей композиции, включающим в себя следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей фосфолипазу, которая может представлять собой полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей фосфолипид; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) и композиции со стадии (Ь) до, во время или после рафинирования каустическим средством. Полипептид может обладать фосфолипазной активностью, например активностью РЬС, РЬВ, РЬЬ и/или РЬ-Α. Полипептид может быть добавлен до рафинирования каустическим средством, т.е. в начале процесса перед добавлением кислоты или каустического средства, как показано на фиг. 13.
Полипептид (который может представлять собой фермент, например РЬС, согласно изобретению) может быть добавлен во время каустического рафинирования, и могут быть добавлены различные уровни кислоты и каустического средства в зависимости от уровней фосфора и уровней свободных жирных кислот. Полипептид (который может представлять собой фермент согласно изобретению) может быть добавлен перед рафинированием каустическим средством или после рафинирования каустическим средством: в смеситель с интенсивным перемешиванием или в смеситель для непрерывного смешивания жидких потоков; после стадии нагревания; в центрифугу, соапсток; промывную воду и/или на стадии обесцвечивания или дезодорации. Способ может включать в себя применение концентрированных растворов каустического средства, например более концентрированных, чем промышленный стандарт 11%, чтобы уменьшить массу смолы. В альтернативных аспектах концентрированный раствор каустического средства имеет концентрацию примерно от 12 до 50%, например примерно 20, 30, 40, 50 или 60%, или более концентрированный.
Композиция, содержащая фосфолипид, может представлять собой растение. Полипептид может быть экспрессирован трансгенно в растении. Полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, может быть добавлен во время дробления семени или другой части растения, или полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, добавляют после разрушения или перед очисткой.
Также предлагается способ каустического рафинирования для гидролиза фосфолипидов в масле (например, растительном масле) с использованием полипептида согласно изобретению с образованием диацилглицерина (ΌΑ6) и водорастворимого сложного фосфатного эфира. В одном аспекте фермент согласно изобретению должен работать в способе рафинирования каустическим средством, включая, необязательно, низкое содержание воды и/или диапазон температур примерно от 55 до примерно 70°С. Применение способа каустического рафинирования при низким содержанием воды в таком диапазоне температуры будет максимизировать выход за счет увеличения ΌΑΟ и уменьшения уносимого масла. В одном аспекте фермент, используемый в данном способе каустического рафинирования согласно изобретению, имеет очень хорошую активность по отношению к фосфатидилхолину (РС) и фосфатидилэтаноламину (РЕ), является активным в диапазоне рН примерно от рН 6 до 9, является активным вплоть до 75°С и является активным при низком содержании воды; в масле, например, примерно от 2 до 5% воды, например, представляет собой фермент, кодируемый последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 177 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Ξ41Α, Е41\, Е41Р, Е41У, Е41Я, Е94Я, П100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, Α104^ Ό111Κ, Т112Я, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Η Ό171ν, Б171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ, Ό234Κ или Ц265Я.
В другом аспекте изобретения в способе каустического рафинирования для гидролиза фосфолипидов в масле используют два фермента: РЬспецифичную РЬС (гидролизует РО и РС-РЬС, которая гидролизует РС, РЕ и ΡΑ. Такой вариант позволяет получать масло, подходящее для химического или физического рафинирования, и максимизирует повышение выхода ΌΑΟ и уменьшение уносимого масла.
Настоящее изобретение относится к способам очистки фитостерина или тритерпена, включающим в себя следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей фитостерин или тритерпен; и (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) и композиции со стадии (Ь) в условиях, при которых полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Фитостерин или тритерпен может включать в себя растительный стерин. Растительный стерин может быть получен из растительного масла. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, кокосовое масло, масло канолы, масло какао, кукурузное масло, хлопковое масло, льняное масло, оливковое масло, пальмовое масло, арахисовое масло, масло, полученное из рисовых отрубей, сафлоровое масло, кунжутное масло, соевое масло или подсолнечное масло. Данный способ может включать в себя использование неполярных растворителей для количественной экстракции свободных фитостеринов и сложных эфиров фитостеринов и жирных кислот. Фитостерин или тритерпен могут включать β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин или брассикостерин.
В настоящем изобретении предлагаются способы рафинирования неочищенного масла, включаю
- 19 015591 щие в себя следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (Ь) получение композиции, включающей в себя масло, содержащее фосфолипид; и (с) осуществление контакта полипептида, полученного на стадии (а), и композиции, полученной на стадии (Ь), в условиях, при которых полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Полипептид может проявлять активность фосфолипазы в водном растворе, добавляемом в композицию. Уровень воды может составлять примерно от 0,5 до 5%. Время обработки может составлять менее чем примерно 2 ч, менее чем примерно 60 мин, менее чем примерно 30 мин, менее чем примерно 15 мин или менее чем примерно 5 мин. Условия гидролиза могут включать в себя температуру в диапазоне примерно 25-70°С. Условия гидролиза могут включать в себя использование каустического средства. Можно использовать концентрированные растворы каустического средства, например более концентрированные, чем промышленный стандарт 11%, чтобы уменьшить массу смолы. В альтернативных аспектах концентрированный раствор каустического средства имеет концентрацию примерно от 12 до 50%, например примерно 20, 30, 40, 50 или 60%, или более концентрированный.
Условия гидролиза могут включать в себя значения рН в диапазоне примерно от рН 3 до 10, примерно от рН 4 до 9, примерно от рН 5 до 8. Условия гидролиза могут включать в себя добавление эмульгаторов и/или перемешивание после контактирования на стадии (с). Способы могут включать в себя добавление деэмульгатора и/или нагревание или охлаждение (например, примерно от 4°С до примерно -20°С или ниже), чтобы ускорить отделение водной фазы. Способы могут включать в себя дегуммирование перед стадией контактирования, чтобы собрать лецитин с помощью центрифугирования, и затем добавление РЬС, РЬС и/или РЬЛ, чтобы удалить негидратируемые фосфолипиды. Способы могут включать в себя дегуммирование неочищенного масла с помощью воды до содержания фосфора менее 10 ч./млн для пищевых масел и последующее физическое рафинирование до содержания фосфора менее чем 50 ч./млн для биодизельных масел. Способы могут включать в себя добавление кислоты для стимулирования гидратации негидратируемых фосфолипидов. В одном аспекте добавление кислоты стимулирует снижение содержания металлов кальция и магния.
В настоящем изобретении предлагается способ ослабления, лечения или профилактики опосредованной липополисахаридами (ЛПС) токсичности, включающий в себя введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно изобретению. В изобретении предлагается способ детоксикации эндотоксина, включающий в себя осуществление контакта эндотоксина с полипептидом согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается способ деацилирования 2'- или 3'-цепи жирных кислот липида А, включающий в себя осуществление контакта липида А с полипептидом согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к применениям полипептида согласно изобретению для производства фармацевтической композиции, например, для производства фармацевтической композиции для профилактики, лечения или ослабления опосредованной липополисахаридами (ЛПС) токсичности или для детоксикации эндотоксина, или деацилирования 2'- или 3'-цепи жирных кислот липида А. В настоящем изобретении предлагаются способы детоксикации эндотоксина, включающие в себя осуществление контакта эндотоксина с полипептидом согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагается способ очистки смазочных веществ, включающий в себя следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей фермент согласно изобретению; (Ь) получение смазочного вещества и (с) обработка смазочного вещества ферментом в условиях, при которых фермент может избирательно гидролизовать масла в смазочном веществе, таким образом очищая его. Смазочным веществом может быть смазочное масло для гидравлических систем.
В настоящем изобретении предлагается способ обработки ткани, включающий в себя следующие стадии: (а) получение композиции, содержащей фермент согласно изобретению, (Ь) получение ткани и (с) обработка ткани ферментом. Обработка ткани может включать в себя улучшение качества на ощупь и драпировки конечной ткани, окраски, получения негорючих тканей, получения водоотталкивающих свойств, получения видимого блеска или отделки смолой. Ткань может содержать хлопок, вискозу, искусственный шелк, волокна лиоцель из эвкалипта, лен, волокна рами, все их смеси или их смеси с полиэфирными волокнами, шерсть, полиамиды, акриловые волокна или полиакриловые волокна. В настоящем изобретении предлагается ткань, пряжа или волокно, содержащие фермент согласно изобретению. Фермент может быть адсорбирован, абсорбирован или иммобилизован на поверхности ткани, пряжи или волокна.
В настоящем изобретении предлагаются способы экспрессии фосфолипазы С, включающие в себя получение штамма Р1сЫа с фенотипом Мий; встраивание гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфолипазу С, в штамм РюЫа и культивирование штамма РюЫа в условиях, при которых экспрессируется фосфолипаза С. Способ также может включать в себя добавление в среду культивирования цинка. Изобретение также относится к клеточным системам, изолированным клеткам и линиям клеток для экспрессии фосфолипазы С, включая штамм РюЫа, имеющий фенотип МиС, содержащий гетероло
- 20 015591 гичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фосфолипазу С, оперативно связанную с промотором, работающим в штамме РюЫа.
В настоящем изобретении предлагаются системы резистентных к зеоцину дрожжевых клеток (например, дрожжевых клеток, линий клеток, отдельных клеток) для экспрессии гетерологичного белка, включающие в себя стадии получения клетки РюЫа §р. (например, Р. раЦопк), содержащей гетерологичную нуклеиновую кислоту, способную экспрессировать гетерологичный белок; культивирования клетки в условиях, включающих присутствие зеоцина в начальной концентрации; отбора клеток, резистентных к начальной концентрации зеоцина, и повторного культивирования в условиях, включающих в себя более высокую концентрацию зеоцина; и отбора клеток, культивируемых на стадии (с), резистентных к более высокой концентрации зеоцина. В одном аспекте гетерологичный белок представляет собой фермент или необязательно фосфолипазу, или необязательно фосфолипазу С (РЬС), например любой фермент согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения биотоплива, включающие в себя: (А) (a) получение фермента фосфолипазы согласно изобретению или фермента фосфолипазы, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермента фосфолипазы, полученного способом согласно настоящему изобретению; (Ь) получение композиции биомассы, содержащей липид или сложный алкиловый эфир; (с) осуществление контакта фермента фосфолипазы по п.(а) с композицией биомассы по п.(Ь), чтобы образовать биотопливо или переэтерифицировать липид или сложный алкиловый эфир; (В) способ (А), в котором биотопливо представляет собой или содержит биодизельное топливо; (С) способ (А) или (В), в котором композиция биомассы, содержащей липид или сложный алкиловый эфир, представляет собой или содержит растительное масло и/или животный жир; (Ό) любой из способов (А)-(С), в котором композиция биомассы, содержащей липид или сложный алкиловый эфир, представляет собой или содержит водоросли, растительное масло, натуральное растительное масло, растительное масло первого отжима, отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, сало, лярд или желтый жир; или (Е) любой из способов (А)-(О), в котором фермент фосфолипаза представляет собой или содержит полипептид, имеющий последовательность, которая указана в любой из последовательностей 8Е6 ГО N0: 1-8Е6 ГО N0: 178 или любом их сочетании.
В настоящем изобретении предлагается биотопливо: (а) полученное способом по п.68, (Ь) содержащее (ί) фермент фосфолипазы согласно изобретению или фермент фосфолипазы, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазы, полученный способом согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении предлагается сухой экстракт барды (008), сухая гранулированная барда (008), конденсированный экстракт барды (СО8), влажная гранулированная барда ГО\\6) или сухая гранулированная барда с растворимыми компонентами (0068), содержащими: (ί) фермент фосфолипазу, имеющую последовательность, которая указана в любой из последовательностей 8Е6 ГО N0: 1-8Е6 ГО N0: 178 или любом их сочетании, или (ίί) фермент фосфолипазу согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, полученную способом согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении предлагается биомасса, содержащая: (а) (ί) фермент фосфолипазу, имеющую последовательность, которая указана в любой из последовательностей 8Е6 ГО N0: 1-8Е6 ГО N0: 178 или любое их сочетание, или (ίί) фермент фосфолипазу согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, полученную способом согласно настоящему изобретению; или (b) биомассу по п.(а), при этом биомасса представляет собой или содержит биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биопропанол или биометанол или любое их сочетение.
В настоящем изобретении предлагается основанный на нефти продукт, содержащий: (а) (ί) фермент фосфолипазу, имеющую последовательность, которая указана в любой из последовательностей 8Е6 ГО N0: 1-8Е6 ГО N0: 178 или любое их сочетание, или (ίί) фермент фосфолипазу согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, полученный способом согласно настоящему изобретению; или (Ь) основанный на нефти продукт по п.(а), содержащий масло, биодизельное топливо или бензин, или биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биопропанол или биометанол; или смесь биоэтанола, биопропанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизельного топлива и бензина.
Подробное раскрытие одного или нескольких вариантов осуществления изобретения приведено на прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут понятны из описания и чертежей, и из формулы изобретения.
Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из бепВапк и депозиты АТСС, упоминаемые в настоящем описании, включены в него в виде ссылок для всех целей.
Краткое описание чертежей
Приведенные чертежи являются иллюстративными для пояснения вариантов осуществления изобретения и не рассматриваются как ограничивающие объем настоящего изобретения, охватываемый прилагаемой формулой изобретения.
- 21 015591
Фиг. 1 представляет собой блок-схему компьютерной системы, подробно описанной ниже.
Фиг. 2 представляет собой график последовательности технологических операций, иллюстрирующий один аспект способа 200 для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями в базе данных для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных, как подробно описано ниже.
Фиг. 3 представляет собой график последовательности технологических операций, иллюстрирующий один процесс, протекающий в компьютере, для определения того, являются ли две последовательности гомологичными, как подробно описано ниже.
Фиг. 4 представляет собой график последовательности технологических операций, иллюстрирующий один аспект работы идентификатора для выявления наличия данного характерного признака в последовательности, как подробно описано ниже.
На фиг. 5А-5С приведена схематичная иллюстрация модельной двухфазной системы, моделирующей опосредованное РЬС дегуммирование, которое подробно описано ниже в примере 2.
Фиг. 6 схематично иллюстрирует типичный способ рафинирования растительного масла с использованием фосфолипаз согласно изобретению.
Фиг. 7 схематично иллюстрирует типичный способ дегуммирования согласно изобретению для физически очищенных масел, который подробно обсуждается ниже.
Фиг. 8 схематично иллюстрирует гидролиз фосфатидов с использованием фосфолипазы С согласно изобретению, который подробно обсуждается ниже.
Фиг. 9 схематично иллюстрирует типичный способ каустического рафинирования согласно изобретению и иллюстрирует альтернативный вариант, включающий в себя применение фосфолипазы С согласно изобретению в качестве добавки при каустическом рафинировании (каустическое рафинирование с длительным перемешиванием), как подробно обсуждается ниже.
Фиг. 10 схематично иллюстрирует применение фосфолипазы С согласно изобретению в качестве вспомогательного средства для дегуммирования, как подробно обсуждается ниже.
Фиг. 11 представляет собой таблицу, описывающую выбранные характерные признаки приведенных в качестве примера нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению, которые подробно описаны ниже.
Фиг. 12 схематично иллюстрирует данные, полученные в двух ферментных системах согласно изобретению, которые описаны в примере 3, ниже.
Фиг. 13 схематично иллюстрирует примерный способ каустического рафинирования согласно изобретению и иллюстрирует альтернативный вариант, включающий в себя применение фосфолипазы С согласно изобретению в качестве добавки при каустическом рафинировании (каустическое рафинирование с длительным перемешиванием), который подробно обсуждается ниже.
Фиг. 14 иллюстрирует другой вариант способов согласно изобретению, в таком способе используют две стадии центрифугирования, как подробно обсуждается ниже.
Фиг. 15 иллюстрирует другой вариант способов согласно изобретению, в таком способе используют три стадии центрифугирования, как подробно обсуждается ниже.
Фиг. 16 иллюстрирует другой примерный вариант данного способа с использованием обработки кислотой и наличием стадии центрифугирования перед стадией дегуммирования, как подробно обсуждается ниже.
Фиг. 17 иллюстрирует результаты экспериментов по расщеплению ίη νίίτο, в которых используют варианты фосфолипазы С согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 4 ниже.
Фиг. 18 иллюстрирует результаты культивирования в ферментере периодического действия с использованием фермента согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 19 иллюстрирует результаты сравнений скорости потребления кислорода (0иК) культурами штаммов Р. раЧогЬ Ми!8 согласно изобретению, как подробно обсуждается в примере 5 ниже.
Фиг. 20 иллюстрирует сравнение профилей потребления метанола штаммами Р. ρ;·ΐ8ΐοπ8 Ми!8 согласно изобретению, как подробно обсуждается в примере 5 ниже.
Фиг. 21 иллюстрирует профиль ОИК. культуры с рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента РЬС согласно изобретению, 8Е0 ΙΌ N0: 2, который подробно обсуждается в примере 5 ниже.
Фиг. 22 иллюстрирует результаты анализа в δΌδ-ПААГ, показывающие качество белка РЬС, продуцируемого в культуре, и соответствующий профиль ОИК культуры с рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента РЬС согласно изобретению, 8Е0 ΙΌ N0: 2, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 23 иллюстрирует результаты анализа в δΌδ-ПААГ, показывая количество активной РЬС, локализованной внутриклеточно в культуре с рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента РЬС согласно изобретению, 8Е0 ΙΌ N0: 2, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 24 иллюстрирует визуальный анализ морфологических изменений в дрожжевых клетках, связанных с активной РЬС рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента РЬС согласно изобретению, 8Е0 ΙΌ N0:2, который подробно обсуждается в примере 5 ниже.
- 22 015591
На фиг. 25 графически суммированы данные, показывающее статус эффективности продукции РЬС через 95 ч ТЕТ (общее время ферментации) в РюЫа, с использованием приведенного в качестве примера фермента РЬС согласно изобретению, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 26 представляет собой итоговую таблицу данных, полученных в результате скрининга экспрессии в колониях адаптированных к зеоцину клеток согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 27 иллюстрирует данные, показывающие, что уровни белка РЬС были выше в культурах, содержащих колонии адаптированных к зеоцину клеток согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 28 иллюстрирует данные, показывающие сравнение роста адаптированных к зеоцину колоний согласно изобретению по сравнению с контролем, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже.
Фиг. 29 иллюстрирует результаты эксперимента с нагреванием, показывающие термостабильность приведенного в качестве примера фермента согласно изобретению 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, условия указаны на чертеже, и результаты подробно обсуждаются в примере 6 ниже.
Фиг. 30 иллюстрирует суммарные данные ЯМР, полученные в эксперименте по нагреванию, показывающие термостабильность приведенного в качестве примера фермента согласно изобретению, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, которые подробно обсуждаются в примере 6 ниже.
Фиг. 31-33 иллюстрируют данные, показывающие термостабильность последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, полученные с использованием р-№РС в условиях, указанных на чертеже, которые подробно обсуждаются в примере 6 ниже.
Фиг. 34 иллюстрирует данные, показывающие термостабильность последовательности 8ЕЦ Ш N0: 2, полученные с использованием анализа ДСК, которые подробно обсуждаются в примере 6 ниже.
Фиг. 35 иллюстрирует массовую долю отдельных видов фосфолипидов (РЬ) (РА, РЕ, РI и РС) относительно общего РЬ, остающегося после обработки мутантной фосфолипазой согласно изобретению.
Фиг. 36 иллюстрирует лучшие мутанты С88М, выбранные для введения в библиотеку СепеЯеак§етЬ1у, которые содержат типичные фосфолипазы согласно изобретению.
Фиг. 37 иллюстрирует типичный способ получения спирта, который включает в себя применение ферментов согласно настоящему изобретению.
Сходные символы на различных чертежах относятся к сходным элементам.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к фосфолипазам, например полипептидам, обладающим активностью фосфолипазы А, В, С, Ό, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (РАР) и/или липидацилгидролазы (ЬАН) или эквивалентной активностью, к кодирующим их полинуклеотидам и способам их получения и применения. В настоящем изобретении предлагаются ферменты, которые эффективно расщепляют глицерофосфатную сложноэфирную связь в маслах, таких как растительные масла, например фосфолипиды семян масличных культур, с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению обладают активностью липидацилгидролазы (ЬАН). В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут расщеплять глицерофосфатные сложноэфирные связи в фосфатидилхолине (РС), фосфатидилэтаноламине (РЕ), фосфатидилсерине (Р8), фосфатидилинозитоле (РЦ, фосфатидной кислоте и/или сфингомиелине или их сочетании. Например, в одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению является специфичной по отношению к одному или нескольким конкретным субстратам, например фермент согласно изобретению может обладать специфичностью действия по отношению к РЕ и РС; РЕ и РЦ РЕ и Р8; Р8 и РЕ; Р8 и И; РI и РЕ; Р8, РI и РС; РЕ, РI и РС или РЕ, Р8, РI и РС.
Фосфолипазу согласно изобретению (например, полипептиды, обладающие активностью фосфолипазы А, В, С, Ό, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (РАР) и/или липидацилгидролазы (ЬАН) или эквивалентной активностью) можно применять для ферментативного дегуммирования растительных масел, так как остаток фосфата растворим в воде и его можно легко удалять. Диглицеридный продукт будет оставаться в масле и поэтому потери будут снижены. РЬС согласно изобретению можно применять в дополнение или вместо РЬА1 и РЬА2 при коммерческом дегуммировании масла, например, в способе ΕNΖΥМАX®, в котором фосфолипиды гидролизуют, используя РЬА1 и РЬА2.
В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению активны при высокой и/или при низкой температуре или в широком диапазоне температур, например, они могут быть активны при температурах в диапазоне от 20 до 90°С, от 30 до 80°С и от 40 до 70°С. Настоящее изобретение также относится к фосфолипазам согласно изобретению, которые обладают активностью при щелочных рН или при кислых рН, например в слабокислой воде. В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут обладать активностью при кислых рН, таких как рН 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 и 3,5 или более кислые (т.е. <рН 3,5). В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут обладать активностью при щелочных рН, таких как рН 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10 или более щелочные (т.е. >рН 10). В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению активны в диапазоне температур примерно от 40°С до примерно 70, 75 или 80°С или выше в условиях низкой активности воды (при низком содержании воды).
- 23 015591
Настоящее изобретение также относится к способам дополнительной модификации типичных фосфолипаз согласно изобретению с получением ферментов с желательными свойствами. Например, фосфолипазы, получаемые способами согласно изобретению, могут обладать измененными характеристиками, такими как субстратная специфичность, специфичность связывания субстрата, картины расщепления субстрата, термостабильность, профиль рН/активность, профиль рН/стабильность (например, повышенная стабильность при низких значениях рН, например при рН<6 или рН<5, или при высоких значениях рН, например при рН>9), стабильность к окислению, зависимость от Са2+, удельная активность и т.п. Настоящее изобретение относится к изменению любого представляющего интерес свойства. Например, изменение может приводить к получению варианта, который в сравнении с исходной фосфолипазой обладает измененным профилем зависимости активности от рН и температуры.
В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению можно применять на разных стадиях обработки растительного масла, таких как экстракция растительного масла, в частности удаление фосфолипидных смол в процессе, называемом дегуммированием масла, который описан в настоящей публикации. Изобретение относится к композициям (например, содержащим ферменты согласно изобретению) и способам получения растительных масел из разных источников, например масло из рисовых отрубей, соевых бобов, рапса, арахиса, кунжута, подсолнечника и кукурузы. Фосфолипазные ферменты согласно изобретению можно применять вместо РЬЛ, например фосфолипазы А2, на любой стадии обработки растительного масла.
Термин фосфолипаза охватывает ферменты, обладающие любой фосфолипазной активностью, например расщепляющие сложноэфирную связь глицерофосфата (катализируя гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата), например, в масле, таком как растительное масло. Фосфолипазная активность согласно изобретению может приводить к образованию экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Фосфолипазная активность согласно изобретению включает в себя также гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата при высоких температурах, низких температурах, щелочных рН и кислых рН. Термин фосфолипазная активность также включает в себя расщепление глицерофосфатного сложного эфира с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Термин фосфолипазная активность также включает в себя разрыв сложноэфирных связей глицерина и фосфорной кислоты в фосфолипидах. Термин фосфолипазная активность также включает в себя другие виды активности, такие как способность связываться и гидролизовать субстрат, такой как масло, например растительное масло, субстрат также включает в себя фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины и сфингомиелины из растений и животных. Фосфолипазная активность может также включать в себя активность фосфолипазы С (РЬС), активность фосфолипазы А (РЬА), такую как активность фосфолипазы А1 или фосфолипазы А2, активность фосфолипазы В (РЬВ), такую как активность фосфолипазы В1 или фосфолипазы В2, включая активность лизофосфолипазы (ЬРЬ) и/или активность лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТА); активность фосфолипазы Ό (РЬИ), такую как активность фосфолипазы Ό1 или активность фосфолипазы Ό2; и/или активность пататина или любое их сочетание. Фосфолипазная активность может включать в себя гидролиз гликопротеида, например гликопротеида, обнаруженного в клубнях картофеля или любого растения рода 8о1апит, например 8о1апит 1нЬсго5ит. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность лататина, такую как эстеразная активность пататина (смотри, например, бнпспсх (2002) Вю1сс11по1. Ргод., 18: 635-640). Фосфолипазная активность может включать в себя активность липидацилгидролазы (ЬАН). Фосфолипазная активность может быть специфичной по отношению к одному или нескольким конкретным субстратам, например фермент согласно изобретению может обладать специфичностью действия по отношению к РЕ и РС; РЕ и И; РЕ и Р8; Р8 и РЕ; Р8 и И; РI и РЕ; Р8, РI и РС; РЕ, РI и РС, или РЕ, Р8, РI и РС, или любому их сочетанию.
В одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению может обладать многофункциональной активностью, например сочетанием одной или нескольких ферментативных активностей, описанных в настоящей публикации. Например, в одном аспекте полипептид согласно изобретению является ферментативно активным, но не имеет липазной активности или не обладает никакой ферментативной активностью, которая влияет на нейтральную фракцию масла (триглицерид). Может быть желательным применение такого полипептида в конкретном способе, например в способе дегуммирования, когда важно, чтобы нейтральная фракция масла не повреждалась (не уменьшалась, не разрушалась, например, не гидролизовалась). Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ дегуммирования, включающий в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности.
В одном аспекте фосфолипазы РЬС согласно изобретению используют (например, катализируют гидролиз) множество фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин (РС), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (Р8), фосфатидилинозитол (РЦ и/или фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, такие ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах указанных фосфолипидов. В различных аспектах ферменты РЬС согласно изобретению могут проявлять предпочтение по отношению к фосфатидилхолину и фосфатидилэтаноламину в качестве субстратов.
- 24 015591
В одном аспекте фосфолипазы РЬС фосфатидилинозитола согласно изобретению используют несколько фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, указанные ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах указанных фосфолипидов. В различных аспектах ферменты РЬС фосфатидилинозитола согласно изобретению могут проявлять предпочтение по отношению к фосфатидилинозитолу в качестве субстрата.
В одном аспекте пататиновые ферменты согласно изобретению используют несколько фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, указанные ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах указанных фосфолипидов. В различных аспектах пататины согласно изобретению основаны на сохранении сходства аминокислотных последовательностей. В различных аспектах указанные ферменты имеют разнообразный набор биохимических свойств и могут осуществлять реакции, характерные для классов ферментов РЬА1, РЬА2, РЬС или РЬИ.
В одном аспекте фосфолипазы РЬИ согласно изобретению используют несколько фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, указанные ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах таких фосфолипидов. В одном аспекте указанные ферменты применимы для осуществления реакции переэтерификации для получения структурированных фосфолипидов.
Термины матрица, или микроматрица, или биочип, или чип в используемом в настоящем описании смысле означают множество целевых элементов, где каждый целевой элемент включает в себя определенное количество одного или более полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности подложки, что подробно описано ниже.
В используемом в настоящем описании смысле термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в самом широком общем контексте и включают в себя все устройства такого рода, которые подробно описаны ниже.
Термины кодирующая последовательность или последовательность кодирует конкретный полипептид или белок означают последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок в том случае, если последовательность помещена под контроль соответствующих регуляторных последовательностей.
Термин экспрессирующая кассета в используемом в настоящем описании смысле относится к нуклеотидной последовательности, которая способна воздействовать на экспрессию структурного гена (например, последовательности, кодирующей белок, такой как фосфолипаза согласно изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты включают в себя, по меньшей мере, промотор, оперативно связанный с последовательностью, кодирующий полипептид; и необязательно с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы, необходимые или благоприятные в отношении воздействия на экспрессию, например энхансеры. Термин оперативно связанный в используемом в настоящем описании смысле относится к связи промотора выше последовательности ДНК, так что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом, экспрессирующая кассета также включает в себя плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любые формы вектора на основе рекомбинантной голой ДНК и т.п. Термин вектор включает в себя нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать или временно или постоянно трансдуцировать клетку. Известно, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в составе комплекса с белком или липидом. Вектор необязательно включает в себя вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточные мембраны, липидную оболочку вируса и т.п.). Векторы включают в себя, без ограничения, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), к которым могут быть присоединены фрагменты ДНК, которые при этом становятся реплицируемыми. Таким образом, векторы включают в себя, без ограничения, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, из плазмиды, вирусы и т.п., смотри, например, патент США № 5217879) и охватывают как экспрессирующие плазмиды, так и неэкспрессирующие плазмиды. В том случае когда в качестве хозяина для экспрессирующего вектора описывают рекомбинантный микроорганизм или клеточную культуру, указанный термин включает в себя и внехромосомную кольцевую и линейную ДНК, и ДНК, которая была включена в хромосому (хромосомы) хозяина. В том случае, когда вектор поддерживается в клетке-хозяине, такой вектор может либо стабильно реплицироваться клетками во время митоза в виде автономной структуры, либо может быть включен в геном хозяина.
Плазмиды обозначают малой буквой р, стоящей перед и/или после заглавных букв и/или номеров. Рассматриваемые в настоящем описании исходные плазмиды представляют собой либо коммерчески доступные, доступные широкому кругу людей без ограничений, либо могут быть сконструированы из доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Кроме того, плазмиды, эквивалентные плазмидам, описанным в настоящей публикации, известны специалистам в данной области.
- 25 015591
Термин ген означает участок ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи, включая, в том числе, области, предшествующие или следующие после кодирующей области, такие как лидерная последовательность, трейлер, промоторы и энхансеры, а также, где это приемлемо, промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами).
Фразы нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты в используемом в настоящем описании смысле относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к любому их фрагменту, к ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, 1РНК) геномного происхождения или полученным в результате синтеза, которые могут быть однонитевыми или двунитевыми и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь, к пептидонуклеиновой кислоте (ПНК) или любому ДНК-подобному или РНК-подобному веществу природного или синтетического происхождения, включая, например, 1РНК, рибонуклеопротеиды (например, двунитевые 1РНК, например, 1РНП). Указанный термин включает в себя нуклеиновые кислоты, например олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими остовами (смотри, например, Ма1а (1997) Тох1со1. Арр1. Рйагтасо1., 144: 189-197; 81гаикк-8оикир (1997) ВюсйетШгу, 36: 8692-8698; 8атйад (1996) АпДкепке Ыис1е1с АсИ Эгид Όβν., 6: 153-156).
В используемом в настоящем описании смысле термины аминокислота или аминокислотная последовательность относятся к последовательности олигопептида, пептида, полипептида или белка или к их фрагменту, части или субъединице, в том числе к встречающимся в природе или синтетическим молекулам.
Термины полипептид и белок в используемом в настоящем описании смысле относятся к аминокислотам, связанным друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, например пептидные изостеры, которые могут содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 аминокислот, кодируемых генами. Термин полипептид также включает в себя пептиды и фрагменты, мотивы полипептидов и тому подобное. Термин также охватывает гликозилированные полипептиды. Пептиды и полипептиды согласно изобретению также включают в себя все формы миметиков и пептидомиметиков, которые подробно описаны ниже.
В используемом в настоящем описании смысле термин изолированный указывает на то, что материал был изъят из своего исходного окружения (например, из природного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме животного, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех присутствующих вместе с ним в природной системе веществ, является изолированным. Такие полинуклеотиды могут составлять часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть составной частью композиции и все же быть изолированными, так как такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. В используемом в настоящем описании смысле изолированный материал или композиция также может быть очищенной композицией, т. е. не требуется достижение абсолютной чистоты, скорее данный термин используется как относительное понятие. Отдельные нуклеиновые кислоты, получаемые из библиотеки, могут быть очищены традиционным способом до электрофоретической гомогенности. В альтернативных аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые были очищены из геномной ДНК или других последовательностей, имеющихся в библиотеке или другом окружении, с достижением по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти или более порядков чистоты.
В используемом в настоящем описании смысле термин рекомбинантный означает, что нуклеиновая кислота граничит с остовом нуклеиновой кислоты, с которым она не соседствует в своем природном окружении. В одном аспекте нуклеиновые кислоты составляют 5% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в популяции молекул остова нуклеиновой кислоты. Молекулы остова согласно изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие векторы, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, интегрирующиеся нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для поддержания или обработки представляющих интерес вставок нуклеиновой кислоты. В одном аспекте обогащенные нуклеиновые кислоты составляют 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более от количества вставок нуклеиновой кислоты в популяции рекомбинантных молекул остова. Термин рекомбинантные полипептиды или белки относится к полипептидам или белкам, получаемым с использованием технологии рекомбинантной ДНК, например получаемым из клеток, трансформированных конструкций экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид или белок. Синтетические полипептиды или белки представляют собой полипептиды или белки, полученные химическим синтезом, как подробно описано ниже.
Промоторная последовательность оперативно связана с кодирующей последовательностью в том случае, когда РНК-полимераза, которая инициирует транскрипцию с промотора, будет траскрибировать кодирующую последовательность в мРНК, что подробно описано ниже.
Термин олигонуклеотид относится либо к однонитевому полидезоксинуклеотиду, либо к двум комплементарным полидезоксинуклеотидным нитям, которые могут быть получены путем химического синтеза. Такие синтетические олигонуклеотиды не содержат 5'-фосфата и, следовательно, не будут лиги
- 26 015591 ровать с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата из АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид будет лигировать с фрагментом, который не был дефосфорилирован.
Фраза по существу, идентичные в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям, которые имеют по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичность нуклеотидов или аминокислотных остатков (в последовательности) при сравнении и выравнивании с целью максимального соответствия, измеряемую с использованием любого известного алгоритма сравнения последовательностей, которые подробно обсуждаются ниже, или путем визуального просмотра. В альтернативных аспектах изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты и полипептида, имеющим существенную идентичность с приведенной в качестве примера последовательностью согласно изобретению, например последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 175 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Е41Υ, Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, О171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ, Ό234Κ или О265К и т.д., на протяжении области, составляющей по меньшей мере примерно 100, 150, 200, 300, 400 остатков или области в диапазоне примерно от 50 остатков до полной длины нуклеиновой кислоты или полипептида. Последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть, по существу, идентичными на протяжении всей длины области, кодирующей полипептид.
Дополнительно, по существу, идентичная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от эталонной последовательности одной или более консервативными или неконсервативными заменами, делециями или вставками аминокислот, особенно если такая замена осуществляется в сайте, который не является активным центром молекулы, и при условии, что полипептид, по существу, сохраняет свои функциональные свойства. Консервативная аминокислотная замена включает в себя, например, замену одной аминокислоты другой аминокислотой того же класса (например, замену одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой гидрофобной аминокислотой, или замену одной полярной аминокислоты другой полярной аминокислотой, такую как замена лизина аргинином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой или аспарагина глутамином). Одна или более аминокислот могут быть делетированы, например, из полипептида фосфолипазы, что приводит к модификации структуры полипептида без существенного изменения его биологической активности. Например, могут быть удалены аминокислоты на амино- или на карбоксильном конце, которые не требуются для проявления биологической активности фосфолипазы. Модифицированные последовательности полипептидов согласно изобретению можно анализировать в отношении биологической активности фосфолипазы с использованием любого количества способов, включающих в себя осуществление контакта модифицированной последовательности полипептида с субстратом фосфолипазы и определение того, будет ли такой модифицированный полипептид снижать количество специфического субстрата в анализе или повышать количество биологических продуктов ферментативной реакции, осуществляемой функциональной фосфолипазой на данном субстрате, что подробно обсуждается ниже.
Термин гибридизация относится к способу, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты связывают с комплементарной цепью посредством спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и избирательными, так что конкретная представляющая интерес последовательность может быть идентифицирована даже в образцах, в которых она присутствует в низких концентрациях. Могут быть заданы соответствующие жесткие условия, например, концентрациями соли или формамида в растворах, используемых перед гибридизацией или в процессе гибридизации, или температурой гибридизации, и такие условия хорошо известны специалистам в данной области. Например, жесткость может быть повышена за счет уменьшения концентрации соли, повышения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации, изменения времени гибридизации, что подробно описано ниже. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях различной жесткости (например, в условиях высокой, умеренной и низкой жесткости), которые указаны в настоящем описании.
Термин вариант относится к полинуклеотидам или полипептидам согласно изобретению, модифицированным по одному или более парам оснований, кодонам, интронам, экзонам или аминокислотным остаткам (соответственно), при сохранении биологической активности фосфолипазы согласно изобретению. Варианты могут быть получены любыми способами, включая такие способы, как, например, склонная к ошибкам ПЦР, перетасовка, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборка с использованием ПЦР, мутагенез с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР), мутагенез ίη νΐνο, кассетный мутагенез, множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, экспоненциальный множественный мутагенез, сайтспецифичный мутагенез, вторичная сборка генов, 688Μ и их сочетание. Способы получения вариантов фосфолипаз, обладающих активностью, например, при значениях рН или температуры, которые отличаются от соответствующих параметров для фосфолипазы дикого типа, также включены в настоящее изобретение.
Термин насыщающий мутагенез или генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (Сепе
- 27 015591
8йе 8а1итайоп ΜιιΙαβοηοκίκ™ (Ο88Μ)), или Ο88Μ, включает в себя способ, в котором используют вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точечных мутаций в полинуклеотид, который подробно описан ниже.
Термин система оптимизированной направленной эволюции, или оптимизированная направленная эволюция, включает в себя способ вторичной сборки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновой кислоты, например родственных генов, что подробно описано ниже.
Термин вторичная сборка по механизму синтеза с использованием лигирования, или 8ЬВ, включает в себя способ лигирования олигонуклеотидных фрагментов неслучайным образом, что подробно описано ниже.
Получение нуклеиновых кислот и манипулирование ими
Настоящее изобретение относится к изолированным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам (например, к приведенным в качестве примера последовательностям 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющим одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, Ό230Β, Ό234\, Ό234ν, Ό234Ο, Ό234Β, О234К или р265В, включая кассеты экспрессии, такие как экспрессирующие векторы, кодирующие полипептиды и фосфолипазы согласно изобретению. Изобретение также относится к способам выявления новых последовательностей фосфолипаз с использованием нуклеиновых кислот согласно изобретению. Также предлагаются способы модификации нуклеиновых кислот согласно изобретению, например посредством вторичной сборки посредством синтеза с использованием реакции лигирования, системы оптимизированной направленной эволюции и/или насыщающего мутагенеза.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены, выделены и/или использованы для манипуляций, например, путем клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и тому подобными способами. В практике осуществления способов посредством согласно изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы посредством обработки матричной нуклеиновой кислоты, что подробно описано ниже. Изобретение может быть осуществлено на практике в сочетании с любым способом или протоколом или устройством, которые известны в данной области техники и хорошо описаны в научной и патентной литературе.
Основные методики
Нуклеиновые кислоты, используемые при практическом осуществлении настоящего изобретения, независимо от их природы: РНК, 1РНК, антисмысловая нуклеиновая кислота, кДНК, геномная ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут быть выделены из множества источников, получены генноинженерными способами, амплифицированы и/или экспрессированы/получены рекомбинантно. Рекомбинантные полипептиды, получаемые на основе таких нуклеиновых кислот, могут быть выделены отдельно или могут быть клонированы и проанализированы в отношении требуемой активности. Может быть использована любая рекомбинантная система экспрессии, включая системы экспрессии клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.
Альтернативно, указанные нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы ίη νίίτο хорошо известными способами химического синтеза, описанными, например, в Айатк (1983) ί. Ат. СЕет. 8ос., 105: 661; Βе1οикον (1997) М.1с1еис. Ас1йк Век., 25: 3440-3444; Ргепке1 (1995) Ргее Вайю. ΒίοΙ. Μей., 19: 373380; В1оттегк (1994) Вюсйет1кйу, 33: 7886-7896; №1гапд (1979) Μеίй. Епхуто1., 68: 90; Вгогоп (1979) Μеίй. Епхуто1., 68: 109; Веаисаде (1981) Тейа. Ьей., 22: 1859; в патенте США № 4458066.
Способы работы с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, мечение зондами (например, мечение случайным праймером с использованием полимеразы Кленова, никтрансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и тому подобные, хорошо описаны в научной и патентной литературе (смотри, например, 8атЬтоок, ей., Μο1еси1а^ С1ошпд: А ЬаЬотаЮгу Μаηиа1 (2пй ей.), Уо1к. 1-3, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬотаЮгу (1989); СиттеШ РгоЮсо1к ш Μο1еси1а^ Вю1оду, АикиЬе1, ей. 1ойп \11еу апй 8опк, Шс., №\ν Уогк (1997); ЬаЬотаЮгу Тес11пк.|иек ш Вюсйет1кйу апй Уо1еси1аг Вю1оду: НуЬпй|/а1юп \\ί11ι МШею Ас1йк РгоЬек, Рай Ι. ТЕеогу апй МШею Ас1йк Ртеретайоп, Туккеп, ей. Е1ке^ег, ΚΥ. (1993)).
Другие способы, применимые для получения и работы с нуклеиновыми кислотами, используемые при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают в себя клонирование из геномных образцов и, при желании, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемые в способах согласно изобретению, включают в себя библиотеки геномной ДНК или кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (ΜАС), смотри, например, патенты США № 5721118, 6025155, искусственных хромосомах человека (смотри, например, ВокепГе1й (1997) №й Сепе1. 15: 333-335), искусственных хромосомах дрожжей (ΥΛΟ), бактериальных искусственных хромосомах (ВАС), искусственных хромосомах Р1 (смотри, например, \ооп (1998) Оепотюк, 50: 306316), векторов, являющихся производными Р1 (РАС) (смотри, например, Кет (1997) Вю1есйтдиек, 23: 120-124), космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах.
В одном аспекте нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, собирают
- 28 015591 в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента.
Настоящее изобретение относится к слитым белкам и к кодирующим их нуклеиновым кислотам. Полипептид согласно изобретению может быть слит с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Ν-концевые идентифицирующие пептиды, которые придают желательные характеристики, такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды согласно изобретению также могут быть синтезированы и экспрессированы в виде белков, слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, например, для получения более иммуногенного пептида, с целью более простого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и В-клеток, экспрессирующих антитела, и т.п. Домены, облегчающие выявление и очистку, включают в себя, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые участки и гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе РЬАС-удлинения/аффинной очистки (1ттипех Согр., 8еай1е XVА). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (Ιηνίйодеп, 8ап Э1едо СА), между доменом, вводимым для очистки, и пептидом или полипептидом, включающим в себя мотив, способствует облегчению очистки. Например, экспрессирующий вектор может включать в себя последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эпитоп, связанный с шестью гистидиновыми остатками, за которыми следует тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназой (смотри, например, ΧνίΠίηιηκ (1995) Вюсйет15йу, 34: 1787-1797; ЭоЬеН (1998) Рго1ет Ехрг. РигШ, 12: 404-414). Гистидиновые остатки облегчают выявление и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназы обеспечивает средство, позволяющее очищать эпитоп из оставшейся части слитого белка. Методики, относящиеся к векторам, кодирующим слитые белки, и к применению таких слитых белков, хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, Кго11 (1993) ΩΝΛ Се11. Вю1., 12: 441-53.
Последовательности регуляции транскрипции и трансляции
Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) согласно изобретению, оперативно связанным с последовательностью(ями) регуляции экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например промоторами или энхансерами для управления или модулирования синтеза/экспрессии РНК. Последовательность регуляции экспрессии может находиться в векторе экспрессии. Примерами бактериальных промоторов являются 1ас1, 1;κΖ. Т3, Т7, др!, РВ лямбда, РЬ и йр. Примерами эукариотических промоторов являются немедленный ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТВ ретровируса и промотор металлотионеина Ι мыши.
Промоторы, подходящие для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или 1гр Е. сой, промотор 1а1, промотор ΕκΖ, промотор Т3, промотор Т7, промотор др!, промотор РВ лямбда, промотор РЬ лямбда, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (ФГК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы белков теплового шока, ранний и поздний промоторы 8У40, ЬТВ. из ретровирусов и промотор металлотионеина I мыши. Также можно использовать другие известные промоторы для регуляции экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.
Экспрессирующие векторы и клонирующие носители
Настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам и клонирующим носителям, содержащим нуклеиновые кислоты согласно изобретению, например последовательности, кодирующие фосфолипазы согласно изобретению. Экспрессирующие векторы и клонирующие носители согласно изобретению могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусные ДНК (например, вирус осповакцины, аденовирус, вирус оспы птиц, вирус псевдобешенства и производные 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные для конкретных интересующих хозяев (таких как ВасШик, АкретдШик и дрожжи). Векторы согласно изобретению могут включать в себя последовательности хромосомной ДНК, внехромосомной ДНК и синтетической ДНК. Специалистам в данной области известно большое число подходящих векторов, которые являются коммерчески доступными. Примерами таких векторов являются из числа бактериальных: рОЕ-векторы (Р1адеп), плазмиды рВ1иекспр1, рNН-векторы (векторы ΖАР лямбда (8йа!адепе)); рйс99а, рКК223-3, рЭВ540, рВ1Т2Т (Рйаттааа); из числа эукариотических: рХТ1, р865 (8йа1адепе), р8УК3, рВРУ, рМ86, р8УЪ8У40 (Рйатташа). Однако можно использовать любую другую плазмиду или любой другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяине. В настоящем изобретении можно использовать как низкокопийные векторы, так и высококопийные векторы.
Экспрессирующий вектор может включать в себя промотор, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать в себя соответствующие последовательности для амплификации экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать начало репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирова
- 29 015591 ния, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК, полученные при сплайсинге 8У40, и сайты полиаденилирования можно использовать для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
В одном аспекте экспрессирующие векторы содержат один или более селектируемых маркерных генов для осуществления селекции клеток-хозяев, содержащих данный вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину культуре эукариотических клеток, гены, придающие клеткам Е. сой устойчивость к тетрациклину или ампициллину, и ген ТКР1 8. сегеу1з1ае. Области промоторов могут быть выбраны из любого требуемого гена при использовании хлорамфениколтрансферазных (ХАТ) векторов или других векторов с селектируемыми маркерами.
Векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры для повышения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой действующие в цис-положении элементы ДНК, обычно имеющие длину примерно от 10 и примерно до 300 п.н., и действуют на промотор, повышая его транскрипцию. Примерами являются энхансер 8У40 на поздней стороне начала репликации на участке от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне начала репликации и энхансеры аденовирусов.
Последовательность ДНК может быть встроена в вектор различными способами. В основном последовательность ДНК лигируют с требуемым положением в векторе после расщепления вставки и вектора соответствующими рестрикционными эндонуклеазами. Альтернативно, могут быть лигированы тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество способов клонирования, например, описанных в работе АизиЬе1 и 8атЬгоок. Такие способы, как и ряд других, известны специалистам в данной области.
Вектор может иметь форму плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают в себя последовательности хромосомной ДНК, нехромосомной ДНК и синтезированной ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговые ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные на основе сочетаний плазмид и фаговых ДНК, ДНК вирусов, таких как вирус осповакцины, аденовирус, вирус оспы птиц и вирус псевдобешенства. Множество клонирующих и экспрессирующих векторов для использования в работе с прокариотическими и эукариотическими хозяевами описано, например, в 8атЬгоок.
Конкретные бактериальные векторы, которые можно использовать, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного клонирующего вектора рВЙ322 (АТСС 37017), рКК223-3 (Рбагтааа Ппе Сбетюа1з, Иррза1а, 8^ебеп), 6ЕМ1 (Рготега Вю!ес, Маб1зоп, ЭД1, И8А), рОЕ70, рОЕ60, рОЕ-9 (Р1адеп), рЭ10, рз1Х174 рВ1иезсйр! II К8, рNН8А, рNН16а, рМН18А, р]\1Н46А (8!га!адепе), рйс99а, рКК223-3, рКК233-3, рПЙ540, рШТ5 (Рбагтааа), рКК232-8 и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают р8У2САТ, рОб44, рХТ1, р86 (8!га!адепе), р8УК3, рВРУ, рМ86 и р8УЪ (Рбагтааа). Однако можно использовать любой другой вектор при условии, что он реплицируется и жизнеспособен в клетке-хозяине.
Клетки-хозяева и трансформированные клетки
Настоящее изобретение относится также к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, например последовательность, кодирующую фосфолипазу согласно изобретению, вектор согласно изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку-хозяина, известную специалистам в данной области, включая прокариотические клетки и эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Ферменты согласно изобретению могут быть экспрессированы в любой клетке-хозяине, например, в любой бактериальной клетке, любой дрожжевой клетке, например РюЫа раз!опз, 8ассбаготусез сегеу1з1ае или 8сЫхозассбаготусез ротЬе. Примеры бактериальных клеток включают любые виды родов ЕзсбейсЫа, ВасШиз, 8!гер!отусез, 8а1топе11а, Рзеиботопаз и 8!арбу1ососсиз, включая, например, ЕзсбейсЫа сой, Ьас!ососсиз 1асйз, ВасШиз зиЫШз, ВасШиз сегеиз, 8а1топе11а 1урЫтш1ит, Рзеиботопаз йиогезсепз. Примером клеток грибов являются любые виды АзрегдШиз. Примерами дрожжевых клеток являются любые виды РюЫа, 8ассбаготусез, 8сЫхозасс11аготусез или 8сб-етапшотусез, включая РюЫа раз!опз, 8ассбаготусез сегеу1з1ае или 8сЫхозасс11аготусез ротЬе. Примерами клеток насекомых являются любые виды 8робор!ега или ЭгозорЫ1а, включая ЭгозорЫ1а 82 и 8робор!ега 8Г9. Примерами клеток животных являются СНО, СО8 или меланома Во\гез или любые линии клеток мышей или человека. Выбор подходящего хозяина доступен специалистам в данной области.
Вектор может быть введен в клетки-хозяева с использованием множества методик, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, использование генных пушек или Т1опосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с использованием фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную ^ЕΛЕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Оау1з, Ь., П1Ьпег, М., Вайеу, I., Вазю Ме!бобз ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1986).
В приемлемом случае полученные генно-инженерными способами клетки-хозяева можно культи
- 30 015591 вировать в обычных питательных средах, модифицированных, как это требуется для активации промоторов, отбора трансформантов или амплифицированных генов согласно изобретению. После трансформации соответствующего штамма-хозяина и роста штамма-хозяина до нужной плотности клеток выбранный промотор может быть индуцирован соответствующими способами (например, путем изменения температуры или химической индукции), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для того, чтобы обеспечить им возможность продуцировать требуемый полипептид или его фрагмент.
Клетки могут быть собраны центрифугированием, разрушены с использованием физических или химических способов, и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Клетки микроорганизмов, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены обычным способом, включая цикл замораживание-оттаивание, озвучивание, механическое разрушение, использование лизирующих клетки средств. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент может быть выделен и очищен из культуры рекомбинантных клеток способами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионоили катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. При необходимости, можно также использовать стадии рефолдинга белка для придания нужной конфигурации полипептиду. При необходимости на конечных стадиях очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Также можно использовать различные системы культивирования клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантного белка. Примеры систем экспрессии клеток млекопитающих включают линии С08-7 фибробластов почки обезьяны и другие клеточные линии, способные к экспрессии белков с совместимого вектора, такие как клеточные линии С127, 3Т3, СН0, НеЬа и ВНК.
Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать обычным способом, чтобы получить генный продукт, кодируемый рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в способе рекомбинантного синтеза, полипептиды, образованные клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированы или могут не подвергаться гликозилированию. Полипептиды согласно изобретению могут включать в себя или не включать в себя остаток начальной аминокислоты метионина.
Системы бесклеточной трансляции также можно использовать для получения полипептида согласно изобретению. В системах бесклеточной трансляции можно использовать мРНК, транскрибированную с конструкции ДНК, содержащей промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкция ДНК может быть линеаризована перед проведением реакции транскрипции ίη νίίτο. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением требуемого полипептида или его фрагмента.
Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов, обеспечивающих фенотипический признак, подходящий для селекции трансформированных клетокхозяев, такой как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину в случае культуры эукариотических клеток, или такой как устойчивость к тетрациклину или ампициллину в случае клеток Е. со11.
Приведенный в качестве примера фермент фосфолипаза С (имеющая последовательность, которая указана в 8ЕС ΙΌ N0: 2) сверхэкспрессировали в активной форме в системах различных хозяев, включая грамотрицательные бактерии, такие как Е. сой, грамположительные бактерии, такие как любые виды Вас111и8 (например, ВасШик киЫгШ, ВасШик сегеик), дрожжевые клетки-хозяева (включая, например, Р1сЫа раШотк, 8ассЬаготусе§ §р., такие как 8. сеге\'Ыае и 8. ротЫе) и ЬаШососсик 1асй§, или клетки млекопитающих, грибов, растений или насекомых. Активный фермент экспрессировали с различных конструкций в каждой системе хозяев. Такие конструкции для экспрессии нуклеиновых кислот могут содержать нуклеотиды, кодирующие полноразмерную открытую рамку считывания (состоящую из сигнальной последовательности, пропоследовательности и последовательности, кодирующей зрелый белок) или они могут содержать подгруппу таких генетических элементов либо отдельно, либо в комбинации с гетерологичными генетическими элементами, которые служат в качестве сигнальной последовательности и/или пропоследовательности для открытой рамки считывания зрелого белка. Каждая из таких систем может служить в качестве хозяина при коммерческом производстве для экспрессии РЬС, применяемой в ранее описанных способах ферментативного дегуммирования масла.
Амплификация нуклеиновых кислот
При практическом осуществлении настоящего изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды согласно изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть репродуцированы, например, путем амплификации. Настоящее изобретение относится к парам последовательностей амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды с фосфолипазной активностью. В одном аспекте пары праймеров способны амплифицировать последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Специалист в данной области может сконструировать пары последовательностей амплифицирующих праймеров для любой части таких последователь
- 31 015591 ностей или для полноразмерных последовательностей.
Настоящее изобретение относится к паре последовательностей амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, при этом пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность согласно изобретению, или ее фрагмент, или ее подпоследовательность. Один или каждый член пары последовательностей амплифицирующих праймеров может включать в себя олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 10-50 следующих друг за другом оснований последовательности или примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 следующих друг за другом оснований последовательности.
Настоящее изобретение относится к парам праймеров для амплификации, при этом пара праймеров содержит первый член, имеющий последовательность, указанную первыми (5') примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатками нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и второй член, имеющий последовательность, указанную первыми (5') примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатками нити, комплементарной первому члену. Настоящее изобретение относится к фосфолипазам, получаемым при амплификации, например, путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием пары праймеров для амплификации согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к способам получения фосфолипазы в результате амплификации, например полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием пары праймеров для амплификации согласно изобретению. В одном аспекте пара амплифицирующих праймеров амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например из библиотеки генов, такой как библиотека генов из окружающей среды.
Реакции амплификации также можно использовать для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (например, количества транскрипта в клеточном образце), мечения нуклеиновой кислоты (например, для нанесения ее на матрицу или на блот), выявления нуклеиновой кислоты или количественного определения содержания конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном аспекте настоящего изобретения транскрипт, выделенный из клетки или библиотеки кДНК, подвергают амплификации. Специалист в данной области может выбрать и сконструировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию ПЦР (смотри, например, РСЯ РгоЮсо1ох. А Сшйе То Μαίιοάχ Апб Аррйсайоп, ей. Ιηηίχ, Асайетю Ртехх, КУ. (1990) апй РСЯ 81га1ед1ех (1995), ей. Ιηηίχ, Асайетю Ртехх, ΚΥ.), лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (смотри, например, А и (1989) Сепотюх, 4: 560; Ьапйедгеп (1988) 8с1епсе, 241: 1077; Ватпдег (1990) Сепе, 89: 117), амплификацию на стадии транскрипции (смотри, например, Κ\\ό1ι (1989) Ргос. №Й. Асай. 8ск И8А, 86: 1173), самоподдерживаемую репликацию последовательностей (смотри, например, Сиа1еШ (1990) Ргос. №И. Асай. 8ск И8А, 87: 1874), амплификацию с участием репликазы О-Ье1а (смотри, например, 8тйй (1997) 1. Сйп. Μ^с^оЬ^о1., 35: 1477-1492); автоматизированный анализ амплификации с использованием репликазы О-Ье1а (смотри, например, Вигд (1996) Μо1. Се11. РтоЬех, 10: 257-271) и другие способы, опосредованные РНК-полимеразой (например, NА8ВА, Сапдепе, Μ^xx^xxаида, 0п1апо; смотри также Вегдег (1987) Μеΐйойx ЕпхутоЕ 152: 307-316; 8атЬгоок; АихиЬе1; патенты США № 4683195 и 4683202; 8оокпапап (1995) Вю1есйпо1оду, 13: 563-564).
Определение степени идентичности последовательностей
Настоящее изобретение относится к изолированным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную (100%) идентичность последовательности с приведенной в качестве примера нуклеиновой кислотой согласно изобретению (например, последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8ЕО ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41А, Е41Е, Е41У, Е41Я, Е94Я, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Э100Е, Ό100Α, А104Б, Ό111Κ, Т112Я, Υ116Α, Ι117Α, Р118А, Е125К, 8168К Э171У, Э171Е, Μ176Α, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234Α, Э234У, Э234С, Ό234Κ, Ό234Κ или О265Я и нуклеиновыми кислотами, кодирующими последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющими одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е4Ш, Е41Е, Е41У, Е41Я, Е94Я, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Э100Е, Ό100Α, А104Б, Ό111Κ, Т112Я, Υ116Α, Ι117Α, ΓΠ8Α, Е125К, 8168К Э171У, Э171Е, Μ176Α, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234Α, Э234У, Э234С, Ό234Κ, Ό234Κ или О265Я) на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков. В настоящем изобретении предлагаются полипептиды, содержащие последовательности, имеющие по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, или большую, или полную (100%) идентичность последовательности с приведенным в качестве примера полипептидом согласно изобретению. Степень идентичности последовательностей (гомологию) можно определить с использованием любой компьютерной программы и соответствующих параметров, включая программы и параметры, описанные в настоящем изобретении, такие как ВБА8Т 2.2.2. или ЕА8ТА, версия 3.0ΐ78, с параметрами, заданными по умолчанию. В альтернативных вариантах идентичность последовательностей может охватывать об
- 32 015591 ласть, включающую в себя по меньшей мере примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 последовательных остатков или распространяться на всю длину нуклеиновой кислоты или полипептида. Степень идентичности последовательностей (гомологии) может быть определена с использованием любой компьютерной программы и связанных параметров, включая программы и параметры, описанные в настоящем изобретении, такие как ВЬА8Т 2.2.2. или РАЗТА, версия 3.0ΐ78, в которых используются значения параметров, заданные по умолчанию.
Фиг. 11 представляет собой таблицу, описывающую выбранные характерные признаки приведенных в качестве примера нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению, включая сравнение идентичности последовательностей, приведенных в качестве примера, с опубликованными базами данных. Все последовательности, описанные на фиг. 11, были подвергнуты поиску ВЬА8Т (который подробно описан ниже) в двух наборах баз данных. Первый набор баз данных доступен из N081 (№11юпа1 СеШет ίοτ Вю1сс11по1оду ΙηίοηηαΙίοη). Все результаты поисков в таких базах данных находятся в колонках, озаглавленных Описание N8, код доступа N8, оценка N8 или организм N8. N8 относится к неизбыточной базе данных нуклеотидных последовательностей, которая хранится в NСВI. Указанная база данных составлена из СепВапк, обновлений СепВапк и обновлений ЕМВЬ. Записи в колонке Описание N8 относятся к строке определения в любой введенной записи NСВI, которая включает в себя описание последовательности, например указание организма, который является источником последовательности, названия гена/названия белка, или небольшое описание функции последовательности. Записи в колонке код доступа N8 относятся к уникальному индексу, присваиваемому записи последовательности. Записи в колонке оценка N8 относятся к ожидаемому значению (оценке), которое представляет собой вероятность того, что вес выравнивания фактически такой же, как найденный между запрашиваемой последовательностью (последовательности согласно изобретению) и последовательностью в базе данных, можно было бы найти при таком же количестве сравнений между случайными последовательностями, которое было сделано в данном поиске ВЬА8Т. Записи в колонке организм N8 относятся к организму, являющемуся источником последовательности, идентифицированному в качестве ближайшего совпадения в ВЬА8Т. Второй набор баз данных известен под общим названием база данных Сепекед™, которая доступна из ТНопъоп ОегиегИ (РЫ1абе1рЫа, РА). Все результаты поисков в указанной базе данных находятся в колонках, озаглавленных описание белка Сепекед, код доступа белка Сепекед, оценка белка Сепекед, описание ДНК Сепекед, код доступа ДНК Сепекед или оценка ДНК Сепекед. Информация, размещенная в указанных колонках, совместима с информацией, находящейся в колонках N8, описанных выше, за исключением того, что она получена в результате поисков ВЬА8Т в базе данных Сепекед™ вместо баз данных NСВI. Кроме того, в указанную таблицу включена колонка предполагаемый номер ЕС. Номер ЕС представляет собой номер, присвоенный типу фермента согласно схеме стандартной номенклатуры ферментов, разработанной комиссией по номенклатуре ферментов Комитета по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии (ШВМВ). Результаты в колонке предполагаемый номер ЕС определяют с помощью поиска ВЬА8Т против базы данных Кедд (КуоЮ Епсус1ореб1а οί Сепек апб Сепотек). Если наилучшее совпадение ВЬА8Т имеет Е-значение, равное или меньше чем е-6, то номер ЕС, присвоенный наилучшему совпадению, вводят в таблицу. Номер ЕС наилучшего совпадения используют в качестве ориентира в отношении того, какой номер ЕС могла бы иметь последовательность согласно изобретению. Колонки длина запрашиваемой ДНК и длина запрашиваемого белка относятся к количеству нуклеотидов или количеству аминокислот, соответственно, в последовательности согласно изобретению, поиск которой и запрос которой осуществляют в базах данных NСВI или Сепекед. Колонки длина ДНК Сепекед или N8 и длина белка Сепекед или N8 относятся к количеству нуклеотидов или количеству аминокислот, соответственно, в последовательности, соответствующей наилучшему совпадению при поиске ВЬА8Т. Результаты, приведенные в указанных колонках, получены в результате поиска, который выдавал более низкое значение Е, либо в базах данных NСВI, либо в базе данных Сепекед. Колонки % ΙΌ Сепекед или N8 и % ΙΌ ДНК Сепекед или N8 относятся к идентичности последовательностей в процентах между последовательностью согласно изобретению и последовательностью наилучшего совпадения, найденного с помощью ВЬА8Т. Результаты, представленные в указанных колонках, получены в результате поиска, который выдавал более низкое значение Е, либо в базах данных NСВI, либо в базе данных Сепекед.
Гомологичные последовательности также включают в себя последовательности РНК, в которых уридины замещают тимины в последовательностях нуклеиновых кислот. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любого из способов, указанных в настоящем описании, или могут представлять собой результат коррекции ошибок секвенирования. Будет понятно, что последовательности нуклеиновых кислот, указанные в настоящем описании, могут быть представлены в традиционной однобуквенной форме (смотри, например, 8йует, БиБей, В^οсйет^к^ιу. 3гб Еб., ν.Η. Ргеетап апб Сю., №\ν ΥογΡ) или в любой другой форме, которая позволяет записать идентичность нуклеотидов в последовательности.
В данном аспекте изобретения можно использовать разные программы сравнения последовательностей, приведенные в настоящем описании. Идентичность последовательностей белков и/или нуклеино
- 33 015591 вых кислот (гомология) можно оценить с использованием любого из множества алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают, без ограничения, ТВЬА8Т^ ВЬА8ТР, ЕА8ТА, ТЕА8ТА и СЬи^ТАЕЛУ (Реагкоп апй Ыртап, Ргос. N011. Асай. 8с1. И8А, 85(8): 2444-2448, 1983; АИзсЫ е! а1., I. Мо1. В1о1., 215(3): 403-410, 1990; Тйотркоп е! а1., М.1с1е1с Ас1йк Кек., 22(2): 4673-4680, 1994: Шддтк е! а1., Ме!йойк Епхуто1., 266: 383-402, 1996; А1!ксйи1 е! а1., I. Мо1. Вю1., 215(3): 403-410, 1990; А1йсЬи1 е! а1., №!иге Сепейск, 3: 266-272, 1993).
Гомологию или идентичность можно измерить с использованием компьютерной программы для анализа последовательности (например, пакета компьютерных программ для анализа последовательностей Сепейск Сотри!ег Сгоир, Итуегкйу о£ \У1ксопкт В1о!есйпо1оду Сеп!ег, 1710 Итуегкйу Ауепие, Майкоп, \νΙ 53705). Указанное программное обеспечение совмещает сходные последовательности, присваивая определенное значение степени гомологии для разных делеций, замен и других модификаций. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые выявлены как одинаковые при сравнении и выравнивании с целью поиска максимального соответствия в окне сравнения или на определенном участке, который измеряют с использованием любого числа алгоритмов сравнения последовательностей или при выравнивании вручную и визуальном просмотре. В случае сравнения последовательностей одна последовательность может выполнять роль эталонной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости, задают координаты подпоследовательности и задают параметры программы, основанной на алгоритме сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы, заданные по умолчанию, или могут быть заданы альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей позволяет вычислить процент идентичности последовательностей для исследуемых последовательностей относительно эталонной последовательности на основе параметров программы.
Окно сравнения в используемом в настоящем описании смысле включает в себя обращение к любому из множества участков, состоящих из следующих друг за другом остатков. Например, в альтернативных аспектах настоящего изобретения следующие друг за другом остатки, количество которых варьирует от 20 до полной длины, приведенной в качестве примера последовательности согласно изобретению, сравнивают с эталонной последовательностью, содержащей такое же количество следующих друг за другом положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Если эталонная последовательность имеет требуемую идентичность с приведенной в качестве примера последовательностью согласно изобретению, например, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность с последовательностью согласно изобретению, то такая последовательность входит в объем настоящего изобретения. В альтернативных вариантах подпоследовательности, имеющие длину примерно от 20 до 600, примерно от 50 до 200 и примерно от 100 до 150 остатков, сравнивают с эталонной последовательностью с таким же количеством непрерывно следующих друг за другом положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для их сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения может быть проведено, например, с использованием алгоритма определения локальной гомологии, предложенного Смитом и Ватерманом, 8тйй апй Vа!е^тап, Айу. Арр1., Май., 2: 482, 1981, алгоритма определения гомологии посредством выравнивания (№ей1етаи апй νππδοΗ, Σ. Мо1. Вю1., 48: 443, 1970), способа поиска сходства (Регкоп апй Ыртап, Ргос. №!1. Асай. 8сг И8А, 85: 2444, 1988), компьютеризированного применения указанных алгоритмов (САР, ВЕ8ТИТ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА в пакете программ V^ксоηк^η Сепейск, Сепейск Сотри!ег Сгоир, 575 8с1епсе Иг., Май1коп, νΙ) или с использованием выравнивания вручную и визуального просмотра. Другие алгоритмы определения гомологии или идентичности включают, например, в дополнение к программе ВЬА8Т (инструмент для поиска на основе базового локального выравнивания Национального Центра биологической информации (Вайс Ьоса1 Айдптеи! 8еаг1й Тоо1 а! !йе №Юопа1 Сеп!ег £ог Вю1одюа1 Шогтайоп)), АЫСН АМА8, (анализ множественного выравнивания последовательностей (Апа1уйк о£ Ми1йр1у Айдпей 8еццепсек)), АМР8 (множественное выравнивание последовательностей белков (Рго!ет Мц1йр1е 8ес.|иепсек Айдптеи!)), А88ЕТ (инструмент для статистической оценки выровненных участков (Айдпей 8едтеп! 81айкйса1 Еуа1иа!юп Тоо1)), ВАN^8. ВЕ8Т8С0К, ВI08САN (программа сравнительного анализа биологических последовательностей (Вю1одюа1 8ес.|иепсе Сотрагайуе Апа1уйк №йе), ВЫМР8 (блоки для улучшенного поиска (В1оскк о£ йпргоуей 8еагсйег)), ЕА8ТА, Й11е1уа1к апй Рот!к, ВМВ, Сйи8ТАЙ V, Сйи8ТАЙ V, С0№Е^И8, ЬС0№Е№и8, №С0№Е№И8, алгоритм Смита-Ватермана, ПАК№Ш, алгоритм Лас-Вегас, ЕNАΤ (улучшенный инструмент выравнивания нуклеотидов (Еогсей №.1с1еоййе Айдпей Тоо1)), Егатеайдп, Егатекеагсй, ^ΥNАМIС, ВЫТЕК, Е8АР (пакет для анализа последовательностей ВпЧепкку (ЕпЧепкку 8ес.|иепсе Апа1уйк Раскаде)), САР (программа глобального выравнивания (С1оЬа1 Айдптеи! Ргодгат)), СΕNА^, СШВ8, СепОиекк Ι88ί’ (чувствительная программа сравнения по
- 34 015591 следовательностей (8епкШуе 8ес.|иепсек Сотрапкоп)), ΕΑυ^ (программа локального выравнивания последовательностей (Ьоса1 8ес.|иепсе Α1^дптей)), ЬСР (программа определения локального содержания (Ьоса1 Сойей Ргодгат)), ΜΑίΑ\ν (инструмент множественного выравнивания, конструирования и анализа (Ми1бр1е Α1^дηтей, Сопк1гис1юп апб Αηηΐλ'κίκ \огкЬепсй)), ΜΑΡ (программа множественного выравнивания (МиШр1у Α1^дптей Ргодгат)), МВЬКР, МВЕК№ ΡIΜΑ (программа множественного выравнивания последовательностей, индуцируемого выявлением закономерностей в структуре (РайетЯпбисеб Ми111-8ес.|иепсе Α1^дптей)), 8ΑΟΑ (выравнивание последовательностей с использованием генетического алгоритма (8ес.|иепсе Α1^дптей Ьу Сепейс Α1до^^ΐйт)) и \ΗΑΤ-ΙΡ. Такие программы выравнивания также могут быть использованы для скрининга геномных баз данных с целью идентификации полинуклеотидных последовательностей, обладающих, по существу, идентичными последовательностями. Доступно большое число геномных баз данных, например, значительная часть генома человека доступна в составе базы, созданной в рамках осуществления проекта секвенирования генома человека (ШЬЬк, 1995)). Секвенировано несколько геномов, например, М. дешййит (Ргакег е! а1., 1995), М. )аппакс1ш (Вий е! а1., 1996), Н. шПиепхае (РШксйтапп е! а1., 1995), Е. со11 (В1абпег е! а1., 1997), дрожжи (8. сегеуШае) (Метек е! а1., 1997) и Ό. те1аиодайег (Абатк е! а1., 2000). Был достигнут значительный прогресс в секвенировании геномов модельного организма, такого как мышь, С. е1едапк и Α^аЬаборк^к кр. Базы данных, содержащие информацию о геномах, сопровождаемые сведениями функционального характера, поддерживаются разными организациями и доступны через Интернет.
В практике осуществления настоящего изобретения также используют алгоритмы В^Α8Τ, ΕΕΑ8Τ 2.0 и В^Α8Τ 2.2.2. Они описаны, например, в Α11κ№ιι1 (1977) Шс. Αο6κ Кек. 25: 3389-3402; Α11κ№ιι1 (1990) 1. Мо1. Вю1., 215: 403-410. Компьютерная программа для проведения анализов В^Α8Τ общедоступна через Национальный Центр биотехнологической информации. Указанный алгоритм включает в себя сначала идентификацию пары последовательностей с высокой оценкой в баллах (Н8Р) путем идентификации коротких слов длиной \ в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому пороговому положительному значению оценки Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т называют порогом оценки родства слов (АЙксНЫ (1990), выше). Такие исходные наилучшие события нахождения родства слов действуют как затравки для начальных поисков с целью нахождения более длинных Н8Р, содержащих ранее найденные. Совпадения слов распространяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности по мере того, как суммарная оценка выравнивания увеличивается. Суммарную оценку в баллах рассчитывают с использованием в случае нуклеотидных последовательностей параметров М (присваиваемая оценка в баллах для пары совпадающих, которая всегда >0). В случае аминокислотных последовательностей используют матрицу для подсчета суммарной оценки в баллах. Расширение совпадений слов в каждом направлении прекращается в том случае, когда суммарная оценка выравнивания в баллах уменьшается на величину X относительно максимального достигнутого значения; значение суммарной оценки в баллах доходит до 0 или ниже за счет накопления одного или нескольких событий выравнивания остатков, оцениваемых отрицательно; или при достижении конца любой из последовательностей. Параметры алгоритма ΕΕΑ8Τ \, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа В^Α8ΤN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (\ ) 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. В случае аминокислотных последовательностей программа В^Α8ΤΡ использует по умолчанию длину слова 3, ожидания (Е) 10, а также матрицу подсчета ВЬ08ИМ62 (смотри НейкоГГ апб НейкоГГ (1989) Ргос. №И. Αсаб. 8ск υ8Α, 89: 10915) с использованием значения выравниваний (В), 50, ожидания (Е), 10, М=5, N=-4 и сравнения обеих нитей. Алгоритм В^Α8Τ также осуществляет статистический анализ результатов поиска сходства между двумя последовательностями (смотри Каг1ш апб Α11κ№ιι1 (1993) Ргос. №111. Αсаб. 8сЕ υ8Α 90: 5873). Одним из критериев сходства, выявляемого с использованием алгоритма В^Α8Τ, является наименьшая сумма вероятностей (Р(Ц)), которая является показателем вероятности, с которой может происходить случайное совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается похожей на эталонную последовательность, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001. В одном аспекте гомологию между белковыми последовательностями и последовательностями нуклеиновой кислоты оценивают с использованием инструмента поиска на основе базового локального выравнивания (В^Α8Τ). Например, можно использовать пять специфичных программ В^Α8Τ для решения следующих задач:
(1) В^Α8ΤΡ и В^Α8Τ3 проводят сравнение запрашиваемой аминокислотной последовательности с базой данных белковых последовательностей;
(2) В^Α8ΤN проводит сравнение запрашиваемой нуклеотидной последовательности с базой данных нуклеотидных последовательностей;
(3) В^Α8ΤX проводит сравнение формальных продуктов трансляции шести рамок считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих нитей) с базой данных белковых последовательностей;
- 35 015591 (4) ТВ^А8ТN проводит сравнение запрашиваемой белковой последовательности с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых во всех шести рамках считывания (для обеих нитей); и (5) ТВЬА8ТХ проводит сравнение продуктов трансляции шести рамок считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности продуктами трансляции шести рамок считывания нуклеотидных последовательностей в базе данных.
Программы ВЬА8Т находят гомологичные последовательности посредством идентификации сходных участков, которые называют в данном описании как пары участков с высокой оценкой в баллах между запрашиваемой аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты и исследуемой последовательностью, которая предпочтительно получена из базы данных белковых последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот. Пары участков с высокой оценкой в баллах предпочтительно идентифицируют (например, выравнивают) с помощью матриц весов, многие из которых известны в данной области. Предпочтительно используемой матрицей весов является матрица βΕ·08υΜ62 (Соппе! е! а1., 8с1епсе 256: 1443-1445; 1992; Непкойй апй НешкойГ, Рго!еш§ 17: 49-61, 1993). Менее предпочтительно также можно использовать матрицы РАМ или РАМ250 (смотри, например, 8с11\уайх апй ИауРойй, ей§., 1978, УаШсе^ йог Ие!ес!шд ИШапсе КекШопРир: А!1а§ ой Рго!еш 8ес.|иепсе апй 8!гис!иге, \а§Ыпд!оп: №Шопа1 Вюшейюа1 гекеагсР Еоипйайоп).
В одном аспекте настоящего изобретения для определения того, имеет ли нуклеиновая кислота идентичность по последовательности, требуемую для того, чтобы она входила в объем настоящего изобретения, используют программы NСВI ВЬА8Т 2.2.2 с параметрами, заданными по умолчанию для Ь1айр. В программе ВЬА8Т 2.2.2 имеется примерно 38 установленных параметров. В данном иллюстративном аспекте настоящего изобретения используются все значения, заданные по умолчанию, за исключением значения установки фильтрования (т.е. все параметры устанавливают по умолчанию, за исключением параметра фильтрования, который устанавливают в положение 0ЕЕ); вместо этого используют установку -Е Е, которая может отключать фильтрование. Использование фильтрования по умолчанию часто приводит к нарушениям Каг1ш-А1!сРи1 из-за короткой длины последовательности.
Установленные по умолчанию значения, используемые в данном иллюстративном аспекте изобретения и используемые для определения значений, приведенных на фиг. 11, которые описаны выше, включают в себя:
Фильтрование для слов низкой сложности: 0N > Размер слова: 3 > Матрица: В1о§иш62 > оценка пробела: наличие пробела: 11 > Удлинение:1
Другие заданные по умолчанию параметры включают в себя фильтр для слов низкой сложности 0ЕЕ, размер слова 3 для белка, матрица В^08υΜ62, штраф за наличие пробела -11 и штраф за продление пробела -1.
В примере 1 ниже показана иллюстративная настройка параметров программы NСВI ВЬА8Т 2.2.2. В данном примере параметр -\ установлен по умолчанию на значении 0. Это означает, что без соответствующей установки размер слова по умолчанию составляет 3 для белков и 11 для нуклеотидов.
Компьютерные системы и компьютерные программные продукты
Для определения и выявления идентичности последовательностей, структурной гомологии, мотивов и тому подобного ш кШсо последовательность полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть сохранена, записана и подвергнута манипуляциям на любой среде, которая может быть прочитана и проанализирована компьютером. Соответственно, настоящее изобретение относится к компьютерам, компьютерным системам, компьютерным читаемым средам, компьютерным программным продуктам и т.п., записанным или хранящимся на них последовательностям нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению, например типичной последовательности согласно изобретению. В используемом в настоящем описании смысле фразы записанная и хранящаяся относятся к способу хранения информации в компьютерной среде. Специалист в данной области легко сможет применить любые известные способы записи информации на машиночитаемых носителях для создания продуктов, содержащих одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот и/или полипептидов согласно изобретению.
Другой аспект настоящего изобретения относится к машиночитаемой среде, на которой записана информация по меньшей мере об одной последовательности нуклеиновой кислоты и/или полипептида согласно изобретению. Машиночитаемые среды включают в себя магнитные читаемые среды, оптические читаемые среды, электронные читаемые среды и магнитные/оптические среды, флэш-память. Например, машиночитаемые среды могут представлять твердый диск, гибкий диск, магнитную ленту, флэш-память, компакт-диск (СИ-ΚΌΜ), цифровой универсальный диск (ИУИ), оперативное запоминающее устройство (ОЗУ (ΡΛΜ) или постоянное запоминающее устройство (ПЗУ (Κ0Μ)), а также другие типы сред, известные специалистам в данной области.
Аспекты настоящего изобретения относятся к системам (например, системы, основанные на досту
- 36 015591 пе через Интернет), в частности компьютерные системы, которые хранят и позволяют манипулировать с последовательностями и информацией о последовательностях, описанных в настоящем изобретении. Один пример компьютерной системы 100 проиллюстрирован на блок-схеме, показанной на фиг. 1. В используемом в настоящем описании смысле термин компьютерная система относится к аппаратным компонентам, программным компонентам и компонентам для хранения данных, используемых для анализа нуклеотидных или полипептидных последовательностей согласно изобретению. Компьютерная система 100 может включать в себя процессор для обработки, оценки и манипулирования данными о последовательностях. Процессор 105 может относиться к любому известному типу центральных процессорных устройств, таких как, например, РепЬит ΙΙΙ от !п(с1 СогрогаРоп или аналогичный процессор от 8ип, ΜοΙΟΓοΙα, Сотрад, ΛΜΩ или ΙηΝπκιΙίοηαΙ Викктек Μαοΐιίικδ. Компьютерная система 100 представляет собой систему общего назначения, которая включает в себя процессор 105 и один или несколько компонентов для хранения внутренних данных 110, предназначенных для хранения данных, и одно или несколько устройств для поиска данных с целью поиска информации, которая хранится в компонентах для хранения данных. Специалисту в данной области будет понятно, что может быть пригодна любая из доступных в настоящее время компьютерных систем.
В одном аспекте компьютерная система 100 включает в себя процессор 105, соединенный с шиной, которая, в свою очередь, соединена с основной памятью 115 (предпочтительно работающей как ОЗУ) и одно или несколько внутренних устройств 110 для хранения данных, таких как жесткий диск и/или другие машиночитаемые среды, содержащие записанную на них информацию. Компьютерная система 100 может дополнительно включать в себя одно или несколько устройств поиска данных 118 для чтения данных, хранящихся во внутренних устройствах для хранения данных 110.
Устройство для поиска данных 118 может представлять собой, например, дисковод для гибких дисков, дисковод для компакт-дисков, драйвер накопителя на магнитной ленте или модем, способный к соединению с удаленной системой хранения данных (например, через Интернет) и т. п. В некоторых вариантах внутреннее устройство для хранения данных 110 представляет собой удаленную машиночитаемую среду, такую как гибкий диск, компакт-диск, магнитная лента и т.п., содержащую записанные на ней контрольные логические и/или другие данные. Компьютерная система 100 преимущественно может включать в себя или быть запрограммированной с помощью соответствующей компьютерной программы на считывание контрольных логических данных и/или данных из компонента хранения данных после того, как его вставляют в устройство для поиска данных.
Компьютерная система 100 включает в себя дисплей 120, который используют для вывода информации пользователю компьютера. Следует также отметить, что компьютерная система 100 может быть соединена с другой компьютерной системой 125а-с в виде сети или в виде более широкой сети для обеспечения централизованного доступа к компьютерной системе 100. Программное обеспечение для оценки и обработки нуклеотидных или аминокислотных последовательностей согласно изобретению может находиться в основной памяти 115 в процессе работы.
В некоторых аспектах компьютерная система 100 может дополнительно включать в себя алгоритм сравнения последовательностей для сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Алгоритм и последовательность(и) могут храниться в машиночитаемой среде. Фраза алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или нескольким программам, которыми может быть снабжена (локально или в удаленном режиме) компьютерная система 100 для сравнения нуклеотидной последовательности с другими нуклеотидными последовательностями и/или соединениями, информация которых хранится в устройствах для хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности репрезентативной последовательности, хранящейся в машиночитаемой среде, с эталонными последовательностями, также хранящимися в машиночитаемой среде, для идентификации наличия гомологии или структурных мотивов.
Параметры, используемые в указанных выше алгоритмах, могут быть адаптированы к соответствующей длине последовательности и степени исследуемой гомологии. В некоторых аспектах такие параметры могут представлять собой заданные по умолчанию параметры, используемые алгоритмами без каких-либо инструкций от пользователя. Фиг. 2 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один аспект способа осуществления процесса 200 для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями, имеющимися в базе данных, для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных. База данных последовательностей может представлять собой частную базу данных, которая хранится в компьютерной системе 100, или общественно доступную базу данных, такую как СЕNΒАNК, доступ к которой открыт через Интернет. Процесс 200 начинается с исходного состояния 201 и затем движется к стадии 202, на которой новую последовательность, подлежащую сравнению, вводят в память компьютерной системы 100. Как обсуждалось выше, память может представлять любой тип памяти, включая ОЗУ или внутреннее устройство для хранения информации.
Затем процесс 200 переходит к стадии 204, на которой открывается база данных последовательностей для анализа и сравнения. Затем процесс 200 переходит к стадии 206, на которой первая последовательность, хранящаяся в базе данных, прочитывается в памяти компьютера. Затем на стадии 210 прово
- 37 015591 дится сравнение для выяснения того, является ли первая последовательность той же самой, что и вторая последовательность. Важно отметить, что данная стадия не ограничивается проведением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью в базе данных. Специалистам в данной области хорошо известны способы сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не идентичны. Например, в последовательность могут быть введены пробелы для повышения уровня гомологии между двумя исследуемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют, будут ли пробелы или другие структурные особенности введены в последовательность в ходе сравнения, обычно задаются пользователем компьютерной системы.
После выполнения сравнения двух последовательностей на стадии 210 осуществляется определение на стадии вынесения решения 210 относительно того, являются ли две последовательности одинаковыми. Конечно, термин одинаковые не ограничивается последовательностями, которые являются абсолютно идентичными. Последовательности, которые соответствуют параметрам гомологии, задаваемым пользователем, будут обозначаться как одинаковые в способе 200. Если определено, что две последовательности являются одинаковыми, то процесс 200 переходит к стадии 214, на которой на дисплей для пользователя выводится название последовательности из базы данных. Данная стадия показывает пользователю, что последовательность с указанным названием удовлетворяет ограничениям, которые были введены для гомологии. После выведения на дисплей названия последовательности для пользователя, процесс 200 переходит к стадии вынесения решения 218, на которой делается вывод, существуют ли еще нужные последовательности в базе данных. Если в базе данных больше нет нужных последовательностей, то процесс 200 заканчивается последней стадией 220. Однако если в базе данных еще имеются последовательности, то процесс 200 движется к стадии 204, на которой указатель переходит к следующей последовательности в базе данных, которая может быть подвергнута сравнению с новой последовательностью. Таким образом, новая последовательность выравнивается и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных.
Следует отметить, что если на стадии вынесения решения 212 определено, что последовательности не являются гомологичными, то процесс 200 сразу же переходит на стадию вынесения решения 218 для определения того, есть ли другие последовательности, доступные в базе данных для сравнения. Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к компьютерной системе, включающей в себя процессор, устройство для хранения данных, хранящее в себе информацию о последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и инструмент сравнения последовательностей для проведения сравнения. Инструмент сравнения последовательностей может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы, или он может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые подвергаются сравнению с кодами данной нуклеиновой кислоты и кодами данного полипептида.
Фиг. 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один вариант способа осуществления процесса 250 в компьютере для определения того, являются ли две последовательности гомологичными. Процесс 250 начинается с исходного состояния 252 и затем переходит к стадии 254, на которой первая подлежащая сравнению последовательность вводится в память для хранения. Затем на стадии 256 вторая последовательность, подлежащая сравнению, направляется в память. Затем процесс 250 переходит к стадии 260, на которой прочитывается первая характеристика первой последовательности, и затем к стадии 262, на которой прочитывается первая характеристика второй последовательности. Следует понимать, что если последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, то такой характеристикой обычно являются А, Т, Ц, Г или У. Если последовательность представляет собой последовательность белка, то это может быть однобуквенный код аминокислоты, так что и первую, и вторую последовательности можно легко сравнить. Затем на стадии вынесения решения 264 определяют, являются ли обе характеристики одинаковыми. Если они одинаковые, то процесс 250 переходит на стадию 268, на которой прочитываются следующие характеристики первой и второй последовательности. Затем определяется, являются ли следующие характеристики одинаковыми. Если они одинаковы, то процесс 250 продолжает такой цикл до тех пор, пока две характеристики будут неодинаковыми. Если определено, что следующие две характеристики являются неодинаковыми, то процесс 250 переходит на стадию вынесения решения 274 для определения того, есть ли еще характеристики или последовательности для прочтения. Если больше нет характеристик для прочтения, то процесс 250 переходит на стадию 276, на которой для пользователя на экран выводятся данные об уровне гомологии между первой и второй последовательностями. Уровень гомологии определяется посредством вычисления отношения характеристик, которые являются одинаковыми в последовательностях, к общему количеству характеристик в первой последовательности. Таким образом, если каждая характеристика в первой 100-нуклеотидной последовательности выровнена с каждой характеристикой во второй последовательности, то уровень гомологии между ними будет составлять 100%.
Альтернативно, компьютерная программа может сравнивать эталонную последовательность с последовательностью согласно изобретению для определения того, отличаются ли такие последовательности по одному или нескольким положениям. Программа может регистрировать длину и идентичность встроенных, делетированных или замененных нуклеотидов или аминокислотных остатков либо относи
- 38 015591 тельно эталонной последовательности, либо последовательности согласно изобретению. Компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли эталонная последовательность единичный нуклеотидный полиморфизм (8ΝΓ) относительно последовательности согласно изобретению или последовательность согласно изобретению включает в себя 8ΝΓ известной последовательности. Таким образом, в некоторых аспектах компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует 8ΝΓ. Указанный способ может быть осуществлен с использованием компьютерной системы, описанной выше, и способ проиллюстрирован на фиг. 3. Указанный метод может быть осуществлен посредством прочтения последовательности согласно изобретению и эталонных последовательностей с использованием компьютерной программы и идентификации различий также с помощью компьютерной программы.
В других аспектах компьютерная система включает в себя идентификатор для идентификации характерных признаков нуклеиновой кислоты или полипептида согласно изобретению. Термин идентификатор относится к одной или нескольким программам, которые позволяют идентифицировать определенные характеристики в последовательности нуклеиновой кислоты. Например, идентификатор может включать в себя программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания (ОРС) в последовательности нуклеиновой кислоты. На фиг. 4 представлена блок-схема, иллюстрирующая один аспект способа идентификации 300, используемого для выявления наличия определенного характерного признака в последовательности. Процесс 300 начинается с исходного состояния 302 и далее переходит к стадии 304, на которой первая последовательность, подлежащая оценке в отношении характерных признаков, вводится в память 115 в компьютерной системе 100. Затем процесс 300 переходит к стадии 306, на которой открывается база данных, включающая информацию о характерных признаках последовательностей. Такая база данных может содержать перечень характерных признаков вместе с их наименованиями. Например, наименование характеристики может быть кодон инициации, а ее значение может быть АТС. Другим примером может быть наименование характеристики ТАТААТАА-бокс и ее значение может быть ТААТАА. Примером такой базы является база данных, созданная Компьютерной Группой по генетике при Университете Висконсин (ΌηίνοίΈίΙν \18соп8ш Сепейсз СотрЩег Сгоир). Альтернативно, указанные характерные признаки могут представлять собой структурные мотивы полипептида, такие как альфа-спирали, бета-слои и функциональные мотивы полипептидов, такие как активные сайты ферментов, мотивы спираль-петля-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области. После того как на стадии 306 открывается база данных с информацией о характеристиках, процесс 300 переходит к стадии 308, на которой прочитывается первая характеристика из базы данных. Затем на стадии 310 выполняется сравнение значения первой характеристики с первой последовательностью. Затем на стадии принятия решения 316 происходит определение того, имеется ли первый характерный признак в первой последовательности. Если признак найден, то процесс 300 переходит к стадии 318, на которой наименование найденного характерного признака выводится на экран для пользователя. Затем процесс 300 переходит к стадии принятия решения 320, на которой определяется, есть ли еще характеристики в базе данных. Если характеристик больше нет, то процесс 300 заканчивается на последней стадии 324. Однако если в базе данных имеются еще характеристики, в процессе 300 происходит прочтение следующей характеристики последовательности на стадии 326 с возвращением процесса к стадии 310, на которой значение следующей характеристики сравнивается с первой последовательностью. Если на стадии принятия решения 316 характерный признак не найден в первой последовательности, то процесс 300 переходит сразу к стадии принятия решения 320, с тем чтобы определить, есть ли еще характеристики в базе данных. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к компьютерной программе, которая идентифицирует открытые рамки считывания (ОРС).
Последовательность полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть введена для хранения и последующей манипуляции с использованием множества программ для обработки данных в разных форматах. Например, последовательность может храниться в виде текста в файле для обработки текстов, таком как М1сго8ОЙ\ОКЭ или \ОВОРЕВРЕСТ, или в виде файла А8С11 в различных программах для баз данных, известных специалистам в данной области, таких как ΌΒ2, 8УВА8Е или ОВАСЬЕ. Кроме того, можно использовать различные компьютерные программы и базы данных в качестве алгоритмов сравнения последовательностей, идентификаторов и источников эталонных нуклеотидных последовательностей или пептидных последовательностей, подвергаемых сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Программы и базы данных, используемые в практике осуществления настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, МасРайегп (ЕМВЬ), ^^8сονе^уΒа8е (Мо1еси1аг Аррйсайопз Сгоир), СепеМше (Мо1еси1аг Аррйсайопз Сгоир), Ьоок (Мо1еси1аг Аррксайопз Сгоир), МасЬоок (Мо1еси1аг Аррксайопз Сгоир), ВБА8Т и ВБА8Т2 (ΝΟΒΙ), Β^А8ТN и ВБА8ТХ (А1!8сйи1 е! а1., I. Мо1. Вю1., 215: 403, 1990); РА8ТА (Реагзоп апб Ыртап, Ргос. Асаб. 8а. И8А 85: 2444, 1988), ЕА8ТИВ (ВгиЙад е! а1., Сотр. Арр. ВюзсГ, 6: 327-245, 1990), Са!а1уз! (Мо1еси1аг 81ти1айоп5 1пс.)/ Са!а1у8!/8НАРЕ (Мо1еси1аг 81ти1а!юп5 1пс.), Сегш82.ИВАссе88 (Мо1еси1аг 81ти1а!юп8 1пс.), НуроСеп (Мо1еси1аг 81ти1а!юп5 1пс.), 1п81дй! II (Мо1еси1аг 81ти1айоп5 1пс.), ^^8сονе^ (Мо1еси1аг 81ти1айоп5 1пс.), СНАВМт (Мо1еси1аг 81ти1айоп5 1пс.), Рейх (Мо1еси1аг 81ти1айоп5 1пс.), Эе1РЫ (Мо1еси1аг 81ти1а!юп5 1пс.), ЦиаШеММ (Мо1еси1аг 81ти1а!юп5 1пс.), Ното1оду (Мо1еси1аг 81ти1айоп5
- 39 015591
1пс.), ΜοάβΙβΓ ^окскат 81тц1а!юпк 1пс.), 1818 (ΜοΚα-ΐΕ-π 81тц1а!юпк 1пс.), Оиап!а/Рго!еш Όβκί^η (Μοίοαι1аг 81ти1айопк 1пс.), \еЬЬаЬ ^окскат 81тц1а!юпк 1пс.), \еЬЬаЬ ΌίνβΓκίίγ Ехр1огег ^окскат 81тц1а!юпк 1пс.), базу Сепе Ехр1огег ^окскат 81тц1а!юпк 1пс.), 8ецРо1б (ΜοΚα-ΐΕ-π 81тц1а!юпк 1пс.), базу данных, содержащую информацию из справочника химических соединений (ΜΌΕ Аνа^1аЬ1е СЕеткак О1гес!огу ба!аЬаке), базу данных с информацией о лекарственных препаратах (ΜΌΕ Эгид Верой ба!а Ьаке), полную базу данных по медицинской химии (СотргеЕепкще Μеά^с^ηа1 СЕеткйу ба!аЬаке), базу данных с информацией, включающей в себя международный указатель Дервента по лекарственным препаратам (Эегиеп1'к \ог1б Эгид 1пбех Па!аЬаке), базу данных Β^οΒуΐеΜаκΐе^Ρ^1е, базу данных СепЬапк и базу данных Сепкецп. Многие другие программы и базы данных могут быть известны специалистам в данной области, к которой относится изобретение.
Мотивы, которые могут быть выявлены с использованием указанных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновые молнии, мотивы спираль-петля-спираль, сайты гликозилирования, сайты убиквитинирования, альфа-спирали и бета-складчатые структуры, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секрецию кодируемых белков, последовательности, участвующие в регуляции транскрипции, такие как гомеобоксы, кислые участки, активные участки ферментов, сайты связывания субстрата и сайты ферментативного расщепления.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение относится к изолированным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые гибридизируются в жестких условиях с типичной последовательностью согласно изобретению, например с последовательностью, указанной в 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Е41У, Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Ь, П111В, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, П171Е, Μ176\, Ό230Η, О230В, Ό234\, Ό234ν, О234С, О234В, О234К или 0265В, или с нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, содержащей последовательность, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 177 или 8Е0 ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Е4Ж Е41В, Е94В, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Ь, П111В, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Ц171Е, Μ176\, Ό230Η, П230В, Ό234\, Ό234ν, П234С, П234В, П234К или 0265В. Жесткие условия могут представлять собой условия высокой жесткости, условия умеренной жесткости и условия низкой жесткости, включая описанные в данной публикации условия высокой и пониженной жесткости. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты согласно изобретению, определяемые по их способности гибридизоваться в жестких условиях, могут иметь длину примерно от пяти остатков до полной длины молекулы, например молекулы типичной нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Например, они могут иметь длину по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или более остатков. Нуклеиновые кислоты, которые короче, чем молекула полной длины, также включены в объем настоящего изобретения. Указанные нуклеиновые кислоты применимы, например, в качестве зондов для гибридизации, зондов для мечения, олигонуклеотидных зондов для ПЦР, 1РНК (однонитевых или двунитевых), антисмысловых последовательностей или последовательностей, кодирующих пептиды, связывающие антитело (эпитопы), мотивы, активные участки, домены связывания, регуляторные домены и тому подобное.
В одном аспекте нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих в себя содержание формамида около 50% при температуре примерно от 37 до 42°С. В одном аспекте нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих в себя содержание формамида примерно 35-25% при температуре примерно от 30 до 35°С. Альтернативно, нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих в себя условия при 42°С и 50% формамида, 5х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и нуклеиновую кислоту, блокирующую повторяющиеся последовательности, такую как со!-1 или ДНК спермы лосося (например, 200 мкг/мл фрагментированной гидродинамическим воздействием и денатурированной ДНК спермы лосося). В одном аспекте нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих в себя содержание формамида 35% и пониженную температуру 35°С.
После гибридизации фильтр может быть промыт с использованием 6х 88С и 0,5% 8Ό8 при 50°С. Указанные условия считают умеренно жесткими, если содержание формамида составляет более 25%, и условиями низкой жесткости, если содержание формамида меньше 25%. Конкретный пример умеренных условий гибридизации включает в себя проведение указанной выше гибридизации при содержании формамида 30%. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости включает в себя проведение указанной выше гибридизации при содержании формамида 10%.
Диапазон температуры, соответствующий конкретному уровню жесткости, может быть дополнительно сужен путем расчета соотношения пуринов к пиримидинам в представляющей интерес нуклеиновой кислоте и соответствующей корректировки температуры. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют также по их способности гибридизоваться в условиях высокой, умеренной и низкой
- 40 015591 жесткости, указанных в руководстве АикиЬе1 и 8атЬгоок. Изменения указанных выше диапазонов и условий могут быть использованы в практике осуществления настоящего изобретения и хорошо известны в данной области.
Условия гибридизации дополнительно обсуждаются ниже.
Олигонуклеотидные зонды и способы их применения
Настоящее изобретение также относится к зондам на основе нуклеиновых кислот для идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, обладающий фосфолипазной активностью. В одном аспекте зонд содержит по меньшей мере 10 следующих друг за другом оснований последовательности, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 177 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е4Ш, Е41Е, Е41У, Е41Я, Е94Я, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ι)100\\\ А104Ь, Ό111Κ, Т112Я, У116№, Ι117№, Р118№, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, М176№, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234№, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ, Ό234Κ или Ц265Я. Альтернативно, зонд согласно изобретению может включать в себя по меньшей мере примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100 или 150 или больше, или примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70 следующих друг за другом оснований последовательности, указанной в последовательности согласно изобретению. Зонды позволяют идентифицировать нуклеиновую кислоту путем связывания или гибридизации. Зонды можно использовать в матрицах согласно изобретению, обсуждаемых ниже, включая, например, капиллярные матрицы. Зонды согласно изобретению также можно использовать для выделения других нуклеиновых кислот или полипептидов.
Зонды согласно изобретению можно использовать для определения того, содержит ли биологический образец, такой как образец почвы, организм, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, или организм, из которого может быть получена указанная нуклеиновая кислота. Такими способами получают биологический образец, который потенциально может содержать организм, из которого возможно выделение данной нуклеиновой кислоты, и из образца получают нуклеиновую кислоту. Нуклеиновые кислоты приводят в контакт с зондом в условиях, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с любыми комплементарными последовательностями, присутствующими в образце. При необходимости, условия, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с комплементарными последовательностями, могут быть определены путем осуществления контакта зонда с комплементарными последовательностями из образцов, в отношении которых известно, что они содержат комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарную последовательность. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, можно варьировать для определения условий, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с комплементарными нуклеиновыми кислотами (смотри обсуждение, относящееся к конкретным условиям гибридизации).
Если образец содержит организм, из которого выделяли нуклеиновую кислоту, то выявляют наличие специфичной гибридизации с зондом. Гибридизация может быть выявлена благодаря мечению зонда регистрируемым агентом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование регистрируемого продукта. Специалистам в данной области известно большое число способов применения меченых зондов для выявления присутствия комплементарных нуклеиновых кислот в образце. К таким способам относятся саузерен-блоттинг, нозерн-блоттинг, способы гибридизации колоний и дот-блот-анализ. Протоколы таких способов описаны в руководстве АикиЬе1 и 8атЬгоок.
Альтернативно, можно использовать более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфично гибридизоваться с любыми комплементарными последовательностями, которые присутствуют в образце нуклеиновой кислоты) в реакции амплификации, чтобы определить, содержит ли образец организм, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению (например, организм, из которого была выделена нуклеиновая кислота). В одном аспекте зонды включают в себя олигонуклеотиды. В одном аспекте реакция амплификации может включать в себя реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны в работе АикиЬе1 и 8атЬгоок (смотри обсуждение, относящееся к реакциям амплификации). В таких способах нуклеиновые кислоты в образце подвергают контакту с зондами, осуществляют реакцию амплификации и выявляют полученный продукт амплификации. Продукт амплификации может быть обнаружен с использованием гель-электрофореза продуктов реакции и окрашивания геля интеркалирующим средством, таким как бромид этидия. Альтернативно, один или несколько зондов могут быть помечены радиоактивным изотопом, и наличие радиоактивного продукта амплификации можно выявить с помощью авторадиографии после гель-электрофореза.
Зонды, получаемые из последовательностей вблизи 3'- или 5'-концов последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, также можно использовать в способах осуществления прогулки по хромосоме, чтобы идентифицировать клоны, содержащие дополнительные, например геномные, последовательности. Такие способы позволяют выделить гены, которые кодируют дополнительные представляющие интерес белки из организма-хозяина.
В одном аспекте последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению используют в
- 41 015591 качестве зондов для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах идентифицированные таким образом родственные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномные ДНК из организмов, отличных от организма, из которого нуклеиновая кислота согласно изобретению была выделена сначала. В таких способах образец нуклеиновой кислоты подергают контакту с зондом в условиях, позволяющих указанному зонду специфично гибридизоваться с родственными последовательностями. Затем с помощью любого из описанных выше способов выявляют наличие гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма.
В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения определенного уровня жесткости, будут варьировать в зависимости от природы нуклеиновых кислот, подлежащих гибридизации. Например, при выборе условий гибридизации учитывают длину, степень комплементарности, состав нуклеотидной последовательности (например, содержание ГЦ-пар относительно АТ-пар) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК) на гибридизуемых участках нуклеиновых кислот. Дополнительно учитывают, была ли иммобилизована одна из нуклеиновых кислот, например, на фильтре. Гибридизацию можно проводить в условиях низкой жесткости, умеренной жесткости или высокой жесткости. В качестве примера гибридизации нуклеиновых кислот полимерную мембрану, содержащую иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты, сначала предварительно гибридизуют в течение 30 мин при температуре 45°С в растворе, содержащем 0,9 М №С1, 50 мМ NаΗ2Р04, рН 7,0, 5,0 мМ №2-ЭДТА, 0,5% 8Ό8, 10х раствор Денхардта и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем к раствору добавляют примерно 2х107 имп/мин (удельная активность 4-9х108 имп/мкг) 32Р-меченого на конце олигонуклеотидного зонда. После 12-16-часовой инкубации мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ) в 1х 8ЕТ (150 мМ №С1, 20 мМ трис-гидрохлорида, рН 7,8, 1 мМ №2-ЭДТА), содержащем 0,5% 8Ό8, с последующей 30-минутной промывкой свежим 1х 8ЕТ при т.пл. -10°С для олигонуклеотидного зонда. Затем мембрану экспонируют с авторадиографической пленкой для выявления сигналов гибридизации.
Варьируя условия жесткости гибридизации, используемой для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномные ДНК, которые гибридизуются с регистрируемым зондом, можно идентифицировать и выделить нуклеиновые кислоты, имеющие разные уровни гомологии с зондом. Условия жесткости можно варьировать за счет проведения гибридизации при разных температурах ниже температур плавления зондов. Температура плавления, т.пл., представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуются с полностью комплементарным зондом. Очень жесткие условия выбираются таким образом, чтобы температура была равна или примерно на 5°С ниже, чем т.пл. конкретного зонда. Температура плавления зонда может быть вычислена с использованием приведенных ниже иллюстративных формул. Для зондов, имеющих длину от 14 до 70 нуклеотидов, температуру плавления (т.пл.) вычисляют, используя формулу:
Т.пл.=81,5+16,6(1од|№+])+0,41(фракция Г+Ц)-(600/К), где N обозначает длину зонда. Если гибридизацию проводят в растворе, содержащем формамид, то температура плавления может быть вычислена с использованием следующего уравнения:
Т.пл.=81,5+16,6(1од|№+])+0,41(фракция Г+Ц)-(0,63% формамид)-(600/Ц), где N обозначает длину зонда. Предварительная гибридизация может быть проведена в растворе, содержащем 6х 88С, 5х реагенте Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или 6х 88С, 5х реагенте Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы 88С и реагента Денхардта, а также других растворов приведены, например, в работе 8атЫгоок.
Гибридизацию проводят, добавляя регистрируемый зонд к указанным выше растворам для предварительной гибридизации. В том случае, когда зонд представляет собой двунитевую ДНК, ее подвергают денатурации перед добавлением к раствору для гибридизации. Фильтр подвергают контакту с раствором для гибридизации в течение достаточного периода времени с тем, чтобы зонд мог гибридизоваться с кДНК или геномными ДНК, содержащими комплементарные или гомологичные ему последовательности. В случае зондов длиной более 200 нуклеотидов гибридизацию можно осуществлять при температуре на 15-25°С ниже т.пл. В случае более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизацию можно проводить при температуре на 5-10°С ниже т.пл. В одном аспекте гибридизация в 6х 88С проводят при температуре примерно 68°С. В одном аспекте гибридизацию проводят в растворах, содержащих 50% формамида, при температуре примерно 42°С. Все указанные выше реакции гибридизации можно считать реакциями, проводимыми в условиях высокой жесткости.
После гибридизации фильтр промывают, чтобы удалить неспецифично связанный регистрируемый зонд. Жесткость, используемую для промывки фильтров, также можно варьировать в зависимости от природы нуклеиновых кислот, подлежащих гибридизации, длины нуклеиновых кислот, подлежащих гибридизации, степени комплементарности, состава нуклеотидной последовательности (например, содержания ГЦ-пар или АТ-пар) и типа нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК). Примеры условий промывки с постепенно повышаемой жесткостью включают в себя следующие условия: 2х 88С, 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая жесткость); 0,1х 88С, 0,5% 8Ό8 при
- 42 015591 комнатной температуре в течение 30 мин - 1 ч (умеренная жесткость); 0,1х 88С, 0,5% 8Ό8 в течение 1530 мин при температуре в диапазоне от температуры гибридизации до 68°С (высокая жесткость) и 0,15 М №С1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая жесткость). Конечная промывка в условиях низкой жесткости может быть проведена в 0,1 х 88С при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только иллюстрацией одного набора условий, которые могут быть использованы при практическом осуществлении изобретения, например, для промывки фильтров. Специалисту в данной области будет понятно, что имеется большое количество других составов для промывки в разных условиях жесткости, которые все можно использовать при практическом осуществлении изобретения.
Нуклеиновые кислоты после их гибридизации с зондом можно идентифицировать с использованием авторадиографии или других стандартных способов. Описанный выше способ можно модифицировать для идентификации нуклеиновых кислот, имеющих пониженные уровни гомологии с последовательностью зонда. Например, для получения нуклеиновых кислот со пониженной гомологией с регистрируемым зондом можно использовать менее жесткие условия. Например, температуру для гибридизации можно снижать ступенчато по 5°С с 68 до 42°С в буфере для гибридизации, имеющем концентрацию №+ примерно 1 М. После гибридизации фильтр может быть промыт 2х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре гибридизации. Указанные условия считают умеренными условиями при использовании температуры выше 50°С и низкими при использовании температуры ниже 50°С. Примером умеренных условий гибридизации является проведение гибридизации при 55°С. Примером гибридизации в условиях низкой жесткости является проведение реакции гибридизации при 45°С.
Альтернативно, реакция гибридизации может быть проведена в буферах, таких как 6х 88С, содержащих формамид, при температуре 42°С. В данном случае концентрация формамида в буфере для гибридизации может быть снижена ступенчато по 5% с 50 до 0% для идентификации клонов, имеющих сниженные уровни гомологии с зондом. После гибридизации фильтр может быть промыт 6х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре 50°С. Указанные условия считают умеренными условиями в случае содержания формамида более 25% и низкими условиями в случае содержания формамида менее 25%. Конкретным примером умеренных условий гибридизации является проведение гибридизации в присутствии 30% формамида. Конкретным примером проведения гибридизации в условиях низкой жесткости является проведение реакции гибридизации в присутствии 10% формамида.
Указанные зонды и способы согласно изобретению можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, имеющих по меньшей мере примерно 99%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащей по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 500 следующих друг за другом оснований, и комплементарных им последовательностей. Гомология может быть измерена с использованием алгоритма выравнивания, который описан в настоящей публикации. Например, гомологичные полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность, которая является встречающимся в природе аллельным вариантом одной из кодирующих последовательностей, описанных в настоящем изобретении. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или добавление одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с нуклеиновыми кислотами согласно изобретению.
Кроме того, зонды и способы согласно изобретению могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере примерно 99%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% идентичность (гомологию) последовательности с полипептидом согласно изобретению, содержащим по меньшей мере примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 следующих друг за другом аминокислот, которую определяют с использованием алгоритма выравнивания последовательностей (например, такого как алгоритм ЕА8ТА, версия 3.0ΐ78, с параметрами, заданными по умолчанию, или программа ВЬА8Т 2.2.2, пример установок соответствующих параметров для которой приведен в настоящем описании).
Ингибирование экспрессии фосфолипаз
Настоящее изобретение, кроме того, относится к нуклеиновым кислотам, комплементарным (например, к антисмысловым последовательностям) нуклеиновым кислотам согласно изобретению, например нуклеиновым кислотам, кодирующим фосфолипазу. Антисмысловые последовательности способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию генов, кодирующих фосфолипазу. Ингибирование можно осуществлять целенаправленным воздействием на геномную ДНК или матричную РНК. Транскрипция или функция целевой нуклеиновой кислоты может быть ингибирована, например, посредством гибридизации и/или расщепления. Один конкретно используемый набор ингибиторов, предлагаемый в настоящем изобретении, включает в себя олигонуклеотиды, которые способны связывать ген или транскрипт фосфолипазы, в любом случае предотвращая или ингибируя образование или функциониро
- 43 015591 вание фермента фосфолипазы. Связывание может быть осуществлено в результате специфичной гибридизации последовательностей. Другой применимый класс ингибиторов включает в себя олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление фосфолипазного транскрипта. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, например, в случае рибозимов. Олигонуклеотид может быть химически модифицирован или конъюгирован с ферментом или композицией, способными расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Может быть проведен скрининг пула множества таких разных олигонуклеотидов в отношении олигонуклеотидов с требуемой активностью.
Ингибирование экспрессии фосфолипазы может иметь множество промышленных применений. Например, ингибирование экспрессии фосфолипазы может замедлять или предупреждать порчу продуктов. Порча продуктов может происходить в тех случаях, когда липиды или полипептиды, например структурные липиды или полипептиды, подвергаются ферментативному разрушению. Это может приводить к порче или гниению фруктов и овощей. В одном аспекте применение композиций согласно изобретению, которые ингибируют экспрессию и/или активность фосфолипазы, например антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов и РНК1, приводит к замедлению или предупреждению порчи продуктов. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам и композициям, включающим в себя нанесение на растение или растительный продукт (например, плод, семена, корни, листья и т.п.) антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов и РНК1 согласно изобретению для замедления или предупреждения порчи. Указанные композиции также могут быть экспрессированы в растении (например, в трансгенном растении) или в другом организме (например, в бактерии или другом микроорганизме, трансформированном геном фосфолипазы согласно изобретению).
Композиции согласно изобретению для ингибирования экспрессии фосфолипазы (содержащая, например, антисмысловые последовательности, 1РНК, рибозимы, антитела) могут быть использованы в качестве фармацевтических композиций.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Настоящее изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, способным связывать транскрипт фосфолипазы, которые могут ингибировать активность фосфолипазы в результате целенаправленного воздействия на мРНК. Методики конструирования антисмысловых олигонуклеотидов широко описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие фосфолипазные олигонуклеотиды, используя новые реагенты согласно изобретению. Например, в данной области хорошо известны протоколы прогулки по гену /картирования РНК для скрининга эффективных антисмысловых олигонуклеотидов, смотри, например, публикацию Но (2000) Ме11юйк Епхуто1., 314: 168-183, в которой описан способ картирования РНК, основанный на стандартных методиках молекулярной биологии, который обеспечивает легкий и надежный путь селекции эффективных антисмысловых последовательностей (смотри также 8ιηί11ι (2000) Еиг. 1 Рйагт. 8съ, 11: 191-198).
Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты используют в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды могут иметь любую длину, например в альтернативных аспектах антисмысловые олигонуклеотиды имеют длину примерно от 5 до 100, примерно от 10 до 80, примерно от 15 до 60, примерно от 18 до 40. Оптимальная длина может быть определена стандартным скринингом. Антисмысловые олигонуклеотиды могут присутствовать в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена стандартным скринингом. Известно широкое множество синтетических не встречающихся в природе аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут внести вклад в решение данной проблемы. Например, можно использовать пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), содержащие неионные остовы, такие как №(2-аминоэтил)глициновые единицы. Также можно использовать антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, которые описаны в νθ 97/03211; νθ 96/39154; Ма!а (1997) Тох1со1. Арр1. Рйагтасо1., 144: 189-197; Апйкепке Тйегареийск, ей. Адга^а1 (Нитапа Ргекк, То1оиа, Ν.Τ, 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие синтетические аналоги остова ДНК, предлагаемые в настоящем изобретении, также могут включать нуклеиновые кислоты, содержащие фосфодитиоат, метилфосфонат, фосфорамидат, сложный алкилолфосфотриэфир, сульфамат, 3'-тиоацеталь, метилен(метилимино)группы, 3'-Ы-карбамат и морфолинокарбамат, как описано выше.
Можно использовать методики комбинаторной химии для создания огромного количества олигонуклеотидов, которые можно легко подвергнуть скринингу в отношении конкретных олигонуклеотидов, которые обладают соответствующей аффинностью связывания и специфичностями по отношению к любой мишени, такие как смысловые и антисмысловые последовательности фосфолипазы согласно изобретению (смотри, например, Оо1й (1995) й. ок В1о1. Сйет., 270: 13581-13584).
Ингибирующие рибозимы
Настоящее изобретение относится к рибозимам, способным связывать транскрипт фосфолипазы, которые могут ингибировать ферментативную активность фосфолипазы посредством целенаправленного воздействия на мРНК. Методики конструирования рибозимов и отбора специфичной к фосфолипазе антисмысловой последовательности для целенаправленного воздействия хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие рибозимы с использо
- 44 015591 ванием новых реагентов согласно изобретению. Рибозимы действуют в результате связывания с РНКмишенью частью рибозима, связывающей РНК-мишень, которая находится в непосредственной близости с ферментативной частью РНК, расщепляющей РНК-мишень. Таким образом, рибозим узнает и связывается с РНК-мишенью посредством комплементарного спаривания оснований и после связывания с правильным сайтом действует ферментативно, расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНКмишени таким образом будет нарушать ее способность направлять синтез кодируемого белка, если такое расщепление происходит в кодирующей последовательности. После связывания рибозима и расщепления его РНК-мишени он обычно высвобождается из данной РНК и может повторно связываться и расщеплять новые мишени.
В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может давать преимущества по сравнению с другими методиками, такими как методика, основанная на применении антисмысловых олигонуклеотидов (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, блокируя ее транскрипцию, трансляцию или ассоциацию с другой молекулой), так как эффективная концентрация рибозима, необходимая для осуществления терапевтического лечения, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Такое возможное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, одна молекула рибозима способна расщепить много молекул РНК-мишени. Кроме того, рибозим обычно представляет собой высокоспецифичный ингибитор, причем специфичность ингибирования зависит не только от механизма спаривания оснований при связывании, но также от механизма, посредством которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. То есть ингибирование вызывается расщеплением РНК-мишени и таким образом специфичность определяется как отношение уровня расщепления РНК-мишени к уровню расщепления другой РНК, отличной от РНК-мишени. Указанный механизм расщепления зависит также от других факторов, кроме факторов, принимающих участие в спаривании оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть выше, чем специфичность связывания антисмыслового олигонуклеотида с тем же сайтом РНК.
Ферментативная молекула рибозимной РНК может иметь форму мотива в виде головки молотка, но также может иметь форму мотива в виде шпильки, вируса гепатита дельта, интрона группы Ι или РНКазаР-подобной РНК (в сочетании с управляющей последовательностью РНК). Примеры таких мотивов в виде головки молотка описаны в Кокк1 (1992) А1йк Кекеагсй апй Нитап Кейоуиикек, 8: 183; мотивы в виде шпильки описаны в Натре1 (1989) ВюсйетШгу, 28: 4929 и Натре1 (1990) Шс. Лайк Кек., 18: 299; мотив вируса гепатита дельта описан в Реггойа (1992) ВюсйетШгу, 31: 16; мотив типа РНКазыР описан в Сиетег-Такайа (1983) Се11., 35: 849 и интрон группы Ι описан в патенте США № 4987071, СесН. Перечисление таких конкретных мотивов не предназначено для ограничения; специалистам в данной области будет понятно, что ферментативная молекула РНК согласно изобретению имеет специфичный сайт связывания субстрата, комплементарный одной или нескольким областям РНК гена-мишени, и имеет нуклеотидную последовательность внутри или вокруг сайта связывания субстрата, которая придает РНК активность в расщеплении молекулы.
Интерференция РНК (РНК1)
В одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, ингибирующей РНК, так называемой молекуле РНК1, содержащей последовательность фосфолипазы согласно изобретению. Молекула РНК1 представляет собой двунитевую молекулу РНК (днРНК). РНК1 может ингибировать экспрессию гена фосфолипазы. В одном аспекте РНК1 имеет длину примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов. Хотя настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, РНК1 может поступать в клетку и вызывать разрушение однонитевой РНК (онРНК) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. В том случае, когда клетка подвергается воздействию двунитевой РНК (днРНК), мРНК с гомологичного гена подвергается избирательному разрушению в результате процесса, называемого интерференцией РНК (РНК1). Возможным основным механизмом РНК1 является расщепление двунитевой РНК (днРНК), комплементарной последовательности конкретного гена, на короткие фрагменты, называемые короткими интерферирующими РНК, которые запускают распад мРНК с комплементарной последовательностью. В одном аспекте РНК1 согласно изобретению используют для лечении на основе глушения генов (смотри, например, 8Ниеу (2002) Эгид Э^соу. Тойау, 7: 1040-1046). В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам избирательного разрушения РНК с использованием РНК1 согласно изобретению. Указанный способ может быть осуществлен ш уНго, ех νί\Ό или ш νί\Ό. В одном аспекте молекулы РНК1 согласно изобретению могут быть использованы для создания в клетке, органе или организме животного мутации вызывающей потерю функции. Способы создания и использования молекул РНК1 для избирательного разрушения РНК хорошо известны в данной области, смотри, например, патенты США №№ 6506559, 6511824, 6515109, 6489127.
Модификации нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение относится к способам создания вариантов нуклеиновых кислот согласно изобретению, например нуклеиновых кислот, кодирующих фермент фосфолипазу. В альтернативном варианте осуществления изобретения предлагаются способы модификации фермента согласно изобрете
- 45 015591 нию, например, посредством мутации кодирующей его последовательности в результате случайных или стохастических способов, неслучайных способов, или посредством направленной эволюции, такой как мутагенез генов по механизму насыщения сайтов (088М), чтобы изменить рН-диапазон активности фермента или диапазон оптимальной активности, температурный диапазон активности или диапазон оптимальной активности, специфичность, активность (кинетику); использованием ферментом гликозилирования, фосфорилирования или металлов (например, Са, Мд, Ζιγ, Ре, №), например, для придания рН/температурной стабильности. Изобретение относится к способам модификации фермента согласно изобретению, например, посредством введения мутации в кодирующую его последовательность, например, в результате О88М, чтобы повысить его резистентность к протеазной активности. В настоящем изобретении предлагаются способы модификации фермента согласно изобретению, например, в результате введения мутации в кодирующую его последовательность, например, с помощью О88М, чтобы модифицировать использование ферментом хелаторов металлов, специфичных по отношению к Са, Мд, №, которые могут не хелатировать Ζιτ. Изобретение относится к способам модификации фермента согласно изобретению, например, в результате введения мутации в кодирующую его последовательность, например, с помощью О88М, которая может обеспечивать требуемое сочетание активностей, например, Р1, РА и РС/РЕ специфичные РЬС.
Указанные способы можно повторять или использовать в различных комбинациях, чтобы создать фосфолипазные ферменты, обладающие измененной или другой активностью или измененной или другой стабильностью, чем фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой. Такие способы также можно повторять или использовать в различных комбинациях, например, чтобы создать варианты по экспрессии гена/транскрипта, трансляции транскрипта или стабильности транскрипта. В другом аспекте генетический состав клетки изменяют, например, посредством модификации гомологичного гена ех у1уо с последующим его встраиванием снова в клетку.
Нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть изменена любыми способами. Например, случайными или стохастическими способами или нестохастическими способами либо направленной эволюцией.
Способы введения случайных мутаций в гены хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 5830696. Например, могут быть использованы мутагены для создания случайной мутации гена. Мутагенами являются, например, ультрафиолетовый свет или гамма-излучение или химический мутаген, например митомицин, азотная кислота, фотоактивированные псоралены, по одиночке или в сочетании, используемые для индукции разрывов ДНК, которые поддаются репарации посредством рекомбинации. Другими химическими мутагенами являются бисульфит натрия, азотная кислота, гидроксиламин, гидразин или муравьиная кислота. Другие мутагены являются аналогами нуклеотидных предшественников, например нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Указанные агенты могут быть добавлены в реакционную смесь для ПЦР вместо нуклеотидного предшественника, что приводит к мутации последовательности. Также можно использовать интеркалирующие агенты, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т.п.
Можно использовать любую методику молекулярной биологии, например мутагенез на основе случайной ПЦР, смотри, например, Кгсе (1992) Ргос. Асаб. 8сг И8А, 89: 5467-5471; или комбинаторной множественный кассетный мутагенез, смотри, например, Статей (1995) Вю!есЬтдцез, 18: 194-196). Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например гены, могут быть подвергнуты вторичной сборке после случайной или стохастический фрагментации, смотри, например, патенты США № 6291242, 6287862, 6287861, 5955358, 5830721, 5824514, 5811238, 5605793. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводятся посредством склонной к ошибкам ПЦР, перетасовки, направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, сборки с использованием ПЦР, мутагенеза с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР), мутагенеза 1п у1уо, кассетного мутагенеза, множественного мутагенеза, регулируемого по типу обратной связи, экспоненциального множественного мутагенеза, сайт-специфичного мутагенеза, вторичной сборки генов, генного мутагенеза по механизму насыщения сайтов (О88М), вторичной сборки по механизму синтеза с использованием лигирования (8ЬЯ), рекомбинации, рекомбинации последовательностей, регулируемой по типу обратной связи, мутагенеза с использованием ДНК, модифицированной фосфотиоатом, мутагенеза с использованием урацилсодержащей матрицы, мутагенеза с использованием дуплекса с пробелами, мутагенеза по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенеза, связанного с недостаточностью функционирования системы репарации в штамме хозяина, химического мутагенеза, радиогенного мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза на основе системы рестрикцииселекции, мутагенеза на основе системы рестрикции-очистки, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, создания мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты и/или сочетания указанных и других способов.
В приведенных ниже публикациях описано множество способов рекомбинации, регулируемой по типу обратной связи, и/или способов, которые могут быть включены в способы согласно изобретению: 8!еттег (1999) Мо1еси1аг Ьгеебтд оГ У1гизез Гог 1агдейпд апб о111ег сбшса1 ргорегйез, Титог Тагдейпд 4:1-4; №зз (1999) №!ше Вю!есЬпо1оду, 17:893-896; Сбапд (1999) Еуо1ийоп оГ а су!окте цзтд ^NΛ Гат- 46 015591
Лу кЬиГГЬпд, №1иге В^οΐесЬηο1οду, 17:793-797; МткЬи11 (1999) РгсЛет еνο1иΐ^οη Ьу тο1еси1а^ Ьгеебшд, Сиггеп! 0ршюп ш СЬет1са1 ВгоУду, 3:284-290; СЬпкйапк (1999) Эйеаеб еνο1иΐ^οη οί Шуппбте ктаке Γογ А2Т рЬοкрЬο^у1аΐ^οη иктд ^NА ГатЛу кЬиГГЪпд, УПиге В^οΐесЬηο1οду, 17:259-264; Статей (1998) ^NА кЬиГПтд οί а ГатЛу οί депек Ггот бйегке креаек ассе1ега!ек бЛес1еб еνο1иΐ^οη, №1иге, 391:288-291; Статей (1997) Μο1еси1а^ еνο1иΐ^οη οΓ ап агкепа!е беΐοx^Г^саΐ^οη раЬ1\гау Ьу ^NА кЬиГШпд, УПиге Вю1есЬго^ду, 15:436-438; 2Ьапд (1997) Эйеаеб еνο1иΐ^οη οΓ ап еГГесРуе Ш^^баке Ггот а да1асШк1баке Ьу ^NА кЬиГПтд апб ксгеешпд, Ргос. №111. Асаб. 8а. И8А, 94:4504-4509; Райеп е1 а1. (1997) Арр^саЮ^ οΓ ^NА 8ЬиГПтд ΐο РЬагтасеийса1к апб Vасс^ηек, Сиггеп! 0ртгоп т В^οΐесЬηο1οду, 8:724-733; Статей е1 а1. (1996) Сοηкΐ^исΐ^οη апб е^юкИго!·! οΓ аШ^бу-рИаде ЬЬгапек Ьу ^NА кЬиГГЪпд, №1иге Мебкше, 2:100103; Статей е1 а1. (1996) 'Чтргоуеб дгееп ГЬюгексеги ргсЛет Ьу пюкабаг еνο1иΐ^οη иктд ^NА кЬиГГЪпд, №Пиге В^οΐесЬηο1οду, 14:315-319; Са1ек е1 а1. (1996) АГИпЛу ке1ес1гое οΓ Лдапбк Ггот рерйбе 11Ьгапек 111гоид11 б1кр1ау οη а 1ас гертек^ Ьеабр1есе б1тег, Ιοί-ΐι··^ οΓ Μο1еси1а^ ВгоУду, 255:373-386; 81еттег (1996) 8ехиа1 РС8 апб АккетЬ1у РС8, 1п: ТЬе Епсус^ребха οΓ Μο1еси1а^ ВгоУду. νΓΗ РиЬЬкЬегк, №\ν Υο±, р. 447-457; Статей апб 81еттег (1995) СοтЬ^ηаΐο^^а1 ти1йр1е саккейе тШадепеЧк сгеа1ек а11 111е ре^тиΐаΐ^οηк οΓ ти1ап1 апб \\'Пб1уре саккейек, ВюТесЬтдиек, 18:194-195; 81еттег е1 а1. (1995) 8тд1ек1ер аккетЬ1у οΓ а депе апб епйге р1акт1б Γοηη 1агде питЬегк οΓ ο1^дοбеοxу^^Ьοηис1еοΐ^бек, Сепе, 164:49-53; 81еттег (1995) ТЬе Еνο1иΐ^οη οΓ Μο1еси1а^ С’οтриΐаΐ^οη. 8аепсе, 270:1510; 81еттег (1995) 8еагсЫпд 8едиепсе 8расе, В^ο/ТесЬηο1οду, 13:549-553; 81еттег (1994) 8ар1б еνο1иΐ^οη οΓ а ргсЛет ш νίΐτο Ьу ^NА кЬиГГЪпд, №1иге, 370:389-391 апб 81еттег (1994) ^NА кЬиГГЪпд Ьу πιΜοιη Г^адтеηΐаΐ^οη апб геаккетЬ1у: 1п νίίτο ^есοтЬ^ηаί^οη Γοτ пюксЫаг еνο1иΐ^οη, Ргос. №111. Асаб. 8α. И8А, 91:10747-10751.
Способы введения мутации для создания разнообразия включают в себя, например, сайтспецифичный мутагенез (Ыпд е1 а1. (1997) АрртоасЬек ΐο ^NА тШадепеЧк: ап ονе^ν^еν, Апа1. ВтсЬет., 254(2):157-178; Эа1е е1 а1. (1996) О1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб πιΜοιη тШадепеЧк иктд 1Ье рЬοкрЬο^οΐЬ^οаΐе те^б^ МеЪюбк Μο1. Вю1., 57:369-374; 8тЛЬ (1985) 1п νίΐτο ти1адепек1к, Апп. 8еν. СепеЬ, 19:423-462; Вοΐкΐе^η & 8Ьο^ΐ1е (1985) 8йа1ед1ек апб аррИса^пк οΓ т νίΐτο тиΐадеηек^к, 8аепсе, 229:1193-1201; Сайег (1986) 811е-бйес1еб т^адепеык, ВюсЬет. 1., 237:1-7 и Кипке1 (1987) ТЬе еГйаепсу οΓ ο1^дοηис1еοΐ^бе бпеЛеб тШадепеЧк т №.1с1е1с Аабк апб Μο1еси1а^ ВюУду (Ескйет, Р апб Ы11еу, Э.М.1. ебк., 8ргтдег Vе^1ад, ВегЬп)); мутагенез с использованием урацилсодержащей матрицы (Кипке1 (1985) 8ар1б апб еГПаеп! кЬе-креаПс пиПадепеЧк \νί11ιοιιΙ рЬеηοΐур1с ^Εαίοπ Ргос. №Π. Асаб. 8а. И8А, 82:488-492; Кипке1 еΐ а1. (1987) 8ар1б апб еГЪаей кйе-креаПс тШадепеЧк νίΐΗοηΐ рЬеηοΐур^с ^^^ίοιτ, МеЬюбк ш Еηζутο1., 154:367-382 и Вакк еΐ а1. (1988) Μиΐаηΐ Тгр ^ер^еккο^к \\'ЬЬ пей ^NА-Ь^ηб^ηд крес^Πс^ΐ^ек. 8аепсе, 242:240-245); сайт-специфичный мутагенез с использованием олигонуклеотидов (МеЬюбк т Еηζутο1., 100:468-500 (1983); Ме^бк т Еηζутο1., 154:329-350 (1987); Ζο18γ & 8тЪЬ (1982) О1^дοηис1еοΐ^бебйейеб тШадепеЧк иктд М13-бепуеб уесЮгк: ап еГПаеп! апб депега1 ргосебпге Γογ 1Ье р^οбисΐ^οη οΓ рο^ηΐ тиΐаΐ^οηк ш апу ^NА Ггадтеп!, №.1с1е1с Аабк 8ек., 10:6487-6500; Ζο18γ & 8тЛЬ (1983) О1^дοηис1еοΐ^бебйеаеб тШадепеЧк οΓ ^NА Ггадтеп1к сУпеб ίιτΐο М13 '^αο^, МеЬюбк ш Еηζутο1., 100:468-500 апб Ζο1Εγ & 8тЬЬ (1987) О1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб тШадепеЧк: а к1тр1е те11юб иктд ΐνο ο1^дοηис1еοΐ^бе рптегк апб а ктд1е-кйапбеб ^NА ΐетр1аΐе, МеЬюбк т Еηζутο1., 154:329-350); мутагенез ДНК, модифицированной фосфоротиоатом (ТауУг еΐ а1. (1985) ТЬе ике οΓ рЬοкрЬο^οΐЬ^οаΐе-тοб^βеб ^NА ш ^екΐ^^сΐ^οη епхуте геаагопк ΐο ргераге шскеб ^NА, N^1. Аабк 8ек., 13:8749-8764; ТауУг еΐ а1. (1985) ТЬе гар1б депе^аΐ^οη οΓ ο1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб тиΐаΐ^οηк а1 ЫдЬ Ггедиепсу иктд рЬοкрЬο^οΐЬ^οаΐе-тοб^Г^еб ^NА, N^1. Аабк 8ек., 13: 8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) 1пЬ1ЬЛюп οΓ ^екΐ^^сΐ^οη еηбοηис1еаке №ί I с1еаνаде Ьу рЬοкрЬο^οΐЬ^οаΐе дгопрк апб 11к аррЬса^п ΐο ο1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб тиΐадеηек^к, N^1. Аабк 8ек., 14:9679-9698; 8ауегк еΐ а1. (1988) Υ-Т Еxοηис1еакек т рЬοкрЬο^οΐЬ^οаΐе-Ьакеб ο1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб тиΐадеηек^к, N^1. Аабк 8ек., 16:791-802 апб 8ауегк еΐ а1. (1988) 8йапб кресШс с1еаνаде οΓ рЬюкрЬο^οΐЬ^οаΐе-сοηΐа^η^ηд ^NА Ьу ^еасΐ^οη νίΐΗ ^екΐ^^сΐ^οη еηбοηис1еакек ш 1Ье ргекепсе οΓ еЬнбтт Ьгот1бе, N^1. Аабк 8ек., 16:803-814); мутагенез с использованием дуплекса ДНК с пробелами (Кгатег еΐ а1. (1984) ТЬе дарреб бир1ех ^NА арргаасЬ ΐο ο1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб тиΐаΐ^οη сοηкΐ^исΐ^οη, N^1. Аабк 8ек., 12:9441-9456; Кгатег & РгЬх (1987) МеЬюбк тЕηζутο1. О1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб οΓ тиΐаΐ^οηк \аа дарреб бир1ех ^NА, 154:350-367; Кгатег еΐ а1. (1988) 'Чтргоуеб епхутаРс т νίΐτο геас^^ ш 1Ье дарреб бир1ех ^NА арргаасЬ ΐο ο1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб οΓ тиΐаΐ^οηк, N^1. Аабк 8ек., 16:7207 апб Ρηΐζ еΐ а1. (1988) О1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб сοηкΐ^исΐ^οη οΓ тиΐаΐ^οηк: а дарреб бир1ех ^NА ргосебпге νίΐΗοηΙ ег^утаЬс таЛ^пк ш νίΐτο, N^1. Аабк 8ек., 16:6987-6999).
Дополнительные протоколы, используемые в способах согласно изобретению, включают в себя получение точечных ошибок спаривания при репарации (Кгатег (1984) Ηοίιτΐ М1кта1сЬ 8ераЛ, Се11., 38:879-887), мутагенез с использованием штаммов хозяев, дефицитных по репарации (Сайег еΐ а1. (1985) 'Чшргоуеб ο1^дοηис1еοΐ^бе к^ΐе-б^^есΐеб тШадепеЧк иктд М13 ^ναο^, N^1. Аабк 8ек., 13:4431-4443 и Сайег (1987) 'Чтргоуеб ο1^дοηис1еοΐ^бе-б^^есΐеб тШадепеЧк иктд М13 νесΐο^к, МеРюбк ш Еηζутο1., 154:382-403), делеционный мутагенез (ЕдЬебагаабеЬ (1986) Ике οΓ ο1^дοηис1еοΐ^бек ΐο депепие 1агде бе1еΐίο^, N^1. Аабк 8ек., 14:5115), мутагенез на основе систем рестрикции-селекции и рестрикции-очистки ^е11к еΐ а1. (198 6) Iтрο^ΐаηсе οΓ Ьуб^οдеη-Ьοηб Γοπι-αΐίοΐ! ш ^Ы^тд Фе ΐ^аηк^ΐ^οη №Не οΓ киЬΐ^1^к^η, РЬ11. Тгапк. 8. 8οα Ромб., А 317:415-423), мутагенез, осуществляемый при синтезе полного гена ^атЫаг
- 47 015591 е1 а1. (1984) То!а1 купШекй апй с1ошпд оГ а депе сойтд Гог !Не пЬопис1еаке 8 рго!ет, 8с1епсе, 223:12991301; 8акатаг апй КНогапа (1988) То!а1 кугИНекй апй ехргеккюп оГ а депе Гог !Не а-киЬипй оГ Ьоутае гой ои1ег кедтеп! диапте пис1еоййе-Ьтйтд рго!ет (йапкйист), №с1. Ас1йк Век., 14:6361-6372; Ме11к е! а1. (1985) Сакке!!е ти!адепек1к: ап еГПс1еп1 те!Ной Гог депегайоп оГ ти1йр1е ти!айопк а! йейпей кйек, Оепе, 34:315-323 апй Сгипйк!гот е! а1. (1985) 011допис1еоййе-ййес!ей тШадепекй Ьу т1сгокса1е кйо!-дип депе купШекй, №с1. Ас1йк Век., 13:3305-3316), репарацию двунитевых разрывов ^а^есИ (1986); Ато1й (1993) Рго1ей1 епдшеегтд Гог ипикиа1 епуйоптеп!к, Сиггеп! 0ртюп ш Вю!есйпо1оду, 4:450-455; 011допис1еоййе-й1гес!ей йоиЫе-кйапй Ьгеак герай ίπ р1акт1йк оГ ЕксНепсЫа сой: те11юй Гог кйе-кресШс ти1адепек1к, Ргос. №11. Асай. 8сг И8А, 83:7177-7181). Дополнительные подробности осуществления многих из указанных выше способов можно найти в руководстве Μеίйοйк ш Еп/уто1оду, уо1. 154, в котором описаны контроли, применимые для решения проблем, связанных с устранением дефектов, возникающих в практике осуществления указанных способов мутагенеза.
Также смотри патент США № 5605793 (81еттег) (25 февраля 1997 г.), '^еЛойк Гог Ιϋ уйго ВесотЬтайоп, патент США № 5811238 (81еттег е! а1.) (22 сентября 1998 г.) '^еЛойк Гог Сеиегайид Ро1упис1еоййек йаутд Эекйей Сйагас!ег1кйск Ьу ЙегаЬуе 8е1есйоп апй ВесотЬтайоп, патент США № 5830721 (81еттег е! а1.) (3 ноября 1998 г.) ^NА Μи!адеηек^к Ьу Вапйот Егадтеп1айоп апй ВеаккетЬ1у; патент США № 5834252 (8!еттег е! а1.) (10 ноября 1998 г.) Епй-Сотр1етеп1агу Ро1утегаке Веасйоп; патент США № 5837458 (Μ^ηкНи11 е! а1.) (17 ноября 1998 г.) Μеίйοйк апй Сотрокйюпк Гог Се11и1аг апй ΜеίаЬο1^с Епдшеегтд; М0 95/22625, 8!еттег апй Статей, Ьу Вапйот Егадтеп1айоп апй ВеаккетЬ1у;
М0 96/33207 Ьу 8!еттег апй Ырксйи!/ Епй Сотр1етеп!агу Ро1утегаке СНата Веасйоп; М0 97/20078 Ьу 8!еттег апй Статей '^еЛойк Гог Сепегайпд Ро1упис1еоййек Наутад Эекйей СНагас1епкРск Ьу ПегаРуе 8е1есйоп апй ВесотЬтайоп; М0 97/35966 Ьу ΜίΗκΗυ11 апй 8!еттег, Μеίйοйк апй Сотрокйюпк Гог Се11и1аг апй ΜеίаЬο1^с Епдшееппд; М0 99/41402 Ьу Риппопеп е! а1. Тагдейпд оГ Сепейс Уассше Уес!огк; М0 99/41383 Ьу Риппопеп е! а1. Апйдеп ЫЬгагу ЕпттихаРоп; М0 99/41369 Ьу Риппопеп е! а1. Сепейс Уассте Уес!ог Епдтееппд; М0 99/41368 Ьу Риппопеп е! а1. 0рйт1/айоп оГ Ептипотойикиогу Ргорегйек оГ Сепейс Уасстек; ЕР 752008 Ьу 8!еттег апй Статей, ^NА Μи!адепек^к Ьу Вапйот Егадтеп1айоп апй ВеаккетЬ1у; ЕР 0932670 Ьу 8!еттег ЕуоМпд Се11и1аг ^NА Ир!аке Ьу Весигкгуе 8ес.|иепсе ВесотЬтайоп; М0 99/23107 Ьу 8!еттег е! а1., Μοй^йса!^οп оГ Уйик Тгорйт апй Нок! Вапде Ьу Уйа1 Сепоте 8НиГйтд; М0 99/21979 Ьу Ар! е! а1., Нитап РарШотауйик Уес!огк; М0 98/31837 Ьу йе1 Сагйауге е! а1. Еуо1и!юп оГ МНо1е Се11к апй 0гдашктк Ьу Весигкгуе 8ес.|иепсе ВесотЬтайоп; М0 98/27230 Ьу Ра!!еп апй 8!еттег, '^еЛойк апй Сотрокйюпк Гог Ро1урерййе Епдшееппд; М0 98/27230 Ьу 8!еттег е! а1., Μеίйойк Гог 0рРпйхаРоп оГ Оепе ТНегару Ьу Весигкгуе 8ес.|иепсе 8НиГГ11пд апй 8е1есйоп, М0 00/00632, Μеίйойк Гог Сепегайпд Н1дй1у Эгуегке ЫЬгапек, М0 00/09679, '^еЛойк Гог 0Ыаттд т Уйго ВесотЬтей Ро1упис1еоййе 8ес.|иепсе Вапкк апй Векийтд 8едиепсек, М0 98/42832 Ьу Агпо1й е! а1., ВесотЬтайоп оГ Ро1упис1еоййе 8ес.|иепсек Икшд Вапйот ог Эейпей Рптегк, М0 99/29902 Ьу Агпо1й е! а1., Μе!йοй Гог Сгеайпд Ро1упис1еоййе апй Ро1урерййе 8едиепсек, М0 98/41653 Ьу Утй, Ап т уйго Μеίйοй Гог Сопкйисйоп оГ а ^NА ЫЬгагу, М0 98/41622 Ьу Вогсйей е! а1., Μе!йοй Гог Сопкйисйпд а ЫЬгагу Икшд ^NА 8НиПЬпд апй М0 98/42727 Ьу Рай апй 2аг11пд, 8ес.|иепсе Айегайопк икшд Ното1одоик ВесотЬтайоп.
Некоторые заявки на выдачу патента США содержат дополнительные подробности, касающиеся способов создания разнообразия, включая 8йиГйтд оГ Сойоп А1!егей Сепек, Ра!!еп е! а1., зарегистрированную 28 сентября 1999 (США, № 09/407800); Еуо1и!юп оГ МНо1е Се11к Апй 0гдашктк Ьу Весигкгуе 8есщепсе ВесотЬтайоп, йе1 Сагйауге е! а1., зарегистрированную 15 июля 1998 г. (США, № 09/166188) и 15 июля 1999 г. (США, № 09/354922); 011допис1еоййе Μей^а!ей №с1ею Ас1й ВесотЬтайоп, Статей е! а1., зарегистрированную 28 сентября 1999 г. (США, № 09/408392) и 0йдопис1еоййе Μей^а!ей №с1ею Ас1й ВесотЬтайоп, Статей е! а1., зарегистрированную 18 января 2000 г. (РСТ/И8 00/01203); Ике оГ СойопУапей 0йдопис1еоййе 8уп1йек1к Гог 8уп1йейс 8йиГйтд, Ме1сН е! а1., зарегистрированную 28 сентября 1999 г. (США, № 09/408393); 'МеШо^ Гог ΜπΕίΗμ Сйагас!ег 81ппдк, Ро1упис1еоййек апй Ро1урерййек Нау1пд Эекйей Сйагас!епкйск, 8е1йопоу е! а1., зарегистрированную 18 января 2000 г. (РСТ/И8 00/01202) и, например, '^еЛойк Гог ΜπΕίΗμ СНагас!ег 8!ппдк, Ро1упис1еоййек апй Ро1урерййек Наутад Эекйей СНагас!епкйск, 8е1йопоу е! а1., зарегистрированную 18 июля 2000 г. (США, № 09/618579); 'МеШо^ оГ Рори1а!1пд Эа!а 81гис!игек Гог Ике ш Еуо1ийопагу 81ти1а!юпк, 8ейГопоу апй 8!еттег, зарегистрированную 18 января 2000 г. (РСТ/И8 00/01138) и 8тд1е-8!гапйей №с1ею Ас1й Тетр1а!е-Μей^а!ей ВесотЬтайоп апй №с1ею Ас1й Егадтеп! коЬйоп, МГНоЙег, зарегистрированную 6 сентября 2000 г. (США, № 09/656549)).
Нестохастические способы или способы направленной эволюции, включая, например, насыщающий мутагенез (688Μ), вторичную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (8ЬВ) или их сочетание, используют для модификации нуклеиновой кислоты согласно изобретению для получения фосфолипаз с новыми или измененными свойствами (например, активных в очень кислых или щелочных условиях, при высоких температурах и т.п.). Полипептиды, кодируемые модифицированными нуклеиновыми кислотами, могут быть подвергнуты скринингу в отношении активности перед их тестированием на наличие фосфолипазной или другой активности. Можно использовать любые способы или протоколы тестирования, например, на основе капиллярной матрицы. Смотри, например, патенты США № 6280926, 5939250.
- 48 015591
Насыщающий мутагенез или С88М
В одном аспекте изобретения используют нестохастическую модификацию генов, способ направленной эволюции, для создания фосфолипаз с новыми или измененными свойствами. Варианты такого способа были названы мутагенез генных сайтов, мутагенез с насыщением сайтов, генный мутагенез с насыщением сайтов или просто 088Μ. Способ можно использовать в сочетании с другими способами мутагенеза. Смотри, например, патенты США № 6171820, 6238884. В одном аспекте 088Μ включает в себя получение матричного полинуклеотида и множества олигонуклеотидов, при этом каждый олигонуклеотид содержит последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, за счет чего достигается целенаправленное воздействие на специфическую последовательность матричного полинуклеотида и последовательность, которая является вариантом гомологичного гена; создание потомства полинуклеотидов, содержащих неслучайные вариации последовательности, путем репликации матричного полинуклеотида с использованием олигонуклеотидов, что приводит к созданию полинуклеотидов, содержащих вариации последовательности гомологичного гена.
В одном аспекте используют праймерные кодоны, содержащие вырожденную последовательность N,N,0/7, для введения точечных мутаций в полинуклеотид, для того чтобы создать набор полипептидного потомства, в котором имеется полный диапазон одиночных замен аминокислот в каждом положении аминокислоты, например аминокислотного остатка в активном центре фермента или в сайте связывания лиганда, подлежащих модификации. Указанные олигонуклеотиды могут содержать следующие друг за другом первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность ΝΝΟ/'Γ и необязательно вторую гомологичную последовательность. Продукты трансляции потомства ниже по ходу считывания информации, получаемые при использовании таких олигонуклеотидов, содержат все возможные изменения аминокислот в каждом сайте аминокислоты вдоль молекулы полипептида, поскольку в связи с вырожденностью последовательности ΝΝΟ/'Γ в нее включены кодоны для всех 20 аминокислот. В одном аспекте один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий, например, одну вырожденную кассету ΝΝΟ/'Γ) используется для введения в каждом таком исходом кодоне в родительской полинуклеотидной матрице полного диапазона замен кодона. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденные кассеты либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для проведения по меньшей мере в двух исходных кодонах в родительской полинуклеотидной матрице полного диапазона замен кодонов. Например, для введения аминокислотных мутаций более чем в одном сайте в одном олигонуклеотиде может присутствовать более одной последовательности ΝΝΟ/'Γ. Множество последовательностей ΝΝΟ/'Γ могут непосредственно соприкасаться или могут быть разделены одной или более дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, служащие для введения добавлений и делеций, могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность ΝΝΟ/'Γ, для введения любого сочетания или перестановки аминокислотных добавок, делеций и/или замен.
В одном аспекте осуществляют одновременный мутагенез двух или более соседних аминокислотных положений с использованием олигонуклеотида, который содержит следующие друг за другом триплеты ΝΝΟ/'Γ, например вырожденную последовательность (N,N,0/!')^ В другом аспекте используют вырожденные кассеты, обладающие меньшей вырожденностью, чем последовательность Ν^Ο/Σ. Например, в некоторых случаях (например, в случае олигонуклеотида) может быть желательно использовать вырожденную триплетную последовательность, включающую в себя только один N при этом указанный N может быть в первом, втором или третьем положении триплета. В оставшихся двух положениях триплета могут быть использованы любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки. Альтернативно, в некоторых случаях (например, в случае олигонуклеотида) может требоваться использование вырожденной триплетной последовательности
В одном аспекте использование вырожденных триплетов (например, триплетов ΝΝΟ/'Γ) позволяет осуществлять систематическое и легкое создание полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) в каждом положении аминокислоты в полипептиде (в альтернативных аспектах способы также включают в себя создание не всех возможных замен аминокислотного остатка кодона или положения, а меньше). Например, в случае полипептида из 100 аминокислот может быть создано 2000 разных видов (т.е. 20 возможных аминокислот на положение х 100 положений аминокислот). При использовании олигонуклеотида или набора олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν^Ο/Σ, 32 индивидуальных последовательности могут кодировать все 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, создается 32 разных производных полинуклеотида, кодирующих 20 разных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайт-специфичном мутагенезе приводит к получению в потомстве только одного полипептидного продукта в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды могут быть необязательно использованы в сочетании с описанными вырожденными праймерами, например невырожденные олигонуклеотиды могут быть использованы для получения специфичных точечных мутаций в рабочем полинуклеотиде. Такой подход представляет собой одно из средств создания специфичных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, которые ведут к соот
- 49 015591 ветствующим изменениям аминокислот, и точечных мутаций, которые вызывают образование стопкодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептида.
В одном аспекте каждый сосуд для проведения реакции насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул полипептидного потомства (например, фосфолипаз), так что все 20 природных аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, подвергаемого мутагенезу в родительском полинуклеотиде (в других аспектах используют не все 20 природных сочетаний, а меньше). Получаемое в результате в каждом таком реакционном сосуде для проведения насыщающего мутагенеза 32-кратное вырожденное потомство полипептидов может быть подвергнуто клональной амплификации (например, клонированию в подходящем организме-хозяине, например в хозяине Е. сой, с использованием, например, экспрессирующего вектора) и скринингу экспрессии. В том случае, когда отдельное полипептидное потомство идентифицируют путем скрининга с выявлением благоприятных изменений свойства (при сравнении с родительским полипептидом, например, такого свойства, как повышенная фосфолипазная активность в щелочных или кислых условиях), оно может быть подвергнуто секвенированию для идентификации содержащихся в нем соответствующих благоприятных аминокислотных замен.
В одном аспекте после проведения мутагенеза в каждом положении аминокислоты в родительском полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, описанного в настоящей публикации, благоприятные изменения аминокислот могут быть идентифицированы более чем в одном аминокислотном положении. Могут быть созданы одна или несколько новых молекул потомства, которые содержат комбинацию всех или части указанных благоприятных замен аминокислот. Например, если в каждом из трех аминокислотных положений в полипептиде идентифицируют 2 специфичных благоприятных изменения аминокислот, то перестановки будут включать в себя 3 возможности в каждом положении (отсутствие изменений относительно исходной аминокислоты и наличие каждого из двух возможных благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, имеется 3х3х3 или в итоге 27 возможностей, включая те 7, которые были рассмотрены ранее: 6 единичных точечных мутаций (т. е. по 2 в каждом из трех положений) и отсутствие изменений в каждом положении.
В другом аспекте мутагенез по механизму насыщения сайтов может быть использован вместе с другими стохастическими или нестохастическими способами варьирования последовательностей, например вторичной сборки по механизму синтеза с использованием лигирования (смотри ниже), перестановки, химеризации, рекомбинации и других процессов мутагенеза и мутагенных средств. Настоящее изобретение относится к применению любых способов мутагенеза, включая насыщающий мутагенез в повторяющемся режиме.
Вторичная сборка по механизму синтеза с использованием лигирования (8ЬК)
Настоящее изобретение относится к системе неслучайной модификации генов, называемой вторичной сборкой по механизму синтеза с использованием лигирования, или просто 8ЬК, процесс направленной эволюции, используемой для получения фосфолипаз с новыми или измененными свойствами. 8ЬК представляет собой способ лигирования олигонуклеотидных фрагментов вместе неслучайным образом. Такой способ отличается от стохастической перетасовки олигонуклеотидов тем, что строительные блоки нуклеиновой кислоты не подвергают случайной перетасовке, объединению или химеризации, а подвергают неслучайной сборке. Смотри, например, заявку на выдачу патента США с порядковым номером (И88Щ 09/332'835, озаглавленную 8уп1йейс Ыдайоп КеаккетЫу ίη Ойсс1сб Еуо1ийоп и зарегистрированную 14 июня 1999 г. (υ88N 09/332835). В одном аспекте 8ЬК включает в себя следующие стадии:
(a) получение матричного полинуклеотида, при этом указанный матричный полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую гомологичный ген;
(b) получение множества полинуклеотидных строительных блоков, при этом полинуклеотидные строительные блоки сконструированы так, чтобы осуществлять перекрестную вторичную сборку с матричным полинуклеотидом в предварительно определяемой последовательности, и каждый полинуклеотидный строительный блок содержит последовательность, которая является вариантом гомологичного гена, и последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, фланкирующую вариантную последовательность;
(c) объединение полинуклеотидного строительного блока с матричным полинуклеотидом, так чтобы происходила перекрестная вторичная сборка полинуклеотидного строительного блока с матричным полинуклеотидом с образованием полинуклеотида, содержащего вариации гомологичной генной последовательности.
8ЬК не зависит от наличия высокого уровня гомологии между полинуклеотидами, подвергающимися реаранжировке. Таким образом, такой способ может быть использован для нестохастического создания библиотек (или наборов) потомства молекул, включающих в себя свыше 10100 различных химерных молекул. 8ЬК может быть использован для создания библиотек, состоящих из более чем 101000 различных химерных молекул в потомстве. Таким образом, аспекты настоящего изобретения включают в себя нестохастические способы получения набора окончательных химерных молекул нуклеиновой кислоты, имеющие порядок полной сборки, который выбран при конструировании. Указанный способ
- 50 015591 включает в себя стадии получения в результате конструирования множества конкретных строительных блоков нуклеиновой кислоты, имеющих пригодные взаимно совместимые лигируемые концы, и сборку указанных строительных блоков нуклеиновой кислоты, так что достигается заданный общий порядок сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы строительных блоков нуклеиновой кислоты, подлежащих сборке, считают пригодными для данного типа упорядоченной сборки, если они позволяют сочетать строительные блоки в предварительно определяемом порядке. Таким образом, общий порядок сборки, в котором могут сочетаться строительные блоки нуклеиновой кислоты, определяется конструкцией лигируемых концов. Если необходимо использовать более одной стадии сборки, то общий порядок сборки, в котором могут сочетаться строительные блоки нуклеиновой кислоты, также определяется последовательным порядком стадий сборки. В одном аспекте подвергнутые отжигу строительные фрагменты обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4), для достижения ковалентного связывания строительных фрагментов.
В одном аспекте конструирование олигонуклеотидных строительных блоков осуществляют в результате анализа набора матриц, состоящих из последовательностей нуклеиновых кислотпредшественников, которые служат в качестве основы для получения набора потомства конечных химерных полинуклеотидов. Таким образом, указанные родительские олигонуклеотидные матрицы служат источником информации о последовательности, которая помогает конструировать строительные блоки нуклеиновой кислоты, которые необходимо подвергнуть мутагенезу, например, посредством химеризации или перетасовки.
В одном аспекте данного способа множество исходных матриц нуклеиновой кислоты выравнивают, чтобы выбрать одну или несколько пограничных точек. Пограничные точки могут располагаться в области гомологии и включать в себя один или несколько нуклеотидов. Указанные пограничные точки предпочтительно являются общими по меньшей мере для двух матриц-предшественников. Благодаря этому пограничные точки могут быть использованы для очерчивания границ получаемых олигонуклеотидных строительных блоков, которые необходимо создать для того, чтобы осуществить реаранжировку родительских полинуклеотидов. Пограничные точки, идентифицированные и выбранные в молекулахпредшественниках, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке конечных молекул химерного потомства. Пограничная точка может находиться в области гомологии (состоящей по меньшей мере из одного гомологичного нуклеотидного основания), принадлежащей по меньшей мере двум родительским полинуклеотидным последовательностям. Альтернативно, пограничная точка может находиться в области гомологии, которая является общей, по меньшей мере, для половины родительских полинуклеотидных последовательностей или может находиться в области гомологии, которая является общей по меньшей мере для двух третей родительских полинуклеотидных последовательностей. Еще более предпочтительно пригодные пограничные точки находятся в области гомологии, которая является общей по меньшей мере для трех четвертых исходных родительских полинуклеотидных последовательностей, или она может быть общей почти для всех родительских полинуклеотидных последовательностей. В одном аспекте пограничная точка находится в области гомологии, которая является общей для всех родительских полинуклеотидных последовательностей.
В одном аспекте способ вторичной сборки с использованием реакции лигирования осуществляют по полной схеме с получением полной библиотеки химерного потомства полинуклеотидов. Другими словами, все возможные упорядоченные комбинации строительных блоков нуклеиновой кислоты представляют в наборе конечных химерных молекул нуклеиновой кислоты. В то же время в другом варианте порядок сборки (например, порядок сборки каждого строительного блока в направлении от 5'- к 3'-последовательности каждой конечной химерной молекулы нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании осуществляют по плану (или неслучайно), как указано выше. В связи с нестохастической природой настоящего изобретения возможность получения нежелательных побочных продуктов резко снижена.
В другом аспекте способ вторичной сборки с использованием реакции лигирования проводят системно. Например, способ осуществляют для того, чтобы создать системную компартментализованную библиотеку молекул потомства с компартментами, которые могут быть подвергнуты системному скринингу, например, друг за другом. Другими словами, в настоящем изобретении показано, что посредством селективного и разумного применения конкретных строительных блоков нуклеиновой кислоты в сочетании с селективным и разумным применением последовательно организованных стадий реакции сборки, может быть реализовано конструирование, при котором могут быть получены конкретные наборы продуктов в потомстве в каждом из нескольких реакционных сосудов. Такой подход позволяет осуществлять системное исследование и процедуру скрининга. Таким образом, приведенные способы позволяют системно исследовать потенциально очень большое количество молекул потомства меньшими группами. В связи с возможностью осуществлять химеризацию в режиме, который характеризуется высокой гибкостью в сочетании с полнотой и системностью, особенно в случае низкого уровня гомологии между молекулами-предшественниками, указанные способы приводят к получению библиотеки (или набора), включающей в себя большое число молекул потомства. В связи с нестохастической природой процесса вторичной сборки с использованием реакции лигирования согласно настоящему изобретению получаемые
- 51 015591 молекулы потомства предпочтительно составляют библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновой кислоты, имеющих полный порядок сборки, выбранный при конструировании. Насыщающий мутагенез и способы оптимизированной направленной эволюции также могут быть использованы для создания различных видов молекул потомства. Понятно, что настоящее изобретение дает свободу выбора и возможность контроля в отношении выбора пограничных точек, размера и количества строительных блоков нуклеиновой кислоты, а также размера и конструкции связывающих звеньев. Кроме того, понятно, что потребность в межмолекулярной гомологии значительно ослабляется в случае осуществления данного изобретения. Фактически пограничные точки могут быть выбраны даже в областях малой гомологии или вообще при отсутствии межмолекулярной гомологии. Например, в связи с неоднозначностью кодонов, т. е. в связи с вырожденностью кодонов, нуклеотидные замены могут быть введены в строительные блоки нуклеиновых кислот без изменения аминокислоты, исходно кодируемой соответствующей матрицей-предшественником. Альтернативно, кодон может быть изменен так, что кодирование исходной аминокислоты меняется. В настоящем изобретении предполагается, что такие замены могут быть введены в строительный блок нуклеиновой кислоты с целью повышения частоты межмолекулярно гомологичных пограничных точек и, таким образом, можно обеспечить повышенное количество связей между строительными блоками, что, в свою очередь, позволяет создавать большее количество химерных молекул потомства.
В другом аспекте синтетическая природа стадии, на которой получают строительные блоки, позволяет осуществлять конструирование и введение нуклеотидов (например, одного или нескольких нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны, или интроны, или регуляторные последовательности), которые позже могут быть необязательно удалены в процессе обработки ίη νίΐΐΌ (например, путем мутагенеза) или в процессе ίη νί\Ό (например) при использовании способности организма-хозяина к сплайсингу гена). Понятно, что во многих случаях введение таких нуклеотидов также может быть желательным по ряду других причин в дополнение к вероятной пользе, связанной с созданием пригодной пограничной точки.
В одном аспекте строительный блок нуклеиновой кислоты используют для введения интрона. Таким образом, функциональные интроны вводят в искусственно полученный исследователем ген согласно способам, описанным в настоящей публикации. Искусственно введенный интрон (интроны) может быть функциональным в клетке-хозяине для сплайсинга генов почти таким же образом, посредством которого встречающийся в природе интрон осуществляет свою функцию в сплайсинге гена.
Система оптимизированной направленной эволюции
Настоящее изобретение относится к системе нестохастической модификации генов, называемой система оптимизированной направленной эволюции, используемой для получения фосфолипаз с новыми или измененными свойствами. Оптимизированная направленная эволюция направлена на применение повторяющихся циклов редукционной реаранжировки, рекомбинации и отбора, позволяющих осуществлять направленную молекулярную эволюцию нуклеиновых кислот посредством рекомбинации. Оптимизированная направленная эволюция позволяет получать большую популяцию измененных в ходе такой эволюции химерных последовательностей, при этом создаваемая популяция существенно обогащена последовательностями, в которых произошло предварительно заданное количество событий кроссинговера.
Событие кроссинговера соответствует точке химерной последовательности, в которой имеет место переход последовательности от одного родительского варианта к другому родительскому варианту. В норме такая точка находится в месте соединения, в котором олигонуклеотиды из двух родительских вариантов лигированы друг с другом с образованием одной последовательности. Такой способ позволяет проводить расчет соответствующих концентраций олигонуклеотидных последовательностей так, чтобы конечная химерная популяция последовательностей была обогащена выбранным количеством кроссинговеров. Такой подход позволяет лучше контролировать выбор химерных вариантов, характеризующихся предварительно заданным количеством событий кроссинговера.
Кроме того, настоящий способ предлагает удобный инструмент для исследования огромного количества возможных белковых вариантов по сравнению с другими системами. Ранее при получении, например, 1013 химерных молекул в результате реакции было чрезвычайно трудно исследовать такое огромное количество химерных вариантов в отношении конкретной активности. Кроме того, значительная часть популяции потомства может иметь очень большое количество событий кроссинговера, что приводит к получению белков, для которых маловероятен повышенный уровень конкретной активности. При использовании данных способов популяция химерных молекул может быть обогащена такими вариантами, которые характеризуются определенным числом кроссинговеров. Таким образом, несмотря на то что в ходе реакции все еще может быть создано 1013 химерных молекул, каждая из молекул, выбранных для дальнейшего анализа, наиболее вероятно характеризуется, например, только тремя событиями кроссинговеров. В связи с тем что полученная популяция потомства может быть сдвинута в сторону наличия предварительно заданного числа кроссинговеров, границы функционального разнообразия химерных молекул сужаются. Это позволяет получать управляемое число переменных при расчете того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственен за воздействие на
- 52 015591 конкретный признак.
Один из способов создания химерной полинуклеотидной последовательности в потомстве заключается в создании олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или частям каждой родительской последовательности. Каждый олигонуклеотид предпочтительно содержит уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к созданию нового варианта, который имеет каждый из олигонуклеотидных фрагментов, и все фрагменты в нем собраны в нужном порядке. Дополнительную информацию также можно найти в υδδΝ 09/332835. Количество олигонуклеотидов, созданных для каждого родительского варианта, связано с общим числом полученных кроссоверов в химерной молекуле, которая в итоге была создана. Например, три варианта родительской нуклеотидной последовательности могут быть подвергнуты реакции лигирования для выявления химерного варианта, обладающего, например, большей активностью при повышенной температуре. В качестве примера может быть создан набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих каждой из частей каждого родительского варианта. Соответственно, в ходе процесса вторичной сборки с использованием реакции лигирования в каждой из химерных последовательностей может происходить до 50 событий кроссинговера. Вероятность того, что каждый из созданных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого родительского варианта в чередующемся порядке, очень низка. Если олигонуклеотидные фрагменты присутствуют в реакционной смеси для лигирования в одинаковом молярном количестве, то вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же родительского полинуклеотида будут лигированы рядом друг с другом, что не приведет к кроссинговеру. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждого предшественника поддерживается постоянной на каждой стадии реакции лигирования в таком примере, то с вероятностью 1/3 (при условии 3 родителей) олигонуклеотиды из одного и того же родительского варианта будут лигировать внутри химерной последовательности и не приведут к кроссинговеру.
Соответственно, может быть определена функция распределения плотности вероятности (РЭЕ) для предсказания популяции событий кроссинговера, которые вероятно произойдут на каждой стадии в данной реакции лигирования при данном наборе родительских вариантов, количестве олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентрациях каждого из вариантов на каждой из стадий реакции лигирования. Ниже описаны статистические и математические параметры, определяющие ΡΌΕ. Используя указанные способы можно рассчитать такую функцию распределения плотности вероятности и таким образом обогатить популяцию химерного потомства молекулами с предварительно заданным количеством событий кроссинговера в результате конкретной реакции лигирования. Кроме того, может быть предварительно задано целевое количество событий кроссинговера, и затем система может быть запрограммирована для расчета исходного количества каждого родительского олигонуклеотида на каждой стадии реакции лигирования, чтобы получить функцию распределения плотности вероятности, максимум которой соответствует предварительно заданному количеству событий кроссинговера. Указанные способы направлены на использование многократных циклов редукционной реаранжировки, рекомбинации и отбора, которые позволяют осуществлять направленную молекулярную эволюцию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, путем рекомбинации. Данная система позволяет создавать крупную популяцию измененных в ходе эволюции химерных последовательностей, при этом получаемая популяция в значительной степени обогащена последовательностями, которые характеризуются предварительно заданным числом событий кроссинговера. Событие кроссинговера соответствует точке химерной последовательности, в которой имеет место переход последовательности от одного родительского варианта к другому родительскому варианту. В норме такая точка находится в месте соединения, в котором олигонуклеотиды из двух родительских вариантов лигированы друг с другом с образованием одной последовательности. Такой способ позволяет проводить расчет соответствующих концентраций олигонуклеотидных последовательностей так, чтобы конечная химерная популяция последовательностей была обогащена выбранным количеством кроссинговеров. Такой подход позволяет лучше контролировать выбор химерных вариантов, характеризующихся предварительно заданным количеством событий кроссинговера.
Кроме того, такие способы обеспечивают удобный инструмент для исследования огромного количества возможных белковых вариантов по сравнению с другими системами. При использовании описанных способов популяция химерных молекул может быть обогащена такими вариантами, которые характеризуются определенными числом событий кроссинговера. Таким образом, несмотря на то что в ходе реакции все еще может быть создано 1013 химерных молекул, каждая из молекул, выбранных для дальнейшего анализа, наиболее вероятно характеризуется, например, только тремя событиями кроссинговеров. В связи с тем, что полученная популяция потомства может быть сдвинута в сторону наличия предварительно заданного числа кроссинговеров, границы функционального разнообразия химерных молекул сужаются. Это позволяет получать управляемое число переменных при расчете того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов может быть ответственен за воздействие на конкретный признак.
В одном аспекте способ позволяет создавать химерную полинуклеотидную последовательность в потомстве в результате создания олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или частям каждой
- 53 015591 родительской последовательности. Каждый олигонуклеотид предпочтительно содержит уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к созданию нового варианта, который имеет каждый из олигонуклеотидных фрагментов, и все фрагменты в нем собраны в нужном порядке. Смотри также υ88Ν 09/332835.
Количество олигонуклеотидов, созданных для каждого родительского варианта, связано с общим числом полученных кроссинговеров в химерной молекуле, которая в итоге была создана. Например, три варианта родительской нуклеотидной последовательности могут быть подвергнуты реакции лигирования для выявления химерного варианта, обладающего, например, большей активностью при повышенной температуре. В качестве примера может быть создан набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих каждой из частей каждого родительского варианта. Соответственно, в ходе процесса вторичной сборки с использованием реакции лигирования в каждой из химерных последовательностей может происходить до 50 событий кроссинговера. Вероятность того, что каждый из созданных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого родительского варианта в чередующемся порядке, очень низка. Если олигонуклеотидные фрагменты присутствуют в реакционной смеси для лигирования в одинаковом молярном количестве, то вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же родительского полинуклеотида будут лигированы рядом друг с другом, что не приведет к кроссинговеру. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждого предшественника поддерживается постоянной на каждой стадии реакции лигирования в таком примере, то с вероятностью 1/3 (при условии 3 родителей) олигонуклеотиды из одного и того же родительского варианта будут лигировать внутри химерной последовательности и не приведут к кроссинговеру.
Соответственно, может быть определена функция распределения плотности вероятности (РЭЕ) для предсказания популяции событий кроссинговера, которые вероятно произойдут на каждой стадии в данной реакции лигирования при данном наборе родительских вариантов, количестве олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентрациях каждого из вариантов на каждой из стадий реакции лигирования. Ниже описаны статистические и математические параметры, определяющие РЭЕ. Можно рассчитать такую функцию распределения плотности вероятности и таким образом обогатить популяцию химерного потомства молекулами с предварительно заданным количеством событий кроссинговера в результате конкретной реакции лигирования. Кроме того, может быть предварительно задано целевое количество событий кроссинговера, и затем система может быть запрограммирована для расчета исходного количества каждого родительского олигонуклеотида на каждой стадии реакции лигирования, чтобы получить функцию распределения плотности вероятности, максимум которой соответствует предварительно заданному количеству событий кроссинговера.
Определение событий кроссинговера
Варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя систему и компьютерную программу, которые позволяют получить требуемую функцию распределения плотности вероятности кроссинговера (РЭЕ), количество родительских генов, подвергаемых вторичной сборке, и количество фрагментов, вводимых во вторичную сборку. Выходные данные такой программы представлены фрагментом РЭЕ, который может быть использован для определения способа получения перегруппированных генов и оценки РЭЕ кроссинговера таких генов. Описанную обработку предпочтительно проводят с использованием языка программирования МАТЬАВ® (Тйе МаШетогкк, №йск, Маккасйикейк) и соответствующей среды разработки для машинной обработки данных.
Повторяющиеся процессы
В практике осуществления настоящего изобретения указанные процессы могут многократно повторяться. Например, любую нуклеиновую кислоту (или конкретную нуклеиновую кислоту), ответственную за измененный фенотип фосфолипазы, вначале идентифицируют, повторно выделяют, снова модифицируют и повторно тестируют на наличие активности. Данный процесс может быть многократно повторен до конструирования требуемого фенотипа. Например, генно-инженерными способами в клетку может быть введен полный биохимический путь анаболического или катаболического характера, включая фосфолипазную активность.
Подобным образом, если определяют, что конкретный олигонуклеотид совсем не оказывает влияния на желательный признак (например, в случае нового фосфолипазного фенотипа), он может быть исключен из переменных признаков в результате синтеза более крупных родительских олигонуклеотидов, включающих в себя подлежащую исключению последовательность. Поскольку включение последовательности в состав более крупной последовательности препятствует прохождению кроссинговера, то больше не будут возникать какие-либо вариации в данной последовательности в полинуклеотидах потомства. Такая многократно повторяемая методика определения того, какой из олигонуклеотидов имеет наибольшее отношение к желательному признаку и какой не имеет отношения, позволяет проводить более эффективное исследование всех возможных белковых вариантов, которые могут обеспечивать конкретный признак или конкретную активность.
Перетасовка ΐη νίνο
Перетасовку молекул ш νί\Ό используют в способах согласно изобретению, которые позволяют получать варианты полипептидов согласно изобретению, например антител, ферментов с фосфолипазной
- 54 015591 активностью и т.п. Перетасовка ш νί\Ό может быть проведена с использованием естественной способности клеток осуществлять рекомбинацию мультимеров. Несмотря на то что рекомбинация ш νί\Ό представляет собой основной путь создания разнообразия молекул в природе, генетическая рекомбинация остается относительно сложным процессом, который включает в себя (1) распознавание гомологии; (2) расщепление цепи, внедрение в цепь и стадии метаболических превращений, приводящие к образованию рекомбинантной хиазмы, и, наконец, (3) разрешение хиазмы на отдельные рекомбинантные молекулы. Для образования хиазмы требуется распознавание гомологичных последовательностей.
В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ получения гибридного полинуклеотида, по меньшей мере, из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. Настоящее изобретение может быть использовано для получения гибридного полинуклеотида за счет введения, по меньшей мере, первого полинуклеотида и второго полинуклеотида, которые имеют по меньшей мере одну общую область частичной гомологии последовательностей, в подходящую клетку-хозяина. Области частичной гомологии последовательностей стимулируют процессы, которые ведут к перестройке последовательностей с образованием гибридного полинуклеотида. Термин гибридный полинуклеотид в используемом в настоящем описании смысле означает любую нуклеотидную последовательность, которую получают способом согласно настоящему изобретению и которая содержит последовательности по меньшей мере из двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут быть получены в результате событий межмолекулярной рекомбинации, которые способствуют интеграции последовательностей молекул ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут возникать в результате внутримолекулярных процессов редукционной реаранжировки, которые используют повторяющиеся последовательности, изменяя нуклеотидную последовательность в молекуле ДНК.
Получение вариантов последовательностей
Настоящее изобретение также относится к способам получения вариантов последовательностей нуклеиновой кислоты и последовательностей фосфолипазы согласно изобретению или выделения фосфолипазного фермента, например фосфолипазы с вариантами последовательности, с использованием нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению. В одном аспекте изобретение относится к вариантам гена фосфолипазы согласно изобретению, который может быть изменен любыми способами, включая, например, случайные или стохастические способы или нестохастические способы или способы направленной эволюции, описанные выше.
Выделенные варианты могут представлять собой встречающиеся в природе варианты. Также могут быть создана варианты ш νίΙΐΌ. Такие варианты могут быть созданы с использованием методов генетической инженерии, таких как сайт-специфичный мутагенез, случайный химический мутагенез, способы делетирования с использованием экзонуклеазы III и стандартные методики клонирования. Альтернативно, такие варианты, фрагменты, аналоги или производные могут быть созданы с использованием способов химического синтеза или модификации. Другие способы создания вариантов также известны специалистам в данной области. Такие способы включают способы, при которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируют с получением нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, обладающие характеристиками, повышающими их ценность для промышленного или лабораторного применения. Такими способами получают и подвергают соответствующей характеристике большое число вариантных последовательностей, имеющих одно или нескольких нуклеотидных отличий по сравнению с последовательностью, полученной из природного изолята. Указанные нуклеотидные отличия могут приводить к изменениям аминокислот относительно полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.
Например, варианты могут быть созданы с использованием склонной к ошибкам ПЦР. В случае склонной к ошибкам ПЦР указанную реакцию ПЦР проводят в условиях, когда ДНК-полимераза обладает очень низкой точностью копирования, так что достигается высокий уровень точечных мутаций по всей длине ПЦР-продукта. Склонная к ошибкам ПЦР описана, например, в Ьеипд, Ό.\. е! а1., Тесйшдие, 1: 11-15, 1989 и Са1б^е11, В.С. & 1оусе С.Р., РСВ Ме11юЙ8 Аррйс, 2: 28-33, 1992. В общих чертах в таких способах нуклеиновые кислоты, подлежащие мутагенезу, смешивают с праймерами ПЦР, реакционным буфером, МдС12, МпС12, Тад-полимеразой и дНТФ в соответствующих концентрациях для достижения высокого уровня точечных мутаций по всей длине ПЦР-продукта. Например, реакция может быть проведена с использованием 20 фмоль нуклеиновой кислоты, подлежащей мутагенезу, 30 пмоль каждого из ПЦР-праймеров, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1 (рН8,3) и 0,01% желатина, 7 мМ МдС12, 0,5 мМ МпС12, 5 единиц Тад-полимеразы, 0,2 мМ дГТФ, 0,2 мМ дАТФ, 1 мМ дЦТФ и 1 мм дТТФ. ПЦР может быть проведена в ходе 30 циклов при температуре 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 12°С в течение 1 мин. Однако будет понятно, что указанные параметры могут варьировать в зависимости от условий. Подвергаемые мутагенезу нуклеиновые кислоты клонируют в соответствующем векторе и оценивают активность полипептидов, кодируемых полученными в результате мутагенеза нуклеиновыми кислотами.
Варианты могут быть также созданы путем направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, ведущего к образованию сайт-специфических мутаций в любой представляющей интерес кло- 55 015591 нируемой ДНК. Мутагенез с использованием олигонуклеотидов описан, например, в Ке1ййааг-01коп (1988) 8с1епсе, 241: 53-57. В общем виде в таких способах синтезируют множество двунитевых олигонуклеотидов, несущих одну или более мутаций, подлежащих введению в клонируемую ДНК, которые встраивают в клонируемые ДНК, подлежащие мутагенезу. Выделяют клоны, содержащие мутированную ДНК, и оценивают активность полипептидов, которые они кодируют.
Другой способ создания вариантов включает в себя сборку с использованием ПЦР. Методика сборки путем ПЦР заключается в сборке ПЦР-продукта из смеси небольших фрагментов ДНК. Имеется большое количество различных продуктов реакции ПЦР параллельно в одном и том же флаконе, при этом продукты одной реакции служат затравкой для продуктов другой реакции. Сборка в результате ПЦР описана, например, в патенте США № 5965408.
Еще один способ создания вариантов заключается в мутагенезе с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР). В случае мутагенеза с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе, ίπ νίΙΐΌ происходит принудительная гомологичная рекомбинация между молекулами ДНК, имеющими разные, но очень сходные последовательности ДНК, в результате случайной фрагментации молекулы ДНК, определяемой гомологией последовательности, с последующей фиксацией продуктов кроссинговера за счет удлинения праймера в реакции ПЦР. Мутагенез с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию, описан, например, в §!ештег (1994) Ргос. №111. Асай. 8ск И8А, 91: 10747-10751). Кратко, в таких способах множество нуклеиновых кислот, подлежащих рекомбинации, расщепляют ДНКазой с получением фрагментов, имеющих средний размер 50-200 нуклеотидов. Фрагменты требуемого среднего размера очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, облегчающих рекомбинацию между фрагментами нуклеиновой кислоты. Например, ПЦР может быть проведена при ресуспендировании очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/мкл в растворе, содержащем 0,2 мМ каждого из дНТФ, 2,2 мМ МдС12, 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1, рН 9,0 и 0,1% тритона Х-100. Добавляют 2,5 единицы Тац-полимеразы к смеси 100:1 и проводят ПЦР в следующем режиме: при температуре 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако будет понятно, что указанные параметры при необходимости могут варьировать. В некоторых аспектах в состав реакционной смеси для ПЦР могут быть включены олигонуклеотиды. В других аспектах в первой группе реакций ПЦР можно использовать фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, а в последующих группах реакций ПЦР можно использовать Тац-полимеразу. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активность полипептидов, которые они кодируют.
Варианты могут также быть созданы путем мутагенеза ш у1уо. В некоторых вариантах случайные мутации в представляющей интерес последовательности создают путем размножения представляющей интерес последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е. сой, который несет мутации в одном или нескольких путях репарации ДНК. Такие штаммы-мутаторы имеют более высокий уровень случайных мутаций, чем родительский штамм дикого типа. Размножение ДНК в одном из таких штаммов в конечном итоге приведет к созданию случайных мутаций внутри ДНК. Штаммы-мутаторы, подходящие для использования в способе мутагенеза ш у1уо, описаны, например, в публикации РСТ № ν0 91/16427.
Варианты также могут быть созданы с использованием кассетного мутагенеза. При кассетном мутагенезе небольшую область двунитевой молекулы ДНК заменяют синтетической олигонуклеотидной кассетой, которая отличается от нативной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично рандомизированную нативную последовательность.
Для создания вариантов может быть также использован множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи. Множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, представляет собой алгоритм для генно-инженерных манипуляций с белками (белковый мутагенез), разработанный с целью получения разнообразных популяций фенотипически родственных мутантов, представители которых отличаются по аминокислотной последовательности. Данный способ использует механизм обратной связи для контроля последовательных раундов комбинаторного кассетного мутагенеза. Множественный мутагенез с обратным контролем описан, например, в Агкт (1992) Ргос. ^Й. Асай. 8сг И8А, 89: 78117815.
В некоторых способах осуществления настоящего изобретения варианты создают с использованием экспоненциального множественного мутагенеза. Экспоненциальный множественный мутагенез представляет собой способ создания комбинаторных библиотек с высоким процентным содержанием уникальных и функциональных мутантов, при этом небольшие группы остатков параллельно рандомизируют, чтобы в каждом изменяемом положении идентифицировать аминокислоты, которые ведут к образованию функциональных белков. Экспоненциальный множественный мутагенез описан, например, в Ие1едгауе (1993) Вю!есйпо1оду Кек., 11: 1548-1552. Случайный сайт-специфичный мутагенез описан, например, в Ато1й (1993) Сиггеп! 0р1шоп ш Вю!есйпо1оду, 4: 450-455.
В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты создают с использованием способов перетасовки, при этом части множества нуклеиновых кислот, которые кодируют отличающиеся поли
- 56 015591 пептиды, сливают вместе с образованием химерных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют химерные полипептиды, как описано, например, в патентах США № 5965408, 5939250.
Настоящее изобретение также относится к вариантам полипептидов согласно изобретению, содержащим последовательности, в которых один или несколько аминокислотных остатков (например, в приведенном в качестве примера полипептиде согласно изобретению) заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (например, консервативным аминокислотным остатком), и такой введенный в качестве замены остаток аминокислоты может кодироваться или не кодироваться генетическим кодом. Консервативные замены представляют собой такие замены, которые позволяют заменить данную аминокислоту в полипептиде другой аминокислотой с близкими свойствами. Таким образом, полипептиды согласно изобретению включают полипептиды с консервативными заменами в последовательностях согласно изобретению, включая, без ограничения, следующие замены: замену алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или наоборот; замену кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота и глютаминовая кислота, другим кислотным остатком; замену остатка, несущего амидную группу, такого как аспарагин и глютамин, другим остатком, несущим амидную группу; обмен основного остатка, такого как лизин и аргинин, на другой основный остаток; и замену ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин, другим ароматическим остатком. Другие варианты представляют собой такие варианты, в которых один или несколько остатков аминокислот в полипептидах согласно изобретению включают в себя введенную в качестве замены группу.
Другие варианты, входящие в область настоящего изобретения, представляют собой такие варианты, в которых полипептид ассоциирован с другим соединением, таким как соединение, увеличивающее время полужизни полипептида, например полиэтиленгликоль.
Дополнительные варианты, входящие в область настоящего изобретения, представляют собой такие варианты, в которых дополнительные аминокислоты слиты с полипептидом, например лидерная последовательность, последовательность секреции, последовательность пробелка или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида.
В некоторых аспектах варианты, фрагменты, производные и аналоги полипептидов согласно изобретению сохраняют ту же биологическую функцию или активность, что и типичные полипептиды, например активность фосфолипазы, которая описана в настоящей публикации. В других аспектах вариант, фрагмент, производное или аналог включает в себя пробелок, так чтобы указанный вариант, фрагмент, производное или аналог могли быть активированы путем отщепления пробелковой части с образованием активного полипептида.
Оптимизация кодонов для достижения высоких уровней экспрессии белка в клетках-хозяевах
Настоящее изобретение относится к способам модификации нуклеиновых кислот, кодирующих фосфолипазу, путем модификации использования кодонов. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, с целью повышения или снижения ее экспрессии в клетке-хозяине. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фосфолипазу, которые модифицированы с целью повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, к модифицированным, таким образом, ферментам с фосфолипазной активностью и к способам создания модифицированных фосфолипазных ферментов. Настоящий способ включает в себя идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, и замену одного или нескольких непредпочтительных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим ту же самую кислоту, что и замененный кодон, и по меньшей мере один непредпочтительный или менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте заменяют предпочтительным кодоном, кодирующим ту же самую аминокислоту. Предпочтительный кодон представляет собой кодон, который широко представлен в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный кодон или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, который мало представлен в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина.
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих кассет и векторов согласно изобретению, включают в себя клетки бактерий, дрожжей, грибов, растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам оптимизации использования кодонов во всех указанных клетках, к нуклеиновым кислотам с измененными кодонами и к полипептидам, получаемым на основе таких нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Примерами клеток-хозяев являются клетки грамотрицательных бактерий, таких как ЕксЬепсЫа со11; грамположительных бактерий, таких как ВасШик (например, В. сегеик) или 8!гер!отусек, Ьас!оЬасШик даккеР, Ьас!ососсик 1асРк, Ьас!ососсик сгетоРк, ВасШик киЫШк. Примерами клеток-хозяев также являются эукариотические организмы, например различные дрожжи, такие как 8ассЬаготусек кр., включая 8ассЬаготусек се1^1к1ае, 8сЫхокассНаготусек ротЬе, РюЫа ракгоЬк и КЫууеготусек 1асРк, Напкепи1а ро1утогрЬа, АкрегдШик Ыдег, и клетки и клеточные линии млекопитающих и клетки и клеточные линии насекомых. Таким образом, настоящее изобретение также включает в себя нуклеиновые кислоты и полипептиды, оптимизированные для экспрессии в таких организмах и видах.
- 57 015591
Например, кодоны нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфолипазу, выделенной из бактериальной клетки, модифицируют таким образом, что нуклеиновая кислота оптимально экспрессируется в бактериальной клетке, отличной от той бактерии, из которой данная фосфолипаза была получена, в клетках дрожжей, грибов, растительной клетке, клетке насекомого или клетке млекопитающего. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 5795737; Васа (2000) Ш 1. Рагакйо1., 30: 113-118; На1е (1998) Рго1ет Ехрг. РцпГ., 12: 185-188; Nа^ит (2001) Шей. Штип., 69: 7250-7253. Также смотри публикацию ^гит (2001) Шей. Штип., 69: 7250-7253, описывающую оптимизацию кодонов в системах мышей, публикацию 0и1сНкоигоу (2002) Рго1еш Ехрг. РипТ, 24: 18-24, описывающую оптимизацию кодонов в дрожжах, публикацию Репд (2000) ВюскетШгу, 39: 1539915409, описывающую оптимизацию кодонов в Е. со11, публикацию НитрЬгеук (2000) Рго1ет Ехрг. РцпГ., 20: 252-264, описывающую оптимизированное использование кодонов, которое влияет на секрецию у Е. со11.
Трансгенные животные, отличные от человека
Настоящее изобретение относится к трансгенным животным, отличным от человека, которые имеют нуклеиновую кислоту, полипептид, экспрессирующую кассету или вектор или трансфицированную или трансформированную клетку согласно изобретению. Трансгенными животными, отличными от человека, могут быть, например, козы, кролики, овцы, свиньи, коровы, крысы и мыши, имеющие нуклеиновые кислоты согласно изобретению. Такие животные могут быть использованы, например, в качестве моделей ш у1уо для изучения фосфолипазной активности или в качестве моделей для скрининга модуляторов фосфолипазной активности ш у1уо. Кодирующие последовательности для полипептидов, подлежащих экспрессии в трансгенных животных, отличных от человека, могут быть сконструированы в виде конститутивных или находящихся под контролем тканеспецифичных, специфичных для стадий развития или индуцируемых факторов регуляции транскрипции. Трансгенные животные, отличные от человека, могут быть сконструированы и созданы с использованием любого способа, известного в данной области, смотри, например, патенты США №№ 6211428, 6187992, 6156952, 6118044, 6111166, 6107541, 5959171, 5922854, 5892070, 5880327, 5891698, 5639940, 5573933, 5387742, 5087571, описывающие получение и применение трансформированных клеток и яйцеклеток и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и коров. Смотри также публикацию Ро11оск (1999) 1. Штипок МеЛобк, 231: 147-157, в которой описано получение рекомбинантных белков в молоке трансгенных молочных животных; публикацию Вадшк1 (1999) N31. ВШесЬпо1., 17; 456-461, демонстрирующую получение трансгенных коз. В патенте США № 6211428 описано получение и использование трансгенных животных, отличных от человека, которые экспрессируют в своем головном мозге конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность ДНК. Патент США № 5387742 описывает инъецирование клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мыши, имплантацию инъецированных яйцеклеток псведобеременным самкам и выращивание до определенного срока трансгенных мышей, клетки которых экспрессируют белки, родственные белкам, обнаруженным при патологии, связанной с болезнью Альцгеймера. В патенте США № 6187992 описано получение и применение трансгенной мыши, геном которой содержит нарушение в гене, кодирующий белокпредшественник амилоида (ΑΡΡ).
Нокаутированных животных также можно использовать для практического осуществления настоящего изобретения. Например, в одном аспекте трансгенные или модифицированные животные согласно изобретению представляют собой нокаутированных животных, например нокаутированную мышь, полученную генно-инженерными способами, так что она не экспрессирует или не способна экспрессировать фосфолипазу.
Трансгенные растения и семена
Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям и семенам, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид (например, фосфолипазу), экспрессирующую кассету или вектор или трансфицированную или трансформированную клетку согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к растительным продуктам, например к маслам, семенам, листьям, экстрактам и т.п., содержащим нуклеиновую кислоту и/или полипептид (например, фосфолипазу) согласно изобретению. Трансгенное растение может быть двудольным или однодольным. Настоящее изобретение также относится к способам получения и применения указанных трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или растительная клетка, экспрессирующие полипептид согласно изобретению, могут быть сконструированы любым способом, известным в данной области. Смотри, например, патент США № 6309872.
Нуклеиновые кислоты и экспрессирующие конструкции согласно изобретению могут быть введены в растительную клетку любым способом. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут быть введены в геном требуемого растения-хозяина или нуклеиновые кислоты или экспрессирующие кассеты могут представлять собой эписомы. Введение в геном требуемого растения может осуществляться таким образом, что образование фосфолипазы в организме хозяина будет регулироваться эндогенными элементами регуляции транскрипции или трансляции. Изобретение также относится к нокаутированным растениям, в которых встраивание генной последовательности, например, путем гомологичной рекомбинации нарушает экспрессию эндогенного гена. Способы создания нокаутирован
- 58 015591 ного растения известны в данной области, смотри, например, 8!герр (1998) Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 95: 4368-4373; Μίηο (1995) Р1ап! I., 7: 359-365. Ниже приведено обсуждение, касающееся трансгенных растений.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть использованы для придания желательных признаков, по существу, любому растению, например растениям, имеющим масличные семена, например семена риса, сои, рапса, подсолнечника, кунжута и арахиса. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть использованы для воздействия на метаболические пути растения с целью оптимизации или изменения экспрессии фосфолипазы у хозяина. При этом может достигаться изменение активности фосфолипазы в растении. Альтернативно, фосфолипазу согласно изобретению можно использовать для получения трансгенного растения, способного продуцировать соединение, которое в естественных условиях данное растение не продуцирует. Такой подход может приводить к снижению стоимости продукции или к созданию нового продукта.
В одном аспекте первая стадия в способе получения трансгенного растения включает в себя создание экспрессирующей конструкции для экспрессии в растительной клетке. Такие методики хорошо известны в данной области. Они могут включать в себя отбор и клонирование промотора, кодирующей последовательности для облегчения эффективного связывания рибосом с мРНК и отбор соответствующих последовательностей терминаторов генов. Одним из примеров конститутивных промоторов является Са№У358 из вируса мозаики цветной капусты, который в основном приводит к достижению высокого уровня экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и реагируют на ключевые изменения во внутреннем и внешнем окружении растения. Примером индуцируемого светом промотора является промотор гена саЬ, кодирующего главный белок связывания хлорофилла а/Ь.
В одном аспекте нуклеиновую кислоту модифицируют для достижения более высокого уровня экспрессии в растительной клетке. Например, последовательность согласно изобретению вероятно будет иметь более высокий процент нуклеотидных пар А-Т по сравнению с обычным содержанием пар А-Т в растении, некоторые из которых предпочтительно содержат пары нуклеотидов Г -Ц. Поэтому нуклеотиды А-Т в кодирующей последовательности могут быть заменены нуклеотидами Г -Ц без существенного изменения аминокислотной последовательности с целью повышения уровня образования генного продукта в растительных клетках.
К генной конструкции могут быть добавлены селектируемые маркеры для идентификации растительных клеток или тканей, в которых успешно интегрирован трансген. Такой селектируемый маркер может быть необходим в связи с тем, что достижение внедрения и экспрессии генов в растительных клетках представляет собой редкое явление, встречающееся лишь в нескольких процентах целевых тканей или клеток. Используемые для селекции маркерные гены кодируют белки, придающие устойчивость к средствам, которые в норме токсичны для растений, таким как антибиотики или гербициды. Только растительные клетки, в которых интегрирован селектируемый маркерный ген, будут выживать при выращивании в среде, содержащей соответствующий антибиотик или гербицид. Как и другие встраиваемые гены, маркерные гены также требуют наличия промоторов и терминирующих последовательностей для правильного функционирования.
В одном аспекте получение трансгенных растений и семян включает в себя введение последовательности согласно изобретению и необязательно маркерных генов в конструкцию для целенаправленной экспрессии (например, в плазмиду) в сочетании с размещением в ней промотора и последовательностей терминаторов. Указанный подход может включать в себя перенос модифицированного гена в растение подходящим способом. Например, конструкция может быть введена непосредственно в геномную ДНК растительной клетки с использованием таких способов, как электропорация и микроинъекция протопластов растительной клетки, или конструкции могут быть введены непосредственно в растительную ткань с использованием баллистических методов, таких как бомбардировка ДНК-частицами. Смотри, например публикации СЫтк!ои (1997) Р1ап! Μο1. Βίο1., 35: 197-203; Ра\\1о\\'кк| (1996) Μο1. Вю!есЬпо1., 6: 17-30; Шет (1987) Шипе, 327: 70-73; Такит1 (1997) Сепек Сепе!. 8ук!., 72: 63-69; в которых обсуждается применение бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшеницу; и публикацию Абат (1997), указанную выше, в которой обсуждается применение бомбардировки частицами для введения ΥАС в растительные клетки. Например, Втейат! (1997) (смотри выше) применял бомбардировку частицами для получения трансгенных растений хлопка. Устройства для ускорения частиц описаны в патенте США № 5015580, и устройство для ускорения частиц РИ8-2000 коммерчески доступно от компании ВюВаб (Βίοйкбск); смотри также патент США № 5608148, 1ойп, и патент США № 5681730, ЕШк, в которых описана опосредованная частицами трансформация голосеменных растений.
В одном аспекте протопласты могут быть иммобилизованы и инъецированы нуклеиновыми кислотами, например экспрессирующей конструкцией. Хотя в случае злаковых растений нелегко достичь регенерации растений из протопластов, такая регенерация растений возможна для бобовых при использовании соматического эмбриогенеза на основе каллусов, полученных из протопластов. Организованные ткани могут быть трансформированы голой ДНК с использованием генной пушки, когда ДНК наносят на вольфрамовые микроснаряды, достигающие 1/100 части от размера клеток, которые приносят ДНК глубоко в клетки и органеллы. Трансформированную ткань затем индуцируют к регенерации, обычно
- 59 015591 путем соматического эмбриогенеза. Указанная методика оказалась успешной в случае некоторых видах злаковых, включая кукурузу и рис.
Нуклеиновые кислоты, например экспрессирующие конструкции, могут быть также введены в растительные клетки с использованием рекомбинантных вирусов. Растительные клетки могут быть трансформированы с использованием вирусных векторов, таких как векторы, полученные на основе вируса. табачной мозаики (Яоитепйа1 (1997) Р1ап! Μо1. Вю1., 33: 989-999), смотри также Ройа (1996) Ихе оГ хйа1 герксопх Гог 111е ехртеххюп о£ депех шр1ап1х, Μо1. Вю1есйпо1., 5: 209-221.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например экспрессирующую конструкцию, можно объединять с соответствующими фланкирующими областями Т-ДНК и вводить в традиционный векторный организм АдтоЬас1епит 1итеГас1епх. Функции вирулентности хозяина АдтоЬас1епит 1итеГас1епх будут направлять вставку конструкции и близлежащего маркера в ДНК растительной клетки при инфицировании клетки бактериями. Способы трансформации, опосредованной АдтоЬас1епит ШтеГааепх, включая обезоруживание и использование бинарных векторов, хорошо описаны в научной литературе. Смотри, например, ΗθγχοΗ (1984) 8с1епсе, 233: 496-498; Ега1еу (1983) Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А, 80: 4803 (1983); Сепе ТгапхГег !о Р1ап!х, Ройуких, ей. (8ргтдег-Уег1ад, Вег1т 1995). В клетке А. ШтеГааепх ДНК содержится в составе бактериальной хромосомы, а также в другой структуре, известной как Т1-плазмида (индуцирующая опухоли плазмида). Т1-плазмида содержит участок ДНК, называемой Т-ДНК (длиной ~20 т.п.н.), которая переносится в растительную клетку в процессе инфекции, и серию генов νίτ (вирулентности), которые управляют процессом инфекции. А. ШтеГааепх может инфицировать растение только через раны: когда корень или стебель растения повреждены, такое растение испускает определенные химические сигналы, в ответ на которые гены νίτ А. ШтеГааепх активируются и запускают цепь событий, необходимых для переноса Т-ДНК от Т1-плазмиды в хромосому растения. Затем Т-ДНК поступает в растительную клетку через рану. Одна из гипотез заключается в том, что Т-ДНК ждет, пока ДНК растения будет реплицироваться или транскрибироваться, и затем вводит себя в такую открытую для воздействия растительную ДНК. Для использования А. ШтеГааепх в качестве трансгенного вектора индуцирующий опухоли участок Т-ДНК необходимо удалить, сохраняя при этом области границ Т-ДНК и νίτ-гены. Затем трансген встраивают между областями границ Т-ДНК и в таком виде он переносится в растительную клетку и интегрируется в хромосомы растения.
Настоящее изобретение относится к трансформации однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот согласно изобретению, включая трансформацию важных видов злаковых культур, смотри Ше1 (1997) Р1ап! Μо1. Вю1., 35: 205-218). Также смотри публикации ΗθγχοΗ, 8с1епсе (1984) 233: 496; Ега1еу (1983) Ргос. №111. Асай. 8ск И8А, 80: 4803; Т1шк)аег (1997), выше; Рагк (1996) Р1ап Μо1. Вю1., 32: 1135-1148, в которых обсуждается интеграция Т-ДНК в геномную ДНК. Также смотри патент США № 5712135 фИаЛит), в котором описан способ стабильной интеграции ДНК, содержащей ген, который является функциональным в клетке злакового или другого однодольного растения.
В одном аспекте третья стадия может включать в себя селекцию и регенерацию целых растений, способных к передаче включенного гена-мишени следующему поколению. Такие методики регенерации основаны на обработках некоторыми фитогормонами, добавляемых в среду роста культуры ткани, обычно основанных на биоцидном и/или гербицидном маркере, который вводят вместе с требуемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивируемых протопластов описана в Ενаηх е! а1., Рго1ор1ах1х [хо1аНоп апй СиИше, ШпйЬоок оГ Р1ап1 Се11 СиНиге, р. 124-176, ΜасΜ^11^1аη РиЬИхНхпд Сотрапу, №\ν Уогк, 1983; и Вхпйшд Яедепегайоп оГ Р1ап1х, Р1ап! Рго1ор1ах(х, р. 21-73, СЯС Ргехх, Воса Яа!оп, 1985. Регенерация также может быть достигнута на основе растительных каллусов, эксплантатов, органов или их частей. Такие методики регенерации в общем описаны в К1ее (1987) Апп. Яеν. оГ Р1ап! Рйух., 38: 467-486). Для получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, указанные ткани можно выращивать в контролируемых условиях среды с использованием серии сред, содержащих питательные вещества и гормоны, т. е. способом, известным как культивирование тканей. После образования целых растений и получения семян начинают оценку потомства.
После стабильного включения экспрессирующей кассеты в трансгенные растения указанная экспрессирующая кассета может быть введена в другие растения посредством полового скрещивания. Можно использовать любую из множества стандартных методик разведения в зависимости от вида, подлежащего такому скрещиванию. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот согласно изобретению приводит к фенотипическим изменениям, то растения, содержащие рекомбинантные нуклеиновые кислоты согласно изобретению, могут быть скрещены половым путем со вторым растением с получением конечного продукта. Таким образом, семена согласно изобретению могут быть получены в результате скрещивания между двумя трансгенными растениями согласно изобретению или скрещивания между растением согласно изобретению и другим растением. Желательные эффекты (например, экспрессия полипептидов согласно изобретению с образованием растения, в котором изменены характеристики цветения) могут быть усилены в том случае, если оба исходных растения экспрессируют полипептиды (например, фосфолипазу) согласно изобретению. Желательные эффекты могут быть переданы будущим поколениям растения с использованием стандартных методик размножения.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды согласно изобретению экспрессируют или встраивают в лю
- 60 015591 бое растение или семя. Трансгенные растения согласно изобретению могут представлять собой двудольные или однодольные растения. Примерами однодольных трансгенных растений согласно изобретению являются травянистые растения, такие как мятлик луговой (голубая трава Роа), кормовые травы, такие как овсяница, райграс, озимые травы, такие как Адгокйк, и злаковые, такие как пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и кукуруза. Примерами двудольных трансгенных растений согласно изобретению являются табак, бобовые, такие как люпин, картофель, сахарная свекла, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Вгаккюасеае), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельный организм АгаЬ1борк1к ШаПапа. Таким образом, трансгенные растения и семена согласно изобретению охватывают широкий диапазон растений, включая без ограничения виды родов Апасагбшт, АгасЫк, Акрагаднк, А1гора, Ауепа, Вгаккюа, Сйгик, Сйги11ик, Саркюит, Саййатик, Сосок, СоГГеа. Сисит1к, СисигЬйа, Эаисик, Е1ае1к, Егадапа, С1усте, Соккуршт, НеНапШик, Не!егосаШк, Ногбеит, Нуоксуатик, Ьас!иса, Ьтит, Ьо1шт, Ьиртик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МапШо!, Ма_)огапа, Мебюадо, Мсобапа, О1еа, Огу/а, Ратеит, Раптке!ит, Регкеа, Рйакео1ик, Р1к1асЫа, Р1кит, Ругик, Ргипик, Карйапик, Кютик, 8еса1е, 8епесю, 8тар1к, 8о1апит, 8огдйит, ТйеоЬготик, Тпдопе11а, Тгйюит, Ую1а, У1бк, Уадпа и 2еа.
В альтернативных вариантах нуклеиновые кислоты согласно изобретению экспрессируются в растениях (например, в трансгенных растениях), таких как масличные растения, например рис, соя, рапс, подсолнечник, кунжут и арахис. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть экспрессированы в растениях, которые содержат клетки волокон, включая, например, хлопок, хлопковое дерево (Карок, Се1Ьа реп!апбга), иву пустынную, креозотный кустарник, терескен шерстистый, бальзу, рами, кенаф, розеллу, джут, абаку сизалевую и лен. В альтернативных вариантах трансгенные растения согласно изобретению могут быть представителями рода Соккуршт, включая представителей любого вида Соккуршт, например С. агЬогеит, С. йегЬасеит, С. ЬагЬабепке и С. Ыгкийнп.
Настоящее изобретение также относится к трансгенным растениям, используемым для получения больших количеств полипептидов (например, фосфолипазы или антитела) согласно изобретению. Например, смотри Ра1тдгеп (1997) Тгепбк. Сепе!., 13: 348; Сйопд (1997) Тгапкдешс Кек., 6: 289-296 (описано получение белка молока человека бета-казеина в трансгенных растениях картофеля с использованием индуцируемого ауксином двунаправленного промотора маннопинсинтазы (так1',2') в результате применения способа трансформации листового диска, опосредованной АдгоЬас!егшт 1итеГас1епк).
С использованием известных способов специалист в данной области может провести скрининг растений согласно изобретению, выявляя повышение или снижение уровня трансгенной мРНК или белка в трансгенных растениях. Способы выявления и количественного определения мРНК или белков хорошо известны в данной области.
Полипептиды и пептиды
Настоящее изобретение относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, имеющим идентичность последовательности (например по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полную (100%) идентичность последовательности) с типичной последовательностью согласно изобретению, например последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 175 или 8Е0 ΙΌ N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\\, Е41Е, Е41У, Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, О171Е, М176\, О230Н, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, О234С, Ό234Κ, Ό234Κ или О265К Как обсуждалось выше, идентичность может быть по всей длине полипептида или идентичность может быть на протяжении его подпоследовательности, например области длиной по меньшей мере примерно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков. Полипептиды согласно изобретению также могут быть более короткими, чем полноразмерные типичные полипептиды. В альтернативном варианте изобретение относится к полипептидам (пептидам, фрагментам) в диапазоне примерно от 5 остатков до полной длины полипептида, например фермента, такого как фосфолипаза; типичные размеры составляют примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 или более остатков, например следующих друг за другом остатков типичной фосфолипазы. Пептиды согласно изобретению могут быть применимы, например, в качестве зондов для мечения, антигенов, толерагенов, мотивов, активных центров фосфолипазы, доменов связывания, регуляторных доменов и тому подобного.
В одном аспекте полипептид обладает фосфолипазной активностью, т.е. способностью расщеплять сложноэфирную связь глицерофосфата, способностью гидролизовать фосфатные сложноэфирные связи, включая активность пататина, липидацилгидролазы (ЬАН), фосфолипазы А, В, С и/или фосфолипазы Ό или любым другим сочетанием активностей.
В альтернативных аспектах типичные полипептиды согласно изобретению обладают фосфолипазной активностью, имеют определенное положение сигнальной последовательности и исходный источник, которые указаны в следующей ниже табл. 1. В качестве пояснения к таблице приведен пример записи в первой строке, где 8ЕО ΙΌ N0: 143, 144 означает полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в виде 8ЕО ΙΌ N0: 144 и кодируется, например, последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 143, имеющий РЬА-специфичную активность РЬА, исходно выделенный из неизвестного источника; другим
- 61 015591 примером является строка 8ЕЦ ΙΌ N0: 167, 168, где запись 167, 168 означает полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 168 и кодируется, например, последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 167, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, имеющий сигнальную последовательность от 1 до 30 остатка (АА1-30 означает аминокислотные остатки с 1 до 30 и т.д.), т.е. ΜΛВ8\VI<\VВР^^88Ε^^V8^ΛРΕ8Т8VРС'ΈI<. и исходно выделенный из неизвестного источника. Изобретение также относится к пептидам, содержащим сигнальные последовательности, и химерным полипептидам, при этом пептиды или химеры содержат сигнальные последовательности, которые указаны в табл. 1 и которые описаны ниже
- 62 015591
Таблица 1
Положение
5ΕΏ ΙΡ N0: Тип Феомента сигнальной последовательности (а/к = аминокислота) Сигнал (АД) Источник
143,
144 РАгСлецифичная РЬА Неизвестный
25, 26 Пататин Неизвестный
77, 78 Пататин Неизвестный
35, 36 Пататим Неизвестный
125,
126 Пататин Неизвестный
135,
136 Пататин Неизвестный
99,
100 Пататин Неизвестный
65, 66 Пататин Неизвестный
87, 83 Пататин Неизвестный
86, 87 Пататин Неизвестный
45, 46 Пататин Неизвестный
59,66 Пататин Неизвестный
13,14 Пататин Неизвестный
71,72 Пататин Неизвестный
55, 56 Пататин Неизвестный
33, 34 Пататин Неизвестный
91,92 Пататда Неизвестный
103,
104 Пататин Неизвестный
11, 12 Пататин Неизвестный
17, 18 Пататин Неизвестный
95, 96 Пататин Неизвестный
43, 44 Пататин Неизвестный
27+ 28 Пататин Неизвестный
131,
132 Пататин Неизвестный
127,
128 Пататин Неизвестный
133,
134 Пататин Неизвестный
137,
138 Пататин Неизвестный
165,
166 Пататин Неизвестный
167, Фосфатазы
168 фосфатидной кислоты АА1-30 МАЕЗИК1/УЕРи.38Р1ЕУ81АРР5ТЗУРСЕК Неизвестный
- 63 015591
169, Фосфатазы
170 фосфатидной кислоты Неизвестный
171, Фосфатазы
172 фосфатидной кислоты Неизвестный
173, Фосфатазы
174 фосфатидной кислоты Неизвестный
111, РкС
112 фосфатидил инозитол
а АА1-16 М6АСА1ккТОАРТА5А Бактерии
107, РЮ
юе фосфатидилинозитола АА1-23 М8МККР1кКкР1С5Т1к5ТЕУЕА Неизвестный
109, РЮ
110 фосфатидилинозитола АА1-23 Μ5ΝΚΚΕΙίΚ£ΡΙΟ5ΤΙ181 ЕУЕА Неизвестный
113, РЮ
114 фосфатидилинозитола АА1-23 М5ЖКЕ1кК1_Е1С5Т1к81 ΕΫΕΑ Неизвестный
117, РЮ
118 фосфатидилинозитола АА1-23 ΜΝΝΚΚΕ1Ι_ΚΙ_ΕΙ05Μνί&ΑΕ\/ΕΑ Неизвестный
119, РЮ
120 фосфатидилинозитола АА1-23 ΜΝΝΚΚΕΙίΚίΕΙΟδΜνίΕΑΕνΡΑ Неизвестный
115, РЮ
116 фосфатидилинозитола АА1-23 ΜΝ ЫККР1кКкЕ1С5 М\Л_5АЕУЕ Α Неизвестный
121, РЮ
122 фосфатидилинозитола АА1-23 МНЖКГ1кКкк1С£>ТУк8ПТУЕА Неизвестный
141,
142 Фосфолипаза Неизвестный
155, ΜΡΤΤΤΤΝννΡ(3ΐνΚ8[_ΚΙ_Ε|_Μ(31.ΟΙ-ΕΙ8Α8ΕΑ8
156 Фосфолипаза АА1-35 8ΑΥΑ Неизвестный
159,
160 Фосфолипаза Неизвестный
145,
146 Р1А Неизвестный
147,
148 Р1_А Неизвестный
149,
150 РкА Неизвестный
151,
152 РкА Неизвестный
153,
154 РкА Неизвестный
157.
158 НА Неизвестный
163,
164 РкА Неизвестный
101, к8кУА8кНРАРСААкАкАкАААТкАУТАабАТ
102 РЮ АА1-39 ΑΑΡΑΑΑΑΑ Бактерии
1,2 РЮ АА1-24 ΜΚΚΚνίΑΙΑΑΜνΑΙΑΑΡ\/αδννΕΑα Неизвестным
3.4 РЮ АА1-24 ΜΚΗΚΙίΑ!Α3νΐΑΙ-ΓΑΡΙ0ε\/ΑΕΑΗ Неизвестный
5,6 РЮ АА1-24 ΜΚΡΚΙΙ-ΑΙΑενίΑΙΤΑΡίαενΑΕΑΗ Неизвестный
97, 98 РЮ АА1-25 ΜΚΡΚίϋΓννΑΐνΤΑίΑ38ΤΑνΐΡΤΑΑΕ Неизвестный
λβ РЮ АА1-29 М1Тк1ККСккУкТМТкккСУЕУРЮР8НАТ Неизвестный
31,32 РЮ АА1-20 МКККкСТ\Л/А1-7ТА1836\,УА1 Неизвестный
81, 62 РЮ АА1-25 МКККкСТМАкУТАГЗеСУУПРТЕАО Неизвестный
- 64 015591
93, 94 РЬС АА1-29 МТЫККСЬЬ УЬТМТЬЬЗСУР/Р ЬО Р8 ΥΑΤ Неизвестный
89, 90 РЬС АА1-25 МКККЬСТЬАЕУТА1351А1Т1РТЕАС1 Неизвестный
123,
124 РЬС АА1-24 МКККУЬАЬААМУАЬААРУС15УУГА Неизвестный
129,
130 РЬС АА1-27 МККК1СТЬАЬ\/ЗА1Т8С\А/Т1РТУА8А Неизвестный
139,
140 РЬС АА1-20 МК1КРЬТЕЗГСЬАУТЗЗ 70А Неизвестный
105,
105 РЬС АА1-30 ММРСРМЗЬМЬ0ЬЯАУТУААЬ\ЛА/А55АА1АУ^ Неизвестный
9,10 РЬС АА1-20 МКЬЬРУЕУСУЕАЬЬЗАНЗКАО Неизвестный
47,48 РЬО Неизвестный
15. 16 РЬО Неизвестный
41,42 РЬО Неизвестный
23, 24 РЬО Неизвестный
51,52 РЬО Неизвестный
53,54 РЬО Неизвестный
19,20 РЬО АА1-19 МККГПАЪАЬЬМР ЕвААЗАО Неизвестный
75,76 РЬО Неизвестный
57, 58 РЬО Неизвестный
63,64 РЬО АА1-18 МКМТЫЬАеСГЬААРДУАО Неизвестный
79,80 РЬО АА1-23 МгаЧЕ5К6ЬТ51 ЬЬ51АТЗТ8АМАЕ Неизвестный
37, 38 РЬО АА1-23 МРКЕ8К6ЬТ81ЬЬе1АТЗТ5АМАЕ Неизвестный
61, 62 РЬО АА1-21 МТЬКЬ5ША5Ь$АУ5РАУ1АМ Неизвестный
07,68 РЬО Νο Неизвестный
83. 84 РЬО АА1-21 ΜΚΚΐνΐΥ3ΕνΑ0νΜΤ8βΌνΓΑΑ Неизвестный
49, 50 РЬО АА1-23 ММГВДЕЬЬЗИЬРМОУСУАНАОРО Неизвестный
39,40 РЬО Неизвестный
73, 74 РЬО Неизвестный
29, 30 РЬО Неизвестный
21,22 РЬО АА1-28 мсю нкьгач ΕΝ ксьтс ууьзуьтзтзам АГ Неизвестный
71,72 РЬО Неизвестный
161,
162 РЬО АА1-24 МКККЬЬ5ЬСЬ6АТ5С1АЬ5ЬР\/НА Неизвестный
В одном аспекте изобретение относится к полипептидам, имеющим последовательности, которые указаны в 8ЕЦ ΙΌ N0: 175 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 176, имеющие одну или несколько мутаций Е41А, Е41\, Е41Е, Ε41Υ, Е41В, Е94В, Ό100Ό, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100\, А104Ь, Ό111Β, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, О230В, Ό234\, Ό234ν, Ό2340, О234В, О234К или 0265В и их подпоследовательности, например их активные участки (каталитические домены), обладающие фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы С (РЬС). В одном аспекте полипептид обладает фосфолипазной активностью, но не проявляет активности при гидролизе нейтральных масел (триглицеридов). Например, в одном аспекте полипептид обладает фосфолипазной активностью, но не имеет активности, которая влияет на нейтральную фракцию масла (триглицериды). В одном аспекте изобретение относится к способу дегуммирования, включающему в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности.
Полипептиды и пептиды согласно изобретению могут быть выделены из природных источников, могут представлять собой синтетические или полученные рекомбинантно полипептиды. Пептиды и белки могут быть экспрессированы рекомбинантно ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό. Пептиды и полипептиды согласно изобретению могут быть получены и выделены с использованием любого известного в данной области способа. Полипептиды и пептиды согласно изобретению могут быть также синтезированы, полностью или частично, с использованием химических способов, известных в данной области. Смотри, например, СагиШегк (1980) N^1010 Ас1йк Век. 8утр. 8ег., 215-223; Нот (1980) N^1010 Ас1йк Рек. 8утр. 8ег., 225232; Вапда А.К., ТЬегареийс Рерййек апй Рго!етк, Рогти1айоп, Ргосекктд апй Ое1Ьегу 8ук1етк (1995) ТесЬпотю РиЬЬкЫпд Со., Ьапсак!ег, РА. Например, синтез пептидов может быть осуществлен с использованием различных методик твердофазного синтеза (смотри, например, ВоЬегде (1995) 8с1епсе, 269: 292; Μ0γπΠ0Η (1997) [Не^тойк Епхуто1. 289: 3-13, может быть проведен автоматизированный синтез с использованием синтезатора пептидов АΒI 431А (Регкт Е1тег) в соответствии с инструкциями производителя.
Пептиды и полипептиды согласно изобретению также могут быть гликозилированы. Гликозилирование может быть осуществлено после трансляции либо химически, либо с помощью клеточных механизмов биосинтеза, при этом последние включат использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для данной последовательности или могут быть добавлены в виде пептида или введены в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может быть осуществлено через 0-связь или №связь.
- 65 015591
Пептиды и полипептиды согласно изобретению, определенные выше, включают все миметические и пептидомиметические формы. Термины миметик или пептидомиметик относятся к полученному путем синтеза химическому соединению, которое обладает, по существу, теми же структурными и/или функциональными свойствами, что и полипептиды согласно изобретению. Миметик может либо полностью состоять из неприродных синтетических аналогов аминокислот, либо представлять собой химерную молекулу, включающую в себя частично природные пептидные аминокислоты и частично неприродные аналоги аминокислот. Миметик может также включать в себя любое количество консервативных замен природных аминокислот, при условии, что такие замены не вызывают существенного изменения в структуре и/или активности миметика. Как и в случае полипептидов согласно изобретению, которые являются консервативными вариантами, в результате обычных экспериментов можно определить, входит ли данный миметик в объем настоящего изобретения, т.е. показать, что его структура и/или функция существенно не были изменены. Таким образом, в одном аспекте композиция миметика входит в объем настоящего изобретения, если она обладает фосфолипазной активностью.
Композиции полипептидных миметиков согласно изобретению могут содержать любое сочетание неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте композиции миметиков согласно изобретению включают в себя одну или все из указанных ниже трех структурных групп: (а) группы, выполняющие функции связывания остатков, отличного от природной амидной связи (пептидной связи); (Ь) неприродные остатки, заменяющие встречающиеся в природе аминокислотные остатки; или (с) остатки, которые индуцируют вторичную структурную мимикрию, т. е. индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например бета-виток, гамма-виток, бета-слой, конформацию альфа-спирали и т.п. Например, полипептид согласно изобретению можно охарактеризовать как миметик, когда все или некоторые из входящих в него остатков соединены химическим способом, отличным от природных пептидных связей. Отдельные остатки пептидомиметика могут быть связаны пептидными связями, другими химическими связями или с помощью сопряжений, таких как, например, с использованием глютаральдегида, сложных Ν-гидроксисукцинимидных эфиров, бифункциональных малеимидов, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (ЭСС) или Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (Э1С). Связывающие группы, которые могут представлять собой альтернативу традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(=О)-СН2- для -С(=О)-ХН-), аминометилен (СН2-ХН), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-О), тиоэфир (СН2-8), тетразол (СН4-), триазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (смотри, например, 8ра!о1а (1983) в руководстве Сйетщйу апй ВюсйетМгу ок Атто Ас1йк, Рерййек апй Рго1ешк, νо1. 7, р. 267-357, Рерййе ВаскЬопе МойШсайоп, Магсе11 Эеккег, ΝΥ).
Полипептид согласно изобретению также может охарактеризовать как миметик в случае содержания в нем всех или некоторых неприродных остатков вместо встречающихся в природе аминокислотных остатков. Неприродные остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе; несколько иллюстративных неприродных композиций, используемых в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и рекомендации по их использованию приведены в описании ниже. Миметики ароматических кислот могут быть получены при замещении, например, Ό- или Ь-нафтилаланином; Ό- или Ьфенилглицином; Ό- или Ь-2-тиенилаланином; Ό- или Ь-1, -2, 3- или 4-пиренилаланином; Ό- или Ь-3тиенилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(3-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; Э-(трифторметил)фенилглицином; Ό(трифторметил)фенилаланином; Ό-п-фторфенилаланином; Ό- или Ь-п-бифенилфенилаланином; Ό- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином, Ό- или Ь-2-индол(алкил)аланинами или Ό- или Ь-алкилаланинами, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изобутил, изопентил или некислую аминокислоту. Ароматические циклы неприродных аминокислот включают, например, тиазолильные, тиофенильные, пиразолильные, бензимидазолильные, нафтильные, фуранильные, пирролильные и пиридильные ароматические циклы.
Миметики кислых аминокислот могут быть получены при замене, например, некарбоксилированными аминокислотами при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланином, сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) могут быть также избирательно модифицированы при взаимодействии с карбодиимидами (В'-Ы-С-Н-В'), такими как, например, 1-циклогексил-3 -(2-морфолинил-(4-этил))карбодиимид или 1 -этил-3 -(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил могут быть также превращены в остатки аспарагинила и глутаминила при взаимодействии с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут быть получены путем замены, например, (дополнительно к лизину и аргинину) аминокислотами орнитином, цитрулином или (гуанидино)уксусной кислотой или (гуанидино)алкилуксусной кислотой, где алкил имеет значение, определенное выше. Нитрильные производные (например, содержащие С№группу вместо СООН) могут быть использованы для замены аспарагина или глутамина. Остатки аспарагинила или глутаминила могут быть подвергнуты дезаминированию до соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики остатка аргинина могут быть получены в результате взаимодействия аргинила, например, с одним или несколькими обычными реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2циклогександион или нингидрин, предпочтительно в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина могут быть получены при взаимодействии тирозила, например, с ароматическими соединениями диазо- 66 015591 ния или тетранитрометаном. ^ацетилимидазол и тетранитрометан могут быть использованы для образования О-ацетилтирозильных видов и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики остатка цистеина могут быть получены в результате взаимодействия остатков цистеинила, например, с альфагалогенацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующими аминами, с получением карбоксиметильных и карбоксиамидометильных производных. Миметики остатка цистеина могут быть получены посредством взаимодействия остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидозоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, ^алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркурибензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина могут быть получены (при этом могут быть изменены аминоконцевые остатки) в результате взаимодействия лизинила, например, с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислоты. Миметики лизина и других альфа-аминосодержащих остатков могут быть получены в результате взаимодействия со сложными имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и в реакциях с глиоксилатом, катализируемых трансамидазой. Миметики метионина могут быть получены в результате взаимодействия, например, с метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3-диметилпролин. Миметики остатка гистидина могут быть получены в результате взаимодействия гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или пара-бромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, миметики, получаемые при гидроксилировании пролина и лизина; при фосфорилировании гидроксильных групп остатков серила или треонила; при метилировании альфааминогрупп лизина, аргинина и гистидина; при ацетилировании №концевого амина; при метилировании амидных остатков в основой цепи или при замене их №метиламинокислотами или при амидировании С-концевых карбоксильных групп.
Остаток, например, аминокислоты в полипептиде согласно изобретению может быть также заменен аминокислотой (или остатком пептидомиметика) противоположной хиральности. Таким образом, любая аминокислота, встречающаяся в природе в виде Ь-конфигурации (которые также обозначаются как К- или 8-конфигурации в зависимости от структуры химического соединения), может быть заменена аминокислотой с таким же типом химической структуры или пептидомиметиком, но противоположной хиральности, называемой Ό-аминокислотой, которые также могут быть названы К- или 8-формой.
Настоящее изобретение также относится к способам модификации полипептидов согласно изобретению, осуществляемым либо в ходе природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.п.), либо путем химической модификации, и к полученным модифицированным полипептидам. Модификация может иметь место в любом положении в полипептиде, включая остов полипептида, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксильный концы. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или разной степени в нескольких сайтах данного полипептида. Кроме того, данный полипептид может содержать несколько типов модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФрибозилирование, амидирование, ковалентное связывание флавина, ковалентное связывание гемовой группы, ковалентное связывание нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное связывание липида или липидного производного, ковалентное связывание фосфатидилинозита, циклизацию посредством поперечных сшивок, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СРЬякоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию и добавление аминокислот к белку, опосредованное транспортной РНК, такое как аргинилирование. Смотри, например, Сге1дй!оп Т.Е., Рго!етк81гис!иге апй Мо1еси1аг Ргорегйек 2пй Ей., №.Н. Ргеетап апй Сотрапу, №\ν Уогк (1993); Рок!1гапк1айопа1 Соуа1еп! Мой1йса!юпк о£ Рго!етк, В.С. Ьойпкоп, Ей., Асайетю Ргекк, №\ν Уогк, р. 1-12 (1983).
Методы твердофазного химического синтеза пептидов также могут быть использованы для синтеза полипептида или фрагментов согласно изобретению. Такой способ известен в данной области с начала 60-х годов (Метйе1й, К.В., I. Ат. Скет. 8ос., 85: 2149-2154, 1963) (смотри также 81е\\'аг1 !М. апй Уоипд, ΙΌ., 8о11й Ркаке Рерййе 8уп!йек1к, 2пй Ей., Р1егсе Сйетюа1 Со., КоскТогй, ΙΙΙ., р. 11-12) и в последнее время используется в коммерчески доступных наборах для конструирования и синтеза пептидов в лабораторных условиях (СатЬпйде Кекеагск Вюсйетюак). В случае таких коммерчески доступных лабораторных наборов в общем использовали руководство Н.М. Сеукеп е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А, 81: 3998 (1984), и наборы предусматривают синтез пептидов на кончиках множества стержней или булавок, которые соединены с одним планшетом. При использовании такой системы планшет со стержнями или булавками переворачивают и вставляют во второй планшет с соответствующими лунками или емкостями, которые содержат растворы для связывания или заякоривания соответствующих аминокислот на кончиках булавок или стержней. При повторении такой стадии процесса, т. е. при переворачивании и вставлении кончиков стержней и булавок в соответствующие растворы, достигается строительство тре
- 67 015591 буемых пептидов из аминокислот. Кроме того, доступно множество систем синтеза пептидов с использованием РМ0С. Например, сборка полипептида или его фрагмента может быть осуществлена на твердой подложке с использованием автоматизированного синтезатора пептидов АррНей Вюкуйетк, 1пс. модели 431А™. Такое оборудование обеспечивает простой доступ к пептидам согласно изобретению либо за счет прямого синтеза, либо путем синтеза серии фрагментов, которые затем могут быть объединены с использованием других известных методик.
Фосфолипазные ферменты
Настоящее изобретение относится к новым фосфолипазам, к кодирующим их нуклеиновым кислотам, к антителам, которые их связывают, к пептидам, представляющим собой антигенные сайты фермента (эпитопы) и активные центры, регуляторные и связывающие домены, и к способам их получения и применения. В одном аспекте полипептиды согласно изобретению обладают фосфолипазной активностью или любым сочетанием фосфолипазных активностей, которые описаны в настоящей публикации (например, способностью расщеплять сложноэфирную связь глицерофосфата, отсутствием липазной активности и т.д.). В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению обладают активностью, которая была модифицирована по сравнению с типичными фосфолипазами, описанными в настоящей публикации.
Настоящее изобретение включает в себя фосфолипазы, содержащие и не содержащие сигнальных последовательностей, а также сами сигнальные последовательности. Изобретение относится к фрагментам или подпоследовательностям ферментов согласно изобретению, например пептидам или полипептидам, содержащим или состоящим из каталитических доменов (активных участков), сайтов связывания, регуляторных доменов, эпитопов, сигнальных последовательностей, доменов препробелка и тому подобных. Настоящее изобретение также относится к иммобилизованным фосфолипазам, антителам против фосфолипаз и их фрагментам. Изобретение относится к гетерокомплексам, например слитым белкам, гетеродимерам и т.п., содержащим фосфолипазы согласно изобретению. Определение пептидов, представляющих антигенные сайты ферментов (эпитопы), активные сайты, сайты связывания, сигнальные последовательности и т.п., может быть осуществлено обычными способами скрининга.
Такие ферменты и способы согласно изобретению могут быть использованы для достижения более полного дегуммирования масел с высоким содержанием фосфора, в частности рисового, соевого, кукурузного масла, масла канолы и подсолнечного масла. Например, в одном аспекте при расщеплении ферментом РЬРЬС фосфатидилинозитол превращается в диацилглицерин и фосфоинозитол. Диацилглицерин при разделении переходит в водную фазу (повышая выход масла), а фосфоинозитол переходит в водную фазу, откуда он удаляется в виде компонента тяжелой фазы во время центрифугирования. Фермент согласно изобретению, например РЬРЬС согласно изобретению, может быть введен в любой химический или физический способ рафинирования масла.
В альтернативных аспектах ферменты согласно изобретению обладают активностью, специфичной по отношению к фосфатидилинозитолу фосфолипазы С (ΡΙ-РЬС), активностью, специфичной по отношению к фосфатидилхолину фосфолипазы С, активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, активностью фосфолипазы А и/или активностью фосфолипазы, родственной пататину. Такие ферменты можно использовать отдельно или в сочетании друг с другом или с другими ферментами согласно изобретению или другими ферментами. В одном аспекте изобретение относится к способам, в которых такие ферменты (включая специфичную по отношению к фосфатидилинозитолу фосфолипазу С (РГРЬС), специфичную по отношению к фосфатидилхолину фосфолипазу С и/или фосфолипазу Ό (вместе с фосфатазой), фосфатазу фосфатидной кислоты, фосфолипазу А, родственную пататину фосфолипазу согласно изобретению) используют отдельно или в комбинации при дегуммировании масел, например растительных масел, например масел с высоким содержанием фосфора, таких как соевое, кукурузное масло, масло канолы, масло из рисовых отрубей и подсолнечное масло. Такие ферменты и способы согласно изобретению можно использовать для достижения более полного дегуммирования масел с высоким содержанием фосфора, в частности соевого, кукурузного масла, масла канолы, масла из рисовых отрубей и подсолнечного масла. При расщеплении РЬРЬС фосфатидилинозитол превращается в диацилглицерин и фосфоинозитол. Диацилглицерин при разделении переходит в водную фазу (повышая выход масла), и фосфоинозитол переходит в водную фазу, откуда он удаляется в виде компонента тяжелой фазы во время центрифугирования. Фермент согласно изобретению, например РЬРЬС согласно изобретению, может быть введен в любой химический или физический способ рафинирования масла.
В одном аспекте изобретение относится к композициям, например растворам, содержащим цитрат натрия, с нейтральным рН, чтобы гидратировать негидратируемые компоненты. Например, изобретение относится к растворам цитрата натрия в диапазоне рН примерно от 4 до 9, или от 5 до 8, или от 6 до 7, которые можно использовать для гидратации негидратируемых фосфолипидов (включая ферменты согласно изобретению) в маслах с высоким содержанием фосфора. В одном аспекте гидратация негидратируемых фосфолипидов происходит в результате хелатирования кальция и магния, ассоциированных с фосфолипидами, которое позволяет ранее нерастворимым солям фосфолипидов быстрее переходить в водную фазу. В одном аспекте после того, как фосфолипиды переходят на границу раздела вода/масло или в водную фазу, фосфолипаза согласно изобретению (например, фосфолипаза-специфичная фосфо
- 68 015591 гидролаза согласно изобретению) или другая фосфолипаза будет превращать фосфолипид в диацилглицерин и сложный фосфатный эфир. В одном аспекте содержание металлов кальция и магния снижается при добавлении кислоты и каустического средства (смотри обсуждение способов с использованием каустического средства).
Ферменты согласно изобретению являются высокоизбирательными катализаторами. Как и другие ферменты, они катализируют реакции с соблюдением требуемой стерео-, регио- и химиоселективности, которая недостижима обычными способами химического синтеза. Кроме того, ферменты согласно изобретению характеризуются замечательной универсальностью. Они могут быть приспособлены для функционирования в органических растворителях, действовать при экстремальных значениях рН (например, при высоких рН и при низких рН), экстремальных температурах (например, при высоких температурах и низких температурах), при экстремальных уровнях солености (например, в условиях высокого уровня содержания соли и низкого уровня содержания соли) и катализируют реакции с соединениями, которые на имеют структурного родства с природными физиологическими субстратами. Ферменты согласно изобретению могут быть разработаны с целью достижения реактивности в отношении широкого круга природных и неприродных субстратов, что позволяет осуществлять модификацию практически любого органического соединения. Ферменты согласно изобретению также могут быть сконструированы для достижения цели высокой энантио- и региоселективности. Высокий уровень специфичности в отношении функциональной группы, проявляемый указанными ферментами, позволяет выдерживать нужное направление каждой реакции в последовательности реакций синтеза, ведущей к новому активному соединению. Ферменты согласно изобретению также могут быть сконструированы для осуществления катализа множества разнообразных реакций, не относящихся к их нативной физиологической функции в природе.
В настоящем изобретении используют уникальные каталитические свойства ферментов. В то время как применение биокатализаторов (например, очищенных или неочищенных ферментов, неживых или живых клеток) в реакциях химической трансформации обычно требует идентификации конкретного биокатализатора, который взаимодействует с конкретным исходным соединением, в настоящем изобретении используют выбранные биокатализаторы, т. е. ферменты согласно изобретению, и условия реакции, которые специфичны для функциональных групп, присутствующих во многих исходных соединениях. Каждый катализатор специфичен по отношению к одной функциональной группе или нескольким родственным функциональным группам и может взаимодействовать со многими исходными соединениями, содержащими указанную функциональную группу. Биокаталитические реакции приводят к созданию популяции производных, полученных из одного исходного соединения. Указанные производные могут быть подвергнуты другому циклу биокаталитических реакций с образованием второй популяции производных соединений. Могут быть получены тысячи вариаций исходного соединения при каждом повторении биокаталитической дериватизации.
Ферменты взаимодействуют с конкретными участками исходного соединения, не влияя на остальную часть молекулы, осуществляя процесс, который очень трудно достижим с использованием традиционных химических способов. Такая высокая степень биокаталитической специфичности обеспечивает средство идентификации единственного активного фермента в библиотеке. Библиотека характеризуется серией биокаталитических реакций, используемых для ее получения, так называемой биосинтетической историей. Скрининг библиотеки с целью выявления биологических активностей и отслеживание биосинтетической истории позволяют идентифицировать специфическую последовательность реакций, приводящую к получению активного соединения. Такую последовательность реакций повторяют и определяют структуру синтезированного соединения. Такой режим идентификации, в отличие от других методик синтеза и скрининга, не требует включения методик иммобилизации и соединения могут быть синтезированы и проанализированы в свободном виде в растворе с использованием практического любого типа скринингового анализа. Важно отметить, что высокая степень специфичности ферментативных реакций, направленных на функциональные группы, позволяет осуществлять отслеживание специфических ферментативных реакций, которые пополняют биокаталитически создаваемую библиотеку.
Настоящее изобретение также относится к способам выявления новых фосфолипаз с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител согласно изобретению. В одном аспекте библиотеки в фаге лямбда подвергают скринингу для обнаружения фосфолипаз на основе их экспрессии. Использование библиотек на основе фага лямбда для скрининга позволяет выявлять токсичные клоны, улучшать доступ к субстрату, снижать потребность в генно-инженерном конструировании хозяина, избегать возможности отклонений при массовом исключении из библиотеки, и дает возможность ускоренного роста при низких плотностях клона. Скрининг библиотек на основе фага лямбда можно осуществлять в жидкой фазе или в твердой фазе. Скрининг в жидкой фазе дает большую гибкость в условиях анализа, дополнительную гибкость в отношении субстрата, повышенную чувствительность в случае слабых клонов и простоту автоматизации при скрининге твердой фазы.
Многие стадии указанного способа осуществляют с использованием роботизации, позволяющей осуществлять в день многие тысячи биокаталитических реакций и скрининговых анализов, а также обеспечивающей высокий уровень точности и воспроизводимости (смотри обсуждение матриц ниже). В ре
- 69 015591 зультате, библиотека производных соединений может быть получена в течение нескольких недель. Дополнительное описание модификаций молекул, включая малые молекулы, приведено в РСТ/ϋδ 94/09174.
Сигнальные последовательности фосфолипаз
Настоящее изобретение относится к сигнальным последовательностям фосфолипаз (например, к сигнальным пептидам (8Р)), например, к пептидам, содержащим сигнальные последовательности и/или химерным полипептидам, при этом пептиды или химеры имеют сигнальную последовательность, которая указана в табл. 1, или которая указана ниже. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные сигнальные последовательности (8Р, например, к пептиду, имеющему последовательность, содержащую/состоящую из аминоконцевых остатков полипептида согласно изобретению). В одном аспекте настоящее изобретение относится к сигнальной последовательности, включающей в себя пептид, содержащий/состоящий из последовательности, которая представлена остатками 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32 или 1-33 полипептида согласно изобретению, например последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 175 или 8Е0 ΙΌ N0: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Е, Ε41Υ, Е41К, Е94К, Э100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, 1)100\\'. А104Ь, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Ν, Э171У, Э171Е, Μ176\, Ό230Η, Ό230Κ, Ό234\, Э234У, Э234С, Ό234Κ, Э234К или Р265К. Любой из указанных пептидов может представлять собой часть химерного белка, например рекомбинантного белка. Пептид сигнальной последовательности может быть соединен с другим ферментом согласно изобретению (например, с фосфолипазой согласно изобретению, из которой он не был получен), или с другой фосфолипазой или с любым полипептидом, которые обсуждаются ниже.
Примеры сигнальных последовательностей приведены в табл. 1 и указаны в списке последовательностей, например, остатки 1-24 последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8Е0 ЕЭ N0: 4, 8Е0 ΙΌ N0: 6; остатки 1-29 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 8; остатки 1-20 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 10; остатки 119 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 20; остатки 1-28 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 22; остатки 1-20 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 32; остатки 1-23 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 38; другие примеры сигнальных последовательностей согласно изобретению смотри в табл. 1 и списке последовательностей.
В некоторых аспектах фосфолипазы согласно изобретению не имеют сигнальных последовательностей. В одном аспекте изобретение относится к фосфолипазам согласно изобретению, в которых полностью отсутствует или отсутствует часть сигнальной последовательности. В одном аспекте изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность из одной фосфолипазы, оперативно связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты другой фосфолипазы, или необязательно может требоваться сигнальная последовательность из белка, отличного от фосфолипазы.
Препродомены, связывающие домены и каталитические домены фосфолипазы
Кроме сигнальных последовательностей (например, сигнальных пептидов (8Р)), которые обсуждались выше, изобретение относится к препродоменам, связывающим доменам (например, домену связывания субстрата) и каталитическим доменам (СЭ). Домены 8Р, связывающие домены, препродомены и/или СЭ согласно изобретению могут представлять собой изолированные, синтетические или рекомбинантные пептиды или могут представлять собой часть слитого белка, например, в качестве гетерологичного домена в химерном белке. В настоящем изобретении предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие такие каталитические домены (СЭ) (например, активные участки), препродомены, связывающие домены и сигнальные последовательности (8Р, например, пептид, имеющий последовательность содержащую/состоящую из аминоконцевых остатков полипептида согласно изобретению).
Сигнальные последовательности (8Р), связывающие домены, каталитические домены (СЭ) и/или препропоследовательности фосфолипаз согласно изобретению могут представлять собой изолированные пептиды, или последовательности, связанные с другим фосфолипазным или нефосфолипазным полипептидом, например, в виде слитого (химерного) белка. В одном аспекте полипептиды, содержащие сигнальные последовательности 8Р и/или препропоследовательности фосфолипазы согласно изобретению, содержат последовательности, гетерологичные по отношению к фосфолипазам согласно изобретению (например, слитый белок, содержащий 8Р и/или препропоследовательность согласно изобретению и последовательности из другого фосфолипазного или нефосфолипазного белка). В одном аспекте изобретение относится к фосфолипазам согласно изобретению с гетерологичными СЭ, 8Р и/или препропоследовательностями, например последовательностям с дрожжевой сигнальной последовательностью. Фосфолипаза согласно изобретению может содержать гетерологичные СЭ, 8Р и/или препропоследовательности в векторе, например в векторе серии рРК.’ (ΙηνίίΓΟβοη, СатНЬай, СА).
В одном аспекте 8Р, СЭ и/или препропоследовательности согласно изобретению идентифицируют после идентификации новых фосфолипазных полипептидов. Пути, посредством которых белки подвергаются сортировке и транспортируются в свое соответствующее место в клетке, часто называют путями целенаправленного воздействия (таргетинга) на белки. Одним из наиболее важных элементов во всех таких системах целенаправленного воздействия является короткая аминокислотная последовательность на аминоконце вновь синтезированного полипептида, называемая сигнальной последовательностью.
Указанная сигнальная последовательность направляет белок к его соответствующему положению в
- 70 015591 клетке и удаляется в процессе транспорта или после того, как белок достигает своего места назначения. Большинство лизосомных, мембранных или секретируемых белков имеют на аминоконце сигнальную последовательность, которая соответствующим образом метит их для последующего перемещения в просвет эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности могут варьировать по длине от 13 до 45 или более аминокислотных остатков. Специалистам в данной области известны различные способы распознавания сигнальных последовательностей. Например, в одном аспекте новые гидролазные сигнальные пептиды идентифицируют способом, называемым 81дпа1Р. В способе 81дпа1Р используют объединенную нейронную сеть, которая распознает и сигнальные пептиды и их сайты расщепления (№е1кеп е! а1., ’ИйепИПсаИоп ой ртока!уоРс апй еикатуоРс ядпа1 рерРйек апй ртейюРоп ой Ше1г с1еауаде кйек, Рго!еш Епдтееппд, νο1. 10, по. 1, р. 1-6 (1997)).
В некоторых аспектах фосфолипаза согласно изобретению может не иметь 8Р и/или препропоследовательностей, и/или каталитических доменов (СИ). В одном аспекте изобретение относится к фосфолипазам, которые утратили полностью или частично 8Р, СИ и/или препродомен. В одном аспекте изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность (8Р), СИ и/или препродомен из одной фосфолипазы, оперативно связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты из другой фосфолипазы или, необязательно, может быть желательна сигнальная последовательность (8Р), СИ и/или препродомен из нефосфолипазного белка.
Настоящее изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим сигнальные последовательности (8Р), препродомен и/или каталитические домены (СИ) согласно изобретению и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, в природе не ассоциированные (например, с фосфолипазой) с 8Р, препродоменом и/или СИ. Последовательность, с которой 8Р, пропродомен и/или СИ в природе не ассоциированы, может находиться на аминоконцевом участке 8Р, препродомена и/или СИ, карбоксильном конце и/или на обоих концах 8Р и/или СИ. В одном аспекте изобретение относится к изолированному, синтетическому или рекомбинантному полипептиду, включающему в себя полипептид (или состоящему из полипептида), содержащий сигнальную последовательность (8Р), препродомен и/или каталитический домен (СИ) согласно изобретению, при условии, что он не ассоциирован с любой последовательностью, с которой он ассоциирован в природе (например, с последовательностью фосфолипазы). Подобным образом, в одном аспекте изобретение относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные полипептиды. Таким образом, в одном аспекте изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты согласно изобретению включают в себя кодирующую последовательность для сигнальной последовательности (8Р) препродомена и/или каталитического домена (СИ) согласно изобретению и гетерологичную последовательность (т. е. последовательность, которая в природе не ассоциирована с сигнальной последовательностью (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СИ) согласно изобретению). Гетерологичные последовательности могут находиться на 3'-конце, 5'-конце и/или на обоих концах последовательности, кодирующей 8Р, препродомен и/или СИ.
Полипептиды согласно изобретению включают фосфолипазы в активной или неактивной форме. Например, полипептиды согласно изобретению включают пробелки до созревания или процессинга препропоследовательностей, например, ферментом процессинга пробелка, таким как конвертаза пробелка, сообразованием активного зрелого белка. Полипептиды согласно изобретению включают фосфолипазы, неактивные по другим причинам, например до активации в результате посттрансляционного процессинга, например, в результате действия эндо- или экзопептидаз или протеиназ, в результате фосфорилирования, амидирования, гликозилирования, дегликозилирования, сульфатирования, димеризации и/или тому подобного. Способы идентификации последовательностей препро-домена, СИ, связывающих доменов и сигнальных последовательностей являются обычной практикой и хорошо известны в данной области, смотри, например, Vаη йе Vеη (1993) Стр. Кеу. 0псод., 4(2): 115-136; скрининги в двугибридных дрожжевых системах для идентификации белок-белковых взаимодействий, описаны, например, в Μΐ^τ (2004) \1е11юс1к Μο1. Вю1., 261: 247-62; Неушпск (2004) \1е111ос1к Μο1. Вю1., 282: 223-41, υ8РN 6617122; 6190874. Например, чтобы идентифицировать препропоследовательность белок очищают из внеклеточного пространства, определяют №концевую последовательность белка и сравнивают с непроцессированной формой.
Полипептиды согласно изобретению могут быть приготовлены в виде препарата белка в любой жидкой, твердой, полутвердой или гелевой форме. Например, препарат белка согласно изобретению может представлять собой препарат, содержащий неводную жидкую композицию, единое твердое вещество, порошок, лиофилизованный порошок, гранулированную форму, форму частиц, прессованную таблетку, большую округлую таблетку, пилюлю, форму геля, гидрогель, пасту, аэрозоль, спрей, примочку или препарат в виде взвеси.
Полипептиды согласно изобретению включают все активные формы, в том числе активные подпоследовательности, например каталитические домены (СИ) или активные участки фермента согласно изобретению. В одном аспекте изобретение относится к каталитическим доменам или активным участкам, которые указаны ниже. В одном аспекте изобретение относится к пептиду или полипептиду, содержа
- 71 015591 щему или состоящему из домена активного участка, который рассчитан благодаря использованию базы данных, такой как РГат (которая представляет собой большую коллекцию множественных выравниваний последовательностей скрытых моделей Маркова, охватывающих множество общих семейств белков, Тйе РГат рго!ет ГатШек ба!аЬаке, А. Ва!етап, Е. Внпеу, Ь. Сегги!1, В. ОигЬт, Ь. ЕйуШег 8.В. Еббу, 8. СпГй!йк-1опек, К.Ь. Ηο\\Ό, Μ. ΜηΓκΗπΕ и Е.Ь.Ь. 8оппйаттег, №.1с1ек Ас1бк Векеагсй, 30(1): 276-280, 2002) или эквивалентная база данных.
В настоящем изобретении предлагается слияние ^концевых или С-концевых подпоследовательностей ферментов согласно изобретению (например, сигнальных последовательностей, препропоследовательностей) с другими полипептидами, активными белками или фрагментами белков. Получение фермента согласно изобретению (например, фермента фосфолипазы С) также можно осуществить посредством экспрессии фермента в виде неактивного слитого белка, который активируют позже в результате протеолитического расщепления (используя либо эндогенную, либо экзогенную протеазную активность, например трипсин), которое приводит к разделению партнера фермента в слитом белке и зрелого фермента, например фермента фосфолипазы С. В одном аспекте слитый белок согласно изобретению экспрессируется с гибридной нуклеотидной конструкцией, которая кодирует одну открытую рамку считывания, содержащую следующие элементы: нуклеотидную последовательность слитого белка, линкерную последовательность (определяемую как нуклеотидная последовательность, которая кодирует гибкую аминокислотную последовательность, которая связывает два менее гибких домена белка), сайт узнавания для расщепления протеазой и последовательность зрелого фермента (например, любого фермента согласно изобретению, например фосфолипазы). В альтернативных аспектах слитый белок может содержать последовательность пектатлиазы, последовательности ксиланазы, последовательность фосфатазы фосфатидной кислоты или другую последовательность, например последовательность, которая, как было показано ранее, сверхэкспрессируется в представляющей интерес системе хозяина.
Можно использовать любую систему хозяина (смотри обсуждение выше), например любые бактерии, например грамположительные бактерии, такие как ВасШик, или грамотрицательные бактерии, такие как Е. сой, или любые дрожжи, например Р1сЫа рак!опк. Порядок расположения нуклеотидных последовательностей в химерной нуклеотидной конструкции можно определить на основе уровней экспрессии белков, достигаемых с использованием каждой слитой конструкции. В одном аспекте в направлении от 5'-конца нуклеотидной конструкции к 3'-концу конструкции нуклеотидные последовательности расположены следующим образом: сигнальная последовательность/слитый белок/линкерная последовательность/сайт узнавания для расщепления протеазой/зрелый фермент (например, любой фермент согласно изобретению, например фосфолипаза) или сигнальная последовательность/пропоследовательность/зрелый фермент/линкерная последовательность/слитый белок. Экспрессия фермента (например, любого фермента согласно изобретению, например фосфолипазы) в виде неактивного слитого белка может улучшить общую экспрессию последовательности фермента, может снизить возможную токсичность, связанную со сверхпродукцией активного фермента и/или может увеличить срок хранения фермента до применения, поскольку фермент может быть неактивным вплоть до того, пока слитый белок, например пектатлиаза, не будет отделен от фермента, например фосфолипазного белка.
В различных аспектах настоящее изобретение относится к специфичным препаратам для активации фосфолипазы согласно изобретению, экспрессированной в виде слитого белка. В одном аспекте активацию активности фосфолипазы, сначала экспрессированной в виде неактивного слитого белка, осуществляют, используя протеолитическую активность или потенциально протеолитическую активность в сочетании с пептидазой аминоконца или карбоксильного конца. Такую активацию можно осуществить различными способами и в разные моменты в процессе производства/хранения перед применением для дегуммирования масла. Примеры способов согласно изобретению включают расщепление эндогенной активностью, экспрессированной продуцирующим хозяином после секреции слитой конструкции в среду для ферментации; расщепление эндогенной протеазной активностью, которая активируется или контактирует с экспрессированной внутри клетки слитой конструкцией при разрушении клеток-хозяев; пропускание неочищенной или очищенной слитой конструкции через колонку с иммобилизованной протеазной активностью, чтобы осуществить расщепление и активацию фермента (например, фосфолипазы согласно изобретению, например, фосфолипазы С) перед приготовлением ферментного препарата; обработку неочищенной или очищенной слитой конструкции с растворимым источником протеолитической активности; активацию фосфолипазы (например, фосфолипазы согласно изобретению, например фосфолипазы С) при рафинации масла с использованием любого растворимого или нерастворимого источника протеолитической активности непосредственно перед применением в данном процессе; и/или активацию активности фосфолипазы (например, фосфолипазы согласно изобретению, например фосфолипазы С) в результате постоянной циркуляции препарата слитой конструкции через колонку с иммобилизованной протеазной активностью при пониженной температуре (например, при температуре примерно от 4 до 20°С). Такая активация может быть осуществлена перед доставкой к месту применения или она может происходить непосредственно на месте рафинирования масла.
- 72 015591
Гликозилирование
Пептиды и полипептиды согласно изобретению (например, гидролазы, антитела) также могут быть гликозилированы, например, в одном аспекте, пептиды и полипептиды, содержащие по меньшей мере один сайт гликозилирования, например ^связанного или 0-связанного гликозилирования. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в Р. рак1ог1к или 8. ротЬе. Гликозилирование может быть добавлено после трансляции либо химически, либо посредством клеточных механизмов биосинтеза, при этом последние заключаются в использовании известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности или могут быть добавлены в виде пептида либо добавлены в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты.
В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, содержащему последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 с ^связанным гликозилированием, которая описана, например, в следующей таблице:
Номер сайга Сайт гликозилирования Длина Положение аминокислот сайта гликозилирования
1 Соответствие: ΝΝ3 Длина: 3 Начало: 27 Конец: 29
2 Соответствие: ΝΤΤ Длина: 3 Начало: 65 Конец: 67
3 Соответствие: ΝΕΤ Длина: 3 Начало: 72 Конец: 74
4 Соответствие: КЗТ Длина: 3 Начало: 100 Конец: 102
5 Соответствие: ΝΡΤ Длина: 3 Начало: 168 Конец: 170
6 Соответствие: N13 Длина: 3 Начало: 171 Конец: 173
7 Соответствие: ΝϋΤ Длина: 3 Начало: 229 Конец: 231
Открытая рамка считывая полноразмерной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 (которая в одном аспекте кодируется последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 1) кодирует семь (7) потенциальных сайтов связанного с аспарагином ^-связанного) гликозилирования. Экспрессия открытой рамки считывания последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 дикого типа в хозяине, способном к гликозилированию (например, Р1сЫа рак1ог1к, 8ассбаготусек сегеуШае, 8с1пхокасс11аго1пусек ротЬе или клетке млекопитающего), приводит к продукции гликозилированного фермента фосфолипазы с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, который, по существу, не активен вследствие присутствия ^связанного гликозилирования. Ферментативное дегликозилирование гликозилированной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 дикого типа ΡNС-азой Р или эндогликозидазой Н приводит к активации активности последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Кроме того, модификация одного или нескольких сайтов ^связанного гликозилирования с использованием мутагенеза (так чтобы сайт больше не распознавался как сайт ^связанного гликозилирования, и гликозилирование в данном сайте больше не происходило) приводит к продукции последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 с повышенной в разной степени активностью.
Мутагенез нуклеотидного кодона, кодирующего аспарагин в сайтах гликозилирования 4, 5 и/или 6 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 (например, превращающий аспарагин в аспарагиновую кислоту), приводит к продукции фермента с повышенной активностью РЬС по сравнению с открытой рамкой считывания дикого типа, экспрессированной в том же хозяине (тройной мутант, экспрессированный в РюЫа рак1опк, обладает удельной активностью и функциональной активностью, которая, по существу, идентична активности последовательности дикого типа, экспрессированной в неспособном к гликозилированию хозяине, подобном Е. со11. Также можно отменить сайт ^связанного гликозилирования в результате мутагенеза остатка серина или треонина в консенсусной последовательности ^связанного гликозилирования ^Х8/Т), например, превращая указанные нуклеотидные кодоны в кодоны, которые кодируют валин или изолейцин в таких положениях вместо серина или треонина. Применение описанной методики для удаления сайтов ^связанного гликозилирования также приводит к продукции активной фосфолипазы 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 в экспрессирующих системах хозяев, способных к гликозилированию.
Анализы активности фосфолипазы
Настоящее изобретение относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам (например, ферментам, антителам), обладающим фосфолипазной активностью или любым сочетанием фосфолипазных активностей, и к кодирующим их нуклеиновым кислотам. Любой известный в данной области анализ фосфолипазной активности может быть использован для определения наличия у полипептида фосфолипазной активности, и такой способ входит в объем настоящего изобретения. Стандартные протоколы определения активности фосфолипазы Α, В, Ό и С, пататина, ацилгидролазы липидов и липазы также известны в данной области.
Примеры анализов активности включают турбидиметрический анализ, анализы с использованием метилумбеллиферилфосфохолина (флуоресцентный), анализ фосфолипазы с использованием Амлекс красного (флуоресцентный), тонкослойную хроматографию (ТСХ), цитолитические анализы и анализы с использованием п-нитрофенилфосфорилхолина. С использованием указанных способов можно проводить быстрый скрининг полипептидов, пептидов или антител в отношении фосфолипазной активности.
Фосфолипазная активность может включать в себя активность ацилгидролазы липидов ^Α^. Смотри, например, публикацию Ьшспсх (2001) Ыр1бк., 36: 1169-1174, в которой описан анализ мицеллярной смеси на основе октаэтиленгликольмонододецилового эфира для определения липидацилгидролазной активности пататина. В публикации Рткпобот (2000) 1. Α§γκ. Рооб С1ет., 48: 155-160 описан
- 73 015591 пример определения липидацилгидролазной (ЬАН) активности пататина.
Турбидиметрический анализ для определения активности фосфолипазы описан, например, в публикациях КаиГГтап (2001) Сот'егзюп ок ВасШиз !Еегтоса!епи1аЩз Ираке ЕНо ап еГПс1еп1 рЕозрЕоЕразе \\'ЕЕ тсгеазеб асйуйу Юиагбз 1опд-сЕаш кайу асу1 зиЬз!га!ез Ьу биес!еб еνο1иΐ^οη апб гаЕопа1 без1дп, Рго!еш Епдшеейпд, 14: 919-928; ЫгаЫт (1995) Е\збепсе 1трЕсаЕпд рЕозрЕоЕразе аз а ν^^и1еηсе ГасЮг ок Сапб1ба а1Ысапз, Е1Гес1. Iттиη., 63: 1993-1998).
Основанные на метилумбеллиферилфосфохолине анализы (флуоресцентный анализ) для определения активности фосфолипазы описаны в публикациях Сообе (1997) Е\збепсе Гог се11 зигГасе апб т!егпа1 рЕозрЕоЕразе асйуйу ш азс1б1ап еддз, Эе\ге1ор. Сго\\1Е. □(ГГег., 39: 655-660; Όίηζ (1999) Ииес! йиогезсепсе-Ьазеб Еразе асйуйу аззау, ВюТесЕпидиез, 27: 696-700).
Анализы с использованием Амплекс красного (флуоресцирующий краситель) для определения активности фосфолипазы доступны в виде наборов, например доступно определение фосфолипазы, специфичной для фосфатидилхолина, с использованием набора для анализа фосфолипазы, специфичной для фосфатидилхолина, на основе Амплекс красного от компании Мо1еси1аг РгоЬез Ею. (Еидепе, ОВ) согласно инструкциям производителя. Флуоресценцию измеряют с помощью устройства, регистрирующего флуоресценцию в микропланшетах, при длине волны возбуждения 560±10 нм и длине волны регистрации флуоресценции 590±10 нм. Такой анализ чувствителен к очень низким концентрациям фермента.
Анализ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) для определения фосфолипазной активности описан, например, в работах Веупо1бз (1991) Ме!Еобз ш Εηζутο1., 197: 3-13; ТадисЫ (1975) РЕозроЕразе Гот С1озЕгбшт по\у| 1уре А.к ВюсЫт. ВюрЕуз. Ас!а, 409: 75-85. Методика тонкослойной хроматографии (ТСХ) является широко используемым способом для выявления фосфолипазной активности. Различные модификации данного способа были использованы для экстракции фосфолипидов из водных смесей для анализа. В некоторых анализах на основе ТСХ гидролиз останавливают добавлением к реакционной смеси хлороформ/метанол (2:1). Непрореагировавший исходный материал и диацилглицерин экстрагируют органической фазой и далее фракционируют посредством ТСХ, тогда как основная группа продукта остается в водной фазе. Для более точного измерения уровня расщепления фосфолипидов могут быть использованы меченные радиоактивным изотопом субстраты (смотри, например, Веупо1бз (1991) Ме!Еобз ш Εηζутο1., 197: 3-13). Для расчета фактического количества молей субстрата, гидролизованного за единицу времени, могут быть использованы соотношения продуктов и реагентов. Если все компоненты экстрагируются одинаково, то любые потери при экстракции будут одинаково влиять на все компоненты. Разделение продуктов расщепления фосфолипидов может быть достигнуто методом ТСХ на силикагеле с использованием в качестве системы растворителей смеси хлороформ/метанол/вода (65:25:4) (смотри, например, ТадисЫ (1975) ВюсЫт. ВюгЕуз. Ас!а, 409: 75-85).
Анализы с использованием п-нитрофенилфосфорилхолина для определения фосфолипазной активности описаны, например, в КогЬзйза!е (1999) С1оЫпд апб сЕа^асΐе^^ζаΕοη оГ а попЕето1уЕс рЕозрЕоЕразе депе Гот ВигкЕо1бейа рзеиботаЕек', I СЕп. МюгоЬюк, 37: 3742-3745; Вегка (1981) 8Ыб1ез оГ рЕозрЕоЕразе (Ееа! 1аЬ11е Еето1узш) ш Рзеиботопаз аегодшоза, Е1Гес1. ^тип., 34: 1071-1074). Указанный тест основан на ферментативном гидролизе субстратного аналога п-нитрофенилфосфорилхолина с высвобождением желтого хромогенного соединения п-нитрофенола, обнаруживаемого при длине волны 405 нм. Данный субстрат удобен для высокопроизводительного скрининга.
Цитолитический анализ позволяет обнаруживать фосфолипазу на основе цитолитической активности, определяемой по лизису эритроцитов. Токсичные фосфолипазы могут взаимодействовать с мембранами эукариотических клеток и гидролизовать фосфатидилхолин и сфингомиелин, что ведет к лизису клеток. Смотри, например, ТйЬаЕ (1993) М1сгоЪю1. Веν., 57: 347-366.
Гибридные (химерные) фосфолипазы и библиотеки пептидов
В одном аспекте настоящее изобретение относится к гибридным фосфолипазам и слитым белкам, включая пептидные библиотеки, содержащие последовательности согласно изобретению. Пептидные библиотеки согласно изобретению могут быть использованы для выделения пептидных модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) мишеней, таких как фосфолипазные субстраты, рецепторы, ферменты. Пептидные библиотеки согласно изобретению могут быть использованы для идентификации по формальным признакам партнеров по связыванию с мишенями, таких как лиганды, например цитокины, гормоны и тому подобные. В одном аспекте настоящее изобретение относится к химерным белкам, содержащим сигнальную последовательность (8Р) и/или каталитический домен (СИ) согласно изобретению, а также гетерологичную последовательность (смотри выше).
Настоящее изобретение относится также к способам создания улучшенных и гибридных фосфолипаз с использованием нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению. Например, настоящее изобретение относится к способам получения ферментов, которые обладают активностью, например, фосфолипазной активностью (такой, как активность фосфолипазы А, В, С или Ό, активность пататинэстеразы, способность расщеплять сложноэфирную связь глицерофосфата, расщеплять сложноэфирную связь в фосфолипиде растительного масла) при высоко щелочных рН и/или кислых рН, при высоких и низких температурах, в экстремальных осмотических условиях и т.п. Настоящее изобретение относится
- 74 015591 к способам получения гибридных ферментов (например, гибридных фосфолипаз).
В одном аспекте способы согласно изобретению приводят к созданию новых гибридных полипептидов за счет использования клеточных процессов, которые интегрируют последовательность первого полинуклеотида таким образом, что полученные гибридные полинуклеотиды кодируют полипептиды, проявляющие активность, свойственную первым биологически активным полипептидам. Например, первые полинуклеотиды могут иметь типичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую типичную фосфолипазу согласно изобретению. Первая нуклеиновая кислота может кодировать фермент из одного организма, который эффективно функционирует в конкретных условиях окружающей среды, например в условиях высокой солености. Он может быть интегрирован с ферментом, кодируемым вторым полинуклеотидом из другого организма, который эффективно функционирует в других условиях окружающей среды, таких как очень высокие температуры. Например, когда две нуклеиновые кислоты могут образовывать гибридную молекулу, например, путем рекомбинации и/или редукционной перегруппировки. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который проявляет свойства обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях среды, относящихся к обоим ферментам, кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например, при высокой солености и экстремальных температурах.
Альтернативно, гибридный полипептид, получаемый способом согласно настоящему изобретению, может проявлять особую ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редукционной перегруппировки полинуклеотидов, кодирующих фосфолипазную активность, образованный гибридный пептид, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может быть подвергнут скринингу для поиска особых активностей, получаемых от каждого исходного фермента, т. е. типа связи, на которую фосфолипаза действует, и температуры, при которой функционирует такая фосфолипаза. Таким образом, фосфолипаза, например, может быть подвергнута скринингу для выявления таких химических функциональных свойств, которые отличают гибридную фосфолипазу от исходных фосфолипаз, таких как: (а) действие на амидные (пептидные связи), т.е. фосфолипазы; (Ь) сложноэфирные связи, т. е. фосфолипазы и липазы; (с) ацетали, т. е. гликозидазы, и, например, свойства, определяющие температуру, рН или концентрацию соли, при которых функционирует гибридный полипептид.
Источники полинуклеотидов, подлежащих интеграции с нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, могут быть выделены из отдельных организмов (изолятов), коллекций организмов, которые выращивались в определенных средах (обогащенные культуры) или некультивируемых организмов (образцов из окружающей среды). Применение подхода, независимого от культивирования, для получения полинуклеотидов, кодирующих новые биологически активные структуры, из образцов окружающей среды, является наиболее предпочтительным, поскольку позволяет проникать в широкие ресурсы биологического разнообразия. Библиотеки окружающей среды получают из образцов окружающей среды и в них представлены объединенные геномы встречающихся в природе организмов, хранящиеся в клонирующих векторах, которые могут быть размножены в соответствующих прокариотических хозяевах. В связи с тем, что клонированная ДНК вначале была экстрагирована непосредственно из образцов окружающей среды, библиотеки не ограничены небольшой фракцией прокариотов, которые могут быть выращены в чистой культуре. Кроме того, нормализация ДНК из окружающей среды, присутствующей в данных образцах, позволяет осуществлять более равномерное представление ДНК из всех видов, присутствующих в исходном образце. Это может резко повысить эффективность поиска представляющих интерес генов из минорных составляющих образца, которые могут быть представлены на несколько порядков слабее, чем доминирующие виды.
Например, генные библиотеки, получаемые от одного или более некультивированных микроорганизмов, подвергают скринингу в отношении представляющей интерес активности. Потенциальные элементы путей, кодирующих представляющие интерес биологически активные молекулы, вначале захватываются прокариотическими клетками в виде экспрессирующих генных библиотек. Из таких библиотек выделяют полинуклеотиды, кодирующие представляющую интерес активность, и вводят в клеткухозяина. Клетку-хозяина выращивают в условиях, способствующих рекомбинации и/или редукционной перегруппировке, которые ведут к созданию потенциально активных биомолекул с новой или повышенной активностью.
Микроорганизмы, из которых могут быть получены гибридные полинуклеотиды, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕиЬас!епа и АгсбаеЬас!епа, и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды могут быть выделены из образцов окружающей среды. Нуклеиновые кислоты могут быть извлечены без культивирования организма или выделены из одного или нескольких культивируемых организмов. В одном аспекте такие микроорганизмы могут быть экстремофилами, такими как гипертермофилы, психрофилы, психротрофы, галофилы, барофилы и ацидофилы. В одном аспекте полинуклеотиды, кодирующие фосфолипазные ферменты, выделенные из экстремофильных микроорганизмов, используют для получения гибридных
- 75 015591 ферментов. Такие ферменты могут функционировать при температурах выше 100°С, например в горячих источниках и глубоководных термальных скважинах, при температурах ниже 0°С, например в арктических водах, в условиях среды, содержащей насыщенные концентрации соли, например в водах Мертвого моря, при значениях рН около 0, например в залежах угля и в геотермальных источниках, обогащенных серой, или при значениях рН выше 11, например в иле сточных вод. Например, фосфолипазы, клонированные и экспрессированные из экстремофильных организмов, могут проявлять высокую активность в широком диапазоне температур и значений рН.
Выбранные и выделенные в соответствии с настоящим описанием полинуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту согласно изобретению, вводят в соответствующую клетку-хозяина. Подходящая клетка-хозяин представляет собой любую клетку, которая способна стимулировать рекомбинацию и/или редукционную перегруппировку. Выбранные полинуклеотиды могут находиться в векторе, который включает в себя соответствующие регуляторные последовательности. Клетка-хозяин может представлять собой клетку высшего эукариота, такую как клетка млекопитающего, или низшую эукариотическую клетку, такую как дрожжевая клетка, или предпочтительно клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой, такой как бактериальная клетка. Введение конструкции в клеткухозяина может быть осуществлено путем трансфекции с использованием фосфата кальция, трансфекции, опосредованной ОЕАЕ-декстраном или электропорацией (Όηνίκ е1 а1., 1986).
Примером подходящих хозяев могут быть любые клетки-хозяева, известные специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или растительные клетки. Примеры бактериальных клеток включают любые виды родов ЕксДепсЫа, ВасШик, 8йер1отусек, 8а1топе11а, Ркеийотопак и 81арДу1ососсик, включая, например, ЕксДепсЫа сой, ЬасЮсоссик 1асДк, ВасШик киЬДДк, ВасШик сегеик, 8а1топе11а 1урЫтиг1ит, Ркеийотопак Диогексепк. Примеры клеток грибов включают любые виды АкрегдШик. Примеры дрожжевых клеток включают любые виды РюЫа, 8ассДаготусек, ЗсЫхокассйаготусек или 8сйтаппютусек, включая РюЫа райопк, 8ассДаготусек сегеуыае или 8с1и/окасс11аготусек ротЬе. Примеры клеток насекомых включают любые виды 8ройор1ега или ЬгокорЫ1а, включая ЬгокорЫ1а 82 и 8ройор1ега 8Г9. Примеры клеток животных включают СН0, С08 или меланому Вотек или любые линии клеток мыши или человека. Специалисты в данной области могут выбрать подходящего хозяина. Специалисты в данной области смогут выбрать подходящего хозяина для рекомбинации и/или редукционной перегруппировки или непосредственно для экспрессии рекомбинантного белка на основе руководства, изложенного в настоящем описании. Системы культивируемых клеток млекопитающих, которые могут быть использованы для рекомбинации и/или редукционной перегруппировки непосредственно для экспрессии рекомбинантного белка, включают, например, линии фибробластов почки обезьяны С08-7, описанные в 8У40-1гапкГогтей ктиап се11к киррой Ше герДсайоп оГ еаг1у 8ν40 ти1ап1к (СШ/тап, 1981), линии клеток С127, 3Т3, СН0, НеЬа и ВНК. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать начало репликации, подходящий промотор и энхансер и необходимые сайты связывания с рибосомой, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетраскрибируемые последовательности. Последовательности ДНК, полученные при сплайсинге 8ν40, и сайты полиаденилирования могут быть использованы для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды (для рекомбинации и/или редукционной перегруппировки или непосредственно для экспрессии рекомбинантного белка), можно культивировать в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, соответствуют тем, которые описаны ранее для использования в случае клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и такие условия известны специалистам в данной области. Клоны, которые идентифицируют как обладающие специфичной ферментативной активностью, могут быть далее подвергнуты секвенированию для идентификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий повышенной активностью.
В другом аспекте нуклеиновые кислоты и способы согласно изобретению могут быть использованы для создания новых полинуклеотидов, участвующих в соответствующих биохимических путях, например в путях, зависимых от одного или нескольких оперонов или генных кластеров или их частей. Например, бактерии и многие эукариоты имеют координированный механизм, используемый для регуляции генов, продукты которых участвуют в родственных процессах. Гены сгруппированы в структуры, называемые генными кластерами, на одной хромосоме и транскрибируются вместе под контролем одной регуляторной последовательности, содержащей один промотор, который инициирует транскрипцию всего кластера. Таким образом, генный кластер представляет собой группу соседних генов, которые обычно либо идентичны, либо родственны с точки зрения их функций.
ДНК генного кластера может быть выделена из различных организмов и лигирована в векторы, особенно в векторы, содержащие регуляторные последовательности экспрессии, которые могут контролировать и регулировать продукцию регистрируемого белка или активности ряда родственных белков с
- 76 015591 лигированных генных кластеров. Использование векторов, которые обладают исключительно большой емкостью для введения экзогенной ДНК, особенно применимо в случае таких генных кластеров, и такие векторы описаны в настоящей публикации в качестве примера, включая й-фактор (или фактор фертильности) Е. со11. Указанный й-фактор Е. со11 представляет собой плазмиду, которая влияет на высокочастотный перенос ее самой при конъюгации и является идеальным средством для получения и стабильного размножения из смешанных образцов микроорганизмов крупных фрагментов ДНК, таких как генные кластеры. Фосмиды, космиды или бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) могут быть использованы в качестве векторов для клонирования. Указанные векторы получают из й-фактора Е. со11, который способен стабильно интегрировать крупные участки геномной ДНК. При интегрировании с ДНК из смешанного некультивированного образца окружающей среды становится возможным получать крупные геномные фрагменты в форме стабильной библиотеки ДНК из окружающей среды. Космидные векторы вначале были разработаны для клонирования и размножения крупных участков геномной ДНК. Клонирование в космидных векторах подробно описано в руководстве 8атЬгоок е! а1., Μο1еси1а^ С1ошпд: А ЬаЬога!огу Μаηиа1, 2пй Ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (1989). После лигирования в соответствующий вектор два или более векторов, содержащих различные кластеры генов поликетидсинтазы, могут быть введены в подходящую клетку-хозяина. Области частичной гомологии последовательностей, которые являются общими для генных кластеров, будут стимулировать процессы, приводящие к реорганизации последовательностей с образованием в результате гибридного генного кластера. Новый гибридный генный кластер может быть затем подвергнут скринингу в отношении повышенной активности, которой не было в исходных генных кластерах.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения биологически активного гибридного полипептида с использованием нуклеиновой кислоты согласно изобретению и скринингу полипептида в отношении активности (например, повышенной активности) путем:
(1) введения в подходящую клетку-хозяина, по меньшей мере, первого полинуклеотида (например, нуклеиновой кислоты согласно изобретению) в оперативной связи, и второго полинуклеотида, в оперативной связи, при этом указанные, по меньшей мере, первый полинуклеотид и второй полинуклеотид имеют по меньшей мере одну общую область частичной гомологии последовательностей;
(2) выращивания клетки-хозяина в условиях, способствующих реорганизации последовательности, с образованием гибридного полинуклеотида в оперативной связи;
(3) экспрессии гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;
(4) скрининга гибридного полипептида в условиях, способствующих идентификации требуемой биологической активности (например, повышенной фосфолипазной активности) и (5) выделения полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.
Способы скрининга активности различных ферментов известны специалистам в данной области и обсуждаются в настоящем описании. Такие способы могут быть использованы при выделении полипептидов и полинуклеотидов согласно изобретению.
Способ перегруппировки ш νί\Ό может быть сфокусирован на межмолекулярных процессах, в целом называемых рекомбинацией. В бактериях указанный процесс известен как КесА-зависимое явление. Настоящее изобретение может быть основано на процессах рекомбинации в клетке-хозяине для достижения рекомбинирования и перегруппировки последовательностей или к способности клеток осуществлять редукционные процессы для снижения сложности квазиповторяющихся последовательностей в клетке путем делеции. Указанный процесс редукционной перегруппировки происходит посредством внутримолекулярного КесА-независимого процесса. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения при использовании нуклеиновых кислот согласно изобретению получают новые полинуклеотиды путем редукционной перегруппировки. Указанный способ включает в себя получение конструкций, содержащих следующие друг за другом последовательности (исходные кодирующие последовательности), их встраивание в соответствующий вектор и последующее введение в подходящую клетку-хозяина. Перегруппировка отдельных молекулярных структур осуществляется путем комбинаторных процессов между следующими друг за другом последовательностями в конструкции, имеющей области гомологии, или между квазиповторяющимися единицами. В процессе перегруппировки происходит рекомбинирование и/или снижение сложности и протяженности повторяющихся последовательностей, что проводит к получению новых молекулярных видов.
Для повышения степени перегруппировки можно использовать различные виды обработки. Указанные способы включают обработку ультрафиолетовым светом или химическими веществами, повреждающими ДНК, и/или использование линий клеток-хозяев, имеющих повышенные уровни генетической нестабильности. Таким образом, процесс перегруппировки может включать в себя гомологичную рекомбинацию или использовать природное свойство квазиповторяющихся последовательностей направлять свою собственную эволюцию.
Повторяющиеся или квазиповторяющиеся последовательности играют важную роль в генетической нестабильности. Квазиповторы представляют собой повторы, которые не ограничены структурой их исходной единицы. Квазиповторяющиеся единицы могут быть представлены в виде ряда последовательностей в конструкции как следующие друг за другом единицы со сходными последовательностями.
- 77 015591
После лигирования соединяющие участки между следующими друг за другом последовательностями становятся, по существу, невидимыми, и квазиповторяющаяся природа полученной конструкции становится непрерывной на молекулярном уровне. Делеционный процесс, который происходит в клетке, снижающий сложность полученной конструкции, происходит среди квазиповторяющихся последовательностей. Квазиповторяющиеся единицы обеспечивают практически безлимитный репертуар матриц, на которых могут иметь место эффекты проскальзывания. Таким образом, конструкции, содержащие квазиповторы, эффективно обеспечивают достаточную молекулярную эластичность, так что явления делеции (и потенциально вставок) могут происходить практически в любом месте в пределах квазиповторяющихся единиц. В том случае, когда все квазиповторяющиеся последовательности лигированы в одной и той же ориентации, например голова к хвосту или наоборот, клетка не может различить отдельные единицы. Следовательно, редукционный процесс может осуществляться на протяжении всей последовательности. И наоборот, когда единицы представлены, например, голова к голове, а не голова к хвосту, такая инверсия очерчивает конечные точки соседней единицы, так что образование делеции предпочтительно будет приводить к утрате дискретных единиц. Таким образом, в одном аспекте изобретения последовательности, подвергаемые перегруппировке, находятся в одной и той же ориентации. Случайная ориентация квазиповторяющихся последовательностей будет приводить к снижению эффективности перегруппировки, тогда как согласованная ориентация последовательностей будет давать наивысшую эффективность. Однако хотя наличие меньшего числа соприкасающихся последовательностей в одной ориентации снижает эффективность, эластичность может быть все еще достаточной для эффективного восстановления новых молекул. Конструкции могут быть получены с использованием квазиповторяющихся последовательностей в одной и той же ориентации, что обеспечивает более высокую эффективность.
Последовательности могут быть собраны в ориентации голова к хвосту с использованием любого из множества способов, включая следующие способы. а. Могут быть использованы праймеры, которые включают поли-А-головную часть и поли-Т-хвостовую часть, которые в том случае, когда их делают однонитевыми, могут обеспечивать нужную ориентацию. Указанный процесс осуществляют за счет наличия первых нескольких оснований праймеров, полученных из РНК и поэтому легко удаляемых РНКазой Η. Ь. Могут быть использованы праймеры, которые включают уникальные сайты расщепления ферментами рестрикции. Могут потребоваться множественные сайты, набор уникальных последовательностей и повторяемые стадии синтеза и лигирования. с. Несколько внутренних оснований праймера могут быть тиолированы и используют экзонуклеазу для получения молекул с правильными хвостами.
Извлечение перегруппированных последовательностей основано на идентификации клонирующих векторов со сниженным индексом повторения (ΚΙ). Такие перегруппированные кодирующие последовательности могут быть извлечены посредством амплификации. Продукты подвергают повторному клонированию и экспрессии. Извлечение клонирующих векторов со сниженным значением ΚΙ можно осуществлять с помощью:
(1) использования векторов, стабильно поддерживаемых только в том случае, когда конструкция имеет сниженную сложность;
(2) физического извлечения укороченных векторов физическими способами. В данном случае клонирующий вектор может быть извлечен с использованием стандартных способов выделения плазмид и подвергнут фракционированию по размеру в агарозном геле или на колонке с отсечением продуктов с низкой молекулярной массой с использованием стандартных способов;
(3) извлечения векторов, содержащих прерванные гены, которые могут быть отобраны в случае снижения размера вставки;
(4) применения методик прямой селекции с использованием экспрессирующего вектора и подходящей селекции.
Кодирующие последовательности (например, гены) из родственных организмов могут иметь высокий уровень гомологии и кодировать практически разные белковые продукты. Указанные типы последовательностей особенно применимы в настоящем изобретении в качестве квазиповторов. Однако такой способ не ограничивается такими почти идентичными повторами.
Ниже приведен пример способа согласно изобретению. Кодирующие последовательности нуклеиновых кислот (квазиповторы) получают из трех (3) видов, содержащих нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Каждая последовательность кодирует белок с определенным набором свойств, включая фермент согласно изобретению. Каждая из последовательностей отличается одной или несколькими парами оснований в уникальном положении последовательности. Квазиповторяющиеся последовательности подвергают амплификации, по отдельности или вместе, и лигируют в случайных компоновках, так в популяции лигированных молекул имеются все возможные перестановки и сочетания. Количество квазиповторяющихся единиц можно регулировать условиями сборки. Среднее количество квазиповторяющихся единиц в конструкции определяют в виде индекса повторения (ΚΙ). Конструкции после образования могут быть подвергнуты или не подвергнуты фракционированию по размеру в агарозном геле согласно опубликованным протоколам, встроены в клонирующий вектор и трансфицированы в подходящую клетку-хозяина. Затем клетки размножают и проводят редукционную перегруппировку. При необходимости скорость процесса редукционной перегруппировки может быть простимулирована путем
- 78 015591 введения повреждения ДНК. Опосредуется ли снижение ЯI образованием делеций между повторяющимися последовательностями за счет внутримолекулярного механизма или событиями, подобными рекомбинации посредством межмолекулярного механизма, не имеет значения. Конечный результат представляет собой перегруппировку молекул с получением всех возможных сочетаний. В одном аспекте настоящий способ включает в себя дополнительную стадию скрининга членов библиотеки из полученного путем перетасовки пула для идентификации отдельных подвергнутых перетасовке членов библиотеки, обладающих способностью связываться или иным образом взаимодействовать или катализировать конкретную реакцию (например, таких как каталитический домен фермента) с предварительно заданной макромолекулой, такой как, например, белковый рецептор, олигосахарид, вирион или другое предварительно заданное соединение или структура. Полипептиды, например фосфолипазы, которые идентифицируют из таких библиотек, могут быть использованы для различных целей, например, в промышленных способах, описанных в настоящем изобретении, и/или могут быть подвергнуты одному или нескольким дополнительным циклам перетасовки и/или отбора.
В другом аспекте предполагается, что перед или во время рекомбинации или перегруппировки полинуклеотиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, могут быть подвергнуты воздействию агентов или процессов, которые способствуют введению мутаций в исходные полинуклеотиды. Введение таких мутаций может повышать разнообразие получаемых гибридных полинуклеотидов и кодируемых ими полипептидов. Агенты или способы, способствующие мутагенезу, могут включать без ограничения, (+)-СС-1065 или синтетический аналог, такой как (+)-СС-1065-(N3-аденин) (смотри 8ип апй Ηω·^, (1992)); Кацетилированный или деацетилированный 4'-фтор-4-аминобифениловый аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (смотри, например, νаη йе Ро11 е! а1., (1992)); или ^ацетилированный или деацетилированный 4-аминобифениловый аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (смотри также νаη йе Ро11 е! а1., (1992), р. 751-758); трехвалентный хром, соль трехвалентного хрома, аддукт ДНК на основе полициклического ароматического углеводорода (ПАУ), способный ингибировать репликацию ДНК, такой как 7-бромметилбенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3-дибромпропил)фосфат (Тпх-ВР), 1,2дибром-3-хлорпропан (ЭВСР), 2-бромакролеин (2ВА), бензо[а]пирен-7,8-дигидродиол-9-10-эпоксид (ВРЭЕ), галогенид платины (ΙΙ), N-гидрокси-2-амино-3-метилимидазо[4,5-Г]хинолин (Кгидрокси-Ю) и N-гидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-Г]пиридин (Кгидрокси-РЫР). Особенно предпочтительные способы замедления или остановки амплификации ПЦР включают в себя использование ультрафиолетового облучения, (+)-СС-1065 и (+)-СС-1065-(N3-аденина). Особенно предпочтительными средствами являются аддукты ДНК или полинуклеотиды, содержащие аддукты ДНК, из полинуклеотидов или пула полинуклеотидов, которые могут быть высвобождены или отделены способом, включающим в себя нагревание раствора, содержащего полинуклеотиды, перед дальнейшей обработкой.
Методики скрининга и устройства мониторинга в режиме он-лайн
В практике осуществления способов настоящего изобретения можно использоваться множество приборов и методик в сочетании с полипептидами и нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, например, для скрининга полипептидов в отношении фосфолипазной активности, для скрининга соединений в качестве возможных модуляторов активности (например, усиления или ингибирования активности ферментов), скрининга в отношении антител, которые связываются с полипептидом согласно изобретению, скрининга нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой согласно изобретению и т.п.
Ферменты, иммобилизованные на твердых подложках
Фосфолипазные ферменты, их фрагменты и нуклеиновые кислоты, которые кодируют указанные ферменты и фрагменты, могут быть прикреплены к твердой подложке. Часто такой способ является более экономичным и эффективным в случае применения фосфолипаз в промышленных процессах. Например, объединение или смесь фосфолипазных ферментов (или их активных фрагментов), которые используют в конкретной химической реакции, могут быть связаны с твердой подложкой и опущены в чан для обработки. При этом может происходить ферментативная реакция. Затем твердую подложку можно вынуть из чана вместе с прикрепленными на ней ферментами для повторного использования. В одном варианте осуществления изобретения выделенную нуклеиновую кислоту согласно изобретению прикрепляют на твердой подложке. В другом варианте согласно изобретению твердая подложка выбрана из группы, состоящей из геля, смолы, полимера, керамики, стекла, микроэлектрода и любого их сочетания.
Например, твердые подложки, применимые в настоящем изобретении, включают гели. Некоторые примеры гелей содержат сефарозу, желатин, глютаральдегид, обработанный хитозаном глютаральдегид, альбумин-глютаральдегид, хитозан-ксантан, гель Тоуореаг1 (полимерный гель), альгинат, альгинатполилизин, каррагинан, агарозу, глиоксилагарозу, намагниченную агарозу, декстран-агарозу, поли(карбамоилсульфонат)гидрогель, гидрогель, содержащий БСА-ПЭГ, фосфорилированный поливиниловый спирт (ПВС), моноаминоэтал-Каминоэтил (ΜАNА), аминогруппу или любое их сочетание.
Другие твердые подложки, применимые в настоящем изобретении, включают в себя смолы или полимеры. Некоторые примеры смол или полимеров включают целлюлозу, акриламид, нейлон, вискозу, сложный полиэфир, анионообменную смолу, Амберлит™ ХАЭ^, Амберлит™ ХАЭ-8, Амберлит™ ША
- 79 015591
94, Амберлит™ ГКС-50, поливинил, полиакриловую кислоту, полиметакрилат или любое их сочетание.
Другой тип твердой подложки, применимой в настоящем изобретении, представляет собой керамический материал. Некоторые примеры включают непористый керамический материал, пористый керамический материал, 8102, А1203. Другой тип твердой подложки, применимый в настоящем изобретении, представляет собой стекло. Некоторые примеры включают непористое стекло, пористое стекло, аминопропиловое стекло или любое их сочетание. Другой тип твердой подложки, который может быть использован, представляет собой микроэлектрод. Примером такого микроэлектрода является покрытый полиэтиленимином магнетит. В качестве твердой подложки также можно использовать графитовые частицы.
Другие примеры твердых подложек, применяемых при практическом осуществлении изобретения, содержат диатомитовые продукты и силикаты. Некоторыми примерами являются СЕНТЕ®, КЕМТЕ®, ПНСТШ®, РШМНЫ®, диатомиты ΟΙΛΕΙΕ® и МЮ^-СЕЕ®, САЬРЬ0®, 8ΙΕΛ80ΚΗ™ и синтетические силикаты кальция и магния СЕЬКАТЕ®. Другим примером твердой подложки является клетка, например эритроцит.
Способы иммобилизации
Имеется много способов, известных специалисту в данной области, для иммобилизации ферментов или их фрагментов, или нуклеиновых кислот на твердой подложке. Некоторыми примерами таких способов являются, например, создание электростатических капель, электрохимические средства, иммобилизация путем адсорбции, путем ковалентного связывания, путем поперечной сшивки, путем химической реакции или процесса инкапсулирования, захвата, с использованием альгината кальция или поли(2гидроксиэтилметакрилата). Подобные способы описаны в Ме!1ойк 1п Епхуто1оду, ИптоЫНхей Епхутек апй Се11к, Раг! С, 1987, Асайетис Ргекк. Еййей Ьу 8.Р. Со1о\\'1ск апй N.0. Кар1ап, уо1. 136 и в ^тоЬШхайоп оГ Епхутек апй Се11к. 1997. Нитапа Ргекк. Еййей Ьу С.Р. В1скегк1аГГ. 8епек: Ме11юйк т Вю!есЬпо1оду. Ей1!ей Ьу РМ. νη^ΐ'.
Капиллярные матрицы
Капиллярные матрицы, такие как СЮАМАТКРХ™ (И1уегка Согрогайоп, 8ап П1едо), могут быть использованы в способах согласно изобретению. Нуклеиновые кислоты или полипептиды согласно изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на указанную матрицу, включая капиллярные матрицы. Матрицы могут быть использованы для скрининга или мониторинга библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т. п.) в отношении их способности связываться или модулировать активность нуклеиновых кислот или полипептидов согласно изобретению. Капиллярные матрицы обеспечивают другую систему удерживания и скрининга образцов. Например, устройство для скрининга образцов может включать в себя множество капилляров, образующих матрицу, в которой капилляры прилегают к друг другу, при этом каждый капилляр имеет по меньшей мере одну стенку, формирующую просвет для удержания образца. Данное устройство может также включать в себя промежуточный материал, расположенный между соседними капиллярами в такой матрице, и один или несколько стандартных индикаторов, образованных в промежуточном материале. Капилляр для скрининга образца, причем капилляр приспособлен для соединения с другими капиллярами в виде матрицы, может иметь первую стенку, определяющую просвет для удержания образца, и вторую стенку, образованную из фильтрующего материала, например, для фильтрования энергии возбуждения, передаваемой в просвет для возбуждения образца.
Полипептид или нуклеиновая кислота, например лиганд, могут быть введены в первый компонент по меньшей мере в часть капилляра в капиллярной матрице. Каждый капилляр в капиллярной матрице может иметь по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для удержания первого компонента. После первого компонента в капилляр может быть введен пузырек воздуха. Затем в капилляр может быть введен второй компонент, причем второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Представляющий интерес образец может быть введен в качестве первой жидкости, меченной регистрируемой частицей, в капилляр капиллярной матрицы, при этом каждый капилляр в капиллярной матрице имеет по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для удержания первой жидкости и регистрируемой частицы, и по меньшей мере одна стенка покрыта связывающим материалом для связывания регистрируемой частицы по меньшей мере с одной стенкой. Данный способ дополнительно может включать в себя удаление первой жидкости из капиллярной трубки, причем связанная регистрируемая частица удерживается внутри капилляра, и затем введение второй жидкости в капиллярную трубку.
Капиллярная матрица может включать в себя множество отдельных капилляров, имеющих по меньшей мере одну внешнюю стенку, которая формирует просвет. Внешняя стенка капилляра может представлять собой одну или несколько стенок, слитых вместе. Подобным образом, стенка может определять просвет, который имеет цилиндрическую, квадратную, гексагональную или любую другую геометрическую форму, при условии, что стенки образуют просвет для удерживания жидкости или образца. Капилляры в капиллярной матрице могут тесно примыкать друг к другу с образованием плоской структуры. Капилляры могут соединяться вместе, будучи спаянными (например, когда капилляры сделаны из стекла), склеенными, соединенными связями или зажатыми бок о бок. Капиллярная матрица может быть образована из любого количества отдельных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 ка- 80 015591 пилляров. Капиллярная матрица может образовывать планшет для микротитрования, включающий в себя примерно 100000 или более соединенных вместе отдельных капилляров.
Матрицы или биочипы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды согласно изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу. Указанные матрицы могут быть использованы для скрининга или мониторинга библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) в отношении их способности связываться или модулировать активность нуклеиновой кислоты или полипептида согласно изобретению. Например, в одном аспекте настоящего изобретения отслеживаемый параметр представляет собой экспрессию транскрипта гена фосфолипазы. Один или несколько или все транскрипты в клетке могут быть проанализированы путем гибридизации образца, содержащего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, типичные или комплементарные транскриптам клетки, при гибридизации с нуклеиновыми кислотами, иммобилизованными на такой матрице или биочипе. При использовании матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе может быть проведена количественная оценка некоторых или всех транскриптов одновременно. Альтернативно, также можно использовать матрицы, содержащие геномные нуклеиновые кислоты, для определения генотипа нового сконструированного штамма, полученного способами согласно изобретению. Также могут быть использованы полипептидные матрицы для одновременного определения количества множества белков.
Настоящее изобретение может быть осуществлено на практике с использованием любой известной матрицы, также называемой микроматрицей, или матрицей нуклеиновых кислот, или полипептидной матрицей, или матрицей антител, или биочипом, или их вариация. Матрицы, в общем, представляют собой множества пятен или элементов-мишеней, где каждый элемент-мишень включает в себя определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например, олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата, для специфичного связывания с молекулой образца, например с мРНК-транскриптами.
В практике осуществления способов согласно изобретению любая известная матрица и/или способ создания и применения матриц могут быть использованы полностью или частично, или в виде их вариаций, как описано, например, в патентах США №№ 6277628, 6277489, 6261776, 6258606, 6054270, 6048695, 6045996, 6022963, 6013440, 5965452, 5959098, 5856174, 5830645, 5770456, 5632957, 5556752, 5143854, 5807522, 5800992, 5744305, 5700637, 5556752, 5434049; смотри также VО 99/51773, VО 99/09217, VО 97/46313, VО 96/17958; смотри также, например, йойпйоп (1998) Сигг. Вю1., 8: В171-В174; 8сйиштег (1997) ВШесйтдиек, 23: 1087-1092; Кет (1997) ВШесйтдиек, 23: 120-124; 8о1так-То1йо (1997) Сепек, Сйготокотек апй Сапсег, 20: 399-407; Во\\1е11 (1999) №11иге Сепейск 8ирр., 21: 25-32. Смотри также публикации заявок на выдачу патентов США №№ 20010018642, 20010019827, 20010016322, 20010014449, 20010014448,20010012537,20010008765.
Антитела и способы скрининга на основе антител
Настоящее изобретение относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с фосфолипазой согласно изобретению. Указанные антитела могут быть использованы для выделения, идентификации или количественного определения фосфолипаз согласно изобретению или родственных полипептидов. Указанные антитела могут быть использованы для ингибирования активности фермента согласно изобретению. Указанные антитела могут быть использованы для выделения полипептидов, родственных полипептидам согласно изобретению, например, родственных фосфолипазных ферментов.
Антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой пептид или полипептид, полученный, смоделированный или, по существу, кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов, или его фрагменты, способные специфично связывать антиген или эпитоп, смотри, например Еипйатеп!а1 1ттипо1оду, ТЫгй Ей1йоп, ν.Ε. Раи1, ей., Ваνеη Ргекк, Ν.Υ. (1993); V^1коη (1994) й. 1ттипо1. МеШойк, 175: 267-273; Υатшк11 (1992) й. Вюсйет. Вюрйук. МеШойк, 25: 85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие части, т.е., антигенсвязывающие участки (например, фрагменты, подпоследовательности, определяющие комплементарность области (СЭВ)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (ί) ЕаЬ-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЬ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Е(аЬ')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два ЕаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Ей-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Еν-фрагмент, состоящий из доменов УЬ и УН одного плеча антитела, (ν) йАЬ-фрагмент №агй е! а1., (1989) Шипе, 341: 544-546), который состоит из домена УН; и (νί) изолированную определяющую комплементарность область (СЭВ). Одноцепочечные антитела также включены в понятие антитело.
Антитела могут быть использованы для иммунопреципитации, окрашивания (например, ЕАС8), на колонках для иммуноаффинной хроматографии и т.п. При желании, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие специфические антигены, могут быть получены посредством иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на матрице согласно изобретению.
Альтернативно, способы согласно изобретению могут быть применены для модификации структуры антитела, получаемого в клетке, подлежащей модификации, например, для повышения или снижения
- 81 015591 аффинности антитела. Кроме того, способность создавать или модифицировать антитела может быть обусловлена фенотипом клетки, полученным генно-инженерными способами согласно изобретению.
Способы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описаны в научной и патентной литературе; смотри, например, Со11дап, СиККЕКГ РК0Т0С0Ь8 ГО ΕΜ^υ^^ΟΥ, №11еу/6геепе, NΥ (1991); 8Шек (ейк.) ВА8Ш АМ) СЬЮТСЛЬ IΜΜυN0^06Υ (7(Ь ей.) Ьапде Μей^са1 РиЫюаЬопк, Ьок А11ок, СА (8Шек); Сойшд, Μ0N0(4.0%^. АNТIВ0^IΕ8: РКШСШЬЕ8 АМ) РКАСПСЕ (2й ей.) Асайетю Ргекк, Αν УоШ NΥ (1986); КоЫег (1975) №!иге 256:495; Наг1оте (1988) АNТIВ0^IΕ8, А ^ЛВ0КАТ0КΥ ΜАNυЛ^, Со1й 8рппд НагЬог РиЬЬсаРопк, №\ν ¥огк. Антитела также получают ш νίΙΐΌ с использованием, например, библиотек на основе фагового дисплея, экспрессирующих сайты связывания рекомбинантных антител, в дополнение к традиционным способам ш νί\Ό с использованием животных. Смотри, например, НоодепЬоот (1997) Тгепйк Вю!есЬпо1., 15: 62-70; Ка1х (1997) Аппи. Кех. ВюрЬук. Вюто1. 8!гис!., 26: 27-45.
Полипептиды можно использовать для получения антител, которые связываются специфично с полипептидами согласно изобретению. Полученные антитела могут быть использованы в способах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для выявления наличия полипептида в биологическом образце. В таких способах белковый препарат, такой как экстракт или биологический образец, приводят в контакт с антителом, способным к специфичному связыванию с одним из полипептидов согласно изобретению.
В основанных на иммуноаффинности способах антитело связывают с твердой подложкой, такой как шарики или другая матрица для колонки. Белковый препарат приводят в контакт с антителом в условиях, при которых антитело специфично связывается с одним из полипептидов согласно изобретению. После промывки для удаления неспецифично связавшихся белков проводят элюирование специфично связавшихся полипептидов.
Способность белков в биологическом образце связываться с антителом может быть выявлена с использованием множества способов, известных специалистам в данной области техники. Например, наличие связывания может быть определено путем мечения антитела регистрируемой меткой, такой как флуоресцирующий агент, ферментативная метка или радиоактивный изотоп. Альтернативно, наличие связывания антитела с образцом может быть определено с использованием второго антитела, несущего на себе такую регистрируемую метку. Конкретные анализы включают в анализы ЕЫ8А, сэндвичанализы, радиоиммуноанализы и вестерн-блоттинг.
Поликлональные антитела, вырабатываемые против полипептидов согласно изобретению, могут быть получены путем прямой инъекции полипептидов в организм животного или путем введения полипептидов животному, например животному, отличному от человека. Получаемое при этом антитело будет затем связывать полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующая лишь фрагмент полипептида, может быть использована для создания антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Такие антитела затем могут быть использованы для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих данный полипептид.
Для получения моноклональных антител можно использовать любую методику, которая обеспечивает продукцию антител непрерывными культурами клеточных линий. Примерами являются методика получения гибридом, методика получения триомов, методика получения гибридом из В-клеток человека и методика получения ΕВV-гибридом (смотри, например, Со1е (1985) в Μοηοс1οηа1 АпРЬоШек апй Сапсег ТЬегару, А1ап К. Ыкк. Шс., р. 77-90).
Методики, описанные для получения одноцепочечных антител (смотри, например, патент США № 4946778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к полипептидам согласно изобретению. Альтернативно, можно использовать трансгенных мышей для экспрессии гуманизированных антител против указанных полипептидов или их фрагментов.
Антитела, получаемые против полипептидов согласно изобретению, можно использовать при скрининге близких полипептидов из других организмов и образцов. В таких методиках полипептиды из организма приводят в контакт с антителом и выявляют те полипептиды, которые специфично связывают антитело. Для обнаружения связывания антитела можно использовать любую описанную выше методику.
Наборы
Настоящее изобретение относится к наборам, содержащим композиции, например нуклеиновые кислоты, экспрессирующие кассеты, векторы, клетки, полипептиды (например, набор, содержащий по меньшей мере одну фосфолипазу согласно изобретению) и/или антитела (например, набор, содержащий, по меньшей мере одно антитело согласно изобретению). Наборы могут содержать ферменты для обработки (получения) биотоплива, детергентов или для обработки или переработки пищевых продуктов, кормов, биомассы, пищевых и кормовых добавок или добавок питательных веществ и т.п. Наборы также могут содержать инструктивный материал с рекомендациями относительно методик и промышленного применения изобретения, раскрытого в настоящем описании.
Промышленные и медицинские применения ферментов согласно изобретению
Настоящее изобретение относится к многим промышленным и медицинским применениям с использованием полипептидов согласно изобретению, например фосфолипазы и других ферментов соглас
- 82 015591 но изобретению, например, фосфолипаз А, В, С и Ό, пататинов, включая в качестве некоторых примеров превращение негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, получение биотоплива и обработку биомассы, дегуммирование масел, обработку масел из растений, рыбы, водорослей и т.п. В случае любого из указанных альтернативных промышленных применений и медицинских применений ферменты могут быть добавлены в определенном порядке, например, в определенном порядке добавляют фосфолипазы с разными специфичностями, например, сначала добавляют фермент с РС- и РЕгидролизующей активностью (или добавляют два фермента, один с РС-гидролизующей активностью, а другой с РЕ-гидролизующей активностью), затем добавляют фермент с РЬгидролизующей активностью (например, активностью РЬС) или их добавляют в любом сочетании.
Любой или все способы согласно изобретению можно применять в промышленном масштабе, например обработку или рафинирование масла в масштабе примерно от 15000, 25000, 50000, 75000 или 100000 фунтов рафинированного масла/сутки до примерно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более миллионов фунтов рафинированного масла/сутки.
Способы применения фосфолипазных ферментов в промышленности хорошо известны в данной области. Например, фосфолипазы и способы согласно изобретению могут быть использованы для обработки жиров и масел, как описано, например, в публикации патента !Р Н6-306386, в которой описано превращение фосфолипидов, имеющихся в маслах и жирах, в водорастворимые вещества, содержащие группы фосфорной кислоты.
Фосфолипазы согласно изобретению могут быть использованы для обработки растительных масел и фосфолипидов, например, выделяемых из рисовых отрубей, сои, канолы, пальмы, хлопка, кукурузы, пальмовых косточек, кокоса, арахиса, кунжута, подсолнечника. Фосфолипазы согласно изобретению могут быть использованы для обработки незаменимых масел, например масел из фруктовых семян, например из виноградных косточек, абрикоса, бурачника и т. п. Фосфолипазы согласно изобретению могут быть использованы для обработки масел и фосфолипидов в различных формах, включая неочищенные формы, дегуммированные формы, камеди, промывные воды, глину, кремнезем, соапсток и т.п. Фосфолипиды согласно изобретению можно использовать для обработки масел с высоким содержанием фосфора, рыбьего жира, животных жиров, растительных масел, масел из водорослей и т.п. В любом аспекте настоящего изобретения каждый раз можно использовать фосфолипазу С, альтернативный вариант включает в себя использование фосфолипазы Ό согласно изобретению и фосфатазы, (например, использование сочетания РЬЭ/фосфатазы для повышения выхода масла с высоким содержанием фосфора, такого как соевое масло).
Фосфолипазы согласно изобретению можно использовать для обработки и получения пищевых масел, биодизельных масел, липосом для фармацевтических и косметических средств, структурированных фосфолипидов и структурированных липидов. Фосфолипазы согласно изобретению можно использовать для экстракции масла. Фосфолипазы согласно изобретению можно использовать для обработки и получения различных видов мыла.
Обработка пищевых масел: получение 1,3-диацилглицерина (1,3 БАС)
В настоящем изобретении предлагаются способы применения фермента(ов) согласно изобретению для получения 1,3-диацилглицерина (1,3 ЬАС). В одном аспекте фосфолипаза С или фосфолипаза Ό плюс фосфатаза образуют 1,2-диацилглицерин; это улучшает выход масла при рафинировании пищевых масел. В случае применения в способе, который включает в себя стадию нейтрализации каустическим средством, например, в качестве вспомогательного средства при каустическом рафинировании, до 70%
1.2- диацилглицерида (1,2-ЭАС) подвергается реакции миграции ацила и превращается в 1,3-ЭАС. 1,3ЬАС более полезен для здоровья, и поэтому применение РЬС в качестве вспомогательного средства при каустическом рафинировании позволяет получать масло с повышенной питательной ценностью.
В настоящем изобретении предлагаются способы применения фермента(ов) согласно изобретению для получения и обработки пищевых масел, включая получение пищевых масел с повышенным содержанием 1,3-ЭАС. Диацилглицерины являются встречающимися в природе соединениями, найденными во многих пищевых маслах. В одном аспекте способа согласно изобретению, например способа дегуммирования масла, основание (каустическое средство) вызывает изомеризацию 1,2-ЭАС, продуцируемого РЬС, в 1,3-ЭАС, который является более полезным для здоровья с пищевой точки зрения по сравнению с
1.2- ЭАС, например 1,3-ЭАС сжигается, давая энергию, а не хранится в виде жира (как 1,2-ЭАС). Добавляя РЬС в начале процесса каустического рафинирования (и позже добавляя кислоты и каустического средства), способы согласно изобретению позволяют получать повышенный уровень 1,3-ЭАС (снижение
1.2- ЭАС). С точки зрения питания 1,3-ЭАС для нас лучше, чем 1,2-ЭАС. В альтернативном аспекте изобретение относится к способу дегуммирования масла с использованием РЬС согласно изобретению, при этом конечный продукт в виде очищенного от смол масла содержит не менее чем примерно 0,5, 1,0, 2,0 или 3,0% или более 1,3-ОАС.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ получения (посредством переэтерификации) рафинированного масла (например, масла, содержащего диацилглицерин), включая пищевые масла, содержащие повышенные уровни 1,3-диацилглицерина (1,3-ЭАС), например, как показано в примере 13, в котором фосфолипазу, такую как фермент согласно изобретению, загружают вначале процес
- 83 015591 са или добавляют перед добавлением кислоты или каустического средства. Образование в результате ферментативного гидролиза ЭЛС из триглицерида приводит к переэтерификации с получением 1,3-ОАС из 1,2-ОАС. 1,3 ОАС-содержащее пищевое масло оказывает другое воздействие на метаболизм по сравнению с обычными пищевыми маслами. Различия в метаболических путях между 1,3-0 АС и либо 1,2ОАС, либо триглицеридами позволяют большую часть жирных кислот из 1,3-диацилглицерина сжигать с получением энергии, а не хранить в виде жира. Клинические исследования показали, что регулярное потребление ОАС-содержащего масла в виде части разумной диеты может помогать людям с излишней массой тела и отложениями жира в организме. Кроме того, метаболизм 1,3-ОАС снижает уровень циркулирующих триглицеридов в кровяном русле после еды. Так как ожирение и повышенные уровни липидов в крови являются факторами риска развития хронических заболеваний, включая сердечнососудистые заболевания и диабет типа ΙΙ, то на такие связанные с образом жизни состояния здоровья может благотворно влиять регулярное потребление ОАС-содержащих масел.
Потребление ОАС-содержащего масла можно осуществлять разными путями. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу применения фермента согласно изобретению для приготовления пищи, например выпечки, имеющей повышенные уровни диаацилглицерида 1,3-ОАС, и выпечки, содержащей диацилглицериновые масла. В одном аспекте выпечка представляет собой булочки, торты и подобные полученные при выпечке изделия. В альтернативных вариантах сочетание ферментов, которое можно использовать в способах согласно изобретению, включая обработку пищевых масел, представляет собой (при этом один, несколько или все ферменты в сочетании представляют собой фермент согласно настоящему изобретению):
1) РБС + РЬРБС + РБА (РБА добавляют после завершения реакций РБС);
2) РБО + фосфатаза + РЬРБС, затем РБА или
3) РБС или (РБС + РЬРБС) + РБА, специфичная к фосфатидной кислоте (все ферменты добавляют вместе или последовательно).
Дегуммирование масла и обработка растительного масла
Ферменты согласно изобретению (например, полипептиды согласно изобретению, обладающие липазной, фосфолипазной, эстеразной и/или гликозидазной или эквивалентной активностью) могут быть использованы на различных стадиях обработки растительного масла, таких как стадия экстракции растительного масла, особенно на стадии удаления фосфолипидных смол в процессе, называемом дегуммирование масла.
Указанные способы согласно изобретению можно применять в промышленном масштабе, например, в масштабе примерно от 15000, 25000, 50000, 75000 или 100000 фунтов рафинированного масла/сутки до примерно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более миллионов фунтов растительного масла/сутки.
В одном аспекте изобретение относится к способу дегуммирования масла, включающему в себя применение фосфолипазы согласно изобретению, например РБС согласно изобретению. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя добавление другой фосфолипазы (которая также может представлять собой фосфолипазу согласно изобретению), например другой РБС, РБА, РБВ, РБВ или пататина согласно изобретению, или фермента (который также может представлять собой фермент согласно изобретению), обладающего активностью лизофосфолипазы-трансацилазы (БРТА) или активностью лизофосфолипазы (ЕРБ) и лизофосфолипазы-трансацилазы (БРТА), или их сочетанием, и/или пататинподобной фосфолипазы (которая также может представлять собой фермент согласно изобретению). В одном аспекте все ферменты добавляют вместе или, альтернативно, ферменты добавляют в определенном порядке, например после добавления РЬС следует добавление РБА и/или пататина; или первым добавляют фермент или ферменты согласно изобретению, обладающие активностью РС и РЕ, затем вторым добавляют РЕРБС.
В одном аспекте такой способ улучшает выход в результате обработки фосфолипазой (например, РБС согласно изобретению). В одном аспекте указанный способ обеспечивает дополнительное снижение содержания фосфора в масле в результате обработки фосфолипазой (например, РБА согласно изобретению).
В одном аспекте изобретение относится к способам, включающим в себя применение фосфолипазы согласно изобретению, например РБС согласно изобретению, для уменьшения массы смолы и увеличения выхода нейтрального масла (триглицерида) за счет уменьшения удержания масла. В одном аспекте изобретение относится к способам, включающим в себя применение фосфолипазы согласно изобретению, например РБС согласно изобретению, для увеличения получения нейтральных масел и диацилглицерина (ОАС) в составе масляной фазы. В альтернативных аспектах способы согласно изобретению (например, способы дегуммирования) могут включать в себя применение одного или нескольких других ферментов, таких как протеаза, амилаза, липаза, кутиназа, другая фосфолипаза (включая, например, фермент согласно изобретению), карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, манназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, осидаза, например лактаза и/или пероксидаза, или полипептид с эквивалентной активностью либо их сочетание.
Фосфолипазы согласно изобретению можно использовать на различных стадиях обработки растительного масла, таких как экстракция растительного масла, особенно на стадии удаления фосфолипид
- 84 015591 ных смол в процессе, называемом дегуммированием масла, который описан выше. Настоящее изобретение относится к способам обработки растительных масел из различных источников, таких как рисовые отруби, соя, рапс, арахис и другие орехи, кунжут, подсолнечник, пальма и кукуруза. Такие способы могут быть использованы в сочетании со способами, основанными на экстракции гексаном с последующим рафинированием неочищенных экстрактов до получения пищевых масел, включающим в себя использование способов и ферментов согласно изобретению. Первая стадия способа рафинирования представляет собой так называемый процесс дегуммирования, который служит для отделения фосфатидов при добавлении воды. Материал, преципитированный в результате дегуммирования, отделяют и затем обрабатывают до получения смесей лецитинов. Коммерческие лецитины, такие как соевый лецитин и лецитин подсолнечника, представляют собой полутвердые или очень вязкие материалы. Они состоят из смеси полярных липидов, в основном фосфолипидов, и масла, главным образом триглицеридов.
Фосфолипазы согласно изобретению могут быть использованы в любом способе дегуммирования, включая дегуммирование водой, дегуммирования масла с использованием А^С0N (например, в случае соевых бобов), дегуммирование с использованем 8аГшсо, супер-дегуммирование, ИЕ-дегуммирование, Т0Р-дегуммирование, уни-дегуммирование, сухое дегуммирование и дегуммирование с использованием ΕNΖΥΜАX™. Смотри, например, патенты США №№ 6355693, 6162623, 6103505, 6001640, 5558781, 5264367. Различные способы дегуммирования, включенные в способы настоящего изобретения, описаны в работе Воск18сЬ, Μ. (1998) Ιη Еа18 апй 0ί1δ НапйЬоок, ТНс Ех1гасюп оГ Уеде1еЬ1е 0ΐ1δ (Скар1ег 5), 345-445, А0С8 Ргезз, Скатра1дп, Шшо18. Фосфолипазы согласно изобретению можно использовать при промышленном применении ферментативного дегуммирования триглицеридных масел, как описано, например, в ЕР 513709.
В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению используют для обработки растительных масел, например неочищенных масел, таких как масел из рисовых отрубей, сои, канолы, подсолнечника и т.п. В одном аспекте применение фосфолипаз повышает эффективность процесса дегуммирования. В одном аспекте изобретение относится к способам ферментативного дегуммирования в условиях с низким содержание воды, например, в диапазоне примерно от 0,1 до 20% воды или от 0,5 до 10% воды. В одном аспекте это приводит к лучшему отделению тяжелой фазы от масляной фазы во время центрифугирования. Улучшенное разделение указанных фаз может приводить к более эффективному удалению фосфолипидов из масла, включая как гидратируемые, так и негидратируемые масла. В одном аспекте такой способ может давать фракцию смол, которая содержит меньше задерживаемого в них нейтрального масла (триглицеридов), тем самым повышая общий выход масла в процессе дегуммирования.
В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению, например полипептид, обладающий активностью РЬС, применяют для обработки масел (например, растительных масел, включая неочищенные масла, такие как масло из рисовых отрубей, сои, канолы, подсолнечника и т.п.), например, в способе дегуммирования, чтобы уменьшить массу смол и увеличить выход нейтрального масла за счет уменьшения удерживания масла. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению, например полипептид, обладающий активностью РЬС, применяют для получения диацилглицерина (ΌΛΟ) и включения его в масляную фазу.
Фосфолипазы согласно изобретению могут быть использованы в промышленном применении ферментативного дегуммирования, как описано, например, в СА 1102795, где раскрыт способ выделения полярных липидов из липидов зерновых культур путем добавления по меньшей мере 50 мас.% воды. Указанный способ представляет собой модификацию процесса дегуммирования, в том смысле, что он работает по принципу добавления воды к неочищенной масляной смеси.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к ферментативным способам, включающим в себя применение фосфолипаз согласно изобретению (например, РЬС), которые заключаются в гидролизе гидратированных фосфолипидов в масле при температуре примерно от 20 до 40°С, при щелочных значениях рН, в частности при рН примерно от 8 до 10, с использованием времени реакции примерно от 3 до 10 мин. Указанный способ может привести к достижению конечного уровня фосфора в масле менее 10 ч./млн. Настоящее изобретение также относится к ферментативным способам, включающим в себя применение фосфолипаз согласно изобретению (например, РЬС), которые заключаются в гидролизе гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в масле при температуре примерно от 50 до 60°С, при рН несколько ниже нейтрального, например, при значениях рН от 5 до 6,5 с использованием времени реакции примерно от 30 до 60 мин. Указанный способ может привести к достижению конечного уровня фосфора в масле менее 10 ч./млн.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к ферментативным способам, в которых применяют фермент фосфолипазу С, чтобы гидролизовать глицерилфосфоэфирные связи и тем самым обеспечить возможность возврата диацилглицеридной часть фосфолипидов в масло, например в растительное масло, рыбий жир или масло из водорослей (фосфолипаза С (РЬС) как вспомогательное средство при каустическом рафинировании) и снизить содержание фосфолипидов на стадии дегуммирования до достаточно низких уровней с тем, чтобы проводить физическую очистку масел с высоким содержанием фосфора (фосфолипаза С (РЬС) как вспомогательное средство при дегуммировании). Оба подхода могут
- 85 015591 приводить к достижению разных показателей и имеют разные целевые применения.
В различных приведенных в качестве примерах способах согласно изобретению ряд отдельных стадий включает в себя процесс дегуммирования, предшествующий основному процессу обесцвечивания и дезодорации при рафинировании. Указанные стадии включают в себя нагревание, смешивание, отстаивание, разделение и сушку. После стадии нагревания добавляют воду и часто кислоту и перемешивают с тем, чтобы дать возможность нерастворимой фосфолипидной смоле собраться в частицы, которые могут быть отделены. В то время как вода позволяет отделить многие из фосфатидов при дегуммировании, часть фосфолипидов представляет собой негидратируемые фосфатиды ЩНР), присутствующие в виде кальциевых или магниевых солей. Процессы дегуммирования включают в себя обработку таких Ν^ добавлением кислоты. После гидратации фосфолипидов масло перемешивают, отстаивают и отделяют центрифугированием. В конце масло подвергают сушке и хранят, отправляют или очищают, как показано, например, на фиг. 6. Полученные смолы либо обрабатывают дальше до лецитиновых продуктов, либо возвращают в измельченный материал.
В различных иллюстративных способах согласно изобретению уровни фосфора снижают до показателей, достаточных для физической очистки. Процесс отделения может приводить к потенциально более высоким потерям, чем каустическое рафинирование. Кроме того, процессы дегуммирования могут приводить к образованию отходов, которые нельзя предлагать в качестве коммерческого лецитина, смотри, например, фиг. 7, на которой проиллюстрирован типичный способ дегуммирования для физически очищенного масла. Поэтому продукты, полученные такими способами, не заняли существенной части рынка, и способы каустического рафинирования продолжают доминировать в промышленности при обработке рисовых отрубей, сои, канолы и подсолнечника. Однако следует отметить, что фермент фосфолипаза С, используемый в специальном процессе дегуммирования, может снижать образование смол и возвращает диглицеридную часть фосфолипида назад в масло.
В одном аспекте изобретение относится к способам применения РЬС согласно изобретению во фракции смолы. В одном аспекте указанного способа масло добавляют к неочищенному маслу для образования эмульсии, что приводит к переходу фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола в водную фазу (дегуммирование водой). После центрифугирования такие фосфолипиды являются основными компонентами водной фракции смолы. Фосфолипиды во фракции смолы могут быть обработаны фосфолипазой С или фосфолипазой Ό плюс фосфатазой (или другими сочетаниями, указанными ниже), чтобы получить диацилглицерин (ОАО) и сложный фосфатный эфир. В указанной точке ОАО может быть экстрагирован из других компонентов смол и обработан липазой в условиях, подходящих для переэтерификации ОАО с образованием требуемого триацилглицерина (структурированного липида).
В другом аспекте большая часть 1,2-ЭАС может быть превращена в 1,3-ЭАС посредством увеличения рН смолы после реакции с участием РЬС, например, при добавлении каустического средства. Затем
1,3-ЭАС можно экстрагировать из смолы и подвергнуть взаимодействию с липазой в условиях, подходящих для переэтерификации 1,3-ЭАС в положении зп2, чтобы получить требуемый структурированный триацилглицерин.
В альтернативных аспектах жирные кислоты, используемые в реакции переэтерификации, могут быть из разных источников, включая свободные жирные кислоты, имеющиеся в неочищенном масле.
В одном аспекте фосфолипиды, полученные при дегуммировании водой, используют в сочетании с РЬС согласно изобретению для получения структурированных липидов. Дегуммированное водой масло может быть подвергнуто воздействию ферментов РЬС и/или РЬЬ (любой из них или оба фермента могут представлять собой ферменты согласно изобретению) плюс воздействию фосфатазы или одной из их комбинаций, затем РЬА (которая может представлять собой фермент согласно изобретению), чтобы уменьшить уровни фосфора до уровней, подходящих для каустического или физического рафинирования.
В альтернативных вариантах комбинации ферментов, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, включая способы дегуммирования, состоят из следующих ферментов (при этом один, несколько или все ферменты в комбинации представляют собой ферменты согласно настоящему изобретению):
1) РЬС + Р1-РЬС + РЬА (РЬА добавляют после завершения реакций с участием РЬС);
2) РЬЬ + фосфатаза + Р1-РЬС, затем РЬА; или
3) РЬС или (РЬС + Р1-РЬС) + РЬА, специфичная для фосфатидной кислоты (все ферменты добавляют вместе или последовательно).
Каустическое рафинирование
Настоящее изобретение относится к способам применения фосфолипаз (включая ферменты согласно изобретению) в каустическом рафинировании, при этом ферменты применяют в качестве вспомогательных средств при каустическом рафинировании. В альтернативных аспектах РЬС или РЬЭ и/или фосфатазу применяют в способах в виде вспомогательных средств либо до, либо во время, либо после процесса рафинирования с использованием нейтрализации каустическим средством (либо непрерывного, либо периодического рафинирования). Количество добавляемого фермента может варьировать в зависи
- 86 015591 мости от характера процесса. Уровень воды, используемый в способе, может быть низким, например, от 0,5 до 5%. Альтернативно, каустическое средство можно добавлять в процесс несколько раз. Кроме того, данный способ может быть осуществлен при разных температурах (25-70°С), с разными кислотами или каустическими веществами и при варьирующих значениях рН (4-12). Могут быть использованы концентрированные растворы каустического средства, например более концентрированные, чем промышленный стандарт 11%, чтобы уменьшить массу смолы. В альтернативных аспектах концентрированный раствор каустического средства имеет концентрацию примерно от 12 до 50%, например примерно 20, 30, 40, 50 или 60% или более концентрированный.
В одном аспекте фермент фосфолипаза С согласно изобретению гидролизует фосфатид по глицерилфосфоэфирной связи с образованием диглицерида и водорастворимого фосфатного соединения. Гидролизованный фосфатид переходит в водную фазу, оставляя диглицерид в масляной фазе, как показано на фиг. 8. Одной из целей использования РЬС в качестве вспомогательного средства при каустическом рафинировании является превращение фосфолипидных смол, образующихся при нейтрализации, в диацилглицерид, который переходит назад в масляную фазу. Тогда как одной из целей использования РЬС в качестве вспомогательного средства при дегуммировании является снижение уровня фосфолипидов в неочищенном масле до эквивалента фосфора, составляющего менее 10 частей на миллион (ч./млн).
Кислоты, которые могут быть использованы в способе каустического рафинирования, включают без ограничения, фосфорную, лимонную, аскорбиновую, серную, фумаровую, малеиновую, хлористоводородную и/или уксусную кислоты. Кислоты используют для гидратации негидратируемых фосфолипидов. Каустики, которые могут быть использованы, включают без ограничения К0Н и №10Н. Каустики используют для нейтрализации свободных жирных кислот. Альтернативно, фосфолипазы, или более конкретно, РЬС или РЬО, и фосфатазу используют для очистки фитостеринов из смолы/соапстока.
Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения, относящийся к добавлению фосфолипазы перед каустическим рафинированием, включает в себя экспрессию фосфолипазы в растении. В другом варианте фосфолипазу добавляют в процессе дробления растения, семян или других частей растения. Альтернативно, фосфолипазу добавляют после дробления, но перед рафинированием (т.е. в сосуде, где происходит выдерживание). Кроме того, фосфолипазу добавляют в качестве средства для предварительной обработки при рафинировании вместе с кислотой или без кислоты.
Другой вариант настоящего изобретения, уже описанный выше, относится к добавлению фосфолипазы в процессе рафинирования с использованием каустиков. В данном способе уровни кислоты и каустика варьируют в зависимости от уровня фосфора и от уровня свободных жирных кислот. Кроме того, в данном способе используют широкий диапазон значений температур и рН в зависимости от типа используемого фермента.
В другом варианте изобретения фосфолипазу добавляют после каустического рафинирования (фиг. 9). В одном случае фосфолипазу добавляют в смеситель с интенсивным перемешиванием или в смеситель для непрерывного смешивания жидких потоков перед разделением. Альтернативно, фосфолипазу добавляют после стадии нагревания. В другом варианте фосфолипазу добавляют на стадии центрифугирования. В дополнительном варианте фосфолипазу добавляют к соапстоку. Альтернативно, фосфолипазу добавляют к промывной воде. В другом случае фосфолипазу добавляют в процессе обесцвечивания и/или на стадии дезодорации.
В одном аспекте фермент фосфолипаза, например фосфолипаза С, согласно изобретению гидролизует фосфатид как из гидратируемых, так и негидратируемых фосфолипидов в нейтрализованных неочищенных и дегуммированных маслах перед обесцвечиванием и дезодорацией. Пример способа каустического рафинирования согласно изобретению показан на фиг. 9 и 13. На фиг. 9 приведены примерные значения времени, температуры и рН для статического смесителя (30-60 мин, 50-60°С, рН 5-6,5) и смесителя для непрерывного смешивания жидких потоков (3-10 мин, 20-40°С). Целевой фермент можно использовать в качестве вспомогательного продукта в существующем процессе нейтрализации каустическим средством, как показано на фиг. 9. В данном аспекте не требуется, чтобы фермент противостоял экстремальным значениям рН, если его добавляют после введения каустического средства. Как показано на фиг. 13 (типичный способ с загрузкой фермента вначале процесса), любая фосфолипаза, включая, например, фосфолипазу согласно изобретению, такую как РЬС, РЬВ, РЬА и/или РЬС, может быть использована в способе дегуммирования неочищенного масла, который описан, например, в Ва11еу'§ ΙηΦίδΙπηΙ 011 апй Еа1 РгойисЦ ν. 4 (ей. ΥΉ. Нш). На фиг. 14 и 15 показаны варианты осуществления способов согласно изобретению, в случае которых используют две или три стадии центрифугирования, соответственно, такие способы могут быть использованы для обработки любого масла, например, растительного масла, такого как неочищенное соевое масло, как показано на чертежах. В иллюстративном способе, показанном на фиг. 15, использована стадия центрифугирования перед каустическим рафинированием (дополнительно к стадии центрифугирования после каустического рафинирования и перед промывкой водой и после промывки водой), тогда как в иллюстративном способе, показанном на фиг. 14, нет стадии центрифугирования перед каустическим рафинированием. Фиг. 16 иллюстрирует другой иллюстративный вариант данного способа с использованием обработки кислотой, в котором имеется ста
- 87 015591 дия центрифугирования перед стадий дегуммирования; такой иллюстративный способ может быть использован для обработки любого масла, например растительного масла, такого как неочищенное соевое масло, как показано на чертеже.
В одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению позволяет удалять фосфор до низких уровней, пригодных для физической очистки. В одном аспекте РЬС согласно изобретению будет гидролизовать фосфатид как в гидратируемых, так и негидратируемых фософлипидах в неочищенных маслах перед обесцвечиванием и дезодорацией. Целевой фермент может быть внесен в виде дополнительного вспомогательного средства в существующий процесс дегуммирования, смотри, например, фиг. 10. При использовании субоптимального перемешивания в условиях коммерческого оборудования вполне вероятно может потребоваться кислота для приведения негидратируемых фосфолипидов в контакт с ферментом на границе раздела масло/вода. Поэтому в одном аспекте используют кислотостабильную РЬС согласно изобретению.
В одном аспекте способ дегуммирования с добавлением РЬС согласно изобретению может устранять потери в одной или всех трех зонах, отмеченных в табл. 2. Потери, связанные с процессом обработки РЬС, могут составлять примерно 0,8% по сравнению с 5,2 мас.% за счет удаления фосфатида.
Таблица 2
Потери, связанные с получением продуктов при обработке РЬС
Добавка при каустиче ском рафинировании Добавка при дегуммировании
1) Потери масла при образовании и отделении смолы 2,1% X X
2) Омыленное масло при добавлении каустика 3,1% X
3) Масло, оставшееся в глине при обесцвечивании* <1,0% X X
Суммарные потери выхода -5,2% -2,1% -5,2%
Дополнительные возможные преимущества рассматриваемого способа согласно изобретению включают в себя следующие:
уменьшение расхода адсорбентов - требуется меньшее количество адсорбентов при снижении уровня фосфора (<5 ч./млн);
снижение расхода химических средств - снижение затрат на химические средства и обработку связано с осуществлением гидратации негидратируемых фосфолипидов;
уменьшение образования отходов - требуется меньше воды для удаления фосфора из масла.
Масла, обрабатываемые способом согласно настоящему изобретению (например, дегуммированные), представляют собой растительные масла из масличных культур, например соевое масло, рапсовое масло, масло из рисовых отрубей и подсолнечное масло. В одном аспекте добавка РЬС в качестве вспомогательного средства при каустическом рафинировании согласно изобретению может сохранить дополнительно 1,2% относительно выхода при использовании существующих способов каустического рафинирования. Применение такого вспомогательного средства в процессе рафинирования относится к соевому маслу, которое подвергнуто дегуммированию для получения лецитина, и соответствующие проценты также исключены из расчетов значение/загрузка.
Цели, достигаемые в случае применения способов согласно изобретению, могут варьировать в зависимости от соответствующих применений и, более конкретно, от момента добавления фермента, смотри табл. 3.
- 88 015591
Таблица 3
Цели, достигаемые в случае применения
Добавка при каустическом рафинир о в а нии Добавка при дегуммировании
Уровни фосфора в поступающем масле <200 ч/млн.* 600-1400 ч/млн.
Уровни фосфора в готовом масле <10 ч/млн.т <10 ч/млн.
Гидратируемые и не гидра тируемые смолы Да Да
Продолжительность обработки 3-10 минут 30 минут*
Жидкий препарат Да Да
Целевое значение рН 8-10”’ 5,0-5, 5”
Целевая температура 20-40°С ~50-60°С
Содержание воды <5% 1-1,25%
Чистота препарата ферментов Отсутствует липаза/протеаза1 Отсутствует липаза/протеаза
Другие ключевые требования Удаление Ге Удаление Ее
* - масло, дегуммированное водой целевые уровни, достигаемые на стадии каустической нейтрализации выше по потоку, но которые должны поддерживать ся * - существующие 1-2 ч ф* - кислотное дегуммирование, в случае которого может требоваться фермент, который стабилен в намного более кислых условиях: при рН 2,3 в случае лимонной кислоты в концентрации 5% (-КоеЬш ϋ3ΡΝ 6001640);
*** - рН нейтрализованного масла не является нейтральным.
Тестирование РОЗ показывает, что рН может находиться в щелочном диапазоне от 6,5 до 10 (9 декабря 2002 г.). Обычно следует определять диапазон рН.
Фосфолипазу согласно изобретению можно использовать также в других способах, например, фосфолипаза А1 может превращать негидратируемые нативные фосфолипиды в их гидратируемую форму. В одном аспекте фермент чувствителен к нагреванию. Такое свойство может быть желательным, поскольку нагревание масла может разрушить фермент. Однако реакционная смесь при дегуммировании должна быть доведена до значений рΗ 4-5 и до температуры 60°С с целью создания соответствующих условий для данного фермента. С использованием насыщающей дозы 300 единиц/кг указанный типичный способ позволяет успешно снижать содержание фосфора в предварительно дегуммированном водой масле до уровня 10 ч./млн Р. Преимуществом способа может быть снижение содержания Η20, что в итоге ведет к экономии, достигаемой на стадии ее применения, обработки и утилизации отходов. В табл. 4 перечислены примерные направления промышленного применения ферментов согласно изобретению.
Таблица 4
Пример использования
Добавка при каустическом рафинировании Добавка при де гуммиров ании
Получение соевого масла/лецитина X
Химически рафинированное соевое масло, подсолнечное масло, масло канолы X X
Масло с низким содержанием фосфатидов (например, пальмовое) X
В дополнение к указанным различным процессам дегуммирования фосфолипазы согласно изобретению также можно использовать на любой стадии обработки растительного масла. Например, фосфолипазные ферменты согласно изобретению можно использовать вместо Р1 ,А, например фосфолипазы А2, на любой стадии обработки растительного масла. Масла, которые обрабатывают или дегуммируют способами согласно настоящему изобретению, включают соевые масла, рапсовые масла, кукурузные масла, масло из пальмовых косточек, масла канолы, подсолнечные масла, кунжутные масла, арахисовые масла, масла из рисовых отрубей и т.п. Основные продукты, получаемые указанным способом, представляют собой триглицериды.
В одном типичном способе, в котором фермент добавляют и подвергают взаимодействию с неочищенным маслом, количество используемой фосфолипазы составляет примерно 10-10000 единиц, или,
- 89 015591 альтернативно, примерно 100-2000 единиц на 1 кг неочищенного масла. Ферментативную обработку проводят в течение периода времени от 5 мин до 10 ч при температуре 30-90°С, или, альтернативно, при температуре примерно 40-70°С. Условия могут варьировать, в зависимости от оптимальной температуры для фермента. Количество добавляемой воды для растворения фермента составляет 5-1000 мас. ч. на 100 мас. ч. неочищенного масла или, альтернативно, примерно 10-200 мас. ч. на 100 мас. ч. неочищенного масла.
После завершения такой ферментативной обработки содержащую фермент жидкость отделяют соответствующими способами, например в центробежном сепараторе, и затем обрабатывают полученное масло. Фосфорсодержащие соединения, получаемые при ферментативном разложении смолистых веществ таким способом, практически полностью переходят в водную фазу и удаляются из масляной фазы. После завершения ферментативной обработки обработанное масло, при необходимости, может быть дополнительно промыто водой или органической или неорганической кислотой, такой как, например, уксусная кислота, лимонная кислота, фосфорная кислота, янтарная кислота и эквивалентные кислоты, или растворами солей.
В одном примере способа проведения дегуммирования с использованием ультрафильтрации фермент связывают с фильтром или фермент добавляют в масло перед фильтрованием либо фермент используют для периодической очистки фильтров.
В одном примере способа осуществления опосредованной фосфолипазой вспомогательной обработки при физическом рафинировании воду и фермент добавляют к неочищенному маслу (например, неочищенному растительному маслу). В одном аспекте в данном способе используют РЬС или РЬИ согласно изобретению и фосфатазу. При физической очистке, опосредованной фосфолипазой, уровень воды может быть низким, например 0,5-5%, и продолжительность процесса небольшая (менее 2 ч, или менее 60 мин, или менее 30 мин, или менее 15 мин, или менее 5 мин). Способ может быть осуществлен при разных температурах (25-70°С) с использованием разных кислот и/или каустических средств, при разных значениях рН (например, 3-10).
В альтернативных аспектах сначала проводят дегуммирование водой для сбора лецитина путем центрифугирования и затем добавляют РЬС или РЬС и РЬА для удаления негидратируемых фосфолипидов (способ должен проводиться при низкой концентрации воды). В другом аспекте проводят дегуммирование водой неочищенного масла до содержания фосфора менее 10 ч./млн (пищевые масла) и последующую физическую очистку (менее 50 ч./млн для биодизельных масел). В одном аспекте добавляют эмульгатор и/или неочищенное масло подвергают обработке в высокоскоростном смесителе для усиления перемешивания. Альтернативно, добавляют деэмульгатор и/или неочищенное масло нагревают, чтобы стимулировать отделение водной фазы. В другом аспекте добавляют кислоту, способствующую гидратации негидратируемых фосфолипидов. Дополнительно, фосфолипазы могут использоваться для облегчения очистки фитостеринов из смолы/соапстока.
В одном аспекте изобретение относится к композициям и способам (которые могут включать в себя применение фосфолипаз согласно изобретению) для дегуммирования масла, включающим в себя использование различных количеств кислоты и основания без получения соапстока. В случае применения указанного аспекта изобретения для дегуммирования масла можно использовать кислоту (включая фосфорную и/или лимонную) для гидратации негидратируемых фосфолипидов в маслах с высоким содержанием фосфора (включая соевое масло, масло канолы и подсолнечника). После гидратирования фосфолипидов рН водной фазы можно увеличить, используя добавление каустика: определенное количество добавляемого каустика может давать значение рН предпочтительно для активности фермента, но не будет приводить к образованию существенной фракции соапстока в масле. Поскольку соапсток не образуется, свободные жирные кислоты, имеющиеся в масле, могут быть удалены ниже по потоку после стадии дегуммирования во время обесцвечивания и дезодорации.
Ферменты согласно изобретению используют для улучшения экстракции масла и дегуммирования масла (например, растительных масел). В одном аспекте РЬС согласно изобретению и по меньшей мере одно средство, разрушающее клеточные стенки растений (например, целлюлазу, гемицеллюлазу или тому подобные, чтобы размягчить стенки и увеличить выход экстракции) используют в способе согласно изобретению. В таком примере способа применения ферментов согласно изобретению для улучшения экстракции масла и дегуммирования масла фосфолипазу С согласно изобретению, а также другие гидролазы (например, целлюлазу, гемицеллюлазу, эстеразу, протеазу и/или фосфатазу) используют во время стадий измельчения при производстве масла (включая без ограничения масло из сои, канолы, подсолнечника, рисовых отрубей). Используя ферменты перед или вместо экстракции растворителем, можно увеличить выход масла и уменьшить количество гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в неочищенном масле. Снижение содержания негидратируемых фосфолипидов может быть результатом превращения потенциально негидратируемых фосфолипидов в диацилглицерин и соответствующий сложный фосфатный эфир перед образования комплекса с кальцием или магнием. Общее снижение содержания фосфолипидов в неочищенном масле приведет к повышенным выходам при рафинировании и возможному исключению потребности в отдельной стадии дегуммирования перед осветлением и дезодо
- 90 015591 рацией.
В одном аспекте изобретение относится способу применения фосфолипазы согласно изобретению (например, фосфолипазаспецифичная фосфогидролаза согласно изобретению) или другой фосфолипазы В модифицированном способе органического рафинирования, который может включать в себя добавление ферментов (например, РЬС) в чан с лимонной кислотой.
Ферменты согласно изобретению можно применять в любом способе обработки масла, например при дегуммировании или эквивалентных процессах. Например, ферменты согласно изобретению могут быть использованы в способах, описанных в патентах США № 5558781, 5264367, 6001640. Способ, описанный в υ8ΡN 5558781, включает в себя использование фосфолипазы А1, А2 или В, в значительной степени разрушающей лецитин в маслах, который выполняет функцию эмульгатора.
Ферменты и способы согласно изобретению могут быть использованы в способах снижения уровня фосфорсодержащих компонентов в пищевых маслах, включая высокое содержание негидратируемого фосфора, за счет использования фосфолипазы согласно изобретению, например полипептида, обладающего активностью фосфолипазы А и/или В, как описано, например, в ЕР патенте № 0869167. В одном аспекте пищевое масло представляет собой неочищенное масло, так называемое недегуммированное масло. В одном аспекте данный способ используют для обработки недегуммированного масла, включая масло, полученное прессованием, или экстрагированные масла, или их смеси, полученные, например, из рапса, сои, кунжута, арахиса, кукурузы, рисовых отрубей или подсолнечника. Содержание фосфатидов в неочищенном масле может варьировать от 0,5 до 3% мас./мас., соответствующих содержанию фосфора в диапазоне от 200 до 1200 ч./млн или в диапазоне от 250 до 1200 ч./млн. Кроме фосфатидов, неочищенное масло может также содержать небольшие концентрации углеводов, соединений сахаров и комплексов металл/фосфатидная кислота, включающих в себя Са, Мд и Ре. В одном аспекте данный способ включает в себя обработку фосфолипида или лизофосфолипида фосфолипазой согласно изобретению для гидролиза ацильной группы жирной кислоты. В одном аспекте фосфолипид или лизофосфолипид представляет собой лецитин или лизолецитин. В одном аспекте способа пищевое масло характеризуется содержанием фосфора примерно от 50 до 250 ч./млн и способ включает в себя обработку масла фосфолипазой согласно изобретению для гидролиза основной части фосфолипида и отделения от масла водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид. В одном аспекте перед процессом ферментативного дегуммирования масло подвергают дегуммированию водой. В одном аспекте данные способы обеспечивают получение корма для животных, содержащего смесь фосфолипазы согласно изобретению с кормовыми веществами и по меньшей мере одним фосфолипидом.
Ферменты и способы согласно изобретению можно использовать в способах дегуммирования масла, как описано, например, в \У0 98/18912. Фосфолипазы согласно изобретению могут быть использованы для снижения содержания фосфолипида в пищевом масле. Указанный способ может включать в себя обработку масла фосфолипазой согласно изобретению для гидролиза основной части фосфолипида и отделения от масла водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид. Такой способ применим для очистки любого пищевого масла, которое содержит фосфолипид, например растительных масел, таких как соевое масло, масло из рисовых отрубей, рапсовое масло и подсолнечное масло, рыбий жир, масло из водорослей, животные жиры и т.п. Перед ферментативной обработкой растительное масло предпочтительно подвергают предварительной обработке для удаления слизи (растительного клея), например, путем влажного рафинирования. Масло может содержать примерно от 50 до 250 ч./млн или от 50 до примерно 1500 ч./млн либо больше фосфора в составе фосфолипида перед началом обработки фосфолипазой, и способ согласно изобретению позволяет снизить указанное значение до величин ниже 5-10 ч./млн.
Ферменты согласно изобретению можно использовать в способах, которые описаны в заявке на выдачу патента 1Р № Н5-132283, зарегистрированной 25 апреля 1993 г., в которой описан способ очистки масел и жиров, включающий в себя стадию превращения фосфолипидов, присутствующих в маслах и жирах, в водорастворимые вещества, содержащие группы фосфорной кислоты, и удаления их в виде водорастворимых веществ. Действие ферментов используют для превращения в водорастворимые вещества. Предпочтительно в качестве такого фермента используют фермент, обладающий активностью фосфолипазы С.
Ферменты согласно изобретению можно использовать в способе, который описан как способ органического рафинирования (ОКР) (ШН, ОтаДа, №), который представляет собой способ рафинирования масел из семян масличных культур. ОКР может иметь преимущества по сравнению с традиционным химическим рафинированием, включая повышенный выход очищенного масла, дополнительные ценные продукты, снижение капитальных вложений и снижение расходов, связанных с предупреждением загрязнения окружающей среды.
Ферменты согласно изобретению могут быть использованы в способах обработки масла или жира, животного или растительного происхождения, сырого, полуобработанного или рафинированного, включающих в себя добавление к такому маслу или жиру по меньшей мере одного фермента согласно изобретению, который позволяет осуществлять гидролиз и/или деполимеризацию неглицеридных соединений, содержащихся в масле, как описано, например, в заявке на выдачу европейского патента 82870032.8. Ти
- 91 015591 пичные способы гидролиза и/или деполимеризации неглицеридных соединений в маслах включают в себя следующие обработки.
1. Добавление и смешивание в маслах и жирах фермента согласно изобретению или ферментных комплексов, предварительно растворенных в небольшом количестве подходящего растворителя (например, воды). Можно использовать ряд растворителей, но выбирают нетоксичный и приемлемый для фермента растворитель. Указанное добавление может быть выполнено в процессах, включающих в себя последовательное введение, а также в непрерывных процессах. Количество фермента(ов), необходимое для добавления к маслам и жирам в соответствии с настоящим способом, может варьировать в зависимости от ферментов и продуктов, подлежащих обработке, примерно от 5 до 400 ч./млн или примерно от 20 до 400 ч./млн, например от 0,005 до 0,4 кг фермента на 1000 кг масла или жира, и предпочтительно от 5 до 100 ч./млн, т.е. от 0,005 до 0,1 кг фермента на 1000 кг масла, и следует понимать, что указанные значения относятся к концентрированным ферментам, т.е. без добавления разбавителя или растворителя.
2. Пропускание масла или жира через фиксированный или нерастворимый фильтрующий слой фермента(ов) согласно изобретению, находящегося на твердых или полутвердых подложках, которые предпочтительно имеют пористую или волокнистую структуру. В указанном способе ферменты улавливаются в микрополости пористой или волокнистой структуры подложек. Указанные подложки состоят, например, из смол или синтетических полимеров, карбонатов целлюлозы, гелей, таких как агароза, нитей полимеров или сополимеров с пористой структурой, захватывающих маленькие капельки ферментного раствора в свои полости. Что касается концентрации фермента, то ее можно доводить до концентрации, позволяющей насыщать подложки.
3. Дисперсию масел и жиров в виде мелких капелек в разбавленном ферментативном растворе, в альтернативных аспектах содержащем примерно от 0,05 до 4% или содержащем примерно от 0,2 до 4 об.% фермента согласно изобретению. Указанная методика описана, например, в патенте Бельгии № 595219. Цилиндрическую колонку высотой несколько метров с коническим колпачком заполняют разбавленным ферментативным раствором. Для данной цели выбирают растворитель, который является нетоксичным и не смешиваемым с маслами или жирами, подлежащими обработке, предпочтительно воду. Нижняя часть колонки снабжена системой распределения, в которую непрерывно впрыскивают масло или жир в чрезвычайно мелкодисперсной форме (примерно 10000 выбросов на м2). При этом образуется бесконечное число капелек масла или жира, которые медленно поднимаются в растворе ферментов, доходя до поверхности, где осуществляется их постоянный отбор через верхнюю часть конического колпачка реактора.
Пальмовое масло может быть предварительно обработано перед воздействием фермента согласно изобретению. Например, около 30 кг сырого пальмового масла нагревают до температуры +50°С. Готовят 1% растворы в дистиллированной воде с добавлением целлюлаз и пектиназ. Добавляют по 600 г каждого из них к водным растворам масла при сильном перемешивании в течение нескольких минут. Затем масло выдерживают при температуре +50°С в условиях умеренного перемешивания в течение общего времени реакции, равного двум часам. Затем температуру поднимают до +90°С для дезактивации ферментов и подготовки смеси для фильтрования и дальнейшей обработки. Масло сушат в вакууме и фильтруют через фильтрующее устройство.
Ферменты согласно изобретению можно использовать в способах, описанных в патенте ЕР 0513709 В2. Например, настоящее изобретение относится к способу снижения содержания количества фосфорсодержащих компонентов в животных жирах и растительных маслах путем ферментативного разложения с использованием фосфолипазы согласно изобретению. В альтернативных аспектах подвергнутые предварительной обработке для удаления клейких веществ животные жиры и растительные масла с содержанием фосфора примерно от 50 до 1500 ч./млн или примерно от 50 до 250 ч./млн встряхивают с органической карбоновой кислотой и значение рН в полученной смеси доводят до рН 4-6, и ферментативный раствор, содержащий фосфолипазу А1, А2 или В согласно изобретению, добавляют к смеси в резервуар при турбулентном перемешивании с образованием мелких капелек, где образуется эмульсия 0,5-5 мас.% относительно масла, при этом указанную эмульсию пропускают по меньшей мере еще через один следующий реакционный сосуд в результате турбулентного течения, где время реакции составляет от 0,1 до 10 ч при температурах в диапазоне от 20 до 80°С, и обработанное масло после отделения водного раствора имеет содержание фосфора ниже 5 ч./млн.
Способ органического рафинирования применим как к неочищенному, так и к дегуммированному маслу. В указанном способе используют добавление органической кислоты в условиях поточного контролируемого процесса в сочетании с традиционным отделением путем центрифугирования. Вода, естественно отделяемая от фосфолипидов растительного масла (УОР), возвращается в оборот и используется повторно. Суммарное потребление воды может быть существенно снижено в результате применения способа органического рафинирования.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут применяться при ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6162623. В указанных иллюстративных способах согласно изобретению используют амфифильный фермент. Такой фермент может быть
- 92 015591 иммобилизован, например, путем приготовления эмульсии, содержащей непрерывную гидрофобную фазу и дисперсную водную фазу, содержащую фермент и носитель для фермента, с последующим удалением воды из дисперсной фазы до превращения содержимого данной фазы в твердые частицы, покрытые ферментом. Такой фермент может представлять собой липазу. Иммобилизованная липаза может быть использована для реакций, катализируемых липазой, таких как переэтерификация моно-, ди- или триглицеридов, деацидификация триглицеридного масла или удаление фосфолипидов из триглицеридного масла, в тех случаях, когда липаза представляет собой фосфолипазу. Водная фаза может содержать жидкость после ферментации, пищевое триглицеридное масло может находиться в гидрофобной фазе, а используемые носители включают сахара, крахмал, декстран, водорастворимые производные целлюлозы и остатки ферментирования. Указанный типичный способ может быть использован для обработки триглицеридов, диглицеридов, моноглицеридов, глицерина, фосфолипидов, гликолипидов или жирных кислот, которые могут находиться в гидрофобной фазе. В одном аспекте способ удаления фосфолипидов из глицеридного масла включает в себя смешивание триглицеридного масла, содержащего фосфолипиды, с препаратом, содержащим фосфолипазу согласно изобретению; гидролиз фосфолипидов до лизофосфолипидов; отделение гидролизованных фосфолипидов от масла, при этом фосфолипаза представляет собой иммобилизованную фосфолипазу.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут применяться при ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6127137. Указанный способ включает в себя гидролиз обеих ацильных групп жирных кислот в интактном фосфолипиде. Фосфолипаза согласно изобретению, используемая в данном способе, не обладает липазной активностью и активна при очень низких значениях рН. Указанные свойства делают ее пригодной для использования в процессе дегуммирования масла, где и ферментативный, и щелочной гидролиз (сапонификация) масла могут быть подавлены. В одном аспекте изобретение относится к способу гидролиза ацильных групп жирных кислот в фосфолипиде или в лизофосфолипиде, включающему в себя обработку фосфолипида или лизофосфолипида фосфолипазой, которая гидролизует обе ацильные группы жирных кислот в фосфолипиде и которая, по существу, не обладает липазной активностью. В одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению имеет температурный оптимум примерно при 50°С, измеряемый при значении рН от 3 до 4 в течение 10 мин и оптимум рН, примерно при значении 3, измеряемый при температуре 40°С в течение примерно 10 мин. В одном аспекте фосфолипид или лизофосфолипид представляет собой лецитин или лизолецитин. В одном аспекте после гидролиза основной части фосфолипида водную фазу, содержащую гидролизованный фосфолипид, отделяют от масла. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу удаления фосфолипида из пищевого масла, включающему в себя обработку масла при рН 1,5-3 дисперсией водного раствора фосфолипазы согласно изобретению и отделение от масла водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид. В одном аспекте масло подвергают обработке для удаления клейких веществ перед обработкой фосфолипазой. В одном аспекте масло перед обработкой фосфолипазой содержит фосфолипид в количестве, соответствующем 50-250 ч./млн фосфора. В одном аспекте обработку фосфолипазой проводят при 30-45°С в течение периода времени от 1 до 12 ч при дозировке фосфолипазы от 0,1 до 10 мг/л в присутствии 0,5-5% воды.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут применяться при ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6025171. В указанных примерах способов ферменты согласно изобретению иммобилизуют путем получения эмульсии, содержащей непрерывную гидрофобную фазу, такую как глицеридное масло, и дисперсную водную фазу, содержащую амфифильный фермент, такой как липаза или фосфолипаза согласно изобретению, а также материал носителя, который частично растворяется и частично не растворяется в водной фазе, с последующим удалением воды из водной фазы до превращения содержимого указанной фазы в твердые частицы носителя, покрытые ферментом. Нерастворенная часть материала носителя может представлять собой материал, нерастворимый в воде и масле, или водорастворимый материал в нерастворенной форме, из-за того что водная фаза уже насыщена водорастворимым материалом. Водная фаза может быть образована жидкостью после ферментирования с неочищенной липазой, содержащей остатки ферментации и биомассу, которые могут служить в качестве материала носителя. Иммобилизованную липазу используют для эфирной перегруппировки и деацидификации масла. После проведения реакции иммобилизованный фермент может быть подвергнут регенерации для последующей реакции путем добавления воды для частичного растворения носителя, после чего гидрофобную фазу, в которой диспергирована водная фаза с полученным ферментом и носителем, подвергают выпариванию для удаления воды, чтобы вновь образовать частицы носителя, покрытые ферментом.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут быть использованы при ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6143545. Приведенный типичный способ используют для снижения содержания фосфорсодержащих компонентов в пищевом масле, включающем в себя большое количество негидратируемого фосфора, с использованием фосфолипазы согласно изобретению. В одном аспекте указанный способ используют для снижения содержания фосфорсодержащих компонентов в пищевом масле, имеющем содержание негидратируемого фосфора по
- 93 015591 меньшей мере 50 ч./млн, которое измеряют с использованием предварительной обработки пищевого масла при 60°С, добавления раствора, содержащего моногидрат лимонной кислоты в воде (количество добавляемой воды относительно масла составляет 4,8% мас./мас.; (лимонная кислота) в водной фазе = 106 мМ, в эмульсии вода/масло = 4,6 мМ) на 30 мин; переноса 10 мл предварительной обработанной эмульсии типа вода-в-масле в пробирку; нагревания эмульсии на кипящей водяной бане в течение 30 мин; центрифугирования со скоростью 5000 об/мин в течение 10 мин; переноса примерно 8 мл из верхней (масляной) фазы в новую пробирку, которую оставляют для осаждения на 24 ч; и отбора 2 г из верхней прозрачной фазы для измерения содержания негидратируемого фосфора (ч./млн) в пищевом масле. Данный способ также может включать в себя осуществление контакта масла при рН примерно от 5 до 8 с водным раствором фосфолипазы А или В согласно изобретению (например, РЬА1, РЬА2 или РЬВ), при котором данный раствор эмульгируют в масле вплоть до снижения содержания фосфора в масле до уровня менее чем 11 ч./млн, с последующим отделением водной фазы от обработанного масла.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно использовать для ферментативной обработки пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 5532163. Способ согласно изобретению относится к процессам рафинирования масла и жира, при которых фосфолипиды в обрабатываемом масле и жире подвергаются разложению и эффективно удаляются. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу рафинирования масла и жира, который включает в себя взаимодействие в эмульсии масла и жира с ферментом согласно изобретению, например с ферментом, обладающим активностью, направленной на разложение сложноэфирных связей глицерин-жирная кислота в глицерофосфолипидах (например, РЬА2 согласно изобретению); и к другому способу, при котором обработанные ферментом масло и жир промывают водой или водным раствором кислоты. В одном аспекте водный раствор кислоты, используемый на стадии промывки, представляет собой раствор по меньшей мере одной кислоты, например лимонной кислоты, уксусной кислоты, фосфорной кислоты и их солей. В одном аспекте эмульгирующие условия создают, используя 30 мас. ч. по массе или более воды на 100 мас. ч. по массе масла и жира. Поскольку масло и жир могут быть очищены без использования традиционных стадий щелочного рафинирования, может быть снижено образование промывных сточных вод и других промышленных отходов. Кроме того, улучшается выход масла в связи с тем, что в настоящем способе не происходит потери нейтрального масла и жира вследствие их попадания в такие отходы. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу рафинирования масла и жира, содержащих примерно от 100 до 10000 ч./млн фосфолипидов, который включает в себя взаимодействие в эмульгированном состоянии указанного масла и жира с ферментом согласно изобретению, обладающим активностью, направленной на разложение сложноэфирных связей глицерин-жирная кислота в глицерофосфолипидах. В одном аспекте изобретение относится к способам рафинирования масла и жира, содержащих от 100 до 10000 ч./млн, фосфолипидов, которые включают в себя взаимодействие в эмульгированном состоянии масла и жира с ферментом согласно изобретению, обладающим активностью, направлено на разложение сложноэфирных связей глицерин-жирная кислота в глицерофосфолипидах, с последующей промывкой обработанного масла и жира промывной водой.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут быть использованы для ферментативной обработки пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 5264367. Содержание фосфорсодержащих компонентов и содержание железа в пищевом растительном масле или животном жире, таком как, например, соевое масло, которое было подвергнуто способу влажного рафинирования для удаления растительного клея, снижают в результате ферментативного разложения, осуществляемого путем контакта масла с водным раствором фермента согласно изобретению, например фосфолипазы А1, А2 или В, с последующим отделением водной фазы от обработанного масла. В одном аспекте настоящее изобретение относится к ферментативному способу снижения уровня фосфорсодержащих и железосодержащих компонентов в маслах, которые были подвергнуты рафинированию для удаления растительного клея. Масло, которое было подвергнуто рафинированию для удаления растительного клея, может быть обработано ферментом согласно изобретению, например фосфолипазой С, А1, А2 или В. При этом может быть достигнуто снижение содержания фосфора до уровня ниже 5 ч./млн и содержания железа до уровня ниже 1 ч./млн. Низкое содержание железа может быть благоприятным фактором с точки зрения стабильности масла.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно использовать для получения переэтерифицированных масел, как описано, например, в патенте США № 5288619. Настоящее изобретение относится к способам ферментативной переэтерификации для получения маргаринового масла, имеющего низкое содержание транс-кислот, и низкое содержание жирных кислот с короткими цепями и цепями средней длины. Данный способ включает в себя стадии получения реакционной смеси для переэтерификации, содержащей источник стеариновой кислоты и жидкое пищевое растительное масло, переэтерификацию источника стеариновой кислоты и растительного масла с использованием липазы, специфичной по 1-, 3-положению, с последующей окончательной гидрогенизацией смеси жирных кислот с получением возвращаемого в повторный цикл источника стеариновой кислоты для повторной реакции с растительным маслом. Изобретение также относится к противоточному способу получения переэтерифицированного масла. Указанный способ включает в себя стадии получения зоны реакции переэтерификации,
- 94 015591 содержащей липазу, специфичную по 1- или 3-положению, введения растительного масла в зону переэтерификации, введения материала источника стеариновой кислоты, введения противотока суперкритического газа или субкритического сжиженного газа, осуществления реакции переэтерификации потока триглицерида с потоком стеариновой кислоты или потоком сложного моноэфира стеариновой кислоты в зоне реакции, отбор потока переэтерифицированного триглицеридного маргаринового масла, отбора противоточной жидкой фазы, гидрогенизации переэтерифицированной стеариновой кислоты или сложного моноэфира стеариновой кислоты с получением рециркулируемого гидрогенизированного источника стеариновой кислоты и введения гидрогенизированной рециркулируемой стеариновой кислоты в зону реакции.
В одном аспекте высоконенасыщенное фосфолипидное соединение может быть превращено в триглицерид при соответствующем использовании фосфолилазы С согласно изобретению для удаления фосфатной группы в положении зп-3 с последующим синтезом посредством 1,3-липазы сложного ацилового эфира. 2-Замещенный фосфолипид может бить непосредственно использован в качестве функционального пищевого ингредиента или может быть впоследствии подвергнут селективному гидролизу в реакторе 160 с использованием иммобилизованной фосфолипазы С согласно изобретению с образованием 1-диглицерида, с последующей ферментативной этерификацией как описано в настоящей публикации с получением триглицеридного продукта, содержащего компонент в виде 2-замещенной полиненасыщенной жирной кислоты.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно использовать в способе ферментативного дегуммирования растительного масла, как описано, например, в патенте США № 6001640. Указанный способ согласно изобретению включает в себя стадию дегуммирования в процессе получения пищевых масел. Растительные масла, из которых гидратируемые фосфатиды были удалены в процессе предварительного водного дегуммирования, освобождают от негидратируемых фосфатидов путем ферментативной обработки с использованием фосфолипазы согласно изобретению. Данный процесс является мягким, экономичным и не вредным для окружающей среды. В данном процессе дегуммирования используют фосфолипазы, которые гидролизуют только лизолецитин, но не лецитин.
В одном аспекте с целью создания подходящих условий для действия фермента согласно изобретению обе фазы, масляная фаза и водная фаза, содержащая фермент, должны быть тщательно смешаны. Может быть недостаточно просто встряхнуть их. Хорошее диспергирование фермента в масле может быть достигнуто, если его растворить в небольшом количестве воды, например в 0,5-5 мас.% (относительно масла) и в такой форме эмульгировать в масле с образованием капелек менее 10 мкм в диаметре (среднемассовый диаметр). Капельки могут быть меньше 1 мкм. Турбулентное перемешивание может быть проведено с угловой скоростью выше 100 см/с. Масло может циркулировать реакторе с использованием внешнего роторного насоса. Водная фаза, содержащая фермент, может быть также подвергнута мелкому диспергированию с помощью ультразвуковой обработки. Может быть использовано устройство для диспергирования.
Ферментативная реакция, вероятно, происходит на поверхности раздела между масляной фазой и водной фазой. Целью всех указанных мер, направленных на перемешивание, является создание максимально большой возможной поверхности для водной фазы, которая содержит фермент. Добавление поверхностно-активных веществ повышает микродисперсию водной фазы. Поэтому в некоторых случаях к раствору фермента добавляют поверхностно-активные вещества со значениями НЬВ (гидрофильнолипофильного баланса) выше 9, такие как додецилсульфат №, как описано, например, в ЕР-А 0513709. Подобным эффективным способом улучшения эмульгирования является добавление лизолецитина. Добавляемые количества могут попадать в диапазон от 0,001 до 1% относительно масла. Температура, поддерживаемая при ферментативной обработке, не является решающим фактором. Могут быть использованы температуры от 20 до 80°С, но последнее значение может применяться только в течение короткого времени. В данном аспекте используют фосфолипазу согласно изобретению, обладающую хорошей устойчивостью к температуре и/или низкому значению рН. Применение температур в диапазоне от 30 до 50°С является оптимальным. Длительность обработки зависит от температуры и может быть уменьшена при повышении температуры. В основном достаточным является время реакции от 0,1 до 10 ч или от 1 до 5 ч. Реакция проходит в реакторе для дегуммирования и может быть разделена на стадии, как описано, например, в ИЕ-А 4339556. Поэтому возможно осуществление непрерывного процесса, наряду с периодическим способом. Реакция может быть осуществлена постадийно при разных температурах. Например, инкубирование происходит в течение 3 ч при 40°С, а затем в течение 1 ч при 60°С. Если реакция проходит постадийно, открывается возможность доведения разных значений рН на каждой отдельной стадии. Например, на первой стадии рН раствора может быть доведен, например, до 7, а на второй стадии до 2,5 посредством добавления лимонной кислоты. Однако по меньшей мере на одной стадии рН раствора фермента должен быть ниже 4 или ниже 3. Если впоследствии рН доводят до уровня, ниже указанного выше, может наблюдаться ухудшение результата. Поэтому к раствору фермента перед его смешиванием с маслом может быть добавлена лимонная кислота.
После завершения ферментативной обработки ферментативный раствор вместе с продуктами раз
- 95 015591 ложения ИНР, содержащимися в нем, может быть отделен от масляной фазы, в периодическом или непрерывном режиме, например, путем центрифугирования. Поскольку ферменты характеризуются высоким уровнем стабильности и в растворе содержится незначительное количество продуктов распада (они могут осаждаться в виде осадка), одна и та же водная фаза фермента может быть использована несколько раз. Имеется также возможность выделения фермента из осадка, смотри, например, ИЕ-А 4339556, так что ферментный раствор, по существу, не содержащий осадка, можно снова использовать. В одном аспекте данного процесса дегуммирования получают масла, которые содержат менее 15 ч./млн фосфора. Одной целью является достижение содержания фосфора менее 10 или менее 5 ч./млн. При содержании фосфора ниже 10 ч./млн дальнейшая обработка масла способом дистилляционной деацидификации легко достижима. Из масла может быть удалено множество других ионов, таких как ионы магния, кальция, цинка, а также железа до уровня, например, ниже 0,1 ч./млн. Таким образом, получаемый продукт обладает идеальными предпосылками для хорошей устойчивости к окислению при дальнейшей обработке и хранении.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут быть использованы для снижения количества фосфорсодержащих компонентов в растительных маслах и животных жирах, как описано, например, в патенте ЕР 0513709. В данном способе содержание фосфорсодержащих компонентов, особенно фосфатидов, таких как лецитин, и содержание железа в растительных маслах и животных жирах, которые ранее были подвергнуты обработке для удаления шлаков, например, в соевом масле, снижаются за счет ферментативного разложения с использованием фосфолипазы А1, А2 или В согласно изобретению.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут быть использованы для рафинирования жиров или масел, как описано, например, в патенте !Р 06306386. Изобретение относится к способам рафинирования жира или масла, включающим в себя стадию превращения фосфолипида в жире или масле в водорастворимое вещество, имеющее фосфорсодержащую группу, с последующим удалением указанного вещества. Действие фермента согласно изобретению (например, РЬС) используют для превращения фосфолипида в указанное вещество. Таким образом, становится возможным осуществлять рафинирование жира или масла без проведения стадии щелочного рафинирования, в результате которой образуются промышленные отходы, содержащие щелочные сточные воды, и при этом получать большее количество масла. Улучшение выхода может быть достигнуто за счет того, что потери нейтрального жира или масла, уходящего с отходами, могут быть снижены до нуля. В одном аспекте камедеобразные вещества превращают в водорастворимые вещества и удаляют в виде водорастворимых веществ за счет добавления фермента согласно изобретению, обладающего активностью фосфолипазы С, на стадии дегуммирования неочищенного масла и проведения ферментативной обработки. В одном аспекте фосфолипаза С согласно изобретению обладает активностью в расщеплении сложноэфирных связей между глицерином и фосфорной кислотой в фосфолипидах. При необходимости, данный способ может включать в себя промывку обработанного ферментом масла водой или подкисленным водным раствором. В одном аспекте добавляют фермент согласно изобретению и проводят реакцию с неочищенным маслом. Количество используемой фосфолипазы С может составлять от 10 до 10000 единиц или примерно от 100 до 2000 единиц на 1 кг неочищенного масла.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут быть использованы в способах дегуммирования водой, как описано, например, в работе Иуккйа, А1Ьей I. е! а1., 01еадтеих, Согр 6гак, Ыр1йек, (1998), 5(5), 367-370. В указанном примере способа водное дегуммирование применяют для получения лецитина и для сухого дегуммирования используют дегуммирующую кислоту и отбеливающую землю. Данный способ может быть экономически рентабельным только в случае масел с низким содержанием фосфатидов, например пальмового масла, лауриновых масел и т. п. Для масел, получаемых из семян масличных культур, которые характеризуются высоким содержанием ИНР, используют процесс кислотного рафинирования, при этом такой процесс осуществляют при дроблении, чтобы обеспечить возможность удаления смолы при перемалывании. В одном аспекте указанное кислотное рафинирование масла представляет собой возможную операцию так называемой полировки, проводимую перед физическим рафинированием.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также могут быть использованы в процессах дегуммирования, описанных, например, в работе Иуккйа е! а1., Кек. Ьеу. Иер., Ν.ν. Уапйетоог1е1е Соогй. Сеп!., Иедет, Ве1д. 1А0С8, I. Ат. 011 СЬет. 8ос. (1989), 66: 1002-1009. В данном примере способа процесс общего дегуммирования включает в себя диспергирование кислоты, такой как Н3Р04 или лимонная кислота, в соевом масле, обеспечение контакта в течение некоторого времени с последующим примешиванием основания, такого как каустическая сода или силикат натрия, в эмульсию типа кислота в масле. Указанный способ позволяет поддерживать уровень нейтрализации, достаточно низкий для того, чтобы избежать образования мыла, поскольку это может привести к повышенным потерям масла. Затем масло пропускают через центробежный сепаратор, где удаляется большая часть смол из потока масла с образованием фазы со смолами, содержащей минимальное количество масла. Затем поток масла пропускают во второй центробежный сепаратор для удаления всех оставшихся смол с получением разбавленной фазы смол, которую возвращают в повторный цикл. Промывка и сушка или поточное щелочное рафинирование завершает данный процесс. После введения способа общего дегуммирования достигается улучшение
- 96 015591 выхода примерно 0,5% в сравнении с классическим способом щелочного рафинирования. Подвергнутое общему дегуммированию масло затем можно подвергать щелочному рафинированию, обесцвечиванию и дезодорированию или обесцвечиванию и физическому рафинированию.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно использовать для удаления негидратируемых фосфолипидов из растительного масла, например соевого масла, как описано, например, в Нто1Ыу е1 а1., 8о_)акадеГаЫг., СорепЬадеп, Эей., 1. Μе^. 011 СЬет. 8ос. (1971) 48: 503-509. В указанном примере способа дегуммированное водой масло смешивают при различных фиксированных значениях рН с буферными растворами, содержащими и не содержащими Са++, реагенты, связывающие Μд/Са, и поверхностно-активные вещества. Негидратируемые фосфолипиды могут быть удалены в таком не подвергнутом превращению состоянии в качестве компонента мицелл или смешанных эмульгаторов. Кроме того, негидратируемые фосфолипиды удаляются путем превращения в диссоциированные формы, например, в результате удаления Μд и Са из фосфатидатов, что может быть достигнуто при подкислении или при обработке реагентами, образующими Μд/Са-комплексы или осаждающими Μд/Са. Удаление или химическое превращение негидратируемых фосфолипидов может приводить к снижению образования эмульсии и к улучшению отделения деацидифицированного масла от эмульсионного слоя и соапстока.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно применять для дегуммирования растигельных масел, как описано, например, в публикации ВисЬоИ е1 а1., Р^аηкГи^ί/Μа^η, Сегтапу. Рей А1ББепБсЬай ТесЬпо1од1е (1993), 95(8), 300-304. В данном примере способа дегуммирования пищевых растительных масел согласно изобретению водные суспензии фермента согласно изобретению, например фосфолипазы А2, используют для гидролиза жирной кислоты, связанной в положении бп2 фосфолипида, с образованием 1-ациллизофосфолипидов, которые нерастворимы в масле и таким образом становятся более пригодными для физического отделения. Добавление даже небольших количеств, соответствующих примерно 700 единицам лецитазы/кг масла, приводит к достижению остаточной концентрации Р менее чем 10 ч./млн, так что процесс химического рафинирования заменяется физическим рафинированием, который устраняет необходимость в нейтрализации, расщеплении соапстока и сточных вод.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно применять для дегуммирования растигельного масла, как описано, например, в ЕηζуΜаx. ОаЬ1ке, К1аиБ. Эер1. С-РЭ0, Ьигд1 01-СаБ, СЬет1е, СтЫН, РгапкГий, Сегтапу. 01еадтеих, СогрБ СгаБ, ЫрШеБ (1997), 4(1), 55-57. Указанный типичный способ представляет собой способ дегуммирования, осуществляемый с целью физического рафинирования практически любого вида масла. Посредством гидролиза, катализируемого ферментом, фосфатиды превращаются в водорастворимые лизофосфатиды, которые отделяют от масла центрифугированием. Остаточное содержание фосфора в масле после ферментативного дегуммирования может снижаться до 2 ч./млн Р.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно применять для дегуммирования растительных масел, как описано, например, в С1еепе\уегск е1 а1., Κν. Vатο Μί115, Ι/едет, Ве1д. Рей А1ББепБсЬай ТесЬпо1од1е (1992), 94: 317-22 и С1аиБеп, К1т; №е1Беп, Μиηк. NονοζутеБ А/8, Эеп. ЭапБк Кет1 (2002) 83(2): 24-27). Фосфолипазы и способы согласно изобретению могут включать в себя использование предварительного рафинирования растительных масел, как описано в, например, в №1ББоп-1оЬапББоп, е1 а1., Ра1Б 011б Όίν., АЬа-Ьауа1 Еоой Епд. АВ, ТитЫа, 8\гей. Рей А1ББепБсЬай ТесЬпо1од1е (1988), 90(11), 447-51 апй, Μπηο^ Егпб1 А. Сегео1 ЭеШБсЫапй СтЫН, ΜаηηЬе^т, Сегтапу. Еййог(б): Айбоп, КгсЬагй Р. РгосеейшдБ оГ 1Ье Аог1й СопГегепсе оп 0ЙБеей РгосеББшд ИйР/айоп, Сапсип, ΜΧ, №у. 12-17, (2001), Μеейηд Эа1е 2000, 17-20.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению также можно применять для дегуммирования растигельных масел, как описано, например, в 1егхеиБка е1 а1., 1пб1. РгхетуБЙ! Μ^еБηедο ί Т1иБ7с/отедо, АагБа\\\ Ро1., Т1иБ/с/е 1айа1пе (2001), 36(3/4), 97-110. В способе согласно изобретению ферментативное дегуммирование гидратируемого рапсового масла с низким содержанием эруковой кислоты осуществляется с использованием фосфолипазы А2 согласно изобретению. Фермент может катализировать гидролиз сложноэфирных связей жирной кислоты с центральным атомом углерода в глицериновой части фосфолипидов. Указанный фермент может осуществлять гидролиз негидратируемых фосфолипидов до соответствующих гидратируемых лизосоединений. При использовании неочищенного препарата фермента лучшие результаты могут быть достигнуты при добавлении 2% препарата на 4 ч (87% удаления Р).
В другом примере способа дегуммирования масла согласно изобретению (или способа дегуммирования с применением фермента согласно изобретению) добавляют кислый полимер, например альгинат или пектин. В указанном способе дегуммирования масла согласно изобретению кислый полимер (например, альгиновую кислоту или пектин либо более растворимую форму соли) добавляют к неочищенному маслу с небольшим количеством воды (например, в диапазоне примерно от 0,5 до 5%). В данном аспекте кислые полимеры могут уменьшать образование и/или разрушать комплексы фосфолипид-металл благодаря связыванию кальция и/или магния в неочищенном масле, тем самым повышая растворимость негидратируемых фосфолипидов. В альтернативных аспектах такие фосфолипиды будут переходить на границу раздела масло/вода или переходить в водную фазу и либо превращаться в диацилглицерин и соответствующую боковую цепь, либо интактный фосфолипид может быть удален последующим цен
- 97 015591 трифугированием в виде компонента тяжелой фазы. Присутствие кислого полимера в водной фазе также может увеличивать плотность водной фазы и приводить к улучшенному отделению тяжелой фазы от масляной (легкой) фазы.
В одном примере способа дегуммирования масла согласно изобретению (или в способе дегуммирования масла с применением фермента согласно изобретению) изменяют процесс дезодорирования, чтобы получить фракцию диацилглицерина (ΌΑΟ). В альтернативном аспекте, при необходимости или при желании, после дегуммирования с помощью фермента условия дезодорирования (температура, давление, конфигурация аппарата для перегонки) могут быть модифицированы с целью улучшения отделения свободных жирных кислот (ΡΡΑ) от фракции, содержащей диацилглицерин/триацилглицерин, или дополнительно модифицированы для отделения диацилглицерина от фракции триацилглицерина. В результате таких модификаций, используя указанный способ согласно изобретению, можно получить пищевые ΡΡΑ и диацилглицерин, если используют фермент согласно изобретению (например, фосфатазу, либо РЬС, либо сочетание РЬС и фосфатаз) для дегуммирования пищевого масла в способе физического рафинирования.
В различных аспектах практическое применение способов согласно изобретению, которые описаны в настоящей публикации (или способов с применением ферментов согласно изобретению), имеет преимущества, такие как уменьшение или исключение растворителя и утилизации растворителя; более низкие капитальные затраты; снижение затрат на дальнейшее рафинирование, уменьшение использования химических средств, оборудования, уменьшение технологического времени, затрат энергии (тепла) и использования воды/образования сточных вод; получение масла более высокого качества; полученное отжимом в шнековом прессе масло можно использовать без рафинирования при приготовлении и жарке пищи (такое полученное прессованием масло может обладать превосходной стабильностью, характеристиками с точки зрения цвета и запаха и высоким содержанием токоферола); получение жмыха более высокого качества; получение более низкого содержания жира в жмыхе (в настоящее время жмых, выходящий из механического пресса, вызывает проблемы с пищеварение у жвачных животных); получение улучшенных питательных свойств - пониженных уровней глюкозинолатов, танинов, синапина, фитиновой кислоты (как описано, например, в Тесбпо1оду апб 8оЬеп1к Гог Ехбасбпд 011кеебк апб ^пребокит 0118, Α0С8 1997).
В одном аспекте изобретение относится к способам рафинирования растительных масел (например, соевого масла, кукурузного масла, хлопкового масла, пальмового масла, арахисового масла, рапсового масла, сафлорового масла, масла из семян подсолнечника, масла из семян кунжута, масла из рисовых отрубей, кокосового масла или масла канолы) и побочных продуктов из производства, и к способам дезодорирования лецитина, например, как описано в патенте США № 6172248 или 6172247, при этом способы включают в себя применение по меньшей мере одного фермента согласно изобретению, например фосфолипазы С согласно изобретению. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются лецитин и растительные масла, содержащие по меньшей мере один фермент согласно изобретению. В приведенном в качестве примера способе рафинирования органическими кислотами растительное масло объединяют с разбавленным водным раствором органической кислоты и подвергают смешиванию с большими сдвиговыми усилиями, чтобы тонко диспергировать раствор кислоты в масле. Полученную смесь кислоты с маслом перемешивают при низких сдвиговых усилиях в течение периода времени, достаточного для захвата загрязняющих веществ в фазу гидратированных примесей с получением очищенной фазы растительного масла. В указанном примере способа можно использовать смеситель или систему регенерации (например, емкость регенерации воды) и/или резервуар для хранения фосфатидов или лецитина, например, как описано в патентах США № 4240972, 4049686, 6172247 или 6172248. Указанные способы можно осуществлять в периодическом или непрерывном режиме. Неочищенное или дегуммированное растительное масло может подаваться из резервуара для хранения (например, с помощью насоса) и может быть подвергнуто нагреванию. Растительное масло, подлежащее очистке, может представлять собой либо сырое, либо дегуммированное масло.
В одном аспекте ферменты фосфатидилинозитол-РЬС (РЬРЬС) согласно изобретению применяют для дегуммирования растительного масла. Ферменты РЬРЬС согласно изобретению можно использовать отдельно или в сочетании с другими ферментами (например, с ферментами РЬС, РЬЭ, фосфатазой согласно изобретению), чтобы улучшить выход масла во время дегуммирования растительных масел (включая масло сои, канолы и подсолнечника). РЬРЬС предпочтительно может превращать фосфатидилинозитол в 1,2-диацилглицерин (ΌΑΟ) и фосфоинозитол, но фермент также может проявлять активность по отношению к другим фосфолипидам, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин или фосфатидную кислоту, или их сочетание. Улучшение выхода может быть реализовано в виде увеличения количества ΌΑΟ в обработанном ферментом растительном масле и увеличение нейтрального масла, вследствие снижения количества масла, уносимого в меньшей фракции смол, которая образуется в результате обработки растительного масла ферментом.
- 98 015591
Ферментативная обработка семян масличных культур
В настоящем изобретении предлагаются композиции (например, ферменты) и способы ферментативной обработки семян масличных культур, включая сою, канолу, кокос, авокадо и кашицу оливок. В одном аспекте указанные способы согласно изобретению могут увеличивать выход масла и улучшать пищевое качество полученных пищевых продуктов. В некоторых аспектах ферментативная обработка семян масличных культур с использованием ферментов и способов согласно изобретению будет обеспечивать экономическую выгоду и пользу с точки зрения охраны окружающей среды, а также применение альтернативных методик экстракции масла и обработки пищевых продуктов для человека и животных. В альтернативных аспектах способы согласно изобретению включают в себя применение фосфолипаз согласно изобретению, других фосфолипаз, протеаз, фосфатаз, фитаз, ксиланаз, амилаз (например, Όамилаз), глюканаз (например, β-глюканаз), полигалактуроназ, галактолипаз, целлюлаз, гемицеллюлаз, пектиназ и других ферментов, разрушающих клеточные стенки растений, а также смешанных ферментных препаратов и клеточных лизатов.
В альтернативных аспектах способы согласно изобретению могут быть осуществлены на практике вместе с другими способами, например, с ферментативными обработками, например карбогидразами, включая целлюлазу, гемицеллюлазу и другие разрушающие активности, или с химическими способами, например с экстракцией гексана соевого масла. Ферментативная обработка может увеличивать экстрагируемость масла на 8-10%, если ферментативную обработку осуществляют перед экстракцией растворителем.
В альтернативных аспектах способы согласно изобретению могут быть осуществлены на практике в способах, основанных на водной экстракции. Способы водной экстракции могут представлять собой экологически более чистые альтернативные методики экстракции масла. Низкие выходы экстракции в случае водного способа могут быть компенсированы благодаря использованию ферментов, которые гидролизуют структурные полисахариды, образующие клеточную стенку семян масличных культур, или которые гидролизуют белки, которые образуют клеточные мембраны и мембраны липидных телец, например, используя расщепление целлюлазой, гемицеллюлазой и/или протопектиназой для экстракции масла из клеток соевых бобов. В одном аспекте способы осуществляют на практике с использованием фермента согласно изобретению, как описано в публикации Кака1 (2003) 1. Адпс. Роой Скет., 51: 62176222, в которой указано, что наиболее эффективным ферментом для расщепления клеточной стенки является целлюлаза.
В одном аспекте используют протеазы в сочетании со способами согласно изобретению. Оценивали комбинированное действие переменных процесса и ферментативной активности протеазы и целлюлазы на выходы экстракции масла и белков в сочетании с другими параметрами процесса, такими как концентрация фермента, время гидролиза, размер частиц и соотношение твердых веществ к жидкости. В одном аспекте способы осуществляют на практике с использованием фермента согласно изобретению, как описано в публикации Кокеп!ка1 (2001) Епхуте апй МюгоЬ. Теск., 28: 499-509, где показано, что применение протеазы может приводить к значительно более высоким выходам масла и белка по сравнению с контролем в том случае, когда используют подвергнутую тепловой обработке муку.
В одном аспекте использовали экстракцию общего белка, пектина и гемицеллюлозы в сочетании со способами согласно изобретению. Растительная клетка состоит из ряда полисахаридов, часто ассоциированных или заменяемых белками или фенольными соединениями. Большинство таких углеводов расщепляются только частично или плохо утилизируются пищеварительными ферментами. Разрушение таких структур перерабатывающими или расщепляющими ферментами может улучшить доступность питательных веществ. В одном аспекте способы осуществляют на практике с использованием фермент согласно изобретению, как описано в 0иЫйа (2002) 1. Адпс. Роой Скет., 50:1933-1938, где сообщается, что было достигнуто значительное разрушение целлюлозы клеточной стенки сои (до 20%) после экстракции общего белка, пектина и гемицеллюлозы.
В одном аспекте способы согласно изобретению дополнительно включают в себя введение обработок различными ферментами в обработке семян, например семян канолы, такие обработки включают в себя использование протеаз, целлюлаз и гемицеллюлаз (в различных комбинациях друг с другом и с одним или несколькими ферментами согласно изобретению). Например, способы перед стандартной обработкой могут включать в себя обработку семян канолы ферментами при содержании влаги во время инкубации с ферментами от 20 до 40; как описано, например, Ьу 8оки1кк1 (1990) Ргос. Сап. Шк!. Роой 8с1. Тескпо1., 3: 656. Способы согласно изобретению могут дополнительно включать в себя введение протеаз, -амилаз, полигалактуроназ (в различных сочетаниях друг с другом и с одним или несколькими ферментами согласно изобретению) для осуществления гидролиза клеточного материала в кокосовой муке и высвобождения кокосового масла, которое может быть извлечено центрифугированием, как описано, например, в МсС1опе (1986) 1. оГ Роой 8ск, 51: 695-697. Способы согласно изобретению дополнительно включают в себя введение пектиназ, -амилаз, протеаз, целлюлаз в различных сочетаниях (друг с другом и с одним или несколькими ферментами согласно изобретению) для получения существенного увеличения выхода (~70% в лучшем случае) во время ферментативной экстракции масла авокадо, как описано, например, в Виепгок!го (1986) Вю!еск. Ьейегк, 8(7): 505-506. В способах экстракции оливкового масла со
- 99 015591 гласно изобретению пасту из оливок обрабатывают целлюлазой, гемицеллюлазой, полигалактуроназой, пектинметилтрансферазой, протеазой и их сочетанием (друг с другом и с одним или несколькими ферментами согласно изобретению), как описано, например, в МоШейого (197 6) Лс1а Уйатт. Епхуто1. (Μί1апо), 30: 13.
Очистка фитостеринов из растительных масел
Настоящее изобретение относится к очистке фитостеринов и тритерпенов или растительных стеринов из растительных масел. Фитостерины, которые могут быть очищены с использованием фосфолипидов и способов согласно изобретению, включают в себя β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин и брассикастерин. Растительные стерины представляют собой важные сельскохозяйственные продукты, применяемые в здравоохранении и пищевой промышленности. Так, фосфолипазы и способы согласно изобретению используют для получения эмульгаторов, применяемых в производстве косметических средств, и стероидных промежуточных продуктов и предшественников для получения гормональных фармацевтических препаратов. Фосфолипиды и способы согласно изобретению используют для получения (например, очистки) аналогов фитостеринов и их сложных эфиров в качестве средств, понижающих уровень холестерина, способствующих улучшению состояния сердечной системы. Фосфолипазы и способы согласно изобретению используют для очистки растительных стеринов, применяемых для снижения уровней холестерина в сыворотке благодаря ингибированию всасывания холестерина в просвете кишечника. Фосфолипазы и способы согласно изобретению используют для очистки растительных стеринов, обладающих иммуномодулирующими свойствами в чрезвычайно низких концентрациях, включая повышенную клеточную реакцию Т-лимфоцитов и цитотоксическую способность натуральных клетоккиллеров против линии злокачественных клеток. Фосфолипазы и способы согласно изобретению используют для очистки растительных стеринов, применяемых при лечении туберкулеза легких, ревматоидного артрита, при ведении пациентов с ВИЧ-инфекцией и для подавления иммунного стресса, например, у марафонцев.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению используют для очистки стериновых компонентов, присутствующих во фракциях стеринов широко употребляемых растительных масел (например, кокосового масла, масла канолы, масла какао, кукурузного масла, хлопкового масла, льняного масла, оливкового масла, пальмового масла, арахисового масла, масла из рисовых отрубей, сафлорового масла, кунжутного масла, соевого масла и подсолнечного масла), таких как ситостерин (40,2-92,3%), кампестерин (2,6-38,6%), стигмастерин (0-31%) и 5-авенастерин (1,5-29%).
Способы согласно изобретению могут включать в себя выделение растительных стеринов из семян масличных культур путем экстракции растворителем, таким как смесь хлороформ-метанол, гексан, метиленхлорид или ацетон, с последующей сапонификацией и хроматографической очисткой полученной обогащенной суммарной фракции стеринов. Альтернативно, растительные образцы могут быть подвергнуты экстракции сверхкритической жидкостью со сверхкритическим диоксидом углерода для получения экстрактов суммарных липидов, которые могут быть обогащены и из которых могут быть выделены стерины. Для последующей характеристики и количественного определения стериновых соединений неочищенная выделенная фракция может быть очищена и разделена с помощью множества хроматографических методик, включающих в себя колоночную хроматографию (СС), газовую хроматографию, тонкослойную хроматографию (ТСХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в нормальной фазе, обращенно-фазовую ВЭЖХ и капиллярную электрохроматографию. Из всех хроматографических методик выделения и разделения СС и ТСХ являются наиболее доступными, приемлемыми и подходящими для удаления примесей из образца, очистки, количественных анализов и предварительной оценки содержания стеринов в исследуемых образцах.
Процессы рафинирования пищевого масла могут приводить к потерям фитостеринов из растительных масел в качестве побочных продуктов. Фосфолипазы и способы согласно изобретению используют фитостерины, выделенные из таких побочных продуктов, для получения обогащенных фитостеринами продуктов, выделенных из таких побочных продуктов. Способы выделения и очистки фитостеринов согласно изобретению могут включать в себя такие операции, как молекулярная перегонка, экстракция по типу жидкость-жидкость и кристаллизация, в которых подвергаются обработке побочные продукты, получаемые в способах промышленной обработки масла.
Способы согласно изобретению могут включать в себя процессы экстракции липидов с целью выделения фитостеринов. Например, в способах согласно изобретению можно использовать неполярные растворители, такие как гексан (обычно используемый для экстракции большинства типов растительных масел), приводящие к количественной экстракции свободных фитостеринов и сложных эфиров фитостеринов и жирных кислот. Стерилгликозиды и ацилированные жирными кислотами стерилгликозиды лишь частично экстрагируются гексаном, тогда как повышение полярности растворителя проводит к более высокому проценту экстракции. Один способ, который можно использовать, представляет собой способ экстракции смесью хлороформ-метанол, описанный Β1ί§1ι апй Эуег, для экстракции всех классов стериновых липидов, включая фосфолипиды. Один типичный способ качественного выделения и количест
- 100 015591 венного анализа классов фитостериновых липидов включает в себя инъекцию липидного экстракта в систему ВЭЖХ.
Фосфолипазы и способы согласно изобретению можно использовать для удаления стеринов из жиров и масел, как описано, например, в патенте США № 6303803. Указанный способ относится к методике снижения содержания стеринов в стеринсодержащих жирах и маслах. Такой эффективный и рентабельный способ основан на аффинности холестерина и других стеринов к амфипатическим молекулам, которые образуют гидрофобные жидкие бислои, такие как фосфолипидные бислои. Агрегаты фосфолипидов подвергают контакту, например, со стеринсодержащим жиром или маслом в водном окружении и затем перемешивают. Молекулярная структура такой агрегированной фосфолипидной смеси обладает высокой аффинностью к холестерину и другим стеринам, в связи с чем может быть достигнуто избирательное удаление таких молекул из жиров и масел. Используемую для разделения компонентов водную смесь перемешивают в течение периода времени, достаточного для избирательного снижения содержания стеринов в жировом/масляном продукте за счет распределения стеринов в часть фосфолипидных агрегатов. Жир или масло со сниженным содержанием стеринов отделяют от водной разделяющей смеси. Альтернативно, фракция, соответствующим образом обогащенная стеринами, может быть также выделена из водной разделяющей смеси. Указанные стадии могут быть проведены при температуре окружающей среды, при этом снижаются расходы, связанные с нагреванием, а также минимизируется возможность термического разрушения продукта. Кроме того, требуется минимальный набор оборудования, и поскольку все применяемые материалы высокого качества, способы не требуют специальной предосторожности при обработке, сбросе отходов и не загрязняют конечный продукт (продукты).
Фосфолипазы и способы согласно изобретению могут быть использованы для удаления стеринов из жиров и масел, как описано, например, в патенте США № 5880300. Фосфолипидные агрегаты подвергают контакту, например, со стеринсодержащим жиром или маслом в водном окружении и затем перемешивают. После соответствующего перемешивания жир или масло со сниженным содержанием стеринов отделяют от водной разделяющей смеси. Альтернативно, фосфолипиды, соответствующим образом обогащенные стеринами, также могут быть выделены из водной разделяющей смеси. Растительные масла содержат растительные стерины (фитостерины), которые также могут быть удалены с использованием способов согласно изобретению. Данный способ применим к жировому/масляному продукту на любой стадии цикла коммерческой обработки. Например, способ согласно изобретению может быть применен к рафинированным, обесцвеченным и дезодорированным маслам (ВВП-маслам) или на любой стадии обработки до достижения состояния ВВП-масла. Хотя ВВП-масла могут иметь измененную плотность по сравнению с маслами до стадии ВВП-масла, указанные способы легко могут быть адаптированы для получения ВВП-масел или масел, предшественников ВВП, или к различным другим жировым/масляным продуктам путем варьирования содержания фосфолипидов, состава фосфолипидов, соотношения фосфолипид: вода, температуры, давления, условий перемешивания и условий разделения, описанных ниже.
Альтернативно, ферменты и способы согласно изобретению можно использовать для выделения фитостеринов или других стеринов на промежуточных стадиях обработки масла. Известно, например, что происходит потеря фитостеринов при дезодорировании растительных масел. Стеринсодержащая фракция дистиллята, например, на промежуточной стадии обработки может быть подвергнута процедурам экстракции стеринов, как описано выше. Такой подход обеспечивает получение обогащенного стерином лецитина или другого фосфолипидного материала, который может быть дополнительно обработан для восстановления уровня экстрагированных стеринов.
Детергентные композиции
Настоящее изобретение относится к детергентным композициям, включающим в себя одну или несколько фосфолипаз согласно изобретению, и к способам приготовления и использования таких композиций. Изобретение включает в себя все способы получения и использования детергентных композиций, смотри, например, патенты США № 6413928, 6399561, 6365561, 6380147. Детергентные композиции могут представлять собой водную композицию из одной или двух частей, неводную жидкую композицию, монолитную твердую форму, гранулярную форму, форму частиц, прессованную таблетку, гель и/или пасту и форму взвеси. Настоящее изобретение также относится к способам, пригодным для быстрого удаления загрязнений жирной пищей, пленок от пищевых отбросов и других минорных пищевых композиций с использованием детергентных композиций. Фосфолипазы согласно изобретению могут облегчать удаление пятен за счет каталитического гидролиза фосфолипидов. Фосфолипазы согласно изобретению можно использовать в составе детергентов, используемых для мытья посуды и для стирки текстильных материалов.
Фактическое содержание активного фермента зависит от способа производства детергентной композиции и не является решающим фактором при условии, что раствор детергента имеет требуемую ферментативную активность. В одном аспекте количество фосфолипазы, присутствующей в готовом растворе, варьирует примерно от 0,001 до 0,5 мг на 1 г детергентной композиции. Выбор конкретного фермента для применения в способе и продуктах согласно изобретению зависит от условий предполагаемого применения конечного продукта, включая физическую форму продукта, значение используемого рИ значение используемой температуры и тип загрязнения, которое необходимо разрушить или изменить. Фер
- 101 015591 мент выбирают таким образом, чтобы обеспечить оптимальную активность и стабильность в любом конкретном наборе условий применения. В одном аспекте полипептиды согласно изобретению активны в широком диапазоне рН примерно от 4 и примерно до 12 и в температурном диапазоне примерно от 20 до 95°С. Детергенты согласно изобретению могут включать в себя катионогенные, полуполярные неионогенные или цвиттерионные поверхностно-активные вещества или их смеси.
Фосфолипазы согласно изобретению могут быть введены в состав композиций с порошковыми и жидкими детергентами, имеющими значения рН от 4,0 до 12,0, в концентрации от 0,01 и примерно до 5 мас.% (предпочтительно от 0,1 до 0,5 мас.%). Такие детергентные композиции могут также включать в себя другие ферменты, такие как известные протеазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, а также вспомогательные вещества для приготовления композиции и стабилизаторы. Добавление фосфолипаз согласно изобретению к традиционным очищающим композициям не сопровождается какими-либо особыми ограничениями в их использовании. Иными словами, любые значения температуры и рН, подходящие для детергента, также подходят для таких композиций при условии, что значение рН остается в пределах указанного диапазона, а температура сохраняется на уровне ниже, чем температура денатурации фермента. Кроме того, полипептиды согласно изобретению могут быть использованы в чистящей композиции без детергентов, либо сами по себе, либо в сочетании со вспомогательными веществами, применяемыми для приготовления композиции, и стабилизаторами.
Настоящее изобретение относится к чистящим композициям, включая детергентные и/или дезинфицирующие композиции для очистки и/или дезинфекции твердых поверхностей, детергентные композиции для очистки и/или дезинфекции тканей, композиции для мытья посуды, композиции для очищения ростовой полости, композиции для чистки зубов и/или растворы для очищения контактных линз.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу промывки объекта, включающему в себя приведение в контакт данного объекта с фосфолипазой согласно изобретению в условиях, подходящих для указанной промывки. Фосфолипаза согласно изобретению может быть включена в состав детергентной добавки. Детергентные композиции согласно изобретению могут быть приготовлены, например, в виде детергентной композиции для ручной или машинной стирки, содержащей фосфолипазу согласно изобретению. Добавка для стирки, пригодная для предварительной обработки загрязненных пятнами тканей, может включать в себя фосфолипазу согласно изобретению. Композиция для смягчения тканей может включать в себя фосфолипазу согласно изобретению. Альтернативно, фосфолипаза согласно изобретению может быть введена в состав детергентной композиции, применяемой в домашней хозяйстве для чистки различных твердых поверхностей. В альтернативных аспектах детергентные добавки и детергентные композиции согласно изобретению могут включать в себя один или более других ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, другая фосфолипаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, например лактаза, и/или пероксидаза. Свойства фермента(ов) согласно изобретению выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с выбранным детергентом (например, по оптимуму рН, совместимости с другими ингредиентами ферментативной и неферментативной природы и т.п.), и чтобы указанный фермент (ферменты) присутствовал в эффективных количествах. В одном аспекте фосфолипазные ферменты согласно изобретению используют для удаления из тканей материалов с неприятным запахом. Различные детергентные композиции и способы их получения, которые могут применяться при практическом осуществлении настоящего изобретения, описаны, например, в патентах США №№ 6333301, 6329333, 6326341, 6297038, 6309871, 6204232, 6197070, 5856164.
Обработка отходов
Фосфолипазы согласно изобретению можно применять для обработки отходов. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу разложения твердых отходов с использованием фосфолипаз согласно изобретению. Способы могут включать в себя снижение массы и объема фактически не обработанных твердых отходов. Твердые отходы могут быть обработаны способом ферментативного разложения в присутствии раствора фермента (содержащего фосфолипазы согласно изобретению) в контролируемых температурных условиях. Твердые отходы могут быть превращены в ожиженные отходы и любые отходы с остаточным содержанием твердых веществ. Полученные ожиженные отходы могут быть отделены от указанных любых остаточных отвержденных отходов. Смотри, например, патент США № 5709796.
Детоксикация
Фосфолипазы (например, РЬС, пататины согласно изобретению) можно применять в способах детоксикации, например для детоксикации эндотоксинов, например, композиций, содержащих липополисахариды (ЬР8), и изобретение относится к способам детоксикации с использованием по меньшей мере одного фермента согласно изобретению, например пататина, имеющего последовательность, которая указана в 8ЕЦ ΙΌ N0: 175 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 176, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41\, Е41Р, Ε41Υ, Е41В, Е94В, П100Ь, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ρ, Ό100\, А104Ь, П111В, Т112В, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168Н Ό171ν, Ό171Ε, Μ176\, Ό230Η, П230В, Ό234\, Ό234ν, Ό2340, Ь234В, Ό234Ι< или Ц265В. В одном аспекте фосфолипазу согласно изобретению используют для детоксикации липополисахарида (ЬР8). В одном аспекте такая детоксикация заключается в деацилировании 2'
- 102 015591 и/или 3'-цепей жирных кислот в липиде А. В одном аспекте фосфолипазу (например, РЬС, пататин) согласно изобретению используют для гидролиза цепей 2'-лауроила и/или 3'-миристоила из липида, например липида А (например, из бактериального эндотоксина). В одном аспекте способ согласно изобретению применяют для разрушения эндотоксина, например токсина грамотрицательных бактерий, например Е. со11. В одном аспекте фосфолипазу (например, РЬС, пататин) согласно изобретению используют для ослабления эффектов отравления токсином (например, во время протекания грамотрицательной инфекции), или для того, чтобы профилактически предотвратить действие эндотоксина во время инфекции (например, инфекции у животного или человека). Соответственно, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фосфолипазу (например, РЬС, пататин) согласно изобретению, и к способу применения гидролазы согласно изобретению для ослабления или профилактики токсических эффектов липополисахаридов (ЬР8), например, при сепсисе.
Обработка пищевых продуктов
Фосфолипазы согласно изобретению можно применять для обработки пищевых продуктов, например, для изменения их стабильности, срока хранения, вкуса, консистенции, для улучшения их питательной ценности и тому подобного. Например, в одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению используют для получения кислых фосфолипидов для снижения горького вкуса пищевых продуктов.
В одном аспекте изобретение относится к способам изготовления сыра с использованием фосфолипаз согласно изобретению (и, следовательно, изобретение также относится к сырам, содержащим фосфолипазы согласно изобретению). В одном аспекте ферменты согласно изобретению (например, фосфолипаза А, лизофосфолипаза или их сочетание) используют для обработки сыров с целью усиления вкуса, чтобы повысить выход и/или для стабилизации сыров, например, уменьшая тенденцию к обезжириванию, или в одном аспекте ферменты согласно изобретению используют для получения сыра из молока для производства сыра. Такие способы согласно изобретению могут включать в себя любой способ или протокол, которые описаны, например, в патентах США № 6551635 и 6399121, XV0 03/070013, XV0 00/054601. Например, в одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению используют для стабилизации жировой эмульсии в молоке или содержащих молоко композициях, например в кремах, и используют для стабилизации молочных композиций, например, для производства кремов или кремовых ликеров. В одном аспекте изобретение относится к способу усиления сырного вкуса сыра с использованием по меньшей мере одного фермента согласно изобретению, при этом способ включает в себя инкубацию белка, жира и протеазы и липазы в водной среде в условиях, которые способствуют получению усиленного сырного вкуса (например, снижению горечи), например, как описано в Χν0 99/66805. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению используют для усиления сырного вкуса (например, створоженного молока) посредством смешивания с водой протеазы и липазы (согласно изобретению) при повышенной температуре, например примерно от 75 до 95°С, как описано, например, в патенте США № 4752483. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению используют для ускорения созревания сыра добавлением фермента согласно изобретению (например, липазы или фосфолипазы) к сыру (например, к молоку для производства сыра) перед добавлениям коагулянта к молоку, или добавлением фермента согласно изобретению к створоженному молоку с солью перед прессованием, например, как описано, например, в патенте США № 4707364. В одном аспекте липазу согласно изобретению используют для разрушения триглицеридов в жирах молока для высвобождения свободных жирных кислот, что приводит к усилению вкуса. Протеазу также можно использовать в любом их таких способов согласно изобретению, смотри, например, ВтшйШ (2001) I. ой Еоой 8с1., 66: 1100-1107. В другом аспекте в любом из указанных способов согласно изобретению можно использовать сочетание эстераз, липаз, фосфолипаз и/или протеаз.
В одном аспекте фосфолипазу согласно изобретению используют для снижения количества фосфорсодержащих компонентов в пищевых продуктах, например в масле, таком как растительное масло, имеющее высокое содержание негидратируемых фосфорсодержащих соединений, например, как описано в ΧΧΌ 98/26057.
Переработка биомассы и получение чистого биотоплива
В настоящем изобретении предлагаются полипептиды, включая ферменты (фосфолипазы (РЬ), например, РЬА, РЬС или РЬЬ согласно изобретению) и антитела согласно изобретению, и способы переработки биомассы или любого лигноцеллюлозного материала (например, любой композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин) в топливо (например, биоэтанола, биопропанола, биобутанола, биометанола, биодизельного топлива) в дополнение к кормам, пищевым продуктам и химическим веществам. Например, в альтернативном варианте фермент (ферменты) согласно изобретению, используемый для переработки биомассы и для получения биотоплива, может обладать одной или несколькими фосфолипазными активностями, включая активность фосфолипазы С (РЬС); активность фосфолипазы А (РЬА), такую как активность фосфолипазы А1 или фосфолипазы А2; активность фосфолипазы Ό (РЬЭ), такую как активность фосфолипазы Ό1 или фосфолипазы Ό2; активность фосфолипазы В (РЬВ), например активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазытрансацилазы (ЬРТА), или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) и лизофосфолипазытрансацилазы (ЬРТА); или активность пататина, или их сочетание.
- 103 015591
Таким образом, композиции и способы согласно изобретению обеспечивают получение эффективных и экологически рациональных альтернатив или дополнений к применению продуктов на основе нефти, например, в виде смеси биотоплива, такого как биометанол, биоэтанол, биопропанол, биобутанол и тому подобное, с дизельным топливом, бензином, керосином и тому подобным. В настоящем изобретении предлагаются организмы, экспрессирующие ферменты согласно изобретению, способные участвовать в химических циклах, включающих в себя переработку природной биомассы. В одном аспекте в качестве ферментов в способах переработки применяют совокупность ферментов для обработки фосфолипидов. В настоящем изобретении предлагаются способы обнаружения и применения наиболее эффективных ферментов, обеспечивающих осуществление такого важного нового способа переработки биомассы и альтернативных способов для энергетической промышленности.
Композиции и способы согласно изобретению могут быть использованы для обеспечения эффективных и экологически рациональных альтернатив или дополнений к использованию продуктов на основе нефти, например, в виде смеси биоэтанола, биопропанола, биобутанола, биометанола и/или биодизельного топлива и бензина. В настоящем изобретении предлагаются способы обнаружения и применения наиболее эффективных ферментов, обеспечивающих осуществление такого важного нового способа переработки биомассы и альтернативных способов для энергетической промышленности.
В данном изобретении предлагаются способы, ферменты и смеси ферментов или коктейли согласно изобретению для обработки материала, например материала биомассы, содержащей целлоолигосахарид, олигомер арабиноксилана, лигнин, лигноцеллюлозу, ксилан, глюкан, целлюлозу и/или сбраживаемый сахар, включающей в себя осуществление контакта композиции с полипептидом согласно изобретению или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению, при этом материал необязательно получен из сельскохозяйственных культур (например, пшеницы, ячменя, картофеля, проса, древесины тополя), представляет собой побочный продукт производства пищевых продуктов или кормов, представляет собой лигноцеллюлозные отходы или представляет собой растительные остатки или макулатуру или полученный из макулатуры, и необязательно растительные остатки содержат стебли, листья, кожуру, шелуху, кукурузу или стержни кукурузного початка, кукурузную солому, кукурузные волокна, сено, солому (например, рисовую солому или пшеничную солому), жмых из сахарного тростника, мякоть сахарной свеклы, мякоть цитрусовых и кожуру цитрусовых, древесину, материал выборочных рубок деревьев, древесные стружки, древесную массу, отходы целлюлозного производства, древесные отходы, древесные стружки и опилки, строительные отходы и/или отходы, полученные при сносе строений, и обрезки (например, обрезки древесины, древесные стружки и опилки), и необязательно бумажные отходы, которые включают бракованную или использованную фотобумагу, бумагу для компьютерного принтера, бумагу для тетрадей, бумагу для блокнотов, бумагу для пишущих машинок, газеты, журналы, картон и изготовленные из бумаги упаковочные материалы и материалы вторичной переработки бумаги. Кроме того, можно использовать городские отходы, например бумажную фракцию коммунальнобытовых твердых отходов, коммунальные древесные отходы и коммунальные лесосечные отходы, наряду с другими материалами, содержащими сахар, крахмал и/или целлюлозу. В альтернативных аспектах при обработке материала, например, материала биомассы, образуется биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол.
Альтернативно, полипептид согласно изобретению может быть экспрессирован в растительном материале биомассы или сырья для промышленности.
Способы согласно изобретению также включают в себя получение обработанной или переработанной (например, способом, включающим в себя применение фермента согласно настоящему изобретению) биомассы или растительного материала, например, содержащего липиды материала или лигноцеллюлозного материала (обработанного, например, ферментами согласно изобретению) и их переработку в топливо (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) посредством ферментации (например, дрожжами) и/или с помощью химического синтеза. В одном аспекте полученные сахара подвергают ферментации и/или неферментируемые продукты газифицируют.
Способы согласно изобретению также включают в себя превращение водорослей, растительного масла, такого как растительные масла холодного отжима или отработанные растительные масла, животных жиров и топленых жиров (например, сала, лярда и желтого жира) или сточных вод с использованием ферментов согласно изобретению и переработке их в топливо (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) посредством ферментации и/или химического синтеза или превращения.
Ферменты согласно изобретению (включая, например, организмы, такие как микроорганизмы, например грибы, дрожжи или бактерии, продуцирующие и в некоторых аспектах секретирующие рекомбинантные ферменты согласно изобретению) могут быть использованы или введены/интегрированы на любой стадии любого способа переработки биомассы, например на любой одной стадии, нескольких стадиях или на всех стадиях всех указанных ниже способов переработки биомассы или введены во все указанные альтернативные виды биотоплива:
прямое сжигание: сжигание материала при непосредственном нагревании, которое представляет
- 104 015591 собой наиболее простую технологию переработки биомассы; может быть очень экономичным, если источник биомассы находится поблизости;
пиролиз: представляет собой термическое разложение биомассы при нагревании в отсутствие кислорода; в одном аспекте биомассу нагревают до температуры примерно от 800 до 1400° по Фаренгейту (426-760°С), но для поддержания горения кислород не вводят, что приводит к образованию газа, мазута и угля;
газификация: биомасса может быть использована для получения метана в результате нагревания или анаэробного разложения; из биомассы можно получать синтетический газ, смесь оксида углерода и водорода;
газ из органических отходов: образуется в результате гниения (анаэробного разложения) захороненных на свалках отходов; в случае разложения органических отходов образуется газ, состоящий примерно на 50% из метана, основного компонента природного газа;
анаэробное расщепление: превращает органическое вещество в смесь метана, основного компонента природного газа, и диоксида углерода. в одном аспекте биомассу, такую как сбрасывая вода (сточные воды), навоз или отходы обработки пищевых продуктов, смешивают с водой и подают в резервуар для расщепления без воздуха;
ферментация;
спиртовое брожение: топливный спирт получают превращением целлюлозной массы и/или крахмала в сахар, брожением сахара с образованием спирта, затем разделения водно-спиртовой смеси перегонкой. Исходной сырье, такое как специальные культуры (например, пшеница, ячмень, картофель, просо, древесина тополя), остатки и отходы сельского хозяйства (например, рисовая солома, кукурузная солома, пшеничная солома, жмых сахарного тростника, рисовая шелуха, кукурузные волокна, мякоть сахарной свеклы, мякоть цитрусовых и кожура цитрусовых), отходы лесного хозяйства (например, материал выборочных рубок лиственных и хвойных пород, остатки производства пиломатериалов лиственных пород и хвойных пород, древесные стружки и опилки), коммунально-бытовые отходы (например, бумажная фракция коммунально-бытовых твердых отходов, коммунальные древесные отходы, коммунальные лесосечные отходы), древесные отходы (например, отходы лесопильных предприятий, отходы целлюлозных предприятий, отходы строительства, отходы, образуемые при сносе строений, древесные стружки и опилки) и макулатура или другие материалы, содержащие сахар, крахмал и/или целлюлозу, можно превратить в сахара и затем в спирт посредством дрожжевого брожения. Альтернативно, материалы, содержащие сахара, могут быть непосредственно превращены в спирт в результате ферментации;
переэтерификация: примером реакции превращения масла в биодизельное топливо является так называемая переэтерификация. В процессе переэтерификации происходит взаимодействие спирта (подобного метанолу) с триглицеридными маслами, входящими в состав растительных масел, животных жиров или регенерированных технических жиров, с образование сложных алкиловых эфиров жирных кислот (биодизельного топлива) и глицерина. Реакция требует нагревания и использования сильного основного катализатора, такого как гидроксид натрия или гидроксид калия;
биодизель: биодизель представляет собой смесь сложных алкиловых эфиров жирных кислот, полученных из растительных масел, животных жиров или регенерированных технических жиров. Биодизель можно использовать в его очищенной форме в качестве топлива для транспортных средств, но обычно его используют в качестве дизельной добавки к бензину, чтобы понизить уровень частиц, оксида углерода, углеводородов и токсичных для атмосферы веществ, выбрасываемых транспортными средствами, работающими на дизельном топливе;
гидролиз: включает в себя гидролиз соединения, например, биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, катализируемый с использованием фермента согласно настоящему изобретению;
когенерация: представляет собой одновременное получение более чем одной формы энергии с использованием одного вид топлива и одной системы. В одном аспекте когенерация с использованием биомассы имеет больше возможностей для развития, чем только образование биомассы, так как когенерация дает и тепловую, и электрическую энергию.
В одном аспекте полипептиды согласно изобретению обладают гидролазной активностью, например активностью фосфолипазы, пататина и/или другой родственной ферментативной активностью для образования топлива (например, биоспирта, например биоэтанола, биометанола, биобутанола или биопропанола, или биодизельного топлива) из органического материала, например биомассы, такой как композиции, полученные из растений и животных, включая любую сельскохозяйственную культуру или другое возобновляемое сырье, остатки, получаемые в сельском хозяйстве, или отходы животноводства, органические компоненты коммунальных и промышленных отходов, или отходы или обломки, образуемые при строительстве или сносе строений, или микроорганизмы, такие как водоросли или дрожжи.
В одном аспекте полипептиды согласно изобретению применяют в способе переработки любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая липидсодержащую или лигноцеллюлозную биомассу, в топливо (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо), или в других случаях применяют в способах гидро
- 105 015591 лиза или расщепления биоматериалов, так чтобы их можно было использовать в качестве топлива (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо), или для облегчения переработки биомассы в топливо.
Ферменты согласно изобретению, включая смесь ферментов или коктейли согласно изобретению, также можно использовать для очистки глицерина. Побочный продукт глицерина содержит не прореагировавший катализатор и мыло, которое нейтрализуют кислотой. Воду и спирт удаляют, получая от 50 до 80% неочищенного глицерина. Остальные загрязняющие вещества включают не прореагировавшие жиры и масла, которые могут быть обработаны с использованием полипептидов согласно изобретению. На больших заводах по производству биодизельного топлива согласно изобретению глицерин может быть дополнительно очищен, например, до 99% или более высокой степени очистки, для фармацевтической и косметической промышленности.
Топливо (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол или биодизельное топливо), полученное с использованием полипептидов согласно изобретению, включая смесь ферментов или коктейли согласно изобретению, может быть использовано с оксигенатами топлива, чтобы улучшить параметры сжигания. Добавление кислорода приводит к более полному сжиганию, что снижает выбросы оксида углерода. Это является другим преимуществом замены топлива на основе нефти биотопливом (например, топливом согласно изобретению) для окружающей среды. Биотопливо, полученное с использованием композиций и/или способов согласно настоящему изобретению, может быть смешано с бензином с образованием смеси Е10 (примерно от 5 до 10% этанола и примерно от 90 до 95% бензина), но его можно использовать в более высоких концентрациях, например в виде Е85 или в очищенной форме. Биотопливо, полученное с использованием композиций и/или способов согласно настоящему изобретению, может быть смешано с дизельным топливом на основе нефти с образованием смеси В20 (20% биодизельного топлива и 80% дизельного топлива на основе нефти), хотя можно использовать другие уровни в смеси вплоть до В100 (чистое биодизельное топливо).
Изобретение также относится к способам получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) из композиций, содержащих любую биомассу, например биомассу животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды биомассу или лигноцеллюлозную массу. Материал биомассы может быть получен из сельскохозяйственных культур в качестве побочного продукта производства пищевых продуктов и кормов или в качестве лигноцеллюлозных отходов, таких как растительные остатки, макулатура или отходы или обломки, образующиеся при строительстве и/или сносе строений. Примерами подходящих растительных источников или растительных остатков для обработки полипептидами согласно изобретению являются бурые водоросли, зеленые водоросли, зерно, семена, стебли, листья, кожура, шелуха, стержни кукурузного початка, кукурузная солома с початками, солома, травы (например, соргаструм, такой как 8огдЕаз!гит пи!апз; или просо, например виды Рашсит, такие как Рашсит упда!ит), и тому подобные, а также древесина, древесные стружки, древесная масса и опилки. Примеры бумажных отходов, подходящих для обработки полипептидами согласно изобретению, включают бракованную фотобумагу, бумагу для компьютерного принтера, бумагу для тетрадей, бумагу для блокнотов, бумагу для пишущих машинок и тому подобную, а также газеты, журналы, картон и изготовленные из бумаги упаковочные материалы. Примерами отходов и обломков, образующихся при строительстве и сносе строений, являются древесина, древесные отходы, древесные стружки и опилки.
В одном варианте ферменты, включая смесь ферментов или коктейли согласно изобретению, и способы согласно изобретению можно использовать совместно с более традиционными способами получения этанола, метанола, пропанола, бутанола, пропанола и/или биодизельного топлива из биомассы, например, такими как способы, включающие в себя гидролиз липидов и/или лигноцеллюлозных материалов, который осуществляют, подвергая в реакторе любую высушенную биомассу, например, биомассу животных, водорослей и/или растений, включающую в себя липидсодержащий или лигноцеллюлозный материал биомассы, воздействию катализатора, состоящего из разбавленного раствора сильной кислоты и соли металла; это может снижать энергию активации или температуру реакции гидролиза целлюлозы, чтобы получить более высокие выходы сахара; смотри, например, патенты США № 6660506 и 6423145.
Другой типичный способ, который включает в себя применение ферментов согласно изобретению, включая смесь ферментов или коктейли согласно изобретению, заключается в гидролизе любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды биомассу или лигноцеллюлозную биомассу, содержащую гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнина, или любой другой полисахарид, который может быть гидролизован ферментом согласно настоящему изобретению, в результате того, что материал подвергают первой стадии гидролиза в водной среде при температуре и давлении, выбранных для осуществления главным образом деполимеризации гемицеллюлозы без существенной деполимеризации целлюлозы до глюкозы. Указанная стадия приводит к получению суспензии, в которой жидкая водная фаза содержит растворенные моносахариды, образованные в результате деполимеризации гемицеллюлозы, а твердая фаза содержит целлюлозу и лигнин. Вторая стадия гидролиза может включать в себя такие условия, чтобы, по меньшей мере, основная часть целлюлозы подвергалась
- 106 015591 деполимеризации, такая стадия приводит к образованию жидкой водной фазы, содержащей растворенные/растворимые продукты деполимеризации целлюлозы. Смотри, например, патент США № 5536325. Ферменты согласно изобретению (включая смеси или коктейли ферментов согласно изобретению) могут быть добавлены на любой стадии данного приведенного в качестве примера способа.
Другой типичный способ, который включает в себя применение ферментов согласно изобретению, включая смесь ферментов или коктейли согласно изобретению, заключается в обработке любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включающей в себя липидсодержащий или лигноцеллюлозный материал биомассы, на одной или нескольких стадиях гидролиза разбавленной кислотой с использованием примерно 0,4%-2% сильной кислоты; и обработке не прореагировавшего твердого лигноцеллюлозного компонента подвергнутого кислотному гидролизу материала биомассы способом щелочной делигнификации с образованием предшественников для биоразрушаемых термопластиков и производных. Смотри, например, патент США № 6409841. Ферменты согласно изобретению могут быть добавлены на любой стадии указанного приведенного в качестве примера способа.
Другой типичный способ, который включает в себя применение ферментов согласно изобретению, включая смесь или коктейли ферментов согласно изобретению, заключается в предварительном гидролизе биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включающей в себя липидсодержащий или лигноцеллюлозный материал биомассы, в реакторе для предварительного гидролиза; добавлении кислой жидкости к твердому материалу (например, лигноцеллюлозному материалу) с получением смеси; нагревании смеси до температуры реакции; поддержании температуры реакции в течение периода времени, достаточного для фракционирования лигноцеллюлозного материала на растворенную часть, содержащую по меньшей мере примерно 20% лигнина из лигноцеллюлозного материала, и твердую фракцию, содержащую целлюлозу; отделения растворенной части от твердой фракции при температуре, равной или близкой к температуре реакции, при этом целлюлоза в твердой фракции становится более чувствительной к ферментативному расщеплению; и извлечения растворимой части. Смотри, например, патент США № 5705369. Ферменты согласно изобретению могут быть добавлены на любой стадии указанного типичного способа.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения композиций моторного топлива (например, для моторов с электрозажиганием) на основе жидких углеводородов, смешанных с топливным спиртом, полученным с использованием фермента или способа согласно изобретению. В одном аспекте топливо, полученное с применением фермента согласно изобретению, содержит, например, смеси жидкого каменноугольного газа или жидкого природного газа с этанолом. В одном аспекте корастворителем является полученный из биомассы 2-метилтетрагидрофуран (МТНЕ). Смотри, например, патент США № 6712866.
В одном аспекте способы согласно изобретению для ферментативного разрушения любой биомассы, например, биомассы животных, водорослей и/или растений, включая липидсодержащую или лигноцеллюлозную биомассу, например, для получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельные топлива) из органического материала, также могут включать в себя применение ультразвуковой обработки материала биомассы; смотри, например, патент США № 6333181.
В другом аспекте способы согласно изобретению для получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельные топлива) из целлюлозного субстрата включают в себя получение реакционной смеси в форме взвеси, содержащей целлюлозный субстрат, фермент согласно настоящему изобретению и агент для ферментации (например, в резервуаре для реакции, таком как биореактор с полунепрерывной подачей твердых веществ), и реакционную смесь подвергают реакции в условиях, достаточных для инициации и поддержания реакции ферментации (как описано, например, в заявке на выдачу патента США № 20060014260). В одном аспекте с помощью экспериментальных или теоретических расчетов можно определить оптимальную частоту подачи. В одном аспекте в резервуар для реакции подают дополнительные количества целлюлозного субстрата и фермента с определенными интервалами в соответствии с оптимизированной частотой подачи.
Один пример способа получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) согласно изобретению описан в публикациях заявок на выдачу патента США № 20050069998, 20020164730; и в одном аспекте включает в себя стадии измельчения любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая липидсодержащую или лигноцеллюлозную биомассу (например, до размера частиц 15-30 мм), предварительной обработки полученного продукта паром (например, при температуре 190-230°С) в течение периода времени от 1 до 10 мин в реакторе; сбора предварительно обработанного материала в циклоне или подобном продукте производства и разделения жидкой и твердой фракций фильтрованием в фильтрпрессе, введения твердой фракции в слой для ферментации и добавления одного или нескольких ферментов согласно изобретению, например фермента целлюлазы и/или бета-глюкозидазы (например, растворенных в цитратном буфере с рН 4,8).
Другой типичный способ получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельные топлива) согласно изобретению, содержащего
- 107 015591 биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, с использованием ферментов согласно изобретению включает в себя предварительную обработку исходного материала, содержащего любую биомассу, например биомассу животных, водорослей и/или растений, включая исходную липидсодержащую или лигноцеллюлозную биомассу, содержащую, по меньшей мере, гемицеллюлозу и целлюлозу. В одном аспекте исходный материал содержит картофель, сою (рапс), ячмень, рожь, кукурузу, овес, пшеницу, свеклу или сахарный тростник или компонент, или отходы, или побочные продукты производства пищевых продуктов и кормов. Исходный материал (сырье) подвергают реакции в условиях, которые разрушают структуру растительных волокон, чтобы осуществить, по меньшей мере, частичный гидролиз гемицеллюлозы и целлюлозы. Условия для разрушения могут включать в себя, например, воздействие на исходный материал средними температурами от 180 до 270°С при рН 0,5-2,5 в течение периода времени примерно от 5 с до 60 мин; или температурами от 220 до 270°С, при рН 0,5-2,5 в течение периода времени от 5 до 120 с, или эквивалентные условия. Такие условия позволяют получать сырье с повышенной доступностью для расщепления ферментом, например ферментом целлюлазой согласно изобретению, патент США № 6090595.
Типичные условия для применения ферментов согласно изобретению в гидролизе любой биомассы, например биомассы животных, водорослей/или растений, включая липидсодержащую или лигноцеллюлозную биомассу, включают в себя реакции при температурах примерно от 30 до 48°С и/или значениях рН примерно от 4,0 до 6,0. Другие типичные условия включают в себя температуру примерно от 30 до 60°С и значения рН примерно от 4,0 до 8,0.
Глюканазы (или целлюлазы), маннаназы, ксиланазы, амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы согласно изобретению можно использовать для переработки биомассы в топливо и для получения этанола, например, как описано в заявках РСТ № \0 0043496 и \0 8100857. Глюканазы (или целлюлазы), маннаназы, ксиланазы, амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы согласно изобретению можно использовать для получения ферментируемых сахаров и содержащей глюкан биомассы, которая может быть переработана в топливный этанол.
Биодизельные топлива - применение ферментов согласно изобретению для их получения
В настоящем изобретении предлагаются композиции, содержащие ферменты согласно изобретению, и способы получения биодизельного топлива, включая любое биотопливо, например биодизельное топливо, содержащее сложные алкиловые эфиры, полученные в результате переэтерификации растительных масел и/или животных жиров.
Например, в альтернативных аспектах полипептиды согласно изобретению, включая смеси ферментов или коктейли согласно изобретению, применяют в способах переэтерификации, в процессе взаимодействия спирта (подобного этанолу, пропанолу, бутанолу, пропанолу, метанолу) с триглицеридным маслом, входящим в состав растительного масла, животного жира или регенерированных технических жиров, с образованием сложных алкиловых эфиров жирных кислот - включая биодизель - и глицерина. В одном аспекте биодизельное топливо получают из соевого масла или регенерированных масел для жарки. Животные жиры, другие растительные масла и другие регенерированные масла также можно использовать (и обрабатывать ферментами, например фосфолипазами, согласно изобретению) для получения биодизельного топлива, в зависимости от их стоимости и доступности. В другом аспекте используют смеси всех видов жиров и масел для получения биодизельного топлива согласно изобретению с использованием ферментов согласно изобретению.
В настоящем изобретении предлагаются композиции, содержащие ферменты согласно изобретению, и способы обработки желтого жира, указанный термин изначально был дан в области производства технических жиров и кормовых продуктов из непищевого животного сырья. Желтый жир, который может быть повергнут обработке с использованием композиций и способов согласно изобретению, включает жир из масел после жарки, например, из фритюрниц или жироуловителей ресторанов, или жиры различных (например, более низкого качества) сортов, получаемых на заводах по переработке отходов. Таким образом, изобретение также относится к маслам, техническим жирам, маслам после жарки, растительным маслам, техническим жирам из отходов ресторанов и к обработке жиров разного сорта с использованием по меньшей мере одного фермента согласно настоящему изобретению.
Желтый жир, обработанный с использованием композиций согласно изобретению, содержащей ферменты, и способов согласно изобретению можно применять для распыления на дорогах, например, для борьбы с пылью, или в качестве добавок в корма для животных или кормов, или добавок к продуктам питания.
В другом аспекте композиции согласно изобретению, содержащие ферменты, и способы согласно изобретению можно применять для обработки липидов, например технических жиров, таких как жиры из отходов ресторанов, чтобы получить биотопливо, например биодизельное топливо, например, для легковых автомобилей, автобусов, грузовых автомобилей или судов. В одном аспекте биодизельное топливо, полученное с использованием композиции или способа согласно изобретению, может быть получено из любого возобновляемого растительного источника, например из сои, и/или из технического жира, такого
- 108 015591 как желтый жир.
Композиции согласно изобретению, содержащие ферменты, и способы согласно изобретению можно применять для обработки 8УО, или неиспользованного растительного масла, включая любое растительное масло, которое может служить топливом для дизельного двигателя, например, когда обработка включает в себя переэтерификацию липидов в топливо, например, для применения при низких температурах.
Композиции согласно изобретению, содержащие ферменты, и способы согласно изобретению можно применять для обработки \УУО или отходов растительного масла, чтобы получить, например, желтый жир, включая отходы жира из ресторанов; в одном аспекте жировые отходы могут быть профильтрованы для удаления частиц пищи. Желтый жир, обрабатываемый композициями согласно изобретению, содержащими ферменты, и способами согласно изобретению, может попадать в категорию 8УО/^УО, включая любой технический жир, например, жировые отходы ресторанов, которые могут содержать говяжий жир и другие животные продукты.
Обработка сухой гранулированной барды
В другом аспекте ферменты (например, фосфолипазы) согласно изобретению можно использовать для обработки/процесса обработки сухого экстракта барды (ΌΌ8), сухой гранулированной барды (ΌΌ8), конденсированного экстракта барды (СЭ8), влажной гранулированной барды (Ό\ν0) или сухой гранулированной барды с растворимыми компонентами (ΌΌ08); при этом сухая гранулированная барда может представлять собой побочный продукт процесса перегонки продуктов из злаковых культур и может содержать растворимые компоненты. Указанные способы могут включать в себя сухое измельчение растительных побочных продуктов, например, для применения в качестве корма, например, для домашней птицы, коров, свиней и других домашних животных. Таким образом, ферменты согласно изобретению могут быть использованы для обработки зерновых, например хлебных злаков, которые являются побочными продуктами любого способа перегонки, включая способы, в которых используют любой источник зерна, например традиционные связанные с пивоварением источники или, альтернативно, производящие этанол предприятия (заводы, комбинаты и тому подобное). Ферменты согласно изобретению можно использовать для обработки/способа сушки сусла, полученного после перегонки; такое сусло затем может быть использовано для многих целей, например, в качестве корма для скота, особенно для жвачных животных; таким образом, настоящее изобретение относится к способам обработки корма для скота, например для жвачных животных, и к обработанному ферментом корму, содержащему фитазы согласно настоящему изобретению.
Ферменты согласно настоящему изобретению можно использовать отдельно или с другими ферментами для обработки сухого экстракта барды (ΌΌ8), сухой гранулированной барды (ΌΌ8), конденсированного экстракта барды (СЭ8), влажной гранулированной барды (Ό\ν0) и сухой гранулированной барды с растворимыми компонентами (ΌΌ08). Например, ферменты согласно настоящему изобретению можно использовать на любой стадии способа получения спирта, как показано на фиг. 37. Ферменты согласно настоящему изобретению можно использовать для повышения биодоступности фосфора в любом биотопливе или потенциальном биотопливе, включая фосфор в составе сухого экстракта барды (ΌΌ8), сухой гранулированной барды (ΌΌ8), конденсированного экстракта барды (СЭ8), влажной гранулированной барды (Ό\ν0) или сухой гранулированной барды с растворимыми компонентами (ΌΌ08) (смотри, например, С. Майте/ Ате/сиа, 2004 Роибгу 8с1епсе, 83: 971-976).
Получение спиртных напитков или питьевого спирта
Ферменты согласно настоящему изобретению согласно настоящему изобретению также можно использовать для обработки сухой гранулированной барды для получения спирта - спирта в виде спиртных напитках, например, получения пива или виски (в дополнение к применению для обработки биомассы для получения биотоплива). Ферменты согласно настоящему изобретению можно использовать на спиртовых заводах, например, для обработки зерна, такого как кукуруза. Сухую гранулированную барду можно получить, сначала размалывая зерно (например, кукурузу) до получения грубого помола и добавляя его к горячей воде. После охлаждения добавляют дрожжи и смесь бродит в течение от нескольких дней до недели. Твердые вещества, оставшиеся после брожения, представляют собой частицы барды. Фитазы согласно настоящему изобретению можно использовать на любой стадии указанного способа.
Препараты
В настоящем изобретении предлагаются новые препараты, содержащие ферменты согласно настоящему изобретению, и препараты фосфолипаз согласно изобретению, включая препараты, которые содержат новые ферменты согласно изобретению. Ферменты согласно изобретению можно использовать или готовить в виде препарата отдельно, или в виде смеси фосфолипаз согласно изобретению, или смеси с другими фосфолипазами или другими ферментами, такими как ксиланазы, целлюлазы, протеазы, липазы, амилазы или окислительно-восстановительные ферменты, такие как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы или редуктазы. Они могут быть приготовлены в твердой форме, такой как порошок, лиофилизованный препарат, гранула, таблетка, пластинка, кристалл, капсула, пилюля, подушечка, или в жидкой форме, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, суспензия, эмульсия вода/масло, крем, капсула, или суспензия везикул или мицеллярная суспензия. Препараты согласно изобретению могут содержать
- 109 015591 любой из следующих ингредиентов или их сочетание: полиолы, такие как полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, глицерин, сахар, такой как сахароза, сорбит, трегалоза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, манноза, гелеобразующий агент, такой как гуаровая камедь, карагинан, альгинат, декстраны, производное целлюлозы, пектин, соль, такая как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид цинка, сульфат цинка, соль жирной кислоты и производное жирной кислоты, хелатор металла, такой как ЕЭТА, ЕСТА, цитрат натрия, противомикробное средство, такое как жирная кислота или производное жирной кислоты, парабен, сорбат, бензоат, дополнительное модулирующее соединение для блокирования действия фермента, такого как протеаза, объемные белки, такие как БСА, гидролизат пшеницы, боратное соединение, аминокислота или пептид, соединение, модулирующее соответствующий уровень рΗ или температуру соединение, эмульгатор, такой как неионогенный и/или ионогенный детергент, окислительно-восстановительный агент, такой как цистин/цистеин, глутатион, окисленный глутатион, восстановленное или антиоксидантное соединение, такое как аскорбиновая кислота, или диспергирующее вещество.
Для повышения стабильности фермента можно использовать поперечное сшивание и модификации белка, такие как пегилирование, модификацию жирными кислотами, гликозилирование.
Другие применения фосфолипаз согласно изобретению
Фосфолипазы согласно изобретению также могут быть использованы для изучения фосфоинозитидных (И) сигнальных систем; в диагностике, прогнозировании и разработке способов лечения биполярных расстройств (смотри, например, Рапйеу (2002) Nеи^орхусйорйа^тасо1оду, 26: 216-228); в качестве антиоксидантов; в качестве модифицированных фосфолипидов; в качестве пенообразующих и гелеобразующих средств; при создании ангиогенных липидов для васкуляризации тканей; для идентификации модуляторов фосфолипаз, например РЬА, РЬВ, РЬС, РЬЭ и/или пататина (агонистов или антагонистов), например ингибиторов, с целью использования в качестве противоопухолевых, противовоспалительных и анальгезирующих средств. Указанные фосфолипазы также можно использовать для получения кислых фосфолипидов для снижения горького вкуса пищи и фармацевтических препаратов. Их также можно использовать при очистке жиров. Кроме того, они могут использоваться для идентификации пептидных ингибиторов, применяемых при лечении вирусных, воспалительных, аллергических и сердечнососудистых заболеваний. Ферменты также можно использовать для создания вакцин. Их также можно использовать для получения глицеридов полиненасыщенных глицеридов жирных кислот и фосфатидилглицеринов.
Фосфолипазы согласно изобретению, например ферменты РЬА и РЬС, используют для получения иммунотоксинов и различных терапевтических средств, применяемых при лечении рака.
Фосфолипазы согласно изобретению могут использоваться в сочетании с другими ферментами для обесцвечивания (например, для удаления хлорофилла) и в составе детергентов (смотри выше), например, в сочетании с другими ферментами (например, с липазами, протеазами, эстеразами, фосфатазами). Например, в любом случае, где используют РЬС, в сочетании с ней можно использовать РЬЭ и фосфатазу для достижения того же результата, что и в случае использования одной РЬС.
В приведенной далее таблице суммировано несколько примеров способов и препаратов согласно изобретению
Пример способа согласно изобретению
Использование химических веществ в дегуммировании масла с применением РЬС Не применяют кислоту
Не применяют каустик
Диапазон использования кислоты и каустика (не избыток к избытку)
Другие типы кислоты и каустика
Цель
Исключение химических веществ Исключение химических веществ Уменьшение использования химических средств/ альтернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования
- 110 015591
Влияние воды в дегуммировании масла с применением РЬС
Использование силикагеля
Использование средства, осушающего воду
Влияние более низкого содержания воды во время каустической обработки Минимальное содержание воды (<5%)
Максимальное содержание воды (>5%)
Профили влажности при РЬСдегуммировании
Зависимость выхода масла от содержания воды в случае РЬС-дегуммирования Удаление свободных жирных кислот (ЕЕА) ίη вхЕи
Добавление агента, хелатирующего ГГА
Замена стадии промывки водой Исключение воды в конечном продукте Исключение воды в конечном продукте Исключение воды в конечном продукте .Альтернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования
Альтернативный вариант способа дегуммирования; улучшает условия в масле из испорченных бобов
Влияние режима смешивания на дегуммирование масла с применением РЬС
РЬС-дегуммирование с минимальным перемешиванием
РЬС-дегуммирование с начальным перемешиванием со сдвиговыми усилиями с последующим перемешиванием с помощью лопастной мешалки
Порядок добавления химических регентов
Порядок добавления: фермент-вода, затем кислота и затем каустик
Защита фермента от денатурации, индуцированной перемешиванием, энергосбережение /Аль тернативный вариант способа дегуммирования
Позволяет РЬС работать до воздействия кислоты или каустика, вызывающих потенциальную инактивацию РЬС изза рН или хелатирования металлов
Альтернативные варианты дегуммирования с применением РЬС в отношении температуры и времени
Стадия обработки ферментов (время): <60 минут, предпочтительно <30 минут
Альтернативный вариант способа дегуммирования
- 111 015591
Стадия обработки ферментов (температура): 50-70°С, возможно <50°С (например, комнатная температура)
Преимущества дегуммирования масла с применением РЬС
Получение соапстока с минимизированным содержанием РЬ и обогащенного водорастворимыми сложными фосфатными эфирами
Снижение содержания нейтрального масла в смоле благодаря применению РЬС
Способ увеличения содержания ОАЕ в растительных маслах (например, 1,3—6АЕ)
Полезные для здоровья преимущества использования растительных масел с повышенным содержанием ЬАС по сравнению с другими маслами
Исследование способа дегуммирования, при котором не остается активности РЬС в масле
Исследование способа дегуммирования, при котором не остается регистрируемого белка РЬС в масле
Применение фермента для получения ОАС из содержащей лецитин массы смолы Применение РЬС со специальными маслами (РА, Р1-обогащенные)
Применение ΡΑ/ΡΙ-специфичных ферментов (например 596Е32/Р1-специфичный)
Применение ΡΑ/ΡΙ-специфичных ферментов (например 596ЕБ2/Р1-специфичный) + РС/РЕ-специфичные ферменты; влияние порядка добавления
Периодический или непрерывный способ
Применение ресуспендированной обработанной РЬС смолы для дальнейших операции дегуммирования масла
Баланс масс ϋΑΕ, ΕΈΑ, Р, металлов, нейтрального масла в смоле
Разное
Добавление РЬС к хлопьям, полученным из семян и косточек масличных культур перед прессованием
Альтернативный вариант способа дегуммирования
Альтернативный вариант способа дегуммирования
Аль тернати вный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования Пример пользы продукта
Альтернативный вариант способа дегуммирования/ регуляторные улучшения Альтернативный вариант способа дегуммирования/ регуляторные улучшения Пример пользы продукта Пример пользы продукта Альтернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования
Альтернативный вариант способа дегуммирования Аль тернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования
Аль тернативный вариант способа
- 112 015591
Анализ дегуммирования в небольшом масштабе
Использование других ферментов для уменьшения массы смол (например, фермента Руго1азе™, хлорофиллазы, пероксидазы, липазы, лакказы, маннаназы, протеазы, лактазы, амилазы и т.д. или их сочетаний)
Применение соединения для лучшего разделения масла/смолы
Твердая смола из обработанного Е'ЪС масла
Гликозилированные/дегликозилированные варианты фосфолипазы
Примеры препаратов согласно изобретению Пример жидкого препарата с точки зрения стабильности
Применение соединений для повышения стабильности РЪС при разных рН и в разных диапазонах температур (полиолы, соли, металлы...)
Использование гидрофобной системы доставки для РЪС (липосомы, гидратированный фермент в капельках рафинированного масла)
Альтернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммиро вания
Альтернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования Альтернативный вариант способа дегуммирования Цель
Стабилизация фермента для максимального получения ϋΑ6, возможно для изменения субстратной специфичности или сдвига образования продукта в сторону 1, 3-ПАС
Стабилизация фермента для максимального получения ПАС, возможно для изменения субстратной специфичности или сдвига образования продукта в сторону 1,3-ОАС
Твердый препарат с точки зрения стабильности
- 113 015591
Применение разных РЬС, систем носителей фосфолипаз (смол для иммобилизации, пористых матриц, гелей, гранул, порошков, таблеток, везикул/мицелл, инкапсулированных препаратов, структурных липидов, и т.д.), чтобы стабилизировать фосфолипазу и коферменты
Использование отходов дегуммирования (компонентов смолы, шелухи от семян) для препарата РЬС
Пример препарата и способы повышения активности
Использование химического средства или фермента для обеспечения лучшего диспергирования фермента в масле (например, шипучая матрица и т.д.)
Повторное использованием смол/фермента для дальнейших реакций дегуммирования
Использованием препаратов, которые усиливают расщепление или улавливание ферментом РЬ для гидролиза
Использование нескольких препаратов, содержащих РЬС с разными РЬспецифичностями
Использование нескольких препаратов для предотвращения инактивации одной РЬС компонентом в препарате другой РЬС с другой субстратной специфичностью
Использование нескольких препаратов для предотвращения инактивации одной РЬС компонентом в препарате другого фермента (гидролазы, оксидазы)
Использование периодических добавлений каустика в виде высвобождаемого в определеннее время препарата каустической добавки
Стабилизация фермента (ферментов) и простота отделения фермента от масла или фазы смолы после дегуммирования; физической отделение ферментной фазы во время обработки масла; воздействие на ΡΙ/ΡΑ ферментом РЬС
Уменьшение стоимости ингредиентов препарата, лучшая смешиваемость фермента с маслом, термостабилизация фермента
Более короткое время реакции/способ дегуммирования/ уменьшение использования химических средств Возможность повторного использования фермента
Более короткое время реакции/способ дегуммирования/ уменьшение использования химических средств Многосторонность процесса; разные ферменты могут требовать разных препаратов или могут быть добавлены на разных стадиях способа
Защита активностей РЬС в варианте с использованием многоферментной формы
Защита активностей РЬС в варианте с использованием многоферментной формы
Защита фермента от индуцированной перемешиванием денатурации, энергосбережение
Инактивация и модулирование активности ферментов гликозилированием
Настоящее изобретение относится к способам, включающим в себя применение рекомбинантных технологий для получения и экспрессии ферментов или других белков, обладающих биологической активностью, например вредных или токсичных ферментов (при этом ферменты или другие белки аномально гликозилированы) в неактивной или менее активной форме, которая может быть реактивирована. Способ включает в себя добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования (например, ^связанного или 0-связанного гликозилирования) к ферментам или другим белкам, обладающим биологической активностью (например, к ферменту согласно настоящему изобретению) посредством конструирования кодирующей последовательности, внедряющей новый сайт (сайты) гликозилирования; экспрессии вариантов кодирующей последовательности в эукариотических клетках или сконструированных эквивалентных клетках или в системе 1п уйго, способных к посттрансляционному гликозилированию.
- 114 015591
Например, состоящая из 3 аминокислот последовательность NX8/Т представляет собой сайт гликозилирования в эукариотических клетках, прокариотические клетки не способны к гликозилированию. Таким образом, изобретение включает в себя добавление по меньшей мере одной состоящей из 3 аминокислот последовательности NX8/Т к белку, так что его активность снижается или инактивируется вследствие посттрансляционного гликозилирования.
Гликозилирование может приводить к добавлению двух молекул №ацетилглюкозамина ЩС1ис№1с) к достатку. Последующие добавления могут быть специфичными для организма. У большинства видов затем к NС1исNас добавляется сахар манноза (Мапп), при этом количество остатков Мапп остатков составляет от 10 до 100. У некоторых видов также происходит добавление сиаловой кислоты. У Р1сЫа после добавления NС1исNас могут быть добавлены от 10 до 25 остатков Мапп.
Указанные способы включают в себя применение любого из дегликозилирующих ферментов или набора ферментов, многие из которых могут быть определены и/или являются коммерчески доступными. Например, фермент эндогликозидаза Н отщепляет последний NС1исNас, оставляя один NС1исNас все еще связанным с остатком N. Фермент РNСаза Г отщепляет все сахара и превращает аминогруппу боковой цепи остатка N в гидроксильную группу, что приводит к тому, что аминокислота N в ферменте становится аминокислотой аспартатом (Ό). Таким образом, способы включают в себя применение эндогликозидазы Н и/или РNСазы Г или эквивалентных ферментов ш у1уо или ш уйго для частичной или полной реактивации сконструированных временно инактивированных белков.
Способ включает в себя направление ферментов или других полипептидов в секреторный путь хозяина, так чтобы ферменты могли стать гликозилированными. Новые сайты гликозилирования конструируют так, что гликозилирование инактивирует фермент или модифицирует его активность, например снижает его активность или иным образом модифицирует активность, например блокирует сайт связывания субстрата. В связи с тем, что фермент является неактивным или менее активным, вредные или токсичные ферменты могут быть экспрессированы на высоком уровне, так как негативные эффекты вследствие их активности больше не являются ограничением того, сколько белка может быть накоплено в клетках-хозяевах. Неактивный гликозилированный фермент может быть реактивирован (частично или полностью) в результате удаления сахаров, например, с использованием коммерчески доступных дегликозилирующих ферментов, например, в результате удаления сахаров ш уйго или удаления сахаров ш у1уо с использованием клеточной инженерии.
В одном аспекте сайт-мишень гликозилирования эукариот, такой как NX8/Т, добавляют к любому белку, например ферменту согласно изобретению. Указанный способ позволяет специалисту в данной области добавлять сайты гликозилирования к представляющему интерес белку с возможным превращением такого белка в белок, который становится временно неактивным в том случае, когда такой белок гликозилирован в результате экспрессии такого белка в эукариотической клетке-хозяине и направления белка в секреторный путь клетки-хозяина.
Таким образом, изобретение относится к способам получения ферментов, которые обычно являются слишком вредными или токсичными, так что клетка-хозяин не может переносить их в больших количествах. Эффект может быть временным, так как можно восстановить активный фермент (в результате дегликозилирования, например в результате посттрансляционной модификации/дегликозилирования) для последующей работы, в которой требуется активный фермент.
В одном аспекте изобретение относится к способам получения и экспрессии белка, обладающего биологической активностью, активность которого временно инактивирована гликозилированием, включающим в себя: (а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий биологической активностью, при этом белок в природе не гликозилируется; (Ь) встраивание по меньшей мере одной последовательности, кодирующей мотив гликозилирования, в нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, при этом гликозилированная форма белка является неактивной; (с) встраивание в белок направляющей к мишени последовательности, так чтобы белок направлялся в секреторный путь клетки-хозяина, при этом клетка-хозяин способна узнавать мотив гликозилирования и гликозилировать белок; и (б) экспрессию модифицированной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя дегликозилирование экспрессированного белка с реактивацией таким образом активности белка, например фермента, такого как фермент согласно изобретению. В одном аспекте клеткойхозяином является эукариотическая клетка. В одном аспекте инактивированный экспрессированный рекомбинантный белок реактивируют ш уйго посредством дегликозилирования, либо химического, либо ферментативного.
Определение расположения одного или нескольких мотивов гликозилирования для временной инактивации белка включает в себя только обычные способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих варианты белков, например, с помощью С88М и обычных протоколов скрининга, например анализов активности или связывания.
Фермент, активность которого наносит вред клетке-хозяину, делали неактивной благодаря гликозилированию. Поскольку фермент был неактивным, он мог накапливаться в эукариотических клеткаххозяевах на гораздо более высоких уровнях. Поскольку он больше не был активным, он не мог больше проявлять свои негативные воздействия. Инактивация токсичного фермента была временной, так как
- 115 015591 дегликозилирование фермента с использованием ΕηбοΗ или РNСазы Р приводило к полному восстановлению нормальной активности фермента. Большое количество гликозилированного неактивного фермента накапливалось в среде, что свидетельствовало о том, что в неактивной форме он хорошо переносился хозяином.
Изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на конкретные примеры; однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено такими примерами.
Примеры
Пример 1. Программа ВБА8Т, используемая для анализа идентичности последовательностей.
В данном примере описана типичная программа определения идентичности последовательностей с целью выяснения того, входит ли данная нуклеиновая кислота в объем настоящего изобретения. Используется программа NСΒI ВБА8Т 2.2.2. с опциями, устанавливаемыми по умолчанию для Ь1ак!р. Использовали все значения, заданные по умолчанию, за исключением установки уровня фильтрования (т.е. все параметры установлены по умолчанию, за исключением параметра фильтрования, который установлен на значении 0РР); вместо него используют параметр -Р Р, который блокирует фильтрование. Использование параметра фильтрования по умолчанию часто приводит к нарушениям Каг1т-А1!ксйи1, связанным с малой длиной последовательности. Ниже приведены значения, используемые в данном примере по умолчанию:
Фильтрование в отношении низкой сложности: 0N > Размер слова: 3 > Матрица: В1окит62 > Вес пробела: Наличие: 11 > Расширение: 1.
Другие параметры, используемые по умолчанию, включали: фильтрование в отношении низкой сложности 0РР, размер слова 3 для белка, матрица Β^08υΜ62, штраф за наличие пробела -11 и штраф за расширение пробела -1. Параметр -\ устанавливается по умолчанию на 0. Это означает, что если он не установлен, то размер слова по умолчанию составляет 3 для белков и 11 для нуклеотидов. Происходило считывание установок:
ΒΕЛ^ΜΕ.Ь^к.!x!
> аргументы Ь1ак!а11 > -р Наименование программы [8!ппд] > -б База данных [8!ппд] > значение по умолчанию = пг > -ΐ Файл ввода запроса [Р11е ш] > значение по умолчанию = к!бш > -е значение ожидания (Е) [Веа1] > значение по умолчанию = 10,0.
> -т Параметры просмотра выравнивания:
> 0 = попарное, > 1 = показ идентичности по запросу, > 2 = нет идентичности по запросу, > 3 = показ идентичности по прямому запросу, > 4 = нет идентичности по прямому запросу, > 5 = нет идентичности по запросу и тупым концам, > 6 = нет идентичности по прямому запросу и тупым концам, > 7 = вывод из ΧΜΕ В1ак!, > 8 = табличная форма, > 9 = табличная форма с пояснениями [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -о файл вывода сообщений из ВБА8Т [Р11е 0и!] необязательный > значение по умолчанию = к!бои!
> -Р Фильтрование запрашиваемой последовательности (ОБ8Т для Ь1ак!п, 8ЕС для других программ) [8!ппд] > значение по умолчанию = Т > -С Вес открытия пробела (ноль выводит на режим работы по умолчанию) [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -Е Вес расширения пробела (ноль выводит на режим работы по умолчанию) [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -Χ Падение значения Χ для выравнивания с пробелами (в битах) (ноль выводит на режим работы по умолчанию) [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -Ι Показ С в строках определения [Т/Р] > значение по умолчанию = Р
- 116 015591 > -с.| Штраф за несовпадение нуклеотида (только для Ь1а§1п) [целое число] > значение по умолчанию = -3 > -г Добавление баллов за правильный подбор нуклеотида (только для ЫаЧп) [целое число] > значение по умолчанию = 1 > -ν Количество последовательностей в базе данных, выводимых для показа в виде однострочных описаний для (V) [целое число] > значение по умолчанию = 500 > -Ь Количество последовательностей в базе данных, выводимых для показа выравниваний для (В) [целое число] > значение по умолчанию = 250 > -Г Пороговое значение для расширения попаданий, в случае нуля значение по умолчанию [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -д Проведение выравнивания с пробелами (недоступно для 1Ь1а81х) [Т/Р] > значение по умолчанию = Т > -р Генетический код используемого запроса [целое число] > значение по умолчанию = 1 > -Ό Генетический код в БД (только для 1Ь1а81[пх]) [целое число] > значение по умолчанию = 1 > -а Количество используемых процессоров [целое число] > значение по умолчанию = 1 > -9 файл 8ес|ЛПдп [Р11е 0и1] необязатальный > -1 Подтверждение строки определения для запроса [Т/Р] > значение по умолчанию = Р > -Μ Матрица |§1г1пд| > значение по умолчанию - ΕΡ·08υΜ62 > Размер слова, если ноль, берется значение по умолчанию [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -ζ Эффективная длина в базе данных (для реального размера используется ноль) [81ппд] > значение по умолчанию = 0 > -К Количество наилучших попаданий в просматриваемой области (оГГ по умолчанию, при использовании рекомендуется значение 100) [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -Р 0 для множественных попаданий и 1 пропуска, 1 для однократного попадания и 1 пропуска, 2 для двух пропусков [целое число] > значение по умолчанию - 0 > -Υ Эффективная длина поискового пространства (используется ноль для реального размера) [Кеа1] > значение по умолчанию = 0 > -8 Запрос на поиск цепей в базе данных (для Ь1ай[пх] и 1Ь1а81х), 3 - для обеих, 1 - для верхней, 2 для нижней [целое число] > значение по умолчанию = 3 > -Т Вывод результатов в ΗТΜ^ [Т/Р] > значение по умолчанию = Р > -1 Ограничение поиска в базе данных перечнем ΟΙ [81ппд] необязательный > -И Использование нижнего варианта параметра фильтрования последовательности РЛ8ТЛ [Т/Р] необязательный > значение по умолчанию = Р > -у Падение значения (X) для расширения в Ь1а81 в битах (0.0 выводит на режим по умолчанию) [Кеа1] > значение по умолчанию = 0.0 > -Ζ Падение значения (X) для конечного выравнивания с пробелами (в битах) [целое число] > значение по умолчанию = 0 > -К Файл проверки Р8I-ТВ^Λ8ТN [Р11е №] необязательный > -п Поиск в ΜедаВ1а8ΐ [Т/Р] > значение по умолчанию = Р > -Ь Расположение на запрашиваемой последовательности [81ппд] необязательный > -Л Размер окна для множественных попаданий (ноль для алгоритма однократного попадания) [целое число] > значение по умолчанию = 40
Пример 2. Моделирование дегуммирования, опосредованного РЬС.
В данном примере описано моделирование опосредованного фосфолипазой С (РЬС) дегуммирова
- 117 015591 ния.
В связи с низкой растворимостью в воде фосфатидилхолин (РС) сначала растворяли в этаноле (100 мг/мл). Для первоначального тестирования готовили исходный раствор РС в 50 мМ 3-морфолинопропансульфоновой кислоте или 60 мМ лимонной кислоте/NаОΗ при рН 6. Исходный раствор РС (10 мкл, 1 мкг/мкл) добавляли к 500 мкл рафинированного соевого масла (2% воды) в эппендорфовской пробирке. Для получения эмульсии содержимое пробирки перемешивали в течение 3 мин в вихревом смесителе (смотри фиг. 5А). Масляную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 1 мин со скоростью 13000 об/мин (фиг. 5В). Реакционные пробирки предварительно инкубировали при требуемой температуре (37, 50 или 60°С) и 3 мкл РЬС из ВасШик сегеик (0,9 ед./мкл) добавляли к водной фазе (фиг. 5С). Исчезновение РС определяют с помощью ТСХ, используя в качестве системы растворителей смесь хлороформ/метанол/вода (65:25:4) (смотри, например, ТадисЫ (1975, выше) и визуализировали результат после воздействия паров йода.
На фиг. 5 показана схема, иллюстрирующая модель двухфазной системы для моделирования РЬСопосредованного дегуммирования. Фиг. 5А: получение эмульсии при смешивании неочищенного масла с 2% воды для гидратации загрязняющих фосфатидов (Р). Фиг. 5В: масляную и водную фазы разделяют после центрифугирования и добавляют РЬС к водной фазе, которая содержит осажденные фосфатиды (смолы). Гидролиз под действием РЬС происходит в водной фазе. Фиг. 5С: протекание реакции отслеживают в результате отбора аликвот из водной фазы с последующим анализом способом ТСХ.
Пример 3. Экспрессия фосфолипазы.
В данном примере описано конструирование коммерческого продуцирующего штамма согласно изобретению, который может экспрессировать несколько фосфолипаз (включая ферменты согласно изобретению). Чтобы получить многоферментный препарат, подходящий для применения в дегуммировании пищевых сортов растительных масел (включая соевое масло, масло канолы и подсолнечное масло), может быть создан рекомбинантный экспрессирующий штамм, который экспрессирует последовательности двух разных фосфолипаз в одном и том же экспрессирующем хозяине. Например, такой штамм может быть сконструирован так, чтобы он содержал одну или несколько копий гена РЬС и одну или несколько копий гена фосфатидилинозитол-специфичной РЬС. Такие гены могут существовать в одной плазмиде, в нескольких плазмидах, или гены могут быть встроены в геном экспрессирующего хозяина с использованием гомологичной рекомбинации. В том случае, когда гены вводят путем гомологичной рекомбинации, гены могут быть введены в один сайт в геноме хозяина в виде экспрессирующей ДНКкассеты, которая содержит одну или несколько копий обоих генов. Альтернативно, одну или несколько копий каждого гена можно вводить в отдельные сайты хромосомы хозяина. Экспрессия таких двух последовательностей генов может управляться одним типом промотора или каждая генная последовательность может управляться независимым промотором. В зависимости от количества копий каждого гена и типа промотора конечный штамм будет экспрессировать разные соотношения каждого типа активного фермента. Экспрессирующие штаммы могут быть сконструированы с использованием любой системы экспрессии на основе ВасШик (например, В. сегеик) или 81герШшусек, Е. отЬ 8. рοтЬе, Р. ракЮпк или других грамотрицательных, грамположительных или дрожжевых систем экспрессии.
В одном аспекте изобретение относится к двухферментной системе для дегуммирования соевого масла, в которой по меньшей мере один фермент представляет собой фермент согласно изобретению. РЬС плюс Р1-РБС дает больше ЭАС, чем любой фермент отдельно. Однако оба фермента дают больше ЭАС, чем в контрольном образце без фермента. В одном аспекте условия реакции включают в себя 1 мл соевого масла, -0,4% влаги в исходном масле перед любыми добавками, 50°С, 0,2% лимонную кислоту, нейтрализованную 2,75 М №0Н, 10 единиц РЬС, 15 мкл Р1-РБС (0,45 мг общего белка), общее время реакции 1 ч. На фиг. 12 изображена таблица, в которой суммированы данные, полученные в такой двухферментной системе дегуммирования согласно изобретению.
В другом аспекте фермент, Р1-РБС фермент согласно изобретению, может быть использован при таких же условиях, которые описаны для РЬС. Условия включают в себя химическое рафинирование растительных масел и дегуммирование растительных масел водой.
Пример 4. Фосфолипазы с улучшенной экспрессией и измененной резистентностью к протезам.
Изобретение относится к способу селекции вариантов фосфолипазы С (мутантов), обладающих улучшенной экспрессий в гликозилирующем хозяине и измененной резистентностью к секретируемым протеазам.
Улучшенная экспрессия в гликозилирующем хозяине
Возможные сайты связанного с аспарагинами гликозилирования с консенсусной аминокислотной последовательностью, аспарагин - любая аминокислота - серин или треонин ^Х8/Т в однобуквенном коде аминокислот), нокаутировали, используя способы мутагенеза, чтобы изменить аспарагины, или серин, или треонин в мотивах узнавания для гликозилирования на другие аминокислоты, так чтобы последовательность больше не кодировала возможный сайт гликозилирования. Исключение сайтов гликозилирования осуществляли, как указано ниже: аминокислотные положения аминокислоты 63, аминокислоты 131 и аминокислоты 134 фермента фосфолипазы С согласно изобретению, имеющей аминокислотную
- 118 015591 последовательность, которая указана в 8ЕЦ ГО N0: 175, кодируемую последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 178. Указанное исключение сайтов гликозилирования улучшало экспрессию такого варианта активного фермента фосфолипаз в С, когда белок гетерологично экспрессировался в дрожжах Р1сЫа ракЮпк. Такая методика уменьшения или исключения сайтов гликозилирования в ферменте РЬС может улучшать экспрессию активной РЬС в любом гликозилирующем хозяине. Таким образом, настоящее изобретение относится к фосфолипазным ферментам (и кодирующим их нуклеиновым кислотам), имеющим последовательность любой типичной фосфолипазы согласно изобретению с одним или несколькими или всеми измененными сайтами гликозилирования, которые описаны выше. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам получения последовательностей, кодирующих варианты фосфолипаз, имеющих повышенный уровень экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает в себя модификацию кодирующей фосфолипазу последовательности согласно изобретению так, что один, несколько или все мотивы, кодирующие сайты ^связанного гликозилирования, модифицируются с образованием негликозилированного мотива. Изобретение также относится к последовательности, кодирующей фосфолипазу, полученной таким способом, и к ферментам, которые они кодируют.
Измененная резистентность к протеазам
В настоящем изобретении предлагаются способы получения последовательностей, кодирующих варианты фосфолипаз, которые кодируют фосфолипазу, обладающую повышенной резистентностью к протеазе, включающих в себя модификацию аминокислоты в положении 131 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 175 с получением одного, нескольких или всех следующих остатков: лизина (К); серина (8); глицина (С); аргинина (К); глутамина (О); аланина (Α); изолейцина (Ι); гистидина (Н); фенилаланина (Р); треонина (Т); метионина (М); лейцина (Ь). Изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным фосфолипазам, кодируемым последовательностью, полученной таким способом. Изобретение также относится к способам получения последовательности, кодирующей варианты фосфолипаз, которая кодирует фосфолипазу, обладающую пониженной резистентностью к протеазе, включающим в себя модификацию аминокислоты в положении 131 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 175 с получением одной, нескольких или всех следующих остатков: триптофан (\ ); глутамин (Е); тирозин (Υ). Изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным фосфолипазам, кодируемым последовательностью, полученной таким способом.
Надосадок, содержащий смесь нативных протеаз, секретируемых РюЫа райопк, перемешивают и инкубируют с препаратами фермента РЬС дикого типа или мутантного РЬС. Реакции гасят и распад визуализируют в 8О8-ПААГ, сравнивая с негативным контролем без протеазы. Распад также можно определить, измеряя остаточную активность РЬС. Новизна результатов, полученных в таких исследованиях, заключается в том, что некоторые мутации, приводящие к нокаутированию гликозилирования, существенно изменяют чувствительность экспрессированной фосфолипазы к разрушению во время ферментации. Преимуществом способа является прямая селекция мутантов с повышенной или пониженной резистентностью к протеазам, секретируемым организмом-хозяином во время продуцирования.
В указанном способе согласно изобретению можно использовать сайт-специфичный мутагенез (например, С88М), чтобы изменить аминокислотную последовательность фермента фосфолипазы С согласно изобретению, например, как показано ниже - ферментативно активной подпоследовательности 8ЕЦ ГО N0: 2 (8ЕЦ ГО N0: 175). Каждую из аминокислот, изображенную жирным шрифтом или подчеркнутую (ниже), изменяют, превращая аспарагин в однобуквенном коде) в аспартат (Ό), серин (8) или другую аминокислоту, как описано ниже. Такие аминокислоты обозначены как аминокислота 63, аминокислота 131 и аминокислота 134 приведенной ниже последовательности, где триптофан (\) обозначен как аминокислота 1. Указанные мутации получали для того, чтобы увеличить экспрессию активного белка фосфолипазы С за счет уменьшения гликозилирования экспрессированного белка в системе экспрессии РюЫа ракЮпк. Такие же мутации могут увеличивать экспрессию любой активной фосфолипазы С согласно изобретению в любой другой системе экспрессии, которая гликозилирует аспарагины (^ связанное гликозилирование) в соответствии с системой NX8/Τ, где N означает аспарагин, X означает любую аминокислоту и 8/Т означает серин или треонин. Таким образом, изобретение также относится к способу изменения чувствительности экспрессированной фосфолипазы С в результате изменения аминокислоты в положении 131.
Аминокислоты 1-37 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2 представляют собой лидерную последовательность, которая удаляется во время экспрессии в РюЫа или удаляется протеазами при экспрессии в Е. со11. Аминокислоты 38-286 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2, содержащей три модификации (N630, N1318, N1340) представляют собой последовательность 8ЕЦ ГО N0: 175:
Примечание: чтобы подсчитать измененные положения, начинайте счет с первой аминокислоты (\) как положение 1.
Ή3ΑΕβΚΗΝΕ0ΙΝ3ΗΓΗΐνΝΚΑΙ0ΙΜ3ΕΝΤΤΐνΝΡΝΕΤΑ1ΈΝΕΗΚΆ0ΏΕΝ0ΙΥΞΑ0ΥΕΝΡΥΥ0ϋ
8ΤΥΑ5ΗΕ’Υη₽ΟΤ6ΤΤΥΙΡΓΑΚΗΑΚΕΤΟΆΚΥΕΉΙ·ΑΘ0ΑΥ0Νζ2ΟΜΩ0ΆΓΓΥΙ)εΐ<5Ι>ΗΥΕ6θνΝ0Ρ
ΜΗΑΑ3ΕΤΒ15ΥΡΜ6ΡΗ3ΚΥΕΝΡνϋΤΙΚΝΝΥΐν5Ο3Ν6ΥΗΝΗΚ6ΑΝΡΕΟ»ΙΕ6ΑΑνΑΑΚ0ϋΥΡ6 ννΝΟΤΤΚϋ»ΕνΚΑΑν30ΕΥΑΟΚ»ΚΑΕνΤ₽ντεΚΚΕΜΕΑ0ΚνΤΑεΥΙΗ1«ΓΟΤΥνΝΚ- 119 015591
Экспрессированные варианты фосфолипазы С инкубировали в присутствии протеаз Р. ракЫпк, как описано ниже, и получили следующие результаты.
Следующие аминокислоты в положении аминокислоты 131 последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 2 повышали резистентность экспрессированной фосфолипазы С к разрушению протеазами Р. ракЮпк: лизин (К); серин (8); глицин (С); аргинин (В); глутамин (О); аланин (А); изолейцин (I); гистидин (Н); фенилаланин (Е); треонин (Т); метионин (М); лейцин (Ъ). Следующие аминокислоты в положении аминокислоты 131 последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 2 снижали резистентность экспрессированной фосфолипазы С к разрушению протеазами Р. ракЮпк: триптофан (V); глутамат (Е); тирозин (Υ). Таким образом, настоящее изобретение относится к варианту фосфолипазы, имеющей любую одну или несколько либо все такие модификации, в зависимости от того, требуется ли увеличение или снижение резистентности экспрессированной фосфолипазы С к разрушению протеазой. В настоящем изобретении предлагается вариант фосфолипазы, имеющий любую одну или несколько либо все такие модификации в положении, эквивалентном положению 131 в последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 2. Какой остаток эквивалентен положению 131 последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 2, и может ли какая-либо конкретная модификация аминокислотного остатка повышать или снижать резистентность фермента к разрушению протеазой, можно обычным образом и с уверенностью установить, используя протоколы, которые хорошо известны в данной области, например, типичный анализ, используемый для оценки чувствительности к протеазам фосфолипазы С (последовательность 8Е0 ΙΌ NО: 2, кодируемая последовательностью 8Е0 ΙΌ NО: 1), описан ниже.
Буферы:
1,0 М МЕ8, рН 6,2
0,7 М ацетат натрия (NаАс), рН 5,2.
Проверка:
используют отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл;
к 25 мкл образца фермента РЬС добавляют 5 мкл NаΛс или 7 мкл буфера МЕ8 и смешивают; добавляют 25 мкл надосадка РюЫа рак1ог1к, содержащего протеазу, и смешивают;
добавляют 2 мкл 5% азида натрия и смешивают;
пробирки помещают в плавающем штативе в предварительно нагретом химическом стакане с водой в инкубатор во влажную атмосферу;
контроли содержат РЬС + буфер + йН2О и 8Ν РюЫа + буфер + ЙН2О;
инкубируют в течение 0-24 ч, при необходимости отбирают образцы в определенных временных точках.
Регистрация:
визуализируют в 8Э8-ПААГ, смешивая образцы 1:2 с буфером для образцов, содержащим 5 мМ ЕЭТА, нагревают до 100°С 4 мин, охлаждают, центрифугируют, смешивают, наносят 5 мкл образца на дорожку, красят Кумасси;
образцы в разных временных точках также могут быть взяты непосредственно для стандартного анализа активности РЬС.
Результаты:
разгоняли образцы в 8Э8-ПААГ-гелях, результаты показаны на фиг. 17; на которой представлены результаты экспериментов по расщеплению ш уНго, в которых варианты фосфолипазы С инкубировали в неочищенных протеазных экстрактах до 22 ч при 37°С. Каждый мутант РЬС назван в соответствии с аминокислотной, находящейся в положении X последовательности ΌΧΌ (аспартат в положении аминокислоты 63 - любая аминокислота в положении аминокислоты 131 - аспартат в положении аминокислоты 134). Результаты, полученные с использованием гелей, показывали стабильность или чувствительность экспрессированного мутантного белка РЬС при последующей инкубации с неочищенной протеазой. Стабильный мутант давал полосу РЬС, имеющую сходную интенсивность окрашивания в случае (контроль без протеазной реакции) и + (реакционная смесь содержит протеазу). Мутант более чувствительный к протеазе вызывал уменьшение интенсивности окрашивания полосы белка РЬС на дорожке по сравнению с дорожкой -.
Пример 5. Способ осуществления стабильной экспрессии РЬС на высоком уровне.
В настоящем изобретении предлагается способ ферментации для стабильного высокого уровня экспрессии и высокоспецифичной активности ферментов фосфолипаз, например РЬС, в дрожжевых культурах, например в культурах РюЫа рак1опк. Ферменты, полученные таким способом, могут быть использованы, например, при рафинировании растительного масла, такого как масло сои, канолы, подсолнечника или других масел.
В настоящем изобретении предлагается способ получения, включая параметры, которые делают возможным такое получение, активной фосфолипазы, например РЬС, в культуре дрожжевых клеток, например РюЫа ракГОпк, в виде подпитываемых культур в масштабе г/л. Гетерологичная экспрессия активного белка РЬС в микробиологических культурах была мало описана в литературе и только в масштабе мг/л. Способ согласно настоящему изобретению основан, кроме всего прочего, на обнаружении того, что экспрессия белка РЬС в культурах РюЫа ухудшает способность поглощать МеОН, но не влияет на дру
- 120 015591 гие исследованные параметры физиологического роста. В отличие от обычной экспрессии гетерологичного белка в культурах Р1сЫа требуются высокие скорости одновременной подпитки (глюкоза/или глицерин). Кроме улучшения параметров продуцирования фермента, большая степень подпитки также исключает экспрессию общей протеазной активности, которая коррелирует с разрушением РЬС. Кроме того, такие свойства, как плохая утилизация Μ00Η, можно преодолеть, тем самым дополнительно улучшив параметры продуцирования за счет получения РЬС в штаммах Р1сЫа с фенотипом Μπΐ+, не создавая проблем с масштабируемостью, обычно связанных с фенотипом Μπΐ+ (поэтому штаммы не использовали в промышленном масштабе). Таким образом, указанный способ согласно изобретению повышает продукцию активной РЬС в >50 раз (от 100 ед./мл с использованием стандартных способов до >5000 ед./мл цельного бульона; >5 г/л белка) по сравнению с условиями, которые обычно используют в системах Р1сЫа в промышленных масштабах. Кроме того, поскольку РЬС является металлоферментом, требующим связывания цинка для правильной укладки и активности, в одном аспекте изобретение относится к подпитке цинком. Такая методика подпитки цинком культур согласно изобретению делает активность РЬС почти полностью стабильной (потеря активности <5%) в виде цельного бульона, например, при 4°С в течение >5 суток. Такая методика существенно помогает в процессе извлечения, так как 1) полученная нестабильная активность белка продолжает ухудшаться в процессе извлечения и 2) методика обеспечивает большую гибкость обработки, особенно в крупном масштабе.
Анализ триптофаниламинопептидазы на планшетах для микротитрования
В настоящем изобретении предлагается анализ триптофаниламинопептидазы на планшетах для микротитрования, который разработали для определения относительных активностей триптофаниламинопептидаз в образцах, полученных в разных временных точках ферментации Р1сЫа. Пропускная способность такого анализа достаточна для отбора образцов во множестве временных точек в многочисленных процессах ферментации.
Материалы и способы.
Буфер:
мМ NаР04, 2 мМ ΜηС12) рН 7,5, водный.
Субстрат:
НТ^р-ΛΜС (ВасЕет, 11670).
Раствор субстрата: субстрат растворяют до концентрации 10 мМ в метаноле добавляют 100 мкл 10 мМ субстрата к 6 мл буфера.
Образцы:
временные точки ферментации Р1сЫа центрифугируют, чтобы удалить клетки. Подготовка микропланшетов:
вносят аликвоты раствора субстрата объемом 90 мкл в каждую лунку 96-луночного черного планшета в случае каждого повтора образца, пустые контроли и эталоны;
планшет для микротитрования помещают на столик считывающего устройства для микропланшетов для регистрации флуоресценции (например 8ресΐ^аΜаx, Μο1еси1а^ Оупаткк).
Добавления образцов и кинетика реакции:
настраивают считывающее устройство для микропланшетов для регистрации флуоресценции: возбуждение 350 нм/эмиссия 460 нм; предел автоматического отсечения (455 нм); РΜТ средняя; 3 считывания на лунку; автокалибровка оп;
комнатная температура;
время 0-30 мин; считывание каждые 30 с;
запуск функции смешивания содержимого планшетов на приборе, чтобы произвести перемешивание в течение 5 с перед первым считыванием;
вносят аликвоты образцов в 96-луночный планшет и используют многоканальную пипетку, перенеся образцы по 10 мкл на лунку;
снимают крышку, снова помещают микропланшет в считывающее устройство; начинают считывание.
В зависимости от активности, присущей неизвестным образцам, может требоваться изменение разбавления образца, продолжительности анализа и кинетики отбора образцов, при этом все переменные могут быть определены при обычном скрининге.
Показано, что субстрат является очень стабильным в указанных условиях, негативный пустой контроль не должен давать увеличения поглощения с течением времени.
Анализ протеазной активности на планшетах для микротитрования, содержащих ВоШру-БСА
В настоящем изобретении предлагается анализ протеазной активности на микропланшетах с Вой1ру-БСА с целью определения общей протеазной активности в образцах, полученных в разных временных точках при ферментации Р1сЫа. Пропускная способность в многочисленных процессах ферментации.
- 121 015591
Материалы и способы.
Субстрат:
ЬО-БСА зеленый РгоЬек, Ό12050).
Раствор субстрата:
растворяют содержимое одного флакона с субстратом (1 мг) в 1 мл воды, содержащей 0,1% азида натрия.
Образцы:
временные точки ферментации Р1сЫа;
центрифугируют, чтобы удалить клетки.
Позитивный контроль:
0,2 мг/мл субтилизина (81дта, Р5380) в 50 мМ ИаР04, рН 7,5;
стерильно разбавляют в воде.
Подготовка микропланшетов:
вносят аликвоты раствора субстрата объемом 90 мкл в каждую лунку 96-луночного черного планшета в случае каждого повтора образца, пустые контроли и эталоны.
Добавление образцов и реакция:
вносят аликвоты образцов в 96-луночный планшет и используют многоканальную пипетку для переноса образцов по 10 мкл на лунку;
заменяют крышку микропланшета фольгой, помещают во влажную среду в инкубатор при 37°С и инкубируют 3-4 ч или в течение ночи.
Измерение флуоресценции:
настраивают считывающее устройство для микропланшетов для регистрации флуоресценции (8ресΙπιΜηχ);
возбуждение 495 нм/эмиссия 525 нм; предел автоматического отсечения (515 нм); РМТ низкая; 3 считывания на лунку; автокалибровка оп;
комнатная температура.
Вой1ру-БСА выбирали в качестве общего субстрата протеаз. Отсутствие гидролиза Ьойру-БСА не указывало на отсутствие протеазы (протеаз), но было показано, что оно коррелирует с гидролизом фермента РЬС и отсутствием активности РЬС. Было показано, что БСА можно заменить Ьой1ру-мечеными овальбумином или казеином.
В одном аспекте используют характеристику протеазной активности на всем протяжении процесса ферментации, так как активность может быть временной и преходящей.
Показано, что субстрат является очень стабильным в указанных условиях, при этом негативный пустой контроль не должен давать увеличения поглощения с течением времени.
Измерение активности РЬС в цельном культуральном бульоне или в надосадке
В данном изобретении предлагается анализ для измерения активности РЬС в цельном культуральном бульоне или в надосадке; анализ представляет собой модификацию способа, описанного, например, в Ей\\'агй А. Ьепшк (1973) Кшейс йерепйепсе ой рЬокрЬоБраке А2 асНуЧу оп !Ье йе!егдеп! Тгйоп Х-100. I. Ыр1й Кек., 14: 152-159, и8Р 24/ΝΡ 19, РапсгеаЬраке-Аккау йог Браке асйуйу, р. 1256-1257. Анализ для измерения активности РЬС согласно изобретению включает в себя:
Растворы:
100 мМ раствор сульфата цинка;
100 мМ раствор хлорида кальция.
Раствор субстрата (20 мМ фосфатидилхслин, 40 мМ тритон Х-100, 5 мМ хлорид кальция).
Буфер для разбавления (0,1% тритон Х-100, 1 мМ сульфат цинка, 1% аравийская камедь).
Процедура анализа:
готовят разведения анализируемых образцов, используя буфер для разбавления (1,0% аравийская камедь, 1,0% тритон Х-100, 1 мМ сульфат цинка). Разведения готовят непосредственно перед анализом, используя ледяной буфер, и хранят на бане со льдом вплоть до использования;
переносят 20 мл раствора субстрата в стеклянный сосуд с рубашкой емкостью примерно 50 мл, наружная камера которого связана с термостатически регулируемой водяной баней. Смесь закрывают и непрерывно перемешивают, используя механическую мешалку. Поддерживая температуру смеси 37±0,1°С, субстрат предварительно титруют 0,01 N К0Н (водн. раствор) из микробюретки, вставленной через отверстие в крышке, чтобы довести рН до 7,3. Добавляют 50 мкл разведения фермента и затем продолжают автоматически добавлять 0,01 Ν К0Н (водн. раствор) в течение 6 мин, чтобы поддерживать значение рН 7.
Кроме того, используют стандартный электрофорез в ПААГ-геле, вестерн-блот-анализ и нозернблот-анализ ферментируемых культур, а также стандартные способы анализа параметров ферментации в режиме оп-1ше/ойй-1ше (уровни биомассы, анализ газа и т.д.).
- 122 015591
Создание штаммов РкЫа с фенотипом Ми1+
В настоящем изобретении предлагаются клетки, клеточные системы и способы экспрессии фосфолипазы С, включающие в себя применение штамма РюЫа с фенотипом Μυΐ+. Способ включает в себя встраивание гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей РЬС, в штамм РюЫа. Затем клетку культивируют в условиях, при которых экспрессируется РЬС. Способ может дополнительно включать в себя добавление цинка в среду культивирования.
В одном аспекте в указанных способах, клетках и клеточных системах используют последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, которая представляет собой металлофермент, требующий цинка. В одном аспекте его используют в концентрации 3 моль/моль. Он имеет молекулярную массу примерно 28 кД и рI примерно 5,2 и имеет широкую устойчивость к субстратам РС>РЕ>Р8»РЕ Эе подвергнутый процессингу фермент имеет сигнальную последовательность из 24 аминокислот, пропоследовательность из 13 аминокислот и зрелый фермент из 245 аминокислотных остатков.
В одном аспекте штаммы РюЫа Μυΐ+ согласно изобретению имеют две копии генов алкогольоксидазы (А0Х), А0Х1 и А0Х2, которые затрагивает трансформация (Μυΐ означает утилизация метанола Μе!11аηо1 и!111ха(1оп) следующим образом:
Μυΐ+
Единичное событие кроссинговера, гены А0Х1 и А0Х2 являются интактными.
Рост и экспрессия только на метаноле. Возможна ко-подпитка.
Μυΐ’
Событие двойного кроссинговера разрушает ген А0Х1.
Рост и экспрессия улучшаются с помощью ко-подпитки.
Μυ!-
Событие рекомбинации разрушает гены А0Х1 и 2.
Эе могут метаболизировать метанол, требуют ко-подпитки.
Итак: Μυΐ^Μυΐ’^Μυΐ’/ΜυΡ^Μυ^
Существуют различия в ферментации Μυΐ+ и Μιιΐ’ по нескольким параметрам, включая оптимальную концентрацию метанола для индукции;
скорость потребления кислорода;
Μυΐ+ растет быстрее, чем Μιιΐ’ на метаноле вследствие способности к более быстрому поглощению; простоту переходного периода после индукции;
Μυ!+ не используют для экспрессии в крупном масштабе;
аэрацию/возможность охлаждения, чувствительность к Μе0Η.
Путь утилизации метанола у РюЫа рах!ог хорошо известен в данной области. Алкогольоксидаза (А0Х) катализирует превращение метанола в формальдегид; таким образом, если А0Х сверхэкспрессируется, то это приводит к интоксикации дрожжевой клетки.
Пример протокола ферментации РюЫа рах!ог1х, используемого в одном аспекте согласно изобретению, включает в себя:
посев культуры (колба или резервуар);
периодическая ферментация в богатой среде, чтобы увеличить биомассу;
культивирование в ферментере с периодической подпиткой;
фаза получения партии (глицерин);
наращивание биомассы по мере потребления исходного источника углерода;
фаза подпитки глюкозой или глицерином;
добавление подпитки, регулируемое содержанием Ό.0., или линейная/экспоненциальная подпитка; выращивание до получения биомассы, достаточной для индукции и экспрессия (в отсутствие этанола, С-ограниченные);
индукция метанолом;
добавление подпитки, регулируемое (Ό.0.%, датчик Μе0Η, КО), или имеющиеся профили подпитки;
ко-подпитка глюкозой или глицерином в зависимости от фенотипа и параметров экспрессии; индукция Μυΐ+ 1-3 г/л Μе0Η;
индукция Μυΐ’ 4-7 г/л Μе0Η.
Фиг. 18 иллюстрирует результаты культивирования в ферментере периодического действия, которое обсуждается выше, с использованием только глицерина. Протеазная активность обусловлена эндогенной протеазой РюЫа. Периодическая ферментация может происходить в богатой среде для увеличения биомассы. Как показано на фиг. 18, постепенное увеличение протеазной активности, начинающееся примерно через 69 ч, соответствует постепенному снижению активности РЬС. Более высокая скорость ко-подпитки глицерином (д1ус) повышает экспрессию активной РЬС и снижает (исключает) продукцию протеазы, как показано в следующей таблице, в которой представлены суммарные данные:
- 123 015591
Скорость коподпитки (мл/мин) с- источник до/после индукции Индукция Οϋ Активность РЬС (Ед./мл надосадка) Потребление МеОН (л) ВосНрупротаава Конечная ОО
0,5 (л1ус/С1ус 100 1 Да 450
1,5 С1ус/С1ус 1100 1,7 Нет 680
2 61ус/С1ус 250-300 1550 1/3 Нет 860
2,5 Й1ус/С1ус 1550 1,4 Нет 900
3 {З1ус/Сз1ус 1715 1,4 Нет 820
1,5 1,5 С1ис/<л1ь1с С1ус/С1ис 250-300 180 616 0,5 1/3 Нет Нет 520 730
3 С1ус/Сз1ус 100 949-1529 0,8-1,4 Нет 998
2,5 С1ус/С1ус 229-729 0,4 Нет 963
Указанные исследования осуществляли в 30-литровых ферментерах ВВ для случая 080-РЬС. Измеряли скорость поглощения кислорода или ОИВ (Охудеп Ир!аке Ва!е), в качестве показателя общего здоровья культуры или биомаркера хорошей экспрессии. Фиг. 19 иллюстрирует результаты данного исследования, в котором проводили сравнение профилей ОИВ 30-литровых культур Р. раз)опз Ми!8, продуцирующих □8О-РЬС, 1700 ед./мл, 1100 ед./мл и 100 ед./мл РЬС, используя 30°С, ко-подпитку глицерином, как обсуждалось выше.
Фиг. 20 иллюстрирует сравнение профилей потребления метанола в 30-литровых культурах Р. раз1опз Ми!8, продуцирующих О8Э-РЬС при рН 6,2 (1100 ед./мл и 100 ед./мл РЬС) или гетерологичный белок, которые выращивали с ко-подпиткой глицерином, как обсуждалось выше. Такая подпитка МеОН регулировалась в зависимости от потребности, и остаточный уровень МеОН поддерживали на уровне 4 г/л.
Кроме того, фенотип Ми!+ повышал экспрессию активной РЬС и усиливал потребление МеОН, что суммировано в следующей таблице данных:
МиЪ Скорость ко- Индукция Активность Потребляли© ВосНру- Конечная
(ЛЭ РЬС МеОН протеаза ОП
подпитки
(мл/мин) (ед./мл надосадка) (л)
0,5 250-300 100 1 Да 450
1,5 1100 1,7 Нет 630
2 1550 1,3 Нет 860
2,5 1550 1,4 Нет 900
3 1715 1,4 Нет 820
0,5 1001 5, 6 Да 871
0,5 1200 7 Нет 908
1 1786 5,9 Нет 988
1 2010 6,8 Нет 930
1 250-300 1768 7,9 Нет 700
т 1,5 2669 10 Нет 701
1,5 2693 7,1 Нет 818
1,5 2597 3,1 Нет 804
2 2154 8,3 Нет 752
1,5 1164 7,1 Нет 807
1,5 1220 6,9 Нет 799
1,5 250-300 945 2,1 Да' 726
1,5 784 3 Да* 685
РЬС, по-видимому, не влияет на физиологические характеристики роста данного штамма с фенотипом Ми!+, который экспрессирует рекомбинантную РЬС 8ЕЦ ГО ΝΌ: 2, при количестве копий 6х, как показано на фиг. 21, где профиль ОИВ исследовали, как указано в описании к чертежу. В исследовании использовали подпитку МеОН, которая регулировалась подачей без остаточной глюкозы или МеОН в культурах МнЬ.
Кроме того, качество продуцируемого белка РЬС изменчиво и его невозможно предсказать, например, активно или 50% общего белка РЬС, как показано в виде представления результатов, полученных в 8О8-ПААГ, на фиг. 22. Суммарные данные, относящиеся к профилю ОИВ (обсуждаемого выше), графически представлены в верхней части изображения 808-ПААГ. Контроль обозначен 1С=0,5 мкл
- 124 015591
1,6 мг-мл-1. Не выявлено корреляции с протеазной или аминопептидазной активностью. Значительное количество активной РЬС было локализовано внутри клеток, как показано на фиг. 23 (где также показан протокол исследования), при этом >700 ед./мл РЬС выявляли внутри клеток (на фиг. 23, РЬС (8ЕЦ ΙΌ NО: 2) + альфа-сигнальный пептид (из 8ассбаготусез) + гликозилирование). Морфологические изменения коррелировали с концентрацией активной РЬС, как показано на фиг. 24. Степень морфологических изменений зависела от штамма и источника С.
Повышенный уровень Ζπ не усиливал экспрессию в штамме РюЫа, имеющем 2х-количество копий МиЕ 8ЕЦ ΙΌ NО: 2 с мутацией Ό8Ό, как указано в таблице данных ниже (превышение при 1х в результате ко-подпитки) (первый верхний ряд соответствует контрольному пустому вектору). Повышенный уровень Ζπ не улучшал стабильность при хранении в виде цельного бульона (сходный уровень активности после >100 ч при 4°С) и общую устойчивость процесса к нарушениям.
Ση МеОН (л) Основа (л) 70% (об./об.) глицерин (л) 00600 РЬС (ед./мл)
IX (2,2 мМ) 7,1 2,3 9,6 765 0
0,2Х 7,4 2,1 8, 6 731 392
IX 7,1 2, 8 9,0 776 2700
4Х 6,1 2,2 10 780 2448
12Х 6,4 2,3 9,8 776 2498
Ни фиг. 25 графически суммированы данные, показывающие состояние эффективности продуцирования РЬС в точке 95 ч ТРТ (общее время ферментации) у Р1сЫа. Пять столбиков с правой стороны графика показывают результаты для штамма Ζео или адаптированного к зеоцину штамма РюЫа разЮпз, продуцирующего РЬС. Указанный штамм представляет собой устойчивый к антибиотику не содержащий маркера штамм, экспрессирующий в качестве гетерологичного гена РЬС согласно изобретению (8ЕЦ ΙΌ NО: 2) в штамме РюЫа разЮпз. Было показано, что в результате адаптации штамма к антибиотику зеоцину можно получить новый стабильный штамм с сильно повышенным уровнем экспрессии представляющего интерес белка.
Исходный устойчивый к антибиотику не содержащий маркера штамм, штамм № 1 (содержащий последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 2), выращивали, используя серию стадий разведения, причем каждый раз с возрастающей концентрацией зеоцина, который является антибиотиком. На каждой стадии часть культуры с предыдущей стадии разбавляли до оптической плотности при 600 нм (ОЬ600), равной 1,0, свежей средой и добавляли возрастающие количества зеоцина к новой культуре еще на 24 ч роста. На конечной стадии использовали концентрацию зеоцина 200 мкг/мл, и конечную культуру штрихом высевали на чашку МЬ/УРЬ, давая возможность вырасти отдельным колониям. Обнаружено, что колонии с конечной стадии культивирования проявляли высокую толерантность к зеоцину, тогда как родительский штамм имел очень низкую толерантность. В одной из колоний, штамм № 2 (содержащий последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 2), наблюдали очень сильное повышение (примерно на 70% выше) экспрессии РЬС по сравнению с исходным штаммом № 1. Также было показано, что штамм № 2 стабилен как по толерантности к зеоцину, так и по экспрессии РЬС после посева 40-го поколения, что свидетельствует о том, что новый штамм приобрел постоянный признак высокой экспрессии РЬС и толерантности к зеоцину.
Высокий уровень активности РЬС достигали, используя штамм Ζео (адаптация РюЫа к зеоцину) согласно изобретению: достигали 4100 мкг/мл в минирезервуарах. Такой результат получали в случае штамма РюЫа, содержащего 6х-последовательность Ь80-8ЕО ΙΌ NО: 2. Коротко, указанный штамм, экспрессирующий последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 2, адаптировали посредством его выращивания с использованием серии стадий, на каждой из которых увеличивали концентрацию зеоцина. Вероятно, такой процесс адаптации вызывал некоторые изменения (на молекулярном или генетическом уровне) в штамме/конструкции и приводил к значимому повышению уровня активности РЬС. Например, получены следующие результаты:
резервуар 1, 2 и 4 (в каждом разные колонии), все колонии превосходили исходный предварительно адаптированный штамм, экспрессирующий последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 2, при этом в резервуарах 1 и 4 получали до 4100 мкг/мл, а в резервуаре 2 получали до 3500 мкг/мл;
в резервуаре 1 и 4 достигали более 3000 мкг/мл уже через 75 ч, что свидетельствует о более быстром накоплении активности по сравнению с исходным предварительно адаптированным штаммом, экспрессирующим последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 2 (который обычно к этому времени дает намного ниже 2000 мкг/мл).
Подробности дизайна эксперимента и результаты приведены ниже.
Обоснование адаптации к зеоцину.
Более раннюю стадию работы, связанную с экспрессией РЬС, осуществляли с использованием вектора рРIСΖа РюЫа, который содержит маркер устойчивости к зеоцину. Таким образом, зеоцин использовали для селекции трансформантов. Позже авторы переключились на вариант конструкции без АМК, чтобы разработать возможные кандидаты для коммерческих продуктов. При осуществлении фермента
- 125 015591 ции в минирезервуарах авторы наблюдали значительное снижение уровня активности РЬС, получаемой при использовании конструкций без ΛΜΚ: активность в надосадке достигала 4000 мкг/мл в случае конструкций рРIСΖа-^8^, тогда как только примерно 2000 мкг/мл наблюдали в случае 2х Ό8Ό. Значительные физиологические отличия, например более низкие скорости потребления метанола и намного более высокую степень лизиса клеток, также наблюдали в случае конструкций без ΛΜΚ, особенно при тестировании конструкций с большим количеством копий (5х, 6х) при использовании таких же протоколов ферментации.
Поскольку одним из явных отличий между конструкцией рРЕа и конструкцией без ΛΜΚ являлось использование зеоцина при трансформации, возникал вопрос о том, что произошло в клетках в ходе селекции на зеоцине. В настоящем изобретении предлагается выращивание конструкции без ΛΜΚ в присутствии зеоцина - в таком случае клетки претерпевают изменения, полезные для экспрессии РЬС.
Эксперименты по адаптации к зеоцину на 2х Ό8Ό.
Сначала в эксперименте использовали 3х Ό8Ό (которую на тот момент применяли в качестве молекулы для переноса). Исследование начинали с концентрации зеоцина 1 мкг/мл ('Уео 1) и выращивали культуру в течение ~24 ч. После этого осуществляли стадии увеличения концентрации зеоцина до ζео 5, ζео 10, ζео 15, ζео 20, ζео 40, ζео 60, ζео 80, ζео 100 и, наконец, до ζео 200 Цео 100 обычно используют для селекции при трансформации). На каждой стадии использовали свежую среду, использовали культуру с предыдущей стадии для инокуляции культуры на следующей стадии с 0Ό 1,0 и выращивали в течение ~24 ч. Культуры с каждой стадии также высевали штрихом на чашки УРЭ для сохранения и для получения отдельных колоний.
Ферментация в минирезервуарах дает адаптированные к ζео колонии.
Чтобы исследовать влияние адаптации к зеоцину по двенадцать колоний из культур ζео 200 и ζео 100 (которые высевали штрихом на чашки УР^) собирали и подвергали скринингу с использованием минирезервуаров. Результаты суммированы на слайде 6. Авторам удалось найти несколько колоний, которые существенно превосходят по характеристикам исходную конструкцию (штамм РюЫа, содержащий последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2). Из них колония № 5 из культуры ζео 200 имела примерно 50% повышение уровня активности РЬС.
Наблюдения в результате скрининга.
Не обнаружено явных различий в профиле роста между ζео-адаптированными культурами и исходным штаммом, экспрессирующим последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2.
Хотя стабильность адаптированных культур широко не испытывали, их несколько раз высевали штрихом на чашки УР^ и/или ΜΌ в отсутствие зеоцина. Все ферментации также осуществляли в отсутствие зеоцина.
Имели место явные вариации при сравнении колоний как в отношении роста, так и в отношении экспрессии РЬС.
Такие вариации отчасти могут быть связаны с некоторыми техническими проблемами.
Эксперимент по адаптации к зеоцину на 6х Ό8Ό.
Воодушевленные результатами, полученными для ζео-адаптированных 2х Ό8Ό, авторы осуществили такой же эксперимент для 6х Ό8Ό (которые, как было определено на тот момент, превосходили 2х Ό8Ό). Авторы начинали с концентрации зеоцина 5 мкг/мл ('Уео 5) и выращивали культуру в течение ~24 ч. После этого осуществляли стадии увеличения концентрации зеоцина до ζео 15, ζео 30, ζео 50, ζео 100 и, наконец, до ζео 200, так же, как в случае 2х Ό8Ό, на каждой стадии использовали свежую среду и использовали культуру с предыдущей стадии для инокуляции культуры на следующей стадии с 0Ό 1,0 и выращивали в течение ~24 ч. Культуры с каждой стадии также высевали штрихом на чашки УР^ для сохранения и для получения отдельных колоний.
Результаты для ζео-адаптированных колоний 6х Ό8Ό, выращиваемых в минирезервуарах.
Шесть колоний из культуры ζео 200 (которую высевали штрихом на чашку ΜΌ) собирали и тестировали вместе с исходным штаммом, экспрессирующим последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2, в минирезервуарах. Были сделаны следующие важные наблюдения.
Все три колонии (резервуар 1, 2 и 4) превосходили исходный штамм, экспрессирующий последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2, при этом в резервуаре 1 и 4 получали до 4100 мкг/мл, а в резервуаре 2 получали до 3500 мкг/мл.
В резервуаре 1 и 4 достигали более 3000 мкг/мл уже через 75 ч, что свидетельствует о более быстром накоплении активности по сравнению со штаммом, экспрессирующим последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2 (который обычно к этому времени дает намного ниже 2000 мкг/мл).
Уровень белка РЬС также был выше в резервуарах 1, 2 и 4 по сравнению с 3000 мкг/мл, достигаемым в 10-литровом резервуаре (смотри слайд 4). Таким образом, не ясно, выше ли удельная активность в резервуарах 1, 2 и 4, т.е. продуцируется ли другая РЬС, чем в случае исходного штамма, экспрессирующего последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2.
Контроль, резервуары 7 и 8, на сей раз не достигал 3000 мкг/мл. Не ясно, можно ли в резервуарах 1, 2 и 4 достичь еще более высокого уровня. Обратите внимание, что процент увеличения (35%,
- 126 015591
4100 мкг/мл по сравнению с 3000 мкг/мл) меньше, чем для 2 х-адаптированной культуры.
Суммарные данные, полученные при скрининге экспрессии в адаптированных к зеоцину 6х Ό8Όколониях, показаны на фиг. 26. Наиболее высокий уровень активности, наблюдаемый в случае исходного штамма, составлял ~3000 мкг/мл (минирезервуар и 10-литровый); уровень, достигаемый в случае адаптированного к зеоцину 6х Ό8Ό, составлял 4100 мкг/мл (увеличение ~35%). Фиг. 27 иллюстрирует данные, показывающие, что уровень белка РЬС был выше в резервуарах 1, 2 и 4 по сравнению с 3000 мкг/мл, достигаемым в 10-литровом резервуаре (и в условиях резервуара), как обсуждалось выше (на гель наносили 1,0 мкл 5 х-разбавленного бульона, 0,2 мкл цельного бульона). На фиг. 28 показано сравнение роста хео-адаптированных колоний и контрольных колоний. Адаптированные к зеоцину колонии 6х Ό8Ό имели профиль роста, сходный с профилем исходного штамма, экспрессирующего последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2 (6х Ό8Ό).
Ор секретируемого белка в ограниченных по С аэробных дрожжевых культурах обычно составляет 0,5-2,5 мг/г-ч-1 при μ=0,10 ч-1. На основании содержания белка 400 мг/г сухой массы метаболический груз составляет <10% от производительности общего белка. Уровень мРНК РЬС остается высоким на протяжении ферментации и не коррелирует с экспрессией. Из расчета 5 г/л (150 г) белка РЬС, менее чем 0,1 моль С/ч из общих 5 моль С/ч (~2% от общего количества потребляемого С) идет на углерод РЬС и ~25% идет на биомассу. Активность РЬС, по-видимому, не влияет на общие физиологические характеристики роста в таких условиях продуцирования (за исключением способности утилизировать Ме0Н).
Итак, в настоящем изобретении предлагаются резистентные к зеоцину системы дрожжевых клеток, такие как дрожжевые клетки, клеточные линии и/или отдельные клетки, для экспрессии гетерологичного белка (например, фермента, такого как РЬС), полученные способом, включающим в себя стадии получения клетки РюЫа кр. (например, Р. рак!опк), содержащей гетерологичную нуклеиновую кислоту (например, вектор, содержащий последовательность, кодирующую фермент; 0КР, оперативно связанную с промотором), способной экспрессировать гетерологичный белок; культивирования клетки (клеток) в условиях, включающих зеоцин в начальной концентрации (концентрация достаточно низкая, чтобы выжили некоторые клетки, но достаточно высокая, чтобы отобрать резистентные к антибиотику клетки); отбора клеток, резистентных к начальной концентрации зеоцина, и повторного культивирования в условиях, включающих более высокую концентрацию зеоцина; и отбора клеток, резистентных к более высокой концентрации зеоцина. Изобретение также относится к дрожжевым клеткам, клеточным линиям и/или отдельным клеткам, полученным таким способом. При обычном скрининге можно определить, какую нужно использовать начальную концентрацию антибиотика, сколько раундов необходимо или желательно и как быстро увеличивать концентрации антибиотика между раундами отбора.
Пример 6. Термостабильная РЬС.
Изобретение относится к термостабильным фосфолипазным ферментам. Показана термостабильность типичного фермента, имеющего последовательность, которая указана в 8ЕЦ ГО N0: 2. Показана термостабильность сравнимых фосфолипидов согласно изобретению с использованием последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2. Активность 8ЕЦ Ш N0: 2 тестировали в двух разных системах: водной и масляной. В водной системе для измерения активности использовали суррогатный субстрат (р-пррс); фермент начинал терять активность при 86°С. Однако в анализах с использованием масла, фермент проявлял хорошую активность в гидролизе субстратов РС и РЕ, присутствующих в соевом масле, при 85°С. Проверена Тт такого же фермента и обнаружено, что она составляет 86°С при 15 мг/мл, и процесс не обратим.
Фиг. 29 иллюстрирует результаты эксперимента по нагреванию до 85°С с использованием 10 единиц 8ЕЦ ГО N0: 2, проводимого в условиях, показанных на чертеже. Фиг. 30 иллюстрирует данные ЯМР, суммирующие данные такого эксперимента по нагреванию. Фиг. 31-33 иллюстрируют суммарные данные относительно термостабильности последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2 в случае использования р-№РС в условиях, показанных на чертеже. Фиг. 34 иллюстрирует данные ДСК-анализа, показывающие термостабильность последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2 при использовании концентрации фермента 15 мг/мл и Тт при 86°С.
Пример 7. Модификации РЬС согласно изобретению.
Модифицированный фермент фосфолипаза С, обсуждаемый в примере 4 (8ЕЦ ГО N0: 175, кодируемый последовательностью 8ЕЦ Ш N0: 178) является ферментативной активной подпоследовательностью более длинной последовательности (8ЕЦ ГО N0: 176). Последовательность 8ЕЦ ГО N0: 176 имеет лидерную последовательность из остатков 1-37 (указаны жирным шрифтом) последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2. Последовательность 8ЕЦ ГО N0: 176, которая кодируется последовательностью 8ЕЦ Ю N0: 177, использовали в качестве матрицы для дополнительной модификации с использованием методики С88М. Положения пронумерованы, начиная с №концевого метионина. Мутации, обсуждаемые в примере 4, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом (пронумерованы в данном описании как N1000, N1688 и N1710).
- 127 015591
МКККУЪАЪАА ΜνΑΙΛΆΡνςε ννΕΑ2ΤΝ№Ε ЗРАР1ЫШЗА ΕΏΚΗΝΕΟΙΝ3
ΗΙΛΐίνΝΚΆΙΟ ΙΜΕΒΝΤΤΙνΝ РИЕТАЫЛЕИ ΚΑ0ΕΕΝ<3ΙΥ3 ΑΟΥΕΝΡΥΥΏΏ
5ΤΥΑ3ΗΓΥϋΡ ΟΤΟΤΤΥΙΡΕΑ ΚΗΑΚΕΤΟΑΚΥ ΓΝΕΑΟΏΑΥΟΜ ОЕМООАРРУЬ оьзьнуъсоу нормнаазрт пьзурмсрнз куемгтоик шгагузозыз ΥΝΝΝΚΟΑΝΡΕ ϋΜΙΞΘΑΑνΑΑ ΚΟΕΥΡΘνΥΝΟ ТТКШГУКАА νΒΟΕΥΑΏΚΗΚ ΑΕνΤΡνΤΟΚϋ ЬМЕАОЮТАС ΥΙΗΙΜΡΟΤΥν ΝΚ (5Ε0 ΙΟ N0:176)
ИЗА ΕΏΚΗΝΕ0ΙΝ3
НЬИГЛТКАЮ ΧΜΗΚΝΤΤίνΝ РЫЕТАЗЬЫЕИ ΚΑϋΏΕΝαΐΥβ ΑΕΥΕΗΡΥΥΕΏ 3ΤΥΑ3ΗΡΥΠΡ ϋΤΟΤΤΥΙΡΡΑ ΚΗΆΚΕΤΟΑΚΥ ΡΝΙΑΟΟΑΥΟΝ ΟΌΜβΟΑΡΡΥί сьзг.нуьооу ыормнаазрт □ьзурморнз куеыртоик ннузузпзмз ΥΜΝΚΚΟΑΝΡΕ ϋΚΙΕΘΑΑνΑΑ ΚΟϋΥΡΟνΛΖΝΏ ТТЮТРУКАА УЗОЕУАПКИК ΑΕνΤΡνΤΟΚΕ ΕΜΕΑΟΚνΤΑΟ ΥΙΗΕΝΕΟΤΥν ΝΚ (ΕΕΓι ΙΟ N0:175)
АТеААААА<ЗАААеТАТТАвСАСТА<ЗСАВСТАТ0СТТвСТТТАЙСТ6С6С
САСТТСАААвТСТАЗТАТТТССАСАААСАААТААТАСТ0АААеТССТаС
АСССАТТТТААСАТССТСАССТСАССАТААССАТААТСАССССАТТААС
ТСТСАТТТСТССАТТаТАААТССТСЗСААТТСАСАТСАТаТСТССТААТА
СААСОАТТОТОААТСССААТОАААСТОСАТТАТТАААТСАОТСОССТСС
ТСАТТТАСААААТетТАТТТАТТСТОСТСАТТАССАОААТССТТАТТАТ
САТСАТАСТАСАТАТССТТСТСАСТТТТАТСАТССЗОАТАСТСЕААСАА
САТАТАТТССТТТТСССАААСАТССААААОАААСАОССССААААТАТТТ
ТААССТТССТССТСААССАТАССААААТСААСАТАТаСАаСААССАТТС
ТТСТАСТТАССАТТАТСаСТТСАТТАТТТАССАОАТСТЗААТСАСССАА
ТаСАТОСАОСАТСТТТТАСОСАТСТТТСТТАТССААТССатТТССАТТС
ΤΑΑΑΤΑΟΘΑΑΑΑΤΤΤΤΘΤΤΘΑΤΑΟΑΑΤΑΑΑΑΑΑΤΑΑΟΤΑΤΆΤΤΘΤΤΤΟΑ
САТАОСААТЙЗАТАТТеОААТТеСАААСОАОСТАААСССАСААЕАТТССА
ТТОААООАССАССССТАБСАЗСТАААСААБАТТАТССТЭЗСОТТСТОАА
С0АТАСОАСААААСАТТССТТТеТААААССАСССС!ТАТСТСААСААТАТ
ССАЙАТАААТеССОТОСССААСТААСАССССТЗАСАОСАААеСеТТТАА
ТСаААОСССАОСОССТТАСАССТеОТТАТАТТСАТТТеТОСТТТСАТАС
СТАТСТАААТСССТАА (ЗЕ(2 ГО N0:177) тозтсАестедсзаАТААесАТААТСАееасАГГААСтстсАтттатссА
ТТБТАААТСБТБСААТТОАСАТСАТОТСТСОТААТАСААССАТТОТБАА
ТССаААТОАААСТБСАТТАТТАААТБАСТСаССТССТСАТТТАБААААТ
СБТАТТТАТТСТССТСАТТАСОАБААТССТТАТТАТБАТСАТАБТАСАТ
АТБСТТСТСАСТТТТАТБАТССБСАТАСТОБААСААСАТАТАТТССТТТ
ТССБАААСАТОСААААОАААСАОБСССААААТАТТТТААССТТССТООТ
СААБСАТАССААААТСААБАТАТССАБСААБСАТТСТГСТАСТТАСБАТ
ТАТСССТТСАТТАТТТАСБАСАТСТСААТСАБССААТССАТОСАБСАТС
ТТТТАСССАТСТТТСТТАТССААТББСТТТССАТТСТАААТАСОААААТ
ТТТБТТБАТАСААТААААААТААСТАТАТТБТТТСАБАТАОСААТСБАТ
АТТБСААТТЕСАААаБАОСАААСССАОААбАТТСБАТТСААСБАОСАОС
ББТАССАБСТАААСААБАТТАТССТСССаТТБТСААСБАТАСвАСАААА ОАТТБОТТТСТААААССАБССБТАТСТСААОААТАТБСАаАТАААТССС СТБСБСААСТААСАСССеТСАСАССАААСССТТТААТБаААССОСАССБ ССТТАСАССТСОТТАТАТТСАТТТБТСЮТТТСАТАСеТАТСТАААТССС ТАА (ВЕС ГО N0:178)
Мутации, затрагивающие один остаток, получали, используя способы мутагенеза генов с насыщением сайтов (С88М), описанные выше, и анализировали в отношении фосфолипазной активности. В це
- 128 015591 лях скрининга использовали экспрессирующий вектор рА8К в хозяине Е. со11 Тор10. Наилучшие Ο88Μмутанты отбирали при первичном скрининге, для которого использовали эмульсию РА/И в качестве субстрата, и образцы анализировали с помощью ЖХ-МС. Такие первично отобранные лучшие мутанты затем подтверждали на соевом масле и анализировали в 31Р-ЯМР и ВЭЖХ.
Использовали следующий анализ соевого масла и следующий способ получения образцов для ЯМРанализа.
Детергент для ЯМР получали растворением 25 г дезоксихолевой кислоты, 5,84 г ЕЭТА, 5,45 г трисоснования в 900 мл воды, затем рН доводили до значения 10,5, используя таблетки К0Н. В качестве внутреннего стандарта ЯМР использовали 50 мМ ТГР и 12,5 мМ ТВР в изопропаноле, очищенном для ВЭЖХ. Оксид дейтерия (Ό, 99,9%) со слабыми парамагнитными свойствами получали из СатЬпйде кофре ЬаЬога!ог1ек Шс. (ΌΕΜ - 11-100). В качестве контроля ЯМР использовали лецитин Ауап!1 (эталонный стандарт масла из смешанных фосфолипидов сои, принятый международным обществом по исследованию лецитина и фосфолипидов), АуапЬ Ро1аг Ыр1йк Шс, № 95309.
Стандарты и образцы готовили следующим образом.
Тщательно перемешивали партию неочищенного соевого масла.
Переносили 1 мл масла в пробирку объемом 2 мл и добавляли 60 мкл очищенного фермента (для контроля, 18 единиц) или очищенного клеточного лизата (для скрининга мутантов) и перемешивали в течение 15 с. Единицы определяли по гидролизу 1 мкмоль РС в 1 мин при 37°С при рН 7,3.
Инкубировали при 60°С в течение 48 ч в термостатируемой мешалке, перемешивая со скоростью 14000 об./мин, периодически встряхивая.
После инкубации образцы тщательно перемешивали, используя вихревую мешалку.
Отвешивали по 250 мг (+/-0,2 мг) каждого образца в пробирку объемом 2 мл и отвешивали ЯМРконтроль: 10 мг (+/-0,1 мг) лецитина АуапЬ.
Добавляли 900 мкл детергента для ЯМР, затем добавляли 100 мкл Э20 к каждому образцу.
Образцы тщательно смешивали посредством интенсивного перемешивания и встряхивания в термомешалке Еррепйогй при 30-37°С и 14000 об./мин в течение 30 мин.
Центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10 мин.
Осторожно удаляли верхний масляный слой.
Добавляли 750 мкл гексана в каждый образец и осторожно встряхивали.
Центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10 мин.
Осторожно удаляли 600 мкл нижнего водного слоя и переносили в новую пробирку.
Добавляли 25 мкл внутреннего стандарта, тщательно перемешивали.
Переносили 500 мкл в 5-мм пробирку для ЯМР.
Высвобождение ЭАС измеряли с использованием количественной ВЭЖХ согласно следующему протоколу.
Раствор образца представлял собой ~50 мкл масляных образцов и 950 мкл смеси гексан/изопропанол (9:1) для получения 1 мл. Стандартные растворы представляли собой, например, 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мг/мл масла Епоуа'™. Масло Епоуа является маслом с высоким содержанием ЭАС, которое имеет распределение жирных кислот, сходное с обычным растительным маслом (1,3-ЭАС и 1,2-ЭАС).
Установочные параметры ВЭЖХ.
Колонка: СЬготедакрЬеге™ 8Ι-60, 15 смх4,6 мм
Температура: 40°С
Расход: 2 мл/мин
Объем инъекции: 20 мкл
Подвижная фаза А: гексан
Подвижная фаза В: гексан/изопропанол/этилацетат/муравьиная кислота = 800:100:100:1.
Градиентное элюирование:
Время (мин) 0 8 8,5 15 15,1 19
%В 2 35 98 98 2 2
Установка параметров ЕЬ8Э. В примере использовали следующие параметры: температура 40°С, приращение 5 и газ азот 3,5 бар (350000 Па). Пик ЭАС идентифицировали, сравнивая время удержания с временем удержания стандарта. Количественный анализ был основан на взаимосвязи между выходным сигналом детектора (область пика) и концентрацией аналита.
На основании данных ЯМР и ВЭЖХ отбирали мутации, показанные в табл. 5 ниже. В табл. 5 показана исходная аминокислота, номер положения аминокислотного изменения и использованная для замены аминокислота. В таблице также показан исходный кодон, кодон после замены и другие кодоны для замен, приводящих к такой же аминокислоте. Например, во второй строке, Е41А, показано, что аминокислота в положении 41 исходно представляла собой Е (глутаминовую кислоту), но была заменена на А (аланин). Исходный кодон в случае изменения Е41А представлял собой кодон САС, но был изменен до ССА. Однако также могут быть использованы кодоны ССС, ССС или ССТ. В табл. 5 ука
- 129 015591 заны варианты кодонов, которые дают варианты последовательности 8Е0 ГО N0: 176 с наилучшим изменением или улучшением по сравнению с диким типом (81:() ГО N0: 176) в отношении гидролиза РА. В настоящем изобретении предлагаются нуклеиновые кислоты и полипептиды, которые они кодируют, содержащие одно, несколько или все изменения или эквиваленты всех изменений, указанных в табл. 5.
На фиг. 35 приведены массовые доли отдельных видов фосфолипидов (РЬ) относительно суммарного количества РЬ, оставшегося после реакции, что отражает специфичность мутантов к конкретному виду. В данном случае анализировали следующие виды: фосфатидную кислоту (РА), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилинозитол (ΈΙ), фосфатидилхолин (РС). ТЕР относится к внутреннему стандарту ЯМР. Высвобождаемый ЬАС измеряли с помощью ВЭЖХ, и полученные данные отражают относительные значения для образцов по сравнению с контролями суммарно для 1,3-ЭАС и 1,2-ЭАС. Позитивный контроль представлял собой очищенный образец мутанта Е41А, ранее описанный в Тап е! а1., Вюсйеш1к(гу, 37: 4275-4279 (1998). Результаты показывают, что мутанты действительно высвобождают ЬАС и имеют хорошую активность по отношению к разным видам, включая фосфатидилхолин (РС) и фосфатидилэтаноламин (РЕ), сравнимую или более высокую, чем матрица (8Е() ГО N0: 176). Например, Ь100Ь и Э100М проявляет особую активность на РА. ()265К проявляет особую активность на РЬ Указанные мутации можно комбинировать, чтобы получить ферменты, обладающие требуемыми активностями на разных субстратах.
Таблица 5
Лучшие С88М-мутации
Лучшие варианты РЬС, полученные в ©88М Исходный кодон Изменен на Другие кодоны, кодирующие такое же изменение аминокислоты Исходная аминокислота Аминокислота после изменения Положение мутации кодона
Е41А ОАО ОСА СС©, ©СС. ССТ Е А 41
Е41» ОАО ТОО Е νν 41
Е41Р ОАО ТТС ТТТ Е Ρ 41
Ε41Υ ОАО ТАС ТАТ Е Υ 41
Е41Р ОАО СОТ ССС, ССА, С©0, АСА, АС© Е к 41
Е94Р ОАО СО© С©С, СОА, С©Т, АОА, АС© Е к 94
ОЮОЬ САТ ТТО СТС. ТТА. СТТ, СТА, СТ© ϋ ь 100
0100М ОАТ АТ© - ϋ Μ 100
ϋ100Υ ОАТ ТАТ ТАС ϋ Υ 100
ϋ100Ρ ОАТ ТТТ ТТС ϋ Ρ 100
0100» ОАТ ТС© - ϋ νν 100
А104Ь ОСТ СТТ СТС, ТТА, ТТС, СТА, СТ© Α ь 104
0111Р ОАТ АС© ССС, ССА, ССТ, АСА, ССС 0 к 111
Т112Р АСТ СО© ССС, СОА, СОТ, А©А, АС© Τ Ρ 112
Υ116» ТАТ т©© - Υ νν 116
1117» АТТ то© - I νν 117
Р118» ССТ тс© - Ρ νν 118
Е125К ΘΑΑ ААС ААА Ε к 125
8168Ν ТСТ ААС ААТ Ν 8 168
017Τν ОАТ ст© ©ТТ, СТС. ©ТА 0 V 171
0171Е ОАТ ©А© ©АА ϋ Ε 171
М176» АТО ТСС - Μ νν 176
Б230Н ОАТ САТ САС ϋ Η 230
Б230Р ОАТ ССТ СОС, ССА, ССО, АСА, АО© 0 к 230
0234» ОАТ ТСС - 0 νν 234
0234У ОАТ СТО ©ТТ, ©ТС, СТА 0 V 234
02340 ОАТ ССТ ©СС, 0©А, ©С© ϋ С 234
Ο234Ρ ОАТ СО© С©С, СОА, С©Т, А©А, А©© 0 Ρ 234
Ο234Κ ОАТ АА© ААА ϋ к 234
Ο265Ρ САО С©Т С©С, ССА, С©©, А©А, А©С 0 Ρ 265
Соответственно, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность 8Е() ГО N0: 177 или 8Е() ГО N0: 178, имеющую одну, две или более мутаций нуклеиновой кислоты, которые кодируют аминокислотные мутации, перечисленные выше, такие как изменения кодонов, описанные в данной публикации; такие нуклеиновые кислоты и полипептиды дополнительно предлагаются в описанных в данной публикации вариантах.
После скрининга лучших вариантов, полученных в результате С88М, и отбора самых лучших (смотри табл. 5) для их характеристики проводили анализы на чашках с яичным желтком, чтобы уменьшить количество одиночных С88М-мутантов, используемых для комбинирования с использованием методики вторичной сборки генов. В табл. 7 показаны данные анализа на яичном желтке (анализ на яичном желтке описан ниже), вместе с результатами анализов масла и определением термоустойчивости по остаточной активности. Фиг. 36 иллюстрирует лучшие одиночные мутанты С88М, которые были отобраны для проведения способа вторичной сборки генов. Вторичную сборку генов осуществляли, как описано ранее.
В табл. 6 ниже перечислены 288 примеров полипептидных последовательностей согласно изобретению, которые были созданы в результате комбинирования отобранных наилучших одиночных мутантов С88М с использованием методики вторичной сборки генов. Все они являются вариантами исходной аминокислотной последовательности 8Е() ГО N0: 176 (последовательности дикого типа или \Т).
С целью оказания помощи в прочтении табл. 6 ниже рассмотрен пример фосфолипазы согласно изобретению, охарактеризованной как измененная фосфолипаза 1 (вторая строка):
аминокислотный остаток дикого типа Е или глутаминовая кислота (д1и) в положении остатка 41 модифицирован до Υ, или остатка тирозина (!уг);
аминокислотный остаток дикого типа №' или аспарагин (акр) в положении остатка 100 модифицирован до М или остатка метионина (те!);
аминокислотный остаток дикого типа №' или аспарагин (акр) в положении остатка 168 модифицирован до 8 или остатка серина (кег);
- 130 015591 аминокислотный остаток дикого типа 'Ή или аспарагин (акр) в положении остатка 171 остается М и аминокислотный остаток дикого типа М или метионин (шеЦ в положении остатка 176 остается М.
Примечание: измененная фосфолипаза 172 (строка 173, жирным шрифтом) не является примером фосфолипазы согласно изобретению, она представляет собой исходную последовательность фосфолипазы 8Е0 ΙΌ N0: 2 (смотри пример 4).
Таблица 6
Библиотека фосфолипаз, полученная в результате комбинирования лучших одиночных С88М-мутаций в ходе вторичной сборки генов
Измененная фосфолипаза Е41 N100 N163 N171 Μ176
1 Υ Μ 3 Ν Μ
2 Е νν 3 Ε Μ
3 А Μ Ν Ε νν
4 Υ Ε 3 Ε Μ
5 Υ Υ 3 Ν Μ
6 К Ε Ν Ε Μ
7 Е Υ Ν Ε Μ
б Е Ε Ν Ν νν
9 А νν 3 Ε Μ
10 Υ Υ 8 Ν νν
11 Е ь 8 Ν νν
12 А Ε Ν Ν Μ
13 νν Μ Ν Ν Μ
14 νν Υ 8 Ε Μ
15 к I. Ν Ε νν
16 νν νν 8 Ε νν
17 νν Ν 8 Ν Μ
18 νν ί Ν Ε Μ
19 к Ν Ν Ε Μ
20 Ε Ν Ν Ν νν
21 Υ Ν 8 Ε Μ
22 Ε! Ν 5 Ν νν
23 Ε Υ 3 Ν νν
- 131 015591
24 Ρ ь Ν Ε νν
25 А Ν Ν Ε Μ
26 А νν Ν Ν Μ
27 νν Μ Ν Ε νν
23 Ρ ь δ Ε νν
29 Υ Ρ 8 Ν Μ
30 Ρ Ρ Ν Ν Μ
31 Ε νν Ν Ε Μ
32 Ε νν Ν Ν νν
33 Ε νν 3 Ε Μ
34 Ε Υ 3 Ν Μ
35 Ε Ν 3 Ν Μ
36 Ε Ё Ν Ε νν
37 Υ Μ Ν Ε Μ
38 Ρ Ν 8 Ν νν
39 VI Ν Ν Ε νν
40 Ε Μ 8 Ν Μ
41 Υ Ν 8 Ν Μ
42 Υ Υ Ν Ε Μ
43 Υ Ь Ν Ε Μ
44 Ρ Μ Ν Ν νν
45 Ρ Ν 8 Ε Μ
46 Ρ Μ 8 Ν νν
47 Ε Ρ 3 Ν νν
48 νν Υ Ν Ε νν
49 Ρ Ρ Ν Ε Μ
50 к Μ 3 Ν νν
51 Α Ν Ν Ε νν
52 К νν 8 Ν Μ
53 Ρ Ц 8 Ν Μ
54 Η νν Ν Ε Μ
55 Ρ νν Ν Ν Μ
56 Ε ί Ν Ν νν
57 Ε ί 3 Ε Μ
58 Α Υ 3 Ν νν
59 Ε Υ 3 Ν νν
60 VI Ν Ν Ε Μ
61 VI Ν Ν Ν νν
62 Α Ρ 3 Ν Μ
63 Υ Μ 8 Ε νν
64 Ρ! Ρ 8 Ν Μ
65 Α Μ Ν Ν Μ
66 Ρ Ν Ν Ε Μ
- 132 015591
67 Ε м Ν Ε Μ
68 Е Υ 3 Ε Μ
69 Е Е 8 Ε Μ
70 Е νν 3 Ν Μ
71 Е νν 3 Ν νν
72 Е νν Ν Ε νν
73 Υ ь Ν Ν νν
74 Υ Ν 3 Ν νν
75 А Υ 3 Ε νν
76 Е Ε 3 Ν Μ
77 νν Ь 3 Ν Μ
78 Υ Ν Ν Ε Μ
79 Е Ρ Ν Ε Μ
80 УУ Ν 3 Ε Μ
81 Е Μ 3 Ε Μ
82 УУ Ν 3 Ν νν
83 Е νν 3 Ν νν
84 Υ Μ Ν Ε νν
85 Е Υ Ν Ν νν
86 Р Μ Ν Ε νν
87 К I. 8 Ε νν
88 УУ Ρ 8 Ν Μ
89 Е I. 8 Ν Μ
90 Е ί Ν Ε Μ
91 Υ Ε Ν Ν νν
92 Υ ί 8 Ε Μ
93 А Ν 3 Ν νν
94 Е Ν Ν Ν νν
95 Е Μ 3 Ν νν
96 Я Ν Ν Ε νν
97 Е Μ Ν Ε νν
98 Е νν 8 Ε νν
99 УУ νν Ν Ν Μ
100 УУ Ν Ν Ν Μ
101 Е Ν 8 Ε νν
102 К νν 3 Ε νν
103 А νν 3 Ε νν
104 А Υ 8 Ε Μ
105 Е Υ 8 Ε νν
106 А Υ Ν Ν νν
107 К Ν 3 Ν Μ
108 Р Ρ Ν Ν νν
109 Υ Ν Ν Ε νν
- 133 015591
110 Ε νν 5 Ε νν
111 Ρ Ν 8 Ε Μ
112 Ε ί Ν Ν Μ
113 Ε Ν 8 Ν νν
114 Η νν 8 Ν νν
115 Ε νν Ν Ε Μ
116 Υ Υ Ν Ε νν
117 Ε Υ Ν Ν νν
113 νν Υ 8 Ν νν
119 Α Ν 8 Ν Μ
120 Α ί 8 Ν νν
121 Ε Υ Ν Ε νν
122 Ε Υ 8 Ε νν
123 νν Ν 8 Ε νν
124 Ε Μ Μ Ν Μ
125 Ε Ν Μ Ε Μ
126 Υ νν Ν Ε νν
127 Α νν Ν Ν νν
128 Υ Υ 8 Ε Μ
129 νν Υ Ν Ν νν
130 Ε Υ Ν Ε Μ
131 Α Ν 8 Ε Μ
132 Α 8 Ε νν
133 Ε Ε Μ Ε νν
134 Η Ν 8 Ε νν
135 Ε Ν 8 Ε νν
136 Ε νν Ν Ν Μ
137 Ε Ν Ν Ε νν
138 νν νν Ν Ε νν
139 Υ νν 5 Ν νν
140 νν Υ Ν Ε Μ
141 к Υ 8 Ν νν
142 Ε Υ 8 Ν Μ
143 Υ Ε 8 Ν νν
144 Ρ ί Ν Ε Μ
145 Ε Ν Ν Ε νν
146 Υ Ν 3 Ε νν
147 Ρ Ν Ν Ν Μ
148 Ε Υ Ν Ν Μ
149 Ρ νν 5 Ε Μ
150 Υ νν Ν Ν νν
151 Α νν 8 Ν νν
152 Ρ Υ ‘5 Ε Μ
- 134 015591
153 Ε Υ Ν Ε Μ
154 νν Υ 3 Ε νν
155 Α Υ Ν Ε νν
156 Υ Μ Ν Ν νν
157 Υ Ε Ν Ν Μ
158 Α Ν 3 Ε νν
159 Υ Ν Ν Ν Μ
160 Ε Ε Ν Ν Μ
161 Υ νν δ Ε Μ
162 Υ νν Ν Ε Μ
163 νν νν Ν Ν νν
164 Ε Υ Ν Ε νν
165 νν Υ 5 Ν Μ
166 Α Υ Ν Ε Μ
167 Ε Ε δ Ε νν
16В νν Б δ Ε Μ
169 Υ Υ δ Ε νν
170 Ε ί 3 Ε νν
171 Ε Ν Ν Ν Μ
172 Ε Ν Ν Ν Μ
173 νν νν δ Ε Μ
Δ νν Ν С Μ
175 κ Υ Ν Ν νν
176 Α Υ 6 Ν Μ
177 Κ Ύ δ Ν Μ
178 Ε Υ δ Ε νν
179 Β Μ Ν Ε νν
180 νν Ρ Ν Ε Μ
181 Ε Ε 5 Ε νν
182 Ε Μ 3 Ε νν
183 Α Ν Ν Ν Μ
184 Ε Ν 3 Ε Μ
185 Ε νν Ν Ν νν
186 Ε νν 3 Ν Μ
187 Κ Υ Ν Ε νν
188 Υ Υ Ν Ν νν
189 Ε Υ 3 Ε Μ
190 Ε Ν 3 Ν Μ
191 Κ Ε 3 Ε νν
192 Ε ί 3 Ν νν
193 νν Υ Ν Ν Μ
194 Α ί Ν Ν Μ
195 Ε ί Ν Ν Μ
- 135 015591
196 А Ε 5 Ε νν
197 νν Ε 3 Ε νν
198 А Ρ Ν Ε νν
199 К ί 3 Ν νν
200 νν Ь Ν Ε νν
201 Υ ь 3 Ν νν
202 Η Μ Ν Ε Μ
203 А Μ 3 Ε νν
204 Υ νν 3 Ν Μ
205 Η Υ Ν Ν Μ
206 Υ Μ Ν Ν Μ
207 νν Μ Ν Ν νν
208 Ε Ε 3 Ε Μ
209 Υ Ε 3 Ε νν
210 νν Ε 3 Ε Μ
211 νν ί 3 Ν νν
212 к ί Ν Ν νν
213 νν ί Ν Ν νν
214 νν Μ 3 Ν νν
215 νν Μ 8 Ε νν
216 к νν Ν Ε νν
217 Ρ ί Ν Ν Μ
218 Ρ Ρ Ν Ν Μ
219 Α Ν Ν Ν νν
220 Υ Ε Ν Ε Μ
221 νν Ε Ν Ν νν
222 Ρ Ρ 3 Ε Μ
223 Ε 1. 3 Ν Μ
224 Ε ί 3 Ε Μ
225 Α Μ 3 Ε Μ
226 Α Μ 3 Ν Μ
227 Ρ Μ 3 Ε Μ
228 Ρ νν Ν Ν νν
229 Α Υ Ν Ν Μ
230 Υ νν Ν Ν Μ
231 Ε Μ Ν Ν νν
232 Α Ε 3 Ε Μ
233 νν Ε Ν Ε νν
234 νν Ε 3 Ν νν
235 Α ί 8 Ε Μ
236 Υ ί Ν Ε νν
237 Ε Μ 3 Ε Μ
238 νν Μ 8 Ε Μ
- 136 015591
239 Р М δ Ε νν
240 Υ νν 3 Ε νν
241 νν Е Ν Ν Μ
242 νν Ь Ν Ν Μ
243 к м Ν Ν νν
244 к Е Ν Ν νν
245 А Р Ν Ν νν
246 Е Е Ν Ε νν
247 А Ь Ν Ε νν
248 Υ Ь 3 Ν Μ
249 Е м 5 Ν Μ
250 Υ м 3 Ε Μ
251 Е м Ν Ε Μ
252 Е νν Ν Ε νν
253 Υ ь Ν Ν Μ
254 К νν Ν Ν Μ
255 Υ N Ν Ν νν
256 к Е 3 Ν νν
257 А Е 3 Ν νν
258 А Р Ν Ε Μ
259 А Ь Ν Ν νν
260 А ь Ν Ε Μ
261 К м 3 Ε νν
262 VI м 3 Ν Μ
263 к м 3 Ν Μ
264 А νν 3 Ν Μ
265 К м Ν Ν Μ
266 Е Υ Ν Ν Μ
267 А м Ν Ν νν
268 Е Е 8 Ν Μ
269 Υ Е Ν Ε νν
270 Е ί Ν Ε Μ
271 Υ ь 3 Ε νν
272 Р 1. Ν Ν νν
273 Υ м 8 Ν νν
274 А м Ν Ε Μ
275 А νν Ν Ε νν
276 νν νν 3 Ν νν
277 Е Μ Ν Ν Μ
278 Υ Υ Ν Ν Μ
279 К Ν Ν Ν νν
280 Е Ε 3 Ν νν
281 К Ρ Ν Ε νν
282 Α ί 3 Ν Μ
283 νν ί 8 Ε νν
284 К ί ε Ε Μ
285 νν Μ Ν Ε Μ
286 Α Μ 8 Ν νν
287 νν νν Ν Ε Μ
288 νν νν 3 Ν Μ
В табл. 7 суммированы результаты анализов различных ферментативных активностей и свойства систем экспрессии типичных ферментов согласно изобретению (и в случае системы экспрессии Р1сЫа рах!опх - активности экспрессии нуклеиновых кислот, которые их кодируют), при этом все полипептиды согласно изобретению являются вариантами последовательности исходной последовательности фосфолипазы 8Е0 ΙΌ N0: 176 (кодируемой, например, последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0:177). С целью оказания помощи в прочтении табл. 7 рассмотрена для примера строка Е41А, указан- 137 015591 ная строка характеризует пример фермента согласно изобретению, имеющий последовательность 8Ε^ ГО N0: 176, в которой Е или глутаминовая кислота (д1и) в аминокислотном положении 41 заменена Л или аланином (а1а) и т.д.
Таблица 7
Анализ активности и суммарные данные
Анализ масла Экспрессия Рю1на Рае1оп$ Термоустойчивость в процентах остаточной активности
Лучшие Θ85Μмутанты РЮ Номер аминокислотного остатка лучшего О88М-мутанта Изменение аминокислоты вОЗЗМ Гидролиз РАв% через 24 часа Активность на чашках с яичным желтком Белок, экспрессированный в Е. соИ Белок, экспрессированный в РюЫа ра8(оп5
Неочищенное масло 0
Е41Е 41 Дикий тип 20 Активный 81% 100%
Е41А 41 А 29 Активный 83% 99%
Е41У/ 41 νν 31 Активный 94% Ν/Α
Е41Е 41 Р 68 Неактивный 80% Ν/Α
Ε41Υ 41 Υ 69 Неактивный 89% Ν/Α
Е41Р 41 к 66 Активный 78% 104%
Е94Р 94 к 23 Активный Не анализировали Ν/Α
ОЮОЬ 100 1 45 Активный Не анализировали 87%
ОЮОМ 100 м 48 Активный Не анализировали 104%
0100Υ 100 Υ 57 Активный Не анализировали 105%
ϋΐοορ 100 Р 59 Активный 43% 92%
οιοονν 100 \Л/ 61 Активный Не анализировали 91%
Α104ί 104 ь 26 Активный 115% 86%
0111К 111 к 27 Активный Не анализировали 99%
Т112Р 112 к 23 Активный 107% 92%
γιιβνν 116 νν 23 Активный 118% 102%
1117\Л/ 117 νν 15 Активный 109% 102%
ριιβνν 118 νν 17 Активный Не анализировали Ν/Α
Е125К 125 К 15 Активный 99% 86%
О171У 171 V 29 Активный Не анализировали 106%
О171Е 171 Ε 44 Активный Не анализировали 110%
Μ176νν 176 νν 42 Активный 101% 101%
0230Н 230 Η 21 Активный Не анализировали 97%
□230Р 230 к 14 Активный 107% 104%
Э234М 234 νν 10 Активный 101% 98%
О234У 234 V 0 Активный 109% 102%
02340 234 0 3 Активный 109% 114%
О234Р 234 к 27 Активный 114% 90%
О234К 234 к 23 Активный Не анализировали 101%
О265Р 265 к 0 Неактивный Не анализировали Ν/Α
Е41А ΝΝΝ 41, 100, 168, 171 Α, Ν, Ν, Ν 72 63%
Ε41ΑΝΚΝ 41,100,168, 171 Α, Ν, К, Ν 75 65%
Ε41ΑΝΡΝ 41,100,168, 171 Α, Ν, К, Ν 79 75%
Ε41Α Ν8Ν 41, 100, 168, 171 Α, Ν, ο, Ν 72 85%
Анализ яичного желтка.
Анализ яичного желтка осуществляли следующим образом.
Чашки с агаром, содержащим яичный желток, готовили добавлением 0,5 мас.% фосфатидилхолина яичного желтка в среде перед автоклавированием. Чашки были более однородными, если фосфатидилхолин диспергировали, используя мешалку с большими сдвиговыми усилиями, перед автоклавированием среды.
В агаре делали лунки и в лунки вносили равные объемы (например, по 2 мл) серийных разведений образцов, включая позитивный контроль.
Чашки оставляли на 3-12 ч при 37°С, за это время фермент диффундировал из лунок, гидролизовал лецитин яичного желтка и образовывал зоны преципитации вследствие образования диацилглицерина.
Область внутри кольца преципитации, измеренную в виде диаметра кольца, или среднее значение плотности (ГОУ) откладывали на графике против стандартной кривой для позитивного контроля, чтобы определить активность фосфолипазы в образце. Способ можно использовать для определения активности неизвестной РЬС в образце. Способ является полуколичественным.
Фосфатидилхолин (РС): из 81дта, номер в каталоге Р 5394.
РС из высушенного яичного желтка, тип Х-Е, примерно 60% РС по данным ТСХ.
Хотя изобретение описано подробно со ссылкой на некоторые его иллюстративные аспекты, будет понятно, что модификации и вариации входят в объем и не противоречат сути изобретения, которое описано и определено формулой изобретения.

Claims (27)

1. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты:
(a) кодирующую полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, и (ί) имеющую по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 177, и имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41^, Е41Е, Е41У, Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100ν, А104Ь, П111К, Т112К, Υ116ν, Ι117ν, Р118№, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, Μ176ν, П230Н, О230К, Ό234ν, Ό234ν, О234С, О234К, Э234К и/или Ρ265Κ или эквивалентные аминокислотные мутации либо любое их сочетание, (ίί) гибридизирующуюся в жестких условиях с комплементарной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 177, и имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих Е41А, Е41№, Е41Е, Е41^ Е41К, Е94К, Ό100Ε, Ό100Μ, Ό100Υ, Ό100Ε, Ό100ν, А104Ь, П111К, Т112К, Υ116ν, Ι117ν, Р118№, Е125К, 8168Ν, Ό171ν, П171Е, Μ176ν, П230Н, П230К, Ό234ν, Ό234ν, О234С, О234К, О234К или Р265К, или любую их комбинацию, при этом жесткие условия включают в себя стадию промывки, которая заключается в промывке в 0,2х 88С при температуре примерно 65°С в течение примерно 15 мин;
(b) последовательность по п.(а), кодирующую полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности или последовательности пробелка либо гомологичной промоторной последовательности;
(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по п.(а) или (Ь), кодирующую полипептид, обладающий фосфолипазной активностью и дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность, или нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по п.(а) или (Ь), которая содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность;
(й) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по п.(с), где гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или метку либо эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;
(е) нуклеиновую кислоту по любому из пп.(а)-(й), где нуклеотидные остатки в криптическом стартовом сайте транскрипции модифицированы, чтобы исключить образование большинства или всех укороченных транскриптов;
(й) нуклеиновую кислоту по п.(е), где модификации нуклеотидных остатков в криптическом стартовом сайте транскрипции включают в себя изменение в сайте связывания рибосомы (КВ8); или (д) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарную нуклеотидной последовательности по любому из пп.(а)-(й).
2. Вектор, кассета экспрессии или носитель для клонирования, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1 и представляющий собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг, искусственную хромосому, аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса или бактериальную искусственную хромосому (ВАС), вектор, полученный из бактериофага Р1 (РАС), дрожжевую искусственную хромосому (УАС) или искусственную хромосому млекопитающих ^АС).
3. Клетка-хозяин или трансформированная клетка, включающая последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1 или вектор, кассету экспрессии или носитель для клонирования по п.2, при этом клетка представляет собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку насекомого или растительную клетку.
4. Трансгенное животное, отличное от человека, включающее последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1; вектор, кассету экспрессии или носитель для клонирования по п.2 или клетку-хозяина или трансформированную клетку по п.3; при этом животное представляет собой мышь, крысу, козу, кролика, овцу, свинью или корову.
5. Трансгенное растение или семя, включающее последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1; вектор, кассету экспрессии или носитель для клонирования по п.2 или клеткухозяина или трансформированную клетку по п.3; при этом растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, травянистое растение, хлопок, пальму, растение кунжута, растение арахиса, растение подсолнечника или растение табака или семя представляет собой кукурузное зерно, пшеничное зерно, семя масличного растения, семя рапса, соевое семя, косточку пальмы, семя подсолнечника, кунжутное семя, семя риса, ячменя, арахиса, хлопка, пальмы или семя растения табака.
6. Изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающий:
(а) аминокислотную последовательность (ί), имеющую по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,
- 139 015591
87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высокую или 100% идентичность последовательности с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 176 и имеющую по меньшей мере одну мутацию Ξ41Α, Е41\, Е41Р, Е4Ш, Е41К, Е94К, Ό100Ε, О100М, Ό100Υ, О100Р, Ό100\, Α104Ε, Ό111Κ, Т112К, Υ116\, Ι117\, Р118\, Е125К, 8168^ Ό171ν, О171Е, М176\, О230Н, Ό230Κ, Ό234\, Ό234ν, Ό2346, Ό234Κ, Э234К или Ц265К или эквивалентные аминокислотные мутации или любую их комбинацию, при этом идентичность последовательностей определяют необязательно в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра; или (ίί) кодируемую нуклеиновой кислотой (полинуклеотидом) по п.1;
(b) полипептид по п.(а), в котором отсутствует сигнальная последовательность или последовательность пробелка;
(c) полипептид по п.(а) или (Ь), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность;
(б) полипептид по п.(с), в котором гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из гетерологичной (лидерной) сигнальной последовательности или метки либо эпитопа;
(е) полипептид по любому из пп.(а)-(б), где (ί) полипептид гликозилирован или полипептид содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, (ίί) полипептид по п.(1), где гликозилирование представляет собой ^связанное гликозилирование или 0-связанное гликозилирование; (ш) полипептид по п.(1) или (ίί), где полипептид гликозилирован после экспрессии в дрожжевой клетке; или (ίν) полипептид по п.(ш), где дрожжевой клеткой является клетка Р.ракШпк или 8.ротЬе; или (Г) полипептид по любому из пп.(а)-(е), где (ί) полипептид дополнительно содержит дополнительные аминокислотные остатки между сигнальной последовательностью (лидерной последовательностью или лидерным пептидом) и ферментом, или (ίί) полипептид по п.(1), где дополнительные аминокислотные остатки включают в себя 61ι.ι-Α1η.
7. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий в себя:
(Α) (а) получение нуклеиновой кислоты, оперативно связанной с промотором, при этом нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1; и (Ь) экспрессию нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии полипептида, получая таким образом рекомбинантный полипептид; или (В) способ по п.^), дополнительно включающий трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а), получая таким образом рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке.
8. Способ создания варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, включающий в себя:
(Α) (а) получение матричной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1;
(b) модификацию, делетирование или добавление одного или нескольких нуклеотидов в последовательность матрицы или сочетание указанных изменений с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты;
(c) экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с образованием варианта полипептида фосфолипазы или (В) многократное повторение стадий (а)-(с), пока не будет получена фосфолипаза (вариант фосфолипазы), имеющая измененную или другую активность (вариант активности) или измененную или другую стабильность (вариант стабильности) по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, или пока не будет получена измененная или другая вторичная структура (вариант) по сравнению со вторичной структурой полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой, или пока не будет получена измененная или другая посттрансляционная модификация (вариант) по сравнению с посттрансляционной модификацией полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой; или пока не будет получен вариант фосфолипазного полипептида, который имеет повышенное гликозилирование по сравнению с фосфолипазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой; или пока не будет получен вариант фосфолипазного полипептида, который имеет повышенный уровень экспрессии по сравнению с фосфолипазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой.
9. Способ модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазный полипептид, где способ включает:
(a) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1; и (b) идентификацию кодона в нуклеиновой кислоте со стадии (а) и его замену другим кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, что и замененный кодон, что приводит, таким образом, к модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу.
10. Способ гидролиза, расщепления или разрушения содержащей фосфолипиды композиции, включающий:
(Α) (а) получение фосфолипазного полипептида по п.6 или фосфолипазного полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1; и
- 140 015591 (Ь) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с композицией, содержащей фосфолипид, в условиях, при которых фосфолипаза гидролизует, расщепляет или разрушает содержащую фосфолипид композицию;
(B) способ по п.(А), где композиция включает фосфолипидсодержащий липидный бислой или мембрану; или (C) способ по любому из пп.(А) или (В), где композиция включает растительную клетку, бактериальную клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого или клетку животного.
11. Композиция или продукт, (а) содержащие полипептид по п.6 или полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) по п.1, (Ь) композиция по п.(а), где композиция представляет собой фармацевтическое средство, детергент, биомассу, биотопливо, основанный на нефти продукт, сухой экстракт барды (008), сухую гранулированную барду (ϋϋ8), конденсированный экстракт барды (СО8), влажную гранулированную барду (Ό\νθ) или сухую гранулированную барду с растворимыми компонентами (ООС8).
12. Способ дегуммирования масла или жира, включающий:
(A) (а) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) по п.1; и (Ь) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с композицией, содержащей масло или жир;
(B) способ по п.(А), где полипептид связывают с фильтром и жир или масло пропускают через фильтр; или (Ь) полипептид добавляют к раствору, содержащему жир или масло, и затем раствор пропускают через фильтр;
(C) способ по п.(А) или (В), где полипептид увеличивает количество нейтральных масел в обрабатываемой композиции, включающей жир или масло; или (Ь) продукцию диацилглицерина (ОАС) в составе масляной фазы, увеличивая количество диацилглицерина (ОАС) в обрабатываемой композиции, включающей жир или масло, или где конечный продукт дегуммирования масла или жира обогащен 1,3ОАС, или где конечный продукт дегуммирования масла или жира содержит не менее 1,0% 1,3-ОАС;
(О) способ по любому из пп.(А)-(С), дополнительно включающий добавление одного или нескольких полипептидов, обладающих активностью протеазы, амилазы, липазы, кутиназы, другой фосфолипазы, карбогидразы, целлюлазы, пектиназы, маннаназы, арабиназы, галактаназы, ксиланазы, оксидазы, например лактазы и/или пероксидазы, или полипептидов с эквивалентной активностью либо их комбинации, для того чтобы дополнительно разрушить массу смолы и увеличить выходы масла; или (Е) способ по любому из пп.(А)-(О), дополнительно включающий физическое удаление смолы, образуемой в случае применения способа дегуммирования путем добавления отверждающего вещества; где отверждающее вещество необязательно представляет собой или содержит тальк.
13. Способ превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающий:
(a) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) по п.1; и (b) , (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) и композиции, содержащей негидратируемый фосфолипид, в условиях, в которых полипептид превращает негидратируемый фосфолипид в гидратируемую форму.
14. Способ очистки фитостерина или тритерпена, включающий:
(A) (а) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) по п.1;
(Ь) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с композицией, содержащей фитостерин или тритерпен в условиях, в которых полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции;
(B) способ по п.(А), где фитостерин или тритерпен содержат растительный стерин;
(C) способ по п.(А) или (В), дополнительно включающий использование неполярных растворителей для количественного экстрагирования свободных фитостеринов и сложных эфиров фитостеринов и жирных кислот; или (О) способ по п.(В), где фитостерин или тритерпен включают β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин или брассикастерин.
15. Способ рафинирования масла или жира, включающий:
(A) (а) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) по п.1; и (Ь), (с) осуществление контакта полипептида со стадии (а) с композицией, содержащей масло или жир;
(B) способ по п.(А), где рафинирование представляет собой физическое рафинирование;
(C) способ по п.(А), где рафинирование представляет собой каустическое рафинирование;
(О) способ по любому из пп.(А)-(С), включающий добавление кислоты, щелочи, эмульгатора или разрушителя эмульсии;
- 141 015591 (Е) способ по любому из пп.(А)-(О), где полипептид добавляют (а) во время каустического рафинирования и варьирование уровней добавляемых кислоты и щелочи зависит от уровня фосфора и уровня свободных жирных кислот; (Ь) после каустического рафинирования в смеситель с интенсивным перемешиванием или в смеситель для непрерывного смешивания жидких потоков перед разделением; после стадии нагревания; в центрифугу, в соапсток; в промывную воду или на стадиях обесцвечивания или дезодорации; (с) во время дробления семян или других частей растения, или полипептид добавляют после дробления или перед рафинированием; или (Р) способ по любому из пп.(А)-(Е), где полипептид находится в водном растворе, который добавляют к композиции, где уровень воды необязательно составляет от приблизительно 0,5 до 5%;
(С) способ по любому из пп.(А)-(Р), включающий дополнительный нагрев или охлаждение для промотирования разделения водной фазы; или (Η) способ по любому из пп.(А)-(С), включающий дегумирование до стадии контактирования, чтобы собрать лецитин центрифугированием, с последующим добавлением РЬС, РЬС и/или РЬА для удаления негидратируемого фосфолипида.
16. Способ деацилирования 2'- или 3'-цепи жирной кислоты из липида А, включающий контактирование липида А с полипептидом по п.6 или с полипептидом, кодируемым последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1.
17. Способ уменьшения массы смолы и увеличения выхода нейтрального масла (триглицерида) за счет уменьшения удержания масла, включающий в себя:
(A) (а) получение композиции, содержащей фосфолипазный полипептид по п.9 или полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) по п.1;
(Ь) контактирование полипептида со стадии (а) и композиции, содержащей фосфолипидный жир или масло в условиях, в которых полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции, в течение времени, достаточного для снижения массы смолы и увеличения количества нейтральных масел;
(B) способ по п.(А), включающий смешивание композиции с полипептидом со стадии (а) с высоким усилием сдвига с последующим смешиванием без или с низким усилием сдвига для обеспечения достаточного контактирования фосфолипида с полипептидом.
18. Способ получения последовательности, кодирующей вариант фосфолипазы, которая кодирует:
(a) фосфолипазу, обладающую пониженной резистентностью к протеазе, включающий модификацию аминокислоты, эквивалентной аминокислоте в положении 131 последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 176 или нуклеиновой кислоты по п.1, на один, несколько или всех следующих остатков: лизина (К); серина (8); глицина (С); аргинина (8); глутамина (О); аланина (А); изолейцина (Ι); гистидина (Н); фенилаланина (Г); треонина (Т); метионина (М), лейцина (Ь); или (b) фосфолипазу, обладающую пониженной резистентностью к протеазе, включающий модификацию аминокислоты, эквивалентной аминокислоте в положении 131 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 176 или нуклеиновой кислоты по п.1, на один, несколько или всех следующих остатков: триптофана (ν); глутамата (Е); тирозина (Υ).
19. Способ получения биотоплива, включающий:
(A) (а) получение полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) по п.1; и (Ь), (с) контактирование полипептида по п.(а) с биомассой;
(B) способ по п.(А), где биотопливо представляет собой или содержит биодизельное топливо;
(C) способ по п.(А) или (В), где биомасса содержит водоросли, растительное масло, натуральное растительное масло, растительное масло первого отжима, отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, сало, лярд или желтый жир.
20. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающая нуклеиновую кислоту с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 177 и имеющая мутации, кодирующие:
a) Е41У, №00М, Э171Е и Μ176V или эквивалентные аминокислотные мутации;
b) Е4№, N100Р, Э171Е и Μ176V или эквивалентные аминокислотные мутации или
c) Е4№ МЮЕ Э171Е и Μ176V или эквивалентные аминокислотные мутации.
21. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.20, дополнительно включающая мутацию, кодирующую 8168№ или эквивалентную аминокислотную мутацию.
22. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающая нуклеиновую кислоту с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 177 и имеющая мутации, кодирующие:
a) Е41Р, №00М и Μ176V или эквивалентные аминокислотные мутации;
b) Е41Р, N100Р и Μ176V или эквивалентные аминокислотные мутации или
c) Е41Р, N10(8 и Μ176V или эквивалентные аминокислотные мутации.
- 142 015591
23. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.22, дополнительно включающая мутацию, кодирующую 8168Ν и/или Ό171Ν, или эквивалентные аминокислотные мутации.
24. Изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающий аминокислотную последовательностью 8ЕЦ ΙΌ NО: 176 и имеющий следующие мутации:
a) Е41У, №00М, И171Е и М176^ или эквивалентные аминокислотные мутации;
b) Е41У, Ν100Ε, И171Е и М176^ или эквивалентные аминокислотные мутации или
c) Е41У, Ν100Ε, И171Е и М176^ или эквивалентные аминокислотные мутации.
25. Изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид по п.24, дополнительно включающий мутацию, кодирующую 8168Ν, или эквивалентную аминокислотную мутацию.
26. Изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающий аминокислотную последовательностью 8ЕЦ ΙΌ NО: 176 и имеющий следующие мутации:
a) Е41Е, Ю00М и М176^, или эквивалентные аминокислотные мутации;
b) Е41Е, Ν100Ε и М176^, или эквивалентные аминокислотные мутации; или
c) Е41Е, Ν100Ε и М176^, или эквивалентные аминокислотные мутации.
27. Изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид п.26, дополнительно включающий мутацию 8168Ν и/или Ό171Ν или эквивалентные аминокислотные мутации.
EA200970308A 2006-09-21 2007-09-21 Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения EA015591B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82651206P 2006-09-21 2006-09-21
PCT/US2007/079109 WO2008036863A2 (en) 2006-09-21 2007-09-21 Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970308A1 EA200970308A1 (ru) 2009-10-30
EA015591B1 true EA015591B1 (ru) 2011-10-31

Family

ID=39201292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970308A EA015591B1 (ru) 2006-09-21 2007-09-21 Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8637290B2 (ru)
EP (1) EP2057274B1 (ru)
KR (1) KR20090068266A (ru)
CN (1) CN101558154B (ru)
AR (1) AR062947A1 (ru)
BR (1) BRPI0716872A2 (ru)
CA (1) CA2663001A1 (ru)
EA (1) EA015591B1 (ru)
ES (1) ES2451266T3 (ru)
MX (1) MX2009003034A (ru)
PL (1) PL2057274T3 (ru)
PT (1) PT2057274E (ru)
WO (1) WO2008036863A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014140924A3 (en) * 2013-03-12 2015-02-19 International Park Of Creativity Biological devices and methods for increasing the production of lycopene from plants
RU2680690C2 (ru) * 2014-02-21 2019-02-25 Клариант Продукте (Дойчланд) Гмбх Композиция для ферментативного дегуммирования масла

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1387616T3 (da) 2001-05-18 2007-09-24 Danisco Fremgangsmåde til fremstilling af en dej med et enzym
US20080070291A1 (en) 2004-06-16 2008-03-20 David Lam Compositions and Methods for Enzymatic Decolorization of Chlorophyll
JP5604032B2 (ja) 2004-07-16 2014-10-08 デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス 食用油の酵素的脱ガム方法
WO2009081094A2 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Danisco A/S Process
EP2246440A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-03 Aterovax Enzymatic assay for the quantitative determination of phospholipase a1 or a2 activity in a sample
UA111708C2 (uk) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. Спосіб рафінування олії
UA109884C2 (uk) * 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
CN103429747A (zh) 2011-01-21 2013-12-04 诺维信公司 产生脂肪酸烃基酯
US20130014431A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Phillips 66 Company Advanced, biomass-derived, low-sulfur bunker fuels
KR101336785B1 (ko) * 2011-11-18 2013-12-04 한국생명공학연구원 갯벌 메타게놈 유래 신규 유전자 및 이로부터 얻어지는 포스포리파제 및 리파제 동시 활성을 보이는 신규 단백질
BR112014020280A8 (pt) 2012-02-17 2017-07-11 Clariant Produkte Deutschland Gmbh Método para o desengomamento enzimático e método de desengomamento de triglicerídeos
GB201208105D0 (en) * 2012-05-09 2012-06-20 Univ Dundee Modified plants
US10006041B2 (en) 2012-08-16 2018-06-26 Vib Vzw Means and methods for altering the lignin pathway in plants
RU2517538C1 (ru) * 2012-11-22 2014-05-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Фосфолипидный флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2 в сыворотке крови
RU2015126866A (ru) * 2012-12-11 2017-01-19 Новозимс А/С Полипептиды, обладающие активностью фосфолипазы с, и полинуклеотиды, кодирующие их
WO2014100649A1 (en) * 2012-12-20 2014-06-26 Cargill, Incorporated Enzymatically-degummed oil and uses thereof
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
NZ756750A (en) 2013-09-13 2022-05-27 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
PL3044323T3 (pl) 2013-09-13 2022-06-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposoby wykrywania i ilościowego oznaczania białka komórki gospodarza w liniach komórkowych
CN104560910B (zh) * 2013-10-16 2021-03-26 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 提高毕赤酵母发酵产磷脂酶c产量的培养基及方法
CN104630175B (zh) * 2013-11-14 2019-10-25 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 一种磷脂酶c
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
EP3122874A4 (en) * 2014-03-27 2017-08-16 Novozymes A/S Polypeptides having phospholipase c activity and polynucleotides encoding same
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
CA2980261A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Dsm Ip Assets B.V. Use of phospholipase c
CN113913475A (zh) 2015-10-09 2022-01-11 诺维信公司 酶或非酶生物柴油精制方法
JP2019505223A (ja) 2016-02-19 2019-02-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ ベーキングリパーゼ
CN105567713B (zh) * 2016-03-09 2019-01-08 河北省农林科学院粮油作物研究所 花生AhPLDα3蛋白及其编码基因与应用
CN110129298B (zh) * 2016-06-02 2021-08-03 天津科技大学 一种磷脂酶d突变体及其应用
EP3472335A1 (en) 2016-06-16 2019-04-24 Novozymes A/S Reduction of phospholipids in phospholipid-containing oil material
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
WO2018171552A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Novozymes A/S Method for degumming and refining of vegetable oil
MX2019013532A (es) 2017-05-12 2020-08-03 Basf Se Metodo para usar enzimas lipasas para limpieza.
EP3701019A2 (en) 2017-10-25 2020-09-02 Basf Se Beta-amylase enzymes
CN109321546B (zh) * 2017-12-12 2021-08-31 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 磷脂酶c及其编码基因
US10258917B1 (en) 2018-02-09 2019-04-16 Tenneco Automotive Operating Company Inc. System for removing water and particulates from engine exhaust
CN108359654B (zh) * 2018-03-02 2021-11-05 江苏中酶生物科技有限公司 一种具有磷脂酶b活性的多肽或蛋白质及其应用
EP3776557A4 (en) * 2018-04-13 2021-12-15 The Hong Kong Polytechnic University DATA STORAGE USING PEPTIDES
US11732250B2 (en) 2018-04-26 2023-08-22 Basf Se Lipase enzymes
US20210115422A1 (en) 2018-05-03 2021-04-22 Basf Se Amylase enzymes
CN109134645A (zh) * 2018-09-12 2019-01-04 深圳市菲鹏生物制药股份有限公司 一种细胞浓缩补料培养工艺
CN111378634B (zh) * 2018-12-28 2024-04-02 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 具有磷脂酶c活性的多肽及其用途
CN111051505B (zh) * 2018-12-29 2023-11-03 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种磷脂酶d突变体、其应用及其制备磷酯酰丝氨酸的方法
MX2021010109A (es) 2019-02-20 2021-09-21 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de un medio definido y una alimentacion de oligoelementos.
WO2020169563A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
US20220186200A1 (en) 2019-03-11 2022-06-16 Basf Se Amylases and methods for making and using them
EP3947665A2 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Basf Se Amylase enzymes
EP3947664A2 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Basf Se Amylase enzymes
WO2020193532A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Cleaning composition having amylase enzymes
CN113993878A (zh) 2019-06-13 2022-01-28 巴斯夫欧洲公司 用二价阳离子从发酵液中回收蛋白的方法
MX2022000253A (es) 2019-07-05 2022-02-03 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para celulas microbianas mediante el uso de un precultivo de alimentacion por lotes.
JP2022545465A (ja) 2019-08-22 2022-10-27 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア アミラーゼバリアント
CN111004787B (zh) * 2020-01-06 2022-05-10 江南大学 一种链霉菌磷脂酶d突变体、改造方法及其应用
CA3189121A1 (en) * 2020-08-06 2022-02-10 Poet Research, Inc. Endogenous lipase for metal reduction in distillers corn oil
CN112452277A (zh) * 2020-11-16 2021-03-09 西南石油大学 一种记忆效应影响下水合物生成实验装置
BR112023022967A2 (pt) 2021-05-04 2024-01-23 Novozymes As Tratamento enzimático de matéria-prima para produção de óleo vegetal hidrotratado (hvo)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2182163C2 (ru) * 1995-06-07 2002-05-10 Уильям К. Орр Состав топлива
WO2005086900A2 (en) * 2004-03-08 2005-09-22 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Family Cites Families (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE318048B (ru) 1959-09-21 1969-12-01 Pellerin Ab Zenith
GB1541017A (en) 1975-03-10 1979-02-21 Unilever Ltd Degumming process for triglyceride oils
SE417441B (sv) 1977-08-19 1981-03-16 Kare Larsson Forfarande for att isolera polera lipider ur en blandning av polera och opolera cerealiclipider genom blandning med vatten och derpa foljande tyngdkraftsseparation
US4240972A (en) 1978-12-19 1980-12-23 Canada Packers Limited Continuous process for contacting of triglyceride oils with _an acid
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
WO1981000857A1 (en) 1979-09-28 1981-04-02 Vsesoyuzny Ni Biotek Inst Method of production of ethyl alcohol from starch raw material
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4707364A (en) 1984-01-27 1987-11-17 Miles Laboratories, Inc. Composition for accelerating cheese aging
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3546806C2 (ru) 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US4752483A (en) 1986-05-30 1988-06-21 Campbell Soup Company Method for producing a highly flavored cheese ingredient
US5030240A (en) 1986-06-09 1991-07-09 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5288619A (en) 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
EP0528881A4 (en) 1990-04-24 1993-05-26 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
US5326477A (en) 1990-05-07 1994-07-05 Bio-Sep, Inc. Process for digesting solid waste
DE69133372T2 (de) 1990-06-15 2005-02-24 Scios Inc., Sunnyvale Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt
CA2096843C (en) 1990-11-23 2007-08-07 Kathleen D'halluin Process for transforming monocotyledonous plants
EP0563296B1 (en) 1990-12-20 1999-03-17 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JP2626380B2 (ja) 1991-11-12 1997-07-02 株式会社大林組 クレーン用吊治具の旋回防止装置
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
JP2937746B2 (ja) 1993-04-25 1999-08-23 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
JPH06306386A (ja) 1993-04-25 1994-11-01 Showa Sangyo Co Ltd 油脂の精製方法
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
CA2184687A1 (en) 1994-03-09 1995-09-14 Pedro Antonio Prieto Humanized milk
JPH09509848A (ja) 1994-03-09 1997-10-07 アボツト・ラボラトリーズ オリゴ糖及び複合糖質を産生するトランスジェニック動物
ES2250969T3 (es) 1994-03-29 2006-04-16 Novozymes A/S Amilasa alcalina de bacilo.
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
US6211428B1 (en) 1994-09-01 2001-04-03 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse expressing a familial form of human amyloid precursor protein
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
WO1996039154A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
AP9801185A0 (en) 1995-06-07 1998-01-31 William C Orr Vapor phase combustion method and compositions II.
CA2225475A1 (en) 1995-06-27 1997-01-16 Unilever Plc Immobilized enzyme and its use for the processing of triglyceride oils
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
SE504664C2 (sv) 1995-09-22 1997-03-24 Scotia Lipidteknik Ab Sätt att framställa fraktionerad olja, oljan, dess användning samt emulsionskomposition innehållande oljan
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
US6197070B1 (en) 1996-05-15 2001-03-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping
WO1997046313A1 (en) 1996-06-07 1997-12-11 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
US6326341B1 (en) 1996-09-11 2001-12-04 The Procter & Gamble Company Low foaming automatic dishwashing compositions
US6127137A (en) 1996-10-31 2000-10-03 Novo Nordisk A/S Acidic phospholipase, production and methods using thereof
CN1235636A (zh) 1996-10-31 1999-11-17 诺沃挪第克公司 新型磷脂酶,及其生产和应用
AR010340A1 (es) 1996-12-09 2000-06-07 Novozymes As COMPOSICIoN PARA HORNEADO, USO DE DICHA COMPOSICIoN Y USO DEL POLIPÉPTIDO DE DICHA COMPOSICIoN.
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
HUP0000486A3 (en) 1996-12-19 2001-10-29 Unilever Nv Immobilized enzyme and its use for the processing of triglyceride oils
US6069122A (en) 1997-06-16 2000-05-30 The Procter & Gamble Company Dishwashing detergent compositions containing organic diamines for improved grease cleaning, sudsing, low temperature stability and dissolution
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
EP1007732B1 (en) 1997-01-17 2006-07-26 Maxygen, Inc. EVOLUTION OF procaryotic WHOLE CELLS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION
DE19703364A1 (de) 1997-01-30 1998-08-06 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel
US5880300A (en) 1997-01-31 1999-03-09 Cargill, Incorporated Phospholipid-based removal of sterols from fats and oils
US6303803B1 (en) 1997-01-31 2001-10-16 Cargill, Incorporated Removal of sterols from fats and oils
KR20000076363A (ko) 1997-03-18 2000-12-26 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 Ｄｎａ 라이브러리를 제조하기 위한 시험관내 방법
JP4263248B2 (ja) 1997-03-18 2009-05-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ Ｄｎａのシャッフリングによるライブラリーの作成方法
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
CN1273609A (zh) 1997-08-15 2000-11-15 希斯克有限公司 检测或量化核酸物类的方法和组合物
ES2225407T3 (es) 1997-09-11 2005-03-16 Bioventures, Inc. Metodo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad.
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
AU9737398A (en) 1997-10-30 1999-05-24 Novo Nordisk A/S Alpha-amylase mutants
EP1030861A4 (en) 1997-10-31 2001-09-05 Maxygen Inc MODIFICATION OF VIRAL TROPISM AND THE DIVERSITY OF HOST SPECIES BY RECOMBINATION OF THE VIRAL GENOME
BR9813201A (pt) 1997-11-10 2000-08-29 Procter & Gamble Processo para preparação de um tablete detergente
US6118044A (en) 1997-11-14 2000-09-12 Sankyo Company, Limited Transgenic animal allergy models and methods for their use
DK1036198T3 (da) 1997-12-08 2013-01-02 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999041383A1 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
AU2674199A (en) 1998-02-11 1999-08-30 Maxygen, Inc. Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines
CA2323638A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
WO1999057360A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Novo Nordisk A/S Enhancers such as n-hydroxyacetanilide
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
DE19824705A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Henkel Kgaa Amylase und Protease enthaltende Wasch- und Reinigungsmittel
US6022567A (en) 1998-06-23 2000-02-08 Nestec S.A. Flavor enhancer
CA2331926C (en) 1998-06-29 2013-09-10 Phylos, Inc. Methods for generating highly diverse libraries
JP4335995B2 (ja) 1998-07-22 2009-09-30 昭 神谷 環境保全型粒状洗浄用組成物
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
US6183962B1 (en) 1998-09-09 2001-02-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Protein kinase molecules and uses therefor
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6172248B1 (en) 1998-11-20 2001-01-09 Ip Holdings, L.L.C. Methods for refining vegetable oils and byproducts thereof
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
FR2788782B1 (fr) 1999-01-25 2003-01-31 Gie Agro Ind Produit multienzymatique a activites glucoamylasique, proteolytique et xylanasique et procede pour sa production par fermentation a l'etat solide de son de ble avec aspergillus niger
CA2367955C (en) 1999-03-15 2009-05-19 University Of British Columbia Abc1 polypeptide and methods and reagents for modulating cholesterol levels
ATE289482T1 (de) 1999-03-16 2005-03-15 Novozymes As Verfahren zur herstellung von käse
US6399121B1 (en) 1999-03-16 2002-06-04 Novozymes A/S Process for producing cheese
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
US6309871B1 (en) 1999-03-31 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline α-amylase activity
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
US20030190651A1 (en) 2000-07-31 2003-10-09 Sophia Kossida Regulation of human phosphatidylinositol-specific phospholipase c-like enzyme
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
EP1332153A4 (en) 2000-10-12 2006-01-11 Exelixis Inc HUMAN ECT2 AND METHOD OF USE THEREOF
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
US6660491B2 (en) 2000-11-24 2003-12-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. Process for producing dietary sterol fatty acid esters
EP1478237A1 (en) 2002-02-20 2004-11-24 Novozymes A/S Process for producing cheese
CN102174546A (zh) 2002-04-19 2011-09-07 维莱尼姆公司 磷脂酶，编码磷脂酶的核酸以及制备和应用磷脂酶的方法
CA3007908A1 (en) * 2003-03-07 2005-04-14 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20060014260A1 (en) 2004-05-07 2006-01-19 Zhiliang Fan Lower cellulase requirements for biomass cellulose hydrolysis and fermentation
CA2601472A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Verenium Corporation Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for improving paper strength
AU2014284148B2 (en) 2013-06-21 2017-02-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic system with fluid pickups

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2182163C2 (ru) * 1995-06-07 2002-05-10 Уильям К. Орр Состав топлива
WO2005086900A2 (en) * 2004-03-08 2005-09-22 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YP 00164384.1, Submitted 24.09.2004, Naydeno iz Internet:<URL:http://www.ncbi.nlm. nih.gov./, [naydeno 24.08.2009] *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014140924A3 (en) * 2013-03-12 2015-02-19 International Park Of Creativity Biological devices and methods for increasing the production of lycopene from plants
RU2680690C2 (ru) * 2014-02-21 2019-02-25 Клариант Продукте (Дойчланд) Гмбх Композиция для ферментативного дегуммирования масла

Also Published As

Publication number Publication date
US20110093965A1 (en) 2011-04-21
MX2009003034A (es) 2009-11-18
CN101558154B (zh) 2016-02-24
EP2057274B1 (en) 2013-12-11
WO2008036863A2 (en) 2008-03-27
BRPI0716872A2 (pt) 2015-06-16
AR062947A1 (es) 2008-12-17
PT2057274E (pt) 2014-03-13
EA200970308A1 (ru) 2009-10-30
KR20090068266A (ko) 2009-06-25
EP2057274A4 (en) 2010-01-06
WO2008036863A3 (en) 2008-10-23
ES2451266T3 (es) 2014-03-26
PL2057274T3 (pl) 2014-05-30
CA2663001A1 (en) 2008-03-27
US8637290B2 (en) 2014-01-28
CN101558154A (zh) 2009-10-14
EP2057274A2 (en) 2009-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015591B1 (ru) Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
US10487316B2 (en) Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US9512382B2 (en) Oil degumming methods
CN101426918B (zh) 磷脂酶，编码磷脂酶的核酸以及制备和应用磷脂酶的方法
EA010903B1 (ru) Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
EA013993B1 (ru) Композиции для ферментативного обесцвечивания хлорофилла и способы
EA020035B1 (ru) Способы
JP2010284168A (ja) ヒドロラーゼ、それをコードする核酸並びにその製造および使用方法
Rafeeq et al. Esterases and Their Industrial Applications

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU