CN108359654B

CN108359654B - 一种具有磷脂酶b活性的多肽或蛋白质及其应用

Info

Publication number: CN108359654B
Application number: CN201810173368.6A
Authority: CN
Inventors: 严明; 陈圣; 章志林; 魏淼; 陈晶晶
Original assignee: Nanjing Xinzhimei Biological Technology Co ltd; Jiangsu Zhongmei Biological Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Xinzhimei Biological Technology Co ltd; Jiangsu Zhongmei Biological Technology Co ltd
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: CN108359654A

Abstract

本发明涉及一种具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质及其应用。利用定点突变得到了改进的具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质，可有效用于制备甘油磷酸胆碱。本发明亦涉及包含编码所述多肽或蛋白质酶的多核苷酸和该多核苷酸的核苷酸构建体、载体和宿主细胞，连同生产所述多肽或蛋白质以及使用该多肽或蛋白质的方法。

Description

一种具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质及其应用

序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种具有磷脂酶B的多肽或蛋白质及其应用，具体而言，是涉及一种具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质及其应用于甘油磷酸胆碱的制备。

背景技术

磷脂在自然界分布广泛，所有的细胞中都含有磷脂，磷脂是生物膜的基本组成成分。磷脂在生命过程中起代谢作用和结构形成作用，是重要的生命物质。磷脂酶是水解磷脂的酯键的酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。依据其作用位点不同，磷脂酶分为磷脂酶A₁、A₂、B、C、D等。其中磷脂酶A₁、磷脂酶A₂可以特异水解磷脂甘油S_n-1或S_n-2位上的酰基，生成溶血磷脂和游离脂肪酸，从而去除非水化磷脂。磷脂酶B(PLB)具有水解酶和溶血磷脂酶-转酰基酶的活性，水解酶的活性能同时水解S_n-1和S_n-2位酰基，清除磷脂和溶血磷脂中的脂肪酸，转酰基酶活性则将游离脂肪酸转移到溶血磷脂而生成磷脂。

磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油/水混合物的乳化；磷脂酶可用于植物油加工过程中的酶法脱胶；淀粉水解产物(特别是小麦淀粉的水解产物)的后续处理以提高过滤通透能力。

甘油磷酸胆碱(L-alpha glycerylphosphorylcholine，L-α-GPC)由胆碱、甘油和磷酸盐组成，是合成乙酰胆碱神经递质的前体，和所有体细胞中重要的营养素。甘油磷酸胆碱的临床研究已经显其在改善神经学脑功能和认知表现方面具有重要的医药应用价值，可用于治疗如阿尔茨海默氏症、小脑性共济失调、精神***症和双相情感障碍等，但是就作为药用原料及相关研究而言需要较高纯度的L-α-GPC。然而遗憾的是天然L-α-GPC的含量较少，故制备纯度高、质量好的甘油磷酸胆碱产品具有重要意义。

酶法制备甘油磷酸胆碱是指在一定条件下，利用PLB能够水解磷脂S_n-l和S_n-2位脂肪酸酰基的作用催化磷脂酰胆碱反应生成甘油磷酸胆碱，该方法相比化学合成具有反应条件温和、产品得率高、质量好等优点。故需要开发或改造出具有更高活性的PLB来提高甘油磷酸胆碱生产效率，从而提高生产经济效益。

发明内容

本发明提供一种具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质及其应用，利用定点突变技术对具有磷脂酶B活性的蛋白进行改造，提高其在制备甘油磷酸胆碱中的效率。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：4所示；其含有如SEQ ID No：10所示的核苷酸编码序列。在一个实施方案中，所述的具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质含有如SEQ ID No：4所示的氨基酸序列。

本发明还涉及如上所述的磷脂酶B多肽或蛋白质的；

在一个实施方案中，所述核苷酸编码序列含有如SEQ ID No：10所示的序列。

本发明亦涉及包含一种核酸构建体或表达载体，其包含上述方案中所述的多肽或蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的产生。

本发明亦涉及包含一种重组宿主细胞，其包含上述方案中的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的产生。

本发明提供了一种产生具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)、在有助于所述多肽或蛋白质的产生的条件下培养上述方案的宿主细胞；和

(b)、回收所述多肽或蛋白质。

本发明亦涉及一种组合物，其包含上述方案中的多肽或蛋白质和其它酶。

本发明提供了一种制备及检测甘油磷酸胆碱的方法，该方法包括：

(a)、将含有磷脂酰胆碱、pH4.5-9.0的缓冲液、EDTA、Triton X-100以及磷脂酶B(具有磷脂酶B活性的野生型蛋白或突变体蛋白)的相同标准反应体系，在37℃下分别反应4-30h后，100℃水浴5min终止酶反应；

(b)、从(a)中各反应体系取等量反应液分别加入到含有甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(GPCP)、Tris-HCl缓冲液及CaCl₂的相同反应体系中，37℃下反应20min；

(c)、从(b)中各反应体系取等量反应液分别加入到含有碱性磷酸酶(AP)、glycine-NaOH缓冲液、MgCl₂及ZnCl₂的相同反应体系中，56℃下反应10min；

(d)、用BIOMOL Green Reagent磷酸盐显色试剂盒检测(c)中各反应体系产生的无机磷酸盐含量，而上述磷脂酶B催化产生的甘油磷酸胆碱的含量即等于各体系中的无机磷酸盐的含量。

上述方案中，所述有关内容解释如下：

本发明以来源于Streptomyces sp.Sge12菌的具有磷脂酶B活性的假定的蛋白的基因(如SEQ ID No：6所示)为出发基因，进行基因突变，通过定向筛选获得了活性提高的突变体酶。

本发明的来源于Streptomyces sp.Sge12菌的具有磷脂酶B活性的突变体的氨基酸序列含有如下序列：

(1)SEQ ID No：1所示的氨基酸序列：突变位点为H49K：

MRCASATQRSMHIRGQVHPLPGIDQRVNLACSGAETVNVLSTAAGGQPKLGEAPQTDRLAAVARTARVRLIALSIGGNDLGFGAIIGDCAYDWYFRRLCWKKQAPVVEQKLPGVRAKVTAVVDDIRATMRAAGYADGDYRLVLQSYPSPIPGGESFRLNQNDSDRMFKDGCPFNDRDADWAAYTLVPRIGDMVEAVAGARGTDYLDLRDALAGHEVCALGPEQVGQTGPDARRHEWFRFLDRVNTQGTLEESMHPNAHGQRAMAVCLGLVGAAAPGRYACTQDWFGDGDPSRMRIRQAV

(2)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列：突变位点为G190S：

MRCASATQRSMHIRGQVHPLPGIDQRVNLACSGAETVNVLSTAAGGQPHLGEAPQTDRLAAVARTARVRLIALSIGGNDLGFGAIIGDCAYDWYFRRLCWKKQAPVVEQKLPGVRAKVTAVVDDIRATMRAAGYADGDYRLVLQSYPSPIPGGESFRLNQNDSDRMFKDGCPFNDRDADWAAYTLVPRISDMVEAVAGARGTDYLDLRDALAGHEVCALGPEQVGQTGPDARRHEWFRFLDRVNTQGTLEESMHPNAHGQRAMAVCLGLVGAAAPGRYACTQDWFGDGDPSRMRIRQAV

(3)SEQ ID No：3所示的氨基酸序列：突变位点为A264V：

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(4)SEQ ID No：4所示的氨基酸序列：突变位点为G190S+A264V：

MRCASATQRSMHIRGQVHPLPGIDQRVNLACSGAETVNVLSTAAGGQPHLGEAPQTDRLAAVARTARVRLIALSIGGNDLGFGAIIGDCAYDWYFRRLCWKKQAPVVEQKLPGVRAKVTAVVDDIRATMRAAGYADGDYRLVLQSYPSPIPGGESFRLNQNDSDRMFKDGCPFNDRDADWAAYTLVPRISDMVEAVAGARGTDYLDLRDALAGHEVCALGPEQVGQTGPDARRHEWFRFLDRVNTQGTLEESMHPNAHGQRAMVVCLGLVGAAAPGRYACTQDWFGDGDPSRMRIRQAV

上述磷脂酶B突变体的编码DNA序列包含以下DNA序列：

(1)SEQ ID No：7，其为SEQ ID No：6所示的具有磷脂酶B活性的假定蛋白的基因序列中第145-147bp的CAC突变为AAA；

(2)SEQ ID No：8，其为SEQ ID No：6所示的具有磷脂酶B活性的假定蛋白的基因序列中第568-570bp的GGC突变为TCC；

(3)SEQ ID No：9，其为SEQ ID No：6所示的具有磷脂酶B活性的假定蛋白的基因序列中第790-792bp的GCG突变为GTC；

(4)SEQ ID No：10，其为SEQ ID No：6所示的具有磷脂酶B活性的假定蛋白的基因序列中第568-570bp的GGC突变为TCC，且第790-792bp的GCG突变为GTC；

其中，相关定义内容如下：

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trendsin Genetics 16：276-277)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)为10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)为0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度一比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Bi010 Open Software Suite,Rice等，见上文)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度一比对中缺口的总数)

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的蛙鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、己剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工然后作为成熟的己剪接的mRNA出现。

核酸构建体：术语“核苷酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或将其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，调控序列包括启动子以及转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点目的的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翩译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。

本发明涉及对源自Streptomyces sp.Sge12菌的未表征的假定的蛋白进行定点突变，就上述蛋白质而言，从未描述过其在制备甘油磷酸胆碱或其他应用中的用途。

根据本发明的一个实施方案，诸位发明人发现，相比野生蛋白该突变体的磷脂酶B活性有明显改进，且在利用该突变体催化磷脂酰胆碱制备甘油磷酸胆碱的方法中，转化效率也得到显著提高。

产生方法

以Streptomyces sp.Sge12菌株中假定的蛋白的基因作为模板(氨基酸序列如SEQID No：5所示，GeneBank登录号为：WP_081522390.1)，设计核苷酸引物，通过PCR方法扩增获得该蛋白的突变体。然后，将所获得的突变体基因***到适合的表达载体中，从而产生含有该假定蛋白的突变体基因的重组载体，并且将所述重组载体转化到适合的宿主细胞中。将该转化的微生物进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基因回收。在一方面，回收包含该多肽的发酵液。

在一个替代性方面中，该多肽未被回收，而是使用表达该多肽的本发明的宿主细胞作为该多肽来源。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。且在以下实例中，提及的野生型磷脂酶B均指所述源自Streptomyces sp.Sge12菌野生型假定的蛋白，提及的本发明的具有磷脂酶B活性的突变体是氨基酸序列为SEQ ID：4所示的序列。

实施例1：克隆和表达

编码磷脂酶的基因是通过常规技术从以上所指示出的菌株进行克隆的，或者作为合成基因订购并且***到适合的质粒中。

选择一个正确重组基因序列克隆入表达载体pUC702中，转化至链霉菌Streptomyces lividans TK24宿主细胞中表达该基因构建体。

实施例2：定点突变

以包含整合的表达构建体的重组链霉菌的野生型假定蛋白基因序列为模板，设计突变引物，依次将第190位甘氨酸突变为丝氨酸，将第264位丙氨酸突变为缬氨酸，得到了具有改进的磷脂酶B活性的突变体。然后将包含野生型假定蛋白的重组菌以及测序正确的突变体分别从平板接种到250mL的锥形瓶在摇床上中进行培养，每个锥形瓶包含50ml的3％(w/v)TSB液体培养基(含5μg/ml的硫链丝菌素)。在28℃下培养36h后，4℃下18 800g离心20min后,收集上清液获得粗酶液。

引入G190S突变的定点突变引物为：

正向引物5’-GTCCCGAGGATCTCCGACATGGTCGAGGCGGTGG-3’

反向引物5’-CTCGACCATGTCGGAGATCCTCGGGACGAGCGT-3’

引入A264V突变的定点突变引物为：

正向引物5’-AGCGGGCGATGGTCGTCTGCCTCGGCCTGGTG-3’

反向引物5’-GCCGAGGCAGACGACCATCGCCCGCTGCCCGTGG-3’

实施例3：酶活力检测

(1)磷脂酶B酶活测定方法

①设置100μl标准检测体系，包含50mM Tris-HCl pH＝8.0缓冲液、0.5％(w/v)1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate,monosodium salt(DMPA)底物、0.5％(w/v)Ttiton X-100、10mM EDTA以及5％(v/v)磷脂酶B，于50℃下水浴反应5min后，100℃水浴反应5min终止反应。

②反应结束后，21 800g离心5min，按照试剂盒NEFAC Kit(Wako Pure ChemicalIndustries Ltd)的使用说明，以油酸为标品，检测上述酶反应体系释放出的游离脂肪酸含量。

(3)酶活力定义为

以DMPA为底物，在50℃，pH＝8.0的条件下，每分钟产生1μmol游离脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位，记为U/mL。

(4)磷脂酶B酶活的测定

测定野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体的粗酶液活力，突变体的酶活比突变前提高了30％，分别为25.2U/ml和32.8U/ml。

实施例4：以野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体制备甘油磷酸胆碱

①设置100μl的反应体系，包含50mM Tris-HCl pH＝8.0缓冲液、0.5％(w/v)磷脂酰胆碱、0.5％(w/v)Ttiton X-100、10mM EDTA以及5％(v/v)磷脂酶B粗酶液，在37℃下反应30h后，100℃水浴5min终止酶反应。

②从①中取50μl结束后的反应液加入到含有0.17U的GPCP、50mM Tris-HCl pH＝9.0缓冲液及15mM CaCl2的100μL反应体系中，37℃下反应20min；

③从②中取10μl结束后的反应液加入到含有2U的AP、50mM glycine-NaOH pH＝9.6缓冲液、1mM MgCl2及0.1mM ZnCl2的100ul反应体系中，56℃下反应10min；

④用BIOMOL Green Reagent磷酸盐显色试剂盒检测③中反应结束后体系产生的无机磷酸盐含量，而上述磷脂酶B催化产生的甘油磷酸胆碱的含量即等于体系中的无机磷酸盐的含量。

其中野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体酶催化制备甘油磷酸胆碱的转化率分别为20％、52％。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

序列表

<110> 江苏中酶生物科技有限公司

<120> 一种具有磷脂酶B活性的突变体及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

MRCASATQRS MHIRGQVHPL PGIDQRVNLA CSGAETVNVL STAAGGQPKL GEAPQTDRLA 60

AVARTARVRL IALSIGGNDL GFGAIIGDCA YDWYFRRLCW KKQAPVVEQK LPGVRAKVTA 120

VVDDIRATMR AAGYADGDYR LVLQSYPSPI PGGESFRLNQ NDSDRMFKDG CPFNDRDADW 180

AAYTLVPRIG DMVEAVAGAR GTDYLDLRDA LAGHEVCALG PEQVGQTGPD ARRHEWFRFL 240

DRVNTQGTLE ESMHPNAHGQ RAMAVCLGLV GAAAPGRYAC TQDWFGDGDP SRMRIRQAV 299

<210> 2

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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DRVNTQGTLE ESMHPNAHGQ RAMAVCLGLV GAAAPGRYAC TQDWFGDGDP SRMRIRQAV 299

<210> 3

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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DRVNTQGTLE ESMHPNAHGQ RAMVVCLGLV GAAAPGRYAC TQDWFGDGDP SRMRIRQAV 299

<210> 4

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

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DRVNTQGTLE ESMHPNAHGQ RAMVVCLGLV GAAAPGRYAC TQDWFGDGDP SRMRIRQAV 299

<210> 5

<211> 299

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. Sge12

<400> 5

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AVARTARVRL IALSIGGNDL GFGAIIGDCA YDWYFRRLCW KKQAPVVEQK LPGVRAKVTA 120

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DRVNTQGTLE ESMHPNAHGQ RAMAVCLGLV GAAAPGRYAC TQDWFGDGDP SRMRIRQAV 299

<210> 6

<211> 897

<212> DNA

<213> Streptomyces sp. Sge12

<400> 6

atgcgctgcg cgtccgcgac ccagcggagc atgcacatcc ggggccaggt tcacccgctg 60

cccgggatcg accagcgggt gaacctggcc tgctccggag ccgagacggt caacgtcctg 120

agcacggcgg ccggcgggca gccccacctc ggggaggccc cgcagaccga ccggctggcc 180

gccgtcgcgc ggacggcccg ggtcaggctg atcgcgctgt ccatcggcgg gaacgacctc 240

ggcttcggcg cgatcatcgg cgactgcgcg tacgactggt acttcaggcg gctgtgctgg 300

aagaagcagg cgccggtcgt cgagcagaag ctgcccgggg tgagggccaa ggtcacggcc 360

gtcgtggacg acatccgggc aacgatgcgg gccgccgggt acgcggacgg cgactaccgg 420

ctggtcctgc agtcctaccc gtcaccgatt ccgggcgggg agtccttccg gctgaaccag 480

aacgactcgg accggatgtt caaggacggc tgccccttca acgaccggga cgcggactgg 540

gcggcgtaca cgctcgtccc gaggatcggc gacatggtcg aggcggtggc cggcgcccgc 600

ggcaccgact acctggacct gcgggacgca ctggcggggc acgaggtgtg cgcgctgggc 660

ccggagcagg tggggcagac cggaccggac gcccgccggc acgagtggtt ccgtttcctc 720

gaccgcgtca acacgcaggg cacgctggag gagtccatgc accccaacgc ccacgggcag 780

cgggcgatgg cggtctgcct cggcctggtg ggggcagcgg ctcccggccg gtacgcgtgc 840

acgcaggact ggttcggcga cggggacccg agccggatgc ggatccggca ggccgtg 897

<210> 7

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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cccgggatcg accagcgggt gaacctggcc tgctccggag ccgagacggt caacgtcctg 120

agcacggcgg ccggcgggca gcccaaactc ggggaggccc cgcagaccga ccggctggcc 180

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ggcttcggcg cgatcatcgg cgactgcgcg tacgactggt acttcaggcg gctgtgctgg 300

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gtcgtggacg acatccgggc aacgatgcgg gccgccgggt acgcggacgg cgactaccgg 420

ctggtcctgc agtcctaccc gtcaccgatt ccgggcgggg agtccttccg gctgaaccag 480

aacgactcgg accggatgtt caaggacggc tgccccttca acgaccggga cgcggactgg 540

gcggcgtaca cgctcgtccc gaggatcggc gacatggtcg aggcggtggc cggcgcccgc 600

ggcaccgact acctggacct gcgggacgca ctggcggggc acgaggtgtg cgcgctgggc 660

ccggagcagg tggggcagac cggaccggac gcccgccggc acgagtggtt ccgtttcctc 720

gaccgcgtca acacgcaggg cacgctggag gagtccatgc accccaacgc ccacgggcag 780

cgggcgatgg cggtctgcct cggcctggtg ggggcagcgg ctcccggccg gtacgcgtgc 840

acgcaggact ggttcggcga cggggacccg agccggatgc ggatccggca ggccgtg 897

<210> 8

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcgctgcg cgtccgcgac ccagcggagc atgcacatcc ggggccaggt tcacccgctg 60

cccgggatcg accagcgggt gaacctggcc tgctccggag ccgagacggt caacgtcctg 120

agcacggcgg ccggcgggca gccccacctc ggggaggccc cgcagaccga ccggctggcc 180

gccgtcgcgc ggacggcccg ggtcaggctg atcgcgctgt ccatcggcgg gaacgacctc 240

ggcttcggcg cgatcatcgg cgactgcgcg tacgactggt acttcaggcg gctgtgctgg 300

aagaagcagg cgccggtcgt cgagcagaag ctgcccgggg tgagggccaa ggtcacggcc 360

gtcgtggacg acatccgggc aacgatgcgg gccgccgggt acgcggacgg cgactaccgg 420

ctggtcctgc agtcctaccc gtcaccgatt ccgggcgggg agtccttccg gctgaaccag 480

aacgactcgg accggatgtt caaggacggc tgccccttca acgaccggga cgcggactgg 540

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<210> 9

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

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cccgggatcg accagcgggt gaacctggcc tgctccggag ccgagacggt caacgtcctg 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgcgctgcg cgtccgcgac ccagcggagc atgcacatcc ggggccaggt tcacccgctg 60

cccgggatcg accagcgggt gaacctggcc tgctccggag ccgagacggt caacgtcctg 120

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gcggcgtaca cgctcgtccc gaggatctcc gacatggtcg aggcggtggc cggcgcccgc 600

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ccggagcagg tggggcagac cggaccggac gcccgccggc acgagtggtt ccgtttcctc 720

gaccgcgtca acacgcaggg cacgctggag gagtccatgc accccaacgc ccacgggcag 780

cgggcgatgg tcgtctgcct cggcctggtg ggggcagcgg ctcccggccg gtacgcgtgc 840

acgcaggact ggttcggcga cggggacccg agccggatgc ggatccggca ggccgtg 897

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccgaggcag acgaccatcg cccgctgccc gtgg 34

Claims

1.一种具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，所述的磷脂酶B多肽或蛋白质的核苷酸编码序列如SEQ ID No：10所示。

2.一种核酸构建体或表达载体，其包含权利要求1所述的多肽或蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的产生。

3.一种重组宿主细胞，其包含权利要求1的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的产生。

4.一种产生具有磷脂酶B活性的多肽或蛋白质的方法，其特征在于：所述方法包括：

(a)、在有助于所述多肽或蛋白质的产生的条件下培养权利要求3的宿主细胞；和

(b)、回收所述多肽或蛋白质。

5.一种组合物，其包含权利要求1所述的多肽或蛋白质和其它酶。

6.权利要求1的多肽或蛋白质或权利要求5的组合物在用于制备甘油磷酸胆碱的方法：

将含有磷脂酰胆碱、pH4.5-9.0的缓冲液、EDTA、Triton X-100以及磷脂酶B的相同标准反应体系，在37℃下分别反应4-30h后，100℃水浴5min终止酶反应。