JP4263248B2 - Ｄｎａのシャッフリングによるライブラリーの作成方法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、（ａ）いわゆる遺伝子又はDNAのシャッフリング（shuffling）技術を利用して、注目する生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的多様性を人工的に作り出すことによって、「遺伝子」の大きなライブラリーを創作し、適当な発現系によって前記遺伝子ライブラリーを発現させ、そして特定の特性に関して、発現させたタンパク質をスクリーニングし、希望する特性を呈する前記タンパク質を決定することによって、注目するタンパク質の特性を改良するために、あるいは、
（ｂ）調節性要素、例えばプロモーター又はターミネーターのライブラリーを作り、これらを構造遺伝子に作用可能に連結したもので適当な宿主を形質転換し、そしてその調節性要素の希望する特性に関してスクリーニングすることによって、その調節性要素の特性を改良するために、DNA配列を最適化することに関する。
発明の背景
一般的には、ある生物活性を発揮するタンパク質は、生物の属間で多様性を示し、さらに同種の生物間でも差異が存在することが分かっている。この多様性は、遺伝子レベルでは更に顕著である。
同一の生物活性を基本的に有するタンパク質をコードする遺伝子間でのこの様な天然の遺伝子多様性は、長年に亘って自然界で生成してきたもので、当生物体の環境に対する、コードされるタンパク質の自然界での最適化を反映している。
現代社会では、生物の環境は、自然環境から大きくかけ離れていて、天然の生物活性分子は、人間によって作りだされる様々な使用状況、特に工業目的の使用状況には適していないことが分かっている。
従って、目的とする使用状況に対して最適な特性を示す生物活性タンパク質を同定することが、工業上の関心となっている。
このことは、長年、天然生物資源をスクリーニングするか、または、変異誘発を利用して行われてきた。例えば、洗剤中に用いる酵素の技術分野では、例えば天然のプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼの洗浄能及び／又は食器洗浄能が、それらの酵素のインビトロ改修によって有意に改良されてきた。
ほとんどの場合、これらの改良は、アミノ酸のタイプ、又は、成熟酵素の２次もしくは３次構造上の位置に基づいて選ばれた特異的なアミノ酸残基の置換、欠損又は挿入を誘導する部位特異的変異誘発によってなされてきた（例えば米国特許4,518,584参照）。
この様な方法で、新規なポリペプチド変異体、例えば、比活性、基質特異性、温度、pH及び塩に対する安定性、pH至適性、pI，Km，Vmaxなどの特性が変更された新規な酵素修飾体の調製が成功し、特性が改良されたポリペプチドが得られた。
例えば、酵素の技術分野では、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼなどの洗浄能及び／又は食器洗浄能が有意に改良された。
タンパク質及び酵素を改修するための別の一般的な方法は、例えばUS 4,894,331及びWO93／01285で開示されている様に、ランダム変異誘発に基づくものである。
改良された機能特性を有するポリペプチド変異体を得ることは、厄介であり、そして時間がかかるので、改修されたポリペプチドを早急に調製する少数の代替方法が、提唱されている。
Weber et al．，（1983），Nucleic Acids Research，vol.11，5661-5661には、２つの相同遺伝子間でインビボの組換えを行って遺伝子を改修する方法が記載されている。５′末端でアルファ１ヒトインターフェロンをコードするDNA配列、そして３′末端でアルファ２ヒトインターフェロンをコードするDNA配列によって挟まれた、プラスミドベクターを含有する直鎖状DNA配列を作成し、そして大腸菌のrecA陽性株に導入する。耐性マーカーを用いて、組換え体を同定し、そして単離する。
Pompon et al．，（1989），Gene 83，p．15-24には、哺乳動物のチトクロームＰ−450の遺伝子ドメインをシャッフリングする方法で、末端を埋め込んで平滑化した直鎖状プラスミド、及びこのプラスミドの末端部分に部分的に相同なDNA断片によってサッカロミセス・セレビシエを形質転換し、このサッカロミセス・セレビシエ内で部分的に相同な配列のインビトロ組換えを行わさせる前記方法が記載されている。
WO97／07205には、プラスミドDNAを鋳型として用いたインビボ組換えによって、相同DNA配列中の異なったヌクレオチド配列をシャッフリングして、ポリペプチド変異体を調製する方法が記載されている。
米国特許5,093,257（Genencor Int．Inc．）には、インビボ組換えによってハイブリッドポリペプチドを生産する方法が開示されている。ハイブリッドDNA配列は、複製のための配列、ハイブリッドポリペプチドのアミノ末端部分をコードする１つ目のDNA配列、そのハイブリッドポリペプチドのカルボキシ末端部分をコードする２つ目のDNA配列を含んでいる環状ベクターを形成することによって生産される。この環状ベクターを、この環状ベクターが増幅されるrecA陽性微生物に導入する。その結果、recA陽性微生物の天然の組換え機構によって、前記環状ベクターの組換えが起こる。前記微生物には、バチルス菌及び大腸菌などの原核生物、並びにサッカロミセス・セレビシエなどの真核生物が含まれる。
相同DNA配列をシャッフリングする方法がStemmerによって記載されている（Stemmer，（1994），Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．91，10747-10751; Stemmer，（1994），Nature，vol．370，389-391）。この方法では、インビトロPCR技術によって相同DNA配列をシャッフリングする。シャッフリングされたDNA配列を含んでいる陽性組換え遺伝子を、発現したタンパク質の改良された機能に基づいて、DNAライブラリーから選択する。
前記の方法は、WO95／22625にも記載されている。WO95／22625は、相同DNA配列をシャッフリングする方法に関する。WO95／22625で記載された方法における重要な過程は、相同な鋳型二本鎖ポリヌクレオチドを、希望するサイズのランダムな断片に切断してから、これらの断片を相同的に再集合させて、完全長の遺伝子にすることである。
WO95／22625の方法に固有な欠点は、当方法によって生成する多様性が、（WO95／22625中で規定された）用いられた相同遺伝子配列によって制限されることである。
WO95／22625の方法の別の欠点は、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドの切断によってランダムな断片を生産することにある。
注目する別の参考文献はWO95／17413であり、これには、特異的なDNA配列、いわゆるデザインエレメント（DE）を組換えることによって遺伝子又はDNAをシャッフリングする方法であって、合成した二本鎖断片又はPCRで生成した配列を組換えて、少くとも２つのデザインエレメントを含有するいわゆる機能エレメント（FE）を生産する前記方法が記載されている。WO95／17413に記載の方法では、組換えるための異なった配列間のハイブリダイゼーションが可能となるために十分な配列相同性を有するDNA配列を有するデザインエレメント間で、本組換えを行なわなければならない。
従って、WO95／17413の方法でも、生成する多様性が比較的に制限されるという欠点がある。さらに、この方法は、時間がかかり、費用がかかり、そして自動化するのに適していない。
前記の方法があるにもかかわらず、新規なポリペプチド変異体を調製するための、反復性のより良いインビボ組換え方法が求められている。この様な方法は、少容量で行うことができ、そして自動化しやすい方法であるべきでもある。
更に、比較的に低い相同性を有する遺伝子をシャッフリングできる可能性がある方法も必要とされている。
発明の要約
本発明は、多数の異なった出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型に由来する組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法に関し、この出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型は、15％未満から80％超までの幅広い範囲の相同性を有する、進化上又は合成の相同ペプチドをコードする遺伝子からなる群において別個の点を表し、前記の群では、少くとも１つの同定配列（identification sequence）が存在し、そしてこの方法では、前記遺伝子に遺伝子シャッフリング工程を施し、前記の出発材料の鋳型の遺伝子間に追加された別個の点を表す、前記群の遺伝子に由来するシャッフリングされた変異体を生成させる。
本発明に従って用いられるこの遺伝子シャッフリング方法は、任意の適当な方法、例えば前記の方法又は同日に提出され、同時に係属中の本発明者の特許出願に記載され、以下にその概略を記した方法でよい。
その方法では、インビトロDNA合成による新しく合成されたDNA鎖の鋳型シフトを用いて、DNAシャッフリングを達成する。
本発明の更に別の点は、同一の生物活性を有する天然のポリペプチドに比べて、改良された特性を呈するポリペプチドを同定する方法に関し、この方法では、前記方法によって作成した組換えポリヌクレオチドのライブラリーを、適当なベクターにクローン化し、次にこのベクターを、適切な宿主系に導入して、それらに対応するポリペプチドを発現させ、次に適当な検査によってそれらのポリペプチドをスクリーニングし、そして特性が改良されたものを選択する。
本発明の更に別の点は、前記の方法によって同定された注目するポリペプチドを生産する方法に関し、この方法では、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターで適切な宿主を形質転換し、この宿主を増殖させて、このポリペプチドを発現させ、そしてこのポリペプチドを回収及び精製する。
定義
本発明を詳細に説明する前に、以下の用語をまず定義する。
「シャッフリングする」：本明細書では、用語「シャッフリングする」とは、入力ポリヌクレオチド（すなわち出発点としてのポリヌクレオチド）に比べて、多数の交換されたヌクレオチド断片を有する出力ポリヌクレオチド（すなわちシャッフリング工程を経たポリヌクレオチド）を生成するために、２つ以上のポリヌクレオチド間でヌクレオチド配列断片を組み換えることを意味する。
「DNA配列又はポリヌクレオチドの相同性」：本明細書では、DNA配列の相同性の程度は、２つの配列間の同一の程度として決定され、１つ目の配列の２つ目の配列からの派生性を示す。この相同性は、当業界に周知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラム内にあるGAPを用いて適切に決定される（Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711）（Needleman，S.B．and Wunsch，C.D．，（1970），Journal of Molecular Biology 48，443-453）。
「相同の」：用語「相同の」とは、１つの一本鎖核酸配列が、相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズすることができることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、多数の因子、例えば配列間の同一性の程度並びにハイブリダイゼーション条件、例えば以下で検討する温度及び塩濃度に依存するだろう。
DNA配列比較のための以下の設定：GAP creation penalty 5.0及びGAP extension penalty 0.3にてコンピュータプログラムGAP（前出）を用いると、本明細書では、２つのDNA配列が、相互に、好ましくは少くとも70%、より好ましくは少くとも80％、そしてさらにより好ましくは少くとも85％の同一性を有する場合に、（以下に定義する低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズすることができると考えられる。
「非相同の」：２つ以上のDNA配列が、相互に、前記した値より小さな同一性の程度を示す場合、これらは、本明細書では、「非相同」であると言える。
「ハイブリダイゼーション」：２つ以上の注目するDNA配列がハイブリダイズするか否か決定するために適する実験条件を、本明細書では、以下に詳細に記載する様な低ストリンジェント条件でのハイブリダイゼーションとして定義する。
この様な条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子を、Ｘ線フィルムまたはホスホイメージャーで検出する。
「プライマー」：本明細書で、特にPCR反応に関連して用いられる用語「プライマー」は、当業界に既知の標準的な記載（“PCR Apractical approach”IRL Press（1991））に従って定義及び作成されるオリゴヌクレオチド（特に「PCRプライマー」）である。
「配列に対するプライマー」：用語「配列に対するプライマー」とは、注目する配列部分に対する配列同一性が少くとも80％、より好ましくは少くとも90％となる様に作成されたプライマー（好ましくはPCR反応に用いるもの）を意味し、このプライマーが「配列に対する」プライマーである。このプライマーは、与えられた温度で、このプライマーが対象とする領域に特異的にアニールする様に設計される。特に、このプライマーの３′末端部分の同一性は、ポリメラーゼの機能、すなわち、アニールしたプライマーを伸長するポリメラーゼ活性にとって必須である。
「フランキング」：本明細書では、PCR断片中に含まれるDNA配列に関連して、用語「フランキング」とは、PCR断片の５′及び３′の両末端部分に存在する最も外側の末端部分配列を意味する。
「ポリペプチド」：アミノ酸の重合体のことで、時にタンパク質と称される。アミノ酸の配列から、そのポリペプチドがとる折りたたみ立体構造が決定され、次にこの立体構造から、活性などの生物特性が決まる。ポリペプチドには、単一のポリペプチド鎖からなるもの（単量体）、そしていくつかのポリペプチドが結合したもの（多量体）が含まれる。全ての酵素及び抗体はポリペプチドである。
「酵素」：化学反応を触媒するタンパク質のこと。酵素の特定の型は、ａ）ヒドロラーゼ、例えばアミラーゼ、セルラーゼ及びその他のカルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、並びにリパーゼ、ｂ）オキシドレダクターゼ、ｃ）リガーゼ、ｄ）リアーゼ、ｅ）イソメラーゼ、ｆ）トランスフェラーゼなどである。本発明に関連して特に注目する酵素は、洗剤中に用いられる酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼなどである。
発明の詳細な説明
進化上の同一起源に由来するポリペプチドをコードする全の候補遺伝子は、非常に大きなDNA配列の群とみなされる（例えば、Gspはセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の組を示す）。この様な群中の単一構成体によってコードされるポリペプチド間の相同性は、15％未満ほどの低さでもよい（この様な遺伝子は、「遠位」の生物体に由来する）。
人間が開発した多様な目的に適するポリペプチドを探索する場合、現在の情報レベルで不可能でないとしても、問題とするポリペプチドの最適な立体構造に関して合理的な方法で結論を導くことは困難である。従って、前記の非常に大きな群の部分群で、その大きな群中で可能な多様性からなる実質的な部分を表す前記部分群を生成する簡単な方法が望まれていた。
従って、本発明の目的は、同一の機能性を有するが、低い相同性しか示さないポリペプチドをコードする遺伝子の構成要素をシャッフリングすることが可能となる方法を提供することである。
この目的のために、問題とする群に関する合理的な情報を得る必要があり、このことは、すなわち、自由に利用できる、できる限り高い多様性を示す多数の個別の構成体（例えば５，10，15またはそれ以上の構成体）を有していることを意味する。この小さい部分群を、遺伝子の非常により大きな部分群を生成するための出発点として使用する。次に、得られたこの大きな部分群に由来する対応するポリペプチドを適当な方法で表示及びスクリーニングして、目標とする目的のために最適な、前記の大きな部分群中の構成体を同定する。
出発点の部分群から、大きな部分群に拡張することは、遺伝子をシャッフリングする方法によって達成できることが判った。
前記文献に記載されているこの様な方法から、合理的に高い相同性、典型的には80％超の相同性を有するポリペプチドをコードする遺伝子間で、DNA断片を交換し、80％〜99％の相同性を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子を生成させる方法が提供される。
本発明の方法では、出発群中の少くとも１つの別の遺伝子に対して少くとも70％から80％までの相同性を示す、ポリペプチドをコードする遺伝子を用いることが、出発群として必要であることも判った。
本発明では、従って、かなり類似している遺伝子から、類似していないが、同一の進化起源（機能）をなお有する遺伝子までの範囲内の中間の配列を含んでいる、遺伝子群又は遺伝子サブセットから開始することが重要である。その後にのみ、さらにかなり非相同な配列をシャッフリングすることが可能である。最初のかなり相同な遺伝子を段階的にシャッフリングすることによって、出発群に含まれていない新しい種類のものが生成し、そして、続いて行うシャッフリングにおいて、これらを、相互に、及び出発群中の他のより非相同な遺伝子と組換える。
最後に、非常に非相同な出発の遺伝子に由来する配列部分を見いだすことができるハイブリットが生成する。これらの回収された出発遺伝子は、あまりに大きな「配列間隔」距離のために、出発群中の中間的種類を有することなしには、けっしてシャッフリングされなかったであろう。
この条件が満たされれば、出発群中で認められた最低の相同性と同程度に低い相同性を有する新規な機能性ポリペプチドをコードする遺伝子が生成される可能性があることが判った。原理的には、最終的な群の相同性の範囲は、出発群のものよりさらにより大きくてよい。
本発明の第１点は、多数の異なった出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型に由来する組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法に関し、この出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型は、15％未満から80％超までの幅広い範囲の相同性を有する、進化上又は合成の相同ペプチドをコードする遺伝子からなる群において別個の点を表し、前記の群では、少くとも１つの同定配列が存在し、そしてこの方法では、前記遺伝子に遺伝子シャッフリング工程を施し、前記の出発材料の鋳型の遺伝子間に追加された別個の点を表す、前記群の遺伝子に由来するシャッフリングされた変異体を生成させる。
本発明では、45％、40％、35％、30％、25％、20％又は15％未満から、80％、85％、90％、95％又は99％超までの範囲の相同性を示す親のDNA鋳型を用いることが可能である。
特定の態様では、少くとも１つの同定配列が認められ、そしてこれにアニールするプライマーが作られる。これらの配列は、当該遺伝子のどの位置にあってもよい。
好ましい態様では、少くとも２つの同定配列が認められる。これらの配列は、お互いに任意の距離に位置してよいが、当該遺伝子上でお互いにできるだけ離れて位置するのが好ましい。
これらの態様では、前記の同定配列は、出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型の集合体によってコードされるペプチド間で保存性の高い、４〜８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、５〜７個のアミノ酸残基からなる前記アミノ酸配列が好ましい。
これらの同定配列は、40％までの変動を有する前記集合体中の遺伝子の平均サイズに相当する距離ほど離れて位置するのが好ましい。前記配列が離れているほど、遺伝子の部分はより大きくシャッフリングされる。
しかし、互いにかなり接近して位置する同定配列間の配列をシャッフリングすることのみが望まれる状況も起こるだろう。
既に指摘した様に、本発明の方法において利用される遺伝子シャッフリング方法は、それほど、又は全く重要ではない。原理的には、いかなる方法も機能する。
従って、本発明では、WO95／22625及びWO95／17413に開示されている方法を操作することも完全にできる。本発明を実行するために、これらの方法をどの様にして利用するかということに関する詳細は、以下の実施例に記載している。
従って、同時に提出した特許出願に記載されている遺伝子シャッフリング方法も、本発明に利用されることが考えられる。
これらの方法の１つに従って、インビトロDNA合成による新しく合成されたDNA鎖の鋳型シフトを用いて、DNAのシャッフリングを達成する。
より詳しくは、その方法は、多数の異なった出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型、及びプライマーから、ポリメラーゼを用いるインビトロポリヌクレオチド合成中に誘発される鋳型シフトによるもので、組換え相同ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するために提供され、この方法では、
Ａ．以下の手順で伸長されたプライマー又はポリヌクレオチドを合成し；
ａ）親の二本鎖DNA鋳型を変性させて、一本鎖の鋳型を生成させ、
ｂ）前記プライマーを、前記一本鎖DNA鋳型にアニールさせ、
ｃ）前記ポリメラーゼを用いて合成を開始させて、前記プライマーを伸長させ、
ｄ）前記合成を停止させ、そして、
ｅ）生成した二本鎖を変性させて、前記の鋳型から、前記の伸長されたプライマーを分離し、
Ｂ．以下の手順で鋳型シフトを誘発し；
ａ）前記の鋳型から、新しく合成された一本鎖の伸長されたプライマーを分離し、そして、（Ａ）において生産された前記の伸長されたプライマーを、プライマーと鋳型の両方として用いて、Ａ．ｂ）からＡ．ｅ）までの過程を繰り返すか、または、
ｂ）Ａ．ｂ）からＡ．ｅ）までの過程を繰り返し、
Ｃ．前記の工程を、過程Ａ．及びＢ．ａ）、過程Ａ．及びＢ．ｂ）、又はこれらの組み合せの過程を適当な回数繰り返した後に、停止させ、並びに、
Ｄ．場合によっては、前記の生成したポリヌクレオチドを、注目するポリヌクレオチドを選択的に増幅する特異的プライマーを用いた標準的なPCR反応において増幅する。
別の特定の態様では、同時に提出した本発明者の出願に記載された方法で、遺伝子のシャッフリングを実行する。この方法では、以下の過程を含んでいて、少くとも１つの保存領域を有する注目する非相同DNA配列をシャッフリングするために、非相同DNA配列の保存領域を同定する：
ｉ）２つ以上の非相同配列において、１つ以上の保存領域（“Ａ，Ｂ，Ｃ”などと記す）を同定すること；
ii）ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のための２組のPCRプライマー（各組は、センス及びアンチセンスプライマーを含む）を作成すること、
ただし、これらのプライマーの１つ目の組は（「ａ」センスプライマー；「ａ′」アンチセンスプライマー」）、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の５′配列領域に対するものであり、そして２つ目の組は（「ｂ」センスプライマー；「ｂ′」アンチセンスプライマー」）、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の３′配列領域に対するものであり、前記アンチセンスプライマー「ａ′」及びセンスプライマー「ｂ」は、保存領域内に少くとも10塩基対（bp）の相同な配列重複を有し、
iii）過程ｉ）において同定された注目する１つ以上の保存領域のために、過程ｉ）の非相同DNA配列を鋳型として、２回のPCR増幅反応を行うこと、ただし、
そのPCR反応の１つでは、過程ii）において決定した５′プライマー組（例えば「ａ」、「ａ′」）を使用し、そして２つ目のPCR反応では、過程ii）において決定した３′プライマー組（例えば「ｂ」、「ｂ′」）を使用し、
iv）過程ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のために、過程iii）で記載した様に作成したPCR断片を単離すること、
ｖ）過程iv）で単離した２つ以上のPCR断片を混合し、そしてこれらの単離したPCR断片を鋳型として用いて、配列重複伸長PCR反応（SOE−PCR）を行うこと、並びに、
vi）過程ｖ）で得られたPCR断片を単離すること、ただし、この単離したPCR断片は、過程iv）で単離したPCR断片からシャッフリングされた混合物を含んでいる多数の異なったシャッフリングされた配列を含んでいる。
特定の態様では、本発明の方法に対して様々な改修を行うことができる。例えば、欠点のあるポリメラーゼ、例えば、鋳型に対して変異を導入する様な誤りがちなポリメラーゼ、または反応停止を介して、ポリヌクレオチド合成を途中で停止させるポリメラーゼを利用することが有益である。
特定の態様では、当該ペプチドは、プロテアーゼ、特にスブチラーゼである。
スプチラーゼの場合、同定配列は、スブチリシンBPN’の配列位置32のアスパラギン酸、または位置64のヒスチジン及び位置221の活性セリンの周辺に位置してよい。
別の態様では、当該ペプチドは、アミラーゼ、特にα−アミラーゼである。
この場合、同定配列は、B．licheniformisのα−アミラーゼの配列位置100のAsp及び位置328のAspの周辺に位置してよい。
バチルス菌種由来のα−アミラーゼの場合、同定配列は、好ましくは、配列位置８のTyr及び位置476のSerの周辺に位置してよい。
別の態様では、当該ペプチドは、リパーゼまたはセルラーゼである。
リパーゼの場合、適当な同定配列は、A．Svendsen et al．，（1995）: Biochemical properties of cloned lipases from the Pseudomonas family，Biochimica et Biophysica Acta 1259，9-17に示されたリパーゼの整列を利用して、見い出すことができる。例えば、これは、（P．glumaeリパーゼのアミノ酸位置で）位置10のPro又は位置285のHisの周辺でよい。
セルラーゼの場合、特に、ファミリー45セルラーゼ由来のセルラーゼ（WO96／29397参照）では、適当な同定配列は、保存領域「Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro/Thr」及び保存領域「Trp Arg Phe/Tyr Asp Trp Phe」でよい。これらのセルラーゼの同定配列に関する詳細は、PCT／DK97／00216を参照する。特にPCT／DK97／00216の実施例３を参照する。
キシラナーゼの場合、特にファミリー11キシラナーゼ由来のキシラナーゼでは、適当な同定配列は、保存領域「DGGTYDIY」及び「EGYQSSG」でよい。これらのキシラナーゼの同定配列に関する詳細は、PCT／DK97／00216を参照する。特にPCT／DK97／00216の実施例１，２を参照する。
PCRプライマー
当該PCRプライマーを、当業界の標準的な記載に従って作成する。標準的には、これらの長さは10−75塩基対（bp）である。しかし、ランダム又はセミランダムプライマーを用いる特定の態様では、その長さは、前記よりも実質的に長くてよい。
PCR反応
特に言及しない場合、本発明で行うPCR反応は、当業界に既知の標準的な方法で行う。
用語「PCR断片の単離」とは、単純にPCR断片を含んでいる分画というほどの広い範囲を含んで意味する。しかし、好ましくは、PCR断片を、余ったプライマー、ヌクレオチド、鋳型などが取り除かれた程度にまで単離する。
本発明の態様では、このDNA断片を、低、中または高頻度にランダム突然変異を生じさせる条件下で調製する。
低頻度の突然変異を得るために、（DNA断片を含んでいる）DNA配列を、標準的なPCR増幅方法（US 4,683,202またはSaiki et al．，（1988），Science 239 487-491）に従って調製することができる。
中または高頻度の突然変異は、ヌクレオチドの誤った組込みを増加させる条件下でPCR増幅を行うことによって、例えば、Deshler，（1992），GATA 9（4），103-106; Leung et al．，（1989），Technique，vol．1，No.11-15の記載通りに行うことによって達成される。
本発明では、PCR増幅を、適当な物理的又は化学的変異誘発剤を用いた変異誘発過程、例えば、転位、転換、逆位、スクランブリング、欠損、及び／又は挿入を起こす変異と組み合わせることも考えられる。
組換えシャッフリング配列からの組換えタンパク質の発現
本発明の第２点目及び３点目の過程におけるシャッフリングされた配列によってコードされる組換えタンパク質の発現を、当業界に既知の標準的な発現ベクター及びそれに対応する発現系を用いて行うことができる。
スクリーニング及び選択
本明細書では、用語「陽性のポリペプチド変異体」とは、対応する入力DNA配列から生産されるポリペプチドに対して改良された機能特性を有する様に作られたポリペプチド変異体を意味する。この様な改良された特性の例は、例えば亢進又は低下した生物活性、亢進した洗浄能、温度安定性、酸化安定性、基質特異性、抗生物質耐性などの様に多様である。
従って、陽性の変異体を同定するために用いるスクリーニング方法は、変化が望まれる問題とするポリペプチドの特性、及び望ましい変化の方向に依存する。
希望する生物活性をスクリーニング又は選択する多数の適当なスクリーニング又は選択システムが当業界で報告されている。例えば、Strauberg et al．，Biotechnology 13: 669-673（1995）には、カルシウム非依存的な安定性を有するスブチリシン変異体をスクリーニングするシステムが記載されていて；Bryan et al．，Proteins 1: 326-334（1986）には、強化された温度安定性を有するプロテアーゼをスクリーニングするシステムが記載されていて；そしてPCT／DK96／00322には、洗剤中で強化された洗浄能有するリパーゼをスクリーニングするシステムが記載されている。
本発明の態様には、希望する生物活性が、食器洗浄または衣類洗浄用洗剤における性能である組換えタンパク質をスクリーニング又は選択することが含まれる。適当な食器洗浄用又は衣類洗浄用洗剤の例が、PCT／DK96／00322及びWO95／30011に開示されている。
当該ポリペプチドの改良された機能特性が、１回のシャッフリング工程後に十分に良くない場合、このポリペプチドに、もう１回当工程を施すことができる。
本発明の態様では、同一遺伝子の多数の変異を有するポリヌクレオチドを鋳型として用いる場合、少くとも１回のシャッフリング工程は、野生型DNA断片でもよい最初に用いたDNA断片を用いたバッククロスする工程である。これによって、本質的でない変異が除かれる。最初に用いる入力DNA材料として野生型DNA断片を用いることによっても、本質的でない変異を除くことができる。
更に本発明で考えられる生物活性を有するポリペプチドは、例えば、インスリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、パラチロイドホルモン、下垂体ホルモン、ソマトメジン、エリトロポエチン、黄体形成ホルモン、絨毛膜性ゴナドトロピン、視床下部の放出ホルモン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リラクシン、インターフェロン、トロンボポエチン（TPO）及びプロラクチンである。
本発明では、前記の様にして、異なった属の野生型生物体に由来する親のポリヌクレオチドをシャッフリングすることも考えられる。
この出発材料の親のDNA配列は、任意のDNA配列でよく、例えば、野生型DNA配列、変異体（variauts or mutants）をコードするDNA配列、又はそれらの修飾体、例えば拡張された又は伸長されたDNA配列でよく、そして、本発明の方法又は他の任意の方法（例えば、従来技術の章で記載された任意の方法）に従って１回以上のシャッフリング工程を経た結果のDNA配列（すなわち出力DNA配列）、あるいは合成配列又はその他の方法で変異誘発された配列でもよい。
本発明の方法を用いた場合、組換えられた生成ポリヌクレオチド（すなわちシャッフリングされたDNA配列）では、多数のヌクレオチド断片が交換された。これによって、親のポリペプチドと比較して、当ポリペプチド変異体内で少くとも１つのアミノ酸の置換が達成される。表現上無変化の（silent）交換（すなわちアミノ酸配列が変化しないヌクレオチド交換）も考えられる。
材料と方法
実施例
実施例１
細菌宿主に由来する進化上の相同体の集合体／群のシャッフリング
この実施例では、WO95／22625に記載の方法と類似した遺伝子シャッフリング方法を用いる。
スブチラーゼをコードする遺伝子又はその様な遺伝子の部分を含んでなる群を、単離又は合成を介して生成させる。これらの遺伝子の源は、Siezen et al．，Protein Engineering 4，1991，719-737に記載されている通りでよい。当群は、GenBankのA13050_1，D26542，A22550，Swiss-ProtのSUBT_BACAM P00782、そしてPD498（特許出願WO96／34963で指定されるプレプロスブチラーゼをコードする遺伝子を含んでいるものでもよく、これらの相同性（類似性）は、Clustal Methodを利用したMegAlignソフトウェア（DNASTAR Inc．，WI 53715，USA）で計算した場合、32％〜64％の範囲となった。
このシャッフリング反応に用いる基質は、シャッフリングしようとする当該DNA末端部分に対する／位置するプライマーを用いたPCR増幅によって生成される直鎖状二本鎖DNAで代表される。この実施例では、スブチリシンBPN’のアミノ酸位置64のヒスチジン及び位置221のセリンの周辺の配列を用いて、前記プライマーを簡単に作成することができる。このPCRの鋳型は、クローン化されたプロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミド又は細菌体、例えば土壌から単離されたプロテアーゼを分泌する細菌から抽出した染色体DNAであってよい。この基質は、典型的には、全ての鋳型に対して別個に生成され、そしてシャッフリング反応前に集められる。
これらの基質を、WO95／22625の記載の様に、DNase I処理または超音波による分断によって断片化する。生成した断片を、アガロースゲル電気泳動によって大きさに応じて分離し、そして希望する大きさ、例えば10〜50bp、又は30〜100bp、又は50〜150bp、又は100〜200bpの生成断片をそのゲルから精製する。
これらの断片を、WO95／22625の記載の通りにPCRによって再集合させる。場合によっては、適切に集められたDNA断片を、この適切に集められた断片の末端部分にアニールする２つのプライマーを用いた別のPCRを、前記再集合反応からの生成物に施すことによって増幅する。生成した断片を、適当な発現プラスミドにクローン化し、そして当業界に周知の方法によって特異的な特性、例えば温度安定性に対するスクリーニングを行うことができる。
本発明は、（ａ）いわゆる遺伝子又はDNAのシャッフリング（shuffling）技術を利用して、注目する生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的多様性を人工的に作り出すことによって、「遺伝子」の大きなライブラリーを創作し、適当な発現系によって前記遺伝子ライブラリーを発現させ、そして特定の特性に関して、発現させたタンパク質をスクリーニングし、希望する特性を呈する前記タンパク質を決定することによって、注目するタンパク質の特性を改良するために、あるいは、
（ｂ）調節性要素、例えばプロモーター又はターミネーターのライブラリーを作り、これらを構造遺伝子に作用可能に連結したもので適当な宿主を形質転換し、そしてその調節性要素の希望する特性に関してスクリーニングすることによって、その調節性要素の特性を改良するために、DNA配列を最適化することに関する。
発明の背景
一般的には、ある生物活性を発揮するタンパク質は、生物の属間で多様性を示し、さらに同種の生物間でも差異が存在することが分かっている。この多様性は、遺伝子レベルでは更に顕著である。
同一の生物活性を基本的に有するタンパク質をコードする遺伝子間でのこの様な天然の遺伝子多様性は、長年に亘って自然界で生成してきたもので、当生物体の環境に対する、コードされるタンパク質の自然界での最適化を反映している。
現代社会では、生物の環境は、自然環境から大きくかけ離れていて、天然の生物活性分子は、人間によって作りだされる様々な使用状況、特に工業目的の使用状況には適していないことが分かっている。
従って、目的とする使用状況に対して最適な特性を示す生物活性タンパク質を同定することが、工業上の関心となっている。
このことは、長年、天然生物資源をスクリーニングするか、または、変異誘発を利用して行われてきた。例えば、洗剤中に用いる酵素の技術分野では、例えば天然のプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼの洗浄能及び／又は食器洗浄能が、それらの酵素のインビトロ改修によって有意に改良されてきた。
ほとんどの場合、これらの改良は、アミノ酸のタイプ、又は、成熟酵素の２次もしくは３次構造上の位置に基づいて選ばれた特異的なアミノ酸残基の置換、欠損又は挿入を誘導する部位特異的変異誘発によってなされてきた（例えば米国特許4,518,584参照）。
この様な方法で、新規なポリペプチド変異体、例えば、比活性、基質特異性、温度、pH及び塩に対する安定性、pH至適性、pI，Km，Vmaxなどの特性が変更された新規な酵素修飾体の調製が成功し、特性が改良されたポリペプチドが得られた。
例えば、酵素の技術分野では、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼなどの洗浄能及び／又は食器洗浄能が有意に改良された。
タンパク質及び酵素を改修するための別の一般的な方法は、例えばUS 4,894,331及びWO93／01285で開示されている様に、ランダム変異誘発に基づくものである。
改良された機能特性を有するポリペプチド変異体を得ることは、厄介であり、そして時間がかかるので、改修されたポリペプチドを早急に調製する少数の代替方法が、提唱されている。
Weber et al．，（1983），Nucleic Acids Research，vol.11，5661-5661には、２つの相同遺伝子間でインビボの組換えを行って遺伝子を改修する方法が記載されている。５′末端でアルファ１ヒトインターフェロンをコードするDNA配列、そして３′末端でアルファ２ヒトインターフェロンをコードするDNA配列によって挟まれた、プラスミドベクターを含有する直鎖状DNA配列を作成し、そして大腸菌のrecA陽性株に導入する。耐性マーカーを用いて、組換え体を同定し、そして単離する。
Pompon et al．，（1989），Gene 83，p．15-24には、哺乳動物のチトクロームＰ−450の遺伝子ドメインをシャッフリングする方法で、末端を埋め込んで平滑化した直鎖状プラスミド、及びこのプラスミドの末端部分に部分的に相同なDNA断片によってサッカロミセス・セレビシエを形質転換し、このサッカロミセス・セレビシエ内で部分的に相同な配列のインビトロ組換えを行わさせる前記方法が記載されている。
WO97／07205には、プラスミドDNAを鋳型として用いたインビボ組換えによって、相同DNA配列中の異なったヌクレオチド配列をシャッフリングして、ポリペプチド変異体を調製する方法が記載されている。
米国特許5,093,257（Genencor Int．Inc．）には、インビボ組換えによってハイブリッドポリペプチドを生産する方法が開示されている。ハイブリッドDNA配列は、複製のための配列、ハイブリッドポリペプチドのアミノ末端部分をコードする１つ目のDNA配列、そのハイブリッドポリペプチドのカルボキシ末端部分をコードする２つ目のDNA配列を含んでいる環状ベクターを形成することによって生産される。この環状ベクターを、この環状ベクターが増幅されるrecA陽性微生物に導入する。その結果、recA陽性微生物の天然の組換え機構によって、前記環状ベクターの組換えが起こる。前記微生物には、バチルス菌及び大腸菌などの原核生物、並びにサッカロミセス・セレビシエなどの真核生物が含まれる。
相同DNA配列をシャッフリングする方法がStemmerによって記載されている（Stemmer，（1994），Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．91，10747-10751; Stemmer，（1994），Nature，vol．370，389-391）。この方法では、インビトロPCR技術によって相同DNA配列をシャッフリングする。シャッフリングされたDNA配列を含んでいる陽性組換え遺伝子を、発現したタンパク質の改良された機能に基づいて、DNAライブラリーから選択する。
前記の方法は、WO95／22625にも記載されている。WO95／22625は、相同DNA配列をシャッフリングする方法に関する。WO95／22625で記載された方法における重要な過程は、相同な鋳型二本鎖ポリヌクレオチドを、希望するサイズのランダムな断片に切断してから、これらの断片を相同的に再集合させて、完全長の遺伝子にすることである。
WO95／22625の方法に固有な欠点は、当方法によって生成する多様性が、（WO95／22625中で規定された）用いられた相同遺伝子配列によって制限されることである。
WO95／22625の方法の別の欠点は、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドの切断によってランダムな断片を生産することにある。
注目する別の参考文献はWO95／17413であり、これには、特異的なDNA配列、いわゆるデザインエレメント（DE）を組換えることによって遺伝子又はDNAをシャッフリングする方法であって、合成した二本鎖断片又はPCRで生成した配列を組換えて、少くとも２つのデザインエレメントを含有するいわゆる機能エレメント（FE）を生産する前記方法が記載されている。WO95／17413に記載の方法では、組換えるための異なった配列間のハイブリダイゼーションが可能となるために十分な配列相同性を有するDNA配列を有するデザインエレメント間で、本組換えを行なわなければならない。
従って、WO95／17413の方法でも、生成する多様性が比較的に制限されるという欠点がある。さらに、この方法は、時間がかかり、費用がかかり、そして自動化するのに適していない。
前記の方法があるにもかかわらず、新規なポリペプチド変異体を調製するための、反復性のより良いインビボ組換え方法が求められている。この様な方法は、少容量で行うことができ、そして自動化しやすい方法であるべきでもある。
更に、比較的に低い相同性を有する遺伝子をシャッフリングできる可能性がある方法も必要とされている。
発明の要約
本発明は、多数の異なった出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型に由来する組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法に関し、この出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型は、15％未満から80％超までの幅広い範囲の相同性を有する、進化上又は合成の相同ペプチドをコードする遺伝子からなる群において別個の点を表し、前記の群では、少くとも１つの同定配列（identification sequence）が存在し、そしてこの方法では、前記遺伝子に遺伝子シャッフリング工程を施し、前記の出発材料の鋳型の遺伝子間に追加された別個の点を表す、前記群の遺伝子に由来するシャッフリングされた変異体を生成させる。
本発明に従って用いられるこの遺伝子シャッフリング方法は、任意の適当な方法、例えば前記の方法又は同日に提出され、同時に係属中の本発明者の特許出願に記載され、以下にその概略を記した方法でよい。
その方法では、インビトロDNA合成による新しく合成されたDNA鎖の鋳型シフトを用いて、DNAシャッフリングを達成する。
本発明の更に別の点は、同一の生物活性を有する天然のポリペプチドに比べて、改良された特性を呈するポリペプチドを同定する方法に関し、この方法では、前記方法によって作成した組換えポリヌクレオチドのライブラリーを、適当なベクターにクローン化し、次にこのベクターを、適切な宿主系に導入して、それらに対応するポリペプチドを発現させ、次に適当な検査によってそれらのポリペプチドをスクリーニングし、そして特性が改良されたものを選択する。
本発明の更に別の点は、前記の方法によって同定された注目するポリペプチドを生産する方法に関し、この方法では、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターで適切な宿主を形質転換し、この宿主を増殖させて、このポリペプチドを発現させ、そしてこのポリペプチドを回収及び精製する。
定義
本発明を詳細に説明する前に、以下の用語をまず定義する。
「シャッフリングする」：本明細書では、用語「シャッフリングする」とは、入力ポリヌクレオチド（すなわち出発点としてのポリヌクレオチド）に比べて、多数の交換されたヌクレオチド断片を有する出力ポリヌクレオチド（すなわちシャッフリング工程を経たポリヌクレオチド）を生成するために、２つ以上のポリヌクレオチド間でヌクレオチド配列断片を組み換えることを意味する。
「DNA配列又はポリヌクレオチドの相同性」：本明細書では、DNA配列の相同性の程度は、２つの配列間の同一の程度として決定され、１つ目の配列の２つ目の配列からの派生性を示す。この相同性は、当業界に周知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラム内にあるGAPを用いて適切に決定される（Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711）（Needleman，S.B．and Wunsch，C.D．，（1970），Journal of Molecular Biology 48，443-453）。
「相同の」：用語「相同の」とは、１つの一本鎖核酸配列が、相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズすることができることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、多数の因子、例えば配列間の同一性の程度並びにハイブリダイゼーション条件、例えば以下で検討する温度及び塩濃度に依存するだろう。
DNA配列比較のための以下の設定：GAP creation penalty 5.0及びGAP extension penalty 0.3にてコンピュータプログラムGAP（前出）を用いると、本明細書では、２つのDNA配列が、相互に、好ましくは少くとも70%、より好ましくは少くとも80％、そしてさらにより好ましくは少くとも85％の同一性を有する場合に、（以下に定義する低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズすることができると考えられる。
「非相同の」：２つ以上のDNA配列が、相互に、前記した値より小さな同一性の程度を示す場合、これらは、本明細書では、「非相同」であると言える。
「ハイブリダイゼーション」：２つ以上の注目するDNA配列がハイブリダイズするか否か決定するために適する実験条件を、本明細書では、以下に詳細に記載する様な低ストリンジェント条件でのハイブリダイゼーションとして定義する。
この様な条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子を、Ｘ線フィルムまたはホスホイメージャーで検出する。
「プライマー」：本明細書で、特にPCR反応に関連して用いられる用語「プライマー」は、当業界に既知の標準的な記載（“PCR Apractical approach”IRL Press（1991））に従って定義及び作成されるオリゴヌクレオチド（特に「PCRプライマー」）である。
「配列に対するプライマー」：用語「配列に対するプライマー」とは、注目する配列部分に対する配列同一性が少くとも80％、より好ましくは少くとも90％となる様に作成されたプライマー（好ましくはPCR反応に用いるもの）を意味し、このプライマーが「配列に対する」プライマーである。このプライマーは、与えられた温度で、このプライマーが対象とする領域に特異的にアニールする様に設計される。特に、このプライマーの３′末端部分の同一性は、ポリメラーゼの機能、すなわち、アニールしたプライマーを伸長するポリメラーゼ活性にとって必須である。
「フランキング」：本明細書では、PCR断片中に含まれるDNA配列に関連して、用語「フランキング」とは、PCR断片の５′及び３′の両末端部分に存在する最も外側の末端部分配列を意味する。
「ポリペプチド」：アミノ酸の重合体のことで、時にタンパク質と称される。アミノ酸の配列から、そのポリペプチドがとる折りたたみ立体構造が決定され、次にこの立体構造から、活性などの生物特性が決まる。ポリペプチドには、単一のポリペプチド鎖からなるもの（単量体）、そしていくつかのポリペプチドが結合したもの（多量体）が含まれる。全ての酵素及び抗体はポリペプチドである。
「酵素」：化学反応を触媒するタンパク質のこと。酵素の特定の型は、ａ）ヒドロラーゼ、例えばアミラーゼ、セルラーゼ及びその他のカルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、並びにリパーゼ、ｂ）オキシドレダクターゼ、ｃ）リガーゼ、ｄ）リアーゼ、ｅ）イソメラーゼ、ｆ）トランスフェラーゼなどである。本発明に関連して特に注目する酵素は、洗剤中に用いられる酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼなどである。
発明の詳細な説明
進化上の同一起源に由来するポリペプチドをコードする全の候補遺伝子は、非常に大きなDNA配列の群とみなされる（例えば、Gspはセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の組を示す）。この様な群中の単一構成体によってコードされるポリペプチド間の相同性は、15％未満ほどの低さでもよい（この様な遺伝子は、「遠位」の生物体に由来する）。
人間が開発した多様な目的に適するポリペプチドを探索する場合、現在の情報レベルで不可能でないとしても、問題とするポリペプチドの最適な立体構造に関して合理的な方法で結論を導くことは困難である。従って、前記の非常に大きな群の部分群で、その大きな群中で可能な多様性からなる実質的な部分を表す前記部分群を生成する簡単な方法が望まれていた。
従って、本発明の目的は、同一の機能性を有するが、低い相同性しか示さないポリペプチドをコードする遺伝子の構成要素をシャッフリングすることが可能となる方法を提供することである。
この目的のために、問題とする群に関する合理的な情報を得る必要があり、このことは、すなわち、自由に利用できる、できる限り高い多様性を示す多数の個別の構成体（例えば５，10，15またはそれ以上の構成体）を有していることを意味する。この小さい部分群を、遺伝子の非常により大きな部分群を生成するための出発点として使用する。次に、得られたこの大きな部分群に由来する対応するポリペプチドを適当な方法で表示及びスクリーニングして、目標とする目的のために最適な、前記の大きな部分群中の構成体を同定する。
出発点の部分群から、大きな部分群に拡張することは、遺伝子をシャッフリングする方法によって達成できることが判った。
前記文献に記載されているこの様な方法から、合理的に高い相同性、典型的には80％超の相同性を有するポリペプチドをコードする遺伝子間で、DNA断片を交換し、80％〜99％の相同性を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子を生成させる方法が提供される。
本発明の方法では、出発群中の少くとも１つの別の遺伝子に対して少くとも70％から80％までの相同性を示す、ポリペプチドをコードする遺伝子を用いることが、出発群として必要であることも判った。
本発明では、従って、かなり類似している遺伝子から、類似していないが、同一の進化起源（機能）をなお有する遺伝子までの範囲内の中間の配列を含んでいる、遺伝子群又は遺伝子サブセットから開始することが重要である。その後にのみ、さらにかなり非相同な配列をシャッフリングすることが可能である。最初のかなり相同な遺伝子を段階的にシャッフリングすることによって、出発群に含まれていない新しい種類のものが生成し、そして、続いて行うシャッフリングにおいて、これらを、相互に、及び出発群中の他のより非相同な遺伝子と組換える。
最後に、非常に非相同な出発の遺伝子に由来する配列部分を見いだすことができるハイブリットが生成する。これらの回収された出発遺伝子は、あまりに大きな「配列間隔」距離のために、出発群中の中間的種類を有することなしには、けっしてシャッフリングされなかったであろう。
この条件が満たされれば、出発群中で認められた最低の相同性と同程度に低い相同性を有する新規な機能性ポリペプチドをコードする遺伝子が生成される可能性があることが判った。原理的には、最終的な群の相同性の範囲は、出発群のものよりさらにより大きくてよい。
本発明の第１点は、多数の異なった出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型に由来する組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法に関し、この出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型は、15％未満から80％超までの幅広い範囲の相同性を有する、進化上又は合成の相同ペプチドをコードする遺伝子からなる群において別個の点を表し、前記の群では、少くとも１つの同定配列が存在し、そしてこの方法では、前記遺伝子に遺伝子シャッフリング工程を施し、前記の出発材料の鋳型の遺伝子間に追加された別個の点を表す、前記群の遺伝子に由来するシャッフリングされた変異体を生成させる。
本発明では、45％、40％、35％、30％、25％、20％又は15％未満から、80％、85％、90％、95％又は99％超までの範囲の相同性を示す親のDNA鋳型を用いることが可能である。
特定の態様では、少くとも１つの同定配列が認められ、そしてこれにアニールするプライマーが作られる。これらの配列は、当該遺伝子のどの位置にあってもよい。
好ましい態様では、少くとも２つの同定配列が認められる。これらの配列は、お互いに任意の距離に位置してよいが、当該遺伝子上でお互いにできるだけ離れて位置するのが好ましい。
これらの態様では、前記の同定配列は、出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型の集合体によってコードされるペプチド間で保存性の高い、４〜８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、５〜７個のアミノ酸残基からなる前記アミノ酸配列が好ましい。
これらの同定配列は、40％までの変動を有する前記集合体中の遺伝子の平均サイズに相当する距離ほど離れて位置するのが好ましい。前記配列が離れているほど、遺伝子の部分はより大きくシャッフリングされる。
しかし、互いにかなり接近して位置する同定配列間の配列をシャッフリングすることのみが望まれる状況も起こるだろう。
既に指摘した様に、本発明の方法において利用される遺伝子シャッフリング方法は、それほど、又は全く重要ではない。原理的には、いかなる方法も機能する。
従って、本発明では、WO95／22625及びWO95／17413に開示されている方法を操作することも完全にできる。本発明を実行するために、これらの方法をどの様にして利用するかということに関する詳細は、以下の実施例に記載している。
従って、同時に提出した特許出願に記載されている遺伝子シャッフリング方法も、本発明に利用されることが考えられる。
これらの方法の１つに従って、インビトロDNA合成による新しく合成されたDNA鎖の鋳型シフトを用いて、DNAのシャッフリングを達成する。
より詳しくは、その方法は、多数の異なった出発材料の一本鎖又は二本鎖の親のDNA鋳型、及びプライマーから、ポリメラーゼを用いるインビトロポリヌクレオチド合成中に誘発される鋳型シフトによるもので、組換え相同ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するために提供され、この方法では、
Ａ．以下の手順で伸長されたプライマー又はポリヌクレオチドを合成し；
ａ）親の二本鎖DNA鋳型を変性させて、一本鎖の鋳型を生成させ、
ｂ）前記プライマーを、前記一本鎖DNA鋳型にアニールさせ、
ｃ）前記ポリメラーゼを用いて合成を開始させて、前記プライマーを伸長させ、
ｄ）前記合成を停止させ、そして、
ｅ）生成した二本鎖を変性させて、前記の鋳型から、前記の伸長されたプライマーを分離し、
Ｂ．以下の手順で鋳型シフトを誘発し；
ａ）前記の鋳型から、新しく合成された一本鎖の伸長されたプライマーを分離し、そして、（Ａ）において生産された前記の伸長されたプライマーを、プライマーと鋳型の両方として用いて、Ａ．ｂ）からＡ．ｅ）までの過程を繰り返すか、または、
ｂ）Ａ．ｂ）からＡ．ｅ）までの過程を繰り返し、
Ｃ．前記の工程を、過程Ａ．及びＢ．ａ）、過程Ａ．及びＢ．ｂ）、又はこれらの組み合せの過程を適当な回数繰り返した後に、停止させ、並びに、
Ｄ．場合によっては、前記の生成したポリヌクレオチドを、注目するポリヌクレオチドを選択的に増幅する特異的プライマーを用いた標準的なPCR反応において増幅する。
別の特定の態様では、同時に提出した本発明者の出願に記載された方法で、遺伝子のシャッフリングを実行する。この方法では、以下の過程を含んでいて、少くとも１つの保存領域を有する注目する非相同DNA配列をシャッフリングするために、非相同DNA配列の保存領域を同定する：
ｉ）２つ以上の非相同配列において、１つ以上の保存領域（“Ａ，Ｂ，Ｃ”などと記す）を同定すること；
ii）ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のための２組のPCRプライマー（各組は、センス及びアンチセンスプライマーを含む）を作成すること、
ただし、これらのプライマーの１つ目の組は（「ａ」センスプライマー；「ａ′」アンチセンスプライマー」）、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の５′配列領域に対するものであり、そして２つ目の組は（「ｂ」センスプライマー；「ｂ′」アンチセンスプライマー」）、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の３′配列領域に対するものであり、前記アンチセンスプライマー「ａ′」及びセンスプライマー「ｂ」は、保存領域内に少くとも10塩基対（bp）の相同な配列重複を有し、
iii）過程ｉ）において同定された注目する１つ以上の保存領域のために、過程ｉ）の非相同DNA配列を鋳型として、２回のPCR増幅反応を行うこと、ただし、
そのPCR反応の１つでは、過程ii）において決定した５′プライマー組（例えば「ａ」、「ａ′」）を使用し、そして２つ目のPCR反応では、過程ii）において決定した３′プライマー組（例えば「ｂ」、「ｂ′」）を使用し、
iv）過程ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のために、過程iii）で記載した様に作成したPCR断片を単離すること、
ｖ）過程iv）で単離した２つ以上のPCR断片を混合し、そしてこれらの単離したPCR断片を鋳型として用いて、配列重複伸長PCR反応（SOE−PCR）を行うこと、並びに、
vi）過程ｖ）で得られたPCR断片を単離すること、ただし、この単離したPCR断片は、過程iv）で単離したPCR断片からシャッフリングされた混合物を含んでいる多数の異なったシャッフリングされた配列を含んでいる。
特定の態様では、本発明の方法に対して様々な改修を行うことができる。例えば、欠点のあるポリメラーゼ、例えば、鋳型に対して変異を導入する様な誤りがちなポリメラーゼ、または反応停止を介して、ポリヌクレオチド合成を途中で停止させるポリメラーゼを利用することが有益である。
特定の態様では、当該ペプチドは、プロテアーゼ、特にスブチラーゼである。
スプチラーゼの場合、同定配列は、スブチリシンBPN’の配列位置32のアスパラギン酸、または位置64のヒスチジン及び位置221の活性セリンの周辺に位置してよい。
別の態様では、当該ペプチドは、アミラーゼ、特にα−アミラーゼである。
この場合、同定配列は、B．licheniformisのα−アミラーゼの配列位置100のAsp及び位置328のAspの周辺に位置してよい。
バチルス菌種由来のα−アミラーゼの場合、同定配列は、好ましくは、配列位置８のTyr及び位置476のSerの周辺に位置してよい。
別の態様では、当該ペプチドは、リパーゼまたはセルラーゼである。
リパーゼの場合、適当な同定配列は、A．Svendsen et al．，（1995）: Biochemical properties of cloned lipases from the Pseudomonas family，Biochimica et Biophysica Acta 1259，9-17に示されたリパーゼの整列を利用して、見い出すことができる。例えば、これは、（P．glumaeリパーゼのアミノ酸位置で）位置10のPro又は位置285のHisの周辺でよい。
セルラーゼの場合、特に、ファミリー45セルラーゼ由来のセルラーゼ（WO96／29397参照）では、適当な同定配列は、保存領域「Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro/Thr」及び保存領域「Trp Arg Phe/Tyr Asp Trp Phe」でよい。これらのセルラーゼの同定配列に関する詳細は、PCT／DK97／00216を参照する。特にPCT／DK97／00216の実施例３を参照する。
キシラナーゼの場合、特にファミリー11キシラナーゼ由来のキシラナーゼでは、適当な同定配列は、保存領域「DGGTYDIY」及び「EGYQSSG」でよい。これらのキシラナーゼの同定配列に関する詳細は、PCT／DK97／00216を参照する。特にPCT／DK97／00216の実施例１，２を参照する。
PCRプライマー
当該PCRプライマーを、当業界の標準的な記載に従って作成する。標準的には、これらの長さは10−75塩基対（bp）である。しかし、ランダム又はセミランダムプライマーを用いる特定の態様では、その長さは、前記よりも実質的に長くてよい。
PCR反応
特に言及しない場合、本発明で行うPCR反応は、当業界に既知の標準的な方法で行う。
用語「PCR断片の単離」とは、単純にPCR断片を含んでいる分画というほどの広い範囲を含んで意味する。しかし、好ましくは、PCR断片を、余ったプライマー、ヌクレオチド、鋳型などが取り除かれた程度にまで単離する。
本発明の態様では、このDNA断片を、低、中または高頻度にランダム突然変異を生じさせる条件下で調製する。
低頻度の突然変異を得るために、（DNA断片を含んでいる）DNA配列を、標準的なPCR増幅方法（US 4,683,202またはSaiki et al．，（1988），Science 239 487-491）に従って調製することができる。
中または高頻度の突然変異は、ヌクレオチドの誤った組込みを増加させる条件下でPCR増幅を行うことによって、例えば、Deshler，（1992），GATA 9（4），103-106; Leung et al．，（1989），Technique，vol．1，No.11-15の記載通りに行うことによって達成される。
本発明では、PCR増幅を、適当な物理的又は化学的変異誘発剤を用いた変異誘発過程、例えば、転位、転換、逆位、スクランブリング、欠損、及び／又は挿入を起こす変異と組み合わせることも考えられる。
組換えシャッフリング配列からの組換えタンパク質の発現
本発明の第２点目及び３点目の過程におけるシャッフリングされた配列によってコードされる組換えタンパク質の発現を、当業界に既知の標準的な発現ベクター及びそれに対応する発現系を用いて行うことができる。
スクリーニング及び選択
本明細書では、用語「陽性のポリペプチド変異体」とは、対応する入力DNA配列から生産されるポリペプチドに対して改良された機能特性を有する様に作られたポリペプチド変異体を意味する。この様な改良された特性の例は、例えば亢進又は低下した生物活性、亢進した洗浄能、温度安定性、酸化安定性、基質特異性、抗生物質耐性などの様に多様である。
従って、陽性の変異体を同定するために用いるスクリーニング方法は、変化が望まれる問題とするポリペプチドの特性、及び望ましい変化の方向に依存する。
希望する生物活性をスクリーニング又は選択する多数の適当なスクリーニング又は選択システムが当業界で報告されている。例えば、Strauberg et al．，Biotechnology 13: 669-673（1995）には、カルシウム非依存的な安定性を有するスブチリシン変異体をスクリーニングするシステムが記載されていて；Bryan et al．，Proteins 1: 326-334（1986）には、強化された温度安定性を有するプロテアーゼをスクリーニングするシステムが記載されていて；そしてPCT／DK96／00322には、洗剤中で強化された洗浄能有するリパーゼをスクリーニングするシステムが記載されている。
本発明の態様には、希望する生物活性が、食器洗浄または衣類洗浄用洗剤における性能である組換えタンパク質をスクリーニング又は選択することが含まれる。適当な食器洗浄用又は衣類洗浄用洗剤の例が、PCT／DK96／00322及びWO95／30011に開示されている。
当該ポリペプチドの改良された機能特性が、１回のシャッフリング工程後に十分に良くない場合、このポリペプチドに、もう１回当工程を施すことができる。
本発明の態様では、同一遺伝子の多数の変異を有するポリヌクレオチドを鋳型として用いる場合、少くとも１回のシャッフリング工程は、野生型DNA断片でもよい最初に用いたDNA断片を用いたバッククロスする工程である。これによって、本質的でない変異が除かれる。最初に用いる入力DNA材料として野生型DNA断片を用いることによっても、本質的でない変異を除くことができる。
更に本発明で考えられる生物活性を有するポリペプチドは、例えば、インスリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、パラチロイドホルモン、下垂体ホルモン、ソマトメジン、エリトロポエチン、黄体形成ホルモン、絨毛膜性ゴナドトロピン、視床下部の放出ホルモン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リラクシン、インターフェロン、トロンボポエチン（TPO）及びプロラクチンである。
本発明では、前記の様にして、異なった属の野生型生物体に由来する親のポリヌクレオチドをシャッフリングすることも考えられる。
この出発材料の親のDNA配列は、任意のDNA配列でよく、例えば、野生型DNA配列、変異体（variauts or mutants）をコードするDNA配列、又はそれらの修飾体、例えば拡張された又は伸長されたDNA配列でよく、そして、本発明の方法又は他の任意の方法（例えば、従来技術の章で記載された任意の方法）に従って１回以上のシャッフリング工程を経た結果のDNA配列（すなわち出力DNA配列）、あるいは合成配列又はその他の方法で変異誘発された配列でもよい。
本発明の方法を用いた場合、組換えられた生成ポリヌクレオチド（すなわちシャッフリングされたDNA配列）では、多数のヌクレオチド断片が交換された。これによって、親のポリペプチドと比較して、当ポリペプチド変異体内で少くとも１つのアミノ酸の置換が達成される。表現上無変化の（silent）交換（すなわちアミノ酸配列が変化しないヌクレオチド交換）も考えられる。
材料と方法
実施例
実施例１
細菌宿主に由来する進化上の相同体の集合体／群のシャッフリング
この実施例では、WO95／22625に記載の方法と類似した遺伝子シャッフリング方法を用いる。
スブチラーゼをコードする遺伝子又はその様な遺伝子の部分を含んでなる群を、単離又は合成を介して生成させる。これらの遺伝子の源は、Siezen et al．，Protein Engineering 4，1991，719-737に記載されている通りでよい。当群は、GenBankのA13050_1，D26542，A22550，Swiss-ProtのSUBT_BACAM P00782、そしてPD498（特許出願WO96／34963で指定されるプレプロスブチラーゼをコードする遺伝子を含んでいるものでもよく、これらの相同性（類似性）は、Clustal Methodを利用したMegAlignソフトウェア（DNASTAR Inc．，WI 53715，USA）で計算した場合、32％〜64％の範囲となった。
このシャッフリング反応に用いる基質は、シャッフリングしようとする当該DNA末端部分に対する／位置するプライマーを用いたPCR増幅によって生成される直鎖状二本鎖DNAで代表される。この実施例では、スブチリシンBPN’のアミノ酸位置64のヒスチジン及び位置221のセリンの周辺の配列を用いて、前記プライマーを簡単に作成することができる。このPCRの鋳型は、クローン化されたプロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミド又は細菌体、例えば土壌から単離されたプロテアーゼを分泌する細菌から抽出した染色体DNAであってよい。この基質は、典型的には、全ての鋳型に対して別個に生成され、そしてシャッフリング反応前に集められる。
これらの基質を、WO95／22625の記載の様に、DNase I処理または超音波による分断によって断片化する。生成した断片を、アガロースゲル電気泳動によって大きさに応じて分離し、そして希望する大きさ、例えば10〜50bp、又は30〜100bp、又は50〜150bp、又は100〜200bpの生成断片をそのゲルから精製する。
これらの断片を、WO95／22625の記載の通りにPCRによって再集合させる。場合によっては、適切に集められたDNA断片を、この適切に集められた断片の末端部分にアニールする２つのプライマーを用いた別のPCRを、前記再集合反応からの生成物に施すことによって増幅する。生成した断片を、適当な発現プラスミドにクローン化し、そして当業界に周知の方法によって特異的な特性、例えば温度安定性に対するスクリーニングを行うことができる。
Claims (14)
- 機能的に類似する酵素をコードする組換えポリヌクレオチドの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）機能的に類似する酵素をコードするポリヌクレオチドの出発集団を用意し、ここで、当該集団は、45％未満の配列同一性をもつ少なくとも２つの上記ポリヌクレオチドを含み、かつ、ここで、当該集団の各ポリヌクレオチドは、当該集団の少なくとも１の他のポリヌクレオチドに対し少なくとも70％同一であり；
（ｂ）組換えポリヌクレオチドが、少なくとも70％の配列同一性をもつ親ポリヌクレオチドから作製されることを可能にする条件下で、上記集団をシャッフリングし、ここで、機能的に類似する酵素をコードする組換えポリヌクレオチドが作製される；
を含む前記方法。 - 前記ステップ（ｂ）が、１回以上のその後のシャッフリング・ラウンドにおいて繰り返される、請求項１に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）において作製された組換えポリヌクレオチドをベクターにクローニングし、宿主細胞を形質転換させ、そして当該組換えポリヌクレオチドを発現させるステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 着目の非組換え酵素に比較して、望ましく変更された特性を示す着目の組換え酵素を取得するために、前記発現された酵素をスクリーニングするステップ（ｄ）をさらに含む、請求項３に記載の方法。
- １以上の保存された領域が、前記ステップ（ａ）の集団に含まれる少なくとも２つのポリヌクレオチド内に同定され、かつ、前記ステップ（ｂ）が、上記保存された領域に向けられた少なくとも１のPCRプライマー・セットを用いて実行される、請求項１に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、プロテアーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、スブチリシン又はスブチラーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、アミラーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、α−アミラーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、リパーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、セルラーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、ファミリー45セルラーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、キシラナーゼである、請求項４に記載の方法。
- 前記着目の酵素が、ファミリー11キシラナーゼである、請求項４に記載の方法。
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