EA009291B1 - Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз - Google Patents
Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз Download PDFInfo
- Publication number
- EA009291B1 EA009291B1 EA200501700A EA200501700A EA009291B1 EA 009291 B1 EA009291 B1 EA 009291B1 EA 200501700 A EA200501700 A EA 200501700A EA 200501700 A EA200501700 A EA 200501700A EA 009291 B1 EA009291 B1 EA 009291B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- activity
- impaired
- cells
- acid
- substrate
- Prior art date
Links
- 239000012636 effector Substances 0.000 title claims abstract description 73
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims description 33
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 title description 30
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 title description 14
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 title description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 130
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 114
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 75
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 65
- 102000003642 glutaminyl-peptide cyclotransferase Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010081484 glutaminyl-peptide cyclotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 124
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 95
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 81
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 73
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 58
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 33
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 32
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 29
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 29
- -1 5-oxoprolyl) residues Chemical group 0.000 claims description 28
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 26
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 24
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 24
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 24
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 claims description 23
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 claims description 23
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 20
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 claims description 20
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 20
- PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N neurotensin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N 0.000 claims description 20
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 102400001103 Neurotensin Human genes 0.000 claims description 19
- 101800001814 Neurotensin Proteins 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 claims description 15
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 14
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 14
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 14
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 10
- 102000002512 Orexin Human genes 0.000 claims description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 10
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 10
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 10
- 108060005714 orexin Proteins 0.000 claims description 10
- 210000001711 oxyntic cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 9
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 9
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 claims description 9
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims description 9
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 claims description 9
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 claims description 9
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 9
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 8
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- OFNHNCAUVYOTPM-IIIOAANCSA-N orexin-a Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)CSSC1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CNC=N1 OFNHNCAUVYOTPM-IIIOAANCSA-N 0.000 claims description 8
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 claims description 8
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 7
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 7
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 claims description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000022925 sleep disturbance Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 claims description 6
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 claims description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000037424 autonomic function Effects 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- OKGNKPYIPKMGLR-ZPCKCTIPSA-N gastrins Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CN=CN1 OKGNKPYIPKMGLR-ZPCKCTIPSA-N 0.000 claims description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 3
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940097396 Aminopeptidase inhibitor Drugs 0.000 claims 3
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 2
- 210000003550 mucous cell Anatomy 0.000 claims 2
- 101710141938 Single-stranded DNA-binding protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 84
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 52
- 241000219173 Carica Species 0.000 description 49
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 49
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 32
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 31
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 27
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 17
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- WJJMNDUMQPNECX-UHFFFAOYSA-N dipicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=N1 WJJMNDUMQPNECX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N tetrahydropyrrole Substances C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 14
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 10
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 10
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 9
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 8
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 8
- 229940079865 intestinal antiinfectives imidazole derivative Drugs 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 7
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 7
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 7
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 7
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 7
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 7
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 7
- 238000003402 intramolecular cyclocondensation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 7
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 6
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 5
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101001129465 Homo sapiens Pyroglutamyl-peptidase 1 Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100031108 Pyroglutamyl-peptidase 1 Human genes 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 5
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical compound C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102400000336 Thyrotropin-releasing hormone Human genes 0.000 description 4
- 101800004623 Thyrotropin-releasing hormone Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 101800000285 Big gastrin Proteins 0.000 description 3
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 3
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 3
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 3
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 3
- 239000000627 Thyrotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 3
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical class NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 3
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003164 beta-aspartyl group Chemical group 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 3
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 2
- ARNUPLMOASAEAN-ASLNEKEESA-N (2s,3s)-2-amino-3-methyl-1-(1,3-thiazolidin-2-yl)pentan-1-one Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)C1NCCS1 ARNUPLMOASAEAN-ASLNEKEESA-N 0.000 description 2
- JFMNKDRNEZZRBW-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxamide Chemical class C1=CC=C2CNC(C(=O)N)CC2=C1 JFMNKDRNEZZRBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKGHUXJLDXCNGS-UHFFFAOYSA-N 1-cyclopropylpyrrolidine Chemical class C1CC1N1CCCC1 OKGHUXJLDXCNGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSSNTDFYBPYIEC-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylimidazole Chemical compound C=CN1C=CN=C1 OSSNTDFYBPYIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEULWJSKCVACTH-UHFFFAOYSA-N 1-phenylimidazole Chemical compound C1=NC=CN1C1=CC=CC=C1 SEULWJSKCVACTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWYUFVNJZUSCSM-UHFFFAOYSA-N 2-aminobenzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC(N)=NC2=C1 JWYUFVNJZUSCSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 2
- 101150054177 Acot8 gene Proteins 0.000 description 2
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 2
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- UFIMPKKWQWTOEN-UHFFFAOYSA-N C1=CC(OC=C1)(C#N)O Chemical class C1=CC(OC=C1)(C#N)O UFIMPKKWQWTOEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 229940124213 Dipeptidyl peptidase 4 (DPP IV) inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102100029846 Glutaminyl-peptide cyclotransferase Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000585315 Homo sapiens Glutaminyl-peptide cyclotransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N Ile(5)-angiotensin II Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 2
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003603 dipeptidyl peptidase IV inhibitor Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- ACJOYTKWHPEIHW-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-phenylprop-2-ynoate Chemical compound CCOC(=O)C#CC1=CC=CC=C1 ACJOYTKWHPEIHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 2
- 125000002962 imidazol-1-yl group Chemical group [*]N1C([H])=NC([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003951 lactams Chemical group 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 2
- IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N levobunolol Chemical compound O=C1CCCC2=C1C=CC=C2OC[C@@H](O)CNC(C)(C)C IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- RZIMNEGTIDYAGZ-HNSJZBNRSA-N pro-gastrin Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 RZIMNEGTIDYAGZ-HNSJZBNRSA-N 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- NGHKPFDSWWVQRM-UHFFFAOYSA-N (1-cyclopentyl-3-methyl-1-oxobutan-2-yl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC(C)C([NH3+])C(=O)C1CCCC1 NGHKPFDSWWVQRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJFDQNDYQVFWKP-UHFFFAOYSA-N (17-acetyl-10,13-dimethyl-6,16-dimethylidene-3-oxo-2,7,8,9,11,12,14,15-octahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) acetate Chemical compound C1C(=C)C2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CC(=C)C(OC(=O)C)(C(C)=O)C1(C)CC2 WJFDQNDYQVFWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVBVTDXOGUNDHC-LURJTMIESA-N (2s)-2-amino-1-pyrrolidin-1-ylpropan-1-one Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCCC1 IVBVTDXOGUNDHC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UMMQVDUMUMBTAV-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 UMMQVDUMUMBTAV-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- XOYSDPUJMJWCBH-VKHMYHEASA-N (3s)-3,5-diamino-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)CC(O)=O XOYSDPUJMJWCBH-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IDNSGZOFDGAHTI-BYPYZUCNSA-N (3s)-3,6-diamino-6-oxohexanoic acid Chemical group OC(=O)C[C@@H](N)CCC(N)=O IDNSGZOFDGAHTI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N (3s)-3-aminopiperidine-2,6-dione Chemical class N[C@H]1CCC(=O)NC1=O NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FAAZAHIRCXGFFM-ZETCQYMHSA-N (4s)-4-amino-5-oxo-5-pyrrolidin-1-ylpentanamide Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCCC1 FAAZAHIRCXGFFM-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- AXJZCJSXNZZMDU-UHFFFAOYSA-N (5-methyl-1h-imidazol-4-yl)methanol Chemical compound CC=1N=CNC=1CO AXJZCJSXNZZMDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAADPEJYEZPFOT-UHFFFAOYSA-N 1-(1h-imidazol-2-yl)propan-1-amine Chemical compound CCC(N)C1=NC=CN1 IAADPEJYEZPFOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKKDZZRICRFGSD-UHFFFAOYSA-N 1-benzylimidazole Chemical compound C1=CN=CN1CC1=CC=CC=C1 KKKDZZRICRFGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXQAPNSHUJORMC-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-4-propylbenzene Chemical compound CCCC1=CC=C(Cl)C=C1 QXQAPNSHUJORMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAXWTHPUJQUILB-UHFFFAOYSA-N 1h-benzimidazole;1h-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1.C1=CC=C2NC=NC2=C1 LAXWTHPUJQUILB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-4,5-dicarbonitrile Chemical compound N#CC=1N=CNC=1C#N XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWBQWRPBMAMRKN-UHFFFAOYSA-N 2-(1-aminocyclohexyl)-1-cyclopentylethanone Chemical compound C1CCCC1C(=O)CC1(N)CCCCC1 ZWBQWRPBMAMRKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UVOCKSMHKPRDMY-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylphenyl)methyl]-1h-imidazole Chemical compound CC1=CC=CC=C1CC1=NC=CN1 UVOCKSMHKPRDMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDOGNMDURIJYQC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-6-methyl-1h-pteridin-4-one Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=NC(C)=CN=C21 UDOGNMDURIJYQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYPSHJCKSDNETA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1h-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC(Cl)=NC2=C1 AYPSHJCKSDNETA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYAYIUGCUKYFGY-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-1-(2-hydroxyphenyl)ethanone Chemical compound OCC(=O)C1=CC=CC=C1O IYAYIUGCUKYFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDZYRENCLPUXAX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1h-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC(C)=NC2=C1 LDZYRENCLPUXAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 2-naphthylamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC=C21 JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- IMPHTMIOYCILIV-UHFFFAOYSA-N 3-(3-imidazol-1-ylpropyl)-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical compound O=C1CNC(=S)N1CCCN1C=NC=C1 IMPHTMIOYCILIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNEOHNUYPRAJMX-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-[[2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-[[1-(butoxycarbonylamino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(=O)OCCCC)CC1=CC=CC=C1 VNEOHNUYPRAJMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPHGOBGXZQKCKI-UHFFFAOYSA-N 4,5-diphenyl-1h-imidazole Chemical compound N1C=NC(C=2C=CC=CC=2)=C1C1=CC=CC=C1 CPHGOBGXZQKCKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXISNRUOUSNUDX-UHFFFAOYSA-N 4-[(3-methylimidazol-4-yl)methyl]-3-propyloxolan-2-one Chemical compound C1OC(=O)C(CCC)C1CC1=CN=CN1C HXISNRUOUSNUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- ULKLGIFJWFIQFF-UHFFFAOYSA-N 5K8XI641G3 Chemical compound CCC1=NC=C(C)N1 ULKLGIFJWFIQFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027936 Attractin Human genes 0.000 description 1
- 101710134735 Attractin Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 1
- 102100023700 C-C motif chemokine 16 Human genes 0.000 description 1
- 102100023701 C-C motif chemokine 18 Human genes 0.000 description 1
- 101710112526 C-C motif chemokine 18 Proteins 0.000 description 1
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241000207062 Candidatus Hepatobacter Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014464 Chemokine CX3CL1 Human genes 0.000 description 1
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010089448 Cholecystokinin B Receptor Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100484977 Danio rerio waca gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 1
- 102000004860 Dipeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090001081 Dipeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100020751 Dipeptidyl peptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000647977 Escherichia coli (strain K12) Alkanesulfonate monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 102000009165 Gonadoliberin Human genes 0.000 description 1
- 108050000048 Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000894895 Homo sapiens Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000978375 Homo sapiens C-C motif chemokine 16 Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000967820 Homo sapiens Inactive dipeptidyl peptidase 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000606465 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000642815 Homo sapiens Protein SSXT Proteins 0.000 description 1
- 101000629913 Homo sapiens Translocon-associated protein subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101100222815 Hordeum vulgare EPB2 gene Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100040449 Inactive dipeptidyl peptidase 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039813 Inactive tyrosine-protein kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LCGISIDBXHGCDW-VKHMYHEASA-N L-glutamine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O LCGISIDBXHGCDW-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 1
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- RJUFJBKOKNCXHH-UHFFFAOYSA-N Methyl propionate Chemical compound CCC(=O)OC RJUFJBKOKNCXHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- AWZVYNHQGTZJIH-UHFFFAOYSA-N N-Nitrosomethylvinylamine Chemical compound C=CN(C)N=O AWZVYNHQGTZJIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDGQXGPQOGUGIX-VIFPVBQESA-N O-BENZYL-l-SERINE Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COCC1=CC=CC=C1 IDGQXGPQOGUGIX-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoserine Chemical compound OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000316914 Prococcus Species 0.000 description 1
- 102100035586 Protein SSXT Human genes 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000000066 S-methyl group Chemical group [H]C([H])([H])S* 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000662518 Solanum tuberosum Sucrose synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102100026229 Translocon-associated protein subunit beta Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000030120 acrosome reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 229940045714 alkyl sulfonate alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- XXXHSQBVHSJQKS-UHFFFAOYSA-N amino benzoate Chemical compound NOC(=O)C1=CC=CC=C1 XXXHSQBVHSJQKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940058303 antinematodal benzimidazole derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 239000003693 atypical antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127236 atypical antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001556 benzimidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N cyclohexylsulfamic acid Chemical compound OS(=O)(=O)NC1CCCCC1 HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSURFXBOHQPUPW-UHFFFAOYSA-N cyclopentyl(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-2-ium-3-yl)methanone;chloride Chemical compound [Cl-].C1C2=CC=CC=C2C[NH2+]C1C(=O)C1CCCC1 CSURFXBOHQPUPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- BDYYDXJSHYEDGB-UHFFFAOYSA-N diloxanide furoate Chemical compound C1=CC(N(C(=O)C(Cl)Cl)C)=CC=C1OC(=O)C1=CC=CO1 BDYYDXJSHYEDGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003497 diloxanide furoate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108090000212 dipeptidyl peptidase II Proteins 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002367 endolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L fumarate(2-) Chemical class [O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009760 functional impairment Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 108010066264 gastrin 17 Proteins 0.000 description 1
- GKDWRERMBNGKCZ-RNXBIMIWSA-N gastrin-17 Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 GKDWRERMBNGKCZ-RNXBIMIWSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009688 glial response Effects 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004116 glycogenolysis Effects 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical group [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- JEGIFBGJZPYMJS-UHFFFAOYSA-N imidazol-1-yl(phenyl)methanone Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)C1=CC=CC=C1 JEGIFBGJZPYMJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001055 magnesium Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5 Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003039 myelosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C21 KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 108010054321 proneurotensin Proteins 0.000 description 1
- UFUASNAHBMBJIX-UHFFFAOYSA-N propan-1-one Chemical compound CC[C]=O UFUASNAHBMBJIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000016160 smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4164—1,3-Diazoles
- A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4164—1,3-Diazoles
- A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4164—1,3-Diazoles
- A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/4192—1,2,3-Triazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
- C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
- C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
- C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
- C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
- C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
- C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
- C07D409/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07F9/572—Five-membered rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07F9/576—Six-membered rings
- C07F9/59—Hydrogenated pyridine rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- C07F9/6503—Five-membered rings
- C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Obesity (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
Abstract
В изобретении описаны новые физиологические субстраты глутаминилциклазы млекопитающих (QC, КФ 2.3.2.5), новые эффекторы QC, способы скрининга таких эффекторов и применение указанных эффекторов и фармацевтических композиций, содержащих такие эффекторы, для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC. Предпочтительные композиции дополнительно содержат ингибиторы DP IV или подобных DP IV ферментов для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC и DP IV.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к глутаминилциклазе (ОС. КФ 2.3.2.5), которая катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, рО1и*) с выделением в свободном состоянии аммиака и внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамата с образованием пироглутаминовой кислоты с выделением в свободном состоянии воды.
При создании настоящего изобретения были идентифицированы ОС млекопитающих в качестве металлоферментов, выявлены новые физиологические субстраты ОС в организме млекопитающих и разработаны пути применения эффекторов ОС и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы ОС. для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции ОС-активности. Кроме того, установлено, что взаимодействие с металлом является важным подходом для создания ингибиторов ОС.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов ОС-активности в сочетании с ингибиторами ΌΡ IV (дипептидилпептидаза IV) или ΌΡ ΐν-подобных ферментов для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС и/или ΌΡ IV.
Предложен также способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС-активности.
Предпосылки создания изобретения
Глутаминилциклаза (ОС, КФ 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, рО1и*) с выделением в свободном состоянии аммиака. ОС впервые была выделена Меззег из латекса тропического растения Сапса рарауа в 1963г. (Меззег М. №Шге 4874, 1963, с. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (ВизЬу Л.Н.1. и др. 1. Βίο1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536; Изсйет XV. Н. и 8р1езз 1. Ргос. №Й. Асаб. 8с1. И8А 84, 1987, сс. 3628-3632). Для ОС млекопитающих превращение О1п в рО1и с помощью ОС было обнаружено для предшественников ТКН (тиреолиберин) и ОпКН (гонадолиберин) (ВизЬу Л.Н.1. и др. 1. Βίο1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536; Изсйет Л.Н. и 8р1езз 1. Ргос. №11. Асаб. 8ст И8А 84, 1987, сс. 3628-3632). Кроме того, предварительные эксперименты по выявлению локализации ОС позволили выявить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее функции в синтезе пептидных гормонов (Воскегз Т.М. и др. 1. №игоепбосгшо1. 7, 1995, сс. 445-453). В противоположность этому, физиологическая функция растительной ОС все еще остается неясной. Предполагается, что фермент из С. рарауа играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (Е1 Моиззаош А. и др. Се11 Мо1. Ь1Ге 8с1. 58, 2001, сс. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые ОС из других растений (ЭаЫ 8.XV. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 20, 2000, сс. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной.
Известные выделенные из растений и животных ОС обладают строгой специфичностью в отношении Ь-глутамина в Ν-концевом положении субстратов, и установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментена (Рой1 Т. и др., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 88, 1991, сс. 10059-10063; Сопзако А.Р. и др., Апа1. Вюсйет. 175, 1988, сс. 131-138; Со1о1оЬоу М.У. и др., Вю1. Сйет. Норре. 8еу1ег. 377, 1996, сс. 395-398). Однако сравнение первичной структуры ОС из С. рарауа и высококонсервативных ОС млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей (Эай1 8.Л. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 20, 2000, сс. 27-36). В то время, как растительные ОС, вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов (ЭаЫ 8.Л. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 20, 2000, сс. 27-36), установлено, что ОС млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Ва1етап К.С. и др., Вюсйет1з1ту 40, 2001, сс. 11246-11250), что позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении ОС из растений и животных.
В ЕР 02011349.4 описаны полинуклеотиды, кодирующие глутаминилциклазу насекомых, а также кодируемые ими полипептиды. В этой заявке описаны также клетки-хозяева, которые содержат экспрессионные векторы, несущие полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. Выделенные полипептиды и клетки-хозяева, содержащие ОС насекомых, применяют в методах скрининга агентов, которые снижают глутаминилциклазную активность. Установлено, что такие агенты можно применять в качестве пестицидов.
Болезнь Альцгеймера (АБ) характеризуется аномальным накоплением внеклеточных амилоидных бляшек, непосредственно связанных с дистрофичными нейронами, реактивными астроцитами и микроглией (Теггу Β.Ό. и Ка1/тап К., Апп. №иго1. 14, 1983, сс. 497-506; О1еппет О.О. и Лопд С.Л., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Сотт. 120, 1984, сс. 885-890; 1п1адак1 8. и др. 1. №иго1ттипо1. 24, 1989, сс. 173-182; Еипа1о Н. и др., Ат. 1. Ра1йо1. 152, 1998, сс. 983-992; 8е1кое Ό.Ι., Рйузю1. Неу. 81, 2001, сс. 741-766). Амилоид-βпептиды (Λβ-пептиды) являются основными компонентами старческих бляшек, и считается, что они непосредственно участвуют с патогенезе и развитии АБ, эта гипотеза подтверждается генетическими исследованиями (О1епиег О.О. и Лопд С.Л., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Сотт. 120, 1984, сс. 885-890; Вогсйе11 Ό.Β. и др., №игоп. 17, 1996, сс. 1005-1013; Ьетете С. А. и др., №1. Меб. 2, 1996, сс. 1146-1150; Мапп О.М. и 1теа1зиЬо Т. №итобедепега1юп 5, 1996, сс. 115-120; Сйтоп М. и др., №1. Меб. 3, 1997, сс. 67-72; 8е1кое Ό.Ι., Рйузю1. Неу. 81, 2001, сс. 741-766 ). Ав образуется в результате протеолитического процессинга βамилоидного белка-предшественника (АРР) (Капд, 1. и др., №1ите 325, 1987, сс. 733-736; 8е1кое Ό.Ι.,
- 1 009291
Тгепбз Се11 ΒιοΙ. 8, 1998, сс. 447-453), который последовательно расщепляется β-секретазой на Ν-конце и γ-секретазой на С-конце Αβ (Наазз С. и 8е1кое Ό.Ι., Се11 75, 1993, сс. 1039-1042; 81топз М. и др., 1. №итозс1. 16, 1996, сс. 899-908). Помимо доминирующих Ав-пептидов, у которых на Ν-конце находится Ь-Азр (Ав 1-42/40), в старческих бляшках присутствует множество гетерогенных укороченных на Ν-конце форм. Установлено, что такие укороченные пептиды обладают более высокой нейротоксичностью ίη νίίτο и у них существенно быстрее происходит агрегация по сравнению с полноразмерными изоформами (Р1ке С.1. и др., 1. Βίο1. СЬет. 270, 1995, сс. 23895-23898). Известно, что у пациентов на ранней стадии семейной АБ (СБА) происходит сверхпроизводство укороченных на Ν-конце пептидов (8а1бо Т.С. и др., №итоп. 14, 1995, сс. 457-466; Виззо С. и др., №1Шге 405, 2000, сс. 531-532), эти пептиды появляются в раннем возрасте в головном мозге пациентов, страдающих синдромом Дауна (ДС), и их количество увеличивается с возрастом (Виззо С. и др. ΡΕΒ8 Ьей. 409, 1997, сс. 411-416, Виззо С. и др., №итоЬю1. Ό13. 8, 2001, сс. 173-180; Тектап Т.Ь. и др., 1. №игора(Ьо1. Ехр. №ито1. 57, 1998, сс. 76-94). И, наконец, их количество отражает развитие более серьезной формы заболевания (Виззо С. и др., ΡΕΒ8 Ьей. 409, 1997, сс. 411-416). Дополнительные посттрансляционные процессы могут также модифицировать Ν-конец в результате изомеризации или рацемизации аспартата в положении 1 и 7 и циклизации глутамата на остатках 3 и 11. Пироглутаматсодержащие изоформы в положении 3 |ρΟ1υ3’|Αβ3-40/42| представляют собой доминирующие формы на их долю приходится примерно 50% общего количества укороченных на Ν-конце видов Ав в старческих бляшках (Мой Н. и др., 1. Βώ! СЬет. 267, 1992, сс. 17082-17086, 8а1бо Т.С. и др., №итоп. 14, 1995, сс. 457-466; Виззо С. и др., ΡΕΒ8 Ьей. 409, 1997, сс. 411-416; Тектап Т.Ь. и др., 1. №итора1Ьо1. Ехр. №ито1. 57, 1998, сс. 76-94; Себбез 1.А. и др., №итоЬю1. АДпд 20, 1999, сс. 75-79; Напдауа Υ. и др., Β^οсЬет. ЕюрЬуз. Вез. Соттип. 276, 2000, сс. 422-427), и они присутствуют также в преамилоидных повреждениях (Ьа1о\\'зк| М. и др., 1. ΒώΙ СЬет. 271, 1996, сс. 33623-33631). Накопление пептидов ΑβΝ3φΕ), вероятно, является следствием структурной модификации, которая усиливает агрегацию и придает устойчивость к большинству аминопептидаз (8а1бо Т.С. и др., №итоп. 14, 1995, сс. 457-466; Тектап Т.Ь. и др., 1. №итосЬет. 73, 1999, сс. 1584-1589). Эти данные являются ключом к объяснению основной роли пептидов ΑβΝ3φΕ) в патогенезе АБ. Однако пока имеется относительно мало сведений об их нейротоксичности и способности к агрегации (Не А. и Еаггслу С.Е, Β^οсЬет^зί^у 38, 1999, сс. 10871-10877; Тектап Т.Ь. и др., 1. №игосЬет. 73, 1999, сс. 1584-1589). Более того, совершенно нет данных о действии этих изоформ на глиальные клетки и о глиальном ответе на эти пептиды, хотя связь активированной глии со старческими бляшками точно установлена и глия может активно участвовать в накоплении амилоидных отложений. В современных исследованиях изучали токсичность, агрегацию и катаболизм пептидов Αβ142, Αβ1-40, |ρΟ1υ3]Αβ3-42 и [р61и3]Αβ3-40 в культурах клеток нейронов и глии, и было установлено, что модификация пироглутамата усиливает токсичные свойства Αβ-пептидов и ингибирует также их расщепление культивируемыми астроцитами. 8Ыто1аш с соавторами изучали образование пептидов |ρΟ1π3]Αβ в первичных кортикальных нейронах, зараженных вирусом Синбис ш \йго. Эти авторы сконструировали путем аминокислотной замены и делеции комплементарные ДНК амилоидного белка-предшественника, которые кодировали потенциальный предшественник |ρΟ1π3]Αβ. Для одного из искусственных предшественников, у которого на Ν-конце находился остаток глутамина вместо глутамата, присутствующего во встречающемся в естественных условиях предшественнике, сделано предположение о спонтанном превращении или ферментативном превращении с помощью глутаминилциклазы в пироглутамат. Механизм циклизации Ν-концевого глутамата в положении 3 во встречающемся в естественных условиях предшественнике пептида |ρ61и3]Αр ш νί\Ό не выяснен (8Ыго1аш К., ТзиЬик1 8., Бее Н.Е, Магиуата К. и 8а1бо Т.С., №итозск Ьей. 327, 2002, сс. 25-28).
Дипептидилпептидаза IV (ЭР IV) представляет собой осуществляющую расщепление в положении после пролина (в меньшей степени после аланина, после серина или после глицина) сериновую протеазу, обнаруженную в различных тканях организма, включая почку, печень и кишечник, и она отщепляет Νконцевые дипептиды от пептидной цепи. В настоящее время установлено, что ЭР IV играет важную роль в метаболизме нейропептидов, Т-клеточной активации, прикреплении раковых клеток к эндотелию и в проникновении ВИЧ в лимфоидные клетки (см. АО 02/34242, АО 02/34243, АО 03/002595 и АО 03/002596).
Известно, что ингибиторы ΌΡ IV можно применять для лечения нарушенной толерантности к глюкозе и сахарного диабета (международная заявка на патент, публикация АО 99/61431, Ребегзоп В.А. и др., Э1аЬе1ез 47, 1998, сс. 1253-1258 и Раи1у В.Р. и др., Ме1аЬоЬзт 48, 1999, сс. 385-389). В частности, в АО 99/61431 описаны ингибиторы ЭР IV, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, и их соли, прежде всего Ь-треоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилпиролидин и их соли.
Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, Ν-замещенные 2-цианпиролы и -пирролидины, №(№-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, №(замещенный глицил)тиазолидины, №(замещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы IV описаны в И8 6380398, И8 6011155; И8 6107317; И8 6110949; И8 6124305; И8 6172081; АО
- 2 009291
95/15309, АО 99/61431, АО 99/67278, АО 99/67279, ΌΕ 19834591, АО 97/40832, ΌΕ 19616486 С2, АО 98/19998, АО 00/07617, АО 99/38501, АО 99/46272, АО 99/38501, АО 01/68603, АО 01/40180, АО 01/81337, АО 01/81304, АО 01/55105, АО 02/02560 и АО 02/14271, АО 02/04610, АО 02/051836, АО 02/068420, АО 02/076450; АО 02/083128, АО 02/38541, АО 03/000180, АО 03/000181, АО 03/000250, АО 03/002530, АО 03/002531, АО 03/002553, АО 03/002593, АО 03/004496, АО 03/024942 и АО 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего, касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к новым физиологическим субстратам ОС в организме млекопитающих, таким как Άβ3-40/42, [Ο1η3]Άβ3-40/42, [Ο1υ11]Άβ11-40/42, [Ο1η11]Άβ11-40/42, [С1и1]гастрин, [С1и1]нейротензин, [С1и1]ЕРР, [С1и1]ССЬ 2, [С1и1]ССЬ 7, [С1и1]ССЬ 8, [С1и1]ССЬ 16, [С1и1]ССЬ 18, [С1и1]фракталкин, [С1и!]орексин А, [С1и3]глюкагон3-29 и [С1и5] субстанция Р5-11, и к применению эффекторов ОС и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы ОС. для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС.
С помощью экспериментов по ингибированию установлено, что человеческая ОС представляет собой металлзависимую трансферазу. Апофермент ОС может проявлять наибольшую реакционную способность в присутствии ионов цинка, и металлсвязывающий мотив цинкзависимых аминопептидаз присутствует также в человеческой ОС. Соединения, которые взаимодействуют с активным сайтом связывания металла, являются эффективными ингибиторами.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что рекомбинантная человеческая ОС, а также активность ОС в экстрактах, выделенных из головного мозга, катализирует циклизацию как Ν’концевого глутаминила, так и глутамата. В этом исследовании убедительно доказано, что для катализируемого циклазой С1и1-превращения оптимальным является значение рН, близкое к 6,0, а для С1и'превращения в рС1и-производное оптимальным является значение рН, близкое к 8,0. Поскольку образование пептидов, родственных рС1и-Ав, можно подавлять путем ингибирования рекомбинантной человеческой ОС и ОС-активности экстрактов, выделенных из гипофиза свиньи, фермент ОС является мишенью для разработки пути лечения болезни Альцгеймера.
Путем введения млекопитающим эффекторов ОС-активности можно предупреждать, или облегчать, или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, язвенная болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас!ет ру1ог1, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников.
Путем введения ингибиторов ОС можно также подавлять мужскую фертильность.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов ОС-активности в сочетании с ингибиторами ΌΡ IV или ферментов, подобных ΌΡ IV, для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности ОС и/или ΌΡ IV.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для парентерального, энтерального или орального введения, которые содержат по меньшей мере один эффектор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами или которые содержат по меньшей мере один эффектор РС в сочетании по меньшей мере с одним ингибитором ΌΡ IV необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
Разработаны также способы скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС.
Краткое описание чертежей
Эти и другие аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы ниже со ссылкой на чертежи, на которых показано:
на фиг. 1 - кривые, характеризующие процесс циклизации Н-С1и-А1а-ОН, катализируемой человеческой ОС по снижению абсорбции при 340 нм. Образцы содержали 0,3 мМ НАДН/Н+, 14 мМ α-кетоглутаровую кислоту, 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы и 1 мМ Н-С1и-А1а-ОН. На кривых Ά-Г представлены результаты, полученные с использованием различных концентраций ОС: Ά, 10 мед. (0,001 стандартной единицы)/мл, Б, 5 мед./мл, В, 2,5 мед./мл. На кривой Г представлены результаты, полученные без ОС. Обнаружена линейная зависимость полученной активности от концентрации ОС (вклейка);
на фиг. 2 - зависимость от рН активности человеческой ОС и ОС из папайи (вставка), которую опре
- 3 009291 деляли в условиях скорости реакции первого порядка с использованием в качестве субстрата ΟΙη-βΝΆ. Для человеческой ^С использовали буферную систему, обеспечивающую постоянную ионную силу, предложенную ЕШк и Мотков, в состав которой входили 25 мМ МЕ8, 25 мМ уксусная кислота и 50 мМ Трис (ЕШк К.1. и Мотков 1.Р., Ме1йобк Εηζνιηοΐ. 87, 1982, сс. 405-426). Из-за некоторого ингибирующего действия Трис на фермент ОС из папайи изучали с использованием 50 мМ Морк-буфера. Ионную силу доводили до 0,05М, добавляя №С1. Профили скорости реакции оценивали путем аппроксимации с использованием модели, основанной на концепции диссоциирующих групп. Для ОС из папайи при аппроксимации данных с использованием модели однократной диссоциации установлено, что значение рКа составляло 7,13±0,03;
на фиг. 3 - данные о воздействии значений рН на стабильность ОС из латекса папайи и человеческой ОС. Маточный раствор фермента разбавляли в 20 раз 0,1М буфером с различными значениями рН (натрийцитратый буфер, рН 4-7 и натрийфосфатный буфер, рН 7-10). Растворы ферментов инкубировали при 30°С в течение 30 мин и затем оценивали ферментативную активность согласно стандартному протоколу;
на фиг. 4 - результаты сравнения констант специфичности кса1/КМ для набора субстратов, содержащих глутамат в положении второй аминокислоты. В то время, как при переходе от ди- к трипептидам было обнаружено повышение специфичности человеческой ОС. никаких изменений в этом варианте не обнаружено для ОС из папайи. Представленные диаграммы получены на основе параметров, приведенных в табл. 3;
на фиг. 5 - данные об образовании рС1и-Еук(рС1и)-Агд-Ееи-А1а^Н2 из Н-С1п-Еук(С1п)-Агд-Еев-А1аΝΗ2, катализируемом человеческой ОС. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении т/ζ, обусловленному выбросом аммиака. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 38 нМ ОС в 40 мМ трис/НС1, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали массспектрометрическому анализу. Очень близкая зависимость обнаружена и для ОС из папайи;
на фиг. 6 - данные об образовании рС1и-Р11е-Еу8-А1а-С1и^Н2 из Н-СЕч^МерРйе-Еук-Ака-Ск^Н^ катализируемом ОС из папайи. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении т/ζ, обусловленному выбросом метиламина. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 0,65 мкМ ОС из папайи в 40 мМ Трис/НС1, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу. Никакого превращения субстрата не обнаружено в образцах без РС из папайи или при добавлении к субстрату вплоть до 1,5 мкМ человеческой ОС (данные не представлены);
на фиг. 7 - данные об образовании [Ο1η3]-Άβ3-11 из [Ο1η3]Άβ1-11, катализируемом ΌΡ IV. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 8 - данные о предупреждении расщепления |С1п3|Ав1-11 с помощью ингибитора ΌΡ IV Уа1пирролидида Жа1-Ругг). В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 9 - данные об образовании [рО1и3]Ав3-11 из [Ο1η3]Άβ3-11, катализируемом ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 10 - данные об ингибировании образования [рС1и3]Ав3-11 из [Ο1η3]Άβ3-11 с помощью ингибитора ОС 1,10-фенантролина. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 11 - данные об образовании [ρ61υ3]Άβ3-11 из [С1ηз]Άβ1-11 после последовательного катализа с помощью ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 12 - данные об ингибировании образования [ρΟ1υ3]Άβ3-11 из [С1η3]Άβ1-11 с помощью ингибитора ОС 1,10-фенантролина в присутствии каталитически активных ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 13 - данные о снижении образования [ρΟ1υ3]Άβ3-11 из [С1η3]Άβ1-11 с помощью ингибитора ΌΡ IV Уа1-Бугг в присутствии каталитически активных ΌΡ IV и ОС. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 14 - данные об образовании [р61и3]Άβ-пептид3-11 из [С1η3]Άβ1-11 после последовательного катализа аминопепетидазой(ами) и ОС, которые присутствовали в гомогенате гипофиза свиньи. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу;
на фиг. 15 Ά и Б - масс-спектры Άβ3-11α и Άβ3-2Ετ инкубированных в присутствии рекомбинантной человеческой ОС, которую кипятили в течение 10 мин перед применением. На фиг. 15 В и Д представлены масс-спектры Άβ3-11 и Ά β3-21а в присутствии активной человеческой ОС, что приводило к образованию [р61и3]Άβ3-11а и [р61и3]Άβ3-21а, соответственно. На фиг. 15 Д и Е представлены масс-спектры Άβ3-11 а и Άβ3-21 а в присутствии активной ОС и 5 мМ бензимидазола, подавляющего образование [рО1и3];
- 4 009291 на фиг. 16 - скорости реакции катализируемого ОС из папайи превращения Ο1υ-β-ΝΑ в зависимости от концентрации субстрата. Начальные скорости оценивали в 0,1М пирофосфатном буфере, рН 6,1 (квадраты), 0,1М фосфатном буфере, рН 7,5 (кружки) и 0,1М боратном буфере, рН 8,5 (треугольники). Значения кинетических параметров: КМ=1,13±0,07 мМ, кса1= 1,13±0,04 мин-1 (рН 6,1); КМ=1,45±0,03 мМ, кса1=0,92±0,01 мин-1 (рН 7,5); КМ=1,76±0,06 мМ, кса1=0,56±0,01 мин-1 (рН 8,5);
на фиг. 17 - зависимость от рН превращения Ο1η-βΝΑ (кружочки) и Ο1υ-βΝΑ (квадраты), которую определяли в условиях скорости реакции первого порядка (8«КМ). Использовали концентрацию субстрата 0,01 и 0,25 мМ, соответственно. Для обоих вариантов использовали трехкомпонентную буферную систему, включающую 0,05М уксусную кислоту, 0,05М пирофосфорную кислоту и 0,05М трицин. Все буферы доводили до одинаковой проводимости путем добавления №1С1 для того, чтобы избежать различий в ионной силе. Данные аппроксимировали с помощью уравнений, позволивших установить для двух диссоциирующих групп значения рКа 6,91±0,02 и 9,5±0,1 для ΟΙη-βΝΑ и 4,6±0,1 и 7,55±0,02 для ΟΙυβΝΑ. Значения рКа для аминогрупп соответствующего субстрата, которые определяли титрованием, составили 6,97±0,01 (ΟΙη-βΝΑ) и 7,57±0,05 (ΟΙυβΝΑ). Все определения осуществляли при 30°С;
на фиг. 18 - кривые, характеризующие процесс катализируемой человеческой ОС циклизации Η-Ο1ηЛМС в присутствии имидазола, дипиколиновой кислоты и без ингибитора. Гиперболическая форма кривой в присутствии дипиколиновой кислоты свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта ОС;
на фиг. 19 - зависящая от времени инактивация ОС с помощью гетероциклического хелатора 1,10фенантролина. После инкубации фермента ОС с ингибитором в отсутствие субстрата (сплошная линия) обнаружена пониженная ферментативная активность по сравнению с образцами, которые не подвергали предварительной инкубации с ингибитором (пунктирная линия), что свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта ОС;
на фиг. 20 - реактивация человеческой ОС ионами одновалентных и двухвалентных металлов. ОС инактивировали добавлением 2 мМ дипиколиновой кислоты в 50 мМ бис-трис-буфере, рН 6,8. Затем фермент подвергали диализу в противотоке 50 мМ бис-трис-буфера, рН 6,8, содержащего 1,0 мМ ЭДТК. Для реактивации фермента осуществляли инкубацию инактивированного образца фермента с ионами металлов в концентрации 0,5 мМ в присутствии 0,5 мМ ЭДТК для того, чтобы избежать неспецифической реактивации следами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах. В качестве контролей использовали содержащие фермент образцы, которые не инактивировали, но так же, как и инактивированный фермент, подвергали диализу в противотоке раствора ЭДТК (+ЭДТК), и образцы фермента, которые подвергали диализу в противотоке буферных растворов, не содержащих ЭДТК (-ЭДТК);
на фиг. 21 - сравнительный анализ последовательностей человеческой ОС (11ОС) и других представителей семейства М28 металлопептидаз С1ан МН. Сравнительный анализ множества последовательностей осуществляли с помощью программы С1и51а1\У в с11.ЕМВпс1.огд с принимаемыми по умолчанию параметрами. Превращение связанных с ионом цинка остатков обнаружено для человеческой ОС (11ОС; ΟепΒаηк Х71125), Ζη-зависимой аминопептидазы из 81гер1ошусе5 §Г15СИ5 (8ΟΑΡ; 8\\'155-Рго1 Р80561) и в Ν-ацетилированном-альфа-связанном кислотном дипептидазном домене (ΝΑΑΕΑΌ;·ι^ I) (остатки 274587) человеческой глутаматкарбоксипептидазы II (ЮСР II; 8\νί55-ΡΐΌΐ 004609). Аминокислоты, участвующие в связывании металла, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. В случае человеческой ОС эти остатки, вероятно, являются «двойниками» пептидаз.
Пептидные последовательности
Упомянутые и применяемые согласно настоящему описанию пептиды имеют следующие последовательности.
Αβ1-42:
Α5ρ-Α1;·ι-Ο1ιι-Ρ1κ-ΑΓ8-Ηί5-Α5ρ-8οΟΕ·-Τ\·Γ-Ο1ιι-ν;·ι1-Ηί5-Ηί5-Ο1η-ΕΎ5-ΕΌΐι-ν;·ι1-Ρ1κ-Ρ1κ-Α1;·ι-Ο1ιι-Α5ρVа1-Ο1у-8е^-Α5п-^у5-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меι-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vа1-Vа1-I1е-Α1а
Αβ1-40:
Α8р-Α1а-Ο1и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-Ο1у-Τу^-Ο1и-Vа1-Η^8-Η^8-Ο1η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-Ο1и-Α8рVа1-Ο1у-8е^-Α5п-^у5-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меι-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vа1-Vа1
Αβ3-42:
01и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-01у-Τу^-01и-Vа1-Η^8-Η^8-01η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-01и-Α8р-Vа1-01у8е^-Α8η-^у8-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меΐ-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vаΐ-Vа1-I1е-Α1а
Αβ3-40:
01и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-01у-Τу^-01и-Vа1-Η^8-Η^8-01η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-01и-Α8р-Vа1-01у8е^-Α8η-^у8-Ο1у-Α1а-I1е-I1е-Ο1у-^еи-Меΐ-Vа1-Ο1у-Ο1у-Vа1-Vа1
Αβ1-11Β:
Α8р-Α1а-Ο1и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-Ο1у-Τу^-Ο1и-NΗ2
Аβ3-11а:
Ο1ιι-Ρ1κ-ΑΓ8-Ηί5-Α5ρ-8οΟ1\·-Τ\τ-Ο1ιι-ΝΗ2
Αβ1-21Β:
Α8р-Α1а-Ο1и-Ρйе-Α^д-Η^8-Α8р-8е^-Ο1у-Τу^-Ο1и-Vа1-Η^8-Η^8-Ο1η-^у8-^еи-Vа1-Ρйе-Ρйе-Α1а-NΗ2
- 5 009291
Ав3-21а:
С1и-Р11с-Аг8-Н|5-А5р-8сг-С1у-Туг-С1и-Уа1-Н|5-Н|5-С1п-Еу5-Еси-Уа1-Р11с-Р11с-А1а-НН;
61η3-Αβ3-40:
С1п-Р11с-Аг8-Н|5-А5р-8сг-С1у-Туг-С1и-Уа1-Н|5-Н|5-С1п-Р.у5-Рси-Уа1-Р11с-Р11с-А1а-С1и-А5р-Уа1-С1у§ег-А8п-Ьу8-61у-А1а-11е-11е-61у-Ьеи-Ме!-Уа1-61у-61у-Уа1-Уа1
61п3-Ав3-21а:
61п-Рйе-Агд-Н18-А8р-§ег-61у-Туг-61и-Уа1-Н18-Н18-61п-Ьу8-Ьеи-Уа1-Рйе-Рйе-А1а-НН2
61п3-Ав1-11а:
А8р-А1а-61п-Рйе-Агд-Н18-А8р-§ег-61у-Туг-61и-ИН2
61п3-Ав3-11а:
С1п-Р11е-Агд-Н|5-А5р-8ег-С1у-Туг-С1и-НН2
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к эффекторам глутаминилциклазы (ОС), предназначенным:
а) для лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить путем модуляции активности ОС 1п νίνο;
б) и/или для модуляции физиологических процессов, основанных на действии рО1и-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией активности ОС.
Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям, предназначенным для ингибирования глутаминилциклазы (ОС, КФ 2.3.2.5) и/или ОС-подобных ферментов в организме млекопитающего и к применению ингибиторов ОС-активности для лечения патологических состояний, связанных с ОС-активностью.
В настоящем изобретении предложен также новый способ лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. Ν-концы амилоидных β-пептидов, отложение которых происходит в головном мозге при болезни Альцгеймера и синдроме Дауна, несут пироглутаминовую кислоту. Образование рО1и представляет собой важное событие в развитии и прогрессировании заболевания, так как известно, что амилоидные β-пептиды характеризуются повышенной тенденцией к агрегации β-амилоидов и токсичностью, чем, вероятно, обусловлено начало и развитие болезни (Ριΐδδο С. и др., 1. №игосйет. 82, 2002, сс. 1480-1489).
В противоположность этому, во встречающихся в естественных условиях Ав-пептидах (3-40/42) в качестве Ν-концевой аминокислоты присутствует глутаминовая кислота. К настоящему времени отсутствуют данные о превращении О1и в рО1и. Кроме того, пока не обнаружена спонтанная циклизация О1ипептидов в рО1ц-пептиды. Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является выяснение роли ОС в болезни Альцгеймера и синдроме Дауна. Эта задача решается с помощью синтеза А(33-11 и Ав 1-11, которые содержат аминокислоту глутамин вместо глутаминовой кислоты в положении 3, определения особенностей этих модифицированных амилоидных β-пептидов в качестве субстратов для ОС/ ΌΡ 1У и ΌΡ 1У-подобных ферментов и аминопептидаз и применения ингибиторов ОС для предупреждения образования рО1и из Ν-концевого глутаминильного остатка выведенных из амилоида β-пептидов 111 и 3-11. Результаты описаны в примере 8. Примененный метод описан в примере 3.
К настоящему времени отсутствуют какие-либо сведения об участии ОС в развитии заболевания, поскольку Ν-концевой аминокислотой в Аβ (3-40/42 или 11-40/42) является глутаминовая кислота. Однако ОС является единственным известным ферментом, который обладает способностью образовывать рО1и на Ν-конце пептидов. Другие объекты настоящего изобретения касаются следующих данных и открытий:
а) побочная реакция катализируемой ОС циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,
б) глутаминовая кислота β-амилоидного белка-предшественника (АРР) или образованные из нее амилоидные β-пептиды превращаются в глутамин после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а на второй стадии ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
в) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а затем ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
г) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный β-белок, что приводит к замене О1и в положении 3 на О1п. После трансляции и процессинга Ν-конца ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,
д) глутамин включается в возникающую пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому ОС катализирует циклизацию Ν-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида.
ОС участвует в имеющей решающее значение стадии во всех 5 перечисленных выше случаях, а именно в образовании пироглутаминовой кислоты, которая способствует агрегации амилоидных β-пептидов. Таким образом, ингибирование ОС приводит к предупреждению осаждения бляшкообразующих Аβ3-40/41/43 или Аβ 11-40/41/43, вызывая появление и прогрессирование болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, в независимости от механизма, посредством которого происходит циклизация.
- 6 009291
Глутамат обнаружен в положениях 3, 11 и 22 амилоидного β-пептида. Среди прочего описана мутация, приводящая к замене глутаминовой кислоты (Е) на глутамин (О) в положении 22 (соответствующая амилоидному белку-предшественнику АРР 693, 8\\звврго1 Р05067), в качестве мутации, приводящей к цереброартериальному амилоидозу датского типа.
Установлено, что β-амилоидные пептиды, несущие остаток пироглутаминовой кислоты в положении 3, 11 и/или 22, являются более цитотоксическими и гидрофобными по сравнению с Ав 1-40/42/43 (8а1бо Т.С., Мебюа1 НуроШевев 54(3), 2000, сс. 427-429).
Многочисленные Ν-концевые вариации в различных местоположениях β-сайта можно получать с помощью β-секретазы, фермента, расщепляющего β-сайт амилоидного белка-предшественника (ВАСЕ) (Ниве ТТ. и др., 1. Вю1. СНет. 277 (18), 2002, сс. 16278-16284), и/или процессинга с помощью аминопептидазы. Во всех случаях циклизация может происходить согласно описанным выше механизмам а)-д).
Таким образом, к настоящему времени отсутствуют экспериментальные данные, подтверждающие ферментативный путь превращения С1и1-пептидов в рС1и-пептиды с помощью неизвестной глутамилциклазы (ЕС), что соответствует механизму а) (Сагбеп Β.ν., Μογοζ Т.Р., С1еевоп 1.М., Г1оуб Ρ.Ό., Ы Ь.Т, ВиЬакЫи 8.8. и 8\\себ1ег ТУ. 1. №игосйет. 72, 1999, сс. 676-681; Новоба В. и др. 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, сс. 1089-1095). К настоящему времени не была обнаружена такая ферментативная активность, которая может осуществлять циклизацию С1и1-пептидов, протонированных на Ν-конце и несущих отрицательно заряженный остаток С1и1у-карбоксилата, при слабых щелочных значениях рН.
ОС-активность в отношении С1п1-субстратов очень резко снижалась при значениях рН ниже 7,0. В противоположность этому, установлено, что превращение С1И1 может происходить в кислых реакционных средах (1\ха1виЬо Т., 8а1бо Т.С., Мапп Ό.Μ., Ьее У.М. и Тго)апо\\'вк| 1.О., Ат. 1. Ра1йо1. 149, 1996, сс. 18231830; Вивво С., 8а1бо Т.С., ЭеВивк Ь.М., ТаЬаЮп М., СатЬеШ Р. и Те11ег ГК., ΓΕΒ8 Ьей. 409, 1977, сс. 411416; Влево С., 8айв 8., ПоШш V., Vеηеζ^а V., 8опд Х.Н., Те11ег 1.К. и 8сйей!ш С., №игоЬю1. Όίβ. 8, 2001, сс. 173-180; Текшап Т.Ь., 8а1бо Т.С., МагкевЬегу ν.Β., Вивве11 М.1., '№екв!ет Ό.Β., Ра1е1 Е. и Себбев IV., 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, сс. 76-94; Вивво С., Ую1аш Е., 8айв 8., Сег^а V., Эо1сйй V., ЭатоЩе С., ВепаШ и., ЭАггщо С., Районе Е., Саг1о Р. и 8сйейш1 С., 1. №игосйет. 82, 2002, сс. 14801489; Новоба В., 8а1бо Т.С., О1уов Ь., 1г., Ага1 Т., Мапп Ό.Μ., Ьее V.М., Тго)апо\\'вк| 1.0. и ЕсайиЬо Т., 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1. 57, 1998, сс. 1089-1095; Сагбеп Β.ν., Мо^оζ Т.Р., С1еевоп ГМ., Г1оуб РГО., Ы Ь.Т, ВиЬакЫп 8.8. и 8\\себ1ег ГМ, 1. №игосйет. 72, 1999, сс. 676-681).
При создании настоящего изобретения изучался вопрос о том, может ли ОС распознавать и участвовать в превращении выведенных из амилоида-β пептидов в слабокислых условиях. Для этой цели синтезировали и исследовали в качестве потенциальных субстратов фермента пептиды [С1η3]Аβ1-11а, Аβ3-11а, [С1п3]Аβ3-11а, Αβ3-2^, [С1п3]Аβ3-21а и [С1п3]Аβ3-40. Эти последовательности были выбраны для имитации встречающихся в естественных условиях укороченных на Ν-конце и на С-конце пептидов |С1и3|А β и пептидов [Ώ^ΙΑβ, которые могут присутствовать в результате посттрансляционного амидирования С1и.
При создании настоящего изобретения было установлено, что ОС из папайи и человеческая ОС катализируют циклизацию как глутаминила, так и глутамила. По-видимому, первичной физиологической функцией ОС является прекращение созревания гормонов в эндокринных клетках посредством циклизации глутамина до или во время процесса секреции гормона. Известно, что такие секреторные пузырьки характеризуются кислым значением рН. Таким образом, побочная активность фермента в узком диапазоне значений рН от 5,0 до 7,0 может представлять собой открытую при создании настоящего изобретения глутамилциклазную активность, которая трансформирует также пептиды 01ιι-Αβ. Однако из-за существенно меньшей скорости С1и-циклизации по сравнению с С1п-конверсией вопрос о том, может ли циклизация глутамила играть важную физиологическую роль, является спорным. При этом циклизация глутамила участвует в патологии нейродегенеративных заболеваний.
При создании настоящего изобретения при изучении зависимости этой ферментативной реакции от значений рН установлено, что непротонированный Ν-конец играет ключевую роль для циклизации С1п1-пептидов и, соответственно, значение рКа субстрата идентично значению рКа при ОС-катализе (см. фиг. 17). Таким образом, ОС стабилизирует внутримолекулярное нуклеофильное воздействие непротонированной α-аминогруппы на у-карбонильный углерод, который приобретает электрофильные свойства в результате амидирования (схема 1).
В отличие от одновалентного заряда, присутствующего в пептидах, несущих Ν-концевой глутамин, Ν-концевой остаток С1и в содержащих С1и пептидах в большинстве случаев несет двухвалентных заряд при нейтральных значениях рН. Для глутамата характерно значение рКа примерно 4,2 и 7,5 для у-карбоксильного остатка и для α-аминогруппы, соответственно. То есть при нейтральных и щелочных значениях рН хотя азот α-аминогруппы является частично или полностью непротонированным и нуклеофильным, у-карбоксильная группа является непротонированной и поэтому не проявляет никакой электрофильной, характерной для карбонила, активности. Поэтому внутримолекулярная циклизация представляется невозможной.
Однако при значениях рН примерно 5,2-6,5, с учетом соответствующих значений рКа, обе функциональные группы присутствуют в неионизированной форме в концентрациях примерно 1-10% (-ИН2) или 10-1% (-СООН) от общей массы Ν-концевого содержащего С1и пептида. В результате при слабокислых значениях рН присутствуют виды Ν-концевых С1и-пептидов, в которых обе группы являются неза
- 7 009291 ряженными, и поэтому представляется возможным, что ОС может стабилизировать промежуточное звено внутримолекулярной циклизации с образованием рО1и-пептида. То есть, если γ-карбоксильная группа является протонированной, то углерод карбонила является достаточно электрофильным, что позволяет осуществлять нуклеофильное воздействие на него непротонированной α-аминогруппы. При таких значения рН ион гидроксила функционирует в качестве уходящей группы (схема 3). Эти предположения подтверждаются данными о зависимости от рН, полученными для катализируемого ОС превращения О1иβΝΑ (см. пример 11). В отличие от превращения с помощью ОС глутамина ΟΙη-βΝΑ, оптимум рН катализа сдвигается в кислотный диапазон значений рН, примерно рН 6,0, т.е. диапазон значений рН, при котором одновременно присутствует значительное количество видов молекул субстрата, которые несут протонированную γ-карбоксильную и непротонированную α-аминогруппу. Кроме того, характеризующее кинетическую реакцию конкретное значение рКа, составляющее 7,55±0,02, очень хорошо согласуется со значением, установленным для α-аминогруппы Ο1π-βΝΑ с помощью титрования (7,57±0,05).
С физиологической точки зрения, при рН 6,0 константа скорости реакции второго порядка (или константа специфичности кса1/КМ) катализируемой ОС циклизации глутамата может быть примерно в 8000 раз ниже, чем константа, характеризующая циклизацию глутамина (фиг. 17). Однако не связанное с ферментом превращение обоих модельных субстратов Ο1π-βΝΑ и Ο1η-βΝΑ является очень незначительным, что согласуется с данными о незначительном образовании рО1и-пептида, полученными при создании настоящего изобретения. Следовательно, из соотношения констант скорости ферментативной и неферментативной реакций (при сравнении констант скорости реакции второго порядка для ферментативного катализа с соответствующими константами скорости реакции первого порядка для неферментативной циклизации коэффициент каталитической эффективности составляет 109-1010М-1 для Ο1η- и О1и-превращения, соответственно) можно оценить, что для образования рО1и с помощью ОС может быть достигнуто ускорение по меньшей мере в 108 раз. Из этих данных можно сделать вывод о том, что ίη νίνο возможным является только ферментативный путь, приводящий к образованию рО1и.
Поскольку ОС присутствует в больших количествах в головном мозге, а также принимая во внимание высокую скорость превращения, составляющую 0,9 мин-1, которая в последние годы установлена для созревания 30 мкМ (О1п-)ТВН-подо6ного пептида (Ргока1 Ь., РгокаъТайш К., Оиуаид X., К1т Н.8., XVи ХУ.М.. ΖΙκιπΕονη А. и Вобог Ν., 1. Меб. СЬет. 42, 1999, сс. 4563-4571), можно предсказать, что время полужизни соответствующего глутаматного субстрата при его циклизации составляет примерно 100 ч, что совпадает с предложенными в настоящем описании реакционными условиями. Кроме того, принимая во внимание компартментализацию и локализацию в головном мозге ОС/ЕС в пути секреции, ίη νίνο в неповрежденных клетках фактические концентрации фермента и субстрата и условия реакции могут оказаться еще более оптимальными для ферментативной циклизации. А также, если Ν-концевой О1ц заменяют на 01η, то можно ожидать еще более быстрое образование рО1и, опосредуемое ОС. Ιη νίΐτο обе реакции подавлялись при внесении ингибиторов ОС/ЕС-активности (фиг. 9, 10 и 15).
В целом, при создании настоящего изобретения установлено, что человеческая ОС, которая присутствует в больших количествах в головном мозге, вероятно, катализирует образование амилоидогенных пептидов из предшественников Ο1π-Αβ и Ο1η-Αβ, на долю которых приходится более чем 50% отложений бляшек при болезни Альцгеймера. Эти данные позволили установить, что ОС/ЕС участвуют в образовании старческих бляшек и вследствие этого представляют собой новую мишень для разработки лекарственных средств, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.
Второй вариант осуществления настоящего изобретения касается того, что выведенные из амилоида-β пептиды являются субстратом для дипептидилпептидазы IV (ΌΡ IV) или подобных ΌΡ IV ферментов, предпочтительно дипептидилпептидазы II (ΌΡ II). ΌΡ IV, ΌΡ II или другие подобные ΌΡ IV ферменты высвобождают дипептид из Ν-конца модифицированного амилоидного β-пептида (1-11), что приводит к образованию амилоидного β-пептида (3-11), у которого в качестве Ν-концевого аминокислотного остатка присутствует глутамин. Эти результаты представлены в примере 8.
Перед расщеплением с помощью ΌΡ II, ΌΡ IV или другого подобного ΌΡ IV фермента пептидная связь между аспарагиновой кислотой (остаток 1 амилоидного β-пептида) и аланином (остаток 2 амилоидного β-пептида) может быть изомеризована с образованием изоаспартильного остатка, что описано в литературе (Кио Υ.-М., Еттебшд М.В., Χνοο6δ Α.8., СоИег В.1., РоЬег Α.Ε., ВВВС 237, 1997, сс. 188-191; δΐιίιηίζιι Т., VаΐаηаЬе Α., Одаиага М., Моп Н. и ЗЫгакаиа Т., Лгск ВюсЬет. ВюрЬук. 381, 2000, сс. 225-234).
Эти изоаспартильные остатки придают амилоидному β-пептиду устойчивость к расщеплению аминопептидазой, и в результате коровые бляшки содержат более высокие количества изо Αφ1 -амилоидных β-пептидов, что позволяет предположить пониженное превращение на Ν-конце.
Однако в настоящем изобретении впервые продемонстрировано, что под воздействием дипептидилпептидаз может высвобождаться Ν-концевой дипептид Н-изоΑ8р1-Α1а2-ОН, прежде всего, в кислотных условиях. Кроме того, при создании изобретения было установлено, что изомеризация может предшествовать также расщеплению β-секретазой и что изомеризация может ускорять протеолитическое расщепление, что приводит к выделению в свободном состоянии Ν-концевой изоаспартильной связи (Γ^Αφ1амилоидных β-пептидов, которые, в свою очередь, являются объектом для обновления с помощью ΌΡ II,
- 8 009291
ΌΡ IV или подобных ΌΡ IV ферментов (Мотапб I. и С1агке 8., ВюскеппЧгу 26, 1987, сс. 7798-7805; Кио Υ.-М., Еттетйпд М.В., ХУообк А.8., Собег КД., Войег А.Е., ВВВС 237, 1997, сс. 188-191). Таким образом, ингибирование образования изоаспартила может приводить к снижению расщепления β-секретазой и, в свою очередь, к пониженному образованию амилоидных β-пептидов. Кроме того, блокада превращения изоАкр'-амилоидного β-пептидов путем ингибирования ΌΡ II, ΌΡ IV или подобных ΌΡ IV ферментов должна препятствовать катализируемому ОС/ЕС образованию |рС1и3|Аβ из |01υ3|Αβ.
Согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения комбинацию ингибиторов активности ΌΡ IV и ингибиторов ОС можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
Совместное действие ΌΡ IV и/или подобных ΌΡ IV ферментов и ОС иллюстрируют следующие факты:
а) ΌΡ IV и/или подобные ΌΡ IV ферменты расщепляют Аβ 1-40/42, при этом высвобождается дипептид, содержащий Н-Акр-А1а-ОН и Аβ3-40/42,
б) побочная реакция катализируемой ОС циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,
в) глутаминовая кислота превращается в глутамин на Ν-конце после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а затем ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
г) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а на второй стадии ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида,
д) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный β-белок, что приводит к замене С1и в положении 3Аβ С1п. После трансляции и процессинга Ν-конца ОС катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,
е) глутамин включается в возникающую пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому ОС катализирует циклизацию Ν-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга Ν-конца амилоидного β-пептида.
ОС-активность в отношении Ν-концевого С1п может запускаться также действием различных пептидаз. Аминопептидазы могут удалять последовательно Акр и А1а из Ν-конца Аβ 1-40/41/43, демаскируя тем самым аминокислоту в положении 3, которая может подвергаться циклизации. Дипептидилпептидазы, такие как ΌΡ I, ΌΡ II, ΌΡ IV, ΌΡ 8, ΌΡ 9 и ΌΡ 10, в одну стадию осуществляют удаление дипептида Акр-А1а. Таким образом, ингибирование аминопептидазной или дипептидилпептидазной активности можно применять для предупреждения образования Аβ3-40/41/43.
Совместное действие ингибиторов ΌΡ IV и/или подобных ΌΡ IV ферментов и снижающих активность эффекторов ОС можно проиллюстрировать следующим образом:
а) ингибиторы ΌΡ IV и/или подобных ΌΡ IV ферментов ингибируют превращение Аβ 1-40/42 в Аβ3-40/42,
б) тем самым предотвращается воздействие на Ν-концевую глутаминовую кислоту и не происходит ее превращение в глутамин либо ферментативным путем, либо с помощью химического катализа, что в дальнейшем делает возможным образование пироглутаминовой кислоты,
в) ингибиторы ОС предупреждают также образование пироглутаминовой кислоты из любых молекул Аβ3-40/42 с модифицированными остатками и тех модифицированных молекул Аβ3-40/42, которые образуются в результате мутаций гена АРР.
При создании настоящего изобретения аналогичное совместное действие ΌΡ IV или подобных ΌΡ IV ферментов и ОС было продемонстрировано также для других пептидных гормонов, таких как глюкагон, СС-хемокины и вещество Р.
Глюкагон представляет собой состоящий из 29 аминокислот полипептид, который выделяется из альфа-клеток панкреатических островков, и его функцией является поддержание нормальной глицемии путем стимуляции печеночного гликогенолиза и глюконеогенеза. Несмотря на важность этого вопроса, сохраняются противоположные мнения о механизме, ответственном за клиренс глюкагона в организме. Ρокр^к^1^к с соавторами изучали ферментативный метаболизм глюкагона с помощью высокочувствительных методов масс-спектрометрии для идентификации продукта на молекулярном уровне. Инкубация глюкагона с очищенной свиной дипептидилпептидазой IV (ΌΡ IV) приводила к последовательному производству глюкагона 3-29 и глюкагона 5-29. В человеческой сыворотке расщепление до глюкагона 3-29 сопровождалось быстрой Ν-концевой циклизацией глюкагона, что препятствовало дальнейшему опосредуемому ΌΡ IV гидролизу. Биологический анализ глюкагона после его инкубации с очищенной ΌΡ IV или нормальной крысиной сывороткой продемонстрировал значительное снижение гипергликемической активности, в то время как аналогичная инкубация с крысиной сывороткой с дефицитом ΌΡ IV не приводила ни к какому снижению биологической активности глюкагона. Расщепление, для оценки которого применяли масс-спектрометрию и биологический анализ, блокировали с помощью специфического ингибитора ΌΡ IV изолейцилтиазолидина. Эти результаты свидетельствуют о том, что ΌΡ IV представляет собой основной фермент, участвующий в расщеплении и инактивации глюкагона. Эти данные нашли важное применение для определения уровней глюкагона в человеческой плазме ^окр^Ик и др., Веди1. Ρерΐ., 12; 96(3), январь 2001, сс. 133-41).
Хемотаксический белок человеческих моноцитов (МСР)-2 впервые был выделен из стимулирован
- 9 009291 ных клеток остеосаркомы в качестве хемокина, производимого вместе с МСР-1 и МСР-3. Уоп Со1Ше с соавторами (Уаи Со1Ше Е. и др., В1оейеш181гу 37, 1998, сс. 12672-12680) клонировали из библиотеки кДНК человеческих яичек кДНК МСР-2 с удлинением на 5'-конце. Она кодировала состоящий из 76 остатков белок МСР-2, но отличалась от известной полученной из костного мозга последовательности кДНК МСР-2 кодоном 46, который кодировал Ьу§ вместо О1и. Осуществляли анализ биологической активности этого варианта МСР-2Ьу§46, полученного в результате полиморфизма одного нуклеотида (8ΝΡ), и МСР-2О1и46. Кодирующие области субклонировали в бактериальном экспрессионном векторе ρΗΕΝ1 и после трансформации им ЕксйепсШа сой из периплазмы выделяли два варианта белка МСР-2. С помощью расщепления по Эдману подтвердили наличие на Ν^-конце остатка О1и вместо рО1и. гМСР2О1и46 и тМСР-2Ьу846 и копии с циклическим Ν^-концом оценивали на клетках моноцитов в опытах по мобилизации кальция и оценке хемотаксиса. Никаких различий в биологической активности не обнаружено между изоформами гМСР-2О1и46 и тМСР-2Ьу546. Однако для обоих вариантов МСР-2 установлено, что наличие Ν^-концевого пироглутамата имело решающее значение для хемотаксиса, но не было важно для мобилизации кальция. Укорочение Ν^-конца тМСР-2Ьу546 с помощью сериновой протеазы СЭ26/дипептидилпептидазы 1У (СЭ26/ЭРР 1У) приводило к высвобождению Ν^-концевого дипептида О1и-Рто, в то время как синтетический МСР-2, несущий на Ν^-конце рО1и, остался неповрежденным. Укороченный с помощью СЭ26/ЭРР 1У гМСР-2Ьу §46(3-76) оказался практически полностью неактивным как в опытах по оценке хемотаксиса, так и в опытах по оценке передачи сигнала.
Эти данные свидетельствуют о том, что ИН2-концевой рО1и в МСР-2 является не только необходимым для хемотаксической активности, но также защищает белок от расщепления с помощью СЭ26/ЭРР 1У (уаи Со1Ше Е. и др., Вюсйеш1§1ту, 37, 1998, сс. 12672-80).
При создании настоящего изобретения с помощью анализа методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) установлено, что образование Ν-концевого остатка пироглутамата в глюкагоне 3-29 (Ро§р1§111к и др., 2001) и в изоформах МСР-2 (уаи Со1Ше и др., 1998), катализируется ОС.
Кроме того, с помощью ЖХ/МС доказано, что после катализируемого ЭР 1У удаления двух дипептидов Ьу§-Рто и Агд-Рго из Ν-конца вещества Р оставшееся [Ο1η5] вещество Р5-11 трансформируется с помощью ОС с образованием [рО1и5] вещества Р5-11.
Ингибиторы ЭР 1У описаны в АО 99/61431. В частности, описаны ингибиторы ЭР 1У, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, и их соли, прежде всего Ьтреоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин, Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-аллоизолейцилпирролидин и их соли.
Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы 1У являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, Ν-замещенные 2-цианпиролы и -пирролидины, №(№-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, №(замещенный глицил)тиазолидины, Ν-Оамещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы 1У описаны в И8 6380398, И8 6011155; И8 6107317; И8 6110949; И8 6124305; И8 6172081; АО 95/15309, АО 99/61431, АО 99/67278, АО 99/67279, ΌΕ 19834591, АО 97/40832, ΌΕ 19616486 С2, АО 98/19998, АО 00/07617, АО 99/38501, АО 99/46272, АО 99/38501, АО 01/68603, АО 01/40180, АО 01/81337, АО 01/81304, АО 01/55105, АО 02/02560 и АО 02/14271, АО 02/04610, АО 02/051836, АО 02/068420, АО 02/076450; АО 02/083128, АО 02/38541, АО 03/000180, АО 03/000181, АО 03/000250, АО 03/002530, АО 03/002531, АО 03/002553, АО 03/002593, АО 03/004496, АО 03/024942 и АО 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения.
Предпочтительными для применения в сочетании с эффекторами ОС являются такие ингибиторы ЭР 1У, как ХУР-ЭРР728А (1-[[[2-[{5-цианпиридин-2-ил}амино]этил]амино]ацетил]-2-циан-(8)-пирролидин) (фирма №уаП1§), описанный у Нидйе§ и др., ВюсйетМгу 38, 1999, сс. 11597-11603, ЬАР-237 (1-[(3гидроксиадамант-1-иламино)ацетил]пирролидин-2(8)-карбонитрил), описанный у Нидйе§ и др., Меейид ок 1Не Ашепсаи Э|аЬе1е§ А§§ос1абоп, 2002, реферат № 272 (фирма №уатб§), Т8Ь-225 (триптофил-1,2,3,4тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота), описанная у Уашаба и др., Вюотд. Меб. Сйеш. Ьеб. 8, 1998, сс. 537-1540, 2-цианпирролидиды и 4-цианпирролидиды, описанные у А§^от1й и др., Вюотд. Меб. Сйеш. Бей. 6, 1996, сс. 1163-1166 и сс. 2745-2748 , РЕ-999011, описанный у 8ибте и др., Э|аЬе1е§ 51, 2002, сс. 1461-1469 (фирма Ретид), и соединения, описанные в АО 01/34594 (фирма Оибкотб), при их использовании в дозах, которые указаны в приведенных выше ссылках.
Более предпочтительными ингибиторами ЭР 1У, которые можно применять в сочетании с эффекторами ОС, являются дипептидные соединения, в которых аминокислоту предпочтительно выбирают из встречающихся в естественных условиях аминокислот, таких, например, как лейцин, валин, глутамин, глутаминовая кислота, пролин, изолейцин, аспарагины и аспарагиновая кислота. Подобные дипептидам соединения, применяемые согласно изобретению, в концентрации (в пересчете на дипептидные соединения) 10 мкМ снижают активность в плазме дипептидилпептидазы 1У или ферментов-аналогов ЭР 1У по меньшей мере на 10%, прежде всего по меньшей мере на 40%. Часто ίη у1уо требуется также снижение активности по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%. Предпочтительные соединения могут
- 10 009291 обладать также способностью снижать активность, максимум, на 20 или 30%.
Предпочтительными дипептидными соединениями являются Ν-валилпролил, О-бензоилгидроксиламин, аланилпирролидин, изолейцилтиазолидин, например Ь-аллоизолейцилтиазолидин, Ь-треоизолейцилпирролидин и их соли, прежде всего фумараты, и Ь-аллоизолейцилпирролидин и его соли. Особенно предпочтительными соединениями являются глутаминилпирролидин и глутаминилтиазолидин, Н-Акппирролидин, Н-Акп-тиазолидин, Н-Акр-пирролидин, Н-Акр-тиазолидин, Н-А8р(КНОН)-пирролидин, НА5р(кНОН)-тиазолидин. Н-С1и-пирролидин, Н-С1и-тиазолидин, Н-С1и(NНОН)-пирролидин, Н-С1и(NНОН)тиазолидин, Н-Н1к-пирролидин, Н-Н1к-тиазолидин, Н-Рго-пирролидин, Н-Рго-тиазолидин, Н-йе-азидидин, Н-Пе-пирролидин, Н-Ь-алло-йе-тиазолидин, Н-Уа1-пирролидин и Н-Уа1-тиазолидин и их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в \УО 99/61431 и ЕР 1304327.
Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение эффекторов ОС в сочетании с напоминающими субстрат пептидными соединениями, которые можно использовать для конкурентной модуляции катализа, осуществляемого дипептидилпептидазой IV. Предпочтительными пептидными соединениями являются 2-аминооктановая кислота-Рго-11е, АЬи-Рго-11е, А1Ь-Рго-11е, Ахе-Рго-Пе, Ска-Рго-йе, Ие-Нур11е, 11е-Рго-алло-11е, 11е-Рго-трет-бутил-С1у, Пе-Рго-Уа1, Ше-Рго-йе, №а-Рго-Пе, От-Рго-11е, Рке-Рго-йе, РкдРго-11е, Р1р-Рго-11е, 8ег(Вх1)-Рго-11е, 8ег(Р)-Рго-Пе, 8ег-Рго-11е, трет-бутил-С1у-Рго-Э-Уа1, трет-бутил-С1у-РгоС1у, трет-бутил-С1у-Рго-11е, трет-бутил-С1у-Рго-11е-амид, трет-бутил-С1у-Рго-трет-бутил-С1у, трет-бутилС1у-Рго-Уа1 Ткг-Рго-йе, Т1с-Рго-11е, Тгр-Рго-11е, Туг(Р)-Рго-11е, Туг-Рго-алло-11е, Vа1-Р^о-алло-I1е, Уа1-Рготрет-бутил-С1у, Уа1-Рго-Уа1 и их фармацевтически приемлемые соли, в которых трет-бутил-С1у обозначает
а 8ег(Вх1) и 8ег(Р) обозначают бензилсерин и фосфорилсерин, соответственно. Туг(Р) обозначает фосфорилтирозин. Эти соединения описаны в \УО 03/002593.
Другими предпочтительными ингибиторами ЭР IV, которые можно применять согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами ОС, являются пептидилкетоны, например гидробромид 2-метилкарбонил-1-№[(Е)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-метилкарбонил-1-№[(Е)-валинил-(Е)-пролил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[(ацетилоксиметил)карбонил]-1-№[(Е)-аланил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-№[{(Е)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, 2-{[(2,6-дихлорбензил)тиометил]карбонил}-1-№[{(Е)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидин, гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-№[глицил-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[([1,3]-тиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-№[{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-№[№{(Е)-аланил}-(Е)-валинил]-(28)-пирролидина, трифторацетат 2-[(-бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил] -1-№[{(Ъ)-аланил}глицил] -(2 8)-пирролидина, трифторацетат 2-[(пиридин-2-ил)карбонил]-1-№[№{(Ь)-аланил}-(Ь)-валинил]-(28)-пирролидина и другие их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в \УО 03/033524.
Кроме того, согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами ОС можно применять замещенные аминокетоны. Предпочтительными замещенными аминокетонами являются хлорид 1-циклопентил-3 -метил-1 -оксо-2-пентанаминия, хлорид 1-циклопентил-3 -метил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклопентил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 1-циклогексил-3,3-диметил-1 -оксо-2-бутанаминия, хлорид 3-(циклопентилкарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиния, хлорид №(2-циклопентил-2-оксоэтил)циклогексанаминия и другие их фармацевтически приемлемые соли.
Ранее считалось, что из редкой группы специфических для пролина протеаз ЭР IV является единственным связанным с мембраной ферментом, специфическим для пролина в качестве предпоследнего остатка на аминоконце полипептидной цепи. Однако были выявлены другие молекулы, даже не обладающие структурной гомологией ЭР IV, но обладающие соответствующей ферментативной активностью. Подобные ЭР I У-ферменты, которые были выявлены к настоящему времени, представляют собой, например, протеин α, участвующий в активации фибробластов, дипептидилпептидазу IV β, белок, подобный дипептидиламинопептидазе, Ν-ацетилированная α-связанная кислотная дипептидаза, пролиндипептидаза покоящихся клеток, дипептидилпептидаза II, аттрактин и белок, родственный дипептидилпептидазе IV (ЭРР 8), ЭРЫ (ЭРХ, ЭР6), ЭРЬ2 и ЭРР 9, которые описаны в обзорных статьях 8ебо и Майк (8ебо и Ма11к, ВюсЫт. Вюркук. Ас1а., 36506, 2001, сс. 1-10) и АЬЬой и Согге11 (АЬЬой С.А. и Согге11 Μ.Ό. в: ЕсЮрерПбакек, под ред. Ьапдпег и Апкогде, изд-во К1и\тег Асабетю/Р1епит РиЬкккегк, Νο\ν Уотк, 2002, сс. 171-195). В настоящее время описано клонирование и характеристики дипептидилпептидазы 10 (ЭРР 10) (Οί 8.Υ. и др., Вюскетюа! 1оита1 Iттеά^аΐе РиЬксайоп, публикация 28 марта 2003г., рукопись В120021914).
- 11 009291
Эффекторы в контексте настоящего описания обозначают молекулы, которые связываются с ферментом и понижают или повышают его активность ίη νίίτο и/или ίη νίνο. Некоторые ферменты несут сайты связывания для небольших молекул, которые влияют на их каталитическую активность; молекулустимулятор называют активатором. Ферменты могут нести даже несколько сайтов, которые распознаются более чем одним активатором или ингибитором. Ферменты могут обнаруживать концентрации различных молекул и использовать эту информацию для изменения собственной активности.
Эффекторы могут модулировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут принимать как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами, ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы воздействуют не только на активные сайты ферментов, но также на регуляторные сайты или аллостерические сайты, последнее понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте (Эагпе11 ί.. Ьоб18Й Н. и ВаШшоге Ό., Мо1еси1аг Се11 Βίοίοβν. 2-ое изд., изд-во 8с1еп6Пс Лшепсап Воокк, Ыете Уогк, 1990, с 63).
В пептидах, предлагаемых в настоящем изобретении, каждый аминокислотный остаток обозначен однобуквенным или трехбуквенным кодом, который соответствует тривиальному названию аминокислоты, общепринятые обозначения которых представлены ниже.
Аминокислота | Однобуквенный символ | Трехбуквенный символ |
Аланин | А | А1а |
Аргинин | К | Аге |
Аспарагин | N | А$п |
Аспарагиновая кислота | Ц | Авр |
Цистеин | С | Су8 |
Глутамин | <3 | О1п |
Глутаминовая кислота | Е | О1и |
Глицин | а | О1у |
Гистидин | н | ΗΪ5 |
Изолейцин | I | Не |
Лейцин | ь | Ьеи |
Лизин | к | Ьуз |
Метионин | м | Ме» |
Фенилаланин | Р | РЬе |
Пролин | Р | Рго |
Серин | 8 | 8ег |
Треонин | т | ТЬг |
Триптофан | V/ | Тгр |
Тирозин | Υ | Туг |
Валин | V | Уа1 |
Понятие «ОС» в контексте настоящего описания обозначает глутаминилциклазу (ОС) и ОС-подобные ферменты. ОС и ОС-подобные ферменты имеют идентичную или сходную ферментативную активность, обозначенную далее как ОС-активность. Следует отметить, что ОС-подобные ферменты могут принципиально отличаться от ОС по молекулярной структуре.
Понятие «ОС-активность» в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (рС1ц*), или Ν’концевого Ь-гомоглутамина, или Ε-β-гомоглутамина с образованием циклического пирогомоглутаминового производного с выделением в свободном состоянии аммиака (см. ниже схемы 1 и 2).
Схема 1
Циклизация глутамина с помощью ОС
пептид | | пептид | |
ΝΗ | Ϊ ΗΝ | |
Н,М._ X. | \_=о | |
О | ΝΗ3 ή | /ΝΗ |
Ο;>^ΝΗ2 | ОС | ч О |
- 12 009291
Схема 2
Циклизация Ь-гомоглутамина с помощью ^С
Понятие «ЕС» в контексте настоящего описания обозначает побочную активность ОС и ОС-подобных ферментов, таких как глутаматциклаза (ЕС), которая обозначена далее как ЕС-активность.
Понятие «ЕС-активность» в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию Ν-концевых глутаматных остатков с образованием пироглутаминовой кислоты (рО1и*) с помощью ОС (см. ниже схему 3).
Понятие «металлзависимый фермент» в контексте настоящего описания обозначает фермент(ы), который (ые) связывает(ют) ион металла для того, чтобы осуществлять присущую ему(им) каталитическую функцию и/ или для которого(ых) требуется связывание иона металла для формирования каталитически активной структуры.
Молекулы, которые связываются с ферментами и понижают или повышают их активность, называют «эффекторы». Эффекторы могут модифицировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут иметь как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами; ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы связываются с регуляторными сайтами или аллостерическими сайтами (от греческого «другая форма»), это понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте.
Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения предпочтительными могут являться либо активаторы, либо ингибиторы.
Схема 3
Ν-концевая циклизация незаряженных глутамильных пептидов с помощью ОС (ЕС)
Следующим объектом настоящего изобретения является идентификация новых физиологических субстратов ОС. Их идентифицировали, осуществляя эксперименты по циклизации, описанные в примере 5, с использованием пептидов млекопитающих. Предварительно человеческую ОС и ОС из папайи выделяли согласно процессу, описанному в примере 1. Применяемые методы описаны в примере 2, а применяемый пептидный синтез изложен в примере 6. Результаты исследования представлены в табл. 1.
Таблица 1 Новые физиологические субстраты глутаминилциклазы (*, количественное определение проведено с помощью ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ-экспериментов)
Субстрат | Человеческая ОС | ОС из папайи | ||||
км (мкМ) | ^са! (с’*) | мМ'1 с'1) | Км (мкМ) | ^са1 (с'*) | кса(/Км (мМ-1 с'1) | |
[(ЛпУгастрин | 31 ±1 | 54,1 ±0,6 | 1745,2 +36,9 | 34 ±2 | 25,8 +0,5 | 759 ±30 |
[ОП^-нейротензин | 37 ±1 | 48,8 +0,4 | 1318,9 ±24,8 | 40 ±3 | 35,7 ±0.9 | 893 +44 |
[ΟΙη'ΐ-ΓΡΡ | 87 ±2 | 69,6 +0,3 | 800,0 ±14,9 | 232 ±9 | 32,5 +0,4 | 140+4 |
[О1п']-ТКН | 90 +4 | 82,8 ±1,2 | 920,0 ±27,6 | н.д. | Н.д. | Н.д. |
[СИп’рСпКН | 53 ±3 | 69,2 + 1,1 | 1305,7 ±53,2 | 169 ±9 | 82,5 ±1,9 | 488,2 +14,8 |
[СИп ]-глюкагон(3- 29) | * | * | ||||
[611?]-вещество Р(5- 11) | * | * |
- 13 009291
Все анализы осуществляли в оптимальном диапазоне активности и стабильности либо человеческой, либо растительной ОС что продемонстрировано в примере 4.
Άминокислотные последовательности физиологически активных пептидов, несущих Ν-концевой остаток глутамина и, следовательно, являющихся субстратами для фермента РС, представлены в табл. 2.
Таблица 2 Лминокислотные последовательности физиологически активных пептидов с Ν-концевыми остатками глутамина
Пептид | Аминокислотная последовательность | Функция |
гастрин 17 Змбзв-Рго!: Р01350 | ()ЮР 9/1. ΕΕΕΕΕΑΥΩλΥΜ ОГ (амид) | Гастрин стимулирует слизистую желудка к производству и секреции соляной кислоты и поджелудочную железу к секреции ее пищеварительных ферментов. Он стимулирует также сокращение гладких мышц и усиливает кровоток и секрецию воды в желудке и тонком кишечнике. |
нейротензин 3\νΐ85-ΡΓ0ΐ: Р30990 | ΟίΥΕΝΚΡΚΒ.Ρ У1Ь | Нейротензин играет эндокринную и паракринную роль в регуляции метаболизма жиров Он вызывает сокращение гладких мышц. |
РРР | ОЕР амид | Трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТКН), обнаружен в семенной плазме. В современных исследованиях /и νίζτο и ίη νϊνο установлено, что ГРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы. |
ткн 8уу183-Рго1: Р20396 | С)НР амид | ТКН функционирует в качестве регулятора биосинтеза Т8Н в передней доле гипофиза и в качестве нейротрансмиттера/нейром одулятора в центральной и периферической нервной системе. |
ОпКН 5Мз8-Рго1: Р01148 | ОШУКУбЬ КР(О) амид | Стимулирует секрецию гонадотропинов; стимулирует секрецию, как лютеинизирующего, так и фолликулостимулируьощег о гормона. |
ССИ6 (малый индуцибельный цитокин А16) 8м0зз-Рго1: 015467 | рРКУРЕ1У УЫТРЗТССЬК УУЕКУБРККЕ ννΟΥΚΚΑίΝΟ НЬРАПЕУТК ΚΝΚΕΥΟΤΝΡΝ ГЮУАОЕУТКП ΡΝΕΡΕΕΡΤΚΝ БЗТУКПТАК ΝΟ<2Ρ()ΕΕΝ8ζ> | Обладает хемотаксической активностью для лимфоцитов и моноцитов, но не для нейтрофилов. Проявляет также высокую миелосупрессорную активностью, подавляет пролиферацию миелоидных клеток-предшественников. Рекомбинантный 8СУА16 обладает хемотаксической активностью для моноцитов и ТНР-1моноцитов, но не для покоящихся лимфоцитов и нейтрофилов. Индуцирует поток кальция в ТНР-1клетках, которые предварительно десенсибилизированы посредством предыдущей экспрессии ΚΑΝΤΕ8. |
- 14 009291
1ССЬ8 (малый индуцибельный цитокин А8) 8тйП88-Рго1: Р80075 | (}РО8У81 ΡΙΤΟΟΡΝνίΝ КЮРК/ЖЬЕЗ ΥΤΚΙΤΝΙΟΟΡ ΚΕΑνίΡΚΤΚΚ СКЕУСАОРКЕ ΚΐννΚΟ8ΜΚΗΕ ϋΟΙΓρΝΙ,ΚΡ | Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты, лимфоциты, базофилы и эозинофилы. Может играть роль в неоплазии и воспалительных реакциях хозяина. Этот белок может связывать гепарин. |
ССЬ2 (малый индуцибельный цитокин А2) 5\νίδ8-ΡΓοί: Р13500 | ΟΡΟΑΙΝΑ ΡνΤίΧΎΝΕΤΝ КК18У(}КЕА8 УК.К1Т88КСР ΚΕΑνίΓΚΤίν АКЕ1САБРК0 ΚΛνν<2Ο8ΜϋΗΕ СКОТрТРКТ | Хемотаксический фактор, привлекающий моноциты и базофилы, но не нейтрофилы или эозинофилы. Повышает противоопухолевую активность моноцитов. Участвует в патогенезе заболеваний, характеризующихся инфильтрацией моноцитов, таких как псориаз, ревматоидный артрит или атеросклероз. Может участвовать в рекрутменте моноцитов в стенке артерий в процессе развития атеросклероза. Связывается с ССВ.2 и ССК4. |
ССЫ8 (малый индуцибельный цитокин А18) 8твз-Рго1: Р55774 | рУОТИКЕБС ουνγτεν/οιρ ΟΚΡίνϋΥΚΕΤ 8Р(2СРКР6У1 ЬЕТККОКр1С ΑΟΡΝΚΚ\νν(2Κ ΥΙδΏΕΚΕΝΑ | Хемотаксический фактор, привлекающий лимфоциты, но не моноциты или гранулоциты. Может участвовать в В-клегочной миграции в В-клеточные фолликулы в лимфатических узлах Привлекает нестимулированные Τ’лимфоциты к дендритным клеткам и активированные макрофаги в лимфатические узлы, обладает хемотаксической активностью для нестимулированных Тклеток, СЭ4+- и СО8+-Т клеток и поэтому может играть роль, как в гуморальных, так и в клеточно-опосредуемых иммунных ответах. |
Фракталкин (нейротактин) 8ш13в-Рго1: Р78423 | С)НН6УТ КСЬПТСЗКМТ ЗИРУАЬЫН Υ(}<3Ν(2Α8Γ6Κ КАПЬЕТ^Н КЕРСАОРКЕЦ ХУУКОАМрНЬО Κζ>ΑΑΑΕΤΚΝ<3 СТРЕКрЮЕУ ΚΡ ΚΤΤΡΑАСС ΜΌΕ8ννΐ_ΕΡΕ АТОЕ888ЬЕР ΤΡ88ς>ΕΑς>ΚΑ ШТ8РЕЕРТС νΤ6886ΤΚΕΡ ΡΤΡΚΑΟϋΟΟΡ УСТЕЬРКУРР У8ТААТ1¥С>88 ΛΡΗΓ)Ρ<3Ρ8ΤΛν ΑΕΑΚΤ5ΕΑΡ8 Т(?ОР8ТС)А8Т Α88ΡΑΡΕΕΝΑ Ρ8Ε09Κνλν09 698ΡΚΡΕΝ8Ε ЕКЕЕМСРУРА ΗΤΠΑΡΟΓΑνΟΡ σδΜΑΗνεννρ У88ЕОТР8КЕ РУА8С8\УТРК ΑΕΕΡΙΗΑΤΜΟ Р9аЬОУЫТР νΡϋΑςΑΑΤΚΚ ΟΑνσίΧΑΡΕΟ ЬЬРСЬОУАМР ТУО81.ОС1СРК КМАОЕМАЕСЬ ΚΥΙΡΚ80Ο8Ν зууьуру | Растворимая форма является хемотаксической для Т-клеток и моноцитов, но не для нейтрофилов. Связанная с мембраной форма усиливает адгезию таких лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Может играть роль в регуляции процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелии. Связывается с схЗсг!. |
- 15 009291
ССЬ7 (малый индуцибельный цитокин А7) 5М88-Рго{: Р80098 | ζ)ΡνθΙΝΤ 8ТТССΥΚΡΙΝ КК1РК0КБЕ8 УКЕТТЗЗНСР ΚΕΑνίΓΚΤΚΧ Γ)Κ.ΕΙ€ΑϋΡΤζ> КШ'ООЕМКНЬ ОККТОТРКГ | Хемотаксической фактор, привлекающий моноциты и эозинофилы, но не нейтрофилы. Усиливает противоопухолевую активность моноцитов. Индуцирует также высвобождение желатиназы В. Этот белок может связывать гепарин. Связывается с ССК.1, ССР2 и ССКЗ. |
орексин А (гипокретин-1) 5\νΪ88-ΡΓθΙ 043612 | ОРБРОССКрК ТСЗСКЬУЕЬЬ ΗΟΑΟΝΗΑΑΟΙ ЬТБ | Нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и в нарушении сна, вероятно» из-за координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных, связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма» нарушении функции вегетативной нервной системы, нарушении гормонального баланса и нарушении регуляции общей воды организма. Орексин-А связывается как с 0X1 К, так и с 0Х2К с высокой (7) аффинностью. |
вещество Р | КРК Р<2<)ЕЕ<ЗЬМ | Принадлежит к тахикинам. Тахикины представляют собой активные пептиды, которые возбуждают нейроны, вызывают поведенческие реакции, являются эффективными вазодилататорами и усиливающими секрецию факторами и сокращают (прямо или косвенно) целый ряд гладких мышц. |
Согласно четвертому варианту осуществления изобретения были идентифицированы в качестве новых физиологических субстратов ОС пептиды |С1п'|гастрин (длиной 17 и 34 аминокислоты), |С1п'|нейротензин и |С1п'|ЕРР. Гастрин, нейротензин и ЕРР несут остаток рО1и в Ν-концевом положении. Установлено, что у всех пептидов этот Ν-концевой остаток рО1и образован из Ν-концевого глутамина с помощью ОС-катализа. В результате эти пептиды активизируются с точки зрения их биологической функции при превращении Ν-концевого остатка глутамина в рО1и.
Клетки, обладающие способностью к трансдукции через эпителий, прежде всего несущие гастрин (О) клетки, осуществляют координацию секреции желудочной кислоты и поступающей в желудок пищи. В современных исследованиях установлено, что из предшественника гастрина образуются продукты с множеством видов активности и что существует целый ряд важных моментов в биосинтезе гастрина. Участвующие в биосинтезе предшественники и промежуточные продукты (прогастрин и О1у-гастрины), возможно, представляют собой факторы роста; их продукты, амидированные гастрины, регулируют пролиферацию эпителиальных клеток, дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток (ЕСЬ-клеток) и экспрессию генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также острую стимуляцию секреции кислоты. Гастрин стимулирует также производство представителей семейства эпидермального фактора роста (ЕОЕ), которые, в свою очередь, ингибируют функцию париетальных клеток, но стимулируют рост поверхностных эпителиальных клеток. Концентрации гастрина в плазме у пациентов, зараженных Не11соЬас1ег ру1оп, у которых, как известно, существует повышенный риск возникновения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, повышены (Эоскгау О.1., 1. Рйузю1. 15, 1999, сс 315-324).
Известно, что пептидный гормон гастрин, который выделяется из антральных О-клеток, стимули
- 16 009291 рует синтез и высвобождение гистамина из ЕСЬ-клеток в кислородпродуцирующую слизистую через ССК-2-рецепторы. Мобилизованный гистамин индуцирует секрецию кислоты в результате связывания с Н(2)-рецепторами, локализованными на париетальных клетках. В современных исследованиях сделано предположение о том, что гастрин, как в виде полностью амидированной, так и в виде менее процессированных форм (прогастрин и удлиненный глицином гастрин), также является фактором роста в желудочно-кишечном тракте. Было установлено, что основное трофическое действие амидированного гастрина связано с кислородпродуцирующей слизистой желудка, где он вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток желудка и ЕСЬ-клеток, что приводит к увеличению массы париетальных и ЕСЬ-клеток. С другой стороны, основной мишенью трофического действия менее процессированного гастрина (например, удлиненного глицином гастрина), вероятно, является слизистая ободочной кишки (Кой Т.1. и Сйеи, И., Кеди1. Рер1. 93, 2000, сс. 37-44).
Согласно пятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОС для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, прежде всего пролиферации слизистых клеток желудка, пролиферации эпителиальных клеток, дифференцировки продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток (ЕСЬ) и экспрессии генов, связанных с синтезом и хранением гистамина в ЕСЬ-клетках, а также для стимуляции острой секреции кислоты у млекопитающих путем поддерживания или повышения концентрации активного |рС1и'| гастрина.
Согласно шестому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов ОС для лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, связанного или не связанного с Нейойас1ег ру1оп. у млекопитающих путем снижения скорости превращения неактивного [01η1] гастрина в активный |рС1и'| гастрин.
Нейротензин (НТ) представляет собой нейропептид, участвующий в патофизиологии шизофрении, который специфически модулирует системы нейротрасмиттеров (нейромедиаторов), регуляция которых, как продемонстрировано ранее, нарушается при этом заболевании. Клинические исследования, при которых определяли концентрации НТ в спинно-мозговой жидкости (СМЖ), позволили выявить группу страдающих шизофренией пациентов с пониженными концентрациями НТ в ЦСЖ, которые восстанавливались при эффективном лечении с помощью антипсихотических лекарственных средств. Известны также данные, которые являются важным подтверждением роли НТ-систем в механизме действия антипсихотических лекарственных средств. Поведенческие и биохимические реакции при введении НТ в центральную нервную систему очень сходны с реакциями на системное введение антипсихотических лекарственных средств, и антипсихотические лекарственные средства повышают нейротрансмиссию НТ. Совокупность этих данных привела к гипотезе о том, что НТ функционирует в качестве эндогенного антипсихотического агента. Кроме того, обычные и атипичные антипсихотические лекарственные средства по-разному изменяют нейротрансмиссию НТ в области черного тела и в мезолимбических допаминсодержащих конечных областях, и эти эффекты обусловливают способность вызывать побочные действия и эффективность, соответственно (Вшйег Е.В. и др., Вю1. РкусЫайу, 50, 2001, сс. 856-872).
Согласно седьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов ОС для приготовления антипсихотических лекарственных средств и/или для лечения шизофрении у млекопитающих. Эффекторы ОС либо поддерживают, либо повышают концентрацию активного [р01и1]нейротензина.
Стимулирующий оплодотворение пептид (ЕРР), трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (ТИН), обнаружен в семенной плазме. Современные исследования ίη νίΐτο и ίη νίνο позволили установить, что ЕРР играет важную роль в регуляции фертильности спермы. В частности, ЕРР, прежде всего, стимулирует «включение» не способных к оплодотворению (неактивных) сперматозоидов и существенно быстрее делает их фертильными, а затем поддерживают эту способность посредством того, что сперматозоиды не подвергаются спонтанной потере акросомы и вследствие этого не теряют способность к оплодотворению. Аденозин, который, как известно, регулирует путь трансдукции сигнала аденилилциклазы (АС)/цАМФ, приводит к аналогичным реакциям и фактически усиливает их. Установлено, что и ЕРР, и аденозин стимулируют производство цАМФ в неактивных клетках, но ингибируют его в активных клетках, причем ЕРР-рецепторы каким-то образом взаимодействуют с аденозиновыми рецепторами и 0-протеинами для осуществления регуляции АС. Эти события влияют на состояние фосфорилирования тирозина различных белков, некоторые из которых важны для начального «включения», другие, вероятно, участвуют в самой реакции акросомы. Кальцитонин и ангиотензин II, также обнаруженные в семенной плазме, оказывают аналогичные действия ίη νίίτο на неактивные сперматозоиды и могут усиливать реакции на ЕРР. Эти молекулы оказывают аналогичные действия ίη νίνο, оказывая влияние на фертильность путем стимуляции и затем поддержания способности к оплодотворению. Любое уменьшение доступности ЕРР, аденозина, кальцитонина и ангиотензина II или дефекты в их рецепторах участвуют в развитии мужского бесплодия (Егакег Ь.И. и Айеоуа-Оыдита 8. А., Уйаш. Ногт. 63, 2001, сс. 1-28).
Согласно восьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов ОС для приготовления препятствующих оплодотворению лекарственных средств и/или для снижения фертильности у млекопитающих. Понижающие активность эффек
- 17 009291 торы ОС снижают концентрацию активного |рС1и'|ЕРР. что приводит к предупреждению способности к оплодотворению спермы и к дезактивации сперматозоидов. В противоположность этому, установлено, что повышающие активность эффекторы ОС могут стимулировать фертильность особей мужского пола и их можно применять для лечения бесплодия.
Согласно девятому варианту осуществления настоящего изобретения были идентифицированы дополнительные физиологические субстраты ОС. Они представляют собой [С1п1]ССЬ2, [С1п1]ССЬ7, [С1п1]ССЬ8, [С1п1]ССЬ16, [С1п1]ССЬ18 и [С1п!]фракталкин (более подробные характеристики приведены в табл. 2). Эти полипептиды играют важную роль в таких физиологических состояниях, как подавление пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий.
В настоящее время в клинических опытах изучено несколько цитотоксических вакцин на основе пептидов Т-лимфоцитов против гепатита В, вируса иммунодефицита человека и меланомы. Одной из перспективных вакцин против миеломы, которую применяют индивидуально или в сочетании с другими опухолевыми антигенами, является декапептид ΕΕΑ. Этот пептид является аналогом иммунодоминантного пептида антигена Ме1аη-Α/МΑВТ-1 с Ν-концевой глутаминовой кислотой. Известно, что аминогруппа и гамма-карбоксильная группа глутаминовых кислот, а также аминогруппа и гамма-карбоксамидная группа глутаминов легко конденсируются с образованием пироглутаминовых производных. Для решения указанных проблем, связанных со стабильностью, было разработано несколько пептидов, представляющих интерес с фармацевтической точки зрения, которые содержали пироглутаминовую кислоту вместо Ν-концевого глутамина или глутаминовой кислоты без потери фармакологических свойств. Однако по сравнению с ΕΕΑ у производного пироглутаминовой кислоты (Ρу^Ε^Α), а также Ν-концевого кэппированного ацетилом производного (ΑсΕ^Α) не удалось сохранить цитотоксическую активность, присущую Т-лимфоцитами (СТЬ). Несмотря на то, что в Ρу^Ε^Α и ΑсΕ^Α были внесены кажущиеся очень небольшими модификации, эти два производных, вероятно, обладают более низкой аффинностью по сравнению с ΕΕΑ к специфическому классу I главного комплекса гистосовместимости. Следовательно, для того, чтобы полностью сохранить активность ΕΕΑ, следует избегать образования Ρу^Ε^Α (Беск А. и др., I. Рер! Вез. 57(6), 2001, сс. 528-38.). В последние годы установлено, что при меланомах происходит также сверхэкспрессия глутаминилциклазы (ОС) (Возз Э.Т. и др., №11. Сепе! 24, 2000, сс. 227-235).
Согласно десятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патофизиологических состояний, например для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, злокачественного метастаза, меланомы, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, нарушенных гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий.
Согласно одиннадцатому варианту осуществления настоящего изобретения был идентифицирован [С1п!]орексин в качестве физиологического субстрата ОС. Орексин А представляет собой нейропептид, который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и нарушения сна, вероятно, в результате координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, функции вегетативной нервной системы, гормональном балансе и регуляции общей воды организма.
Согласно двенадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушенного всасывания пищи и сна, нарушенной связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушенной функции вегетативной нервной системы, нарушенного гормонального баланса и нарушенной регуляции общей воды организма.
Экспансия полиглутамина в некоторые белки приводит к возникновению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Кеннеди. Их механизм пока остается неясным. Биохимические свойства полиглутаминовых повторов предполагает наличие одного из возможных объяснений: эндолитическое расщепление связи глутаминил-глутаминил с последующим образованием пироглутамата может принимать участие в патогенезе в результате повышения катаболитической стабильности, гидрофобности, амилоидогенеза и нейротоксичности полиглутаминильных белков (8а1бо Т., Меб. Нуро(Ьезез, 54(3), март 2000, сс. 427-429).
Таким образом, согласно тринадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов ОС для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Паркинсона и болезни Гентингтона.
Согласно четырнадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложен общий путь снижения или ингибирования ферментативной активности ОС. Предложены также репрезентативные ингибиторы.
Первоначально в качестве ингибиторов ОС млекопитающих был описан только 1,10-фенантролин и восстановленный 6-метилптерин (Ъи8Ьу А.Н.1. и др., I. Βώ! СЬет. 262, 1987, сс. 8532-8536). ЭДТК не ингибирует ОС, из чего было сделано заключение, что ОС не представляет собой металлзависимый фермент (Лизку А.Н.1. и др., I. Βώ! СЬет. 262, 1987, сс. 8532-8536, Βаΐетаη В.С.1. и др., Β^οсЬет^зί^у 40, 2001, сс. 11246-11250, ΒοοίЬ ВЛ. и др., ВМС Βώ^^ 2, 2004). Однако при создании настоящего изобретения
- 18 009291 установлено, что человеческая ОС и другие ОС животного происхождения являются металлзависимыми ферментами, что доказано по характеристикам ингибирования ОС 1,10-фенантролином, дипиколиновой кислотой, 8-гидроксихинолином и другими хелаторами (фиг. 18, 19) и по реактивации ОС ионами переходных металлов (фиг. 20). И, наконец, зависимость от металлов вытекает при сравнении с последовательностями других зависимых от металлов ферментов, что свидетельствует о превращении хелатирующих аминокислотных остатков также и в человеческой ОС (фиг. 21). Взаимодействие соединений с ионом металла, связанным с активным сайтом, представляет собой общий путь ингибирования ОС-активности.
При создании настоящего изобретения установлено, что имидазольные производные являются эффективными ингибиторами ОС. С помощью непрерывного анализа (подробно описанного в примере 2) проанализирован целый ряд имидазольных производных в плане их способности ингибировать человеческую ОС в качестве представителя высококонсервантивных ОС млекопитающих.
Таким образом, в настоящем изобретении предложены имидазольные производные, а также гистидин и его производные в качестве понижающих активность эффекторов ОС и описаны их характеристики с точки зрения типа ингибирования и эффективности. Структуры и значения К1 представлены в табл. 3 и 4. Результаты подробно описаны в примере 7.
Таблица 3
Константы ингибирования имидазольных производных в катализируемой человеческой ОС реакции (Опыты проводили при 30°С в 0,05М трис-НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК)
Структура
Значение К·. (мМ)
1,1 -сульфонилдиимидазол
4,5-дицианоимидазол ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует ингибирование отсутствует
С-4(5)-производные
Ν-омега-ацетилгистамин
Ь-гистидинамид
С-2-производные
2-метилбензилимидазол
2-этил-4-метилимидазол
2-аминобензимидазол
2-хлор-1 Н-бензимидазол
Ь-гистидинол
Ь-гистидин
4-имидазолкарбоксальдегид метиловый эфир имидазол4-карбоновои кислоты
Е-гистамин
С-4,5-производные
5-гидроксиметил-4-метилимидазол амид 4-аминоимидазол-5карбоновой кислоты
4,5-дифенилимидазол
Прочие
3-(1Н-имидазол-1-ил)-1-(3метилбензо|Ь]тиофен-2ил)пропан-1-он
Соединение
Структуры ядра имидазол бензимидазол ^-/-производные
1-бензимидазол
I -метилиммидазол
1-винилимидазол диимидазолидид щавелевой кислоты /ν-ацетилимидазол
А-(триметилсилил)имилазол /У-бензоилимидазол
1-(2-оксо-2(Ьенилэтил)имидазол
-(З-аминопропил)имидазол
-фенилимидазол
- 19 009291
4-[(1-метил-1Н-имидазол-5 ил)метил]-3пропилдигидрофуран-2(ЗН)-он
- 0,0067± 0,0003
4-(2-(1 //-имидазо л-1 ил)этокси]бензойная кислота
0,0034 ± 0,0001
3-[3-(1Н-имидазол-1ил)пропил]-2тиоксоимидазолидин-4-он
0,00041 ± 0,00001
5-нитро-2-[2-([ {3-( ΊΗимидазол-!ил)пропил } амино] карбонил)фения]фурамид
0,0066 ± 0,0004
М-(4-хлорфенил)-Ы'-[2-(1Н· имидазол-1 ил)этил]тиомочевина
0,00165 ± 0,00007 метиловый эфир 2-[(5имидазол-1- 0,0322 ± 0,0007 илметилпирролидин-2карбонил)амино]пропионово й кислоты
метиловый эфир 2-[(5- н.д имидазол-1 -илметил-2,3дигидро-1Н-пиррол-2карбонил)амино]пропионово й кислоты
имидазо<1.5а>пиридин 0,0356 ± 0,0005 метил-(25’)-2-{[(25)-2-амино- 0,164 ± 0,004
5-( 1Я-имидазол-1-иламино)5-оксопентаноил]амино}-3метилбутаноат
Таблица 4
Ингибирование ОС Ь-гистамином и его двумя биологическими метаболитами (также называемыми телеметилгистаминами)
- 20 009291
При создании изобретения в процессе изучения ферментативной активности неожиданно было установлено, что помимо Ν-концевого глутаминильного остатка, Ν-концевые β-гомоглутаминильные остатки удовлетворяют характеристикам в качестве субстратов ОС из растений и млекопитающих. Ν-концевой β-гомоглутаминильный остаток превращался в 5-членное лактамовое кольцо посредством реакции, катализируемой человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно. Результаты описаны в примере 5. Применяемый метод проиллюстрирован в примере 2, а пептидный синтез осуществляли согласно методу, описанному в примере 6.
Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам скрининга эффекторов ОС.
Предпочтительный способ скрининга для идентификации модифицирующих активность эффекторов ОС из группы соединений, предусматривает стадии, которые заключаются в том, что:
а) приводят в контакт соединения с ОС в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;
б) добавляют субстрат ОС;
в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную ОС-активность; и
г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС для идентификации модифицирующего активность эффектора.
Другой предпочтительный способ скрининга аналогичен методу идентификации и отбора эффекторов, которые взаимодействуют непосредственно или опосредованно с ионом металла, связанным с активным сайтом ОС, и он предусматривает стадии, которые заключаются в том, что:
а) приводят в контакт соединения с ОС в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;
б) добавляют субстрат ОС который подвергается превращению с помощью ОС;
в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную ОС-активность; и
г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС, где изменения можно использовать для идентификации модифицирующего активность эффектора.
Предпочтительными для применения в вышеуказанных методах скрининга являются ОС млекопитающих или ОС из папайи. Особенно предпочтительной является ОС млекопитающих, так как эффекторы, идентифицированные с помощью указанных способов скрининга, можно использовать для лечения болезней млекопитающих, прежде всего человека.
Эти агенты, отобранные с помощью описанных выше способов скрининга, могут осуществлять снижение превращения по меньшей мере одного из субстратов ОС (негативные эффекторы, ингибиторы) или путем увеличения превращения по меньшей мере одного субстрата ОС (позитивные эффекторы, активаторы).
Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть превращены в кислотно-аддитивные соли, прежде всего фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли.
Соли соединений, предлагаемых в изобретении, могут находиться в форме неорганических или органических солей.
Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно превращать и применять в форме кислотно-аддитивных солей, прежде всего в форме фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Фармацевтически приемлемая соль, как правило, находится в форме, в которой основная боковая цепь протонирована неорганической или органической кислотой. Репрезентативными органическими или неорганическими кислотами являются соляная, бромисто-водородная, перхлорная, серная, азотная, фосфорная, уксусная, пропионовая, гликолевая, молочная, янтарная, малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, бензойная, миндальная, метансульфоновая, гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, щавелевая, памоновая, 2-нафталинсульфоновая, паратолуолсульфоновая, циклогексансульфамовая, салициловая, сахариновая или трифторуксусная кислота. Подразумевается, что все формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, в виде кислотно-аддитивных солей подпадают под объем настоящего изобретения.
Учитывая близкое сходство соединений в свободной форме и соединений в форме соли, следует иметь в виду, что когда в настоящем описании упоминается соединение, то при этом подразумевается соответствующая его соль, при условии, что существует возможность ее получения и применения в определенных условиях.
Если соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют по меньшей мере один хиральный центр, то они могут существовать в виде энантиомеров. Если соединения имеют два или более хиральных центра, то они могут, кроме того, существовать в виде диастереоизомеров. Следует иметь в виду, что все такие изомеры и их смеси подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений могут существовать в полиморфной форме, и такие соединения подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые соединения могут образовывать сольваты с водой (т.е. гидраты) или с обычными органическими растворителями, и подразумевается, что такие сольваты также подпадают под объем настоящего изобретения.
Соединения, включая их соли, можно получать также в форме гидратов или в форме, содержащей другие растворители, применяемые для их кристаллизации.
- 21 009291
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предупреждения или лечения состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС у индивидуума, нуждающегося в этом, который заключается в том, что вводят любое из соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, или содержащих их фармацевтических композиций в количестве и согласно схеме приема лекарственного средства, терапевтически эффективных для лечения состояния. Кроме того, под объем настоящего изобретения подпадает применение соединений, предлагаемых настоящем изобретении, и их соответствующих фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения состояния у индивидуума, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС. Соединение можно вводить пациенту с помощью любого стандартного пути введения, включая (но не ограничиваясь ими) внутривенное, оральное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, парентеральное введение и их комбинации.
Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются фармацевтические композиции, представляющие собой лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение, предлагаемое в изобретение, или его соль необязательно в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или растворителями.
Фармацевтические композиции могут находиться, например, в форме препаратов для парентерального или энтерального введения и содержать соответствующие носители или могут находиться в форме препаратов для орального введения, которые могут содержать соответствующие носители, пригодные для орального введения. Предпочтительно они находятся в форме препаратов для орального введения.
Эффекторы ОС-активности, вводимые согласно изобретению, можно применять в составе фармацевтических препаратов или комплексов препаратов в качестве ингибиторов или в сочетании с ингибиторами, субстратами, псевдосубстратами, ингибиторами экспрессии ОС, связывающимися белками или антителами к таким белковым ферментам, которые снижают концентрацию белка ОС в организме млекопитающих. Соединения, предлагаемые в изобретении, позволяют осуществлять регулирование лечения применительно к конкретным пациентам и заболеваниям, в частности при их использовании можно избегать индивидуальной непереносимости, аллергии и побочных действий.
Соединения обладают также различной зависимостью активности от времени. Таким образом, у врача, осуществляющего лечение, имеется возможность различного подхода к индивидуальному состоянию пациента: он может точно регулировать, с одной стороны, быстроту начала действия и, с другой стороны, продолжительность действия и, прежде всего, интенсивность действия.
Предпочтительный способ, предлагаемый в изобретении, представляет собой новый подход к лечению или предупреждению состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента ОС у млекопитающих. Его преимущество заключается в том, что он является простым, пригодным для коммерческого применения и удобным для применения, прежде всего, при лечении заболеваний, которые обусловлены нарушением баланса концентрации физиологически активных субстратов ОС, например перечисленных в табл. 1 и 2, прежде всего, для лечения млекопитающих, прежде всего, для лечения человека.
Соединения предпочтительно можно вводить, например, в форме фармацевтических композиций, которые содержат действующее вещество в сочетании с общепринятыми добавками, такими как разбавители, эксципиенты и/или носители, известне в данной области техники. Их можно вводить, например, парентерально (например, ί.ν. в физиологическом растворе) или энтерально (например, орально в виде композиции со стандартными носителями).
В зависимости от их эндогенной стабильности и биологической доступности можно вводить одну или несколько доз соединений в день для достижения требуемой нормализации уровней глюкозы в крови. Такие дозы для человека могут составлять, например, от примерно 0,01 до 250,0 мг в день, предпочтительно от примерно 0,01 до 100 мг соединения на кг веса тела.
Путем введения млекопитающим эффекторов ОС-активности можно предупреждать, или облегчать, или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, язвенная болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
Кроме того, введение млекопитающему эффекторов ОС-активности может приводить к потере функции сперматозоидов, подавляя тем самым мужскую фертильность. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ регуляции и контроля мужской фертильности и применение понижающих ОС-активность эффекторов для приготовления контрацептивных лекарственных средств для особей
- 22 009291 мужского пола.
Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов ОС-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников.
Соединения, применяемые согласно изобретению, можно включать хорошо известным методом в состав стандартных композиций, таких, например, как таблетки, капсулы, драже, пилюли, суппозитории, гранулы, аэрозоли, сиропы, жидкие, твердые и кремообразные эмульсии и суспензии и растворы, с использованием инертных нетоксичных фармацевтически приемлемых носителей и добавок или растворителей. В каждой из таких композиций обладающие терапевтической эффективностью соединения предпочтительно присутствуют в концентрации примерно от 0,1 до 80 мас.%, более предпочтительно от 1 до 50 мас.% в пересчете на общую массу смеси, т.е. в количествах, достаточных для обеспечения требуемого диапазона доз.
Субстанции можно применять в качестве лекарственных средств в форме драже, капсул, жевательных капсул, таблеток, капель, сиропов или также в виде суппозиториев или в виде назальных спреев.
Композиции можно предпочтительно приготавливать, например, путем разбавления действующего вещества растворителями и/или носителями необязательно с применением эмульгаторов и/или диспергаторов, например, в том случае, когда в качестве разбавителя используют воду, необязательно можно применять в качестве вспомогательных растворителей органические растворители.
Примерами эксципиентов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются вода, нетоксичные органические растворители, такие как парафины (например, фракции нефтепродуктов), растительные масла (например, рапсовое масло, арахисовое масло, кунжутное масло), спирты (например, этиловый спирт, глицерин), гликоли (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль); твердые носители, такие, например, как природные измельченные в порошок минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты), сахара (например, сахар-сырец, лактоза и декстроза); эмульгаторы, такие как неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты, простые эфиры полиоксиэтилена и жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты), диспергаторы (например, лигнин, сульфитный щелок, метилцеллюлоза, крахмал и поливинилпирролидон) и замасливатели (например, стеарат магния, тальк, стеариновая кислота и лаурилсульфат натрия) и необязательно корригенты.
Введение можно осуществлять стандартным методом, предпочтительно энтерально или парентерально, прежде всего, орально. При энтеральном введении таблетки могут содержать в дополнение к указанным носителям дополнительные добавки, такие как цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция, наряду с различными добавками, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал, желатин и т.п. Кроме того, дополнительно в процессе таблетирования можно применять замасливатели, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. В случае водных суспензий и/или эликсиров, предназначенных для орального введения, можно добавлять к действующим веществам помимо вышеуказанных эксципиентов различные корригенты или красители.
В случае парентерального введения можно применять растворы действующих веществ с использованием пригодных жидких носителей. Было установлено, что, как правило, в случае внутривенного введения предпочтительно вводить количества, составляющие примерно от 0,01 до 2,0 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1,0 мг/кг веса тела в день, и в случае энтерального введения доза составляет примерно от 0,01 до 2 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1 мг/кг веса тела в день.
Тем не менее, в некоторых случаях необходимо отступать от указанных количеств в зависимости от веса тела экспериментального животного или пациента или от пути введения, а также в зависимости от вида животного и его индивидуальной реакции на лекарственное средство или от интервала, с которым осуществляют введение. Следовательно, в определенных случаях может оказаться достаточным применять дозы, меньшие, чем указанные выше минимальные количества, в то время как в других случаях указанный верхний предел может быть превышен. В случаях, когда требуется вводить относительно большие количества, может оказаться целесообразным разделять эти количества на несколько однократных доз, вводимых в один день. Для применения для лечения человека можно использовать тот же самый диапазон доз. Вышеуказанные комментарии применимы также и в этом случае.
Примеры фармацевтических композиций
1. Капсулы, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении, на капсулу.
Для получения примерно 10000 капсул приготавливают раствор, имеющий следующий состав.
Соединение, предлагаемое в изобретении 1,0 кг
Глицерин 0,5 кг
Полиэтиленгликоль 3,0 кг
Вода 0,5 кг
5,0 кг
Раствор вносят в мягкие желатиновые капсулы хорошо известным методом. Капсулы можно применять путем разжевывания или проглатывания.
2. Таблетки или таблетки с покрытием или драже, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении.
- 23 009291
Для приготовления 100000 таблеток используют следующее количество ингредиентов.
Соединение, предлагаемое в изобретении, тонкоизмельченное | 10,00 кг |
Глюкоза | 4,35 кг |
Лактоза | 4,35 кг |
Крахмал | 4,50 кг |
Целлюлоза, тонкоизмельченная | 4,50 кг |
Указанные выше компоненты смешивают и затем добавляют раствор, содержащий | |
Поливинилпирролидон | 2,0 кг |
Полисорбат | 0,1 кг |
Вода Примерно 5,0 кг и гранулируют хорошо известным методом путем пропускания влажной массы через решетчатую мельницу, после чего добавляют 0,2 кг стеарата магния и сушат. Конечную смесь для таблеток массой 30,0 кг подвергают обработке с получением выпуклых таблеток массой 300 мг. В идеальном случае, на таблетки можно наносить покрытие или сахарное покрытие хорошо известным методом. Целесообразно, чтобы фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержали комбинацию по меньшей мере одного эффектора ОС-активности и по меньшей мере одного ингибитора ΌΡ IV. Такие фармацевтические композиции можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
Пример 1. Получение человеческой ОС и ОС из папайи.
Штаммы-хозяева и среды.
Штамм Р1сЫа раЧоШ Х33 (АОХ1, АОХ2), который применяли для экспрессии человеческой ОС, выращивали, трансформировали и анализировали согласно инструкциям производителя (фирма Ιηνίίτο^η). Среды, необходимые для Р. райогщ, т.е. забуференную глицерином (ВМСУ) сложную среду или метанольную (ΒΜΜΥ) сложную среду и базальную (минимальную) соляную среду для ферментации, готовили согласно рекомендациям производителя.
Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих человеческую ОС.
Все процедуры клонирования осуществляли с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для экспрессии в дрожжах использовали вектор рР1С2аВ (фирма ΙηνίίΓο^η). Вектор рОЕ-31 (фирма 0|аде1'1) применяли для экспрессии человеческой ОС в Е. сой. кДНК зрелой ОС, начинающуюся с кодона 38, сливали в рамке считывания с плазмидой, кодирующей метку 6хН18. После амплификации с использованием праймеров рОСус-1 и рОСус-2 (табл. 1) и субклонирования фрагмент встраивали в экспрессионный вектор, используя сайты рестрикции 8рЫ и ΗίηάΙΙΙ.
Трансформация Р. раЧопк и экспрессия в небольших объемах (маломасштабная экспрессия).
Плазмидную ДНК амплифицировали в штамме Е. со11 ΙΜ109 и очищали согласно рекомендациям производителя (фирма 0|аде1'1). В применяемой для экспрессии плазмиде рР1С2аВ существуют 3 сайта рестрикции, пригодных для линеаризации. Поскольку 8ас1 и Вк!Х1 осуществляют расщепление внутри кДНК ОС, для линеаризации был выбран сайт Рте1. 20-30 мкг плазмидной ДНК линеаризовали с помощью Рте1, осаждали этанолом и растворяли в стерильной деионизированной воде. Затем 10 мкг ДНК использовали для трансформации компетентных клеток Р. раЧопк путем электропорации согласно инструкциям производителя (фирма ВюИаб). Отбор осуществляли на планшетах, содержащих 150 мкг/мл зеоцина. Одна трансформация с использованием линеаризованной плазмиды позволяла получать несколько сотен трансформантов.
Для тестирования рекомбинантных клонов дрожжей в отношении экспрессии ОС рекомбинанты выращивали в течение 24 ч в 10-мл конических пробирках, содержащих 2 мл среды ΒΜСΥ. Затем дрожжи центрифугировали и ресуспендировали в 2 мл среды ВММ^, содержащей 0,5% метанола. Эту концентрацию поддерживали, добавляя метанол каждые 24 ч в течение вплоть до 72 ч. Затем определяли ОС-активность в супернатанте. Присутствие слитого белка подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга, используя антитело к 6хН18-метке (фирма 0|аде1'1). Клоны, проявляющие наиболее высокую ОСактивность, отбирали для дополнительных экспериментов и ферментации.
Крупномасштабная экспрессия в ферментере.
Экспрессию ОС осуществляли в 5-л реакторе (модель В1о8(а( В, фирма В. Вгннп Ыо1есй.), практически в соответствии с руководством «Рю1па ίοΓηκηΐΗΐίοη ргосекк §шбе1ше8» (фирма ΙηνίΙτο^η). В целом, метод состоял в следующем: клетки выращивали в базальной солевой среде для ферментации, дополненной следовыми количествами солей и глицерином в качестве единственного источника углерода (рН 5,5). В процессе фазы начальной загрузки продолжительностью примерно 24 ч и последующей фазы с периодической подпиткой продолжительностью примерно 5 ч проходило накопление клеточной массы. После достижения массы клеток во влажном состоянии 200 г/л осуществляли индукцию экспрессии ОС, применяя трехстадийную метанольную подпитку, так, чтобы полное время ферментации составляло примерно 60 ч. Затем клетки удаляли из содержащего ОС супернатанта путем центрифугирования при 6000хд, 4°С в течение 15 мин. Значение рН доводили до 6,8, добавляя №1ОН и образовавшийся мутный раствор центрифугировали при 37000х д, 4°С в течение 40 мин. Если раствор оставался мутным, приме
- 24 009291 няли дополнительную стадию фильтрации через целлюлозную мембрану (размер пор 0,45 мкм). Очистка меченной с помощью 6 остатков гистидина (бхНщ) ОС. экспрессированной в Р. райотк. Меченную с помощью Нщ ^С сначала очищали с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (ИМАХ). Для осуществления общепринятой очистки 1000 мл супернатанта культуры вносили на содержащую Νί2+ хелатирующую сефарозную ЕЕ колонку (1,6х20 см. фирма Рйаттас1а), которую уравновешивали 50 мМ фосфатным буфером, рН 6,8, содержащим 750 мМ №С1, со скоростью потока 5 мл/мин. После промывки колонки уравновешивающим буфером, взятым в объеме, равном 10 объемам колонки, и уравновешивающим буфером, содержащим 5 мМ гистидин, взятым в объеме, равном 5 объемам колонки, связанный белок элюировали путем замены на 50 мМ фосфатный буфер, рН 6,8, содержащий 150 мМ Ναί'Ί и 100 мМ гистидин. Полученный элюат подвергали диализу в противотоке 20 мМ бистрис/НС1-буфера, рН 6,8, при 4°С в течение ночи. Затем ОС дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии на колонке типа Мопо 06 (фирма ВюКаб), уравновешенной буфером для диализа. Содержащую ОС фракцию вносили на колонку при скорости потока 4 мл/мин. Затем колонку промывали уравновешивающим буфером, содержащим 100 мМ №С1. Элюцию осуществляли с использованием двух градиентов с использованием уравновешивающего буфера, содержащего 240 и 360 мМ №С1, взятого в объеме, равном 30 или 5 объемом колонки, соответственно. Собирали фракции объемом 6 мл и чистоту анализировали с помощью ДСН-ПААГ. Фракции, содержащие гомогенную ОС, объединяли и концентрировали с помощью ультрафильтрации. Для длительного хранения (-20°С) добавляли глицерин до конечной концентрации 50%. Проводили количественную оценку белка методами Бредфорда или Гилла и Гиппеля (ВтабТотб М.М., Апа1. Вюсйет. 72, 1976, сс. 248-254; ОШ Б.С. и νοη Н1рре1 Р.Н., Апа1. Вюсйет. 182, 1989, сс. 319-326).
Экспрессия и очистка ОС в Е. со11.
Конструкцией, кодирующей ОС, трансформировали клетки линии М15 (фирма 01адеп) и выращивали на планшетах в селективной агаровой ЬВ-среде при 37°С. Для экспрессии белка при комнатной температуре использовали ЬВ-среду, содержащую 1% глюкозы и 1% этанола. Когда значение оптической плотности (ОП600) культуры достигало примерно 0,8, экспрессию индуцировали в течение ночи с помощью 0,1 мМ ИНТГ (изопропилтиогалактозид). После одного цикла замораживания и оттаивания клетки лизировали при 4°С, добавляли 2,5 мг/мл лизоцима в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 300 мМ №1С1 и 2 мМ гистидин, в течение примерно 30 мин. Раствор осветляли путем центрифугирования при 37000хд, 4°С в течение 30 мин с последующей фильтрацией с использованием стеклянной фритты (отделение ДНК) и двух дополнительных стадий фильтрации с использованием целлюлозных фильтров для неочищенных и тонких осадков. Супернатант (примерно 500 мл) вносили на ΝΓ'-ко.тонку для аффинной хроматографии (1,6x20 см) со скоростью потока 1 мл/мин. Элюцию ОС осуществляли с помощью 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 150 мМ №1С1 и 100 мМ гистидин. Содержащую ОС фракцию концентрировали ультрафильтрацией.
Очистка ОС из латекса папайи.
ОС из латекса папайи получали, используя систему ВюСАЭ 700Е (фирма РегеерШ'е Вюкуйетк, Висбаден, Германия) с использованием модифицированной версии ранее описанного метода (2етйоиш Б. и др., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а. 138, 1989, сс. 275-290). 50 г латекса растворяли в воде и центрифугировали согласно описанному методу. Для инактивации протеаз применяли Б-метилметантиосульфонат и полученный неочищенный экстракт подвергали диализу. После диализа весь супернатант вносили на колонку (21x2,5 см внутренний диаметр (ί.ά.)) из БР-сефарозы, которую можно применять при высокой скорости потока (Еа§1 Е1оте, ЕЕ), уравновешенную 100 мМ натрийацетатным буфером, рН 5,0 (скорость потока 3 мл/мин). Элюцию осуществляли в три стадии, повышая концентрацию натрийацетатного буфера, при скорости потока 2 мл/мин. На первой стадии использовали линейный градиент от 0,1 до 0,5М ацетатного буфера, взятого в объеме, равном 0,5 объема колонки. На второй стадии использовали линейное повышение концентрации от 0,5 до 0,68М в 4 объемах колонки. Во время последней стадии элюции использовали 0,85М буфер в 1 объеме колонки. Объединяли фракции (6 мл) с наиболее высокой ферментативной активностью. При ультрафильтрации осуществляли замену концентрации и буфера на 0,02М трис/НС1, рН 8,0 (фирма Атюоп; мембрана с пределом пропускания молекулярной массы 10 кДа).
Добавляли сульфат аммония к концентрированному ферменту из папайи, полученному после стадии ионообменной хроматографии, до получения конечной концентрации 2М. Этот раствор вносили на Еа§1 Е1оте-колонку (21x2,5 см ί.ά.), заполненную бутилсефарозой 4 (скорость потока 1,3 мл/мин), уравновешенную 2М сульфатом аммония, 0,02М трис/НС1, рН 8,0. Элюцию осуществляли в три стадии понижающимися концентрациями сульфата аммония. На первой стадии использовали линейный градиент от 2 до 0,6М сульфата аммония, 0,02М трис/НС1, рН 8,0 в объеме, равном 0,5 объема колонки, при скорости потока 1,3 мл/мин. На второй стадии использовали линейный градиент от 0,6 до 0М сульфата аммония, 0,02М трис/НС1, рН 8,0 в объеме, равном 5 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Последнюю стадию элюции осуществляли, используя 0,02М трис/НС1, рН 8,0, в объеме, равном 2 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Все содержащие ОС-активность фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией. Полученную гомогенную ОС хранили при -70°С. Конечные концентрации белка определяли методом Брэдфорда, осуществляя сравнение со стандартными кривыми, получен
- 25 009291 ными для бычьего сывороточного альбумина.
Пример 2. Анализы глутаминилциклазной активности.
Флуорометрические анализы.
Все измерения осуществляли с использованием ридера для биологических анализов (ВюАввау Веабег) типа НТ8-7000Р1ив для микропланшетов (фирма Регкт Е1тег) при 30°С. Активность ОС оценивали флуорометрически с использованием в качестве субстрата Н-С1η-βNΑ. Образцы содержали 0,2 мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма υη^ζуте, Хорсгольм, Дания) в 0,2М трис/НС1, рН 8,0, содержащем 20 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для β-нафтиламина в условиях анализа. За единицу принимали количество образовавшего в результате катализа ОС 1 мкМ в мин рС1и-βNΑ из Н-С1η-βNΑ в указанных условиях.
Во втором флуорометрическом анализе активность ОС определяли, используя в качестве субстрата Н-С1п-АМС. Реакции осуществляли при 30°С с помощью ридера типа NОVО8ίа^ для микропланшетов (фирма ВМС 1аЫесйио1од1ев). Образцы содержали различные концентрации флуорогенного субстрат, 0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма О1адеп) в 0,05М трис/НС1, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной ОС в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность ОС определяли из стандартной кривой для 7-амино-4метилкумарина в условиях анализа. Результаты кинетических анализов обрабатывали с помощью программы СгаЕй.
Спектрофотометический анализ ОС.
Этот новый анализ применяли для оценки кинетических параметров большинства субстратов ОС. Активность ОС активность анализировали спектрофотометрически с помощью непрерывного анализа, разработанного посредством адаптации ранее описанного дискретного анализа (ВаГетап В.С.1., 1. №иговск МеШобв 30, 1989, сс. 23-28), основанного на использовании глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы содержали соответствующий субстрат ОС, 0,3 мМ НАД-Н, 14 мМ αкетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реакции инициировали, добавляя ОС, и оценивали по снижению абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин. Типичные зависимости образования продукта от времени представлены на фиг. 1.
Начальные скорости оценивали и ферментативную активность определяли из стандартных кривых для аммиака в условиях анализа. Все образцы оценивали при 30°С с использованием ридера для микропланшетов либо типа 8РЕСТВАЕ1иог Р1ив, либо типа 8иппве (оба фирмы ТЕСАК). Данные кинетических анализов обрабатывали с помощью программы СгаЕй.
Анализ ингибирования.
При анализа ингибирования состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него добавляли предполагаемый ингибитор. Для быстрой оценки ингибирования ОС использовали образцы, содержащие 4 мМ соответствующий ингибитор и субстрат в концентрации, соответствующей 1 КМ. Для более детального исследования ингибирования и определения значений К1 оценивали влияние ингибитора на вспомогательные ферменты. В каждом случае не было выявлено никакого влияния на какие-либо другие применяемые ферменты, что позволяет достоверно оценивать ингибирование ОС. Константу ингибирования определяли путем аппроксимации набора характеризующих процесс кривых с помощью общего уравнения для конкурентного ингибирования с использованием программы СгаЕй.
Пример 3. Масс-спектрометрия типа МАЬО1-ТОЕ.
Масс-спектрометрию на основе определения пролета с использованием опосредуемой матрицей лазерной десорбции/ионизация осуществляли с помощью системы Не\\'1е11-Раскагб С2025 ЬО-ТОЕ с линейным анализатором времени пролета. Прибор был снабжен лазером на азоте, работающим при 337 нм, потенциальным источником ускорения (5 кВ) и трубой для измерения пролета длиной 1,0 м. Детектор был установлен для работы в моде с положительно заряженными ионами, и сигналы регистрировали и осуществляли их фильтрацию с помощью цифрового запоминающего осциллоскопа типа ЬеСгоу 9350М, соединенного с персональным компьютером. Образцы (5 мкл) смешивали с равными объемами раствора матрицы. В качестве матрицы применяли раствор ДГАФ/ВКАЦ, полученный путем растворения 30 мг 2,6'-дигидроксиацетофенона (фирма А1бпс11) и 44 мг вторичного кислого цитрата аммония (фирма Ника) в 1 мл смеси ацетонитрил/0,1% ТФК в воде (1:1, об./об.). Небольшой объем (»1 мкл) матричной аналитической смеси вносили в верхний конец зонда и сразу же испаряли в вакуумной камере (оборудование для анализа образцов типа Не\\'1е11-Раскагб С2024А) для гарантии быстрой и гомогенной кристаллизации образца.
Для продолжительной оценки С1и1-циклизации выведенные из Аβ пептиды инкубировали в 100 мкл 0,1М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2 или 0,1М бис-трис-буфера, рН 6,5 при 30°С. Пептиды вносили в концентрации 0,5 мМ [Аβ3-11а] или 0,15 мМ [Аβ3-21а] и 0,2 ед. ОС вносили в течение всех 24 ч. В случае Аβ3-21а образцы для анализа содержали 1% ДМСО. В различные моменты времени образцы удаляли из аналитической пробирки, пептиды экстрагировали с помощью 21рТ1рв (фирма М1Шроге) согласно ре- 26 009291 комендациям производителя, смешивали с раствором матрицы (1:1 об./об.) и после этого определяли масс-спектры. Отрицательный контроль либо не содержал ОС совсем, либо содержал дезактивированный тепловой обработкой фермент. Для исследования ингибиторов состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него вносили ингибитор (5 мМ бензимидазол или 2 мМ 1,10фенантролин).
Пример 4. Зависимость от рН.
Зависимость от рН катализа человеческой ОС и ОС из папайи изучали в условиях скорости реакции первого порядка, что отражает воздействие концентрации протонов на константу специфичности кса1/КМ. Для этой цели применяли парный ферментативный анализ, основанный на использовании пироглутамиламинопептидазы в качестве вспомогательного фермента и Ο1η-βΝΛ в качестве субстрата. Известно, что пироглутамиламинопептидаза является активной и стабильной при рН 5,5-8,5 (Ткиги Ό. и др., 1. Вюскет. (Токио), 84, 1978, сс. 467-476). Следовательно, анализ позволяет оценивать катализ с помощью ОС в этом диапазоне значений рН. Полученные профили скоростей аппроксимировали с помощью классических колоколообразных кривых, как проиллюстрировано на фиг. 2. Человеческая ОС характеризуется зависимостью от рН в очень узком диапазоне с оптимумом примерно при рН 7,8-8,0. Скорости имеют тенденцию к снижению при более щелочных значениях рН. В противоположность этому, профиль скоростей, полученных для ОС из папайи, свидетельствует об отсутствии снижения активности вплоть до рН 8,5 (фиг. 2, вставка). Однако оптимальным для проявления специфичности обоих ферментов является рН 8. При создании изобретения неожиданно было установлено, что анализ кривых свидетельствует об идентичных значениях рКа в кислотном диапазоне значений рН 7,17±0,02 и 7,15±0,02 для человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно.
Очевидно, что снижение активности человеческой ОС при основных значениях рН, по-видимому, является результатом диссоциации группы, что характеризуется значением рКа примерно 8,5. Для ОС из папайи не были получены данные при основных значениях рН, которые могли бы позволить достоверно определить второе значение рКа. Это подтверждается подгонкой данных к модели однократной диссоциации, дающей практически идентичное значение рКа (рКа 7,13±0,03), про сравнению с подгонкой данных к модели двойной диссоциации. Это свидетельствует о том, что оба значения рКа являются весьма различными.
Стабильность при различных значениях рН.
Стабильность глутаминилциклаз оценивали, осуществляя инкубацию ферментов растительного и животного происхождения при 30°С в течение 30 мин при различных значениях рН в диапазоне от 4 до 10. После этого активность ОС определяли в стандартных условиях. Результаты представлены на фиг. 3.
ОС из латекса папайи оказалась стабильной в изученном диапазоне значений рН без заметной тенденции к снижению стабильности в кислом или основном диапазоне. В противоположность этому, для человеческой ОС сопоставимая стабильность обнаружена только при рН 7-8,5, что свидетельствует о выраженном снижении стабильности при значениях рН выше 8 и ниже 6. Таким образом, значения рН, близкие к 8, вероятно, являются оптимальными для активности и стабильности растительной и человеческой ОС и приемлемыми значениями рН для сравнения субстратной специфичности различных ОС.
Пример 5. Определение субстратной специфичности ОС.
Спектрофотометрический анализ.
Осуществляли непрерывный спектрофотометрический анализ, описанный в примере 2. Согласно этому анализу об активности ОС свидетельствует снижение абсорбции при 340 нм, вызванное высвобождением аммиака и последующим поглощением НАДН/Н+ из-за образования глутамата из α-кетоглютаровой кислоты. Как видно из фиг. 1, были получены линейные графики и была выявлена линейная зависимость между измеренной активностью и концентрацией ОС. Кроме того, кинетические параметры, полученные для Н-О1п-О1п-ОН с использованием непрерывного описанного выше анализа (табл. 1), хорошо согласовались с данными, полученными с использованием дискретного анализа (КМ=175±18 мкМ, кеа1=21,3±0,6 с-1). Помимо этого, кинетические параметры для превращения субстратов Н-О1п-А1а-ОН, НО1п-О1и-ОН, Н-О1п-О1п-ОН, Н-О1п-О1Ви и Н-61п-ЯН2 с помощью ОС из папайи, представленные в табл. 1, хорошо коррелируют с данными, которые были получены с помощью прямого метода при рН 8,8 и 37°С (Со1о1оЬоу М.У. и др., Вю1. Скет. Норре. 8еу1ет. 377, 1996, сс. 395-398). Таким образом, очевидно, что новый непрерывный анализ позволяет получать надежные результаты.
Ди-, трипептиды и дипептидные заместители.
При использовании описанного выше нового непрерывного анализа примерно 30 соединений были изучены в качестве потенциальных субстратов ОС из С. рарауа и человеческой ОС. Результаты представлены в табл. 5. Путем сравнения специфичности установлено, что практически все короткие пептидные субстраты более эффективно превращаются под действием ОС из папайи по сравнению с человеческим ферментом. Заслуживает внимания тот факт, что для обоих ферментов более эффективными являются субстраты с крупными гидрофобными остатками во втором положении, что обнаружено по специфичности в отношении Н-О1п-Тут-А1а-ОН, Н-О1п-Рке-А1а-МН2 и Н-О1п-Ттр-А1а-МН2 при сравнении с другими трипептидами или по реактивности хромотропных субстратов Н-О1п-АМС, Н-С1п-вНА и Н-О1п
- 27 009291
Туг-ОН по сравнению с дипептидными субстратами. Для ОС из папайи эти данные согласуются с ранее полученными результатами, свидетельствующими о том, что специфичность коррелирует с размером второго аминокислотного остатка (Οο1ο^ον Μ.Υ. и др., Βίο1. С1ет. Норре. 8еу1ег. 377, 1996, сс. 395398). Единственное выраженное различие в специфичности ОС растительного и животного происхождения обнаружено в случае Η-Ο1η-ΟίΒυ. В то время, как этот сложный эфир превращается при использовании ОС из папайи со специфичностью, характерной для дипептидных субстратов, его превращение при использовании человеческой ОС происходит на порядок медленнее.
Олигопептиды.
Помимо нескольких дипептидов и трипептидов была изучена способность ОС из папайи и человеческой ОС превращать целый ряд олигопептидов (табл. 5). Заслуживает внимания тот факт, что общее различие в специфичности между человеческой и растительной ОС для ряда тетрапептидов оказалось не столь заметным, как для дипептидных и трипептидных субстратов. Это свидетельствует о том, что аминокислоты в 3-м и 4-м положениях все еще оказывают влияние на кинетические характеристики, прежде всего, человеческой ОС. Однако исключением являются пептиды, несущие остаток пролина в положении второй аминокислоты, для которых обнаружено заметное снижение значений кса1/КМ в ряду тетрапептидов, имеющих строение Η-Ο1η-Χ,ι,ι-ΤνΓ-Ρ1κ-ΝΗ2 (табл. 5). Снижение специфичности более выражено для человеческой ОС, и это приводит примерно к 8-кратным различиям в значении кса1/КМ по сравнению с ОС из папайи.
Небольшое снижение специфичности человеческой ОС обнаружено также в случае превращения субстратов с положительно заряженным С-концевым аминокислотным остатком глутамина, что обнаружено по специфичности в отношении Η-Ο1π-Αγ§^γ-Ρ^-ΝΗ2, Η-Ο1π-Αγ§^γ-Ρ^-ΝΗ2 и Η-Ο1η^8-ΛΓ§^υ-ΝΗ2 по сравнению с другими тетрапептидами. Очевидно, что пониженная специфичность, прежде всего, является следствием меньшего индекса превращения. Этот эффект не выявлен для растительного фермента.
Таблица 5 Кинетические параметры пептидных субстратов для человеческой ОС и ОС из папайи (н.р. - отсутствие реактивности; н.и. - отсутствие ингибирования; н.д. - не делали; * - для ингибирования субстрата)
Субстрат | Человеческая ОС | ОС из папайи | ||||||
Км (мкМ) | (с’1) | К|* (мМ) | кса/Км (мМ1 с’1) | Км (мкМ) | (с-1) | К|* (мМ) | кса^Км (мМ 1 с | |
Η-ΟΙη-ΟΗ | н.р. | Н.р. | Н.Д. | н.р. | н.д. | н.д. | н.д. | 0,23 ±0.1 |
Н-СИп-АМС | 54 ±2 | 5,3 ±0,1 | Н.д. | 98 ±2 | 42 ±1 | 39,4 ±0,4 | н.д. | 938 ±13 |
Н-СНп-βΝΑ | 70 ±3 | 20,6 ±0,5 | 1,21 ±0,07 | 294 ±6 | 38 ±3 | 51,4 ±1,4 | 1,20 ±0,08 | 1353 ±70 |
Н-(31п-О1Ви | 1235 ±74 | 6,7 ±0,2 | Н.И. | 5,4 ±0,2 | 223 ±9 | 49,4 +0,6 | Н.И. | 222 ±6 |
Η-Ο1η-ΝΗ2 | 409 ±40 | 12,8 ±0,5 | н.и. | 31 ±2 | 433 ±13 | 44,8 ±0,4 | н.и. | 103±2 |
Н-О1п-О1уОН | 247 ±10 | 13,2 ±0,2 | н.и. | 53 ±1 | 641 ±20 | 45,8 ±0,4 | н.и. | 71 +2 |
Н-С1п-А1аОН | 232 ±5 | 57,2 ±0,4 | н.и. | 247 ±4 | 158 ±8 | 69,8 ±1,0 | н.и. | 442 ±16 |
Η-αΐη-ΟΙηОН | 148 ±5 | 20,7 ±0,2 | н.и. | 140+2 | 44 ±3 | 43,2 ±0,7 | и.и. | 982 +51 |
Н-61п-(31иОН | 359 ±10 | 24,7 ±0,2 | н.и. | 58 ±1 | 106 ±5 | 50,3±0,6 | н.и. | 475 ±17 |
Н-О1п-Уа1ОН | 196 ±5 | 17,2 ±0,1 | н.и. | 88 ±2 | Н.д. | н.д. | н.и. | н.д. |
Н-СНп-ТугОН | 211 ±5 | 94 ±1 | н.и. | 446±6 | Н.д. | н.д. | н.и. | Н.Д. |
Н-С1п-С1и- Туг-ЫН2 | 79 ±2 | 45,1 ±0,4 | н.и. | 524±8 | 103 ±4 | 53,6 ±0,7 | н.и. | 520+13 |
Н-С1п-С1уРго-ОН | 130 ±5 | 25,3 ±0,2 | н.и. | 195 ±7 | 333 ±15 | 41,7 ±0,5 | н.и. | 125 ±4 |
Н-СИп-ТугА1а-ОН | 101 ±4 | 125 ±1 | н.и, | 930 +27 | 63 ±3 | 104,0 ±1,0 | н.и. | 1650 ±63 |
Н-СНп-Рйе- Α1α-ΝΗ2 | 69 ±3 | 109 ±1 | н.и. | 1811 ±64 | 111 ±5 | 132,1 ±0,6 | н.и. | 1190 ±48 |
Η-ΟΙη-Тгр- Α1η-ΝΗ2 | 50 ±2 | 47,0 ±0,7 | н.и. | 940 ±24 | 78 ±5 | 151,8 ±2,6 | н.и. | 1946 ±91 |
Н-С1п-Аг£СИу-Пе-ЫНг | 143 ±4 | 33,5 ±0,4 | н.и. | 234 ±4 | 123 ±10 | 49,2 ±1,7 | н.и. | 400 ±19 |
Η-ΟΙη-Ακηαΐγ-ιΐβ-ΝΗ2 | 172 ±5 | 56,6 ±0,5 | н.и. | 329 ±7 | 153 ±9 | 51,4 ±0,9 | н.и. | 336 ±14 |
Т1-С1п-8ег- Туг-РЬе-ЫНг | 55 ±3 | 52,8 +0,8 | н.и. | 960 ±38 | 135 +6 | 64,9 ±1,0 | н.и. | 481 ±14 |
- 28 009291
Н-О1п-Ат§Туг-Р11е-ЫН2 | 55 ±2 | 29,6 ±0,3 | н.и. | 538 ±14 | 124 ±6 | 48,9 ±0,7 | Н.И. | 394+13 |
Η-ΟΙη-Рго- Туг-РЬе-ИН2 | 1889 +152 | 31,7 ±1,2 | н.и. | 17 ±1 | 149 ±14 | 18,8 ±0,6 | н.и. | 126 ±8 |
Η-Ο1η-Ηίί· Туг-РЬе-ЫН2 | 68 ±3 | 55,4 ±0,7 | н.и. | 815 ±26 | 92 ±7 | 75,9 ±1,4 | н.и. | 825 +48 |
Н-61П-61П- Туг-РНе-М12 | 41 ±2 | 41,4 ±0,4 | н.и. | 1010 +40 | 45 ±2 | 52,9 ±0,7 | н.и. | 1176 +37 |
Н-О1п-О1ц- Туг-РЬе-ЫН2 | 47 ±4 | 46 ±1 | н.и. | 979 ±62 | 100 +4 | 54,6 ±0,6 | н.и. | 546 ±16 |
Н-О1п-О1и- А1а-А1а-ЧН2 | 77 ±4 | 46 ±1 | н.и. | 597 ±18 | 102 ±4 | 53,7 +0,6 | н.и. | 526 ±15 |
Н-<31п-С1и- Туг-А1а-МН2 | 69+2 | 42,1 ±0,4 | н.и. | 610 ±12 | ИЗ ±5 | 44,7 ±0,5 | н.и. | 396 ±13 |
Н-С1п-О1иА1а-Р11е-ХН2 | 39 +3 | 39 ±1 | н.и. | 1000 ±51 | 81 ±3 | 48,5 ±0,45 | н.и. | 599 ±17 |
Н-О1п-О1иΑίρΈευ-ΝΗί | 55 ±2 | 45,8 ±0,5 | н.и. | 833 +21 | 107 +6 | 58,5 ±0,4 | н.и. | 547 ±27 |
Н-О1п-Ьу8Аг8-Ьеи-МН2 | 54 +3 | 33,4 ±0,5 | н.и. | 619+25 | 118 ±6 | 48,2 ±0,8 | н.и. | 408 ±14 |
Результаты, полученные с использованием тетрапептидов, позволяли сделать еще одно заключение. Как уже отмечалось, ОС из папайи обладает высокой селективностью в отношении дипептидов. Однако для некоторых тетрапептидов при использовании человеческой ОС были получены более высокие значения констант специфичности, что видно из графика, представленного на фиг. 4, для построения которого использовали некоторые данные из табл. 5, касающиеся ряда пептидов, которые содержат глутамат в положении второй аминокислоты. Кроме того, по мере того, как длина цепи возрастает от ди- к трипептидам, селективность человеческой ОС повышается, в отличие от результатов, полученных с использованием ОС из папайи. Кроме того, наиболее высокая специфичность человеческой ОС обнаружена в отношении пептидов, несущих крупные гидрофобные остатки аминокислот в 3-м и 4-м положениях, что свидетельствует о гидрофобных взаимодействиях с ферментом. При сравнении кинетических параметров, характеризующих взаимодействие с соответствующими пептидами, изменения, вероятно, прежде всего, связаны с более низкими значениями Км, установлено, что индексы превращения пептидов являются близкими. Таким образом, более высокая селективность человеческой ОС в отношении пептидов с более длинной цепью, вероятно, является результатом более прочного связывания более гидрофобных субстратов с ферментом.
Обнаруженные различия между человеческой и растительной ОС в отношении пептидов, содержащих гидрофобные аминокислоты в 3-м и 4-м положении, также становятся очевидными при сравнении констант специфичности ферментов в отношении Н-61и-Атд-61у-Пе-ХН2 и Н-61и-Агд-Туг-Рйе-ХН2 или Н-61и-О1и-ОН и Н-61и-61и-Тут-РЬе-ОН.
Было установлено также, что человеческая ОС обладает большей селективностью в отношении гомологичных субстратов, содержащих Ν-концевой О1и и увеличенное количество С-концевых остатков А1а (табл. 6). В то время, как селективность человеческой ОС повышается с увеличением длины субстрата, такая тенденция не обнаружена для ОС из папайи. Поскольку человеческая ОС обладает меньшей специфичностью в отношении пептидов, которые имеют в последовательности остаток 8ет, можно предположить, что природа боковой цепи также является важной (табл. 6).
Таблица 6
Влияние длины субстрата на активность человеческой ОС и ОС из папайи
Субстрат | Человеческая ОС | ОС из папайи | ||||
Км (мкМ) | кса1 (С1) | к<а(/Км (мМ' 'с'1) | Км (мкМ) | кса1 (с‘1) | кса|/КМ (мМ‘ 'с'1) | |
Н-О1п-А1а -ΝΗ2 | 155 +9 | 40,1 +0,9 | 259 ±9 | 212 ±21 | 62,8 ±3,0 | 296+15 |
Н-а1п-А1а-А1а-ЧН2 | 87 +3 | 76,3 ±0,7 | 877 ±22 | 164 ±6 | 83,2 +1,0 | 507 ±12 |
Н-О1п-А1а-А1а-А1а- А1а-ИН2 | 65 ±3 | 60,5 ±0,7 | 1174 ±43 | 197 + 8 | 74,6 ±1,0 | 379 + 10 |
Н-С1п-А1а-А1а-8ег- Α1α-Α13-ΝΗ2 | 79 ±6 | 55,3 ±1,6 | 700 +33 | 216±6 | 78,5 + 1,0 | 363 ±5 |
Воздействие ионной силы на катализ.
Другой параметр, действие которого на субстратную специфичность изучено, представляет собой ионную силу. Для этой цели определяли кинетические параметры для циклизации нескольких субстратов
- 29 009291 в присутствии 0,5М КС1 и без соли (табл. 7). При создании изобретения неожиданно было установлено, что специфичность в отношении субстратов с незаряженным каркасом при добавлении соли не изменялась в значительно степени как в случае ОС из латекса папайи, так и человеческой ОС. Однако константы специфичности человеческой ОС в отношении Η-01η-Α1Β-0Η и Н-О1п-О1и-ОН снижались при добавлении КС1. Как видно из индивидуальных кинетических параметров, это было обусловлено увеличением значения КМ и только небольшим снижением значения кса1. В случае ОС из папайи не обнаружено воздействия ни на один из изученных параметров. Это явление, вероятно, не связано с самим отрицательно заряженным субстратом, так как для отрицательно заряженного пептида 4-0111-0111^5):)^^11^42 не обнаружено изменение этих параметров. Представляющее интерес действие соли дополнительно было выявлено для положительно заряженных субстратов 4-0111^12-0114^^42 и Η-Ο1η-^у5-Α^д-^еи-NΗ2. Установлено, что положительное действие на катализ, как для растительной, так и для человеческой ОС, прежде всего, обусловлено более низким значением КМ и несколько повышенным индексом превращения.
Таблица 7
Влияние ионной силы на катализ человеческой ОС и ОС из папайи
Субстрат | 0.05М трицин-ИаОН, рН 8,0 | 0,05М трицин-ИаОН, рН 8,0, 0.5М КС1 | |||||||
Б Л Е га Е ί“1 Б О' | Км (мМ) | кса! (с'1) | кса/Км (мМ *с ’) | К) (мМ) | Км (мМ) | кса! Ή') | кСа|/Км (мМ''с’ ‘) | К; (мМ) | |
Η-ΟΙη-ΝΗ2 | 0,434 ±0,015 | 43,4 ±0,4 | 100 ±3 | н.и. | 0,446 +0,010 | 45,2 +0,3 | 101 +2 | н.и. | |
Н-О1П-Д4А | 0,036 ±0,002 | 48,8 ±1,0 | 1356±50 | 1,14 ±0,05 | 0,032 ±0,002 | 47,2 +0,8 | 1475 ±70 | 1,33 ±0,07 | |
Н-С!п-А1а-0Н | 0,137 ±0,007 | 69,7 ±0,9 | 509 ±19 | н.и. | 0,143 ±0,005 | 68,1 ±0,6 | 480 +12 | н.и. | |
Н-<з1п-<31и-0Н | 0,098 ±0,005 | 45,0 ±0,5 | 459 ±18 | н.и. | 0,094 ±0,003 | 44,4 ±0,3 | 472 ±12 | н.и. | |
Η-ΟΙη-Ττρ- А1а-ЯН2 | 0,079 ±0,005 | 138 ±3 | 1747 ±73 | н.и. | 0,072 ±0,004 | 133 ±3 | 1847 ±61 | и.к. | |
Н-01п-Аг§- С1у-11е-ЫН2 | 0,106 ±0,008 | 52,9 ±1,2 | 499 ±26 | н.и. | 0,065 ±0,005 | 48,4 ±1,0 | 745 ±42 | н.и. | |
Н-С1п-Ьу5- Ат§-Ьеи-ГГН2 | 0,102 ±0,007 | 50 ±1 | 493 ±22 | н.и. | 0,053 +0,002 | 58,1 ±0,7 | 1096 ±28 | н.и. | |
Н-01п-С1и- А5р-Ьеи-МН2 | 0,109 ±0,005 | 52,4 ±0,7 | 481 +16 | н.и. | 0,094 ±0,003 | 53,6 ±0,5 | 570 ±13 | н.и. | |
Человеческая ОС | 0,05М трис-НС1, рН 8,0 | 0.05М трис-НС1, рН 8,0, 0.5М КС1 | |||||||
Η-61η-ΝΗ2 | 0,442 ±0,030 | 12,8 ±0,3 | 29±1 | н.и. | 0,401 ±0,014 | 12,2 ±0,1 | 30+1 | н.и. | |
Η-61Π-/7ΝΑ | 0,076 ±0,004 | 21,7 ±0,5 | 285±8 | 1,39 ±0,08 | 0,063 ±0,003 | 20,0 ±0,4 | 318 ±9 | 0,97 +0,04 | |
Н-61п-А1а-0Н | 0,269 ±0,007 | 54,4 ±0,5 | 202+3 | н.и. | 0,357 ±0,012 | 47,6 ±0,6 | 133 +3 | Н.И. | |
Н-61п-01и-0Н | 0,373 ±0,015 | 21,4 ±0,3 | 57±2 | н.и. | 0,607 ±0,036 | 18,9 +0,5 | 31 ±1 | н.н. | |
Н-61п-Тгр- Α13-ΝΗ2 | 0,054 ±0,003 | 50,8 ±0,6 | 941 ±41 | н.и. | 0,056 ±0,002 | 50,0 ±0,4 | 893+25 | н.и. | |
Н-61п-Аг£61у-Пе-ИН2 | 0,166 ±0,013 | 31 ±1 | 187 ±9 | н.и. | 0,091 ±0,005 | 29,8 ±0,5 | 327 +12 | н.и. | |
Н-Оп-ЬузАг£,-Ееи-ЫН2 | 0,051 ±0,003 | 29,4 ±0,5 | 577 ±24 | н.и. | 0,034 ±0,001 | 31,6 ±0,3 | 929 ±19 | н.и. | |
Н-С.1л-С11и- Азр-Ьеи-йНг | 0,060 ±0,002 | 46,6 ±0,5 | 777 ±18 | н.и. | 0,061 ±0,002 | 45,6 ±0,5 | 748 ±16 | н.и. |
Физиологические субстраты.
В проведенных ранее исследованиях уже доказано превращение |01η'|-ΤΡ4 и [01п1]-0иКН с помощью ОС с использованием бычьей ОС и ОС из гипофиза свиней (ВикЬу ν.Η.Ρ и др., 1. Вю1. СЬет. 262, 1987, сс. 8532-8536; РЬсЬег ν.Η. и 8р1е55 1., Ριυα №111. Αсаб. 8с1. υδΑ 84, 1987, сс. 3628-3632). Помимо этих уже изученных гормонов гипофиза были синтезированы три потенциальных физиологических субстрата человеческой ОС и изучено их превращение, а именно 1011/11361)111^ [01η1]нейротензин и [01η1]ΡΡΡ. Кинетические параметры, характеризующие их превращение, представлены в табл. 1. Представляет интерес тот факт, что превращение глутаминильных пептидов в соответствующие пироглутамильные пептиды характеризуется увеличением значения констант специфичности в зависимости от размера, т. е. первым в этом ряду стоит наиболее крупный пептид прогастрин, состоящий из 17 аминокислот, за ним следуют пронейротензин, про-0иКН, про-ΤΚΗ и про-ΡΡΡ. Эти результаты соответствуют
- 30 009291 данным, полученным при использовании синтетических пептидов.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что превращение растительным ферментом более длинных субстратов также является высоко селективным, что частично противоречит данным, касающимся более коротких олигопептидов. Возможно, существуют вторичные взаимодействия, обусловливающие связывание субстрата и фермента, которые удалены от активного сайта.
Пептиды, содержащие модифицированные аминокислоты.
С целью дальнейшего изучения специфичности и селективности ОС синтезировали пептиды, содержащие либо модифицированный Ν-концевой глутаминильный остаток, либо модифицированную аминокислоту во втором положении. Превращение этих пептидов оценивали количественно с помощью МАЬО1-ТОЕ-масс-спектрометрии (см. также пример 3). Циклизация глутаминильного остатка или его аналога,, соответственно обусловливает различие в массе субстрата и продукта катализа. В случае, когда происходит выделение 1 моля аммиака в свободном состоянии на 1 моль субстрата, превращение также можно анализировать количественно с помощью спектрофотометрического анализа.
Н-61п-Ьу8(61п)-Агд-Ьеи-А1а-Ж2.
Превращение этого разветвленного на Ν-конце пептида, который содержит два глутаминильных остатка на Ν-конце, связанных с лизильным остатком через пептидную и частично изопептидную связь, с помощью человеческой ОС (фиг. 5) и ОС из папайи (данные не приведены), по-видимому, происходит одинаковым образом. Оба глутаминильных остатка превращаются в пироглутаминовую кислоту без какого-либо заметного предпочтения в отношении конкретного остатка, что следует из данных о соответствующем превращении субстрата (фиг. 5). Таким образом, селективность различных ОС в отношении по-разному связанных глутаминильных остатков не имеет существенных различий.
Н-61п(ММе)-Рйе-Ьу8-А1а-61и-МН2.
Метилированный глутаминильный остаток превращается в пироглутамильный остаток только с помощью ОС из папайи (фиг. 6). Кроме того, не обнаружено ингибирование человеческой ОС пептидом, что свидетельствует о том, что метилированный остаток не распознается человеческой ОС.
Н-61и(ОМе)^А и Η-Ο1υ-βΝΑ.
Ни одно из этих соединений не подвергалось каталитическому превращению с помощью ОС из папайи или человеческой ОС. Эти флуорогенные субстраты анализировали флуорометрически, используя пироглутамиламинопептидазу в качестве вспомогательного фермента. Однако у О-метилированного глутаматного остатка обнаружено выраженное отсутствие стабильности как в трис-, так и в трициновом буфере, что свидетельствует о наличии у них тенденции к циклизации, катализируемой не ферментативным путем. Кроме того, активность обеих ОС в отношении Н-О1п-АМС в качестве субстрата не ингибировалась более длинными пептидами Н-61и(ОМе)-Рйе-Ьу8-Агд-Ьеи-А1а-ЫН2 или Н-61и-Рйе-Ьу8-Агд-ЬеиА1а-№Н2, эти данные свидетельствуют о том, что глутаминовая кислота или ее производные не распознаются обеими формами ОС. Кроме того, результаты свидетельствуют о том, что не только отрицательный заряд остатка глутаминовой кислоты является причиной отталкивания пептида от активного сайта.
Н-61п-Цикло(№-Ьу8-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе).
Превращение субстрата Н-61п-цикло(№-Ьу8-Агд-Рго-А1а-61у-Рйе), который содержит внутримолекулярную частичную изопептидную связь, анализировали количественно, при этом установлено, что значения КМ составляют 240±14 мкМ и 133±5 мкМ для человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно. Установлено, что вследствие более высокого индекса превращения с помощью ОС из папайи (49,4±0,6 с-1) по сравнению с человеческой ОС (22,8±0,6 с-1) для растительного фермента значение кса1/КМ составляет 372±9 мМ-1 мин-1, что примерно в 4 раза выше, чем для человеческой ОС. Таким образом, константа специфичности в случае ОС из папайи только немного ниже, чем для субстратов, имеющих меньший размер, таких как Н-О1п-А1а-А1а-8ег-А1а-А1а-ХН2. Однако установлено, что значение кса1/КМ для человеческой ОС составляет 95±3 мМ-1с-1, что примерно на 1 порядок ниже по сравнению со значениями, полученными для субстратов близкого размера (табл. 5).
Н-вГомо61п-Рйе-Ьу8-Агд-Ьеи-А1а-МН2.
Ν-концевой β-гомоглутаминильный остаток превращали в 5-членное лактамовое кольцо посредством катализа с использованием человеческой ОС и ОС из папайи, соответственно. Сопровождающее этот процесс выделение в свободном состоянии аммиака анализировали спектрофотометрически и с помощью описанного выше МАЬП1-ТОЕ-анализа. Не обнаружено выделение в свободном состоянии аммиака, если ОС отсутствовала или ее подвергали кипячению, что свидетельствует о специфичности катализа циклизации. Интересным представляется тот факт, что ОС из С. рарауа (КМ=3,1±0,3 мМ, кса1=4,0±0,4 с-1) и человеческая ОС (КМ=2,5±0,2 мМ, кса1=3,5±0,1 с-1) катализируют превращение этого пептида с практически идентичными значениями кса1/КМ 1,4±0,1 и 1,3±0,1 мМ-1с-1, соответственно. Таким образом, циклизация β-гомоглутаминового остатка катализируется с примерно в 1000 раз меньшей эффективностью по сравнению с катализом пептидов такого же размера, которые содержат глутаминильный остаток на Νконце. Это свидетельствует о том, что наличие α-углерода субстрата является для распознавания субстрата формами ОС важным, но не основным фактором. Основным требованием к субстрату является наличие γ-амидной группы и непротонированной Ν-концевой аминогруппы на расстоянии и под углом,
- 31 009291 необходимыми для циклизации, это требование удовлетворяется наличием Ν-концевых глутаминильных и β-гомоглутаминильных остатков.
Пример 6. Синтез субстратов ОС.
Олигопептиды.
Пептиды синтезировали полуавтоматически в количестве порядка 0,5 мМ с помощью пептидного синтезатора (ЪаЬойес 8Р650, Бахем, Швейцария) согласно описанному ранее методу (ЗсйПНнд 8. и др., ВюсйетШгу 41, 2002, сс. 10849-10857). Более длинные пептиды синтезировали в количестве порядка 25 мкМ с помощью автоматического пептидного синтезатора типа 8утрйо^ (фирма Ρηίηίη ШкйитеШ Со.) согласно описанному методу (Маикай 8. и др., Вюсйетщйу 42, 2003, сс. 3081-3088). Для всех пептидных сочетаний применяли основанные на использовании Етос модифицированные протоколы твердофазного пептидного синтеза, предусматривающие применение тетрафторбората 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурония (ТБТУ, фирма NονаЬ^οсйет)/основания (диизопропилэтиламина или Ν-метилформолина; фирма Мегск) или в случае затрудненного сочетания применение Ν-оксида гексафторфосфата Ν[(диметиламино)-1Н-1,2,3,-триазоло [4,5-Ь]пиридин-1 -илметилен]-Ы-метилметанаммония (4,5) (ГАТУ, фирма Аррйей ВюкуйетО/диизопропилэтиламина в качестве активирующих реагентов. После отщепления от смолы с помощью содержащей трифторуксусную кислоту (ТФК, фирма Мегск) смеси неочищенные пептиды очищали с помощью препаративной ЖХВР с использованием не содержащих кислоту растворителей для того, чтобы исключать дальнейшую циклизацию Ν-концевого глутамина. Препаративную ЖХВР осуществляли с использованием линейного градиента ацтонитрила (фирма Мегск) в воде (540% или 65% ацетонитрила в течение 40 мин) на колонке типа 250-21 Ьииа ИР18 (фирма Рйеηοтеηеx). Для подтверждения чистоты и идентификации пептидов использовали аналитическую ЖХВР и Е8ГМС.
О1и(МН-МН2)-8ег-Рго-Тйг-А1а-МН2.
Линейный пептид-предшественник (Етос-С1и-8ег-Рго-Тйг-А1а-НН2) синтезировали согласно стандартным методам, основанным на применении Етос (8сй111шд 8. и др., ВюсйетШгу 41, 2002, сс. 1084910857) на амидной МВНА-смоле Ринка (фирма №уаЬюс11ет). После отщепления защищенного с помощью Етос пептида от смолы пептид осаждали с помощью диэтилового эфира (фирма Мегск), фильтровали и сушили. Смолу НМВА-АМ (1,16 мМ/г, фирма НоуаЬюсйет) применяли для сочетания кислотной γ-карбоксильной группы глутаминовой кислоты пептида-предшественника (3 экв.) в дихлорметане (ДХМ, фирма Мегск). В качестве агентов для сочетания применяли дициклогексилкарбодиимид (ДЦК, фирма 8егуа) (4 экв.) и диметиламинопиридин (ДМАП, фирма А1йпсй) (0,1 экв.). Через 12 ч смолу фильтровали, промывали ДХМ и реакцию повторяли. После удаления Ν-концевой Етос-группы с помощью 20% пиперидина в ДМФ (3x5 мин) несущую пептид смолу обрабатывали 5% раствором гидразина (20 мл/г) в течение 1,5 ч. Смолу фильтровали и промывали диметилформамидом (ДМФ, фирма Ио11г Германия) и ТФК. После упаривания неочищенный пептид осаждали простым эфиром, выход 76%.
Н-бШ-ЬуЦб^-Агд-Ьеи-АИ-МН^
Линейный пептид синтезировали с помощью стандартной процедуры, основанной на использовании ЕтосДВи, на амидной МВНА-смоле Ринка (8сй111тд 8. и др., Вюсйетщйу 41, 2002, сс. 10849-10857), при этом для сочетания применяли предпоследнюю аминокислоту Етос-Ьу8(Етос)-ОН. 4 экв. ЕтосС1п(Тг1)-ОН подвергали сочетанию после удаления двух аминозащитных групп лизина с помощью 20% пиперидина (фирма Мегск) в ДМФ. Выход после стандартного процесса расщепления составлял 95%.
Н-бЬ^Ме^Рйе-Вук-АИ-ОШ-МН^
Етос-ОШ/ЫМе^ОН синтезировали, начиная процесс с Етос-61и-О1Ви на смоле Етос-МГАМ (фирма НоуаЬюсйет). После добавления ДХМ для набухания смолу (0,5 г) промывали ДМФ и удаляли защитные группы с помощью 20% раствора пиперидина в ДМФ. Смолу вносили в 5 мл ДМФ и последовательно добавляли 5 экв. Етос-О1и-О1Ви, 5 экв. ГАТУ и 10 экв. ДИПЭА и встряхивали в течение 6 ч. После фильтрации и промывки продукт отщепляли в условиях стандартного расщепления с помощью ТФК. Пептид Н-б^ММе^Рйе-Ьук-АИ-ОШ-МН синтезировали с помощью известного метода (8сй111шд 8. и др., ВюсйетШгу 41, 2002, сс. 10849-10857). Осуществляли сочетание Етос-ОШ/ЫМе^ОН с ГАТУ/ДИПЭА в течение ночи. После стандартного процесса расщепления выход неочищенного пептида составлял 78%.
Н-О1и(ОМе)-в-нафтиламид, Н-ОЫ-УаГОН, Н-С1п-Туг-ОН.
Защищенные с помощью Вос дипептиды синтезировали стандартным методом, основанным на применении смешанного ангидрида с использованием изобутилхлоркарбоната (фирма Мегск). С-концевые сложные метиловые эфиры Вос-ОШ-Туг-ОМе и Вос-С1г1-Уа1-ОМе омыляли с помощью 1н. №ОН в диоксане. У защищенных с помощью Вос пептидов удаляли защитную группу, обрабатывая раствором НС1/диоксан в течение 10 мин. После упаривания остаток кристаллизовали с помощью нескольких растворителей с получением твердого соединения, выход 60-70%.
Н-бШ-цикло^е-Ьук-Агд-Рго-АЦ-б^-Рйе).
Линейный предшественник Вос-СкйТгВ-куъ-АгЦРтсрАЫ-СК-Рйе-ОН синтезировали на чувствительной к действию кислот 2-хлортритильной смоле. Сочетание осуществляли с помощью стандартного протокола, основанного на применении Етос/Ви, с использованием Етос-Ьу8(Мй)-ОН. После расщепления с помощью 3% раствора ТФК в ДХМ (10 раз по 5 мин) раствор нейтрализовали 10% раствором
- 32 009291 пиридина (фирма Мегск) в метаноле (МеОН; фирма Мегск), трижды промывали ДХМ и МеОН, упаривали до 5% от исходного объема и неочищенный пептид осаждали с помощью охлажденной на льду воды. После этого неочищенный пептид подвергали циклизации, используя активацию смесью ДЦК/Ы-гидроксибензотриазол (ГОБТ, фирма Α16γΚΗ). Неочищенный пептид растворяли в безводном дихлорметане (0,2 ммоля/50 мл), добавляли 0,2 ммоля Ν-метилморфолина и 0,4 ммоля 1-гидроксибензотриазола. Этот раствор добавляли по каплям к раствору, содержащему 0,4 ммоля дициклогексилкарбодиимида в 250 мл дихлорметана, при 0°С. Реакцию прекращали путем перемешивания в течение ночи при комнатной температуре. После фильтрации Ν,Ν'-дициклогексилмочевины растворитель удаляли выпариванием. Остаток растворяли в этилацетате и промывали несколько раз 1н. НС1, насыщенным раствором NаНСОз и водой. Раствор сушили над безводным №28О4, фильтровали и упаривали досуха в вакууме.
Пример 7. Характеристики эффекторов ОС.
Имидазольные производные.
Имидазольные и бензимидазольные производные, имеющие заместители в различных положениях 5-членного кольца, тестировали в качестве ингибиторов ОС (табл. 3). Порядок нумерации относится к имидазольному кольцу. Применяемые методы описаны в примере 2.
С-4(5)- и С-4,5-производные.
Установлено, что соединения, имеющие замены в любом из структурно эквивалентных положений 4 или 5 имидазольного кольца или в обоих положениях, обладали пониженной способностью к ингибированию человеческой ОС. При этом существует одно исключение, поскольку Ν-ω-ацетилированный гистамин является одним из наиболее эффективных ингибиторов. Небольшие заместители в этих положениях оказывали незначительное воздействие на связывание, о чем свидетельствуют близкие значения константы ингибирования для 5-гидроксиметил-4-метилимидазола при сравнении с имидазолом. Более крупные и имеющие больший объем группы, присоединенные к этим сайтам, снижают или устраняют связывание соединения ферментом. Для некоторых других изученных заместителей известно, что они проявляют отрицательное индукционное или мезомерное действие, что может снижать электронную плотность в имидазольном кольце, это тоже приводит к ухудшению связывания, соответственно, значений констант связывания. Различия в значениях К1 Ь-гистидина и гистидинамида также свидетельствуют о некотором воздействии заряда на связывание. Данные об электростатическом отталкивании заряженных субстратов были получены ранее при оценке субстратной специфичности, т.е. глутаминамид эффективно превращался в продукты с помощью человеческой ОС, но никакой реактивности не обнаружено при использовании свободного глутамина в качестве субстрата.
С-2-производные.
Все изученные производные ингибировали ОС слабее, чем имидазол. Любая замена, превышающая по размеру протон, мешала соответствующему связыванию с ОС. В случае 2-метилбензимидазола только из-за введения метильной группы значение константы ингибирования снижалось примерно на один порядок. Очень близкая взаимосвязь обнаружена при сравнении значений К1 для бензимидазола и 2-аминобензимидазола. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что это воздействие не связано с электронными изменениями.
Ν-1-производные.
Из изученных в качестве ингибиторов человеческой ОС имидазольных производных у большинства соединений, обладающих повышенными значениями К1 по сравнению с имидазолом, обнаружены изменения на одном атоме азота. К этим соединениям относится также один из наиболее эффективных ингибиторов ОС 1-бензилимидазол. Важным представляется тот факт, что лишь незначительные изменения этой структуры приводят к потере ингибирующей активности, это можно обнаружить при сравнении 1бензоилимидазола и фенилимидазола, последний из которых не проявлял активности в экспериментальных условиях. В этом случае также выявленные изменения, вероятно, связаны не только со сниженной электронной плотностью имидазольного кольца из-за отрицательного мезомерного действия фенильной группы, поскольку у более объемной триметилсилильной группы, проявляющей положительное индукционное действие, обнаружена также пониженная способность к связыванию по сравнению с другими остатками. Важным представляется тот факт, что одним из наименее эффективных соединений в этой группе является 1-аминопропилимидазол. Низкая эффективность этого соединения обусловлена наличием основной аминогруппы, поскольку у соединений с близким стерическим строением 1-метилимидазола и 1-винилимидазола выявлена повышенная способность к связыванию с активным сайтом. Таким образом, положительно заряженная аминогруппа ответственна за более низкое значение К1, этот результат подтверждается при сравнении значений К1 Ν-ω-ацетилированного гистамина (табл. 3) и гистамина (табл. 4).
Роль 3,4- и 3,5-дериватизации.
Установлено, что имидазольные производные, которые имеют заместителей в положениях 4(5) или в обоих положениях, обладают ограниченной эффективностью в отношении связывания с ферментом. Роль конкретных замен выявляли путем сравнения констант ингибирования Ь-гистамина и двух промежуточных продуктов биологического расщепления гистамина, 3-метил-4-гистамина и 3-метил-5-гистамина
- 33 009291 (табл. 4). Для Ь-гистамина установлено, что значение К1 примерно на порядок ниже, чем для ацетилированного аналога. Метилирование атома азота приводит к значительному повышению эффективности в случае 3-метил-4-гистамина. Однако метилирование, приводящее к получению 3-метил-5-гистамина, приводит к полной потере ингибирующей активности. Таким образом, выявленный эффект, вероятно, прежде всего, связан со стерическим препятствием связыванию из-за дериватизации атома углерода, примыкающего к основному азоту. Вероятно, основный азот играет основную роль в связывании с ферментом.
Пример 8. Образование Аβ3-40/42-производных.
Исследования проводили с использованием двух коротких Ν-концевых пептидных последовательностей Аβ3-40/42, таких как [С1η3]-Аβ 1-11 (последовательность: ΟΛ0ΕΚΗΟ8ΟΥΕ) и [С1η3]Аβ3-11, содержащая глутамин вместо глутаминовой кислоты в 3-м положении. Расщепление с помощью ΌΡ IV и циклизацию Ν-концевого остатка глутамина с помощью ОС этих двух пептидов оценивали методом МАЬПСТОЕ-масс-спектрометрии. Опыты проводили с использованием очищенной ΌΡ IV (свиная почка) или неочищенного гомогената свиного гипофиза в качестве источника ОС, а также для обоих ферментов в опытах по оценке последовательного катализа.
Результаты.
1. Образование [С1η3]Аβ3-11а из [С1п3]Аβ1-11а, катализируемое ΌΡ IV, и его предупреждение с помощью ингибитора ΌΡ IV Vа1-пирролидида £731^14).
ΌΡ IV или подобная ΌΡ IV активность приводила к расщеплению [С1η3]Λβ1-11а с образованием [С1п3]Аβ3-11а (фиг. 7). Остаток в 3-м положении не затрагивался при этом расщеплении и поэтому становился более пригодным для модификации другими ферментами, т.е. ОС. Как и ожидалось, катализ можно было полностью подавлять с помощью 731^134 (фиг. 8).
2. Образование [рС1и3]Λβ3-11а из [С1η3]Λβ3-11а посредством катализа ОС в гомогенатах гипофиза и предупреждение его с помощью 1,10-фенантролина.
Глутаминилциклаза, присутствующая в гомогенате свиного гипофиза, катализирует превращение [С1η3]Λβ3-11а в [рС1и3]Λβ3-11а (фиг. 9). Образование [рС1и3]Аβ3-11а ингибировалось при добавлении
1.10- фенантролина (фиг. 10).
3. Последовательный катализ ΌΡ IV и ОС, приводящий в образованию [рС1и3]Аβ3-11а, и его предупреждение с помощью 731-Ρυγγ и 1,10-фенантролина.
Образование [рС1и3]Аβ3-11а из [С1η3]Λβ1-11а происходило после последовательного катализа с помощью ΌΡ IV и ОС при оценке в неочищенном гомогенате свиного гипофиза с добавлением ΌΡ IV из свиной почки (фиг. 11). Образования [рС1и3]Аβ3-11а не происходило, когда добавляли ингибитор ОС
1.10- фенантролин (фиг. 12) или ингибитор ΌΡ IV Vа1-Ρу^^ (фиг. 13). При аминопептидазном расщеплении и последующей циклизации остатка глутамина происходит образование небольших количеств [рС1и3]Λβ311а, о чем свидетельствует образование [С1η3]Λβ2-11а.
4. Образование [рС1и3]Λβ3-11а в неочищенном гомогенате гипофиза в результате катализа аминопептидазой(ами).
Из-за образования [рС1и3]Аβ3-11а, не зависящего от ΌΡ Ш-катализа, изучали расщепление [С1η3]Λβ1-11а в неочищенном гомогенате гипофиза без добавления ΌΡ IV (фиг. 14). Как и ожидалось из данных, представленных в разделе 4, было обнаружено образование [рС1и3]Аβ3-11а. Эти данные свидетельствуют о том, что расщепление [С1η3]Λβ1-11а может являться также результатом катализа аминопептидазой(ами), что приводит к образованию [рС1и3]Аβ3-11а. Таким образом, результаты, свидетельствующие о том, что в этой ткани образование пироглутамила является конечной точкой расщепления Νконцевых пептидов, подтверждают также роль ОС в формировании бляшек.
Пример 9. Превращение [С1η3]Аβ3-11а; 3-21а и 3-40 с помощью рекомбинантной человеческой ОС.
Все изученные выведенные из [Ο^^β пептиды эффективно превращались с помощью человеческой ОС в соответствующие пироглутамильные формы (табл. 8). Из-за плохой растворимости [С1η3]Λβ321а и [С1п3]Λβ3-40 в водном растворе их изучение проводили в присутствии 1% ДМСО. Однако более высокая растворимость [С1ηз]Λβ3-11а позволила проводить кинетический анализ катализируемого ОС превращения в присутствии ДМСО и без него (табл. 8). Взятые в совокупности, результаты изучения Аβпептидов, состоящих из 8, 18 и 37 аминокислот, в качестве субстратов ОС (см. табл. 8) подтвердили данные о том, что активность человеческой ОС повышается с увеличением длины ее субстратов. Таким образом, на основе данных о значении констант специфичности можно заключить, что О1п1-гастрин, С1п'нейротензин, С1п1-СиВН являются одними из лучших субстратов ОС. Аналогично этому установлено, что для [С1п3]Аβ3-40 и глюкагона, которые являются наиболее крупными из изученных субстратов ОС, обнаружены высокие значения констант скорости реакции второго порядка (449 мМ-1с-1 и 526 мМ-1с-1, соответственно) даже в присутствии 1% ДМСО (табл. 8).
Важным представляется тот факт, что кинетические параметры, характеризующие превращение изученных амилоидных пептидов, не изменялись существенно с увеличением размера, что позволяет предположить не очень существенную роль С-концевой части Аβ в ОС-катализе. Таким образом, из-за
- 34 009291 лучшей растворимости и простоты использования в экспериментах дополнительные изучения, касающиеся Ν-концевого аминопептидазного процессинга этих пептидов, проводили с применением фрагментов Ав меньшего размера, таких как [С1п3]Ав 1-11а, [С1п3]Ав3-11а и Ав3-11а.
Таблица 8 Кинетические параметры, характеризующие превращение Ν-концевых содержащих С1п пептидов с помощью рекомбинантной человеческой ОС в буферном растворе, содержащем 1% ДМСО
Пептид | Км (мкМ) | кса1 (с'*) | кса(/Км (мЬГ’с·1) |
[С1п3]АрЗ-11а | 87 ± 3# | 55 ± 1* | 632 ± 10* |
[Сл1п3] Αβ3-11 а | 155 ±4 | 41,4 ±0,4 | 267 ±4 |
[О1п3]АрЗ-21а | 162 ± 12 | 62 ±3 | 383 ± 10 |
[Ο1η3]Αβ3-40 | 89 ± 10 | 40 ± 2 | 449 ± 28 |
глюкагон(3-29) | 19± 1 | 10,0 ±0,2 | 526 ± 17 |
#Определение проводили в отсутствие ДМСО.
Пример 10. Превращение Ав3-11а и Ав3-21а с помощью рекомбинантной человеческой ОС.
Инкубация Ав3-11а и Ав3-21а в присутствии ОС позволила установить, что, в отличие от данных, приведенных в ранее опубликованных работах, содержащие глутамат пептиды также могут служить в качестве субстратов ОС (фиг. 15В и Г). Катализируемое ОС образование [рС1и3]Ав3-11а и [рС1и3]Ав321а изучали при рН 5,2 и 6,5, соответственно. Если в раствор добавляли ингибитор ОС бензимидазол до начала добавления ОС, то превращение субстрата, приводящее к образованию [рС1и3]Ав3-11а или [рО1и3]Ав3-21а, подавлялось (фиг. 15Д и Е). Если ОС кипятили перед внесением, то образование рС1ипептидов было незначительным (фиг. 15А и Б).
Пример 11. Зависимость от рН катализируемой ОС из папайи циклизации Ο1π-βΝΛ и 01ιι-βΝΛ.
Превращение ОС из папайи Ск-вНА при концентрации вплоть до 2 мМ (что ограничено растворимостью субстрата) удовлетворяет уравнению скорости ферментативной реакции Михаэлиса-Ментена (фиг. 16). Изучение зависимости превращения от концентрации субстрата для катализируемого ОС превращения С1и-βNА, проведенное при рН 6,1-8,5, позволило установить, что для этого содержащего С1и субстрата оба кинетических параметра, т.е. КМ и кса1, изменялись в зависимости от рН (фиг. 16). Этот результат противоречит данным, описанным ранее для катализируемой ОС циклизации глутамина, согласно которым в данном диапазоне значений рН происходит изменения только значений КМ (Со1о1оЬоу М.У., 8опд I., Лапд V. и Ва1етап К.С., Агсй. Вюсйет. Вюрйуз. 309, 1994, сс. 300-307).
Поэтому было проведено изучение влияния концентрации протонов при С1и-и С1п-циклизации, зависимости от рН-циклизации С1и-βNА и С1п-βNА в условиях скорости реакции первого порядка (т.е. при использовании концентраций субстрата существенно более низких, чем значения КМ) (фиг. 17). Для циклизации глутамина рН-оптимум соответствовал рН 8,0, в отличие от циклизации глутаминовой кислоты, для которой рН-оптимум находился при рН 6,0. Поскольку константы специфичности в соответствующих рН-оптимумах различались примерно в 80000 раз, соотношение активности ОС и ЕС при значении рН, близком к рН 6,0, составляло примерно 8000.
Изучение неферментативного образования рС1и из С1η-βNА при рН 6,0 осуществляли в течение 4 недель, и при этом было установлено, что значение константы скорости реакции первого порядка равно 1,2х10-7с-1. Однако за этот же промежуток времени не обнаружено никакого образования рС1и-βNА из С1и-βNА, что позволяет оценить, что константа скорости, ограничивающая это превращение, составляет порядка 1,0х10-9с-1.
Пример 12. Процессы инактивации/реактивации фермента.
Аликвоту человеческой ОС (0,1-0,5 мг, 1 мг/мл) инактивировали в течение ночи путем диализа в противотоке 3000-кратного избытка 5 мМ 1,10-фенантролина или 5 мМ дипиколиновой кислоты в 0,05М бис-трис/НС1-буфере, рН 6,8. Затем инактивирующий агент тщательно удаляли путем диализа (3 цикла, 2000-кратный избыток) образцов в противотоке 0,05М бис-трис/НС1-буфера, рН 6,8, содержащего 1 мМ ЭДТК. Эксперименты по реактивации осуществляли при комнатной температуре в течение 15 мин, используя ионы Ζη, Мп++, Νί++, Са++, К++ и Со++ в концентрациях 1,0, 0,5, 0,25 мМ в 0,025М бис-трисбуфере, рН 6,8, содержащем 0,5 мМ ЭДТК. Анализ активности ОС проводили в 0,05М трис/НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 2 мМ ЭДТК, для исключения быстрой реактивации следовыми количествами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах.
Ингибирование свиной ОС 1,10-фенантролином уже было описано ранее (ВизЬу Л.НЭ. и др., 1. Вю1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536, Ва1етап К.СЭ. и др., Вюсйет1з1гу 40, 2001). Однако тот факт, что ЭДТК оказывает активирующее действие на ОС-катализ, позволяет предположить, что ингибирование фенантролином обусловлено образованием хелатных комплексов с металлами (ВизЬу Л.НЭ. и др., 1. Вю1. Сйет. 262, 1987, сс. 8532-8536, Ва1етап К.СЭ. и др., Вюсйет1з1гу 40, 2001). Помимо ингибирования
1,10-фенантролином катализируемая человеческой ОС циклизация субстрата снижалась в присутствии дипиколиновой кислоты и 8-гидроксихинолина, других ингибиторов металлоферментов. Эти хелаторы
- 35 009291 конкурентно и в зависимости от времени ингибировали ОС, т.е. было обнаружено конкурентное ингибирование активности уже в начале реакции и активность продолжала снижаться при пролонгированной инкубации с соединениями (фиг. 18, 19). Важным представляется тот факт, что ЭДТК не обладает заметным ингибированием, вне зависимости от продолжительности инкубации или любых иных условий.
Человеческая ОС практически полностью инактивировалась после продолжительного диализа в противотоке 5 мМ 1,10-фенантролина или 5 мМ дипиколиновой кислоты. После повторного диализа в течение ночи в противотоке не содержащих хелатор буферных растворов активность ОС частично реактитвировалась вплоть до 50-60%. Однако при диализе в противотоке буферов, содержащих 1 мМ ЭДТК, не происходило никакой реактивации.
Практически полного восстановления активности ОС после инактивации либо дипиколиновой кислотой, либо 1,10-фенантролином достигали путем инкубации белка в течение 10 мин с 0,5 мМ ΖΝ8Ο4 в присутствии 0,5 мМ ЭДТК (фиг. 20). Частичное восстановление активности ОС было получено также с использованием для реактивации ионов Со++ и Мп++. Даже в присутствии 0,25 мМ Ζπ могла проходить реактивация вплоть до 25% от исходной активности. Никакой реактивации не происходило при использовании ионов Νί++, Са++ или К++. Аналогично этому инкубация полностью активной ОС с этими ионами не оказывала никакого воздействия на ферментативную активность.
Claims (42)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение эффекторов глутаминилциклазы (ОС) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для:в) лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить путем модуляции ОС-активности ш νίνο, и/илиг) модуляции физиологических процессов, основанных на действии рО1и-содержащих пептидов, обусловленной модуляцией ОС-активности.
- 2. Применение по п.1 для изменения превращения Ν-концевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в остатки пироглутаминовой кислоты по меньшей мере в одном субстрате ОС, который выбран из ряда, включающего Аβ3-40/42, [61η3]Αβ3-40/42, [61и11]Αβ11-40/42, [61η11]Αβ11-40/42, |С1п||гастрины (17 и 34), [61п!] нейротензин, [О1п1]БРР, [61п1]ТЕН, [61п1]0пКН, [61п1]ССЬ 2, [61п1]ССЬ 7, [О1п1]ССЬ 8, [О1п1]ССЬ 16, [О1п1]ССЬ 18, [61п1]ЕЬА, [О1п1]фракталкин, [61п!]орексин А, [О1п3] глюкагон 3-29 и [О1п5] вещество Р5-11.
- 3. Применение по п.1 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
- 4. Применение по п.1 для регуляции и/или контроля мужской фертильности.
- 5. Применение по п.1 для лечения заболевания, выбранного из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас!ет ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
- 6. Применение по п.1 для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
- 7. Применение по п.1 для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников.
- 8. Применение по п.1 для лечения заболевания, выбранного из болезни Гентингтона и болезни Кеннеди.
- 9. Применение по одному из предыдущих пунктов, где эффектор ОС вводят в сочетании с ингибитором ΌΡ 1У или ΌΡ 1У-подобными ферментами и/или ингибитором аминопептидазы.
- 10. Применение по п.9, где блокируют активность подобного ΌΡ 1У фермента, приводящую к образованию Н-изоА§р-А1а-ОН.
- 11. Применение по п.9 или 10, где ΌΡ 1У-подобный фермент представляет собой ΌΡ II.
- 12. Фармацевтическая композиция для парентерального, энтерального или орального введения, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один эффектор ОС необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
- 13. Фармацевтическая композиция для парентерального, энтерального или орального введения, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один эффектор ОС в сочетании по меньшей мере с одним ингибитором ΌΡ 1У или ΌΡ 1У-подобными ферментами и/или по меньшей мере с одним ингибитором аминопептидазы необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами.
- 14. Применение фармацевтических композиций по п.12 или 13 для модуляции ш νίνο ферментативной активности ОС и/или ΌΡ 1У и ΌΡ 1У-подобных ферментов и/или аминопептидаз.- 36 009291
- 15. Применение по п.14, где блокируют активность ЭР Ш-подобного фермента, приводящую к образованию Н-изоАкр-А1а-ОН.
- 16. Применение по п.14 или 15, где ЭР Ш-подобный фермент представляет собой ЭР II.
- 17. Применение по одному из пп.14-16 для изменения превращения Ν-концевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в пироглутамильные (5-оксопролильные) остатки по меньшей мере в одном субстрате ОС, который выбран из ряда, включающего Άβ3-40/42, [С1п3]Ав3-40/42, [С1ип]Ав 11-40/42, |С1п|Ав11-40/42, |С1п'|гастрины (17 и 34), |С1п'|нейротензин, [С1п']ЕРР, [С1пП]ТВН, [С1п1]СпКН, [С1п']ССЬ 2, [С1п1]ССЬ 7, [С1п1]ССЬ 8, [С1п1]ССЬ 16, [С1п1]ССЬ 18, [С1п1]ЕЬА, [С1п1]фракталкин, [С1п1]орексин А.
- 18. Применение по одному из пп.14-16 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
- 19. Применение по одному из пп.14-16 для модуляции мужской фертильности путем введения эффекторов ОС.
- 20. Применение по одному из пп.14-16 для лечения заболевания, выбранного из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
- 21. Применение по одному из пп.14-16 для стимуляции пролиферации клеток желудочнокишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
- 22. Применение по одному из пп.14-16 для подавления пролиферации миелоидных клетокпредшественников.
- 23. Способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов ОС, предусматривающий следующие стадии:а) контактирование соединения с ОС млекопитающего в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;б) добавление субстрата ОС млекопитающего;в) оценка превращения субстрата или необязательное определение остаточной активности ОС млекопитающего иг) количественная оценка изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности ОС млекопитающего для идентификации модифицирующего активность ОС эффектора.
- 24. Способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов, которые непосредственно или опосредовано взаимодействуют с ионом металла, связанным с активным сайтом ОС млекопитающего, предусматривающий следующие стадии:а) контактирование соединения с ОС млекопитающего в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание;б) добавление субстрата ОС млекопитающего;в) оценка превращения субстрата или необязательное определение остаточной активности ОС млекопитающего иг) количественная оценка изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности млекопитающего ОС для идентификации модифицирующего активность ОС эффектора.
- 25. Эффекторы ОС млекопитающего, идентифицированные с помощью способов скрининга по п.23 или 24.
- 26. Способ лечения заболеваний у млекопитающих, которые можно лечить:а) путем модуляции активности ОС ш νί\Ό и/илиб) путем модуляции физиологических процессов, основанных на действии рС1и-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией ОС-активности, который заключается в том, что млекопитающим вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного эффектора глутаминилциклазы (ОС) для модуляции активности ОС в отношении содержащих С1п или С1и пептидов.
- 27. Способ по п.26, в котором модуляция активности ОС приводит к изменению превращения Νконцевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в остатки пироглутаминовой кислоты по меньшей мере в одном субстрате ОС, который выбран из ряда, включающего Λβ3-40/42, [С1п3]Ав3-40/42, [С1ип]Ав11-40/42, [С1п11]Ав 11-40/42, [С1п1]гастрины (17 и 34), [С1п1]нейротензин, [С1п1]ЕРР, [С1п1]ТВН, [С1п1]СпЯН, [С1п']ССЬ 2, [С1п']ССЬ 7, [С1п']ССЬ 8, [С1п']ССЬ 16, [С1п']ССЬ 18, [С1п1]ЕЬА, [С1п1 ]фракталкин, [С1п']орексин А, [С1п3] глюкагон 3-29 и [С1п5] вещество Р5-11.
- 28. Способ по п.26 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.- 37 009291
- 29. Способ по п.26, в котором модуляция активности рС включает регуляцию и/или контроль мужской фертильности.
- 30. Способ по п.26, в котором заболевание выбрано из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1оп, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточноопосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
- 31. Способ по п.26, в котором лечение приводит к стимуляции пролиферации клеток желудочнокишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
- 32. Способ по п.26, в котором лечение приводит к подавлению пролиферации миелоидных клетокпредшественников.
- 33. Способ по одному из пп.26-32, в котором эффектор рС вводят в сочетании с ингибитором БР IV или БР Ιν-подобными ферментами и/или ингибитором аминопептидазы.
- 34. Способ по п.33, в котором блокируют активность БР Ιν-подобного фермента, приводящую к образованию Н-изоЛзр-Л1а-ОН.
- 35. Способ лечения по п.34, в котором БР Ιν-подобный фермент представляет собой БР ΙΙ.
- 36. Способ лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить:а) путем модуляции активности рС ίη νίνο и/илиб) путем модуляции физиологических процессов, основанных на действии рО1и-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией активности рС, и/или активности БР Ιν и БР Ιν-подобных ферментов, и/или активности аминопептидазы ίη νίνο, который заключается в том, что млекопитающим вводят фармацевтические композиции по п.12 или 13.
- 37. Способ по п.36 изменения превращения Ν-концевых остатков глутаминовой кислоты или глутамина в пироглутамильные (5-оксопролильные) остатки по меньшей мере в одном субстрате рС, который выбран из ряда, включающего Ар3-40/42, [01η3]Αβ3-40/42, [О1и11]Лр 11-40/42, [Ο1η11]Αβ 11-40/42, [01η1]гастрины (17 и 34), [СЬ^нейротензин, [С1п1]РРР, [С1п1]ТКН, [С1п1]ОпЕН, [С1п1]ССЬ 2, [С1п1]ССЬ 7, [С1п1]ССЬ 8, [С1п1]ССЬ 16, [С1п1]ССЬ 18, [С1п1]ЕЬА, [С^фракталкин, [С^орексин А.
- 38. Способ по п.36 для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна.
- 39. Способ по п.36 для модуляции мужской фертильности.
- 40. Способ по п.36 для лечения заболевания, выбранного из ряда, включающего язвенную болезнь и рак желудка, связанный или не связанный с заражением Не1юЬас1ег ру1ог1, патогенные психические состояния, шизофрению, бесплодие, неоплазию, воспалительные реакции хозяина, рак, злокачественный метастаз, меланому, псориаз, ревматоидный артрит, атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточноопосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенную связанную с гомеостазом регуляцию энергетического метаболизма, нарушенную функцию вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенную регуляцию общей воды организма.
- 41. Способ по п.36 для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферации слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острой секреции кислоты и дифференцировки, продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток.
- 42. Способ по п.36 для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US46804303P | 2003-05-05 | 2003-05-05 | |
US46801403P | 2003-05-05 | 2003-05-05 | |
US51203803P | 2003-10-15 | 2003-10-15 | |
PCT/EP2004/004778 WO2004098625A2 (en) | 2003-05-05 | 2004-05-05 | Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200501700A1 EA200501700A1 (ru) | 2006-06-30 |
EA009291B1 true EA009291B1 (ru) | 2007-12-28 |
Family
ID=42827350
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200501700A EA009291B1 (ru) | 2003-05-05 | 2004-05-05 | Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1620082B9 (ru) |
JP (1) | JP5690463B2 (ru) |
CN (1) | CN1784220B (ru) |
AT (1) | ATE464889T1 (ru) |
AU (2) | AU2004237408C9 (ru) |
BR (1) | BRPI0410078A (ru) |
CA (1) | CA2524009C (ru) |
DK (1) | DK1620082T3 (ru) |
EA (1) | EA009291B1 (ru) |
HK (1) | HK1089964A1 (ru) |
IL (2) | IL171339A (ru) |
MX (1) | MXPA05011861A (ru) |
NZ (1) | NZ543146A (ru) |
PL (1) | PL1620082T3 (ru) |
WO (1) | WO2004098625A2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2542994C2 (ru) * | 2009-12-04 | 2015-02-27 | Эббви Инк. | Bcl-2-селективные апоптоз-индуцирующие средства для лечения рака и иммунных заболеваний |
Families Citing this family (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE602004026712D1 (de) | 2003-05-05 | 2010-06-02 | Probiodrug Ag | Medizinische verwendung von hemmern von glutaminyl und glutamatcyclasen |
MXPA06003998A (es) | 2003-10-15 | 2006-06-27 | Probiodrug Ag | Uso de efectores de ciclasas de glutamato y glutaminil. |
US20050137142A1 (en) * | 2003-11-03 | 2005-06-23 | Probiodrug Ag | Combinations useful for the treatment of neuronal disorders |
AU2005210004B2 (en) * | 2004-02-05 | 2010-10-28 | Probiodrug Ag | Novel inhibitors of glutaminyl cyclase |
EA013790B1 (ru) * | 2004-02-05 | 2010-06-30 | Пробиодруг Аг | Новые ингибиторы глутаминилциклазы |
SI1942898T2 (sl) | 2005-09-14 | 2014-08-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Dipeptidil-peptidazni inhibitorji za zdravljenje diabetesa |
CN102675221A (zh) | 2005-09-16 | 2012-09-19 | 武田药品工业株式会社 | 用于制备嘧啶二酮衍生物的方法中的中间体 |
US7572614B2 (en) | 2006-02-24 | 2009-08-11 | Academia Sinica | Crystal structure of soluble glutaminyl cyclase |
WO2007112347A1 (en) | 2006-03-28 | 2007-10-04 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Dipeptidyl peptidase inhibitors |
TW200808773A (en) | 2006-06-23 | 2008-02-16 | Abbott Lab | Cyclopropyl amine derivatives |
US9108948B2 (en) | 2006-06-23 | 2015-08-18 | Abbvie Inc. | Cyclopropyl amine derivatives |
US8889709B2 (en) | 2006-09-21 | 2014-11-18 | Probiodrug Ag | Use of isoQC inhibitors in the treatment and prevention of inflammatory diseases or conditions |
US9277737B2 (en) | 2006-09-21 | 2016-03-08 | Probiodrug Ag | Mouse models carrying a knock-out mutation of the QPCTL-gene |
NZ590631A (en) * | 2006-09-21 | 2011-12-22 | Probiodrug Ag | Novel genes related to glutaminyl cyclase |
EP2089383B1 (en) | 2006-11-09 | 2015-09-16 | Probiodrug AG | 3-hydr0xy-1,5-dihydr0-pyrr0l-2-one derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase for the treatment of ulcer, cancer and other diseases |
TW200838536A (en) | 2006-11-29 | 2008-10-01 | Takeda Pharmaceutical | Polymorphs of succinate salt of 2-[6-(3-amino-piperidin-1-yl)-3-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethy]-4-fluor-benzonitrile and methods of use therefor |
NZ578513A (en) | 2007-01-19 | 2012-01-12 | Probiodrug Ag | In vivo screening models for treatment of alzheimer's disease and other qpct-related disorders |
US20120070444A1 (en) | 2007-01-19 | 2012-03-22 | Probiodrug Ag | IN VIVO SCREENING MODELS FOR TREATMENT OF isoQC-RELATED DISORDERS |
AU2008220785B2 (en) | 2007-03-01 | 2013-02-21 | Vivoryon Therapeutics N.V. | New use of glutaminyl cyclase inhibitors |
EP2118101B1 (en) | 2007-03-09 | 2012-09-26 | Probiodrug AG | Imidazo [1,5-a] pyridine derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase |
US9656991B2 (en) | 2007-04-18 | 2017-05-23 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
WO2009034158A2 (en) | 2007-09-12 | 2009-03-19 | Probiodrug Ag | Transgenic mice |
AU2009204864A1 (en) | 2008-01-14 | 2009-07-23 | Probiodrug Ag | Mouse models carrying a knock-out mutation of the glutaminyl cyclase gene |
SG193148A1 (en) * | 2008-07-31 | 2013-09-30 | Probiodrug Ag | Glutaminyl cyclase as a diagnostic / prognostic indicator for neurodegenerative diseases |
US8288591B2 (en) | 2008-11-20 | 2012-10-16 | Designer Molecules, Inc. | Curing agents for epoxy resins |
US9186353B2 (en) | 2009-04-27 | 2015-11-17 | Abbvie Inc. | Treatment of osteoarthritis pain |
PL2475428T3 (pl) | 2009-09-11 | 2015-12-31 | Probiodrug Ag | Pochodne heterocykliczne jako inhibitory cyklazy glutaminowej |
JP2013505438A (ja) * | 2009-09-18 | 2013-02-14 | プロビオドルグ エージー | アミロイドβペプチドの検出のための新規アッセイ |
WO2011076854A1 (en) * | 2009-12-22 | 2011-06-30 | Probiodrug Ag | CLEAVAGE OF β-AMYLOID PRECURSOR PROTEIN |
CN102947705A (zh) * | 2010-02-18 | 2013-02-27 | 前体生物药物股份公司 | 通过确定焦谷氨酸修饰的mcp-1诊断炎性疾病的方法和谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的筛选方法 |
US9181233B2 (en) | 2010-03-03 | 2015-11-10 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
DK2545047T3 (da) | 2010-03-10 | 2014-07-28 | Probiodrug Ag | Heterocycliske inhibitorer af glutaminylcyclase (QC, EC 2.3.2.5) |
US20130012620A1 (en) * | 2010-03-17 | 2013-01-10 | Designer Molecules, Inc. | Curing agents for epoxy resins |
WO2011131748A2 (en) | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Probiodrug Ag | Novel inhibitors |
ES2540467T3 (es) | 2010-08-19 | 2015-07-09 | Probiodrug Ag | Estructura cristalina de glutaminil ciclasa |
US8853390B2 (en) | 2010-09-16 | 2014-10-07 | Abbvie Inc. | Processes for preparing 1,2-substituted cyclopropyl derivatives |
RU2650778C2 (ru) * | 2011-02-17 | 2018-04-17 | Фуджиребио Диагностикс, Инк | Композиции и способы применения для определения не4а |
EP2686313B1 (en) | 2011-03-16 | 2016-02-03 | Probiodrug AG | Benzimidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase |
EP2742062A2 (en) | 2011-08-12 | 2014-06-18 | Probiodrug AG | In vivo screening models for treatment of qc-related disorders |
US9138393B2 (en) * | 2013-02-08 | 2015-09-22 | The Procter & Gamble Company | Cosmetic compositions containing substituted azole and methods for improving the appearance of aging skin |
US9512115B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-12-06 | Probiodrug Ag | Inhibitors |
JP6902416B2 (ja) * | 2016-07-05 | 2021-07-14 | ライオン株式会社 | 睡眠評価用マーカー及びその用途 |
FI3658141T3 (fi) | 2017-07-24 | 2023-03-02 | Patologisten tilojen hoitaminen suoralla tai epäsuoralla siralfa-cd47-vuorovaikutukseen kohdentamisella | |
PL3461819T3 (pl) | 2017-09-29 | 2020-11-30 | Probiodrug Ag | Inhibitory cyklazy glutaminylowej |
IT202100012173A1 (it) * | 2021-05-12 | 2022-11-12 | Univ Degli Studi Roma La Sapienza | Composizioni per l’uso nel trattamento di disabilità intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down |
EP4359405A1 (en) | 2021-06-24 | 2024-05-01 | Insilico Medicine IP Limited | Beta-lactam derivatives for the treatment of diseases |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993020061A1 (en) * | 1992-04-01 | 1993-10-14 | The University Of Toledo | 4-[4'-piperidinyl or 3'-pirrolidinyl] substituted imidazoles as h3-receptor antagonists and therapeutic uses thereof |
US5552426A (en) * | 1994-04-29 | 1996-09-03 | Eli Lilly And Company | Methods for treating a physiological disorder associated with β-amyloid peptide |
WO1999041224A1 (en) * | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Merck Frosst Canada & Co. | Biaryl-acetic acid derivatives and their use as cox-2 inhibitors |
WO2001034594A1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-17 | Guilford Pharmaceuticals, Inc. | Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and methods of making and using dipeptidyl peptidase iv inhibitors |
WO2002013821A1 (en) * | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Gliatech, Inc. | Novel alicyclic imidazoles as h3 agents |
WO2003040174A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-15 | Probiodrug Ag | Substituted amino ketone compounds |
WO2004089366A1 (en) * | 2003-04-10 | 2004-10-21 | Pfizer Japan, Inc. | Bicyclic compounds as nr2b receptor antagonists |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL111785A0 (en) | 1993-12-03 | 1995-01-24 | Ferring Bv | Dp-iv inhibitors and pharmaceutical compositions containing them |
WO1995022327A1 (en) * | 1994-02-22 | 1995-08-24 | Knoll Ag | Use of 1-(arylalkylaminoalkyl) imidazoles for treating neurological damage |
DE69619381T2 (de) * | 1995-05-30 | 2002-11-21 | Gliatech Inc | 1h-4(5)substituierte imidazolderivate |
DE19616486C5 (de) | 1996-04-25 | 2016-06-30 | Royalty Pharma Collection Trust | Verfahren zur Senkung des Blutglukosespiegels in Säugern |
TW492957B (en) | 1996-11-07 | 2002-07-01 | Novartis Ag | N-substituted 2-cyanopyrrolidnes |
US6011155A (en) | 1996-11-07 | 2000-01-04 | Novartis Ag | N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV |
EP2574336A1 (en) | 1998-02-02 | 2013-04-03 | Trustees Of Tufts College | Use of dipeptidylpeptidase inhibitors to regulate glucose metabolism |
AU3034299A (en) | 1998-03-09 | 1999-09-27 | Fondatech Benelux N.V. | Serine peptidase modulators |
DE19823831A1 (de) | 1998-05-28 | 1999-12-02 | Probiodrug Ges Fuer Arzneim | Neue pharmazeutische Verwendung von Isoleucyl Thiazolidid und seinen Salzen |
DE19828114A1 (de) | 1998-06-24 | 2000-01-27 | Probiodrug Ges Fuer Arzneim | Produgs instabiler Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV |
DE19828113A1 (de) | 1998-06-24 | 2000-01-05 | Probiodrug Ges Fuer Arzneim | Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV |
DE19834591A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Probiodrug Ges Fuer Arzneim | Verfahren zur Steigerung des Blutglukosespiegels in Säugern |
EP1932535A3 (en) | 1998-07-31 | 2008-10-29 | Novo Nordisk A/S | Stimulation of beta cell profileration |
US6110949A (en) | 1999-06-24 | 2000-08-29 | Novartis Ag | N-(substituted glycyl)-4-cyanothiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV |
US6107317A (en) | 1999-06-24 | 2000-08-22 | Novartis Ag | N-(substituted glycyl)-thiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV |
US6172081B1 (en) | 1999-06-24 | 2001-01-09 | Novartis Ag | Tetrahydroisoquinoline 3-carboxamide derivatives |
GB9928330D0 (en) | 1999-11-30 | 2000-01-26 | Ferring Bv | Novel antidiabetic agents |
US6380398B2 (en) | 2000-01-04 | 2002-04-30 | Novo Nordisk A/S | Therapeutically active and selective heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme DPP-IV |
AU2001228309A1 (en) | 2000-01-24 | 2001-08-07 | Novo-Nordisk A/S | N-substituted 2-cyanopyroles and -pyrrolines which are inhibitors of the enzyme dpp-iv |
US6395767B2 (en) | 2000-03-10 | 2002-05-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Cyclopropyl-fused pyrrolidine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method |
GB0010183D0 (en) | 2000-04-26 | 2000-06-14 | Ferring Bv | Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV |
GB0010188D0 (en) | 2000-04-26 | 2000-06-14 | Ferring Bv | Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV |
JP2004502690A (ja) | 2000-07-04 | 2004-01-29 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 酵素dpp−ivのインヒビターである複素環式化合物 |
WO2002004610A2 (en) | 2000-07-10 | 2002-01-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human dipeptidyl-peptidase iv-like enzyme |
WO2002014271A1 (fr) | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Mitsubishi Pharma Corporation | Dérivés de proline et leur utilisation comme médicaments |
BR0114924A (pt) | 2000-10-27 | 2003-12-23 | Probiodrug Ag | Método para o tratamento de distúrbios neurológicos e neuropsicológicos |
TWI243162B (en) | 2000-11-10 | 2005-11-11 | Taisho Pharmaceutical Co Ltd | Cyanopyrrolidine derivatives |
JPWO2002051836A1 (ja) | 2000-12-27 | 2004-04-22 | 協和醗酵工業株式会社 | ジペプチジルペプチダーゼ−iv阻害剤 |
AU2002234640B8 (en) | 2001-02-24 | 2009-11-05 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Xanthine derivative, production and use thereof as a medicament |
JP2004525929A (ja) | 2001-03-27 | 2004-08-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | 糖尿病の治療または予防用のジペプチジルペプチダーゼ阻害薬 |
US6573287B2 (en) | 2001-04-12 | 2003-06-03 | Bristo-Myers Squibb Company | 2,1-oxazoline and 1,2-pyrazoline-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method |
US20030013177A1 (en) * | 2001-05-23 | 2003-01-16 | Ebens Allen J. | Polynucleotides encoding insect glutaminyl cyclase and uses thereof |
AU2002310465B2 (en) | 2001-06-20 | 2006-06-15 | Merck & Co., Inc. | Dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment of diabetes |
EP1406872B1 (en) | 2001-06-20 | 2007-12-19 | Merck & Co., Inc. | Dipeptidyl peptidase inhibitors for the treatment of diabetes |
GB0115517D0 (en) | 2001-06-25 | 2001-08-15 | Ferring Bv | Novel antidiabetic agents |
NZ529973A (en) | 2001-06-27 | 2006-01-27 | Smithkline Beecham Corp | Fluoropyrrolidines as dipeptidyl peptidase inhibitors |
DE10150203A1 (de) | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Probiodrug Ag | Peptidylketone als Inhibitoren der DPIV |
CN1688599A (zh) | 2001-06-27 | 2005-10-26 | 前体生物药物股份有限公司 | 二肽基肽酶iv抑制剂的新用途 |
EP1399433B1 (en) | 2001-06-27 | 2007-08-22 | Smithkline Beecham Corporation | Fluoropyrrolidines as dipeptidyl peptidase inhibitors |
JP4300108B2 (ja) | 2001-06-27 | 2009-07-22 | スミスクライン ビーチャム コーポレーション | ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としてのピロリジン類 |
WO2003002595A2 (en) | 2001-06-27 | 2003-01-09 | Probiodrug Ag | Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and their uses as anti-cancer agents |
EP1404675B1 (en) | 2001-07-03 | 2008-03-12 | Novo Nordisk A/S | Dpp-iv-inhibiting purine derivatives for the treatment of diabetes |
US20040259883A1 (en) | 2001-09-14 | 2004-12-23 | Hiroshi Sakashita | Thiazolidine derivative and medicinal use thereof |
EP1463727A2 (en) | 2001-09-19 | 2004-10-06 | Novo Nordisk A/S | Heterocyclic compounds that are inhibitors of the enzyme dpp-iv |
GB0704100D0 (en) | 2006-03-17 | 2007-04-11 | Vodafone Plc | Improvements in an ehspa architecture |
US8593773B2 (en) | 2008-11-05 | 2013-11-26 | Osram Gesellschaft Mit Berschraenkter Haftung | Half-bridge circuit protected against short circuits and having semiconductor switches |
US8049427B2 (en) | 2008-11-25 | 2011-11-01 | Lutron Electronics Co., Inc. | Load control device having a visual indication of energy savings and usage information |
-
2004
- 2004-05-05 AT AT04731150T patent/ATE464889T1/de active
- 2004-05-05 MX MXPA05011861A patent/MXPA05011861A/es active IP Right Grant
- 2004-05-05 CA CA2524009A patent/CA2524009C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-05-05 NZ NZ543146A patent/NZ543146A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-05-05 WO PCT/EP2004/004778 patent/WO2004098625A2/en active Application Filing
- 2004-05-05 EP EP04731150A patent/EP1620082B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-05-05 CN CN2004800123862A patent/CN1784220B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-05 PL PL04731150T patent/PL1620082T3/pl unknown
- 2004-05-05 DK DK04731150.1T patent/DK1620082T3/da active
- 2004-05-05 AU AU2004237408A patent/AU2004237408C9/en not_active Ceased
- 2004-05-05 JP JP2006505377A patent/JP5690463B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-05 BR BRPI0410078-6A patent/BRPI0410078A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-05-05 EA EA200501700A patent/EA009291B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-10-10 IL IL171339A patent/IL171339A/en active IP Right Grant
-
2006
- 2006-09-27 HK HK06110737.1A patent/HK1089964A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-10-23 AU AU2009227925A patent/AU2009227925B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-05-27 IL IL206009A patent/IL206009A/en active IP Right Grant
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993020061A1 (en) * | 1992-04-01 | 1993-10-14 | The University Of Toledo | 4-[4'-piperidinyl or 3'-pirrolidinyl] substituted imidazoles as h3-receptor antagonists and therapeutic uses thereof |
US5552426A (en) * | 1994-04-29 | 1996-09-03 | Eli Lilly And Company | Methods for treating a physiological disorder associated with β-amyloid peptide |
WO1999041224A1 (en) * | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Merck Frosst Canada & Co. | Biaryl-acetic acid derivatives and their use as cox-2 inhibitors |
WO2001034594A1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-17 | Guilford Pharmaceuticals, Inc. | Dipeptidyl peptidase iv inhibitors and methods of making and using dipeptidyl peptidase iv inhibitors |
WO2002013821A1 (en) * | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Gliatech, Inc. | Novel alicyclic imidazoles as h3 agents |
WO2003040174A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-15 | Probiodrug Ag | Substituted amino ketone compounds |
WO2004089366A1 (en) * | 2003-04-10 | 2004-10-21 | Pfizer Japan, Inc. | Bicyclic compounds as nr2b receptor antagonists |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MISQUITTA S.A. ET AL.: "CHARACTERIZATION OF THE INHIBITION OF GLUTAMINYL CYCLASE BY IMIDAZOLE DERIVATIVES AND PHENANTHROLINES", FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY. ANNUAL MEETING. ABSTRACTS OF PAPERS, vol. 16, no. 4, 20 March 2002 (2002-03-20), page A157, XP009034877, abstract * |
MISQUITTA S.A. ET AL.: "INHIBITION STUDIES OF GLUTAMINYL CYCLASE", FASEB JOURNAL (FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY), BETHESDA, US, vol. 15, no. 5, 8 March 2001 (2001-03-08), page A1159, XP009034875, ISSN: 0892-6638, abstract * |
SCHILLING S. ET AL.: "Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions", FEBS LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 563, no. 1-3, 9 April 2004 (2004-04-09), pages 191-196, XP004501117, ISSN: 0014-5793, see abstract * |
SCHILLING S. ET AL.: "Identification of human glutaminyl cyclase as a metalloenzymesee", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 50, 12 December 2003 (2003-12-12), pages 49773-49779, XP002324506, see abstract * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2542994C2 (ru) * | 2009-12-04 | 2015-02-27 | Эббви Инк. | Bcl-2-селективные апоптоз-индуцирующие средства для лечения рака и иммунных заболеваний |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE464889T1 (de) | 2010-05-15 |
HK1089964A1 (en) | 2006-12-15 |
WO2004098625A3 (en) | 2005-06-23 |
JP5690463B2 (ja) | 2015-03-25 |
EA200501700A1 (ru) | 2006-06-30 |
CN1784220B (zh) | 2011-08-03 |
BRPI0410078A (pt) | 2006-05-16 |
IL206009A0 (en) | 2010-11-30 |
CA2524009C (en) | 2014-04-29 |
AU2004237408C1 (en) | 2010-04-01 |
JP2006525278A (ja) | 2006-11-09 |
NZ543146A (en) | 2008-09-26 |
MXPA05011861A (es) | 2006-02-17 |
IL206009A (en) | 2017-09-28 |
DK1620082T3 (da) | 2010-08-16 |
EP1620082B9 (en) | 2010-08-25 |
CN1784220A (zh) | 2006-06-07 |
AU2009227925A1 (en) | 2009-11-12 |
AU2004237408C9 (en) | 2010-04-15 |
AU2004237408B2 (en) | 2009-10-01 |
EP1620082A2 (en) | 2006-02-01 |
IL171339A (en) | 2011-11-30 |
PL1620082T3 (pl) | 2010-10-29 |
EP1620082B1 (en) | 2010-04-21 |
AU2009227925B2 (en) | 2011-12-15 |
CA2524009A1 (en) | 2004-11-18 |
AU2004237408A1 (en) | 2004-11-18 |
WO2004098625A2 (en) | 2004-11-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA009291B1 (ru) | Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз | |
EA010108B1 (ru) | Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз | |
EP2206496B1 (en) | Screening of inhibitors of formation of pyroglutamic acid in amyloid beta peptide | |
ES2348500T3 (es) | Uso medico de inhibidores de glutaminil y glutamato ciclasas para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer y el sindrome de down. | |
AU2013211539A1 (en) | Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases | |
AU2011265545A1 (en) | Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |