IT202100012173A1 - Composizioni per l’uso nel trattamento di disabilità intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down - Google Patents

Composizioni per l’uso nel trattamento di disabilità intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down Download PDF

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IT202100012173A1
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sitagliptin
dpp4
mice
ts2cje
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Antonella Tramutola
Marzia Perluigi
Eugenio Barone
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Univ Degli Studi Roma La Sapienza
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Description

Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo:
?Composizioni per l?uso nel trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down?,
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell?invenzione
La presente descrizione si riferisce a composizioni per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down.
Sfondo
La sindrome di Down (DS) ? una condizione causata dalla trisomia totale o parziale del cromosoma 21 ed ? caratterizzata da difetti sia fisici sia neurologici, tra cui una disabilit? intellettiva da lieve a grave. Inoltre, i soggetti con DS hanno un rischio elevato di sviluppare malattie neurodegenerative, quale la malattia di Alzheimer (AD), generalmente a partire da 40 anni di et?.
Il recupero del deficit comportamentale e neurofisiologico osservato in seguito all?utilizzo di inibitori del recettore GABAA (GABAA-R) in modelli murini di DS ha portato all?ipotesi che il deficit intellettivo potesse dipendere da uno squilibrio a carico dei circuiti inibitori.
La maggior parte dei dati prodotti finora in modelli murini suggerisce che tale squilibrio possa essere riconducibile ad un elevato numero di neuroni inibitori e ad una maggiore frequenza delle correnti post-sinaptiche di tipo inibitorio. Allo stesso tempo, tuttavia, ? stata anche fornita evidenza del contrario: in particolare, lo squilibrio dei circuiti inibitori determinerebbe un aumento della concentrazione intracellulare di ioni cloro (Cl-) tale per cui, in seguito all?attivazione del recettore GABAA-R si osserverebbe un flusso di ioni Cl<- >dall?interno verso l?esterno della cellula, con conseguente depolarizzazione del neurone e ridotta inibizione.
Di conseguenza, nonostante l?alterazione della trasmissione GABAergica sia alla base del ritardo cognitivo in soggetti con DS, le cause di questa alterazione risultano ancora poco chiare e, ad oggi, non esistono approcci terapeutici utili a migliorare il deficit cognitivo e contrastare lo sviluppo di malattie neurodegenerative in soggetti con DS, in particolare in et? adulta.
Prodotti esistenti quali antagonisti o inibitori inversi del recettore GABA-A non sono disponibili in clinica; quando testati sull?uomo non hanno raggiunto gli endpoint primari e secondari e lo studio ? stato interrotto. L?uso di antagonisti del recettore GABAA ad ampio spettro, inoltre, non ? stato approvato in quanto in grado di promuovere convulsioni e crisi d?ansia.
Sintesi dell?invenzione
La presente descrizione ha lo scopo di fornire una composizione efficace e sicura per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down (DS).
Secondo la presente descrizione, tale scopo viene raggiunto grazie all?oggetto specificamente indicato nelle rivendicazioni che seguono, che vengono intese come parte integrante della presente descrizione.
Una forma di realizzazione della presente descrizione fornisce una composizione per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con DS, in cui la composizione comprende quale agente attivo almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori dell?enzima dipeptidil-peptidasi IV (DPP4). Preferibilmente, detto almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 pu? essere selezionato nel gruppo costituito da sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, gemigliptin, anagliptin, tenegliptin, alogliptin, trelagliptin e omarigliptin
La presente descrizione fornisce inoltre un procedimento per il trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con DS, il procedimento comprendendo la fase di somministrare una composizione comprendente almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori dell?enzima dipeptidil-peptidasi IV (DPP4) quale agente attivo al soggetto.
La composizione oggetto della presente descrizione ? risultata efficace non solo nel ripristinare la trasmissione GABAergica e il deficit cognitivo ma anche nel rallentare lo sviluppo di malattie neurodegenerative in soggetti con DS, quali ad esempio la malattia di Alzheimer. La composizione attiva, inoltre, uno specifico meccanismo molecolare (descritto nel seguito) che in soggetti con DS ? a differenza di quanto dimostrato in soggetti in salute ? si ? rivelato sorprendentemente in grado di promuovere effetti neuroprotettivi (e non neurotossici).
Breve descrizione delle figure
Una o pi? forme di attuazione saranno ora descritte, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento alle figure annesse, in cui:
- la Figura 1 mostra uno schema rappresentativo del meccanismo molecolare attraverso cui si esplicano gli effetti neuroprotettivi della somministrazione di sitagliptin, quale inibitore dell?enzima dipeptidil-peptidasi IV (DPP4), in un modello murino di DS; Freccia: attivazione; linea: inibizione; freccia tratteggiata sottile: inibizione dovuta all?insulino-resistenza; freccia/linea spessa: effetti relativi al nuovo meccanismo d?azione ipotizzato del DPP4 sull?asse DYRK1A/GSK3b/gephyrin nei topi Ts2Cje; freccia/linea sottile, meccanismo d?azione noto per la sitagliptin.
- la Figura 2 mostra l?analisi dell?attivit? dell?enzima DPP4 in campioni umani. In (A) analisi dell?attivit? del DPP4 in (i) campioni post-mortem di corteccia prefrontale isolati da persone con DS prima (< 40 anni) e dopo lo sviluppo dell?AD (> 40 anni) e (ii) campioni post-mortem di lobulo inferiore parietale isolati da pazienti affetti da AD a diversi stadi della patologia. In tabella sono riportate le caratteristiche dei campioni analizzati. Ctr G: controlli giovani con meno di 40 anni di et?; DS: persone con DS con meno di 40 anni di et?; DSAD: persone con DS che hanno sviluppato l?AD e di et? superiore a 40 anni; Ctr A: controlli adulti con un?et? maggiore di 40 anni; Ctr Anz: controlli anziani relativi ai soggetti con AD e con un?et? superiore a 80 anni; PCAD (pre-clinical AD): soggetti affetti da AD ma in uno stadio pre-clinico della patologia; MCI (amnestic mild cognitive impairment): soggetti affetti da AD ma in uno stadio intermedio della patologia; AD: soggetti affetti da AD conclamato. PMI (post-mortem interval): intervallo di tempo trascorso tra il decesso e il prelievo del cervello; Et?: et? espressa in anni; Sesso: sesso dei soggetti compresi nello studio. In (B) analisi dell?attivit? del DPP4 in campioni di plasma prelevati da persone affette da DS e relativi controlli. *, p<0.05 analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni;
- la Figura 3 illustra l?analisi dell?attivit? dell?enzima DPP4 in campioni di ippocampo isolati dai topi Ts2Cje a diverse et?. Eu: topi euploidi di controllo; Ts: topi Ts2Cje. *, p<0.05 analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni;
- la Figura 4 riguarda gli effetti della somministrazione di sitagliptin sulla memoria. In (A) viene descritto il piano sperimentale. Al termine del trattamento gli animali dei 4 gruppi sperimentali sono stati sottoposti ad un test comportamentale per la valutazione della memoria a lungo termine. Viene riportato l?indice di preferenza (B) e l?indice di discriminazione (C) dei roditori misurato rispettivamente negli animali euploidi e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo (soluzione salina). *, p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni;
- la Figura 5 illustra gli effetti della somministrazione di sitagliptin sulle caratteristiche morfometriche degli animali. In (A), variazione del peso misurato in grammi (gr) durante il corso del trattamento. In (B) e (C) risultati del test di tolleranza al glucosio (GTT) effettuato alla fine del trattamento per valutare se la somministrazione intranasale di sitagliptin promuove effetti periferici a carico del metabolismo glucidico. La curva in (B) rappresenta la concentrazione di glucosio nel plasma misurata in topi mantenuti a digiuno per 6 ore, dopo 0, 30, 60, 90 e 120 minuti dalla somministrazione intraperitoneale di glucosio (10% in soluzione fisiologica). Gli istogrammi in (C) rappresentano il valore dell?area sotto la curva. In (D-G), variazioni dell?area di superficie corporea (BSA) e dell?indice di massa corporea (BMI) misurati all?inizio (T= 0, iniziale) ed alla fine (T= 21, finale) del trattamento nei topi di ciascun gruppo. *, p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni;
- la Figura 6 illustra i risultati di analisi elettrofisiologiche condotte alla fine del trattamento con sitagliptin. mEPSC: correnti post-sinaptiche eccitatorie; Eu: topi euploidi trattati con veicolo; Eu S: topi euploidi trattati con sitagliptin; Ts: topi Ts2Cje trattati con veicolo; Ts S: topi Ts2Cje trattati con sitagliptin.(*, p<0.05 Ts S vs Ts analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni); - la Figura 7 illustra l?analisi dell?attivit? dell?enzima DPP4 in campioni di tessuto isolati dai topi Euploidi e Ts2Cje in seguito al trattamento con sitagliptin. Analisi dell?attivit? dell?enzima DPP4 in campioni di ippocampo, fegato e plasma isolati alla fine del trattamento con sitagliptin. Eu: topi euploidi; Ts: topi Ts2Cje. *, p<0.05 e **, p<0.01 analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni;
- la Figura 8 riguarda gli effetti della somministrazione di sitagliptin sui livelli totali della proteina DYRK1A. In (A) Immagine rappresentativa del western blot e della corsa elettroforetica (gel-normalizzatore, proteine totali) dei livelli di proteina DYRK1A valutata nell?ippocampo dei quattro gruppi sperimentali. In (B) gli istogrammi riportano l?analisi densitometrica dei livelli di DYRK1A rispettivamente negli animali euploidi e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo (soluzione salina). I valori di densitometria riportati sono espressi in percentuale rispetto al gruppo Eu trattato con il veicolo. I dati vengono presentati come media ? SEM, * p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni;
- la Figura 9 ? relativa a una valutazione della somministrazione di sitagliptin sull?attivazione della proteina GSK3b. I valori di densitometria riportati sono espressi in percentuale rispetto al gruppo Eu trattati con veicolo. I dati vengono presentati come media ? SEM, * p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni. (F) Regressione lineare eseguita valutando le variazioni della forma attiva di GSK3b rispetto ai livelli proteici di DYRK1A nei 4 gruppi sperimentali;
- la Figura 10 ? relativa a una valutazione della somministrazione di sitagliptin sulla co-localizzazione del recettore GABAA (GABAA-R) e della proteina gephyrin. Gli istogrammi mostrano l?analisi di immunofluorescenza nelle regioni ippocampali CA3 e CA1 dei topi euploidi trattati con veicolo e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo (soluzione salina) per la valutazione dell?espressione di GABAA-R (A) e proteina gephyrin (B). Nel grafico in (C) ? riportata l?analisi per stimare gli effetti di sitagliptin sulla co-localizzazione tra GABAA-R e proteina gephyrin in CA3 e CA1 nei topi euploidi e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo. Gli istogrammi mostrano l?intensit? di fluorescenza (MFI). I dati vengono presentati come media ? SEM, * p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni.- la Figura 11 mostra gli effetti della somministrazione di sitagliptin sull?attivazione della proteine Akt e MAPK44/42 nell?ippocampo dei topi Eu e Ts2Cje. In (A) immagini rappresentative del western blot e della corsa elettroforetica (gel-normalizzatore, proteine totali) dei livelli di fosforilazione e dei livelli totali delle seguenti proteine: p(ser473)-Akt, Akt, p(Thr202,Tyr204)-MAPK44/42 e MAPK44/42. In (B) analisi densitometrica relativa l?attivazione della proteina Akt ed in (C) analisi densitometrica relativa all?attivazione di MAPK44/42 rispettivamente negli animali euploidi e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo (soluzione salina). I valori di densitometria riportati sono espressi in percentuale rispetto al gruppo Eu trattato con il veicolo. I dati vengono presentati come media ? SEM, * p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni.
- la Figura 12 mostra gli effetti della somministrazione di sitagliptin sui livelli di stress ossidativo (A-B), sui livelli di beta-amiloide (Ab) e Tau fosforilata (pTau Ser404) (C-D) e sui livelli delle proteine normalmente associate con la plasticit? sinaptica quali la sintaxin-1, la proteina post-synaptic density protein 95 (PSD95) e la proteina brain derived neurotrophic factor (BDNF) (E-G) nell?ippocampo dei topi euploidi e Ts2Cje. I livelli di stress ossidativo sono stati rilevati misurando tramite la tecnica dello slot blot due delle principali modificazioni posttrasduzionali di ossidazione lipidica e proteica: (A) 3-nitrotirosina (3-NT, in seguito alla nitrazione di residui tirosina) e (B) 4-idrossinonenale (4-HNE, prodotto della perossidazione lipidica). I valori di densitometria riportati sono espressi in percentuale rispetto al gruppo Eu veicolo. La valutazione quantitativa di A? 1-42 (C) e tau fosforilata sulla Ser404 (D) delinea gli effetti della somministrazione di sitagliptin sugli aspetti neuropatologici dell?Alzheimer. La determinazione quantitativa di A? 1-42 ? avvenuta tramite l?impiego di un kit ELISA. I livelli di fosforilazione di Tau sulla Ser 404 sono stati misurati tramite immunofluorescenza. I livelli di tre proteine coinvolte nella trasmissione sinaptica sono stati misurati tramite immunofluorescenza. I grafici riportano l?intensit? di fluorescenza per sintaxin-1, un marcatore presinaptico (E), PSD95, un marcatore post-sinaptico (F) e BDNF, un fattore di crescita neuronale (G). I dati vengono presentati come media ? SEM, * p<0.05, analisi ANOVA seguita da test t con correzione di Bonferroni.
Descrizione dettagliata di forme di realizzazione preferite
Nella descrizione che segue, numerosi dettagli specifici vengono dati per fornire una comprensione approfondita delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono venire messe in pratica senza uno o pi? dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non vengono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento tutta la presente descrizione a ?una (aggettivo numerale) forma di realizzazione? o ?una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione? indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in relazione alla forma di realizzazione ? incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Quindi, le forme delle espressioni ?in una (aggettivo numerale) forma di realizzazione? o ?in una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione? in vari punti di tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono venire combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o pi? forme di realizzazione. I titoli forniti in questa sede sono solo per convenienza e non interpretano l?ambito o lo scopo delle forme di realizzazione. L?alterazione dell?equilibrio tra attivit? eccitatoria ed inibitoria dei circuiti neuronali ? un fattore responsabile della disabilit? intellettiva nonch? di altre manifestazioni neurologiche e psichiatriche che incidono fortemente sulla qualit? della vita delle persone con DS e delle loro famiglie. In particolare, si osserva una maggiore frequenza di ansia, disturbi del sonno clinicamente rilevanti e iperattivit? o disturbi del movimento. Infatti, i pazienti con DS dimostrano una maggiore incidenza di episodi epilettici con insorgenza di convulsioni concentrati principalmente durante la prima infanzia e l'invecchiamento. Le disfunzioni a carico della via di trasmissione GABAergica compromettono la plasticit? sinaptica, l'apprendimento e la memoria nelle persone con DS alterando l'equilibrio tra processi eccitatori/inibitori a livello sinaptico.
Come sottolineato nelle sezioni che precedono, non sono tuttavia ad oggi noti farmaci approvati per trattare o prevenire il deficit cognitivo e lo sviluppo di malattie neurodegenerative in soggetti con DS.
La presente descrizione fornisce una composizione per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con DS, in cui la composizione comprende quale agente attivo almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori dell?enzima dipeptidilpeptidasi IV (DPP4) (anche noti come gliptine). Tale composto pu? essere selezionato nel gruppo costituito da sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, gemigliptin, anagliptin, tenegliptin, alogliptin, trelagliptin, omarigliptin.
Un vantaggio derivato dall?impiego di tali composti ? che essi sono gi? stati approvati da diverse agenzie regolatorie internazionali e ed alcuni sono gi? ampiamente utilizzati nel trattamento di altre patologie; in particolare, essi rappresentano farmaci di scelta per il trattamento del diabete mellito di tipo 2 e dell?obesit?.
Tutti i composti appartenenti alla classe delle gliptine sono risultati efficaci nell? inibire l?attivit? dell?enzima DPP4 e nel favorire il conseguente aumento dei livelli di incretine come il GLP1, sia in vitro che in vivo, contribuendo in questo modo ad un miglioramento dell?uptake e dell?omeostasi del glucosio nonch? ad una riduzione dei processi infiammatori che sono caratteristiche peculiari delle malattie metaboliche come il diabete (sia di tipo 1 che di tipo 2) e l?obesit?. Come risulter? evidente dai risultati che seguono, la somministrazione intranasale in vivo di sitagliptin ((R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-diidro[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amine)), quale composto inibitore di DPP4, ? risultata efficace nel ripristinare la trasmissione GABAergica e la disabilit? intellettiva in un modello animale di DS. Inoltre, nel medesimo modello, il composto si ? dimostrato efficace nel rallentare lo sviluppo di fenomeni neurodegenerativi.
La disabilit? intellettiva ? caratterizzata da un funzionamento intellettivo significativamente al di sotto della media (spesso espresso come un quoziente di intelligenza < 70-75). La disabilit? intellettiva ? considerata un disturbo dello sviluppo neurologico. Tale condizione appare nella prima infanzia, di solito prima dell'ingresso a scuola. L?et? e le caratteristiche dell?esordio dipendono dall?eziologia (causa) e dalla gravit? della menomazione della struttura e/o delle funzioni cerebrali. ? un disturbo che comprende deficit del funzionamento sia intellettivo che adattivo negli ambiti concettuali, sociali e pratici, quali:
? Deficit delle funzioni intellettive, come ragionamento, problem solving, pianificazione, pensiero astratto, capacit? di giudizio, apprendimento scolastico e apprendimento dall?esperienza, confermati sia da una valutazione clinica sia da test di intelligenza individualizzati e standardizzati;
? Deficit del funzionamento adattivo che porta al mancato raggiungimento degli standard di sviluppo e socioculturali di autonomia e di responsabilit? sociale. Senza un supporto costante, i deficit adattivi limitano il funzionamento in una o pi? attivit? della vita quotidiana, come la comunicazione, la partecipazione sociale e la vita autonoma, attraverso molteplici ambienti quali casa, scuola, ambiente lavorativo e comunit?;
Quando la disabilit? intellettiva ? espressione di una particolare condizione genetica, ad es. DS, ci pu? essere un aspetto fisico tipico.
In una o pi? forme di attuazione, quando la composizione comprende sitagliptin quale agente attivo, essa pu? essere contenuta nella composizione sotto forma di sale, preferibilmente sale fosfato monoidrato 7-[(3R)-3-amino-1-oxo-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butyl]-5,6,7,8-tetrahydro-3-(trifluoromethyl)-1,2,4 triazolo[4,3-a]pyrazine phosphate (1:1) monohydrate.
La composizione oggetto della presente descrizione pu? comprendere almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 in una concentrazione compresa tra 0,1 mM e 50 mM, preferibilmente tra 0,5 mM e 2,5 mM.
In una o pi? forme di attuazione, l?agente attivo pu? comprendere, preferibilmente essere costituito da, sitagliptin. In una o pi? forme di attuazione, la composizione pu? comprendere almeno un ulteriore composto quale agente attivo.
In una o pi? forme di attuazione, la composizione oggetto della presente descrizione ? una composizione intranasale ovvero per un rilascio intranasale. La composizione si pu? presentare sotto forma di dose unitaria da somministrare una volta al giorno, in cui il composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 pu? essere presente preferibilmente in una quantit? compresa tra 0,001 mg e 1 mg.
Come descritto nel seguito, la somministrazione intranasale della composizione esercita un effetto localizzato al cervello, senza promuovere effetti significativi a livello periferico. Ulteriore vantaggio di questo tipo di somministrazione risiede nella possibilit? di impiegare un dosaggio inferiore dell?agente attivo rispetto a somministrazioni per via orale (OS); ci? in quanto la somministrazione intranasale della composizione favorisce l?attraversamento della barriera emato-encefalica da parte dell?agente attivo. La dose totale giornaliera del composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4, preferibilmente sitagliptin, pu? essere compresa tra 0,000015 mg/Kg e 0,015 mg/kg peso corporeo del soggetto.
La somministrazione intranasale non ? invasiva e risulta pertanto di facile utilizzo anche in soggetti affetti da DS. La composizione pu? essere somministrata sotto forma di spray o aerosol. La composizione pu? inoltre presentarsi sotto forma di soluzione acquosa.
La composizione pu? inoltre comprendere almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile. La composizione pu? inoltre comprendere almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile e noto nell?arte selezionato ad esempio tra soluzioni tampone, soluzione fisiologica salina, acqua.
Uno dei vantaggi apportati dalla composizione oggetto della presente domanda risiede nell?utilizzo di almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 quale agente attivo ovvero una classe di composti considerati molto sicuri per il ridotto numero di effetti collaterali associati alla loro somministrazione e gi? ampiamente utilizzati nell?uomo per il trattamento del diabete e dell?insulinoresistenza periferica.
La somministrazione di una composizione comprendente tali composti ? risultata pertanto una promettente alternativa farmacologica alla ristretta rosa di composti testati come antagonisti del neurotrasmettitore GABA in soggetti con DS.
Gli Inventori della presente domanda hanno dimostrato, inoltre, che gli effetti della somministrazione della composizione non sono limitati alla correzione della trasmissione GABAergica. I risultati descritti nel seguito mostrano chiaramente un marcato effetto neuroprotettivo contro l?accumulo di marcatori neuropatologici tipici dell?AD.
L?associazione tra gli effetti neuroprotettivi a carico della trasmissione GABAergica e quelli a carico delle vie normalmente alterate e responsabili dello sviluppo dell?AD rappresenta un aspetto ad oggi mai osservato nell?ambito del trattamento della DS.
Come verr? descritto nel seguito, gli Inventori hanno dimostrato che la sitagliptin, sorprendentemente, agisce mediante un meccanismo molecolare che si esplica attraverso l?asse delle proteine DYRK1A e GSK3b. In particolare, a seguito della somministrazione della composizione in un modello murino di DS, ovvero il topo Ts2Cje, ? stata osservata una riduzione dei livelli proteici di DYRK1A ed un?aumentata attivazione di GSK3b con conseguente degradazione della proteina gephyrin mediata da GSK3b ed il ripristino del turnover del GABAA-R a livello sinaptico.
Il risultato finale ha determinato un ripristino della corretta trasmissione GABAergica con un miglioramento significativo delle prestazioni cognitive.
La composizione, inoltre, si ? rivelata efficace nell?aumentare i livelli del fattore neurotrofico cerebrale (Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)) e delle proteine di membrana sintaxin-1 e PSD95 e al contempo nel ridurre i livelli della proteina beta-amiloide, della proteina Tau fosforilata e dello stress ossidativo nel cervello di un modello murino di DS (topi Ts2Cje) contribuendo cos? a prevenire e a rallentare i processi di neurodegenerazione.
Come illustrato in Figura 1, in condizioni fisiologiche, il legame del peptide glucagon-like peptide 1 (GLP1) al suo recettore (GLP-1R) promuove l?attivazione di due vie del segnale principali: la via dell?adenilato-ciclasi (AC) e la via del fosfatidilinositolo 3-chinasi/protein chinasi B (PI3K/Akt), le quali mediano gli effetti insulinotropici e neurtrofici associati al GLP1. La via del PI3K/Akt ? condivisa con il segnale dell?insulina. Infatti, a seguito del legame dell?insulina al suo recettore (IR), si osserva la fosforilazione e conseguente attivazione del substrato del recettore dell?insulina di tipo 1 (IRS1), il quale a sua volta media l?attivazione della via del PI3K/Akt. In condizioni di resistenza all?insulina, la proteina IRS1 ? inibita pertanto l?attivazione della via del PI3K/Akt a valle non avviene. Per questo motivo l?utilizzo di farmaci che promuovono un aumento delle concentrazioni di GLP1 o agonisti per il GLP-1R sono utilizzati per bypassare l?inibizione di IRS1 e ripristinare l?attivazione della via del PI3K/Akt. Il GLP1 ha un?emivita abbastanza breve in quanto viene inattivato dall?enzima dipeptidil-peptidasi di tipo 4 (DPP4) attraverso un taglio proteolitico che porta all?eliminazione di due amminoacidi a livello della porzione N-terminale della proteina trasformando cos? il GLP1-9-36 (forma attiva) in GLP1-7-36 (forma inattiva).
I composti appartenenti alla classe degli inibitori del DPP4, la sitagliptin ad esempio, sono in grado di aumentare la concentrazione extracellulare di GLP1 e quindi promuoverne gli effetti insulinotropici. Tale meccanismo era noto agli Inventori della presente domanda, il cui obiettivo era inizialmente quello di ripristinare l?attivazione del segnale dell?insulina in soggetti con DS.
Sorprendentemente, tuttavia, gli Inventori hanno osservato un nuovo meccanismo molecolare, mai descritto prima, alla base degli effetti neuroprotettivi della sitagliptin nei topi Ts2Cje. La DS ? caratterizzata dalla triplicazione del cromosoma 21, sul quale si trova il gene che codifica per la proteina dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1A (DYRK1A). Questa proteina ? over-espressa sia nell?uomo sia in modelli murini per la DS, e la sua over-espressione ? responsabile di numerosi effetti neurotossici. Inoltre, DYRK1A promuove l?inibizione della proteina glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3b). Tra i molteplici effetti mediati da GSK3b, quello a carico del turnover del recettore GABAergico di tipo A (GABAA-R) appare del tutto rilevante ai fini dell?invenzione qui descritta. Infatti, normalmente, GSK3b promuove la fosforilazione e la conseguente degradazione della proteina gephyrin che ancora il GABAA-R a livello della membrana post-sinaptica. Di conseguenza, l?overespressione di DYRK1A nella DS ? responsabile dell?over-inibizione di GSK3b e del conseguente accumulo di GABAA-R a livello post-sinaptico. Questo, sarebbe uno dei motivi responsabili della disfunzione della trasmissione GABAergica nella DS.
Il trattamento con un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 si ? dimostrato in grado di promuovere la riduzione dei livelli di DYRK1A e di favorire il ripristino dell?attivazione di GSK3b con conseguente degradazione della gephyrin. In questo modo, si assiste al ripristino del normale turnover dei recettori GABAergici a livello post-sinaptico con effetti positivi sui meccanismi alla base della plasticit? sinaptica in soggetti con DS.
Il ripristino della trasmissione GABAergica e quindi il miglioramento del deficit cognitivo nella DS viene efficacemente ottenuto attraverso un meccanismo molecolare completamente nuovo.
La quasi totalit? degli studi presenti in letteratura mostra come un?attivazione prolungata ed eccessiva della proteina GSK3b sia associata con lo sviluppo di neurodegenerazione, durante il normale processo di invecchiamento, nell?AD e nello sviluppo dell?epilessia. Molecole proposte come inibitori di GSK3b sono di conseguenza numerose.
Al contrario, l?attivazione della proteina GSK3b nel cervello dei topi Ts2Cje ? risultato un evento chiave al fine di ripristinare la trasmissione GABAergica e quindi di migliorare il deficit cognitivo in soggetti con DS.
I risultati descritti nel seguito evidenziano, inoltre, come l?attivazione di GSK3b nel cervello dei topi Ts2Cje non sia associata con l?accumulo di marcatori tipici dell?AD come la proteina Tau fosforilata o la beta-amiloide (Ab), suggerendo che l?attivazione di GSK3b conseguente alla somministrazione di un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4, quale la sitagliptin, segua vie di trasduzione del segnale differenti nella DS.
MATERIALI E METODI
Campioni di corteccia cerebrale
I campioni di corteccia frontale di cervello umano sono stati ottenuti dall'Universit? della California Alzheimer's Disease Research Center (UCI-ADRC) e dall'Universit? del Kentucky Alzheimer's disease Center. La tabella 1 mostra le caratteristiche e i dati demografici dei casi inclusi nello studio. I casi di DS sono stati divisi in due gruppi, con (DSAD, n=8) o senza (DS, n=8) una diagnosi neuropatologica per l?AD. L'et? dei casi di DS risulta inferiore a 40 anni, mentre i casi DSAD hanno un?et? maggiore ai 40 anni. Per questo motivo, i controlli sono stati suddivisi in due gruppi: controlli giovani (Ctr G, n=6), da confrontare con il gruppo DS, avendo un ?et? ? 45 anni; controlli anziani (Ctr A, n=8), da confrontare con DSAD poich? hanno un?et? maggiore di 45 anni. I campioni di plasma dei pazienti DS (n=30) ed i rispettivi controlli (Ctr y, n= 25), utilizzati per valutare l?attivit? enzimatica di DPP4, sono stati raccolti presso l?ospedale pediatrico Bambino Ges?.
Per quanto riguarda i campioni di corteccia dei pazienti affetti da AD sono stati ottenuti considerando i tre diversi stadi della patologia (Preclinical AD, PCAD (n=8); Mild Cognitive impairment, MCI (n=6) e AD conclamato, AD (n=8). I controlli anziani (Ctr Anz, n=8) sono stati selezionati in base all?et? per poterli paragonare ai casi affetti da AD. Tutti i risultati ottenuti dai campioni autoptici umani sono stati analizzati considerando la differenza nell'intervallo post-mortem (PMI) tra i gruppi.
Per quanto riguarda i campioni post-mortem non era richiesto un consenso informato trattandosi di campioni autoptici conservati rispettivamente nelle biobanche dell?UCI-ADRC e dell?Universit? del Kentucky. Per quanto riguarda i campioni di plasma ottenuti dall?Ospedale Pediatrico Bambin Ges?, il loro prelievo ? stato approvato dal Comitato Etico dello stesso ospedale con protocollo n? 1771_OPBG_2019.
Campioni murini e trattamento
I topi Ts2Cje (Rb-12.Ts171665Dn2Cje) sono un consolidato modello animale per lo studio della DS, sono trisomici per il cromosoma 16 (Mmu16), da Mrpl39 al telomero distale, omologo del cromosoma 21 umano (hsa21). Le prime generazioni di genitori di topi trisomici e non sono state acquistate presso Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). La colonia murina viene mantenuta incrociando le femmine trisomiche Ts2Cje con maschi ibridi F1 (B6EiC3SnF1/J), dal seguente incrocio si ottengono cucciolate per il 40% trisomiche (Ts2Cje), mentre il restante 60% dei nuovi nati risultano euploidi (Eu). La trisomia della prole viene confermata utilizzando una PCR standard, validata da Reinholdt et al. La colonia murina ? stata ospitata nello stabulario del Dipartimento di Istologia dell?Universit? Sapienza di Roma. Le condizioni ambientali dello stabulario sono rimaste costanti e monitorate (temperatura 22 ? 2?C, illuminazione dalle ore 7:00 alle ore 19:00 e umidit? costante 50-60%), con cibo ed acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati condotti nel rigoroso rispetto delle Leggi Nazionali Italiane (DL 116/92) e delle Direttive del Consiglio delle Comunit? europee (86/609 / CEE). Inoltre, il protocollo sperimentale adottato per gli studi sui Ts2Cje ? stato approvato dal Ministero della Salute (# 1183/2016-PR). Nello studio, sono stati compiuti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.
Per la valutazione dei cambiamenti et?-dipendenti dell?attivit? enzimatica di DPP4 (descritta sotto) nell?ippocampo, i topi euploidi e Ts2Cje sono stati sacrificati a diverse et? 1-3-9-12 mesi (n=6 per gruppo). Quest?esperimento ci ha permesso di individuare un?et? specifica in cui l?attivit? enzimatica di DPP4 ? aumentata nei topi trisomici (9 mesi) rispetto agli euploidi. Questa et? ? stata scelta per il trattamento con il farmaco oggetto dello studio.
I topi, all?et? di 9 mesi, sono stati suddivisi in 4 gruppi sperimentali: euploidi trattati con veicolo (Eu veicolo, n=10), Ts2Cje trattati con veicolo (Ts2 veicolo, n=10), euploidi trattati con sitagliptin (Eu sitagliptin, n=10) e Ts2Cje trattati con sitagliptin (Ts2 sitagliptin, n=10). La somministrazione ? stata di tipo intranasale ed ogni topo ha ricevuto quotidianamente per 21 giorni 10 ?L a narice di veicolo (soluzione fisiologica salina) o sitagliptin (Selleckchem #S4002, 5 mM) disciolta in soluzione fisiologica salina. Per tutta la durata del trattamento i topi sono stati pesati settimanalmente al fine di valutare eventuali variazioni di peso. Dopo 21 giorni di trattamento gli animali sono stati sottoposti ad un test comportamentale per valutare le loro capacit? di memoria e di apprendimento. Dopo il test comportamentale si ? proceduto alla valutazione di parametri metabolici quali la glicemia (sia a digiuno che sotto curva glicemica), la superficie corporea (BSA) e l?indice di massa corporea (BMI). Infine, gli animali sono stati sacrificati utilizzando la dislocazione cervicale. Le aree cerebrali e periferiche sono state isolate e raccolte in azoto liquido e successivamente sono state conservate a ? 80?C fino al momento dell'utilizzo per le analisi biochimiche.
Parametri metabolici
Il peso corporeo degli animali (gr) dei 4 gruppi sperimentali (Eu veicolo, Eu sitagliptin, Ts2 veicolo e Ts2 sitagliptin) ? stato monitorato una volta a settimana dall?inizio del trattamento (0-7-14-21 giorni). Inoltre, ad inizio e fine trattamento topi sono stati misurati per valutare la lunghezza in centimetri (cm). Per il calcolo della superficie di massa corporea ? stata utilizzata l?equazione di DuBois: superficie corporea (m2) = 0.007184 x peso (Kg 0.425) x altezza (cm0.725). L?indice di massa corporea ? stato calcolato come rapporto tra peso e BSA (gr/m2). Al termine del trattamento ? stato effettuato sui 4 gruppi sperimentali il test di tolleranza al glucosio (GTT). Dopo un periodo di digiuno di 6 ore, ? stata valutata la glicemia basale degli animali con un piccolo prelievo di sangue a livello della coda (T0). In seguito, gli stessi animali sono stati trattati con una soluzione di glucosio (10%, iniezione intraperitoneale) e la glicemia ? stata misurata con un glucometro (lineaD ORO, Bioseven) dopo 30-60-90-120 minuti.
Test cognitivo
Il test di riconoscimento degli oggetti (Novel object recognition, NOR) ? un mezzo relativamente veloce ed efficiente per testare le diverse fasi di apprendimento e memoria nei topi. Il test si basa su un minimo di tre sessioni: una sessione di abituazione (Giorno 1), una sessione di addestramento (Giorno 2) e una sessione di test (Giorno 3). L'addestramento implica semplicemente l'esplorazione visiva di due oggetti identici, mentre la sessione di test prevede la sostituzione di uno degli oggetti esplorati in precedenza con un nuovo oggetto. Poich? i roditori hanno un'innata preferenza per la novit?, un roditore che ricorda l'oggetto familiare trascorrer? pi? tempo ad esplorare il nuovo oggetto. I topi appartenenti ai 4 gruppi sperimentali (Eu veicolo, Eu sitagliptin, Ts2 veicolo e Ts2 sitagliptin) sono stati sottoposti al seguente test cognitivo.
Nella fase di abituazione, ogni animale pu? esplorare liberamente l'arena per 10 minuti (50 cm di profondit? ? 30 cm di larghezza ? 30 cm di altezza) in assenza di oggetti. Durante la fase di addestramento, un singolo animale viene posto nell'arena contenente due oggetti identici (due palline) per 10 min. Nella fase di test, dopo 24 ore, l'animale viene riportato all'arena con due oggetti, uno ? l'oggetto familiare e l'altro ? un nuovo oggetto (pallina lego). Il contesto sperimentale non cambia durante i tre giorni di test. Nella fase di analisi vengono valutati l'indice di discriminazione (DI) e di preferenza (PI). L'indice di discriminazione (DI), consente di calcolare la capacit? dell?animale di discriminare tra oggetti nuovi (TN) e familiari (TF) [DI = (TN ? TF) / (TN TF)]. Mentre, l'indice di preferenza (PI) ? il rapporto tra la quantit? di tempo trascorso esplorando entrambi gli oggetti nella fase di addestramento (A, B) o il nuovo oggetto nella fase di test (C) rispetto al tempo totale trascorso nell'esplorazione di entrambi gli oggetti in percentuale ovvero A, B o C / (A+B C) ? 100 (%). Pertanto, un indice di preferenza superiore al 50% indica una netta preferenza per il nuovo oggetto.
Elettrofisiologia
Le sezioni di encefalo contenenti l?ippocampo sono state ottenute dai topi appartenenti ai 4 gruppi sperimentali (Eu Veh, Eu SITA, Ts2 Veh e Ts2 SITA) a 9 mesi d?et? dopo essere sottoposti ad eutanasia mediante overdose di isofluorano. I cervelli sono stati rapidamente rimossi e posti in una soluzione ghiacciata di taglio contenente quanto segue (in mM): 124 NaCl, 3,2 KCl, 1 NaH2PO4, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 26 NaHCO3, 10 glucosio, 2 Na-piruvato e 0,6 acido ascorbico, pH 7,4, 95% O2/5% CO2. Le sezioni di cervello contenenti l?ippocampo (300 mm di spessore) sono state tagliate mediante un vibratomo (VT1000S; Leica Microsystems) e immediatamente trasferite in una camera di incubazione riempita con ACSF contenente quanto segue (in mM): 124 NaCl, 3,2 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 26 NaHCO3 e 10 glucosio, pH 7,4, 95% O2/5% CO2. Le sezioni di cervello sono state lasciate recuperare a 32?C per 1 ora prima di essere equilibrate a temperatura ambiente.
Per le registrazioni elettrofisiologiche, le sezioni di cervello sono state trasferite in una camera di registrazione costantemente perfusa con ACSF riscaldato (32?C) e gorgogliato con il 95% di O2/5% di CO2. Successivamente, le fettine sono state utilizzate per le registrazioni elettrofisiologiche. Tutte le registrazioni elettrofisiologiche sono state eseguite utilizzando la tecnica del patch-clamp nella configurazione ?whole-cell?. Le registrazioni sono state ottenute con un amplificatore Axopatch 700B (Molecular Devices) e la stimolazione e l'acquisizione dei dati sono state eseguite con una Digidata 1200 e con il software pCLAMP 11 (Molecular Devices). Il rilascio spontaneo di neurotrasmettitore ? stato studiato con esperimenti di voltage-clamp. Le pipette di registrazione di vetro borosilicato (Warner Instruments, Inc) con una resistenza da 3?5 M? ottenute sono state fabbricate utilizzando un puller Narishige PC-10 (Giappone) e riempite con una soluzione interna contenente (in mM): 146 K-gluconato, 18 HEPES, 1 EGTA, 4,6 MgCl2, 4 NaATP, 0,3 Na2GTP, 15 creatina fosfato. I neuroni sono stati mantenuti a -70 mV di potenziale di holding. Negli stessi neuroni ? stata valutata la capacit? e la resistenza di membrana. Mediante esperimenti di current-clamp ? stato studiato il potenziale di membrana a riposo.
Preparazione dei campioni
Sono stati preparati estratti proteici totali dalla corteccia frontale per i campioni autoptici umani e dall?ippocampo per i campioni murini, utilizzando la soluzione RIPA (pH 7,4) contenente TrisHCl (50 mM, pH 7,4), NaCl (150 mM), 1% NP-40, 0,25% di sodio desossicolato, acido etilendiammina tetracetico (EDTA) (1 mM), 0,1% sodio dodecil solfato (SDS). Per lo studio dell?attivit? enzimatica DPP4 i campioni sono stati usati senza inibitori inibitori delle proteasi e delle fosfatasi che altrimenti avrebbero inibito anche l?attivit? della stessa DPP4. Per il resto degli esperimenti gli estratti proteici sono stati integrati con dei cocktails di inibitori delle proteasi e delle fosfatasi (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA). I tessuti cerebrali sono stati omogenati nella soluzione sopra descritta tramite sonicazione e centrifugati a 14.000 rpm per 30 min a 4?C. Il supernatante ? stato utilizzato per determinare la concentrazione proteica totale tramite il saggio dell?acido bicinconinico (BCA, Pierce, Rockford, IL).
Dosaggio dell?attivit? enzimatica di DPP4
L'attivit? enzimatica di DPP4 ? stata misurata secondo il saggio di Matheeussen et al. che misura la velocit? di scissione della 7-amino-4- metilcumarina (AMC) dal substrato sintetico H-glicil-prolil-AMC (H-Gly-Pro-AMC; BioVi-sion, San Francisco, California, USA, nmol/min/ml). Per attribuire la misurazione dell'attivit? enzimatica esclusivamente a DPP4 e non ad altri membri della famiglia DPP, un set parallelo di campioni ? stato incubato con l'inibitore selettivo di DPP4, sitagliptin, a una concentrazione finale di 500 ?M. Per ogni campione, l'attivit? DPP4 ? stata quindi calcolata in base alla fluorescenza residua ottenuta sottraendo la fluorescenza del campione trattato con l?inibitore da quella del campione senza inibitore.
Immunofluorescenza
L?immunofluorescenza ? stata effettuata sui cervelli dei topi euploidi e Ts2Cje trattati con veicolo e il gruppo di Ts2Cje trattati con sitagliptin. I cervelli sono stati posti in paraformaldeide al 4% per 24 ore. I cervelli sono stati poi fissati nelle successive 48 ore in una soluzione di saccarosio al 20%. Le sezioni di cervello sono state, in seguito, tagliate con uno spessore di 15 ?m mediante un criostato (Leica System) e sono state conservate in una soluzione acquosa di PBS contenente 0,02% di NaN3 a 4?C fino all?utilizzo. Le fettine cos? ottenute sono state montate su vetrini e sono state bloccate e permeabilizzate tramite la soluzione di Blocking (10% di normal goat serum e 0,2% Triton X-100 in TBS) per 2 ore. In seguito, le sezioni sono state incubate overnight a 4?C con un i seguenti anticorpi: recettore GABA ?2 (1:500, Synaptic System, #224-103) e gephyrin (1:250, Synaptic System, #147-111), p-Tau Ser404 (1:500, Abcam, #92676), sintaxin-1 (1:250, Genetex, #GTX113559) e PSD95 (1:250, Abcam, #ab18258), BDNF (1:200, Santa Cruz, sc-546)
Il giorno seguente, le stesse fettine sono state incubate con un mix di anticorpi secondari fluorescenti, per valutare la co-localizzazione delle due proteine, antimouse Alexa Fluor 488nm per gephyrin e anti-rabbit Alexa Fluor 594nm per GABA ?2 (1:1500, Invitrogen, Carlsbad, California, CA, USA) per 2 ore a temperatura ambiente. Le fettine poi sono state lavate nuovamente e incubate con DAPI marcatore nucleare (1:10000, Invitrogen, Carlsbad, California, CA, USA). Per sottrarre il segnale di background non specifico creato dall? anticorpo secondario, alcune sezioni sono state incubate solo con l?anticorpo secondario. Infine, il campione ? stato sigillato con un vetrino copri-oggetto tramite fluorimount (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). L?acquisizione e l?analisi delle sezioni di cervello ? avvenuta tramite microscopia confocale TCS SP5 X Leica ed il software d?analisi ImageJ.
Western Blot
Per i western blot, 20 ?g di proteine provenienti dall?ippocampo dei topi appartenenti ai 4 gruppi sperimentali sono state separate tramite una SDS-PAGE 4-15% CriterionTM TGX (Tris-Glyicine eXtended) Stain- FreeTM (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Questa tipologia di gel permette una rapida acquisizione della corsa proteica nell'ultravioletto (UV) tramite ChemidocTM MP imaging systems (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Quindi, il gel, una volta acquisita l?immagine, rappresenta il totale delle proteine caricate (Total Load) che verranno poi utilizzate per normalizzare le specifiche proteine da esaminare. Dopo l'elettroforesi e l'imaging del gel, le proteine vengono trasferite tramite l'apparato semi-dry TransBlot Turbo (Bio-Rad Laboratories) su membrane di nitrocellulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Le membrane di nitrocellulosa vengono bloccate con albumina sierica bovina (BSA) 3% in una soluzione di Tween 20-TBS e incubate overnight a 4?C utilizzando anticorpi primari specifici: p(T216) -GSK3? (1:1000, Santa Cruz, #sc-135653), p(S9) -GSK3? (1:1000, Cell Signalling, #5558S), GSK3? (1:1000 Abcam, #93926) e DYRK1A (1:1000, Cell Signalling, #8765S), MAPK44/42 (1:1000, Cell Signaling, #9102), p(Thr202/Tyr204)-MAPK44/42 (1:1000, Cell Signaling, #9101), Akt (1:2000, Bio-Rad, #vma00253K), p(S473)Akt (1:1000, Cell Signaling, #4060S). Dopo 3 lavaggi con una soluzione tampone T-TBS, le membrane sono state incubate per 1 ora a temperatura ambiente con anticorpi secondari. Gli anticorpi secondari ad attivit? perossidasica sono anti-mouse o anti-rabbit (1:5000, Bio-rad, Hercules, CA, USA). Le membrane sono state sviluppate tramite Clarity Enhanced Chemiluminescence (ECL), un substrato chemiluminescente (Bio-rad, Hercules, CA, USA) e acquisite con Chemidoc Mp (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Infine, i risultati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il programma ImageLab (Bio-rad, Hercules, CA, USA).
Slot Blot
Per l'analisi dei livelli totali di proteine modificate per 4-idrossinonenale (4-HNE) e per 3-nitrotirosina (3-NT) nei topi Euploidi e Ts2Cje trattati rispettivamente con veicolo e sitagliptin, 5?l di campione omogenato, come descritto nel paragrafo ?preparazione campioni?, sono stati incubati con 10 ?l di Laemmly buffer contenente: Tris HCl 0,125M pH 6.8, 4% (p/v) di SDS e 20% (v/v) di glicerolo. I campioni (250 ?l per pozzetto) sono stati caricati nei pozzetti dell?apparato slotblot e trasferiti su membrana di nitrocellulosa. La membrana ? stata bloccata per 2 h con una soluzione al 3% di albumina di siero bovino in T-TBS ed incubata con un anticorpo primario policlonale anti-HNE (1:3000; HNE, NOVUS, #NB100-63093) o anti-3-NT (1:1000; Sigma Aldrich, #SAB52000009), per 2 ore a temperatura ambiente. La membrana ? stata lavata con T-TBS e incubata con anticorpo secondario anti-rabbit o anti- mouse coniugato con fosfatasi alcalina (1:5000, Sigma Aldrich) per 1 ora a temperatura ambiente. Le membrane sono state acquisite con Chemidoc Mp (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Infine, i risultati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il programma ImageLab (Bio-rad, Hercules, CA, USA).
ELISA A? 1-42
Il kit ELISA A?1-42 (KMB3441; Invitrogen TermoFisher Scientific) ? stato utilizzato per determinare i livelli di peptide ?-amiloide 1-42 nei topi Eu e Ts2Cje trattati rispettivamente con veicolo e sitagliptin (n = 6 / gruppo). Come controllo positivo per la produzione di ?-amiloide 1-42 ? stato utilizzato il topo 3x-Tg, modello animale comunemente usato per lo studio della patologia d?Alzheimer (n = 2 / gruppo). In breve, ~ 10 mg di ippocampo sono stati omogenati nel tampone DEA (10?L / mg di tessuto; 0,2% dietanolammina e 50 mM di NaCl) a cui ? stato aggiunto il cocktail di inibitori della proteasi (1: 100; Millipore). Il campione ? stato centrifugato a 15.000 rpm per 1 ora 30 min 4 ? C, il surnatante ? stato conservato per la misurazione di ?-amiloide 1-42 seguendo le istruzioni indicate dal produttore del kit. I calcoli per la quantizzazione di ?-amiloide sono stati effettuati con l?impiego del software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad, La Jolla, CA, USA).
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software GraphPad Prism 8.0. L'analisi della varianza (One way-ANOVA) ? stata utilizzata per confrontare i risultati ottenuti accompagnata dal post-hoc test di Bonferroni per i confronti multipli. I valori di p < 0.05 * sono stati considerati significativi.
RISULTATI
Come illustrato in Figura 2, l?analisi dell?attivit? dell?enzima DPP4, valutata in campioni post-mortem di corteccia prefrontale isolati da persone con DS sia prima che dopo lo sviluppo dell?Alzheimer (DSAD), paragonati con i rispettivi controlli, mostra un aumento significativo nelle persone con DS (Figura 2A). Lo stesso aumento non si osserva in campioni di plasma collezionati da persone con DS e relativi controlli (Figura 2B), suggerendo un?alterazione particolarmente significativa a livello cerebrale. Inoltre, la stessa valutazione condotta in campioni post-mortem di cervello (lobulo parietale inferiore) isolati da pazienti con AD a diversi stadi della patologia e relativi controlli, fornisce l?evidenza di come l?aumento dell?attivit? della DPP4 sia un?alterazione principalmente associata con l?et?, piuttosto che con la patologia AD (Figura 2A).
Questi risultati sono in accordo con l?ipotesi prevalente in letteratura che riferisce della DS come una condizione che promuove un processo di invecchiamento accelerato.
Inoltre, l?analisi dell?attivit? dell?enzima DPP4 in campioni di corteccia prefrontale isolati dal topo Ts2Cje (un modello murino di DS) mostra un aumento et?dipendente congruente con i risultati ottenuti sull?uomo (Figura 3), e supporta l?utilizzo di questo modello animale per gli studi successivi. In particolare, gli effetti della somministrazione della composizione sono stati valutati in topi Ts2Cje a 9 mesi di et?, in quanto questa era l?et? associata a un aumento significativo dell?attivit? della DPP4 nel cervello.
L?identificazione di un nuovo meccanismo molecolare di modulazione mediato dalla sitagliptin, quale composto inibitore di DPP4, ha consentito di dimostrarne l?efficacia nel promuove il ripristino della trasmissione GABAergica nei topi Ts2Cje, cui si associa un significativo miglioramento del deficit cognitivo. Il trattamento promuove, altres?, un marcato miglioramento del quadro neuropatologico.
In particolare, la somministrazione della composizione comprendente sitagliptin (5 mM) per via intranasale (10 uL/narice, 1 volta al giorno per 21 giorni) promuove un marcato miglioramento delle prestazioni cognitive, valutate attraverso un test standard, il novel object recognition (NOR), nei topi Ts2Cje a 9 mesi di et? (Figura 4).
Allo stesso tempo, lo schema di trattamento si ? rivelato sicuro in quanto non sono state osservate variazioni fenotipiche o morfometriche, n? variazioni degli indici relativi al metabolismo glucidico nei topi Ts2Cje trattati con sitagliptin (Figura 5).
Il miglioramento osservato nei test cognitivi ? stato inoltre supportato da risultati ottenuti mediante analisi elettrofisiologiche che mostrano il completo ripristino della trasmissione GABAergica nei topi Ts2Cje trattati con la composizione comprendente sitagliptin (Figura 6). In particolare, in topi Ts2Cje si osserva un significativo aumento della frequenza di rilascio spontaneo del neurotrasmettitore rispetto ai topi Eu (A) come dimostrato con esperimenti di patch-clamp in neuroni della regione CA1 dell?ippocampo. L?ampiezza dei segnali non ? significativamente diversa tra topi Ts2Cje ed Eu (B), il che correla con un effetto presinaptico e/o generalizzato a livello circuitale. Il trattamento farmacologico dei topi Ts2Cje (Ts+S) reverte completamente l?aumento della frequenza di rilascio spontaneo del neurotrasmettitore osservata nei topi Ts2Cje (A). La composizione non ha effetti sulla frequenza e sull?ampiezza del rilascio spontaneo di neurotrasmettitori nei topi Eu (A e B). L?aumento della frequenza di rilascio spontaneo del neurotrasmettitore ? correlabile ad un aumento dell?eccitabilit? ippocampale. Lo studio della capacit? di membrana (C) e dell?input resistance (D) indica che i neuroni analizzati possiedono propriet? biofisiche simili. Il potenziale di membrana non ? significativamente diverso nei vari gruppi studiati (E). Questi dati indicano che l?aumento dell?eccitabilit? osservato nei topi Ts potrebbe essere dovuto ad una alterata attivit? dei neuroni GABAergici e che la sitagliptin ? in grado di ripristinare le alterazioni elettrofisiologiche osservate nei topi Ts2Cje. Un altro aspetto rilevante della composizione descritta nella presente domanda riguarda l?evidenza che essa ? risultata in grado di ridurre l?attivazione dell?enzima DPP4 a livello ippocampale senza promuovere effetti significativi a livello periferico (Figura 7). L?importanza di tale aspetto ? correlato con il fatto che lo scopo dell?impiego della composizione ? quello di ripristinare l?attivit? dell?enzima DPP4 solo e selettivamente nelle aree in cui si ? osservata una maggiore attivazione di tale enzima e non in altre.
Da un punto di vista molecolare, il trattamento con sitaglitpin promuove una riduzione significativa dei livelli di espressione della proteina DYRK1A nell?ippocampo dei topi Ts2Cje (Figura 8), in cui il pannello (A) mostra un?immagine rappresentativa del western blot e della corsa elettroforetica dei livelli di proteina DYRK1A valutata nell?ippocampo di quattro gruppi sperimentali; il pannello (B) mostra istogrammi relativi all?analisi densitometrica dei livelli di DYRK1A rispettivamente negli animali euploidi e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo (soluzione salina).
Questo risultato, mai osservato prima, ? molto incoraggiante in quanto DYRK1A ? una delle proteine codificate a livello del cromosoma 21 e quindi over-espresse nella DS. DYRK1A svolge, inoltre, un ruolo fondamentale nello sviluppo neuronale. Modelli murini transgenici caratterizzati dall? over-espressione di DYRK1A (topi mBACtgDYRK1A) mostrano alterazioni delle dimensioni del cervello e della densit? neuronale, ritardi dello sviluppo neurologico, anomalie motorie, alterata plasticit? sinaptica, deficit di apprendimento e memoria. Caratteristiche simili si osservano nella DS, dove l?over-espressione di DYRK1A ? stata collegata al deficit cognitivo ed allo squilibrio esistente tra i meccanismi che mediano i processi di eccitazione ed inibizione a livello neuronale.
Inoltre, DYRK1A, promuove l?inibizione della proteina glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3b). Gli Inventori della domanda in oggetto mostrano come la riduzione dei livelli di DYRK1A mediata dalla sitagliptin sia associata ad un?aumentata attivazione della proteina GSK3b nel cervello dei topi Ts2Cje. La Figura 9, pannello A, mostra i risultati di test sperimentali condotti mediante western blot e corsa elettroforetica relativi ai livelli di proteina GSK3b e delle sue forme fosforilate (inibita: pS9; attiva: pT216). I livelli totali di GSK3b ed il suo stato di inibizione/attivazione sono stati misurati nell?ippocampo dei quattro gruppi sperimentali. Negli istogrammi viene mostrata l?analisi densitometrica dei livelli totali di proteina totale (B), della sua forma inibita (C) e della sua forma attiva (D), queste ultime due normalizzate rispetto ai livelli totali di proteina. Inoltre, nel grafico in (E) viene riportato lo stato di attivazione complessivo di GSK3b come rapporto tra la forma inibita e quella attiva (pS9/pT216) rispettivamente negli animali euploidi e Ts2Cje trattati con sitagliptin o con veicolo (soluzione salina). Il pannello F indica la regressione lineare eseguita valutando le variazioni della forma attiva di GSK3b rispetto ai livelli proteici di DYRK1A nei 4 gruppi sperimentali.
La suddetta evidenza sperimentale si ? rivelata alla base dell?aspetto innovativo della composizione descritta, in quanto i dati disponibili in letteratura, al contrario, suggeriscono che una eccessiva attivazione di GSK3b nel cervello promuove effetti neurotossici (per esempio un aumento della fosforilazione della proteina Tau nell?AD). Nonostante questo, va sottolineato il fatto che la DS, a differenza di altre patologie neurodegenerative, presenta caratteristiche peculiari dovute alla trisomia del cromosoma 21 che la rendono una condizione abbastanza unica. In quest?ottica, l?over-espressione di DYRK1A promuoverebbe una persistente inibizione di GSK3b e questa alterazione sarebbe alla base dei difetti nella trasmissione GABAergica.
La proteina GSK3b, oltre ad essere coinvolta nella via di trasduzione del segnale dell?insulina, promuove la fosforilazione e la conseguente degradazione della proteina gephyrin, che regola il turnover dei recettori GABAA-R a livello delle sinapsi (Figura 1). I risultati ottenuti dagli Inventori della presente domanda mostrano chiaramente che all?attivazione della proteina GSK3b conseguente al trattamento intranasale con la composizione, ? associata a una riduzione dei clusters di gephyrin e GABAA-R a livello sinaptico (valutati attraverso microscopia confocale) (Figura 10) e tale evidenza spiega anche il ripristino della trasmissione GABAergica osservata negli studi di elettrofisiologia sopra descritti (Figura 6).
L?asse DPP4/DYRK1A/GSK3b/gephyrin/GABAA-R rappresenta pertanto un meccanismo molecolare per la prima volta identificato dagli Inventori della presente domanda (Figura 1), meccanismo molecolare attraverso cui si esplicano gli effetti neuroprotettivi della composizione comprendente sitagliptin nella DS. Inoltre, a seguito della somministrazione della composizione, sono stati osservati i seguenti risultati: i) il ripristino dell?attivazione del segnale dell?insulina cerebrale a livello della via delle MAPK44/42 e di Akt (Figura 11), note per mediare effetti neuroprotettivi; ii) una riduzione dei livelli di stress ossidativo, Ab e Tau fosforilata (Figura 12 A-D), iii) un aumento delle proteine coinvolte nella trasmissione sinaptica (sintaxin-1, PSD95 e BDNF) (Figura 12 E-G).

Claims (7)

RIVENDICAZIONI
1. Composizione per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di disabilit? intellettiva e di malattie neurodegenerative in un soggetto con Sindrome di Down, la composizione comprendendo quale agente attivo almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori dell?enzima dipeptidil-peptidasi IV (DPP4).
2. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 ? selezionato nel gruppo costituito da sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, gemigliptin, anagliptin, tenegliptin, alogliptin, trelagliptin, omarigliptin.
3. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui detto almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori dell?enzima dipeptidil-peptidasi IV (DPP4) ? sitagliptin.
4. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui dette malattie neurodegenerative comprendono la malattia di Alzheimer.
5. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui detto almeno un composto appartenente alla classe degli inibitori del DPP4 ? contenuto nella composizione in una concentrazione compresa tra 0,1 mM e 50 mM, preferibilmente tra 0,5 mM e 2,5 mM.
6. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui la composizione ? una composizione intranasale.
7. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui la composizione comprende almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile, preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da soluzioni tampone, soluzione fisiologica salina, acqua.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2004098625A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Probiodrug Ag Medical use of inhibitors of glutaminyl and glutamate cyclases
US20090017015A1 (en) * 2004-02-20 2009-01-15 Thomas Edward Hughes Dpp-iv inhibitors for treating neurodegeneration and cognitive disorders

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