FI64600C - Litiumklavulanat foer anvaendning vid rening av klavulansyra och dess derivat - Google Patents

Description

\ l-Vyn,—-1 rBl KUULUTUSjUUKAlSU / < /;λλ

Wa [bj (11) utläggningsskrift 6 4oUU

^ (51) K'r.iw.^nt.a3 C 07 D 4-98/04- SUOMI—FINLAND (21) Pfflttlh»k«mu« — Pitt>w«efcnln| 802142 (22) H»k*ml*ptlyt —An»0knlnf»d·* 03-07.00 (23) AtkupUvt—Glltljh*t*dtf 06.02.76 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offsntllj 03.07.80

Patentti· ja reklsterihallfan (44) Nthttvtkslpanon js kuuLJulk»i»uii pvm. — οι nfi

Patent· och regifterstyreleen 7 AmOkan utlajd oeh utUkrHten publlcurad JX.uu.uj (32)(33)(31) Pyydetty utuolkuu*—B«flrd prtoritut 07-02.75 17.03.75 Englanti-England(GB) 5^09/75 11076/75 (71) Glaxo Laboratories Limited, Greenford, Middlesex, Englanti-England(GB) (72) Ian Dunlop Fleming, Chalfont St. Peter, Buckinghamshire, David Noble,

Marlov, Buckinghamshire, Hazel Mary Noble, Marlow, Buckinghamshire,

Wilfred Frank Wall, High \tycomhe, Buckinghamshire, Englanti-England(GB) (7M Oy Kolster Ab (54) KL a viilaani hapon ja sen johdannaisten puhdistamisessa käytettävä litium-klavulanaatti - Litiumklavulanat för användning vid rening av klavulan-syra och dess derivat (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 760285 (patentti 63580) -Avdelad fr in ansökan 760285 (patent 63580) Tämä keksintö käsittelee puhtaan klavulaanihapon tuottamiseen käytettävää kiteisessä muodossa olevaa litiumklavulanaattia, joka on käyttökelpoinen välituote valmistettaessa puhdasta klavulaani-happoa tai sen johdannaisia.

Streptomyces clavuligerus-kantaa NRRL 3$85 viljelemällä saadaan useita antibiootteja. GB-patentissa 1 315 177 on kuvattu Streptomyces clavuligerus-kannan NRRL 3585 viljely ja viljelyliemestä eristetyt antibiootit A 16886 I ja A 16886 II.

Samaa organismia viljelemällä voidaan saada vielä yksi antibiootti, nimittäin (2R, 5R, Z)-3-(2-hydroksietylideeni)-7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo^3,2,0_7“heptaani-2-karboksyylihappo, jolla on kaava I:

? JCL CH0OH

rViT‘^v. / .

/ - ' c», \ i 64600 ja jota seuraavassa nimitetään klavulaanihapoksi.

Klavulaanihappo muodostaa suoloja emästen kanssa. Näistä voidaan mainita alkalimetallisuolat, esim. natrium-, kalium- ja li-, tiumsuolat; maa-alkalimetallisuolat, esim. kalsium-, magnesium-ja bariumsuolat; ammoniumsuola; ja orgaanisten emästen muodostamat suolat, esimerkiksi primäärisistä, sekundäärisistä tai ter-tiäärisistä N-kvaternäärisistä amiineista johdetut, esim. mono-f di- tai trialkyyliammoniumsuolat kuten metyyliammonium- ja tri-etyyliammoniumsuolat ja heterosyklisten emästen muodostamat suolat kuten piperidiinisuolat.

( Epäorgaanisten emästen muodostamat suolat ja useimmat orgaa- t t nisten emästen muodostamista suoloista ovat yleensä stabiilimpia vesiliuoksessa kuin vapaa klavulaanihappo. Suolat voivat esiintyä i f solvaattien muodossa, so. niiden kiderakenne voi sisältää vettä ί ja/tai muuta liuotinta.

| Klavulaanihapon ja sen suolojen tuottaminen puhtaina on tä- I hän asti ollut vaikeata.Se on yleensä sisältänyt jopa 25 %, tavaili lisemmin noin 15 % painosta valmistuksen yhteydessä syntyneitä epä- ί puhtauksia ja isomeerejä.

| Puhtaamman klavulaanihapon tuottaminen on siten olennai- l nen edistysaskel. On todettu, että esimerkiksi puhtaudeltaan 98-%: | sta tai sitäkin puhtaampaa klavulaanihappoa saadaan valmistamalla \ litiumklavulinaattia kiteisessä muodossa. Sen puhtausastetta osoit- f * tavat molaarinen ekstinktiokerroin, joka on vähintään 16,200 määri- I ^ ; tettynä 259-1 nm alueella 0,1-m NaOH-vesiliuoksessa, molaarinen s kiertokyky vesiliuoksessa, joka on vähintään +137-5°, suclas- ' D ^ | ta vapautetun hapon ekstinktiokerroin, E. 0,1-n NaOH-vesiliuok-‘ lcm 24 | sessa, 590 tai suurempi ja optinen ominaiskierto /b( /D dimetyyli- f o sulfoksidissa, joka on noin +54 . On huomattava, että klavulaanihapon tuottaminen näin puhtaana on tärkeätä tuotteita käytettäessä farmaseuttisissa ja eläinlääketieteellisissä valmisteissa ja on erittäin suotavaa sitä käytettäessä välituotteena. Termi "puhtaus" tässä käytettynä tarkoittaa klavulaanihapon ja/tai sen suolan pai-noprosenttiosuutta koko kiinteän aineen painosta, jolloin tuotteeseen sitoutunutta vettä tai muuta liuotinta ei oteta huomioon kokonaispainossa.

Klavulaanihapolla ja sen suoloilla on antibakteerinen vai- 64600 kutus joukkoon gram-negatiivisia ja gram-positiivisia mikro-organismeja, esimerkiksi Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shighella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis.

Klavulaanihappo ja sen suolat voidaan eristää Streptomyces clavuligerus kannan NRRL 3585 viljelyliemestä GB-patentissa 1 315 177 kuvatulla menetelmällä, jossa fraktiointimenettelyä käyttämällä epäpuhtaudet, kuten proteiinit, entsyymit ja erityisesti muut β-laktaamiantibiootit poistetaan liuoksesta. Tässä puhdistusmenetelmässä ei kuitenkaan erilaisia β -laktaamikarboksyyli-happoja, kuten edellä mainittujen antibiootteja A 16886 I ja II samanlaisesta käyttäytymisestä johtuen saada erotettua. Antibiootin eristäminen voidaan kuitenkin suorittaa helposti muuttamalla klavulaanihappo tai sen suola litiumklavulanaatiksi ja saostamalla litiumklavulanaatti kiteisessä muodossa. Klavulanaatti-ionien ja litiumionin välisestä suuresta affiniteetista johtuen saostuu mukana vähän tai ei lainkaan merkittäviä epäpuhtauksia, kuten muita /3 -laktaameja. Eristämällä suoraan suola, ts välttämällä kla-vulaanihapon muuttaminen orgaaniseksi johdannaiseksi kuten esteriksi ja siitä uudelleen hapoksi, voidaan välttää klavulaanihapon toisiintuminen isomeereiksi. On huomattu, että klavulaanihappo-estereiden pelkistävässä lohkaisussa voi muodostua jopa 15 % isomeeristä ainetta.

Olisi huomattava, että käymisliuoksissa ja muissa liuoksissa suunnilleen neutraalissa pH:ssa klavulaanihapon ja sen yhden tai useamman kationin kanssa muodostamien suolojen välillä on tasapainotila ja klavulaanihapon ja/tai sen suolojen eristysmenet-tely riippuu pHtsta ja muista olosuhteista. Yleensä klavulaanihappo ja sen suolat ovat melko epästabiileja vesiliuoksissa pH-alueen 5,5-8 ulkopuolella ja alla kuvatuissa menettelyissä on tarpeellista pitää pH tällä alueella ja edullisesti lähellä noin pH

6,5, mikäli toisin ei ole ilmoitettu.

Epäpuhtauksien poistamiseksi klavulaanihappo ja/tai sen suola saatetaan reagoimaan vesiliuoksessa olevan ionisoituneen li-tiumyhdisteen kanssa, jolloin saadaan vesiliuos, joka sisältää litiumklavulanaattia, joka voidaan saostaa ja erottaa vesiliuoksesta.

4 64600

Yleensä ionisoituva litiumyhdiste on suola. Litiumkloridi on edullinen, mutta sopivia ovat myös litiumbromidi, -jodidi tai -sulfaatti tai litiumkarboksylaatit, kuten asetaatti, propio-naatti, formiaatti, bentsoaatti tai laktaatti. Suoloin valintaan voivat vaikuttaa muut läsnäolevat aineet. Jos klavulaanihappo on esimerkiksi bariumsuolana, voidaan edullisesti käyttää litium-sulfaattia, jolloin bariumsulfaatti saostuu ennen litiumklavula-naatin saostumista.

Litiumklavulanaatin väkevyys ennen saostusta on yleensä vähintään 0,1 paino-% painosta, edullisesti vähintään 2 paino-%, ja suuremmat väkevyydet, esimerkiksi 12 %:iin tai jopa 20 %:iin painosta saakka antavat luonnollisesti suurempia prosentuaalisia saantoja.

Puhdistettava klavulaanihapon suola voi olla esimerkiksi alkalimetallisuola (kuten natrium- tai kaliumsuola tai jopa litium-suola, jos tämä on läsnä vähäisenä aineosana klavulaanihappomate-riaalissa), maa-alkalimetallisuola (esim. kalsium-, barium- tai magnesiumsuola) tai orgaanisen emäksen muodostama suola, kuten yllä on kuvattu, tai suola, joka on muodostettu emäksisen ionin-vaihtohartsin kanssa.

Litiumklavulanaatin saostumista helposti erittäin puhtaana voidaan käyttää hyödyksi monella tavalla.

Litiumklavulanaatin ulos suolaus

Menetelmän erään sovellutuksen mukaan litiumklavulanaattia sisältävä vesiliuos voi myös sisältää riittävän määrän ionisoitunutta litiumyhdistettä, tavallisesti litiumklavulanaatin muodostamiseen käytettyä litiumsuolaa, jälkimmäisen suoloittamiseksi nostamalla litiumionien väkevyyttä niin, että mainitussa lämpötilassa litiumklavulanaatin liukoisuustulo ylitetään suuresti. Koska klavulanaatti on niukkaliukoisempi alemmissa lämpötiloissa, on yleensä edullista alentaa liuoksen lämpötilaa saostumisen maksimoimiseksi, esimerkiksi noin välille 0-5°C.

Tällaiseen suoloitukseen on ionisoituvan litiumyhdisteen väkevyys litiumklavulanaattia sisältävässä vesiliuoksessa edullisesti 4-10-m, vaikka väkevyydet aina kyllästymiseen asti ovat käyttökelpoisia; edullisempi alue on 5-8-m.

Kun ensimmäinen litiumklavulanaattierä on korjattu, saattaa 5 64600 olla edullista väkevöidä liuos edelleen ja korjata toinen erä.

Muiden klavulanaattien muuttaminen litiumklavulanaatiksi Litiumklavulanaattia sisältävä liuos voidaan muodostaa yksinkertaisesti liuottamalla veteen klavulaanihapon muu kuin litiumsuo-la, esimerkiksi natrium-, kalium-, magnesium-, barium-, kalsium-tai ammoniumsuola, ja lisäämällä liuokseen vesiliukoinen litium-suola, kuten litiumkloridi. Bariumsuolan ollessa kysymyksessä suuren litiumkloridiväkevyyden käyttö voi johtaa bariumkloridin samanaikaiseen saostumiseen litiumklavulanaatin kanssa. Bariumklo-ridi voidaan kuitenkin poistaa helposti liuottamalla seos uudelleen veteen ja lisäämällä litiumsulfaattia bariumsulfaatin saosta-miseksi, joka voidaan poistaa esimerkiksi suodattamalla, jota seuraa litiumkloridin lisäys puhtaan litiumklavulanaatin saostamiseksi. Litiumklavulanaatin muodostaminen ioninvaihtohartsin avulla Erittäin edullisesti saadaan litiumklavulanaatin vesiliuos, kun klavulaanihapon suola, joka on muodostettu emäksisen ioninvaihto-hartsin kanssa, saatetaan yhteyteen litiumsuolan vesiliuoksen kanssa. Hartsi on tavallisesti pylväässä, johon täytetään epäpuhdas klavu-laanihappo ja/tai sen suola, ja josta litiumklavulanaatin vesi-liuos eluoidaan käyttäen vesiliukoisen litiumsuolan, esim. litiumkloridin, vesiliuosta. Hartsi pestään tavallisesti, esim. vedellä, ennen eluointia.

Hartsissa on yleensä amino- tai tertiäärisiä aminoryhmiä (heikosti emäksisiä) tai kvaternäärisiä ammoniumryhmiä (vahvasti emäksisiä). Hartsi voi olla esimerkiksi polystyreeni-, polyakryyli-, epoksi-polyamiini-, fenolipolyamiini- tai haarautunut dekstraani-hartsi ja se voi olla makroverkkoutettu tai mikroverkkoutettu.

Termiin "hartsi" sisältyvät tässä myös selluloosajohdannaiset ja yllämainitut dekstraanijohdannaiset, jotka on johdettu luonnossa esiintyvistä polymeereistä. Tyypillisiä heikosti emäksisiä ioninvaihtohartseja ovat Amberlite IRA68 (mikroverkkoutettu: poly-akrylaatti verkkouttajana divinyylibentseeni: tertiäärisiä aminoryhmiä) , Amberlite IRA93 (makroverkkoutettu: polystyreeni verkkouttajana divinyylibentseeni: tertiäärisiä aminoryhmiä), (Rohm &

Haas (U.K.) Ltd.). Tyypillisiä vahvasti emäksisiä ioninvaihtohartseja ovat Zerolit FF ja Zerolit FF(IP) (Zerolit Co. Ltd.).

6 64600

Emäksiset ioninvaihtohartsit ovat edullisesti suolan muodossa, kun ne saatetaan epäpuhtaan klavulaanihapon ja/tai suolan kanssa kosketukseen; anioni on edullisesti sama kuin eluenttina käytetyssä litiumsuolassa, sopivasti kloridi-ioni, mutta eri anio-neja voidaan käyttää ilman merkittäviä haittavaikutuksia.

Eluenttina käytetyn litiumsuolan vesiliuoksen väkevyys on edullisesti 0,02-8-m alempien väkevyyksin antaessa kuitenkin hyvin laimeita litiumklavulanaattiliuoksia ja aiheuttaessa seuraa-van saostumisen vaikeutumisen. Yleensä väkevyydet alueella 0,5-2,5-m ovat edullisia.

Kun adsorbointi/eluointi-menettely yleensä suoritetaan siten, että haluttu tuote erotetaan kromatografisesti muusta adsorboituneesta aineesta, niin tässä tapauksessa seuraavan saostamisvaiheen ollessa erittäin tehokas erotettaessa litiumklavulanaatista häiritsevät epäpuhtaudet, on yleensä edullista käyttää eluentissa suhteellisen suuria litiumsuolaväkevyyksiä. Näin pylvääseen saadaan kapea klavulanaattivyöhyke, joka voidaan eluoida suhteellisen pienellä eluenttitilavuudella, mikä mahdollistaa seuraavan saostami-sen.

Eluaatti sisältää yleensä litiumsuolaa, esim. litiumklori-dia väkevyydessä 0,5-2,5-m, kun taas pois suolauksella saadaan tehokkaimmillaan väkevyyksiä 5-10-m. Siksi on edullista väkevöi-dä eluaatti esimerkiksi haihduttamalla tyhjössä, esim. noin 5-ker-taisesti. Litiumklavulanaatin liukoisuus noin 20°C:ssa eri väkevyyksissä litiumkloridin vesiliuoksissa on annettu seuraavassa taulukossa:

Taulukko 1

LiCl-molaarisuus Litiumklavulanaatin liukoisuus _mg/ml (suunnilleen)_ 2.5 23,5 3,75 10,2 5,0 4,1 6,25 1,8 7.5 0,8

Edellämainittu väkevöinti on litiumsuolalisäystä edullisempi, koska myös litiumklavulanaatti väkevöityy, ja emäliuos- 7 64600 tappiot siten vähenevät. Adsorboituneiden epäpuhtauksien eluoituulisen vähentämiseksi hartsista voi olla edullista sisällyttää eluenttiin veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta väkevänä. Vaihtoehtoisesti, kun eluointi on suoritettu käyttämättä tällaista liuotinta, tämä voidaan lisätä eluaattiin eluoitujen epäpuhtauksien saostamiseksi ja sakka erottaa ennen jatkokäsittelyä. Liuotin voi olla esimerkiksi ketoni, kuten asetoni, alkoholi, kuten meta-noli, etanoli, isopropyylialkoholi tai etyleeniglykoli, eetteri, kuten dioksaani tai tetrahydrofuraani tai substituoitu amidi, imi-di tai sulfoksidiliuotin kuten dimetyyliformamidi tai dimetyylisulf-oksidi. Yleensä alkoholit ovat edullisia tällaisina liuottimina, esim. etanoli tai isopropyylialkoholi. Tällaisten tarpeettomien epäpuhtauksien erottamiseksi alkoholin edullinen väkevyys eluentissa tai eluaatissa alkoholilisäyksen jälkeen on välillä 70-97 % tilavuudesta.

Litiumklavulanaatln saostamlnen käyttäen veteen sekoittuvaa liuotinta

On huomattava, että mikäli veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja litiumsuolojen väkevyys edelläkuvatussa menettelyssä on liian korkea, voi litiumklavulanaatti saostua liian aikaisin. Itse asiassa on mahdollista saostaa litiumklavulanaatti vesi-liuoksesta käyttämällä hyvin suuria väkevyyksiä sellaisia liuottimia ottamalla täten käyttöön vaihtoehtoinen menettelytapa, joka käyttää hyväkseen yllä kuvattua litiumklavulanaatin valikoivan saostuksen etuja. Siten klavulaanihappo ja/tai sen suola voidaan saattaa yhteyteen litiumsuolan kanssa suhteellisen matalassa väkevyydessä joko pylväästä eluoimalla tai liuottamalla suolat yhteen liuokseen ja saamalla haluttu saostuminen tapahtumaan väke-vöimättä lisäämällä veteen sekoittuvaa liuotinta. Täten esimerkiksi alkoholiliuokset väkevyycfeItään vähintään 90 % edullisesti vähintään 95 % ovat tehokkaita litiumklavulanaatin saostamiseksi. Saattaa olla tarpeellista korjata ensimmäinen sato litiumklavula-naattia ja sitten väkevöidä tyhjössä, esim. nelinkertaiseksi, toisen sadon saamiseksi.

Klavulaanihapon suolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla Emäksinen ioninvaihtohartsi, johon edellä on viitattu, voidaan täyttää klavulaanihapolla ja/tai suolalla käyttämällä suo- 8 64600 raan käymisliuosta, josta kiinteä aine on aikaisemmin poistettu, esim. suodattamalla tai sentrifugoimalla. Tämä mahdollisuus on olemassa seuraavan litiumsaostusaskeleen huomattavan puhdistus-vaikutuksen ansiosta. Kuitenkin saattaa olla edullista käsitellä liuos kiinteiden aineiden poistamisen jälkeen adsorboivalla hiilellä klavulaanihapon ja/tai suolan adsorboimiseksi; tämä auttaa muiden suolojen erottamista klavulanaatista ja välttää emäksisen ionin-vaihtohartsin turhaa täyttymistä tarpeettomalla ionisoituvalla aineella.

Yleensä kirkas liuos voidaan johtaa hiilikerroksen läpi esim. pylväässä, edullisesti käyttäen juuri riittävää määrää hiiltä kaiken halutun klavulaanihapon ja/tai suolan adsorboimiseksi, tavallisesti suhteessa noin 1 osa tilavuudesta hiiltä 3-10 osaa tilavuudesta kirkasta liuosta kohti. Tavallinen hiili on sopivaa eikä ole tarpeellista käyttää erittäin aktiivia ainetta. Hiili voidaan sitten puhdistaa käyttämällä veteen sekoittuvan liuottimen vesiliuosta, esim. ketonia kuten metyylietyyliketoni, metyyli-iso-butyyliketoni tai edullisesti asetoni, edullisesti väkevyydessä ketonia 30-95 %, edullisesti 50-70 %. Ennen puhdistusta hiili edullisesti pestään esim. vedellä käymisliuosjätteiden poistamiseksi.

Toinen muunnos ylläkuvatusta menetelmästä on valmistaa klavulaanihapon hartsisuola, kuten yllä on kuvattu, ja eluoida tämä jollain muulla kuin litiumsuolalla, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai kalsiumsuolalla esimerkiksi kloridilla tai asetaa-tilla, tai ammonium- tai pyridiinisuolalla, esim. ammoniumformiaa-tilla tai -asetaatilla tai pyridiinihydrokloridilla, jolloin saadaan vastaavan klavulanaatin vesiliuos; sitten voidaan lisätä ylimäärin vesiliukoista litiumsuolaa eluaattiin ja saostaa litium-klavulanaatti yllä kuvatulla tavalla.

Litiumklavulanaatin valmistus uuttamalla klavulaanihapon fenolipitoista liuosta

Erään menetelmävaihtoehdon mukaan litiuroklavulanaattia sisältävä vesiliuos voidaan saada uuttamalla klavulaanihapon fenolipitoista liuosta litiumhydroksidin vesiliuoksella, jonka jälkeen litiumklavulanaatin saostuminen saadaan aikaan yllä kuvatulla tavalla, edullisesti jäljelle jääneen fenolipitoisen liuottimen poiston jälkeen uuttamalla vesiliuos veteen sekoittamattomalla 9 64600 liuottimena kuten eetterillä, kloroformilla tai hiilitetraklo-ridilla.

Ylläkuvattua tekniikkaa voidaan myös käyttää valmistettaessa muita klavulaanihapon suoloja kuin litiumsuolaa uuttamalla fenolipitoinen liuos sopivalla emäksellä, esim. maa-alkalimetalli-hydroksidilla kuten kalsium- tai bariumhydroksidi. Kaikki muodostuva sakka, esim. bariumsulfaatti, tulisi poistaa ja sen jälkeen suola voidaan eristää, esim. pakastekuivaarnalla. Sen jälkeen voidaan suorittaa puhdistus litiumsuolaksi muuttamalla, kuten yllä on kuvattu.

Yleensä fenolipitoisen liuottimen uuttaminen suoritetaan edullisesti sellaisella tavalla, että vesifaasi saadaan noin pH:ssa 6,5.

Fenolipitoinen uute voidaan tuottaa uuttamalla vesipitoinen eluaatti yllä kuvatunlaisesta hiili- tai hartsiadsorbaatista fenolipitoisella liuottimena yleensä eluaatin väkevöimisen jälkeen ja haluttaessa orgaanisten haitallisten epäpuhtauksien saostami-sen jälkeen, joka suoritetaan lisäämällä yhtä tai useampia veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia ja/tai poistamalla sellaiset epäpuhtaudet uuttamalla veteen sekoittumattomalla liuottimella.

Siten esimerkiksi tämän tyyppisessä menettelyssä eluaatti joko hiilestä tai hartsista väkevöidään edullisesti haihduttamalla alennetussa paineessa. Yleensä käsittely puhdistuksen aikana suoritetaan edullisesti pH-alueella 6,0-7,0 esim. noin 6,5:ssä, hajoamisen minimoimiseksi. Sitten eluaatti voidaan edelleen puhdistaa saostamalla haitalliset aineet veteen sekoittuvalla ketonilla kuten asetonilla, edullisesti antaen ketonille väkevyyden 50-90 % tilavuudesta, edullisesti noin 85 %. pH tällä askeleella on edullisesti noin 6,5 ja mikäli vesiliuos jo sisältää veteen sekoittuvaa ketonia, tämä poistetaan edullisesti pH-mittauksen mahdollistamiseksi. pH voidaan säätää emästä lisäämällä, esim. alkalimetalli-hydroksidia kuten natriumhydroksidia.

Puhdistus edelleen voidaan suorittaa liuottimella uuttamis-askeleella tarpeettomien epäpuhtauksien poistamiseksi esim. väke-vöimällä ja säätämällä suodoksen pH ketonisaostuksesta noin 4:ään lisäämällä mineraalihappoa, kuten rikkihappoa tai kloorivetyhappoa 10 64600 ja uuttamalla n-butanolilla tai suurempi molekyylipainoisella nestemäisellä alkoholilla. Sopivasti voidaan käyttää 1-8 tilavuutta liuotinta.

Tämän uuttamisen jälkeen vesifaasi väkevöidään edullisesti noin pH 6,5:ssä ja voidaan puhdistaa edelleen uuttamalla haluttu antibiootti fenolipitoiseen liuottimeen, esim. fenoliin itseensä tai kresoliin, edullisesti sen jälkeen, kun pH on laskettu noin 4tään mineraalihapolla. Fenolipitoinen liuotin sisältää edullisesti emästä, kuten Ν,Ν-dimetyylianiliinia, ja veteen sekoit-tumatonta liuotinta, kuten kloroformia tai hiilitetrakloridia. Uuttaminen suoritetaan edullisesti useita kertoja käyttäen 2/3 liuotintilavuutta kutakin uuttamista varten. Uutteet voidaan sitten yhdistää ja vettä lisätä noin 1/15 liuotintilavuudesta erillisen faasin muodostamiseksi. Sitten antibiootti voidaan uuttaa takaisin lisäämällä vesifaasiin emästä, edullisesti alkalimetalli-hydroksidia, esim. litiumhydroksidia, tai maa-alkalimetalli-hydroksidia, esim. barium- tai kalsiumhydrokefidia, noin pHrhon 6,5. Vesikerros erotetaan fenolikerroksesta ja takaisinuuttamis-menettely kerrataan edullisesti yhdistäen sen jälkeen vesiuutteet. Sen jälkeen, kun kaikki sakka on erotettu, esim. bariumsulfaatti, kaikki jäljelle jäänyt fenoliliuotin voidaan poistaa vesiliuoksesta uuttamalla veteen sekoittumattomalla liuottimena kuten eetterillä, kloroformilla tai hiilitetrakloridilla, ja antibioottisuo-lan talteen ottamiseksi vesifaasi voidaan pakastekuivata tai suihkukuivata pH:ssa 6,5.

Puhdistus edelleen voidaan suorittaa tavallisilla tavoilla kuten kromatografisesti käyttäen erikoisesti aineita kuten Sephadex Pharmacia Ltd.). Täten antibiootti, joka tässä vaiheessa on yleensä suolan muodossa, esim. bariumsuolana, voidaan lisätä Sephadexpylvääseen, esim. Sephadex G 15 ja uuttaa vedellä, jolloin merkittävästi antibioottisesti aktiiviset fraktiot yhdistetään seuraavaa suolan talteenottomenettelyä varten, joka tapahtuu esim. pakastekuivaarnalla.

Litlumklavulanaatln muuttaminen klavulaanihapoksi ja muiksi suoloiksi

Edellä mainitulla menettelyllä valmistettu puhdistettu li-tiumklavulanaatti voidaan muuttaa muiksi suoloiksi ioninvaihto- 11 64600 menettelyillä käyttäen esim. ioninvaihtohartsia. Siten esimerkiksi litiumsuolan vesiliuos voidaan lisätä kationin vaihtohartsiin, esim. Bio Rad AG50X8; (Bio Rad Laboratories, Richmond California) kationimuodossa, jolloin kationi on se klavulaanihapon suola, jota halutaan, esim. natrium tai kalium, jota seuraa eluointi vedellä. Vapaa klavulaanihappo voidaan muodostaa esim. tekemällä esim. natriumkloridilla tai ammoniumsulfaatilla kyllästetty litium-suolan vesiliuos jossa on suuri ionivahvuus happamaksi noin pH:hon 2,6, veteen sekoittumattoman klavulaanihapon liuottimen läsnäollessa, esim. esteriliuotin kuten etyyliasetaatti. Tarvittaessa vesi-faasi voidaan edelleen uuttaa liuottimena ja uutteet yhdistää. Yleensä mikä tahansa happo, jolla saadaan riittävän alhainen pH, on sopiva happamaksi tekemiseen, esim. mineraalihappo kuten kloo-rivetyhappo. Liuotin voidaan sitten poistaa vapaan hapon saamiseksi, yleensä öljyn muodossa. Vapaan hapon liuos veteen sekoittumat-tomassa liuottimessa voidaan käyttää laajan suolasarjan valmistamiseksi uuttamalla sopivan emäksen vesiliuoksella, ja erottamalla suola siitä. Saattaa olla tarpeellista suodattaa kiinteä aine vesi-faasista ennen kuin suolan eristämiseen ryhdytään. Koska vapaa happo on suhteellisen pysymätön, se olisi edullisesti käytettävä, esimerkiksi suolojen tai muiden johdannaisten valmistamiseksi, niin pian kuin mahdollista muodostumisensa jälkeen.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Klavulaanihappo-pitoisuuksien määrityksiin käytettiin seuraavia menetelmiä: 1. UV-spektroskopia

Klavulaanihapolla ja sen suolojen vesiliuoksilla on hyvin matala UV-absorptio 230 nm yläpuolella ja esimerkiksi molaarinen ekstinktiokerroin 280 nm:ssä on noin 60. Emäkseen liuotettuna kuitenkin voimakas UV-absorptio kehittyy nopeasti kohdalla Amax295-^ ja tätä voidaan käyttää klavulaanihapon ja/tai sen suolojen määrittämiseen. Koetta varten kiinteä aine punnitaan tarkasti ja liuotetaan laimeaan natriumhydroksidiin (0,1-m) , jolloin saadaan tunnettu tilavuus liuosta, joka vastaa noin 0,01 mg/ml klavulaani-happoa. Liuoksen optinen tiheys absorptiomaksimikohdalla tai noin 259 nm mitattiin sopivalla spektrofotometrillä; kiinteän aineen puhtaudet voidaan laskea edellyttäen klavulaanihapolle £ olevan 12 64600 16 700. Molaariset eksinktiokertoimet voidaan laskea E^-arvoista, se on ekstinktiokertoimet 1 % liuoksella 1 cm kyvetissä. Samoin käyttönesteet orgaanisten liuottimien tarvittaessa poiston jälkeen laimennettiin tarkasti laimealla natriumhydroksidilla, jolloin saatiin samanlaiset emäksen ja kalvulaanihapon väkevyydet, josta klavulaanihapon väkevyys alkuperäisessä nesteessä määritettiin kuten yllä. Raakojen kiinteiden aineiden ja käyttönesteiden arvot korjattiin epäpuhtauksien absorptiot huomioiden käyttäen samanväke-vyisiä liuoksia vedessä.

2. Biologinen aktiivisuus Määritettiin vertaamalla tunnetun klavulaanihappopitoisuuden kiinteän aineen liuoksia agar petrimaljakokeessa Acinetobacter-la-jiin seuraten oleellisesti Lees ja Tootill-menetelmää (Lees, K.A.

& Tootill, J.P.R., Analyst, 1955, 80 (947), 95-110* ibid 110-123; 80 (952) , 531-535).

Esimerkki 1 1) Kalsiumsuolan valmistus a) Streptomyces clavuligerus-kannan NRRL 3585 viljelyliemestä eristetty raaka klavulaaikihapon bariumsuola (8,83 g) lisättiin 50 mitään (NH^jSO^ kyllästettyä vesiliuosta. Etyyliasetaattia (50 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin. pH-mittari asetettiin seokseen ja pH säädettiin pHtsta 6,8 pHthon 2,6 noin 15 ml:11a IM H2SO4. Vesiliuos erotettiin etyyliasetaatista ja sekoitettiin uudelleen tuoreeseen etyyliasetaattiannokseen (50 ml). Nämä kaksi etyyliasetaattiuutetta yhdistettiin, tislattua vettä (100 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin pH-mittarissa. Noin 40 ml kyllästettyä kalsiumhydroksidiliuosta lisättiin seoksen pH:n säätämiseksi 6,6:ksi. Vesiliuos erotettiin etyyliasetaatista, suodatettiin suodatinmassan läpi ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin 1,44 g kiinteää kalsiumsuolaa.

b) Kohdan (a) kiinteä aine liuotettiin 15 ml:aan tislattua vettä, suodatettiin Milliporesuodattimen läpi ja siirrettiin Sep-hadex G15 sisältävään pylvääseen, joka oli tehty veteen, jolloin oli saatu 15 cm korkea ja 2,5 cm halkaisijaltaan kerros. Eluointi suoritettiin tislatulla vedellä ja kerättiin 20 ml fraktiot. Fraktiot tutkittiin ohutlevykromatografisesti (selluloosa, Eastman Kodak 6065 levyt; liuotin asetonitriili-vesi, 7:3 tilavuudelta) 13 64600 ajaen agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureus-ta. Fraktiot 33-37 yhdistettiin ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin 490 mg. Kiinteä aine kuivattiin P20^:llä tyhjössä 60 tunnin ajan. (b):stä saadulla kalsiumsuolalla oli seuraavat ominaisuudet: pKa:

Suola potentiometrisesti titrattaessa todettiin vastaavan hapon pKa-arvon olevan noin 2,4.

Optinen kierto: £ci.JD 22°C:ssa, +44,9° (väkevyys, 0,287 g/100 ml vettä) .

UV-spektri: Näytteellä (0,00148 g), joka oli liuotettu 100 ml:aan 0,1M NaOH, oli absorptiomaksimi (Λ max) kohdalla 258 nm E^-arvon ollessa noin 550.

IR-spektri: Näytteen infrapunaspektrissä nujolissa oli absorptiomak-simit aaltoluvuilla (cm ^): 3300 s,br 2330 w 1788 s 1692 m 1604 s 1404 s 1305 s 1190 m 1118 m 1082 m 1060 m 1042 m 1012 m 992 m 968 m 892 m 848 w 790 w 740 m 654 w (s, m, nr ja w = voimakas, keskinkertainen, leveä ja heikko intensiteetti vastaavasti).

Koko spektri on esillä liitteenä olevien piirrosten kuviossa 3.

NMR-spektri: Näyteliuoksen protonin ydinmagneettisen resonanssin spektri raskaassa vedessä näytti huippuryhmät CC -arvot) kohdilla noin 4,31, 5,10, 5,85, 6,46, 6,91.

Ohutlevykromatografia: Näyteannokset veteen liuotettuina sijoitettiin lähtöviivalle joko Eastman-Rodak selluloosa TL-levyille (muovitaustainen, EK 6065) tai Eastman-Kodak selluloosa-TL-levyille (muovitaustainen, EK 6065) tai Eastman-Kodak silikageeli-TL-levyille (muovitaustainen, EK 6060) . Levyt kehitettiin liuottimena huoneen lämpöti- 14 64600 lassa, ilmakuivattiin sitten ja ajettiin agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureusta. Rf-arvot, jotka laskettiin ehkäistyneen bakteerikasvun etäisyytenä kunkin vyöhykkeen alkupisteestä keskipisteeseen jaettuna etäisyydellä alkupisteestä liuotin-rintamaan, on annettu alla viidelle systeemille.

_Liuotin_Pinnoite_Rf_

Propan-l-oli:vesi (7:3) selluloosa 0,60

Butan-l-oliretikkahappo:vesi (3:1:1) " 0,64

Asetonitriili:vesi (7:3) " 0,68

Asetonitriili:vesi:propan-2-oli (1:1:1) " 0,87

Butan-l-oli:etikkahappo:vesi (3:1:1) pii 0,63

Paperl-ionoforeesl: Näyteannoksille suoritettiin ionoforeesi Whatman 541 paperilla 1 tunnin ajan käyttämällä 400 V 20 cm:lle.

Aktiivisuus, joka todettiin ajamalla ilmakuivattu paperi agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureusta, sai aikaan syaanokobalamiiniin verrattuna 4,5 cm liikkeen kohti anodia pH:ssa 4,8 (O,IM asetaatti), pH:ssa 6,9 (0,01M fosfaatti) ja pH:ssa 9,5 (0,01M pyrofosfaatti).

ii) Litiumsuolan valmistus

Kohdan (i) (b) mukaan valmistettua kalsiumsuolaa (1 g; UV-kokeen mukaan puhdasta) liuotettiin 10 ml:aan vettä ja 10 ml kyllästettyä litiumkloridin vesiliuosta lisättiin. Kiteytyminen tapahtui raaputtamatta ja suoloittamatta. Kun seos oli jäähdytetty 0°:seen, kiteet suodatettiin, pestiin 5 ml:11a etanolia, 5 ml:11a asetonia ja 2 x 5 ml:11a dietyylieetteriä. Kiteet kuivattiin alennetussa paineessa (0,1 mmHg) silikageelillä 2 tunnin ajan, jolloin saatiin 495,5 mg kiinteää litiumsuolaa. Tällä suolalla oli seuraa-vat ominaisuudet:

Alkuaineanalyysi:

Saatu (keskiarvot on annettu suluissa): C 45,5, 45,8; (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1); Li, 3,2 %. Rikkiä ei todettu menetelmällä N.Dl Cheronis & J.B. Entrikin (1947) Semimicro Qualitative Analysis, s. 93. Crowell, New York.

64600 15

CgHgNOgLi.1/4 H20 vaatii C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31 % Yllämainittu Li analyysiarvo, (3,2 %), määritettiin atomiabsorp-tiospektrofotometrisesti. Sulfaattituhkaa oli 26,8 %,josta laskettuna LijSO^rksi, se on ekvivalentti 3,38 % litiumin kanssa.

pKa:

Suolan potentiometrisellä titrauksella todettiin vastaavan hapon pKa-arvon olevan noin 2,3.

Optinen kierto: 0,145 % paino/tilavuus vesiliuoksen arvo 24 C:ssa oli +66,0°.

Ultravioletti spektri: 0,00091 % liuoksen 0,1M natriumhydroksidissa UV-absorp-tiospektrissä oli absorptiomaksimi (Amax) kohdalla 258 nm E^ -arvon ollessa 788.

Infrapunaspektri:

Nujolissa ajetulla infrapunaspektrillä oli absorptiohuiput (cm^) noin kohdilla': 3420 m 1402 s 1200 w 1026 m 880 w 3012 w 1338 m 1129 m 992 m 850 w 1765 s 1325 s 1101 m 976 m 734 m 1683 s 1300 m 1062 m 950 s 708 w 1618 s 1224 w 1048 s 900 ro

Koko spektri näkyy liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1.

NMR-spektri:

Litiumsuolan 100 MHz protonin NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli huiput -arvot sekä huippujen lukumäärät ja kytkentä-vakiot (Hz) suluissa), joiden keskipisteet olivat noin 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd,3 ja 17) ja 6,89 (d,17).

(s,d,dd,t ja m = singletti dubletti, kaksoisdubletti, tri-pletti ja multipletti vastaavasti).

Esimerkki 2

Litiumsuolan uudelleen kiteytys

Esimerkissä 1 (ii) valmistettua litiumsuolaa (0,1 g) liuotettiin veteen (1,0 ml) ja laimennettiin varovaisesti isopropano-lilla (19 ml). Tuote kiteytyi hitaasti 0°:ssa ja kerättiin kahtena 64600 saantona keittämällä alennetussa paineessa 5 ml:ksi toista saantoa varten. Litiumsuolakiteet kuivattiin silikageelillä tyhjössä 3 päivän ajan.

Saanto 1 20.0 mg Λ max 259 nm ε| = 814 natriumhydroksidiliuoksessa (0,1M) 10 ^ug/ml. Alkuaineanalyysissä saatiin: C 46,2, 46,0; H 4,10, 3,85; N 6,8, 6,7 %

CgHgN05Li.l/4 H20 vaatii C 45,84; H 4,06; N 6,68 %

Saanto 2 67.0 mg /\ max 259 nm e| = 800 natriumhydroksidissä (0,1N) 10 ^,ug/ml. Alkuaineanalyysissä saatiin: C 46,15, 46,5; H 3,9, 4,0; N 6,65, 6,5; litium 3,4 % (sulfaatti-tuhka) .

CgHgNOgLi 1/4 H20 vaatii: C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31 %

Esimerkki 3

Raakaa bariumsuolaa (vert. esim. 1) (30 g; 274) liuotettiin veteen (40 ml) ja lisättiin kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta (300 ml). Liuoksen pH säädettiin 2,4:ksi rikkihapolla (20 %, 23,0 ml) ja uutettiin sitten etyyliasetaatilla (2 x 300 ml). Vettä (200 ml) lisättiin yhdistettyihin uutteisiin. Seosta sekoitettiin voimakkaasti ja natriumhydroksidiliuosta (IM; 89,3 ml) lisättiin, kunnes pH oli 6,8 vesifaasi erotettiin ja tislattiin alennetussa paineessa 33 mlrksi. Butan-l-olia (770 ml) lisättiin vesiväkevöit-teeseen ja sekoitettiin sitten, lämmitettiin 40°C:seen ja ravistettiin voimakkaasti. Liukenematon aine suodatettiin pois ja uutettiin uudelleen vesi:butan-l-oli-seoksella (1:23 til/til) kunnes kaikki oli liuennut. Yhdistetyt liuokset jäähdytettiin 4°C:seen yli yön. Muodostunut kiteinen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla, pestiin butan-l-olilla ja asetonilla ja ilmakuivat-tiin, jolloin saatiin 3,34 g natriumsuolaa (E^ 648).

2,92 g tätä natriumsuolaa liuotettiin veteen (20 ml) ja suodatettiin. Suodosta sekoitettiin 0°C:ssa, samalla kun litiumklo-ridiliuosta (20 ml, kyllästetty 20°C:ssa) lisättiin 5 minuutin aikana. Sekoittamista ja jäähdyttämistä jatkettiin 1 tunnin ajan, jonka jälkeen kiteet kerättiin suodattamalla, pestiin etanolilla (20 ml), asetonilla (2 x 20 ml), dietyylieetterillä (2 x 25 ml) ja ilmakuivattiin, jolloin saatiin litiumsuola (2,275 g) valmiina pitkulaisina Iitteinä kiteinä (E^ 770).

64600 17

Esimerkki 4

Raakaa bariumsuolaa (vrt. esim. 1) (7,99 g; 288) liuo tettiin veteen (60 ml) ja suodatettiin. Suodosta käsiteltiin annoksittain litiumsulfaatilla (4,0 g) sekoittaen ympäröivässä lämpötilassa, kunnes bariumille ei saatu toteamisreaktiota natrium-roditsonaatilla. Suspensio kirkastettiin sentrifugoimalla ja neste kaadettiin pois ja keitettiin kokoon noin 35 ml:ksi alennetussa paineessa. Litiumkloridia (9,0 g) lisättiin annoksittain sekoittaen ja jäähdyttäen; 1 tunnin kuluttua 0°:ssa litiumsuola kerättiin suodattamalla, pestiin etanolilla (10 ml), asetonilla (2 x 25 ml), dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja iomakuivattiin suo-datinsuppilossa, jolloin saatiin 1,590 g valkeita kiteitä (E^ 790).

Esimerkki 5

Natriumsuolan valmistus

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettua litiumsuolaa (3,5 g) liuotettiin 20 ml:aan tislattua vettä ja siirrettiin pylvääseen, joka sisälsi 5Q ml AG50x8 kationinvaihtohartsia (Bio-Rad, Na+; 200-400 mesh koko). Eluointi suoritettiin vedellä ja 8 ml fraktiot kerättiin. Fraktiot tutkittiin paperille aplikoituina annoksina ajamalla agar-ravintoliuoksella, joka sisälsi Staphylococcus aureus-ta. Aktiiviset fraktiot (4-13) yhdistettiin ja pakastekuivattiin. Pakastekuivattu kiinteä aine liuotettiin tislattuun veteen, jolloin saatiin 19 ml liuosta, ravisteltiin butan-l-olin (450 ml) kanssa ja lämmitettiin (vesihaude), kunnes liuos oli melkein kirkas. Lämmin liuos suodatettiin sintterin läpi keltaisen kiinteän aineen poistamiseksi ja suodosta pidettiin 4°C:ssa 60 tunnin ajan. Muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin butan-l-olilla (2 x 10 ml), sitten asetonilla (2 x 10 ml) ja kuivattiin alennetussa paineessa 40°C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin 2,18 g kiinteää ainetta. Kiinteä aine kiteytettiin uudelleen vesi-butan-l-olista (1:23,3 tilavuudelta) kuvatulla tavalla. Kiteet kuivattiin alennetussa paineessa silikageeIillä 44°C:ssa 1,5 tunnin ajan, jolloin saatiin 1,8 g kiinteää natriumsuolaa.

Kiinteä aine oli hygroskooppista. Se jauhettiin survimessa ja huhmaressa ja sen annettiin imeä ilmakehän vesi 18°C:ssa. Kun noin 22 % (paino/paino) vettä oli imeytynyt, oli saavutettu tasapaino. Tällä suolalla oli seuraavat ominaisuudet.

18 64600

Alkuaineanalyysi (tasapainossa oleva kostea aine)

Saatu (keskiarvot on annettu suluissa): C 33,3, 33,2 (33,25); H 4,6, 4,6 (4,6); N 4,6, 4,7 (4,65); Na 7,3 (absorptiospektrofotometrisesti), 7,9 (laskettu sulfaattituhkasta); vettä, 2195 %.

CgH805NNa.4H20 vaatii C 32,76? H 5,46; N 4,78; Na 7,8; vettä 24,57% Metallianalyysi: 1) Saatu atomiabsorptiospektrofotometrisestii

Na 7,3 - 0,2 % (tämä arvo on ilmoitettu alkuaineanalyysin kohdalla) 2) Olettaen, että sulfaattituhka on Na2S04, laskettiin Na-pitoisuus 7,9 %.

Optinen kierto; 0,134 % (paino/tilavuus) vesiliukoisen arvo 24°C:ssa oli +47°.

Ultravioletti spektri: 0,00098 % liuoksen 0,1M NaOHrssa UV-absorptiospektrissä oli absorptiomaksimi ( Λ max) kohdalla 258 nm -arvon ollessa 555.

Infrapunaspektri:

Nujolissa ajetussa IR-spektrissä oli absorptiohuiput (cm ^) noin kohdilla: 3400 s 1592s 1288 m 1080 w 986 s 850 w 3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 w 1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 w 753 m 1690 s 1310 s 1138 m 1015 s 902 m 1665 m 1302 sh 1120 m 998 m 880 w

Koko spektri on esitetty liitteenä olevien piirroksien kuviossa 2.

NMR-spektri:

Liuoksen protonin NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli huippuryhmät (^-arvot), joiden keskipisteet olivat noin 4,28, 5,07, 5,82, 6,44 ja 6,88.

Esimerkki 6

Kaliumsuolan valmistus

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettua litiumsuolaa (3,0 g) liuotettiin veteen (100 ml) ja ajettiin läpi Dowex 50W x 2-pylvään 19 64600 (450 ml; kaliumkierto. Esieluaatti (150 ml) hävitettiin. Seuraa-va 400 ml eluaattia kerättiin ja haihdutettiin 15 ml:ksi alennetussa paineessa. Butan-l-olia (340 ml) lisättiin ja seosta lämmitettiin ja ravistettiin hyvin. Hiukan liukenematonta kiinteää ainetta suodatettiin pois. Suodos tislattiin alennetussa paineessa 200 ml:ksi, varastoitiin sitten 4°C:ssa yli yön. Kiteinen sakka suodatettiin pestiin butan-l-olilla (2 x 10 ml), asetonilla (2 x 50 ml) ja dietyylieetterillä (2 x 50 ml) ja kuivattiin lopulta vakuumieksikkaattorissa ympäröivässä lämpötilassa. Saanto 2,34 g kaliumsuolaa. (E^ = 704). E^ määritettiin liuottamalla 7,1 mg kaliumsuolaa 100 ml:aan vettä. Tämä liuos laimennettiin yhdestä kymmeneen 0,1-m natriumhydroksidilla, jolloin saatiin lopullinen liuos 7,1 yug/ml.

Alkuaineanalyysi:

Saatu: (keskiarvot on annettu suluissa) C 4Q,0, 40,14 (40,07)? H 3,5, 3,55 (3,53)? N 6,0, 5,82 (5,91); K (absorptiospektrofotometrisesti) 16,0 (sulfaattituhkana) 15,9; vettä 1,75, 1,95 (1,85 %).

CgHgNOgK.1/4 H20 vaatii C 39,7? H 3,5? N 5,8? K 16,2? vettä 1,96 %.

Optinen kierto: 0,276 % paino/tilavuus vesiliuoksen /G{ /^3 -arvo oli +58,4°.

Klavulaanihapon kalsium-, barium- ja magnesiumsuolat valmistettiin samalla tavalla litiumklavulanaatista ja niillä todettiin olevan E^ -arvot 530, 576 ja 713 vastaavasti.

Esimerkki 7

Vapaan klavulaanihapon valmistus

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettu litiumsuola (500 mg) jaettiin etyyliasetaatin (10 ml) ja kyllästetyn natriumkloridin vesiliuoksen (10 ml) välillä. 2-n kloorivetyhappoa (1 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin nopeasti. Vesifaasi erotettiin, pestiin etyyliasetaatilla (10 ml) ja yhdistetyt orgaaniset uutteet pestiin kyllästetyllä natriumkloridin vesiliuoksella (15 ml). Saatu orgaaninen liuos kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin melkein kuiviin, jolloin saatiin vapaa happo öljynä (352 mg), joka sisälsi noin 0,5 moolia etyyliasetaattia. Yhdisteellä oli seuraavat ominaisuudet. /,y /^4 (c 1,0: DMSO) + 54,5°, Λ max 0,00098 % liuokselle υ 1 0,1-n vesiliuoksessa on 258 nm (E^ 590). Nujolissa on infrapuna- 20 64600 ) l \ \ huippuja kohdilla 3350, 1790 ja 1722 cm NMR-huippuja (DMSO-dg) kohdilla £^4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s) , 5,23 Xt, 7Hz) , 5,97 (d,7 Hz), 6,37 ja 6,93 (dd, 3 ja 17 Hz; d, 17 Hz); huiput, joiden keskipiste on kohdilla 8,82, 8,00 ja 5,95 osoittavat, että näyte sisälsi noin 0,5 moolia etyyliasetaattia klavulaanihappomoolia kohti. Nämä arvot osoittavat, että näyte sisälsi vähintään 85 % painosta klavulaanihappoa.

Esimerkki 8

Ammoniumsuolan valmistus

Dowex 50W-pylväs (240 ml) muutettiin ammoniumkiertoon käsittelemällä ammoniumsulfaatilla ja pestiin puhtaaksi sulfaatista vedellä. Litiumsuola (1,0 g) liuotettiin veteen (15 ml), siirrettiin pylvääseen ja pylväs kehitettiin vedellä. Reaktioita (25 ml) kerättiin ja kokeiltiin UV-absorptiolla 0,1-n natriumhydroksidissa. Aktiiviset fraktiot (4-7) yhdistettiin ja tislattiin lähes kuiviin (2 ml) alennetussa paineessa ja n-butanolia (85 ml) lisättiin. Seos tislattiin varovaisesti 25°C:ssa 0,1 mm paineessa, kunnes kiteinen aine saostui. Ammoniumsuola kerättiin suodattamalla, pestiin hyvin pienellä määrällä etanolia, asetonia ja lopuksi pestiin di-etyylieetterillä ja kuivattiin 0,1 mm:ssä 6 tunnin ajan, jolloin saatiin valkeita kiteitä (0,54 g) . (c 0,39 % vedessä) +60,1°;

Xmax (0,1N natriumhycfiroksidi, 8,8 yUg/ml) 258 nm (E^ 745); IR-huippuja nujolissa oli kohdilla 3360, 1780, 1700 ja 1580 cm (5 % D20) arvoihin kuuluivat 4,27 (d, 3Hz), 5,08 (s),5,09 (t,7Hz), 5,84 (d, 7Hz), 6,43 (dd, 17Hz, 3Hz) ja 6,89 (d, 17Hz).

Saatu: C 44,4; H 5,6; N 13,3 % CgHgNOgNH^ vaatii C 44,4; H 5,6; N 13,0 %. Karl Fischer-analyysillä todettiin jäänteitä vedestä (0,6 %) .

Esimerkki 9

Metyyliamiinisuolan valmistus

Amberlite IR 12Q H -pylväs (20Q ml) muutettiin metyyliammo-niummuotoon käsittelemällä 0,5M metyyliamiiniliuoksella vedessä.

Tämä pestiin neutraaliksi vedellä ja metyyliammoniumkloridia (3,0 g) vedessä (10 ml) lisättiin. Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja oli valmis käyttöön.

Litiumsuola (1,50 g) liuotettiin veteen (15 ml) ja kaadettiin pylvään yläpinnalle. Pylväs kehitettiin vedellä ja fraktiot 64600 21 (25 ml) kerättiin. Fraktiot 3-7 yhdistettiin (161 ml pesuliuok-sineen), tislattiin 35°/l,0 mm:ssa noin 2 ml:ksi ja n-butanolia (200 ml) lisättiin. Kirkas liuos tislattiin samanlaisissa olosuhteissa 20 ml:ksi, jolloin kiteytyminen tapahtui. Kiteet kerättiin suodattamalla 1 tunnin kuluttua 2°:ssa, pestiin dietyylieetterillä (2 x 15 ml) ja kuivattiin 3 tunnin ajan 1 mmissä, jolloin saatiin metyyliamiinisuola (1,2 g) valkeina pitkulaisina kidekimppuina.

(c 0,23 % vedessä) +56,1°, Λ max (0,1-n natriumhydroksidi, 9,5 ^,ug/ml) 260 nm, (E1 584) ; IR-huippuja nujolissa oli kohdilla 2500, 1790, 1692, 1632 ja 1576 cm ^? ^*(8 % DjO) arvoja olivat 6,40 ja 6,86 (dd, 17Hz, 3Hz; d, 17 Hz), 4,24 (d, 3Hz), 5,06 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s). Saatu C 46,7? H 6,1; N 12,5 %. vaatii C 47,0; H 6,1 ja N 12,2 %.

Esimerkki 10

Piperidllnisuolan valmistus (R) oninvaihtohartsipylväs (200 ml Bio-Rad Laboratories, AG 50Wx2, 100-200 mesh H -muoto) muutettiin piperidiinimuotoon piperi-diiniliuoksella (75 ml)vedessä (1500 ml). Hartsi pestiin neutraaliksi vedellä ja käsiteltiin piperidiinikloridilla (3 g) vedessä (10 ml). Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja oli valmis käyttöön.

Litiumsuola (1,50 g) kaadettiin pylvään yläpinnalle vedessä (15 ml) ja pylväs kehitettiin vedessä ottaen 25 ml fraktiot. Fraktiot 3-6 yhdistettiin pesuliuosten kanssa (172 ml).

Liuos haihdutettiin lähes kuiviin 35°/l,0 mm:ssä ja puhdasta tolueenia lisättiin, öljymäinen suspensio haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa kuten yllä ja kiteinen kiinteä aine, joka näin saatiin, jauhettiin hienoksi etyyliasetaatissa (90 ml). Kiteinen piperidiinisuola kerättiin suodattamalla, pestiin etyyliasetaatilla (3 x 30 ml) ja jäljelle jäänyt liuotin poistettiin 0,1 mmHg paineessa 3 tunnin aikana, jolloin saatiin 1,775 g hiukan likaisen

valkoisia kiteitä. /jbC/^ (c 0,35 % vedessä) +42,2°; ^\max (0,1N

u 1 natriumhydroksidi, 10 ^,ug/ml) 259,5 nm (E^ 474); IR-huippuja nujolissa oli kohdilla 3380, 2540, 1782 ja 1608 cm "S '“ZT(8 % D2O) arvoja oli 6,90 (d, 17Hz), 6,44 (dd3, 17Hz), 4,28 (d, 2Hz), 4,28 (d, 2Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (monimutkainen multipletti), 8,0-8,5 (monimutkainen multipletti).

64600

Saatu C 52,8; H 7,2; N 9,3 % C13H20N2°5*^'6 H2° vaatii c 52#9; H 7,4; ja N 9,5 %.

Esimerkki 11

Trietyyliamiinlsuolan valmistus

Esimerkissä 10 kuvattu ioninvaihtohartsipylväs (Bio-Rad (R) AG 50W) muutettiin trietyyliammoniummuotoon trietyyliamiinin vesiliuoksella (0,5N, 1,5 1) ja pestiin neutraaliksi vedellä. Tri-etyyliammoniumkloridin (3 g) vesiliuosta (15 ml) lisättiin pylvääseen. Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja se oli valmis käyttöön.

Litiumsuola (1,5 g) kaadettiin pylvään yläpinnalle vedessä (15 ml) ja pylväs kehitettiin vedellä ottaen 25 ml fraktiot. Fraktiot 4-9 kerättiin yhteen (175 ml pesuliuoksineen).

Liuos keitettiin kokoon alennetussa paineessa (35°/l,0 mm), jolloin saatiin öljy, joka keitettiin kokoon kolme kertaa toluee-nin kanssa samoissa olosuhteissa. Saadut kiteet rikottiin etyyliasetaatissa (50 ml), kerättiin suodattamalla, pestiin kahdesti dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja vapautettiin jäljelle jääneestä liuottimesta eksikkaattorissa 3 tunnin ajan 0,1 mm:ssä jolloin saatiin trietyyliammoniumsuola (1,588 g) hiukan likaisenvalkoi-sina kiteinä. (c 0,22 % vedessä) +44,3°; X max (0,1-n nat- riumhydroksidi, 9,7 ^,ug/ml) 258 nm (E1 485); IR-huippuja nujolis-sa on kohdilla 3250, 2080, 1784, 1700 ja 1640 cm"1; ^(10 % D20) arvoja on 6,41 ja 6,87 (dd 17Hz, 3Hz:d 17Hz), 4,26 (d, 3Hz), 5,07 (t,7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,07 (s), 8,74 (t, 7Hz) ja 6,78 (q, 7Hz). Saatu C 55,2; H 7,9; N 9,2 %. C14H24N205.1/4 H20 vaatii C 55,2; H 8,0 ja N 9,2 %.

Esimerkki 12

Streptomyces clavuligerus-kannan NRR4 3585 viljelyliemestä eristetty hiilieluaattinäyte väkevöitiin alennetussa paineessa asetonin poistamiseksi. Saatu väkevöite (1 1; joka biokokeen mukaan sisälsi 1,28 g klavulaanihappoa) kaadettiin IRA68-hartsipylvääseen (kloridikierto; 100 ml). Pylväs pestiin vedellä (300 ml) ja eluoi-tiin 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridin vesiliuoksella keräten eluaatti 100 ml fraktioina.

23 64600

Fraktiot 1 ja 2 yhdistettiin (200 ml), haihdutettiin alennetussa paineessa 40 ml:ksi ja jätettiin 4°C:seen yli yön. Muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla (lo ml), asetonilla (50 ml) ja dietyylieetterillä (50 ml) ennen kuivaamista tyhjössä, jolloin saatiin 530 mg valkoista kiinteää ainetta (E^ 802), joka tarkoitti 40,8 % saantoa hiilieluaatista.

Saman tilavuuden kyllästettyä litiumkloridin vesiliuosta lisääminen emäliuoksiin, jota seurasi varastointi 4°C:ssa, tuotti toisen sadon, edellä kuvatulla tavalla valmistettuna 178 mg (E^ 740), joka tarkoitti 12,7 % lisäsaantoa.

Sarjassa samanlaisia kokeita litiumkloridieluentin väkevyyttä, ioninvaihtohartsia ja eluenttikätionin ja vastaavan anio-nin luonnetta muuteltiin, jolloin saatiin taulukoidut tulokset.

Hartsi Kierto Eluentti (molaarisuus) Tuotteen 6aanto $ *)

Amberlite kloridi litiurakloridi 750 51»8 IRA 68 (0,5M)

Amberlite kloridi litiumkloridi 760 55»6 IRA 95 (1»0M)

Amberlite kloridi litiumkloridi 640 44,5 IRA 95 (0,5M)

Amberlyst kloridi litiumkloridi 650 54,5 A 21 (1,0M)

Amberlite asetaatti 0 litiumasetaatti 660· 56,8 IRA 68 (0,5M)

Amberlite formiaatti 0 ammoniumformiaatti 520 55,9 IRA 68 (0,5M) k) 'Tuotteen saanto on laskettu hiilieluaatin lähtömäärästä.

^Näissä kokeissa litiumsuola oli valmistettu väkevöimällä eluaatit x 6 ja lisäämällä sama tilavuus 5Q % (paino/tilavuus) litium-kloridiliuosta. Saadut litiumsuolat käsiteltiin kuten edellä.

24 64 600

Esimerkki 13

Hiilieluaattinäyte (vrt. esim. 12) (4 litraa) ajettiin IRA68-pylvään (kloridikierto; 250 ml) läpi, joka sitten pestiin vedellä (250 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridi-liuoksella. 200 ml eluaattia, joka sisälsi 73 % lähtöaineen biologisesta aktiivisuudesta, kerättiin. Näyte (70 ml) tätä eluaat-tia käsiteltiin 5 tilavuudella propan-2-olia sekoittaen, jolloin saatiin tervamainen sakka. Neste kaadettiin pois ja väkevöitiin alennetussa paineessa 7 ml:ksi. Seisottuaan 4°C:ssa yli yön kiteinen tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ennen kuivaamista tyhjössä. Kuiva kiinteä aine (870 mg) todettiin puhtaaksi biokokeella, ja se edusti 94 % saantoa hartsipylvään eluaatista.

Esimerkki 14 IRA68-hartsipylväs (kloridikierto; 50 ml) täytettiin hiili-eluaatilla (vrt. esim. 12) (840 ml), joka oli valmistettu valmis tuksen 3 tavalla, pestiin vedellä (100 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/-tilavuus) litiumkloridilla propan-2-oli:vesiseoksessa (5:1). Ensimmäiset 5 pylvään tilavuutta väkevöitiin alennetussa paineessa, antibiootti kiteytettiin kuten esimerkissä 13. Kiinteä aine painoi 292 mg, (Biokoe: 970 mg litiumklavulanaattia/mg kiinteää ainetta) ja vastasi 45 % saantoa hiilieluaatista.

Esimerkki 15

Streptomyces clavuligerus-kannan NRRL 3585 viljelyliemen suodatettu näyte (1 1), joka sisälsi 0,43 g klavulaanihappoa (biologinen koe) ajettiin IRA93-hartsipylvään läpi (kloridikierto; 100 ml). Pylväs pestiin laimealla etikkahapolla (0,25 M; 200 ml), vedellä (750 ml) ja eluoitiin litiumkloridin vesiliuoksella (IM). Ensimmäinen 150 ml eluaattia, joka sisälsi 0,28 g klavulaanihappoa (biologinen koe) väkevöitiin alennetussa paineessa 15 ml:ksi ja varastoitiin 4°C:ssa yli yön. Tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ennen kuivaamista ilmassa, jolloin saatiin 668 mg kiinteää ainetta (E^ 245), joka tarkoitti 47 % saantoa suodatetusta liuoksesta.

Esimerkki 16

Viljelyliemen suodatettu näyte (vrt. esim. 15) (2 1), joka sisälsi 1,23 g klavulaanihappoa (biologinen koe) ajettiin IRA93- 64600 25 hartsipylvään läpi (kloridikierto; 240 ml). Pylväs pestiin vedellä (500 ml), propan-2-oli:vesiseoksella (5:1; 400 ml) ja eluoitiin sitten 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridillä propan-2-oli:vesi-seoksessa (5:1). Ensimmäiset 97Q ml eluaattia väkevöitiin alennetussa paineessa 100 ml:ksi ja varastoitiin 4°C:ssa 2 päivän ajan. Tuote suodatettiin ja pestiin kuten esimerkissä 15, jolloin saatiin 286 mg kiinteää ainetta (E^ 662) joka vastasi 19 % saantoa suo datetusta liuoksesta.

Esimerkki 17

Viljelyliemen suodatettu näyte (vrt. esim. 15) (500 ml) täytettiin IRA93-pylvääseen (kloridikierto; 50 ml). Pylväs pestiin vedellä (50 ml) ja 95 % etanolin vesiliuoksella (100 ml) ennen eluointia litiumkloridilla (1 % paino/tilavuus 95 % etanolin vesi-liuoksessa; 50 ml fraktiot). Fraktiot 2 ja 3 yhdistettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa, kunnes kiinteä aine alkoi saostua. Väkevöite jäähdytettiin +4°C:seen 3/4 tunnin ajaksi ja kiinteä aine kerättiin sintterisuodattimelle. Kiinteä aine pestiin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin 1/2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa tyhjöuunissa, jolloin saatiin 89 mg litiumkalvu-lanaattia (E^ 770), joka vastaa 32 % saantoa suodatetusta liuoksesta.

Esimerkki 18

Hiilieluaatti (vrt. esim. 12) (5 litraa) ajettiin IRA68 pylvään (500 ml tilavuudeltaan) kloridikierrossa 1 litran tuntivauhtia. Pylväs pestiin vedellä (1 litra) ja eluoitiin 0,5M natrium-kloridiliuoksella. Ensimmäinen eluaattilitra väkevöitiin pyörö-haihduttimessa 90 ml:ksi. Annos väkevöitettä (10 ml) käsiteltiin propan-2-olilla (50 ml) sekoittaen. Neste kaadettiin tervamaisesta muodostuneesta sakasta, väkevöitiin pyöröhaihduttimella 3 ml tilavuuteen ja käsiteltiin 3 ml:11a 30 % paino/tilavuus litiumklo-ridiliuoksella. Seisottuaan 4°C:ssa yli yön tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin valkean jauheen saamiseksi, 280 mg, E^ 770.

Esimerkki 19

Litiumklavulanaattia (E^ 667; 2,0 g valmistettu kuten esimerkissä 15, jota seurasi käsittely isopropyylialkoholilla) liuotettiin veteen (16 ml) ja suodatettiin; etanolia (64 ml) lisättiin 64600 26 varovaisesti ja seosta sekoitettiin ympäröivässä lämpötilassa 1 tunnin ajan. Aluksi muodostunut sakka ei sisältänyt litiumklavu-lanaattia UV-spektroskooppisesti tutkittuna ja se hävitettiin. Neste laimennettiin kyllästetyllä litiumkloridiliuoksella (16 ml) ja asetettiin syrjään kiteytymään 2 1/2 tunniksi. Kiteet kerättiin suodattamalla, kuivattiin imulla, pestiin asetonilla (2 x 15 ml), dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja kuivattiin tyhjössä vakio-painoon (1,350 g) 735).