DE69827956T2

DE69827956T2 - Peptidanaloga mit inhibitorischer wirkung auf hepatitis c

Info

Publication number: DE69827956T2
Application number: DE69827956T
Authority: DE
Inventors: Montse Llinas-Brunet; Douglas Murray BAILEY; Teddy Halmos; Marc-Andre Laval Vimont POUPART; Youla Tsantrizos
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1997-08-11
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: JP2001512744A; PT1012180E; HUP0100100A2; DE69827956D1; EP1012180B1; US6143715A; ES2234144T3; AU757072B2; ATE283865T1; IL134233A0; JP4452401B2; HUP0100100A3; CA2294562A1; NZ503263A; CA2294562C; WO1999007734A2; AU8846698A; EP1012180A2; WO1999007734A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Hepatitis C-Virus(HCV)-Infektionen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung neuartige Peptide und deren Analoge, pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Peptide enthalten, und Verfahren zur Verwendung dieser Peptide bei der Behandlung von HCV-Infektionen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) ist weltweit der wichtigste ätiologische Auslöser von durch Transfusion und durch allgemeine Umstände erworbene Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis. Es wird angenommen, dass weltweit mehr als 100 Millionen Personen von dem Virus infiziert sind. Bei einem hohen prozentualen Anteil von Virusträgern entsteht eine chronische Infektion, wobei es in zahlreichen Fällen zu einer chronischen Leberkrankheit kommt, der sogenannten chronischen Hepatitis C. Bei dieser Gruppe besteht wiederum die starke Gefahr von ernsthaften Leberkrankheiten, wie Leberzirrhose, hepatozellulärem Karzinom und zum Tod führenden terminalen Stadien von Lebererkrankungen.
Der Mechanismus, gemäß dem HCV seinen viralen Fortbestand gewährleistet und eine hohe Rate an chronischen Lebererkrankungen hervorruft, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist nicht bekannt, wie HCV mit dem Wirtsimmunsystem in Wechselwirkung tritt und diesem ausweicht. Ferner müssen die Rollen der zellulären und humoralen Immunreaktionen beim Schutz gegen HCV-Infektionen und -Krankheiten noch aufgeklärt werden. Es wurde berichtet, dass Immunoglobuline eine Prophylaxe bei transfusionsbedingter viraler Hepatitis bewirken, jedoch empfiehlt das Center for Disease Control gegenwärtig zu diesem Zweck nicht die Behandlung mit Immunoglobulinen.
Das Fehlen einer wirksamen schützenden Immunreaktion behindert die Entwicklung eines Impfstoffes oder angemessener Prophylaxemaßnahmen nach der Belastung, so dass in naher Zukunft die ganze Hoffnung fest auf antivirale Eingriffe gesetzt wird.
Es wurden verschiedene klinische Studien mit dem Ziel durchgeführt, pharmazeutische Mittel zu identifizieren, die in wirksamer Weise zur Behandlung von HCV-Infektionen bei von chronischer Hepatitis C betroffenen Patienten befähigt sind. Bei diesen Untersuchungen verwendete man Interferon-alpha, allein und in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln. Derartige Untersuchungen haben ergeben, dass eine erhebliche Anzahl der Teilnehmer auf diese Therapien nicht reagiert und dass von den Teilnehmern, die eine günstige Reaktion zeigen, ein großer Anteil nach Beendigung der Behandlung einen Rückfall erleidet.
Bis vor einigen Jahren stellte die Behandlung mit Interferon (IFN) die einzige verfügbare Therapie mit nachgewiesenem Nutzen dar, die in der Klinik für Patienten mit chronischer Hepatitis C anerkannt war. Jedoch ist die anhaltende Reaktionsrate gering und ferner führt die Behandlung mit Interferon auch zu schweren Nebenwirkungen (d. h. Retinopathie, Thyreoiditis, akute Pankreatitis, Depressionen), die die Lebensqualität der behandelten Patienten beeinträchtigen. Interferon in Kombination mit Ribavirin wurde ursprünglich für Patienten, die auf IFN allein nicht reagieren, zugelassen. Jedoch werden mit dieser Kombinationstherapie die durch IFN verursachten Nebenwirkungen nicht gelindert.
Somit besteht ein Bedürfnis zur Entwicklung wirksamer antiviraler Mittel zur Behandlung von HCV-Infektionen, mit denen die Einschränkungen vorhandener pharmazeutischer Therapien überwunden werden können.
HCV ist ein umhülltes Plusstrang-RNA-Virus der Familie Flaviviridae. Das einzelsträngige HCV-RNA-Genom weist eine Länge von etwa 9 500 Nucleotiden auf und besitzt einen einzigen offenen Leseraster (ORF), der für ein einziges großes Polyprotein mit etwa 3 000 Aminosäuren kodiert. In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an mehreren Stellen durch zelluläre und virale Proteasen gespalten, wodurch strukturelle und nicht-strukturelle (NS) Proteine entstehen. Im Fall von HCV wird die Erzeugung von reifen, nicht-strukturellen Proteinen (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B) durch zwei virale Proteasen erreicht. Die erste Protease, die noch schlecht charakterisiert ist, spaltet an der NS2-NS3-Verbindungsstelle. Die zweite Protease ist eine Serin-protease, die innerhalb der N-terminalen Region von NS3 enthalten ist (und daher als NS3-Protease bezeichnet wird) und vermittelt sämtliche anschließenden Spaltungen stromabwärts von NS3, sowohl in cis, an der NS3-NS4A-Spaltungsstelle, als auch in trans, für die restlichen NS4A-NS4B-, NS4B-NS5A- und NS5A-NS5B-Stellen. Das NS4A-Protein scheint mehrere Funktionen auszuüben, nämlich die Wirkung als Kofaktor für die NS3-Protease und möglicherweise die Unterstützung der Membranlokalisierung von NS3 und anderen viralen Replicase-Komponenten. Die Komplexbildung des NS3-Proteins mit NS4A scheint für die Prozessierungsereignisse notwendig, die die proteolytische Wirksamkeit an sämtlichen Stellen verstärken. Das NS3-Protein besitzt auch Nucleosid-triphosphatase- und RNA-Helicase-Aktivitäten. NS5B ist eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, die an der Replikation von HCV beteiligt ist.
Eine allgemeine Strategie zur Entwicklung von antiviralen Mitteln besteht in der Inaktivierung von viral kodierten Enzymen, die für die Replikation des Virus erforderlich sind. Diesbezüglich beschreibt die Patentanmeldung WO-97/06804 das (–)-Enantiomere des Nucleosidanalogen Cytosin-1,3-oxathiolan (auch bekannt als 3TC) mit Aktivität gegen HCV. Diese Verbindung wird zwar in früheren klinischen Untersuchungen gegen HIV und HBV als sicher bezeichnet, ihre klinische Aktivität gegen HCV ist jedoch nicht erwiesen und ihr Wirkungsmechanismus gegen das Virus bedarf noch der Aufklärung.
Intensive Bemühungen zum Auffinden von Verbindungen, die die NS3-Protease oder die RNA-Helicase von HCV hemmen, haben zu folgenden Arbeiten geführt:

– US-Patent 5 633 388 beschreibt heterocyclisch substituierte Carboxamide und Analoge mit Wirksamkeit gegen HCV. Diese Verbindungen sind gegen die Helicase-Aktivität des NS3-Proteins des Virus gerichtet, wobei aber bisher nicht über klinische Tests berichtet wird.
– Chu et al. (Tet. Lett., (1996), S. 7229–7232) berichten über ein Phenanthrenchinon, das in vitro gegen die HCV-NS3-Protease wirksam ist. Bezüglich dieser Verbindung gibt es keine Berichte über weitere Entwicklungen.
Bei der Ninth International Conference on Antiviral Research, Urabandai, Fukyshima, Japan (1996) (Antiviral Research, Bd. 30 (1) (1996), A23 (Abstract 19)) wurde eine Arbeit vorgelegt, die über Thiazolidin-Derivate mit Hemmwirkung gegen die HCV-Protease berichtet.
– Mori, Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 231, Nr. 3 (1997), S. 738–742, beschreibt die Hemmung von NS3-Protease durch N-terminale Spaltung des Peptids GEAGODIVPC.

Es gibt mehrere Untersuchungen über Verbindungen mit Hemmwirkung gegen andere Serin-proteasen, wie humane Leukozyten-elastase. Über eine Familie dieser Verbindungen wird in WO-95/33764 berichtet (Hoechst Marion Roussel, 1995). Bei den in dieser Anmeldung beschriebenen Peptiden handelt es sich um Morpholinylcarbonyl-benzoyl-Peptidanaloge, die sich strukturell von den erfindungsgemäßen Peptiden unterscheiden.

– WO-98/17679 der Fa. Vertex Pharmaceuticals Inc. beschreibt Inhibitoren von Serin-protease, insbesondere von Hepatitis C-Virus-NS3-Protease. Bei diesen Inhibitoren handelt es sich um Peptidanaloge auf der Basis des natürlichen NS5A/5B-Substrats, die C-terminate Aldehyde, α-Ketoamide und fluorierte Ketone enthalten.
– Hoffman LaRoche berichtet ebenfalls über Hexapeptide, bei denen es sich um Proteinase-Inhibitoren handelt, die sich als antivirale Mittel zur Behandlung von HCV-Infektionen eignen. Diese Peptide enthalten einen Aldehyd oder eine Boronsäure am C-Terminus.
– Steinkühler et al. und Ingallinella et al. beschrieben eine NS4A-4B-Produkthemmung (Biochemistry, Bd. 37 (1998), S. 8899–8905 und 8906–8914). Jedoch wurden diese Peptide und Analoge nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Peptiden, die die NS3-Protease des Hepatitis C-Virus hemmen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Wir untersuchten Peptide mit potentieller Hemmwirkung gegen die NS3-Protease. Der Befund, dass das N-terminate Spaltungsprodukt (Ac-D-D-I-V-P-C-OH) eines Analogen eines natürlichen Substrats der NS3-Protease eine Hemmwirkung zeigte, führte uns zu den erfindungsgemäßen Peptidanalogen.
Unter den Umfang der Erfindung fallen Verbindungen der Formel (I):
worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist,
worin R₁₁ C_1-10-Alkyl ist, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; oder R₁₁ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, gegebenenfalls substituiert mit einem C_1-6-Alkyl;
R₆ die Seitenkette von Asp oder Glu ist;
R₅ die Seitenkette von D-Asp, D-Val oder D-Glu ist;
Y H oder C_1-6-Alkyl ist;
R₄ C_1-10-Alkyl; C_3-10-Cycloalkyl ist;
R₃ C_1-10-Alkyl; C_3-10-Cycloalkyl ist;
W eine Gruppe der Formel II' ist:
Formel II' worin X CH oder N ist; und
R₂' die Seitenkette von Prolin ist und substituiert ist mit R₁₇ in 4-Position mit der in Formel III' gezeigten Stereochemie:
Formel III' worin R₁₇ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Arlkyl ist, jeweils gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N;
das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder einen Heterocyclus zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl;
der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N;
R₁₇ OR₁₂ ist, worin R₁₂ ein C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, wobei das genannte erste Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls substituiert sind mit C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, Carboxy(nieder)alkyl oder einem zweiten Aryl oder Aralkyl;
das genannte erste und zweite Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N;
Q eine Gruppe der Formel
ist, worin Z CH oder N ist;
X O oder S ist;
R₁ H, C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkenyl, beide gegebenenfalls substituiert mit Thio oder Halogen, ist; und
wenn Z CH ist, dann R₁₃ H; CF₃; CF₂CF₃; CH₂-R₁₄; CH(F)-R₁₄; CF₂-R₁₄; NR₁₄R₁₄'; S-R₁₄; oder CO-NH-R₁₄ ist, worin
R₁₄ und R₁₄' unabhängig Wasserstoff, cyclisches C_3-10-Alkyl oder acyclisches C_1-10-Alkyl oder cyclisches C_3-10-Alkenyl oder acyclisches C_2-10-Alkenyl sind, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls substituiert sind mit NH₂, OH, SH, Halogen oder Carboxyl; das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; oder R₁₄ und R₁₄' unabhängig C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl sind, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl oder substituiert mit einem weiteren C_3-7-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder Heterocyclus; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N;
wobei das cyclische Alkyl, cyclische Alkenyl, Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder einen Heterocyclus zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl oder substituiert ist mit einem weiteren C_3-7-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder Heterocyclus; der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N;
oder R₁₄ und R₁₄' unabhängig C_1-4-Alkyl sind, die, wenn sie zusammen mit N verbunden sind, einen 3- bis 6-gliedrigen, Stickstoff enthaltenden Ring bilden, der gegebenenfalls mit einem weiteren C_3-7-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder Heterocyclus kondensiert ist;
mit der Maßgabe, dass, wenn Z CH ist, R₁₃ dann nicht eine α-Aminosäure oder ein Ester davon ist;
wenn Z N ist, dann R₁₃ H; Carboxy; C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxy; CH₂-R₁₄; CHR₁₄R₁₄'; CH(F)-R₁₄; O-R₁₄; NR₁₄R₁₄' oder S-R₁₄ ist, worin R₁₄ und R₁₄' wie vorstehend definiert sind; oder
Q eine Phosphonatgruppe der Formel:
ist, worin R₁₅ und R₁₆ unabhängig C_6-20-Aryloxy sind; und R₁ wie vorstehend definiert ist.
Unter den Umfang der Erfindung fällt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine gegen Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel oder Hilfsmittel umfasst.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Behandlung einer viralen Hepatitis C-Infektion bei einem Säuger durch Verabreichung einer gegen Hepatitis C antiviral wirksamen Menge der Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon oder einer Zusammensetzung gemäß den vorstehenden Ausführungen an den Säuger.
Ein weiterer wichtiger Aspekt beinhaltet ein Verfahren zur Inhibierung der Replikation des Hepatitis C-Virus, indem das Virus einer Hepatitis-C-Virus-NS3-Protease inhibierenden Menge der Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon oder einer Zusammensetzung gemäß den vorstehenden Ausführungen ausgesetzt wird.
Ein weiterer Aspekt beinhaltet ein Verfahren zur Behandlung einer viralen Hepatitis C-Infektion bei einem Säuger, indem man eine gegen Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Kombination aus der Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon und Interferon verabreicht. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Kombination im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel oder Hilfsstoff enthält, fällt ebenfalls unter den Umfang der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Sofern nichts anderes angegeben wird, gelten für die hier verwendeten Ausdrücke die folgenden Definitionen:
Für die Fälle, in denen die Symbole (R) oder (S) zur Bezeichnung der Konfiguration eines Restes, z. B. von R₄ der Verbindung der Formel I, verwendet werden, gilt die Bezeichnung im Zusammenhang mit der Verbindung und nicht im Zusammenhang mit dem Rest allein.
Die natürlichen Aminosäuren, ausgenommen Glycin, enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Sofern nicht speziell etwas anderes angegeben ist, werden die Verbindungen, die die natürlichen Aminosäuren mit der L-Konfiguration enthalten, bevorzugt. Jedoch zieht es die Anmelderin in Betracht, dass, sofern angegeben, einige Aminosäuren der Formel I in der D- oder L-Konfiguration oder in Form von Gemischen von D- und L-Isomeren, einschließlich der racemischen Gemische, vorliegen können.
Die hier verwendeten Bezeichnungen "P1, P2, P3 und dergl." beziehen sich auf die Position der Aminosäurereste, die vom C-Terminus der Peptidanalogen beginnen und sich bis zum N-Terminus erstrecken (d. h. P1 bedeutet die Position 1 vom C-Terminus aus; P2: zweite Position vom C-Terminus aus; und dergl.) (vergl. A. Berger und I. Schechter, Transactions of the Royal Society London Series, Bd. 257 (1970), S. 249–264).
Die Abkürzungen für die α-Aminosäuren sind in Tabelle A aufgeführt.
Tabelle A
Der hier verwendete Ausdruck "Aminobuttersäure" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der hier verwendete Ausdruck "Allylglycin" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der hier verwendete Ausdruck "tert.-Butylglycin" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der Ausdruck "Rest" im Zusammenhang mit einer Aminosäure oder einem Aminosäurederivat bedeutet einen Rest, der sich von der entsprechenden α-Aminosäure durch Entfernung der Hydroxylgruppe der Carboxylgruppe und eines Wasserstoffatoms von der α-Aminogruppe ergibt. Beispielsweise bedeuten die Ausdrücke Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar und Tyr die "Reste" von L-Glutamin, L-Alanin, Glycin, L-Isoleucin, L-Arginin, L-Asparaginsäure, L-Phenylalanin, L-Serin, L-Leucin, L-Cystein, L-Asparagin, Sarcosin bez. L-Tyrosin.
Der Ausdruck "Seitenkette" in bezug auf eine Aminosäure oder einen Aminosäurerest bedeutet eine Gruppe, die an das α-Kohlenstoffatom der α-Aminosäure gebunden ist. Beispielsweise handelt es sich bei der Seitenketten-R-Gruppe für Glycin um Wasserstoff, für Alanin um Methyl und für Valin um Isopropyl. Für die speziellen R-Gruppen oder Seitenketten der α-Aminosäuren wird auf A. L. Lehninger, Biochemistry, Kapitel 4, verwiesen.
Der hier verwendete Ausdruck "Halogen" bedeutet einen unter Brom, Chlor, Fluor oder Jod ausgewählten Halogenrest.
Die hier verwendeten Ausdrücke "C_1-6-Alkyl" oder "(nieder)-Alkyl" bedeuten allein oder in Kombination mit einem anderen Rest geradkettige oder verzweigte Alkylreste mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, 1-Methylethyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl und 1,1-Dimethylethyl.
Gleichermaßen werden die Ausdrücke "C_1-3-Alkyl", "C_1-4-Alkyl" und "C_1-10-Alkyl" zur Bezeichnung von Alkylresten mit bis zu 3, 4 bzw. 10 Kohlenstoffatomen verwendet.
Der hier verwendete Ausdruck "C_3-7-Cycloalkyl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Cycloalkylrest mit drei bis sieben Kohlenstoffatomen. Zu Beispielen hierfür gehören Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_1-10-(Alkylcycloalkyl)" bedeutet einen Cycloalkylrest mit drei bis sieben Kohlenstoffatomen, der an einen Alkylrest gebunden ist. Die gebundenen Reste enthalten bis zu zehn Kohlenstoffatome. Beispiele hierfür sind Cyclopropylmethyl, Cyclopentylethyl, Cyclohexylmethyl, Cyclohexylethyl oder Cycloheptylethyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_2-10-Alkenyl" bedeutet allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Alkylrest gemäß der vorstehenden Definition mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, der ferner mindestens eine Doppelbindung enthält. Ein Beispiel für Alkenyl ist Allyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_3-4-Alkylen" bedeutet einen zweiwertigen Alkylrest, der sich durch Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von einem geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit drei bis vier Kohlenstoffatomen ableitet. Zu Beispielen hierfür gehören -CH₂CH₂CH₂-, CH(CH₃)CH₂CH₂-, -CH₂C(CH₃)₂- und -CH₂CH₂CH₂CH₂-.
Der hier verwendete Ausdruck "C_1-6-Alkoxy" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest den Rest -O-C_1-6-Alkyl, wobei Alkyl der vorstehenden Definition entspricht und bis zu sechs Kohlenstoffatome enthält.
Beispiele für Alkoxyreste sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy und 1,1-Dimethylethoxy. Der letztgenannte Rest ist allgemein als tert.-Butoxy bekannt.
Der hier verwendete Ausdruck "C₆- oder C₁₀-Aryl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest ein aromatisches monocyclisches System mit einem Gehalt an sechs Kohlenstoffatomen oder ein aromatisches cyclisches System mit einem Gehalt an zehn Kohlenstoffatomen.
Der hier verwendete Ausdruck "C_7-16-Aralkyl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Arylrest gemäß der vorstehenden Definition, der über eine Alkylgruppe gebunden ist, wobei es sich beim Alkylrest um einen der vorstehend definierten Reste mit einem Gehalt an 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handelt. Beispiele für Aralkylreste sind Benzyl und Butylphenyl.
Der hier verwendete Ausdruck "Carboxy(nieder)-alkyl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest eine Carboxylgruppe (COOH), die über eine (nieder)-Alkylgruppe der vorstehenden Definition verbunden ist. Zu Beispielen hierfür gehören Buttersäure oder die folgenden Gruppen:
Die hier verwendeten Ausdrücke "cyclisch" oder "cyclisches System" bedeuten entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen einwertigen Rest, der sich durch Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem gesättigten oder ungesättigten cyclischen Kohlenwasserstoff mit einem Gehalt an 3 bis 7 Kohlenstoffatomen ableitet, sofern nichts anderes angegeben ist, wobei gegebenenfalls ein oder mehr Heteroatome enthalten sind. Die Ausdrücke "cyclisch" oder "cyclisches System" umfassen beispielsweise Cyclopropan, Cyclopentan, Cyclohexan, Cyclohexen, Decalin, Tetralin, Inden und Naphthalin.
Der hier verwendete Ausdruck "Heterocyclus" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen einwertigen Rest, der sich durch Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem fünf-, sechs- oder sieben-gliedrigen, gesättigten oder ungesättigten Heterocyclus mit einem Gehalt an 1 bis 4 Heteroatomen, die unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind, ableitet. Zu Beispielen für geeignete Heterocyclen gehören: Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Thiazolidin, Pyrrol, Thiophen, Diazepin, 1H-Imidazol, 1-Methyl-1H-imidazol, Isoxazol, Thiazol, 2-Methylthiazol, 2-Aminothiazol, Piperidin, 1,4-Dioxan, 4-Morpholin, Pyridin, 2-Methylpyridin, Pyrimidin, 4-Methylpyrimidin und 2,4-Dimethylpyrimidin.
Der hier verwendete Ausdruck "heterocylisches System" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Heterocyclus gemäß der vorstehenden Definition, der mit einem oder mehreren anderen Cyclen, bei dem es sich um einen Heterocyclus oder einen anderen Cyclus handelt, kondensiert sein kann. Zu Beispielen für geeignete heterocyclische Systeme gehören Thiazolo[4,5-b]pyridin, Chinolin oder Indol.
Bevorzugte Ausführungsformen
Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen wird durch die Formel I wiedergegeben, wobei B vorzugsweise ein Acylderivat der Formel R₁₁C(O)bedeutet, wobei R₁₁ folgende Bedeutungen hat:
C_1-6-Alkyl, das gegebenenfalls durch Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy oder C_1-6-Alkoxy substituiert ist;
C_3-7-Cycloalkyl, das gegebenenfalls durch Carboxyl, MeOC(O), EtOC(O) oder BnOC(O) substituiert ist;
3-Carboxypropionyl (DAD) oder 4-Carboxybutyryl (DAE); oder
Insbesondere bedeutet B Acetyl, 3-Carboxypropionyl, 4-Carboxybutyryl, AcOCH₂C(O), Me₃COC(O),
Insbesondere bedeutet B Acetyl, 3-Carboxypropionyl (DAD), 4-Carboxybutyryl (DAE), AcOCH₂C(O),
Ganz besonders bevorzugt ist für B die Bedeutung Acetyl oder 4-Carboxybutyryl (DAE). Insbesondere bedeutet B Acetyl.
Vorzugsweise handelt es sich bei R₆, sofern vorhanden, um die Seitenkette von Asp.
Insbesondere handelt es sich bei R₅ um die Seitenkette von D-Asp, D-Val oder D-Glu. Insbesondere handelt es sich bei R₅ um die Seitenkette von D-Glu.
Vorzugsweise bedeutet Y N oder C_1-3-Alkyl.
Insbesondere hat Y die Bedeutung Me.
Alternativ hat Y insbesondere die Bedeutung N.
Vorzugsweise handelt es sich bei R₄ um die Seitenkette einer Aminosäure, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Val, Cyclohexylglycin (Chg), Tbg, Ile oder Leu. Insbesondere handelt es sich bei R₄ um die Seitenkette von Chg oder Ile.
Eine besonders bevorzugte Bedeutung von R₄ ist die Seitenkette von Chg.
Vorzugsweise handelt es sich bei R₃ um die Seitenkette einer Aminosäure, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Ile, Chg, Cha, Val oder Glu.
Insbesondere handelt es sich bei R₃ um die Seitenkette von Val oder Chg.
Eine ganz besonders bevorzugte Bedeutung von R₃ ist die Seitenkette von Val.
Vorzugsweise handelt es sich bei W um eine Gruppe der Formel II:
wobei R₂ C_1-8-Alkyl oder C_3-6-Cycloalkyl, das gegebenenfalls durch Carboxyl substituiert ist, oder Benzyl bedeutet. Insbesondere handelt es sich bei R₂ um die Seitenkette von Asp, Aminobuttersäure (Abu) oder Val.
W bedeutet eine Gruppe der Formel II':
wobei X die Bedeutung CH oder N hat und R₂' die Seitenkette von Prolin bedeutet (wie in Schwarz dargestellt), die in der 4-Position mit R₁₇ substituiert ist und die in der Formel III' dargestellte Stereochemie aufweist:
Formel III'
Vorzugsweise hat R₁₇ folgende Bedeutungen: Bn; PhCH₂CH₂; PhCH₂CH₂CH₂; O-Bn; o-Tolylmethoxy; m-Tolylmethoxy; p-Tolylmethoxy; 1-Naphthyloxy; 2-Naphthyloxy, 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy; (4-tert.-Butyl)-methoxy; (3I-Ph)CH₂O; (4Br-Ph)O; (2Br-Ph)O; (3Br-Ph)O; (4I-Ph)O; (3Br-Ph)CH₂O; (3,5-Br₂-Ph)CH₂O;
Besonders bevorzugte Bedeutungen für R₁₇ sind: Bn; PhCH₂CH₂; PhCH₂CH₂CH₂; O-Bn; 1-Naphtyloxy; 2-Naphtyloxy, 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy;
Ganz besonders bevorzugte Bedeutungen für R₁₇ sind: O-Bn; 1-Naphthalinylmethoxy oder 2-Naphthalinylmethoxy;
Q hat vorzugsweise folgende Bedeutung:
wobei Z vorzugsweise die Bedeutung CH oder N hat.
Vorzugsweise hat R₁₃ dann, wenn Z CH bedeutet, folgende Bedeutungen: N; CF₃; CF₂CF₃; CH₂-R₁₄; C(O)NH-R₁₄, NR₁₄R₁₄', wobei R₁₄ und R₁₄' die vorstehend definierten Bedeutungen haben, mit der Maßgabe, dass R₁₃ nicht eine α-Aminosäure oder einen Ester davon bedeutet. Insbesondere hat R₁₃ die Bedeutung N; NH-R₁₄ oder C(O)NH-R₁₄. Ganz besonders bevorzugt ist für R₁₃ die Bedeutung N oder C(O)NH-R₁₄. Vorzugsweise bedeutet R₁₄ Phenyl oder C_7-16-Aralkyl. Insbesondere bedeutet R₁₄ Benzyl oder CH(Me)Ph.
Alternativ hat R₁₃ dann, wenn Z N bedeutet, vorzugsweise folgende Bedeutungen: Phenyl, C_7-16-Aralkyl,
Insbesondere bedeutet R₁₃ Naphthyl, NH-CH(Me)Ph, NH-CH(Et)Ph,
Ganz besonders bevorzugt für R₁₃ sind die Bedeutungen NH-CH(Me)Ph,
Alternativ bedeutet Q vorzugsweise eine Phosphonatgruppe der Formel:
worin R₁₅ und R₁₆ unabhängig voneinander vorzugsweise C_6-12-Aryloxy bedeuten. Insbesondere bedeuten R₁₅ und R₁₆ jeweils Phenoxy.
In sämtlichen vorgenannten Fällen bedeutet R₁ vorzugsweise C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkenyl, die gegebenenfalls durch Halogen substituiert sind. Insbesondere bedeutet R₁ C_1-5-Alkyl oder C_1-4-Alkenyl, die gegebenenfalls durch Fluor substituiert sind. Besonders bevorzugt für R₁ sind die Bedeutungen Ethyl, Propyl, Isopentyl oder Allyl.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich ein antivirales Mittel enthalten. Zu Beispielen für antivirale Mittel gehören Ribavirin und Amantadin.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich weitere Inhibitoren von HCV-Protease enthalten.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich einen Inhibitor anderer Ziele im HCV-Lebenszyklus, wie Helicase, Polymerase oder Metalloprotease, enthalten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral, parenteral oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Wir bevorzugen die orale Verabreichung oder die Verabreichung durch Injektion. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Adjuvantien oder Vehikel enthalten. In einigen Fällen kann der pH-Wert der Zubereitung mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, Basen oder Puffern eingestellt werden, um die Stabilität der zubereiteten Verbindung oder deren Abgabeform zu erhöhen. Der hier verwendete Ausdruck "parenteral" umfasst eine subkutane, intrakutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale und intraläsionale Injektion oder Infusionstechniken.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eines sterilen injizierbaren Präparats vorliegen, z. B. in Form einer sterilen, injizierbaren, wässrigen oder ölartigen Suspension. Diese Suspension kann gemäß bekannten Techniken unter Verwendung von geeigneten Dispergier- oder Netzmitteln (z. B. Tween 80) und Suspendiermitteln zubereitet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verabreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen gehören. Im Fall von Tabletten für die orale Anwendung gehören zu üblichen Trägerstoffen Lactose und Maisstärke. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden ebenfalls typischerweise zugesetzt. Für eine orale Verabreichung in Kapselform gehören zu geeigneten Verdünnungsmitteln Lactose und getrocknete Maisstärke. Bei oraler Verabreichung von wässrigen Suspensionen wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln vereinigt. Gegebenenfalls können bestimmte Süßungsmittel und/oder Aromastoffe und/oder farbgebende Mittel zugesetzt werden.
Weitere geeignete Vehikel oder Trägerstoffe für die vorerwähnten Zubereitungen und Zusammensetzungen finden sich in üblichen pharmazeutischen Handbüchern, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19th Auflage, Mack Publishing Company, Easton Penn., (1995).
Dosierungen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 75 mg/kg Körpergewicht pro Tag der hier beschriebenen Protease-Inhibitorverbindungen eignen sich bei einer Monotherapie zur Verhinderung und Behandlung einer durch HCV vermittelten Krankheit. Typischerweise werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 1 bis etwa 5 Mal täglich oder alternativ in Form einer kontinuierlichen Infusion verabreicht. Eine derartige Verabreichung kann als eine chronische oder akute Therapie vorgenommen werden. Die Menge des Wirkstoffes, der mit den Trägermaterialien zur Bildung einer einzelnen Dosierungsform vereinigt wird, hängt vom behandelten Wirt und vom speziellen Verabreichungsweg ab. Ein typisches Präparat enthält etwa 5 bis etwa 95% Wirkstoff (Gew./Gew.). Vorzugsweise enthalten derartige Präparate etwa 20 bis etwa 80% Wirkstoff.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass niedrigere oder höhere Dosen, als sie vorstehend erwähnt wurden, erforderlich sein können. Spezielle Dosierungs- und Behandlungsschemata für jeden speziellen Patienten hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, wozu folgendes gehört: Alter, Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneistoffkombination, Schwere und Verlauf der Infektion, Disposition des Patienten gegenüber der Infektion, Beurteilung durch den behandelnden Arzt. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosen eingeleitet, die wesentlich unter der optimalen Dosis des Peptids liegen. Anschließend wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis die optimale Wirkung unter den gegebenen Umständen erreicht wird. Im allgemeinen wird die Verbindung in besonders zweckmäßiger Weise in einem Konzentrationsbereich verabreicht, der allgemein antiviral wirkende Ergebnisse liefert, ohne dass schädliche oder nachteilige Nebenwirkungen hervorgerufen werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine Kombination aus der Verbindung der Formel I und einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln enthalten, sollen sowohl die Verbindung als auch das zusätzliche Mittel in Dosierungskonzentrationen von etwa 10 bis 100% und insbesondere von etwa 10 bis etwa 80%, der Dosierung vorliegen, die normalerweise bei einem Monotherapie-Schema verabreicht wird.
Wenn diese Verbindungen oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff zubereitet werden, kann die erhaltene Zusammensetzung in vivo an Säugetiere verabreicht werden, z. B. an Menschen, um HCV-NS3-Protease zu hemmen oder um eine HCV-Virusinfektion zu behandeln oder zu verhindern. Eine derartige Behandlung kann auch unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit weiteren Mitteln erreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) folgende Mittel gehören: immunomodulatorische Mittel, wie α-, β- oder γ-Interferone; andere antivirale Mittel, wie Ribavirin und Amantadin; andere Inhibitoren von HCV-NS3-Protease; Inhibitoren von anderen Zielen im HCV-Lebenscyclus, wie Helicase, Polymerase, Metalloprotease oder ein interner "Ribosomen-Entry"; oder Kombinationen davon. Die zusätzlichen Mittel können mit den erfindungsgemäßen Verbindungen unter Bildung einer einzigen Dosierungsform vereinigt werden. Alternativ können diese zusätzlichen Mittel getrennt an einen Säuger als Bestandteil einer mehrfachen Dosierungsform verabreicht werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Hemmung der HCV-NS3-Protease-Aktivität in Säugern bereitgestellt, indem man eine Verbindung der Formel I verabreicht, wobei die Substituenten den vorstehenden Definitionen entsprechen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform eignen sich diese Verfahren zur Verringerung der HCV-NS3-Protease-Aktivität bei einem Säuger. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff enthält, können derartige Verfahren die zusätzliche Stufe der Verabreichung eines weiteren Mittels an den Säuger umfassen, wobei dieses Mittel unter immunomodulatorischen Mitteln, antiviralen Mitteln, HCV-Protease-Inhibitoren oder Inhibitoren anderer Ziele im HCV-Lebenszyklus, wie Helicase, Polymerase oder Metallo-protease, ausgewählt ist. Ein derartiges zusätzliches Mittel kann dem Säuger vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht werden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform eignen sich diese Verbindungen zur Hemmung der viralen Replikation in einem Säugetier. Derartige Verfahren eignen sich zur Therapie oder Prophylaxe einer HCV-Krankheit. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff umfasst, können derartige Verfahren zusätzlich die Stufe der Verabreichung eines Mittels an das Säugetier umfassen, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist: immunomodulatorische Mittel, antivirale Mittel, HCV-Protease-Inhibitoren oder Inhibitoren anderer Ziele des HCV-Lebenszyklus. Derartige zusätzliche Mittel können dem Säugetier vor, gleichzeitig oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabfolgt werden.
Die vorstehend aufgeführten Verbindungen können ferner als Laboratoriumsreagentien verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Behandlung oder Verhinderung einer viralen Kontamination von Materialien verwendet werden und verringern somit die Gefahr einer viralen Infektion von Laboratoriumspersonal oder medizinischem Personal oder Patienten, die in Kontakt mit derartigen Materialien kommen (z. B. Blut, Gewebe, chirurgische Instrumente und Kleidungsstücke, Laboratoriumsinstrumente und -kleidungsstücke sowie Blutsammelvorrichtungen und Blutmaterialien).
Verfahren
Synthese von P6-P2-Fragmenten
Die P2-P6-Fragmente der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden gemäß einem im Schema I dargelegten Verfahren synthetisiert (wobei PG1 eine Carboxylschutzgruppe und PG2 eine Aminoschutzgruppe bedeuten):
Schema I
Kurz zusammengefasst, P2, P3, P4, P5 und P6 können nach bekannten Peptid-Kupplungstechniken verknüpft werden. Die P2-, P3-, P4-, P5- und P6-Reste können in einer beliebigen Reihenfolge miteinander verknüpft werden, sofern die Endverbindung den Peptiden der Formel I entspricht. Beispielsweise kann P6 mit P5 unter Bildung von P5-P6 verknüpft werden, das dann mit P4-P3-P2 verknüpft wird. Oder P6 kann mit P5-P4-P3 verknüpft werden und anschließend mit einem in geeigneter Weise C-terminal geschützten P2 verknüpft werden.
Im allgemeinen werden Peptide verlängert, indem man die Schutzgruppe der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes entfernt und die ungeschützte Carboxylgruppe der nächsten, in geeigneter Weise N-geschützten Aminosäure durch eine Peptidverknüpfung unter Anwendung der beschriebenen Verfahren ankuppelt. Diese Vorgehensweise zur Schutzgruppenentfernung und Kupplung wird wiederholt, bis die angestrebte Sequenz erhalten worden ist. Diese Kupplung kann mit den als Bestandteilen dienenden Aminosäuren stufenweise durchgeführt werden, wie im Schema I dargestellt ist, oder sie können durch Kondensation von Fragmenten (2 oder mehrere Aminosäuren) oder durch eine Kombination beider Verfahren oder durch eine Festphasen-Peptidsynthese gemäß dem ursprünglich von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Bd. 85 (1963), S. 2149–2154; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) durchgeführt werden.
Eine Kupplung zwischen zwei Aminosäuren, einer Aminosäure und einem Peptid oder zwei Peptidfragmenten kann unter Anwendung herkömmlicher Kupplungsverfahren durchgeführt werden, z. B. durch das Azid-Verfahren, das gemischte Carbonsäure-Carbonsäureanhydrid-Verfahren (Isobutylchlorformiat-Verfahren), das Carbodiimid-Verfahren (Dicyclohexylcarbodiimid-, Diisopropylcarbodiimid- oder wasserlösliches Carbodiimid-Verfahren), das aktive Esterverfahren (p-Nitrophenylester- und N-Hydroxysuccinimidoester-Verfahren), das Woodward-Reagenz-K-Verfahren, das Carbonyldiimidazol-Verfahren, das Verfahren mit Phosphorreagenzien oder das Oxidations-Reduktions-Verfahren. Einige dieser Verfahren (insbesondere das Carbodiimid-Verfahren) können durch Zugabe von 1-Hydroxybenzotriazol verstärkt werden. Diese Kupplungsreaktionen können entweder in Lösung (in flüssiger Phase) oder in fester Phase durchgeführt werden.
Im einzelnen umfasst die Kupplungsstufe die dehydratisierende Kupplung einer freien Carboxylgruppe eines Reaktanten mit der freien Aminogruppe des anderen Reaktanten in Gegenwart eines Kupplungsmittels unter Bildung einer verknüpfenden Amidbindung. Eine Beschreibung von derartigen Kupplungsmitteln findet sich in allgemeinen Handbüchern über die Peptidchemie, z. B. M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2. überarbeitete Auflage, Springer-Verlag, Berlin, Deutschland (1993). Zu Beispielen für geeignete Kupplungsmittel gehören N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Hydroxybenzotriazol in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Ethyl-N'-[(3-dimethylamino)-propyl]-carbodiimid. Ein sehr zweckmäßiges und geeignetes Kupplungsmittel ist das handelsübliche (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphoshat, entweder als solches oder in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol. Ein weiteres sehr zweckmäßiges und geeignetes Kupplungsmittel ist das handelsübliche 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat. Ein weiteres sehr zweckmäßiges und geeignetes Kupplungsmittel ist handelsübliches O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat.
Die Kupplungsreaktion wird in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, Acetonitril oder Dimethylformamid, durchgeführt. Ein Überschuß eines tertiären Amins, z. B. Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin oder N-Methylpyrrolidin, wird zugesetzt, um das Reaktionsgemisch auf einem pH-Wert von etwa 8 zu halten. Die Reaktionstemperatur liegt üblicherweise im Bereich von 0 bis 50°C und die Reaktionszeit üblicherweise im Bereich von 15 Minuten bis 24 Stunden.
Bei Anwendung eines synthetischen Festphasenverfahrens wird die C-terminale Carbonsäure an einen unlöslichen Träger (üblicherweise Polystyrol) gebunden. Diese unlöslichen Träger enthalten eine Gruppe, die mit der Carbonsäure unter Bildung einer Bindung reagieren, die unter den Verlängerungsbedingungen stabil ist, die jedoch später leicht gespalten wird. Zu Beispielen hierfür gehören: Chlor- oder Brommethylharze, Hydroxymethylharze und Aminomethylharze. Zahlreiche dieser Harze sind im Handel erhältlich, wobei die angestrebte C-terminate Aminosäure bereits eingebaut ist. Zusätzlich zu den vorstehenden Verfahren sind weitere Verfahren der Peptidsynthese in folgenden Literaturstellen (die durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden) beschrieben: Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Auflage, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Herausgeber, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Bd. 1, 2, 3, 5 und 9, Academic Press, New York (1980–1987); Bodansky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New York (1984).
Die funktionellen Gruppen der als Bestandteile dienenden Aminosäuren müssen im allgemeinen während der Kupplungsreaktionen geschützt werden, um die Bildung von unerwünschten Bindungen zu vermeiden. Die Schutzgruppen, die verwendet werden können, sind in folgenden Druckschriften (die durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden) aufgeführt: Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) und "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Bd. 3, Academic Press, New York (1981).
Die α-Carboxylgruppe des C-terminalen Restes wird üblicherweise durch einen Ester (PG1) geschützt, der unter Bildung der Carbonsäure gespalten werden kann. Zu Schutzgruppen, die verwendet werden können, gehören: 1) Alkylester, wie Methyl, Trimethylsilylethyl und tert.-Butyl; 2) Aralkylester, wie Benzyl und substituiertes Benzyl; oder 3) Ester, die durch Behandlung mit einer schwachen Base oder durch schwache reduktive Mittel gespalten werden können, wie Trichlorethyl- und Phenacylester.
Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die an die wachsende Peptidkette zu kuppeln ist, muß mit einer Schutzgruppe versehen werden (PG2). Es können beliebige, aus dem Stand der Technik bekannte Schutzgruppen verwendet werden. Zu Beispielen für derartige Gruppen gehören:

1) Acylgruppen, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl und p-Toluolsulfonyl;
2) aromatische Carbamatgruppen, wie Benzyloxycarbonyl (Cbz oder Z) und substituierte Benzyloxycarbonyle, und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc);
3) aliphatische Carbamatgruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), Ethoxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl;
4) cyclische Alkylcarbamatgruppen, wie Cyclopentyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl;
5) Alkylgruppen, wie Triphenylmethyl und Benzyl;
6) Trialkylsilyl, wie Trimethylsilyl; und
7) thiolhaltige Gruppen, wie Phenylthiocarbonyl und Dithiasuccinoyl.

Bei den bevorzugten α-Aminoschutzgruppen handelt es sich entweder um Boc oder Fmoc. Zahlreiche Aminosäurederivate, die in geeigneter Weise für die Peptidsynthese geschützt sind, sind im Handel erhältlich.
Die α-Aminoschutzgruppe des neu addierten Aminosäurerestes wird vor der Kupplung der nächsten Aminosäure abgespalten. Bei Verwendung der Boc-Gruppe handelt es sich bei dem Verfahren der Wahl um die Verwendung von Trifluoressigsäure in Reinsubstanz oder in Dichlormethan oder um die Verwendung von HCl in Dioxan oder Ethylacetat. Das erhaltene Ammoniumsalz wird sodann entweder vor der Kupplung oder in situ mit basischen Lösungen, wie wässrigen Puffern, oder tertiären Aminen in Dichlormethan oder Acetonitril oder Dimethylformamid, neutralisiert. Bei Verwendung der Fmoc-Gruppe handelt es sich bei den Reagentien der Wahl um Piperidin oder substituiertes Piperidin in Dimethylformamid, wobei aber beliebige sekundäre Amine verwendet werden können. Die Schutzgruppenentfernung wird bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur (RT) durchgeführt.
Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten müssen während der Herstellung des Peptids unter Verwendung beliebiger der vorerwähnten Gruppen geschützt werden. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die Auswahl und die Verwendung geeigneter Schutzgruppen für diese funktionellen Seitenketten von der Aminosäure und dem Vorliegen von anderen Schutzgruppen im Peptid abhängen. Die Auswahl derartiger Schutzgruppen ist insofern wichtig, als die Gruppe während der Schutzgruppeneinführung und Kupplung der α-Aminogruppe nicht entfernt werden darf.
Beispielsweise eignet sich bei Verwendung von Boc als α-Aminoschutzgruppe p-Toluolsulfonyl (Tosyl) zum Schutz der Aminoseitenkette von Aminosäuren, wie Lys und Arg; Acetamidomethyl-, Benzyl (Bn)- oder tert.-Butylsulfonyl-Reste können zum Schutz der sulfidhaltigen Seitenkette von Cystein verwendet werden; Benzyl (Bn) ether können zum Schutz der hydroxylhaltigen Seitenketten von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin verwendet werden; und Benzylester können zum Schutz der carboxylhaltigen Seitenketten von Asparaginsäure und Glutaminsäure verwendet werden.
Wenn Fmoc für den Schutz der α-Aminogruppe verwendet wird, sind im allgemeinen Schutzgruppen auf der Basis von tert.-Butyl akzeptabel. Beispielsweise können Boc für Lysin und Arginin, tert.-Butylether für Serin, Threonin und Hydroxyprolin sowie tert.-Butylester für Asparaginsäure und Glutaminsäure verwendet werden. Der Triphenylmethyl(Trityl)-Rest kann zum Schutz der sulfidhaltigen Seitenkette von Cystein verwendet werden.
Nachdem die Verlängerung des Peptids beendet ist, werden sämtliche Schutzgruppen entfernt. Bei Anwendung einer Synthese in flüssiger Phase werden die Schutzgruppen auf beliebige Weise entsprechend der durch die Wahl der Schutzgruppen festgelegten Bedingungen entfernt. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Bei Anwendung einer Festphasensynthese wird das Peptid vom Harz gleichzeitig mit der Entfernung der Schutzgruppen abgespalten. Wenn das Boc-Schutzgruppenverfahren bei der Synthese herangezogen wird, stellt die Behandlung mit wasserfreiem HF mit einem Gehalt an Additiven, wie Dimethylsulfid, Anisol, Thioanisol oder p-Cresol, bei 0°C das bevorzugte Verfahren zur Abspaltung des Peptids vom Harz dar. Die Abspaltung des Peptids kann auch durch andere Säurereagenzien, wie Trifluormethansulfonsäure/Trifluoressigsäure-Gemische, erreicht werden. Wenn das Fmoc-Schutzgruppenverfahren herangezogen wird, wird die N-terminale Fmoc-Gruppe mit früher beschriebenen Reagenzien abgespalten. Die übrigen Schutzgruppen und das Peptid werden vom Harz unter Verwendung einer Lösung von Trifluoressigsäure und verschiedenen Additiven, wie Anisol und dergl., gespalten.
Synthese der Verkappungsgruppe B und der P6-, P5-, P4- und P3-Reste
Verschiedene Verkappungsgruppen B werden in das geschützte P6, P5, P4, das gesamte Peptid oder ein beliebiges Peptidsegment mit einem geeigneten Acylchlorid, das entweder handelsüblich ist oder dessen Synthese aus dem Stand der Technik bekannt ist, eingeführt.
Verschiedene P6- bis P3-Reste sind im Handel erhältlich oder lassen sich nach bekannten Verfahren synthetisieren.
Synthese von P2-Resten
1. Synthese von Vorläufern
A) Synthese von Halogenarylmethan-Derivaten
Die Herstellung eines Halogenmethyl-8-chinolins IId wurde gemäß dem Verfahren von K. N. Campbell et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 68 (1946), S. 1844, durchgeführt. Schema 11
(halo = Halogen)
Kurz zusammengefasst, 8-Chinolincarbonsäure IIa wurde in den entsprechenden Alkohol IIc umgewandelt, indem man das entsprechende Säurehalogenid IIb mit einem Reduktionsmittel, wie Lithiumaluminiumhydrid behandelte. Die Behandlung des Alkohols IIc mit der entsprechenden Halogenwasserstoffsäure ergibt das gewünschte Halogenderivat IId. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens wird in Beispiel 1 dargelegt.
2. Synthese von P2
A) Die Synthese eines 4-substituierten Prolins (wobei R₁₇ über ein Kohlenstoffatom an den Ring gebunden ist) (mit der dargestellten Stereochemie)
wird gemäß Schema 111 entsprechend dem von J. Ezquerra et al. (Tetrahedron, Bd. 38 (1993), S. 8665–8678) und von C. Pedregal et al. (Tetrahedron Lett., Bd. 35 (1994), S. 2053–2056) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Schema 111
Kurz zusammengefasst, Boc-Pyroglutaminsäure wird in Form eines Benzylesters geschützt. Die Behandlung mit einer starken Base, wie Lithiumdiisopropylamid und die anschließende Zugabe eines Alkylierungsmittels (Br-R₁₇ oder I-R₁₇) ergibt nach Reduktion des Amids und Entfernung der Esterschutzgruppe die erwünschten Verbindungen IIIe. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens ist in Beispiel 2 dargelegt.
B) Die Synthese von O-alkyliertem 4-(R)-Hydroxyprolin:
kann unter Anwendung verschiedener, nachstehend beschriebener Verfahren durchgeführt werden.
B.1) Wenn R₁₂ die Bedeutung Aralkyl hat, lässt sich das Verfahren gemäß der von E. M. Smith et al. (J. Med. Chem., Bd. 31 (1988), S. 875–885) beschriebenen Vorgehensweise durchführen. Kurz zusammengefasst, handelsübliches Boc-4(R)-Hydroxyprolin wird mit einer Base, wie Natriumhydrid, behandelt, und das erhaltene Alkoxid wird mit einem Alkylierungsmittel (Br-R₁₂ oder I-R₁₂) unter Bildung der gewünschten Verbindungen umgesetzt. Spezielle Ausführungsformen für dieses Verfahren sind in den Beispielen 3 und 4 dargelegt.
B.2) Wenn R₁₂ Aryl bedeutet, lassen sich die Verbindungen über eine Mitsunobu-Reaktion herstellen (Mitsunobu, Synthesis, Januar 1981, S. 1–28; Rano et al., Tet. Lett. Bd. 36 (22) (1995), S. 3779–3792; Krchnak et al., Tet. Lett., Bd. 36 (5) (1995), S. 6193–6196; Richter et al., Tet. Lett., Bd. 35 (27) (1994), S. 4705–4706). Kurz zusammengefasst, handelsüblicher Boc-4(S)-Hydroxyprolinmethylester wird mit dem entsprechenden Arylalkohol oder -thiol in Gegenwart von Triphenylphosphin und Diethylazodicarboxylat (DEAD) behandelt und der erhaltene Ester wird zur Säure hydrolysiert. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens ist in Beispiel 5 dargestellt.
Schema IV
Alternativ kann die Mitsunobu-Reaktion in fester Phase durchgeführt werden (gemäß Darstellung in Schema IV). Der Block mit 96 Vertiefungen des Modell 396-Synthesegeräts ("Advanced ChemTech") wird mit Aliquotmengen der harzgebundenen Verbindung (IVa) versetzt und verschiedene Arylalkohle oder -thiole und entsprechende Reagenzien werden zugegeben. Nach Inkubation werden die einzelnen harzgebundenen Produkte (IVb) gewaschen, getrocknet und vom Harz abgespalten.
B.2.a) Eine Suzuki-Reaktion kann ebenfalls zur weiteren Funktionalisierung des Arylsubstituenten herangezogen werden (Miyaura et al., Synth. Comm. Bd. 11 (1981), S. 513; Sato et al., Chem. Lett., (1989), S. 1405; Watanabe et al., Synlett., (1992), S. 207; Takayuki et al., J. Org. Chem, Bd. 58 (1993), S. 2201; Frenette et al., Tet. Lett., Bd. 35 (49) (1994), S. 9177–9180; Guiles et al., J. Org. Chem, Bd. 61 (1996), S. 5169–5171).
C) Die Synthese von Verbindungen der Formel I, worin Q folgende Bedeutung hat
wobei Z CH bedeutet; R₁ die vorstehend definierte Bedeutung hat und R₁₃ CF₃, CF₂CF₃ oder C(O)NH-R₁₄ bedeutet, wurde gemäß Schema VIII durchgeführt.
Die Synthese der erforderlichen P1-Reste wurde folgendermassen vorgenommen:
i) Für die Synthese von Trifluormethylalkoholen der Formel Vd wurde das Verfahren von J. W. Skiles et al. (J. Med. Chem. Bd. 35 (1992), S. 641–662) gemäß der nachstehenden Darstellung herangezogen: Schema V
wobei R₁ die vorstehende Bedeutung hat.
Kurz zusammengefasst, eine Kondensation von handelsüblichem Trifluoracetaldehyd-ethylhemiacetal Va und dem entsprechenden Nitroalkan liefert den entsprechenden Nitroalkohol Vb. Die Nitrogruppe wird reduziert (vorzugsweise mit Ra-Ni) und als Boc-Derivat Vc zur leichteren Reinigung des Fragments geschützt. Die Behandlung des Boc-Amins mit wasserfreiem HCl liefert das Hydrochloridsalz Vd.
ii) Für die Synthese von Pentafluorethylalkoholen in der Formel VId wurde das von M. R. Angelastro et al. (J. Med. Chem, Bd. 37 (1994), S. 4538–4554) beschriebene Verfahren gemäß der Darstellung in Schema VI herangezogen: Schema VI
wobei R₁ die vorstehend definierte Bedeutung hat.
Kurz zusammengefasst, die Boc-Aminosäure VIa wurde gemäß dem von B. Castro et al. (Synthesis, (1983), S. 676–678) beschriebenen Verfahren in das Weinreb-Amid VIb umgewandelt und mit Lithiumpentafluorethan behandelt. Das erhaltene Pentafluorethylketon VIc wurde reduziert und die Boc-Schutzgruppe mit wasserfreiem HCl entfernt, wodurch man das Hydrochloridsalz des angestrebten Aminoalkohols VId erhielt.
iii) Zur Synthese von Hydroxyamiden der Formel VIIf wurde das Verfahren von Peet et al. (Tet. Lett. (1988), S. 3433) gemäß der Darstellung in Schema VII herangezogen: Schema VII
wobei R₁ die vorstehend definierten Bedeutungen hat.
Kurz zusammengefasst, ergab eine Kondensation zwischen Ethylglyoxylat VIIa und einem Nitroalkan unter basischen Bedingungen den entsprechenden Nitroalkohol VIIb. Die Nitrogruppe wurde reduziert (vorzugsweise mit Ra-Ni) und als Boc-Derivat VIIc geschützt. Durch Verseifung der Estergruppe und anschließende übliche Kupplung mit einem Amin erhielt man das Hydroxyamid VIIe. Die Entfernung der Boc-Schutzgruppe mit wasserfreiem HCl ergab das Hydrochloridsalz des angestrebten Aminohydroxyamids VIIf.
iv) Die Kupplung an P2-6 wurde gemäß der Darstellung in Schema VII durchgeführt:
Schema VIII
a) Das P6-P2-Fragment kann an die freie Aminogruppe des Aminoalkoholderivats VIIIa gemäß dem vorstehenden Schema I unter Bildung des Peptidoalkohols VIIIb gebunden werden.
b) Die funktionelle Alkoholgruppe des Peptidoalkohols VIIIb wird sodann gemäß bekannten und dem Fachmann geläufigen Techniken und Vorgehensweisen oxidiert, z. B. durch Swern-Oxidation (T. T. Tidwell, Synthesis, (1990), S. 857–870) oder insbesondere durch Pfitzner-Moffatt-Oxidation (K. E. Pfitzner und J. G. Moffatt, J. Am. Chem. Soc., (1965), S. 5670–5678) und das Dess-Martin-Periodinan-Verfahren (D. B. Dess oder J. C. Martin (J. Org. Chem, Bd. 48 (1983), S. 4155–4156), wodurch man die Verbindungen der Formel I erhält, worin Q eine aktivierte Carbonylgruppe enthält.
D) Die Synthese von Verbindungen der Formel I, worin Q folgende Bedeutung hat:
wobei Z N bedeutet; und R₁₃ NHR₁₄, NR₁₄ R₁₄', CH₂-R₁₄, CHR₁₄ R₁₄' oder O-R₁₄ bedeutet, wobei R₁₄ und R₁ die vorstehend definierten Bedeutungen haben, wurde gemäß Schema X durchgeführt.
i) Für die Synthese der P1-Fragmente mit der Aza-Gruppierung wurde das Verfahren von A. S. Dutta et al. (J. Chem. Soc. Perkin I, (1975), S. 1712) gemäß der folgenden Darstellung eingehalten: Schema IX
wobei R₁ und R₁₄ die vorstehend definierten Bedeutungen haben.
Kurz zusammengefasst, handelsübliches Boc-Hydrazin IXa wurde mit einem entsprechenden Aldehyd oder Keton unter Bildung des entsprechenden Hydrazons IXb behandelt. Das Hydrazon wurde reduziert (vorzugsweise mit DIBAL), wodurch man das Alkylcarbazat IXc erhielt. Die Behandlung des Alkylcarbazats mit Isocyanaten liefert das entsprechende Azapeptid-Fragment (IXd, wobei z = NH). Eine Behandlung des Alkylcarbazats mit Carbamoylchloriden liefert das entsprechende Azapeptid-Fragment (IXd, wobei z = NR₁₄R₁₄'). Eine Behandlung des Alkylcarbazats mit Chlorformiaten ergibt das Azacarbamat (IXd, wobei z = O), während eine Behandlung mit Säurechloriden die Kohlenstoffanalogen (IXd, wobei z = CH₂) liefert. Alternativ ergibt eine Behandlung des Alkylcarbazats mit Carbonsäuren unter Anwendung üblicher Kupplungsbedingungen das entsprechende Azapeptid-Fragment (IXd, worin z = CHR₁₄' oder CH₂). Schließlich wurde die Boc-Schutzgruppe mit wasserfreiem HCl unter Bildung der angestrebten Azaderivate IXe entfernt.
ii) Die Kupplung von P2-P6 wurde gemäß dem Schema X durchgeführt: Schema X
wobei z die Bedeutung O, NH, CH₂, CHR₁₄', oder NR₁₄' hat.
Das P6-P2-Fragment kann mit der freien Aminogruppe des Derivats Xa gemäß den Angaben in Schema I unter Bildung der Azaderivate der Formel I, wobei Z die Bedeutung N hat, verknüpft werden.
E) Zur Synthese von Verbindungen der Formel I, wobei Q die folgende Bedeutung hat
wobei R₁₅ und R₁₆ die vorstehend definierten Bedeutungen haben, wurde das Verfahren von J. Oleksyszyn et al. (Synthesis, (1979), S. 985–986) gemäß Schema XI herangezogen. Schema XI
wobei R₁ die vorstehend definiert Bedeutung hat.
Kurz zusammengefasst, eine zweistufige Synthese des Diphenylesters wurde durch Kondensation eines geeigneten Aldehyds XIa, von Benzylcarbamat XIb und Triphenylphosphit in Gegenwart von Essigsäure durchgeführt. Durch Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe von XIc unter Verwendung von HBr/AcOH erhielt man das angestrebte Hydrobromidsalz XId.
Das P6-P2-Fragment kann mit der freien Aminogruppe des Phosphonatderivats der Formel XId gemäß den Angaben in Schema I verknüpft werden, wodurch man das Phosphonopeptid der Formel I erhält, wobei Q einen Phosphonatrest bedeutet.
Die folgenden Beispiele dienen zur ausführlicheren Beschreibung der Erfindung. Diese Beispiele, die derzeit als beste Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung angesehen werden, dienen lediglich der Erläuterung und beschränken die Erfindung in keiner Weise.
Beispiele
Nachstehend wird die Erfindung durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele näher erläutert.
Temperaturen werden in Grad Celsius (°C) angegeben. Die Prozentangaben für Lösungen geben das Verhältnis von Gewicht zu Volumen wieder und Verhältnisangaben für Lösungen ergeben das Verhältnis von Volumen zu Volumen wieder, sofern nichts anderes angegeben ist. Kernmagnetische Resonanzspektren (NMR-Spektren) wurden an einem Bruker 400 MHz-Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen (δ) sind in Teile pro Million (ppm) angegeben. Eine Flash-Chromatographie wurde an Kieselgel (SiO₂) gemäß der Still-Flash-Chromatographietechnik durchgeführt (W. C. Still et al., J. Org. Chem., Bd. 43, (1978), S. 2923).
Zu den Abkürzungen, die in den Beispielen verwendet werden, gehören folgende Abkürzungen:
Bn: Benzyl; Boc: tert.-Butyloxycarbonyl {Me₃COC(O)}; BSA: Rinderserumalbumin; CHAPS: 3-((3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1- propansulfonat; DBU: 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en; CH₂Cl₂ = DCM: Methylenchlorid; DIAD: Diisopropylazodicarboxylat; DIPEA: Diisopropylethylamin; DMAP: Dimethylaminopyridin; DCC: 1,3-Dicyclohexyl-carbodiimid; DME: 1,2-Dimethoxyethan; DMF: Dimethylformamid; DMSO: Dimethylsulfoxid; DTT: Dithiothreit oder Threo-1,4-dimercapto-2,3-butandiol; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure; Et: Ethyl; EtOH: Ethanol; EtOAc: Ethylacetat; Et₂O: Diethylether; HPLC: Hochleistungs-Flüssigchromatograpie; MS: Massenspektrometrie; (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionisation-Time of Flight, FAB: Fast Atom Bombardment); LAH: Lithiumaluminumhydrid; Me. Methyl; MeOH: Methanol; MES: (2-{N-Morpholino}-ethan-sulfonsäure); NaHMDS: Natrium-bis-(trimethylsilyl)-amid; NMM: N-Methylmorpholin; NMP: N-Methylpyrrolidin; Pr: Propyl; Succ: 4-Hydroxy-1,4-dioxobutyl; PNA: 4-Nitrophenylamino- oder p-Nitroanalid; TBAF: Tetra-n-butylammoniumfluorid; TCEP: Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid; TFA: Trifluoressigsäure; THF: Tetrahydrofuran; TIS: Triisopropylsilan; TLC: Dünnschichtchromatographie; TMSE: Trimethylsilylethyl; Tris/HCl: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid.
Beispiel 1 Synthese von Brommethyl-8-chinolin (1)
Handelsübliche 8-Chinolincarbonsäure (2,5 g, 14,4 mmol) wurde zu reinem Thionylchlorid (10 ml, 144 mmol) gegeben. Dieses Gemisch wurde 1 Stunde auf 80°C erwärmt, wonach überschüssiges Thionylchlorid unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Der erhaltene braunstichige Feststfoff wurde mit absolutem EtOH (15 ml) versetzt. Nach 1-stündigem Erwärmen auf 80°C wurde das Gemisch unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit EtOAc und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt ein braunstichiges Öl, (2,8 g). Dieses Material (etwa 14,4 mmol) wurde tropfenweise innerhalb von 35 Minuten zu einer LAH (0,76 g, 20,2 mmol)/Et₂O-Suspension, die auf –60°C gekühlt war, gegeben. Sodann wurde das Reaktionsgemisch langsam innerhalb von 1,5 Stunden auf –35°C erwärmt, bevor die Umsetzung vollständig war. Sodann wurde das Reaktionsgemisch langsam innerhalb von 30 Minuten mit MgSO₄ × 10H₂O und anschließend mit feuchtem THF versetzt. Das Gemisch wurde mit Et₂O und 10-prozentiger wässriger NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt einen gelbstichigen Feststoff (2,31 g, 80% über 2 Stufen), der dem Alkohol entsprach. Der Alkohol (2,3 g, 11,44 mmol) wurde in AcOH/HBr (20 ml, 30-prozentige Lösung, Fa. Aldrich) gelöst und 2,5 Stunden auf 70°C erwärmt. Sodann wurde das Gemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, mit EtOAc (100 ml) und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Nach Trocknen (MgSO₄), Filtrieren und Einengen erhielt man die angestrebte Verbindung (1) in Form eines braunstichigen Feststoffes (2,54 g, 100%)
Beispiel 2 Synthese von Boc-4(R)-(3-phenylpropyl)-prolin (2d)
a) Synthese der Verbindung 2b
Eine Lösung von Boc-Pyroglutaminsäurebenzylester (2a) (hergestellt gemäß A. L. Johnson et al., J. Med. Chem., Bd. 28 (1985), S. 1596–1602) (500 mg, 1,57 mmol) in THF (10 ml) wurde bei –78°C langsam mit Lithiumhexamethyldisilylazid (1,72 ml, 1 M Lösung in THF) versetzt. Nach 1-stüdigem Rühren bei –78°C wurde Cinnamylbromid (278 μl, 1,88 mmol) zugegeben. Der Rührvorgang wurde weitere 2 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit gesättiger Ammoniumchloridlösung versetzt und mit Ethylether (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie (8 : 2 Hexan : Ethylacetat) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 2b in Form eines gebrochen weissen Feststoffes (367 mg, Ausbeute 54%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,35–7,19 (m, 10H), 6,43 (d, J = 15 Hz, 1H), 6,11 (ddd, J = 15, J' = J'' = 8 Hz, 1H), 5,26 (d, J = 16 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 16 Hz, 1H), 4,59 (dd, J = 9,5, J' = 2 Hz, 1H), 2,83–2,70 (m, 2H), 2,41–2,34 (m, 1H), 2,22–2,16 (m, 1H), 2,10–2,02 (m, 1H) 1,42 (s, 9H).
b) Synthese der Verbindung 2b
Bei –78°C wurde Lithiumtriethylborhydrid (1 M Lösung in THF, 1,01 ml, 1,01 mmol) unter einer Stickstoffatmosphäre zu einer Lösung der Verbindung 2b (367 mg, 0,843 mmol) in THF (5 ml) gegeben. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit gesättiger wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ml) versetzt und auf 0°C erwärmt. Sodann wurde 30 prozentiges H₂O₂ (5 Tropfen) zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten bei 0°C gerührt. Die organischen flüchtigen Bestandteile wurden unter Vakuum entfernt und die wässrige Phase wurde mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Eine kalte (–78°C) Lösung des Rückstands und von Triethylsilan (134 μl, 0,843 mmol) in CH₂Cl₂ (3 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre tropfenweise mit Bortrifluoridetherat (118 μl, 0,927 mmol) versetzt. Nach 30 Minuten wurden weiteres Triethylsilan (134 μl) und Bortrifluoridetherat (118 μl) zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei –78°C wurde das Reaktionsgemisch mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ml) versetzt und mit DCM (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt Das rohe Produkt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (8 : 2 Hexan : Ethylacetat) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 2c in Form eines farblosen Öls (140 mg, Ausbeute 40%), ¹H-NMR (CDCl₃) (Hinweis auf die Anwesenheit von 2 Rotameren) δ: 7,34–7,22 (m, 10H), 6,38 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,15–6,08 (m, 1H), 5,29–5,07 (m, 2H), 4,44 (d, J = 7 Hz, 1/3H), 4,33 (d, J = 7 Hz, 2/3H), 3,76 (dd, J = 10,5, J' = 8,5 Hz, 2/3H), 3,69 (dd, J = 10,5, J' = 8,5 Hz, 1/3H), 3,13 (dd, J = 9, J' = 8,5 Hz, 2/3H), 3,05 (dd, J = 9, J' = 8,5 Hz, 1/3H), 2,47–2,40 (m, 1H), 2,35–2,2 (m, 2H) 2,15–1,85 (m, 2H), 1,45 (s, (3/9) 9H), 1,33 (s, (6/9) 9H).
e) Synthese der Verbindung 2d
Eine Lösung der Verbindung 2c (140 mg, 0,332 mmol) in Ethanol (4 ml) wurde mit 10% Palladium-auf-Aktivkohle (30 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wurde entfernt, indem man das Gemisch über einen Millipore-Millex-HV-0,45 μm-Filter leitete. Die klare Lösung wurde eingeengt. Man erhielt die angestrebte Verbindung 2d in Form eines farblosen Öls (115 mg, Quantitative Ausbeute).
¹H-NMR (DMSO-d₆) (Hinweis auf die Anwesenheit von 2 Rotameren): δ 7,28–7,14 (m, 5H), 4,33 (br, s, 1H), 4,06–4,10, (m, 1H), 3,56–3,42 (m, 3H), 2,89–2,79 (m, 1H), 2,53–2,49 (m, 1H, unter DMSO-d₆), 2,24–2,10 (m, 1H), 2,03–1,93 (m, 1H), 1,871,75 (m, 1H), 1,62–1,45 (m, 2H), 1,38 (s, (3/9) 9H), 1,33 (s, (6/9) 9H),
Beispiel 3 Synthese von Boc-4(R)-(Naphthalin-1-ylmethoxy)-prolin (3)
Handelsübliches Boc-4(R)-Hydroxyprolin (5,00 g, 21,6 mmol) wurde in THF (100 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Natriumhydrid (60 prozentige Dispersion in Öl, 1,85 g, 45,4 mmol) wurde portionsweise innerhalb von 10 Minuten zugegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde 1-(Brommethyl)-naphthalin (8,00 g, 36,2 mmol) (hergestellt gemäß E. A. Dixon et al., Can. J. Chem., Bd. 59 (1981), S. 2629–2641) zugegeben und das Gemisch wurde 18 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurde das Gemisch in Wasser (300 ml) gegossen und mit Hexan gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit 10-prozentiger wässriger HCl angesäuert und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (49 : 49 : 2 Hexan : Ethylacetat : Essigsäure) gereinigt. Man erhielt die Titelverbindung in Form eines farblosen Öls (4,51 g, Ausbeute 56%).
¹H-NMR (DMSO-d₆ (Hinweis auf die Anwesenheit von 2 Rotameren): δ 8,05 (m, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,29 (d, J = 14 Hz, 1H), 7,55–7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (br, s, 1H), 4,12 (dd, J = J = 8 Hz, 1H), 3,54–3,42 (m, 2H), 2,45–2,34 (m, 1H), 2,07–1,98 (m, 1H) 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9) 9H).
Beispiel 4 Synthese von Boc-4(R)-(8-Chinolinmethyloxy)-prolin (4)
Boc-4(R)-Hydroxyprolin (1,96 g, 8,5 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) wurde zu einer Suspension von NaH (1,4 g, 60% in Öl, 34 mmol) in THF (100 ml) gegeben. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, wonach Brommethyl-8-chinolin von Beispiel 1 (2,54 g, 11,44 mmol) in THF (30 ml) zugegeben wurde. Sodann wurde das Reaktionsgemisch auf 70°C (5 Stunden) erwärmt, wonach überschüssiges NaH vorsichtig mit feuchtem THF zerstört wurde. Sodann wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt und das erhaltene Material wurde in EtOAc and H₂O gelöst. Die basische wässrige Phase wurde abgetrennt und mit 10-prozentiger wässriger HCl auf den pH-Wert ~5 angesäuert, wonach eine Extraktion mit EtOAc (150 ml) vorgenommen wurde. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt ein braunes Öl. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel: 10% MeOH/CHCl₃) erhielt man die angestrebte Verbindung in Form eines blassgelben Feststoffes (2,73 g, 86%).
HPLC (97,5%); ¹H-NMR (DMSO-d₆) (zeigt die Anwesenheit von Rotamerpopulationen in einem Verhältnis von 6 : 4) δ 12–11,4 (bs, 1H), 8,92 (2 × d, J = 4,14 and 4,14 Hz, 1H), 8,38 (2 × d, J = 8,27 and 8,27 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 7,94 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,63–7,54 (m, 2H), 5,14 (2 × s, 2H), 4,32–4,29 (m, 1H), 4,14–4,07 (m, 1H), 3,52–3,44 (m, 2H), 2,43–2,27 (m, 1H), 2,13–2,04 (m, 1H), 1,36 and 1,34 (2 × s, 9H).
Beispiel 5 Herstellung von Boc-4(R)-(7-Chlorchinolin-4-oxo)-prolin (5)
Handelsüblicher Boc-4(S)-Hydroxyprolinmethylester (500 mg, 2,04 mmol) und 7-Chlor-4-hydroxychinolin (440 mg, 2,45 mmol) wurden bei 0°C in trockenes THF (10 ml) gegeben. Sodann wurden Triphenylphosphin (641 mg, 2,95 mmol) zugesetzt, wonach die langsame Zugabe von DIAD (426 mg, 2,45 mmol) folgte. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch eingeengt, in Ethylacetat aufgenommen und dreimal mit 1 N HCl extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit Na₂CO₃ alkalisch gemacht und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt ein gelbes Öl. Dieses Öl wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt. Man erhielt den Methylester der Verbindung (5) in Form eines weißen Feststoffes. 498 mg, Ausbeute 58%.
Dieser Methylester (400 mg, 0,986 mmol) wurde mit einer 1 M wässrigen Natriumhydroxidlösung (1,7 ml, 1,7 mmol) in Methanol (4 ml), 3 Stunden bei 0°C hydrolysiert. Sodann wurde die Lösung zur Entfernung des Methanols eingeengt und mit 1 M wässriger HCl neutralisiert. Die Suspension wurde zur Trockne eingeengt und in Methanol (20 ml) aufgenommen. Die Salze wurden filtriert und das Filtrat wurde eingeengt. Man erhielt die angestrebte Verbindung (5) in Form eines weißen Feststoffes. 387 mg, quantitative Ausbeute.
¹H-NMR (DMSO-d₆) (etwa 1 : 1-Gemisch von Rotameren) δ 8,74 (d, J = 5 Hz, 1H), 8,13–8,09 (m, 1H), 7,99 und 7,98 (s, 1H), 7,58 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5 Hz, 1H), 5,26–5,20 (m, 1H), 4,10–4,01 (m, 1H), 3,81–3,72 (m, 1H), 3,59 (dd, J = 12, 10 Hz, 1H), 2,41–2,31 (m, 2H), 1,34 and 1,31 (s, 9H).
Beispiel 6
Allgemeines Verfahren für Kupplungsreaktionen an einem festen Träger
Die Synthese wurde an einem parallelen Synthesegerät Modell ACT396 der Firma Advanced ChemTechs^® mit dem Block mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Typischerweise wurden 24 Peptide unter Anwendung von üblichen Festphasentechniken parallel synthetisiert. Das als Ausgangsprodukt verwendete Fmoc-Nva-Wang-Harz und das 1-(Fmoc-Amino)-cyclopropancarbonsäure-Wangharz wurden durch das DCC/DMAP-Kupplungsverfahren hergestellt. (E. Atherton, R. C. Scheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, Practical Approach; IRL Press, Oxford 1989, S. 131–148). Weitere Aminosäuren-Wang-Harze wurden im Handel bezogen.
Die einzelnen Vertiefungen wurden mit 100 mg des Ausgangsharzes (etwa 0,05 mmol) beschickt. Die Harze wurden nacheinander mit 1,5 ml-Portionen NMP (1 ×) und DMF (3 ×) gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch 20-minütige Behandlung mit 1,5 ml einer 25 prozentigen (Vol/Vol.) Lösung von Piperidin in DMF entfernt. Die Harze wurden mit 1,5 ml-Portionen DMF (4 ×), MeOH (3 ×) und DMF (3 ×) gewaschen. Die Kupplung wurde in DMF (350 μl) unter Verwendung von 400 μl (0,2 mmol) einer 0,5 M-Lösung von Fmoc-Aminosäure/HOBt-hydrat in DMF, 400 μl (0,4 mmol) einer 0,5 M-Lösung von DIPEA in DMF und 400 μl (0,2 mmol) einer 0,5 M-Lösung von TBTU in DMF durchgeführt. Nach 1-stündigem Schütteln wurden die Vertiefungen entleert. Die Harze wurden mit 1,5 ml DMF gewaschen und anschließend wurde die Kupplung unter den gleichen Bedingungen wiederholt. Sodann wurden die Harze auf die vorstehend angegebene Weise gewaschen und der Zyklus wurde mit der nächsten Aminosäure wiederholt.
Die Verkappungsgruppen wurden auf zwei Wegen eingeführt:

1. In Form einer Carbonsäure unter Anwendung des vorstehenden Verfahrens (z. B. Essigsäure) oder
2. als Acylierungsmittel, wie ein Anhydrid oder ein Säurechlorid.

Das folgende Beispiel erläutert die Verkappung mit Bernsteinsäureanhydrid: nach Fmoc-Schutzgruppenentfernung und anschließendem Waschvorgang wurde DMF (350 μl) zugegeben, wonach die Zugabe von jeweils 400 μl einer DMF-Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (0,5 M, 0,2 mmol) und DIPEA (1,0 M, 0,4 mmol) folgte. Die Harze wurden 2 Stunden gerührt und eine erneute Kupplungsstufe wurde durchgeführt.
Am Ende der Synthese wurde das Harz mit 1,5 ml-Portionen DCM (3 ×), MeOH (3 ×) und DCM (3 ×) gewaschen und 2 Stunden unter Vakuum getrocknet.
Die Abspaltung vom Harz und die gleichzeitige Seitenketten-Schutzgruppenentfernung wurden durch Zugabe von 1,5 ml eines Gemisches aus TFA, H₂O, DTT und TIS (92,5 : 2,5 : 2,5 : 2,5) durchgeführt. Nach 2,5-stündigem Schütteln wurde das Harz abfiltriert und mit 1,5 ml DCM gewaschen. Die Filtrate wurden vereinigt und durch Vakuumzentrifugation eingeengt.
Die einzelnen Verbindungen wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC und unter Verwendung einer C18-Säule (22 mm × 500 mm) gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie identifiziert, vereinigt und lyophilisiert.
Beispiel 7
Allgemeines Verfahren für Kupplungsreaktionen in Lösung (vergl. auch R. Knorr et al., Tetrahedron Letters, Bd. 30 (1989), S. 1927)
Die Reaktanten, d. h. ein freies Amin (1 Äq.) (oder dessen Hydrochloridsalz) und die freie Carbonsäure (1 Äq.) wurden in CH₂Cl₂, CH₃CN oder DMF gelöst. Unter einer Stickstoffatmosphäre wurden vier Äquivalente N-Methylmorpholin und 1,05 Äquivalente des Kupplungsmittels zu der gerührten Lösung gegeben. Nach 20 Minuten wurde 1 Äquivalent des zweiten Reaktanten, d. h. eine freie Carbonsäure zugegeben. (Zweckmäßige und wirksame Kupplungsreagenzien für diesen Zweck sind (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphiumhexafluorphosphat (HOBT) oder vorzugsweise 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (TBTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-y1)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (HATU)). Die Umsetzung wurde durch TLC überwacht. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer 10-prozentigen wässrigen Citronensäurelösung, gesättigter, wässriger NaHCO₃-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Wenn der Rückstand gereinigt wurde, erfolgte dies durch Flash-Chromatographie auf die vorstehend definierte Weise.
Beispiel 8 Synthese des Segments Ac-Chg-Chg-Pro-(4(R)-Naphthalin-1-ylmethoxy)-OH (8g)
Die Verbindung 8a (4,45 g, 11,98 mmol) wurde in wasserfreiem CH₃CN (60 ml) gelöst. DBU (2,2 ml, 14,38 mmol) und Allylbromid (1,1 ml, 13,18 mmol) wurden nacheinander zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Gemisch eingeengt. Das erhaltene Öl wurde mit EtOAc und Wasser und nacheinander mit Wasser (2mal) und Kochsalzlösung (1mal) gewaschen. Die EtOAc-Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das gelbe Öl wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan : EtOAc: 90 : 10–85 : 15) gereinigt. Man erhielt das Produkt 8b in Form eines gelben Öls (2, 4,17 g Ausbeute 85%).
MS (FAB) 412 MH⁺.
¹H-NMR (CDCl₃), Gemische von Rotameren etwa 1 : 2, δ (d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,55–7,41 (m, 4H), 5,95–5,85 (m, 1H), 5,34–5,21 (m, 2H), 5,03–4,88 (m, 2H), 4,70–4,56 (m, 2H), 4,48 & 4,39 (t, J = 8, 15 Hz, 1H), 4,28–4,23 (m, 1H), 3,81–3,55 (m, 2H), 2,46–2,36 (m, 1H), 2,13–2,05 (m, 1H), 1,44 & 1,41 (s, 9H),
Die Verbidung 8b (2,08 g, 5,05 mmol) wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 N HCl/Dioxan behandelt. Durch Eindampfen zur Trockne erhielt man das entsprechende Amin-HCl in Form eines Öls. Das Amin-HCl 8c wurde in wasserfreiem DCM (25 ml) gelöst und nacheinander mit NMM (2,2 ml, 20,22 mmol), Boc-Chg-OH·H₂O (1,53 g, 5,56 mmol) und TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) versetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, anschließend mit EtOAc verdünnt und nacheinander mit 10-prozentiger wässriger Citronensäure (2 ×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×), und Kochsalzlösung (1 ×) gewaschen. Die EtOAc-Schicht wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhielt das rohe Produkt 8d in Form eines gelbstichig-weißen Schaums (etwa 2,78 g, Ausbeute 100%)
MS (FAB) 551,4 MH⁺. ¹H-NMR CDCl₃) δ 8,03 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,86 (b d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,56–7,40 (m, 4H), 5,92–5,85 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,22 (dd, J = 1, 10 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,67–4,60 (m, 3H), 4,31–4,27 (m, 2H), 4,16 (b d, J = 11 Hz, 1H), 3,71 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,47–2,41 (m, 1H), 2,08–1,99 (m, 1H), 1,85–1,63 (m, 5H), 1,44–1,40 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,28–1,00 (m, 5H).
Das rohe Dipeptid 8d (etwa 5,05 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (25 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 8c behandelt. Das rohe Hydrochloridesalz wurde an Boc-Chg-OH·H₂O (1,53 g, 5,55 mmol) mit NMM (2,22 ml, 20,22 mmol) und TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) in DCM (25 ml) gemäß den Angaben zu Verbindung VIIId gekuppelt. Man erhielt das rohe Tripeptid in Form eines gelben ölartigen Schaums. Das rohe Material wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan : EtOAc, 80 : 20–75 : 25) gereinigt. Man erhielt das Tripeptid 8e in Form eines weißen Schaums (2,75 g, Ausbeute über 2 Stufen 79%).
MS (FAB) 690,5 MH⁺. ¹H-NMR (CDCl₃), vorzugsweise ein Rotameres, δ 8,06 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,57–7,40 (m, 4H), 6,41 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,92–5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,98 (b d, J = 7Hz, 1H), 4,93 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,63–4,58 (m, 4H), 4,29–4,25 (m, 1H), 4,10–4,07 (m, 1H), 3,90–3,84 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,48–2,40 (m, 1H), 2,07–1,99 (m, 1H), 1,83–1,55 (m, 12H), 1,43 (s, 9H), 1,23–0,89 (m, 10H).
Das Tripeptid 8e (2,75 g, 3,99 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (20 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 8c behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde in wasserfreiem DCM (20 ml) gelöst. NMM (1,75 ml, 15,94 mmol) und Essigsäureanhydrid (752 μl, 7,97 mmol) wurden nacheinander zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit EtOAc verdünnt. Die organische Phase wurde nacheinander mit 10-prozentiger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×) und Kochsalzlösung (1 ×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhielt das rohe Tripeptid 8f in Form eines weißen Schaums (2,48 g, Ausbeute 98%).
MS (FAB) 632,4 MH⁺¹. ¹H-NMR (CDCl₃), vorzugsweise ein Rotameres, δ 8,06 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,58–7,40 (m, 4H), 6,36 (d, J = 9 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,94–5,83 (m, 1H), 5,34–5,28 (m, 1H), 5,25–5,21 (m, 1H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,64–4,57 (m, 4H), 4,30–4,23 (m, 2H), 4,12–4,08 (m, 1H), 3,73 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,49–2,42 (m, 1H), 2,08–2,01 (m, 1H), 1,99 (S, 3H), 1,85–1,53 (m, 11H), 1,25–0,88 (m, 11H).
Das rohe Tripeptid 8f (2,48 g, 3,93 mmol) wurde in einem wasserfreien Gemisch aus CH₃CN : DCM (20 ml) gelöst. Triphenylphosphin (53,5 mg, 0,200 mmol) und Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium(0)-Katalysator (117,9 mg, 0,102 mmol) wurden nacheinander zugegeben, wonach die Zugabe von Pyrrolidin (353,9 μl, 4,24 mmol) folgte. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc und 10-prozentiger wässriger Citronensäure gelöst und sodann zweimal mit 10-prozentiger wässriger Citronensäure, Wasser (2 ×), und Kochsalzlösung (1 ×) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft. Das rohe Produkt wurde in Et₂O : DCM (85 : 15) verrieben. Nach Filtration erhielt man das Tripeptid 8g in Form eines weißen Feststoffes (2,09 g, Ausbeute 90%).
MS (FAB) 592,4 MH⁺ 614,3 (M + Na)⁺. ¹H-NMR (CDCl₃), vorzugsweise ein Rotameres, δ 8,08 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,93 (b d, J = 9 Hz, 1H), 7,88 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,57–7,41 (m, 4H), 6,47 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,73 (t, J = 9,5, 19 Hz, 1H), 4,44–4,35 (m, 2H), 4,26 (b s, 1H), 4,19 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,47 (b dd, J = 7,5, 13,5 Hz, 1H), 2,20–2,11 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,88–1,41 (m, 11H), 1,30–0,80 (11H).
Beispiel 9 Synthese des Segments: Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-Naphthalin-1-ylmethoxy)-OH (9e)
Die Verbindung 9a (2,89 g, 7,02 mmol) wurde gemäß den Angaben für Verbindung 8c mit 4 N HCl/Dioxan (30 ml) behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde an Boc-Val-OH (1,53 g, 7,73 mmol) mit NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) und TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) in DCM (35 ml) während 3,5 Stunden gemäß den Angaben für Verbindung 3 gekuppelt. Man erhielt das rohe Dipeptid 9b in Form eines elfenbeinfarbenen ölartigen Schaums (etwa 3,60 g, Ausbeute 100%).
MS (FAB) 509,3, MH^– 511,3 MH⁺ 533,2 (M + Na)⁺. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,04 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 7 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,56–7,40 (m, 4H), 5,93–5,85 (m, 1H), 5,34–5,28 (m, 1H), 5,24–5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,67–4,60 (m, 3H), 4,31–4,26 (m, 2H), 4,11–4,09 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,48–2,41 (m, 1H), 2,07–1,99 (m, 1H), 1,44–1,36 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,01 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H).
Das rohe Dipeptid 9b (etwa 7,02 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (30 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 7c behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde an Boc-Chg-OH H₂O (2,13 g, 7,73 mmol) mit NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) und TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) in CH₂Cl₂ (35 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 3 gekuppelt. Man erhielt das rohe Tripeptid 9c in Form eines elfenbeinfarbenen Schaums (etwa 4,6 g, Ausbeute 100%).
MS (FAB) 648,5, MH^– 672,4 (M + Na)⁺. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,06 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,82 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,57–7,40 (m, 4H), 6,46 (b d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,94–5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H), 5,03 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,00–4,97 (m, 1H), 4,93 (d, J =, 12 Hz, 1H), 4,63–4,59 (m, 4H), 4,29–4,27 (m, 1H), 4,10–4,07 (m, 1H), 3,92–3,86 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 5, 11 Hz, 1H), 2,48–2,41 (m, 1H), 2,10–1,99 (m, 1H), 1,76–1,57 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,20–0,92 (m, 6H), 1,00 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H).
Das rohe Tripeptid 9c (etwa 7,02 mmol) wurde gemäß den Angaben für Verbindung 8c mit 4 N HCl/Dioxan (30 ml) behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde ferner mit Essigsäureanhydrid (1,33 ml, 14,05 mmol) und NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) in CH₂Cl₂ (35 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 8f behandelt. Das rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel: Hexan : EtOAc 30 : 70) gereinigt. Man erhielt das acetylierte geschützte Tripeptid 9d in Form eines weißen Schaums (3,39 g, Ausbeute über 3 Stufen 81%).
MS (FAB) 590,3 MH^– 592,4 MH⁺ 614,4 (M + Na)⁺. ¹H-NMR (CDCl₃), vorzugsweise ein Rotameres, δ 8,06 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,88 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,58–7,41 (m, 4H), 6,37 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,94–5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,24 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,66–4,57 (m, 4H), 4,314,22 (m, 2H), 4,11–4,05 (m, 1H), 3,73 (dd, J = 4,5, 11 Hz, 1H), 2,50–2,43 (m, 1H), 2,09–2,01 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,68–1,55 (m, 5H), 1,15–0,89 (m, 6H), 0,99 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,91 (d, J = 7 Hz, 3H).
Das acetylierte Tripeptid 9d (3,39 g, 5,73 mmol) wurde einer Schutzgruppenentfernung mit Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium(0)-Katalysator (172,1 mg, 0,149 mmol) mit Triphenylphosphin (78,1 mg, 0,298 mmol) und Pyrrolidin (516 μl, 6,19 mmol) in einem 1 : 1-Gemisch aus wasserfreiem CH₃CN : DCM (30 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 8g unterzogen. Das rohe hellgelbe Schaumprodukt wurde in Et₂O : DCM (85 : 15) verrieben. Nach Filtration erhielt man das Tripeptid 9e in Form eines gebrochen weißen Feststoffes (3,0 g, Ausbeute 95%).
MS (FAB) 550,3 MH^–. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,08 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,04 (b d, J = 9 Hz, 1H), 7,88 (b d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,58–7,37 (m, 5H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 9,5, 19,5 Hz, 1H), 4,46–4,37 (m, 2H), 4,27 (b s, 1H), 4,17 (d, J = 11 Hz, 1H), 3,74 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,49 (b dd, J = 7,5, 13 Hz, 1H), 2,17–2,09 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 2,03–1,94 (m, 1H), 1,79 (b d, J = 12,5 Hz, 1H), 1,62–1,43 (m, 5H), 1,08–0,85 (m, 5H), 1,00 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 7 Hz, 3H).
Beispiel 10
Synthese des Pentapeptids 10h
Die Synthese wurde folgendermassen durchgeführt:
a) Synthese der Verbindung 10b
Eine Lösung von handelüblichem Boc-4(R)-Benzyloxyprolin (10a) (20,0 g, 62,2 mmol) in Acetonitril (250 ml) wurde bei 0°C nachaneinander mit DBU (10,3 ml, 68,87 mmol) und Allylbromid (6,0 ml, 69,3 mmol) behandelt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Acetonitril abgedampft und der Rückstand in EtOAc gelöst. Das Gemisch wurde nacheinander mit 10-prozentiger wässriger Citronensäure (2 ×), Wasser, gesättiger wässriger NaHCO₃-Lösung, Wasser (2 ×) und Kochsalzlösung gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt den angestrebten Ester 10b (21,84 g, 60,42 mmol, Ausbeute 97%) in Form eines farblosen Öls.
b) Synthese der Verbindung 10c
Der Allylester 10b (21,84 g, 60,42 mmol) wurde 30 Minuten mit einer 4 N HCl-Lösung in Dioxan (453 ml, 1812,0 mmol) behandelt, bevor er unter Vakuum eingeengt wurde. Das Amin-Hydrochlorid wurde den in Beispiel 3 beschriebenen Reaktionsbedingungen unterworfen. Das rohe Hydrochloridsalz wurde mit Boc-Val-OH (13,13 g, 60,43 mmol), NMM (26,6 ml, 241,93 mmol) und TBTU (23,3 g, 72,56 mmol) in CH₂Cl₂ (300 ml) vereinigt. Sodann wurde das Reaktionsgemsich 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und nacheinander mit 10-prozentiger wässriger Citronensäurelösung (2 ×), Wasser, gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×) und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt das rohe Dipeptid 10c (30,23 g).
MS (FAB) 461 (MH⁺). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,36–7,28 (m, 5H), 5,91–5,84 (m, 1H), 5,35–5,21 (m, 2H), 5,19 (bs, 1H), 4,66–4,62 (m, 3H), 4,56 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,28–4,24 (m, 2H), 4,04 (bd, J = 11,1 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 4,5, 11,1 Hz, 1H), 2,25–2,42 (m, 1H), 2,081,98 (m, 1H), 1,45–1,40 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,01 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,7 Hz, 3H).
c) Synthese der Verbindung 10d
Das rohe Dipeptid 10c (etwa 60 mmol) wurde mit einer 4 N-Lösung von HCl in Dioxan (453 ml) behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde mit Boc-Ile-OH (14,0 g, 60,5 mmol), TBTU (23,3 g, 72,6 mmol) und NMM (26,6 ml, 241,9 mmol, 4,0 Äq,) in CH₂Cl₂ (300 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 10c behandelt. Man erhielt das rohe Tripeptid 10d. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie (unter Verwendung eines Gemisches aus 30% EtOAc in Hexan) erhielt man die angestrebte Verbindung 10d (25,61 g, 44,64 mmol, Ausbeute 72%, bezogen auf die Verbindung 10a).
MS (FAB) 574 (MH⁺); ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,37–7,28 (m, 5H), 6,44 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,955,84 (m, 1H), 5,35–5,23 (m, 2H), 5,99 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,65–4,47 (m, 3H), 4,56 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,27–4,21 (m, 1H), 4,03 (bd, J = 10,8 Hz, 1H), 3,97–3,88 (m, 1H), 3,71 (dd, J = 4,1 Hz, J = 10,8 Hz, 1H), 2,49–2,41 (m, 1H), 2,122,00 (m, 2H), 1,85–1,74 (m, 1H), 1,55–1,40 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,16–1,04 (m, 1H), 1,00 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,89–0,82 (m, 6H)
d) Synthese der Verbindung 10e
Das Tripeptid 10d (25,60 g; 44,62 mmol) wurde mit einer 4 N-Lösung von HCl in Dioxan (30 min) behandelt und anschließend unter Vakuum eingeengt. Man erhielt 22,64 g des Hydrochloridsalzes. Das Hydrochloridsalz (14,97 g, 29,35 mmol) wurde mit Boc-(D)Glu(OTMSE)-OH (10,2 g, 29,35 mmol), TBTU (11,30 g, 35,23 mmol) und NMM (11,30 g, 35,23 mmol) in CH₂Cl₂ (150 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 10c behandelt. Die Verbindung 10e wurde in Form eines gebrochen weißen Schaums erhalten (23,6 g). MS (FAB) 803,5 (MH⁺). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,34–7,28 (m, 5H), 6,74 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 8,90 Hz, 1H), 5,93–5,86 (m, 1H), 5,44–5,36 (m, 1H), 5,35–5,22 (m, 2H), 4,64–4,48 (m, 6H), 4,27–4,15 (m, 4H), 4,02 (d, J = 11,13 Hz, 1H), 3,71 (dd, J = 11,13, 4,45 Hz, 2H), 2,49–2,41 (m, 2H), 2,40–2,34 (m, 1H), 2,18–2,00 (m, 3H), 2,96–1,71 (m, 2H), 1,50–1,40 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,15–1,04 (m, 1H), 1,02–0,95 (m, 1H), 0,97 (d, J = 8,27 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 7,00 Hz, 3H), 0,87–0,82 (m, 1H), 0,84 (d, J = 6,67 Hz, 6H), 0,04 (s, 9H).
e) Synthese der Verbindung 10f
Das rohe Tetrapeptid 10e (etwa 28,91 mmol) wurde mit einer 4 N-Lösung von HCl in Dioxan (150 ml) 30 Minuten behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz combined wurde mit Boc-Asp(OTMSE)-OH (10,15 g, 30,44 mmol), NMM (12,7 ml, 115,6 mmol), und TBTU (11,14 g, 34,70 mmol) in CH₂Cl₂ (150 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 10c vereinigt. Das Pentapeptid 10f wurde in Form eines hellgelben Schaums (etwa 29,5 g) erhalten.
MS (FAB) 1018 (MH⁺). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,36–7,28 (m, 6H), 6,78 (d, J = 8,90 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 8,58 Hz, 1H), 6,22 (d, J = 7,94 Hz, 1H), 5,93–5,83 (m, 1H), 5,33–5,21 (m, 2H), 4,62–4,57 (m, 6H), 4,49–4,36 (m, 2H), 4,30 (dd, J = 8,90, 6,35 Hz, 1H), 4,23–4,14 (m, 5H), 3,72 (dd, J = 11,13, 4,77 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 16,85, 6,36 Hz, 1H), 2,79 (dd, J = 16,85, 6,36 Hz, 1H), 2,48–2,27 (m, 3H), 2,21–1,94 (m, 5H), 1,46–1,42 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,17–1,07 (m, 1H), 1,00–0,86 (m, 4H), 0,99 (d, J = 6,68 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,68 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 6,67 Hz, 6H), 0,04 (s, 9H), 0,02 (s, 9H).
f) Synthese der Verbindung 10g
Das Boc-Pentapeptid 10f (etwa 28,91 mmol) wurde 30 Minuten in einer 4 N-Lösung von HCl in Dioxan (150 ml) behandelt und anschließend unter Vakuum eingeengt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde in wasserfreiem DMF (150 ml) gelöst und sodann nacheinander mit Pyridin (51,4 ml, 636,2 mmol) und Essigsäureanhydrid (51,6 ml, 546,5 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in Kochsalzlösung gegossen und mit EtOAc (3 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden nacheinander mit 10-prozentiger wässriger Citronensäurelösung (2 ×), gesättiger NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser (2 ×) und Kochsalzlösung (1 ×) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Öl/Schaum-Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan : EtOAc 4 :6) gereinigt. Man erhielt das acetylierte Pentapeptid 10g in Form eines weißen amorphen Feststoffes (17,56 g, Ausbeute 63%, bezogen auf die Verbindung 10d).
MS (FAB) 960,7 (MH⁺) 982,9 (MNa⁺). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,72 (d, J = 9,22 Hz, 1H), 7,35–7,28 (m, 6H), 7,12 (d, J = 9,54 Hz, 1H) 6,63 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 5,91–5,81 (m, 1H), 5,325,22 (m, 2H), 5,20–4,96 (m, 1H), 4,68–4,54 (m, 5H), 4,49–4,36 (m, 3H), 4,28–4,20 (m, 3H), 4,19–4,12 (m, 2H), 3,74 (dd, J = 11,76, 5,40 Hz, 2H), 2,93 (dd, J = 17,48, 4,45 Hz, 1H), 2,81 (dd, J = 17,49, 6,36 Hz, 1H), 2,47–2,39 (m, 2H), 2,33–2,24 (m, 1H), 2,141,95 (m, 5H), 2,03 (s, 3H), 1,52–1,42 (m, 1H), 1,171,07 (m, 1H), 1,02–0,88 (m, 16H), 0,04 (s, 9H), 0,03 (s, 9H).
g) Synthese der Verbindung 10h
Das Pentapeptid 10g (16,01 g, 16,67 mmol) wurde in wasserfreiem Acetonitril (100 ml) suspendiert und nacheinander mit Triphenylphosphin (227,4 mg, 0,87 mmol) und Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium(0)-Katalysator (501 mg, 0,433 mmol) und sodann mit Pyrrolidin (1,5 ml, 18,01 mmol) behandelt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 4 Stunden mechanisch bei Raumtemperatur gerührt und anschließend unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und nacheinander mit 10-prozentiger wässriger Citronensäurelösung (3 ×), Wasser (3 ×) und Kochsalzlösung (1 ×) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Das rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel 1% HOAc, 2,3% MeOH in CHCl₃) gereinigt. Man erhielt das Pentapeptid 10h in Form eines weißen amorphen Feststoffes (11,45 g, Ausbeute 75%).
MS (FAB) 920 (MH⁺) 942 (MNa⁺), 958,6 (M + K). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,53 (d, J = 8,90 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 7,32 Hz, 1H), 7,35–7,28 (m, 5H), 7,22–7,17 (m, 1H), 6,83 (d, J = 7,31 Hz, 1H) 5,00–4,94 (m, 1H), 4,64–4,61 (m, 2H), 4,53–4,44 (m, 3H), 4,35 (dd, J = 8,26, 6,04 Hz, 1H), 4,28–4,24 (m, 1H), 4,18–4,09 (m, 5H), 3,72 (dd, J = 10,81, 4,14 Hz, 1H), 2,87–2,84 (m, 2H), 2,47–2,41 (m, 2H), 2,34–2,24 (m, 1H) 2,16–1,97 (m, 5H), 2,06 (s, 3H), 1,52–1,42 (m, 1H) 1,17–1,08 (m, 1H), 1,010,84 (m, 16H), 0,04 (s, 9H), 0,03 (s, 9H).
Beispiel 11 Synthese der Verbindung 102 (Tabelle 1)
Die Synthese wurde folgendermaßen durchgeführt:
a) Synthese der Verbindung 11b
Eine kalte (–78°C) Lösung von handelsüblichem Pentafluoroethyliodid (6,4 g, 26,02 mmol) in trockenem Ether (16,7 ml) wurde langsam (10 min) mit einer Kanüle in eine –78°C kalte Lösung von McLi·LiBr in Ether (14,0 ml einer 1,5 M Lösung in Ether, 21,0 mmol) gebracht. Nach weiteren 10 Minuten bei –78°C wurde das Weinreb-Amid 11a (hergestellt aus handelüblichem Boc-Nva-OH gemäß dem Verfahren von B. Castro et al., Synthesis, (1983), S. 676–678) (2,02 g, 7,76 mmol) in Ether (5 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei –78°C und sodann 15 Minuten bei –40°C gerührt. Anschließend wurde eine gesättigte wässrige Lösung von NH₄Cl zugegeben. Das Gemisch wurde 3 mal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde schließlich über MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingeengt.
Das rohe Pentafluorethylketon wurde in einem Gemisch aus THF (38 ml) und MeOH (9,5 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf 0°C gekühlt und mit Natriumborhydrid (323 mg, 8,54 mmol, 1,1 Äq.) versetzt. Nach 15 min wurde Ether zugegeben und das Gemisch wurde mit einer 10 prozentigen wässrigen Citronensäurelösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde 3 mal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden nacheinander mit einer gesättigen wässrigen NaHCO₃-Lösung (2 ×), Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die Ether-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde der Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus EtOAc (15%) und Hexan (85%) unterworfen. Man erhielt die angestrebten Alkohole (1,30 g, 4,05 mmol, Ausbeute 52%, bezogen auf das Amid 11a).
¹H-NMR (CDCl₃) (Gemisch von 2 Diasteromeren in einem Verhältnis von 1 : 1) δ 4,75 (bs, 1/2H), 4,54 (bs, 1/2H), 4,21–4,13 (m, 1H), 3,92 (dd, J = 6,0 Hz, J = 14,6 Hz, 1H), 1,65–1,29 (m, 4H), 1,45 (m, 9H), 0,98–0,93 (m, 3H).
b) Synthese der Verbindung 11c
Die Verbindung 11b (96 mg, 0,30 mmol) wurde mit einer 4 N-Lösung HCl in Dioxan 30 Minuten behandelt und anschließend unter Vakuum eingeengt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde in trockenem DMF (1 ml) gelöst. Das Pentapeptid 10h (204 mg, 0,22 mmol), NMM (0,1 ml, 0,91 mmol, 4 Äq.) und TBTU (85 mg, 0,26 mmol, 1,2 Äq.) wurden nacheinander zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in Kochsalzlösung gegossen und 3 mal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden nacheinander mit einer 10 prozentigen wässrigen Citronensäurelösung (2 ×), Wasser, gesättiger wässriger NaHCO₃-Lösung, Wasser (2 ×) und Kochsalzlösung gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus EtOAc (75–80%) und Hexan (25–20%) gereinigt. Man erhielt die angestrebte Verbindung 11c (154 mg, 0,137 mmol, Ausbeute 62%).
MS (FAB) 1123 (MH⁺).
c) Synthese der Verbindung 11d
Das Gemisch der Alkohole 11c (52 mg, 0,047 mmol) in einer Lösung aus DMSO (0,5 ml) und Toluol (0,5 ml) wurde nacheinander mit Dichloressigsäure (11,5 ml, 0,139 mmol) und EDAC (89 mg, 0,464 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, in Kochsalzlösung (30 ml) gegossen und mit EtOAc (3 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden nacheinander mit gesättiger wässriger NaHCO₃-Lösung, Wasser (2 ×) und Kochsalzlösung gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus EtOAc (75–80%) und Hexan (25–20%) gereinigt. Man erhielt das angestrebte Keton 11d (37 mg, 0,032 mmol, 70% yield).
MS (FAB) 1121 (MH⁺).
d) Synthese der Verbindung 102
Das Ketongemisch 11d (37 mg, 0,032 mmol) wurde in TFA (1 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen der flüchtigen Bestandteile unter Vakuum wurde das angestrebte Peptid erhalten (29 mg, 0,031 mmol, 97%).
MS (FAB) 921 (MH⁺). 943 (MNa⁺), ¹H-NMR (CDCl₃) (Gemisch aus 2 Diastereomeren im Verhältnis von 1,35 : 1) δ 8,14 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,07–8,02 (m, 2H), 7,80–7,78 (m, 1H), 7,357,26 (m, 5H), 4,77–4,56 (m, 1H), 4,56–4,38 (m, 5H), 4,34–4,09 (m, 5H), 2,68–2,59 (m, 2H), 2,26–2,15 (m, 3H), 2,02–1,82 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,78–1,28 (m, 6H), 1,07–0,95 (m, 1H), 0,92–0,80 (m, 10H), 0,77–0,68 (m, 8H).
Beispiel 12 Synthese der Verbindung 205 (Tabelle 2)
Die Verbindung 205 wurde gemäß dem folgendem Schema hergestellt:
a) Synthese der Verbindung 12a
Eine Lösung von Boc-Hydrazin (3,0 g, 22,6 mmol) in Toluol (42 ml) wurde mit Propionaldehyd (1,8 ml, 24,9 mmol) versetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde auf 50°C erwärmt und sodann 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen des Gemisches erhielt man die Verbindung 12a in Form eines weißen Feststoffes (3,70 g, 95%), der sich bei analytischer HPLC als homogen erwies (97,5%).
MS (FAB) 173,1 (MH⁺); ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,33 (bs, 1H), 7,28 (bs, 1H), 2,19–2,09 (m, 2H), 1,42 and 1,41 (2 × s, 9H), 0,97 (dt, J = 7,6, 1,6 Hz, 3H).
b) Synthese der Verbindung 12b
Das Hydrazon 12a (3,7 g, 21,48 mmol) in THF (80 ml) wurde bei –78°C mit DIBAL (31 ml, 47,25 mmol) in Form einer 1,5 M-Lösung in Toluol versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei –78°C und sodann 2 Stunden bei –40°C gehalten. Eine Lösung von Rochelle-Salz (wässriges Kaliumnatriumtartrat) wurde zugegeben. Sodann wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Et₂O (2 × 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) filtriert und unter Vakuum eingeengt. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie an Kieselgel erhielt man die Verbindung 12b in Form eines farblosen Öls (3,4 g, 91%).
MS (Cl-NH₃) 175,2 (MH⁺); ¹H-NMR (DMSO-d₆) d 8,10 (bs, 1H), 4,25 (bs, 1H), 2,6 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,45–1,29 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 0,85 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
c) Synthese der Verbindung 12c
Das Hydrazin 12b (0,20 g, 1,15 mmol) wurde mit (S)-(–)-1-Phenylethylisocyanat (0,162 g, 1,15 mmol) in CH₂Cl₂ (2,4 ml) und DIPEA (0,44 ml, 2,52 mmol) vereinigt und 1 Stunde bei 0°C und sodann 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Gemisch unter Vakuum eingeengt. Der erhaltene weiße Feststoff wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt. Man erhielt die Verbindung 12c (0,25 g, 68%).
MS (FAB) 322,3 (MH⁺); ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,90 and 8,48 (2 × bs, 1H), 7,35–7,23 (m, 5H), 6,84 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 6,50 (bs, 1H), 4,79 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,36 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 0,81 (t, J = 7,3 Hz, 3H).
d) Synthese der Verbindung 12d
Die Verbindung 12c (77 mg, 0,24 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (1,2 ml) 20 Minuten behandelt und sodann unter Vakuum eingeengt. Das Hydrochloridsalz wurde mit dem Pentapeptid 10h (0,20 g, 0,22 mmol), TBTU (85 mg, 0,26 mmol) und Diisopropylethylamin (0,13 ml, 0,73 mmol) in DMF (2,5 ml) 16 Stunden bei Raumtemperatur vereinigt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und nacheinander mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, 10-prozentiger wässriger HCl und Kochsalzlösung gewaschen und sodann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie erhielt man die Verbindung 12d in Form eines weißen Feststoffes (80 mg, 33%).
e) Synthese der Verbindung 205
Das geschützte Peptid 12d (75 mg, 0,067 mmol) wurde 1,5 Stunden mit reiner TFA (1,5 ml) behandelt und sodann unter Vakuum eingeengt. Nach Reinigung durch präparative HPLC erhielt man die Verbindung 205 in Form eines weißen Feststoffes (17 mg, 27%).
HPLC (98%). MS (FAB) 923,6 (MH⁺). HRMS ber. für C₄₆H₆₆N₈O₁₂ (MH⁺) 923,48785, gef.: 923,49097, ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,5–11,9 (bs, 2H), 10,31 (bs, 1H), 8,26 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 8,58 Hz, 1H), 7,42–7,26 (m, 10H), 7,20 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 6,86 (bd, 1H), 4,854,77 (m, 1H), 4,55 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,50–4,40 (m, 1H), 4,46 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,36–4,20 (m, 6H), 3,75–3,68 (m, 1H), 3,48–3,34 (bs, 1H), 3,18–3,07 (bs, 1H), 2,62 (dd, J = 16,5, 5,7 Hz, 1H), 2,44 (dd, J = 16,5, 5,7 Hz, 1H), 2,30–2,22 (m, 1H), 2,17 (t, J = 7,95 Hz, 2H), 2,06–1,84 (m, 2H), 1,81 (s, 3H), 1,80–1,59 (m, 2H), 1,42–1,30 (m, 6H), 1,06–0,98 (m, 1H), 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H), 0,78 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,71 (t, J = 7,0 Hz, 6H).
Beispiel 13
Synthese der Verbindung 231
Die Verbindung 231 wurde gemäß dem Verfahren für die Verbindung 205 hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Isocyanat durch das entsprechende Isocyanat, das aus Piperonylamin auf folgende Weise hergestellt worden war, ersetzt wurde. Eine Lösung von Phosgen in Toluol (0,2 ml, 0,38 mmol, 4 Äq.) und THF (0,7 ml) wurde bei 0°C tropfenweise innerhalb von 15 Minuten mit Piperonylamin (12 μl, 0,095 mmol) in THF (0,7 ml) mit einem Gehalt an Diisopropylethylamin (53 μl, 0,30 mmol) versetzt. Sodann wurde das Gemisch 30 Minuten bei 0°C gerührt und eingeengt. Das gebildete Isocyanat wurde gemäß den Angaben für die Verbindung 12c gekuppelt. Die Boc-Gruppe wurde entfernt (4 N HCl/Dioxan) und das Hydrochloridsalz des Fragments P1/P1' wurde auf übliche Weise mit HATU, Diisopropylethylamin und dem Pentapeptid 10h (0,10 g, 0,095 mmol) in DMF gekuppelt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 0°C und sodann 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und nacheinander mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, 10-prozentiger wässriger HCl und Kochsalzlösung gewaschen und sodann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie erhielt man das angestrebte geschützte Peptid (67 mg, 62,5%). Das geschützte Peptid (63 mg, 0,056 mmol) wurde entsprechend der Synthese der Verbindung 12d behandelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC erhielt man die Verbindung 231 in Form eines weißen Feststoffes (17 mg, 32%).
HPLC (100%). MS (FAB) 953,05 (MH⁺). HRMS ber. für C₄₆H₆₄N₈O₁₄ (MH⁺) 953,46204, gef.: 953,46680. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,35 (bs, 1H), 8,17 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,40–7,25 (m, 5H), 7,23–7,13 (bs, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,79 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 4,57–4,43 (m, 3H), 4,34–4,18 (m, 6H), 4,13–4,08 (m, 2H), 3,70 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 3,67 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 2,68–2,58 (m, 2H), 2,482,42 (m, 1H), 2,34–2,24 (m, 2H), 2,2–2,13 (m, 2H), 2,04–1,94 (m, 1H), 1,94–1,82 (m, 1H), 1,81 (s, 3H), 1,75–1,61 (m, 2H), 1,45–1,30 (m, 3H), 1,03–0,94 (m, 1H), 0,87–0,75 (m, 9H), 0,74–0,67 (m, 6H).
Beispiel 14
Synthese der Verbindung 232
Die Verbindung 12b wurde an die entsprechende Carbonsäure (von Maybridge) unter Verwendung von TBTU und Diisopropylethylamin in DMF auf übliche Weise gekuppelt. Die Boc-Gruppe vom P1/P1'-Fragment wurde entfernt (4 N HCl/Dioxan, 30 min) und das entsprechende Hydrochloridsalz (0,104 mmol) wurde auf übliche Weise durch 16-stündige Behandlung mit HATU (39,5 mg, 0,104 mmol) und Diisopropylethylamin (0,07 ml, 0,4 mmol) in DMF (0,95 ml) an das Peptid 10h (0,10 g, 0,095 mmol) gekuppelt. Das Gemisch wurde eingeengt und der Rückstand in EtOAc extrahiert und mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, 10-prozentiger wässriger HCl und Kochsalzlösung gewaschen und sodann getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt das geschützte Peptid (110 mg, 100%). Die endgültige Schutzgruppenentfernung dieses Peptids wurde durch Verseifung erreicht. Das geschützte Peptid (0,105 mg, 0,09 mmol) wurde in THF (1,3 ml), MeOH (0,7 ml) und H₂O (0,7 ml) gelöst und sodann mit wässriger NaOH (0,18 ml einer 2 N Lösung, 0,36 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde 3,5 Stunden gerührt und sodann unter Vakuum eingeengt. Der rohe Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Man erhielt die Verbindung 232 in Form eines weißen Feststoffes (33 mg, 36%).
HPLC (97%). MS (FAB) 977,4 (MH⁺), 999,4 (MNa⁺). HRMS ber. für C₄₇H₆₄N₁₀O₁₃ (MH⁺) 977,47327, gef.: 977,47620, ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,61 (bs, 1H), 8,75 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,02–7,90 (m, 3H), 7,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,60–7,56 (m, 1H), 7,357,26 (m, 5H), 4,57–4,43 (m, 4H), 4,42–4,34 (m, 2H), 4,33–4,25 (m, 2H), 4,25–4,17 (m, 2H), 3,70 (dd, J = 10,5, 10,5 Hz, 1H), 3,21–3,10 (m, 2H), 2,96–2,80 (m, 1H), 2,69–2,60 (m, 2H), 2,48–2,41 (m, 1H), 2,35–2,25 (m, 1H), 2,22–2,15 (m, 2H), 2,05–1,90 (m, 2H) 1,881,81 (m, 1H), 1,80 (s, 3H), 1,77–1,61 (m, 2H), 1,531,40 (m, 2H), 1,39–1,28 (m, 1H) 1,06–0,95 (m, 1H), 0,91–0,81 (m, 7H), 0,79 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,75–0,67 (m, 6H).
Beispiel 15 Synthese der Verbindung 233
Synthese der Verbindung 15b
Boc-Alanin (15a) (5 g, 26,42 mmol) wurde bei 0°C in wasserfreiem DMF (63 ml) gelöst und sodann mit 3-Aminopropionitril (1,9 ml, 26,42 mmol) und HOBt (3,5 g, 26,42 mmol) versetzt. Die Lösung wurde mit einer Spritze mit DCC (26,4 ml, 26,4 mmol, 1,0 M in Dichlormethan) versetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 0°C gerührt. Der gebildete DCU wurde durch eine Celite-Schicht filtriert und mit kaltem Dichlormethan gewaschen. Das Filtrat wurde unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc in Lösung gebracht und mit 1 N HCl (wässrig), gesättigter NaHCO₃-Lösung und gesättiger Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt 6,3 g eines schwach braunstichigen Feststoffes. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan (7/3) erhielt man die Verbindung 15b in Form eines weißen Feststoffes (3,94 g, 62%).
HPLC (95%); MS (FAB) 242,1 (MH⁺), 264,1 (MNa⁺); ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,10 (bs, 1H), 6,88 (d, J = 7 Hz, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,35–3,2 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,18 (d, J = 7,3 Hz, 2H).
Synthese der Verbindung 15c
Eine Lösung der Verbindung 15b (3,92 g, 17,5 mmol) in THF (350 ml) wurde bei 0°C nacheinander mit Triphenylphosphin (7,2 g, 35,4 mmol), DEAD (5,5 ml, 35,1 mmol), und Trimethylsilylazid (4,66 ml, 35,1 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 16 Stunden gerührt. Sodann wurde das Gemisch 4 Stunden auf 70°C erwärmt und weitere 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit überschüssiger 5,5-prozentiger wässriger (NH₄)₂Ce(NO₃)₆-Lösung behandelt (vorsichtige, tropfenweise Zugabe). Das rohe Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert und mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und sodann getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan (6/4) erhielt man die Verbindung 15c in Form eines weißen Feststoffes (3,3 g, 76%).
MS (FAB) 267,1 (MH⁺). ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 7,75 (d, J =, 1H), 5,1–5,02 (m, 1H), 4,73 (t, J = 2H), 3,18 (t, J = 2H), 1,49 (d, J = X, 3H), 1,36 (s, 9H).
Eine endgültige Schutzgruppenentfernung der funktionellen Tetrazol- und Estergruppen wurde durch Verseifung erreicht. Das geschützte Peptid 15d (38 mg, 0,033 mmol) wurde in THF (0,5 ml), MeOH (0,25 ml) und H₂O (0,25 ml) gelöst und sodann mit einer wässrigen NaOH-Lösung (0,1 ml einer 2 N Lösung, 0,198 mmol) 4 Stunden behandelt. Das Gemisch wurde unter Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation erhielt man die Verbindung 233 in Form eines weißen Feststoffes (7,5 mg, 25%).
HPLC (98%). MS (FAB) 913,5 (M – H^–). HRMS ber. für C₄₁H₆₂N₁₂O₁₂ (MH⁺) 915,4688, gef.: 915,47250, ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,32 (bs, 1H), 8,23 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,35–7,27 (m, 5H), 6,99 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 4,56–4,42 (m, 4H), 4,414,34 (m, 1H), 4,34–4,17 (m, 5H), 3,70 (dd, J = 10,5, 10,5 Hz, 1H), 3,15 (bm, 1H), 2,67–2,61 (m, 2H), 2,482,40 (m, 1H), 2,30–2,23 (m, 1H), 2,22–2,15 (m, 2H), 2,02–1,92 (m, 2H), 1,87–1,81 (m, 1H), 1,80 (s, 3H), 1,77–1,67 (m, 1H), 1,67–1,57 (m, 1H), 1,51 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,45–1,27 (m, 3H), 1,06–0,94 (m, 1H), 0,87 (dd, J = 6,4, 6,4 Hz, 6H), 0,82 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 0,72–0,62 (m, 6H).
Beispiel 16
Herstellung der Verbindung 107
Boc-(L)Nvl-OH (0,28 g, 1,28 mmol) wurde mit Benzylamin (0,163 g, 1,53 mmol), TBTU (0,45 g, 1,41 mmol), und Diisopropylethylamin (0,45 ml, 2,56 mmol) 16 Stunden in DMF (10 ml) behandelt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und der Rückstand in EtOAc (80 ml) gelöst und anschließend nacheinander mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, 10-prozentiger wässriger HCl und Kochsalzlösung gewaschen und sodann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt einen weißen Feststoff (0,18 g, 46%), der bei analytischer HPLC zu 91% homogen war. Dieses Material (37 mg, 0,12 mmol) wurde 30 Minuten mit 4 N HCl/Dioxan (5 ml) behandelt und sodann unter Vakuum eingeengt. Das Hydrochloridsalz (0,12 mmol) wurde mit dem Pentapeptid 10h auf 0,10 g (0,11 mmol) TBTU (39 mg, 0,12 mmol) und Diisopropylethylamin (0,07 ml, 0,38 mmol) in DMF (8 ml) behandelt und 16 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und nacheinander mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, 10-prozentiger wässriger HCl und Kochsalzlösung gewaschen und sodann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt einen weißen Feststoff (0,12 g, 89%). Das Peptid wurde durch 1-stündige Behandlung mit reiner TFA (5 ml) von Schutzgruppen befreit und sodann eingeengt. Die Verbindung wurde durch präparative HPLC gereinigt. Man erhielt die Verbindung 107 (39 mg, 39%).
HPLC (98,5%). FAB MS m/z: 908 (MH⁺). HRMS ber. für C₄₆N₆₅N₇O₁₂ (MH⁺) 908,47693, gef.: 908,47230. AAA OK; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,5–11,9 (bs, 2H), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 8,02 (m, 3H), 7,79 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,37–7,19 (m, 10H), 4,57–4,39 (m, 3H), 4,33–4,14 (m, 6H), 4,11 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 10,8, 4,1 Hz, 1H), 2,63 (dd, J = 16,2, 6,2 Hz, 1H), 2,45 (dd, J = 16,2, 6,2 Hz, 1H), 2,23–2,15 (m, 3H), 2,02–1,85 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,79–1,67 (m, 2H), 1,66–1,48 (m, 2H), 1,40–1,23 (m, 3H), 1,08–0,97 (m, 1H), 0,92–0,81 (m, 11H), 0,73 (t, J = 7,95 Hz, 6H).
Beispiel 17
Synthese der Verbindung 108
Die Verbindung 108 wurde gemäß dem Verfahren für die Verbindung 107 hergestellt.
HPLC (99,9%). FAB MS m/z: 922 (MH⁺). HRMS ber. für C₄₇N₆₇N₇O₁₂ (MH⁺) 922,49261, gef.: 922,49560; ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12,5–11,9 (bs, 2H), 8,21 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,91 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,79 (8,9 Hz, 1H), 7,36–7,25 (m, 10H), 7,23–7,17 (m, 1H), 4,92–4,83 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,51 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,33–4,25 (m, 2H), 4,24–4,14 (m, 3H), 4,11 (d, J = 11 Hz, 1H), 3,71 (m, 1H), 2,63 (dd, J = 11,0, 4,0 Hz, 1H), 2,45 (dd, J = 11,0, 4,0 Hz, 1H), 2,23–2,14 (m, 3H), 2,041,86 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,80–1,66 (m, 2H), 1,621,42 (m, 2H), 1,33 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,30–1,17 (m, 2H), 1,07–0,96 (m, 1H), 0,88 (m, 6H), 0,81 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,73 (t, J = 7,6 Hz, 6H).
Beispiel 18
Radiometrische Bestimmung von rekombinanter HCV-NS3-Protease
a) Klonieren, Exprimieren und Reinigen der rekombinanten HCV-NS3-Protease Typ 1b
Serum eines HCV-infizierten Patienten wurde (von Bernard Willems MD, Hôpital St-Luc, Montreal, Canada und Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Santé Publique du Quebec, Ste-Anne de Bellevue, Canada) erhalten. Eine gentechnisch hergestellte cDNA-Matrize von voller Länge des HCV-Genoms wurde aus DNA-Fragmenten konstruiert, die durch reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) von Serum-RNA und unter Verwendung von speziellen Primern, die auf der Basis der Homologie mit anderen Genotyp 1b-Stämmen ausgewählt worden waren, erhalten worden waren. Aus der Bestimmung der gesamten Genomsequenz wurde ein Genotyp 1b dem HCV-Isolat gemäß der Klassifikation von Simmonds et al. (J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 1493–1503) zugeordnet. Die Aminosäuresequenz der nicht-strukturellen Region NS2-NS4B zeigte eine mehr als 93-prozentige Identität mit dem HCV-Genotyp 1b (BK-, JK- und 483-Isolate) und eine 88-prozentige Identität mit dem HCV-Genotyp 1a (HCV-1-Isolat). Ein DNA-Fragment, das für den Polyprotein-Vorläufer (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) kodierte, wurde durch PCR erzeugt und in eukaryontische Expressionvektoren eingeführt. Nach vorübergehender Transfektion wurde die durch die HCV-NS3-Protease vermittelte Polyprotein-Prozessierung durch die Anwesenheit des reifen NS3-Proteins unter Anwendung von Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Das reife NS3-Protein wurde bei Expression eines Polyprotein-Vorläufers, der die Mutation S1165A enthielt, die die NS3-Protease inaktiviert, nicht beobachtet, was die Funktionalität der HCV-NS3-Protease bestätigte.
Das für die rekombinante HCV-NS3-Protease (Aminosäuren 1027–1206) kodierende DNA-Fragment wurde in den bakteriellen Expressionsvektor pET11d kloniert. Die NS3-Protease-Expression in E. coli BL21(DE3)pLysS wurde durch 3-stündige Inkubation mit 1 mM IPTG induziert. Eine typische Fermentation (18 Liter) ergab etwa 100 g feuchte Zellpaste. Die Zellen wurden in Lysispuffer (3,0 ml/g), der aus 25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin (Vol/Vol), 1 mM EDTA und 0,01% NP-40 bestand, resuspendiert und bei –80°C aufbewahrt. Sodann wurden die Zellen aufgetaut, homogenisiert und mit 5 mM DTT versetzt. Anschließend wurden Magnesiumchlorid und DNase zum Homogenisat in einer Endkonzentration von 20 mM bzw. 20 μg/ml gegeben. Nach 25-minütiger Inkubation bei 4°C wurde das Homogenisat einer Ultraschallbehandlung unterzogen und 30 Minuten bei 4°C mit 15 000 × g zentrifugiert. Der pH-Wert des Überstands wurde sodann unter Verwendung von 1 M Natriumphosphatlösung auf 6, 5 eingestellt.
Eine weitere Gelfiltrations-Chromatographiestufe wurde zur Ergänzung des zweistufigen Reinigungsverfahrens gemäß WO-95/22985 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) durchgeführt. Kurz zusammengefasst, der Überstand des bakteriellen Extrakts wurde auf eine SP-HiTrap-Säule (Pharmacia), die vorher mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min in Puffer A (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01% NP-40) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde sodann mit Puffer A mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl gewaschen. Die Protease wurde durch Aufsetzen von 10 Säulenvolumina eines linearen NaCl-Gradienten von 0,15–0,3 M NaCl eluiert. Die die NS3-Protease enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf eine endgültige NaCl-Konzentration von 0,1 M NaCl verdünnt. Das Enzym wurde weiter an einer HiTrap-Heparin-Säule (Pharmacia), die in Puffer B (25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 5 mM DTT, 0,01% NP40) äquilibriert worden war, gereinigt. Die Probe wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min aufgesetzt. Die Säule wurde sodann mit Puffer B mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min gewaschen. Zwei Waschstufen wurden in Gegenwart von Puffer B mit einem Gehalt an 0,3 oder 1 M NaCl durchgeführt. Die Protease wurde in der 0,3 M NaCl-Waschflüssigkeit gewonnen, 3-fach mit Puffer B verdünnt, erneut auf die HiTrap-Heparin-Säule aufgesetzt und mit Puffer B mit einem Gehalt an 0,4 M NaCl eluiert. Schließlich wurden die die NS3-Protease enthaltenden Fraktionen auf eine Superdex 75-HiLoad-16/60-Säule (Pharmacia), die in Puffer B mit einem Gehalt an 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Reinheit der aus den gepoolten Fraktionen erhaltenen HCV-NS3-Protease wurde aufgrund von SDS-PAGE unter anschließender densitometrischer Analyse zu mehr als 95% bestimmt.
Das Enzym wurde bei –80°C aufbewahrt und sodann auf Eis aufgetaut und vor der Verwendung verdünnt.
Beispiel 19
Radiometrischer Test auf das rekombinante das HCV-NS3-Protease/NS4A-Kofaktor-Peptid
Das Enzym wurde gemäß dem in Beispiel 18 beschriebenen Verfahren kloniert, exprimiert und zubereitet. Das Enzym wurde bei –80°C aufbewahrt, auf Eis aufgetaut und unmittelbar vor der Verwendung im Testpuffer mit einem Gehalt an dem NS4A-Kofaktor-Peptid verdünnt. Das für den radiometrischen Test auf NS3-Protease/N24A-Kofaktor-Peptid verwendete Substrat DDIVPC-SMSYTW wird durch das Enzym zwischen dem Cysteinrest und dem Serinrest gespalten. Die Sequenz DDIVPC-SMSYTW entspricht der natürlichen NS5A/NS5B-Spaltungsstelle, bei dem der Cysteinrest in P2 durch einen Prolinrest substituiert ist. Das Peptidsubstrat DDIVPC-SMSYTW und der Tracer Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵-IY]TW werden mit der rekombinanten NS3-Protease und dem NS4A-Kofaktor-Peptid KKGSVVIVGRIILSGRK (Molverhältnis Enzym : Kofaktor 1 : 100) in Abwesenheit oder Gegenwart von Inhibitoren inkubiert. Die Abtrennung des Substrats von den Produkten wird durch Zugabe von mit Avidin beschichteten Agarosekügelchen zum Testgemisch und anschließende Filtration durchgeführt. Die Menge an SMS[¹²⁵-IY]TW-Produkt, die im Filtrat gefunden wird, ermöglicht die Berechnung des prozentualen Anteils der Substratumwandlung und der prozentualen Hemmung.
A. Reagenzien
Tris- und Tris-HCl (Ultrarein) wurden von der Firma Gibco-BRL bezogen. Glycerin (Ultrarein), MES und BSA wurden von der Firma Sigma bezogen. TCEP wurde von der Firma Pierce, DMSO von der Firma Aldrich und NaOH von der Firma Anachemia.
Testpuffer: 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 30% (Gew./Vol) Glycerin, 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP (Zugabe von TCEP unmittelbar vor der Verwendung aus einer 1 M Vorratslösung in Wasser).
Substrat: DDIVPCSMSYTW, 25 μM Endkonzentration (aus einer 2 mM-Vorratslösung in DMSO bei Aufbewahrung bei –20°C zur Vermeidung von Oxidation).
Tracer: reduziertes monoiodiertes Substrat Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵I-Y]TW (~1 nM Endkonzentration).
HCV-NS3-Protease Typ 1b, 25 nM Endkonzentration (aus einer Vorratslösung in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,01% NP40).
NS4A-Kofaktor-Peptid: KKGSVVIVGRIILSGRK, 2,5 μM Endkonzentration (aus einer 2 mM Vorratslösung in DMSO, aufbewahrt –20°C).
B. Verfahren
Der Test wurde in einer Polypropylenplatte der Firma Costar mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung enthielt folgende Bestandteile:

– 20 μl Substrat/Tracer in Testpuffer;
– 10 μl ± Inhibitor in 20% DMSO/Testpuffer;
– 10 μl NS3-Protease 1b/NS4-Kofaktor-Peptid (Molverhältnis 1 : 100).

Ferner wurden auf der gleichen Testplatte ein Leerwert (ohne Inhibitor und ohne Enzym) und eine Kontrolle (ohne Enzym) vorbereitet.
Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe der Enzym/NS4A-Peptid-Lösung eingeleitet. Das Testgemisch wurde 40 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert. Anschließend wurden 10 μl 0,5 N-NaOH und 10 μl 1 M MES, pH-Wert 5,8, zum Stoppen der enzymatischen Reaktion zugesetzt.
20 μl mit Avidin beschichtete Agarosekügelchen (bezogen von der Firma Pierce) wurden auf eine Millipore-MADP-N65-Filtrationplatte gegeben. Das gestoppte Testgemisch wurde auf die Filtrationsplatte übertragen und 60 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert.
Die Platten wurden unter Verwendung einer Millipore-MultiScreen-Vakuum-Manifold-Filtrationsvorrichtung filtriert. 40 μl Filtrat wurden auf eine undurchsichtige Platte mit 96 Vertiefungen mit einem Gehalt an 60 μl Szintillationsflüssigkeit pro Vertiefung übertragen.
Die Filtrate wurden auf einem Packard-TopCount-Instrument 1 Minute unter Anwendung des ¹²⁵I-Flüssigverfahrens ausgezählt. Die prozentuale Hemmung wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: 100 – [(ZählereignisseInh – ZählereignisseLw)/(ZählereignisseKtr – ZählereignisseLw) × 100]
Eine nicht-lineare Kurvenanpassung nach dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrationsdaten angewandt. Die 50% effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung der SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc., Cary, N. C.) berechnet.
Beispiel 20
Spezifitätstest
Die Spezifität der Verbindungen wurde gegenüber verschiedenen Serin-proteasen getestet: Humane Leukozyten-Elastase, Schweinepankreas-Elastase und Rinderpankreas-α-Chymotrypsin; sowie gegen eine Cystein-protease: Humanes Leber-Cathepsin B. In sämtlichen Fällen wurde das Verfahren mit einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines kolorimetrischen p-Nitroanilid (pNA)-Substrats, das für jedes Enzym spezifisch ist, herangezogen. Jeder Test umfaßte eine 1-stündige Enzym-Inhibitor-Vorinkubation bei 30°C und eine anschließende Zugabe von Substrat und eine Hydrolyse bis zu einer ~30 prozentigen Umwandlung, gemessen mit einem UV-Thermomax^®-Mikroplattenlesegerät. Die Substratkonzentrationen wurden im Vergleich zum K_M-Wert möglichst nieder gehalten, um die Substratkonkurrenz zu verringern. Die Konzentrationen der Verbindungen variierten je nach ihrer Wirkungsstärke von 300 bis 0,06 μM. Folgende Endbedingungen wurden bei jedem Test eingehalten:
50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 für
[100 μM Succ-AAPF-pNA und 250 pM α-Chymotrypsin], [133 μM Succ-AAA-pNA und 8 nM Schweineelastase], [133 μM Succ-AAV-pNA und 8 nM Leukozytenelastase]; oder
[100 mM NaHPO₄ pH-Wert 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP, 0,01% Tween-20, 30 μM Z-FR-pNA und 5 nM Cathepsin B (das Vorratsenzym wurde vor der Verwendung in einem Puffer mit einem Gehalt an 20 mM TCEP aktiviert).
Ein repräsentatives Beispiel wird nachstehend für Schweinepankreas-Elastase zusammengefasst:
In einer Polystyrol-Platte mit 96 flachbödigen Vertiefungen wurden unter Verwendung eines Biomek-Flüssigkeitshandhabungsgeräts (Beckman) folgende Bestandteile vorgelegt:

– 40 μl Testpuffer 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA);
– 20 μl Enzymlösung 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 40 nM Schweinepankreas-Elastase);
– und 20 μl Inhibitorlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 1,5 nM–0,3 μM Inhibitor, 15% (Vol./Vol.) DMSO).

Nach 60-minütiger Vorinkubation bei 30°C wurden 20 μl einer Substratlösung ((50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 μM Succ-AAA-pNA) in jede Vertiefung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 60 Minuten bei 30°C inkubiert, wonach die Absorption am UV-Thermomax^®-Plattenlesegerät abgelesen wurde. Reihen von Vertiefungen wurden für Kontrollen (ohne Inhibitor) und für Leerwerte (ohne Inhibitor und ohne Enzym) bereitgestellt.
2-fache Verdünnungsreihen der Inhibitorlösung wurden auf einer getrennten Platte mit dem Flüssigkeitshandhabungsgerät unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20 und 15% DMSO durchgeführt. Sämtliche übrigen Spezifitätstests wurden auf ähnliche Weise vorgenommen.
Die prozentuale Hemmung wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: [1 – ((UVInh – UVLw)/(UvKtrl. – UVLw))] × 100
Ein nicht-lineare Kurvenanpassung mit dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrationsdaten angewandt. Die zu 50% effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung der SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc., Cary, N. C.) berechnet.
Beispiel 21
Tabellen mit Verbindungen
Die folgenden Tabellen führen die IC₅₀-Werte für repräsentative Verbindungen der Erfindung auf.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
IC₅₀: Konzentration, die zur Erzielung einer 50 prozentigen Hemmung beim radiometrischen NS3-Protease/NS4A-Kofaktor-Peptid-Test gemäß Beispiel 19 erforderlich ist.
HLE: Die Konzentration, die zu einer 50 prozentigen Hemmung beim Test auf humane Leukozyten-Elastase erforderlich ist.
PPE: Die Konzentration, die zur Erzielung einer 50 prozentigen Hemmung beim Test auf Schweinepankreas-Elastase erforderlich ist. Andere: nichtgekennzeichnete Zahlenwerte geben die Konzentration an, die zur Erzielung einer 50 prozentigen Hemmung beim Test auf Schweinpankreas-α-Chymotrypsin erforderlich ist; mit ** markierte Zahlenwerte geben die Konzentration an, die zur Erzielung einer 50 prozentigen Hemmung beim Test auf humanes Leber-Cathepsin B erforderlich ist: MS: Massenspektrometrische Daten (MH⁺ aus FAB). AAA: Daten der Aminosäureanalyse, angegeben in % Peptidausbeute. Acpr: 1-Aminocyclopropylcarbonsäure. Acpe: 1-Aminocyclopentylcarbonsäure. Abu: Aminobuttersäure. Chg: Cyclohexylglycin (2-Amino-2-cyclohexylessigsäure). Hyp: 4(R)-Hydroxyprolin. Hyp(4-Bn): 4(R)-Benzyloxyprolin. Pip: Pipecolinsäure; Tbg: tert-Butylglycin. Ac: Acetyl. Bn: Benzyl. O-Bn: Benzyloxy. DAD: 3-Carboxypropionyl. DAE: 4-Carboxybutyryl.

Claims

Verbindung der Formel I:
worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₁₁ C_1-10-Alkyl ist, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; oder R₁₁ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, gegebenenfalls substituiert mit einem C_1-6-Alkyl; R₆ die Seitenkette von Asp oder Glu ist; R₅ die Seitenkette von D-Asp, D-Val oder D-Glu ist; Y H oder C_1-6-Alkyl ist; R₄ C_1-10-Alkyl; C_3-10-Cycloalkyl ist; R₃ C_1-10-Alkyl; C_3-10-Cycloalkyl ist; W eine Gruppe der Formel II' ist:
Formel II' worin X CH oder N ist; und R₂' die Seitenkette von Prolin ist und substituiert ist mit R₁₇ in 4-Position mit der in Formel III' gezeigten Stereochemie:
Formel III' worin R₁₇ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, jeweils gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy (nieder)alkyl; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder einen Heterocyclus zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl; der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; R₁₇ OR₁₂ ist, worin R₁₂ ein C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, wobei das genannte erste Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls substituiert sind mit C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, Carboxy(nieder)alkyl oder einem zweiten Aryl oder Aralkyl; das genannte erste und zweite Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; Q eine Gruppe der Formel
ist, worin Z CH oder N ist; X O oder S ist; R₁ H, C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkenyl, beide gegebenenfalls substituiert mit Thio oder Halogen, ist; und wenn Z CH ist, dann R₁₃ N; CF₃; CF₂CF₃; CH₂-R₁₄; CH(F)-R₁₄; CF₂-R₁₄; NR₁₄R₁₄'; S-R₁₄; oder CO-NH-R₁₄ ist, worin R₁₄ und R₁₄' unabhängig Wasserstoff, cyclisches C_3-10-Alkyl oder acyclisches C_1-10-Alkyl oder cyclisches C_3-10-Alkenyl oder acyclisches C_2-10-Alkenyl sind, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls substituiert sind mit NH₂, OH, SH, Halogen oder Carboxyl; das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; oder R₁₄ und R₁₄' unabhängig C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_1-6-Aralkyl sind, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl oder substituiert mit einem weiteren C_3-7-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder Heterocyclus; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; wobei das cyclische Alkyl, cyclische Alkenyl, Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder einen Heterocyclus zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl oder substituiert ist mit einem weiteren C_3-7-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder Heterocyclus; der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; oder R₁₄ und R₁₄' unabhängig C_1-4-Alkyl sind, die, wenn sie zusammen mit N verbunden sind, einen 3- bis 6-gliedrigen, Stickstoff enthaltenden Ring bilden, der gegebenenfalls mit einem weiteren C_3-7-Cycloalkyl, C₆- oder C₁₀-Aryl oder Heterocyclus kondensiert ist; mit der Maßgabe, dass, wenn Z CH ist, R₁₃ dann nicht eine a-Aminosäure oder ein Ester davon ist; wenn Z N ist, dann R₁₃ H; Carboxy; C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxy; CH₂-R₁₄; CHR₁₄R₁₄'; CH(F)-R₁₄; O-R₁₄; NR₁₄R₁₄' oder S-R₁₄ ist, worin R₁₄ und R₁₄' wie vorstehend definiert sind; oder Q eine Phosphonatgruppe der Formel:
ist, worin R₁₅ und R₁₆ unabhängig C_6-20-Aryloxy sind; und R₁ wie vorstehend definiert ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Q eine Gruppe der Formel:
ist, worin Z CH oder N ist; R₁ Wasserstoff, C_1-6-Alkyl gegebenenfalls substituiert mit Thiol oder C_1-6-Alkenyl ist; und wenn Z CH ist, dann R₁₃ H; CF₃; CF₂CF₃; CH₂-R₁₄; CH(F)-R₁₄; CF₂-R₁₄; NR₁₄R₁₄'; S-R₁₄; CHR₁₄R₁₄' oder CO-NH-R₁₄ ist, worin R₁₄ und R₁₄' unabhängig Wasserstoff, cyclisches C_3-10-Alkyl oder acyclisches C_1-10-Alkyl oder cyclisches C_3-10-Alkenyl oder acyclisches C_2-10-Alkenyl sind, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls substituiert sind mit NH₂, OH, SH, Halogen oder Carboxyl; das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; oder R₁₄ und R₁₄' unabhängig C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_1-6-Aralkyl sind, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; das cyclische Alkyl, cyclische Alkenyl, Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder einen Heterocyclus zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy(nieder)alkyl; der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; mit der Maßgabe, dass, wenn Z CH ist, R₁₃ dann nicht eine α-Aminosäure oder ein Ester davon ist; wenn Z N ist, dann R₁₃ H; CH₃; NH₂; CH₂-R₁₄; CH(F)-R₁₄; CHR₁₄R₁₄'; O-R₁₄; NHR₁₄; NR₁₄R₁₄' oder S-R₁₄ ist, worin R₁₄ und R₁₄' wie vorstehend definiert sind.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁C(O)- ist, worin R₁₁: C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy oder C_1-6-Alkoxy; C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, MeOC(O), EtOC(O) oder BnOC(O); 3-Carboxypropionyl (DAD) oder 4-Carboxybutyryl (DAE); oder
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 3, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl, 4-Carboxybutyryl, AcOCH₂C(O), Me₃COC(O),
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 4, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl (DAD), 4-Carboxybutyryl (DAE), AcOCH₂C(O),
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 5, worin B Acetyl oder 4-Carboxybutyryl (DAE) ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 6, worin B Acetyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₅ die Seitenkette von D-Glu ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₄ die Seitenkette von einer Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Val, Cyclohexylglycin (Chg), Tbg, Ile oder Leu.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 9, worin R₄ die Seitenkette von Chg oder Ile ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 10, worin R₄ die Seitenkette von Chg ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₃ die Seitenkette von einer Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ile, Chg, Cha, Val oder Glu.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 12, worin R₃ die Seitenkette von Val oder Chg ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 13, worin R₃ die Seitenkette von Val ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₁₇ Bn, PhCH₂CH₂, PhCH₂CH₂CH₂, O-Bn, o-Tolylmethoxy, m-Tolylmethoxy, p-Tolylmethoxy, 1-Naphthalinylmethoxy, 2-Naphthalinylmethoxy, (4-tert.-Butyl)methoxy, (3I-Ph)CH₂O, (4Br-Ph)O, (2Br-Ph)O, (3Br-Ph)O, (4I-Ph)O, (3Br-Ph)CH₂O, (3,5-Br₂-Ph)CH₂O,
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 15, worin R₁₇ O-Bn, 1-Naphthalinylmethoxy, 2-Naphthalinylmethoxy,
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 15, worin R₁₇ O-Bn, 1-Naphthalinylmethoxy oder 2-Naphthalinylmethoxy ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Q
ist, worin Z vorzugsweise CH oder N ist; wenn Z CH ist: R₁₃ H; CF₃; CF₂CF₃; CH₂-R₁₄; C(O)NH-R₁₄, NR₁₄R₁₄' ist, worin R₁₄ und R₁₄' wie vorstehend definiert sind, mit der Maßgabe, dass R₁₃ nicht eine α-Aminosäure oder ein Ester davon ist; und wenn Z N ist: R₁₃ Phenyl oder C_7-16-Aralkyl,
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 18, worin, wenn Z CH ist: R₁₃ H; NH-R₁₄ oder C(O)NH-R₁₄ ist; worin R₁₄ Phenyl oder C_7-16-Aralkyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 19, worin R₁₃ H; oder C(O)NH-R₁₄ ist; und R₁₄ Benzyl oder CH(Me)Ph ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 18, worin, wenn Z N ist; R₁₃ Naphthyl, NH-CH(Me)Ph, NH-CH(Et)Ph,
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 21, worin R₁₃ NH-CH(Me)Ph oder
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Q eine Phosphonatgruppe der Formel:
ist, worin R₁₅ und R₁₆ unabhängig vorzugsweise C_6-12-Aryloxy sind.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 23, worin R₁₅ und R₁₆ jeweils Phenoxy sind.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₁ C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkenyl ist, gegebenenfalls substituiert mit Halogen.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 25, worin R₁ C_1-5-Alkyl oder C_1-4-Alkenyl ist, gegebenenfalls substituiert mit Fluor.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 26, worin R₁ Ethyl, Propyl, Isopentyl oder Allyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁C(O)- ist, worin R₁₁: C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy oder C_1-6-Alkoxy; C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, MeOC(O), EtOC(O) oder BnOC(O); 3-Carboxypropionyl (DAD) oder 4-Carboxybutyryl (DAE); oder
ist, R₆ die Seitenkette von Asp oder Glu ist; R₅ die Seitenkette einer Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-tert.-Butylglycin (Tbg) und L-Tbg; Y H oder C_1-3-Alkyl ist; R₄ die Seitenkette von einer Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Val, Cyclohexylglycin (Chg), Tbg, Ile oder Leu; R₃ die Seitenkette von einer Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ile, Chg, Cha, Val oder Glu; W:
ist, worin R₁₇ OR₁₂ ist, worin R₁₂ ein C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, das genannte erste Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls substituiert sind mit C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, Carboxy(nieder)alkyl oder einem zweiten Aryl oder Aralkyl; das erste und zweite Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; Q:
ist, worin Z N ist; und R₁₃ Phenyl, C_7-16-Aralkyl,
ist und R₁ C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkenyl ist, gegebenenfalls substituiert mit Halogen.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 28, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl (DAD), 4-Carboxybutyryl (DAE), AcOCH₂C(O),
ist, R₆ die Seitenkette von Asp ist oder R₆ nicht vorhanden ist; R₅ die Seitenkette von D-Glu ist; R₄ die Seitenkette von Chg ist; R₃ die Seitenkette von Val ist; W
ist, worin R₁₇ Bn; PhCH₂CH₂; PhCH₂CH₂CH₂; O-Bn; 1-Naphthyloxy; 2-Naphthyloxy; 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy;
ist, Q:
ist, worin R₁₃ NH-CH(Me)Ph oder
ist und R₁ Ethyl, Propyl, Isopentyl oder Allyl ist.
Verbindung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Hepatitis C-Infektion in einem Säuger, umfassend das Verabreichen einer gegen Hepatitis C antiviral wirksamen Menge der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 an ihn.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine gegen Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermedium oder Hilfsmittel.
In-vitro-Verfahren zur Inhibierung der Replikation des Hepatitis C-Virus, in dem der Virus einer Hepatitis C-Virus-NS3-Protease inhibierenden Menge der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon ausgesetzt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, umfassend einen zusätzlichen Immunmodulator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-, β- und δ-Interferon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, umfassend ein zusätzliches antivirales Mitte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribavirin und Amantadin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, ferner umfassend andere Inhibitoren von HCV-Protease.