DE69733282T2 - Überwachung der Hybridisierung während PCR - Google Patents

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Description

  • Diese Europäische Anmeldung ist eine Teilanmeldung der EP 97931089 .
  • Die Erfindung betrifft allgemein das Monitoring von Fluoreszenzsignalen, die bei einer Hybridisierung in Verbindung mit einer Polymerase-Kettenreaktion entstehen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Monitoring einer Hybridisierung mittels Fluoreszenz während und/oder unmittelbar nach der PCR und die Verwendung dieser Informationen zur Produktbestimmung, zum Nachweis einer Sequenzänderung und zur Quantifizierung.
  • Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist für die Molekularbiologie von grundlegender Bedeutung und stellt die erste praktische molekulare Methode für klinische Laborarbeit dar. Trotz ihrer Nützlichkeit und Beliebtheit macht man mit dem derzeitigen Verständnis der PCR keine großen Fortschritte. Geeignete Bedingungen für eine erfolgreiche Amplifikation müssen durch Ausprobieren herausgefunden werden und eine Optimierung erfolgt empirisch. Sogar Fachleute müssen eine leistungsstarke Methode verwenden, ohne die Theorie für ihren Ablauf zu verstehen oder vorhersagen zu können.
  • Die PCR erfolgt dadurch, dass eine Probe verschiedene Temperaturzyklen durchläuft, wodurch die DNA denaturiert (aufgetrennt) wird, sich spezifische Primer anlagern (Annealing oder Assoziation) und eine Replikation erfolgt (Extension oder Verlängerung). Ein PCR-Zyklus dauert üblicherweise 2 bis 8 min, so dass eine 30 Zyklen lange Amplifikation 1 bis 4 Stunden benötigt. Das Ansprechen der Proben auf die Temperatur ist bei den meisten PCR-Geräten im Vergleich zu der für die Denaturierung, das Annealing und die Extension benötigte Zeit sehr langsam. Die physikalischen (Denaturierung und Annealing) und enzymatischen (Extension) Reaktionen bei der PCR laufen sehr schnell ab. Die Amplifikationszeiten bei der PCR können von einigen Stunden auf weniger als 15 min gesenkt werden.
  • Schnelle Thermocycling-Techniken werden durch das schnelle Ansprechen auf die Temperatur und eine Temperaturhomogenität ermöglicht, die in Probenbehältern mit hohem Verhältnis von Oberfläche/Volumen möglich sind, beispielsweise Kapillarröhrchen, Für weitere Informationen siehe auch: C.T. Wittwer, G.B. Reed und K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, in K.B. Mullis, F. Ferre und R.A. Gibbs, The polymerase chain reaction, Birkhauser, Boston, 174-181 (1994). Eine bessere Temperaturhomogenität ermöglicht, dass Zeit- und Temperaturerfordernisse der PCR besser definiert und verstanden werden können. Eine bessere Temperaturhomogenität erhöht auch die Genauigkeit jeder analytischen Methode, die zum Monitoring der PCR bei der Amplifikation verwendet wird.
  • Die Fluorimetrie ist eine empfindliche und vielseitige Methode mit vielen Anwendungsmöglichkeiten in der Molekularbiologie. Viele Jahre lang wurde Ethidiumbromid verwendet, um die Größenverteilung von durch Gelelektrophorese aufgetrennten Nukleinsäuren sichtbar zu machen. Das Gel wird gewöhnlich mit Ultraviolettlicht durchleuchtet und die rote Fluoreszenz der doppelsträngigen Nukleinsäure beobachtet. Im Einzelnen wird Ethidiumbromid gewöhnlich verwendet, um die PCR-Produkte nach Beendigung der Amplifikation zu analysieren. Die EP 0 640 828 A1 von Higuchi & Watson offenbart zudem die Verwendung von Ethidiumbromid bei der Amplifikation zum Monitoring der Menge doppelsträngiger DNA, indem die Fluoreszenz bei jedem Zyklus gemessen wird. Es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz umgekehrt zur Temperatur ansteigt und abfällt und bei der Annealing/Extensionstemperatur (50°C) am stärksten und bei der Denaturierungstemperatur (94°C) am schwächsten war. Die bei jedem Zyklus aufgenommene maximale Fluoreszenz diente als Maß für die DNA-Menge. Die Anmeldung von Higuchi & Watson lehrt keine Verwendung von Fluoreszenz zum Monitoring von Hybridisierungen und sie schlägt auch keine Fluoreszenzerfassung über verschiedene Temperaturen vor, um das Ausmaß der Hybridisierung zu verfolgen. Außerdem machen Higuchi & Watson keine Angaben oder Vorschläge, wie man die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung von PCR-Produkten ausnützen könnte, um PCR-Produkt zu identifizieren oder zu quantifizieren.
  • In der Anmeldung von Higuchi & Watson wird jedoch die Verwendung anderer Fluorophore, einschließlich zweifachmarkierter Sondensysteme, erwähnt, die Fluoreszenz erzeugen, wenn sie durch die 5'-Exonukleaseaktivität bestimmter DNA-Polymerasen hydrolysiert werden, wie in dem U.S. Patent-Nr. 5,210,015 von Gelfand et al. offenbart ist. Die bei diesen Sonden beobachtete Fluoreszenz hängt in erster Linie von der Hydrolyse der Sonden zwischen den beiden Fluorophoren ab. Die Menge an PCR-Produkt wird durch Erfassung der Fluoreszenz einmal pro Zyklus abgeschätzt. Obwohl eine Hybridisierung der Sonden für das Auftreten einer Hydrolyse notwendig zu sein scheint, kommt das Fluoreszenzsignal in erster Linie durch die Hydrolyse der Sonden zustande und nicht durch die Hybridisierung, wobei eine Oligonukleotidsonde mit Fluoreszenzfarbstoffen an gegenüberliegenden Enden ein zum Nachweis des PCR-Produkts und der Nukleinsäurehybridisierung nützliches, gequenchtes Sondensystem liefert, K.J. Livak et al., 4 PCR Meth. Appl. 357-362 (1995). Es findet sich kein Vorschlag, die Temperaturabhängigkeit der Sondenhybridisierung mittels Fluoreszenz zu verfolgen, um Änderungen in der Sequenz der PCR-Produkte zu identifizieren.
  • Die spezifische Hybridisierung einer Nukleinsäure an einen komplementären Strang zu Identifizierungszwecken wurde in vielen verschiedenen Formaten genutzt. Beispielsweise kann genomische DNA nach dem Verdau mit Restriktionsenzymen, nach Größe aufgetrennt und durch Southern Blotting mit Sonden hybridisiert werden. Als weiteres Beispiel können einzelne Basenmutationen durch "Dot Blots" mit allelspezifischen Oligonukleotiden nachgewiesen werden. Um die notwendige Trennschärfe zu erreichen, wird eine Hybridisierung üblicherweise über Minuten bis Stunden bei einer einzelnen Temperatur durchgeführt. Abwechselnd kann das Ausmaß der Hybridisierung während der Temperaturwechsel dynamisch mit Fluoreszenzmethoden verfolgt werden. Beispielsweise wurden Fluoreszenzschmelzkurven zum Monitoring der Hybridisierung verwendet. L.E. Morrison & L.M. Stols, Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution, 32 Biochemistry 3095-3104, 1993. Die Geschwindigkeit des Temperaturscans beträgt gewöhnlich 10°C/Stunde oder weniger, zum Teil wegen der großen thermischen Masse der Fluorimeterküvette.
  • Die augenblicklichen Verfahren zum Monitoring der Hybridisierung brauchen viel Zeit. Falls das Monitoring einer Hybridisierung innerhalb von Sekunden anstatt von Stunden erfolgen könnte, könnte das Monitoring der Hybridisierung während der PCR-Amplifikation und sogar bei einer PCR mit schnellem Thermocycling erfolgen. Die zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten für ein Monitoring der Hybridisierung während der PCR, wie sie hier umfassend offenbart sind, beinhalten Produktidentifizierung und -quantifizierung, Nachweis von Sequenzänderungen und automatische Kontrolle der Parameter für das Thermocycling durch Fluoreszenz-Feedback.
  • Wie oben beschrieben, werden die Temperaturzyklen im Stand der Technik langsam und empirisch durchgeführt. Wenn eine Analyse der PCR-Produkte durch Hybridisierung notwendig ist, werden zusätzliche zeitintensive Schritte nötig. Es wäre daher ein großer Fortschritt auf diesem Gebiet, Verfahren zum Monitoring der Hybridisierung während einer PCR bereitstellen zu können und die Reaktion ohne Probenmanipulation zu analysieren, während sie stattfindet, d.h. während oder unmittelbar nach dem Thermocycling. Durch ein Monitoring der Hybridisierung während der PCR können die grundlegenden Prinzipien, die den Ablauf einer PCR ermöglichen, verfolgt und zur Analyse und Optimierung der Reaktion bei der Amplifikation verwendet werden.
  • Die EP 0 640 828 A offenbart eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Monitoring mehrerer Nukleinsäurereaktionen. Sie verwendet einen Thermocycler und einen Sensor zum Nachweis von Licht, das von Vertiefungen im Thermocycler emittiert wird.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff zum Monitoring von Produkthybridisierung während einer PCR bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur Identifizierung von mit PCR amplifizierten Produkten mit Hilfe ihrer Fluoreszenzschmelzkurven bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit der PCR-Quantifizierung mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, die Menge an spezifischem Produkt, das durch PCR amplifiziert wurde, mittels Schmelzkurven zu bestimmen, um auf unspezifische Amplifikation, die mit dem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff erfasst wurde, zu korrigieren.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur relativen Quantifizierung verschiedener PCR-Produkte mit doppelstrangspezifischen Farbstoffen zur Verfügung zu stellen.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Produktquantifizierung mit Hilfe der Reassoziationskinetik (Reannealing-Kinetik) des Produkts in Gegenwart eines doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der anfänglichen Kopienzahl des Templats bereitzustellen, indem man die Fluoreszenz einer Hybridisierungssonde oder von Hybridisierungssonden in jedem Zyklus während der PCR-Amplifikation verfolgt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur relativen Quantifizierung verschiedener PCR-Produkte mit Hilfe von Sondenschmelzkurven bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Bestimmung der anfänglichen Kopienzahl des Templats mit Hilfe einer Kurvenanpassung der Messkurve von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System und ein Verfahren zur schnellen Durchführung einer PCR und zum gleichzeitigen kontinuierlichen Monitoring der Reaktion und zum Anpassen der Reaktionsparameter während der laufenden Reaktion bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Nukleinsäuresonden durch synthetische Nukleinsäureanaloga oder -derivate, z.B. Peptidnukleinsäuren (PNA), zu ersetzen, vorausgesetzt, dass diese auch mit fluoreszierenden Verbindungen markiert werden können.
  • Diese und andere Aufgeben und Vorteile der Erfindung ergeben sich deutlicher aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen oder lassen sich bei der Ausführung der Erfindung feststellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Echtzeit-Monitoring der Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer Menge SYBRTM Green I, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen von SYBRTM Green I, einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe zur Bildung einer Amplifikationsmischung und Thermocycling der Amplifikationsmischung zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur über eine Vielzahl von Amplifikationszyklen umfasst; und
    entweder Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht,
    oder Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine PCR-Reaktionsmischung zur Amplifikation der Target-Nukleotidsequenz bereit, wobei die Mischung umfasst: eine DNA-Probe, die die Oligonukleotidprimer für die Targetsequenz in einer zur PCR-Amplifikation ausreichenden Menge enthält, eine thermostabile Polymerase und SYBRTM Green I in einer Menge, die ein Fluoreszenzsignal liefern kann, das die Konzentration der Targetsequenz in der Mischung anzeigt.
  • Die Erfindung ist vorzugsweise gekennzeichnet durch Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, und ferner gekennzeichnet durch Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  • Das Verfahren kann zur Bestimmung einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe während der Amplifikation mit einem schnellen Temperaturwechselprofil verwendet werden.
  • Das Temperaturwechselprofil hat vorzugsweise eine Dauer von weniger als 2 Minuten. Die Probe wird bestrahlt und die Fluoreszenz wird zum Erstellen einer Schmelzkurve erfasst, wenn die Temperatur ansteigt.
  • Die vorliegende Erfindung verringert gegenüber den Methoden des Standes der Technik insbesondere die Gesamtzeit, die für die PCR-Amplifikation und die Analyse benötigt wird, wobei sie gleichzeitig die Möglichkeit bietet, die Qualität der Reaktion durch Optimierung der Amplifikationsbedingungen erheblich zu steigern.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Anwendungsmöglichkeiten zum kontinuierlichen Fluoreszenz-Monitoring einer DNA-Amplifikation bereit. Die benötigte Apparatur kombiniert optische Komponenten mit Elementen für ein schnelles Thermocycling zum kontinuierlichen Monitoring der DNA-Amplifikation mit Hilfe einer Vielzahl verschiedener Fluoreszenzmethoden. In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird die Fluoreszenz kontinuierlich von einer einzelnen Probe oder abwechselnd von mehreren Proben auf einem rotierenden Karussell erfasst, wobei alle Proben gleichzeitig einem schnellen Thermocycling unterzogen werden. Weitere Informationen über die zugehörige Geräteausstattung sind in den oben angegebenen US-Patentanmeldungen zu finden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgte das Fluoreszenz-Monitoring während der DNA-Amplifikation mit dem doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBR Green I. Die einmal pro Zyklus erfassten Fluoreszenzdaten ermöglichen eine Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats.
  • Im Gegensatz zur einmaligen Messung der Fluoreszenz pro Zyklus werden außerdem erfindungsgemäße Ausführungsformen offenbart, die Temperatur, Zeit und Fluoreszenz kontinuierlich über jeden Zyklus hinweg überwachen und so eine 3-dimensionale Spirale erzeugen. Diese 3-dimensionale Spirale kann auf Diagramme von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur reduziert werden. Diagramme von Fluoreszenz gegen Temperatur mit der Fluoreszenz von Hybridisierungssonden können zum Nachweis von Sequenzänderungen im Produkt verwendet werden. Diese Sequenzänderungen können natürlichen Ursprungs sein, wie bei Mutationen oder Polymorphismen, oder künstlich, wie bei einem künstlich konstruierten alternativen Templat zur quantitativen PCR.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt das Fluoreszenz-Monitoring zur Aufnahme von Produktschmelzkurven während der PCR durch Fluoreszenz-Monitoring mit SYBRTM Green I. Das Auftragen der Fluoreszenz als Funktion der Temperatur, wenn der Thermocycler durch die Dissoziationstemperatur des Produkts aufheizt, ergibt die Schmelzkurve des PCR-Produkts. Form und Lage dieser DNA-Schmelzkurve sind eine Funktion von GC/AT-Verhältnis, Länge und Sequenz und können zur Unterscheidung von Amplifikationsprodukten verwendet werden, deren Schmelztemperaturen sich um weniger als 2°C unterscheiden. Gewünschte Produkte lassen sich von unerwünschten Produkten, einschließlich Primerdimeren, unterscheiden. Eine Analyse der Schmelzkurven kann verwendet werden, um den dynamischen Bereich der quantitativen PCR zu erweitern und die verschiedenen Produkte bei einer Multiplex-Amplifikation zu unterscheiden. Mit dem Farbstoff können Produktdenaturierung, Reannealing und Extension innerhalb eines jeden Zyklus verfolgt werden. Ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring ermöglicht das Erstellen von Schmelzkurven und Annealingkurven des Produkts während der Temperaturzyklen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien und Verfahren für eine PCR mit schnellen Zyklen und kombinierter Amplifikation und Analyse mit Hilfe von Fluoreszenz-Monitoring in weniger als dreißig Minuten, vorzugsweise weniger als fünfzehn Minuten und besonders bevorzugt weniger als zehn Minuten bereit.
  • Ein Verfahren zum Echtzeit-Monitoring einer Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion in einer biologischen Probe umfasst das Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer Menge SYBRTM Green I, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen von SYBRTM Green I, einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe zur Bildung einer Amplifikationsmischung und Thermocycling der Amplifikationsmischung zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur über eine Vielzahl von Amplifikationszyklen umfasst; und
    entweder Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, oder Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  • Eine PCR-Reaktionsmischung zur Amplifikation einer Target-Nukleotidsequenz umfasst: eine DNA-Probe, die die Oligonukleotidprimer für die Targetsequenz in einer zur PCR-Amplifikation ausreichenden Menge enthält, eine thermostabile Polymerase und SYBRTM Green I in einer Menge, die ein Fluoreszenzsignal liefern kann, das die Konzentration der Targetsequenz in der Mischung anzeigt.
  • Ein Verfahren zur Analyse einer Target-DNA-Sequenz einer biologischen Probe umfasst:
    Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer nukleinsäurebindenden fluoreszierenden Einheit, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe und Thermocycling der biologischen Probe zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur umfasst;
    Anregen der Probe mit Licht einer von der nukleinsäurebindenden fluoreszierenden Einheit absorbierten Wellenlänge; und
    Monitoring der temperaturabhängigen Fluoreszenz von der nukleinsäurebindenden fluoreszierenden Einheit, wenn sich die Temperatur der Probe ändert, wobei die nukleinsäurebindende fluoreszierende Einheit den doppelsträngige Nukleinsäure bindenden Fluoreszenzfarbstoff SYBRTM Green I umfasst.
  • Die temperaturabhängige Fluoreszenz kann zur Identifizierung der amplifizierten Produkte verwendet werden, vorzugsweise durch Analyse der Schmelzkurven. Die relativen Mengen von zwei oder mehreren amplifizierten Produkten können durch Analyse der Schmelzkurven bestimmt werden. Die Flächen unter den Schmelzkurven kann man beispielsweise durch eine nichtlineare Regression der Summe verschiedener Gaußkurven nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate (least-squares regression) bestimmen.
  • Kurze Beschreibung der verschiedenen Zeichnungsansichten
  • Die ursprünglichen 6-14, 16-18, 33-36 und 46-48 wurden gestrichen.
  • 1A & B zeigen Graphen, die ein Gleichgewichts-PCR-Paradigma (A) und ein kinetisches PCR-Paradigma (B) darstellen.
  • 2 veranschaulicht nützliche Abschnitte von Temperatur gegen Zeit zum Fluoreszenz-Monitoring der Hybridisierung.
  • 3 stellt ein Diagramm von Temperatur gegen Zeit dar, das beispielhaft für schnelle Temperaturwechsel bei einer PCR ist.
  • 4 zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur-/Zeit-Profile (A-D) und ihre entsprechenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (Nebenkarte).
  • 5A, B & C veranschaulichen den Mechanismus der Fluoreszenzerzeugung für drei verschiedene Verfahren zum Fluoreszenz-Monitoring einer PCR: (A) Farbstoff für doppelsträngige DNA, Hybridisierungssonden.
  • 15 zeigt ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für mehrere verschiedene anfängliche Kopierreaktionen von Templaten, die mit SYBRTM Green I verfolgt wurden: 0, (Δ); 1, (∎); 10, (–); 102, (–); 103, (+): 104, (•); 105, (⟡); 106 (x); 107,
    Figure 00090001
    ; 108 (☐) ; 109, (♦)
  • 19A-C stellen einen Vergleich von drei Methoden eines Fluoreszenz-Monitoring für PCR dar, einschließlich des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs SYBR Green I (A), einer zweifach markierten Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (B), und einer Fluorescein-markierten Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (C); 19D zeigt den Variationskoeffizienten für die drei in den 19A-C dargestellten Monitoringmethoden.
  • 20 zeigt ein typisches Diagramm von log Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl einer Referenzamplifikation, die mit SYBR Green I verfolgt wurde.
  • 21 zeigt die Anpassung einer exponentiellen Kurve an Zyklen 20-27 der aus 20 stammenden Daten.
  • 22 zeigt eine exponentielle Anpassung an eine unbekannte zu bestimmende anfänglichen Kopienzahl aus den Amplifikationsdaten.
  • 23 zeigt ein typisches Diagramm von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl für fünf Standards, bei denen in jedem Zyklus ein Monitoring mit benachbarten Hybridisierungssonden erfolgte, wobei die anfänglichen Kopienzahlen wie folgt dargestellt sind: 103, (•); 104, (⟡); 105,
    Figure 00090002
    ; 106, (☐); 107, (♦).
  • 24 zeigt eine Kurvenanpassung an die Referenzdaten von 23.
  • 25 zeigt ein typisches Diagramm von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl für fünf Standards, bei denen in jedem Zyklus ein Monitoring mit Hydrolysesonden erfolgte, wobei die anfänglichen Kopienzahlen wie folgt dargestellt sind: 1,5 (•); 15, (⟡); 150,
    Figure 00090003
    ; 1500, (☐); 15.000, (♦).
  • 26 zeigt eine Kurvenanpassung an die Referenzdaten von 25.
  • 27 zeigt ein typisches Diagramm von log Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl von drei Referenzamplifikationen, die mit SYBR Green I verfolgt wurden, wobei: (∎); (•);
    Figure 00090004
    .
  • 28 zeigt verschiedene Kurvenanpassungen an die Referenzdaten der 27.
  • 29A & B zeigen Diagramme von (A) Zeit gegen Fluoreszenz und (B) Zeit gegen Temperatur, was die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz verdeutlicht.
  • 30 stellt ein Diagramm dar, das auch als 3D-Plots dargestellte 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur für die Amplifikation eines 180 bp-Fragments des Hepatitis B-Genoms in Gegenwart von SYBR Green I zeigt.
  • 31 zeigt eine Projektion der Fluoreszenz gegen die Temperatur für die Amplifikation eines 536 bp-Fragments des humanen beta-Globingens in Gegenwart von SYBR Green I.
  • 32A & B stellen ein Diagramm dar, das (A) eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur für Hydrolysesonden und (B) eine radikale Änderung mit der Temperatur für Hybridisierungssonden zeigt.
  • 37 zeigt Schmelzkurven für PCR-amplifizierte Produkte von Hepatitis B-Virus (•; 50% GC, 180 bp); beta-Globin (
    Figure 00100001
    ; 53,2% GC, 536 bp) und Prostata-spezifischem Antigen (x; 60,3% GC, 292 bp).
  • 38 zeigt Schmelzkurven für das PCR-amplifizierte Produkt von Hepatitis B-Virus bei Aufheizgeschwindigkeiten von 0,1°C bis 5,0°C.
  • 39 zeigt die Schmelzkurven für das PCR-amplifizierte Produkt von Hepatitis B-Virus bei verschiedenen Konzentrationen von SYBRTM Green I.
  • 40A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) elektrophoretisch aufgetrennte Banden von Produkte eines beta-Globinfragments, das (a) ohne zugefügtes Templat, (b) mit 106 Kopien zugefügtem Templat unter niedrigstringenten Bedingungen und (c) mit 106 Kopien zugefügtem Templat unter hochstringenten Bedingungen amplifiziert wurde.
  • 41A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) Schmelzpeaks von Hepatitis B-Virus-Fragment (HBV), von β-Globin sowie einer Mischung davon.
  • 42A-D zeigen (A) Diagramme der relativen Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für PCR-amplifizierte Produkte aus verschiedenen Mengen β-Globin-Templat, (B) Schmelzpeaks und (C) Elektrophoresebanden der verschiedenen Produkte und (D) die korrigierte Fluoreszenz der Daten von (A).
  • 43A & B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) Schmelzpeaks von PCR-amplifizierten Produkten einer Mischung aus cystischem Fibrosegen und c-erbB-2-Onkogen.
  • 44 zeigt Schmelzpeaks bei verschiedenen Zykluszahlen für das cystische Fibrosegen (CFTR) und c-erbB-2 (neu).
  • 45 zeigt einen Graphen von integrierten Schmelzpeaks der CFTR- und neu-PCR-Produkte.
  • 49 zeigt die Form der Reannealingkurven von amplifizierten β-Globin-PCR-Produkten bei verschiedenen Anfangsmengen Templat.
  • 50 zeigt die Bestimmung einer Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung zur Bestimmung der anfänglichen Templatkonzentration.
  • 51 zeigt ein Blockdiagramm zur Steuerung des Thermocyclings mit den Fluoreszenzdaten.
  • 52A & B zeigen (A) ein Diagramm von Temperatur gegen Zeit, das nach 20 Zyklen erhalten wurde, und (B) ein Diagramm von Fluoreszenz gegen Zeit, das nach 25 Zyklen erhalten wurde, wobei das Thermocycling mit den Fluoreszenzdaten gesteuert wurde.
  • In der Beschreibung und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung wird entsprechend den nachfolgenden Definitionen die folgende Terminologie verwendet.
  • "Nukleinsäure", "DNA" und ähnliche Bezeichnungen, wie sie hier verwendet werden, schließen auch Nukleinsäureanaloga, d.h. Analoga mit einem anderen als einem Phosphodiestergrundgerüst, ein. Beispielsweise kommen die aus dem Stand der Technik bekannten so genannten "Peptidnukleinsäuren", die Peptidbindungen anstelle von Phosphodiesterbindungen im Grundgerüst aufweisen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht.
  • "Kontinuierliches Monitoring" und ähnliche Begriffe, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen ein mehrmaliges Monitoring während eines PCR-Zyklus, vorzugsweise bei Temperaturwechseln, und besonders bevorzugt den Erhalt wenigstens eines Wertepunktes bei jedem Temperaturwechsel.
  • Der Begriff "Cycle-by-cycle"-Monitoring, wie hier verwendet wird, bedeutet ein einmaliges Monitoring der PCR-Reaktion pro Zyklus, vorzugsweise während der Annealing-Phase der PCR.
  • Der Begriff "wirksame Menge", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Menge, die ausreicht, um eine ausgewählte Wirkung hervorzurufen. Eine wirksame Menge an PCR-Primern ist beispielsweise eine zur Amplifikation eines Nukleinsäurefragments durch PCR ausreichende Menge, vorausgesetzt, dass eine DNA-Polymerase, ein Puffer, ein Templat und andere Bedingungen, einschließlich Temperaturbedingungen, wie sie nach dem Stand der Technik zur Durchführung der PCR notwendig sind, vorliegen.
  • Eine PCR erfordert wiederholtes Denaturieren von Templat und Annealing von Primern. Diese Hybridisierungsvorgänge sind temperaturabhängig. Die Temperaturzyklen der PCR, die die Amplifikation treiben, denaturieren abwechselnd bei hoher Temperatur das sich akkumulierende Produkt und bewirken bei einer niedrigeren Temperatur das Annealing von Primern an das Produkt. Die Übergangstemperaturen von Produktdenaturierung und Primer-Annealing hängen in erster Linie vom GC-Gehalt und von der Länge ab. Wenn eine Sonde konstruiert wird, um innen an das PCR-Produkt zu hybridisieren, hängt die Schmelztemperatur der Sonde auch vom GC-Gehalt, der Länge und dem Grad der Komplementarität mit dem Target ab. Mit PCR-kompatiblen Fluoreszenzsonden lässt sich die Hybridisierung während der Amplifikation verfolgen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung, die vorzugsweise in Verbindung mit schnellen Thermocycling eingesetzt wird (vollständig beschrieben in der oben angegebenen U.S. Serien-Nr. 08/658,993, eingereicht am 4. Juni 1996, mit dem Titel "System And Method For Monitoring PCR Processes", und der U.S. Seriennummer 08/537,612, eingereicht am 2. Oktober 1995, mit dem Titel "Method For Rapid Thermal Cycling of Biological Samples"), ist ein kinetisches Paradigma für die PCR zweckdienlich. Anstatt sich PCR als drei Reaktionen (Denaturierung, Annealing, Extension) vorzustellen, die bei drei verschiedenen Temperaturen über drei Zeiträume ablaufen (1A), ist ein kinetisches Paradigma für die PCR nützlicher (1B). Mit einem kinetischen Paradigma besteht die Kurve von Temperatur gegen Zeit aus kontinuierlichen Wechseln zwischen sich überlagernden Reaktionen. Denaturierung und Annealing erfolgen so schnell, dass keine Haltedauer bei einer bestimmten Temperatur notwendig ist. Die Extension erfolgt mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten über einen Bereich von Temperaturen. Eine vollständige Analyse würde die Kenntnis aller relevanten Geschwindigkeitskonstanten über alle Temperaturen erfordern. Wenn die Geschwindigkeitskonstanten aller Reaktionen bekannt wären, könnte eine "physikochemische Beschreibung der PCR" entwickelt werden. Die Bestimmung dieser Geschwindigkeiten würde eine genaue Kontrolle der Probentemperatur erfordern und wird durch ein Monitoring der Reaktion bei den Temperaturwechseln stark vereinfacht.
  • 2 veranschaulicht nützliche Abschnitte von Temperatur gegen Zeit zum Fluoreszenz-Monitoring der Hybridisierung. Die Produktschmelzkurven werden während eines langsamen Temperaturanstiegs bis zur Denaturierung erhalten. Durch ein schnelles Absenken der Temperatur nach der Denaturierung auf eine konstante Temperatur können gegebenenfalls Produkt-, Sonden- oder Primerannealing verfolgt werden. Die Sondenschmelzkurven werden durch langsames Aufheizen durch die Temperaturen um den Sonden-Tm hindurch erhalten. Die in 2 dargestellte Ausführungsform liefert die gesamte Analyse während des Thermocycling in sofortiger Echtzeitdarstellung. Die Fluoreszenzsonden bilden Teil der Amplifikationslösung zum kontinuierlichen Monitoring von Primer-, Sonden- oder Produkthybridisierung während des Thermocycling.
  • Die hier enthaltenen Fluoreszenzhybridisierungsmethoden basieren auf schnellem Thermocycling, wobei dessen Vorteile in Geschwindigkeit und Spezifität liegen.
  • Das Temperaturprofil einer Probe bei einer PCR mit schnellem Thermocycling ist in 3 gezeigt. Denaturierung und Annealing zeigen sich im Gegensatz zu den breiten Plateaus des herkömmlichen Thermocycling der PCR in diesen Figuren als Temperaturspitzen („Spikes"), z.B. 1A. Schnelles Thermocycling steht dem herkömmlichen Thermocycling in 4 gegenüber, wo gezeigt ist, dass 30 Amplifikationszyklen in 15 Minuten abgeschlossen sein können und die entsprechenden PCR-Produkte viel weniger Nebenprodukte enthalten. Daher werden bei schnellem Thermocycling die zur Amplifikation benötigten Zeiten um ungefähr das 10-fache gesenkt und die Spezifität verbessert.
  • Beispiel 1
  • 4 zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur/Zeit-Profile (A-D) und ihre entsprechenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (A-D). Die Profile A und B in 4 wurden mit einer im Stand der Technik gebräuchlichen Heizblockvorrichtung mit einem im Stand der Technik gebräuchlichen Mikrofugenröhrchen erhalten. Wie in 4 zu sehen ist, erfolgen die Wechsel zwischen den Temperaturen langsam, und in den Profilen A und B zeigen sich viele unspezifische Banden. Profil B zeigt eine Verbesserung bei der Eliminierung einiger der unspezifischen Banden (im Gegensatz zu Profil A), indem die Zeit, für die jede Probe bei jeder Temperatur bleibt, begrenzt wird, was anzeigt, dass kürzere Zeiten bessere Ergebnisse liefern.
  • Profile C und D wurden mit einem schellen Thermocycler erhalten. Wie in 4 zu sehen ist, ist die Amplifikation spezifisch und obwohl die Ausbeute bei Elongationszeiten von 60 Sekunden maximale ist (C), ist sie bei Elongationszeiten von 10 Sekunden noch völlig ausreichend (D).
  • Die optimalen Zeiten und Temperaturen für die Amplifikation eines 536 bp-Fragments von beta-Globin aus humaner genomischer DNA wurden ebenfalls bestimmt. Die Amplifikationsausbeuten und die Produktspezifität waren optimal, wenn die Denaturierung (93°C) und das Annealing (55°C) weniger als 1 Sekunde dauerten. Es gab keinen Vorteil bei längeren Denaturierungs- oder Annealingzeiten. Die Ausbeute stieg bei längeren Elongationszeiten bei 77°C an, aber es wurde kaum eine Veränderung bei Elongationszeiten von länger als 10-20 Sekunden festgestellt. Diese unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass die Bedingungen, die zur Optimierung der physikalischen und enzymatischen Erfordernisse der Reaktion benötigt werden, bei den früher verfügbaren Vorrichtungen zur DNA-Amplifikation nicht maximal sind.
  • Weitere Informationen lassen sich erhalten aus: C.T. Wittwer et al., Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus, 39 Clinical Chemistry 804 (1993) und C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1999). Die zur Fluoreszenzerfassung und zum schnellen Thermocycling verwendete Apparatur ist in der Serien-Nr. 08/537,612, supra, vollständig offenbart.
  • Wie oben angegeben, kann die Polymerase-Kettenreaktion schnell durchgeführt werden. Neben der Möglichkeit einer schnellen Wärmeübertragung erlaubt die Verwendung optisch reiner Kapillarröhrchen ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring der DNA-Amplifikation gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Fluoreszenzsonden können zum Nachweis und zum Monitoring von DNA-Amplifikation verwendet werden. Geeignete Sonden beinhalten für doppelsträngige DNA spezifische Farbstoffe und sequenzspezifische Sonden.
  • In 5A hängt die Fluoreszenz von der Hybridisierung des PCR-Produkts ab, wie mit einem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff nachgewiesen wurde.
  • Das Verfahren von 5A, einem Aspekt der vorliegenden Erfindung, ist nicht sequenzspezifisch, wenngleich die Produktspezifität durch Schmelzkurven bestimmt werden kann.
  • Auswahl des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs. Der Fachmann ist mit der Verwendung von Ethidiumbromid bei Fluoreszenzmethoden vertraut. Wenn während der Amplifikation ein doppelstrangspezifischer Fluoreszenzfarbstoff vorhanden ist, nimmt die Fluoreszenz im Allgemeinen zu, wenn mehr doppelsträngiges Produkt gebildet wird, siehe R. Higuchi et al., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology 413-417 (1992). Ein PCR-Fluoreszenzassay für Hepatitis C-RNA mit einem interkalierenden Farbstoff YO-PRO-1 ist im Stand der Technik ebenfalls bekannt. Siehe T. Ishiguro et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater, 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995). Die Verwendung von SYBRTM Green I, das dem Fachmann allgemein bekannt ist und von Molecular Probes, Eugene, Oregon, erhältlich ist, als doppelstrangspezifischem Farbstoff wird bevorzugt. Die Molekülstruktur dieses Farbstoffs ist ein Geschäftsgeheimnis, aber der Hersteller empfiehlt es als einen empfindlicheren doppelstrangspezifischen Farbstoff zum DNA-Nachweis auf Gelen. SYBRTM Green I ist jedoch hitzelabil und daher nicht zum Fluoreszenz-Monitoring von PCR gemäß den herkömmlichen Verfahren geeignet, bei denen die Temperatur der Reaktionsmischung für längere Zeit auf Schmelztemperatur gehalten wird. Aufgrund der Hitzelabilität war es überraschend zu entdecken, dass SYBRTM Green I zum Monitoring von PCR-Reaktionen verwendet werden kann, wenn die Schmelztemperaturen nicht für längere Zeit beibehalten werden, d.h. wenn die PCR mit schnellem Thermocycling gemäß dem oben beschriebenen kinetischen Paradigma durchgeführt wird.
  • Beispiel 2
  • Verschiedene doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe wurden durch Monitoring der Amplifikation eines 110 bp-Fragments ausgehend vom PCO3/PCO4-Primerpaar des humanen beta-Glonbingens mit 10.000 Templatkopien verglichen. Die Primer wurden mit der standardmäßigen Phosphoramiditchemie, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, nämlich unter Verwendung des Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey), synthetisiert. Die humanen beta-Globinprimer PCO3/PCO4 (110 Basenpaare) sind bei C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989) beschrieben, worauf hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die DNA-Amplifikation wurde in 50 mM Tris, pH 8,5 (25°C), 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem Desoxynukleosidtriphosphat und 0,2 U Taq-Polymerase pro 5 μl Probe durchgeführt, soweit in den folgenden Beispielen nicht anders angegeben. Das gereinigte Amplifikationsprodukt wurde als DNA-Templat verwendet und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung erhalten, siehe D.M. Wallace, Large- and small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids, 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987), gefolgt von Abtrennen der Primer durch wiederholtes Waschen durch einen Centricon 30 Mikroconcentrator (Amicon, Danvers, Massachusetts). Die Templatkonzentrationen wurden durch Extinktion bei 260 nm bestimmt. Die A(260):A(280)-Verhältnisse der Template waren größer als 1,7.
  • SYBRTM Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) wurde in einer Verdünnung von 1:10.000, Ethidiumbromid mit 5 μg/ml und Acridinorange mit 3 μg/ml verwendet. Diese Konzentrationen wurden als optimale Konzentrationen zur Maximierung des bei der Amplifikation für jeden Farbstoff beobachteten Fluoreszenzsignals bestimmt. Die Anregung erfolgte über einen 450-490 nm Interferenzfilter mit einer Xenonlichtbogenquelle, außer bei Ethidiumbromid, bei dem die Anregung bei 520-550 nm erfolgte. Für SYBRTM Green I erfolgte das Monitoring der Emission bei 520-550 nm. Die Ethidiumbromidfluoreszenz wurde durch einen 580-620 nm Bandfilter beobachtet. Das Signal von Acridinorange wurde als Verhältnis von grüner (520-550 nm) zu roter (> 610 nm) Fluoreszenz angenommen. Die Fluoreszenz der Probe vor der Amplifikation wurde mit der Fluoreszenz nach 35 Zyklen (94°C Max., 60°C für 20 sec) bei 60°C verglichen. Der Fluoreszenzanstieg betrug das 5,3-fache für SYBRTM Green I, das 1,7-fache für Ethidiumbromid und das 1,2-fache für Acridinorange. Bei getrennten Experimenten war die Fluoreszenz von SYBRTM Green I für mehr als 30 min bei 70°C stabil. Es wird auch bequem mit sichtbarem Licht angeregt und soll weniger mutagen sein als Ethidiumbromid. In allen Fällen stammte die Background-Fluoreszenz in erster Linie von den Primern.
  • SYBRTM Green I ist der doppelstrangspezifische Farbstoff für das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Monitoring von PCR, in erster Linie wegen seiner der überragenden Empfindlichkeit, die von einer größeren Trennschärfe zwischen doppelsträngiger und einzelsträngiger Nukleinsäure herrührt. SYBRTM Green I kann bei jeder Amplifikation verwendet werden und ist nicht teuer. Außerdem lässt sich die Produktspezifität durch Analyse der Schmelzkurven erhalten, wie nun gleich beschrieben wird.
  • Cycle-by-cycle-Fluoreszenz. Eine übliche Endpunktanalyse der DNA-Amplifikation durch Gelelektrophorese identifiziert die Produktgröße und schätzt die Reinheit ab. Da jedoch die Amplifikation zunächst stochastisch, dann exponentiell und schließlich stagnierend erfolgt, ist der Nutzen der Endpunktanalyse zur Quantifizierung begrenzt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Cycle-by-cycle-Monitoring zur Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats mit Hybridisierungssonden. Wie für einen Fachmann ersichtlich ist, ist ein einmaliges Monitoring. mehrerer Proben pro Zyklus (Once-per-cycle Monitoring) während der DNA-Amplifikation ein leistungsstarkes quantitatives Werkzeug. Ein Cycle-by-cycle-Monitoring wird erreicht, indem man die Fluoreszenz bei der Extension oder der kombinierten Annealing/Extensionsphase eines jeden Zyklus erfasst und die Fluoreszenz mit der Produktkonzentration in Beziehung setzt.
  • Beispiel 3
  • Das Cycle-by-cycle-Monitoring der PCR wurde mit drei verschiedenen Fluoreszenzmethoden durchgeführt. Das Fluoreszenz-Monitoring erfolgte durch (i) den doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBRTM Green I, (ii) ein Absenken des Fluorescein-Quenchings durch Rhodamin nach Exonukleasespaltung einer zweifach markierten Hydrolysesonde und (iii) Resonanzenergietransfer von Fluorescein auf Cy5 durch benachbarte Hybridisierungssonden. Die Erfindung beinhaltet jedoch nur das Fluoreszenz-Monitoring durch den doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBRTM Green I.
  • Die Amplifikationsreagenzien und -bedingungen entsprachen denen von Beispiel 2. Die humanen beta-Globinprimer RS42/KM29 (536 Basenpaare) und PCO3/PCO4 (110 Basenpaare) sind bei C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989) beschrieben, worauf hier nun vollinhaltlich Bezug genommen wird. Das Thermocycling für beta-Globin erfolgte bei 95°C Maximum, 61°C Minimum, 15 sec bei 72°C und einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 5,2°C/sec. Die beta-Actinprimer und die Fluorescein/Rhodamin-Zweifachsonde wurden von Perkin Elmer (Nr. N808-0230) erhalten. Das Thermocycling für beta-Actin erfolgte bei 94°C Maximum, 60°C für 15 sec mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 6,2°C/s. Die einfach markierten Sonden 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Fluorescein-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCARGp (SEQ ID NO: 4) wurden analog zu Beispiel 3 synthetisiert. Diese benachbarten Sonden hybridisieren auf dem gleichen DNA-Strang innen an das PCO3/PCO4-beta-Globin-Primerpaar und sind durch ein Basenpaar getrennt. Das Thermocycling erfolgte bei 94°C Maximum, 59°C für 20 sec, mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 7,0°C/sec. Die Hybridisierungssonden (beta-Actin und beta-Globin) wurden jeweils mit 0,2 μM eingesetzt.
  • Wenn mehrere Proben einmal pro Zyklus mit SYBRTM Green I einem Monitoring unterzogen werden, lässt sich ein Bereich von 107-108 an anfänglicher Templatkonzentration unterscheiden, wie in 15 dargestellt. Diese Amplifikation stammt von einem 536 bp-Fragment des beta- Globingens mit SYBRTM Green I als doppelstrangspezifischem Farbstoff. Wenn die Daten als Prozent maximale Fluoreszenz jeder Probe normiert wurden, waren hundert anfängliche Kopien eindeutig von zehn Kopien getrennt. Der Unterschied zwischen einer und zehn Kopien war jedoch nur marginal und es ließ sich kein Unterschied zwischen null und durchschnittlich einer Kopie pro Probe feststellen.
  • Das Fluoreszenzsignal von den Hybridisierungssonden ist nicht kumulativ und tritt bei jeder Annealingphase neu auf. Die Fluoreszenz ist ein direktes Maß für die Produktkonzentration, da die Hybridisierung eine Reaktion pseudo-erster Ordnung ist. Weil die Konzentration der Sonde viel höher als die des Produkts ist, ist der an die Sonde hybridisierte Anteil des Produkts von der Produktkonzentration unabhängig. Diese Eigenschaften zeigen an, dass die Verwendung einer einzelnen Hybridisierungssonde zusammen mit einem markierten Primer zu einem besseren Monitoring der Produktakkumulation zu Quantifizierungszwecken führt. Die inhärente Varianz der verschiedenen Fluoreszenzmethoden bei einem Cycle-by-Cycle-Monitoring ist für eine Quantifizierung ebenfalls wichtig.
  • Beispiel 4
  • Die DNA-Amplifikation erfolgte gemäß Beispiel 2 für jedes der drei verschiedenen Verfahren zum Fluoreszenz-Monitoring. SYBRTM Green I wurde in einer Verdünnung von 1:10.000 bei der Amplifikation eines 205 bp langen humanen beta-Globinfragments von den Primern KM29 und PCO4 verwendet. Die Hydrolysesonde und -bedingungen entsprechen den in Beispiel 7 beschriebenen. Die Hybridisierungssonde, TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-Fluorescein (SEQ ID NO: 5) wurde mit KM29 und dem wie in Beispiel 8 synthetisierten Cy5-markierten Primer CAACTTCATCCACGTT*CACC (SEQ ID NO: 6), wobei T* eine Cy5-markierte T-Base war, verwendet. Alle Amplifikationen wurden in zehnfacher Ausführung mit 15.000 Templatkopien (50 ng humane genomische DNA/10 μl) durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren 31 sec lang (94°C Maximum, 60°C für 20 s, Durchschnittgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen 6,2°C/sec). Die Fluoreszenz wurde für jede Probe zwischen Sekunden 15 und 20 der Annealing/Extensionssphase erfasst.
  • 19A ermöglicht einen Vergleich der drei Methoden zum Fluoreszenz-Monitoring einer PCR. Die Fluoreszenzsonden sind der dsDNA-Farbstoff SYBRTM Green I (19A), eine zweifach markierte Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (19B) und eine Fluoresceinmarkierte Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (19C). Alle Sonden wiesen fast die gleiche Empfindlichkeit auf, wobei nachweisbare Fluoreszenz etwa um den Zyklus 20 herum auftrat. Bei längerer Amplifikation nahm das Signal bei der Hydrolysesonde kontinuierlich zu, war bei SYBRTM Green I auf einem Niveau und nahm bei der Hybridisierungssonde leicht ab.
  • Die Genauigkeit der drei Methoden zum Fluoreszenz-Monitoring wird in 19D verglichen. Die mittleren +/– -Standardabweichungen sind für jeden Punkt aufgetragen. Die Daten sind als Variationskoeffizient (Standardabweichung/Mittelwert) des Fluoreszenzverhältnisses oberhalb der Grundlinie aufgetragen (genommen als Mittelwert der Zyklen 11-15).
  • Obwohl die Änderung im Fluoreszenzverhältnis bei der Hydrolysesonde größer ist als die bei der Hybridisierungssonde (19B und 19C), ist der Variationskoeffizient der Fluoreszenz bei den Hydrolysesonden größer (19D). Das heißt, dass die Fluoreszenz, die bei dem Verfahren mit Hybridisierungsonden resultiert, genauer ist als bei Verwendung einer Hydrolysesonde, auch wenn die absoluten Signalstärken niedriger sind. Dies stellt einen unerwarteten Vorteil der Hybridisierungssonden gegenüber den üblicheren zweifach markierten Hydrolysesonden dar.
  • Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats. Die quantitative PCR ist sowohl in der biomedizinischen Forschung als auch in der klinischen Laborarbeit zu einer wichtigen Methode geworden. Das Quantifizierungsverfahren beinhaltet oft die Aufnahme einer Eichkurve von Proben, die eine bekannte Kopienzahl der Targetsequenz enthalten, ein. Die Kopienzahl einer unbekannten Probe wird durch Extrapolation zwischen den bekannten Werten ermittelt. Wenn das Cycle-by-cycle-Monitoring einer vollständige Amplifikationskurve mit Fluoreszenz, Radioaktivität oder einem anderen Verfahren erfolgt, das ein zur vorhandenen DNA-Menge proportionales Signal liefert, stehen viele Datenpunkte für eine Analyse zur Verfügung und es ist nicht klar, welcher Wert einen Standard oder eine Unbekannte darstellen soll. Der Stand der Technik wählt einen "Schwellenwert" für das Signal und verwendet dann die Zyklenzahl, bei der der Standard oder die Unbekannte den Schwellenwert schneidet, als repräsentativen Wert (siehe Higuchi & Watson, EPA 0 640 282 A1). Dieser Ansatz verwendet eine sehr kleine Menge der in einer Amplifikationskurve verfügbaren Daten. Außerdem ist die Zuordnung des Schwellenwerts sehr subjektiv und unterliegt einer bewußten oder unbewußten Verzerrung. Mehr verfügbare Daten könnten objektiv durch Anwendung von Methoden zur Anpassung nichtlinearer Kurven auf die Daten in einer Amplifikationskurve verwendet werden. Vorzugsweise könnte man Gleichungen finden, die die Form der Amplifikationskurven durch Modellieren der Faktoren des zugrundeliegenden Verfahrens beschreiben.
  • Eine Vielzahl verschiedener Gleichungen könnte zur Anpassung der bei einer Amplifikation erzeugten Daten verwendet werden. DNA-Amplifikationen weisen üblicherweise einen log-linearen Abschnitt auf und die Daten in diesem Abschnitt können an eine Gleichung angepasst werden, die einen exponentiellen Anstieg beschreiben, wie er bei einer DNA-Amplifikation erwartet wird. Der log-lineare Teil einer DNA-Amplifikation kann durch die Gleichung y = A·[DNA]·(1+E)n beschrieben werden, wobei A ein Skalierungsfaktor ist, der Signaleinheiten in DNA-Einheiten umrechnet; [DNA] die Anfangskonzentration der DNA in der Reaktion ist; E die Effizienz der Reaktion; und n die Zyklenzahl ist.
  • Ein Quantifizierungsverfahren sollte beinhalten: (1) Anpassen der bekannten Standards an die Gleichung und fließen lassen der Parameter A und E, und (2) Anpassen der unbekannten Proben an die Gleichung mit den Werten für A und E aus den Standards und fließen lassen von [DNA]. Diese Methode verwendet viel mehr Daten und nützt den Teil der Daten, den log-linearen Teil, der wahrscheinlich am informativsten ist. Die 20, 21 und 22 zeigen ein Beispiel für diesen Ansatz. Zehnfach-Verdünnungen eines gereinigten PCR-Produkts wurden als Eichkurve amplifiziert und es wurde ein "unbekannter" humaner genomischer DNA-Standard verwendet. 20 zeigt, dass der log-lineare Teil leicht entweder durch den Benutzer oder die Software identifiziert werden kann. 21 zeigt eine Anpassung der Gleichung y = A·[DNA]·(1+E)n an den 104-Kopien-Standard. 22 verwendet Durchschnittswerte von verschiedenen Standards für A und E und passt [DNA] an. Der angepasste Wert von 16.700 liegt sehr nahe am theoretischen Wert eines Gens mit einer einzigen Kopie in der genomischen DNA (15.000 Kopien).
  • Die Verwendung aller Daten für eine Amplifikationskurve sollte das Ausmaß des Hintergrundrauschens und den Plateau-Wert beinhalten. Während das Plateau bei hoher Kopienzahl nicht informativ ist, ist es bei niedriger Kopienzahl häufig zur anfänglichen Kopienzahl proportional. Das Ausmaß des Hintergrundrauschens sollte zur Bestimmung des ersten Punkts nützlich sein, der einen deutlichen Anstieg des Signals zeigt. Zu diesem Zeitpunkt sind alle Faktoren, die an der Form einer DNA-Amplifikationskurve beteiligt sind, unbekannt, so dass ein Ansatz dahingeht, die Form der Kurve zu beschreiben. 23 zeigt Amplifikationskurven bei Verwendung von Fluoreszenzhybridisierungssonden zum Nachweis eines Bereichs von DNA-Templatkonzentrationen von fünf Größenordnungen. Jede Kurve ist an die Gleichung y = ((as·x+ab)–(ds·x+db))/(1+(x/c)^b)+(ds·x+db)angepasst, wobei "as" der Background der Böschungslinie ist, "ab" der y-Abschnitt der Backgroundlinie ist, "ds" die Steigung der Plateaulinie ist, "db" der y-Abschnitt der Böschungslinie ist, "c" die Zyklenzahl ist, bei der die Reaktion auf halbem Wege zwischen Background und Plateau (A50) ist und "b" die Steigung des log-linearen Teils der Amplifikation ist.
  • Diese Gleichung ergibt gute Anpassungen an diese Amplifikationsdaten und 24 zeigt, dass der A50-Wert über sieben Größenordnungen gut mit dem log der anfänglichen Kopienzahl korreliert. 25 zeigt die gleiche Anpassung der Gleichung an die Daten von Amplifikationen, bei denen eine Hydrolysesonde zum Nachweis des DNA-Templates über einen Bereich von 5 Größenordnungen verwendet wurde. Diese Gleichung ergibt gute Anpassungen an diese Amplifikationsdaten und die 26 zeigt, dass der A50-Wert gut mit dem log der anfänglichen Kopienzahl korreliert. Dies zeigt die Flexibilität des Ansatzes einer vollständigen Kurvenanpassung, da die Gleichung gute Anpassungen sowohl an die scharfen Plateaus der Kurven für die Amplifikation mit Hybridisierungssonden als auch an die stetig ansteigenden „Plateaus" der Kurven für die Hydrolysesonden ergab.
  • Vollständige Kurvenanpassungen sind nicht auf diese Gleichung beschränkt. 27 zeigt eine Amplifikation von drei Konzentrationen DNA-Templat, die an die Gleichung: y = (((as·x+ab)–(dmax·x/dd+x))/(1+(x/c)^b))+(dmax·x/dd+x) angepasst ist, die den ersten 6-Parameter-Gleichungen ähnelt, außer dass das Plateau durch eine hyperbolische Kurve und nicht durch eine Gerade definiert ist. 28 zeigt, dass der A50-Wert für diese Gleichung gut mit der anfänglichen Kopienzahl korreliert.
  • Während der A50-Wert bei diesen Beispielen verwendet wurde, sollte eine Ebene zwischen dem Background und dem Plateau gewählt werden, wenn eine bestimmte Methode im Amplifikationsprofil stärker niedriger oder höher ist. Beispielsweise wird eine Reihe von Amplifikationseichkurven für die beste Korrelation zwischen der anfänglichen Kopienzahl und dem A50, dem A40, dem A30, dem A20 und dem A10 ausgewertet. Die Amplifikationsstärke, die am besten mit der bekannten anfänglichen Kopienzahl korreliert, wird bestimmt. Dies ist für verschiedene Nachweissysteme unterschiedlich. 19 zeigt den Variationskoeffizienten für verschiedene Nachweissysteme. Die Amplifikationsstärke, die die beste Vorhersage liefert, ist vermutlich die Stärke mit dem niedrigsten Variationskoeffizienten.
  • Wenn man die DNA-Amplifikationsreaktion selbst besser versteht, könnten andere Gleichungen mit Parametern verwendet werden, die physikalische Prozesse wiedergeben. Das Plateau der DNA-Amplifikationskurve hat bei verschiedenen Reaktionen verschiedene Ursachen. Es ist häufig darauf zurückzuführen, dass die Primer nicht in der Lage sind, mit dem Reannealing der Produkte in den letzten Zyklen zu konkurrieren. Dieser Effekt könnte mit einem Parameter erfasst werden, der vom Quadrat der Produktkonzentration in der Reaktion abhängt (da die Reannealinggeschwindigkeit proportional zum Quadrat der Produktkonzentration ist). Eine andere Ursache für das Plateau kann die Verarmung an Primern sein. Primer-limitierte Reaktionen weisen eine charakteristische Form auf, sie zeigen ein sehr scharfes, klar zu erkennendes Plateau. Anpassungen von primer-limitierten Reaktionen beinhalten Parameter, die diese scharfe Obergrenze definieren. Enzym-limitierte Reaktionen weisen ein sehr abgerundetes Plateau auf, das entsprechend angepasst werden kann. Man kann sich Gewichtungsfaktoren ausdenken, die die bekannten Variations koeffizienten für ein gegebenes System wiedergeben, so dass die verlässlicheren Datenpunkte schwerer gewichtet werden. Indem man mehr Punkte in einem Amplifikationsprofil anpasst, kann man genauere und zuverlässigere Schätzungen der anfänglichen Kopienzahl erhalten. Ein oder mehrere Parameter dieser Anpassungen können verwendet werden, um die anfängliche Kopienzahl unbekannter Proben zu schätzen.
  • Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring von PCR. Das erfindungsgemäße Merkmal des kontinuierlichen Monitorings, das heißt des mehrmaligen Monitorings in jedem PCR-Zyklus, soll nachfolgend erörtert werden. Obwohl ein Fluoreszenz-Monitoring bei einer PCR auch einmal pro Zyklus bei einer konstanten Temperatur erfolgen kann, bietet die vorliegende Erfindung den wichtigen Vorteil, dass sie ein kontinuierliches Monitoring über einen ganzen PCR-Zyklus vorsieht. Die Temperatur ist von Bedeutung, da sich die Fluoreszenz ändert, wenn sich die Temperatur ändert. Die 29A & B zeigen die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz für SYBRTM Green I. Dies ist ein beim Thermocycling verwirrender Effekt, der gewöhnlich eliminiert wird, indem man die Fluoreszenz einmal pro Zyklus bei konstanter Extensionstemperatur betrachtet. Erfindungsgemäß ist jedoch ein Fluoreszenz-Monitoring bei Temperaturwechseln sehr informativ. Vor der vorliegenden Erfindung wurde nicht bei jedem Zyklus ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring durchgeführt, sondern ein einmaliges Fluoreszenz-Monitoring pro Zyklus. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz jede sec, alle 200 ms, alle 100 ms oder sogar mit noch größerer Häufigkeit erfasst. Die entsprechenden Daten können feine Details der Produktdenaturierung, des Reannealing und der Extension, und des Sonden-Annealing und -Aufschmelzens bei einem schnellen Thermocycling aufdecken, die mit den vorher verfügbaren Verfahren nicht verfügbar waren.
  • Beispiel 5
  • Ein 180 bp-Fragment des Gens für das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde ausgehend von 106 Kopien des gereinigten PCR-Produkts mit den Primern 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2) (Genbank-Sequenz HVHEPB) amplifiziert. Man folgte den Amplifikationsbedingungen von Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass die Reaktion eine 1:20.000-Verdünnung an SYBRTM Green I und 2 mM MgCl2 enthielt. Jeder Temperaturzyklus dauerte 27 sec (92°C Maximum, 59°C Minimum, 5 sec bei 70°C, Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen 3,0°C/sec). Zeit, Temperatur und 2 Fluoreszenzkanäle wurden alle 200 ms erfasst und kontinuierlich als Diagramme von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl und Fluoreszenz gegen Temperatur dargestellt. 30 zeigt eine 3D-Kurve für Temperatur, Zeit und Fluoreszenz für die Zyklen 10 bis 39. Diese 3D-Kurve ist in 30 auch in Form von 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur projiziert. Die Projektion von Temperatur gegen Zeit in 30 wiederholt jeden Zyklus und liefert im Wesentlichen die gleichen Informationen, wie sie in 3 angegeben sind. Weil die Fluoreszenz sich umgekehrt zur Temperatur ändert, ist die in 30 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Zeit in frühen Zyklen ein maßstabsgetreues Spiegelbild des Diagramms von Temperatur gegen Zeit (siehe 29). Wenn Produkt akkumuliert, nimmt die Fluoreszenz bei allen Temperaturen bei doppelsträngigem Produkt zu. Bei den Denaturierungstemperaturen fällt die Fluoreszenz jedoch auf die Basislinie zurück, da nur einzelsträngige DNA vorhanden ist. Die in 30 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur der Doppelstrang-Farbstoffe eliminiert die Zeitachse und zeigt die Temperaturabhängigkeit des Strangstatus bei der DNA-Amplifikation.
  • Beispiel 6
  • Ein 536 bp-Fragment des humanen beta-Globingens wurde ausgehend von 25 ng genomischer DNA und einer 1:10.000-Verdünnung von SYBRTM Green I in einem Volumen von 5 μl amplifiziert. Jeder Temperaturzyklus dauerte 28 sec (95°C Maximum, 61°C Minimum, 15 sec bei 72°C mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen von 5,2°C/sec). Andere Bedingungen entsprechen den in 30 beschriebenen. Die Zyklen 15-40 sind dargestellt. Die Temperaturabhängigkeit des Strangstatus des Produkts bei der PCR zeigt sich aus den Diagrammen von Fluoreszenz gegen Temperatur, wie in 31 gezeigt. Die dargestellten frühen Zyklen erscheinen identisch und zeigen einen nichtlinearen Anstieg der Fluoreszenz bei niedrigeren Temperaturen. Bei fortschreitender Amplifikation erscheinen die Temperaturzyklen als aufsteigende Schleifen zwischen Annealing- und Denaturierungstemperatur. Wenn die Probe erhitzt wird, ist die Fluoreszenz bis zur Denaturierung hoch. Wenn die Probe abkühlt, nimmt die Fluoreszenz zu, was ein Reannealing des Produkts widerspiegelt. Wenn die Temperatur bei der Extension konstant ist, korreliert die zunehmende Fluoreszenz mit weiterer DNA-Synthese.
  • Wie sich aus dem Verständnis dieser Offenbarung ergibt, kann ein kontinuierliches Monitoring innerhalb eines Zyklus einen Einblick in die Mechanismen der DNA-Amplifikation bieten, den es zuvor im Stand der Technik nicht gab. Mit der vorliegenden Erfindung sind viele Aspekte der DNA-Amplifikation erkennbar, die vorher schlecht zu verstehen waren. Eine Amplifikation mit schnellem Thermocycling soll das Produkt beispielsweise in weniger als einer Sekunde denaturieren, während der Stand der Technik zehn Sekunden bis eine Minute für die Denaturierung braucht. Die Beobachtung des Aufschmelzens des Produkts durch Echtzeit-Fluoreszenz-Monitoring mit Doppelstrangfarbstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung (30 und 31) zeigt, dass die Anwendung kürzerer Denaturierungszeiten effektiv ist. Als anderes Beispiel ist zu nennen, dass für den bekannten „Plateau-Effekt" viele Gründe vorgeschlagen wurden, aber nur wenige Daten zur Verfügung stehen, um zwischen diesen Alternativen zu unterscheiden. Wie in 31 gezeigt erfolgt das Reannealing des Produkts sehr schnell. Tatsächlich reassoziiert bei späteren Amplifikationszyklen beim Abkühlen in jedem Zyklus der größte Teil des Produkts, bevor die Annealingtemperatur der Primer erreicht wird. In einer Apparatur zum raschen Thermocycling erfolgt dies mit Abkühlgeschwindigkeiten von 5-10°C/sec. Das Reannealing des Produkts mit langsameren, im Stand der Technik gebräuchlichen Thermocyclern ist höher und dieser unerwünschte Effekt größer. Reannealing des Produkts scheint ein Hauptgrund und vielleicht der einzige Grund für den „Plateau-Effekt" zu sein.
  • Nachfolgend wird ein kontinuierliches Monitoring sequenzspezifischer Sonden betrachtet. Wie sich aus dieser Offenbarung ergibt, kann ein kontinuierliches Monitoring innerhalb eines Zyklus die Art der Sondenfluoreszenz identifizieren.
  • Beispiel 7
  • Analog zu Beispiel 3 wurde alle 200 msec ein kontinuierliches Monitoring der Amplifikation mit einer zweifach markierten Hydrolysesonde (beta-Actin) und benachbarten Hybridisierungssonden (beta-Globin) durchgeführt. In 32A sind die Zyklen 20-45 einer Reaktion gezeigt, die mit der Hydrolysesonde verfolgt wurde. Die Hydrolysesonden zeigen eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur und eine parallele Zunahme bei der Fluoreszenz, wenn mehr Sonde hydrolysiert wird. Im Gegensatz dazu ändert sich das Fluoreszenzverhältnis von Hybridisierungssonden drastisch mit der Temperatur (32B, Zyklen 20-90). Während der Annealing/Extensionsphase hybridisieren die Sonden an einzelsträngiges Produkt und das Fluoreszenzverhältnis (Cy5/Fluorescein) nimmt zu. Beim Aufheizen auf Temperaturen zum Denaturieren des Produkts dissoziieren die Sonden bei etwa 70°C, wodurch das Fluoreszenzverhältnis auf Backgroundniveau zurückgeht.
  • Die erfindungsgemäße Kombination aus (1) kontinuierlichem Fluoreszenz-Monitoring innerhalb jedes Temperaturzyklus und (2) Analyse der Temperatur- und Zeitabhängigkeit der Hybridisierung bietet Vorteile, die ansonsten nicht zu erhalten sind. 2 zeigt, dass durch kontinuierliches Monitoring über einen Zyklus hinweg Informationen extrahiert werden können, die vorher nicht erhältlich waren. Ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring während der Phase des Zyklus, in der das Produkt aufgeschmolzen wird, liefert nützliche Informationen über Reinheit, Identität und Menge der bei dem Zyklus vorhandenen DNA.
  • Wenn eine PCR-Reaktion von der Extensionstemperatur auf die Denaturierungstemperatur aufgeheizt wird, wird jede DNA in der Probe in Einzelstränge aufgeschmolzen. Diese Denaturierung kann als Abfall der Fluoreszenz von SYBRTM Green I beobachtet werden. Für kleine PCR-Produkte erfolgt der Vorgang des Aufschmelzens innerhalb eines engen Temperaturbereichs und der Mittelpunkt dieses Schmelzbereichs wird als Tm bezeichnet. Ähnlich der Größenauftrennung durch Gelelektrophorese misst eine Schmelzpeak-Analyse eine grundlegende Eigenschaft der DNA und kann verwendet werden, um amplifizierte Produkts zu identifizieren. Anders als bei der Gelelektrophorese kann die Analyse der Schmelzkurven Produkte mit gleicher Länge aber unterschiedlichem GC/AT-Verhältnis unterscheiden. Zudem hätten zwei Produkte mit gleicher Länge und gleichem GC-Gehalt aber unterschiedlicher GC-Verteilung (beispielsweise gleichverteilt gegenüber einem GC-Clamp an einem Ende) sehr unterschiedliche Schmelzkurven.
  • Die Temperatur, bei der PCR-Produkte schmelzen, variiert über einen großen Bereich. Die Verwendung von im Stand der Technik bekannten empirischen Formeln zum Effekt des GC-Gehalts auf die Schmelztemperatur (Tm) der DNA sagt voraus, dass eine Duplex mit 0% GC um 41°C tiefer als eine Duplex mit 100% GC schmelzen würde. Bei gleichem GC-Gehalt würde ein 40 bp-Primerdimer 12°C unter einem 1000 bp-Produkt schmelzen. Der Tm-Bereich für mögliche PCR-Produkte umfasst daher mindestens 50°C. Dieser breite Bereich ermöglicht eine Unterscheidung der meisten PCR-Produkte aufgrund ihrer Schmelzkurven. Daher bietet eine Kombination aus Fluoreszenz-Monitoring von PCR und Schmelzkurvenanalyse gleichzeitig Amplifikation, Nachweis und Unterscheidung von PCR-Produkten.
  • Beispiel 8
  • Die DNA-Schmelzkurven für drei verschiedene PCR-Produkte wurden an einem Mikrovolumenfluorimeter aufgenommen, das mit einem 24-Proben-Thermocycler mit einem optischen System für SYBRTM Green I-Fluoreszenz (LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho) ausgestattet war. Die Primer für die Amplifikation des 180 bp langen Gens für das Hepatitis B-Oberflächenantigen waren 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2). Die Primer für die Amplifikation des 292 bp langen Gens für das Prostata-spezifische Antigen (PSA) waren 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO: 8). Die Amplifikation des 536 bp langen humanen beta-Globingens wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt und die PCR wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt, gefolgt von wiederholtem Waschen durch einen Centricon 30-Microconcentrator (erhältlich bei Amicon, Danvers, Massachusetts). Die Templatkonzentrationen wurden durch Extinktion bei 260 nm bestimmt und wiesen A(260)/A(280)-Verhältnisse von mehr als 1,7 auf.
  • Fünfzig ng gereinigte DNA in 50 mM Tris, pH 8,5, 2 mM MgCl2 und 250 μg/ml Rinderserumalbumin und ein 5 μl-Volumen wurden in das offene Plastikreservoir von Verbundglas/Plastik-Reaktionsröhrchen pipettiert, zum Sammeln der Probe an der Glaskapillarspitze bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und innen mit einem Plastikstöpsel verschlossen. Die Fluoreszenzdaten für die Schmelzkurven wurden durch Integrieren des Signals über 0,25-2,0 Sekunden bei einem linearen Temperaturwechsel auf 95°C mit 0,1-10,0°C/Sekunde erfasst. Die Fluoreszenz wurde kontinuierlich erfasst und als Diagramm von Fluoreszenz gegen Temperatur in der LabView-Programmierumgebung dargestellt (National Instrument, Austin, TX). 37 zeigt die Schmelzkurven der drei gereinigten PCR-Produkte.
  • Die Tm-Werte der drei Produkte in 37 umfassen nur 6°C und zwei der Kurven unterscheiden sich nur um 2°C. Dieser kleine Unterschied reicht aus, um eine leichte Unterscheidung der Produkte zu ermöglichen. Die Bedeutung des Prozentsatzes an GC über die Länge für die Tm wird durch das 292 bp-PSA-Produkt veranschaulicht, das gegenüber dem längeren 536 bp-beta-Globinfragment bei einer höheren Temperatur schmilzt. Schmelzkurven werden häufig bei einer Geschwindigkeit von 0,5°C/Minute erhalten, um das Gleichgewicht sicherzustellen. Wenn die Aufheizgeschwindigkeit abnimmt, verschiebt sich die Schmelzkurven zudem zu tieferen Temperaturen und wird schärfer (38; Hepatitis B-Fragment). Es sei jedoch zu beachten, dass die Schmelzkurven der 37 bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 0,2°C/sec (12°C/Minute) erhalten wurden und zwischen Produkten unterscheiden lassen, die sich in der Tm um 2°C oder weniger unterscheiden.
  • Die apparente Tm der PCR-Produkte hängt auch von der Konzentration des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs ab (39, Hepatitis B-Fragment). Höhere Farbstoffkonzentrationen erhöhen die Stabilität der DNA-Duplex und die beobachtete Tm.
  • Für ein Monitoring der Schmelzkurven mit SYBRTM Green I sind die bevorzugten Bedingungen eine 1:7.000-1:30.000-fache Verdünnung von SYBRTM Green I und Aufheizgeschwindigkeiten von 0,1-0,5°C/Sekunde. Diese Bedingungen ermöglichen eine leichte Unterscheidung von Produkten, die sich in der Tm um 2°C unterscheiden.
  • Eine genauere Temperaturkontrolle und Software zur Schmelzpeak-Analyse wird den nachweisbaren Unterschied in der Tm auf den Bruchteil eines Grads verringern. Dies wird die Unterscheidung der meisten PCR-Produkte ermöglichen. Nicht alle Produkte können jedoch über die Tm unterschieden werden, genauso wie es möglich ist, Elektrophoreseergebnisse aufgrund der Comigration von zwei oder mehreren Produkten falsch zu interpretieren, ist es möglich, dass ein Teil der Produkte, die im erwarteten Bereich schmelzen, nicht die angestrebten Produkte darstellen. Wenn jedoch im Bereich des erwarteten Produkts keine DNA schmilzt, lässt sich daraus der Schluss ziehen, dass kein erwartetes Produkt vorliegt.
  • Eine andere Form der Produktunterscheidung, die mit einer Schmelzkurvenanalyse verfügbar wird, sind die markanten Muster beim Domänenschmelzen, die man bei längeren PCR-Produkten sieht. Während kurze Produkte (<300 bp) normalerweise in einem Umwandlungsvorgang schmelzen, können längere Produkte interne Schmelzdomänen haben, die den Schmelzkurven ein komplexes, markantes Aussehen verleihen. Diese komplexen Schmelzkurven können als „Fingerprint" zur Identifizierung des Produkts verwendet werden.
  • Die Analyse von Schmelzkurven kann verwendet werden, um angestrebtes Produkt von unspezifischen Produkten wie Primerdimeren, zu unterscheiden. Primerdimere schmelzen über einen breiten Bereich niedriger Temperaturen, sehr verschieden von den scharfen Schmelzkurven spezifischer PCR-Amplifikationsprodukte. Längere heterogene Produkte, die beim Durchlaufen vieler Zyklen bei niedrigstringenten Bedingungen für ein Annealing entstehen, weisen im Vergleich mit reinem PCR-Produkt niedrigere und breitere Schmelzkurven auf.
  • Beispiel 9
  • Die Amplifikation des 536-beta-Globingenfragments wurde analog Beispiel 3 mit einer 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Bedingungen variiert wurden. Bei Reaktion A (40) wurde kein Templat zugegeben und die Reaktion wurde 0 sec bei 94°C, 0 sec bei 60°C und 10 sec bei 72°C 30 Zyklen lang einem Thermocycling unterzogen, was kleine, unspezifische Amplifikationsprodukte lieferte. Bei B zeigte die Amplifikation von 106 anfänglichen Kopien des gereinigten Templats bei niedrigstringenten Bedingungen (94°C für 0 sec, 50°C für 0 sec und 72°C für 10 sec) über 55 Zyklen bei der Gelelektrophorese einen breiten Größenbereich für die Amplifikationsprodukte und ein Schmelzen über einen weiten Temperaturbereich. Bei C wurden 106 anfängliche Kopien gereinigtes Templat 0 sec bei 94°C, 0 sec bei 60°C und 10 sec bei 72°C 30mal einem Thermocycling unterzogen und es zeigt sich eine einzelne klare Bande und ein Schmelzen mit einem scharfen Übergang. Die Geschwindigkeit des Temperaturwechsels betrug 0,2°C/sec. Ein Hind III-Verdau von λ-Phagen-DNA (M) wird als Marker verwendet.
  • 40 zeigt, wie genau Schmelzkurven die Spezifität einer PCR-Reaktion wiedergeben. Die scharfe Schmelzkurve C bei hoher Temperatur entspricht einer einzelnen Bande auf einem Gel. Die breite Schmelzkurve A bei niedriger Temperatur entstammt der Analyse einer Kontrolle ohne Templat, die nur Primerdimere zeigt. Eine Überamplifikation des Produkts bei C ergibt eine dazwischen liegende Schmelzkurve B, die von dem spezifischen Produkt noch deutlich zu unterscheiden ist.
  • Die zum Beispiel in 37 zu sehenden Schmelzkurven können besser quantifiziert werden, wenn man zuerst die Ableitung von Fluoreszenz (F) gegen die Temperatur (T) nimmt. Diese Ableitung wird als dF/dT gegen T dargstellt und überführt die Schmelzkurven in Schmelzpeaks.
  • Beispiel 10
  • Die gereinigten Hepatitis B- und beta-Globin-Genfragmente aus Beispiel 8 wurden einzeln und zusammen bei einer Temperaturwechselgeschwindigkeit von 0,2°C/sec und den weiteren in Beispiel 8 (41) spezifizierten Bedingungen aufgeschmolzen. Die etwas subjektive Bestimmung von Tm aus den Schmelzkurven (oben) ergibt sich leicht durch unmittelbare Betrachtung der Schmelzpeaks (unten). Die Fläche unter den Schmelzpeaks kann auch durch Integration der Fläche unter den Kurven quantifiziert werden. Die Baseline der Fluoreszenz wurde zuerst vom Diagramm –dF/dT gegen T subtrahiert, in der Annahme, dass sich die Höhe der Baseline mit der Fläche unter der Kurve ändert. Dann wurden die Peaks mit dem Mittelwert, der Standardabweichung und der Höhe der Peaks als Anpassungsparameter durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate für Gaußkurven angepasst. Die Fläche unter jeder Gaußkurve wurde als Peakfläche genommen. Alle Berechnungen erfolgten in der LabView-Programmierumgebung (National Instruments, Austin, TX). 41 zeigt beispielhaft eine Umrechnung der Schmelzkurven in Schmelzpeaks. Der Code für diese Berechnungen ist als Anhang A beigefügt.
  • Die Fähigkeit, ein spezifisches Produkt von einem Primerdimer und andere Reaktionsartefakten zu unterscheiden, verbessert die Verwendung von doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen bei der Quantifizierung niedriger anfänglicher Kopienzahlen. Relativ große anfängliche Kopienzahlen des Templats wurden mit Ethidiumbromid quantifiziert (Higuchi & Watson, supra). Bei niedrigen anfänglichen Kopienzahlen stören jedoch Background-Amplifikation der Primerdimere und andere Amplifikationsartefakte das spezifische Amplifikationssignal. Mit der Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, spezifische Produkte von unspezifischen Produkten zu unterscheiden, können doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe zur Quantifizierung niedriger anfänglicher Kopienzahlen des Templats verwendet werden. Dieser Vorteil ergibt sich aus der Einfachheit der Anwendung dieser Farbstoffe. Die doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffe können bei jeder Amplifikation verwendet werden und es sind keine kundenspezifisch fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide notwendig. Die Quantifizierung sehr geringer Kopienzahlen mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen erfordert eine sehr gute Amplifikationsspezifität oder, wie mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt, ein Mittel, um zwischen dem gewünschten Produkt von einer unspezifischen Amplifikation zu unterscheiden.
  • Beispiel 11
  • Der erfindungsgemäße Ansatz für eine Reinheitsbestimmung des Produkts wurde verwendet, um die quantitativen PCR basierend auf einem Once-per-cycle-Monitoring der Fluoreszenz doppelstrangspezifischer DNA-Farbstoffe zu verbessern. Die Fluoreszenz wurde einmal pro Zyklus nach Extension des Produkts mit Polymerase für eine Reihe von Reaktionen erfasst, die sich in der anfänglichen Konzentration des gereinigten beta-Globin-Templats unterschieden (siehe 42A). Das beta-Globin-Templat und die Amplifikationsbedingungen waren analog zu Beispiel 3. Der log-lineare Anstieg über die Background- Fluoreszenz begann bei einer Zyklenzahl, die von der anfänglichen Templatkonzentration abhing. Die Diagramme für die fünf Reaktionen über einen Bereich von 106 bis 102 Kopien pro Reaktion waren durch etwa vier Zyklen getrennt. Die Probe mit durchschnittlich 102 Kopien pro Reaktion zeigte eine Abnahme der Reaktionseffizienz und Reaktionen mit anfänglichen Kopienzahlen unter 100 ergaben weniger brauchbare Fluoreszenzprofile. Die Fluoreszenzprofile für die Reaktionen mit (durchschnittlich) 10 und 1 Kopie(n) stiegen in umgekehrter Reihenfolge an und die negative Kontrolle zeigte nach etwa 30 Zyklen eine Amplifikation. Dies ist auf eine Amplifikation von Primerdimeren und auf andere unspezifische Amplifikationsprodukte zurückzuführen, die sich mit einem Once-per-cycle-Fluoreszenz-Monitoring des doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffs nicht von dem vorgesehenen Produkt unterscheiden lassen.
  • Für jede Probe wurden die Schmelzpeaks aufgenommen (42AB) und es stellte sich heraus, dass sie gut mit den Elektrophoreseergebnissen korrelierten (42C). Die Reaktion mit null und durchschnittlich einer Templatkopie lieferte keine wahrnehmbare Elektrophoresebande an der für 536 Basenpaare erwarteten Position. Die Reaktionen mit 10 und 100 anfänglichen Templatkopien zeigten schwache Elektrophoresebanden. Dies stimmte gut mit der Schmelzpeak-Analyse überein, die im Bereich des angestrebten Produkts (90-92°C) für die Reaktionen mit null und einer anfänglichen Kopie kein Aufschmelzen von DNA zeigte und für 10 und 100 Kopien in diesem Temperaturbereich kleine Peaks zeigte. Starke Elektrophoresebanden für die Reaktionen mit 103-106 anfänglichen Kopien korrelieren gut mit großen Schmelzpeaks im erwarteten Bereich von 90-92°C.
  • Das Verhältnis an angestrebtem Produkt zu Gesamtprodukt, das durch Integrieren über die Schmelzpeaks bestimmt wurde, reichte von 0,28 für 105 Kopien bis 0,0002 für null anfängliche Templatkopien. Jeder Fluoreszenzwert in 41A wurde mit dem passenden Verhältnis multipliziert, um das korrigierte Diagramm zu erhalten (in 42D als „korrigierte Fluoreszenz" bezeichnet). Diese Vorgehensweise erweiterte den effektiven dynamischen Quantifizierungsbereich auf zwischen 10 und 1 anfängliche Templatkopien.
  • Schmelzpeaks können zwischen spezifischen Produkten und unspezifischen Produkten unterscheiden (40) und sie können zwischen zwei gereinigten, miteinander vermischten PCR-Produkten unterscheiden (41), so dass sie auch geeignet sein sollten, um zwei spezifische Produkte, die zusammen in einem einzelnen Reaktionsröhrchen amplifiziert wurden, voneinander zu unterscheiden. Die durch ein erfindungsgemäßes kontinuierliches Monitoring von PCR-Reaktionen erhaltenen Schmelzkurven sind bei einer Multiplex-PCR nützlich.
  • Beispiel 12
  • In diesem Beispiel wurden zwei Genfragmente gleichzeitig aus genomischer DNA amplifiziert und einem Fluoreszenz-Monitoring mit SYBRTM Green unterzogen. Bei jedem Amplifikationszyklus denaturieren verschiedene Amplifikationsprodukte bei Schmelztemperaturen, die von der Länge des Produkts, dem GC-Verhältnis und anderen dem Fachmann bekannten Faktoren abhängen. Die Temperatur, bei der jedes Produkt schmilzt, kann mit dem doppelstrangspezifischen Farbstoff, SYBRTM Green I verfolgt werden. Ein 81 bp-Fragment aus dem cystischen Fibrosegen wurde mit den hier als SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 beschriebenen Primern amplifiziert, zusammen mit einem 98 bp-Fragment des c-erbB-2 (HER2/neu)-Onkogens, das mit den hier als SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 beschriebenen Primern amplifiziert wurde.
  • Die Amplifikationsreaktionen bestanden aus 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 200 μM von jedem dNTP und 0,5 μM cystische Fibrose-Primer, 0,3 μM HER2/neu-Primer, eine 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I, 1 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) und 50 ng humaner genomischer DNA in 10 μl.
  • Nach 30 Minuten Aktivierung der Polymerase bei 95°C wurden die Proben 0 Sekunden bei 94°C (Steigung = 20), 0 Sekunden bei 55°C (Steigung = 20) und 10 Sekunden bei 70°C (Steigung = 29) 35 Zyklen lang einem Thermocycling unterzogen. Die Proben wurden auf 70°C abgekühlt und die Fluoreszenz wurde während eines Anstiegs mit 0,2°C/sec auf 94°C kontinuierlich erfasst. Die Schmelzkurven (43) zeigten deutlich zwei unterschiedliche Produkte, die bei 78°C (CFTR) und 89°C (neu) schmolzen. Die beiden Produkte unterscheiden sich in ihrem Tm um ungefähr 10°C und sind leicht voneinander zu unterscheiden.
  • Eine Multiplex-Amplifikation eignet sich für Fälle, bei denen eine interne Kontrolle bei der Amplifikation nötig ist. Beispielsweise sind mit einer PCR viele Translokationen nachweisbar, indem man auf beiden Seiten des „Breakpoint" Primer plaziert. Wenn keine Amplifikation stattfindet, liegt keine Translokation vor, falls die DNA intakt ist und nicht ein Inhibitor vorhanden ist. Diese Möglichkeiten können ausgeschlossen werden, indem man einen positiven Kontrolllokus in der gleichen Reaktionsmischung amplifiziert. Solche Kontrollamplifikationen werden am besten als interne Kontrollen mit gleichzeitig Amplifikation und Nachweis durchgeführt.
  • Beispiel 13
  • Bei diesem Beispiel wurde entsprechend Beispiels 12 verfahren, mit der Ausnahme, dass die Proben nach 30 Minuten Aktivierung der Polymerase bei 95°C 20 Zyklen 0 Sekunden bei 94°C (Steigung = 20), 0 Sekunden bei 55°C (Steigung = 20) und 10 Sekunden bei 70°C (Steigung = 20) und anschließend 15 Zyklen 0 Sekunden bei 94°C (Steigung = 1), 0 Sekunden bei 55°C (Steigung = 20) und 20 Sekunden bei 70°C (Steigung = 20) einem Thermocycling unterzogen wurden. Für die Zyklen 26-31 wurde die Fluoreszenz für jeden Wechsel von 1°C/sec von 70°C bis 94°C kontinuierlich erfasst. Die Schmelzkurven wurden in Schmelzpeaks umgerechnet und dargestellt (44).
  • Es ist anzumerken, dass die Amplifikationseffizienz des CFTR-Fragments größer zu sein scheint als die des neu-Fragments. Die Amplifikazionseffizienz kann durch die Integration der Daten für die Schmelzpeaks wie in Beispiel 10 genau bestimmt werden.
  • Diese Art quantitativer Daten in Bezug auf eine Kontrolle hat viele Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise werden manche Onkogene wie HER2/neu in vielen Tumoren in vivo amplifiziert. Das heißt, dass die Gene in genomischer DNA, manchmal viele male, repliziert werden. Oft hängt das klinische Verhalten des Tumors vom Ausmaß der Onkogenreplikation ab. Die Amplifikation des Onkogens und eines Kontrolltemplats ermöglicht eine quantitative Bestimmung der relativen Kopienzahl. Ein weiteres Beispiel ist die Quantifizierung der Virusbelastung eines Patienten, der mit HIV oder Hepatitis C infiziert ist, die bei der Prognose und Therapie von Bedeutung ist. Durch Verwendung eines Kontrolltemplats und durch ein Monitoring der Amplifikationseffizienz sowohl der Kontrolltemplate als auch der natürlichen Template bei der Amplifikation, lässt sich eine genaue Quantifizierung der anfänglichen Kopienzahl des Templats erreichen.
  • Das erfindungsgemäße Merkmal der Verwendung von Schmelzkurven zur relativen Quantifizierung soll nachfolgend erörtert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung stellt eine quantitative PCR eine zusätzliche Verwendungsmöglichkeit für die Schmelzkurven dar. 42 zeigte, dass eine Korrelation zwischen der Fläche unter dem Schmelzpeak und der Menge an spezifischem Produkt bestand. Eine relative Quantifizierung zweier PCR-Produkte sollte möglich sein, wenn die beiden Produkte mit ähnlicher Effizienz amplifiziert würden (oder wenn die unterschiedlichen Effizienzen bekannt wären und ausgeglichen werden könnten). Die relative Quantifizierung der beiden Produkte durch Integration über die Schmelzpeakflächen (siehe Beispiel 10) stellt einen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
  • Beispiel 14
  • Die Fragmente der Gene für cystische Fibrose und HER-2-neu aus Beispiel 12 wurden amplifiziert, analog zu Beispiel 2 gereinigt und auf 175 μg/ml eingestellt. Die Proben wurden in verschiedenen Verhältnissen (insgesamt 8 μl) vermischt und zu Puffer (1 μl) und SYBRTM Green I (1 μl) gegeben. Die Endkonzentrationen betrugen 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 250 μg/ml Rinderserumalbumin und eine 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I. Die Schmelzkurven wurden bei 0,2°C/s aufgenommen, die Background-Fluoreszenz subtrahiert und die Peaks wie in Beispiel 10 beschrieben integriert. Die Ergebnisse sind in 45 dargestellt. Es zeigte sich eine ausgezeichnete Korrelation zwischen den relativen Flächen unter den Schmelzpeaks und den relativen Mengen der beiden Produkte.
  • Eine relative Quantifizierung von zwei PCR-Produkten ist für viele quantitative PCR-Anwendungen von Bedeutung. Eine Multiplex-Amplifikation von zwei oder mehr Produkten, denen eine Integration der Flächen unter den Schmelzpeaks folgt, ist auf diesem Gebiet sehr nützlich. mRNA wird oft bezogen auf die Menge an mRNA eines Housekeeping-Gens quantifiziert.
  • Eine andere wichtige Anwendung der relativen Quantifizierung ist bei einer kompetitiven quantitativen PCR gegeben. Üblicherweise wird ein Kompetitor synthetisiert, der die gleichen Primerstellen aufweist, sich aber in der Länge von der Original-Targetsequenz unterscheidet. Bekannte Mengen des Kompetitors werden in eine unbekannte Probe gemischt und es wird eine relative Quantifizierung durchgeführt. Es können Kompetitoren hergestellt werden, die sich von der Targetsequenz in ihrer Tm und nicht in der Länge unterscheiden. Die relativen Mengen der Produkte können durch Vergleich der Flächen unter ihren Schmelzpeaks quantifiziert werden. Wenn die Menge eines der Produkte bekannt ist, lässt sich die Menge des ursprünglichen Targets erhalten. Das Schmelzpeakverfahren ist erheblich einfacher als die derzeit gebräuchlichen Verfahren, die das Laufen lassen von mehreren Röhrchen für jede unbekannte Probe und ein mehrmaliges Ziehen von Röhrchen bei verschiedenen Zykluszahlen bei der Reaktion beinhalten, um den log-linearen Teil der Reaktion zu finden. Dann müssen die relativen Mengen der beiden Produkte bestimmt werden. Üblicherweise erfolgt dies, indem man eines der dNTPs mit einem Radioisotop markiert und anschließend nach Agarosegelelektrophorese die Menge an Marker quantifiziert, die in jede Bande eingebaut ist. Im Vergleich dazu ermöglicht die vorliegende Erfindung ein kontinuierliches Monitoring der Reaktion, so dass der log lineare Teil der Amplifikation leicht bestimmt werden kann. Die relative Quantifizierung kann durch Integration der Schmelzpeaks schnell durchgeführt werden. Ein Ganztagesprozeß wird auf weniger als eine Stunde reduziert.
  • Aus der vorhergehenden Diskussion ergibt sich, dass Fluoreszenz-Monitoring bei DNA-Amplifikation eine außergewöhnlich leistungsstarke analytische Methode ist. Wenn sequenzspezifischer Nachweis und Quantifizierung erwünscht sind, können Resonanzenergietransfersonden anstelle von doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen verwendet werden. Die Tm der Hybridisierungssonden verschiebt sich bei einem einzelnen Basen-Mismatch um etwa 4-8°C. Wenn eine Hybridisierungssonde an der Stelle einer Mutation plaziert wird, sind einzelne Basenmutationen als Verschiebung der Schmelztemperatur der Sonde nachweisbar.
  • Absolute Produktkonzentration durch Reassoziationskinetik des Produkts. Bestimmungen der Produktkonzentration werden mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorteilhaft durchgeführt. Ein kontinuierliches Monitoring der Bildung doppelsträngiger DNA ermöglicht bei jedem Amplifikationszyklus eine DNA-Quantifizierung durch eine Reassoziationskinetik. Die Probentemperatur wird schnell von der Denaturierungstemperatur abgesenkt und bei einer niedrigeren Temperatur konstant gehalten, die noch hoch genug ist, um ein Primer-Annealing zu verhindern (2). Die Geschwindigkeit der Reassoziation des Produkts folgt einer Kinetik zweiter Ordnung (siehe B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71, B. Hames & S. Higgins, Hrsg., (1985)).
  • Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung gemessen werden. Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann jede unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentellen Reassoziationsdaten bestimmt werden. Das Abkühlen erfolgt nie unmittelbar und ein gewisses Reannealing tritt immer auf, bevor eine konstante Temperatur erreicht wird. Ein schnelles Abkühlen maximiert die Menge der Daten, die für eine Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante und der DNA-Konzentration zur Verfügung stehen. Die Methode erfordert ein reines PCR-Produkt, dies kann aber durch Schmelzkurven, die bei der vorliegenden Erfindung ebenfalls während des Thermocyclings erhalten werden, sichergestellt werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Quantifizierung ist in vorteilhafter Weise unabhängig von jeder Schwankung der Signalintensität zwischen den Proben.
  • Beispiel 15
  • Ein 536 bp-Fragment des beta-Globingens wurde aus humaner genomischer DNA amplifiziert (Beispiel 3) und gereinigt (siehe Beispiel 2).
  • Verschiedene Mengen der gereinigten DNA wurden mit einer 1:30.000-Verdünnung von SYBRTM Green I in 5 μl 50 mM Tris, pH 8,3 und 3 mM MgCl2 vermischt. Die Proben wurden bei 94°C denaturiert und anschließend schnell auf 85°C abgekühlt. Das Fluoreszenz-Monitoring bei 520-550 nm erfolgte zeitlich bei 85°C. Wenn verschiedene DNA-Konzentrationen getestet wurden, war die Form der Reassoziationskurve für die DNA-Konzentration charakteristisch (siehe 49). Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung bestimmt werden. 50 zeigt die Bestimmung einer Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung für die Reassoziation für 100 ng des 536 bp-Fragments in 5 μl bei 85°C. Die Kurve wurde durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate mit Fmax, Fmin, t0 und k als Fließparametern angepasst, wobei die in 50 gezeigte Geschwindigkeitsgleichung zweiter Ordnung verwendet wurde. Analyseprogramme für diese Art von Kurvenanpassung sind im Stand der Technik allgemein bekannt (beispielsweise die benutzerdefinierte Kurvenanpassung von Delta Graph, DeltaPoint, Inc., Monteray, CA). Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann eine unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentellen Reassoziationsdaten bestimmt werden.
  • Mit der definierten Geschwindigkeitskonstanten (k) werden die DNA-Konzentrationen in unbekannten Proben bestimmt. Die Kurven von Fluoreszenz gegen Zeit unbekannter Proben werden durch nichtlineare Regression nach der Methode der Abweichung der kleinsten Quadrate, vorzugsweise bei Thermocycling in Echtzeit (beispielsweise mit dem nichtlinearen Levenberg-Marquardt-Verfahren, das in der LabView-Programmierumgebung, National Instruments, Austin, TX, beschrieben ist) angepasst. Bei dieser Anpassung Sind Fmax, Fmin, t0 und [DNA] die Fließparameter und k ist konstant.
  • Da einige Fluoreszenzfarbstoffe konzentrationsabhängig das Reannealing beeinflussen, wird die Annahme einer Kinetik zweiter Ordnung für die Reassoziation des Produkts durch Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten bei verschiedenen Konzentrationen einer Standard-DNA überprüft. Die Beziehung ist definiert und bei Bedarf wird eine alternative Formel zur Anpassung inkorporiert.
  • Die Annealinggeschwindigkeiten für die Sonden benutzt, um die Produktkonzentration zu bestimmen, ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Produktkonzentration durch Produktreassoziation. Die Schritte werden wie folgt zusammengefasst: (1) Wählen der für das System geeigneten Geschwindigkeitsgleichung (2) Laufen lassen bekannter DNA-Standards, um die Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen, (3) Überprüfen der Gültigkeit der Geschwindigkeitsgleichung durch Vergleich verschiedener Geschwindigkeitskonstanten, die sich von verschiedenen Verdünnungen ableiten, und (4) Verwendung der Geschwindigkeitskonstanten zur Bestimmung der DNA-Konzentration von Unbekannten aus deren Daten für das Sondenannealing.
  • Fluoreszenz-Feedback zur Steuerung des Thermocycling. Im Gegensatz zur Endpunkt- und Cycle-by-cycle-Analyse kann Fluoreszenz-Monitoring mit der vorliegenden Erfindung auch über jeden Temperaturzyklus hinweg erfolgen. Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring kann zur Steuerung der Parameter des Thermocycling genutzt werden. Die vorliegende Erfindung nutzt ein Fluoreszenz-Feedback zur Echtzeitsteuerung und Optimierung der Amplifikation. Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring von PCR-Proben, die einen doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff oder fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonden enthalten, kann für ein Monitoring von Hybridisierung und Aufschmelzen während einzelner Amplifikationszyklen verwendet werden. Diese Informationen können von den Algorithmen zur Temperatursteuerung in der Thermocycling-Apparatur verwendet werden, um die Bedingungen für das Thermocycling zu verbessern und für den Benutzer maßzuschneidern. Eine herkömmliche PCR wird durchgeführt, indem man vor der Amplifikation alle Cyclingparameter programmiert. Bei einem kontinuierlichen Monitoring kann eine Bestimmung der Erfordernisse für das Thermocycling während der Amplifikation erfolgen, basierend auf einer kontinuierlichen Beobachtung des Annealing, der Extension und der Denaturierung. Die potentiellen Vorteile einer Verwendung von Hybridisierungsinformationen zur Kontrolle des Thermocycling beinhalten:
    • 1. Sicherstellung einer vollständigen Denaturierung des PCR-Produkts in jedem Zyklus und gleichzeitig: a. Minimieren der Exposition von übermäßig hohen Denaturierungstemperaturen um so eine durch Hitze induzierte Schädigung der Amplifikationsprodukte und der Polymerase zu vermeiden. Begrenzen der Dauer, für die das Produkt den Denaturierungstemperaturen ausgesetzt ist, ist besonders nützlich bei der Amplifikation langer Produkte. b. Erhöhen der Reaktionsspezifität durch Minimierung der Denaturierungstemperatur. Dies selektiert gegen Produkte mit einer Tm, die höher ist als die des angestrebten Amplifikationsprodukts.
    • 2. Maximieren der Amplifikationseffizienz durch Sicherstellen einer für das Primerannealing bei jedem Zyklus ausreichenden Zeit und gleichzeitig: a. Minimieren der Zeitdauer, die zur Amplifikation erforderlich ist, indem man das Primerannealing nicht länger als nötig erlaubt, um eine bestimmte Effizienz zu erreichen. b. Verbesserung der Reaktionsspezifität durch Minimieren der Zeitdauer bei Annealingtemperatur.
    • 3. Maximieren der Amplifikationseffizienz durch Sicherstellen einer für die Extension bei jedem Zyklus ausreichenden Zeit und gleichzeitig: a. Minimieren der Zeitdauer, die zur Amplifikation erforderlich ist, indem man nicht mehr Zeit als nötig erlaubt, um die Produktextension abzuschließen. b. Verbesserung der Reaktionsspezifität, indem man gegen Produkte selektioniert, die länger sind als das angestrebte Amplifikationsprodukt. Diese würden mehr als die zugeteilte Zeit brauchen, um die Produktextension abzuschließen.
    • 4. Initiieren von Änderungen beim Thermocycling in Abhängigkeit von der erhaltenen Fluoreszenzstärke oder der momentanen Amplifikationseffizienz. Beispielsweise können Überamplifikation und unspezifische Reaktionsprodukte minimiert werden, indem man das Thermocycling beendet, wenn die Effizienz auf einen bestimmten Wert fällt. Als weiteres Beispiel können die Temperaturwechsel modifiziert werden, um langsamere Temperaturanstiege zur Aufnahme von Schmelzkurven zu initiieren, wenn die Fluoreszenz nachweisbar wird. Dies spart Zeit, weil die langsameren Anstiege nicht bei früheren Zyklen verwendet werden müssen. Andere wünschenswerte Veränderungen werden bei der weiteren Ausführung der Erfindung deutlich.
  • Die Steuerung basiert auf einer Abschätzung der Reaktionsparameter aus den Fluoreszenzdaten. Die originären Fluoreszenzdaten werden entweder als Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit (temperaturspezifische Geschwindigkeiten von Denaturierung, Annealing und Extension), als Änderung der Fluoreszenz mit der Temperatur (Produkt- oder Sonden-Tm) oder als Änderung in der Stärke der Amplifikation (Amplifikationsausbeute und -effizienz) erhalten. Diese Geschwindigkeiten, Tm und ihre ersten und zweiten Ableitungen werden verwendet, um die optimalen Reaktionsparameter zu bestimmen, welche Temperatur und Zeit für die Denaturierung, Temperatur und Zeit für das Primerannealing, Temperatur und Zeit für das Sondenannealing, Temperatur und Zeit für die enzymatische Extension und die Zyklenzahl umfassen.
  • Doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe werden zur Kontrolle der Denaturierung, zur Kontrolle der Extension und zur Initiierung von Änderungen im Thermocycling bei einer bestimmten Amplifikationshöhe oder – effizienz verwendet.
  • Beispiel 16
  • Ein kommerziell erhältlicher Thermocycler zum Fluoreszenz-Monitoring (LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Falls, Idaho) wurde so modifiziert, dass die Software nicht länger mit Temperatur/Zeit-Sollwerten programmiert ist, sondern auf die Erfassung der Fluoreszenzwerte programmiert ist, um diese Werte anschließend zur Steuerung des Thermocyclers zu verwenden.
  • Wie im Funktionalen Blockdiagramm (51) dargestellt ist, kommuniziert das Lauf-Zeit-Programm über serielle und DAQ-Board-Schnittstellen mit dem LightCycler. Dies ermöglicht einen Zugriff auf entweder Temperatur- oder Fluoreszenzdaten auf höchster Ebene und kann auch von der Board-Level-Software zur Temperatursteuerung verwendet werden. In der vorliegenden Ausführungsform des Geräts werden jedoch nur die Temperaturdaten auf der Controller-Hardware-Ebene in die digitale Form umgewandelt. Die Fluoreszenzdaten werden in analoger Form durch die Schnittstelle des Boards zur digitalen Erfassung geschickt, mit dem Lauf-Zeit-Programm analysiert und über die serielle Schnittstelle zur Board-Level-Software zurückgeschickt.
  • Steuerung des Aufschmelzens von Produkt:
  • Für das angestrebte PCR-Produkt wurde ein Schmelzpeak aufgenommen und für die Probe, die den Reaktionscocktail enthielt, wurde bei der Temperatur, bei der das Produkt vollständig geschmolzen war, eine Baseline-Fluoreszenz erfasst.
  • Jeder Zyklus der Reaktion verwendete dann diesen Fluoreszenzwert als Sollwert. Die Annäherung an die Denaturierung des Produkts erfolgte in zwei Stufen, um die durch die Notwendigkeit begründete Zeitverzögerung zu umgehen, den Fluoreszenzwert zur Analyse zu einem entfernten Computer zu senden und anschließend die Anweisung, dass der Wert erreicht worden war, zurückzusenden. Mit jedem Schritt zum Schmelzen des Produkts wurde die Temperatur erhöht, bis die Fluoreszenz einen Zwischenwert erreichte, dann wurde die Heizstärke so reduziert, dass eine Temperaturanstiegsgeschwindigkeit von ungefähr 3°C/sec dem Computer die Zeit ließ, die Fluoreszenz zu analysieren und dem Thermocycler das Signal zu geben, dass eine Produktdenaturierung stattgefunden hatte.
  • Das resultierende Temperatur/Zeit-Diagramm (52) zeigt einen charakteristischen Anstieg der Schmelztemperatur nach Zyklus 20, wenn die Konzentration des Amplifikationsprodukts ansteigt. Die Tm des Produkts ist eine Funktion der Produktkonzentration.
  • Produkt-Annealing/Extension:
  • Das Fluoreszenz-Monitoring erfolgte bei einer längeren Haltezeit bei einer kombinierten Annealing/Extensionstemperatur und diese Information wurde verwendet um sicherzustellen, dass eine ausreichende, aber nicht übermäßige Zeit für die Produktextension erlaubt worden war. Das Fluoreszenz-Monitoring erfolgte in Abständen von 10 Sekunden, wenn die Fluoreszenz höher als ein einstellbares Verhältnis (üblicherweise 1,00-1,05) anstieg, und dann wurde der Annealing/Extensionsschritt fortgesetzt. Ansonsten wurde der nächste Schritt zum Schmelzen des Produkts initiiert. Das Intervall von 10 Sekunden wurde gewählt, um bei der kombinierten Annealing/Extensionstemperatur ein Minimum von 20 Sekunden zu haben.
  • Das resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm (52) zeigt einen charakteristischen Anstieg in der Verweilzeit bei der kombinierten Annealing/Extensionstemperatur, wenn die Konzentration des Amplifikationsprodukts zunimmt. Da die Primerkonzentration und die Polymerase limitierend werden, wird bei jedem Zyklus mehr Zeit zur Beendigung der Produktextension benötigt.
  • Amplifikationsplateau:
  • Am Ende jedes Annealing/Extensionsschritts wurde der Fluoreszenzwert erfasst und gespeichert. Wenn dieser Wert auf das 1,2-fache des niedrigsten Fluoreszenzwerts am Ende eines Zyklus angestiegen war und danach unterhalb eines vom Benutzer einstellbaren Verhältnisses (üblicherweise 1,00-1,02) aufgehört hatte, zu steigen, wurde das Thermocycling beendet. Dazu wurde ein Schritt zur Erfassung der Schmelzkurven initiiert, indem ein langsamer Temperaturanstieg von 0,1-0,2°C/Sekunde über die Produkt-Tm hinweg eingegeben und ein kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring der Probe durchgeführt wurde.
  • Das resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm (52) zeigt, dass das Verhältnis der Cycle-by-cycle-Zunahme der Fluoreszenz nach 25 Amplifikationszyklen unter 1,00 fiel und die Reaktion beendet war.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis des Amplifikationsplateaus verwendet, um in einem Versuch mit mehreren Proben bei einem für jede Probe optimalen Temperaturzyklus für jede Probe hochaulösende Schmelzkurven zu erfassen. Wenn eine Probe ihr Amplifikationsplateau erreicht, wird für diese Probe eine Schmelzkurve aufgenommen, anschließend wird das reguläre Thermocycling wieder aufgenommen, bis eine andere Reaktion ihr Amplifikationsplateau erreicht.
  • Zusammenfassung. Aus der vorhergehenden Diskussion wird deutlich, dass kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring bei der DNA-Amplifikation zum Monitoring von Hybridisierung eine außergewöhnlich leistungsstarke analytische Methode ist. Mit den hier beschriebenen Verfahren und abhängig von der Zahl der zu Anfang vorhandenen Templatkopien, kann man in fünf bis zwanzig Minuten nach Beginn des Thermocycling eine Identifizierung und Quantifizierung des Produkts erreichen. Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile, die im Stand der Technik bislang nicht möglich waren. Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise Verfahren mit Einfarbenfluoreszenz zum Monitoring der Produktreinheit, zur relativen Quantifizierung mit Multiplex-PCR oder kompetitiver PCR, zur absoluten Produktquantifizierung mittels Reassoziationskinetik bereit, und ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von anfänglichem Templat durch Diagramme von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl.
  • Die folgende Tabelle beschreibt doppelstrangspezifische DNA-Farbstoffe, die sich zum kontinuierlichen Monitoring von PCR eignen. Die Fluoreszenz doppelstrangspezifischer DNA-Farbstoffe hängt vom Strangstatus der DNA ab. Zusammenfassung von Fluoreszenzsonden zum kontinuierlichen Monitoring von PCR
    Hybridisierung dsDNA-Farbstoff
    Mechanismus Strangstatus
    Sondensynthese Unnötig
    Spezifität Produkt-Tm
    Schmelzanalyse Ja
    Mehrfarbenanalyse Nein
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz 1-10mal pro sec erfasst und bei den Temperaturwechseln werden Feindetails von Produkt- und/oder Sondenhybridisierung beobachtet. Mit dem doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoff SYBRTMGreen I wird die Produkthybridisierung bezogen auf die Temperatur verwendet, um Produkte mit Hilfe der Schmelzkurven zu bestimmen. Zudem erreicht man eine relative Quantifizierung von Produkt durch Multiplex-Amplifikation zweier oder mehrerer verschiedener Produkte, die sich in der Tm unterscheiden. Ferner führt man eine kompetitive PCR durch, indem man die Sequenz innen in den gemeinsamen Primern so ändert, dass zwei oder mehr Produkte verschiedene Tm aufweisen. Eine absolute Produktquantifizierung erhält man durch schnelles Abkühlen des denaturierten Produkts und Beobachten der Reassoziations kinetik. Die Empfindlichkeit der Quantifizierung von anfänglichem Templat mit Diagrammen von Fluoreszenz gegen Zyklenzahl wird durch Analyse der Produktschmelzkurven zur Kontrolle auf unspezifische Amplifikation und durch Algorithmen zur Kurvenanpassung erhöht. Schließlich erhält man ein unmittelbares Fluoreszenz-Feedback zur Steuerung von Denaturierungsbedingungen, Elongationszeiten und der Produktausbeute durch Monitoring des Strangstatus des Produkts mit doppelstrangspezifischen DNA-Farbstoffen.
  • Wenn eine Mulitplex-Analyse in einer PCR-Reaktion erwünscht ist, ist es üblich, zur Identifizierung mehrerer Produkte verschiedene Fluoreszenzmarker mit unterscheidbaren Emissionsspektren zu verwenden. Die Analyse wird durch die begrenzte Zahl verfügbarer Fluorophore und die überlappenden Emissionsspektren der verfügbaren Fluorophore kompliziert (siehe HM Shapiro, supra). Die Analyse der Produkt- oder Sondenhybridisierung mit Hilfe von Schmelzkurven stellt ein weiteres Verfahren zur Unterscheidung multipler PCR-Produkte dar. Durch Verfolgen der Hybridisierung bei Temperaturwechseln kann die Anzahl an Sonden und/oder Spektralfarben, die zur Unterscheidung multipler Produkte notwendig sind, minimiert werden.
  • Der Programmiercode für Schmelzkurvenanalysen und anderen Analysen ist auf den nächsten Seiten zu finden.
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  • NICHTLINEARE LEV-MAR-ANPASSUNG:
  • Dieses VI verwendet den Levenberg-Marquardt-Algorithmus zur Bestimmung der least square-Gruppe der Koeffizienten, die am besten mit der Gruppe der Eingabe-Datenpunkte (X,Y) übereinstimmen, wie durch eine nichtlineare Funktion Y = F(X,A) ausgedrückt wird, wo A die beste Gruppe der Koeffizienten kennzeichnet. Dieses VI erzeugt auch die beste Kurvenanpassung Y = F(X,A).
  • Der Benutzer muß ein Sub-VI „TARGET FNC & DERIV NONLIN" öffnen und seine/ihre nichtlineare Funktion F(X,A) in Formelschreibweise eingeben. Wenn der Benutzer eine Formelberechnung für das Ableitungsverfahren auswählt, muß er/sie die partielle Ableitung von F(X,A) unter ebensolcher Berücksichtigung von A einfügen.
  • Eingaben:
    • X: experimentelle Datenpunkte
    • Y: experimentelle Datenpunkte
    • Standardabweichung: Standardabweichung von allen experimentellen Daten. Falls keine Kenntnis des Parameters vorliegt, ist er auszulassen.
    • Anfängliche, geschätzte Koeffizienten: Ihre geschätzten Koeffizienten. Wenn sich diese zu weit von den gewünschten Koeffizienten entfernt befinden, wird VI eventuell nicht die geeigneten Koeffizienten und die beste Kurvenanpassung liefern.
    • Max. Iteration: Der Algorithmus wird die max. Iteration versuchen. Falls sie bei Erreichen der max. Iteration nicht konvergiert, zeigt VI einen Fehler an. Ableitung: Es gibt zwei Wege, die partielle Ableitung von F(X,A) unter Berücksichtigung des Koeffizienten A zu berechnen. Wenn man die numerische Berechnung auswählt, wird VI das numerische Verfahren zu deren internen Berechnung verwenden. Wenn man die Formelberechnung auswählt, muß man die Ableitungsformel in das Sub-VI TARGET FNC & DERIV NONLIN eingeben. Die Formelberechnung ist genauer als die numerische Berechnung.
  • Ausgaben:
    • Beste, geschätzte Koeffizienten: Die least-square-Koeffizienten.
    • Beste Anpassung: die beste Anpassung der Kurve F(X,A).
    • Covarianz: Covarianzmatrix der besten, geschätzten Koeffizienten. MSE. MSE = 1/N·SUM[Y(I)–F(X(I),A))/STD(I)]^2); (STD: Standardabweichung)
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (6)

  1. Verfahren zum Echtzeit-Monitoring der Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Amplifizieren der Targetsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart einer Menge SYBRTM Green I, wobei die Polymerase-Kettenreaktion die Schritte Hinzufügen von SYBRTM Green I, einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Target-Nukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe zur Bildung einer Amplifikationsmischung und Thermocycling der Amplifikationsmischung zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur über eine Vielzahl von Amplifikationszyklen umfasst; und entweder Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, oder Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Bestrahlen der Mischung mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge bei wenigstens einem Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Nachweisen einer Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I nach Probenbestrahlung, wobei die Fluoreszenzemission mit der Menge amplifizierter Target-Nukleinsäure in der Probe in Beziehung steht, und ferner gekennzeichnet durch Bestrahlen der Probe mit Licht einer von SYBRTM Green I absorbierten Wellenlänge im Anschluß an wenigstens einen Teil der Vielzahl von Amplifikationszyklen und Monitoring der Fluoreszenzemission des SYBRTM Green I in der Probe als Funktion der Probentemperatur zum Erstellen einer Schmelzkurve für die amplifizierte Targetsequenz.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Nachweis einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bei einer Amplifikation mit einem schnellen Temperaturwechselprofil.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei jeder Zyklus des schnellen Temperaturwechselprofils eine Dauer von weniger als 2 Minuten besitzt.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Probe zum Erstellen einer Schmelzkurve bestrahlt wird und die Fluoreszenz nachgewiesen wird, wenn die Temperatur erhöht wird.
  6. PCR-Reaktionsmischung zur Amplifikation einer Target-Nukleotidsequenz, wobei die Mischung umfasst: eine DNA-Probe, die die Oligonukleotidprimer für die Targetsequenz in einer zur PCR-Amplifikation ausreichenden Menge enthält, eine thermostabile Polymerase und SYBRTM Green I in einer Menge, die ein Fluoreszenzsignal liefern kann, das die Konzentration der Targetsequenz in der Mischung anzeigt.
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PT (2) PT912766E (de)
WO (1) WO1997046714A1 (de)

Families Citing this family (774)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269799A9 (en) * 1994-06-22 2007-11-22 Zhang David Y Nucleic acid amplification methods
EP1033411B1 (de) 1996-06-04 2006-02-22 University of Utah Research Foundation Fluoreszenz-Donor-Akzeptor Paar
AU6534898A (en) * 1997-02-14 1998-09-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Detection of double-stranded dna in a homogeneous solution
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
EP1025120B1 (de) 1997-10-27 2010-08-18 Boston Probes, Inc. Sich auf "pna molecular beacons" beziehende verfahren, testsätze und zusammensetzungen
EP1040202B9 (de) * 1997-10-28 2009-09-23 Los Alamos National Security, LLC Identifizierung von dna-polymorphismen mittels durchflusszytometrie
JP2001521765A (ja) * 1997-11-04 2001-11-13 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 特異的かつ高感度な核酸検出方法
GB9725197D0 (en) * 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
US6893877B2 (en) * 1998-01-12 2005-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Methods for screening substances in a microwell array
WO1999040219A1 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 Bavarian Nordic Research Institute A/S Quantification by inhibition of amplification
GB9803382D0 (en) * 1998-02-19 1998-04-15 Secr Defence Detection system
US6270973B1 (en) * 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Multiplex method for nucleic acid detection
DE19811729C2 (de) * 1998-03-18 2000-05-18 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis einer Nukleotidsequenz
DE19811731A1 (de) * 1998-03-18 1999-09-23 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz
US6361942B1 (en) 1998-03-24 2002-03-26 Boston Probes, Inc. Method, kits and compositions pertaining to detection complexes
US6132968A (en) * 1998-05-13 2000-10-17 University Of Alberta Methods for quantitating low level modifications of nucleotide sequences
GB9811483D0 (en) * 1998-05-29 1998-07-29 Photonic Research Systems Limi Luminescence assay using cyclical excitation wavelength sequence
US6780617B2 (en) 2000-12-29 2004-08-24 Chen & Chen, Llc Sample processing device and method
US7799521B2 (en) * 1998-06-24 2010-09-21 Chen & Chen, Llc Thermal cycling
GB9815799D0 (en) * 1998-07-21 1998-09-16 Pharmagene Lab Limited Quantitative analysis of gene expression
GB9819418D0 (en) * 1998-09-07 1998-10-28 Secr Defence Amplification method
GB9819417D0 (en) 1998-09-07 1998-10-28 Secr Defence Reaction method
DE19840897A1 (de) * 1998-09-08 2000-03-09 Dirk Happich Faktor V-Leiden-Test
US6140054A (en) * 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
GB9821989D0 (en) * 1998-10-08 1998-12-02 Hybaid Ltd Detection of nucleic acid polymorphism
DE19850593A1 (de) * 1998-11-03 2000-05-04 Biochip Technologies Gmbh Verfahren zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen bei DNA
US6216049B1 (en) * 1998-11-20 2001-04-10 Becton, Dickinson And Company Computerized method and apparatus for analyzing nucleic acid assay readings
EP1013775A1 (de) * 1998-12-21 2000-06-28 LUTZ, Hans Quantitative Polymerase-Kettenreaktion mittels fluorogenen Echtzeiterfassungssystem
GB9901072D0 (en) * 1999-01-19 1999-03-10 Imp Cancer Res Tech Methods for detecting changes to a macromolecular component of a cell
WO2000056456A1 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Genencor International, Inc. Multi-through hole testing plate for high throughput screening
US6303305B1 (en) 1999-03-30 2001-10-16 Roche Diagnostics, Gmbh Method for quantification of an analyte
IL145586A0 (en) * 1999-04-08 2002-06-30 Oasis Biosciences Inc Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
GB9908437D0 (en) * 1999-04-13 1999-06-09 Minton Treharne & Davies Limit Methods of marking materials
US6699661B1 (en) * 1999-04-20 2004-03-02 Kankyo Engineering Co., Ltd. Method for determining a concentration of target nucleic acid molecules, nucleic acid probes for the method, and method for analyzing data obtained by the method
US6387621B1 (en) * 1999-04-27 2002-05-14 University Of Utah Research Foundation Automated analysis of real-time nucleic acid amplification
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
WO2000079009A2 (en) * 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
WO2001007638A2 (en) * 1999-07-27 2001-02-01 University Of Utah Research Foundation Homogeneous fluorescence method for assaying structural modifications of biomolecules
US6197520B1 (en) * 1999-08-13 2001-03-06 University Of Utah Research Foundation Solution-based color compensation adjusted for temperature and electronic gains
US7192698B1 (en) * 1999-08-17 2007-03-20 Purdue Research Foundation EphA2 as a diagnostic target for metastatic cancer
US6927203B1 (en) * 1999-08-17 2005-08-09 Purdue Research Foundation Treatment of metastatic disease
AU1933701A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Glaxo Group Limited Continuous time-resolved resonance energy-transfer assay for polynucleic acid polymerases
GB9928232D0 (en) * 1999-12-01 2000-01-26 Skelton Stephen Detection system
DE10027113A1 (de) * 1999-12-23 2001-09-27 Andreas Hoeft Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS, Kit dafür und Verwendung des Verfahrens
US7700279B2 (en) * 1999-12-24 2010-04-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Assay for bcr/abl gene rearrangement
US7250252B2 (en) * 1999-12-30 2007-07-31 David Aaron Katz Amplification based polymorphism detection
US20020151040A1 (en) 2000-02-18 2002-10-17 Matthew O' Keefe Apparatus and methods for parallel processing of microvolume liquid reactions
GB0005281D0 (en) * 2000-03-07 2000-04-26 Secr Defence Analytical method
DE10045521A1 (de) * 2000-03-31 2001-10-04 Roche Diagnostics Gmbh Nukleinsäureamplifikationen
US6691041B2 (en) * 2000-03-31 2004-02-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method for the efficiency-corrected real-time quantification of nucleic acids
DE10018465A1 (de) * 2000-04-14 2001-10-18 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung
US6783934B1 (en) 2000-05-01 2004-08-31 Cepheid, Inc. Methods for quantitative analysis of nucleic acid amplification reaction
EP1158449A3 (de) * 2000-05-19 2004-12-15 Becton Dickinson and Company Computerverfahren und Vorrichtung zur Analysierung des Lesens von Nukleinsäuretests
GB0016516D0 (en) * 2000-07-06 2000-08-23 Owen Mumford Ltd Improvements relating to needle protection devices
NZ523507A (en) * 2000-07-07 2005-01-28 Aventis Pharma Inc High throughput, possibly automated, process for transposition-mediated sequencing of target DNA fragments in which the amount of non-target DNA sequence is minimised
ES2267803T3 (es) 2000-08-11 2007-03-16 University Of Utah Research Foundation Sondas de oligonucleotidos marcados individuales.
WO2002018660A2 (en) 2000-08-31 2002-03-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of varicella-zoster virus
US7101976B1 (en) 2000-09-12 2006-09-05 Purdue Research Foundation EphA2 monoclonal antibodies and methods of making and using same
US6558929B2 (en) * 2000-09-15 2003-05-06 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forshung E.V. PCR reaction mixture for fluorescence-based gene expression and gene mutation analyses
US6346386B1 (en) * 2000-09-29 2002-02-12 Arup Institue Method of solution-based scanning for alterations in a DNA segment using a double-stranded DNA binding dye and fluorescence melting profiles
WO2002034942A2 (en) * 2000-10-23 2002-05-02 Cancer Research Technology Limited Nucleic acid amplification-based methods for the determination of a methylation profile and reagents therefor
GB0025913D0 (en) * 2000-10-23 2000-12-06 Guldberg Per Materials and methods relating to nucleic acid amplification and profiling
US6908769B2 (en) * 2000-11-16 2005-06-21 Roche Diagnostics Gmbh Dye pair for fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements
US8900811B2 (en) * 2000-11-16 2014-12-02 Caliper Life Sciences, Inc. Method and apparatus for generating thermal melting curves in a microfluidic device
US6312929B1 (en) * 2000-12-22 2001-11-06 Cepheid Compositions and methods enabling a totally internally controlled amplification reaction
WO2002061141A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of bordetella
ES2344594T3 (es) * 2001-01-31 2010-09-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Deteccion del virus del herpes simplex.
US7691571B2 (en) * 2001-01-31 2010-04-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of bordetella
US7267945B2 (en) * 2001-03-26 2007-09-11 Applera Corporation Methods of determining the presence of polynucleotides employing amplification
US7559879B2 (en) * 2001-04-16 2009-07-14 Brunswick Corporation Stride adjustment mechanism
ATE408710T1 (de) 2001-05-07 2008-10-15 Mayo Foundation Nachweis von legionella durch ein pcr und fret verwendendes verfahren
US6979530B2 (en) * 2001-05-21 2005-12-27 Applera Corporation Peptide conjugates and fluorescence detection methods for intracellular caspase assay
GB0112868D0 (en) 2001-05-25 2001-07-18 Secr Defence Detection system
WO2003002959A1 (en) * 2001-06-15 2003-01-09 Mj Research, Inc. Controller for a fluorometer
WO2003000935A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Marshfield Clinic Methods and oligonucleotides for the detection of salmonella sp.,e.coli o157:h7,and listeria monocytogenes
DE10132211A1 (de) * 2001-06-27 2003-01-16 Epigenomics Ag Nachweis spezifischer Dinukleotide in DNA-Proben durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
DE10132785A1 (de) * 2001-07-06 2003-01-16 Clondiag Chip Tech Gmbh Verfahren zum Nachweis von in einer Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten Nukleinsäuremolekülen
EP1275735A1 (de) 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Zusammensetzung und Methode zur 'Hot start' Nukleinsäureamplifizierung
JP4679818B2 (ja) * 2001-07-16 2011-05-11 アイダホ テクノロジー インコーポレーテッド 熱サイクルシステム及びその使用方法
US7226732B2 (en) * 2001-07-16 2007-06-05 Cepheid Methods, apparatus, and computer programs for verifying the integrity of a probe
US6872529B2 (en) * 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US6979541B1 (en) 2001-07-26 2005-12-27 University Of Utah Research Foundation Methods for identifying chromosomal aneuploidy
US7188030B2 (en) * 2001-08-21 2007-03-06 Applera Corporation Automatic threshold setting for quantitative polymerase chain reaction
ES2276948T3 (es) * 2001-08-23 2007-07-01 MERCK &amp; CO., INC. Ensayos pcr de hp multiplex fluorescente que usan fluoforos multiples.
ATE335850T1 (de) * 2001-08-31 2006-09-15 Univ Utah Res Found Echtzeit-quantifizierung mit internen standards
JP4513085B2 (ja) 2001-09-11 2010-07-28 アイキューム インク 試料の容器
US20030082563A1 (en) * 2001-10-15 2003-05-01 Bell Constance A. Detection of bacillus anthracis
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
EP1308524B1 (de) * 2001-11-02 2006-05-31 Roche Diagnostics GmbH Nachweis von Variola Virus
EP1456409B1 (de) * 2001-11-28 2010-02-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Paralleles scoring von polymorphismen mittels amplifikation und fehlerkorrektur
US7424013B1 (en) * 2001-12-20 2008-09-09 Applied Micro Circuits Corporation System and method for granting arbitrated bids in the switching of information
US8418129B1 (en) 2001-12-14 2013-04-09 Qualcomm Incorporated Method for automatically generating code to define a system of hardware elements
US7352694B1 (en) * 2001-12-14 2008-04-01 Applied Micro Circuits Corporation System and method for tolerating data link faults in a packet communications switch fabric
JP2005516300A (ja) 2002-01-25 2005-06-02 アプレラ コーポレイション 製品およびサービスに対する注文を発注し、受理し、および充足する方法
US7228237B2 (en) * 2002-02-07 2007-06-05 Applera Corporation Automatic threshold setting and baseline determination for real-time PCR
US7373253B2 (en) 2002-02-12 2008-05-13 Idaho Technology Multi-test analysis of real-time nucleic acid amplification
US6593093B1 (en) 2002-02-20 2003-07-15 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of group a Streptococcus
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
US7166478B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
US20050065330A1 (en) * 2002-04-24 2005-03-24 The Cleveland Clinic Foundation Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay
US7297484B2 (en) * 2002-04-26 2007-11-20 Idaho Technology Characterization of single stranded nucleic acids by melting analysis of secondary structure using double strand-specific nucleic acid dye
AUPS205802A0 (en) * 2002-05-01 2002-06-06 Bio-Molecular Holdings Pty Limited Improved cycling device and method
US7785776B2 (en) * 2002-05-13 2010-08-31 Idaho Technology, Inc. Genotyping by amplicon melting curve analysis
US20030215814A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-20 Cockerill Franklin R. Detection of Shiga toxin- or Shiga-like toxin-producing organisms
AUPS267802A0 (en) * 2002-05-30 2002-06-20 Bio-Molecular Holdings Pty Limited Improved dna amplification apparatus and method
US20070059690A1 (en) * 2002-05-31 2007-03-15 Amirul Islam "Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands"
US20040029111A1 (en) * 2002-06-14 2004-02-12 Linnen Jeffrey M. Compositions and methods for detecting hepatitis B virus
US6896727B2 (en) * 2002-06-28 2005-05-24 Seh America, Inc. Method of determining nitrogen concentration within a wafer
US7083974B2 (en) * 2002-07-12 2006-08-01 Applera Corporation Rotatable sample disk and method of loading a sample disk
US20040219557A1 (en) * 2002-08-01 2004-11-04 Dobrowolski Steven F. Real time PCR assays to detect mutations in the biotinidase gene for newborn screening
US8277753B2 (en) * 2002-08-23 2012-10-02 Life Technologies Corporation Microfluidic transfer pin
US9394332B2 (en) * 2002-08-29 2016-07-19 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
ATE447040T1 (de) 2002-09-03 2009-11-15 Quanta Biosciences Inc Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für die cdna-synthese
WO2004027023A2 (en) * 2002-09-17 2004-04-01 Pharmacia Corporation Preservation of rna and reverse transcriptase during automated liquid handling
WO2004027028A2 (en) * 2002-09-18 2004-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods and kits for detection of an antigen on a cell and in a biological mixture
US7074598B2 (en) 2002-09-25 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp.
US7365176B2 (en) 2002-09-26 2008-04-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of Epstein-Barr virus
US7074599B2 (en) 2002-09-27 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of mecA-containing Staphylococcus spp.
WO2004031408A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
ES2438967T3 (es) * 2002-10-23 2014-01-21 University Of Utah Research Foundation Análisis de fusión de amplicones con colorantes de saturación
US9850381B2 (en) * 2002-10-23 2017-12-26 University Of Utah Research Foundation Amplicon melting analysis with saturation dyes
US7718361B2 (en) 2002-12-06 2010-05-18 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitative test for bacterial pathogens
JP4377375B2 (ja) 2002-12-06 2009-12-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 病原性生物の多重分析検出
US8275554B2 (en) * 2002-12-20 2012-09-25 Caliper Life Sciences, Inc. System for differentiating the lengths of nucleic acids of interest in a sample
US20060094108A1 (en) * 2002-12-20 2006-05-04 Karl Yoder Thermal cycler for microfluidic array assays
WO2004074818A2 (en) 2002-12-20 2004-09-02 Biotrove, Inc. Assay apparatus and method using microfluidic arrays
US7560231B2 (en) * 2002-12-20 2009-07-14 Roche Molecular Systems, Inc. Mannitol and glucitol derivatives
US20050042639A1 (en) * 2002-12-20 2005-02-24 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of DNA length
WO2004061132A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 Stratagene Compositions and methods for polynucleotide detection
CA2510166A1 (en) 2002-12-20 2004-09-30 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of dna
WO2004067545A1 (en) * 2003-01-29 2004-08-12 Roche Diagnostics Gmbh Improved method for bisulfite treatment
JP4632262B2 (ja) * 2003-02-05 2011-02-16 アイキューム，インク． サンプルの処理
EP1597602A4 (de) * 2003-02-05 2009-07-22 Ge Healthcare Bio Sciences Festphasensequenzierung
JP4608483B2 (ja) * 2003-02-18 2011-01-12 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ポリヌクレオチドの複合的分析のための組成物および方法
EP2390352A1 (de) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systeme und Methoden zur Erhöhung der Milchproduktion bei Tieren
US7282331B2 (en) * 2003-03-18 2007-10-16 Advandx, Inc. Method for improved specificity in probe based assays
US20040191776A1 (en) * 2003-03-21 2004-09-30 Pei-Jer Chen Method for genotyping and quantifying Hepatitis B Virus
GB2399776A (en) * 2003-03-24 2004-09-29 Pa Knowledge Ltd Cyclical heating and cooling device and associated methods
JP4782668B2 (ja) 2003-03-31 2011-09-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 日本脳炎ウィルス血清グループのメンバーを包含する一定のフラビウィルスを検出するための組成物及び方法
JP2006521092A (ja) * 2003-04-04 2006-09-21 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー マルチカラーリアルタイムｐｃｒ用の改良されたシステム
CA2463719A1 (en) * 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
US7820030B2 (en) * 2003-04-16 2010-10-26 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
US20060177824A1 (en) * 2003-04-29 2006-08-10 Procop Gary W Salmonella detection identification
US7148043B2 (en) 2003-05-08 2006-12-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Systems and methods for fluorescence detection with a movable detection module
DE04752947T1 (de) 2003-05-23 2006-11-16 Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules Lokalisierte temperaturregelung für raumanordnungen von reaktionsmedien
EP1641938A2 (de) * 2003-06-30 2006-04-05 AstraZeneca AB Nukleinsäurepolymerase-fluoreszenztests
EP1493822A1 (de) * 2003-07-02 2005-01-05 Labor Becker, Olgemoeller &amp; Kollegen GbR Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
GB0317343D0 (en) * 2003-07-24 2003-08-27 Medical Biosystems Ltd Polynucleotide sequencing
EP1502958A1 (de) * 2003-08-01 2005-02-02 Roche Diagnostics GmbH Neues Format zur Detektion von Heissstart- und Echtzeit-Polymerasekettenreaktion
US20050053950A1 (en) * 2003-09-08 2005-03-10 Enrique Zudaire Ubani Protocol and software for multiplex real-time PCR quantification based on the different melting temperatures of amplicons
US7788039B2 (en) 2003-09-25 2010-08-31 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitation of nucleic acids using growth curves
EP1530046A1 (de) * 2003-11-04 2005-05-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Methode zur Unterscheidung von AML Subtypen mit verändertem Karyotyp mit mittelmässiger Prognose
EP1533618A1 (de) * 2003-11-04 2005-05-25 Ludwig-Maximilians-Universität München Methode zur Unterscheidung prognostisch definierbarer AML
US20070212734A1 (en) * 2003-11-04 2007-09-13 Martin Dugas Method for Distinguishing T(11Q23)/Mll-Positive Leukemias From t(11Q23)/Mll Negative Leukemia
US20070207459A1 (en) * 2003-11-04 2007-09-06 Martin Dugas Method For Distinguishing Immunologically Defined All Subtype
EP1682905A2 (de) * 2003-11-04 2006-07-26 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur unterscheidung cbf-positiver aml-subtypen von cbf-negativen aml-subtypen
US20070212687A1 (en) * 2003-11-04 2007-09-13 Martin Dugas Method For Distinguishing Mll-Ptd-Positive Aml From Other Aml Subtypes
EP1682903A2 (de) * 2003-11-04 2006-07-26 Roche Diagnostics GmbH Methode zur unterscheidung zwischen aml-spezifischen flt3 längenmutationen und tkd mutationen
EP1682906A2 (de) * 2003-11-04 2006-07-26 Roche Diagnostics GmbH Methode zur unterscheidung von aml subtypen mit unterschiedlicher genhäufigkeit
EP1682898A2 (de) * 2003-11-04 2006-07-26 Roche Diagnostics GmbH Methode zur unterscheidung von aml subtypen mit sich wiederholenden gentischen veränderungen
US20070099190A1 (en) * 2003-11-04 2007-05-03 Martin Dugas Method for distinguishing leukemia subtypes
US7691570B2 (en) * 2003-11-06 2010-04-06 Dual Juerg Chemical analysis using dynamic viscometry
US7427475B2 (en) * 2003-11-18 2008-09-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of group B streptococcus
JP2007534308A (ja) * 2003-11-19 2007-11-29 アレロジック・バイオサイエンシズ・コーポレーション 複数のフルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチド
US7582452B2 (en) * 2003-11-24 2009-09-01 Life Genetics Lab, Llc Assay for species sources
EP1692315A1 (de) 2003-12-02 2006-08-23 Roche Diagnostics GmbH Verbessertes verfahren zur bisulfitbehandlung
CA2494571C (en) 2003-12-02 2010-02-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides containing molecular rods
US20050130213A1 (en) * 2003-12-10 2005-06-16 Tom Morrison Selective ligation and amplification assay
US8697433B2 (en) * 2003-12-10 2014-04-15 Samsung Electronics Co., Ltd. Polymerase chain reaction (PCR) module and multiple PCR system using the same
EP1716257B8 (de) * 2004-02-10 2012-11-07 Roche Diagnostics GmbH Neue primer und sonden zum nachweis von parvovirus b19
WO2005077125A2 (en) * 2004-02-11 2005-08-25 Applera Corporation Methods and compositions for detecting nucleic acids
MXPA06009452A (es) 2004-02-19 2007-03-15 Univ Alberta Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos.
US20050250134A1 (en) * 2004-03-02 2005-11-10 Dawei Sheng Fluorescent energy transfer labeled nucleic acid substrates and methods of use thereof
CA2558303A1 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Medical College Of Ohio Methods and compositions for assessing nucleic acids and alleles
EP1735097B1 (de) 2004-03-12 2016-11-30 Life Technologies Corporation Ladung eines nanoliter-arrays
AU2005230833B2 (en) 2004-04-01 2011-04-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Quantitative amplification with a labeled probe and 3' to 5' exonuclease activity
EP1745157A4 (de) * 2004-04-12 2008-06-11 Ohio Med College Verfahren und zusammensetzungen zum testen von analyten
EP1745120A4 (de) * 2004-04-16 2010-04-14 Spartan Bioscience Inc System zur schnellen nukleinsäureamplifikation und -detektion
US7387887B2 (en) 2004-04-20 2008-06-17 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US9657347B2 (en) 2004-04-20 2017-05-23 University of Utah Research Foundation and BioFire Defense, LLC Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
US20050250112A1 (en) * 2004-05-07 2005-11-10 Padmabandu Gothami A Nucleic acids, compositions, methods, and kits for detecting mycoplasma and acholeplasma species
WO2006076022A2 (en) * 2004-05-13 2006-07-20 Anita Goel Nano-pcr: methods and devices for nucleic acid amplification and detection
DE102004025538A1 (de) * 2004-05-25 2005-12-22 Advalytix Ag Temperierverfahren und -vorrichtung für die Temperaturbehandlung kleiner Flüssigkeitsmengen
EP2290071B1 (de) * 2004-05-28 2014-12-31 Asuragen, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen mit MicroRNA
EP1605060A1 (de) * 2004-06-10 2005-12-14 Biodynamics S.R.L. Verfahren und Reaktionsgemisch zur Steigerung der Spezifität und Genauigkeit von Polymerasereaktionen
US8232057B2 (en) * 2004-06-25 2012-07-31 E I Du Pont De Nemours And Company DNA sequences for the detection of and differentiation amongst pathogenic E. coli
EP1610170A1 (de) * 2004-06-25 2005-12-28 Sony Deutschland GmbH Eine Methode zum Auftragen einer Teilchenschicht zur Herstellung einer Oberfläche mit Licht-diffusiven Eigenschaften und / oder verringertem Glanz
GB0416944D0 (en) 2004-07-29 2004-09-01 Lumora Ltd Method for determining the amount of template nucleic acid present in a sample
TWI349704B (en) * 2004-08-10 2011-10-01 Food And Drug Administration Dept Of Health A method for rapidly detecting quinolone-resistant salmonella spp. and the probes and primers utilized therein
US7361469B2 (en) * 2004-08-13 2008-04-22 Stratagene California Dual labeled fluorescent probes
EP1632578A1 (de) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH Methode zur Dekontamination der DNA
JP2008512099A (ja) 2004-09-07 2008-04-24 テレソン インスティテュート フォー チャイルド ヘルス リサーチ アレルギー性疾患の処置または予防のための物質
US20060051796A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Inga Boell Real time PCR with the addition of pyrophosphatase
EP1634965B1 (de) 2004-09-09 2010-01-20 Roche Diagnostics GmbH Echtzeit-PCR unter Zusatz von Pyrophosphatase
AU2005286876A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Multiple mode multiplex reaction quenching method
ATE494392T1 (de) 2004-09-21 2011-01-15 Life Technologies Corp Zweifarbige echtzeit/endpunkt-quantifizierung von mikro-rnas (mirnas)
CA2584267A1 (en) * 2004-10-07 2006-04-20 Chronix Biomedical Detection of nucleic acids to assess risk for creutzfeldt-jakob disease
US20060078894A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Winkler Matthew M Methods and compositions for analyzing nucleic acids
KR101424812B1 (ko) * 2004-10-18 2014-08-07 브랜데이스 유니버시티 핵산 증폭을 위한 프라이머, 프로브 및 방법
US20060194222A1 (en) * 2004-10-20 2006-08-31 Stratagene California Triplex probe compositions and methods for polynucleotide detection
AU2005299089B2 (en) 2004-10-21 2011-08-18 Eberhard Karls Universitaet Tuebingen KASPP (LRKK2) gene, its production and use for the detection and treatment of neurodegenerative disorders
CN103060444B (zh) * 2004-10-27 2016-01-13 塞弗德公司 多阶段核酸扩增反应
EP1809765A2 (de) * 2004-11-04 2007-07-25 Roche Diagnostics GmbH Klassifizierung von aml (akuter myeloider leukämie)
PL2302055T3 (pl) 2004-11-12 2015-02-27 Asuragen Inc Sposoby i kompozycje z wykorzystaniem miRNA oraz cząsteczek inhibitorowych miRNA
EP1841890B1 (de) * 2005-01-03 2013-08-14 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Primer für nukleinsäurenachweis
WO2006074233A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Applera Corporation Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification
US7315376B2 (en) * 2005-01-07 2008-01-01 Advanced Molecular Systems, Llc Fluorescence detection system
ATE357653T1 (de) 2005-01-18 2007-04-15 Hoffmann La Roche Fluoreszenzabbildung mittels telezentrischer anregungs- und abbildungsoptiken
ATE359500T1 (de) 2005-01-18 2007-05-15 Hoffmann La Roche Fluoreszenzabbildung mittels telezentrizität
US8669052B2 (en) 2008-06-10 2014-03-11 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow nucleic acid detector
US8470608B2 (en) * 2008-05-20 2013-06-25 Rapid Pathogen Screening, Inc Combined visual/fluorescence analyte detection test
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US9464310B2 (en) * 2005-02-10 2016-10-11 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Integrated method for collection and maintenance of detectability of a plurality of microbiological agents in a single clinical sample and for handling a plurality of samples for reporting a sum of diagnostic results for each sample
US20060246423A1 (en) * 2005-02-10 2006-11-02 Adelson Martin E Method and kit for the collection and maintenance of the detectability of a plurality of microbiological species in a single gynecological sample
US20060178838A1 (en) * 2005-02-10 2006-08-10 Adelson Martin E Method of receiving and handling a plurality of clinical samples for reporting a sum of diagnostic results for each sample
US20060188891A1 (en) * 2005-02-23 2006-08-24 Bickmore William D Jr Methods and apparatus for controlling DNA amplification
JP4398886B2 (ja) * 2005-03-07 2010-01-13 ソニー株式会社 通信端末装置、通信システム、通信方法、およびプログラム
EP1930730B1 (de) 2005-03-10 2019-08-14 Gen-Probe Incorporated Systeme und Verfahren zur Durchführung von Tests zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Analyten
EP1700922B1 (de) 2005-03-10 2016-08-24 Roche Diagnostics GmbH 3-Substituierte 5-Nitroindolderivate und diese enthaltende markierte Oligonukleotidsonden
US7759469B2 (en) 2005-03-10 2010-07-20 Roche Diagnostics Operations, Inc. Labeling reagent
US8008066B2 (en) 2005-03-10 2011-08-30 Gen-Probe Incorporated System for performing multi-formatted assays
US7680604B2 (en) 2005-03-11 2010-03-16 Roche Molecular Systems, Inc. PCR elbow determination by rotational transform after zero slope alignment
US7776567B2 (en) * 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US7601498B2 (en) 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
US7456281B2 (en) * 2005-04-20 2008-11-25 Idaho Technology, Inc. Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
WO2006116276A2 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Merck & Co., Inc. Real-time hpv pcr assays
EP1880021A2 (de) * 2005-05-02 2008-01-23 Stratagene California Oligonukleotidsonde/primerzusammensetzungen und verfahren zum nachweis von oligonukleotiden
US8362250B2 (en) 2005-05-24 2013-01-29 Enzo Biochem, Inc. Fluorescent dyes and compounds, methods and kits useful for identifying specific organelles and regions in cells of interest
US8357801B2 (en) 2005-05-24 2013-01-22 Enzo Life Sciences, Inc. Labeling of target molecules, identification of organelles and other applications, novel compositions, methods and kits
US7737281B2 (en) * 2005-05-24 2010-06-15 Enzo Life Sciences, Inc. C/O Enzo Biochem, Inc. Purine based fluorescent dyes
US7569695B2 (en) * 2005-05-24 2009-08-04 Enzo Life Sciences, Inc. Dyes for the detection or quantification of desirable target molecules
JP4879975B2 (ja) * 2005-05-31 2012-02-22 アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー 短い核酸のマルチプレックス増幅
US20060281099A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Q-melt for polymorphism detection
DK1907583T4 (da) 2005-06-15 2020-01-27 Complete Genomics Inc Enkeltmolekyle-arrays til genetisk og kemisk analyse
US20060286590A1 (en) * 2005-06-20 2006-12-21 Applera Corporation. Cis-regulatory modules
US20060292578A1 (en) 2005-06-28 2006-12-28 Weidong Zheng DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases
GB0514889D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Lgc Ltd Oligonucleotides
EP1937834B1 (de) * 2005-09-01 2014-06-11 AusDiagnostics Pty Ltd. Verfahren zur amplifikation, quantifizierung und identifizierung von nukleinsäuren
US7569367B2 (en) 2005-09-07 2009-08-04 Roche Diagnostics Operations, Inc. Nucleic acid preparation from whole blood for use in diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy
US20070059713A1 (en) * 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
US7991561B2 (en) 2005-09-29 2011-08-02 Roche Molecular Systems, Inc. Ct determination by cluster analysis with variable cluster endpoint
US7991558B2 (en) 2005-09-29 2011-08-02 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for determining real-time PCR cycle thresholds using cluster analysis
EP2458011B1 (de) 2005-10-03 2013-07-24 Life Technologies Corporation Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Amplifikation von Nukleinsäuren
EP2546360A1 (de) 2005-10-07 2013-01-16 Callida Genomics, Inc. Selbstangeordnete einzelne Molekülarrays und Verwendungen davon
US20090155894A1 (en) * 2005-10-17 2009-06-18 Soper Steven A Electrokinetic Thermal Cycler and Reactor
US7781165B2 (en) 2005-10-19 2010-08-24 Roche Diagnostics Operations, Inc. Benzimidazolium compounds and salts of benzimidazolium compounds for nucleic acid amplification
WO2007120208A2 (en) * 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
KR101542677B1 (ko) 2005-11-29 2015-08-06 캠브리지 엔터프라이즈 리미티드 유방암에 대한 마커
EP1798291B1 (de) * 2005-12-13 2011-05-18 Institut Curie Verfahren für die Detektion von Mutationen in Nukleinsaüren, und die Anwendung in der Diagnose von genetischen Krankheiten und Krebs
ATE480549T1 (de) * 2005-12-14 2010-09-15 Hoffmann La Roche Neues verfahren für die bisulfitbehandlung
EP1798650A1 (de) 2005-12-19 2007-06-20 Roche Diagnostics GmbH Analytisches Verfahren und Instrument
EP1798542A1 (de) * 2005-12-19 2007-06-20 Roche Diagnostics GmbH Analytisches Verfahren und Gerät
US7680868B2 (en) 2005-12-20 2010-03-16 Roche Molecular Systems, Inc. PCR elbow determination by use of a double sigmoid function curve fit with the Levenburg-Marquardt algorithm and normalization
US7844403B2 (en) 2005-12-20 2010-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Temperature step correction with double sigmoid Levenberg-Marquardt and robust linear regression
US7991562B2 (en) 2005-12-20 2011-08-02 Roche Molecular Systems, Inc. PCR elbow determination using curvature analysis of a double sigmoid
US7668663B2 (en) 2005-12-20 2010-02-23 Roche Molecular Systems, Inc. Levenberg-Marquardt outlier spike removal method
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
EP1989326A4 (de) 2006-01-17 2009-09-30 Health Research Inc Heteroduplex-verfolgungstest
US20090305238A1 (en) * 2006-01-23 2009-12-10 Applera Corporation Microarray Microcard
US7785786B2 (en) * 2006-01-23 2010-08-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting nucleic acids using multiple signals
WO2007092538A2 (en) 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
GB0603190D0 (en) * 2006-02-16 2006-03-29 Enigma Diagnostics Ltd Detection system
WO2007096182A1 (en) * 2006-02-27 2007-08-30 Roche Diagnostics Gmbh Pcr hot start by magnesium sequestration
JP2009528063A (ja) * 2006-03-01 2009-08-06 パーレジェン サイエンシーズ， インコーポレイテッド 依存症に対するマーカー
US20110143344A1 (en) * 2006-03-01 2011-06-16 The Washington University Genetic polymorphisms and substance dependence
RU2394915C2 (ru) * 2006-03-24 2010-07-20 Александр Борисович Четверин Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления
US8778637B2 (en) * 2006-03-28 2014-07-15 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Method and apparatus for applying continuous flow and uniform temperature to generate thermal melting curves in a microfluidic device
EP2019687B1 (de) 2006-03-29 2014-03-19 Merial Limited Impfstoff gegen streptokokken
US8293473B2 (en) 2006-04-04 2012-10-23 Labonnet Ltd. Assessment of reaction kinetics compatibility between polymerase chain reactions
US20070238108A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-11 Agilent Technologies, Inc. Validation of comparative genomic hybridization
US20070238095A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research , A Minnesota Corporation Detection of Influenza A Virus
US20070238093A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-11 Espy Mark J Detection of influenza A virus
EP2016415B1 (de) 2006-04-21 2013-08-14 Nanobiosym, Inc. Einzelmolekülplattform für wirkstoffentdeckung: verfahren für wirkstoffentdeckung, einschliesslich der entdeckung von krebsmitteln und viruziden
AU2007244658B2 (en) 2006-04-28 2014-02-13 Igor Kutyavin Use of base-modified deoxynucleoside triphosphates
US8900828B2 (en) * 2006-05-01 2014-12-02 Cepheid Methods and apparatus for sequential amplification reactions
JP2009537152A (ja) * 2006-05-17 2009-10-29 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 温度サイクルシステム
US8232091B2 (en) * 2006-05-17 2012-07-31 California Institute Of Technology Thermal cycling system
US8637436B2 (en) 2006-08-24 2014-01-28 California Institute Of Technology Integrated semiconductor bioarray
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
US9133504B2 (en) * 2006-06-05 2015-09-15 California Institute Of Technology Real time microarrays
US8119352B2 (en) 2006-06-20 2012-02-21 Cepheld Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times
US7629124B2 (en) 2006-06-30 2009-12-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Real-time PCR in micro-channels
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
WO2008021010A2 (en) * 2006-08-07 2008-02-21 Stratagene California Methods for real-time quantitative pcr
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US8080645B2 (en) 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
EP1900824A1 (de) * 2006-09-14 2008-03-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechts Genexpressionsprofile zur Prognose, Diagnose und Therapie von Prostatakrebs und deren Verwendung
AU2007299748A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR -31,miR -145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216 miR-331, mmu-miR-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
MX2009004870A (es) * 2006-11-02 2009-10-08 Veridex Llc Formacion de imagenes de endotelio vascular activado usando agentes de contraste inmunomagneticos, para la formacion de imagenes de resonancia magnetica.
US9114398B2 (en) 2006-11-29 2015-08-25 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device and method for digital multiplex PCR assays
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
CN101627121A (zh) * 2006-12-08 2010-01-13 奥斯瑞根公司 作为治疗干预的靶标的miRNA调控基因和路径
AU2007333109A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro RNAs
WO2008073919A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008073920A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Mir-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
KR101433208B1 (ko) 2006-12-13 2014-08-22 루미넥스 코포레이션 실시간으로 ｐｃｒ의 다중 분석을 위한 시스템과 방법
BRPI0721009B1 (pt) 2006-12-21 2019-08-20 Agriculture Victoria Services Pty Limited Método de seleção artificial em uma população não humana de plantas ou animais que possui um pequeno tamanho populacional efetivo menor do que 1000 indivíduos, uso dométodo, processo para produção de ganho genético em uma população, e método de seleção artificial em pecuária
US8535888B2 (en) 2006-12-29 2013-09-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Compositions and methods for detecting methicillin-resistant S. aureus
CA2671270A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-17 Asuragen, Inc. Mir-16 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2126114B1 (de) * 2007-02-01 2016-09-28 Abacus Diagnostica OY Verfahren zum nachweis des vorliegens von zielpolynukleotid in proben
MX2009008081A (es) 2007-02-02 2010-03-03 Genera Biosystems Limted Generacion de moleculas de acido nucleico.
US20100190167A1 (en) * 2007-02-14 2010-07-29 Genisphere Inc. Methods, Reagents and Kits for Detection of Nucleic Acid Molecules
JP4942508B2 (ja) * 2007-02-20 2012-05-30 アークレイ株式会社 ａｂｌ遺伝子変異の検出用プローブおよびその用途
US9475051B2 (en) * 2007-02-27 2016-10-25 Sony Corporation Nucleic acid amplifier
GB0703997D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Methods for detecting nucleic sequences
GB0703996D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Nucleic acid detection
EP3091088B1 (de) * 2007-03-28 2019-02-06 Signal Diagnostics System und verfahren zur hochauflösenden analyse von nukleinsäuren zur detektion von sequenzvariationen
JP5191041B2 (ja) 2007-04-05 2013-04-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 急速ワンステップｒｔ−ｐｃｒ
CA2684570A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Molecular Detection Inc. Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria
US20090232893A1 (en) * 2007-05-22 2009-09-17 Bader Andreas G miR-143 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
WO2008154333A2 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Asuragen, Inc. Mir-34 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008152144A1 (de) * 2007-06-13 2008-12-18 Attomol Gmbh Molekulare Diagnostika Verfahren und sonden/primersystem zum 'real time' nachweis eines nukleinsäuretargets
DE102007031137A1 (de) * 2007-06-13 2008-12-18 Attomol Gmbh Molekulare Diagnostika Verfahren und Sonden/Primärsystem zum "real time" Nachweis eines Nukleinsäuretargets
CA2691451C (en) 2007-06-21 2015-03-24 Sara H. Fan Instrument and receptacles for performing processes
EP2395113A1 (de) 2007-06-29 2011-12-14 Population Genetics Technologies Ltd. Verfahren und Zusammensetzungen zur Isolierung von Nukleinsäuresequenzvarianten
US20090023138A1 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 Zila Biotechnology, Inc. Oral cancer markers and their detection
US20090055243A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Jayson Lee Lusk Systems and methods for predicting a livestock marketing method
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
US8386184B2 (en) 2007-08-28 2013-02-26 Becton, Dickinson And Company Systems and methods for determining an amount of starting reagent using the polymerase chain reaction
US8380457B2 (en) 2007-08-29 2013-02-19 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Microfluidic devices with integrated resistive heater electrodes including systems and methods for controlling and measuring the temperatures of such heater electrodes
DE102007041864B4 (de) 2007-09-04 2012-05-03 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen
US8361714B2 (en) * 2007-09-14 2013-01-29 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090119020A1 (en) 2007-09-25 2009-05-07 Roche Molecular Systems, Inc. Pcr elbow determination using quadratic test for curvature analysis of a double sigmoid
ATE505562T1 (de) 2007-09-28 2011-04-15 3M Innovative Properties Co Doppel-oligonukleotid- nukleinsäurenachweisverfahren
US20090186015A1 (en) * 2007-10-18 2009-07-23 Latham Gary J Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof
US8145433B2 (en) * 2007-10-25 2012-03-27 Canon U.S. Life Sciences, Inc. High-resolution melting analysis
FR2922897B1 (fr) * 2007-10-25 2009-11-27 Bio Rad Pasteur Mesure d'une population d'acides nucleiques,en particulier par pcr en temps reel.
CN101910399B (zh) 2007-10-30 2015-11-25 考利达基因组股份有限公司 用于核酸高通量测序的装置
US20090181391A1 (en) * 2007-11-01 2009-07-16 Zymo Research Corporation Methods for analysis of dna methylation percentage
US20090137058A1 (en) * 2007-11-28 2009-05-28 General Electric Company Chemical and biological detection method and device based on measurements of fluorescence and reflectivity
US8071562B2 (en) * 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US9551026B2 (en) 2007-12-03 2017-01-24 Complete Genomincs, Inc. Method for nucleic acid detection using voltage enhancement
US20090162863A1 (en) * 2007-12-13 2009-06-25 Hitachi High-Technologies Corporation Nucleic acid detection probe
US20090192114A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-30 Dmitriy Ovcharenko miR-10 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
JP5542438B2 (ja) * 2007-12-26 2014-07-09 アークレイ株式会社 融解曲線解析方法および融解曲線解析装置
JP5542439B2 (ja) * 2007-12-26 2014-07-09 アークレイ株式会社 核酸増幅判定方法および核酸増幅判定装置
DE102007063102B4 (de) 2007-12-28 2022-02-10 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Erfassung eines periodisch pulsierenden Betriebsparameters
EP2238459B1 (de) * 2008-01-23 2019-05-08 Roche Diagnostics GmbH Integrierte vorrichtung zur synthese und verstärkung
WO2009100215A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of clostridium difficile
US20090263803A1 (en) * 2008-02-08 2009-10-22 Sylvie Beaudenon Mirnas differentially expressed in lymph nodes from cancer patients
WO2009103003A2 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Scanning fluorescent reader with diffuser system
WO2009111475A2 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Heatflow Technologies, Inc. Heat flow polymerase chain reaction systems and methods
WO2009111072A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-11 Clean Earth Technologies, Llc Multiplexed pcr-coupled pna labeled beads flow cytometric assay for simultaneous detection of multiple biological agents
CA2658520C (en) * 2008-03-19 2016-11-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers
WO2009154835A2 (en) * 2008-03-26 2009-12-23 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mir-16 and therapy of prostate cancer
WO2009126726A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-15 Asuragen, Inc Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv)
WO2009124665A1 (en) 2008-04-08 2009-10-15 Roche Diagnostics Gmbh Detection of pcr products in gel electrophoresis
EP2108699B1 (de) 2008-04-08 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Vorrichtung zur analytischen Verarbeitung und Detektion
WO2009137807A2 (en) * 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
US9068981B2 (en) 2009-12-04 2015-06-30 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow assays with time delayed components
US8962260B2 (en) 2008-05-20 2015-02-24 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and device for combined detection of viral and bacterial infections
US8815609B2 (en) 2008-05-20 2014-08-26 Rapid Pathogen Screening, Inc. Multiplanar lateral flow assay with diverting zone
US20130196310A1 (en) 2008-05-20 2013-08-01 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections
US8609433B2 (en) 2009-12-04 2013-12-17 Rapid Pathogen Screening, Inc. Multiplanar lateral flow assay with sample compressor
ES2439951T3 (es) 2008-06-06 2014-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna
US20110086359A1 (en) * 2008-06-10 2011-04-14 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow assays
EP2138588A1 (de) * 2008-06-23 2009-12-30 Koninklijke Philips Electronics N.V. Messung der Schmelzkurve während der Amplifizierung
US8097412B2 (en) 2008-07-12 2012-01-17 Biodiagnostics, Inc. DNA-based test for detection of annual and intermediate ryegrass
DE102008040513B4 (de) * 2008-07-17 2010-08-26 BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung Verwendung einer langwellig emittierenden Cyaninverbindung als NIR-Fluoreszenzstandard und Kit zur Kalibrierung von Photolumineszenzmesssystemen
EP2148187A1 (de) 2008-07-25 2010-01-27 Roche Diagnostics GmbH Anregungs- und Abbildungsoptik für die Fluoreszenzdetektion
GB0909333D0 (en) 2009-06-01 2009-07-15 Fu Guoliang Multiplex amplification and detection
CA2638458A1 (en) * 2008-07-31 2010-01-31 Spartan Bioscience Inc. Thermal recycling by positioning relative to fixed-temperature source
ES2539856T3 (es) 2008-08-01 2015-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Lisis mejorada y transcripción reversa para la cuantificación de mRNA
US20100055733A1 (en) * 2008-09-04 2010-03-04 Lutolf Matthias P Manufacture and uses of reactive microcontact printing of biomolecules on soft hydrogels
US9334281B2 (en) * 2008-09-08 2016-05-10 Enzo Life Sciences, Inc. Fluorochromes for organelle tracing and multi-color imaging
US9250249B2 (en) 2008-09-08 2016-02-02 Enzo Biochem, Inc. Autophagy and phospholipidosis pathway assays
US7910720B2 (en) 2008-09-09 2011-03-22 Roche Diagnostics Operations, Inc. Polyanion for improved nucleic acid amplification
CA2736243A1 (en) 2008-09-09 2010-03-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multi-stage, regression-based pcr analysis system
US8219324B2 (en) 2008-09-12 2012-07-10 Roche Molecular Systems, Inc. Real-time PCR elbow calling by equation-less algorithm
US9540686B2 (en) * 2008-09-18 2017-01-10 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Systems and methods for the amplification of DNA
CA2682439A1 (en) 2008-10-17 2010-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell monitoring and molecular analysis
US8170804B2 (en) * 2008-10-17 2012-05-01 Roche Molecular Systems, Inc. Determination of melting temperatures of DNA
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8481302B2 (en) * 2008-11-03 2013-07-09 General Electric Company Total bacteria monitoring system
US20100119454A1 (en) * 2008-11-03 2010-05-13 Ping Shen Use of the conserved Drosophila NPFR1 system for uncovering interacting genes and pathways important in nociception and stress response
US20100112630A1 (en) * 2008-11-03 2010-05-06 Scott Martell Boyette Methods for measuring microbiological content in aqueous media
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
GB2483810B (en) 2008-11-07 2012-09-05 Sequenta Inc Methods for correlating clonotypes with diseases in a population
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US20100179213A1 (en) * 2008-11-11 2010-07-15 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and Compositions Involving miRNAs In Cancer Stem Cells
US10669574B2 (en) 2008-11-18 2020-06-02 XCR Diagnostics, Inc. DNA amplification technology
EP2373808B1 (de) 2008-12-09 2015-11-25 Oxitec Limited Verbesserte amplifikation auf taqman-sondenbasis
US9534255B2 (en) * 2008-12-17 2017-01-03 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants
US20100285478A1 (en) 2009-03-27 2010-11-11 Life Technologies Corporation Methods, Compositions, and Kits for Detecting Allelic Variants
CA2688174C (en) 2008-12-19 2018-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase
US20100159452A1 (en) * 2008-12-22 2010-06-24 Roche Molecular Systems, Inc. Method For Detecting a Target Nucleic Acid in a Sample
US8206929B2 (en) 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
CN102272319B (zh) * 2009-01-08 2014-08-27 伯乐实验室公司 用于提高核酸扩增反应效率的方法和组合物
SG183029A1 (en) 2009-01-13 2012-08-30 Fluidigm Corp Single-cell nucleic acid analysis
PT2387627E (pt) 2009-01-15 2016-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp Determinação do perfil de imunidade adaptativa e métodos de geração de anticorpos monoclonais
WO2010086410A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Kantonsspital Aarau Ag Gene dosage analysis
US8368882B2 (en) 2009-01-30 2013-02-05 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for detecting a signal and applying thermal energy to a signal transmission element
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
US8606527B2 (en) 2009-02-27 2013-12-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. SNP detection by melt curve clustering
US9542526B2 (en) * 2009-03-10 2017-01-10 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Method and system for temperature correction in thermal melt analysis
US8039215B2 (en) 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
GB0905325D0 (en) 2009-03-30 2009-05-13 Selex Sensors & Airborne Sys Detection system
WO2010115160A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Helixis, Inc. Devices and methods for heating biological samples
KR101798211B1 (ko) 2009-04-07 2017-11-15 코닌클리케 필립스 엔.브이. 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 특성 확인 방법
MX2011010763A (es) 2009-04-17 2011-12-16 Basf Plant Science Co Gmbh Promotor de planta operable en endosperma y usos del mismo.
WO2010133972A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Population Genetics Technologies Ltd Sorting asymmetrically tagged nucleic acids by selective primer extension
WO2010135917A1 (zh) 2009-05-26 2010-12-02 厦门大学 一种检测核酸序列变异的方法
US8776573B2 (en) 2009-05-29 2014-07-15 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US20120261274A1 (en) 2009-05-29 2012-10-18 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
WO2010138187A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
WO2010151416A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
US8628924B2 (en) 2009-07-21 2014-01-14 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative amplification and detection over a wide dynamic range
EP3029141A1 (de) 2009-08-20 2016-06-08 Population Genetics Technologies Ltd. Zusammensetzungen und verfahren für intramolekulare neuanordnung von nukleinsäuren
WO2011022589A2 (en) * 2009-08-20 2011-02-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of enterovirus
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
FI20090306A0 (fi) 2009-08-25 2009-08-25 Qret Technologies Oy Erotusvapaa määritysmenetelmä
US8219366B2 (en) 2009-08-26 2012-07-10 Roche Molecular Sytems, Inc. Determination of elbow values for PCR for parabolic shaped curves
CN201837588U (zh) * 2009-09-09 2011-05-18 海利克斯公司 用于多个反应的光学***
US8815515B1 (en) 2009-09-24 2014-08-26 University Of Utah Research Foundation Methods, compositions, and kits for rare allele detection
WO2011053845A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Illumina, Inc. Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same
US20110111403A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-12 Life Technologies Corporation Multi-primer assay for mycoplasma detection
WO2011055232A2 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Population Genetics Technologies Ltd. Base-by-base mutation screening
US9133343B2 (en) 2009-11-30 2015-09-15 Enzo Biochem, Inc. Dyes and compositions, and processes for using same in analysis of protein aggregation and other applications
US8614071B2 (en) 2009-12-11 2013-12-24 Roche Molecular Systems, Inc. Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
US9404160B2 (en) 2009-12-22 2016-08-02 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US8877437B1 (en) 2009-12-23 2014-11-04 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection
EP2524053A1 (de) * 2010-01-15 2012-11-21 Steffen Mergemeier Verfahren zur erkennung mehr als eines ziels in einem pcr-basierten ansatz mit einer unspezifischen und nicht mit der emission fluorphor-etikettierter sonden interferierenden matrize
US20110177512A1 (en) * 2010-01-19 2011-07-21 Predictive Biosciences, Inc. Method for assuring amplification of an abnormal nucleic acid in a sample
WO2011101744A2 (en) 2010-02-22 2011-08-25 Population Genetics Technologies Ltd. Region of interest extraction and normalization methods
WO2011107887A2 (en) 2010-03-02 2011-09-09 Population Genetic Technologies Ltd. Methods for replicating polynucleotides with secondary structure
GB201004339D0 (en) * 2010-03-16 2010-04-28 Enigma Diagnostics Ltd Sequence detection assay
CN102844446A (zh) * 2010-03-29 2012-12-26 凸版印刷株式会社 目标碱基序列的识别方法
DE102010003781B4 (de) * 2010-04-08 2012-08-16 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen
US20110250598A1 (en) 2010-04-12 2011-10-13 Ulrike Fischer Detergent free polymerases
US8774494B2 (en) 2010-04-30 2014-07-08 Complete Genomics, Inc. Method and system for accurate alignment and registration of array for DNA sequencing
US20130065790A1 (en) 2010-05-05 2013-03-14 Check-Points Holding B.V. Assays, compositions and methods for detecting drug resistant micro-organisms
CN104673899A (zh) 2010-05-06 2015-06-03 赛昆塔公司 利用克隆型谱监测健康和疾病状态
GB201007867D0 (en) 2010-05-11 2010-06-23 Enigma Diagnostics Ltd Signalling system
GB201007868D0 (en) 2010-05-11 2010-06-23 Enigma Diagnostics Ltd Sequence detection assay
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
AU2011226792A1 (en) 2010-06-11 2012-01-12 Life Technologies Corporation Alternative nucleotide flows in sequencing-by-synthesis methods
EP2585593B1 (de) 2010-06-24 2017-03-01 Population Genetics Technologies Ltd. Verfahren zur herstellung und verewigung einer polynukleotid-bibliothek sowie zur extraktion relevanter bereiche daraus
US9650629B2 (en) 2010-07-07 2017-05-16 Roche Molecular Systems, Inc. Clonal pre-amplification in emulsion
JP5972265B2 (ja) 2010-07-29 2016-08-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジェネリックｐｃｒ
DE112011102524T5 (de) 2010-07-29 2013-07-11 Roche Diagnostics Gmbh Präparation generischer Proben
WO2012013731A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 F. Hoffmann - La Roche Ag Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids
JP5952275B2 (ja) 2010-07-29 2016-07-13 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多数のパラメーターのための対照核酸
WO2012018741A2 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Weight Brent L Pressurizable cartridge for polymerase chain reactions
WO2012024500A1 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Life Technologies Corporation Chemical coating of microwell for electrochemical detection device
US9051606B2 (en) 2010-09-10 2015-06-09 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for nucleic acid detection
CA2812115C (en) 2010-09-13 2021-10-26 Clinical Genomics Pty. Ltd. Epigenetic markers of colorectal cancers and diagnostic methods using the same
CN110878345A (zh) 2010-09-21 2020-03-13 安捷伦科技有限公司 通过分子计数提高等位基因调用的置信度
WO2012038049A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Roche Diagnostics Gmbh Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers
JP5911495B2 (ja) 2010-10-04 2016-04-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 同じ反応容器内での細胞溶解およびｐｃｒのための方法
ES2533732T3 (es) 2010-10-04 2015-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Método para lisis celular en un tampón de reacción de RT-PCR
WO2012045670A1 (en) 2010-10-04 2012-04-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for cell lysis in a pcr reaction buffer
CA2814047C (en) 2010-10-08 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College High-throughput immune sequencing
CA2814049C (en) 2010-10-08 2021-07-13 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
GB201017011D0 (en) 2010-10-08 2010-11-24 Skova Services Ltd Assay
US8725422B2 (en) 2010-10-13 2014-05-13 Complete Genomics, Inc. Methods for estimating genome-wide copy number variations
GB201017978D0 (en) 2010-10-25 2010-12-08 Oxitec Ltd Multiplex amplification and detection
KR101420094B1 (ko) 2010-10-27 2014-07-17 (주)바이오니아 다양한 생체시료분석을 위한 전자동실시간정량증폭장비, 다양한 생체시료분석을 위한 자동정제 및 반응준비 장치, 전자동 핵산정제 및 실시간 정량 유전자증폭 방법, 전자동 핵산정제방법, 실시간정량ｐｃｒ을 이용한 병원균의 전자동 생균수검사방법, 정량면역ｐｃｒ을 이용한 전자동 항원농도획득방법 및 타겟항원에 라벨링된 부착용 타겟핵산의 정제방법
NZ609567A (en) 2010-11-05 2015-05-29 Transbio Ltd Markers of endothelial progenitor cells and uses thereof
RU2451086C1 (ru) * 2010-12-03 2012-05-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Смоленская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью пцр в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером
US8569254B2 (en) 2010-12-10 2013-10-29 National Yang Ming University Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and methods for identifying agents useful for doing the same
EP2465945A1 (de) 2010-12-17 2012-06-20 F. Hoffmann-La Roche AG Allgemeine Matrix zur Steuerung von Nukleinsäuren
WO2012087135A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Genetic markers specific for clostridium difficile ribotypes 027 (nap01/b1; rt 027) and 078 (nap7/8; rt 078) and their use
US9594870B2 (en) 2010-12-29 2017-03-14 Life Technologies Corporation Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations
US10146906B2 (en) 2010-12-30 2018-12-04 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
US20130060482A1 (en) 2010-12-30 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing
US10241075B2 (en) 2010-12-30 2019-03-26 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
EP2663652B1 (de) 2011-01-11 2018-11-14 Roche Diagniostics GmbH Schmelzanalyse mit hoher auflösung als voruntersuchungsinstrument
MX352460B (es) 2011-01-11 2017-11-24 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
US9096892B1 (en) 2011-02-04 2015-08-04 K2 Biomicrosystems, LLC Nucleic acid amplification and monitoring apparatus
US9365897B2 (en) 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
FR2971258B1 (fr) 2011-02-09 2020-12-04 Bio Rad Pasteur Combinaison de biomarqueurs pour le pronostic d'une reponse ou non-reponse a un traitement anti-vhc
FR2971256A1 (fr) 2011-02-09 2012-08-10 Bio Rad Pasteur Combinaison de biomarqueurs pour la detection et l'evaluation d'une fibrose hepatique
FR2971257B1 (fr) 2011-02-09 2020-12-04 Bio Rad Pasteur Combinaison de biomarqueurs pour le pronostic d'une reponse ou non-reponse a un traitement anti-vhc
SI3270141T1 (sl) 2011-03-08 2021-03-31 Universite Laval Fluidična centripetalna naprava
US9428807B2 (en) 2011-04-08 2016-08-30 Life Technologies Corporation Phase-protecting reagent flow orderings for use in sequencing-by-synthesis
ES2769028T3 (es) 2011-04-15 2020-06-24 Becton Dickinson Co Termociclador microfluídico de barrido en tiempo real
WO2012142656A1 (en) 2011-04-18 2012-10-26 Garvan Institute Of Medical Research Method of diagnosing cancer
BR112013028296B1 (pt) * 2011-05-04 2020-03-24 Biocept, Inc. Métodos para detecção de variantes de sequências de ácido nucléico
CN103635594B (zh) 2011-05-09 2018-02-13 富鲁达公司 基于探针的核酸检测
WO2012153153A1 (en) 2011-05-11 2012-11-15 Diagon Kft. Procedure for rapid determination of viruses using nucleic acid-based molecular diagnostics, and a kit for this purpose
WO2012159025A2 (en) 2011-05-18 2012-11-22 Life Technologies Corporation Chromosome conformation analysis
US9677142B2 (en) 2011-05-24 2017-06-13 Elitechgroup B.V. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US9034581B2 (en) 2011-05-26 2015-05-19 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus
WO2012166913A1 (en) * 2011-06-01 2012-12-06 Streck, Inc. Rapid thermocycler system for rapid amplification of nucleic acids and related methods
WO2012171997A1 (en) 2011-06-14 2012-12-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals
WO2013026027A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Nestec S.A. Compositions and methods for detecting allelic variants
EP2745108B1 (de) 2011-08-18 2019-06-26 Life Technologies Corporation Verfahren, systeme und computerlesbare medien zur herstellung von basenzuordnungen in einer nukleinsäuresequenzierung
US10704164B2 (en) 2011-08-31 2020-07-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, computer readable media, and kits for sample identification
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
CN103946398B (zh) 2011-09-15 2019-08-13 健能泰格技术公司 探针：反义探针组合物对高特异性dna或rna的检测
DK2756098T3 (en) 2011-09-16 2018-09-03 Lexogen Gmbh Process for Preparing a Library of Nucleic Acid Molecules
EP2570487A1 (de) 2011-09-16 2013-03-20 Lexogen GmbH Verfahren zur Nukleinsäuretranskription
ES2656961T3 (es) 2011-09-23 2018-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Uso de G-Clamp para mejorar la PCR específica de alelo
CN103945931B (zh) 2011-09-26 2017-03-22 基因技术股份公司 高效的小体积核酸合成
WO2013049613A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Luminex Corporation Hydrolysis probes
US9416153B2 (en) 2011-10-11 2016-08-16 Enzo Life Sciences, Inc. Fluorescent dyes
JP2014531908A (ja) 2011-10-14 2014-12-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 構造アッセンブリによる配列決定
ES2660228T3 (es) 2011-10-14 2018-03-21 Becton Dickinson & Company Ciclado térmico de onda cuadrada
AU2012325791B2 (en) 2011-10-21 2018-04-05 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US10837879B2 (en) 2011-11-02 2020-11-17 Complete Genomics, Inc. Treatment for stabilizing nucleic acid arrays
WO2013067202A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Handylab, Inc. Polynucleotide sample preparation device
US9447458B2 (en) 2011-11-16 2016-09-20 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Detection of neighboring variants
US9260714B2 (en) 2011-12-02 2016-02-16 Roche Molecular Systems, Inc. Suppression of non-specific amplification with high-homology oligonucleotides
EP2788509B1 (de) 2011-12-09 2018-07-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnose von lymphoid-malignität und nachweis minimaler resterkrankungen
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US20140377762A1 (en) 2011-12-19 2014-12-25 360 Genomics Ltd. Method for enriching and detection of variant target nucleic acids
US8981318B1 (en) 2011-12-30 2015-03-17 Gene Capture, Inc. Multi-dimensional scanner for nano-second time scale signal detection
US9194840B2 (en) 2012-01-19 2015-11-24 Life Technologies Corporation Sensor arrays and methods for making same
US20150126438A1 (en) 2012-01-24 2015-05-07 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Novel ChREBP Isoforms and Methods Using the Same
US9864846B2 (en) 2012-01-31 2018-01-09 Life Technologies Corporation Methods and computer program products for compression of sequencing data
US9515676B2 (en) 2012-01-31 2016-12-06 Life Technologies Corporation Methods and computer program products for compression of sequencing data
WO2013113748A1 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Primer Design Ltd Method for detecting and genotyping target nucleic acid
KR101912401B1 (ko) 2012-02-03 2018-10-26 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 다중화된 생화학적 분석에서의 시그널 인코딩 및 디코딩
WO2013123125A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
WO2013124743A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Population Genetics Technologies Ltd. Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement ii
US9670529B2 (en) 2012-02-28 2017-06-06 Population Genetics Technologies Ltd. Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample
EP3372694A1 (de) 2012-03-05 2018-09-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Festlegung von gepaarten immunrezeptorketten aus frequenzabgestimmten untereinheiten
AU2013228226B2 (en) 2012-03-05 2016-06-02 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension assay
US9932633B2 (en) 2012-03-21 2018-04-03 Roche Molecular Systems, Inc. Methods for assessing RNA quality
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
SG10201507700VA (en) 2012-05-08 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
US9646132B2 (en) 2012-05-11 2017-05-09 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
BR112014028122B1 (pt) 2012-05-11 2022-08-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Método para triar o princípio ou a predisposição ao princípio de neoplasma no intestino grosso ou para monitorar neoplasma no intestino grosso em indivíduo
DK2850212T3 (da) 2012-05-18 2020-03-23 Clinical Genomics Pty Ltd Fremgangsmåde til screening for colorektal cancer
EP2855704A4 (de) * 2012-05-25 2016-03-16 Accugenomics Inc Nukleinsäureamplifikation und anwendung davon
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
US9488823B2 (en) 2012-06-07 2016-11-08 Complete Genomics, Inc. Techniques for scanned illumination
US9628676B2 (en) 2012-06-07 2017-04-18 Complete Genomics, Inc. Imaging systems with movable scan mirrors
WO2013188839A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Life Technologies Corporation Novel compositions, methods and kits for real time polymerase chain reaction (pcr)
CN108875312A (zh) 2012-07-19 2018-11-23 哈佛大学校长及研究员协会 利用核酸存储信息的方法
EP2877952B1 (de) 2012-07-27 2023-04-12 Gen-Probe Incorporated Dual-referenzkalibrierverfahren und system zum quantifizieren von polynukleotiden
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
WO2014022827A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 California Institute Of Technology Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements
US10993418B2 (en) 2012-08-13 2021-05-04 Life Genetics Lab, Llc Method for measuring tumor burden in patient derived xenograft (PDX) mice
US9957557B2 (en) 2012-08-13 2018-05-01 Life Genetics Lab, Llc Development of a highly sensitive quantification system for assessing DNA degradation and quality in forensic samples
US9982313B2 (en) 2012-08-17 2018-05-29 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2
US10053726B2 (en) 2012-09-10 2018-08-21 Biofire Diagnostics, Llc Multiple amplification cycle detection
US9914968B2 (en) 2012-09-26 2018-03-13 Cepheid Honeycomb tube
CN105189779B (zh) 2012-10-01 2018-05-11 适应生物技术公司 通过适应性免疫受体多样性和克隆性表征进行的免疫能力评估
US10176293B2 (en) 2012-10-02 2019-01-08 Roche Molecular Systems, Inc. Universal method to determine real-time PCR cycle threshold values
WO2014058919A1 (en) * 2012-10-09 2014-04-17 University Of Utah Research Foundation Monitoring temperature with fluorescence
US10329608B2 (en) 2012-10-10 2019-06-25 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for repeat sequencing
EP2722399A1 (de) 2012-10-18 2014-04-23 Roche Diagniostics GmbH Verfahren zur Vermeidung von Produkten mit hohem Molekulargewicht während einer Amplifikation
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
CN103114131B (zh) 2012-11-30 2018-10-02 珠海市坤元农业科技有限公司 一种引物中部序列干扰pcr技术
US9411930B2 (en) 2013-02-01 2016-08-09 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
US10089437B2 (en) 2013-02-01 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
AU2014200958B2 (en) 2013-02-25 2016-01-14 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
US10106840B2 (en) 2013-03-13 2018-10-23 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
AU2013202788B2 (en) * 2013-03-14 2015-10-01 Gen-Probe Incorporated Indexing signal detection module
US20140296080A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Life Technologies Corporation Methods, Systems, and Computer Readable Media for Evaluating Variant Likelihood
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
US10563240B2 (en) 2013-03-14 2020-02-18 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
WO2014144495A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abvitro, Inc. Single cell bar-coding for antibody discovery
JP6351703B2 (ja) 2013-03-15 2018-07-04 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 垂直配置カルーセルを有する自動診断分析装置および関連方法
US20140273181A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biofire Diagnostics, Inc. Compact optical system for substantially simultaneous monitoring of samples in a sample array
EP3486328B1 (de) 2013-03-15 2020-11-11 Avellino Lab USA, Inc. Verfahren zur verbesserten isolierung von genomischen dna-matrizen zum nachweis von allelen
US10933417B2 (en) 2013-03-15 2021-03-02 Nanobiosym, Inc. Systems and methods for mobile device analysis of nucleic acids and proteins
CN114137240A (zh) 2013-03-15 2022-03-04 雅培制药有限公司 具有后面可进入轨道***的自动化诊断分析仪及相关方法
JP6165961B2 (ja) 2013-03-15 2017-07-19 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 前処理カルーセルを有する診断分析装置および関連方法
CN105392897B (zh) 2013-03-19 2020-03-20 定向基因组学公司 靶序列的富集
US20160085908A1 (en) 2013-04-23 2016-03-24 Thermo Fisher Scientific Oy Melt Curve Analysis
WO2014189843A1 (en) 2013-05-20 2014-11-27 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Gep5 model for multiple myeloma
EP3521452B1 (de) 2013-06-19 2021-08-04 Luminex Corporation Multiplexierter echtzeithydrolysesondentest
JP6609551B2 (ja) * 2013-06-25 2019-11-20 ザ ユニバーシティー オブ ユタ リサーチ ファンデーション ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法及びその関連する使用
CA2916990C (en) 2013-06-28 2023-05-23 Streck, Inc. Devices for real-time polymerase chain reaction
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
WO2015008985A1 (en) 2013-07-15 2015-01-22 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
US9926597B2 (en) 2013-07-26 2018-03-27 Life Technologies Corporation Control nucleic acid sequences for use in sequencing-by-synthesis and methods for designing the same
KR102265313B1 (ko) 2013-08-09 2021-06-15 루미넥스 코포레이션 핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브
US20160186265A1 (en) 2013-08-15 2016-06-30 Centre Hospitalier Universitarie Vaudois Methods for Typing HLA Alleles
CN105683980B (zh) 2013-10-04 2018-08-24 生命科技股份有限公司 在使用终止化学物质的测序中建立分阶段效应模型的方法和***
KR102323375B1 (ko) 2013-10-09 2021-11-08 플루어레센트릭 인코포레이티드 다중 프로브
US10072288B2 (en) 2013-11-11 2018-09-11 Roche Molecular Systems, Inc. Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe
WO2015073978A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Avellino Lab Usa, Inc. Methods for multiplex detection of alleles associated with ophthalmic conditions
WO2015083004A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Population Genetics Technologies Ltd. Method for evaluating minority variants in a sample
US9476853B2 (en) 2013-12-10 2016-10-25 Life Technologies Corporation System and method for forming microwells
AU2014362322B2 (en) 2013-12-11 2021-05-27 The Regents For Of The University Of California Methods for labeling DNA fragments to recontruct physical linkage and phase
AU2015218821B2 (en) 2014-02-21 2019-01-24 President And Fellows Of Harvard College De novo design of allosteric proteins
EP3114240B1 (de) 2014-03-05 2019-07-24 Adaptive Biotechnologies Corporation Verfahren unter verwendung von randomerhaltigen synthetischen molekülen
US10195610B2 (en) 2014-03-10 2019-02-05 Click Diagnostics, Inc. Cartridge-based thermocycler
EP2921556A1 (de) 2014-03-21 2015-09-23 Lexogen GmbH Anzahlerhaltendes RNA-Analyseverfahren
WO2015147370A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
EP3126524B1 (de) 2014-04-04 2020-07-22 Affymetrix, Inc. Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für molekularinversionsprobenassays
BE1022048B1 (nl) * 2014-04-11 2016-02-10 Ugentec Bvba Methoden voor fluorescentie data correctie
WO2015191723A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 University Of Southern California Usc Discrete elements for 3d microfluidics
DE102014212657B4 (de) * 2014-06-30 2016-03-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. System und Verfahren zur bedarfsgerechten Zuführung von Beleuchtungsenergie an Pflanzen
GB201411567D0 (en) * 2014-06-30 2014-08-13 Epistem Ltd Quantification methods
CA2956925C (en) 2014-08-01 2024-02-13 Dovetail Genomics, Llc Tagging nucleic acids for sequence assembly
DE102014215352A1 (de) * 2014-08-04 2016-02-04 Berthold Technologies Gmbh & Co. Kg Messgerät und Verfahren zum Bestimmen einer Messgröße
KR102465287B1 (ko) 2014-08-11 2022-11-09 루미넥스 코포레이션 핵산 검정에서 개선된 용융 판별 및 멀티플렉싱을 위한 프로브
WO2016041010A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Garvan Institute Of Medical Research Methods for diagnosis, prognosis and monitoring of breast cancer and reagents therefor
KR102541849B1 (ko) 2014-09-15 2023-06-09 에이비비트로, 엘엘씨 고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정
PL3194570T3 (pl) * 2014-09-16 2021-12-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do inżynierii genomowej w której pośredniczy nukleaza i korekty hematopoetycznych komórek macierzystych
CN107002138B (zh) 2014-09-30 2022-06-14 基因技术有限公司 用于评估发展乳腺癌风险的方法
WO2016060974A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer-readable media for accelerated base calling
WO2016069886A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corporation Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US11198855B2 (en) 2014-11-13 2021-12-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bio-engineered hyper-functional “super” helicases
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US9745618B2 (en) 2014-11-19 2017-08-29 Roche Molecular Systems, Inc. Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids
EP3498866A1 (de) 2014-11-25 2019-06-19 Adaptive Biotechnologies Corp. Charakterisierung von adaptiver immunreaktion auf impfungen oder infektionen unter verwendung von immunrepertoiresequenzierung
US9920381B2 (en) 2014-12-02 2018-03-20 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus
LT3557262T (lt) 2014-12-09 2022-11-10 Life Technologies Corporation Didelio efektyvumo nukleorūgščių sintezė mažame tūryje
JP2017537657A (ja) 2014-12-11 2017-12-21 ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド 標的配列の濃縮
US9909169B2 (en) 2014-12-17 2018-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression
EP3240906B1 (de) 2014-12-31 2021-08-25 Visby Medical, Inc. Vorrichtungen zur molekularen diagnostischen prüfung
US10421993B2 (en) 2015-02-11 2019-09-24 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for reducing non-specific amplification products
NZ734854A (en) 2015-02-17 2022-11-25 Dovetail Genomics Llc Nucleic acid sequence assembly
AU2016222788B2 (en) 2015-02-24 2022-03-31 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
US11807896B2 (en) 2015-03-26 2023-11-07 Dovetail Genomics, Llc Physical linkage preservation in DNA storage
US9957393B2 (en) 2015-03-30 2018-05-01 Enzo Biochem, Inc. Monoazo dyes with cyclic amine as fluorescence quenchers
AU2016242967B2 (en) 2015-04-01 2021-07-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
ES2961374T3 (es) 2015-04-24 2024-03-11 Atila Biosystems Incorporated Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada
EP3288563B1 (de) 2015-05-01 2019-11-13 Vanderbilt University Überwachung und analyse von nukleinsäurehybridisierungsstatus und amplifikation mit l-dna
CN114540475A (zh) 2015-05-14 2022-05-27 生命科技公司 条形码序列和有关***与方法
AU2016269875B2 (en) 2015-06-04 2019-05-09 Mizuho Medy Co., Ltd. Kit for together detecting multiple target acids differing from each other and detection method using the same
EP3303662B1 (de) 2015-06-08 2022-03-09 The University of Chicago Bipyramidvorlagensynthese von monodispersen edelmetallnanokristallen
US9499861B1 (en) 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
CA2999888C (en) 2015-09-24 2024-04-09 Abvitro Llc Affinity-oligonucleotide conjugates and uses thereof
WO2017053902A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Abvitro Llc High throughput process for t cell receptor target identification of natively-paired t cell receptor sequences
EP3355914B1 (de) 2015-09-29 2024-03-06 The General Hospital Corporation Eine bcg-haltige zusammensetzung zur cholesterolsenkung.
CN108368542B (zh) 2015-10-19 2022-04-08 多弗泰尔基因组学有限责任公司 用于基因组组装、单元型定相以及独立于靶标的核酸检测的方法
USD799715S1 (en) 2015-10-23 2017-10-10 Gene POC, Inc. Fluidic centripetal device
US10808287B2 (en) 2015-10-23 2020-10-20 Rapid Pathogen Screening, Inc. Methods and devices for accurate diagnosis of infections
WO2017083852A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 MOORE, Tara Methods for the treatment of corneal dystrophies
WO2017098321A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Spartan Bioscience Inc. Tube sealing system and methods for nucleic acid amplification
US10613031B2 (en) 2015-12-18 2020-04-07 Biofire Defense, Llc Solid fluorescence standard
MX2018009254A (es) 2016-01-28 2019-05-06 Univ Melbourne Metodos para evaluar el riesgo de desarrollar cancer colorrectal.
KR20180116377A (ko) 2016-02-23 2018-10-24 더브테일 제노믹스 엘엘씨 게놈 어셈블리를 위한 페이징된 판독 세트의 생성 및 반수체형 페이징
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
SG11201805166PA (en) 2016-03-10 2018-07-30 Pioneer Hi Bred Int Light-mediated polymerase chain reaction amplification and product detection system and methods of use
CN108779500B (zh) 2016-03-11 2022-12-13 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测寨卡病毒的组合物和方法
US10987674B2 (en) 2016-04-22 2021-04-27 Visby Medical, Inc. Printed circuit board heater for an amplification module
US10619205B2 (en) 2016-05-06 2020-04-14 Life Technologies Corporation Combinatorial barcode sequences, and related systems and methods
WO2017197040A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Click Diagnostics, Inc. Devices and methods for nucleic acid extraction
DK3455356T3 (da) 2016-05-13 2021-11-01 Dovetail Genomics Llc Genfinding af langtrækkende bindingsinformation fra konserverede prøver
ES2929367T3 (es) 2016-05-18 2022-11-28 Hoffmann La Roche Amplificación por PCR ultrarrápida cuantitativa usando un dispositivo basado en electrohumectación
US10612101B2 (en) 2016-05-27 2020-04-07 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium
WO2017202894A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Roche Diagnostics Gmbh Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis
WO2017210437A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Life Technologies Corporation Methods and systems for designing gene panels
US20170356025A1 (en) 2016-06-14 2017-12-14 Roche Molecular Systems, Inc. Internal control probes for improving pcr assay performance
WO2017218777A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 California Institute Of Technology Nucleic acid reactions and related methods and compositions
RU2691763C2 (ru) * 2016-06-21 2019-06-18 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты
EP3478857A1 (de) 2016-06-29 2019-05-08 Click Diagnostics, Inc. Vorrichtungen und verfahren zur detektion von molekülen unter verwendung einer durchflusszelle
US10626454B2 (en) 2016-07-27 2020-04-21 SeqMatic, LLC Compositions and methods for nucleic acid amplification and analysis
CN109804089A (zh) 2016-07-29 2019-05-24 朱诺治疗学股份有限公司 用于评估复制型病毒存在或不存在的方法
CN109642253A (zh) 2016-08-02 2019-04-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于提高核酸的扩增和检测/定量的效率的辅助寡核苷酸
CA3036119C (en) 2016-09-15 2022-09-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for performing multiplexed pcr
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018057928A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Grail, Inc. Methods of preparing and analyzing cell-free nucleic acid sequencing libraries
BR112019005748A2 (pt) 2016-09-24 2019-06-18 Abvitro Llc afinidade-conjugados de oligonucleotídeo e usos destes
US9851345B1 (en) 2016-10-12 2017-12-26 Viasphere, Llc Compositions and methods for disease diagnosis using single cell analysis
WO2018073872A1 (ja) 2016-10-17 2018-04-26 オリンパス株式会社 標的核酸分子の検出方法
CN109906276A (zh) 2016-11-07 2019-06-18 格里尔公司 用于检测早期癌症中体细胞突变特征的识别方法
US10793923B2 (en) 2016-11-09 2020-10-06 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of BK virus
ES2928184T3 (es) 2016-12-12 2022-11-16 Cepheid Inmuno-PCR integrado y análisis de ácidos nucleicos en un cartucho de reacción automatizado
EP3551768B1 (de) 2016-12-12 2024-03-06 Grail, LLC Verfahren zur markierung und amplifizierung von rna-template-molekülen zur herstellung von sequenzierungsbibliotheken
US20190211377A1 (en) 2016-12-22 2019-07-11 Roche Molecular Systems, Inc. Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile
EP3559255A1 (de) 2016-12-23 2019-10-30 Grail, Inc. Verfahren zur hocheffizienten bibliothek-herstellung unter verwendung von doppelsträngigen adaptern
US10793901B2 (en) 2016-12-28 2020-10-06 Roche Molecular Systems, Inc. Reversibly protected nucleotide reagents with high thermal stability
WO2018129214A1 (en) 2017-01-04 2018-07-12 Complete Genomics, Inc. Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides
EP3568493B1 (de) 2017-01-10 2021-03-24 Paragon Genomics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur verringerung von redundanten molekularen barcodes in primerextensionsreaktionen
WO2018175715A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herpes simplex virus type-1(hsv-1) vaccine strain vc2 generating an anti-ehv-1 immune response
US11976337B2 (en) 2017-03-24 2024-05-07 Gen-Probe Incorporated Methods for detection of influenza in samples
US11274344B2 (en) 2017-03-30 2022-03-15 Grail, Inc. Enhanced ligation in sequencing library preparation
WO2018183897A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Higher target capture efficiency using probe extension
WO2018183942A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification
WO2018200980A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Avellino Lab Usa, Inc. Methods for detecting alleles associated with keratoconus
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
US20190093155A1 (en) 2017-05-25 2019-03-28 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex Nucleic Acid Amplification Assay
CN111148849A (zh) 2017-05-26 2020-05-12 阿布维托有限责任公司 高通量多核苷酸文库测序和转录组分析
US20180363044A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for improving the thermal stability of nucleic acid amplification reagents
US11450121B2 (en) 2017-06-27 2022-09-20 The Regents Of The University Of California Label-free digital brightfield analysis of nucleic acid amplification
AU2018291032A1 (en) 2017-06-29 2020-01-16 Juno Therapeutics, Inc. Mouse model for assessing toxicities associated with immunotherapies
AU2018300000B2 (en) 2017-07-10 2021-11-11 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
US10760137B2 (en) 2017-07-18 2020-09-01 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of Babesia
CA3070573A1 (en) 2017-07-29 2019-02-07 Juno Therapeutics, Inc. Reagents for expanding cells expressing recombinant receptors
WO2019045532A2 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Seegene, Inc. EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS
US20210071258A1 (en) 2017-09-01 2021-03-11 Juno Therapeutics, Inc. Gene expression and assessment of risk of developing toxicity following cell therapy
WO2019055819A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Grail, Inc. METHODS FOR PREPARING A SEQUENCING LIBRARY FROM SINGLE STRANDED DNA
EP4026915B1 (de) 2017-09-28 2023-10-25 Grail, LLC Anreicherung von kurzen nukleinsäurefragmenten bei der herstellung von sequenzierungsbibliotheken
WO2019063661A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Roche Diagnostics Gmbh COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS
WO2019066461A2 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Seegene, Inc. DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO
US11732257B2 (en) 2017-10-23 2023-08-22 Massachusetts Institute Of Technology Single cell sequencing libraries of genomic transcript regions of interest in proximity to barcodes, and genotyping of said libraries
CA3080509A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a t cell composition
WO2019094784A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Click Diagnostics, Inc. Portable molecular diagnostic device and methods for the detection of target viruses
US11078534B2 (en) 2017-11-27 2021-08-03 Roche Molecular Systems, Inc. Photocleavable nucleotide reagents with high stability
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019118925A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Grail, Inc. Methods for enriching for duplex reads in sequencing and error correction
US20190237161A1 (en) 2017-12-22 2019-08-01 Grail, Inc. Error removal using improved library preparation methods
EP3735476B1 (de) 2018-01-05 2023-08-23 Seegene, Inc. Verfahren zur bestimmung der anwesenheit oder abwesenheit von m. tuberculosis, m. bovis und m. bovis bcg in einer probe
AU2019212931A1 (en) 2018-01-29 2020-08-27 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods
EP3746569A1 (de) 2018-01-31 2020-12-09 Juno Therapeutics, Inc. Verfahren zur untersuchung der präsenz oder absenz von replikationskompetenten viren
US20190292596A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Roche Molecular Systems, Inc. Modified nucleoside phosphates with high thermal stability
US11384376B2 (en) 2018-05-31 2022-07-12 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for post-synthetic modification of nucleic acids
US20210317515A1 (en) 2018-07-10 2021-10-14 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
GB201812192D0 (en) 2018-07-26 2018-09-12 Ttp Plc Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same
EP3836967A4 (de) 2018-07-30 2022-06-15 ReadCoor, LLC Verfahren und systeme zur probenverarbeitung oder -analyse
US20210324461A1 (en) 2018-08-16 2021-10-21 Life Technologies Corporation Reagents, mixtures, kits and methods for amplification of nucleic acids
JP7221491B2 (ja) 2018-09-18 2023-02-14 株式会社ミズホメディー 複数の標的核酸を検出するキットを用いる検出方法
WO2020089218A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Single cell full length rna sequencing
US20210393691A1 (en) 2018-11-06 2021-12-23 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing genetically engineered t cells
US20220017973A1 (en) 2018-12-03 2022-01-20 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of candida auris
WO2020120442A2 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
AU2019403269A1 (en) 2018-12-18 2021-06-17 Grail, Llc Methods for detecting disease using analysis of RNA
US20220356510A1 (en) 2019-01-03 2022-11-10 Dna Script One Pot Synthesis of Sets of Oligonucleotides
JP2022525322A (ja) 2019-03-14 2022-05-12 インシリクサ， インコーポレイテッド 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム
KR20220035032A (ko) 2019-04-17 2022-03-21 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 변이체 icos 리간드(icosl) 융합 단백질의 방법 및 용도
CN116786186A (zh) * 2019-05-01 2023-09-22 卢米耐克斯公司 用于热循环的装置以及样品模块
WO2020221915A1 (en) 2019-05-02 2020-11-05 F. Hoffmann-La Roche Ag UTILIZATION OF dITP FOR PREFERENTIAL/SELECTIVE AMPLIFICATION OF RNA VERSUS DNA TARGETS BASED ON STRAND-SEPARATION TEMPERATURE
WO2020225231A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae
WO2020252218A1 (en) 2019-06-12 2020-12-17 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell-mediated cytotoxic therapy and an inhibitor of a prosurvival bcl2 family protein
CN114174540A (zh) 2019-07-25 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)的组合物和方法
WO2021035194A1 (en) 2019-08-22 2021-02-25 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a t cell therapy and an enhancer of zeste homolog 2 (ezh2) inhibitor and related methods
JP2022546443A (ja) 2019-08-27 2022-11-04 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含む、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅および検出のための組成物および方法
US11441167B2 (en) 2019-11-20 2022-09-13 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi
WO2021116037A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Dicationic fluorescent dyes
JP2023508100A (ja) 2019-12-27 2023-02-28 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための組成物および方法
WO2021138544A1 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Visby Medical, Inc. Devices and methods for antibiotic susceptibility testing
WO2021140173A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Biouniversa S.R.L. Methods and uses for treating fibrotic solid tumors with bags inhibitors
MX2022008625A (es) 2020-01-13 2022-09-09 Aspen Neuroscience Inc Metodo de diferenciacion de celulas neuronales y composiciones relacionadas y metodos de uso.
IL296319A (en) 2020-03-09 2022-11-01 Janssen Biotech Inc Compositions and Methods for Quantifying Recombinant Vector Nucleic Acid Incorporation
CN116171333A (zh) 2020-03-09 2023-05-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)、甲型流感和乙型流感的组合物和方法
WO2021185320A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Mgi Tech Co., Ltd. Restoring phase in massively parallel sequencing
CN115835873A (zh) 2020-05-13 2023-03-21 朱诺治疗学股份有限公司 用于产生表达重组受体的供体分批细胞的方法
US10941453B1 (en) 2020-05-20 2021-03-09 Paragon Genomics, Inc. High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens
KR20230019872A (ko) 2020-05-27 2023-02-09 지네틱 테크놀로지스 리미티드 코로나바이러스 감염에 대한 중증 반응의 발생 위험을 평가하는 방법
WO2021260186A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Juno Therapeutics Gmbh Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
US11519861B2 (en) * 2020-07-20 2022-12-06 Photothermal Spectroscopy Corp Fluorescence enhanced photothermal infrared spectroscopy and confocal fluorescence imaging
EP4237573A1 (de) 2020-10-29 2023-09-06 DNA Script Enzymatische synthese von polynukleotidsonden
CN112461806B (zh) * 2020-11-18 2022-02-11 厦门大学 基于智能手机的荧光光谱检测方法
EP4256089A1 (de) 2020-12-04 2023-10-11 F. Hoffmann-La Roche AG Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von malaria
JP7209980B2 (ja) 2020-12-11 2023-01-23 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
EP4267764A1 (de) 2020-12-22 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zur durchführung von multiplexierter echtzeit-pcr unter verwendung von grossen stokes-verschiebungsfluoreszenzfarbstoffen
US20220205020A1 (en) 2020-12-30 2022-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis
CN116806268A (zh) 2021-02-05 2023-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测人副流感病毒1-4(hpiv 1-4)的组合物和方法
US20220290221A1 (en) 2021-03-15 2022-09-15 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations
WO2022233930A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting hepatitis delta virus by a dual-target assay
EP4366878A2 (de) 2021-07-09 2024-05-15 Cepheid Multiplex-reaktionsgefäss auf hoher ebene, reagenzbetupfungsvorrichtung und zugehörige verfahren
WO2023004371A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of differentiating neural cells and predicting engraftment thereof and related compositions
WO2023043280A1 (ko) 2021-09-17 2023-03-23 주식회사 씨젠 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
US20230121442A1 (en) 2021-10-06 2023-04-20 Johnson & Johnson Consumer Inc. Method of Quantifying Product Impact on Human Microbiome
WO2023057338A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Bayer Aktiengesellschaft Integrated system for chemical, biochemical or molecular biological reactions in a microplate
WO2023079032A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detection of malaria
WO2023089186A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance
WO2023102459A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Medicinal Genomics Corporation Psilocybe assay
US20230377685A1 (en) 2022-04-15 2023-11-23 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells
US11680293B1 (en) 2022-04-21 2023-06-20 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2024003114A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Actome Gmbh Detection of biomolecules in single cells
WO2024003332A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins
WO2024003260A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis
WO2024015766A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Topogene Inc. Scalable, submicron-resolution replication of dna arrays
WO2024042042A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting monkeypox virus
WO2024059493A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Medicinal Genomics Corporation Psilocybe assay
WO2024062208A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Cost-Bry Pty Ltd (trading as BiomeBank) Compositions and methods for reducing endogenous sulphide in inflammatory bowel diseases

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1006767A (en) 1910-01-19 1911-10-24 Gen Electric Electric hair-drier.
US1456005A (en) 1922-07-24 1923-05-22 Harris Jack Incubator
US2379474A (en) 1943-11-10 1945-07-03 Bramson Maurice Heating cabinet, incubator, and the like
US3219416A (en) 1962-10-30 1965-11-23 Scientific Industries Apparatus for the automatic chemical sequential treatment and analysis of small quantities of material
US3556659A (en) 1966-02-03 1971-01-19 Applied Physics Corp Laser-excited raman spectrometer
US3616264A (en) 1969-06-30 1971-10-26 Beckman Instruments Inc Temperature-controlled discrete sample analyzer
US3718133A (en) 1971-01-12 1973-02-27 Damon Corp Container unit for liquid samples
US4038055A (en) 1975-10-10 1977-07-26 Block Engineering, Inc. Gas chromatograph for continuous operation with infrared spectrometer
US4168017A (en) 1977-04-05 1979-09-18 Anderwald Cecil E Container means preventing accidental use by children
AU528259B2 (en) 1978-09-14 1983-04-21 Union Carbide Corp Method and apparatus for assaying liquid materials
IT1101295B (it) 1978-11-22 1985-09-28 Erba Strumentazione Camera gas-cromatografica
US4257774A (en) * 1979-07-16 1981-03-24 Meloy Laboratories, Inc. Intercalation inhibition assay for compounds that interact with DNA or RNA
US4420679A (en) 1982-02-26 1983-12-13 Delta Associates, Inc. Gas chromatographic oven using symmetrical flow of preheated - premixed ambient air
US4468423A (en) 1982-11-17 1984-08-28 Arlie Hall Insulating cell element and structures composed thereof
US4468426A (en) * 1982-11-24 1984-08-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Adherable reinforced poly(ethylene terephthalate) composite sheet
US4481405A (en) 1983-04-27 1984-11-06 Malick Franklin S Cooking appliance
US4599169A (en) 1984-02-28 1986-07-08 Varian Associates, Inc. Heating and cooling apparatus for chromatography column
US4701415A (en) 1984-03-02 1987-10-20 Mallinckrodt, Inc. Controlled atmosphere enclosure
JPS60212986A (ja) 1984-04-06 1985-10-25 日本特殊陶業株式会社 直流電圧印加用セラミツクヒ−タ−
JPS60241884A (ja) 1984-05-15 1985-11-30 Tokyo Daigaku 自動サイクリング反応装置およびこれを用いる自動分析装置
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5333675C1 (en) 1986-02-25 2001-05-01 Perkin Elmer Corp Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5038852A (en) 1986-02-25 1991-08-13 Cetus Corporation Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
JPS6212986A (ja) 1985-07-10 1987-01-21 Hitachi Ltd 磁気バブルメモリデバイスのパツケ−ジ
US4740472A (en) 1985-08-05 1988-04-26 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for automated processing and aliquoting of whole blood samples for analysis in a centrifugal fast analyzer
US4868104A (en) * 1985-09-06 1989-09-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Homogeneous assay for specific polynucleotides
US4675300A (en) 1985-09-18 1987-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Laser-excitation fluorescence detection electrokinetic separation
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
ATE88761T1 (de) * 1986-01-10 1993-05-15 Amoco Corp Kompetitiver homogener test.
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
CA1339653C (en) 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4708782A (en) 1986-09-15 1987-11-24 Sepragen Corporation Chromatography column-electrophoresis system
US4684465A (en) 1986-10-10 1987-08-04 Combustion Engineering, Inc. Supercritical fluid chromatograph with pneumatically controlled pump
US4902624A (en) 1987-11-23 1990-02-20 Eastman Kodak Company Temperature cycling cuvette
DE3808942A1 (de) 1988-03-17 1989-09-28 Bio Med Gmbh Ges Fuer Biotechn Inkubator, insbes. fuer die polymerase-ketten-methode
GB8807297D0 (en) 1988-03-26 1988-04-27 Dean P D G Intelligent heating block
US4908112A (en) 1988-06-16 1990-03-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Silicon semiconductor wafer for analyzing micronic biological samples
US4865986A (en) 1988-10-06 1989-09-12 Coy Corporation Temperature control apparatus
US5169511A (en) 1988-11-29 1992-12-08 Isco, Inc. Capillary electrophoresis technique
US5536648A (en) 1988-12-09 1996-07-16 Amrad Corporation Limited Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein
AU638234B2 (en) 1989-02-08 1993-06-24 City Of Hope Apparatus for peptide sequencing
EP0404258B1 (de) 1989-06-20 1994-09-28 Claudio Bonini Prüfröhrchen mit einer linsenförmigen Aussenfläche, insbesondere für automatische klinische Analysen
US5449621A (en) 1989-07-31 1995-09-12 Biotope, Inc. Method for measuring specific binding assays
US5346672A (en) 1989-11-17 1994-09-13 Gene Tec Corporation Devices for containing biological specimens for thermal processing
US5075556A (en) * 1989-12-01 1991-12-24 Technicon Instruments Corporation Acridine orange derivatives and their use in the quantitation of reticulocytes in whole blood
US5169521A (en) 1989-12-13 1992-12-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Apparatus for countercurrent chromatography separations
US5173163A (en) 1990-01-11 1992-12-22 Isco, Inc. Capillary electrophoresis technique
US5141621A (en) 1990-01-26 1992-08-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Capillary electrophoresis injection device and method
US5207987A (en) * 1990-05-21 1993-05-04 Pb Diagnostic Systems Inc. Temperature controlled chamber for diagnostic analyzer
EP0459241B1 (de) 1990-05-29 1994-10-26 Waters Investments Limited Verfahren und Vorrichtung zum Durchführen der Kapillarelektroforese
US7081226B1 (en) 1996-06-04 2006-07-25 University Of Utah Research Foundation System and method for fluorescence monitoring
US5455175A (en) 1990-06-04 1995-10-03 University Of Utah Research Foundation Rapid thermal cycling device
US5187084A (en) 1990-06-22 1993-02-16 The Dow Chemical Company Automatic air temperature cycler and method of use in polymerose chain reaction
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5269900A (en) 1990-09-13 1993-12-14 University Of North Carolina At Chapel Hill Method and device for high speed separation of complex molecules
DE69128520T2 (de) * 1990-10-31 1998-07-09 Tosoh Corp Verfahren zum Nachweis oder Quantifizierung von Zielnukleinsäuren
US5131998A (en) 1990-11-13 1992-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Two-dimensional high-performance liquid chromatography/capillary electrophoresis
US5240577A (en) 1990-11-13 1993-08-31 University Of North Carolina At Chapel Hill Two-dimensional high-performance liquid chromatography/capillary electrophoresis
KR100236506B1 (ko) 1990-11-29 2000-01-15 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치
US5380489A (en) 1992-02-18 1995-01-10 Eastman Kodak Company Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
ATE147281T1 (de) 1991-03-28 1997-01-15 Perseptive Biosystems Inc Produktinformation in chromatographischem effluenten durch differenzbildung
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
WO1992020778A1 (en) 1991-05-24 1992-11-26 Kindconi Pty Limited Biochemical reaction control
US5340715A (en) 1991-06-07 1994-08-23 Ciba Corning Diagnostics Corp. Multiple surface evanescent wave sensor with a reference
US5316913A (en) 1991-09-06 1994-05-31 Stanford University Neutrophil LECAM-1 as indicator of neutrophil activation
US5114551A (en) 1991-09-30 1992-05-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multi-point detection method for electrophoresis and chromatography in capillaries
US5116471A (en) 1991-10-04 1992-05-26 Varian Associates, Inc. System and method for improving sample concentration in capillary electrophoresis
JP3509859B2 (ja) * 1991-11-07 2004-03-22 ナノトロニクス，インコーポレイテッド 供与体−供与体エネルギー転移系を創製するための発色団および蛍光団でコンジュゲート化されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション
US5348853A (en) 1991-12-16 1994-09-20 Biotronics Corporation Method for reducing non-specific priming in DNA amplification
DE4234086A1 (de) * 1992-02-05 1993-08-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen
EP0566751B1 (de) 1992-03-23 1996-01-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zum DNS-Nachweis
JPH07505297A (ja) 1992-04-06 1995-06-15 アボツト・ラボラトリーズ 内面全反射を使用して核酸または被分析物質を検出する方法及び装置
JPH0634546A (ja) 1992-07-17 1994-02-08 Tosoh Corp 蛍光検出器
DE69314462T2 (de) 1992-08-24 1998-05-20 Dade Microscan Inc Abdichtbarer behälter zum konservieren und behandeln analytischer proben
US5340728A (en) * 1992-12-09 1994-08-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction
US5593840A (en) * 1993-01-27 1997-01-14 Oncor, Inc. Amplification of nucleic acid sequences
US5364790A (en) 1993-02-16 1994-11-15 The Perkin-Elmer Corporation In situ PCR amplification system
US5798215A (en) 1993-02-18 1998-08-25 Biocircuits Corporation Device for use in analyte detection assays
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US6027884A (en) * 1993-06-17 2000-02-22 The Research Foundation Of The State University Of New York Thermodynamics, design, and use of nucleic acid sequences
JP3598123B2 (ja) 1993-07-15 2004-12-08 浜松ホトニクス株式会社 核酸の変性検出装置
EP0636413B1 (de) 1993-07-28 2001-11-14 PE Corporation (NY) Vorrichtung und Verfahren zur Nukleinsäurevervielfältigung
CA2129787A1 (en) * 1993-08-27 1995-02-28 Russell G. Higuchi Monitoring multiple amplification reactions simultaneously and analyzing same
ATE207966T1 (de) * 1993-09-13 2001-11-15 Canon Kk Bestimmung von nukleinsäuren durch pcr, messung der anzahl von mikrobiellen zellen, genen oder genkopien durch pcr und kit zu ihrer verwendung
US5415839A (en) 1993-10-21 1995-05-16 Abbott Laboratories Apparatus and method for amplifying and detecting target nucleic acids
US5804380A (en) 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
ATE545711T1 (de) * 1993-11-12 2012-03-15 Phri Properties Inc Hybridisierungssonden zur nukleinsäuredetektion sowie universelle stämme, verfahren und kits
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5863726A (en) 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
GB9401535D0 (en) 1994-01-27 1994-03-23 Steer Rupert P Timing devices
AU699986B2 (en) 1994-02-01 1998-12-17 Igene Inc. Molecular analyzer and method of use
US5654419A (en) 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
JP3265113B2 (ja) * 1994-03-04 2002-03-11 三菱製紙株式会社 インクジェット記録シート
CA2143365A1 (en) 1994-03-14 1995-09-15 Hugh V. Cottingham Nucleic acid amplification method and apparatus
ATE198511T1 (de) 1994-04-29 2001-01-15 Perkin Elmer Corp Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation
ATE280243T1 (de) * 1994-04-29 2004-11-15 Johnson & Johnson Clin Diag Homogenes verfahren zum nachweis von doppelstrang-nukleinsäuren mittels fluoreszierender farbstoffe und dafür nützliche kits
BR9408578A (pt) 1994-05-23 1997-08-19 Biotronics Corp Método para detecção de um ácido nucléico alvo
US5766889A (en) 1994-06-08 1998-06-16 The Perkin-Elmer Corporation Method for determining the characteristics of the concentration growth of target nucleic acid molecules in polymerase chain reaction sample
US5622821A (en) 1994-06-29 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Luminescent lanthanide chelates and methods of use
DE69527125T2 (de) * 1994-11-09 2003-02-27 Hitachi Ltd Verfahren und Vorrichtung zur DNS Analyse
US6008373A (en) * 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
CA2223050A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Abbott Laboratories Probe masking method of reducing background in an amplification reaction
WO1996041864A1 (en) 1995-06-13 1996-12-27 The Regents Of The University Of California Diode laser heated micro-reaction chamber with sample detection means
US5863727A (en) * 1996-05-03 1999-01-26 The Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5945526A (en) * 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5800996A (en) * 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
EP1033411B1 (de) * 1996-06-04 2006-02-22 University of Utah Research Foundation Fluoreszenz-Donor-Akzeptor Paar
US5846727A (en) 1996-06-06 1998-12-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural & Mechanical College Microsystem for rapid DNA sequencing
EP0822261B1 (de) * 1996-07-29 2002-07-03 Academia Sinica Verfahren zur schnellen antimikrobiellen Empfindlichkeitsnachweis
US6482590B1 (en) * 1996-12-20 2002-11-19 Aventis Behring Gmbh Method for polynucleotide amplification
US6143496A (en) * 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6140054A (en) * 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
US6153411A (en) * 1998-10-30 2000-11-28 American Water Works Company, Inc. Methods and kits for detection of Cryptosporidium parvum using immunomagnetic separation and amplification

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Publication number Publication date
EP1033411A2 (de) 2000-09-06
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