DE102005045560B4 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Zelle - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer definierten Menge einer biologischen Probe,
b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren,
c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte sowie
d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde/wird, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde/wird.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologen Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Kopienzahl von Allelen pro Zelle, ein Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe sowie eine insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung.
  • In der molekularen Diagnostik gewinnen Verfahren zum Quantifizieren von Sequenzen, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen pro Zelle, eine immer bedeutendere Rolle. Da eine Vielzahl von zum Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen von der normalen Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen in dem Genom verursacht werden, lassen sich durch eine zuverlässige Bestimmung der Kopienzahl bestimmter Chromosomen oder bestimmter Genabschnitte entsprechende Krankheiten schon im Frühstadium der Entwicklung zuverlässig diagnostizieren.
  • Beispiele für zum Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, sind die Trisomie 18 (Edward's Syndrom), Trisomie 13 (Pätau-Syndrom) sowie Trisomie 21 (Down-Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopienzahl des betreffenden Chromosoms zu schwersten Anomalien. Während Träger der Trisomie 21 in ihrer Entwicklung drastisch gehemmt sind und teilweise schwere Fehlbildungen aufweisen, versterben die Träger der Trisomie 18 und Trisomie 13 meistens innerhalb des ersten Lebensjahres.
  • Neben Krankheiten, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl von Erkrankungen bekannt, welche auf eine veränderte Kopienzahl von Genen oder Genabschnitten beruhen.
  • Ursache für die Huntington-Krankheit, einer progressiv verlaufenden neurodegenerativen Erkrankung gekennzeichnet durch abnormale, unwillkürliche Bewegungen bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperlichen Fähigkeiten, soll die Hintereinanderschaltung von mehr als 37 Kopien eines bestimmten Motivs (CAG) sein, wobei die Prädisposition zur Krankheitsausbildung mit der Anzahl der Wiederholungen dieses Motivs in dem Genom zunimmt. Weitere Beispiele für instabile Trinukleotidsequenzen beim Menschen sind das Kennedy-Syndrom und die spinocerebrale Ataxie-1.
  • Zudem ist bekannt, dass sich bestimmte Protoonkogene durch Genamplifikation in dem Genom vervielfältigen können. Derartige Amplifikationen sind in dem Chromosomensatz oftmals als so genannte "double minutes" (D. M.) oder als "homogeneously staining regions" (HSR) zu erkennen. Aufgrund der enormen Erhöhung der Gen-Kopienzahl kann das zugehörige Protein in den Zellen in sehr großen Mengen produziert werden, was eine verstärkte Aktivierung der Zellproliferation – ohne Veränderung des Einzelgens an sich – ermöglicht. Insbesondere das myc-Protoonkogen soll von der Amplifikation besonders oft betroffen sein.
  • Aufgrund des Bedarfs an Verfahren zur Quantifizierung von Sequenzkopien in einer biologischen Probe wurde in der Vergangenheit eine Vielzahl entsprechender Verfahren vorgeschlagen.
  • Eines der grundlegenden Quantifizierungsverfahren, welches zumindest eine Aussage über die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und abhängig von der Verfahrensführung auch einen bedingten Rückschluss auf die Kopienzahl der betreffenden Nukleinsäuresequenzen pro Zelle erlaubt, ist das so genannte FISH-Verfahren (fluorescence in situ hybridization). Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende biologische Probe nach entsprechender Vorbehandlung, d. h. Denaturierung mit Formamid sowie Vorhybridisierung, mit einer oder mehreren verschiedenen Sonden, welche zuvor mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, unter Bedingungen inkubiert, welche eine Hybridisierung der Sonden mit dazu homologen Sequenzen in der biologischen Probe ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden die Proben gewaschen, wobei unspezifische Hybridisierungssignale eliminiert werden. Abschließend werden die Fluoreszenzsignale des Präparats mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Jedes vorhandene Fluoreszenzsignal weist auf die Anwesenheit der der mit dem entsprechenden Fluoreszenzmarker versehenen Sonde entsprechenden Sequenz hin. Die Intensität der Fluoreszenz kann einen bedingten Rückschluss auf die Anzahl der Sequenzkopien in der biologischen Probe zulassen. Wird hingegen bei der Wellenlänge einer der eingesetzten fluoreszenzmarkierten Sonden kein Signal oder nur ein unterhalb eines definierten Schwellenwerts liegendes Signal erhalten, kann auf die Abwesenheit der zu der entsprechenden Sonde korrespondierenden Sequenz in der biologischen Probe geschlossen werden. Allerdings kann die Abwesenheit eines entsprechenden Fluoreszenzsignals auch darin begründet liegen, dass in der entsprechenden Bindungsstelle der nachzuweisenden Sequenz eine Mutation und/oder Mikrodeletion stattgefunden hat, weswegen die Sonde unter den gewählten Hybridisierungsbedingungen nicht mehr an die vorbestimmte Sequenz bindet. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt darin, dass eine unerwünschte und zu falschen Ergebnissen führende Kreuzhybridisierung niemals vollständig ausgeschlossen werden kann. Zudem ist dieses Verfahren vergleichsweise teuer, zum einen weil zwingend Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen, und zum anderen, weil es aufwändige Apparaturen, wie Fluoreszenzmikroskope, benötigt. Schließlich hängt die Aussagekraft dieses Verfahrens in ganz erheblichem Maße von der Qualität der eingesetzten Sonden ab; zuverlässige Ergebnisse werden nur erhalten, wenn die Sonden mit einer Effizienz von mehr als 90% an die dazu korrespondierenden Bindungsstellen hybridisieren. Daraus folgt, dass eine falsche Wahl der Sonden, aber auch inadäquate Hybridisierungsbedingungen zu einem falschen Ergebnis führen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens liegt dann, dass eine Mindestmenge an biologischer Probe eingesetzt werden muss, um überhaupt ein auswertbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Zudem darf die Sequenz eine minimale Länge nicht unterschreiten. Weiterhin ist es für ein valides Ergebnis notwendig, eine Vielzahl von Zellen zu analysieren, die einer Hybridisierung zugänglich waren. Aus diesem Grund ist die FISH-Analyse für die Einzelzelldiagnostik nicht adäquat.
  • Ein anderes fluoreszenzbasierendes Verfahren ist die CGH-Analyse (comparative genomic hybridization). Bei diesem Verfahren wird die Nukleinsäure der zu analysierenden Probe komplett mit einem Farbstoff 1 mar kiert. Die gleiche Menge an Nukleinsäuren einer Referenzprobe wird mit einem Farbstoff 2 markiert. Beide Reaktionsansätze werden gemeinsam auf einem gespreiteten Metaphasechromosomensatz hybridisiert, wobei die in beiden Reaktionsansätzen enthaltenen Sequenzen um die Bindungsstellen an den gespreiteten Chromosomen kompetieren. Im Wesentlichen wird sich an allen Hybridisierungsstellen ein Verhältnis von Farbstoff 1 zu Farbstoff 2 wie 1:1 einstellen. Enthält die zu analysierende Probe amplifizierte Bereiche (mehr als die gewöhnliche Kopienzahl der Referenz), so wird der Farbstoff 1 an dieser Hybridisierungsstelle überwiegen. Im Falle einer Deletion in der zu untersuchenden Probe wird man nur den Farbstoff 2 an dieser Hybridisierungsstelle detektieren. Die Referenzmessung erlaubt eine relative Aussage über die Häufigkeit von Sequenzen in der zu analysierenden Probe.
  • Eine spezielle Variante ist die Array-CGH, in der nicht auf Chromosomen, sondern auf immobilisierte Sequenzen, deren physikalische Adresse im Genom bekannt ist, hybridisiert wird.
  • Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen ist die Real-Time-PCR-Methode, bei der eine PCR (polymerase chain reaction bzw. Polymerasekettenreaktion) mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt wird und die Zunahme des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zyklenzahl beobachtet wird. Der Schwellenwert-PCR-Zyklus (auch Threshold-Cycle) wird dem Reaktionszeitpunkt zugeordnet, bei dem sich das Fluoreszenzsignal signifikant von der Hintergrundfluoreszenz abhebt und die PCR-Produktbildung exponentiell verläuft. Dieser korreliert mit der Anfangskopienzahl der zu vermehrenden DNA-Sequenz. Auf diese Weise lassen sich DNA-Proben anhand des Vergleichs mit einer DNA-Verdünnungsreihe relativ quantifizieren. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Menge an Ausgangsma terial nicht beliebig verkleinert werden kann, da mit wenigen Startmolekülen, beispielsweise 10 bis 100 Kopien, als Ausgangsmaterial der stochastische Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird, was keine quantitative Aussagen mehr zulässt. Des weiteren erfordert auch dieses Verfahren aufwändige und teure Apparaturen zur Messung der Fluoreszenzintensität.
  • Ein neueres Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäuresequenz ist die QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), bei der in einem PCR-Ansatz parallel mehrere PCR's unter Einsatz unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Primer durchgeführt werden und die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte anschließend mit einem automatischen DNA-Scanner laserdensitometrisch analysiert werden. Auch bei diesem Verfahren handelt es sich um eine relative Quantifizierungsmethode, da ein Vergleich für zwei PCR-Produkte, die parallel in einem PCR-Versuch amplifiziert werden, gezogen wird. Um einen aussagenkräftigen quantitativen Vergleich zwischen zwei nebeneinander amplifizierten PCR-Produkten treffen zu können, müssen die beiden PCR-Teilreaktionen mit gleicher Effizienz ablaufen und die Fluoreszenzintensitäten der Reaktionsprodukte zum Zeitpunkt der exponentiellen Produktamplifikation quantitativ analysiert werden.
  • Ein auf der QF-PCR-Methodik basierendes Verfahren zur Feststellung möglicher numerischer Aberrationen der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in Fruchtwasserproben ist von Lucchini et al. in Wissenschaftliche Informationen, September 2004 beschrieben worden. Dieses Verfahren basiert auf der in-vitro-PCR-Amplifikation von repetitiven und polymorphen STR (short tandem repeats)-Sequenzen mit fluoreszenzmarkierten Primern. Nach Abschluss der PCR werden die amplifizierten PCR-Produkte mittels Kapillarelektrophorese quantifiziert. Werden bei diesen Verfahren chromo somenspezifische STR-Systeme eingesetzt, so lassen sich aus der Anzahl der erhalten unterschiedlichen PCR-Produkte Rückschlüsse auf die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms schließen. Werden beispielsweise bei der Reaktion mit einem chromosomspezifischen STR-System bei der Kapillarelektrophorese drei Peaks erhalten, wobei die Peakhöhen untereinander 1:1:1 betragen, so enthält das untersuchte Individuum drei verschiedene Allele des entsprechenden Chromosoms (triallelische Trisomie). Werden hingegen bei dem Verfahren zwei Peaks erhalten, wobei das Verhältnis der Peaks untereinander 2:1 beträgt, so weist das untersuchte Individuum pro Zelle zwei gleiche Allele des Chromosoms sowie ein anderes Allel des Chromosoms (diallelische Trisomie) auf. Im Falle, dass nur zwei Peaks mit identischer Peakhöhe erhalten werden, weist das Individuum zwei Allele auf, so dass keine Trisomie vorliegt (heterozygoter Fall). Allerdings lässt dieses Verfahren in dem Fall, dass lediglich ein Peak erhalten wird, keine Aussage über die An- oder Abwesenheit einer Trisomie zu, da dieses Ergebnis sowohl im Falle einer monoallelischen Trisomie als auch im Falle einer monoallelischen Disomie erhalten wird. Ein auf dieser Technologie beruhendes Verfahren zum Nachweis von Trisomie 13 wird auch in der DE 101 02 687 A1 offenbart. Um auch zwischen einer monoallelischen Disomie und einer monoallelischen Trisomie unterscheiden zu können, wird bei diesem Verfahren vorgeschlagen, mit der PCR drei verschiedene, für das Chromosom 13 spezifische STR-DNA-Bereiche zu amplifizieren. Allerdings weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt werden müssen. Zudem erfordert auch dieses den Einsatz einer Mindestmenge an DNA, da andernfalls der stochastische Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird und keine quantitative Aussage mehr möglich ist. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt schließlich darin, dass dieses nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit funktioniert, da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Ver hältnis des Ausgangsmaterials sind. Des weiteren weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass die absolute Fluoreszenzintensität bestimmt werden muss.
  • In der WO 2004/027089 wird ein Verfahren zur Amplifikation genetischer Informationen aus genetischem Material umfassend mehrere voneinander abgrenzbare Teilmengen genetischen Materials mittels PCR und zur Bestimmung der Kopienzahl verschiedener Chromosomen pro Zelle offenbart, wobei in der PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern für jedes zu bestimmende Chromosom spezifische Zielsequenzen mit vorbestimmter Länge amplifiziert werden. Um eine Aussage über die Kopienzahl der zu detektierenden Chromosomen zu erhalten, wird die Fluoreszenzintensität der für die jeweiligen Chromosomen erhaltenen PCR-Produkte bestimmt und werden die für die Zielsequenzen jedes Chromosom erhaltenen Intensitäten miteinander verglichen. Wenn bspw. die mit den für das Chromosom 21 spezifischen PCR-Produkten erhaltene Intensität gleich oder zumindest annähernd gleich wie die mit den für das Chromosom 1 spezifischen PCR-Produkten erhaltene Intensität ist, wird die Aussage getroffen, dass die beiden vorgenannten Chromosomen in der biologischen Probe in gleicher Kopienzahl vorliegen. Auch dieses Verfahren setzt daher zwingend den Einsatz fluoreszenzmarkierter Primer voraus und benötigt zur Auswertung die quantitative Erfassung der Fluoreszenzintensitäten der einzelnen erhaltenen Amplifikationsprodukte. Auch dieses Verfahren funktioniert daher nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit, da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Verhältnis des Ausgangsmaterials sind.
  • Mit keinem der oben genannten Verfahren ist es möglich, die exakte absolute Kopienzahl einer bspw. in 10 Kopien oder weniger in einer biologischen Probe vorliegenden vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homolo ger Sequenzen, bspw. die absolute exakte absolute Kopienzahl von Allelen pro Zelle, zu bestimmen. Abgesehen davon müssen in diesen Verfahren zwingend fluoreszenzmarkierter Primer bzw. Sonden eingesetzt werden, weswegen zur Auswertung teure Apparaturen notwendig sind.
  • In der Stand der Technik nach § 3 (2) PatG bildenden DE 10 2004 036 285 A1 wird ein Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit einer vorbestimmten Sequenz offenbart, bei dem eine oder mehrere Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden, mit denen mehrere unterschiedliche Abschnitte der Sequenz(en) amplifiziert werden können, anschließend nachgewiesen wird, ob bestimmte unterschiedliche Abschnitte der Sequenz(en) der Probe amplifiziert wurden und schließlich die Häufigkeit der Sequenzen) in der Probe anhand der Häufigkeit des Vorhandensein bzw. Nicht-Vorhandenseins der bestimmten unterschiedlichen Abschnitte in dem Amplifikat bestimmt wird.
  • Aus der WO 01/48242 A2 ist ein Verfahren zum Detektieren von Polynukleotiden in einer Probe bekannt, welches die Schritte i) Bereitstellen eines Arrays von Oligonukleotidprimern, wobei jeder Array eine oder mehrere Gruppen an auf diskreten Flächen eines Festphasenträgers immobilisierten Oligonukleotidprimern enthält, ii) Kontaktieren des Arrays mit einer Reaktionsmischung enthaltend eine Probe, iii) Durchführen einer Amplifikationsreaktion für wenigstens zwei Zyklen sowie iv) Detektieren der Anwesenheit und der Menge der synthetisierten Polynukleotide, welche auf den diskreten Flächen des Festphasenträgers über die entsprechenden, immobilisierten Primer hybridisiert sind, umfasst.
  • In der WO 2004/04425 A2 und der US 6,180,349 B1 werden, die Bestimmung der Fluoreszenz von fluoreszenzmarkierten Amplifikationsprodukten umfassende Verfahren zum Abschätzen bzw. Bestimmen der Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen basierend auf statistischer Auswertung beschrieben.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und von dazu homologen Sequenzen, beispielsweise die Anzahl von Allelen in einer Zelle, bereitzustellen, welches einfach und kostengünstig durchführbar ist und welches auch bei einer geringen Anzahl an in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen vorbestimmten Sequenzen, beispielsweise 10 oder weniger, zuverlässige Ergebnisse liefert.
  • Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Anzahl an Kopien von Allelen pro Zelle, gelöst, welches die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Bereitstellen einer definierten Menge einer biologischen Probe,
    • b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren,
    • c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte sowie
    • d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde/wird, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde/wird.
  • Unter homologen Sequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen verstanden, welche unter gleichen Amplifikationsbedingungen mit einem Primerpaar aus einer Probe amplifizierbar sind, wohingegen nicht homologe Sequenzen solche sind, welche unter gleichen Amplifikationsbedingungen mit einem Primerpaar aus einer Probe nicht amplifizierbar sind.
  • Im Unterschied zu den Verfahren nach dem Stand der Technik wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht, wie beispielsweise bei der quantitativen PCR, QF-PCR, FISH und CGH, die absolute Fluoreszenzintensität von PCR-Produkten bestimmt sowie wie im Falle der FISH und CGH mit der Fluoreszenzintensität einer Kontroll- bzw. Referenzprobe verglichen, sondern lediglich die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt und diese Anzahl mit einer Häufigkeitsverteilung verglichen. Insofern müssen in dem erfindungsgemäßen Verfahren keine flu oreszenzmarkierten Primer eingesetzt werden. Sofern diese zur Detektion der Anzahl an erhaltenen verschiedenen PCR-Produkten dennoch eingesetzt werden, muss nicht aufwendig die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten bestimmt werden, sondern lediglich evaluiert werden, ob eine ggf. über einem definierten Schwellenwert liegende Fluoreszenz bei einer den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen entsprechenden Wellenlänge vorhanden ist oder nicht. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ohne kostenaufwändige Apparaturen zur quantitativen Detektion von Fluoreszenz einfach und kostengünstig durchzuführen.
  • Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf dem Vergleich der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten mit einer anhand von wenigstens zwei Referenzproben mit einer bekannten, voneinander verschiedenen Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz erhaltenen Häufigkeitsverteilung, wobei die wenigstens zwei Referenzproben für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung in der gleichen wie in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten Menge, getrennt voneinander unter exakt den gleichen Bedingungen wie in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens einer Amplifikationsreaktion unterworfen wurden und die Anzahl der mit jeder Amplifikationsreaktion erhaltenen verschiedenen Amplifikationsprodukte bestimmt wurde. Erfindungsgemäß wird eine Häufigkeitsverteilung verwendet, für deren Aufnahme die für jede der wenigstens zwei Referenzproben durchgeführte Amplifikationsreaktion mehrfach, bspw. zehn- oder hundertfach, durchgeführt wird. Da in den Amplifikationsreaktionen für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung Ausgangsmaterial mit einer bekannten Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz eingesetzt wird, kann aus diesem Vergleich zuverlässig auf die Anzahl der Ko pien der vorbestimmten Sequenz in der zu untersuchenden biologischen Probe geschlossen werden.
  • Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass es weitgehend von den Amplifikationsbedingungen und der Menge an Ausgangsmaterial der biologischen Probe unabhängig ist. Selbst wenn – bspw. im Falle einer PCR als Amplifikationsreaktion – aufgrund unzureichender Amplifikationsbedingungen, wie beispielsweise einer zu geringen Zyklenzahl in der PCR, oder bei Einsatz von ungenügend an die Primerbindungsstellen bindenden Primern, nur ein Bruchteil der mit der wenigstens einen Amplifikationsreaktion theoretisch erhältlichen PCR-Produkte erhalten wird, so verfälscht dies nicht das erhaltene Kopienzahlergebnis, weil dieselben Parameter auch bei der Aufnahme der wenigstens einen Häufigkeitsverteilung angewandt wurden. Deshalb kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch bei Einsatz geringster DNA-Ausgangsmengen kein das quantitative Ergebnis verfälschender stochastischer Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation auftreten, da derartige etwaige Effekte durch die Häufigkeitsverteilung nivelliert werden. Deshalb ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere auch für sehr kleine Mengen an Ausgangsmaterial geeignet.
  • Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe unabhängig von der Art der vorbestimmten Sequenz geeignet. Vorzugsweise handelt es sich bei der vorbestimmten Sequenz um eine Nukleinsäuresequenz, dennoch ist es grundsätzlich auch denkbar, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unterschiedliche Sequenzvarianten von Proteinen oder Peptiden nachzuweisen. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die vorbestimmte Sequenz ein Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt ist.
  • Auch bezüglich der Art der wenigstens einen Amplifikationsreaktion ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert, vielmehr können alle denkbaren Amplifikationsreaktionen, mit denen Sequenzvarianten nachgewiesen werden können, eingesetzt werden. Dennoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR durchzuführen, da eine PCR einfach und vergleichsweise schnell und mit geringem technischen Aufwand durchzuführen ist und durch die Auswahl geeigneter Primerpaare beliebige Nukleinsäuresequenzen aus der biologischen Probe amplifiziert werden können.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b), welche daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, ein derart geringe Menge an biologischem Ausgangsmaterial eingesetzt, welche bei Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropout" führt. Unter einem "allelic dropout" versteht der Fachmann den Verlust eines allelischen DNA-Fragmentes nach einer PCR-Amplifikation, verursacht durch zu geringe Mengen an DNA-Ausgangsmaterial. In einem heterogenen DNA-Gemisch, wie beispielsweise einer Probe chromosomaler DNA, sind bestimmte Allele unterschiedlich häufig vertreten. Da die PCR exponentiell amplifiziert, kann diese Ungleichverteilung so sehr verstärkt werden, dass das geringer konzentrierte Allel im Verhältnis zu dem höher konzentrierten Allel so gering vertreten ist, dass es nicht mehr detektiert werden kann. Um einen "allelic dropout" zu vermeiden, wird z. B. bei forensischen Untersuchungen immer eine gewisse, im Nanogrammbereich liegende Ausgangsmenge an DNA-Material eingesetzt, um überhaupt zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Im Unterschied dazu ist es bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie nachstehend näher begründet, sogar vorteilhaft, unterhalb einer solchen Mindestmenge an Ausgangsmaterial zu arbeiten.
  • Besonders gute Ergebnisse werden bei dieser Ausführungsform erhalten, wenn in die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine biologische Probe eingesetzt wird, welche weniger als 100 pg DNA, beispielsweise chromosomale DNA, enthält. Insbesondere bevorzugt werden in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als 10 pg DNA und ganz besonders bevorzugt weniger als 5 pg DNA als Ausgangsmaterial eingesetzt, wobei grundsätzlich gilt, dass je weniger Basenpaare die Nukleinsäure in der biologischen Probe enthält, desto weniger DNA eingesetzt werden kann und sollte. Umgerechnet in Zellen entsprechen die vorgenannten DNA-Mengen dem Einsatz von weniger als 100 Zellen, bevorzugt weniger als 10 Zellen und besonders bevorzugt weniger als 5 Zellen in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion. Insbesondere auch bei Einsatz einer einzelnen Zelle als biologisches Ausgangsmaterial werden gute Ergebnisse erhalten.
  • Im Unterschied zu den beispielsweise in der Forensik eingesetzten Verfahren basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf einem statistischen Ansatz, bei dem es gar nicht erwünscht ist, dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen tatsächlich amplifiziert wird. Vielmehr soll gerade durch die Einstellung der Parameter der Amplifikationsreaktion, nämlich den Einsatz einer sehr geringen DNA-Menge als Ausgangsmaterial sowie gegebenenfalls einer entsprechend kleinen Zyklenzahl und/oder sehr stringenten Hybridisierungsbedingungen der eingesetzten Primer zu den Primerbindungsstellen, erreicht werden, dass nur ein bestimmter Prozentsatz der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen tatsächlich amplifiziert wird. Indem die Häufigkeitsverteilung durch mehrmaliges Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter denselben Amplifikationsbedingungen für wenigstens zwei Referenzproben mit bekannter Kopienzahl durchgeführt wird, wird eine statistische Verteilung erhalten, aus der man zuverlässig auf die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der zu untersuchenden biologischen Probe schließen kann. Dieser statistische Ansatz wird nachfolgend am Beispiel einer PCR näher erläutert.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren soll beispielsweise bestimmt werden, ob ein bestimmtes Chromosom, beispielsweise Chromosom 21, in einer Zelle in einer Kopienzahl von 0, 1 oder größer gleich 2 vorliegt. Hierzu wird unter Einsatz von drei verschiedenen Referenzproben eine Häufigkeitsverteilung aufgenommen, wobei als erste Referenzprobe eine Zelle eingesetzt wird, welche keine Kopie des Chromosoms 21 enthält, hingegen als zweite Referenzprobe eine Zelle, die eine Kopie des Chromosoms 21 enthält und als dritte Referenzprobe eine Zelle, die zwei gleiche Kopien des Chromosoms 21 enthält. Jede der Referenzproben wird jeweils mit denselben Primerpaaren und unter den gleichen PCR-Bedingungen einer PCR unterworfen, wobei in jeder der PCR's acht verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, wobei die acht Primerpaare dazu angepasst sind, jeweils eine unterschiedliche spezifische Sequenz aus dem Chromosom 21 zu amplifizieren. Alle PCR's werden jeweils unter exakt den gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei für jede der drei Referenzproben jeweils 100 Experimente durchgeführt werden. Nach jeder PCR wird die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt, wobei beispielsweise die folgende Häufigkeitsverteilung erhalten wird: Tabelle 1 (Beispiel für eine Häufigkeitsverteilung gemäß einer ersten Ausführungsform)
    Kopienzahl der Referenzprobe Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte
    0 1 2 3 4 5 6 7 8
    n = 0 98 2 0 0 0 0 0 0 0
    n = 1 2 13 24 57 3 1 0 0 0
    n = 2 0 0 0 0 3 40 35 20 2
    • n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe
  • Da in den einzelnen PCR's jeweils acht verschiedene Primerpaare eingesetzt wurden, welche daran angepasst sind, acht unterschiedliche spezifische Sequenzen aus dem Chromosom 21 zu amplifizieren, liegt die theoretisch mögliche Maximalzahl an erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten für den Fall n = 0, d. h. einer Zelle ohne Chromosom 21, bei 0, für den Fall n = 1, d. h. einer Zelle mit einem Chromosom 21, bei 8 und für den Fall n = 2, d. h. einer Zelle mit zwei gleichen Kopien (homozygoter Fall) des Chromosoms 21, ebenfalls bei 8. Im heterozygoten Fall läge die theoretisch mögliche Maximalzahl an Amplifikaten bei einer diploiden Zelle bei 16, wodurch mit dem System ein erheblicher Informationsgewinn erhalten wird. Da jedoch in diesem Gedankenbeispiel bei der Aufnahme der Häufigkeitsverteilungsaufnahme in jeder PCR lediglich eine Zelle eingesetzt wurde, also eine bei Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropout" führende Menge, werden einige der in den biologischen Referenzproben enthaltenden Allele nicht amplifiziert. Zudem wurde durch die Auswahl der Primersequenzen sowie der Zyklenzahl die Effizienz jeder einzelnen PCR auf einen Wert unterhalb der theoretisch erreichbaren Grenze von 1 eingestellt. Aus diesen Gründen wird in der in der Tabelle 1 wiedergegebe nen Häufigkeitsverteilung weder bei der Probe mit einer Kopie des Chromosoms 21 (n = 1) noch bei der Probe mit zwei Kopien des Chromosoms 21 (n = 2) die theoretisch maximal mögliche Anzahl an unterschiedlichen Amplifikaten erhalten. Vielmehr werden für den Fall n = 1, d. h. eine Referenzprobe mit einer Kopienzahl von 1, in 2 von der hundert durchgeführten PCR's gar kein Amplifikationsprodukt erhalten, in 13 von 100 PCR's nur 1 PCR-Produkt, in 24 von 100 PCR's 2 unterschiedliche PCR-Produkte, in 57 von 100 von PCR's 3 unterschiedliche PCR-Produkte, in 3 von 100 PCR's vier unterschiedliche PCR-Produkte und in 1 von 100 PCR's 5 unterschiedliche PCR-Produkte anstelle der theoretisch maximal 8 verschiedenen PCR-Produkten erhalten. Es ergibt sich somit für diesen Fall (n = 1) eine einer Gauss-Verteilung ähnliche Häufigkeitsverteilungskurve mit einem Maximalwert von 3 unterschiedlichen PCR-Produkten. Eine ähnliche Häufigkeitsverteilungskurve wird auch für den Fall erhalten, dass Referenzproben mit zwei Kopien des Chromosoms (n = 2) eingesetzt wurden, wobei das Maximum der Häufigkeitsverteilungskurve jedoch zu höheren Werten verschoben ist, nämlich von drei verschiedenen Amplifikaten für den Fall n = 1 auf 5 bis 6 verschiedene PCR-Produkte für den Fall n = 2. Für den dritten Fall, in dem eine Referenzprobe mit 0 Kopien des Chromosoms 21 eingesetzt wurde, werden in 98% der Fälle auch keine Amplifikate und nur in 2% der Fälle, ein Amplifikat erhalten. Da in dem letztgenannten Fall in den Proben kein Chromosom 21 enthalten war, muss es sich bei diesen 2%, in denen ein PCR-Produkt erhalten wurde, um Artefakte handeln.
  • Im Anschluss an die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung kann das erfindungsgemäße Verfahren nun mit einer biologischen Probe mit unbekannter Kopienzahl des Chromosoms 21 durchgeführt werden. Hierzu wird zunächst eine Zelle bereitgestellt, anschließend diese in eine PCR eingesetzt, welche unter exakt den gleichen Bedingungen durchgeführt wird wie die PCR's bei der Aufnahme der Häufigkeitsverteilung, bevor beispielsweise mit Kapillarelektrophorese die Anzahl der in der PCR mit der biologischen Probe erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt wird. Abschließend wird die ermittelte Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten mit der in Tabelle 1 wiedergegebenen Häufigkeitsverteilung verglichen.
  • Wird mit der zu untersuchenden Zelle in der PCR kein PCR-Produkt erhalten, so lässt sich aus der Häufigkeitsverteilung gemäß Tabelle 1 entnehmen, dass die Kopienzahl in der Probe mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 95% bei 0 liegt. Sofern in der PCR zwei oder drei verschiedene PCR-Produkte erhalten werden, liegt die Kopienzahl des Chromosoms 21 in der zu untersuchenden Probe mit der geforderten Sicherheit bei 1, wohingegen die Kopienzahl in dem Fall, dass 5 oder mehr PCR-Produkte erhalten werden, mit der geforderten Sicherheit zwei beträgt. Lediglich in dem Fall, dass in der PCR ein oder vier unterschiedliche PCR-Produkte erhalten werden, kann in diesem konkreten Gedankenbeispiel nicht mit der geforderten Konfidenz entschieden werden, wie viele Kopien an Chromosomen 21 in der Probe enthalten sind, sondern es lässt sich lediglich die Aussage treffen, dass im Falle von einem PCR-Produkt entweder 0 oder eine Kopie und im Falle von 4 unterschiedlichen PCR-Produkten ein oder zwei Kopien des Chromosoms 21 vorliegen. Möchte man auch diese Fälle mit der geforderten Sicherheit entscheiden können, so kann man durch Veränderung des PCR-Protokolls oder durch eine Erhöhung der Anzahl an unterschiedlichen PCR's die einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven voneinander trennen.
  • In der vorgenannten Ausführungsform besteht die Häufigkeitsverteilung aus mit drei Referenzproben mit definierter, sich voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz, in diesem Fall Chro mosom 21, erhaltenen Häufigkeitsverteilungskurven, wobei jede der drei Häufigkeitsverteilungskurven die Wahrscheinlichkeit für den Erhalt jeder zwischen 0 und der theoretisch möglichen Maximalzahl liegenden Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten für eine definierte Kopienzahl angibt. Wie der Fachmann erkennt, kann die Häufigkeitsverteilung auch nur zwei Häufigkeitsverteilungskurven umfassen, welche bspw. mit Referenzproben mit 0 und 1 Kopie der vorbestimmten Sequenz, erhalten wurde oder auch 4 Häufigkeitsverteilungskurven oder mehr. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn für die Bestimmung der Häufigkeitsverteilung 4 bis 20 und besonders bevorzugt 4 bis 10 Referenzproben mit bekannter, sich jeweils voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz eingesetzt werden.
  • Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform kann die Häufigkeitsverteilung auch aus der Angabe der Mittelwerte der mit den einzelnen Referenzproben bei der Mehrfachbestimmung erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten bestehen. Für den vorgenannten, in Bezug auf die Tabelle 1 geschilderten Fall wäre dies: Tabelle 2 (Beispiel für eine Häufigkeitsverteilung gemäß einer zweiten Ausführungsform)
    Kopienzahl der Referenzprobe Durchschnittswert der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte
    n = 0 0,02
    n = 1 2,49
    n = 2 5,78
    • n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe
  • Vorzugsweise wird bei der Häufigkeitsverteilung gemäß dieser Ausführungsform auch die Standardabweichung um den Mittelwert angegeben.
  • Da es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein statistisches Verfahren handelt, bei dem erwünscht ist, dass nicht alle der theoretisch möglichen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte tatsächlich erhalten werden, und die Auswertung durch Vergleich des mit der zu untersuchenden biologischen Probe erhaltenen Ergebnisses mit einer statistischen Häufigkeitsverteilung erfolgt, wird zum Aufnehmen der wenigstens einen Häufigkeitsverteilung gemäß Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens die wenigstens eine Amplifikationsreaktion pro Referenzprobe vorzugsweise 2 bis 1.000 mal, besonders bevorzugt 10 bis 250 mal, ganz besonders bevorzugt 50 bis 150 mal und höchst bevorzugt etwa 100 mal durchgeführt. Je höher die Anzahl der pro Referenzprobe der Häufigkeitsverteilung durchgeführten Amplifikationsreaktionen, desto höher die statistische Sicherheit, desto höher allerdings auch der experimentelle Aufwand. Bevorzugt wird daher für die Erstellung der in Schritt d) eingesetzten Häufigkeitsverteilung die wenigstens eine Amplifikationsreaktion pro Referenzprobe, welche eine bekannte Anzahl der vorbestimmten Sequenz aufweist, 50 bis 150 mal durchgeführt, da dies eine hohe statistische Sicherheit gewährleistet und andererseits der experimentelle Aufwand vergleichsweise gering ist.
  • Die Bestimmung der Häufigkeitsverteilung kann entweder vor der Durchführung der Verfahrensschritte a) bis c) erfolgen oder auch parallel dazu.
  • Wie dargelegt ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur dazu geeignet, die Anzahl einer vorbestimmten Sequenz, bspw. eines speziellen Gens oder Chromosoms, in einer biologischen Probe zu bestimmen, sondern insbesondere auch zur Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Se quenz sowie dazu homologer Sequenzen pro Zelle, wobei es sich bei den homologen Sequenzen vorzugsweise um Allele handelt. Bei der letztgenannten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) wenigstens eine allelspezifische Sequenz zu amplifizieren, worunter eine Sequenz verstanden wird, welche zwischen zwei Allelen zwar hochgradig ähnlich bzw. homolog, aber nicht identisch ist. Da in Schritt c) die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt wird und dadurch die Anzahl der unterschiedlichen Allele das Ergebnis beeinflussen, kann durch Vergleich mit der Häufigkeitsverteilung die Kopienzahl der einzelnen Allele bestimmt werden. Daher wird die wenigstens eine Amplifikationsreaktion in Schritt b) vorzugsweise derart ausgelegt, dass die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen aus dem nicht-kodierenden DNA-Bereich amplifiziert werden. Bekanntermaßen ist der nicht-kodierenden DNA-Bereich wesentlich polymorpher als der kodierende Bereich, so dass die Wahrscheinlichkeit dort allelspezifische Sequenzen zu amplifizieren groß ist.
  • In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu anzupassen, dass wenigstens zwei zueinander nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen amplifiziert werden.
  • Insbesondere in den Fällen, in denen die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, werden gute Ergebnisse erhalten. STR- bzw. short tandem repeat-Sequenzen sind hochpolymorphe Sequenzen, welche aus lediglich 2 bis 4 bp langen Wiederholungseinheiten bestehen und zwischen den einzelnen Individuen eine hohe Variabilität aufweisen. Im Unterschied dazu bestehen VNTR- bzw. variable lamber of tandem repeat Sequenzen aus etwa 15 bis 30 bp Länge aufgebauten repetitiven DNA-Abschnitten, deren Gesamtlänge durch die Anzahl der Wiederholungen dieser Grundeinheit bestimmt sind. Auch VNTR-Sequenzen sind in der Regel hochpolymorph, d. h. die Anzahl der jeweiligen Wiederholungseinheiten unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Individuen sehr stark. Bei SNP's (single nucleotide polymorphism) handelt es sich um die einfachsten Polymorphismen, bei denen sich die homologen Sequenzen nur durch eine Base unterscheiden. Auch diese eignen sich hervorragend für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Abgesehen davon sind jedoch auch alle anderen hochpolymorphen Sequenzen als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
  • Ferner ist es bevorzugt, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
  • Durch die Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen kann die Lage und in gewissem Umfang auch die Breite der einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven der Häufigkeitsverteilung eingestellt werden. Vorzugsweise ist die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst, zwischen 2 und 100 zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, wobei insbesondere bei Anpassung zur Amplifikation von 2 bis 20 zueinander nicht homologen Sequenzen, besonders bevorzugt 3 bis 15 zueinander nicht homologen Sequenzen und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander nicht homologen Sequenzen, besonders gute Ergebnisse erhalten werden. Liegt die Anzahl der zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen beispielsweise zwischen 5 und 8, lassen sich Häufigkeitsverteilungskurven erhalten, welche eine gute Unterscheidung einer Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz pro Zelle von 0, 1 oder größer gleich 2 erlauben, wohingegen die Anpassung an 8 bis 12 zueinander nicht homologen Sequenzen eine zuverlässige Aussage ermöglicht, ob die vorbestimmte Sequenz, beispielsweise ein bestimmtes Chromosom oder ein bestimmtes Gen, pro Zelle in einer Kopienzahl von 0, 1, 2 oder größer gleich 3 vorliegt.
  • In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Anzahl der zu bestimmenden Kopien der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe zwischen 0 und 100, bevorzugt zwischen 0 und 25, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10 und ganz besonders bevorzugt zwischen 0 und 5 zu wählen.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens nur eine PCR durchgeführt, wobei in der PCR eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren, welche dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren, eingesetzt wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass sowohl für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilungen) als auch das Durchführen der Amplifikationsreaktion in Schritt b) nur eine PCR notwendig ist, so dass das Verfahren schnell und ohne großen Pipettieraufwand durchgeführt werden kann. Ein Beispiel für eine geeignete Verfahrensführung ist eine Multiplex-PCR, wobei jedoch auch jede andere Amplifikationsreaktion, bei der die wenigstens zwei zueinander nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen gleichzeitig in einer Reaktion amplifiziert werden können, eingesetzt werden können.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für jede der wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen eine eigene PCR durchgeführt, so dass in jeder PCR nur ein Primerpaar eingesetzt wird. Zur Realisierung dieser Ausführungsform wird in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen einer biologischen Probe bereitgestellt, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge an biologischem Material enthält, bevor die Teilmengen in die einzelnen PCR's eingesetzt werden. Ein Vorteil dieser Verfahrensführung liegt darin, dass sich die einzelnen Amplifikationen nicht gegenseitig beeinflussen können. Bei dieser Ausführungsform kann es, insbesondere wenn nur geringe Mengen an biologischer Probe, bspw. nur eine Zelle, zur Verfügung steht, notwendig sein, die biologische Probe vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer unspezifischen PCR zu amplifizieren und das so erhaltene Reaktionsprodukt in die erforderliche Anzahl an Teilmengen zu unterteilen. Selbstverständlich müssen bei dieser Verfahrensführung die Referenzproben für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung gleichermaßen voramplifiziert und in Teilmengen portioniert werden.
  • Schließlich ist es gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass ein Teil der wenigstens zwei zueinander nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen in einer PCR und der andere Teil der wenigstens zwei zueinander nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen jeweils in davon getrennten PCR's, wobei bei diesen PCR's jeweils nur ein Primerpaar eingesetzt wird, zu amplifizieren. Es handelt sich mithin bei dieser Verfahrensführung um eine Mischform der zuvor genannten Verfahrensformen.
  • Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass in Schritt c) bei der Bestimmung der Anzahl der unterschiedlichen PCR-Produkte pro Amplifikationsansatz jeweils zwei Informationen pro Amplifikationsansatz berücksichtigt werden, nämlich zum einen die An- bzw. Abwesenheit des entsprechenden PCR-Produktes sowie zum anderen die Information über einen zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander unterscheidenden Parameter, bspw. die Länge oder Sequenz der PCR-Produkte, weswegen im Vergleich zu einem entsprechenden Verfahren, bei dem nur die An- und Abwesenheit der einzelnen erhaltenen PCR-Produkte berücksichtigt wird, eine überraschend scharfe Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Zur Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit der wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen kann jedes dem Fachmann zu diesem Zweck geeignete Verfahren eingesetzt werden, wobei lediglich beispielsweise Gelelektrophorese, herkömmliche Hybridisierungstechniken, beispielsweise Hybridisierungsverfahren auf einem DNA-Array, einem Bead-System, sowie andere optische, elektrische oder elektrochemische Messungen genannt sind. Dabei kann es in Abhängigkeit von dem eingesetzten Detektionsverfahren zweckmäßig sein, Schwellenwerte zu definieren, oberhalb derer die Anwesenheit eines PCR-Produktes und unterhalb derer die Abwesenheit eines PCR-Produktes angenommen wird. Die Art des zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander individualisierenden Parameters hängt im wesentlichen von der Art der wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen ab. Werden beispielsweise die PCR-Primer in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion so gewählt, dass STR-Abschnitte und/oder VNTR-Abschnitte als zueinander nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden, wird als zweiter Parameter bzw. Unterscheidungsmerkmal der einzelnen PCR-Produkte vorzugsweise die Länge der einzelnen PCR-Produkte gewählt, so dass die Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte gemäß Schritt c) die Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von PCR-Produkten sowie die Bestimmung der Länge der einzelnen PCR-Produkte umfasst, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht. Ein geeignetes Verfahren hierfür ist bspw. die Kapillarelektrophorese.
  • Werden hingegen bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion PCR-Primer eingesetzt, welche daran angepasst sind, wenigstens zwei zueinander nicht homologe SNP-Sequenzen zu amplifizieren, so ist das zweite Unterscheidungsmerkmal bzw. der zweite Parameter vorzugsweise die Bestimmung der sich unterscheidenden Sequenz, die bei SNP-Abschnitten üblicherweise auf ein Nukleotid beschränkt ist. Hierzu können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren herangezogen werden, wobei lediglich beispielsweise DNA-Sequenzierung oder bekannte Hybridisierungsverfahren genannt seien. Bei dieser Ausführungsform entspricht somit die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Sequenz.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz und dazu homologer Sequenzen in einer Zelle, welches die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Bereitstellen einer biologischen Probe, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und/oder zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst,
    • b) Durchführen wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht ho mologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und aus der aus STR-Abschnitten, VNTR-Abschnitten, SNP-Abschnitten und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren,
    • c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte sowie
    • d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR, wobei in der PCR die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde.
  • Da es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein statistisches Verfahren handelt, ist es vorteilhaft, die Ausgangsmenge und die PCR-Bedingungen, insbesondere hinsichtlich der Temperaturführung, Zyklenzahl und der Bindungsaffinität der Primer, derart einzustellen, dass die einzelnen parallel vorgenommenen PCR-Reaktionen mit einer relativen Häufigkeit für ein positives Ergebnis von größer 0, aber kleiner 1 ablaufen. Hierdurch wird sichergestellt, dass mit minimalem experimentellen Aufwand eine statistische Auswertung mit höchstmöglicher Sicherheit und Zuverlässigkeit des erhaltenen Ergebnisses erreicht wird. Daher ist es be vorzugt, die Bindungsaffinität der einzelnen PCR-Primer zu deren Primerbindungsstellen sowie die sonstigen Parameter der PCR, insbesondere die Zyklenzahl und Temperaturführung, derart einzustellen, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für jede der zu amplifizierenden, wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie ganz besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
  • Insbesondere wenn die Häufigkeitsverteilung vor den Schritten a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgenommen wurde, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) eine Amplifikationsreaktion unter den gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchzuführen, wobei die Kontrollprobe vorzugsweise zu einer bekannten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten führt. So kann auf einfache Weise festgestellt werden, ob die wenigstens eine Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) ordnungsgemäß abgelaufen ist, oder möglicherweise durch einen Defekt an dem Thermocycler, gar nicht oder nur unzureichend stattgefunden hat.
  • In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, als biologische Probe einen Polkörper, vorzugsweise einen Polkörper nach der ersten Reifeteilung, einzusetzen. Da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur quantitativen Bestimmung einer Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz und dazu homologer Sequenzen pro Zelle, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl von Allelen pro Zelle, von 0, 1 oder größer gleich 2 bzw. 0, 1, 2 oder größer gleich 3 geeignet ist, ist dieses hervorragend dazu geeignet, durch eine Polkörperanalyse auf das Genom der entsprechenden Eizelle, aus der der Polkörper entnommen wurde, rückzuschließen. Dies ist deshalb von großer Bedeutung in der pränatalen Diagnostik, weil damit etwaige Chromosomenabberationen schon vor der in-vitro-Befruchtung erkannt werden können, wohingegen mit anderen bekannten Verfahren, wie beispielsweise der Amniozentese, entsprechende Chromosomen-Fehlverteilungen erst zu einem viel späteren Zeitpunkt festgestellt werden können.
  • Während der Eizellreifung wird der Chromosomensatz der anfänglich diploiden Eizelle zu einem haploiden Chromosomensatz reduziert. Während bei der ersten Reifeteilung die homologen Chromosomen getrennt werden, wobei ein haploider Chromosomensatz in der Eizelle verbleibt und der andere in Form des Polkörpers ausgeschleust wird, erfolgt bei der zweiten Reifeteilung die Trennung der einzelnen Chromatiden der in der Eizelle verbliebenen Chromosomen, wobei ein Satz an Chromatiden in Form des zweiten Polkörpers aus der Eizelle ausgeschleust wird, während der andere Satz an Chromatiden in der Eizelle verbleibt. Die beiden während den beiden Reifeteilungen aus der Eizelle in den perivitellinen Spalt der Eizelle transferierten Polkörper entsprechen somit in ihrem genetischen Aufbau einer Zelle, haben jedoch nur einen minimalen Zytoplasmaanteil. Während der erste Polkörper während der Ovulation entsteht, wird der zweite Polkörper erst drei bis vier Stunden nach der Penetration des Spermiums in die Eizelle ausgeschleust. Da Polkörper keinerlei Funktion haben und in der frühen Embryonalentwicklung ohnehin resorbiert werden, ist die Entnahme eines Polkörpers aus der Eizelle zum einen ohne Schädigung der Eizelle und ohne Gefahr einer negativen Beeinflussung der weiteren Entwicklung möglich und zudem nach dem deutschen Embryonenschutzgesetz für den Polkörper nach der ersten Reifeteilung zulässig. Insgesamt bietet die Polkörperuntersuchung demnach die Möglichkeit, schon in einem sehr frühen Stadium, nämlich vor Befruchtung der Eizelle, mögliche Chromosomen-Fehlverteilungen in der Eizelle zu diagnostizieren.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, schnell, einfach und zuverlässig Chromosomenfehiverteilungen in einer Eizelle über die Untersuchung eines daraus entnommenen Polkörpers nach der ersten Reifeteilung zu diagnostizieren. Hierzu kann beispielsweise ein einzelner Polkörper einer PCR unterzogen werden, wobei die PCR als Multiplex-PCR ausgelegt ist, in der bspw. acht verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, welche daran angepasst sind, acht zueinander nicht homologe STR-Sequenzen, die auf dem zu untersuchenden Chromosom, beispielsweise dem Chromosom 21, enthalten sind, zu amplifizieren. Alternativ dazu ist es selbstverständlich auch möglich, die acht zueinander nicht homologen STR-Sequenzen jeweils einzeln in acht verschiedenen PCR's zu amplifizieren. Für die genetische Ausstattung der Eizelle hinsichtlich des Chromosoms 21 sind folgende Möglichkeiten gegeben:
    • 1) die Zelle enthält drei gleiche Allele (monoallelische Trisomie),
    • 2) die Zelle enthält zwei gleiche Allele und ein dazu verschiedenes Allel (biallelische Trisomie),
    • 3) die Zelle enthält drei unterschiedliche Allele (triallelische Trisomie),
    • 4) die Zelle enthält zwei gleiche Allele (monoallelische Disomie [gesunde homozygote Zelle]),
    • 5) die Zelle enthält zwei unterschiedliche Allele (biallelische Disomie [gesunde heterozygote Zelle]) oder
    • 6) die Zelle enthält kein Allel von Chromosom 21.
  • Erfindungsgemäß wird zunächst mit wenigstens zwei unterschiedlichen Referenzproben eine Häufigkeitsverteilung erstellt, wobei mit jeder Referenzprobe bspw. je 100 mal eine PCR mit den zur Amplifizierung von bspw. 8 zueinander nicht homologen STR-Sequenzen geeigneten Primerpaaren durchgeführt wird. Als Referenzproben können bspw. sechs ver schiedene Polkörper, welche jeweils eine der vorgenannten genetischen Ausstattungen aufweisen, eingesetzt werden. Soll nur zwischen einer monoallelischen Disomie und einer biallelischen Disomie unterschieden werden, reicht es selbstverständlich aus, nur zwei entsprechende Referenzproben zur Erzeugung der Häufigkeitsverteilung einzusetzen. Anschließend oder parallel zu der Aufnahme der Häufigkeitsverteilungskurven kann dann ein zu untersuchender Polkörper derselben Multiplex-PCR unterzogen werden und durch Vergleich der erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten mit der Häufigkeitsverteilung die Kopienzahl festgestellt werden.
  • Wie bereits angedeutet kann durch die Anpassung der Verfahrensbedingungen, beispielsweise die Anzahl der zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen und die Anzahl der PCR-Zyklen, die Auflösung der Häufigkeitsverteilung auf einen gewünschten Wert eingestellt werden, so dass Überlappungen der Häufigkeitsverteilungskurven in dem interessierenden Bereich vermieden werden können.
  • Dies sei am Beispiel des folgenden Gedankenexperiments erläutert. Es wird gleichermaßen wie vorstehend unter Bezugnahme auf die Tabelle 1 erläutert vorgegangen, ausgenommen, dass die PCR mit den Referenzproben und der zu untersuchenden biologischen Probe mit jeweils 12 anstelle von 8 für eine Amplifikation zueinander nicht homologer STR-Sequenzen geeigneten Primerpaaren durchgeführt wird. Es wird bspw. folgende Häufigkeitsverteilung erhalten: Tabelle 3 (Häufigkeitsverteilung mit 12 STR-Systemen und hoher Zyklenzahl)
    Kopienzahl der RP Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte
    0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    n = 0 95 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    n = 1 0 0 3 20 44 30 3 0 0 0 0 0 0
    n = 2 0 0 0 0 0 0 0 3 27 45 15 7 3
    • n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe
    • RP = Referenzprobe
  • Wie sich der Tabelle 3 entnehmen lässt, kann mit dieser Häufigkeitsverteilung für jedes für die zu untersuchende Probe erhaltene Ergebnis eindeutig die Anzahl an Sequenzkopien festgestellt werden. Durch die Erhöhung der Anzahl an zu amplifizierenden nicht homologen Sequenzen von 8 auf 12 wurde somit eine Aufspreizung der einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven erreicht unter Vermeidung einer partiellen Überlagerung der einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven, wie dies bei dem unter Bezugnahme auf Tabelle 1 geschilderten Gedankenexperiment für das Ergebnis ein oder vier unterschiedliche PCR-Produkte der Fall ist.
  • Ein weiterer wichtiger Parameter, der die Auflösung der Häufigkeitsverteilung beeinflusst, ist die bei der wenigstens einen PCR eingesetzte Zyklenzahl. Wird bspw. in dem vorgenannten unter Bezugnahme auf die Tabelle 3 dargelegten Gedankenversuch bei ansonsten gleichen Referenzproben und PCR-Bedingungen die Zyklenzahl der PCR von 30 auf 25 reduziert, wird bspw. die in der Tabelle 4 wiedergegebenen Häufigkeitsverteilung erhalten: Tabelle 4 (Häufigkeitsverteilung mit 12 STR-Systemen und niedriger Zyklenzahl)
    Kopienzahl der RP Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte
    0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    n = 0 98 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    n = 1 0 1 14 22 40 20 3 0 0 0 0 0 0
    n = 2 0 0 0 0 0 0 3 10 30 32 15 7 3
    • n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe
    • RP = Referenzprobe
  • Im Vergleich zu der in der Tabelle 3 wiedergegebenen Häufigkeitsverteilung liegen die einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven in der Tabelle 4 näher zueinander und überschneiden sich zumindest teilweise. So lässt dieses Gedankenexperiment nur in den Fällen eine klare Aussage über die Kopienzahl zu, in denen mit der zu untersuchenden Zelle 0 PCR-Produkte, 2 bis 5 verschiedene PCR-Produkte oder 7 oder mehr PCR-Produkte erhalten werden, wobei bei 0 PCR-Produkten die Kopienzahl an Chromosom 21 in der biologischen Probe mit der erforderlichen Sicherheit bei 0, bei 2 bis 5 verschiedenen PCR-Produkten die Kopienzahl bei 1 und bei 7 oder mehr verschiedenen PCR-Produkten die Kopienzahl bei 2 liegt. Hingegen ist, wenn für die zu untersuchende Probe 1 oder 6 verschiedene PCR-Produkte erhalten werden, keine klare Aussage möglich, wie viele Kopien an Chromosom 21 die Probe tatsächlich enthält.
  • Wie der Fachmann erkennt, lässt sich durch die Einstellung der PCR-Bedingungen und die Festlegung der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen zu amplifizierenden Sequenzen die Breite der Häufig keitsverteilungskurven und der Abstand der verschiedenen Häufigkeitsverteilungskurven zueinander nahezu beliebig einstellen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, welches zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Erfindungsgemäß umfasst dieses Kit:
    • a) wenigstens zwei Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren,
    • b) ggf. PCR-Puffer,
    • c) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR und
    • d) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll c) für die zu untersuchende biologische Probe vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in dem Protokoll c) vorgeschriebene Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Kits gemäß der vorliegenden Erfindung sind die wenigstens zwei Primerpaare daran angepasst, in der wenigstens einen PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifizieren. Insbesondere wenn die zueinander nicht homologen Sequenzen hochgradig polymorph sind, werden gute Ergebnisse erhalten. Besonders bevorzugt sind die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst, aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
  • In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, dass die wenigstens zwei Primerpaare und/oder das Protokoll derart angepasst sind, dass in der PCR 2 bis 100, besonders bevorzugt 2 bis 20, ganz besonders bevorzugt 3 bis 15 und höchst bevorzugt 5 bis 12 zueinander nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden.
  • Aus den bereits dargelegten Gründen ist es zudem bevorzugt, die wenigstens zwei Primerpaare und/oder das Protokoll daran anzupassen, dass die relative Häufigkeit der wenigstens einen PCR für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 und ganz besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
  • Zudem hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das Protokoll der PCR und/oder die wenigstens eine Häufigkeitsverteilung daran anzupassen, um zu bestimmen, ob die biologische Probe die vorbestimmte Sequenz in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 oder mindestens 2 o der in einer Kopienzelle pro Zelle von 0, 1, 2 oder mindestens 3 enthält.
  • Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung, umfassend
    • a) einen festen Träger, vorzugsweise einen Glasträger,
    • b) wenigstens zwei auf dem Träger immobilisierte Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, sowie
    • c) eine bspw. elektronisch gespeicherte Häufigkeitsverteilung, welche durch jeweils mehrmaliges Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukte erhalten wurde oder
    • d) wenigstens zwei auf dem Träger räumlich getrennt voneinander immobilisierte, Zelle(n) enthaltende Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen.
  • Vorzugsweise sind die Primerpaare und/oder die Referenzproben auf dem Träger über nicht-chemische Bindungen immobilisiert.
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines den Erfindungsgedanken erläuternden, diesen jedoch nicht einschränkenden Beispiels erläutert.
  • Beispiel
  • (Erstellung einer Häufigkeitsverteilung)
  • a) Durchführung der PCR-Reaktionen
  • Einzelne Lymphozyten eines Individuums wurden unter mikroskopischer Kontrolle als Referenzproben auf den einzelnen Amplifikationsankern eines AmpliGrid-Glasträgers, einem von der Firma Advalytix AG kommerziell vertriebenen Glasstreifens zur Durchführung paralleler automatisierter PCR-Reaktionen, abgelegt, wobei ein Amplifikationsanker z. B. eine derart vorbehandelte Teilfläche ist, dass sich eine Flüssigkeit bevorzugt darauf aufhält. Dabei wurden pro Amplifikationsanker 1 bis 6 Lymphozyten abgelegt, wobei zusätzlich auf einigen Ankern Negativkontrollen bestehend aus Systemflüssigkeit ohne Lymphozyten platziert wurde. Dabei wurden jeweils Mehrfachbestimmungen ausgeführt, wobei 21 Negativkontrollen ohne Lymphozyten, 27 Proben mit je einem Lymphozyten, 42 Proben mit je zwei Lymphozyten, 35 Proben mit je drei Lymphozyten, 31 Proben mit je vier Lymphozyten, 17 Proben mit je fünf Lymphozyten und 6 Proben mit je 2 Lymphozyten, also insgesamt 175 Proben, auf dem Glasträger verteilt wurden.
  • Anschließend wurde auf die einzelnen mit den Proben versehenen Amplifikationsanker aus einem PCR-Mastermix eine 1 μl Teilmenge der nachfolgenden Zusammensetzung pipettiert.
    Bestandteil Menge (μl)
    10x PCR-Puffer (QIAGEN) 0,1
    Hot Star Taq (QIAGEN) 0,096
    Mischung aus Primerpaaren (PowerPlex 16 PCR-Kit [Promega]) 0,1
    dNTP-Mischung (je 2,5 mM) 0,1
    Wasser (bidest.) 0,604
    Gesamtmenge 1
  • Danach wurden die einzelnen PCR-Tropfen mit je 5,2 μl Mineralöl (Covering Solution, Fa. Advalytix AG) überschichtet. Hierzu wurde das Mineralöl zunächst so pipettiert, dass es in Form eines Tropfens an der Pipettenspitze hing, bevor mit diesem Tropfen der PCR-Tropfen berührt wurde, bis dieser von dem Mineralöl gleichmäßig überdeckt war.
  • Daran anschließend wurde mit den einzelnen Proben eine PCR mit den nachfolgenden Temperaturprofil durchgeführt:
    Temperatur Zeit pro Zyklus Zyklenzahl
    95°C 15 Min.
    96°C 1 Min.
    94°C 30 Sek.
    60°C* 30 Sek. 10
    70°C* 45 Sek.
    90°C 30 Sek.
    60°C* 30 Sek. 20
    70°C 45 Sek.
    60°C 30 Min.
    20°C 5 Min.
    8°C ∞
    • * 0,5°C/Sek. ± 0,0°C/Sek.
    • ** 0,3°C/Sek. ± 0,0°C/Sek.
  • Nach der Amplifikation wurde das Gesamtvolumen der einzelnen Reaktionen jeweils mit 4 μl Wasser (bidest.) versetzt. Dabei vermengte sich das Wasser mit der wässrigen Phase der Probe. Die gesamten Reaktionsvolumina einschließlich des Mineralöls wurden dann in verschiedene Gefäße einer Mikrotiterplatte übertragen.
  • b) Bestimmung der Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten
  • Die einzelnen Reaktionsvolumina der Mikrotiterplatte wurden mit jeweils 19 μl Formamid + 1 μl ILS 600 (interner Fluoreszenzstandard, Fa. Applied Biosystems) kurz denaturiert und bei Standardbedingungen in einem Kapillarsequenzer ABI 3100 (Fa. Applied Biosystems) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Ergebnisse wurden in Form von Genotyperfiles gespeichert, wobei die Erkennung von relevanten Signalen und deren Zuordnung zum Standard automatisch durch die Genotyper Software (Fa. Applied Biosystems) erfolgte. Bekanntermaßen werden die Fluoreszenzsignale immer gegen einen Hintergrund von Fluoreszenz gemessen, wobei wie in jeder Messung das Signal-/Rausch-Verhältnis entscheidend ist. Dieses wird von der Software nicht angegeben. Als untere Grenze (Schwellenwert) eines relevanten Signals wurden in diesem Experiment 500 relative Lumineszenzeinheiten festgelegt.
  • Es wurden die automatisch erkannten Allele je Amplifikation für alle Systeme ausgezählt und die Anzahl positiver Reaktionen in Bezug zur Zellzahl gesetzt.
  • Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
    Lymphozytenzellen/Anker N Mean Standardabweichung
    0 21 0,048 0,22
    1 27 10,04 6,72
    2 42 14,00 7,07
    3 35 17,86 5,87
    4 31 19,48 5,63
    5 17 23,24 3,96
    6 2 25,50 0,71
    Gesamt 175 14,49 8,72
  • In der Tabelle bedeuten:
    • Lymphozytenzellen/Anker: die Anzahl der pro Amplifikationsanker abgelegten Zellen. Im Fall diploider Lymphozyten sind das je Zelle genau 2 Kopien einer homologen Sequenz. Diese beiden Kopien stehen für die PCR als Starttemplate zur Verfügung und können beide amplifiziert werden. Sind die beiden Kopien sequenzidentisch, so erfasst man bei der Kapillarelektrophorese genau einen Peak. Unterscheiden sich die beiden Kopien in ihrer Länge (heterozygoter Fall), so können zwei verschiedene Längen einer homologen Sequenz amplifiziert werden. Es entstehen daher zwei Peaks. Die hier analysierten Gruppen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 unterscheiden sich in der Anzahl der Startkopien also um jeweils 2 Kopien (1 Zelle: 2 Kopien, 2 Zellen: 4 Kopien etc.).
    • N: Anzahl der Einzelreaktionen, die mit einer definierten Zellzahl begonnen wurden. Da die Zellen zufällig abgelegt wurden, gibt es unterschiedliche Stichprobengrößen. Der Fall "6 Zellen" wurde nur zweimal vorgelegt, der Fall "5 Zellen" 17-mal usw. Die statistische Analyse berücksichtigt dies.
    • Mean: Mittelwert der Anzahl positiver Signale (Peaks, die softwaregestützt automatisch gefunden wurden), d. h. Mittelwert der Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten.
    • Standardabweichung: Standardabweichung von dem vorgenannten Mittelwert als M für die Streuung um den Mittelwert. Die nachfolgend beschriebene Varianzanalyse (ANOVA) benutzt diese drei Größen, um statistisch signifikante Unterschiede zu berechnen und die Aussage zu treffen, ob sich die Mittelwerte tatsächlich unterscheiden. Statistisch gesprochen möchte man die Hypothese prüfen, ob es sich z. B. bei den Stichproben "2 Zellen vorgelegt" und "4 Zellen vorgelegt" um verschiedene Grundgesamtheiten handelt.
  • Für den Fall "0 Kopien vorgelegt" gab es in 21 Experimenten einmal den Fall, dass ein Einzelpeak detektiert wurde. Dies ist ein falsch positives Ergebnis, das zustande kommt durch
    • a. eine Kontamination mit humaner DNA; allerdings erfasst der PowerPlex Kit bis zu 16 unterschiedliche Sequenzabschnitte in einer Reaktion. Eine Kontamination hätte also mit einer einzigen Sequenz (physikalisch z. B. einem Chromosom) stattgefunden, was sehr unwahrscheinlich ist, oder dadurch, dass
    • b. die Kapillarelektrophorese fälschlicherweise ein Signal angezeigt hat; dies kann ein Spannungspuls während der Elektrophorese sein oder eine Verunreinigung im Gel durch ein Fluoreszenzpartikel unbekannter Herkunft, dass als Peak interpretiert wird.
  • Jedenfalls ergibt sich deshalb für den Fall "0 Kopien vorgelegt" ein positiver Wert und eine positive Standardabweichung. Ohne ein falsch positives Signal wären Mittelwert und Standardabweichung 0.
  • Die Letzte Zeile "Gesamt" summiert die vorgenannten Werte auf.
  • c) Varianzanalyse über alle Daten
  • Mit den vorgenannten Daten wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Die Varianzanalyse beruht auf einem Vergleich der Varianzen (oder Standardabweichungen) innerhalb einer Gruppe (within groups) mit den Varianzen zwischen den Gruppen (between groups). Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
    Sum of Squares df Mean Square F Significance
    Between Groups 7638,212 6 1273,035 38,194 0,000
    Within Groups 5599,502 168 33,330
    Total 13237,714 174
  • Dabei bezeichnen:
    • Sum of Squares die Summen der Abweichungsquadrate,
    • Df die Anzahl Freiheitsgrade (degrees of freedom) und
    • Mean Square die mittleren Summen der quadratischen Abweichungen.
  • Der F-Wert schließlich setzt die Abweichungen innerhalb der Gruppen und zwischen den Gruppen ins Verhältnis (1273.035/33.33 = 38.194). Ob der Wert für eine bestimmte Anzahl von Freiheitsgraden einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen anzeigt, ist in einer Tabelle nachzuschlagen (z. B. J. Bortz: Statistik für Sozialwissenschaftler, Springer Verlag). In diesem Fall ist der Unterschied hochsignifikannt (P = 0.000).
  • Dieses Ergebnis zeigt, dass es hochsignifkante Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen von unterschiedlichen Zellzahlen gibt.
  • d) Scheffe Test
  • Um eine Aussage zu treffen, zwischen welchen Gruppen die Unterschiede wirklich bestehen, wurde mit den erhaltenen Ergebnissen ein Scheffe Test durchgeführt. Das Ergebnis des Tests nach Scheffe sagt aus, zwischen welchen Gruppen in paarweisen Vergleichen signifikante Unterschiede vorliegen. Dazu werden die mittleren Unterschiede zwischen zwei Gruppen (mean difference I-J) sowei deren Standardfehler (Std. Error) dargestellt. Es wurde eine Signifikanzgrenze von 0,05 gewählt.
  • Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
    (I) NOCELLS (J) NOCELLS Mean Difference (I-J) Std. Error Significance Gruppen Unterscheidbar?
    0 1 –9,99 1,68 ,000 ja
    2 –13,95 1,54 ,000 ja
    3 –17,81 1,59 ,000 ja
    4 –19,44 1,63 ,000 ja
    5 –23,19 1,88 ,000 ja
    6 –25,45 4,27 ,000 ja
    1 0 9,99 1,68 ,000 ja
    2 –3,96 1,42 ,264 nein
    3 –7,82 1,48 ,000 ja
    4 –9,45 1,52 ,000 ja
    5 –13,20 1,79 ,000 ja
    6 –15,46 4,23 ,043 nein
    2 0 13,95 1,54 ,000 ja
    1 3,96 1,42 ,264 nein
    3 –3,86 1,32 ,210 nein
    4 –5,48 1,37 ,016 ja
    5 –9,24 1,66 ,000 ja
    6 –11,50 4,18 ,277 nein
    3 0 17,81 1,59 ,000 ja
    1 7,82 1,48 ,000 ja
    2 3,86 1,32 ,210 nein
    4 –1,63 1,42 ,971 nein
    5 –5,38 1,71 ,135 nein
    6 –7,64 4,20 ,767 nein
    4 0 19,44 1,63 ,000 ja
    1 9,45 1,52 ,000 ja
    2 5,48 1,37 ,016 ja
    3 1,63 1,42 ,971 nein
    5 –3,75 1,74 ,592 nein
    6 –6,02 4,21 ,915 nein
    5 0 23,19 1,88 ,000 ja
    1 13,20 1,79 ,000 ja
    2 9,24 1,66 ,000 ja
    3 5,38 1,71 ,135 nein
    4 3,75 1,74 ,592 nein
    6 –2,26 4,32 1,000 nein
    6 0 25,45 4,27 ,000 ja
    1 15,46 4,23 ,043 ja
    2 11,50 4,18 ,277 nein
    3 7,64 4,20 ,767 nein
    4 6,02 4,21 ,915 nein
    5 2,26 4,32 1,000 nein
    • * The mean difference is significant at the .05 level.
  • Die Tabelle ist wie folgt zu interpretieren:
  • Diejenigen Gruppen, zwischen denen die "significance" weniger als 0,05 beträgt, sind voneinander signifkant verschieden, wohingegen bei den anderen Gruppen keine Unterscheidung auf dem gewählten Signifikanzniveau möglich ist.
  • Beispielsweise ist die Gruppe "0 Zellen" ist von allen anderen signifikant verschieden (erster Block). Eine qualitative Entscheidung ist also möglich (0 Kopien gegen alle anderen Fälle).
  • Die Gruppe "1 Zelle" unterscheidet sich von den Gruppen "0 Zellen", "3 Zellen", "4 Zellen", "5 Zellen" und "6 Zellen". Eine Unterscheidung 1 Zelle/2 Zellen ist so hingegen nicht möglich, da die "significance" zwischen diesen Gruppen 0,264 beträgt.
  • Durch Änderung der PCR-Bedingungen, insbesondere Zyklenzahl, und können die einzelnen Gruppen den Anforderungen entsprechend so voneinander getrennt werden, dass diese voneinander signifikant verschiedenen sind.

Claims (39)

  1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer definierten Menge einer biologischen Probe, b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte sowie d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde/wird, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde/wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Sequenz eine Nukleinsäuresequenz, bevorzugt ein Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt, ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR-Reaktion ist.
  4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine bei der Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropout" führende Menge an biologischer Probe bereitgestellt wird.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte biologische Probe weniger als 100 pg DNA, bevorzugt weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als 10 pg DNA und ganz besonders bevorzugt weniger als 5 pg DNA umfasst.
  6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) eingesetzte biologische Probe weniger als 100 Zellen, bevorzugt weniger als 10 Zellen, besonders bevorzugt weniger als 5 Zellen und ganz besonders bevorzugt 1 Zelle umfasst.
  7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Häufigkeitsverteilung aus mit wenigstens zwei Referenzproben mit definierter, sich voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz erhaltenen Häufigkeitsverteilungskurven besteht, wobei jede der Häufigkeitsverteilungskurven die Wahrscheinlichkeit für den Erhalt jeder zwischen 0 und der theoretisch möglichen Maxi malzahl liegenden Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten für eine definierte Kopienzahl angibt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Häufigkeitsverteilung aus der Angabe der Mittelwerte der mit den einzelnen Referenzproben mit definierter, sich voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz bei der Mehrfachbestimmung erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten und Angabe der Standardabweichung besteht.
  9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Häufigkeitsverteilung wenigstens 3, bevorzugt wenigstens 4, besonders bevorzugt 4 bis 20 und ganz besonders bevorzugt 4 bis 10 Referenzproben mit bekannter, sich jeweils voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz eingesetzt werden.
  10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Erstellung der in Schritt d) eingesetzten Häufigkeitsverteilung die wenigstens eine Amplifikationsreaktion 2 bis 1.000 mal, bevorzugt 10 bis 250 mal, besonders bevorzugt 50 bis 150 mal und ganz besonders bevorzugt etwa 100 mal für jede Referenzprobe durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Häufigkeitsverteilung parallel zu der Durchführung der Schritte a) und c) erfolgt oder bereits vor Schritt a) durchgeführt wurde.
  12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange passt ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifizieren.
  13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen zu amplifizieren.
  14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
  16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, zwischen 2 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20, besonders bevorzugt zwischen 3 und 15 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
  17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der zu bestimmenden Kopien der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe zwischen 0 und 100, bevorzugt zwi schen 0 und 25, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10 und ganz besonders bevorzugt zwischen 0 und 5 beträgt.
  18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Art und Durchführung der Amplifikationsreaktion sowie die Menge an eingesetzter biologischer Probe daran angepasst sind, zu bestimmen, ob die biologische Probe die vorbestimmte Sequenz in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 oder mindestens 2 oder in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1, 2 oder mindestens 3 enthält.
  19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine PCR durchgeführt wird, in der eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren, welche dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren, eingesetzt wird.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen einer biologischen Probe bereitgestellt wird, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge biologisches Material enthält, und in Schritt b) mit jeder der Teilmengen eine PCR, in der jeweils ein Primerpaar eingesetzt wird, durchgeführt wird, wobei die in den verschiedenen PCR's eingesetzten Primerpaare dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) wenigstens zwei, aber eine geringere als die der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen einer biologischen Probe bereitgestellt wird, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge biologisches Material enthält, und in Schritt b) mit jeder der Teilmengen eine PCR, in der jeweils wenigstens ein Primerpaar, aber eine geringere als die der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren eingesetzt wird, wobei die in den verschiedenen PCR's eingesetzten Primerpaare dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren.
  22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe vor Durchführung des Verfahrensschritts a) mit einer unspezifischen PCR amplifiziert wird.
  23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die An- bzw. Abwesenheit von Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese, mittels einer Hybridisierungstechnik auf einem DNA-Array, einem Bead-System oder einer anderen optischen, elektrischen oder elektrochemischen Messung erfolgt.
  24. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte nach der Amplifikationsreaktion die An- bzw. Abwesenheit der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen sowie von den erhaltenen Amplifikationsprodukten ein zweiter physikalisch und/oder chemisch messbarer Parameter bestimmt wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen STR-Abschnitte und/oder VNTR-Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Länge der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Amplifikationsprodukte mit Kapillarelektrophorese bestimmt wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen SNP-Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Sequenz der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Sequenz entspricht.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz der Amplifikationsprodukte durch DNA-Sequenzierung oder ein Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.
  29. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz und dazu homologer Sequenzen in einer Zelle, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer biologischen Probe, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und/oder zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst, b) Durchführen wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und aus der aus STR-Abschnitten, VNTR-Abschnitten, SNP-Abschnitten und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte sowie d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR, wobei in den PCR's die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukte erhalten wurde.
  30. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter in der PCR in Schritt b) derart gewählt werden, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen jeweils zumindest im Wesentlichen gleich ist.
  31. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter in der PCR in Schritt b) derart gewählt werden, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
  32. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) eine Amplifikationsreaktion unter gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchgeführt wird.
  33. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe ein Polkörper, bevorzugt ein Polkörper nach der ersten Reifeteilung, eingesetzt wird.
  34. Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 32, umfassend: a) wenigstens zwei Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, b) PCR-Puffer, c) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR und d) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll c) für die zu untersuchende biologische Probe vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in dem Protokoll c) vorgeschriebene Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde.
  35. Kit nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst sind, in der wenigstens einen PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich, bevorzugt hochpolymorphe zueinander nicht homologe Sequenzen, welche besonders bevorzugt aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren.
  36. Kit nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare gemäß a) und/oder das Protokoll gemäß c) daran angepasst ist, in der wenigstens einen PCR zwischen 2 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20, besonders bevorzugt zwischen 3 und 15 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
  37. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare gemäß a) und/oder das Protokoll gemäß c) daran angepasst ist, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen PCR für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
  38. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Häufigkeitsverteilung gemäß d) und/oder das Protokoll der PCR gemäß c) daran angepasst sind, zu bestimmen, ob die biologische Probe die vorbestimmte Sequenz in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 oder mindestens 2 oder in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1, 2 oder mindestens 3 enthält.
  39. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz geeignet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 32, umfassend a) einen festen Träger, vorzugsweise einen Glasträger, b) wenigstens zwei auf dem Träger immobilisierte Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, sowie c) eine gespeicherte Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukte erhalten wurde oder d) wenigstens zwei auf dem Träger räumlich getrennt voneinander immobilisierte, Zelle(n) enthaltende Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen.
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