ES2928184T3 - Inmuno-PCR integrado y análisis de ácidos nucleicos en un cartucho de reacción automatizado - Google Patents

Inmuno-PCR integrado y análisis de ácidos nucleicos en un cartucho de reacción automatizado Download PDF

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Abstract

En diversas realizaciones se proporcionan métodos para detectar y/o cuantificar un analito diana usando inmuno-PCR y, opcionalmente, amplificación de ácidos nucleicos. En determinadas realizaciones, los métodos utilizan un cartucho para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana y, opcionalmente, detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, donde el cartucho comprende una cámara receptora de muestras; una cámara que comprende un material de matriz que actúa como filtro y/o agente de unión al ADN; un canal o cámara de temperatura controlada; y una pluralidad de cámaras que contienen reactivos y/o tampones para realizar inmuno-PCR, donde la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de captura que se une al analito que se va a detectar; la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de detección donde dicho anticuerpo de detección está opcionalmente unido directa o indirectamente a una señal de ADN; la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una mezcla maestra de PCR; la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene cebadores para amplificar todo o una región de dicho ADN señal; y la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una sonda para detectar todo o una región de dicho ADN señal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inmuno-PCR integrado y análisis de ácidos nucleicos en un cartucho de reacción automatizado
Antecedentes
El desarrollo de una prueba diagnóstica confiable, sensible, específica y rápida es un gran desafío para determinar el tratamiento efectivo de enfermedades infecciosas y otras patologías. La PCR se ha convertido en uno de los métodos más populares para la detección directa de ácidos nucleicos de un agente infeccioso o característico de otra patología (por ejemplo, un cáncer). La muy alta sensibilidad de la PCR, que es capaz de detectar una sola molécula de ADN, la convierte en una excelente opción para fines de diagnóstico. Sin embargo, en algunos casos, la proteína diana se expresa en un mayor número de copias que el ácido nucleico.
Los inmunoensayos se han utilizado para la cuantificación de proteínas desde 1960 (véase, por ejemplo, Lequin (2005) Clin. Chem. 51: 2415-2418; Brechot et al. (1985) N. Engl. J. Med. 312: 270-276; y similares) y se han convertido en una herramienta versátil y poderosa para los métodos de diagnóstico. Los inmunoensayos permiten un método de diagnóstico para detectar directamente proteínas diana (por ejemplo, las proteínas de patógenos) y otros analitos, y también para detectar indirectamente anticuerpos producidos contra microorganismos u otros inmunógenos. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es una técnica comúnmente utilizada para detectar anticuerpos o antígenos en muestras mediante la reacción de anticuerpos a sus antígenos (Lequin (2005) Clin. Chem. 51: 2415­ 2418). ELISA combina la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de los ensayos enzimáticos simples y los anticuerpos se acoplan a una enzima fácilmente analizable. A pesar de su eficacia y su especificidad, ELISA es incapaz de detectar algunos antígenos, especialmente cuando están presentes en bajas concentraciones, como puede ser el caso, por ejemplo, de los antígenos del virus de la hepatitis B (VHB) (Brechot et al. (1985) N. Engl. J. Med. 312: 270­ 276), que parece utilizar el bajo nivel de transcripción de sus genes como mecanismo de persistencia en el huésped.
La inmuno-PCR (I-PCR) combina la versatilidad de ELISA con el poder de amplificación exponencial y la sensibilidad de la PCR, lo que conduce a un aumento de la sensibilidad en comparación con un ELISA análogo. La inmuno-PCR es básicamente similar a ELISA (Fig. 1a), que detecta una reacción antígeno-anticuerpo, pero en lugar de usar un anticuerpo conjugado con enzima, el anticuerpo se marca con un fragmento de ADN, que puede amplificarse mediante PCR.
Usando inmuno-PCR, se ha obtenido rutinariamente una mejora de 100-10,000 veces sobre el límite de detección de ELISA (Brechot et al. (1985) N. Engl. J. Med. 312: 270-276). A pesar de esta ganancia de sensibilidad, durante mucho tiempo el número de estudios de inmuno-PCR fue bajo y la mayoría de las aplicaciones se basaron en preguntas de investigación con protocolos exigentes. El requisito de experiencia experimental tanto en ELISA como en PCR, la complejidad de los protocolos y el alto grado de trabajo requerido ha limitado el uso de inmuno-PCR con fines de diagnóstico. El documento WO 2006/121997 A2 describe una bolsa independiente para realizar inmuno-PCR en un entorno cerrado. El documento JP 2012/255664 A describe inmuno-PCR en un entorno cerrado.
Resumen
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un cartucho como se define en la reivindicación 1. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación 7. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación 8. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un sistema como se define en la reivindicación 13. En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un kit como se define en la reivindicación 14. Otras características se definen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra un ensayo en sándwich directo (izquierda) y un ensayo en sándwich indirecto (derecha). La superficie puede ser, pero no se limita a, la superficie de una partícula, la superficie de una pared o piso de una cámara o canal, o una superficie de un material de la matriz (por ejemplo, un filtro).
La Figura 2 ilustra un complejo inmune en sándwich directo con el anticuerpo de captura unido a una partícula.
La Figura 3 muestra algunos métodos de inmuno-PCR ilustrativos, pero no limitativos, implementados en un cartucho.
La Figura 4, paneles A-D, ilustra varios esquemas para acoplar un ADN señal a un anticuerpo. El panel A muestra un ácido nucleico señal conjugado químicamente con un anticuerpo de detección a través de un enlazador. El panel B muestra un ADN señal unida a un anticuerpo de detección a través de un enlace avidina/biotina. El panel C muestra un ADN señal unida a una partícula a la que también está unido un anticuerpo de detección. El panel D ilustra un anticuerpo de detección que se muestra en una fase con el ADN señal contenido dentro del fago. Se reconocerá que en un ensayo indirecto el anticuerpo de detección en cualquiera de estas realizaciones se puede reemplazar con un anticuerpo marcador que se une a un anticuerpo de detección.
La Figura 5A ilustra los componentes principales de un cartucho (por ejemplo, un cartucho GENEXPERT®) adecuado para su uso con los métodos descritos en este documento. La Figura 5b muestra una vista superior del cartucho que ilustra las cámaras dispuestas aproximadamente una válvula central.
La Figura 6A muestra una implementación ilustrativa, pero no limitativa, de un cartucho GENEXPERT® configurado para inmuno-PCR, mientras que la Figura 6B muestra una implementación ilustrativa, pero no limitativa, de un cartucho GENEXPERT® configurado para inmuno-PCR y análisis de ácidos nucleicos.
La Figura 7, paneles A-C, ilustra una realización de un cartucho GENEXPERT® adecuado para inmuno-PCR y análisis de ácido nucleico integrado opcional como se describe en este documento.
Las Figuras 8A-8C muestran realizaciones ilustrativas, pero no limitativas, de los módulos y sistemas (por ejemplo, unidades de procesamiento) para la detección y/o cuantificación mediante inmuno-PCR de un polipéptido o polipéptidos y análisis opcional integrado de ácidos nucleicos. La Fig. 8A ilustra un módulo para el funcionamiento de un cartucho GENEXPERT®. La Fig. 8B ilustra algunos componentes de una realización de un módulo para el funcionamiento de un cartucho para inmuno-PCR y, opcionalmente, análisis de ácidos nucleicos. La Figura 8C ilustra un sistema (por ejemplo, una unidad de procesamiento) que incorpora una pluralidad de módulos.
La Figura 9 ilustra un complejo inmune que comprende un anticuerpo de captura unido a una superficie (por ejemplo, la superficie de una perla) donde el anticuerpo de captura se ha unido a un antígeno (analito) que, a su vez, está unido por un anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección se une a un solo ADN a través de un enlazador y el anticuerpo de detección se une a FAM, que puede unirse mediante un conjugado de fosfatasa alcalina anti-FITC.
Las Figuras 10A y 10B muestran flujos de trabajo ilustrativos pero no limitativos para inmuno-PCR y análisis de ácido nucleico opcional. En determinadas realizaciones, cuando se realizan análisis de ácido nucleico e inmuno-PCR, ambos se realizan en la misma muestra. Por lo tanto, se puede introducir una sola muestra en una cámara de muestra (Fig. 10A). En otras realizaciones, la muestra se puede procesar de manera diferente para inmuno-PCR y análisis de ácidos nucleicos. En tales casos, la muestra de inmuno-PCR se puede introducir en una cámara de muestra y la muestra de análisis de ácido nucleico se puede introducir en otra cámara de muestra en el mismo cartucho (Fig. 10B). La preparación de ácido nucleico que se muestra es ilustrativa y no limitativa.
La Figura 11 es una representación esquemática de un ensayo de inmuno-PCR automatizado que usa el cartucho GeneXpert®, que se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 12 muestra las asignaciones de la cámara del cartucho (CH), los reactivos y los volúmenes iniciales para el ensayo de inmuno-PCR automatizado utilizando el cartucho GeneXpert® descrito en el Ejemplo 2.
La Figura 13 es una curva de respuesta a la dosis para la detección de IL-8 humana, como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 14 es una curva de respuesta a la dosis para la detección de C. difficile, como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 15A-15B es una curva de respuesta a la dosis para formatos de inmuno-PCR de la toxina B de C. difficile (A) manuales y (B) automatizados (véase, Ejemplo 2).
Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen una serie de términos y frases:
Como se usa en el presente documento, los términos "detectar", "que detecta" o "detección" pueden describir el acto general de descubrir o discernir o la observación específica de una composición marcada de forma detectable.
Como se usa en el presente documento, el término "detectablemente diferente" o "espectralmente distinguible" se refiere a un conjunto de marcadores (tales como colorantes/fluoróforos) que pueden detectarse y distinguirse simultáneamente.
Como se usa en este documento, los términos "paciente" y "sujeto" se usan típicamente de manera intercambiable para referirse a un ser humano. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse en muestras de animales no humanos, por ejemplo, un primate no humano, canino, equino, felino, porcino, bovino, lagomorfo y similares. Además, el término paciente puede usarse para animales no humanos en el contexto veterinario.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, el polipéptido tiene al menos 2 aminoácidos de longitud, o al menos 4 aminoácidos de longitud, o al menos 4 aminoácidos de longitud, o al menos 6 aminoácidos de longitud, o al menos 8 aminoácidos de longitud, o al menos 10 aminoácidos de longitud, o al menos 15 aminoácidos de longitud, o al menos 20 aminoácidos de longitud, o al menos 25 aminoácidos de longitud, o al menos 30 aminoácidos de longitud, o más. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales. El término también incluye variantes del enlace peptídico tradicional que une los aminoácidos que forman el polipéptido. Los "péptidos/polipéptidos/proteínas" preferidos son cadenas de aminoácidos cuyos carbonos a están unidos a través de enlaces peptídicos. Por lo tanto, el aminoácido terminal en un extremo de la cadena (terminal amino) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (terminal carboxilo) tiene un grupo carboxilo libre. Como se usa en el presente documento, el término "terminal amino" (terminal N en forma abreviada) se refiere al grupo a-amino libre en un aminoácido en el terminal amino de una proteína o al grupo a-amino (grupo imino cuando participa en un enlace peptídico) de un aminoácido en cualquier otro lugar dentro de la proteína. De manera similar, el término "terminal carboxilo" se refiere al grupo carboxilo libre en el terminal carboxilo de una proteína o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro de la proteína. Las proteínas también incluyen esencialmente cualquier poliaminoácido que incluye, pero no se limita a, miméticos de péptidos tales como aminoácidos unidos por un enlace éter en lugar de un enlace amida. Típicamente, cualquiera de las secuencias de proteínas proporcionadas en el presente documento comprende todos los aminoácidos "L". Sin embargo, en determinadas realizaciones, cualquiera de las secuencias de proteínas proporcionadas en el presente documento puede comprender una combinación de aminoácidos "L" y "D". En determinadas realizaciones, cualquiera de las secuencias de proteína descritas en el presente documento comprende todos los aminoácidos "D", proporcionando así el enantiómero D o la forma inversa de la proteína. En determinadas realizaciones, cualquiera de las secuencias de proteína descritas en el presente documento comprende una retroproteína donde los aminoácidos son todos aminoácidos "L", pero en orden inverso. En determinadas realizaciones, cualquiera de las secuencias de proteína descritas en el presente documento comprende una proteína retro-inversa compuesta por todos los aminoácidos "D" en orden inverso.
Como se usa en el presente documento, los términos "oligonucleótido", "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico" y similares, se refieren a moléculas que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, ADN. Los términos abarcan secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN, que incluyen, pero no se limitan a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina. En determinadas realizaciones, el término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido monocatenario que normalmente tiene menos de 500 nucleótidos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido tiene al menos 6 nt, o al menos 8 nt, o al menos aproximadamente 10 nt, o al menos aproximadamente 12 nt, o al menos aproximadamente 15 nt, hasta aproximadamente 200 nt, o hasta aproximadamente 100 nt, o hasta aproximadamente 50 nt, o hasta aproximadamente 30 nt, o hasta aproximadamente 25 nt. Los oligonucleótidos pueden denominarse por su longitud, por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos puede denominarse "24 mer".
Como se usa en el presente documento, el término "complementario" a un gen diana (o región diana del mismo), y el porcentaje de "complementariedad" de la secuencia de la sonda a la secuencia del gen diana es el porcentaje de "identidad" a la secuencia del gen diana o a el complemento de la secuencia del gen diana. Al determinar el grado de "complementariedad" entre las sondas utilizadas en las composiciones descritas en este documento (o regiones de las mismas) y un gen diana, como los divulgados en este documento, el grado de "complementariedad" se expresa como el porcentaje de identidad entre la secuencia de la sonda (o región de la misma) y secuencia del gen diana o el complemento de la secuencia del gen diana que mejor se alinea con ella. El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que son idénticas entre las 2 secuencias, dividiendo por el número total de nucleótidos contiguos en la sonda y multiplicando por 100. Cuando se usa el término "complementario", el oligonucleótido en cuestión es al menos un 90 % complementario a la molécula diana, a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, el oligonucleótido objetivo es al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos 99% o 100% complementario a la molécula diana.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o sintético que es capaz, al formar un dúplex con una plantilla polinucleotídica, de actuar como un punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico y extenderse desde su extremo 3' a lo largo de la plantilla para que se forma un dúplex extendido. La extensión de un cebador normalmente se lleva a cabo con un ácido nucleico polimerasa, tal como un ADN o ARN polimerasa. La secuencia de nucleótidos añadidos en el proceso de extensión está determinada por la secuencia del polinucleótido plantilla. Por lo general, los cebadores se extienden mediante una ADN polimerasa. En diversas realizaciones, los cebadores tienen típicamente una longitud en el intervalo de aproximadamente 14 a aproximadamente 40 nucleótidos, o en el intervalo de aproximadamente 18 a aproximadamente 36, o aproximadamente 30, o aproximadamente 25 nucleótidos. En determinadas realizaciones, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a una secuencia de al menos 8 nucleótidos contiguos de una molécula de ácido nucleico diana, tal como un gen diana, un ADN señal y similares. En algunas realizaciones, un cebador o sonda comprende una región que es complementaria a una secuencia de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 29, al menos 30, al menos 319, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39 o al menos 40 nucleótidos contiguos de una molécula diana. Cuando un cebador o sonda comprende una región que es "complementaria a al menos x nucleótidos contiguos de una molécula diana", el cebador o la sonda es al menos un 95 % complementaria a al menos x nucleótidos contiguos de la molécula diana. En algunas realizaciones, el cebador o la sonda es al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % complementario a la molécula diana. Los cebadores se emplean en una variedad de reacciones de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, reacciones de amplificación lineal que usan un solo cebador o reacciones en cadena de la polimerasa que emplean dos o más cebadores. La guía para seleccionar las longitudes y secuencias de los cebadores para aplicaciones particulares es bien conocida por los expertos en la técnica, como se evidencia en las siguientes referencias: Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2003).
El término "amplificación de ácido nucleico" abarca cualquier medio por el cual se reproduce al menos una parte de al menos un ácido nucleico diana, típicamente de una manera dependiente de la plantilla, que incluye, pero no se limita a, una amplia gama de técnicas para amplificar secuencias de ácidos nucleicos, ya sea en forma lineal o exponencialmente. Ejemplos de medios para realizar una etapa de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la reacción de detección de la ligasa (LDR), la amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex (MLPA), la ligadura seguida de la amplificación de la Q-replicasa, la extensión del cebador, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA), amplificaciones multiplexadas en dos etapas, amplificación de círculo rodante (RCA) y similares, incluidas versiones multiplexadas y combinaciones de los mismos, por ejemplo, pero no se limita a, OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (también conocida como reacción en cadena combinada - CCR), amplificación digital, y similares. Las descripciones de tales técnicas se pueden encontrar en, pero no se limitan a fuentes, Ausbel et al. (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press; Msuih et al. (1996) J. Clin. Micro. 34: 501-07; Rapley, ed. (2002) The Nucleic Acid Protocols Handbook, Humana Press, Totowa, N.J.; Abramson et al. (1993) Curr. Opin. Biotechnol. 4( 1):41-47; Day et al. (1995) Genomics, 29(1): 152-162; Ehrlich et al.(1991) Science, 252: 1643-1650; Innis et al.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Favis et al. (2000) Nat. Biotechnol., 18: 561-564; Rabenau et al. (2000) Infection, 28: 97-102; Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (disponible en la red en: promega.com/geneticidproc/ ussymp6proc/blegrad.html); Manual de instrucciones del kit de LCR, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 188-193; Bi y Sambrook (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2924-2951; Zirvi et al. (1999) Nucl. Acid. Res. 27: e40i-viii; Dean et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 5261-5266; Barany y Gelfand (1991) Gene, 109: 1-11; Walker et al. (1992) Nucl. Acid Res. 20: 1691-1696; Polstra et al. (2002) BMC Inf. Dis. 2: 18; Lage et al. (2003) Genome Res. 13(2): 294-307; Landegren et al. (1988) Science, 241: 1077-1080; Demidov (2002) Expert Rev. Mol. Diagn. 2(6): 542-548; Cook et al., (2003) J. Microbiol. Meth. 53(2): 165-174, Schweitzer et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12(1): 21-27; patentes de los Estados Unidos Nos: 6,027,998, 5,830,711,6,027,889, 5,686,243, y 6,605,451; publicaciones PCT Nos. WO 97/31256, WO 01/92579, WO/0056927A3, y WO/9803673A1; y similares.
En algunas realizaciones, la amplificación comprende al menos un ciclo de los procedimientos secuenciales de: hibridación con al menos un cebador con secuencias complementarias o sustancialmente complementarias en al menos un ácido nucleico diana; sintetizar al menos una cadena de nucleótidos de manera dependiente de la plantilla utilizando una polimerasa; y desnaturalizar el dúplex de ácido nucleico recién formado para separar las cadenas. El ciclo puede o no repetirse. La amplificación puede comprender termociclado o, en determinadas realizaciones, puede realizarse de forma isotérmica.
El término "hibridar" se usa típicamente en el presente documento para referirse a "hibridación específica" que es la unión, duplexación o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferentemente a una secuencia de nucleótidos particular, en algunas realizaciones, en condiciones rigurosas. El término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las que una sonda se hibridará preferentemente con su secuencia diana y, en menor medida, con otras secuencias, o no lo hará en absoluto. Una "hibridación rigurosa" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de la hibridación de ácidos nucleicos dependen de la secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en, por ejemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY. ("Tijssen"). En general, las condiciones de hibridación y lavado muy rigurosas para las hibridaciones de filtros se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente compatible. En determinadas realizaciones, se seleccionan condiciones muy rigurosas para que sean iguales a la Tm para una sonda en particular. La dependencia de la rigurosidad de la hibridación en la composición del tampón, la temperatura y la longitud de la sonda es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.) vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Nueva York).
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina de humanos u otras especies o polipéptidos derivados de los mismos que pueden unirse a una molécula diana (por ejemplo, un antígeno). Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Se sabe que una unidad estructural típica de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.
Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra convirtiendo así el dímero (Fab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, Nueva York. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Si bien varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos Fab' se pueden sintetizar de novo ya sea químicamente o utilizando la metodología del ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo utilizando metodologías de ADN recombinante. Ciertos anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena sencilla (anticuerpos que existen como una sola cadena polipeptídica), más preferiblemente anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los que se unen una cadena pesada variable y una ligera variable (directamente o a través de un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. El anticuerpo Fv de cadena sencilla es un heterodímero Vh-Vl enlazado covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias que codifican Vh-Vl unidas directamente o unidas por un enlazador que codifica un péptido. Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883. Mientras que Vh y Vl están conectados entre sí como una sola cadena polipeptídica, los dominios Vh y Vl se asocian de forma no covalente. Las primeras moléculas de anticuerpos funcionales que se expresaron en la superficie de los fagos filamentosos fueron los Fv de cadena sencilla (scFv), sin embargo, las estrategias de expresión alternativas también han tenido éxito. Por ejemplo, las moléculas Fab se pueden presentar en fagos si una de las cadenas (pesada o ligera) se fusiona con la proteína de la cápside g3 y la cadena complementaria se exporta al periplasma como una molécula soluble. Las dos cadenas se pueden codificar en el mismo o en diferentes replicones; el punto importante es que las dos cadenas de anticuerpos en cada molécula de Fab se ensamblan después de la traducción y el dímero se incorpora a la partícula del fago a través del enlace de una de las cadenas para, por ejemplo, g3p (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No.: 5,733,743). Los anticuerpos scFv y una serie de otras estructuras que convierten las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas agregadas de forma natural, pero químicamente separadas, de una región V del anticuerpo en una molécula que se pliega en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno son conocidos por un experto en la materia (véase por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,091,513, 5,132,405, y 4,956,778). Los anticuerpos particularmente preferidos deben incluir todos los que se han presentado en fagos (por ejemplo, scFv, Fv, Fab y Fv enlazados por disulfuro (véase, por ejemplo, Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8: 1323-1331). Los anticuerpos como se usan en el presente documento también incluyen, pero no se limitan a, nanocuerpos, por ejemplo, anticuerpos de camélidos (véase, por ejemplo, Harmsen y Haard (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77 (1): 13-22; Moller et al. (2010) J. Biol. Chem. 285(49): 38348-38361; Dolk et al. (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71(1): 442-450; Stanfield et al. (2004) Science, 305(5691): 1770-1773; Desmyter et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3(9): 803-811; y similares), unicuerpos (vease por ejemplo, Kolfschoten et al. (2007) Science 317: 1554-1557; publicación PCT No: WO2007/059782; y similares), afficuerpos (vease, por ejemplo, Nord et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 772-777; Ronmark et al. (2002) Eur. J. Biochem., 269: 2647-2655; patente de los Estados Unidos No: 5,831,012; y similares).
La frase "se une específicamente" indica que la molécula se une preferentemente a la diana de interés o se une con mayor afinidad a la diana (analito) que a otras moléculas. Por ejemplo, un anticuerpo se unirá selectivamente al antígeno contra el que se generó. Una molécula de ADN se unirá a una secuencia sustancialmente complementaria y no a secuencias no relacionadas bajo condiciones rigurosas. La unión específica puede referirse a una reacción de unión que determina la presencia de una diana en una población heterogénea de moléculas (por ejemplo, proteínas y otros productos biológicos). Por lo tanto, bajo condiciones designadas (por ejemplo, condiciones de inmunoensayo en el caso de un anticuerpo o condiciones de hibridación rigurosas en el caso de un ácido nucleico), el ligando o anticuerpo específico se une a su molécula "diana" particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra. Por lo tanto, en varias realizaciones, "específico" o "especificidad" en referencia a la unión de una molécula a otra molécula, tal como una secuencia diana para una sonda, significa el reconocimiento, contacto y formación de un complejo estable entre las dos moléculas junto con sustancialmente menos reconocimiento, contacto o formación de complejos de esa molécula con otras moléculas. En un aspecto, "específico" en referencia a la unión de una primera molécula a una segunda molécula significa que en la medida en que la primera molécula reconoce y forma un complejo con otra molécula en una reacción o muestra, forma el mayor número de complejos con la segunda molécula. Preferiblemente, este número mayor es al menos el cincuenta por ciento, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 % de los complejos formados por cualquiera de los miembros de el complejo. Generalmente, las moléculas involucradas en un evento de unión específico tienen áreas en sus superficies o en cavidades que dan lugar a un reconocimiento específico entre las moléculas que se unen entre sí. Los ejemplos de unión específica incluyen interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-sustrato, formación de dúplex o tríplex entre polinucleótidos y/u oligonucleótidos, interacciones receptor-ligando y similares. Como se usa en este documento, "contacto" en referencia a la especificidad o la unión específica significa que dos moléculas están lo suficientemente cerca como para que las interacciones químicas no covalentes débiles, tales como las fuerzas de Van der Waals, los enlaces de hidrógeno, las interacciones de apilamiento de bases, las interacciones iónicas e hidrofóbicas y similares, dominen la interacción de las moléculas.
El término "muestra" se refiere a una cantidad de material de una fuente biológica, ambiental, médica o del paciente donde se busca la detección o medición del analito o analitos diana (por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, etc.). Por un lado, el término "muestra" incluye un espécimen o cultivo (por ejemplo, cultivos microbiológicos). Por otro lado, el término muestra incluye tanto muestras biológicas como ambientales. Una muestra puede incluir un espécimen de origen sintético. Las muestras biológicas pueden ser animales, incluyendo humanos, fluidos, sólidos (por ejemplo, heces), células o tejidos, así como alimentos y productos para piensos líquidos y sólidos, tales como productos lácteos, verduras, carne y subproductos cárnicos, y desechos. Las muestras biológicas pueden incluir materiales tomados de un sujeto (por ejemplo, un paciente) incluidos, pero no se limitan a, cultivos, plasma, suero, sangre, saliva, líquido amniótico, moco, orina, jugo pancreático, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, biopsias de piel, bronquios y/o o aspirados traqueales, aspirados con aguja, biopsias por punción, secciones crioconservadas, secciones FFPE y similares. Las muestras biológicas se pueden obtener de humanos y de todas las diversas familias de animales domésticos, así como de animales silvestres o salvajes, incluidos, pero no se limitan a, animales como ungulados, osos, peces, roedores, lagomorfos, etc. Las muestras ambientales incluyen material ambiental como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios y artículos desechables y no desechables para el procesamiento de alimentos y lácteos. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención. Los términos "muestra" y "espécimen" se usan indistintamente.
El término "analito" se refiere a cualquier fracción que se va a detectar y/o cuantificar. Los analitos incluyen, pero no se limitan a, biomoléculas particulares (proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y/o ARN), carbohidratos, lectinas, etc.), bacterias o componentes de las mismas, toxinas bacterianas o componentes de las mismas, virus o componentes de los mismas (por ejemplo, proteínas de la cubierta), hongos o componentes de los mismos, toxinas fúngicas o componentes de los mismos, protozoos o componentes de los mismos, toxinas de protozoos o componentes de los mismos, fármacos, otras toxinas, patógenos alimentarios y similares.
Los términos "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refieren a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN mediante la extensión simultánea de cebadores de cadenas complementarias de ADN. En otras palabras, la PCR es una reacción para hacer múltiples copias o réplicas de un ácido nucleico diana flanqueado por sitios de unión a cebadores, dicha reacción comprende una o más repeticiones de las siguientes etapas: (i) desnaturalizar el ácido nucleico diana, (ii) hibridar los cebadores con los sitios de unión de los cebadores y (iii) extender los cebadores mediante un ácido nucleico polimerasa en presencia de nucleósidos trifosfatos. Por lo general, la reacción se cicla a través de diferentes temperaturas optimizadas para cada etapa en un instrumento termociclador. Las temperaturas particulares, las duraciones de cada etapa y las velocidades de cambio entre etapas dependen de muchos factores bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, McPherson et al. eds (1995) PCR: A Practical Approach, 2a ed., |Rl Press, Oxford; y similares). Por ejemplo, en una PCR convencional que usa ADN polimerasa Taq, un ácido nucleico diana de doble cadena se puede desnaturalizar a una temperatura superior a aproximadamente 90 °C, los cebadores se hibridan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 75 °C y los cebadores se extendieron a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 72 °C a aproximadamente 78 °C. El término "PCR" abarca formas derivadas de la reacción, incluidas, pero no se limitan a, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada y similares. En varias realizaciones, los volúmenes de reacción de PCR pueden variar desde unos pocos cientos de nanolitros, por ejemplo, 200 nL, hasta unos pocos cientos de pL, por ejemplo, ~200 pL.
El término "PCR de transcripción inversa" o "RT-PCR" se refiere a una PCR que está precedida por una reacción de transcripción inversa que convierte un ARN diana en un ADN monocatenario complementario, que luego se amplifica (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,168,038).
El término "PCR en tiempo real" se refiere a una PCR para la cual la cantidad de producto de reacción, es decir amplicón, se controla a medida que avanza la reacción. Existen muchas formas de PCR en tiempo real que se diferencian principalmente en las químicas de detección utilizadas para monitorizar el producto de la reacción (véase, por ejemplo, Gelfand et al., patente de los Estados Unidos No. 5,210,015 ("TAQMANMC"); Wittwer et al., patente de los Estados Unidos No. 6,174,670 y 6,569,627 (colorantes intercalantes); Tyagi et al., patente de los Estados Unidos No. 5,925,517 (balizas moleculares); y similares). Se revisan las químicas de detección para PCR en tiempo real, entre otros en Mackay et al. (2002) Nucl. Acids Res. 30: 1292-1305.
Los términos "PCR cuantitativa" o "qPCR" se refieren a una PCR diseñada para medir la abundancia de una o más secuencias diana específicas en una muestra o espécimen. La PCR cuantitativa incluye tanto la cuantificación absoluta como la cuantificación relativa de tales secuencias diana. Por lo general, las mediciones cuantitativas se realizan utilizando una o más secuencias de referencia que pueden analizarse por separado o junto con una secuencia diana. La secuencia de referencia puede ser endógena o exógena a una muestra o espécimen y, en este último caso, puede comprender una o más plantillas competidoras. Las secuencias de referencia endógenas típicas incluyen, pero no se limitan a, segmentos de transcritos de los siguientes genes: p-actina, GAPDH, p2-microglobulina, ARN ribosómico y similares. Las técnicas para la PCR cuantitativa son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Freeman et al. (1999) Biotechniques, 26: 112-126; Becker-Andre et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 9437-9447; Zimmerman et al. (1996) Biotechniques, 21: 268-279; Diviacco et al. (1992) Gene, 122: 3013-3020; y similares).
Los términos "que puede ser resuelto espectralmente" o "diferente y distinguible" en referencia a una pluralidad de marcadores ópticos (por ejemplo, fluorescentes) significa que las bandas de señales ópticas (por ejemplo, emisión fluorescente) de los marcadores son suficientemente distintas, es decir suficientemente no superpuestas, de modo que los marcadores moleculares a las que se unen los marcadores respectivos se puedan distinguir con base en la señal (por ejemplo, señal fluorescente) generada por los marcadores respectivos mediante sistemas de fotodetección estándar, por ejemplo, empleando un sistema de filtros de paso de banda y tubos fotomultiplicadores, o similares (véase, por ejemplo, los sistemas descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos.: 4,230,558; 4,811,218, y similares, o en Wheeless et al. (1985) páginas. 21 -76, en Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, Nueva York).
El término "procedimiento de llenado de tubos" se refiere a un procedimiento que se realiza utilizando instrumentación de laboratorio estándar en lugar de un casete (por ejemplo, en lugar de con un cartucho GENEXPERT®, o GENEXPERT® modificado descrito en este documento).
Descripción detallada
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un cartucho para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho cartucho: una cámara receptora de muestras; una cámara que comprende un material de la matriz que actúa como filtro y/o un agente de unión al ADN; un canal o cámara con control de temperatura; y una pluralidad de cámaras que contienen reactivos para realizar inmuno-PCR, donde: dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de captura que se une al analito que se va a detectar; dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de detección donde dicho anticuerpo de detección está opcionalmente unido directa o indirectamente a un ADN señal; dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una mezcla maestra de PCR; dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene cebadores para amplificar todo o una región de dicho ADN señal; dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una sonda para detectar todo o una región de dicha ADN señal, y en donde dicha cámara receptora de muestras, dicha cámara que comprende un material de la matriz, dicho canal o cámara de calentamiento controlado por temperatura o un puerto en dicho canal o cámara controlado por temperatura, y dicha pluralidad de cámaras están dispuestas alrededor de una válvula central y selectivamente en comunicación fluida con un canal en dicha válvula central, donde dicha válvula central está configurada para acomodar un émbolo que es capaz de extraer fluido hacia adentro o hacia afuera de una cámara en comunicación fluida con dicha válvula central.
Dichos cebadores y/o sondas de PCR y/o polimerasa en dicha mezcla maestra pueden proporcionarse como perlas. Dicho cartucho puede contener anticuerpos de detección para la detección de un solo analito. Dicho cartucho puede contener anticuerpos de captura para la captura de un solo analito. Dicho cartucho puede contener anticuerpos de detección para la detección de una pluralidad de analitos. Dicho cartucho puede contener anticuerpos de detección para la detección de al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10 analitos diferentes. Dicho cartucho puede contener anticuerpos de captura para la captura de una pluralidad de analitos. Dicho anticuerpo de captura puede unirse a la pared de una cámara de reacción o a dicho material de la matriz. Dicho anticuerpo de captura puede conjugarse químicamente con la pared de una cámara de reacción o con dicho material de la matriz. Dicho anticuerpo de captura puede unirse a la pared de una cámara de reacción o a dicho material de la matriz a través de una interacción biotina/estreptavidina. Dicho anticuerpo de captura puede unirse a una partícula. Dicho anticuerpo de captura puede conjugarse químicamente con dicha partícula. Dicho anticuerpo de captura puede unirse a dicha partícula a través de una interacción biotina/estreptavidina. Dicha partícula puede comprender una partícula seleccionada del grupo que consiste en una partícula de látex (poliestireno), copolímeros de poli(estireno/divinilbenceno), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(metacrilato de hidroxietilo) (pHEMA), una partícula de sílice, una partícula de teflón y partícula de metal noble y una partícula magnética. Dicha partícula puede comprender una partícula de látex. Dicha partícula puede variar en tamaño desde aproximadamente 0.5 |jm, o desde aproximadamente 1 jm hasta aproximadamente 10 jm , o hasta aproximadamente 3 jm , o dicha partícula puede variar en tamaño desde aproximadamente 1 jm hasta aproximadamente 2.8 jm . Dicha pluralidad de cámaras puede comprender una cámara que contiene uno o más agentes de bloqueo para reducir la unión no específica. Dicho agente de bloqueo se puede seleccionar del grupo que consiste en un polímero, un detergente, un carbohidrato, una proteína, un tensioactivo y un polisacárido. Dicho agente bloqueante puede comprender un polímero, detergente o carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en PEG, Pluronics F68/F108/F127 (se prefiere F68), PVP, Biolipidure 802 (NOF America), Tween 20 u 80, TEGME (Tre(etilenglicol) monoetil éter), TEG (tegraetilenglicol) y polímeros que contienen fosforilcolina. Dicho agente bloqueante puede comprender una proteína, un tensioactivo o un hidrato de carbono del grupo formado por Caseína, BSA, IgG de cabra, IgG de bovino, Stabilcoat (ThermoFisher), Iota-carragenina, sulfato de dextrano, ADN de esperma de arenque o salmón y suero de ratón. Dicho anticuerpo de detección puede no estar unido a un ADN señal y dicho cartucho puede comprender además una cámara que contiene un anticuerpo marcador que se une a dicho anticuerpo de detección donde dicho anticuerpo marcador está unido a un ADN señal. Dicho anticuerpo de detección puede unirse a un ADN señal. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con dicho anticuerpo de detección, o cuando dicho anticuerpo marcador está presente, dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con dicho anticuerpo marcador. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con dicho anticuerpo mediante una cisteína, mediante una lisina o mediante un carbohidrato. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con un enlazador C6 a C18, o un enlazador C6 a C12. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con un entrelazador heterobifuncional. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con 4-hidrazinonicotinato de succinimidilo acetona hidrazona (SANH) o 4-(n-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC). Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente a través de una modificación de azida del ADN y enlazarse al anticuerpo a través de una fracción de dibenzociclooctino (DBCO). Dicho enlazador puede comprender un enlazador DBCO-PEG-NHS. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con un enlazador escindible. Dicho enlazador escindible puede seleccionarse del grupo que consiste en un enlazador que contiene un enlace disulfuro escindible, un enlazador escindible con base y un enlazador escindible con ácido. Dicho enlazador escindible puede comprender un enlace disulfuro escindible con DTT. Dicho enlazador escindible puede comprender adicionalmente una tetrazina. Dicho ADN señal puede unirse a dicho anticuerpo de detección a través de una interacción biotina/avidina, o cuando dicho anticuerpo marcador está presente, dicho ADN señal puede unirse a dicho anticuerpo marcador a través de una interacción biotina/avidina. Dicha interacción biotina/avidina puede ser una interacción biotina/estreptavidina o una interacción biotina/neutravidina. Dicho ADN señal puede comprender una secuencia Ter y dicho anticuerpo de detección o dicho anticuerpo marcador puede unirse a una proteína Tus y dicho ácido nucleico señal puede unirse a dicho anticuerpo de detección o a dicho anticuerpo marcador a través de una interacción Tus-Ter. Dicho anticuerpo de detección puede unirse a una perla y dicho ADN señal está en la misma perla, o cuando dicho anticuerpo marcador está presente, dicho anticuerpo marcador puede unirse a una perla y dicho ADN señal puede unirse a la misma perla. Dicho anticuerpo y/o dicho ADN señal pueden conjugarse químicamente con dicha perla. Dicho anticuerpo y/o dicho ADN señal pueden unirse a dicha perla a través de una interacción biotina/estreptavidina. Dicha perla puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en látex, sílice, cerámica, teflón, un metal noble, un semiconductor y un material magnético. Dicha perla puede comprender oro. Dicho anticuerpo de detección puede presentarse en la superficie de un fago y el ADN señal puede estar contenido dentro de dicho fago, o cuando dicho anticuerpo marcador está presente, dicho anticuerpo marcador puede presentarse en la superficie de un fago y dicho ADN señal puede estar contenido dentro de dicho fago. Dicha pluralidad de cámaras puede comprender además una cámara que contiene cebadores de PCR para amplificar un ácido nucleico distinto de dicho ácido nucleico señal. Dicha pluralidad de cámaras puede comprender además una cámara que contiene una sonda para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico distinto de dicho ácido nucleico señal. Dicho analito diana puede comprender un polipéptido y dicho ácido nucleico distinto de dicho ácido nucleico señal puede comprender un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido o un fragmento del mismo. Dicho analito diana puede comprender un polipéptido y dicho ácido nucleico distinto de dicho ácido nucleico señal comprende un ácido nucleico característico de una célula, tejido u organismo que produce dicho polipéptido. Dicho cartucho puede comprender una o más cámaras que contienen reactivos para reacciones de PCR TaqMan. Dicho cartucho puede comprender una o más cámaras que contienen una o más sondas fluorescentes que son marcadores del ADN señal amplificado y, opcionalmente, una o más sondas fluorescentes que son marcadores de la secuencia amplificada distinta del ADN señal amplificado. Dichas sondas pueden comprender un colorante informador fluorescente y un colorante inhibidor, donde las sondas proporcionan una señal tras la escisión por la actividad nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa Taq. Dichos cebadores para amplificar un ácido nucleico distinto de dicho ácido nucleico señal y/o dicha sonda para detectar un ácido nucleico distinto de dicho ácido nucleico señal pueden proporcionarse como perlas. Dicho canal o cámara con control de temperatura puede ser un canal o cámara de termociclado. Dicho material de la matriz puede comprender un material que se selecciona del grupo que consiste en vidrio o sílice, una resina de intercambio iónico e hidroxiapatita. Dicha cámara receptora de muestras, comprendiendo dicha cámara un material de la matriz, dicha pluralidad de cámaras que contienen reactivos, y dicho canal o cámara de calentamiento controlado por temperatura, pueden estar selectivamente en comunicación fluida. Dicha cámara receptora de muestras, comprendiendo dicha cámara un material de la matriz, dicha pluralidad de cámaras que contienen reactivos, y dicho canal o cámara de calentamiento controlado por temperatura, pueden estar selectivamente en comunicación fluida mediante válvulas y canales de microfluidos. Dicho cartucho puede configurarse de modo que, cuando se utilice, dicho cartucho comprenda: una cámara que contiene una muestra; una cámara que contiene dicho anticuerpo de detección; una cámara que contiene dicho anticuerpo de captura; una cámara que contiene un tampón de lavado; y una cámara que contiene una mezcla maestra de PCR para amplificar dicho ADN señal. Dicho cartucho puede comprender una cámara que contiene una muestra; una cámara que contiene dicho anticuerpo de detección; una cámara que contiene dicho anticuerpo de captura; una cámara que contiene un tampón de lavado; una cámara que contiene KOH; una cámara que contiene HEPES o Tris-HCl; y una cámara para recibir residuos. Dicho cartucho puede comprender una cámara que contiene una muestra; una cámara que contiene dicho anticuerpo de detección en PBS a un pH de aproximadamente 7.25; una cámara que contiene dicho anticuerpo de captura en PBS a un pH de aproximadamente 7.25; una cámara que contiene un tampón de lavado de PBS; una cámara que contiene KOH; una cámara que contiene HEPES a un pH de aproximadamente 8.25 o Tris-HCl a un pH de aproximadamente 7.4; y una cámara para recibir residuos. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un analito seleccionado del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un prión, un antígeno parasitario, una micotoxina y un marcador de cáncer, y un producto génico de resistencia a fármacos. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un antígeno viral seleccionado del grupo que consiste en antígeno de superficie de Hepatitis B, antígeno de superficie de Hepatitis C, antígeno de herpesvirus bovino, cápside de norovirus, rotavirus, gusanos Angiostrongylus cantonensis, proteína de Hantavirus, antígeno viral de influenza aviar, antígeno VIH-1 y antígeno de H5N1. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un prión seleccionado del grupo que consiste en PRP bovino, PRP de cerebro humano. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un antígeno bacteriano o a una toxina bacteriana seleccionada del grupo que consiste en antígeno de C. difficile, toxina A de C. diffíále, toxina de C. difficile, P. piscidia, antígeno de E. coli, Bacteroides fragilis, BoNT/A, Grupo A de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, antígeno de Y. pestis, y antígeno de M. tuberculosis. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a una toxina bacteriana seleccionada del grupo que consiste en la toxina shiga tipo 2, neurotoxina A de Clostridium botulinum, enterotoxina estafilocócica, toxina de Bacilo thuringiensis, toxina A de C. difficile y toxina B de C. difficile. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un polipéptido codificado por un gen de resistencia a fármacos. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un polipéptido de resistencia a fármacos seleccionado del grupo que consiste en p-glicoproteína glicoproteína p, polipéptido OleC, polipéptido mbcF, polipéptido o polipéptidos MsrA, polipéptido bexA, polipéptido bexB, polipéptido kpsT y polipéptido kpsM. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un analito que es un marcador de una respuesta inflamatoria del huésped. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un analito seleccionado del grupo que consiste en IL-8, calprotectina y lactoferrina. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un analito que es un marcador de cáncer. Dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección pueden ser anticuerpos que se unen a un marcador de cáncer en la Tabla 5. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un analito o un fragmento de un analito seleccionado del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un prión, un antígeno parasitario, una micotoxina, y un analito de una célula cancerosa. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un antígeno viral o un fragmento del mismo donde dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de superficie de Hepatitis B, antígeno de superficie de Hepatitis C, antígeno de herpesvirus bovino, cápside de norovirus, rotavirus, gusanos Angiostrongylus cantonensis, proteína de hantavirus, antígeno viral de influenza aviar, antígeno VIH-1 y antígeno de H5N1. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un antígeno bacteriano o toxina bacteriana o un fragmento del mismo donde dicho antígeno bacteriano o toxina bacteriana se selecciona del grupo que consiste en antígeno de C. difficile, toxina A de C. difficile, P. piscidia, antígeno de E. coli, Bacteroides fragilis, BoNT/A, Grupo A de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, antígeno de Y. pestis, y antígeno de M. Tuberculosis. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica una toxina bacteriana o un fragmento de la misma donde dicha toxina bacteriana se selecciona del grupo que consiste en la toxina shiga 2, neurotoxina A de Clostridium botulinum, enterotoxina estafilocócica, toxina de Bacillus thuringiensis, toxina A de C. difficile y toxina B de C. difficile. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido expresado por un gen de resistencia a fármacos. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de resistencia a fármacos seleccionado del grupo que consiste en MRP, pglucoproteína, glicoproteína p, polipéptido OleC, polipéptido mbcF, polipéptido o polipéptidos MsrA, polipéptido bexA, polipéptido bexB, polipéptido kpsT y polipéptido kpsM. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un marcador o un fragmento de un marcador para una inflamación de respuesta del huésped. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un marcador o un fragmento de un marcador seleccionado del grupo formado por IL-8, calprotectina y lactoferrina. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un marcador de cáncer o un fragmento de un marcador de cáncer. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un marcador de cáncer o un fragmento de un marcador de cáncer de la Tabla 5. Dicho cartucho puede cargarse con una muestra que comprenda un material de una fuente biológica, ambiental, médica o del paciente. Dicha muestra puede comprender una muestra ambiental seleccionada del grupo que consiste en materia superficial, suelo, agua, vegetación y una muestra industrial. Dicha muestra puede comprender una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en un cultivo, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, aspirados bronquiales, lavado traqueal, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados con aguja, biopsias por punción, biopsias quirúrgicas, secciones crioconservadas, sección FFPE. Dicha muestra puede comprender una muestra ambiental seleccionada del grupo que consiste en materia superficial, suelo, agua, vegetación y una muestra industrial. Dicha muestra puede comprender una muestra alimentaria o agrícola, seleccionada del grupo que consiste en carne, productos cárnicos, aves o productos aviares, leche o productos lácteos y cultivos agrícolas y desechos orgánicos.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico diana, comprendiendo dicho método: proporcionar una muestra en una cámara receptora de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR; y usar dicho cartucho en un método de inmuno-PCR que comprende: poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de captura en condiciones en las que dicho anticuerpo de captura se une a dicho analito, formando un complejo de anticuerpo de captura/analito; poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de detección unido a un ADN señal en condiciones en las que dicho anticuerpo de detección se une específicamente y forma un complejo inmune con dicho complejo de anticuerpo de captura/analito; liberar dicho complejo inmune o una parte del mismo que comprende dicho ADN señal y administrar dicho complejo inmune o una parte del mismo en un canal o cámara con control de temperatura; y realizar una amplificación de ácido nucleico en dicho canal o cámara con control de temperatura para detectar y/o cuantificar dicho ácido nucleico señal, detectando y/o cuantificando así dicho analito, donde dicho cartucho es un cartucho como se describió anteriormente.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho método: proporcionar una muestra en una cámara receptora de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR; y usar dicho cartucho en un método de inmuno-PCR que comprende: poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de captura en condiciones en las que dicho anticuerpo de captura se une a dicho analito, formando un complejo de anticuerpo de captura/analito; poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de detección donde dicho contacto se realiza en condiciones en las que dicho anticuerpo de detección se une específicamente y forma un complejo inmune con dicho complejo de anticuerpo de captura/analito; poner en contacto dicho complejo inmune con un anticuerpo marcado que se une a dicho anticuerpo de detección donde dicho anticuerpo marcado se une a un ADN señal y dicho contacto se realiza en condiciones en las que dicho anticuerpo marcado se une específicamente a dicho anticuerpo de detección para formar un complejo inmune marcado; liberar dicho complejo inmune marcado o una parte del mismo que comprende dicho ADN señal y administrar dicho complejo inmune o una parte del mismo en un canal o cámara con control de temperatura; y realizar una amplificación de ácido nucleico en dicho canal o cámara con control de temperatura para detectar y/o cuantificar dicho ácido nucleico señal, detectando y/o cuantificando así dicho analito, donde dicho cartucho es un cartucho como se describió anteriormente.
Dicha amplificación de ácido nucleico puede comprender un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción de detección de la ligasa (LDR), amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex (MLPA), ligadura seguida de amplificación por Q-replicasa, extensión de cebadores, amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación de desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA) y amplificación de círculo rodante (RCA). Dicha amplificación de ácido nucleico puede comprender la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dicha amplificación de ácido nucleico puede comprender qPCR. Dicho anticuerpo de captura puede unirse a la pared de una cámara de reacción o a dicho material de la matriz y la unión de dicho analito puede inmovilizar dicho analito en dicha cámara de reacción o dicho material de la matriz. Dicho anticuerpo de captura puede unirse a una partícula y la unión de dicho analito puede unir dicho analito a dicha partícula. Dicho contacto de dicho analito con un anticuerpo de detección puede comprender el contacto de dicho analito unido a dicha partícula con dicho anticuerpo de detección. Dicho método puede comprender atrapar dicha partícula en dicha matriz. Cuando dicho anticuerpo de captura se une a una perla, liberando dicho complejo inmune o una parte del mismo o liberando dicho complejo inmune marcado o una parte del mismo puede comprender la elución inversa de todo el complejo y administrar ese complejo en dicho canal o cámara con control de temperatura; o cuando dicho anticuerpo de captura se une a la pared de una cámara de reacción o a dicho material de la matriz, liberando dicho complejo inmune, o una parte del mismo, o liberando dicho complejo inmune marcado, o una parte del mismo, puede comprender escindir todo el complejo de dicho material de pared o matriz y suministrar dicho complejo en dicho canal o cámara con control de temperatura. Dicha liberación de dicho complejo inmune o una parte del mismo o liberación de dicho complejo inmune marcado o una parte del mismo puede comprender: liberar dicho anticuerpo de detección unido a un a Dn señal de dicho complejo inmune y administrar dicho anticuerpo de detección con el ADN señal unido a dicho canal o cámara con control de temperatura; o liberar dicho anticuerpo marcador unido a un ADN señal de dicho complejo inmune etiquetado y administrar dicho anticuerpo marcador unido a un ADN señal en dicho canal o cámara con control de temperatura. Dicha liberación puede comprender romper químicamente dicho anticuerpo de detección de dicho complejo inmune o romper químicamente dicho anticuerpo marcador de dicho complejo inmune marcado. Dicha alteración puede comprender poner en contacto dicho complejo inmune o complejo inmune marcado con una base. Dicha alteración puede comprender poner en contacto dicho complejo inmune o complejo inmune marcado con KOH. Dicha liberación puede comprender el uso de calor para romper dicho anticuerpo de detección de dicho complejo inmune o dicho anticuerpo marcador de dicho complejo inmune marcado. Dicha liberación puede comprender el uso de ultrasonidos para interrumpir dicho anticuerpo de detección de dicho complejo inmune o dicho anticuerpo marcador de dicho complejo inmune marcado. Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con dicho anticuerpo de detección o a dicho anticuerpo marcador y liberar dicho complejo inmune, o una parte del mismo, o liberar dicho complejo inmune marcado, o una parte del mismo, puede comprender escindir el enlazador que une dicho ADN señal a dicho anticuerpo de detección o a dicho anticuerpo marcador, y suministrar dicho ADN señal en dicho canal o cámara con control de temperatura. El enlazador que une dicho ADN señal a dicho anticuerpo de detección o a dicho anticuerpo marcador puede ser un enlazador lábil al ácido, y dicha escisión puede comprender poner en contacto dicho enlazador con un ácido capaz de escindir dicho enlazador. El enlazador que une dicho ADN señal a dicho anticuerpo de detección o a dicho anticuerpo marcador puede ser un enlazador lábil a bases, y dicha escisión puede comprender poner en contacto dicho enlazador con una base capaz de escindir dicho enlazador. El enlazador que une dicho ADN señal a dicho anticuerpo de detección o a dicho anticuerpo marcador puede comprender un enlace disulfuro, y dicha escisión puede comprender poner en contacto dicho enlazador con un agente capaz de romper dicho enlace disulfuro. Dicho agente capaz de romper dicho enlace disulfuro puede comprender ditiotreitol (DTT). Dicho ADN señal puede conjugarse químicamente con dicho anticuerpo de detección o dicho anticuerpo marcador o unirse a dicho anticuerpo de detección o dicho anticuerpo marcador mediante una interacción avidina/biotina y liberar dicho complejo inmune, o una parte del mismo, o liberar dicho complejo inmune marcado, o una parte del mismo, puede comprender escindir dicho ADN señal para liberar un fragmento de dicho ADN señal que sea capaz de detectarse o cuantificarse en una reacción de amplificación de ácido nucleico, y administrar dicho fragmento liberado de dicho ADN señal en dicho canal o cámara con control de temperatura. Dicha escisión de dicho ADN señal puede comprender poner en contacto dicho ADN señal con una endonucleasa de restricción que reconoce un sitio de restricción en dicho ADN señal y escinde dicho ADN señal en o cerca de dicho sitio de restricción. Dicho ADN señal puede unirse a una perla y dicho anticuerpo de detección o dicho anticuerpo marcador puede unirse a la misma perla, y liberar dicho ADN señal puede comprender calentar o sonicar dicho a Dn señal y/o perla para liberar dicho ADN señal, y suministrar dicho ADN señal en dicho canal o cámara con control de temperatura. Dicho anticuerpo de detección puede presentarse en la superficie de un fago que contiene dicho ADN señal o dicho anticuerpo marcador puede presentarse en la superficie de un fago que contiene dicho ADN señal, y la liberación de dicho ADN señal puede comprender calentar, sonicar o lisar dicho fago para liberar dicho ADN señal para liberar dicho ADN señal y suministrar dicha ADN señal en dicho canal o cámara con control de temperatura. Dicho método puede comprender lavar dicho complejo inmune o dicho complejo inmune marcado para eliminar los materiales no unidos o el material no unido específicamente antes de liberar dicho complejo inmune o una parte del mismo o dicho complejo inmune marcado o una parte del mismo. Dicho canal o cámara con control de temperatura puede comprender un canal o cámara de termociclado y dicha amplificación puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dicha PCR puede comprender qPCR. Dicha amplificación puede comprender un método seleccionado del grupo que consiste en una reacción de polimerasa lineal, una reacción en cadena de la ligasa, una reacción de desplazamiento de cadena, una amplificación basada en ácido nucleico secuenciado y una reacción de amplificación de círculo rodante. Dicha amplificación puede comprender someter una mezcla de reacción que contiene dicho ADN señal a condiciones de amplificación y monitorizar una señal óptica de un indicador en la mezcla de reacción. Dicha señal óptica puede seleccionarse del grupo que consiste en una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal electroquimioluminiscente y una señal colorimétrica. La señal óptica puede ser una señal óptica fluorescente generada por un indicador fluorescente. Dicho indicador fluorescente puede ser un colorante intercalado no específico que se une a productos de ADN de doble cadena. Dicho indicador fluorescente puede comprender una sonda específica de secuencia diana. Dicha sonda específica de secuencia diana puede seleccionarse del grupo que consiste en una sonda TAQMAN, una sonda SCORPION y una MOLECULAR BEACON. Dicho método se puede realizar en una pluralidad de analitos diferentes en el mismo cartucho. Dicha pluralidad puede comprender al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6 analitos diferentes. Cada analito que comprende dicha pluralidad de analitos puede derivarse de la misma muestra en dicho cartucho. Los ADN señal que representan a cada uno de los analitos que comprenden dicha pluralidad pueden amplificarse secuencialmente en el mismo canal o cámara con control de temperatura. Entre cada reacción de amplificación, dicho método puede comprender: lavar dicho canal o cámara con control de temperatura con una solución de lavado; y retirar dicha solución de lavado de dicho canal o cámara con control de temperatura y transferir fluidamente la solución de lavado a un depósito de residuos. Después de retirar dicha solución de lavado de dicho canal o cámara con control de temperatura, dicho método puede comprender transferir aire a dicho canal o cámara con control de temperatura y calentar el canal o cámara a una temperatura igual o superior a la temperatura de desnaturalización del ADN. Dicha temperatura de desnaturalización puede oscilar entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 99 °C. Los ADN señal que representan cada uno de los analitos que comprenden dicha pluralidad pueden amplificarse simultáneamente cada uno en un canal o cámara con control de temperatura diferente en dicho cartucho. Los ADN señal que representan cada uno de los analitos que comprenden dicha pluralidad pueden amplificarse simultáneamente en el mismo canal o cámara con control de temperatura en dicho cartucho y la amplificación de cada ADN señal proporciona una señal óptica distinguible diferente. Dicho método se puede completar en aproximadamente 1 hora o menos, o en aproximadamente 50 minutos o menos, o en aproximadamente 40 minutos o menos, o en aproximadamente 30 minutos o menos, o en aproximadamente 20 minutos o menos, o en aproximadamente 15 minutos o menos. Dicho método puede comprender además amplificar un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal. Dicha amplificación de un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal puede comprender: unir un ácido nucleico de dicha muestra a un material de la matriz; lavar el ácido nucleico unido para proporcionar un ácido nucleico lavado; eluir el ácido nucleico lavado; y someter dicho ácido nucleico lavado a una reacción de amplificación para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana si está presente en dicho ácido nucleico lavado. Dicho ácido nucleico distinto de dicho ADN señal puede comprender un ADN. Dicho ácido nucleico distinto de dicho ADN señal puede comprender un ARN. Dicha amplificación de un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal se puede realizar en ácidos nucleicos obtenidos de la misma muestra en la cámara de muestras utilizada para dicha inmuno-PCR. Dicha amplificación de un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal se puede realizar en ácido o ácidos nucleicos obtenidos de una muestra en una cámara de muestra diferente a la cámara de muestra utilizada para dicha inmuno-PCR. Los ADN señal y el o los ácidos nucleicos distintos del ADN señal pueden amplificarse secuencialmente en el mismo canal o cámara con control de temperatura. El ADN señal puede amplificarse antes de la amplificación del ácido nucleico distinto del ADN señal. El ADN señal puede amplificarse después de la amplificación del ácido nucleico distinto del ADN señal. Entre la amplificación de dicho ADN señal y la amplificación de un ácido nucleico que no sea un ADN señal, dicho método puede comprender: lavar dicho canal o cámara con control de temperatura con una solución de lavado; y retirar dicha solución de lavado de dicho canal o cámara con control de temperatura y transferir fluidamente la solución de lavado a un depósito de residuos. Después de retirar dicha solución de lavado de dicho canal o cámara con control de temperatura, dicho método puede comprender transferir aire a dicho canal o cámara con control de temperatura y calentar el canal o cámara a una temperatura igual o superior a la temperatura de desnaturalización del ADN. Dicha temperatura de desnaturalización puede oscilar entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 99 °C. El o los ADN señal y el ácido o ácidos nucleicos distintos de un ADN señal pueden amplificarse simultáneamente cada uno en un canal o cámara con control de temperatura diferente en dicho cartucho. El o los ADN señal y el ácido o ácidos nucleicos distintos del ADN señal pueden amplificarse simultáneamente en el mismo canal o cámara con control de temperatura en dicho cartucho y la amplificación del o los ADN señal y el ácido o ácidos nucleicos distintos de un ADN señal pueden proporcionar una señal óptica distinguible diferente. Dicha amplificación de un ácido nucleico distinto de un a Dn señal puede comprender someter una mezcla de reacción que contiene dicho ácido nucleico distinto de un ADN señal a condiciones de amplificación y controlar una señal óptica de un indicador en la mezcla de reacción. Dicha señal óptica puede seleccionarse del grupo que consiste en una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal electroquimioluminiscente y una señal colorimétrica. La señal óptica puede ser una señal óptica fluorescente generada por un indicador fluorescente. Dicho indicador fluorescente puede ser un colorante intercalado no específico que se une a productos de ADN de doble cadena. Dicho indicador fluorescente puede comprender una sonda específica de secuencia diana. Dicha sonda específica de secuencia diana puede seleccionarse del grupo que consiste en una sonda TAQMAN, una sonda SCORPION y una MOLECULAR BEACON. Dicha muestra puede comprender un material de origen biológico, ambiental, médico o del paciente. Dicha muestra puede comprender una muestra ambiental seleccionada del grupo que consiste en materia superficial, suelo, agua, vegetación y una muestra industrial. Dicha muestra puede comprender una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en un cultivo, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, aspirados bronquiales, lavado traqueal, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados con aguja, biopsias por punción, biopsias quirúrgicas, secciones crioconservadas, sección FFPE. Dicha muestra puede comprender una muestra ambiental seleccionada del grupo que consiste en materia superficial, suelo, agua, vegetación y una muestra industrial. Dicha muestra puede comprender una muestra alimentaria o agrícola, seleccionada del grupo que consiste en carne, productos cárnicos, aves o productos aviares, leche o productos lácteos y cultivos agrícolas y desechos orgánicos. Dicho analito puede comprender una fracción seleccionada del grupo que consiste en un polipéptido, una lectina, un lípido, un carbohidrato y una pequeña molécula orgánica. Dicho analito se puede seleccionar del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un prión, un antígeno parasitario, una micotoxina y un marcador de cáncer, y un producto génico de resistencia a fármacos. Dicho analito puede comprender un antígeno viral seleccionado del grupo que consiste en antígeno de superficie de hepatitis B, antígeno de superficie de hepatitis C, antígeno de herpesvirus bovino, cápside de norovirus, rotavirus, gusanos Angiostrongylus cantonensis, proteína de hantavirus, antígeno viral de influenza aviar, antígeno de VIH-1 y antígeno de H5N1. Dicho analito puede comprender un prión seleccionado del grupo que consiste en PRP bovino, PRP de cerebro humano. Dicho analito puede comprender un antígeno bacteriano o una toxina bacteriana seleccionada del grupo que consiste en antígeno de C. difficile, toxina A, de C. diffidle, toxina B de C. diffiále, P. pisadla, antígeno de E. coli, Bacteroides fragilis, BoNT/A, Grupo A de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, antígeno de Y. pestis, y antígeno de M. tuberculosis. Dicho analito puede comprender una toxina bacteriana seleccionada del grupo que consiste en la toxina shiga 2, neurotoxina A de Clostridium botulinum, enterotoxina estafilocócica, toxina de Bacillus thuringiensis, toxina A de C. difficile y toxina B C. difficile. Dicho analito puede comprender un polipéptido codificado por un gen de resistencia a fármacos. Dicho analito puede comprender un polipéptido de resistencia a fármacos seleccionado del grupo que consiste en p-glicoproteína, glicoproteína p, polipéptido OleC, polipéptido mbcF, polipéptido o polipéptidos MsrA, polipéptido bexA, polipéptido bexB, polipéptido kpsT y polipéptido kpsM. Dicho analito puede comprender un marcador para una inflamación de respuesta del huésped. Dicho marcador puede seleccionarse del grupo que consiste en IL-8, calprotectina y lactoferrina. Dicho analito puede comprender un marcador de cáncer. Dicho analito puede comprender un marcador de cáncer en la Tabla 5. Dicho método puede comprender amplificar un ácido nucleico que codifica un analito o un fragmento de un analito seleccionado del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un prión, un antígeno parasitario, una micotoxina y un analito de una célula cancerosa. Dicho método puede comprender amplificar un ácido nucleico que codifica un antígeno viral o un fragmento del mismo donde dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de superficie de hepatitis B, antígeno de superficie de hepatitis C, antígeno de herpesvirus bovino, cápside de norovirus, rotavirus, gusanos Angiostrongylus cantonensis, proteína de hantavirus, antígeno viral de influenza aviar, antígeno de VIH-1 y antígeno de H5N1. Dicho método puede comprender la amplificación de un ácido nucleico que codifica un antígeno bacteriano o una toxina bacteriana o un fragmento del mismo, donde dicho antígeno bacteriano o toxina bacteriana se selecciona del grupo que consiste en antígeno C. difficile, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, P. piscidia, antígeno de E. coli, Bacteroides fragilis, BoNT/A, Grupo A de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, antígeno de Y. pestis, y antígeno de M. tuberculosis. Dicho método puede comprender amplificar un ácido nucleico que codifica una toxina bacteriana o un fragmento de la misma donde dicha toxina bacteriana se selecciona del grupo que consiste en la toxina shiga 2, neurotoxina A de Clostridium botulinum, enterotoxina estafilocócica, toxina de Bacilo thuringiensis, toxina A de C. difficile y toxina B de C. difficile. Dicho método puede comprender amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido expresado por un gen de resistencia a fármacos. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de resistencia a fármacos seleccionado del grupo que consiste en MRP, p-glicoproteína glicoproteína p, polipéptido OleC, polipéptido mbcF, polipéptido o polipéptidos MsrA, polipéptido bexA, polipéptido bexB, polipéptido kpsT y polipéptido kpsM. Dicho método puede comprender la amplificación de un ácido nucleico que codifica un marcador para una inflamación de respuesta del huésped. Dicho cartucho puede contener cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionado del grupo que consiste en IL-8, calprotectina y lactoferrina. Dicho método puede comprender amplificar un ácido nucleico que codifica un marcador de cáncer. Dicho método puede comprender amplificar un ácido nucleico que codifica un marcador de cáncer en la Tabla 5.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un sistema para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho sistema: un recinto configurado para contener uno o más módulos de procesamiento de muestras, cada módulo de procesamiento de muestras configurado para contener un cartucho extraíble como se describió anteriormente, donde dicho sistema está configurado para operar los módulos de procesamiento de muestras para realizar inmuno-PCR para determinar la presencia y/o cantidad de uno o más analitos diana y/o para determinar el nivel de una o más secuencias de ADN diana dentro de un cartucho de muestra extraíble correspondiente, donde dicho procesamiento en una muestra dentro del cartucho de muestra extraíble correspondiente realiza un método como se describió anteriormente.
Dicho sistema puede configurarse para contener un módulo de procesamiento de muestras. Dicho sistema puede estar configurado para contener al menos dos módulos de procesamiento de muestras, o al menos 4 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 8 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 12 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 16 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 20 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 24 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 28 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 32 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 64 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 128 módulos de procesamiento de muestras. Dichos módulos pueden comprender una o más placas de calentamiento para calentar una cámara o canal con control de temperatura en dicho cartucho. Dichos módulos pueden comprender un ventilador configurado para enfriar un canal o cámara con control de temperatura en dicho cartucho. Dichos módulos pueden comprender circuitos para pasar información (por ejemplo, información óptica) a un ordenador para su análisis. Dichos módulos pueden comprender bloques ópticos para proporcionar excitación y/o detección de una o más señales ópticas producidas por reacciones en dicho cartucho. Dicho sistema puede configurarse para operar dicho cartucho para realizar una inmuno-PCR. Dicho sistema puede configurarse para operar dicho cartucho para realizar una amplificación de un ácido nucleico que no sea un ADN señal.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un kit para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho kit: un recipiente que contiene un cartucho como se describió anteriormente. Dicho kit puede comprender además un recipiente que contiene uno o más reactivos para preparar una muestra para inmuno-PCR.
Dicho kit puede comprender además un recipiente que contiene uno o más reactivos para preparar una muestra para una amplificación de ácido nucleico. Dichos uno o más reactivos para preparar una muestra para una amplificación de ácido nucleico pueden comprender una solución de lisis para suero, o plasma o una muestra FFPE. Dichos uno o más reactivos para preparar una muestra para una amplificación de ácido nucleico pueden comprender proteinasa K. Dicho kit puede contener materiales instructivos que enseñan el uso de dicho cartucho para la realización de inmuno-PCR. Dicho kit puede contener material instructivo que enseñe el uso de dicho cartucho para realizar una amplificación de ácido nucleico además de dicha inmuno-PCR.
En diversas realizaciones, se proporcionan dispositivos y métodos que facilitan la detección y/o cuantificación rápida de un polipéptido (u otro analito) usando inmuno-PCR. En determinadas realizaciones, los dispositivos también proporcionan detección y/o cuantificación de un ácido nucleico de interés (que no sea un ADN señal de inmuno-PCR) mediante PCR u otros métodos de amplificación. En vista de la capacidad de detectar y/o cuantificar polipéptidos (u otros analitos) y ácidos nucleicos, los dispositivos proporcionados en este documento permiten la detección y/o cuantificación de un analito diana (por ejemplo, polipéptido) y, opcionalmente, un ensayo reflejo para un ácido nucleico relevante, o por el contrario la detección y/o cuantificación de un ácido nucleico diana y un ensayo reflejo para un polipéptido relevante. En determinadas realizaciones, se proporcionan cartuchos de reacción automatizados que facilitan la inmuno-PCR rápida y precisa, así como la detección de ácido nucleico (por ejemplo, a través de qPCR) como son los métodos que utilizan el cartucho o cartuchos de reacción automatizada para facilitar la detección y/o cuantificación de uno o más analitos diana (por ejemplo, polipéptido o polipéptidos) y, opcionalmente, una o más dianas de ácido nucleico.
En determinadas realizaciones, los cartuchos descritos en el presente documento realizan la totalidad o parte de una o más reacciones de inmuno-PCR que incluyen, pero no se limita a, formatos tipo sándwich directos e indirectos. En determinadas realizaciones, los cartuchos proporcionan la preparación del inmunoconjugado diana y, opcionalmente, la eliminación del complejo inmune completo, o la eliminación del anticuerpo que está marcado con el ADN señal, o la eliminación del ADN señal del inmunoconjugado unido, que posteriormente puede ser separado y cualquiera de estas fracciones se pueden analizar por separado, por ejemplo, en un cartucho de PCR o en un sistema de PCR de mesa. En determinadas realizaciones, los cartuchos proporcionan el ensayo de inmuno-PCR completo que incluye la amplificación y detección y/o cuantificación del producto amplificado. En determinadas realizaciones, los cartuchos también proporcionan un análisis de ácido nucleico (por ejemplo, preparación, amplificación y detección y/o cuantificación) de un ácido nucleico (por ejemplo, ARN, ADN) otro u otros ADN señal utilizados en la o las reacciones de inmuno-PCR. En determinadas realizaciones, el aislamiento y la purificación del analito diana que se va a analizar mediante inmuno-PCR y, opcionalmente, el ácido nucleico adicional que se va a analizar.
Hay varias ventajas en la automatización del análisis de inmuno-PCR, que incluyen, por ejemplo, la reducción del tiempo de procesamiento general, mejoras en la eficiencia, disminución de errores del usuario y variabilidad, minimización de la pérdida entre etapas y una capacidad mejorada para usar cantidades más pequeñas de muestra. El uso de un proceso basado en cartuchos, como se describe en este documento, permite realizar pruebas rápidas y sencillas de múltiples tipos de muestras. Además, la capacidad de realizar análisis de ácidos nucleicos (por ejemplo, qPCR de ARN o ADN) en la misma muestra permite realizar un ensayo reflejo eficaz con un compromiso mínimo de tiempo y recursos y se cree que proporciona umbrales de detección y precisión mejorados.
Los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento encuentran uso en un amplio número de contextos. Por ejemplo, la inmuno-PCR se puede usar para identificar la presencia y/o cuantificar cualquiera de una serie de microorganismos, incluidos, pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, protozoos, que incluyen, pero no se limitan a, cualquier forma/especie/cepa patógena de tales microorganismos.
En determinadas realizaciones, la inmuno-PCR se puede usar para identificar toxinas producidas por cualquiera de estos microorganismos, incluidos, pero no se limitan a, la toxina shiga, toxina A y toxina B de Clostridium difficile, neurotoxina botulínica A y B, diversas micotoxinas y similares. Los dispositivos y métodos de inmuno-PCR del presente documento se pueden usar para identificar marcadores de inflamación de respuesta del huésped como IL-8, calprotectina y lactoferrina asociados con infección por Clostridium difficile (véase, por ejemplo, Swale et al. (2014) PLoS UNO 9(8): e106118). Los dispositivos y métodos de inmuno-PCR descritos en este documento se pueden usar para identificar varios tipos de cáncer o marcadores de cáncer y para identificar células cancerosas o microorganismos que muestran resistencia a los fármacos (por ejemplo, MRSa , tuberculosis resistente a los fármacos, células cancerosas resistentes a la doxorrubicina o la gentamicina, y similares). Los ensayos de inmuno-PCR encuentran uso, pero no se limita a, en el campo médico, así como en estudios ambientales (por ejemplo, para filtrar el agua y los contaminantes del suelo), y en el campo de la agricultura (por ejemplo, para cribar carne de vacuno, aves de corral, diversos cultivos alimentarios y similares).
Debido a que, en varias realizaciones, los cartuchos descritos en el presente documento permiten tanto un análisis de inmuno-PCR (de uno o más analitos diana) como un análisis de ácido nucleico (de uno o más ácidos nucleicos diana), es posible realizar primero un ensayo de inmuno-PCR diana y luego realizar un ensayo reflejo para un ácido nucleico relacionado, o primero analizar un ácido nucleico diana y luego realizar un ensayo de inmuno-PCR reflejo para un analito diana relacionado. La capacidad de realizar rápidamente dichos ensayos reflejos esencialmente en la misma muestra mejora la sensibilidad del ensayo (por ejemplo, en particular cuando los patrones de transcripción y traducción no siempre se correlacionan positivamente) y puede reducir la aparición de falsos positivos.
Métodos de inmuno-PCR.
La inmuno-PCR (I-PCR) combina la versatilidad de ELISA con el poder de amplificación exponencial y la sensibilidad de la PCR, lo que conduce a un aumento de la sensibilidad en comparación con un ELISA análogo. La inmuno-PCR es similar a ELISA, que detecta una interacción antígeno-anticuerpo, pero en lugar de usar un anticuerpo conjugado con enzima, el anticuerpo se marca con un fragmento de ADN (un ADN señal), que puede amplificarse, por ejemplo, mediante PCR. Aunque ELISA es el método más utilizado para la detección de antígenos, a menudo falla cuando hay una baja concentración del antígeno diana. La PCR se usa ampliamente como técnica de laboratorio de rutina para la detección de moléculas de ácido nucleico, pero no puede detectar moléculas que no sean de ácido nucleico.
La inmuno-PCR es un método versátil que permite la detección de antígenos proteicos (u otros) y los anticuerpos que se generan contra esos antígenos. La inmuno-PCR se ha explorado ampliamente para la detección de una variedad de moléculas biológicas que incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, marcadores tumorales, receptores de células T, angiotensinógeno, toxinas, hormonas y biomarcadores para enfermedades autoinmunes y de Alzheimer. Se puede adaptar como una nueva herramienta de diagnóstico para la detección de antígenos y anticuerpos microbianos. véase, por ejemplo, Niemeyer et al. (2005) Trends Biotechnol. 23: 208-216; Niemeyer et al. (2007) Nat. Protoc. 2: 1918-1930; Malou y Raoult (2011) Trends Microbiol. 19: 295-302; Potucková et al. (2011) J. Immunol. Meth. 371: 38-47; Mehta et al. (2012) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72: 166-174; y similares). La inmuno-PCR se ha utilizado para detectar una variedad de proteínas virales y bacterianas (por ejemplo, antígeno de rotavirus VP6 (véase, por ejemplo, Adler et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 333: 1289-1294), antígeno p24 del VIH (véase, por ejemplo, Barletta et al. (2004) Am. J. Clin. Patol. 122: 20-27), cápside de norovirus (véase, por ejemplo, Tian y Mandrell (2006) J. Appl. Microbiol. 100: 564-574), y la proteína A de la pared celular de Staphylococcus aureus (véase, por ejemplo, Huang y Chang (2004) Clin. Chem. 50: 1673-1674)). La inmuno-PCR también se ha adaptado y aplicado a la detección de anticuerpos, tal como, para la medición de la inmunoglobulina G (IgG) específica contra las paperas en suero humano. (véase, por ejemplo, McKie et al. (2002) J. Inmunol. Meth. 270: 135-141; y similares).
Varios formatos comúnmente utilizados de inmuno-PCR incluyen, pero no se limitan a, inmuno-PCR directa, inmuno-PCR indirecta, inmuno-PCR en sándwich e inmuno-PCR en sándwich indirecta.
En una inmuno-PCR tipo sándwich tradicional, el antígeno que se va a detectar (analito diana) se une a un anticuerpo de captura adherido a los pocillos de una placa de microtitulación y se intercala entre ese anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección que también se une al antígeno (véase, por ejemplo, Figura 1, izquierda). El anticuerpo de detección tiene un ADN señal adjunto (también conocido como ADN informador) que posteriormente se amplifica para proporcionar una señal de detección. La formación del "sándwich" (Ab de captura-analito-Ab de detección-ADN señal) proporciona un complejo inmune (IC) (también conocido como inmunoconjugado). Después del lavado para eliminar los materiales no unidos y/o los materiales unidos de forma no específica, el ADN señal se puede eliminar del anticuerpo de detección, o el complejo inmune se puede romper para liberar el anticuerpo de detección que porta el ADN señal para la posterior amplificación y detección y/o cuantificación del producto de amplificación del ADN señal que proporciona una indicación de la presencia y/o cantidad del analito diana. En determinadas realizaciones novedosas descritas en el presente documento, el complejo inmune completo se puede introducir en la reacción de amplificación.
En una inmuno-PCR tipo sándwich indirecta, el antígeno (analito diana) se intercala entre un anticuerpo de captura, generalmente unido a los pocillos de una placa de microtitulación y un anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección, a su vez, se une a un anticuerpo marcador que tiene un ADN señal adjunto (también conocido como ADN informador) que posteriormente se amplifica para proporcionar una señal de detección-Ab-marcador-Ab-ADN señal) (véase, por ejemplo, la Figura 1, derecha). La formación del "sándwich marcado" (Ab de captura-analito-Ab de detección-Ab marcador-ADN señal) proporciona un "inmunoconjugado marcado" (también conocido como complejo inmune marcado). Después del lavado para eliminar los materiales no unidos y/o los materiales unidos de forma no específica, el ADN señal se puede eliminar del anticuerpo marcador, o el complejo inmune se puede romper para liberar el anticuerpo marcador que porta el ADN señal para su posterior amplificación y detección y/o cuantificación del producto de amplificación del a Dn señal que proporciona una indicación de la presencia y/o cantidad del analito diana. En determinadas realizaciones novedosas descritas en el presente documento, el complejo inmune marcado completo puede introducirse en la reacción de amplificación.
En inmuno-PCR directa e inmuno-PCR indirecta, se omite el anticuerpo de captura y el analito se une directamente a una superficie, por ejemplo, una superficie de una placa de microtitulación.
Sin estar ligado a una teoría en particular, se cree que los formatos sándwich (por ejemplo, inmuno-PCR en sándwich e inmuno-PCR en sándwich indirecto) son ventajosos sobre la inmuno-PCR directa y la inmuno-PCR indirecta ya que los métodos en sándwich eliminan la necesidad del recubrimiento directo de analitos sobre una superficie, lo que puede disminuir la unión no específica sin comprometer la estabilidad (véase, por ejemplo, Niemeyer et al. (1997) Anal. Biochem. 246: 140-145; Mehta et al. (2012) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72: 166-174; y similares). Sin embargo, mientras que los métodos de inmuno-PCR implementados con cartucho se describen en este documento con respecto a los métodos en sándwich, se reconocerá que en varias realizaciones los formatos se pueden alterar para proporcionar formatos que no sean en sándwich con unión directa del analito o analitos a las perlas y/o a superficies de cámara/canal/matriz.
Como se explica a continuación, se pueden utilizar numerosas estrategias en los métodos de cartucho descritos en el presente documento para la unión y/o liberación del ADN señal.
También se apreciará que la inmuno-PCR como se describe en el presente documento no se limita únicamente a la amplificación por PCR del ADN señal. Otros métodos de amplificación también se contemplan en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción de detección de la ligasa (LDR), amplificación de sonda dependiente de ligadura multiplex (MLPA), ligadura seguida de amplificación por Q-replicasa, extensión de cebador, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA), amplificación por círculo rodante (RCA), ensayo de la ligasa de proximidad (PLA) y similares.
Métodos de inmuno-PCR basada en cartucho.
En diversas realizaciones, la inmuno-PCR y, opcionalmente, un análisis de ácido nucleico (por ejemplo, qPCR) de un ácido nucleico distinto del ADN señal utilizado para la inmuno-PCR, se realiza en un cartucho. En determinadas realizaciones en las que se realizan tanto una inmuno-PCR como un análisis de ácido nucleico, ambos ensayos se pueden realizar en el mismo cartucho.
En determinadas realizaciones, la unión del analito diana (por ejemplo, un polipéptido), la formación de un complejo inmune en sándwich (o un complejo inmune en sándwich marcado en el caso de un ensayo indirecto), la liberación de un ADN señal y la subsiguiente amplificación y detección y/o cuantificación del ADN señal (que proporciona una medida de la presencia y/o la cantidad del analito diana) se realiza todo en un solo cartucho. De manera similar, cuando se realiza adicionalmente un análisis de ácido nucleico, la limpieza y la amplificación y la detección y/o cuantificación del ácido nucleico amplificado pueden realizarse todas en el mismo cartucho.
Para inmuno-PCR, la muestra, opcionalmente preparada en un tampón/solución compatible con inmuno-PCR, se introduce en una cámara de muestra en el cartucho. El cartucho normalmente contiene uno o más, o todos los reactivos necesarios para realizar una reacción de inmuno-PCR directa o una reacción de inmuno-PCR indirecta. En determinadas realizaciones, el cartucho comprende uno o más o todos los reactivos para detectar una pluralidad de analitos usando inmuno-PCR. Así, por ejemplo, el cartucho puede contener anticuerpos de captura y/o detección para 2, o 3, o 4, o 5, o 6, o 7, o 8, o 9, o 10 o más analitos diana diferentes.
En determinadas realizaciones, el cartucho se coloca en un módulo de procesamiento y el ensayo de inmuno-PCR se inicia haciendo clic en un conjunto de selecciones dentro del software que controla el módulo de procesamiento (véase, por ejemplo, las Figuras 10A y 10B). A continuación, el cartucho realiza el o los ensayos de inmuno-PCR. En determinadas realizaciones también se realiza el análisis de ácido nucleico (por ejemplo, detección y/o cuantificación de ADN o ARN). Mientras que en determinadas realizaciones, todas las operaciones se realizan en el cartucho, en otras realizaciones, los subconjuntos de las diversas operaciones se realizan en el cartucho, por ejemplo, como se describe a continuación.
En diversas realizaciones ilustrativas, pero no limitativas, la muestra puede comprender cualquier material del que se sospeche que contiene el o los analitos que se van a detectar. En determinadas realizaciones, la muestra puede comprender una cantidad de material de una fuente biológica, ambiental, médica o del paciente donde se busca la detección o medición del o los analitos diana (por ejemplo, polipéptidos, moléculas orgánicas pequeñas, azúcares, lectinas, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.). En varias realizaciones, la "muestra" comprende un espécimen o cultivo (por ejemplo, cultivos microbiológicos). En determinadas realizaciones, comprende una muestra biológica de un ser humano o un animal no humano, tal como un fluido biológico, un sólido biológico (por ejemplo, heces), células o tejido. En determinadas realizaciones, la muestra comprende un material biológico tomado de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano o un animal) tal como heces, plasma, suero, sangre, saliva, líquido amniótico, moco, orina, jugo pancreático, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, biopsias de piel, bronquios y/o o aspirados traqueales, aspirados con aguja, biopsias por punción, secciones crioconservadas, secciones FFPE y similares. En determinadas realizaciones, la muestra comprende un alimento líquido o sólido y un producto alimenticio (por ejemplo, productos lácteos, verduras, carnes y subproductos cárnicos, etc.). En determinadas realizaciones, la muestra comprende una muestra ambiental tal como materia superficial, suelo, agua y/o vegetación. En determinadas realizaciones, la muestra puede comprender un material del que se sospecha que contiene una bacteria, un virus, un protozoo u otro patógeno.
En varias realizaciones, la inmuno-PCR ilustrativa basada en cartuchos que utiliza un ensayo directo implica proporcionar una muestra en una cámara receptora de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR (por ejemplo, como se describe a continuación) y usar el cartucho para:
1) poner en contacto el analito (si está presente en la muestra) con un anticuerpo de captura en condiciones en las que el anticuerpo de captura se une al analito formando un complejo de anticuerpo de captura/analito;
2) poner en contacto el analito con un anticuerpo de detección unido a un ADN señal en condiciones en las que el anticuerpo de detección se une específicamente y forma un complejo inmune con el complejo anticuerpo de captura/analito;
3) liberar el complejo inmune o una parte del mismo que comprende el ADN señal y administrar el complejo inmune o una parte del mismo en un canal o cámara con control de temperatura; y
4) realizar una amplificación de ácido nucleico en el canal o cámara con control de temperatura para detectar y/o cuantificar el ácido nucleico señal, detectando y/o cuantificando así el analito.
En determinadas realizaciones, la inmuno-PCR ilustrativa basada en cartuchos que utiliza un ensayo indirecto implica proporcionar una muestra en una cámara receptora de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR (por ejemplo, como se describe a continuación) y usar el cartucho para:
1) proporcionar una muestra en una cámara de recepción de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR; y usando el cartucho:
2) poner en contacto el analito (si está presente en la muestra) con un anticuerpo de captura en condiciones en las que el anticuerpo de captura se une al analito formando un complejo de anticuerpo de captura/analito;
3) poner en contacto el analito con un anticuerpo de detección cuando el contacto se realiza en condiciones en las que el anticuerpo de detección se une específicamente y forma un complejo inmune con el complejo anticuerpo de captura/analito;
4) poner en contacto el complejo inmune con un anticuerpo marcador que se une al anticuerpo de detección donde el anticuerpo marcador se une a un ADN señal y el contacto se realiza en condiciones en las que el anticuerpo marcador se une específicamente al anticuerpo de detección para formar un complejo inmune marcado;
5) liberar el complejo inmune marcado o una parte del mismo que comprende el ADN señal y administrar el complejo inmune o una parte del mismo en un canal o cámara con control de temperatura; y
6) realizar una amplificación de ácido nucleico en el canal o cámara con control de temperatura para detectar y/o cuantificar el ácido nucleico señal, detectando y/o cuantificando así el analito.
En diversas realizaciones, la amplificación de ácido nucleico comprende un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción de detección de la ligasa (LDR), amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex (MLPA), ligadura seguida por amplificación por Q-replicasa, extensión de cebadores, amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación de desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA) y amplificación de círculo rodante (RCA).
La inmuno-PCR se puede implementar en el cartucho usando cualquiera de varios formatos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura se une a la pared de una cámara de reacción o a un material de la matriz (por ejemplo, sílice) en una cámara en el cartucho y la unión del analito inmoviliza el analito en dicha cámara de reacción o material de la matriz. El anticuerpo de detección se une y, en el caso de un ensayo indirecto, se une un anticuerpo marcador, el inmunoconjugado resultante o el inmunoconjugado marcado se lava para eliminar los materiales no unidos y/o el material unido no específicamente y se libera el ADN señal (unido al anticuerpo de detección en un ensayo directo o unido a un anticuerpo marcador en un ensayo indirecto), por ejemplo, como se describe a continuación, para su posterior amplificación.
En varias realizaciones, sin embargo, el anticuerpo de captura se une a una partícula (por ejemplo, una partícula de látex, una partícula de sílice, una partícula de teflón, una partícula de metal noble (por ejemplo, Au), una partícula magnética, etc.), por ejemplo, como se ilustra en la Figura 2. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura se une directamente a la partícula (por ejemplo, a través de la reacción entre los grupos funcionales de la partícula y el anticuerpo, o el anticuerpo de captura se conjuga químicamente con el anticuerpo (por ejemplo, a través de un enlazador bifuncional (por ejemplo, un enlazador heterobifuncional)), o el anticuerpo se une a la partícula mediante una reacción de biotina/avidina.
El anticuerpo de captura unido a la partícula se une a un analito que luego puede unirse a un anticuerpo de detección formando un complejo inmune (o, en el caso de un ensayo indirecto, un complejo inmune marcado). Se observa que la Figura 2 ilustra un complejo inmune producido por un ensayo en sándwich directo. Después del lavado, se libera el ADN señal (por ejemplo, como se describe a continuación) y se amplifica para la detección (véase, por ejemplo, la Figura 3).
En determinadas realizaciones, la partícula no está unida a una superficie y se forman el complejo inmune <partícula>-<Ab de captura>-<analito>-<Ab de detección-ADN señal> o el complejo inmune marcado <partícula>-<Ab de captura>-<analito>-<Ab de deteccion>-<Ab marcador-ADN señal> en solución/suspensión. El complejo inmune resultante o el complejo inmune marcado se puede inmovilizar, por ejemplo, mediante la unión química de la partícula a un sustrato tal como un material de la matriz como se describe en el presente documento (por ejemplo, a través de una interacción biotina/avidina) o el complejo inmune resultante o el complejo inmune marcado puede inmovilizarse mediante un simple atrapamiento mecánico y/o adsorción en un sustrato poroso tal como un material de la matriz descrito en este documento.
Los mecanismos de liberación del ADN señal dependen del esquema de acoplamiento particular utilizado para unir el ADN señal al anticuerpo de detección o, en el caso de un ensayo indirecto, al anticuerpo marcador. En diversas realizaciones, el complejo inmune completo o el complejo inmune marcado completo, o una parte del complejo inmune o del complejo inmune marcado, o un ADN señal o un fragmento de un ADN señal se libera y se suministra a un canal o cámara con control de temperatura para amplificación.
La Figura 4, paneles A-D, muestra algunos métodos ilustrativos, pero no limitativos, de acoplamiento de un ADN señal a un anticuerpo de detección o a un anticuerpo marcador. Como se ilustra en la Figura 4, panel A, en determinadas realizaciones, el ADN señal puede conjugarse químicamente con el anticuerpo de detección (o anticuerpo marcador).
Típicamente, se utiliza un enlazador para conjugar químicamente un anticuerpo con un ácido nucleico. Generalmente, el enlazador comprende un grupo funcional. Los grupos funcionales incluyen enlazadores monofuncionales que comprenden un grupo reactivo así como enlazadores multifuncionales que comprenden dos o más grupos reactivos capaces de formar un enlace con dos o más dianas funcionales diferentes. En algunas realizaciones, los enlazadores multifuncionales son enlazadores heterobifuncionales que comprenden dos o más grupos reactivos diferentes.
Los grupos reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, tiol (-SH), carboxilato (COOH), carboxilo (-COOH), carbonilo, amina (NH2), hidroxilo (-OH), aldehído (-CHO), alcohol (ROH), cetona (R2CO), hidrógeno activo, éster, sulfhidrilo (SH), fosfato (-PO3), o fracciones fotorreactivas. Los grupos reactivos de amina incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, isotiocianatos, isocianatos, azidas de acilo, ésteres de NHS, cloruros de sulfonilo, aldehídos y glioxales, epóxidos y oxiranos, carbonatos, agentes arilantes, imidoésteres, carbodiimidas y anhídridos. Los grupos reactivos con tiol incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a derivados de haloacetilo y haluros de alquilo, maleimidas, aziridinas, derivados de acriloilo, agentes de arilación y reactivos de intercambio tiol-disulfuros. Los grupos reactivos de carboxilato incluyen, pero no se limitan por ejemplo a, diazoalcanos y compuestos de diazoacetilo, tales como carbonildiimidazoles y carbodiimidas. Los grupos reactivos hidroxilo incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a epóxidos y oxiranos, carbonildiimidazol, oxidación con peryodato, carbonato de N,N'-disuccinimidilo o cloroformiato de N-hidroxilsuccimidilo, oxidación enzimática, halógenos de alquilo e isocianatos. Los grupos reactivos aldehído y cetona incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, derivados de hidracina para la formación de bases de Schiff o aminación por reducción. Los grupos reactivos de hidrógeno activo incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a derivados de diazonio para reacciones de condensación y yodación de Mannich. Los grupos fotorreactivos incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a azidas de arilo y azidas de arilo halogenadas, benzofenonas, compuestos diazo y derivados de diazirina.
Otros grupos reactivos adecuados y clases de reacciones útiles para formar conjugados químicos incluyen los que son bien conocidos en la técnica de la química de bioconjugados. Las clases de reacciones preferidas actualmente para la conjugación química de anticuerpos incluyen, pero no se limitan, a sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), sustituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se analizan, por ejemplo, en March (1985) Advanced Organic Chemistry, 3.a edición, John Wiley & Sons, Nueva York, Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego; y Feeney et al. (1982) Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C.
En determinadas realizaciones, el enlazador normalmente es capaz de formar enlaces covalentes tanto con una molécula o moléculas, por ejemplo, el anticuerpo y el ácido nucleico. Los enlazadores particularmente adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores de carbono heterocíclicos o enlazadores peptídicos. En determinadas realizaciones, los enlazadores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes del anticuerpo a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace disulfuro a la cisteína). Sin embargo, en determinadas realizaciones, los enlazadores se unirán al carbono alfa de los grupos amino y carboxilo de un aminoácido terminal en el anticuerpo.
En determinadas realizaciones, se puede usar un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en el anticuerpo y otro grupo reactivo en el ácido nucleico para formar el conjugado deseado. Alternativamente, se puede realizar la derivatización para proporcionar grupos funcionales. Así, por ejemplo, también se conocen procedimientos para la generación de grupos sulfhidrilo libres en péptidos (véase la patente de los Estados Unidos No. 4,659,839).
En determinadas realizaciones, el agente de enlace es un enlazador heterobifuncional que comprende dos o más grupos reactivos diferentes. Por ejemplo, un enlazador heterobifuncional tal como cisteína puede comprender un grupo reactivo amina y un grupo reactivo tiol puede interactuar con un aldehído en un péptido derivatizado. En determinadas realizaciones, los enlazadores se pueden acoplar a una lisina. Las combinaciones adicionales de grupos reactivos adecuados para enlazadores heterobifuncionales incluyen, por ejemplo, grupos reactivos amina y sulfhidrilo; grupos reactivos carbonilo y sulfhidrilo; grupos amina y fotorreactivos; grupos sulfhidrilo y fotorreactivos; grupos carbonilo y fotorreactivos; grupos carboxilato y fotorreactivos; y arginina y grupos fotorreactivos. En determinadas realizaciones, los enlazadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, 4-hidrazinonicotinato de succinimidilo acetona hidrazona (SANH) o 4-(n-maleimidometilo)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), y similares
Se conocen muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para unir varias moléculas a péptidos o proteínas. (véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea No. 188,256; las patentes de Estados Unidos Nos. 4,671,958; 4,659,839; 4,414,148; 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789 y 4,589,071; y Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071­ 4075; van Buggenum et al. (2106) Sci. Rep., 6: 22675; Gong et al. (2015) Bioconjug. Chem., 27: 217-227; y similares).
En determinadas realizaciones, el enlazador que une el ADN marcador al anticuerpo de detección (o al anticuerpo marcador) es un enlazador no escindible.
Como alternativa a la conjugación química, el anticuerpo se puede unir al ácido nucleico mediante una interacción avidina/biotina (véase, por ejemplo, la Figura 4, panel B). Tales interacciones incluyen, pero no se limitan a, interacciones avidina/biotina, interacciones estreptavidina/biotina, interacciones neutravidina/biotina y similares. Las interacciones de avidina biotina son esencialmente irreversibles bajo condiciones químicas relevantes.
En determinadas realizaciones, particularmente cuando la unión del ADN señal al anticuerpo no es escindible, el suministro del ADN señal al sitio de reacción de amplificación (por ejemplo, un canal o cámara con control de temperatura) se puede lograr simplemente administrando el complejo inmune completo (o el complejo inmune marcado) a la reacción de amplificación. Así, por ejemplo, cuando el complejo inmune se forma en una partícula como se describe en el presente documento, la partícula se puede eluir de forma inversa simplemente desde su atrapamiento mecánico (por ejemplo, en el material de la matriz). Al invertir la dirección del flujo (desde la dirección donde inicialmente se suministró el complejo inmune unido a partículas, se liberará una cantidad suficiente de complejo inmune para la detección en una reacción de amplificación.
En determinadas realizaciones, el complejo inmune puede romperse simplemente para liberar el anticuerpo de detección que porta el ADN señal o el anticuerpo marcador que porta el ADN señal y el ADN señal unido al anticuerpo se suministra a la reacción de amplificación. Los métodos para romper un complejo anticuerpo/analito son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, calentar el complejo de anticuerpo/analito o someter el complejo de anticuerpo/analito a una solución básica (por ejemplo, k Oh ). En determinadas realizaciones, el complejo de anticuerpo/analito se puede romper usando, por ejemplo, condiciones de alto contenido de sal, condiciones desnaturalizantes tales como SDS/urea (por ejemplo, 8 M), glicina*HCl y similares.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une al ADN señal utilizando un enlazador escindible. Los expertos en la técnica conocen numerosos enlazadores escindibles. (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos.
4,618,492; 4,542,225, 4,625,014, y similares). Los enlazadores escindibles ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, enlazadores lábiles a ácidos, enlazadores lábiles a bases, enlazadores escindibles por proteasa, enlazadores disulfuro y similares. Los enlazadores lábiles a los ácidos están diseñados para ser estables a un pH aproximadamente neutro, pero se vuelven inestables y se degradan en condiciones de pH bajo. Los enlazadores escindibles por proteasa están diseñados para ser susceptibles a varias proteasas que se pueden proporcionar en el cartucho para efectuar tal escisión. Un enlazador escindible por proteasa ilustrativo, pero no limitativo, comprende un enlace Val-Cit que se hidroliza rápidamente por varias catepsinas. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro pueden escindirse fácilmente utilizando, por ejemplo, ditiotreitol (DTT) o tris(2-carboxietil)fosfina (TECP).
En una realización ilustrativa, pero no limitativa, la conjugación de un anticuerpo a un ADN señal se puede lograr utilizando una cicloadición de alquino-azida (la reacción clic sin Cu), donde el anticuerpo se activa con una fracción dibenzociclooctino (DBCO) y posteriormente unido covalentemente con un ADN modificado con azida (véase, por ejemplo, Gong et al. (2015) Bioconjug. Chem., 27: 217-225). El enlazador puede incorporar fácilmente un enlace escindible por proteasa, un enlace disulfuro y similares. En otro enfoque ilustrativo, pero no limitativo, los anticuerpos se funcionalizan con NHS-s-s-tetrazina químicamente escindible. El ADN de doble cadena se funcionaliza con TCO mediante la adición enzimática de N3-dATP y acoplamiento a trans-cicloocteno-PEG-dibenzociclooctino. Luego, los conjugados se obtienen de manera eficiente al mezclar los anticuerpos funcionalizados y el ADNbc en proporciones molares bajas de, por ejemplo, 1:2 (véase, por ejemplo, van Buggenum et al. (2016) Sci. Rep., 6: 22675). En determinadas realizaciones, el PEG que comprende el enlazador es un PEG12.
Cuando el anticuerpo se une al ADN señal mediante un enlazador escindible, el cartucho puede contener los reactivos (por ejemplo, proteasa, DTT, ácido, base, etc.) adecuados para escindir el enlazador. Cuando se va a liberar la señal, se hace funcionar el cartucho para poner en contacto el complejo inmune (o el complejo inmune marcado) con el reactivo de escisión, liberando así el ADN señal que puede transportarse a la reacción de amplificación, por ejemplo, a la cámara o canal de reacción con control de temperatura).
En determinadas realizaciones, el ADN señal se une a una perla que también se une al anticuerpo de detección o al anticuerpo marcador. (véase, por ejemplo, la Figura 4, panel C). Cuando el anticuerpo o el ADN señal se une a la perla mediante un enlazador escindible, el ADN señal puede liberarse de la partícula, o el complejo perla-ADN señal puede liberarse del anticuerpo escindiendo el enlazador, por ejemplo, como se describió anteriormente. Cuando el ADN señal y el anticuerpo se unen a la perla por medios no escindibles (por ejemplo, enlazadores no escindibles, interacciones biotina/avidina, etc.) el complejo anticuerpo/analito puede romperse, por ejemplo, como se describió anteriormente, liberando así la fracción de anticuerpo de detección-perla-ADN señal o la fracción de anticuerpo marcador-perla-ADN señal que se puede suministrar a la reacción de amplificación. En determinadas realizaciones, el calor puede ser suficiente para liberar el ADN señal de la perla.
En determinadas realizaciones, por ejemplo, cuando el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo, o cuando el ADN señal se une al anticuerpo mediante una interacción biotina/avidina, o cuando el anticuerpo y el ADN señal se unen a una perla, una secuencia de ADN señal puede liberarse mediante la escisión de una porción del ADN señal. En determinadas realizaciones, el ADN señal se puede preparar de manera que incorpore un nucleótido que se escinda fácilmente utilizando un reactivo químico. Así, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,610,492 describe ácidos nucleicos que comprenden cualquiera de varios nucleótidos, una base nitrogenada heterocíclica modificada que se escinde fácilmente. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico se escinde utilizando una base química, en particular una base que comprende una amina. Las bases ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, 3-pirrolidinol, 2-pirrolidinametanol, 3-pirrolidinametanol, 4-hidroxipiperidina, 4-piperidinaetanol y similares.
En determinadas realizaciones, el ADN señal se proporciona con una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una endonucleasa de restricción (un sitio de restricción). Poner en contacto el ADN señal con la endonucleasa de restricción correspondiente escinde el ADN señal. Típicamente, cuando se va a escindir el ADN señal, el ADN señal se diseña de modo que el fragmento escindido tenga suficiente longitud e identidad de secuencia para permitir la amplificación y detección.
En otra realización ilustrativa, pero no limitativa, el conjugado de anticuerpo-ADN señal se puede crear usando el cierre Tus-Ter (véase, por ejemplo, Morín et al. (2011) Analyst, 136(22): 4815-4821. En este enfoque, la secuencia peptídica Tus (también conocida como sustancia de utilización terminal) se fusiona con un anticuerpo y el ADN señal se proporciona con una secuencia Ter. La secuencia Ter está unida por el péptido Tus proporcionando así un inmunoconjugado. En determinadas realizaciones, el ADN señal se pone en contacto con el anticuerpo de detección o el anticuerpo marcador después de la formación del complejo inmune. En otras realizaciones, la inmunoconjugación Tus-Ter se proporciona antes de la formación del complejo inmune.
En otro enfoque, el anticuerpo de detección o el anticuerpo marcador se expresa en la superficie de un fago (por ejemplo, un fago filamentoso) y el ADN señal se proporciona dentro del fago (véase, por ejemplo, la Figura 4, panel D). Después de la formación del complejo inmune o complejo inmune marcado, el ADN señal se libera mediante lisis del fago utilizando calor y/o reactivos líticos. El ADN señal liberado se entrega luego a la reacción de amplificación.
En varias realizaciones, la amplificación de uno o más ADN señal comprende someter una mezcla de reacción que contiene el o los ADN señal a condiciones de amplificación y monitorizar una señal (por ejemplo, una señal óptica) de un indicador en la mezcla de reacción. En determinadas realizaciones, la señal comprende una señal óptica seleccionada del grupo que consiste en una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal electroquimioluminiscente y una señal colorimétrica. En determinadas realizaciones, la señal óptica comprende una señal óptica fluorescente generada por un indicador fluorescente. En determinadas realizaciones, el indicador fluorescente es un colorante intercalado no específico que se une a productos de ADN de doble cadena, mientras que en otras realizaciones, el indicador fluorescente comprende una sonda específica de la secuencia diana. En determinadas realizaciones, la sonda específica de la secuencia diana se selecciona del grupo que consiste en una sonda TAQMAN, una sonda SCORPION y una MOLECULAR BEACON.
En determinadas realizaciones, la inmuno-PCR se realiza en una pluralidad de analitos diferentes (por ejemplo, al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6 analitos diferentes) en el mismo cartucho. En determinadas realizaciones, cada analito que comprende dicha pluralidad de analitos se deriva de la misma muestra en dicho cartucho. En determinadas realizaciones, los ADN señal que representan a cada uno de los analitos que comprenden la pluralidad se amplifican secuencialmente en el mismo canal o cámara con temperatura controlada. En determinadas realizaciones, la cámara se "lava" y "limpia" entre las reacciones de amplificación para reducir o evitar la contaminación cruzada entre las reacciones de amplificación. Así, por ejemplo, en determinadas realizaciones, el canal o cámara con control de temperatura se lava con una solución de lavado. En determinadas realizaciones, después de retirar la solución de lavado, se transfiere aire al canal o cámara con control de temperatura y el canal o cámara se calienta a una temperatura igual o superior a la temperatura de desnaturalización del ADN (por ejemplo, de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 99 °C).
En determinadas realizaciones, los ADN señal que representan a cada uno de los analitos que comprenden la pluralidad se amplifican simultáneamente cada uno en un canal o cámara con control de temperatura diferente en dicho cartucho. En determinadas realizaciones, los ADN señal que representan cada uno de los analitos que comprenden dicha pluralidad se amplifican simultáneamente en el mismo canal o cámara con control de temperatura en el cartucho y la amplificación de cada ADN señal proporciona una señal óptica diferente y distinguible.
En determinadas realizaciones, la inmuno-PCR basada en cartucho se puede realizar usando uno o más agentes de bloqueo para reducir o prevenir la unión no específica.
Los agentes de bloqueo ilustrativos incluyen, pero no se limita a, varios polímeros y/o detergentes y/o carbohidratos (por ejemplo, PEG, Pluronics F68/F108/F127 (se prefiere F68), PVP, Biolipidure 802 (NOF America), Tween 20 u 80, TEGME (tre(etilenglicol)monoetil éter), TEG (tegraetilenglicol) y similares) y/o diversas proteínas y/o tensioactivos y/o polisacáridos (por ejemplo, caseína, BSA, IgG de cabra, IgG bovina, Stabilcoat (ThermoFisher), iota-carragenano, sulfato de dextrano, suero de ratón y similares).
Como se indicó anteriormente, los métodos de inmuno-PCR realizados en un cartucho como se describe en este documento son típicamente significativamente más rápidos y sustancialmente menos laboriosos que los métodos tradicionales de inmuno-PCR. En determinadas realizaciones, el método se puede completar en aproximadamente 1 hora o menos, o en aproximadamente 50 minutos o menos, o en aproximadamente 40 minutos o menos, o en aproximadamente 30 minutos o menos, o en aproximadamente 20 minutos o menos, o en aproximadamente 15 minutos o menos.
Inmuno-PCR combinado con amplificación de ácido nucleico.
En diversas realizaciones, los cartuchos proporcionados en el presente documento proporcionan análisis de ácidos nucleicos (por ejemplo, detección y/o cuantificación de un ácido nucleico) además de las reacciones de inmuno-PCR. La capacidad de realizar tanto una reacción de inmuno-PCR como una reacción de amplificación de ácido nucleico en el mismo cartucho permite, entre otros, un análisis de inmuno-PCR de uno o más analitos diana para reflejar un análisis de ácido nucleico de la misma muestra, o por el contrario, un análisis de ácido nucleico de uno o más analitos para reflejar un ensayo de inmuno-PCR.
En determinadas realizaciones, el análisis de ácidos nucleicos se realiza en la misma muestra que la inmuno-PCR, donde el análisis de ácidos nucleicos extrae la muestra de la misma cámara de muestras que el ensayo de inmuno-PCR (véase, por ejemplo, la Figura 10A). En otras realizaciones, el análisis de inmuno-PCR se puede realizar en una muestra extraída de una primera cámara de muestra, mientras que un análisis de ácido nucleico se realiza en una muestra extraída de una segunda cámara de muestra (véase, por ejemplo, la Figura 10B). El último enfoque permite un procesamiento de muestras diferente para las muestras utilizadas en inmuno-PCR y las muestras utilizadas en un análisis de ácido nucleico. Así, por ejemplo, el análisis de ácidos nucleicos puede implicar un aislamiento y/o purificación de ADN que se realiza antes de colocar una muestra en el cartucho o, alternativamente, puede realizarse por el propio cartucho. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la muestra para el análisis de ácidos nucleicos se añade directamente al cartucho de reacción, mientras que en otras realizaciones, la muestra se mezcla con uno o más reactivos. En determinadas realizaciones, la preparación de ADN normalmente implica preparar ADN sustancialmente aislado. Esto puede implicar lisar células para liberar ADN, eliminar partículas y residuos celulares y/o eliminar componentes proteicos para proporcionar una muestra que comprenda ácidos nucleicos sustancialmente puros (por ejemplo, ADN sustancialmente puro y/o una combinación sustancialmente pura de ADN y ARN). En una realización ilustrativa, pero no limitativa, la muestra (por ejemplo, una muestra de tejido) se agrega a un reactivo de lisis, se agita y luego se inserta en el cartucho para su posterior procesamiento. Como alternativa, todo el procesamiento de muestras se realiza en el cartucho.
Por consiguiente, en diversas realizaciones, los métodos de inmuno-PCR basados en cartuchos contemplados en el presente documento comprenden además la amplificación de un ácido nucleico distinto del o de los ADN señal usados en la inmuno-PCR. En determinadas realizaciones, la amplificación de un ácido nucleico distinto de dicho ácido de ADN señal comprende:
unir un ácido nucleico de dicha muestra a un material de la matriz;
lavar el ácido nucleico unido para proporcionar un ácido nucleico lavado;
eluir el ácido nucleico lavado; y
someter el ácido nucleico lavado a una reacción de amplificación para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana si está presente en el ácido nucleico lavado.
En determinadas realizaciones, el ácido nucleico se une al mismo material de la matriz utilizado para unir o bien inmovilizar el inmunoconjugado de inmuno-PCR o el inmunoconjugado marcado. En otras realizaciones, se usa un segundo material de la matriz diferente (por ejemplo, en una segunda cámara/canal diferente) para unir y eluir el ácido nucleico.
En determinadas realizaciones, la amplificación de un ácido nucleico distinto del ADN señal se realiza en ácido o ácidos nucleicos obtenidos de la misma muestra en la cámara de muestra utilizada para dicha inmuno-PCR. En determinadas realizaciones, la amplificación de un ácido nucleico distinto del ADN señal se realiza en ácido o ácidos nucleicos obtenidos de una muestra en una cámara de muestras diferente a la cámara de muestras utilizada para la inmuno-PCR. En determinadas realizaciones, el o los ADN señal y el o los ácidos nucleicos distintos del ADN señal se amplifican secuencialmente en el mismo canal o cámara con control de temperatura. En determinadas realizaciones, el ADN señal se amplifica en el mismo canal o cámara con temperatura controlada antes de la amplificación del ácido nucleico que no sea un ADN señal y en otras realizaciones, el ADN señal se amplifica después de la amplificación del ácido nucleico que no sea un ADN señal. En determinadas realizaciones, el canal y/o la cámara con temperatura controlada se lavan y/o se purgan entre una amplificación de ADN señal de inmuno-PCR y una reacción de amplificación realizada en un ácido nucleico que no sea un ADN señal. En determinadas realizaciones, el lavado comprende lavar el canal o cámara con control de temperatura con una solución de lavado. En determinadas realizaciones, el lavado y la purga comprende retirar la solución de lavado del canal o cámara con control de temperatura, transferir aire al canal o cámara con control de temperatura y calentar el canal o cámara a una temperatura igual o superior a la temperatura de desnaturalización del ADN (por ejemplo, desde aproximadamente 90 °C a aproximadamente 99 °C).
En determinadas realizaciones, el o los ADN señal y el o los ácidos nucleicos distintos del ADN señal se amplifican simultáneamente, cada uno en un canal o cámara diferente con control de temperatura en el cartucho. En determinadas realizaciones, el o los ADN señal y el o los ácidos nucleicos que no sea un ADN señal se amplifican simultáneamente en el mismo canal o cámara con control de temperatura en el cartucho y la amplificación del o los ADN señal y el o los ácidos nucleicos que no sea un ADN señal proporcionan señales diferentes y distinguibles (por ejemplo, señales ópticas diferentes y distinguibles). En determinadas realizaciones, la amplificación de un ácido nucleico que no sea un ADN señal comprende someter una mezcla de reacción que contiene el ácido nucleico que no sea un ADN señal a condiciones de amplificación, y monitorizar una señal (por ejemplo, una señal óptica) de un indicador en la mezcla de reacción. En determinadas realizaciones, la señal comprende una señal óptica seleccionada del grupo que consiste en una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal electroquimioluminiscente y una señal colorimétrica. En determinadas realizaciones, la señal óptica es una señal óptica fluorescente generada por un indicador fluorescente. En determinadas realizaciones, el indicador fluorescente es un colorante intercalado no específico que se une a productos de ADN de doble cadena o comprende una sonda específica de secuencia diana. En determinadas realizaciones, el indicador fluorescente comprende una sonda específica de secuencia diana que se selecciona del grupo que consiste en una sonda TAQMAN, una sonda SCORPIo N y una MOLECULAR BEAc On .
La descripción anterior de métodos de análisis de inmuno-PCR con base en cartucho e inmuno-PCR/ácido nucleico combinados es ilustrativa y no limitativa. Utilizando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica dispondrán de muchos otros métodos de análisis de inmuno-PCR basados en cartuchos e inmuno-PCR/ácido nucleico combinados.
Cartucho, módulos y sistemas para inmuno-PCR y análisis de ácido nucleico opcional.
Cartuchos
En varias realizaciones, se proporcionan cartuchos para realizar los métodos de inmuno-PCR descritos en este documento. En determinadas realizaciones, se proporcionan cartuchos para realizar los métodos de inmuno-PCR descritos en el presente documento, así como la amplificación de uno o más ácidos nucleicos distintos del o los ADN señal usados en las reacciones de inmuno-PCR.
En determinadas realizaciones ilustrativas, pero no limitativas, el cartucho comprende:
una o más cámaras de recepción de muestras;
una o más cámaras que comprenden un material de la matriz que actúa como filtro y/o agente de unión al ADN; uno o más canales o cámaras con control de temperatura; y
una pluralidad de cámaras que contienen reactivos y/o tampones para realizar inmuno-PCR, donde:
la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de captura que se une al analito que se va a detectar;
la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de detección donde el anticuerpo de detección está opcionalmente unido directa o indirectamente a un ADN señal;
la pluralidad de cámaras comprende una o más cámaras que contienen una mezcla maestra de PCR;
la pluralidad de cámaras comprende una o más cámaras que contienen cebadores para amplificar todo o una región del ADN señal de inmuno-PCR; y
la pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una sonda para detectar la totalidad o una región del o los ADN señal de inmuno-PCR.
En determinadas realizaciones, la mezcla maestra de PCR y/o los cebadores y/o la o las sondas están en la misma cámara. En varias realizaciones, los cebadores y/o sondas de PCR y/o polimerasa en la mezcla maestra se proporcionan como perlas. En determinadas realizaciones, el cartucho contiene anticuerpos de detección para la detección de un único analito, mientras que en otras realizaciones el cartucho contiene anticuerpos de detección para la detección de una pluralidad de analitos. En determinadas realizaciones, el cartucho contiene anticuerpos de captura para la captura de un solo analito, mientras que en otras realizaciones, el cartucho contiene anticuerpos de detección para la detección de una pluralidad de analitos. En determinadas realizaciones, la pluralidad de analitos comprende al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10 analitos diferentes.
En determinadas realizaciones, el cartucho de inmuno-PCR contiene uno o más tipos de anticuerpos de captura unidos (por ejemplo, conjugados químicamente o unidos a través de una interacción biotina/avidina, o inmovilizados por una atracción magnética) a la pared o al suelo de una cámara o canal de una cámara de reacción o al material de la matriz. En determinadas realizaciones, el cartucho de inmuno-PCR contiene uno o más anticuerpos de captura unidos a una partícula o partículas (por ejemplo, látex, vidrio, teflón, metal (por ejemplo, metal noble como el oro), semiconductores, magnéticos, etc.). En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura se conjuga químicamente con la partícula (por ejemplo, como se describió anteriormente). En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura se une a la partícula a través de una interacción biotina/estreptavidina. En determinadas realizaciones, el tamaño de la partícula varía desde aproximadamente 0.5 pm, o desde aproximadamente 1 pm hasta aproximadamente 10 pm, o hasta aproximadamente 3 pm, o donde la partícula varía en tamaño desde aproximadamente 1 pm hasta aproximadamente 2.8 pm.
En determinadas realizaciones, la pluralidad de cámaras que comprende el cartucho de inmuno-PCR comprende una o más cámaras que contienen uno o más agentes de bloqueo que pueden reducir la unión no específica. Los agentes de bloqueo ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, varios polímeros y/o detergentes y/o carbohidratos (por ejemplo, PEG, Pluronics F68/F108/F127 (se prefiere F68), PVP, Biolipidure 802 (NOF America), Tween 20 o 80, Te GME (tre(etilenglicol éter monoetílico), TEG (tegraetilenglicol) y similares) y/o diversas proteínas y/o tensioactivos y/o polisacáridos (por ejemplo, caseína, BSA, IgG de cabra, IgG de bovino, Stabilcoat (ThermoFisher), iota-carragenano, sulfato de dextrano, suero de ratón y similares).
En determinadas realizaciones, el cartucho contiene reactivos para un ensayo en sándwich directo (por ejemplo, el cartucho contiene, entre otros, un anticuerpo de captura (que puede estar unido a una partícula) y un anticuerpo de detección que tiene un ADN señal adjunto o que tiene una fracción (por ejemplo, una proteína Tus) configurada para unirse a un ADN señal). En determinadas realizaciones, el cartucho contiene reactivos para un ensayo en sándwich indirecto (por ejemplo, el cartucho contiene, entre otros, un anticuerpo de captura (que puede unirse a una partícula), un anticuerpo de detección y un anticuerpo marcador que tiene un ADN señal adjunto o que tiene una fracción (por ejemplo, una proteína Tus) configurada para unirse a un ADN señal). En determinadas realizaciones, el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo de detección, o cuando el anticuerpo marcador está presente, el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo marcador. En determinadas realizaciones, el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo a través de una cisteína, una lisina o un carbohidrato. En determinadas realizaciones, el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo con un enlazador que comprende un enlazador C6 a C-is, o un enlazador C6 a C12. En determinadas realizaciones, el enlazador es un enlazador cruzado heterobifuncional. En determinadas realizaciones, el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo con 4-hidrazinonicotinato de succinimidilo acetona hidrazona (SANH) o 4-(n-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC). En determinadas realizaciones, el ADN señal se conjuga químicamente con el anticuerpo a través de una modificación de azida del ADN y la unión al anticuerpo a través de una fracción de dibenzociclooctino (DBCO). En determinadas realizaciones, el enlazador comprende un enlazador DBCO-PEG-NHS.
En determinadas realizaciones, el ADN señal se une químicamente al anticuerpo de detección, o cuando un anticuerpo marcador se presente al anticuerpo marcador, con un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, un enlazador que contiene un enlace disulfuro escindible, un enlazador escindible con base y un enlazador escindible con ácido, un enlazador que contiene un sitio de reconocimiento de proteasa/peptidasa o un enlazador que contiene un sitio de restricción. En determinadas realizaciones, el enlazador escindible comprende un enlace disulfuro escindible con DTT. En determinadas realizaciones, el enlazador escindible comprende además una tetrazina.
En determinadas realizaciones, el ADN señal se une al anticuerpo de detección usando una interacción avidina/biotina, o cuando el anticuerpo marcador está presente, el ADN señal se une al anticuerpo marcador usando una interacción avidina/biotina.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo de detección, o el anticuerpo marcador cuando está presente, se une a, por ejemplo, fusionado genéticamente a una proteína Tus y el ADN señal comprende una secuencia Ter que es reconocida y unida por la proteína Tus.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo de detección se une a una perla y el ADN señal está en la misma perla, o cuando el anticuerpo marcador está presente, el anticuerpo marcador se une a una perla y el ADN señal se une a la misma perla (por ejemplo, una perla de oro). En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el ADN señal se conjugan químicamente con la perla (por ejemplo, como se describió anteriormente), mientras que en otras realizaciones, el anticuerpo y/o el ADN señal se unen a la perla a través de una interacción biotina/estreptavidina. En determinadas realizaciones, la perla comprende un material tal como látex, sílice, teflón, un metal noble, un material semiconductor y un material magnético. En determinadas realizaciones, la perla comprende oro.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo de detección se presenta en la superficie de un fago (por ejemplo, un fago de una biblioteca de presentación de fagos) y el ADN señal está contenido dentro del fago, o cuando el anticuerpo marcador está presente, el anticuerpo marcador se presenta en la superficie de un fago y el ADN señal está contenido dentro del fago.
En varias realizaciones, el cartucho está configurado para realizar adicionalmente un análisis (por ejemplo, amplificación y detección y/o cuantificación) de un ácido nucleico que no sea un ADN señal de inmuno-PCR. En dichas realizaciones, la pluralidad de cámaras puede comprender además una cámara que contiene cebadores y/o sondas de PCR para amplificar y detectar un ácido nucleico distinto del ácido nucleico señal.
En determinadas realizaciones, cuando el analito diana comprende un polipéptido, el ácido nucleico distinto del ácido nucleico señal puede comprender un ácido nucleico que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, cuando el analito diana comprende un polipéptido, el ácido nucleico distinto del ácido nucleico señal puede comprender un ácido nucleico característico de una célula, tejido u organismo que produce el polipéptido.
En determinadas realizaciones, el cartucho comprende una o más cámaras que contienen una sonda TAQMAN y/o una sonda SCORPION y/o una MOLECULAR b Ea CON. En determinadas realizaciones, el cartucho comprende una o más cámaras que contienen reactivos para reacciones de PCR TaqMan.
En determinadas realizaciones, el cartucho comprende una o más cámaras que contienen una o más sondas fluorescentes que son marcadores para el ADN señal amplificado y, opcionalmente, una o más sondas fluorescentes que son marcadores para la secuencia amplificada distinta del ADN señal amplificado. En determinadas realizaciones, las sondas comprenden un colorante informador fluorescente y un colorante inhibidor, donde las sondas proporcionan una señal tras la escisión por la actividad nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa Taq. En determinadas realizaciones, los cebadores para amplificar un ácido nucleico distinto del ácido nucleico señal y/o la sonda para detectar un ácido nucleico distinto del ácido nucleico señal se proporcionan como perlas.
En varias realizaciones, el canal o canales o la cámara o cámaras con control de temperatura en el cartucho son canal o canales o cámara o cámaras de termociclado. En diversas realizaciones, el material de la matriz es uno que puede adsorber, unirse químicamente o atrapar mecánicamente un complejo inmune (por ejemplo, un complejo inmune unido a perlas o un complejo inmune marcado unido a perlas). En determinadas realizaciones, el material de la matriz es uno que puede unirse y eluir adicionalmente un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, el material de la matriz comprende un material que se selecciona del grupo que consiste en vidrio o sílice, una resina de intercambio iónico e hidroxiapatita.
En diversas realizaciones ilustrativas, pero no limitativas, la cámara o cámaras receptoras de muestra, la cámara o cámaras que comprenden un material de la matriz, la pluralidad de cámaras que contienen reactivos, y el canal o canales o la cámara o cámaras de calentamiento con control de temperatura, están selectivamente en comunicación fluida. En determinadas realizaciones, la cámara o cámaras receptoras de muestras, la cámara o cámaras que comprenden un material de la matriz, la pluralidad de cámaras que contienen reactivos, y el canal o canales o la cámara o cámaras de calentamiento con control de temperatura, están selectivamente en comunicación fluida mediante canales de microfluidos y válvulas.
En determinadas realizaciones del cartucho, la cámara de recepción de muestras, la cámara que comprende un material de la matriz, la pluralidad de cámaras que contienen reactivos y el canal o cámara de calentamiento con control de temperatura o un puerto en el canal o la cámara con control de temperatura están dispuestos alrededor de una válvula central y selectivamente en comunicación fluida con un canal en la válvula central, donde la válvula central está configurada para acomodar un émbolo que es capaz de extraer fluido dentro o fuera de una cámara en comunicación fluida con la válvula central.
En varias realizaciones, el cartucho está configurado para que, cuando esté en uso, el cartucho comprenda una cámara que contiene una muestra, una cámara que contiene el anticuerpo de detección, una cámara que contiene el anticuerpo de captura, una cámara que contiene un tampón de lavado y una cámara que contiene una mezcla maestra de PCR para amplificar el ADN señal. En determinadas realizaciones, el cartucho, cuando está en uso, comprende una cámara que contiene una muestra, una cámara que contiene el anticuerpo de detección, una cámara que contiene el anticuerpo de captura, una cámara que contiene un tampón de lavado, una cámara que contiene KOH, una cámara que contiene HEPES o Tris-HCl, y una cámara para recibir residuos. En determinadas realizaciones, el cartucho, cuando está en uso, comprende una cámara que contiene una muestra, una cámara que contiene el anticuerpo de detección en PBS a un pH de aproximadamente 7.25, una cámara que contiene el anticuerpo de captura en PBS a un pH de aproximadamente 7.25, una cámara que contiene un tampón de lavado de PBS, una cámara que contiene KOH, una cámara que contiene HEPES a un pH de aproximadamente 8.25 o Tris-HCl a un pH de aproximadamente 7.4, y una cámara para recibir desechos.
En varias realizaciones, el cartucho está configurado de manera que la cámara de recepción de muestras, dicha columna o columnas, la pluralidad de cámaras y el canal o cámara con control de temperatura, están selectivamente en comunicación fluida. En determinadas realizaciones, la comunicación selectiva de fluidos se proporciona mediante válvulas y canales de microfluidos. En determinadas realizaciones, la comunicación selectiva de fluidos se proporciona al proporcionar la cámara receptora de muestras, dicha columna o columnas, dicha pluralidad de cámaras, el canal o cámara de calentamiento o un puerto en el canal o cámara de calentamiento, dispuestos alrededor de una válvula central y selectivamente en comunicación fluida con un canal en dicha válvula central.
Las Figuras 5A, 5B, 6A, 6B y 7 ilustran un cartucho adecuado para la práctica de los métodos descritos en este documento. Los cartuchos ilustrados se basan en el cartucho GENEXPERt ® (Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA). Como se muestra en la Figura 7, panel A, el cartucho 200 comprende un cuerpo 202 de cartucho que contiene una pluralidad de cámaras 208 de reactivo y/o tampón. Las cámaras están dispuestas alrededor de un cilindro 206 central de jeringa que está en comunicación fluida con un cuerpo 210 de válvula (panel B y Figura 5B) y que se sella con una junta 204. El cuerpo 210 de válvula puede comprender una tapa 212 y todo el cuerpo del cartucho se puede apoyar en una base 226 del cartucho. El cartucho normalmente contiene uno o canales o cavidades (cámara o cámaras) 214 que pueden contener un material de la matriz como se describe en el presente documento que puede funcionar para inmovilizar un complejo inmune inmuno-PCR y, opcionalmente, para unir y eluir un ácido nucleico. En varias realizaciones, el cartucho comprende además uno o más canales o cámaras 216 con control de temperatura que pueden, en determinadas realizaciones, funcionar como cámaras de termociclado. Se puede operar un "émbolo" no mostrado para extraer fluido en el cilindro 206 de la jeringa y rotación del cilindro 206 de la jeringa y cuerpo 210 asociado a la válvula proporciona una comunicación fluida selectiva entre las distintas cámaras 208 de reactivos y canales, cámara o cámaras de reacción, y los canales o cámaras con control de temperatura. Así, las distintas cámaras 208 de reactivos, las cámaras de reacción, el material o materiales de la matriz y las cámaras o canales con control de temperatura están en comunicación fluida selectivamente mediante la rotación del émbolo y el movimiento del reactivo (por ejemplo, carga o descarga de la cámara) es operado por la acción de "jeringa" del émbolo.
Como se muestra en la Figura 5A, en determinadas realizaciones, el cartucho proporciona ventanas ópticas para proporcionar detección en tiempo real de, por ejemplo, productos de amplificación, identidad de bases en operaciones de secuenciación, y similares.
Si bien los métodos descritos anteriormente (y en el Ejemplo 1, véase, por ejemplo, las Figuras 6A y 6B) se describen con respecto a cámaras específicas en el cartucho GENEXPERT®, se reconocerá que las asignaciones particulares de reactivo/cámara pueden variar dependiendo de las particularidades de la inmuno-PCR y/o detección/cuantificación adicional de ácido nucleico. También se reconocerá que en determinadas realizaciones, también se contemplan, variantes del cartucho GENEXPERT®. Dichas variantes pueden incluir, pero no se limitan a, más cámaras de reactivos o menos cámaras de reactivos y/o cámaras de diferentes tamaños, dos (o más) cámaras de recepción de muestras, dos (o más) canales o cámaras con control de temperatura, cartuchos apilados (que brindan control de dos cartuchos por un módulo), y similares.
Módulos de reacción
En determinadas realizaciones, el cartucho 200 está configurado para insertarse en un módulo 300 de reacción, por ejemplo, como se muestra en la Figura 8A. Como se ilustra en la Figura 8B, el módulo está configurado para recibir el cartucho 200. En determinadas realizaciones, el módulo de reacción proporciona placas 308 de calentamiento para calentar la cámara o el canal con control de temperatura. Opcionalmente, el módulo puede incluir adicionalmente un ventilador 304 para proporcionar refrigeración cuando el canal o cámara con control de temperatura es un canal o cámara de termociclado. Se pueden proporcionar circuitos 302 electrónicos para pasar información (por ejemplo, información óptica) a un ordenador central para su análisis. En determinadas realizaciones, el módulo puede contener bloques 306 ópticos para proporcionar excitación y/o detección de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más) señales ópticas que representan, por ejemplo, ADN señal amplificados para varias dianas de inmuno-PCR y/o varios ácidos nucleicos amplificados distintos del o los ADN señal de inmuno-PCR. En varias realizaciones, se puede proporcionar un conector 312 eléctrico para interconectar el módulo con un sistema por ejemplo, controlador del sistema o con una unidad discreta de análisis/control. Como se ilustra, en la Figura 8B, la muestra se puede introducir en el cartucho con una pipeta 310.
En determinadas realizaciones, el módulo también contiene un controlador que opera un émbolo en el cilindro de la jeringa y la rotación del cuerpo de la válvula.
Sistemas
En determinadas realizaciones, se proporciona un sistema (por ejemplo, una unidad de procesamiento). En la Figura 8C se muestra una realización ilustrativa, pero no limitativa. En determinadas realizaciones, la unidad de procesamiento comprende un recinto configurado para contener uno o más módulos de procesamiento de muestras donde cada módulo de procesamiento está configurado para contener y operar un cartucho extraíble como se describe en este documento. En determinadas realizaciones, el sistema está configurado para operar los módulos de procesamiento de muestras para realizar un ensayo de inmuno-PCR para uno o más analitos diana y, opcionalmente, para determinar el nivel de una o más secuencias diana de ARN/ADN (distintas del o los ADN señal de inmuno-PCR) dentro de un cartucho de muestra extraíble correspondiente. Típicamente, el procesamiento de una muestra dentro del cartucho de muestra extraíble correspondiente implica operar el cartucho para realizar un método como se describe en este documento. En determinadas realizaciones, el sistema está configurado para contener un módulo de procesamiento de muestras. En determinadas realizaciones, el sistema está configurado para contener al menos dos módulos de procesamiento de muestras, o al menos 4 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 8 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 12 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 16 módulos de procesamiento de muestras, o al menos al menos 20 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 24 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 28 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 32 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 64 módulos de procesamiento de muestras, o al menos 128 módulos de procesamiento de muestras. En determinadas realizaciones, el sistema proporciona una interfaz de usuario que permite al usuario ingresar instrucciones operativas y/o controlar el funcionamiento de los cartuchos para determinar la presencia y/o cantidad de uno o más analitos de inmuno-PCR y/o la presencia y/o cantidad de uno o más ácidos nucleicos que no son ADN señal de inmuno-PCR.
Si bien los métodos descritos en este documento se describen principalmente con referencia al cartucho GENEXPERT® de Cepheid Inc. (Sunnyvale, CA) (véase, por ejemplo, la Figura 5A), se reconocerá que, en vista de las enseñanzas proporcionadas en este documento, los métodos pueden implementarse en otros sistemas de cartucho/microfluidos. Dichos sistemas de cartucho/microfluidos pueden incluir, por ejemplo, sistemas de microfluidos implementados usando litografía blanda, sistemas de microfluidos micro/nanofabricados implementados usando litografía dura, y similares.
Detección/cuantificación de ADN señal y/o ácidos nucleicos distintos de los ADN de inmuno-PCR.
En diversas realizaciones, los ADN señal de las reacciones de inmuno-PCR se amplifican para su detección y/o cuantificación. En determinadas realizaciones ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm, etc.) distintos de los a Dn señal de inmuno-PCR (por ejemplo, de reacciones de inmuno-PCR realizadas en el mismo cartucho) se amplifican adicionalmente para su detección y/o cuantificación. En determinadas realizaciones, la amplificación comprende cualquiera de una serie de métodos que incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción de detección de la ligasa (LDR), amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex (MLPA), ligadura seguido de amplificación por Q-replicasa, extensión de cebador, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA), amplificación por círculo rodante (RCA) y similares.
En realizaciones ilustrativas, pero no limitativas, la reacción de amplificación puede producir una señal óptica que es proporcional a la cantidad de ácido nucleico diana amplificado (por ejemplo, a Dn señal). Las señales ópticas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal electroquimioluminiscente, una señal colorimétrica y similares. En determinadas realizaciones, la señal óptica es una señal óptica fluorescente generada por un indicador fluorescente. En determinadas realizaciones, el indicador fluorescente es un colorante intercalado no específico que se une a productos de ADN de doble cadena, mientras que en ciertas otras realizaciones, el indicador fluorescente comprende una sonda específica de secuencia diana (por ejemplo, una sonda TAQMAN®, una sonda SCORPION®, una MOLECULAR BEAc On®, y similares).
Las reacciones sencillas de inmuno-PCR o las reacciones multiplex de inmuno-PCR procesadas secuencialmente (o simultáneamente en cámaras o canales separados con temperatura controlada) también pueden usar el mismo marcador detectable, ya que los ADN señal de inmuno-PCR ejecutados secuencialmente se analizan secuencialmente y los ADN señal simultáneos de inmuno-PCR se distinguen por su presencia en diferentes canales o cámaras con control de temperatura. Lo mismo ocurre cuando el cartucho se usa adicionalmente para el análisis/amplificación de uno o más ácidos nucleicos diana (distintos de los ADN señal de inmuno-PCR). Por lo tanto, la señal producida por esta amplificación se puede distinguir de otros productos de amplificación porque no se realiza al mismo tiempo y/o porque se realiza en un canal/cámara de reacción diferente.
Sin embargo, cuando se procesan varios productos de inmuno-PCR simultáneamente en las mismas cámaras y/o la amplificación de ácido nucleico (para un ácido nucleico que no sea un ADN señal de inmuno-PCR) también se procesa simultáneamente en la misma cámara, los productos de reacción de cada análisis son típicamente detectados y/o cuantificados mediante el uso de marcadores diferentes y distinguibles.
En determinadas realizaciones, los productos de amplificación (ADN señal amplificados y ácido nucleico amplificado del análisis de ácido nucleico cuando se realiza) pueden detectarse utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. En determinadas realizaciones, la amplificación es una reacción de amplificación por PCR simple y directa. En determinadas realizaciones, sin embargo, se usa una reacción de PCR anidada para la diana o dianas de ADN señal de inmuno-PCR y el ácido nucleico amplificado del análisis de ácido nucleico cuando se realiza.
En diversas realizaciones, se contemplan ensayos de PCR multiplexada, en particular cuando se desea analizar múltiples analitos de inmuno-PCR en la misma reacción de amplificación, y/o cuando se desea analizar productos del análisis de ácidos nucleicos en la misma reacción de amplificación que el análisis de inmuno-PCR. En determinadas realizaciones en tales reacciones de amplificación multiplexadas, cada sonda (por ejemplo, para cada analito específico) tiene su propio colorante/flúor específico para que sea detectable independientemente de las otras sondas.
En determinadas realizaciones, típicamente, para la generación de señales, las sondas utilizadas en varias reacciones de amplificación utilizan un cambio en la fluorescencia de un fluoróforo debido a un cambio en su interacción con otra molécula o fracción producida al cambiar la distancia entre el fluoróforo y la molécula o fracción que interactúa para la detección y/o cuantificación del producto amplificado. Como alternativa, se contemplan otros métodos para detectar un polinucleótido en una muestra, incluido, pero no se limitan a, el uso de sondas marcadas radiactivamente.
Los ensayos basados en fluorescencia generalmente se basan en la generación de señales en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, o "FRET", según lo cual un cambio en la fluorescencia es causado por un cambio en la distancia que separa un primer fluoróforo de un aceptor de energía de resonancia que interactúa, ya sea otro fluoróforo o un inhibidor. Las combinaciones de un fluoróforo y una molécula o fracción que interactúa, incluidas las moléculas o fracciones inactivadoras, se conocen como "pares de FRET". El mecanismo de interacción del par de FRET normalmente requiere que el espectro de absorción de un miembro del par se superponga al espectro de emisión del otro miembro, el primer fluoróforo. Si la molécula o fracción que interactúa es un inhibidor, su espectro de absorción generalmente se superpone al espectro de emisión del fluoróforo (véase, por ejemplo, Stryer (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846; Selvin (1995) Met. Enzymol. 246: 300-335; y similares). La interacción eficiente de FRET generalmente se logra cuando los espectros de absorción y emisión del par tienen un alto grado de superposición. La eficiencia de la interacción de FRET es linealmente proporcional a esa superposición. Típicamente, se desea una gran magnitud de señal (es decir, un alto grado de superposición). Por lo tanto, los pares de FRET, incluidos los pares fluoróforo-inhibidor, se eligen típicamente sobre esa base.
Se conocen una variedad de sondas de hibridación de ácidos nucleicos marcados y ensayos de detección que utilizan FRET y pares de FRET. Uno de estos esquemas es descrito por Cardullo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794, y en Heller et al., documento EP 0070685. Este esquema utiliza una sonda que comprende un par de oligodesoxinucleótidos complementarios a las regiones contiguas de una cadena de ADN diana. Una molécula de sonda contiene un marcador fluorescente, un fluoróforo, en su extremo 5', y la otra molécula de sonda contiene un marcador fluorescente diferente, también un fluoróforo, en su extremo 3'. Cuando la sonda se hibrida con la secuencia diana, los dos marcadores se acercan mucho entre sí. Cuando la muestra se estimula con luz de una frecuencia adecuada, se produce la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de un marcador al otro. FRET produce un cambio medible en la respuesta espectral de los marcadores, lo que indica la presencia de dianas. Un marcador podría ser un "inhibidor", que puede ser, entre otros, una fracción interactiva (o molécula) que libera la energía aceptada como calor.
Otro tipo de ensayo de sonda de hibridación de ácido nucleico que utiliza un par de FRET es el ensayo "TAQMAN®" descrito, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,210,015, y 5,538,848. La sonda es típicamente un oligonucleótido monocatenario marcado con un par de FRET. En un ensayo TAQMÁN®, una ADN polimerasa libera nucleótidos únicos o múltiples mediante la escisión de la sonda de oligonucleótidos cuando se hibrida con una cadena diana. Esa liberación proporciona una forma de separar el marcador del inhibidor y el marcador del fluoróforo del par de FRET.
En determinadas realizaciones, también se pueden usar las sondas fluorescentes no FRET, tales como las descritas en, por ejemplo, Tiagi et al., patente de los Estados Unidos No. 6,150,097. Por ejemplo, la patente de Tiyagi et al., describe cómo los cambios en los espectros de absorción del par marcador pueden usarse como una señal detectable como alternativa al cambio en la fluorescencia. Cuando se utiliza el cambio en la absorción, el par marcador puede incluir dos cromóforos cualesquiera, es decir, fluoróforos, inhibidores y otros cromóforos. El par marcador puede incluso ser cromóforos idénticos.
En algunas realizaciones, se introducen colorantes y otras fracciones, tales como inhibidores, en cebadores y/o sondas utilizadas en los métodos y cartuchos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, dichos colorantes e inhibidores incluyen, pero no se limitan a, colorantes (fluorescentes) adecuados para su uso como sondas de FRET. En determinadas realizaciones, los colorantes y/o los inhibidores comprenden nucleótidos modificados. Un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que se ha modificado químicamente, pero que aún funciona como un nucleótido. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado tiene una fracción química, tal como un colorante o inhibidor, unido covalentemente y puede introducirse en un polinucleótido, por ejemplo, mediante la síntesis en fase sólida del polinucleótido. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado incluye uno o más grupos reactivos que pueden reaccionar con un colorante o inhibidor antes, durante o después de la incorporación del nucleótido modificado en el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado es un nucleótido modificado con amina, es decir, un nucleótido que ha sido modificado para tener un grupo amino reactivo. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado comprende una fracción base modificada, tal como uridina, adenosina, guanosina y/o citosina. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado con amina se selecciona de 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-ATP; N6-(4-amino)butil-ATP, N6-(6-amino)butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-amino)hexil-ATP; 8-[(6-amino)hexil]-amino-ATP; 5-propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP. En algunas realizaciones, los nucleótidos con diferentes fracciones de nucleobase se modifican de manera similar, por ejemplo, 5-(3-aminoalil)-GTP en lugar de 5-(3-aminoalil)-UTP. Muchos nucleótidos modificados con amina están disponibles comercialmente a través de, por ejemplo, Applied Biosystems, Sigma, Jena Bioscience y TriLink. En la Tabla 1 se muestra una lista ilustrativa, pero no limitativa, de fluoróforos adecuados.
Tabla 1. Fluoróforos ilustrativos, pero no limitativos (marcadores fluorescentes), para uso en los cebadores y/o sondas descritos en el presente documento.
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Si el ensayo está diseñado para detectar una secuencia de ADN diana (por ejemplo, un ADN señal de inmuno-PCR), entonces solo se necesita usar una sonda de hibridación fluorescente y, en determinadas realizaciones, FAM, TET o HEX (o una de sus alternativas enumeradas en la Tabla 2) será un buen fluoróforo para marcar la sonda. Estos fluoróforos se pueden excitar y detectar fácilmente en varios termocicladores espectrofluorométricos. Además, debido a la disponibilidad de derivados de fosforamiditas de estos fluoróforos y la disponibilidad de columnas de vidrio de poro de control enlazadas con inhibidor, las sondas de hibridación fluorescentes con estos marcadores se pueden sintetizar completamente en un proceso de síntesis de ADN automatizado, con la ventaja de un costo relativamente menor y fabricación de sondas con menos mano de obra.
Tabla 2. Marcadores fluoróforos ilustrativos adicionales para sondas de hibridación fluorescentes.
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En determinadas realizaciones, se detectan múltiples dianas en una sola reacción multiplex, por ejemplo, diferentes ADN señal para diferentes reacciones de inmuno-PCR, y/o productos de amplificación para una reacción de amplificación realizada para un ácido nucleico diferente de un a Dn señal de inmuno-PCR. En algunas realizaciones, cada sonda que se dirige a un producto de amplificación diferente es espectralmente distinguible (detectable en forma diferente) de las otras sondas utilizadas en la reacción multiplex. Las combinaciones de sondas adecuadas para la detección multiplex son conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las combinaciones ilustrativas de diferentes fluoróforos detectables en cuatro sistemas multiplex diana incluyen, pero no se limitan a:
1) FAM, TMR, Texas Red y Cy5;
2) FAM, TET, TMR y Texas Red;
3) FAM, HEX, Texas Red y Cy5; y
4) FAM, Cy3, Texas Red y Cy5.
Una combinación ilustrativa de diferentes fluoróforos detectables en un sistema multiplex de cinco dianas es FAM, TET, TMR, Texas Red y Cy5. Las combinaciones ilustrativas de diferentes fluoróforos detectables en un sistema multiplex de seis dianas incluyen, pero no se limitan a:
1) FAM, TET, HEX, TMR, ROX y Texas Red; y
2) FAM, HEX, LC red 610, LC red 640, LC red 670 y LC red 705.
Se reconocerá que estas combinaciones de fluoróforos son ilustrativas y no limitativas y muchos otros fluoróforos estarán disponibles para los expertos en la técnica.
Como se indicó anteriormente, para el diseño de sondas de hibridación fluorescentes que utilizan transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), se deben elegir pares de fluoróforo-inhibidor que tengan suficiente superposición espectral. Los fluoróforos con un máximo de emisión entre 500 y 550 nm, tales como FAM, TET y HEX, se inhiben mejor con inhibidores con máximos de absorción entre 450 y 550 nm, tales como dabcilo, BHQ-1 y similares (véase, por ejemplo, la Tabla 3 para marcadores ilustrativos de inhibidores). Los fluoróforos con un máximo de emisión superior a 550 nm, tales como las rodaminas (incluidos TMR, ROX y Texas red) y los colorantes Cy (incluidos Cy3 y Cy5) se inhiben de manera efectiva con inhibidores con máximos de absorción superiores a 550 nm (incluido BHQ-2).
Para el diseño de sondas de hibridación fluorescentes que utilizan inhibición por contacto, cualquier inhibidor no fluorescente puede servir como un buen aceptor de energía del fluoróforo. Por ejemplo, Cy3 y Cy5 son inhibidos efectivamente por los inhibidores BHQ-1 y BHQ-2.
Tabla 3. Marcadores ilustrativos de inhibidores para sondas de hibridación fluorescentes.
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En determinadas realizaciones, los nucleótidos pueden inhibir la fluorescencia de los fluoróforos, siendo la guanosina el inhibidor más eficaz, seguida de la adenosina, la citidina y la timidina. En general, los fluoróforos con una longitud de onda de excitación entre 500 y 550 nm se inhiben de manera más eficiente con nucleótidos que los fluoróforos con longitudes de onda de excitación más largas. Al diseñar sondas de hibridación fluorescentes, puede ser deseable evitar colocar un marcador de fluoróforo directamente al lado de una guanosina, para garantizar señales de fluorescencia más altas del fluoróforo.
El efecto estabilizador de algunos pares fluoróforo-inhibidor que interactúan mediante inhibición por contacto puede tener consecuencias importantes para el diseño de sondas de hibridación (véase por ejemplo, Marras et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: e122; Johansson et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 6950-6956). Por ejemplo, se ha observado que las sondas de hibridación marcadas con un fluoróforo inhibido por BHQ-1 o BHQ-2 muestran un aumento en la temperatura de fusión del híbrido de aproximadamente 4 °C, en comparación con las sondas de hibridación con la misma secuencia de sonda, pero marcadas con fluoróforos inhibidos por dabcilo. También se advierte que se ha observado una fuerte afinidad entre los colorantes Cy, Cy3 y Cy5, y los inhibidores Black Hole, BHQ-1 y BHQ-2.
En vista de lo anterior y de los Ejemplos y enseñanzas proporcionados en el presente documento, estarán disponibles numerosas combinaciones de cebador/sonda para su uso en los métodos y cartuchos descritos en el presente documento.
Objetivos/analitos para detección/cuantificación por inmuno-PCR y análisis opcional de ácido nucleico.
Los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento encuentran uso en un amplio número de contextos. Por ejemplo, la inmuno-PCR se puede usar para identificar la presencia y/o cuantificar cualquiera de una serie de organismos o microorganismos que incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, plantas, algas, protozoos y similares, incluidos, pero no se limitan a, cualquier forma/especie/cepa patógena de dichos organismos o microorganismos. En determinadas realizaciones, la inmuno-PCR se puede usar para identificar toxinas producidas por cualquiera de estos microorganismos. En diversas realizaciones, los dispositivos y métodos de inmuno-PCR descritos en el presente documento se pueden usar para identificar varios tipos de cáncer o marcadores de cáncer y/o para identificar células cancerosas o microorganismos que muestran resistencia a los fármacos (por ejemplo, MRSA, tuberculosis resistente a fármacos, células cancerosas resistentes a doxorrubicina o gentamicina, y similares). Los ensayos de inmuno-PCR encuentran uso, entre otros, en el campo de la medicina, así como en estudios ambientales (por ejemplo, para filtrar el agua y los contaminantes del suelo), y en el campo de la agricultura (por ejemplo, para cribar carne de vacuno, aves de corral, diversos cultivos alimentarios y similares).
En consecuencia, el cartucho se carga (por ejemplo, o se configura para ser cargado) con una muestra que comprende un material de una fuente biológica, ambiental, médica o del paciente. En varias realizaciones, la muestra comprende una muestra ambiental seleccionada del grupo que consta de materia superficial, suelo, agua, vegetación y una muestra industrial. En determinadas realizaciones, la muestra comprende una muestra de alimentos o agrícola, seleccionada del grupo que consiste en carne, productos cárnicos, aves o productos aviares, leche o productos lácteos y cultivos agrícolas y desechos orgánicos. En determinadas realizaciones, la muestra comprende una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en un cultivo, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, aspirados bronquiales, lavado traqueal, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados con aguja, biopsias por punción, biopsias quirúrgicas, secciones crioconservadas, secciones Ff PE y similares.
En determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos de uso de los mismos se utilizan para detectar y/o cuantificar diversas bacterias y/o virus patógenos o toxinas producidas por tales bacterias y/o virus patógenos y, por lo tanto, diagnosticar y/o caracterizar un estado de enfermedad y facilitar la selección de un régimen terapéutico apropiado. En este sentido, se señala que la inmuno-PCR se ha utilizado para detectar y/o cuantificar una serie de virus, bacterias y toxinas bacterianas, por ejemplo, como se identifica en la Tabla 4. Además, la inmuno-PCR se ha utilizado para detectar proteínas priónicas (véase, la Tabla 4) y, por lo tanto, puede usarse para detectar enfermedades priónicas (por ejemplo, encefalopatía espongiforme bovina o humana), y/o para detectar infecciones priónicas en los productos animales. Usando la enseñanza proporcionada en este documento y en las referencias que se muestran en la Tabla 4, los diversos ensayos de inmuno-PCR descritos pueden implementarse fácilmente en los cartuchos descritos en este documento.
Tabla 4. Dianas ilustrativas analitos/antí eno que se han detectado mediante inmuno-PCR.
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En diversas realizaciones, los marcadores antigénicos característicos de diversos microorganismos se detectan y/o cuantifican usando inmuno-PCR basada en cartuchos como se describe en el presente documento para proporcionar la detección de la presencia y/o abundancia del microorganismo. Dichas detecciones encuentran uso en el diagnóstico de pacientes, estudios ambientales y en detecciones de productos de ganaderos, cárnicos y agrícolas.
En determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento se utilizan para detectar y/o cuantificar diversas toxinas bacterianas. Las toxinas bacterianas incluyen, pero no se limitan a, neurotoxinas botulínicas, toxina A y toxina B de Clostridium diffiále, lipopolisacárido o endotoxina (asociada con bacterias Gram negativas), toxina tetánica, toxina shiga, toxina similar a shiga, toxinas estafilocócicas (por ejemplo, enterotoxina A y B de S. aureus), toxina de ántrax, cianotoxina, toxina de difteria, exotoxina, toxina de tos ferina y similares.
También se contempla la detección de varios marcadores antigénicos característicos de hongos y/o micotoxinas producidas por varios hongos. Las micotoxinas que pueden detectarse utilizando la inmuno-PCR basada en cartuchos descrita en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, aflatoxinas, ocratoxina, citrinina, alcaloides del cornezuelo del centeno, patulina, toxinas de fusarium y similares. Las aflatoxinas son un tipo de micotoxina producida por las especies de hongos Aspergillus, tales como A. flavus y A. parasiticus, y similares. Las aflatoxinas incluyen cuatro tipos diferentes de micotoxinas designadas B1, B2, G1, y G2. La aflatoxina B1, la más tóxica, es un carcinógeno potente y se ha relacionado directamente con efectos adversos para la salud, tal como el cáncer de hígado, en muchas especies animales[8]. Las aflatoxinas se asocian en gran medida con los productos básicos producidos en los trópicos y subtrópicos, tales como el algodón, el maní, las especias, los pistachos y el maíz. La ocratoxina es una micotoxina que se presenta en tres formas de metabolitos secundarios, todos los cuales son producidos por las especies Penicillium y Aspergillus. Las tres formas difieren en que la Ocratoxina B (OTB) es una forma no clorada de la Ocratoxina A (OTA) y que la Ocratoxina C (OTC) es una forma de éster etílico de la Ocratoxina A. Aspergillus ochraceus se encuentra como contaminante de una amplia gama de productos básicos, incluidas bebidas tales como la cerveza y el vino. Aspergillus carbonarius es la principal especie que se encuentra en la fruta de la vid, que libera su toxina durante el proceso de elaboración del jugo. La OTA se ha marcado como un carcinógeno y una nefrotoxina, y se ha relacionado con tumores en el tracto urinario humano. La citrinina ha sido identificada en más de una docena de especies de Penicillium y varias especies de Aspergillus. Algunas de estas especies se utilizan para producir alimentos humanos como el queso (Penicillium camemberti), sake, miso y salsa de soja (Aspergillus oryzae). La citrinina está asociada con la enfermedad del arroz amarillento en Japón y actúa como nefrotoxina en todas las especies animales analizadas. Se asocia con muchos alimentos humanos, incluidos, pero no se limitan a, trigo, arroz, maíz, cebada, avena, centeno y alimentos coloreados con pigmento Monascus. Los alcaloides del cornezuelo de centeno incluyen compuestos producidos como una mezcla tóxica de alcaloides en los esclerocios de especies de claviceps, que son patógenos comunes de varias especies de gramíneas. La ingestión de esclerocios del cornezuelo de centeno de cereales infectados, comúnmente en forma de pan producido a partir de harina contaminada, causa ergotismo, la enfermedad humana históricamente conocida como Fuego de San Antonio. Hay dos formas de ergotismo: gangrenoso, que afecta el suministro de sangre a las extremidades, y convulsivo, que afecta el sistema nervioso central. Los métodos modernos de limpieza de granos han reducido significativamente el ergotismo como enfermedad humana, sin embargo, sigue siendo un problema veterinario importante. La patulina es una toxina producida por las especies de hongos P. expansum, Aspergillus, Penicillium, y Paecilomyces. P. expansum se asocia especialmente con una variedad de frutas y verduras mohosas, en particular manzanas e higos podridos. Es destruido por el proceso de fermentación y, por lo tanto, no se encuentra en las bebidas de manzana, tal como la sidra. Aunque no se ha demostrado que la patulina sea cancerígena, se ha informado que daña el sistema inmunitario de los animales. En 2004, la Comunidad Europea fijó límites a las concentraciones de patulina en los productos alimenticios. Las toxinas de Fusarium son producidas por más de 50 especies de fusarium y tienen antecedentes de infectar el grano de cereales en desarrollo como el trigo y el maíz. Incluyen una variedad de micotoxinas, tales como: las fumonisinas, que afectan el sistema nervioso de los caballos y pueden causar cáncer en roedores; los tricotecenos, que están más fuertemente asociados con efectos tóxicos crónicos y fatales en animales y humanos; y zearalenona, que no está correlacionada con ningún efecto tóxico fatal en animales o humanos. Algunos de los otros tipos principales de las toxinas de fusarium incluyen: beauvercina y eniatinas, butenolida, equisetina y fusarinas.
En determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento se usan para la detección de diversos marcadores antigénicos de algas y/o toxinas producidas por diversas algas. Varias algas y toxinas de algas son patógenos importantes, en particular en la industria de alimentos marinos. Las toxinas de algas incluyen toxinas producidas por cianobacterias (por ejemplo, Microcystis sp., Anabaena sp., Aphanizomenon sp., Nodularia sp,. Oscilatoria sp., etc.) e incluyen hepatotoxinas (por ejemplo, microcistinas y nodularina) y neurotoxinas (por ejemplo, anatoxina-a y anatoxina-a(s)), ácido domoico, que es una neurotoxina producida por Pseudonitzschia sp. responsable del envenenamiento amnésico de los mariscos; saxitoxina, una neurotoxina producida por Alexandrium sp. que es responsable del envenenamiento paralizante por mariscos, brevetoxina una neurotoxina producida por Gymnodinuum sp., y similares.
En determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento se utilizan para la detección de diversos genes de resistencia a fármacos o marcadores antigénicos característicos de diversas cepas de patógenos resistentes a fármacos. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en este documento se pueden usar para identificar rápidamente bacterias resistentes a los fármacos e informar estrategias terapéuticas o, en el caso del cáncer, para identificar ciertas células cancerosas resistentes a los fármacos que pueden determinar el régimen quimioterapéutico más apropiado. Las bacterias ilustrativas resistentes a fármacos incluyen, pero no se limitan a, cepas resistentes a los fármacos de Staphylococcus aureus (MRSA), Burkholderia cepacian, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes, y similares.
En determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento se utilizan para detectar uno o más marcadores de una respuesta inflamatoria (por ejemplo, una inflamación de respuesta del huésped). Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, IL-8, calprotectina y lactoferrina.
En determinadas realizaciones, los cartuchos de inmuno-PCR y los métodos descritos en el presente documento se usan para detectar uno o más marcadores de cáncer. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, los marcadores de cáncer que se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Marcadores ilustrativos de cáncer referencias asociadas.
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En vista de lo anterior, en determinadas realizaciones, el o los cartuchos de inmuno-PCR descritos en este documento pueden incluir anticuerpos de captura y anticuerpos de detección que se unen a un analito seleccionado del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un prión, un antígeno parasitario, una micotoxina, un antígeno de algas, un antígeno fúngico, un marcador de cáncer y un producto genético de resistencia a fármacos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos que se unen a un antígeno viral seleccionado del grupo que consiste en antígeno de superficie de hepatitis B, antígeno de superficie de hepatitis C, antígeno de herpesvirus bovino, cápside de norovirus, rotavirus, gusanos Angiostrongylus cantonensis, proteína de hantavirus, antígeno viral de influenza aviar, antígeno de VIH-1 y antígeno de H5N1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos que se unen a un prión seleccionado del grupo que consiste en PRP bovino, PRP de cerebro humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos que se unen a un antígeno bacteriano o a una toxina bacteriana seleccionada del grupo que consiste en antígeno de C. difficile, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, P. piscidia, antígeno de E. coli, Bacteroides fragilis, BoNT/A, Grupo A de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, antígeno de Y. pestis, y antígeno de M. Tuberculosis. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos que se unen a una toxina bacteriana seleccionada del grupo que consiste en la toxina shiga 2, neurotoxina A de Clostridium botulinum, enterotoxina estafilocócica, toxina de Bacillus thuringiensis, toxina A de C. difficile y toxina B de C. difficile. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos que se unen a un polipéptido codificado por un gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, un polipéptido de resistencia a fármacos tal como p-glicoproteína, glicoproteína p, polipéptido OleC, polipéptido mbcF, polipéptido o polipéptidos MsrA, polipéptido bexA, polipéptido bexB, polipéptido kpsT, polipéptido kpsM y similares). En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos que se unen a una cepa resistente a fármacos de Staphylococcus aureus (MRSA), Burkholderia cepacian, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, y/o Streptococcus pyogenes, o a un polipéptido codificado por un gen de resistencia a fármacos en estas cepas.
En determinadas realizaciones, el o los cartuchos de inmuno-PCR descritos en este documento pueden incluir anticuerpos de captura y anticuerpos de detección que se unen a un analito que comprende marcadores de una respuesta inflamatoria (por ejemplo, una inflamación de respuesta del huésped). Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, IL-8, calprotectina y lactoferrina.
En determinadas realizaciones, el o los cartuchos de inmuno-PCR descritos en este documento pueden incluir anticuerpos de captura y anticuerpos de detección que se unen a un analito que comprende un marcador de cáncer. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, los marcadores de cáncer que se muestran en la Tabla 5.
Debido a que, en diversas realizaciones, los cartuchos descritos en este documento permiten tanto un análisis de inmuno-PCR (de uno o más analitos diana que pueden ser o no un polipéptido) como un análisis de ácido nucleico (de uno o más ácidos nucleicos diana distintos de ADN de señal de inmuno-PCR en el cartucho), es posible analizar primero una diana de inmuno-PCR y luego realizar un ensayo reflejo para un ácido nucleico relacionado, o primero analizar una diana de ácido nucleico y luego realizar un ensayo de inmuno-PCR reflejo para un analito diana relacionado.
Así, por ejemplo, cuando un ensayo de inmuno-PCR se dirige a un antígeno característico de una cepa patógena de un organismo, el análisis de ácido nucleico se puede dirigir a un ácido nucleico que codifica ese marcador (por ejemplo, para la validación) o a un ácido nucleico que codifica un gen o marcador de resistencia a los fármacos para proporcionar una primera identificación del patógeno y una segunda determinación del estado de resistencia a los fármacos de ese patógeno. Por el contrario, en determinadas realizaciones, estas funciones de la inmuno-PCR y el análisis de ácidos nucleicos pueden invertirse.
Cuando un ensayo de inmuno-PCR se dirige a marcadores de una respuesta inflamatoria (por ejemplo, IL-8, calprotectina, lactoferrina, etc.), el análisis de ácido nucleico se puede dirigir a un ácido nucleico que codifica ese marcador (por ejemplo, para la validación).
De manera similar, cuando un ensayo de inmuno-PCR se dirige a un antígeno característico de una célula cancerosa (por ejemplo, un marcador de cáncer), el análisis de ácido nucleico se puede dirigir a un ácido nucleico que codifica ese marcador (por ejemplo, un marcador que se muestra en la Tabla 5, para la validación) o a un ácido nucleico que codifica un gen o marcador de resistencia a los fármacos para proporcionar primero la identificación del cáncer y luego su estado de resistencia a los fármacos para informar los protocolos quimioterapéuticos. Por el contrario, en determinadas realizaciones, estas funciones de la inmuno-PCR y el análisis de ácidos nucleicos pueden invertirse.
En otro ejemplo, se puede usar una inmuno-PCR para identificar una toxina producida por un organismo y el análisis de ácido nucleico se puede usar para identificar específicamente el organismo o la cepa que produce la toxina. Por el contrario, en determinadas realizaciones, estas funciones de la inmuno-PCR y el análisis de ácidos nucleicos pueden invertirse.
En varias realizaciones, el cartucho de inmuno-PCR contiene además cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un analito o un fragmento de un analito seleccionado del grupo que consiste en un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un prión, un antígeno parasitario, una micotoxina y un analito de una célula cancerosa. En determinadas realizaciones, el cartucho de inmuno-PCR contiene adicionalmente cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un antígeno viral o un fragmento del mismo donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de superficie de hepatitis B, antígeno de superficie de hepatitis C, antígeno del herpesvirus bovino, cápside del norovirus, rotavirus, gusanos Angiostrongylus cantonensis, proteína del hantavirus, antígeno del virus de la influenza aviar, antígeno del VIH-1 y antígeno de H5N1. En ciertos casos, el cartucho de inmuno-PCR contiene adicionalmente cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un antígeno bacteriano o una toxina bacteriana o un fragmento del mismo, donde el antígeno bacteriano o la toxina bacteriana se selecciona del grupo que consiste en antígeno de C. difficile, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, P. piscidia, antígeno de E. coli, Bacteroides fragilis, BoNT/A, Grupo A de Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, antígeno de Y. pestis y antígeno de M. tuberculosis. En algunos casos, el cartucho de inmuno-PCR contiene además cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica una toxina bacteriana o un fragmento de la misma, donde la toxina bacteriana se selecciona del grupo que consiste en la toxina shiga 2, neurotoxina A de Clostridium botulinum, enterotoxina estafilocócica, toxina de Bacillus thuringiensis, toxina A de C. difficile y toxina B de C. difficile. En algunos casos, el cartucho de inmuno-PCR también contiene cebadores y sondas para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido expresado por un gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, MRP, p-glicoproteína, glicoproteína p, polipéptido OleC, polipéptido mbcF, polipéptido o polipéptidos MsrA, polipéptido bexA, polipéptido bexB, polipéptido kpsT, polipéptido kpsM y similares).
Los diversos analitos y ensayos "reflejos" descritos anteriormente son ilustrativos y no limitativos. En vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, un experto en la técnica reconocerá otras numerosas dianas de ensayo y combinaciones de ensayo.
Kits
En diversas realizaciones se proporcionan kits para realizar los métodos descritos en el presente documento. En una realización ilustrativa, los kits comprenden uno o más cartuchos configurados para realizar inmuno-PCR como se describe en este documento. En determinadas realizaciones, los kits incluyen adicionalmente un segundo cartucho (por ejemplo, un cartucho GENEXPERT®) configurado para preparar y analizar una muestra de ácido nucleico como se describe en este documento. En varias realizaciones, los kits comprenden un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR como se describe en este documento, así como una amplificación de ácido nucleico adicional como se describe en este documento.
En determinadas realizaciones, un cartucho en el kit está configurado para cargarse con una muestra que comprende un material de una fuente biológica, ambiental, médica o del paciente. En varias realizaciones, el kit puede proporcionar además uno o más instrumentos y/o dispositivos para obtener y/o preparar una muestra para usar en un cartucho provisto en el kit. En determinadas realizaciones, el kit contiene uno o más instrumentos y/o dispositivos para obtener y/o preparar una muestra que comprende una muestra ambiental seleccionada del grupo que consiste en materia superficial, suelo, agua, vegetación y una muestra industrial. En determinadas realizaciones el kit contiene uno o más instrumentos y/o dispositivos para obtener y/o preparar una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en cultivo, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, aspirados bronquiales, lavado traqueal, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados con aguja, biopsias por punción, biopsias quirúrgicas, secciones crioconservadas, secciones FFPE y similares. En determinadas realizaciones, el kit contiene uno o más instrumentos y/o dispositivos para obtener y/o preparar una muestra que comprende una muestra de alimento o agrícola seleccionada del grupo que consiste en carne, productos cárnicos, aves o productos aviares, leche o productos lácteos, y cultivos agrícolas y residuos orgánicos.
En determinadas realizaciones donde los kits incluyen adicionalmente un segundo cartucho (por ejemplo, un cartucho GENEXPERT®) configurado para preparar y analizar una muestra de ácido nucleico como se describe en este documento o cuando los kits comprenden un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR como se describe en este documento, así como una amplificación de ácido nucleico adicional como se describe en este documento, los kits pueden contener adicionalmente reactivos para procesamiento y preparar una muestra de ácido nucleico. Dichos reactivos pueden incluir, por ejemplo, una solución de lisis, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT. No: WO 2014/052551, la solicitud Pc T No.: PCT/US16/41917, y similares. En determinadas realizaciones, el kit comprende un contenedor que contiene proteinasa K y/o un contenedor que contiene etanol, y/o el kit contiene una columna para la preparación de ADN.
En determinadas realizaciones, el kit contiene material instructivo que enseña el uso de un cartucho para inmuno-PCR o el uso de un cartucho para inmuno-PCR y un análisis de ácido nucleico adicional. Cuando un cartucho de preparación de muestras (por ejemplo, como se describe en la solicitud PCT No: PCT/US16/37422) está incluido en el kit, el kit también puede contener materiales instructivos que enseñan el uso y la operación del cartucho de preparación de muestras.
Aunque los materiales de instrucción de los kits descritos anteriormente normalmente comprenden materiales escritos o impresos, no se limitan a ellos. Esta invención contempla cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), y similares. Dichos medios pueden incluir direcciones de sitios de Internet que brindan dichos materiales de instrucción.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Inmuno-PCR basada en cartuchos
Uno de los objetivos de este estudio fue extender el uso de cartucho GENEXPERT® Cepheid o cartuchos similares a la inmuno-PCR sola o en combinación con una amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, qPCR de ADN o ARN). Se cree que la capacidad de detectar polipéptidos por inmuno-PCR utilizando el cartucho GENEXPERT® además del análisis de ácidos nucleicos proporciona una utilidad significativa porque los patrones de transcripción y traducción no siempre se correlacionan positivamente. La capacidad de analizar un polipéptido y luego reflejar la muestra para analizar, por ejemplo, un ácido nucleico correspondiente, o por el contrario, para analizar un ácido nucleico diana y luego reflejar la muestra para analizar, por ejemplo, un polipéptido correspondiente aumenta la probabilidad de detección del analito o analitos diana deseados. Dicho sistema es muy adecuado para la detección y/o cuantificación de patógenos (por ejemplo, bacterias, virus, protozoos patógenos, etc.), toxinas bacterianas, contaminantes ambientales, para identificar bacterias y células (por ejemplo, células cancerosas) que exhiben resistencia a fármacos, para detectar animales, productos alimenticios y pacientes "infectados" con priones, y similares.
Como sistema modelo, se usaron cartuchos GENEXPERT® para la detección de toxina B por inmuno-PCR de Clostridium difficile. Un éxito en el desempeño fue la detección de toxina B de C. difficile en una concentración que oscilaba entre aproximadamente 2.5 a aproximadamente 1,000 ng/mL con un tiempo hasta el resultado de menos de aproximadamente 60 minutos y una imprecisión de menos de aproximadamente el 15 % en todo el espectro de concentraciones.
Clostridium difficile es la causa de diarrea asociada a Clostridium difficile (CDAD), una diarrea asociada a antibióticos y colitis pseudomembranosa (PMC). En estos trastornos, el sobrecrecimiento bacteriano de Clostridium difficile se desarrolla en el colon, generalmente como consecuencia del uso de antibióticos. La clindamicina y las cefalosporinas de amplio espectro se han asociado con mayor frecuencia con CDAD y PMC, pero casi todos los antimicrobianos pueden ser responsables. La enfermedad está relacionada con la producción de la toxina A y/o B. El tratamiento generalmente implica la suspensión de los antimicrobianos asociados y, si los síntomas persisten, metronidazol, vancomicina o fidaxomicina administrados por vía oral y activos por vía intraluminal. Se puede usar metronidazol intravenoso si no se puede administrar un agente oral. En los últimos años, se ha reconocido que una forma más grave de CDAD con mayor morbilidad y mortalidad es causada por una cepa epidémica hiperproductora de toxinas de Clostridium difficile (cepa NAP1). Muchos aislados hiperproductores de toxinas también contienen el gen de la toxina binaria y son quinolonas resistentes.
Tradicionalmente, el diagnóstico se basaba en 1) características clínicas y epidemiológicas, 2) cultivo (que es laborioso y lento), 3) ensayos de citotoxicidad, que son laboriosos y lentos, y 4) inmunoensayos de detección de toxinas (que son insensibles).
La inmuno-PCR basada en cartuchos descrita en este documento facilita la detección rápida de la colonización asintomática, la confirmación de la infección activa y puede reducir el sobrediagnóstico, particularmente cuando se usa con un reflejo de un análisis de ácido nucleico correspondiente.
Se utilizaron muestras de heces, sólidas, semisólidas o líquidas. Para muestras sólidas y semisólidas, utilizando un hisopo estéril tal como Pur-Wraps (Puritan Medical), se cubre el hisopo con la muestra igual a unos 3 mm de diámetro. Para muestras fecales líquidas, se coloca el hisopo en la muestra durante al menos 10 segundos o, alternativamente, se usan aproximadamente 50 - 300 pL de muestra para procesar. Los hisopos sucios o las muestras fecales líquidas se transfieren a 100 - 1,000 pL de reactivo de extracción/diluyente de muestra que contiene, pero no se limita a, suero de ratón al 0.5 %, CHAPS al 0.1 %, EDTA 1 mM, azida sódica al 0.09 % o timerosal al 0.02 % como conservantes en PBS a pH 7.5. Las muestras diluidas se agitan completamente durante aproximadamente 10 segundos. Las muestras se pueden centrifugar entre 1,000 y 5,000 rpm durante un máximo de cinco minutos para eliminar los sólidos o, alternativamente, se pueden transferir a la cámara de muestra del cartucho (Figura 5B, cámara 3) que contiene un prefiltro opcional o un tapón fibroso insertado en un embudo que permite el filtrado de la muestra del cartucho. Las muestras diluidas se almacenan a 2 - 8 °C durante aproximadamente 72 horas o, alternativamente, se almacenan a < -20 °C durante períodos más prolongados. La muestra de prueba que contenía toxina B de C. difficile era
Se adjuntó un anticuerpo de captura (Ab monoclonal de ratón anti-toxina B de BBI Solutions) a partículas conjugadas con avidina (incluyendo en varias realizaciones, partículas de látex (Spherotech), partículas de sílice (Bangs Lab) y partículas magnéticas hidrofílicas e hidrófobas (Dynal, ThermoFisher ) usando una interacción biotina/avidina a través de un NHS-PEG12-biotina, brazo espaciador de 56 A (ThermoFisher) conjugado con el anticuerpo de captura a través de lisinas usando éster de N-hidroxisuccinimida. Las partículas varían en tamaño desde aproximadamente 1 pm hasta aproximadamente 2.9 pm.
Un anticuerpo de detección (Ab monoclonal de ratón anti-toxina B de BBI Solutions) se unió a un ADN señal (véase, la SEQ ID NO: 4 en la Tabla 6, a continuación) a través de un enlazador C12 por conjugación de éster de NHS a través de lisinas de anticuerpos (kit Innova Biosciences) para proporcionar unión al anticuerpo y oxidación de peryodato del ácido siálico terminal de la estructura de glicano para formar aldehído reactivo, aminación reductora con amina primaria de la plantilla de ADN señal para formar un conjugado estable (enlace de amina secundaria). Un complejo inmune ilustrativo formado por este ADN señal conjugado, se ilustra esquemáticamente en la Figura 9.
Los cebadores y las sondas utilizados para la amplificación por PCR y la detección del ADN señal se muestran a continuación en la Tabla 6.G
Tabla 6. Cebadores, sonda ADN señal utilizados para detectar toxina B de C. difficile
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La mezcla maestra de PCR proporcionada en el cartucho GENEXPERT® compuesto por KCl 50 mM, MgCl26 mM, dNTP 200 pM, 0.5 U/pL de Pheonix Taq (Enzymatics), cebadores y sonda 0.25 pM (que se muestran en la Tabla 6), betaína 1 M, (NH4)2SO4, 10 mM, Tween 20 al 0.2%, 0.2 mg/mL de BSA y HEPES 25 mM pH 8.2.
En una realización ilustrativa, el cartucho GENEXPERT® se configuró como se muestra en la Tabla 7 y se ilustra en la Figura 6A.
Tabla 7. Una realización ilustrativa que muestra el contenido de la cámara para el uso de un cartucho GENEXPERT® para la medición de un biomarcador.
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Después de cargar, el cartucho se colocó en un módulo de reacción (véase, por ejemplo, la Figura 8A) que se colocó en una unidad de procesamiento (véase, por ejemplo, la Figura 8C), y se hizo funcionar para realizar inmuno-PCR. Los parámetros de termociclado para la detección del ADN señal utilizando ADN señal, cebadores y sondas que se muestran en la Tabla, se proporcionan a continuación en la Tabla 8.
Tabla 8. Parámetros de termociclado.
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La inmuno-PCR basada en cartucho anterior es ilustrativa y no limitativa. Otras variaciones bajo consideración incluyen, entre otros, enlace covalente del anticuerpo de captura a la partícula (por ejemplo, a través de un carbohidrato, lisina o cisteína) en lugar de enlace a través de estreptavidina/biotina, enlazadores escindibles (por ejemplo, enlazadores lábiles a bases, enlazadores lábiles a ácidos, enlazadores disulfuro y sitios de restricción) para unir el anticuerpo de detección al ADN señal, así como varios métodos de glicoconjugación (por ejemplo, oxidación con peryodato de sodio de cis-dioles (galactosa o ácido siálico), o remodelación de la estructura de glucano con una mezcla de p 1,4-galactosiltransferasa (Gal T) y a2,6-sialiltransferasa (Sial T) seguida de una oxidación suave de ácido siálico para la conjugación), y similares.
El uso de varios agentes bloqueadores, por ejemplo, para prevenir o reducir la unión no específica también se está investigando. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, varios polímeros/detergentes/carbohidratos (por ejemplo, PEG, Pluronics F68/F108/F127 (se prefiere F68), PVP, Biolipidure 802 (NOF America), Tween 20 u 80, Te g Me (Tre (etilenglicol) monoetil éter), TEG (Tegraetilenglicol) y similares) y/o diversas proteínas/tensioactivos/polisacáridos (por ejemplo, caseína, BSA, IgG de cabra, IgG bovina, Stabilcoat (ThermoFisher), iota-carragenina, sulfato de dextrano, suero de ratón y similares), ADN de esperma de arenque o salmón, y similares.
También se están revisando las modificaciones de partículas para la conjugación directa de anticuerpos. En determinadas realizaciones, dichas modificaciones utilizan grupos funcionales comunes, tales como carboxilato, aldehído, hidrazida, amida, azida, etc., para la unión directa de anticuerpos o para la unión de enlazadores. En determinadas realizaciones también se contempla el uso de brazos espaciadores hidrofílicos. Dichos espaciadores/enlazadores comprenden una fracción tal como PEG y/o polímeros que contienen grupos colgantes hidrófilos de fosforilcolina y similares.
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en este documento son solo para fines ilustrativos.
Ejemplo 2
Inmuno-PCR basada en cartucho: Detección de IL-8 humana y toxina B de Clostridium diffiále
Este estudio ilustra la detección de interleucina 8 (IL-8) humana y toxina B de Clostridium difficile mediante inmuno-PCR basada en cartuchos y compara los resultados obtenidos con este formato con los obtenidos con un formato manual.
Materiales y métodos
Biotinilación de anticuerpos de captura
El anticuerpo monoclonal de ratón anti-toxina B de C. difficile (BBI Solutions) (0.5 mg en PBS pH 7.2, NaN3al 0.1 %) se biotiniló con un exceso de 10 veces de NHS-PEGi2-Biotina EZ-LINKMc (Thermo Fisher) utilizando una solución patrón 250 mM del reactivo de modificación en DMSO. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción se desalinizó y el tampón se intercambió por PBS pH 7.4 y NaN3 al 0.09 % utilizando una columna de desalinización por centrifugación z EbAMc (corte de peso molecular 30 kDa, Thermo Fisher). La cuantificación se realizó utilizando mediciones de A280 y se utilizó sin purificación adicional. La biotinilación de IL-8 antihumano monoclonal de ratón (BD Biosciences) se realizó como se describió anteriormente con un exceso de 20 veces de reactivo de biotinilación y usando el concentrador para desalinización VIVASPIN® 500 con corte de peso molecular de 50 kDa (Sartorius), intercambio de tampones y concentración.
El anticuerpo monoclonal de ratón anti-toxina B de C. difficile también se puede conjugar directamente con partículas de látex modificadas con carboxilo (Thermo Fisher) a través del acoplamiento EDAC/Sulfo-NHS a razón de 20 - 30 |jg de anticuerpo por mg de partículas. Brevemente, las partículas de carboxilato se activaron en tampón de activación/acoplamiento (tampón MES pH 6.0) con una proporción de 20:1 de Sulfo-NHS a carboxilato y una proporción de EDAC a carboxilato de 2.5:1 a temperatura ambiente durante 40 minutos. Los subproductos de la reacción se eliminaron por centrifugación y las partículas activadas se lavaron una vez con el tampón de activación/acoplamiento. Para la conjugación de anticuerpos, las partículas se resuspendieron con el tampón de activación/acoplamiento, se sometieron a ultrasonidos al 10 % de amplitud durante 4 a 6 segundos, seguido de la adición del anticuerpo de captura. La concentración final de partículas fue del 2 % (p/v) durante la conjugación del anticuerpo con el anticuerpo a razón de 0.2 - 0.3 mg/mL. La conjugación prosiguió durante la noche a 2 - 8 °C. La reacción se inactivó con 30 jL de etanolamina y las partículas se lavaron seis veces con PBS, Triton X-100 al 0.1 %, pH 7.43 con sonicación con amplitud del 20 % durante 2-3 durante los dos primeros ciclos de lavado. La cantidad de anticuerpo unido covalentemente a las partículas se estimó utilizando el ensayo Micro BCA (Thermo Fisher).
Conjugación de ADN con anticuerpo de detección
Preparación de anticuerpo de detección de anti-IL-8 humano
El conjugado de ADN para el anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-8 humano se realizó utilizando el sistema de conjugación el THUNDER-LINK® Oligo (Innova Biosciences) a través de las lisinas de superficie de anticuerpos disponibles. Brevemente, se activaron 100 |jg del anticuerpo con el reactivo de activación durante 45 minutos a temperatura ambiente y se desalinizaron utilizando una columna PD-10 equilibrada con el tampón de lavado adjunto.
La plantilla de ADN derivatizada en el extremo 5' con una amina primaria y en el extremo 3' con FAM (Integrated DNA Technologies, Tabla 9) se activó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, una solución madre de la plantilla se diluyó con el tampón de lavado suministrado a 100 jM , se añadió al reactivo de activación y se hizo reaccionar durante 35 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se desalinizó utilizando una columna PD-10 equilibrada con tampón de lavado.
El conjugado de anticuerpo-ADN se produjo mezclando un exceso de 3 veces de la plantilla activada con el anticuerpo activado y haciéndolo reaccionar durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Se añadió reactivo conjugado de limpieza, 600 jL , a la mezcla y se incubó en hielo durante 30 minutos y se centrifugó a 15,000 x g durante 5 minutos para aislar el precipitado del conjugado. El conjugado se resuspendió con PBS pH 7.2 y NaN3 al 0.09 %. La cuantificación se realizó utilizando el ensayo de Bradford.
Preparación del anticuerpo de detección anti-toxina B de C. diffidle
La formación del conjugado de ADN del anticuerpo monoclonal de ratón anti-toxina B de C. difficile se logró mediante la formación de un enlace de bis-arilhidrazona entre el anticuerpo y la plantilla de ADN. La plantilla de ADN Im001_NH2 (Tabla 9) se resuspendió con tampón de modificación (fosfato 0.1 M, pH 8.0, NaCl 0.15 M) a 1.7 nmol/OD. Se añadió un exceso de 4-formilbenzoato de succinimidilo (SFB, TriLink Biotechnologies) en DMF a la plantilla de amino y se mezcló a 600 RPM durante 2.5 horas a temperatura ambiente. La plantilla modificada con aldehido se desalinizó dos veces y el tampón se intercambió por el tampón de conjugación (fosfato 0.1 M, pH 6.0, NaCl 0.15 M) usando una columna de centrifugación ZEBAMC a 1,500 x g durante 2 minutos.
El anticuerpo, 516 jg , se intercambió en el tampón de modificación utilizando una columna de centrifugación ZEBAMC con una concentración resultante de 2.5 mg/mL medida por absorción a 280 nm. Se añadieron al anticuerpo doce equivalentes de 4-hidrazinonicotinato de succinimidilo acetona hidrazona (SANH, TriLink Biotechnologies) en DMF y se mezclaron a 600 RPM durante 2.5 horas a temperatura ambiente. Se usó una columna de centrifugación ZEBAMC para desalinizar e intercambiar el anticuerpo modificado en el tampón de conjugación. La concentración de anticuerpos modificados se determinó utilizando el ensayo de Bradford.
El conjugado de anticuerpo-ADN se formó mezclando un exceso de la plantilla de ADN modificada con aldehido con el anticuerpo modificado con hidrazona durante la noche a 4 °C. El conjugado resultante se purificó por exclusión por tamaño (Superdex 200 Increase 10/300, GE Healthcare) bajo un gradiente isocrático de PBS pH 7.3 a razón de 0.75 mL/min. El conjugado de anticuerpo-ADN se concentró usando un Concentrador centrífugo VIVASPIN® 500 con un corte de peso molecular de 50 kDa. Se determinó que la concentración del conjugado era de 3.5 mg/mL usando el ensayo MICRO BCAMC (Thermo Fisher).
Tabla 9. Plantilla de ADN
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Ensayo de inmuno-PCR basado en partículas (iPCR) con placa filtrante
Preparación de partículas de captura
Los anticuerpos biotinilados, 4 jg/mL, se inmovilizaron en microesferas de látex recubiertas de estreptavidina de 1 jm (Spherotech) a una concentración de 2 * 109 partículas/mL en diluyente de ensayo (PBS pH 7.4, caseína al 1 % y BSA al 1 %) durante 1 hora a temperatura ambiente mezclando. Las suspensiones de perlas de anticuerpo inmovilizadas se lavaron 5 veces con 1 mL de PBST (PBS pH 7.3, Tween 20 al 0.1 %) o PBS-TX (Triton X-100 al 0.1 %). Entre lavados, las partículas se recuperaron por centrifugación a 9,000 * g durante 4 minutos. Las perlas de anticuerpo inmovilizados se bloquearon con STABILCOAT® Plus Microarray Stabilizer (Surmodics) durante 2 horas a 37 °C mezclando a 600 RPM y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Antes de su uso, las partículas se lavaron 1 vez con PBS pH 7.3 y se llevaron a una concentración de trabajo de ~2.8 * 109 partículas/mL con diluyente de ensayo. Ensayos de placa filtrante de toxina B de C. diffiále e IL-8 humana
1. Se realizó una dilución en serie de 10 veces de toxina B de C. difficile (Enzo Life Sciences) utilizando un diluyente de ensayo que cubría un intervalo de 0 - 1,600 ng/mL. Se utilizó diluyente de ensayo para 0 ng/mL.
2. Se realizó una dilución en serie de 5 veces de IL-8 humana (Perpotech) utilizando un diluyente de ensayo que cubría un intervalo de 0 - 10,000 pg/mL. Se usó diluyente de ensayo para 0 pg/mL.
3. Se realizó el humedecimiento previo y el bloqueo de la superficie de una placa filtrante de PCF (policarbonato) de 96 pocillos con un tamaño de poro de 0.45 pm (Millipore Sigma) utilizando 150 pL de diluyente de ensayo a temperatura ambiente durante 1 hora antes de su uso. Se usó filtración al vacío a 7" de Hg de vacío para eliminar el diluyente usando el colector de vacío MULTISCREENMC (Millipore Sigma).
4. Ensayo de toxina B
a. Se añadieron 75 pL de diluyente de ensayo a todos los pocillos.
b. Se añadieron 25 pL de partículas a la concentración de trabajo (~2.8 * 109 partículas/mL) a todos los pocillos. c. Se añadieron 25 pL de cada toxina B diluida en serie a los pocillos apropiados. Se usó diluyente de ensayo para el control cero. El ensayo se realizó por duplicado.
d. La placa se selló y se colocó en un agitador a 650 RPM durante 5 minutos. La reacción se filtró a 6 - 7" de Hg. e. La reacción se lavó 10 veces con 200 pL de PBST.
f. Se añadieron 100 pL de conjugado de anticuerpo anti-toxina B de C. difficile-ADN (0.5 pg/mL) a todos los pocillos. g. La placa se selló y se colocó en un agitador a 650 RPM durante 5 minutos. La reacción se filtró a 6 - 7" de Hg. h. La reacción se lavó 10 veces con 200 pL de PBST.
i. Se añadieron 65 pL de KOH 25 mM a cada pocillo, se selló la placa, se colocó en un agitador a 650 RPM durante 5 minutos.
j. Se añadieron 70 pL de Tris-Cl 50 mM pH 7.0 a cada pocillo y el eluyente se recogió en una placa de 96 pocillos de fondo sólido mediante vacío a 6 - 7 ” de Hg.
5. Ensayo de IL-8
a. Se añadieron 50 pL de diluyente de ensayo a todos los pocillos.
b. Se añadieron 25 pL de partículas a la concentración de trabajo (~2.8 * 109 partículas/mL) a todos los pocillos. c. Se añadieron 25 pL de cada toxina B diluida en serie a los pocillos apropiados. Se usó diluyente de ensayo para el control cero. El ensayo se realizó por duplicado.
d. La placa se selló y se colocó en un agitador a 650 RPM durante 10 minutos. La reacción se filtró a 6 - 7" de Hg. e. La reacción se lavó 5 veces con 250 pL de PBST.
f. Se añadieron 100 pL de conjugado de anticuerpo anti-IL-8 humana-ADN (30 ng/mL) a todos los pocillos.
g. La placa se selló y se colocó en un agitador a 650 RPM durante 10 minutos. La reacción se filtró a 6 - 7" de Hg. h. La reacción se lavó 9 veces con 225 pL de PBST.
i. Se añadieron 65 pL de KOH 25 mM a cada pocillo, se selló la placa, se colocó en un agitador a 650 RPM durante 5 minutos.
j. Se añadieron 70 pL de Tris-Cl 50 mM pH 7.0 a cada pocillo y el eluyente se recogió en una placa de 96 pocillos de fondo sólido mediante vacío a 6 - 7 ” de Hg.
6. Detección por PCR
a. Se añadieron 2 pL de eluyente de ensayo a una placa de PCR de 96 pocilios. Luego, 18 pL de mezcla maestra de PCR que contenía 2 unidades de polimerasa Pheonix Hot Start Taq (Enzymatics) en tampón Gc 1 vez complementado con 0.2 mg/mL de BSA, Tween 20 al 0.2 %, magnesio 0.4 mM (Mg2+ total 2.4 mM), dNTP 200 pM, cebador directo 0.5 pM, cebador inverso 1.0 pM y sonda 0.35 pM (Tabla 2).
b. Se realizó una PCR de dos etapas de acuerdo con el protocolo enumerado en la Tabla 10.
Tabla 10. Cebadores de PCR, sonda y protocolo de PCR
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Ensayo de inmuno-PCR automatizado con el cartucho GeneXpert
La Figura 11 muestra un resumen del proceso de ensayo automatizado. La Figura 12 muestra las asignaciones de la cámara del cartucho (CH), los reactivos y los volúmenes iniciales. Los reactivos de ensayo se dispensaron en el cartucho A+ equipado con un filtro de fibra de vidrio y un tamaño de poro de 0.7 pm.
1. Ensayo automatizado de toxina B
Cebado del cartucho
a. Se usaron 500 pL de PBST (CH2) para cebar las rutas fluidas directas y filtrantes y se suministraron a CH8. Captura de toxina B
b. Se aspiran 25 pL de estándar de toxina B de C. diffiále de CH3 y se suministran para capturar partículas en CH4. c. En CH3, durante 5 minutos, la muestra se incuba con las partículas de captura con dos eventos de mezcla a 142 segundos.
d. Para mover la toxina B inmovilizada en las partículas al filtro, se mueven 125 pL del contenido de CH3 desde CH3 a través de la ruta del filtro hacia CH8.
e. El CH3 se lava moviendo 200 pL de PBST de CH2 a CH3 y luego moviendo el contenido de CH3 a CH8 a través de la ruta del filtro.
f. La toxina B inmovilizada en partículas se lava 10 veces con alícuotas de 250 pL de PBST moviendo PBST de CH2 a CH8 a través de la ruta del filtro.
Detección de la toxina B
g. Para la detección, se aspiran 75 pL de diluyente de ensayo (CH1) a través de la ruta del filtro y se transfieren a CH10 moviendo las partículas cargadas con la toxina B al conjugado de ADN anti-toxina B de C. difficile.
h. En CH10, durante 5 minutos, la muestra se incuba con las partículas con dos eventos de mezcla a 142 segundos. i. Para mover el complejo inmune inmovilizado al filtro, se mueven 100 pL del contenido de CH10 desde CH10 a través de la ruta del filtro hacia CH8.
j. CH10 se lava moviendo 200 pL de PBST de CH5 a CH10 y luego moviendo el contenido de CH10 a CH8 a través de la ruta del filtro.
k. El complejo inmune inmovilizado se lava 10 veces con alícuotas de 250 pL de PBST moviendo PBST de CH5 a CH8 a través de la ruta del filtro.
Ruptura y neutralización de complejos inmunes
l. Se aspiran 65 pL de KOH de CH11 y se dispensan en CH9 a través del filtro que contiene el complejo inmune inmovilizado en partículas y se mezclan 2 veces.
m. Se aspiran 15 pL de KOH de CH9 en la jeringa equilibrando el contenido del líquido en tres espacios: 15 pL en jeringa, 40 pL en la región del filtro y 10 pL en CH9.
n. En la región del filtro, las partículas cargadas con el complejo inmune se sonican a una amplitud del 40 % durante 15 segundos, se mezclan y se sigue con una etapa de espera de 60 segundos. El proceso se repite una vez más para un total de 2 minutos de exposición del complejo inmune a KOH. (Nota: La elución se puede realizar con o sin sonicación y con una duración de 2 - 5 minutos).
o. Se mueven 70 pL de Tris-Cl de CH6 a CH9 a través de la ruta del filtro para neutralizar la plantilla de ADN eluida.
Preparación y detección de PCR
p. Se mueven 8 pL de la muestra de CH9 a CH7 y se mezclan con la mezcla maestra de PCR una vez. CH7 contiene 72 pL de mezcla maestra de PCR que contiene 6.4 unidades de polimerasa Pheonix Hot Start Taq (Enzymatics) en tampón GC 1 vez complementado con 0.2 mg/mL de BSA, Tween 20 al 0.2 %, magnesio 0.4 mM (Mg2+ total 2.4 mM), dNTP 200 pM, cebador directo 0.5 pM, cebador inverso 1.0 pM y sonda 0.35 pM (Tabla 2).
q. Se aspiran 70 pL de la mezcla de PCR en el tubo de reacción de PCR.
r. La PCR se realiza de acuerdo con el protocolo descrito en la Tabla 10. Se utiliza un fluoróforo y un inhibidor patentados para preparar la sonda Taqman. La señal de emisión generada por la hidrólisis de la sonda se detecta entre 620 - 645 nm.
Resultados
La respuesta a la dosis de iPCR de IL-8 humana se creó combinando diluciones de cinco veces (10,000 - 0.64 pg/mL) de la citocina recombinante y se midió por duplicado. Los resultados se muestran en la Figura 13. El intervalo dinámico (80 - 10,000 pg/mL) y el límite de detección (80 pg/mL) están limitados por las interacciones no específicas del conjugado de detección de anti IL8-humana-ADN con la superficie de la partícula. La CV de precisión entre ensayos fue < 4 %, lo que representa un rendimiento aceptable en el intervalo de dosis de 3.2 - 10,000 pg/mL. La alta imprecisión (% de CV > 10) del ensayo ocurre en las concentraciones de dosis baja y cero, 0.64 pg/mL y 0 pg/mL, Tabla 11.
Tabla 11. Ct promedio de IL-8 humana e imprecisión del ensayo
[IL.8) (pg/mL) Ct promedio DE % de CV
0 21.4 2.79 13.1
1 22.1 2.27 10.3
3.2 22.3 0.59 2.6
16 21.1 0.50 2.4
80 19.7 0.10 0.5
400 17.6 0.16 0.9
2,000 15.2 0,60 4.0
10,000 14 3 0.53 3.7
El ensayo de placa filtrante manual de iPCR para toxina B de C. diffiále demostró una CV entre ensayos < 4 % a través del intervalo de dilución de diez veces de 1,600 -0.0016 ng/mL (Figura 14 y Tabla 12) con un límite de detección de 0.16 ng/mL. En comparación, la automatización del ensayo usando cartucho GENEXPERT® demostró una mayor imprecisión (hasta un 14 % de CV) en todo el intervalo del ensayo (Tabla 4). El límite de detección se redujo 1,000 veces debido a la imprecisión de la réplica. Se anticipa que las mejoras adicionales al protocolo automatizado del fluido del cartucho reducirán la imprecisión del ensayo y aumentarán la sensibilidad del ensayo.
Tabla 12. Ct promedio de toxina B de C. diffiále e imprecisión del ensayo
[Toxina B] (ng/mL)
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Ct promedio DE manual % de CV Ct promedio DE automatizada % de CV 0 24.9 0.24 1.0 24 3.2 12.4
0.0016 24.9 0.25 1.0 N/A N/A N/A
0.016 24.7 0,63 2.5 23.7 2.1 8.9
0.16 24.0 0.14 0.6 22.1 1.1 5.0
1.6 21.5 0.06 0.3 19.8 2.7 13.6
16 18.3 0.22 1.2 19.3 1.4 7.3
160 15.6 0.61 3.9 14.8 1.2 0.6
1600 13.2 0.28 2.1 13.4 1.4 1.5 Para comparar el rendimiento entre la automatización del ensayo de inmuno-PCR de la toxina B de C. diffiále con el ensayo de placa filtrante, la toxina B se agregó al diluyente del ensayo (PBS, BSA al 1 %, NaN3 al 0.05 %, pH 7.4), se diluyó diez veces en serie y se analizó con cada formato con ambas iteraciones tomando una hora para el resultado. Ambos formatos dan como resultado un % de CV <10% en todo el intervalo de dilución (Tabla 13).
Tabla 13. Imprecisión del ensayo automatizado y manual de la toxina B de C. diffiále
Manual Automatizado
[Toxina B] (ng/mL)
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Ct promedio % de CV Ct promedio % de CV
0 29.7 ± 1.1 3.8 22.1 ± 1.2 5.5
0.0025 28.3 ± 1.6 5.7 N/A
0.025 28.3 ± 0.81 2.8 21.1 ± 1.6 7.6
0.25 27.0 ± 0.41 1.5 23.2 ±0.57 2.4
2.5 22.9 ± 0.07 0.3 21.9 ±0.31 1.4
25 18.4 ±0.47 2.5 18.8 ±0.40 2.1
250 15.6 ±0.12 0.8 16.7 ±0.26 1.6
2500 15.0 ±0.18 1.2 15.7 ±0.21 1.4
Las curvas de respuesta a la dosis se ajustaron usando un ajuste logístico de cuatro parámetros con el límite superior de cuantificación (ULOQ) y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) calculados usando la predicción inversa de la concentración graficada. Se restó o se sumó tres veces la desviación estándar a los valores promedio de Ct para los cálculos de LLOQ o ULOQ respectivamente utilizando un nivel de confianza del 95 %. La Figura 15 muestra las curvas de respuesta a la dosis ajustadas entre los dos métodos. Hay una reducción de 65 veces en el LOD con el proceso automatizado en comparación con el método manual; sin embargo, el LLOQ (32.5 ng/mL) para el proceso automatizado sigue siendo clínicamente relevante y suficiente para respaldar la selección del tratamiento para pacientes con infección por C. diffiále.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un cartucho para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho cartucho:
una cámara de recepción de muestras;
una cámara que comprende un material de la matriz que actúa como filtro y/o agente de unión al ADN;
un canal o cámara con control de temperatura; y
una pluralidad de cámaras que contienen reactivos para realizar inmuno-PCR, en donde:
dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de captura que se une al analito que se va a detectar;
dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene un anticuerpo de detección donde dicho anticuerpo de detección está opcionalmente unido directa o indirectamente a un ADN señal;
dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una mezcla maestra de PCR;
dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene cebadores para amplificar todo o una región de dicho ADN señal; y
dicha pluralidad de cámaras comprende una cámara que contiene una sonda para detectar todo o una región de dicho ADN señal,
donde dicha cámara receptora de muestras, comprendiendo dicha cámara un material de la matriz, dicho canal o cámara de calentamiento con control de temperatura o un puerto en dicho canal o cámara con control de temperatura, y dicha pluralidad de cámaras están dispuestas alrededor de una válvula central y selectivamente en comunicación fluida con un canal en dicha válvula central, donde dicha válvula central está configurada para acomodar un émbolo que es capaz de aspirar fluido dentro o fuera de una cámara en comunicación fluida con dicha válvula central.
2. El cartucho de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha válvula central comprende un cilindro de jeringa en comunicación fluida con un cuerpo de válvula y que está sellado con una junta, y donde dicho cilindro de jeringa y dicho cuerpo de válvula están configurados para girar.
3. El cartucho de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, donde dichos cebadores y/o sondas de PCR y/o polimerasa en dicha mezcla maestra se proporcionan como perlas; y/o donde dicho cartucho contiene anticuerpos de detección para la detección de un solo analito o una pluralidad de analitos; y/o donde dicho cartucho contiene anticuerpos de captura para la captura de un solo analito.
4. El cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo de captura está unido a una partícula; o donde dicho anticuerpo de captura se une a una partícula y donde dicha partícula varía en tamaño de al menos aproximadamente 0.5 pm, o desde aproximadamente 1 pm hasta aproximadamente 10 pm, o hasta aproximadamente 3 pm, o donde dicha partícula varía en tamaño de aproximadamente 1 pm hasta aproximadamente 2.8 pm.
5. El cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha pluralidad de cámaras comprende además una cámara que contiene cebadores de PCR para amplificar un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal; y/o donde dicha pluralidad de cámaras comprende además una cámara que contiene una sonda para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal; y/o donde dicho analito diana comprende un polipéptido y un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal comprende un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido o un fragmento del mismo; y/o donde dicho analito diana comprende un polipéptido y un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal comprende un ácido nucleico característico de una célula, tejido u organismo que produce dicho polipéptido.
6. El cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho cartucho está configurado de manera que, cuando está en uso, dicho cartucho comprende:
una cámara que contiene una muestra;
una cámara que contiene dicho anticuerpo de detección;
una cámara que contiene dicho anticuerpo de captura;
una cámara que contiene un tampón de lavado; y
una cámara que contiene una mezcla maestra de PCR para amplificar dicho ADN señal.
7. Un método para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico diana, comprendiendo dicho método: proporcionar una muestra en una cámara receptora de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR; y usar dicho cartucho en un método de inmuno-PCR que comprende:
poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de captura en condiciones en las que dicho anticuerpo de captura se une a dicho analito, formando un complejo de anticuerpo de captura/analito;
poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de detección unido a un ADN señal en condiciones en las que dicho anticuerpo de detección se une específicamente y forma un complejo inmune con dicho complejo de anticuerpo de captura/analito;
liberar dicho complejo inmune o una parte del mismo que comprende dicho ADN señal y administrar dicho complejo inmune o una porción del mismo en un canal o cámara con control de temperatura; y
realizar una amplificación de ácido nucleico en dicho canal o cámara con control de temperatura para detectar y/o cuantificar dicho ácido nucleico señal, detectando y/o cuantificando así dicho analito, donde dicho cartucho es un cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un método para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho método: proporcionar una muestra en una cámara receptora de muestras de un cartucho configurado para realizar inmuno-PCR; y usar dicho cartucho en un método de inmuno-PCR que comprende:
poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de captura en condiciones en las que dicho anticuerpo de captura se une a dicho analito, formando un complejo de anticuerpo de captura/analito;
poner en contacto dicho analito con un anticuerpo de detección donde dicho contacto se realiza en condiciones en las que dicho anticuerpo de detección se une específicamente y forma un complejo inmune con dicho complejo de anticuerpo de captura/analito;
poner en contacto dicho complejo inmune con un anticuerpo marcado que se une a dicho anticuerpo de detección donde dicho anticuerpo marcado se une a un ADN señal y dicho contacto se realiza en condiciones en las que dicho anticuerpo marcado se une específicamente a dicho anticuerpo de detección para formar un complejo inmune marcado;
liberar dicho complejo inmune marcado o una parte del mismo que comprende dicho ADN señal y administrar dicho complejo inmune o una parte del mismo en un canal o cámara con control de temperatura; y
realizar una amplificación de ácido nucleico en dicho canal o cámara con control de temperatura para detectar y/o cuantificar dicho ácido nucleico señal, detectando y/o cuantificando así dicho analito, donde dicho cartucho es un cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde dicho método se realiza en una pluralidad de analitos diferentes en el mismo cartucho; y/o donde dicho método se puede completar en aproximadamente 1 hora o menos, o en aproximadamente 50 minutos o menos, o en aproximadamente 40 minutos o menos, o en aproximadamente 30 minutos o menos, o en aproximadamente 2o minutos o menos, o en aproximadamente 15 minutos o menos.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 -9 , donde
dicho método se realiza en un cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 - 6; y
dicho método comprende además amplificar un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal.
11. El método de la reivindicación 10, donde dicha amplificación de un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal comprende:
unir un ácido nucleico de dicha muestra a un material de la matriz;
lavar el ácido nucleico unido para proporcionar un ácido nucleico lavado;
eluir el ácido nucleico lavado; y
someter dicho ácido nucleico lavado a una reacción de amplificación para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana si está presente en dicho ácido nucleico lavado.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 - 11, donde dicho ácido nucleico distinto de dicho ADN señal comprende un ADN o un ARN; y/o donde dicha amplificación de un ácido nucleico distinto de dicho ADN señal se realiza en un ácido o ácidos nucleicos obtenidos de la misma muestra en la cámara de muestras utilizada para dicha inmuno-PCR o en un ácido o ácidos nucleicos obtenidos de una muestra en un cámara de muestra diferente a la cámara de muestra utilizada para dicha inmuno-PCR; y/o donde los ADN señal y el ácido o ácidos nucleicos distintos del ADN señal se amplifican secuencialmente en el mismo canal o cámara con control de temperatura.
13. Un sistema para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o para detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho sistema:
un recinto configurado para contener uno o más módulos de procesamiento de muestras, cada módulo de procesamiento de muestras configurado para contener un cartucho extraíble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho sistema está configurado para operar los módulos de procesamiento de muestras para realizar inmuno-PCR para determinar la presencia y/o la cantidad de uno o más analitos diana y/o para determinar el nivel de una o más secuencias de ADN diana dentro de un cartucho de muestra extraíble correspondiente, donde dicho procesamiento en una muestra dentro del cartucho de muestra extraíble correspondiente realiza un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-12.
14. Un kit para realizar inmuno-PCR para detectar y/o cuantificar uno o más analitos diana, y/o detectar y/o cuantificar un ácido nucleico, comprendiendo dicho kit:
un recipiente que contiene un cartucho de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
15. El kit de la reivindicación 14, donde dicho kit comprende además un recipiente que contiene uno o más reactivos para preparar una muestra para inmuno-PCR.
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