ES2886012T3 - Métodos y composiciones para la ingeniería y corrección de genomas mediadas por nucleasas en células madre hematopoyéticas - Google Patents

Métodos y composiciones para la ingeniería y corrección de genomas mediadas por nucleasas en células madre hematopoyéticas Download PDF

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Abstract

Una célula genéticamente modificada, que comprende: - un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en un gen endógeno de beta-hemoglobina (Hbb) humana; y - una modificación genómica dentro de 1-300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 del gen Hbb después de la ruptura bicatenaria por el par de nucleasas en dedo de zinc, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, y en la que la modificación genómica comprende una inserción y/o supresión.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para la ingeniería y corrección de genomas mediadas por nucleasas en células madre hematopoyéticas
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere al campo de la ingeniería del genoma, en particular la modificación dirigida del genoma de una célula hematopoyética.
ANTECEDENTES
Uno de los enfoques más prometedores en la terapia génica para un gran número de enfermedades implica el uso de modificación de genes in vitro de células madre, seguido de trasplante e injerto de las células modificadas en un paciente. Particularmente prometedor es cuando las células madre introducidas muestran persistencia a largo plazo y diferenciación de múltiples linajes. Las células madre hematopoyéticas, más comúnmente en forma de células enriquecidas en base a la expresión del marcador de superficie celular CD34, son una población celular particularmente útil, ya que se pueden obtener fácilmente y contienen las células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSC), que pueden reconstituir todo el linaje hematopoyético después del trasplante.
Se han descrito diversos métodos y composiciones para la escisión dirigida de ADN genómico. Tales eventos de escisión dirigida pueden usarse, por ejemplo, para inducir mutagénesis dirigida, inducir supresiones dirigidas de secuencias de ADN celular, y facilitar la recombinación dirigida en un locus cromosómico predeterminado en células de cualquier organismo. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 9.045.763; 9.005.973; 8.956.828; 8.945.868; 8.586.526; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; las Publicaciones de Patentes U.S. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960 y 20150056705, y la Solicitud US n214/706.747. Estos métodos a menudo implican el uso de sistemas de escisión manipulados mediante ingeniería para inducir una rotura bicatenaria (DSB) o una muesca en una secuencia de ADN diana, de modo que la reparación de la rotura mediante un proceso generado por error, tal como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación usando un molde de reparación (reparación dirigida por homología o HDR) puede dar como resultado la desactivación de un gen o la inserción de una secuencia de interés (integración dirigida). La ruta de reparación seguida (NHEJ frente a HDR, o ambas) depende típicamente de la presencia de un molde de reparación y de la actividad de varias rutas de reparación que compiten.
La introducción de una rotura bicatenaria en ausencia de un molde de reparación suministrada externamente (por ejemplo, donante) se usa comúnmente para la inactivación del gen diana a través de mutaciones introducidas mediante la ruta celular de NHEJ. Las rutas de NHEJ se pueden separar en la ruta estándar dependiente de Ku y una ruta alternativa independiente de Ku basada en la unión de extremos mediada por microhomología, que aprovecha pistas cortas de repeticiones directas cerca del sitio de escisión. El patrón de inserciones y/o supresiones (“indels”) después de la edición de genes a través de estas dos rutas de NHEJ difiere, lo que puede dar lugar a diferencias en las consecuencias funcionales de las mutaciones, según la aplicación.
En presencia de un donante suministrado externamente que porta tramos de homología con las secuencias que flanquean la ruptura bicatenaria, la reparación génica dirigida por homología (HDR) que usa la molécula del donante se puede usar para cambiar la secuencia de una sola base o un pequeño tramo de a Dn (“corrección de genes”) o, en el otro extremo, para la inserción dirigida de un casete de expresión completo (“adición de genes”) en una ubicación genómica predeterminada.
La escisión puede ocurrir mediante el uso de nucleasas específicas, tales como nucleasas en dedo de zinc manipuladas (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), o mediante el sistema CRISPR/Cas con un crRNA/tracrRNA manipulado (“ARN de guía única”) para guiar la escisión específica. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 8.697.359 y 8.932.814, y la Publicación de Patente U.S. n° 20150056705. Además, se están desarrollando nucleasas dirigidas basadas en el sistema Argonauta (por ejemplo, de T. thermophilus, conocido como “TtAgo” ; véase Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261), que también puede tener potencial para usos en la edición del genoma y la terapia génica. El documento WO 2014/036219 describe nucleasas en dedo de zinc contra la beta globina humana.
La escisión dirigida usando uno de los sistemas de nucleasas mencionados anteriormente puede explotarse para insertar un ácido nucleico en una ubicación diana específica usando procesos mediados por HDR o NHEJ. Sin embargo, administrar tanto el sistema de nucleasa como el donante a la célula puede ser problemático. Por ejemplo, el suministro de un donante o una nucleasa mediante la transducción de un plásmido en la célula puede ser tóxico para la célula receptora, especialmente para una célula que es una célula primaria y por lo tanto no tan robusta como una célula de una línea celular.
Las células madre o progenitoras CD34+ son un conjunto heterogéneo de células que se caracterizan por su capacidad para autorrenovarse y/o diferenciarse en las células del linaje linfoide (por ejemplo, células T, células B, células NK) y linaje mieloide (por ejemplo, monocitos, eritrocitos, eosinófilos, basófilos, y neutrófilos). Su naturaleza heterogénea surge del hecho de que dentro de la población de células madre CD34+, existen múltiples subgrupos que a menudo reflejan la multipotencia (ya sea de linaje comprometido) de un grupo específico. Por ejemplo, las células CD34+ que son CD38- son células progenitoras CD34+ más primitivas e inmaduras (también conocidas como progenitores hematopoyéticos a largo plazo), mientras que las que son CD34+CD38+ (progenitores hematopoyéticos a corto plazo) están comprometidas con el linaje (véase Stella et al (1995) Hematologica 80:367-387). Cuando esta población progresa entonces más abajo en la ruta de diferenciación, se pierde el marcador CD34. Las células madre CD34+ tienen un enorme potencial en la terapia celular clínica.
Los glóbulos rojos (RBC), o eritrocitos, son el principal componente celular de la sangre. De hecho, los RBC representan una cuarta parte de las células en un ser humano. Los RBC maduros carecen de núcleo y de muchos otros orgánulos en los seres humanos, y están llenos de hemoglobina, una metaloproteína que se encuentra en los RBC y que funciona para transportar oxígeno a los tejidos y transportar dióxido de carbono fuera de los tejidos y de regreso a los pulmones para su eliminación. La proteína constituye aproximadamente el 97% del peso seco de los RBC y aumenta la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre en alrededor de setenta veces. La hemoglobina es un heterotetrámero que comprende dos cadenas de globina de tipo a y dos cadenas de globina de tipo b y 4 grupos hemo. En los adultos, el tetrámero a2b2 se conoce como hemoglobina A (HbA) o hemoglobina adulta. Normalmente, las cadenas de globina alfa y beta se sintetizan en una relación aproximada de 1:1, y esta relación parece ser crítica en términos de estabilización de hemoglobina y RBC. De hecho, en algunos casos en los que un tipo de gen de globina se expresa de forma inadecuada (véase más abajo), la reducción de la expresión (por ejemplo, usando un ARNip específico) del otro tipo de globina, que restaura esta relación 1:1, alivia algunos aspectos del fenotipo celular mutante (véase Voon et al (2008) Haematologica 93(8): 1288). En un feto en desarrollo, se produce una forma diferente de hemoglobina, la hemoglobina fetal (HbF), que tiene una mayor afinidad de unión por el oxígeno que la hemoglobina A, de modo que el oxígeno puede llegar al sistema del bebé a través del torrente sanguíneo de la madre. La hemoglobina fetal también contiene dos cadenas de globina a, pero en lugar de las cadenas de globina b del adulto, tiene dos cadenas de globina g fetal (es decir, la hemoglobina fetal es a2g2). Aproximadamente a las 30 semanas de gestación, la síntesis de g globina en el feto comienza a disminuir mientras aumenta la producción de b globina. Aproximadamente a los 10 meses de edad, la hemoglobina del neonato es casi toda a2b2, aunque algo de HbF persiste hasta la edad adulta (aproximadamente 1-3% de la hemoglobina total). La regulación del cambio de la producción de g a b es bastante compleja, e implica principalmente una disminución de la expresión de g globina con un aumento simultáneo de la expresión de b globina.
Los defectos genéticos en las secuencias que codifican las cadenas de hemoglobina pueden ser responsables de una serie de enfermedades conocidas como hemoglobinopatías, tales como la anemia drepanocítica y las talasemias. En la mayoría de los pacientes con hemoglobinopatías, los genes que codifican la g globina permanecen presentes, pero la expresión es relativamente baja debido a la represión génica normal que se produce alrededor del parto, como se describió anteriormente.
Se estima que 1 de cada 5000 personas en los Estados Unidos de América tiene la anemia drepanocítica (SCD), principalmente en personas de ascendencia africana subsahariana. Parece haber un beneficio de la heterocigosidad de células falciformes para la protección contra la malaria, por lo que este rasgo puede haber sido seleccionado con el tiempo, de modo que se estima que en el África subsahariana, un tercio de la población tiene el rasgo de células falciformes. La anemia drepanocítica es causada por una mutación en el gen de b-globina en la que la valina sustituye al ácido glutámico en el aminoácido n° 6 (un GAG a GTG a nivel del ADN), en la que la hemoglobina resultante se denomina “hemoglobina S” o “HbS”. En condiciones de menos oxígeno, un cambio conformacional en la forma desoxi de HbS expone un parche hidrófobo en la proteína entre las hélices E y F. Los restos hidrófobos de la valina en la posición 6 de la cadena beta en la hemoglobina pueden asociarse con el parche hidrófobo, lo que hace que las moléculas de HbS se agreguen y formen precipitados fibrosos. Estos agregados provocan, a su vez, la anomalía o “formación de células falciformes” de los RBC, lo que da como resultado una pérdida de flexibilidad de las células. Los RBC falciformes ya no pueden introducirse en los lechos capilares, y pueden provocar una crisis vasooclusiva en pacientes con anemia drepanocítica. Además, los RBC falciformes son más frágiles que los RBC normales, y tienden a la hemólisis, lo que eventualmente conduce a anemia en el paciente.
El tratamiento y el manejo de pacientes con anemia drepanocítica es una propuesta de por vida que implica el tratamiento con antibióticos, el manejo del dolor, y las transfusiones durante los episodios agudos. Un enfoque es el uso de hidroxiurea, que ejerce sus efectos en parte aumentando la producción de g globina. Sin embargo, aún se desconocen los efectos secundarios a largo plazo de la terapia crónica con hidroxiurea, y el tratamiento produce efectos secundarios no deseados y puede tener una eficacia variable de un paciente a otro. A pesar de un aumento en la eficacia de los tratamientos de drepanocitos, la esperanza de vida de los pacientes todavía se encuentra entre mediados y finales de los 50, y las morbilidades asociadas de la enfermedad tienen un impacto profundo en la calidad de vida del paciente.
De este modo, sigue existiendo la necesidad de métodos y composiciones adicionales que puedan usarse para la edición del genoma, para corregir un gen aberrante o alterar la expresión de otros, por ejemplo, para tratar hemoglobinopatías tales como la anemia drepanocítica.
SUMARIO
La invención proporciona una célula modificada genéticamente que comprende: un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en un gen endógeno de betahemoglobina (Hbb) humana; y una modificación genómica dentro de 1 -300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 del gen Hbb después de la rotura bicatenaria por el par de nucleasas en dedo de zinc, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, y en la que la modificación genómica comprende una inserción y/o supresión.
La invención también proporciona un método in vitro para producir una célula genéticamente modificada que comprende una inserción y/o supresión dentro de 1-300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 de un gen endógeno de beta-hemoglobina (Hbb) humana, comprendiendo el método producir una ruptura bicatenaria usando un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en el gen Hbb, comprendiendo el par las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1.
La invención proporciona además una célula diferenciada modificada genéticamente que desciende de la célula madre modificada genéticamente de la invención, opcionalmente en la que la célula diferenciada es un glóbulo rojo (RBC), comprendiendo la célula diferenciada modificada genéticamente: - un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en el gen Hbb; y - una modificación genómica dentro de 1-300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 del gen Hbb después de la rotura bicatenaria por el par de nucleasas en dedo de zinc, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, y en la que la modificación genómica comprende una inserción y/o supresión.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula modificada genéticamente de la invención.
La invención también proporciona una nucleasa en dedo de zinc que comprende una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en la que la proteína en dedo de zinc comprende las regiones de hélice de reconocimiento ordenadas como se muestra en las proteínas designadas como 33488, 47773 o 47817 en la Tabla 1.
La invención proporciona además una proteína de fusión que comprende la proteína en dedo de zinc como se define en la nucleasa en dedo de zinc de la invención, y un semidominio de escisión de tipo salvaje o manipulado.
La invención proporciona una nucleasa que comprende un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1.
La invención también proporciona un polinucleótido que codifica una o más nucleasas en dedo de zinc de la invención, proteínas de fusión de la invención, o nucleasas de la invención. La invención proporciona además una célula aislada que comprende un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, opcionalmente en la que la célula es un glóbulo rojo (RBC) o una célula precursora (por ejemplo, célula madre hematopoyética CD4+).
La invención proporciona un kit que comprende un par de nucleasas en dedo de zinc o un polinucleótido que codifica un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en el que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1.
La invención también proporciona un método in vitro para alterar la expresión de Hbb en una célula, comprendiendo el método: introducir, en la célula, uno o más polinucleótidos que codifican un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en el que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, en condiciones tales que se expresa una o más proteínas y se altera la expresión del gen Hbb, que comprende además opcionalmente la integración de una secuencia donante en el genoma de la célula.
La invención proporciona además la célula modificada genéticamente de la invención para uso en el tratamiento de una hemoglobinopatía, tal como anemia drepanocítica, en la que la célula es una célula madre hematopoyética, una célula precursora de glóbulos rojos, o un glóbulo rojo, y se injerta en un paciente.
La invención proporciona una célula genéticamente modificada que comprende una modificación genómica dentro de 1-300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 de un gen endógeno de beta-hemoglobina (Hbb) humana después de la ruptura bicatenaria mediante un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo el par las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817, en la que la modificación genómica comprende la integración de un polinucleótido donante que codifica un transgén que corrige una mutación de drepanocitos, y en la que la integración del polinucleótido donante introduce una o más mutaciones silenciosas como se muestra en la Figura 4C que bloquea re-escisión de la nucleasa en dedo de zinc.
Se describen aquí métodos y composiciones para alterar la expresión o para corregir uno o más genes que codifican proteínas implicadas en una enfermedad genética (por ejemplo, que produce proteínas que carecen, son deficientes o aberrantes en la enfermedad, y/o proteínas que regulan estas proteínas) tal como la anemia drepanocítica. Se describen composiciones y métodos para uso en terapia génica e ingeniería del genoma.
La alteración de tales proteínas puede dar como resultado el tratamiento de estas enfermedades genéticas. En particular, la edición del genoma se usa para corregir un gen aberrante, insertar un gen de tipo salvaje, o cambiar la expresión de un gen endógeno. Un enfoque implica el uso de corrección génica en la que se selecciona como diana un gen endógeno defectuoso de p-globina y se reemplaza la secuencia mutante. Un enfoque implica además el uso de la modificación de una célula madre (por ejemplo, célula madre hematopoyética o célula precursor de RBC), la cual se puede usar entonces para injertarla en un paciente, para el tratamiento de una hemoglobinopatía.
En un aspecto, se describe aquí una célula o línea celular modificada genéticamente, por ejemplo, en comparación con la secuencia genómica de tipo salvaje del mismo tipo de célula o línea celular. En ciertas realizaciones, las células comprenden precursores de RBC modificados genéticamente (células madre hematopoyéticas conocidas como “HSC”). La célula o línea celular puede ser heterocigótica u homocigótica para la modificación. Las modificaciones pueden comprender inserciones, supresiones y/o combinaciones de las mismas. Las HSC pueden modificarse con una nucleasa manipulada y un ácido nucleico donante, de modo que se inserta y expresa un gen de tipo salvaje (por ejemplo, gen de globina) y/o se corrige un gen aberrante endógeno. La modificación (por ejemplo, inserción) puede estar en o cerca del sitio o sitios de unión y/o escisión de la o las nucleasas, incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones a secuencias dentro de 1 -300 (o cualquier número de pares de bases entremedias) pares de bases en dirección 5’ o en dirección 3’ del sitio o sitios del sitio de escisión y/o unión; modificaciones dentro de 1-100 pares de bases (o cualquier número de pares de bases entremedias) de cualquier lado del sitio o sitios de unión y/o escisión; modificaciones dentro de 1 a 50 pares de bases (o cualquier número de pares de bases entremedias) en cualquier lado del sitio o sitios de unión y/o escisión; y/o modificaciones a uno o más pares de bases del sitio de unión a nucleasas y/o sitio de escisión. La modificación puede estar en o cerca (por ejemplo, 1-300 pares de bases o cualquier número de pares de bases entremedias) de SEQ ID NO: 23 o 24. En algunas realizaciones, la modificación es 1-100 (o cualquier número de pares de bases entremedias) pares de bases de SEQ ID NO: 23 o 24. En ciertas realizaciones, la modificación está dentro de la SEQ ID NO: 23 y/o la SEQ ID NO: 24, por ejemplo una modificación de 1 o más pares de bases en la SEQ ID NO: 23 o 24. En algunos casos, la secuencia del gen de tipo salvaje para la inserción codifica una p-globina de tipo salvaje. En otros casos, el gen aberrante endógeno es el gen de p-globina, por ejemplo, una o más modificaciones genómicas que corrigen al menos una mutación en un gen de beta-hemoglobina (Hbb) humana aberrante endógena. En algunos aspectos, la modificación del gen de beta globina permite un ayuste adecuado de los ARN transcritos. En otros aspectos, la modificación del gen de beta globina corrige la mutación en el alelo falciforme de tal manera que el codón GTG que codifica el aminoácido valina incorrecto en la sexta posición en la secuencia polipeptídica se altera a GAG, que codifica ácido glutámico como se encuentra en el polipéptido de tipo salvaje. También se proporcionan células parcial o totalmente diferenciadas descendientes de las células madre modificadas genéticamente como se describe aquí (por ejemplo, RBC o células precursoras de RBC). También se proporcionan composiciones tales como composiciones farmacéuticas que comprenden las células modificadas genéticamente como se describe aquí.
En otro aspecto, se describe aquí una proteína en dedo de zinc (ZFP) que se une a un sitio diana en una región de interés (por ejemplo, un gen de p-globina) en un genoma, en el que la ZFP comprende uno o más dominios de unión en dedo de zinc manipulados. La ZFP puede ser una nucleasa en dedo de zinc (ZFN) que escinde una región genómica diana de interés, en la que la ZFN comprende uno o más dominios de unión en dedo de zinc manipulados y un dominio de escisión por nucleasa o semidominio de escisión. Los dominios de escisión y los semidominios de escisión se pueden obtener, por ejemplo, a partir de diversas endonucleasas de restricción y/o meganucleasas. En una realización, los semidominios de escisión derivan de una endonucleasa de restricción de tipo IIS (por ejemplo, Fok I). El dominio en dedo de zinc puede reconocer un sitio diana en un gen de globina o puerto seguro. Por ejemplo, el dominio en dedo de zinc puede comprender 5 o 6 dominios en dedo de zinc y reconocer un sitio diana en un gen de globina (por ejemplo, una proteína en dedo de zinc que tiene 5 o 6 dedos con las regiones de hélice de reconocimiento que se muestran en la Tabla 1).
En otro aspecto, se describe aquí una proteína TALE (tipo activador de la transcripción) que se une al sitio diana en una región de interés (por ejemplo, gen de p-globina) en un genoma, en la que TALE comprende uno o más dominios de unión a TALE manipulados. En un aspecto de la descripción, TALE es una nucleasa (TALEN) que escinde una región genómica diana de interés, en la que TALEN comprende uno o más dominios de unión a ADN de TALE manipulados y un dominio de escisión por nucleasa o semidominio de escisión. Los dominios de escisión y los semidominios de escisión se pueden obtener, por ejemplo, a partir de diversas endonucleasas de restricción y/o meganucleasas. Los semidominios de escisión pueden derivar de una endonucleasa de restricción de tipo IIS (por ejemplo, Fok I).
En otro aspecto, se describe aquí un sistema CRISPR/Cas o TtAgo que se une al sitio diana en una región de interés (por ejemplo, un gen asociado a una enfermedad) en un genoma, en el que el sistema CRISPR/Cas comprende una nucleasa CRIPSR/Cas y un crRNA/tracrRNA manipulado (o ARN guía único). En ciertos aspectos de la descripción, el sistema CRISPR/Cas o TtAgo reconoce una diana en un gen de globina.
En algunas realizaciones, la nucleasa que facilita la ingeniería genómica de la célula se administra como un péptido, mientras que en otras se administra como un ácido nucleico que codifica la nucleasa. En algunas realizaciones, se usa más de una nucleasa, y se puede administrar en forma de ácido nucleico, forma de proteína, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones preferidas, el o los ácidos nucleicos que codifican la nucleasa es un ARNm, y, en algunos casos, el ARNm está protegido. En realizaciones preferidas adicionales, el ARNm puede comprender una caperuza ARCA y/o puede comprender una mezcla de nucleótidos modificados y no modificados. En aspectos de la descripción, la nucleasa puede comprender una nucleasa en dedo de zinc (ZFN), una nucleasa TALE (TALEN), un sistema de nucleasa TtAgo o CRISPR/Cas, o una combinación de los mismos. En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica la o las nucleasas se administra mediante electroporación. En otro aspecto, se describe aquí un método para aumentar la integración dirigida (por ejemplo, a través de HDR) después de la escisión mediada por nucleasas en una célula. En ciertos aspectos de la descripción, los métodos comprenden las etapas de: (i) introducir una o más nucleasas (y/o ARNm o constructos de expresión que expresan la o las nucleasas y uno o más ARN guía único si es necesario) junto con una o más moléculas donantes en una célula hospedante, y (ii) introducir uno o más factores que afectan y/o aumentan la expansión de las células madre sin pérdida de rigidez o diferenciación en la célula y/o el medio de cultivo que contiene la célula antes, durante y/o después de la introducción de la o las nucleasas. El donante puede administrarse antes, después o junto con el ácido nucleico que codifica la o las nucleasas.
El donante puede administrarse mediante métodos de transferencia de genes virales y/o no virales. En otras realizaciones, el donante se administra a la célula a través de un virus adenoasociado (AAV). En algunos casos, el AAV comprende las LTR que son de un serotipo heterólogo en comparación con el serotipo de la cápside. En otras realizaciones, el donante se administra a la célula a través de un lentivirus. En algunos casos, el lentivirus es un lentivirus con integrasa defectuosa (IDLV).
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico donante se integra mediante métodos no dependientes de homología (por ejemplo, NHEJ). Como se señaló anteriormente, con la escisión in vivo, las secuencias del donante se pueden integrar de manera dirigida en el genoma de una célula en la ubicación de una DSB. La secuencia del donante puede incluir uno o más de los mismos sitios diana para una o más de las nucleasas usadas para crear la DSB. De este modo, la secuencia del donante puede ser escindida por una o más de las mismas nucleasas usadas para escindir el gen endógeno en el que se desea la integración. En ciertas realizaciones, la secuencia del donante incluye diferentes sitios diana de nucleasas de las nucleasas usadas para inducir la DSB. Las DSB en el genoma de la célula diana pueden crearse mediante cualquier mecanismo. La DSB se puede crear mediante una o más nucleasas en dedo de zinc (ZFN), proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión en dedo de zinc, que se manipula para unirse a una secuencia dentro de la región de interés, y un dominio de escisión o un semidominio de escisión. En otros aspectos de la descripción, la DSB se crea mediante uno o más dominios de unión al ADN de TALE (de origen natural o no natural) fusionados a un dominio de nucleasa (TALEN). En aún otros aspectos de la descripción, la DSB se crea usando un sistema de nucleasa CRISPR/Cas en el que se usa un ARN guía único manipulado o su equivalente funcional para guiar la nucleasa a un sitio diana en un genoma. En aún otros aspectos de la descripción, la DSB se crea usando un sistema TtAgo.
En otro aspecto, se describen kits que son útiles para aumentar la disrupción genética y/o la integración dirigida (por ejemplo, corrección genética) después de la escisión mediada por nucleasas del genoma de una célula (por ejemplo, ZFN, proteínas de fusión de nucleasa de dominio efector TAL, un sistema TtAgo, o meganucleasas manipuladas o ARN guía manipulados con el sistema CRISPR/Cas). Los kits suelen incluir una o más nucleasas que se unen a un sitio diana, uno o más factores que afectan la expansión y/o diferenciación de las células madre, e instrucciones para introducir las nucleasas y los factores que afectan a las células madre en las células, de manera que se mejora la disrupción genética mediada por nucleasas y/o la integración dirigida. Opcionalmente, las células que contienen el sitio o sitios diana de la nucleasa también pueden incluirse en los kits descritos aquí. Los kits pueden comprender al menos un constructo con el gen diana y una nucleasa conocida capaz de escindirse dentro del gen diana. Dichos kits son útiles para optimizar las condiciones de escisión en una variedad de tipos de células hospedantes variables. Otros kits pueden incluir una nucleasa conocida capaz de escindirse dentro de un locus diana conocido dentro de un genoma, y pueden comprender adicionalmente un ácido nucleico donante. En algunos aspectos, el ADN donante puede codificar un polipéptido, una región reguladora, o un ácido nucleico estructural. En algunas realizaciones, el polipéptido es un gen informador (por ejemplo, GFP). Dichos kits son útiles para optimizar las condiciones para la integración del donante o para la construcción de células modificadas específicamente, líneas celulares, y animales que contienen disrupciones genéticas o inserciones dirigidas.
En otros aspectos, se describen métodos para administrar a un sujeto una célula madre modificada genéticamente como se describe aquí. Los precursores de células sanguíneas modificadas genéticamente (“HSC/PC”) como se describe aquí se administran típicamente en un trasplante de médula ósea, y las HSC/PC se diferencian y maduran in vivo. En algunas realizaciones, las HSC/PC se aíslan después de la movilización inducida por G-CSF, y en otras, las células se aíslan de la médula ósea humana o los cordones umbilicales. En algunos aspectos, las HSC/PC se editan mediante tratamiento con una nucleasa diseñada para anular un gen específico o una secuencia reguladora. En otros aspectos, las HSC/PC se modifican con una nucleasa manipulada y un ácido nucleico donante de manera que se inserta y expresa un gen de tipo salvaje u otro gen de interés y/o se corrige un gen aberrante endógeno. En algunas realizaciones, las HSC/PC modificadas se administran al paciente después de un preacondicionamiento mieloablativo leve. En otros aspectos, las HSC/PC se administran después de la mieloablación completa de modo que, después del injerto, el 100% de las células hematopoyéticas derivan de las HSC/PC modificadas. Además, la célula puede detenerse en la fase G2 del ciclo celular.
En algunas realizaciones, la célula transgénica HSC/PC incluye un transgén que codifica un gen humano. En algunos casos, el animal transgénico comprende una inactivación génica en el locus endógeno correspondiente al transgén exógeno, permitiendo así el desarrollo de un sistema in vivo en el que la proteína humana puede estudiarse de forma aislada. Dichos modelos transgénicos pueden usarse con fines de cribado para identificar moléculas pequeñas o biomoléculas grandes u otras entidades que pueden interactuar con la proteína humana de interés o modificarla. En algunos aspectos, el transgén se integra en el locus seleccionado (por ejemplo, puerto seguro) en una célula madre (por ejemplo, una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, una célula madre hematopoyética, etc.) o un embrión animal obtenido por cualquiera de los métodos descritos aquí, y después el embrión se implanta de manera que nazca un animal vivo. A continuación, el animal se cría hasta la madurez sexual y se le permite producir descendencia en la que al menos parte de la descendencia comprende la secuencia del gen endógeno editado o el transgén integrado.
Estos y otros aspectos serán fácilmente evidentes para el experto a la luz de la descripción en su conjunto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A a 1E muestran escisión y corrección en el locus de beta-globina en células CD34+ usando un IDLV donante. La Figura 1A (SEQ ID NO: 3) muestra una porción de la secuencia de ADN del exón I de la beta-globina que muestra los sitios diana de ZFN (subrayados) encima del codón de inicio (negrita) y la mutación falciforme (negrita, cursiva). La Figura 1B es un gel que muestra una escisión dirigida en el locus de la beta-globina en las células CD34+ de sangre del cordón umbilical humano. Las células se analizaron tres días después de la electroporación con ARNm transcrito in vitro que codifica las ZFN. “Simulado” representa células CD34+ no tratadas. Las flechas indican las bandas cortadas después de la amplificación por PCR y la digestión con Surveyor® Nuclease (Transgenomic®). La Figura 1C es un esquema de corrección génica de sitio específico en la mutación falciforme en el gen de beta globina en relación con los exones 1 y 2. También se ilustran detalles del constructo donante y el ADN genómico resultante tras la escisión por ZFN y reparación por HDR. Se indica la ubicación de la mutación falciforme y el RFLP de HhaI (asterisco). Las ubicaciones de los cebadores para los ensayos Surveyor Nuclease y RFLP se muestran debajo. Los exones están a escala; las marcas de almohadilla en ángulo indican áreas que no están a escala. La Figura 1D es un gel de RFLP para la modificación de genes dirigida de la beta-globina en presencia de las ZFN y donante. Se electroporaron células CD34+ de sangre de cordón umbilical (CB) con ARNm de ZFN transcrito in vitro y/o se transdujeron con un donante que comprende IDLV como se indica en la parte superior del gel. Las células se recolectaron cuatro días después del tratamiento, se amplificaron por PCR desde fuera de la región donante, se digirieron con enzima HhaI, y se resolvieron en un gel de agarosa. La flecha muestra el producto escindido, lo que indica la incorporación del RFLP en el genoma en el sitio diana. La Figura 1E es un gráfico que muestra los porcentajes de modificación de genes en células CD34+ en las condiciones indicadas. Las células CD34+ de CB se electroporaron con ARNm de ZFN transcrito in vitro y se transdujeron con el IDLV donante. Las células se recolectaron tres días después del tratamiento, se amplificaron por PCR desde fuera de la región donante, y se completó la qPCR con cebadores diseñados para detectar específicamente la incorporación del cambio de base silencioso que genera el RFLP de HhaI y normalizados a cebadores que se unen en el exón 2 del locus de la beta-globina en el amplicón (n=4 para todas las condiciones). Se encontró modificación de genes en aproximadamente el 18% de las células tratadas tanto con las ZFN como con el donante.
Las Figuras 2A a 2D muestran los resultados de la optimización de las dosis de ZFN e IDLV usadas para la transducción. Las Figuras 2A, B y C son gráficos que muestran los resultados después de la titulación del ARNm de ZFN. Las células CD34+ se electroporaron con cantidades crecientes de ARNm de ZFN transcrito in vitro y se transdujeron con una cantidad constante de IDLV donante. Simulado indica células no tratadas, muestra de ZFN solo electroporada con 30 ug/ml de cada ZFN, muestra de IDLV solo pulsada y transducida con 2E+07 TU/ml de IDLV donante. La Figura 2A muestra las tasas de modificación de genes a los 3 días después de la electroporación según lo determinado por qPCR para el RFLP. La Figura 2B muestra el número de veces de la expansión 1 día después de la electroporación, y la Figura 2C muestra la viabilidad celular 1 día después de la electroporación según lo determinado por el tinte de exclusión tripán, (n=8 para todas las condiciones). La Figura 2D muestra un esquema del vector lentiviral deficiente en integrasa del donante (IDLV): Se clonó una región de 1,1 kb de beta-globina a la inversa con respecto a los elementos promotores en la repetición terminal larga (LTR) en un esqueleto lentivírico en el que la 3’ LTR contiene la supresión auto-inactivante (SIN) que se transfiere durante la transcripción inversa a la 5’ LTR del ADN proviral. UTR: región no traducida, RRE: elemento de respuesta rev, Int: intrón.
Las Figuras 3A a 3C son gráficos que muestran la titulación del IDLV donante. Las células CD34+ se electroporaron con una cantidad constante de ARNm de ZFN transcrito in vitro y se transdujeron con cantidades crecientes de IDLV donante. Simulado indica células no tratadas, muestra de ZFN solo electroporada con 10 ug/ml de cada ZFN, muestra de IDLV solo pulsada y transducida con 6E+07 TU/ml de IDLV donante. La Figura 3A muestra las tasas de modificación de genes a los 3 días después de la electroporación según lo determinado por qPCR para el RFLP. La Figura 3B muestra el número de veces de expansión 1 día después de la electroporación, y la Figura 3C muestra la viabilidad celular 1 día después de la electroporación según lo determinado por el colorante de exclusión tripán, (n=6 para todas las condiciones).
Las Figuras 4A a 4F muestran corrección usando el par de ZFN 33488/33501 en el locus de beta-globina en células CD34+ usando un donante de oligonucleótidos. La Figura 4A muestra un esquema de la modificación de genes dirigida por oligonucleótidos (SEQ ID NO: 4 y 5). La Figura 4B es un gel de un amplicón de PCR digerido con Avr II del locus de la beta-globina. El fragmento contiene un sitio AvrlI nativo, cuya escisión sirve como control interno para la digestión con AvrlI (la banda inferior del gel). Las flechas indican los productos de escisión de AvrII. En presencia del donante de oligos y de la ZFN, hay una tasa de corrección genética del 15%. La Figura 4C muestra seis posibles sitios de mutación silenciosa en el sitio de unión de ZFN SBS#33501 (SEQ ID NO: 53 para WT y SEQ ID NO: 54 para SMS). La mutación falciforme está en cursiva, y los sitios de mutación silenciosa (SMS) posibles en negrita. La Figura 4D muestra que las mutaciones silenciosas aumentaron la corrección génica en la beta-globina. Se transfectaron células CD34+ de mPB con ZFN y el oligonucleótido donante indicado. La introducción de la mutación silenciosa relevante se ensayó mediante secuenciación de alto rendimiento. Las barras blancas indican inserciones y eliminaciones (indels); barras grises, corrección genética. La Figura 4E muestra que las mutaciones silenciosas bloquean la re-escisión de ZFN. Se examinaron los alelos con indels en busca de pruebas de modificación mediada por homología. Se muestran los porcentajes de alelos con modificación de genes que también tienen pruebas de indels provocadas por NHEJ. La Figura 4F muestra la optimización de la concentración de ZFN y el tipo de donante. Las indels provocadas por NHEJ (barras blancas) y la corrección de genes (barras grises) se ensayaron mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento. Dada la profundidad de la secuenciación de ADN de alto rendimiento, se espera que el error de medida sea muy bajo. WT: tipo salvaje; SMS: sitios de mutación silenciosos; oligo: oligonucleótido.
La Figura 5 muestra la optimización de la longitud y la hebra del donante. Se transfectaron células CD34+ de mPB con combinaciones de ZFN y oligonucleótidos diseñados para introducir una secuencia de tres pares de bases en el locus de beta-globina. Se recolectaron las células, y se ensayaron los niveles de indels provocadas por NHEJ y la integración dirigida (“TI”) de esta secuencia corta mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento (HTS). Se obtuvieron aproximadamente 4-9.000 lecturas de secuencia por muestra.
Las Figuras 6A y 6B representan eventos de HDR parciales, y revelan que la síntesis durante la modificación de genes mediada por oligonucleótidos transcurre de izquierda a derecha. La Figura 6A muestra datos de secuenciación de ADN de alto rendimiento de los ZFN más el donante SMS124 de la Figura 3F que se analizaron en busca de pruebas de productos de HDR parcial (alelos SMS1, SMS12, SMS24 y SMS4). Del ~41% de modificación de genes en este experimento, el 6% de la modificación provino de eventos SMS12, mientras que los alelos SMS24 estuvieron casi completamente ausentes (0,03%). Esta asimetría implica que la síntesis de aDn transcurre de izquierda a derecha. La Figura 6B lo demuestra usando un promedio de datos de las tres concentraciones de ZFN que se muestran, con los eventos de las muestras de 30 y 60 mg/ml normalizados hacia arriba para coincidir con la modificación de genes de ~41% observada en la muestra de 15 mg/ml.
Las Figuras 7A a 7D muestran el análisis de escisión en diana en el grupo de genes de beta-globina. La Figura 7A es una ilustración de la captura de GFP de la siguiente manera: las células de eritroleucemia K562 se electroporaron con ARNm transcrito in vitro y se transdujeron con un vector IDLV que expresa GFP. Las células se cultivaron durante 60 días para diluir todas las GFP no atrapadas, después de lo cual se clasificaron las células positivas para GFP usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se realizó nrLAM-PCR en las muestras, y se completó el análisis del sitio de integración del vector. Se muestra una descripción general de los sitios de integración más comunes en beta-globina y delta-globina, según se determina mediante análisis de conglomerados. HBB: hemoglobina beta humana de tipo salvaje; HBD: hemoglobina delta humana. La Figura 7B muestra la alineación de secuencias parciales del gen de globina en el cromosoma 11 en el grupo de genes de beta-globina alrededor del sitio de corte de ZFN (SEQ ID NO: 6 a 11). Los sitios de unión de ZFN están subrayados, la mutación falciforme está en negrita, y en cursiva. HBB: hemoglobina beta humana de tipo salvaje; HBD: hemoglobina delta humana; HBE1: hemoglobina épsilon humana; HBBP1: pseudogén 1 de hemoglobina beta humana; HBG1: hemoglobina gamma A humana; HBG2: hemoglobina gamma G humana. La Figura 7C es un gel que muestra un ensayo de Surveyor® Nuclease de células CD34+ tratadas con ARNm de ZFN transcrito in vitro o no tratadas (Simulado). Cada uno de los genes del grupo de beta globina indicados se amplificó alrededor de la región de mayor homología con el sitio diana, y se escindió con Surveyor® Nuclease. Las bandas se cuantificaron por densitometría. La Figura 7D es un gel que muestra un ensayo Surveyor® Nuclease de muestras de médula ósea de pacientes con SCD como en la Figura 7b. La heterocigosidad para un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de la gamma-globina produjo la escisión de fondo, incluso en las muestras no expuestas a ZFN (flechas finas).
La Figura 8 es un gráfico que muestra el potencial formador de colonias de las HSPC modificadas con ZFN y oligonucleótido. Las células CD34+ de mPB se transfectaron de forma simulada, se transfectaron con ZFN 10 ug/ml, o se transfectaron con ZFN y un donante de oligonucleótidos a 3 pM. Después de cinco días de cultivo, las células se sembraron en metilcelulosa y medio que contenía citocinas, y se diferenciaron. Después de quince días de crecimiento, las unidades formadoras de colonias (CFU) se contaron y clasificaron morfológicamente como eritroides (E), unidades formadoras de ráfagas - eritroides (BFU-E), granulocitos/macrófagos (GM), o granulocitos/eritroides/macrófagos/megacariocitos (GEMM).
Las Figuras 9A y 9B muestran la estabilidad de las células modificadas durante la diferenciación eritroide. La Figura 9A muestra que las células CD34+ de mPB se transfectaron con ZFN a 0, 3,75, 7,5, 15 o 30 pg/ml y un donante de oligonucleótidos a 3 pM, o se transfectaron con un donante de oligonucleótidos solo. Se indujo a las células a diferenciarse en glóbulos rojos, y se extrajeron alícuotas después de 0, 6, 12, 15 y 18 días. Se preparó ADN genómico a partir de las células, y se analizó la frecuencia de las células modificadas en sus genes mediante secuenciación de alto rendimiento. Se obtuvieron aproximadamente 10-50.000 lecturas de secuencia por muestra por punto de tiempo. La Figura 9B muestra el análisis de HPLC de proteínas de globina en células manipuladas.
Las Figuras 10A a 10E muestran el trasplante de células tratadas con ZFN y donante en ratones NSG. La Figura 10A muestra las tasas de modificación de genes de células trasplantadas a granel tratadas con ZFN+IDLV y cultivadas in vitro según lo determinado por qPCR para el RFLP a los 7 días después de la electroporación. Las células simuladas no se tratan (n=3 experimentos independientes). La Figura 10B es un gráfico que muestra la modificación en la base falciforme evaluada por secuenciación de alto rendimiento para células CD34+ modificadas con ZFN+IDLV. Resultados de la secuenciación del locus de beta-globina que muestran el porcentaje de lecturas alineadas totales que contienen la base cambiada de tipo salvaje a falciforme (T), así como inserciones y supresiones (indels) en el sitio de corte. Las mismas muestras que en la Figura 10A. Base cambiada, blanca; indels, gris. La Figura 10C es un gráfico que muestra el injerto en la sangre periférica de ratones trasplantados a las 5 semanas y 8 semanas después del trasplante. El injerto humano se determinó como un porcentaje de células hCD45+ del total de células hCD45+ y mCD45+ mediante citometría de flujo de células de ratones que recibieron células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes negros. (n=3 experimentos independientes; simulado n=5, ZFN+IDLV n=12). La Figura 10D es un gráfico que muestra que las células CD34+ se electroporaron con Oligo, ZFN, o ZFN+Oligo, y se cultivaron in vitro antes del trasplante en ratones NSG. Las tasas de modificación (n=1) en la base falciforme y las indels se muestran como en la Figura 10C. La Figura 10E es un gráfico que muestra el injerto en la sangre periférica como en la Figura 10C, de células de ratones que recibieron células tratadas con Oligo, ZFN, o ZFN+Oligo. Oligo, círculos; ZFN, triángulos; ZFN+Oligo, diamantes. (Oligo n=8, ZFN n=7, ZFN+Oligo n=9), n.s.: no significativo, *p<0,05, **p<0,01.
Las Figuras 11A y 11B muestran el análisis de linaje de ratones NSG trasplantados en la semana 8. Análisis inmunofenotípico de sangre periférica de ratones NSG trasplantados con células tratadas de forma simulada y con ZFN y donante 8 semanas después del trasplante. El porcentaje de células humanas CD45+ que fueron positivas para los marcadores de células B (CD19), células T (CD3), progenitores hematopoyéticos (CD34), progenitores mieloides (CD33), y células asesinas naturales (CD56) se enumeró usando citometría de flujo. La Figura 11A es un gráfico que muestra las células de los ratones trasplantados con células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV, (n=3 experimentos independientes; simulado n=5, ZFN+IDLV n=12). La Figura 11B es un gráfico que muestra células de ratones trasplantados con células tratadas con oligo, ZFN, o ZFN+Oligo, (Oligo n=8, ZFN n=7, ZFN+Oligo n=9). n.s.: no significativo; el asterisco indica significancia, *p<0,05, **p<0,01.
Las Figuras 12A a 12D muestran el injerto de sangre periférica final y el análisis de linaje. La Figura 12A es un gráfico que muestra el injerto en la sangre periférica de ratones trasplantados a las 16 semanas después del trasplante. El injerto humano se determinó como un porcentaje de células hCD45+ del total de células hCD45+ y mCD45+ mediante citometría de flujo de células de ratones que recibieron células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes negros. La Figura 12B es un gráfico que muestra el análisis inmunofenotípico de la sangre periférica de ratones NSG trasplantados a las 16 semanas después del trasplante. El porcentaje de células hCD45+ que resultaron positivas para los marcadores de células B (CD19), células T (CD3), progenitores hematopoyéticos (CD34), progenitores mieloides (CD33), y células asesinas naturales (CD56) se enumeró usando citometría de flujo de células de ratones que recibieron células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes negros; (n=3 experimentos independientes; simulado n=5, ZFN+IDLV n=12). La Figura 12C es un gráfico que muestra el injerto en la sangre periférica como en la Figura 12A de células de ratones que recibieron células tratadas con Oligo, z Fn , o ZFN+Oligo. Oligo, círculos; ZFN, triángulos; ZFN+Oligo, diamantes. La Figura 12D es un gráfico que muestra el análisis de linaje de la sangre periférica como en la Figura 12B de células de ratones que recibieron células tratadas con Oligo, ZFn , o ZFN+Oligo. Oligo, círculos; ZFN, triángulos; ZFN+Oligo, diamantes; (Oligo n=8, ZFN n=7, ZFN+Oligo n=9). n.s.: no significativo, *p<0,05.
Las Figuras 13A a 13C muestran que las células modificadas genéticamente persisten en ratones NSG. La Figura 13A es un gráfico que muestra las tasas de modificación de genes en la médula ósea y el bazo de ratones trasplantados a las 16 semanas en células de ratones que recibieron células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV. Se recogió tejido, se extrajo y se amplificó ADN genómico, y se analizó la qPCR para el RFLP incorporado. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes negros. La Figura 13B es un gráfico que muestra la corrección en la mutación falciforme evaluada por secuenciación de alto rendimiento de las muestras descritas en la Figura 13A. Resultados de la secuenciación del locus de beta-globina que muestran el porcentaje de lecturas alineadas totales que contienen la base modificada en la mutación falciforme. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes negros. (n=3 experimentos independientes; simulado n=5, ZFN+IDLV n=12). La Figura 13C es un gráfico que muestra la corrección en la mutación falciforme en células de ratones que recibieron células tratadas con Oligo, ZFN, o ZFN+Oligo como se describe en la Figura 13B. Oligo, círculos; ZFN, triángulos; ZFN+Oligo, diamantes. (Oligo n=8, ZFN n=7, ZFN+Oligo n=9). n.s.: no significativo; el asterisco indica significancia, *p<0,05, **p<0,01.
La Figuras 14A a 14D muestran el injerto final de médula ósea y el análisis de linaje. La Figura 14A es un gráfico que muestra el injerto en la médula ósea de ratones trasplantados a las 16 semanas después del trasplante. El injerto humano se determinó como un porcentaje de células hCD45+ del total de células hCD45+ y mCD45+ mediante citometría de flujo de células de ratones que recibieron células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes negros. La Figura 14B es un gráfico que muestra el análisis inmunofenotípico de la médula ósea de ratones NSG trasplantados a las 16 semanas después del trasplante. El porcentaje de células hCD45+ que resultaron positivas para los marcadores de células B (CD19), células T (CD3), progenitores hematopoyéticos (CD34), progenitores mieloides (CD33), y células asesinas naturales (CD56) se enumeró usando citometría de flujo de células de ratones que recibieron células tratadas de forma simulada o con ZFN+IDLV. Simulado, diamantes blancos; ZFN+IDLV, diamantes cerrados; (n=3 experimentos independientes; simulacros n=5, ZFN+IDLV n=12). La Figura 14C es un gráfico que muestra el injerto en la médula ósea como en la Figura 14A de células de ratones que recibieron células tratadas con Oligo, ZFN, o ZFN+Oligo. Oligo, círculos; ZFN, triángulos; ZFN+Oligo, diamantes. La Figura 14D es un gráfico que muestra el análisis de linaje de la médula ósea como en la Figura 14B de células de ratones que recibieron células tratadas con Oligo, ZFN, o ZFN+Oligo. Oligo, círculos; ZFN, triángulos; ZFN+Oligo, diamantes; (Oligo n=8, ZFN n=7, ZFN+Oligo n=9). n.s.: no significativo, *p<0,05.
Las Figuras 15A a 15C muestran diferenciación de células CD34+ de médula ósea falciformes. La Figura 15A es un gráfico que muestra el número de veces de expansión de las células CD34+ de la médula ósea del paciente con SCD que se electroporaron con ARNm de ZFN transcrito in vitro y se transdujeron con el IDLV donante que porta la base WT en la ubicación falciforme y que se hicieron crecer en condiciones eritroides. La Figura 15B es un gráfico de las unidades formadoras de colonias totales para cada tipo de colonia hematopoyética identificada por cada 200 células sembradas en placa. La Figura 15C es un gráfico que muestra el porcentaje de colonias formadas en relación con el número total de células sembradas. CFU: unidad formadora de colonias; BFU: unidad formadora de blastos; GEMM: granulocitos, eritrocitos, monocitos, y macrófagos; E: eritroide, GM: granulocitos y macrófagos; G: granulocitos; M: monocitos, el asterisco indica significancia, *p<0,05, **p<0,01, (n=2 experimentos independientes; Simulado n=3; ZFN solo n=4; IDLV solo n=3, ZFN+IDLV n=6).
Las Figuras 16A a 16D muestran la corrección funcional de las células CD34+ de la médula ósea falciformes. Células CD34+ de médula ósea de pacientes con anemia drepanocítica se electroporaron con ARNm de ZFN transcrito in vitro y se transdujeron con IDLV donante que porta la base WT en la localización falciforme, y se cultivaron en condiciones eritroides. La Figura 16A es un gráfico que muestra las tasas de modificación de genes analizadas por qPCR para el RFLP incorporado a los 12 días después de la electroporación. La Figura 16B es un gráfico que muestra la corrección en la mutación falciforme evaluada mediante secuenciación de alto rendimiento. Resultados de la secuenciación del locus de beta-globina que muestran el porcentaje de lecturas alineadas totales que contienen la base WT corregida (A) en la mutación falciforme, así como inserciones y supresiones (indels) en el sitio de corte. Base corregida, blanco; indels, gris. La Figura 16C muestra el análisis por HPLC de células eritroides diferenciadas al final del cultivo. Las células se peletizaron, se lisaron, y el sobrenadante se analizó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). El panel izquierdo muestra una muestra simulada de SCD, y el panel derecho muestra una muestra SCD ZFN+IDLV. El sombreado indica el pico de HbA:hemoglobina del adulto WT. La Figura 16D es un gráfico de la cuantificación del porcentaje de HbA del área total bajo la curva representada por los picos principales. HbA: hemoglobina del adulto WT, HbF: hemoglobina fetal, HbS: hemoglobina falciforme. n.s.: no significativo, (n=2 experimentos independientes; Simulado n=3; ZFN solo n=4; IDLV solo n=3, ZFN+IDLV n=6).
Las Figuras 17A y 17B muestran corrección en el locus de beta-globina en células CD34+ usando donantes de oligonucleótidos y concentraciones variables del par de nucleasas en dedo de zinc 47773/47817. La Figura 17A muestra la frecuencia de reparación del ADN mediante NHEJ. La Figura 17B muestra la frecuencia de reparación del ADN dependiente de homología. Además de la mutación de drepanocitos, el donante de oligonucleótidos incluye las mutaciones SMS12 (barras negras) o las mutaciones SMS012 (barras grises) que se muestran en la Figura 4C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se describen aquí composiciones y métodos para la transducción de una célula para uso en terapia génica o ingeniería del genoma. En particular, se logra de manera eficiente en una célula la integración dirigida mediada por nucleasas (es decir, ZFN, TALEN, sistema TtAgo o CRISPR/Cas) de una secuencia exógena o la alteración del genoma por escisión dirigida. Particularmente útiles para la transducción y manipulación de HSC/PC, los métodos y composiciones también pueden usarse para otros tipos de células para proporcionar células modificadas genéticamente que comprenden inserciones y/o supresiones en un gen de globina. Específicamente, los métodos y composiciones descritos aquí son útiles para editar un gen de globina mediante la corrección de un alelo asociado a una enfermedad para el tratamiento y la prevención de la anemia drepanocítica.
General
La práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones descritas aquí, emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante, y campos relacionados como se encuentran dentro de la pericia de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT Pr OTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; las series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, Ch Ro Ma T iN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definiciones
Las expresiones “ácido nucleico”, “polinucleótido” y “oligonucleótido” se usan indistintamente, y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma monocatenaria o bicatenaria. Para los fines de la presente descripción, estas expresiones no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Las expresiones pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en los restos de la base, del azúcar y/o del fosfato (por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de apareamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará en base con T.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de los correspondientes aminoácidos de origen natural.
“Unión” se refiere a una interacción no covalente, específica de secuencia, entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (por ejemplo, contactos con restos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su conjunto sea específica de secuencia. Estas interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o menor. “Afinidad” se refiere a la fuerza de la unión: una mayor afinidad de unión se correlaciona con una menor Kd .
Una “proteína de unión” es una proteína que puede unirse a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a proteínas, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.), y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas en dedo de zinc tienen actividad de unión a ADN, de unión ARN y de unión a proteínas.
Una “proteína de unión a ADN en dedo de zinc” (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion de zinc. La expresión proteína de unión a ADN en dedo de zinc a menudo se abrevia como proteína en dedo de zinc o ZFP.
Un “dominio de unión a ADN de TALE” o “TALE” es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición de TALE. Los dominios repetidos están implicados en la unión del TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una única “unidad de repetición” (también denominada “repetición”) tiene típicamente 33 a 35 aminoácidos de longitud, y exhibe al menos alguna homología de secuencia con otras secuencias de repetición de TALE dentro de una proteína TALE de origen natural.
Los dominios de unión en dedo de zinc y TALE se pueden “manipular” para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, mediante ingeniería (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de una proteína en dedo de zinc o TALE de origen natural. Por lo tanto, las proteínas de unión al ADN manipuladas (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no aparecen naturalmente. Los ejemplos no limitantes de métodos para manipular proteínas de unión a ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN diseñada es una proteína que no se encuentra en la naturaleza y cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños existentes de ZFP y/o TALE y datos de unión. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261 y 8.586.526; véanse también los documentos WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
Una proteína en dedo de zinc “seleccionada” o TALE es una proteína que no se encuentra en la naturaleza, cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico tal como la presentación de fagos, la trampa de interacción, o la selección de híbridos. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; 8.586.526; documentos WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084.
“TtAgo” es una proteína argonauta procariota que se cree que está involucrada en el silenciamiento de genes. TtAgo deriva de la bacteria Thermus thermophilus. Véanse, por ejemplo, Swarts et al, ibid., G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111,652). Un “sistema TtAgo” son todos los componentes necesarios, incluyendo, por ejemplo, los ADN guía para la escisión por una enzima TtAgo.
“Recombinación” se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, que incluye, pero no se limita a, captura del donante por unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga. Para los fines de esta descripción, “recombinación homóloga (HR)” se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en células mediante mecanismos de reparación dirigida por homología. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula “donante” para reparar el molde de una molécula “diana” (es decir, la que experimentó la ruptura bicatenaria), y se conoce como “conversión de genes no cruzados” o “conversión de genes de tracto corto”, debido a que conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin desear ceñirse a ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de desajustes del ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o “hibridación de hebra dependiente de síntesis”, en la que el donante se utiliza para resintetizar información genética que se convertirá en parte de la diana, y/o procesos relacionados. Ta1 HR especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana de manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora al polinucleótido diana.
En los métodos de la descripción, una o más nucleasas dirigidas como se describen aquí crean una ruptura bicatenaria (DSB) en la secuencia diana (por ejemplo, cromatina celular) en un sitio predeterminado. La DSB puede dar como resultado supresiones y/o inserciones por mecanismos de reparación dirigida por homología o por reparación no dirigida por homología. Las eliminaciones pueden incluir cualquier número de pares de bases. De manera similar, las inserciones pueden incluir cualquier número de pares de bases, que incluyen, por ejemplo, la integración de un polinucleótido “donante”, que opcionalmente tiene homología con la secuencia de nucleótidos en la región de la ruptura. La secuencia donante puede integrarse físicamente o, alternativamente, el polinucleótido donante se usa como molde para reparar la ruptura mediante recombinación homóloga, dando como resultado la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el donante en la cromatina celular. De este modo, se puede alterar una primera secuencia en la cromatina celular, y, en ciertas realizaciones, se puede convertir en una secuencia presente en un polinucleótido donante. Así, se puede entender que el uso de los términos “reemplazar” o “reemplazo” representa el reemplazo de una secuencia de nucleótidos por otra, (es decir, reemplazo de una secuencia en el sentido informativo), y no requiere necesariamente el reemplazo físico o químico de un polinucleótido por otro.
En cualquiera de los métodos descritos aquí, se pueden usar pares adicionales de proteínas en dedo de zinc, TALEN, sistemas TtAgo y/o CRIPSR/Cas para la escisión bicatenaria adicional de sitios diana adicionales dentro de la célula.
Cualquiera de los métodos descritos aquí se puede usar para la inserción de un donante de cualquier tamaño y/o la inactivación parcial o completa de una o más secuencias diana en una célula mediante la integración dirigida de la secuencia del donante que interrumpe la expresión del gen o genes de interés. También se proporcionan líneas celulares con genes parcial o completamente inactivados.
En cualquiera de los métodos descritos aquí, la secuencia de nucleótidos exógena (la “secuencia donante” o “transgén”) puede contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a secuencias genómicas en la región de interés, estimulando así la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. De este modo, en ciertas realizaciones, las porciones de la secuencia donante que son homólogas a las secuencias en la región de interés exhiben entre alrededor de 80 y 99% (o cualquier número entero entremedias) de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se reemplaza. En otras realizaciones, la homología entre la secuencia donante y la genómica es mayor que 99%, por ejemplo, si solo difiere 1 nucleótido entre las secuencias donante y genómica a lo largo de 100 pares de bases contiguos. En ciertos casos, una porción no homóloga de la secuencia donante puede contener secuencias que no están presentes en la región de interés, de modo que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga está generalmente flanqueada por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor entero entremedias) o cualquier número de pares de bases superior a 1.000, que son homólogas o idénticas a secuencias en la región de interés. En otras realizaciones, la secuencia donante no es homóloga a la primera secuencia, y se inserta en el genoma mediante mecanismos de recombinación no homóloga.
“Escisión” se refiere a la ruptura del esqueleto covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace de fosfodiéster. Tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria son posibles, y la escisión bicatenaria puede producirse como resultado de dos eventos de escisión monocatenaria distintos. La escisión del ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de fusión se usan para la escisión de ADN bicatenaria dirigida.
Un “semidominio de escisión” es una secuencia polipeptídica que, junto con un segundo polipéptido (idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferiblemente actividad de escisión bicatenaria). Las expresiones “semidominios de escisión primero y segundo”, “semidominios de escisión y -” y “semidominios de escisión derecho e izquierdo” se usan indistintamente para referirse a pares de semidominios de escisión que se dimerizan.
Un “semidominio de escisión manipulado” es un semidominio de escisión que se ha modificado para formar heterodímeros obligados con otro semidominio de escisión (por ejemplo, otro semidominio de escisión manipulado). Véanse también, las Patentes U.S. nos 7.888.121; 7.914.796; 8.034.598 and 8.823.618.
El término “secuencia” se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificada, y puede ser monocatenaria o bicatenaria. La expresión “secuencia donante” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede tener cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 100.000.000 de nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entremedias o superior), preferiblemente entre alrededor de 100 y 100.000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero entremedias), más preferiblemente entre alrededor de 2000 y 20.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entremedias), e incluso más preferible, entre alrededor de 5 y 15 kb (o cualquier valor entremedias).
“Cromatina” es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteínas, incluyendo las histonas y las proteínas cromosómicas que no son histonas. La mayoría de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, en los que un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociado con un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN enlazador (de longitud variable según el organismo) se extiende entre los núcleos de los nucleosomas. Una molécula de histona H1 generalmente se asocia con el ADN enlazador. Para los fines de la presente descripción, el término “cromatina” pretende abarcar todos los tipos de nucleoproteínas celulares, tanto procariotas como eucariotas. La cromatina celular incluye cromatina tanto cromosómica como episomal.
Un “cromosoma” es un complejo de cromatina que comprende todo o una parte del genoma de una célula. El genoma de una célula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que componen el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.
Un “episoma” es un ácido nucleico en replicación, un complejo de nucleoproteínas u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas virales.
Una “región accesible” es un sitio en la cromatina celular en el que un sitio diana presente en el ácido nucleico puede unirse mediante una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que una región accesible es aquella que no está empaquetada en una estructura nucleosómica. La estructura distintiva de una región accesible a menudo se puede detectar por su sensibilidad a sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas.
Un “sitio diana” o “secuencia diana” es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico al que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión.
Una molécula “exógena” es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que puede introducirse en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La “presencia normal en la célula” se determina con respecto a la etapa de desarrollo particular y las condiciones ambientales de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula sin choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.
Una molécula exógena puede ser, entre otros, una molécula pequeña, tal como la que se genera mediante un proceso químico combinatorio, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, glicoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser monocatenarios o bicatenarios; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los que pueden formar dúplex, así como los ácidos nucleicos que forman tríplex. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, entre otros, proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metilado, polimerasas, metilasas, demetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas, y helicasas.
Una molécula exógena puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo una proteína o ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma viral infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Los expertos en la técnica conocen métodos para la introducción de moléculas exógenas en células, e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación de fosfato cálcico, transferencia mediada por DEAE-dextrano, y transferencia mediada por vectores virales. Una molécula exógena también puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena pero derivada de una especie diferente de la que deriva la célula. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de ácido nucleico humano en una línea celular derivada originalmente de un ratón o un hámster. Los expertos en la técnica conocen métodos para la introducción de moléculas exógenas en células vegetales, e incluyen, pero no se limitan a, transformación de protoplastos, carburo de silicio (por ejemplo, WHISKERS™), transformación mediada por Agrobacterium, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas (por ejemplo, usando una “pistola de genes”), coprecipitación de fosfato cálcico, transferencia mediada por DEAE-dextrano, y transferencia mediada por vectores virales.
Por el contrario, una molécula “endógena” es aquella que normalmente está presente en una célula particular en una etapa de desarrollo particular bajo condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico de origen natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.
Como se usa aquí, la expresión “producto de un ácido nucleico exógeno” incluye productos polinucleotídicos y polipeptídicos, por ejemplo, productos de transcripción (polinucleótidos tales como ARN) y productos de traducción (polipéptidos).
Una molécula de “fusión” es una molécula en la que dos o más moléculas subunitarias están unidas, preferiblemente de forma covalente. Las moléculas subunitarias pueden ser del mismo tipo químico de molécula o pueden ser diferentes tipos químicos de moléculas. Los ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN ZFP o TALE y uno o más dominios de activación) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita más arriba). Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, una fusión entre un ácido nucleico formador de tríplex y un polipéptido, y una fusión entre un aglutinante de surco menor y un ácido nucleico.
La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar del suministro de la proteína de fusión a la célula o del suministro de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en la que el polinucleótido se transcribe, y la transcripción se traduce, para generar la proteína de fusión. El ayuste trans, la escisión de polipéptidos y la ligación de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para el suministro de polinucleótidos y polipéptidos a las células se presentan en otra parte de esta descripción.
Un “gen”, para los fines de la presente descripción, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase más abajo), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, estén o no tales secuencias reguladoras adyacentes a secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de traducción tales como sitios de unión a ribosomas y sitios de entrada de ribosomas internos, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos de frontera, orígenes de replicación, sitios de unión a matriz, y regiones de control de locus.
“Expresión génica” se refiere a la conversión de la información contenida en un gen en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural, o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican mediante procesos tales como encaperuzamiento, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas mediante, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación, y glicosilación.
La “modulación” de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, activación génica y represión génica. La edición del genoma (por ejemplo, escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) se puede usar para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye un sistema ZFP, TALE, TtAgo o CRISPR/Cas como se describe aquí. Por tanto, la inactivación de genes puede ser parcial o completa.
Una “región de interés” es cualquier región de la cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro o adyacente a un gen, en la que es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser con el fin de escisión de ADN dirigida y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma organular (por ejemplo, mitocondrial, cloroplasto), o un genoma viral infeccioso, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias finales o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea en dirección 5’ o en dirección 3’ de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o hasta 2.000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor entero de pares de nucleótidos.
Las células “eucariotas” incluyen, pero no se limitan a, células fúngicas (tal como levadura), células vegetales, células animales, células de mamíferos, y células humanas (por ejemplo, células T), incluyendo las células madre (pluripotentes y multipotentes).
Las expresiones “enlace operativo” y “enlazado operativamente” (o “enlazado operablemente”) se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (como elementos de secuencia), en los que los componentes están dispuestos de manera que ambos componentes funcionen normalmente y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora transcripcional, tal como un promotor, está operativamente ligada a una secuencia codificante si la secuencia reguladora transcripcional controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores transcripcionales. Una secuencia reguladora de la transcripción generalmente está operativamente ligada en cis con una secuencia codificante, pero no es necesario que esté directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está operativamente ligada a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.
Con respecto a los polipéptidos de fusión, la expresión “ligado operativamente” puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en ligamiento al otro componente como lo haría si no estuviera ligado de esa manera. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP, TALE, TtAgo o Cas se fusiona con un dominio de activación, el dominio de unión a ADN de ZFP, TALE, TtAgo o Cas y el dominio de activación están en unión operativa si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP, TALE, TtAgo o Cas es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación es capaz de aumentar la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión al ADN de ZFP, TALE, TtAgo o Cas se fusiona con un dominio de escisión, el dominio de unión al ADN de ZFP, TALE, TtAgo o Cas y el dominio de escisión están en unión operativa si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión al a Dn de ZFP, TALE, TtAgo o Cas es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión es capaz de escindir el ADN en las proximidades del sitio diana.
Un “fragmento funcional” de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, pero conserva la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos o el mismo número de restos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Métodos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función codificante, capacidad para hibridar con otro ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. De manera similar, los métodos para determinar la función de las proteínas son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de unión a filtro, desplazamiento de movilidad electroforética, o inmunoprecipitación. La escisión del ADN puede ensayarse mediante electroforesis en gel. Véase Ausubel et al., más arriba. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína se puede determinar, por ejemplo, mediante co-inmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genética como bioquímica. Véanse, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; Patente U.S. n° 5.585.245 y documento PCT WO 98/44350.
Un “vector” es capaz de transferir secuencias de genes a células diana. Normalmente, “construcción de vector”, “vector de expresión” y “vector de transferencia de genes” significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias de genes a células diana. De este modo, la expresión incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.
Los términos “sujeto” y “paciente” se usan indistintamente, y se refieren a mamíferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales tales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones, y otros animales. Por consiguiente, el término “sujeto” o “paciente”, como se usa aquí, significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que se pueden administrar las nucleasas, donantes y/o células modificadas genéticamente de la invención. Los sujetos de la presente invención incluyen aquellos con un trastorno.
“Rigidez” se refiere a la capacidad relativa de cualquier célula para actuar de manera similar a una célula madre, es decir, el grado de toti-, pluri-, u oligopotencia, y autorrenovación expandida o indefinida que puede tener cualquier célula madre en particular.
Factores que mejoran la expansión de las células madre
En la práctica de la presente invención se puede usar cualquier factor o factores que mejoren la expansión y/o diferenciación de las células madre. Los factores pueden introducirse directamente en la célula (por ejemplo, como genes que codifican el factor o factores) y/o pueden introducirse en el medio de cultivo circundante (incluyendo las capas alimentadoras y otros sustratos sólidos) para afectar a las células. El uso de tales factores, por ejemplo, en las condiciones de cultivo antes, durante o después de inducir la modificación mediada por nucleasas, aumenta la tasa de modificación mediada por nucleasas de la célula madre.
Los ejemplos no limitantes de factores que pueden usarse incluyen SR1, un antagonista del receptor de aril hidrocarburo, dmPGE2, una prostaglandina, UM171 y UM729, compuestos identificados en un cribado de biblioteca (véase Pabst et al (2014) NatMeth 11:436-442), rapamicina (véase Wang et al (2014) Blood. pii: blood-2013-12-546218), proteínas similares a la angiopoyetina (“Angptls”, por ejemplo, Notch/delta/ANGPTL5 (véase Zhang et al (2008) Blood. 111 (7):3415-3423), Angptl2, Angptl3, Angptl5, Angptl7, y Mfap4), el quelante de cobre tetraetilenpentamina (TEPA, véase de Lima et al (2008) Bone Mar Trans 41:771-778), inhibidores de histona desacetilasa (HPAC), por ejemplo ácido valproico (véase Chaurasia et al (2014) J Clin Invest 124:2378-2395), proteína 2 de unión a IGF (IGFBP2), nicotinamida (véase Horwitz et al (2014) J. Clin. Invest 124:3121-3128), las proteínas de fusión Tat-myc (véase el documento WO2010025421) y tat-Bcl2 (véase el documento WO2014015312), MAPK14/p38a Ly2228820 (véase Baudet et al (2012) Blood 119(26):6255-6258), productos de genes autorrenovables tales como HOXB4, sangre del cordón umbilical OCT3/4 y/o capas alimentadoras derivadas de MSC o un sistema de cocultivo de nicho vascular ex vivo denominado E4+EC (véase Butler et al (2012) Blood. 120(6): 1344-1347), citocinas (a modo de ejemplo no limitativo Stemspan™ CC110, CC100, y/o H3000 (Stemcell™ technologies), ligando Flt-3, SCF, TPO).
En algunas realizaciones, los factores comprenden StemRegenin (SR1, véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.741.640; Boitano et al, (2010) Science 329(5997): 1345-1348), un antagonista del receptor de aril hidrocarburo (AhR) que promueve la expansión de las células CD34+ ex vivo se utiliza en los métodos y composiciones descritos aquí. En otras realizaciones, los factores comprenden UM171 (véase Fares et al (2013) Blood: 122 (21)), que es un agonista de la renovación de células madre. En aún otros aspectos, el factor comprende una o más prostaglandinas, por ejemplo, dmPGE2. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.168.428; North et al (2007) Nature 447(7147): 1007-1011). En algunos aspectos, el factor comprende una o más hormonas, tales como proteínas similares a la angiopoyetina (“Angptls”, por ejemplo, Angptl2, Angptl3, Angptl5, Angptl7, y Mfap4) y proteína 2 de unión a IGF (IGFBP2). Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 7.807.464; Zhang et al (2008) 111(7): 3415-3423). En otros aspectos, se usan los factores que comprenden uno o más productos proteicos de genes autorrenovables tales como HOXB4 u OCT. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.735.153; Watts et al (2012) Exp Hematol. 40(3): 187-196). Alternativamente, estos genes pueden expresarse de forma transitoria en el medio de cultivo y/o en las células madre.
Los factores que afectan la expansión de las células madre también pueden comprender métodos de soporte celular, que incluyen, pero no se limitan a, capas alimentadoras derivadas de células estromales y/o células derivadas de MSC. Véase, por ejemplo, Breems et al (1998) Blood 91(1): 111-117 y Magin et al., (2009) Stem Cells Dev. enerofebrero 2009; 18(1 ):173-86.
Puede usarse cualquier cantidad adecuada de uno o más factores que mejoren la expansión de las células madre, siempre que sea eficaz para aumentar la actividad de nucleasa y la modificación genómica mediada por nucleasa. Las concentraciones particulares usadas pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, se utiliza entre 0,1 nM y 100 pM, por ejemplo, se usan concentraciones de entre 0,5 pM a 25 pM, incluyendo cualquier cantidad entremedias (por ejemplo, 1 pM a 20 pM, 3 pM a 10 pM, etc.).
Moléculas de fusión
Se describen aquí composiciones, por ejemplo, nucleasas, que son útiles para la escisión de un gen diana seleccionado en una célula, particularmente una célula madre. En ciertas realizaciones, uno o más componentes de las moléculas de fusión (por ejemplo, nucleasas) son de origen natural. En otras realizaciones, uno o más de los componentes de las moléculas de fusión (por ejemplo, nucleasas) no son de origen natural, es decir, están manipulados en el o los dominios de unión al ADN y/o el o los dominios de escisión. Por ejemplo, el dominio de unión al ADN de una nucleasa de origen natural puede alterarse para unirse a un sitio diana seleccionado (por ejemplo, una meganucleasa que ha sido manipulada para unirse a un sitio diferente al sitio de unión afín). La nucleasa puede comprender dominios heterólogos de unión y escisión de ADN (por ejemplo, nucleasas en dedo de zinc; proteínas de unión a ADN del dominio efector TAL; dominios de unión a ADN de meganucleasa con dominios de escisión heterólogos).
A. Moléculas de unión al ADN
La composición y los métodos descritos aquí pueden emplear una molécula de unión al ADN de meganucleasa (endonucleasa “homing") (también denominada dominio de unión al ADN) para unirse a la molécula donante y/o unirse a la región de interés en el genoma de la célula. Las meganucleasas de origen natural reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases, y comúnmente se agrupan en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de la caja His-Cyst, y la familia HNH. Las meganucleasas ejemplares incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, Pl-Sce, I-ScelV, I-CsmI, I-PanI, I-Sc^eII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-Tev\, I-TevII y I-TevIII. Se conocen sus secuencias de reconocimiento. Véanse, además, la Patente U.S. n° 5.420.032; Patente U.S. n° 6.833.252; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.
280:345-353 y el catálogo New England Biolabs. Además, la especificidad de unión al ADN de endonucleasas homing y meganucleasas puede manipularse para unirse a sitios diana no naturales. Véanse, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicación de Patente U.S. n° 20070117128. Los dominios de unión al ADN de las endonucleasas homing y meganucleasas se pueden alterar en el contexto de la nucleasa como un todo (es decir, de manera que la nucleasa incluye el dominio de escisión afín), o se pueden fusionar a un dominio de escisión heterólogo.
En otros aspectos de la descripción, el dominio de unión al ADN de una o más de las nucleasas usadas en los métodos y composiciones descritos aquí comprende un dominio de unión al ADN efector de TAL de origen natural o manipulado (no natural). Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.586.526. Se sabe que las bacterias fitopatógenas del género Xanthomonas causan muchas enfermedades en plantas de cultivo importantes. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema de secreción conservada de tipo III (T3S) que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran efectores de tipo activador de la transcripción (TAL) que imitan a los activadores transcripcionales de las plantas y manipulan el transcriptoma de las plantas (véase Kay et al (2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión al ADN y un dominio de activación transcripcional. Uno de los efectores TAL mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véanse Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y el documento WO2010079430). Los efectores TAL contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, conteniendo cada repetición aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional ácido (para una revisión, véase Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Además, en las bacterias fitopatógenas Ralstonia solanacearum se han encontrado dos genes, denominados brg11 y hpx17, que son homólogos a la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepa GMI1000 de R. solanacearum biovar 1 y en la cepa RS1000 de biovar 4 (véase Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Estos genes son 98,9% idénticos entre sí en la secuencia nucleotídica, pero se diferencian por una supresión de 1.575 pares de bases en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40% de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.586.526.
La especificidad de estos efectores TAL depende de las secuencias que se encuentran en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pares de bases, y las repeticiones son típicamente 91 -100% homólogas entre sí (Bonas et al, en el mismo lugar). El polimorfismo de las repeticiones generalmente se ubica en las posiciones 12 y 13, y parece haber una correspondencia uno a uno entre la identidad de los dirrestos hipervariables (RVD) en las posiciones 12 y 13 con la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana del efector TAL (véanse Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326:1501 y Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, el código natural para el reconocimiento del ADN de estos efectores TAL se ha determinado de manera que una secuencia de HD en las posiciones 12 y 13 conduce a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, e ING se une a T. Estas repeticiones de unión de ADN se han ensamblado en proteínas con nuevas combinaciones y números de repeticiones, para producir factores de transcripción artificiales que pueden interactuar con nuevas secuencias y activar la expresión de un gen informador no endógeno en células vegetales (Boch et al, en el mismo lugar). Las proteínas TAL manipuladas se han enlazado a un semidominio de escisión FokI para producir una fusión de nucleasa con dominio de efector TAL (TALEN). Véanse, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.586.526; Christian et al ((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717). En ciertos aspectos de la descripción, el dominio TALE comprende una caperuza en N y/o una caperuza en C como se describe en la Patente U.S. n° 8.586.526.
El dominio de unión al ADN de una o más de las nucleasas usadas para la escisión in vivo y/o la escisión dirigida del genoma de una célula puede comprender una proteína en dedo de zinc. Preferiblemente, la proteína en dedo de zinc no es de origen natural por cuanto está diseñada para que se una a un sitio diana de elección. Véase, por ejemplo, véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patentes U.S. nos 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y Publicaciones de Patente U.S. nos 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
Un dominio de unión en dedo de zinc manipulado puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con una proteína en dedo de zinc de origen natural. Los métodos de ingeniería incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos en dedo de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos de tripletes o cuadrupletes está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen al triplete particular o secuencia de cuadrupletes. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. 6.453.242 y 6.534.261 en propiedad junto con la presente.
Los métodos de selección ejemplares, que incluyen sistemas de presentación de fagos y de dos híbridos, se describen en las Patentes US 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como documentos WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión en dedo de zinc, por ejemplo en el documento WO 02/077227 en propiedad junto con la presente.
Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios en dedo de zinc y/o proteínas en dedo de zinc con múltiples dedos se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia enlazadora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse también, las Patentes U.S. nos 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas aquí pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.
La selección de sitios diana y métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en detalle en las Patentes 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; documentos WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios en dedo de zinc y/o proteínas en dedo de zinc con múltiples dedos se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia enlazadora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse también, las Patentes U.S. nos 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas aquí pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.
En ciertos aspectos de la descripción, el dominio de unión al ADN es parte de un sistema de nucleasa CRISPR/Cas, que incluye, por ejemplo, un ARN guía único (ARNsg). Véanse, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.697.359 y la Publicación de Patente U.S. n° 20150056705. El locus CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas), que codifica los componentes de ARN del sistema, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res.
30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60) componen las secuencias de genes del sistema de nucleasas CRISPR/Cas. Los loci CRISPR en hospedantes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión del ácido nucleico mediada por CRISPR.
El CRISPR de Tipo II es uno de los sistemas mejor caracterizados, y lleva a cabo en cuatro etapas secuenciales una ruptura bicatenaria del ADN dirigida. Primero, dos ARN no codificantes, la matriz pre-crRNA y tracrRNA, se transcriben desde el locus CRISPR. En segundo lugar, tracrRNA se hibrida con las regiones repetidas del pre-crRNA y media en el procesamiento de pre-crRNA en crRNA maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo crRNA:tracrRNA maduro dirige Cas9 al ADN diana a través del emparejamiento de bases Watson-Crick entre el espaciador en el crRNA y el protoespaciador en el ADN diana junto al motivo adyacente del protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento de la diana. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN diana para crear una ruptura bicatenaria dentro del protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas consta de tres etapas: (i) inserción de secuencias de ADN ajenas en la matriz CRISPR para prevenir ataques futuros, en un proceso llamado “adaptación”, (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico ajeno. Por lo tanto, en la célula bacteriana, varias de las llamadas proteínas “Cas” están involucradas con la función natural del sistema CRISPR/Cas y cumplen funciones en funciones como la inserción del ADN extraño, etc.
La proteína Cas puede ser un “derivado funcional” de una proteína Cas de origen natural. Un “derivado funcional” de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los “derivados funcionales” incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada aquí es la capacidad del derivado funcional para hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término “derivado” abarca tantas variantes de secuencias de aminoácidos del polipéptido, modificaciones covalentes, y fusiones de los mismos. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero sin limitación, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas, o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como los derivados de la proteína Cas o un fragmento de la misma, puede obtenerse de una célula o sintetizarse químicamente o mediante una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce proteína Cas de forma natural, o una célula que produce proteína Cas de forma natural y está manipulada genéticamente para producir la proteína Cas endógena a un nivel de expresión más alto, o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido exógenamente, ácido nucleico el cual codifica una Cas que es igual o diferente de la Cas endógena. En algunos casos, la célula no produce proteína Cas de forma natural, y está manipulada genéticamente para producir una proteína Cas.
En algunos aspectos de la descripción, el dominio de unión al ADN es parte de un sistema TtAgo (véase Swarts et al, en el mismo lugar; Sheng et al, en el mismo lugar). En eucariotas, el silenciamiento génico está mediado por la familia de proteínas Argonauta (Ago). En este paradigma, Ago se une a los ARN pequeños (19-31 nt). Este complejo de silenciamiento de proteína-ARN reconoce los ARN diana a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el ARN pequeño y la diana, y escinde endonucleolíticamente el ARN diana (Vogel (2014) Science 344:972-973). Por el contrario, las proteínas procariotas Ago se unen a pequeños fragmentos de ADN monocatenarios, y probablemente funcionen para detectar y eliminar ADN extraño (a menudo viral) (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts et al., en el mismo lugar). Las proteínas Ago procarióticas ejemplares incluyen aquellas de Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides, y Thermus thermophilus.
Una de las proteínas Ago procariotas mejor caracterizadas es la de T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al., en el mismo lugar). TtAgo se asocia con fragmentos de ADN monocatenario de 15 nt o 13-25 nt con grupos fosfato 5’. Este “ADN guía” unido por TtAgo sirve para dirigir el complejo proteína-ADN para que se una a una secuencia de ADN complementaria de Watson-Crick en una molécula de ADN de terceros. Una vez que la información de la secuencia en estos ADN guía ha permitido la identificación del ADN diana, el complejo de ADN guía TtAgo escinde el ADN diana. Dicho mecanismo también está respaldado por la estructura del complejo de ADN guía-TtAgo mientras está unido a su ADN diana (G. Sheng et al., en el mismo lugar). Ago de Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) tiene propiedades similares (Olivnikov et al., en el mismo lugar).).
Los ADN guía exógenos de secuencia de ADN arbitraria se pueden cargar en la proteína TtAgo (Swarts et al. en el mismo lugar). Dado que la especificidad de la escisión de TtAgo está dirigida por el ADN guía, un complejo de TtAgo-ADN formado con un ADN guía exógeno, especificado por el investigador, dirigirá la escisión del ADN diana de TtAgo a un ADN diana complementario especificado por el investigador. De esta manera, se puede crear una rotura bicatenaria específica en el ADN. El uso del sistema de ADN guía TtAgo (o sistemas de ADN guía Ago ortólogos de otros organismos) permite la escisión dirigida del ADN genómico dentro de las células. Tal escisión puede ser monocatenaria o bicatenaria. Para la escisión del ADN genómico de mamíferos, sería preferible usar una versión del codón TtAgo optimizada para la expresión en células de mamíferos. Además, podría ser preferible tratar las células con un complejo TtAgo-ADN formado in vitro en el que la proteína TtAgo se fusiona con un péptido que penetra en las células. Además, podría ser preferible usar una versión de la proteína TtAgo que se haya alterado mediante mutagénesis para tener una actividad mejorada a 37 grados Celsius. La escisión de a Dn mediada por ARN-Ago podría usarse para afectar a una amplia gama de resultados que incluyen eliminación de genes, adición de genes dirigidos, corrección de genes, eliminación de genes dirigidos usando técnicas estándar en la técnica para la explotación de roturas de ADN.
Por tanto, la nucleasa comprende un dominio de unión al ADN que se une específicamente a un sitio diana en cualquier gen en el que se desee insertar un donante (transgén).
B. Dominios de escisión
Cualquier dominio de escisión adecuado puede unirse operativamente a un dominio de unión a ADN para formar una nucleasa. Por ejemplo, los dominios de unión a ADN de ZFP se han fusionado con dominios de nucleasa para crear ZFN - una entidad funcional que es capaz de reconocer su diana de ácido nucleico a través de su dominio de unión de ADN manipulado (ZFP) y hacer que el ADN se corte cerca de sitio de unión de ZFP a través de la actividad nucleasa, incluso para uso en la modificación del genoma en una variedad de organismos. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patentes de los Estados Unidos de América 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la Publicación Internacional WO 07/014275. Asimismo, los dominios de unión al ADN de TALE se han fusionado con los dominios de nucleasa para crear TALEN. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 8.586.526. También se han descrito sistemas de nucleasa CRISPR/Cas que comprenden ARN de guía única (sgRNA) que se unen al ADN y se asocian con dominios de escisión (por ejemplo, dominios Cas) para inducir la escisión dirigida. Véanse, por ejemplo, la Patentes U.S. n° 8.697.359 y 8.932.814 y la Publicación de Patente U.S. n220150056705.
Como se indicó anteriormente, el dominio de escisión puede ser heterólogo para el dominio de unión al ADN, por ejemplo: un dominio de unión al ADN en dedo de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa; un dominio de unión a ADN de TALEN y un dominio de escisión de una nucleasa; un dominio de unión a ADN de sgRNA y un dominio de escisión de una nucleasa (CRISPR/Cas); y/o dominio de unión a ADN de meganucleasa y dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos se pueden obtener a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que se puede derivar un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y meganucleasas. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (por ejemplo, Nucleasa S1; nucleasa de frijol mungo; DNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura. Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) se pueden usar como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.
De manera similar, un semidominio de escisión puede derivar de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se estableció anteriormente, que requiere dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Alternativamente, se puede usar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están preferiblemente dispuestos, uno con respecto al otro, de modo que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloque los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permita que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por tanto, en ciertas realizaciones, los bordes cercanos de los sitios diana están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios diana (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios diana.
Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse de forma específica de secuencia al ADN (en un sitio de reconocimiento) y escindir el ADN en o cerca del sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, Tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima Tipo IIS Fok I cataliza la escisión bicatenaria del ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una hebra y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véase, por ejemplo, las Patentes US 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. Por tanto, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de Tipo IIS y uno o más dominios de unión en dedo de zinc, que pueden o no pueden ser manipulados por ingeniería genética.
Una enzima de restricción de Tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima en particular es activa como dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575. Por consiguiente, para los fines de la presente descripción, la parte de la enzima Fok I usada en las proteínas de fusión descritas se considera un semidominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones de dedo de zinc-Fok I, dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un semidominio de escisión FokI, se pueden usar para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se pueden usar una sola molécula de polipéptido que contiene un dominio de unión en dedo de zinc y dos semidominios de escisión Fok I. En otra parte de esta descripción se proporcionan parámetros para la escisión dirigida y la alteración de la secuencia dirigida usando fusiones de dedo de zinc-Fok I.
Un dominio de escisión o semidominio de escisión puede ser cualquier parte de una proteína que retiene la actividad de escisión o que conserva la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizarse) para formar un dominio de escisión funcional.
Las enzimas de restricción de Tipo IIS ejemplares se describen en la Publicación Internacional WO 07/014275. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y éstos se contemplan en la presente descripción. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión manipulados (también denominados mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente U.S. nos 20050064474; 20060188987; 20070305346 y 20080131962. Restos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491,496, 498, 499, 500, 531,534, 537, y 538 de FokI son todos ellos dianas para influir en la dimerización de los semidominios de escisión de FokI.
Se pueden usar dominios de escisión con más de una mutación, por ejemplo mutaciones en las posiciones 490 (E®K) y 538 (I®K) en un semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión manipulado designado “E490K:I538K” y mutando las posiciones 486 (Q®E) y 499 (I®L) en otro semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión manipulado designado “Q486E:I499L”; mutaciones que reemplazan el resto de Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 con un resto de Glu (E), el resto de Iso (I) de tipo salvaje en la posición 499 con un resto de Leu (L) y el resto de Asn (N) de tipo salvaje en la posición 496 con un resto Asp (D) o Glu (E) (también denominados dominios “ELD” y “ELE”, respectivamente); semidominio de escisión manipulado que comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numeradas en relación con FokI de tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el resto de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 con un resto de Lys (K), el resto Iso de tipo salvaje (I) en la posición 538 con un resto de Lys (K) y el resto de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 con un resto de Lys (K) o un resto de Arg (R) (también denominado “Dominios KKK” y “KKR”, respectivamente); y/o el semidominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numeradas en relación con respecto a FokI de tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el resto de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 con un resto de Lys (K) y el resto His (H) de tipo salvaje en la posición 537 con un resto Lys (K) o un resto Arg (R) (también denominados dominios “KIK” y “KIR”, respectivamente). Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 7.914.796; 8.034.598 y 8.623.618. En otras realizaciones, el semidominio de escisión manipulado comprende las mutaciones “Sharkey” y/o “Sharkey’” (véase Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1 ):96-107).
Alternativamente, las nucleasas se pueden ensamblar in vivo en el sitio diana del ácido nucleico usando la tecnología denominada “enzima dividida” (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente U.S. n° 20090068164). Los componentes de tales enzimas divididas pueden expresarse en construcciones de expresión separadas o pueden unirse en un marco de lectura abierto en el que los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A autoescindible o una secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión en dedo de zinc individuales o dominios de un dominio de unión de ácido nucleico de meganucleasa.
Las nucleasas se pueden cribar para determinar su actividad antes de su uso, por ejemplo, en un sistema cromosómico basado en levadura como se describe en la Patente U.S. n° 8.563.314.
El sistema CRISPR/Cas relacionado con Cas9 comprende dos componentes de ARN no codificantes: tracrRNA y una matriz de pre-crRNA que contiene secuencias de guía de nucleasa (espaciadores) intercaladas por repeticiones directas idénticas (DR). Para usar un sistema CRISPR/Cas para lograr la ingeniería del genoma, ambas funciones de estos ARN deben estar presentes (véase Cong et al, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). En algunos aspectos de la descripción, el tracrRNA y los pre-crRNA se suministran mediante construcciones de expresión separadas o como ARN separados. En otros aspectos de la descripción, se construye un ARN quimérico en el que un crRNA maduro diseñado (que confiere especificidad de la diana) se fusiona con un tracrRNA (que proporciona interacción con el Cas9) para crear un híbrido de crRNA-tracrRNA quimérico (también denominado ARN guía único) (véanse Jinek, en el mismo lugar y Cong, en el mismo lugar).
Sitios diana
Como se describió en detalle anteriormente, los dominios de unión al ADN pueden manipularse para unirse a cualquier secuencia de elección. Un dominio de unión a ADN manipulado puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con un dominio de unión a ADN de origen natural.
Ejemplos no limitantes de genes diana adecuados son un gen de beta (b) globina (HBB), un gen de gamma (8) globina (HBG1), un gen de linfoma/leucemia de células B 11A (BCL11A), un gen del factor 1 de tipo Kruppel (KLF1), un gen CCR5, un gen CXCR4, un gen PPP1R12C (AAVS1), un gen de hipoxantina fosforribosiltransferasa (Hp RT), un gen de albúmina, un gen del factor VIII, un gen del factor IX, una gen de la cinasa 2 de repetición rica en leucina (LRRK2), un gen de la huntingtina (Htt), un gen de la rodopsina (RHO), un gen del regulador de la conductancia transmembránica de la fibrosis quística (CFTR), un gen de la proteína B del tensioactivo (SFTPB), un gen del receptor alfa de células T (TRAC), un gen del receptor beta de células T (TRBC), un gen de muerte celular programada 1 (PD1), un gen del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4), un gen del antígeno leucocitario humano (HLA) A, un gen de HLA B, un gen de HLA C, un gen de HLA-DPA, un gen de HLA-DQ, un gen de HLA-DRA, un gen de LMP7, un gen del transportador asociado con el procesamiento de antígenos (TAP) 1, un gen de TAP2, un gen de tapasina (TAPBP), una gen del transactivador del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (CIITA), un gen de la distrofina (DMD), un gen del receptor de glucocorticoides (GR), un gen IL2RG, un gen Rag-1, un gen RFX5, un gen FAD2, un gen FAD3, un gen ZP15, un gen KASII, un gen MDH, y/o un gen EPSPS.
En ciertos aspectos de la descripción, la nucleasa se dirige a un loci de “puerto seguro” tal como los genes AAVS1, HPRT, albúmina, y CCR5 en células humanas, y Rosa26 en células murinas (véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; 8.586.526; Publicaciones de Patente U.S.
20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960), y el locus Zp15 en plantas (véase la Patente de los Estados Unidos de América U.S. 8.329.986).
Donantes
La presente descripción se refiere a la modificación mediada por nucleasa del genoma de una célula madre. Como se señaló anteriormente, la inserción de una secuencia exógena (también llamada “secuencia donante” o “donante” o “transgén”), por ejemplo, para la supresión de una región específica y/o la corrección de un gen mutante o para una mayor expresión de un gen de tipo salvaje. Resultará fácilmente evidente que la secuencia donante no es típicamente idéntica a la secuencia genómica en la que se coloca. Una secuencia donante puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir una HDR eficaz en la ubicación de interés, o puede integrarse mediante mecanismos de reparación no dirigidos por homología. Además, las secuencias donantes pueden comprender una molécula de vector que contiene secuencias que no son homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula donante puede contener varias regiones discontinuas de homología con la cromatina celular. Además, para la inserción dirigida de secuencias que normalmente no están presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico donante y flanqueadas por regiones de homología con la secuencia en la región de interés.
Al igual que con las nucleasas, los donantes pueden introducirse en cualquier forma. En ciertas realizaciones, los donantes se introducen en forma de ARNm para eliminar el virus residual en las células modificadas. En otras realizaciones, los donantes pueden introducirse usando ADN y/o vectores virales mediante métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente U.S. nos 20100047805 y 20110207221. El donante puede introducirse en la célula en forma circular o lineal. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (por ejemplo, de degradación exonucleolítica) por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más restos de didesoxinucleótidos al extremo 3’ de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Véanse, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de grupo o grupos amino terminales y el uso de enlaces internucleotídicos modificados tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y restos de O-metil ribosa o desoxirribosa.
En ciertas realizaciones, el donante incluye secuencias (por ejemplo, secuencias codificantes, también denominadas transgenes) de más de 1 kb de longitud, por ejemplo, entre 2 y 200 kb, entre 2 y 10 kb (o cualquier valor entremedias). El donante también puede incluir al menos un sitio diana de nucleasa. En ciertas realizaciones, el donante incluye al menos 2 sitios diana, por ejemplo, para un par de nucleasas ZFN, TALEN, TtAgo o CRISPR/Cas. Normalmente, los sitios diana de la nucleasa están fuera de las secuencias del transgén, por ejemplo 5’ y/o 3’ de las secuencias del transgén, para la escisión del transgén. El sitio o sitios de escisión de nucleasa pueden ser para cualquier nucleasa. En ciertas realizaciones, el sitio o sitios diana de nucleasa contenidos en el donante bicatenario son para la o las mismas nucleasas usadas para escindir la diana endógena en la que se integra el donante escindido mediante métodos independientes de homología.
El donante puede insertarse de modo que su expresión sea impulsada por el promotor endógeno en el sitio de integración, es decir, el promotor que impulsa la expresión del gen endógeno en el que se inserta el donante. Sin embargo, resultará evidente que el donante puede comprender un promotor y/o potenciador, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible o específico de tejido. La molécula donante puede insertarse en un gen endógeno de modo que se exprese todo, parte o nada del gen endógeno. Además, aunque no son necesarias para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras de la transcripción o traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aislantes, sitios de entrada de ribosomas internos, secuencias que codifican péptidos 2A, y/o señales de poliadenilación.
Los transgenes transportados en las secuencias donantes descritas aquí pueden aislarse de plásmidos, células u otras fuentes usando técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como PCR. Los donantes para uso pueden incluir diversos tipos de topología, incluyendo circular superenrollado, circular relajado, lineal, y similares. Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente usando técnicas estándar de síntesis de oligonucleótidos. Además, los donantes pueden estar metilados o carecer de metilación. Los donantes pueden estar en forma de cromosomas artificiales bacterianos o de levadura (BAC o YAC).
Los polinucleótidos donantes descritos aquí pueden incluir una o más bases y/o cadenas principales no naturales. En particular, la inserción de una molécula donante con citosinas metiladas puede llevarse a cabo usando los métodos descritos aquí para lograr un estado de quiescencia transcripcional en una región de interés.
El polinucleótido exógeno (donante) puede comprender cualquier secuencia de interés (secuencia exógena). Las secuencias exógenas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cualquier secuencia codificante de polipéptido (por ejemplo, ADNc), secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, etiquetas de epítopo, genes marcadores, sitios de reconocimiento de enzimas de escisión, y diversos tipos de construcciones de expresión. Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a, secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína verde fluorescente, proteína verde fluorescente mejorada, proteína roja fluorescente, luciferasa), y proteínas que median el crecimiento celular mejorado y/o la amplificación de genes (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las etiquetas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA, o cualquier secuencia de aminoácidos detectable.
En algunas realizaciones, el donante comprende además un polinucleótido que codifica cualquier polipéptido cuya expresión en la célula se desee, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, antígenos, enzimas, receptores (de superficie celular o nucleares), hormonas, linfocinas, citocinas, polipéptidos informadores, factores de crecimiento, y fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores. Las secuencias codificantes pueden ser, por ejemplo, ADNc.
En ciertas realizaciones, las secuencias exógenas pueden comprender un gen marcador (descrito anteriormente), que permite la selección de células que han sufrido una integración dirigida, y una secuencia enlazada que codifica una funcionalidad adicional. Los ejemplos no limitantes de genes marcadores incluyen GFP, marcador o marcadores de selección de fármacos, y similares.
En ciertas realizaciones, el transgén puede incluir, por ejemplo, genes de tipo salvaje para reemplazar secuencias endógenas mutadas. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia de gen de tipo salvaje (u otro funcional) en el genoma de una célula madre en la que se muta la copia endógena del gen. El transgén puede insertarse en el locus endógeno, o alternativamente puede dirigirse a un locus de puerto seguro.
La construcción de tales casetes de expresión, siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, utiliza metodologías bien conocidas en la técnica de la biología molecular (véase, por ejemplo, Ausubel o Maniatis). Antes del uso del casete de expresión para generar un animal transgénico, la capacidad de respuesta del casete de expresión al inductor de estrés asociado con elementos de control seleccionados se puede evaluar introduciendo el casete de expresión en una línea celular adecuada (por ejemplo, células primarias, células transformadas, o líneas celulares inmortalizadas).
Además, aunque no son necesarias para la expresión, las secuencias exógenas también pueden ser secuencias reguladoras de la transcripción o traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aislantes, sitios de entrada de ribosomas internos, secuencias que codifican péptidos 2A, y/o señales de poliadenilación. Además, los elementos de control de los genes de interés se pueden enlazar operativamente a genes indicadores para crear genes quiméricos (por ejemplo, casetes de expresión informadores). Las secuencias de sitios aceptores de ayuste ejemplares son conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen, solo a modo de ejemplo, CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG, (SEQ ID NO: 1) (del gen HBB humano) y TTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO: 2) (del gen de inmunoglobulina gamma humana).
También se puede lograr la inserción dirigida de la secuencia de ácido nucleico no codificante. Para inserciones dirigidas, también pueden usarse secuencias que codifican ARN antisentido, ARNi, shRNA, y microARN (miARN).
En realizaciones adicionales, el ácido nucleico donante puede comprender secuencias no codificantes que son sitios diana específicos para diseños de nucleasas adicionales. Posteriormente, se pueden expresar nucleasas adicionales en las células de modo que la molécula donante original se escinda y modifique mediante la inserción de otra molécula donante de interés. De esta manera, se pueden generar integraciones reiterativas de moléculas donantes que permitan el apilamiento de rasgos en un locus de interés particular o en un locus de puerto seguro.
Células
Por tanto, aquí se proporcionan células manipuladas genéticamente, por ejemplo, células madre que comprenden un gen inactivado y/o un transgén, incluyendo células producidas mediante los métodos descritos aquí. El transgén se integra de manera dirigida en el genoma de la célula usando una o más nucleasas. A diferencia de la integración aleatoria, la integración dirigida asegura que el transgén se integre en un gen específico. El transgén puede integrarse en cualquier parte en el gen diana. El transgén puede integrarse en o cerca del sitio de unión y/o escisión de nucleasa, por ejemplo dentro de 1 -300 (o cualquier número de pares de bases entremedias) pares de bases en dirección 5’ o en dirección 3’ del sitio de escisión y/o sitio de unión, más preferiblemente dentro de 1-100 pares de bases (o cualquier número de pares de bases entremedias) de cualquier lado del sitio de escisión y/o de unión, incluso más preferiblemente dentro de 1 a 50 pares de bases (o cualquier número de pares de bases entremedias) de cualquier lado del sitio de escisión y/o de unión. En ciertas realizaciones, la secuencia integrada no incluye ninguna secuencia de vector (por ejemplo, secuencias de vector viral). Las células pueden comprender una modificación (por ejemplo, inserción y/o supresión) realizada por una nucleasa como se describe aquí, de modo que la modificación esté dentro de un exón del gen de beta-globina, por ejemplo, dentro del exón 1, 2 o 3. En ciertas realizaciones, la modificación corrige una mutación de células falciformes en el exón 1 del gen de beta globina. La modificación puede estar en o cerca (por ejemplo, 1-300 pares de bases o cualquier número de pares de bases entremedias) de SEQ ID NO: 23 o 24. En otras realizaciones, la modificación es 1-100 (o cualquier número de pares de bases entremedias) pares de bases de SEQ ID NO: 23 o 24. En ciertas realizaciones, la modificación está dentro de la SEQ ID NO: 23 y/o la SEQ ID NO: 24, por ejemplo una modificación de 1 o más pares de bases en la SEQ ID NO: 23 o 24.
Cualquier tipo de célula puede modificarse genéticamente como se describe aquí para que comprenda un transgén, incluyendo, pero sin limitarse a, células y líneas celulares. Otros ejemplos no limitantes de células modificadas genéticamente como se describen aquí incluyen células T (por ejemplo, CD4+, CD3+, CD8+, etc.); células dendríticas; células B; autólogas (por ejemplo, derivadas del paciente). En ciertas realizaciones, las células son células madre, incluyendo células madre heterólogas pluripotentes o multipotentes (por ejemplo, células CD34+, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre embrionarias, o similares). En ciertas realizaciones, las células descritas aquí son células madre derivadas del paciente.
Las células como se describen aquí son útiles para tratar y/o prevenir trastornos en un sujeto con el trastorno, por ejemplo, mediante terapias ex vivo. Las células modificadas con nucleasa se pueden expandir y después reintroducir en el paciente usando técnicas estándar. Véase, por ejemplo, Tebas et al (2014) New Eng J Med 370(10):901. En el caso de las células madre, después de la infusión en el sujeto, también se produce la diferenciación in vivo de estos precursores en células que expresan la proteína funcional (del donante insertado). También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las células descritas aquí. Además, las células se pueden crioconservar antes de la administración a un paciente.
Suministro
Las nucleasas, polinucleótidos que codifican estas nucleasas, polinucleótidos donantes, y composiciones que comprenden las proteínas y/o polinucleótidos descritos aquí pueden suministrarse por cualquier medio adecuado. En ciertas realizaciones, las nucleasas y/o los donantes se suministran in vivo. En otras realizaciones, las nucleasas y/o los donantes se suministran a células aisladas (por ejemplo, células madre autólogas o heterólogas) para la provisión de células modificadas útiles en el suministro ex vivo a pacientes.
Los métodos para suministrar nucleasas como se describe aquí se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S. nos 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.
Las nucleasas y/o construcciones de donantes como se describen aquí también pueden suministrarse usando cualquier mecanismo de suministro de ácido nucleico, incluyendo ADN y/o ARN desnudos (por ejemplo, ARNm) y vectores que contienen secuencias que codifican uno o más de los componentes. Se puede usar cualquier sistema de vectores, incluyendo, pero sin limitarse a, vectores plasmídicos, minicírculos de ADN, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de herpesvirus, y vectores de virus adenoasociados, etc., y combinaciones de los mismos. Véanse también las Patentes U.S. nos 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824, y la Solicitud de Patente U.S. n°. 14/271.008. Además, resultará evidente que cualquiera de estos sistemas puede comprender una o más de las secuencias necesarias para el tratamiento. Por tanto, cuando se introducen una o más nucleasas y un constructo donante en la célula, las nucleasas y/o el polinucleótido donante pueden transportarse en el mismo sistema de suministro o en diferentes mecanismos de suministro. Cuando se usan múltiples sistemas, cada mecanismo de suministro puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples nucleasas y/o construcciones de donantes (por ejemplo, ARNm que codifica una o más nucleasas y/o ARNm o AAV que portan una o más construcciones de donantes).
Se pueden usar métodos convencionales de transferencia de genes virales y no virales para introducir ácidos nucleicos que codifican nucleasas y construcciones de donantes en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Los sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, minicírculos de ADN, ácido nucleico desnudo, y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro tal como un liposoma, nanopartículas lipídicas, nanopartículas de polilactato-ácido glicólico, agentes complejantes de poliaminas, o poloxámero. Los sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y de ARN, que tienen genomas episomales o integrados después del suministro a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véanse Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31 -44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
Los métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, ARN desnudo, ARN encaperuzado, viriones artificiales, y captación de ADN mejorada por agentes. También se puede usar para el suministro de ácidos nucleicos la sonoporación, usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar).
Los sistemas de suministro de ácidos nucleicos ejemplares adicionales incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc., (véase, por ejemplo, la Patente U.S. n° 6.008.336). La lipofección se describe en, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355), y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos de reconocimiento de receptores eficaz incluyen los de Felgner, documentos WO 91/17424, WO 91/16024.
La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluyendo los liposomas dirigidos tales como los complejos de inmunolípidos, es bien conocida por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.
52:4817-4820 (1992); Patentes U.S. nos 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871,4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787).
Los métodos de suministro adicionales incluyen el uso del empaquetamiento de los ácidos nucleicos a suministrar en vehículos de suministro EnGenelC (EDV). Estos EDV se suministran específicamente a tejidos diana usando anticuerpos biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana, y después el EDV es llevado a la célula mediante endocitosis. Una vez en la célula, los contenidos se libera (véase MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos que codifican sistemas CRISPR/Cas manipulados aprovecha los procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas del cuerpo y transportar la carga útil viral al núcleo. Los vectores virales se pueden administrar directamente a los sujetos (in vivo), o pueden usarse para tratar células in vitro, y las células modificadas se administran a sujetos (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para el suministro de sistemas CRISPR/Cas incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus retrovirales, lentivirus, adenovirales, adenoasociados, de la vacuna, y del virus del herpes simple para la transferencia de genes. La integración en el genoma del hospedante es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, lo que a menudo da como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferente.
El tropismo de un retrovirus se puede alterar incorporando proteínas de cubierta extrañas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que pueden transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen títulos virales altos. La selección de un sistema de transferencia de genes retroviral depende del tejido diana. Los vectores retrovirales se componen de repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR que actúan en cis mínimas son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que entonces se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y combinaciones de los mismos (véanse, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731 -2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); documento PCT/US94/05700).
En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células, y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido títulos elevados y niveles de expresión elevados. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados (“AAV") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción de ácidos nucleicos y péptidos in vitro, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véanse, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); Patentes U.S. nos 4.797.368; documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en diversas publicaciones, que incluyen la Patente U.S. n° 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, pNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989). Se puede usar cualquier serotipo de AAV, incluyendo AAV1, a Av 3, AAV4, AAV5, AAV6 and AAV8, AAV 8.2, AAV9, y Aa V rh10 y AAV pseudotipado tal como AAV2/8, AAV2/5 y AAV2/6.
Actualmente se encuentran disponibles al menos seis enfoques de vectores virales para la transferencia de genes en ensayos clínicos, que usan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos con genes insertados en líneas de células auxiliares para generar el agente transductor.
pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han usado en ensayos clínicos (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50% o más para los vectores empaquetados MFG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1): 10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) son sistemas alternativos prometedores de suministro de genes basados en el virus tipo 2 adenoasociado de parvovirus defectuoso y no patógeno. Todos los vectores derivan de un plásmido que retiene solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pares de bases (pb) de AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. La transferencia de genes eficiente y el suministro de transgenes estable debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave para este sistema de vector. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Según la presente invención, también pueden usarse otros serotipos de AAV, incluyendo AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 y AAVrh10, y todas las variantes de los mismos.
Los vectores adenovirales recombinantes deficientes en replicación (Ad) pueden producirse con un título alto e infectar fácilmente varios tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus se manipulan de manera que un transgén sustituya a los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector de replicación defectuoso en replicación se propaga en células 293 humanas que suministran en trans la función génica suprimida. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo las células diferenciadas que no se dividen, tales como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad portadora. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).
Las células de empaquetamiento se usan para formar partículas de virus que pueden infectar una célula hospedante. Dichas células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células y2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales usados en la terapia génica generalmente se generan mediante una línea de células productoras que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas necesarias para el empaquetamiento y la posterior integración en un hospedante (si procede), siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones virales que faltan se suministran en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV usados en terapia génica normalmente solo poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que son necesarias para el empaquetamiento e integración en el genoma hospedante. El ADN viral se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, a saber, rep y cap, pero carece de secuencias ITR. La línea celular también está infectada con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector de AAV y la expresión de genes de AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias de ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir mediante, por ejemplo, tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.
En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica se suministre con un alto grado de especificidad para un tipo de tejido particular. Por consiguiente, un vector viral se puede modificar para que tenga especificidad para un tipo de célula dado expresando un ligando como una proteína de fusión con una proteína de la cubierta viral en la superficie exterior del virus. El ligando se escoge para que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), dieron a conocer que el virus de la leucemia murina de Moloney se puede modificar para expresar herregulina humana fusionada con gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede extenderse a otros pares de virus-célula diana, en los que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, los fagos filamentosos pueden manipularse para mostrar fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular escogido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a los vectores virales, se pueden aplicar los mismos principios a los vectores no virales. Dichos vectores se pueden manipular para que contengan secuencias de captación específicas que favorezcan la captación por células diana específicas.
Los vectores de terapia génica se pueden suministrar in vivo por administración a un sujeto individual, típicamente por administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, o intracraneal) o aplicación tópica, como se describe a continuación. Alternativamente, los vectores se pueden suministrar a las células ex vivo, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de un donante universal, seguido de la reimplantación de las células en un paciente, normalmente después de la selección de las células que han incorporado el vector.
Los vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen nucleasas y/o construcciones de donantes también se pueden administrar directamente a un organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, se puede administrar ADN desnudo. La administración se realiza mediante cualquiera de las rutas normalmente usadas para introducir una molécula en contacto final con células sanguíneas o tisulares, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar dichos ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica, y aunque se puede usar más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta.
Los vectores adecuados para la introducción de polinucleótidos descritos aquí incluyen vectores de lentivirus no integrantes (IDLV). Véanse, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; Publicación de Patente U.S. n22009/054985.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, como se describe a continuación (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).
Resultará evidente que las secuencias que codifican nucleasa y las construcciones donantes pueden administrarse usando el mismo o diferentes sistemas. Por ejemplo, un polinucleótido donante puede ser portado por un AAV, mientras que una o más nucleasas pueden ser portadas por ARNm. Además, los diferentes sistemas pueden administrarse por la misma o diferentes rutas (inyección intramuscular, inyección en la vena de la cola, otra inyección intravenosa, administración intraperitoneal, y/o inyección intramuscular. Los vectores pueden suministrarse simultáneamente o en cualquier orden secuencial).
Las formulaciones para las administraciones tanto ex vivo como in vivo incluyen suspensiones en líquidos o líquidos emulsionados. Los ingredientes activos a menudo se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH, agentes estabilizantes, u otros reactivos que mejoran la eficacia de la composición farmacéutica.
Kits
También se proporcionan kits para realizar cualquiera de los métodos anteriores. Los kits contienen típicamente polinucleótidos que codifican una o más nucleasas, uno o más factores que afectan la expansión de las células madre, y/o polinucleótidos donantes como se describe aquí, así como instrucciones para administrar los factores que afectan a las células madre en las células en las que se introducen las nucleasas y/o el polinucleótido donante (o el medio circundante). Los kits también pueden contener células, amortiguadores para la transformación de células, medios de cultivo para células, y/o amortiguadores para realizar ensayos. Por lo general, los kits también contienen una etiqueta que incluye cualquier material, tales como instrucciones, folletos para el envasado o publicitarios que se adjuntan o acompañan a los otros componentes del kit.
Los siguientes Ejemplos se refieren a aspectos ejemplares de la presente descripción en los que la nucleasa comprende una o más ZFN o una o más TALEN. Se apreciará que esto es solo con fines de ejemplificación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Diseño, construcción y caracterización general de nucleasas proteicas en dedo de zinc (ZFN)
Las proteínas en dedo de zinc se diseñaron e incorporaron en plásmidos, AAV o vectores adenovirales esencialmente como se describe en Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816, y como se describe en la Patente U.S. n° 6.534.261, y evaluaron para determinar la unión. Para las ZFN y TALEN específicas para el locus de beta globina humana, véanse la Patente U.S. n° 7.888.121 y las Publicaciones de Patente U.S. nos 20130137104 y 20130122591 en propiedad junto con la presente.
Ejemplo 2: Actividad de las ZFN específicas de globina
Se usaron pares de ZFN dirigidos al locus de globina humana para evaluar la capacidad de estas ZFN para inducir DSB en un sitio diana específico. Las secuencias de aminoácidos de las regiones de hélice de reconocimiento de cada dedo de las ZFN indicadas se muestran a continuación en la Tabla 1. Los sitios diana (sitios diana de ADN indicados en letras mayúsculas; nucleótidos sin contacto indicados en minúsculas) se muestran en la Tabla 2.
Tabla 1: Diseños de hélice de reconocimiento de proteínas en dedo de zinc específicas de beta globina humana
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Tabla 2: Sitios diana de los dedos de zinc específicos de la beta globina humana
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Se obtuvieron y procesaron células CD34+ humanas como sigue. Todas las muestras de sangre del cordón umbilical (CB) se obtuvieron de acuerdo con las pautas aprobadas por la Universidad de California, y se consideraron desechos médicos anónimos exentos de la revisión del IRB. Las células se procesaron dentro de las 48 horas posteriores a la recolección. Se obtuvieron aspirados de médula ósea (BM) de donantes voluntarios con SCD con autorización firmada según el protocolo UCLA IRB n° 10-001399. Se aislaron células mononucleares (MNC) de BM y CB usando centrifugación de densidad Ficoll Hypaque (Stem Cell Technologies). A continuación, se usó la separación en columna inmunomagnética para enriquecer las células CD34+ incubando las MNC con microperlas anti-CD34 (Miltenyi Biotec Inc.) a 4°C durante 30 min. A continuación, las células se enviaron a través de la columna magnética, y las células CD34+ se recogieron y se colocaron en crioviales con medio de congelación (10% de dimetilsulfóxido (Sigma Aldrich), 90% de FBS), y se criopreservaron en nitrógeno líquido. Las células CD34+ movilizadas (mPB) se adquirieron de Allcells.
Para producir el ARNm para la electroporación, los plásmidos que codifican las ZFN que se muestran en la Tabla 1 se linealizaron con SpeI (New England Biolabs) y se purificaron con fenol:cloroformo antes de su uso como molde para transcripción in vitro. El kit de transcripción mMessage mMachine® T7 ULTRA (Life Technologies) se usó de acuerdo con el protocolo del fabricante para producir ARNm transcrito in vitro, y se limpió con el kit de limpieza RNeasy® MinElute® (Qiagen). Para la electroporación, se siguió el siguiente protocolo: las células CD34+ de CB se descongelaron a 37°C, se lavaron en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 20% (Gemini Bio-products) y (1x glutamina, penicilina y estreptomicina), y se preestimularon durante 48 horas en medio X-VIVO15 (Lonza) que contiene glutamina, penicilina, estreptomicina, 50 ng/ml de SCF, 50 ng/ml de Flt-3, y 50 ng/ml de TPO (Peprotech). Para la electroporación, se centrifugaron 200.000 células por reacción a 90g durante 15 min, se resuspendieron en 100 pl de amortiguador de prensa BTX (Harvard Apparatus), se mezclaron con las cantidades indicadas de ARNm de ZFN y/u oligonucleótido según corresponda, y se pulsaron una vez a 250 V durante 5 ms en el electroporador de onda cuadrada BTX ECM 830 ((Harvard Apparatus).
Después de la electroporación, las células reposaron durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de los medios de cultivo, y se transfirieron a placas en un total de 500 ul. El IDLV donante estaba presente en el medio de cultivo final a las concentraciones descritas para las muestras apropiadas.
La corrección génica y la alteración génica se analizaron como sigue: se usó el ensayo de nucleasa Surveyor® (Cel-1) para determinar la alteración alélica específica del sitio inducida por ZFN. Una región de 410 pb que rodea el sitio de unión de ZFN se amplificó por PCR a partir de 200 ng de ADN genómico usando CellFwd (5’-gacaggtacggctgtcatca-3’ SEQ ID NO:25) and CellRev (5’-cagcctaagggtgggaaaat-3’ SEQ ID NO:26) usando Accuprime Taq Hi-Fi (Life Technologies). La desnaturalización, la rehibridación, la digestión, y el análisis electroforético y densitométrico se completaron como se describe (por ejemplo, Joglekat et al (2013) Mol. Ther: J of the Amer Soc Gene Ther 21: 1705-17). La modificación de genes específica del sitio se detectó mediante el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP).
Una región de 1,1 kb que rodea el sitio de unión de ZFN se amplificó por PCR usando los cebadores BgloOuterFwd (5’-atgcttagaaccgaggtagagttt-3’, SEQ ID NO:27) y BgloOuterRev (5’-cctgagacttccacactgatg-3’, SEQ ID NO:28) y Accuprime Taq Hi-Fi (Life Technologies). El producto de PCR se purificó usando un kit de limpieza de PCR (Life Technologies) y se digirió usando 10 unidades de HhaI (New England Biolabs) durante 3,5 horas a 37°C. Los productos de digestión se separaron en gel TBE-agarosa al 1,0% teñido previamente con GelGreen (Biotium), y se fotografiaron en un Typhoon FLA 9000 Biomolecular Imager (GE Healthcare).
Para cuantificar la modificación de genes, se usó un ensayo a base de PCR cuantitativa. Se realizó un conjunto de dos reacciones de PCR usando el producto de PCR de 1,1 kb descrito anteriormente como molde. El molde de PCR no purificado se diluyó 1:5.000, de los cuales 1 ul se usó en cada una de las siguientes reacciones de 25 ul. La primera PCR se realizó para amplificar genomas modificados, usando los cebadores HhaIFwd (5’-gaagtctgccgttactgcg-3’, SEQ ID NO:29) y HhaIRev (5’-cccagtttctattggtctcc-3’, SEQ ID NO:30). La segunda PCR se realizó para normalizar el molde de entrada usando los cebadores ExonIIFwd (5’-ctcggtgcctttagtgatgg-3’, SEQ ID NO:31) y ExonIIRev (5’-gactcaccctgaagttctc-3’, SEQ ID NO:32). Estas dos PCR se hicieron cuantitativas usando Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) y se adquirieron en ViiA7 (Life Technologies). La frecuencia de modificación de genes se determinó usando la diferencia Ct (ciclos hasta el umbral) entre las dos reacciones y una curva estándar de plásmido. Se encontró que todas las ZFN eran activas.
Los parálogos de globina se amplificaron por PCR y se secuenciaron en profundidad en una máquina Illumina MiSeq para analizar la modificación fuera de la diana. Los cebadores usados para la PCR son los siguientes: HBB: 5’-acacgacgctcttccgatctnnnngggctgggcataaaagtcag-3’ (SEQ ID NO:33) y 5’-gacgtgtgctcttccgatcttccacatgcccagtttctatt-3’ (SEQ ID NO:34); HBD: 5’-acacgacgctcttccgatctnnnntaaaaggcagggcagagtcga-3’ (SEQ ID NO:35) y 5’-gacgtgtgctcttccgatctacatgcccagtttccatttgc-3’ (SEQ ID NO:36); HBE1: 5’-acacgacgctc ttccgatctnnnnctgcttccgacacagctgcaa-3’ (SEQ ID NO:37) y 5’-gacgtgtgctcttccgatcttcacccttcattcccatgcat-3’ (SEQ ID NO:38); HBG1 y HBG2: 5’-acacgacgctcttccgatctnnnnggaacgtctgaggttatcaat-3’ (SEQ ID NO:39) y 5’-gacgtgtgctcttcc gatcttccttccctcccttgtcc-3’ (SEQ ID NO:40). HBG1 y HBG2 se coamplificaron, y las lecturas de secuencia se asignaron a HBG1 o HBG2 usando SNP específicos de locus dentro del amplicón. Las bases mezcladas dentro de los cebadores directos permiten la deconvolución de grupos durante la secuenciación.
Las ZFN indujeron una alteración alélica del 35-65% (indels) en el locus de la beta-globina dependiendo del tipo de célula, mientras que la modificación detectada en los parálogos de la beta-globina fue menor, como se muestra a continuación en la Tabla 3.
Tabla 3: Modificación asociada a ZFN en la beta globina humana
y sus parálogos en células K562 o CD34+ (33488/33501)
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La electroporación de ARNm transcrito in vitro que codifica las ZFN en CD34+ aisladas tanto de sangre de cordón umbilical humano (CB) como de sangre periférica movilizada (mPB) dio como resultado una escisión efectiva del locus diana, según lo determinado por el ensayo Surveyor Nuclease (Figura 1B).
Los resultados mostraron que las ZFN impulsan altos niveles de modificación de genes en el locus de la betaglobina.
Ejemplo 4: Corrección conducida por ZFN en la base de la célula falciforme
Después de la escisión exitosa en el locus de beta-globina diana, buscamos determinar si la corrección de la base falciforme en este sitio era posible usando un molde donante homólogo. Con este fin, se diseñaron y evaluaron en paralelo dos tipos de moldes de corrección de genes: un oligo de ADN corto y un IDLV. El molde donante de fragmento de gen de beta-globina humana de 1,1 kb clonado en el IDLV se diseñó para incluir el cambio correctivo en la mutación falciforme, así como un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción silencioso (RFLP) para crear un sitio de restricción HhaI para el análisis sustituto de recombinación homóloga (Figura 1C). El molde donante fue administrado por IDLV (véase la Figura 2D), lo que permite la transducción eficiente de HSPC CD34+ con una citotoxicidad mínima, produciendo transitoriamente un alto número de copias del molde con una integración genómica mínima.
Los niveles de modificación de genes en las células CD34+ tratadas con ZFN (par 33488/33501) más el donante IDLV se determinaron inicialmente mediante la digestión de RFLP de HhaI (Figura 1D) y un ensayo a base de PCR cuantitativa (qPCR) a un promedio de 18,0±2,2% de alelos (Figura 1 E). Se realizaron optimizaciones de las concentraciones de ARNm de ZFN y de donante IDLV (Figura 2 y Figura 3), y se demostró la importancia de valorar los reactivos de ZFN en el tipo de célula de interés para lograr una modificación de alto nivel mientras se mantiene el número de células y la viabilidad.
El uso de un oligonucleótido como molde de modificación/corrección de genes tendría ventajas de velocidad, coste, reproducibilidad, y facilidad de experimentación. Los experimentos iniciales que usan el molde donante de oligonucleótidos en HSPC de mPB introdujeron una secuencia de 3 pares de bases diseñada para crear un RFLP AvrII en el gen de beta-globina (HBB) produjeron 15% de modificación de genes (véase la Figura 4).
Para refinar el uso de donantes oligo, se evaluó un panel de oligonucleótidos correspondientes a una u otra hebra y de longitud simétricamente creciente centrada en el sitio de escisión de ZFN (véase la Tabla 4 a continuación), en la que en negrita indica la base que fue mutada con respecto a la secuencia de tipo salvaje. Los oligonucleótidos que están marcados con una “s” comprenden secuencias diseñadas para introducir la mutación falciforme en un gen de tipo salvaje. Como se muestra en la tabla, en la columna etiquetada “S”, la secuencia de tipo salvaje comprende una A en esta posición, mientras que la mutación falciforme comprende una T.
Tabla 4: Donantes oligo
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El uso de oligonucleótidos de cadena inversa más largos proporcionó el nivel más alto de modificación de genes (véase la Figura 5). Dado que la modificación o corrección de genes en el sitio de mutación de SCD no cambiará la secuencia o el espaciamiento de los sitios de unión de ZFN, se diseñaron mutaciones silenciosas en el molde donante y se introdujeron conjuntamente en el cromosoma para prevenir o reducir la unión de ZFN y la nueva escisión de alelos modificados. El uso de donantes de hebra inversa es compatible con la introducción de mutaciones silenciosas en el sitio de unión de ZFN de 3’ (Figura 4C).
Se introdujeron diversas combinaciones de mutaciones silenciosas en el oligo donante, y se ensayó la frecuencia de la modificación de genes. La combinación de los sitios de mutación silenciosa (SMS) uno y dos (SMS12) produjo el nivel más alto de modificación de HBB, y se usó en todos los experimentos subsiguientes de subsecuencias (Figura 4D). La relación inversa entre los alelos de HBB de genes modificados y los alelos modificados y luego reescindidos sugiere que los donantes SMS sirven de hecho para bloquear la reescisión de ZFN (Figura 4E). El examen de los transcritos de HBB en conjuntos de HSPC y en unidades formadoras de colonias de eritroides (BFU-E) no encontró signos de alteración de ayuste de ARNm de ningún alelo de SMS.
A concentraciones altas de ARNm de ZFN (par 47773/47817), el uso de un oligonucleótido donante que contenía SMS012 produjo más alelos con HBB modificada que el uso del donante SMS12 (Figura 17B).
El análisis exhaustivo de los resultados moleculares en HBB después del tratamiento con ZFN y el donante SMS124 reveló solo niveles menores de eventos inesperados de reparación del ADN, tal como los de una combinación de modificación de genes dirigida por homología y basada en NHEJ (1,5%) o de captura basada en NHEJ del oligonucleótido (0,4%) (véase la Tabla 5 a continuación).
Tabla 5: Resultados moleculares del tratamiento de HSPC con ZFN y donante de oligonucleótidos
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Finalmente, la sobreabundancia de eventos de modificación de genes dirigidos por homología parcial (SMS12 frente a SMS24) prestó un fuerte apoyo a la idea de que la nueva síntesis de ADN durante la modificación de genes con moldes de oligonucleótidos se produce usando el extremo 3’ monocatenario izquierdo de la DSB resecada (véase la Figura 6). Las combinaciones óptimas de ZFN, oligonucleótidos y donante de HSPC permitieron la modificación de genes del 30-40% de los alelos (véase la Figura 4F).
De este modo, las ZFN pueden inducir tanto niveles altos de DSB dirigidas como también niveles altos de modificación de genes de sitio específico en HSPC primarias cuando se suministran junto con un molde donante homólogo.
Ejemplo 5: Especificidad de ZFN
Dado que la beta-globina tiene una alta homología con otros genes de globina (delta, épsilon, gamma A, gamma G, y pseudo-beta-globina), las ZFN se diseñaron para evitar la escisión en estas regiones (Figura 6A). Las tasas de escisión en genes de globina homólogos usando el par 33488/33501 se ensayaron usando el ensayo de nucleasa Surveyor y mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento. El análisis de cada una de estas regiones reveló una modificación fuera de la diana solo en el gen delta-globina altamente homólogo en las células mPB, CB y SCD BM CD34+ (Figura 6B, Tabla 3). Complementamos estos ensayos directos de escisión de ZFN fuera de la diana con un enfoque más completo e imparcial de todo el genoma para identificar sitios fuera de la diana. Este ensayo se basa en la propensión de un IDLV no homólogo a ser capturado en los sitios de roturas bicatenarias, y utiliza análisis de sitios de integración agrupados en dirección 3’ (CLIS) de las integraciones en células K562 seleccionadas por su permisividad a la captura de IDLV. El procedimiento seguido se describe a continuación:
Los sitios de agrupación de genes de beta-globina se amplificaron por PCR con los siguientes cebadores: HBD: 5’-ggttcatttttcattctcaca-3’ (SEQ ID NO:41) y 5’-gtaatctgagggtaggaaaac-3’ (SEQ ID NO:42); HBBP1: 5’-cacccttgaccaatagattc-3’ (SEQ ID NO:52) y 5’- gagactgtgggatagtcata-3’ (SEQ ID NO:43); HBE1: 5’-cattatcacaaacttagtgtcc-3’ (SEQ ID NO:44) y 5’-agtctatgaaatgacaccatat-3’ (SEQ ID NO:45); HBG1: 5’-gcaaaggctataaaaaaaattagc-3’ (SEQ ID nO:46) y 5’-gagatcatccaggtgctttg-3’ (SEQ ID NO:47); HBG2: 5’-ggcaaaggctataaaaaaaattaagca-3’ (SEQ ID NO:48) y 5’-gagatcatccaggtgcttta-3’ (SEQ ID NO:49), y se analizaron mediante Surveyor® Nuclease como se describió anteriormente.
Las células K562 se electroporaron con 15 mg/ml de ARNm de ZFN y se transdujeron con 2E+08 TU/ml (MOI=250) de un IDLV que contenía un transgén de GFP conducido por el promotor MND (véase Challita, P. M. et al. (1995) J of Virol 69, 748-55) y sin ninguna homología con el locus de la beta-globina para asegurar que la integración en las roturas bicatenarias se debiera a la captura mediada por NHEJ (véase la Figura 7A). Se completaron cuatro réplicas biológicas individuales de ZFN+IDLV para mantener una alta sensibilidad a posibles sitios fuera de la diana en todo el genoma, mientras que se completaron dos controles para determinar el nivel de integración de fondo. Las células de control recibieron el IDLV de GFP, pero no ARNm de ZFN, para detectar sitios de DSB de origen natural que capturan IDLV sin la acción de las ZFN. Las células K562 se cultivaron en RPMI1640 (Cellgro) con suero bovino fetal al 10% (Gemini Bio-products) y 1% de penicilina/estreptomicina/L-glutamina (Gemini Bioproducts) durante 60 días. Durante este período, se realizaron con regularidad análisis de citometría de flujo para positividad de GFP para garantizar que cualquier IDLV no integrado se diluyó de las muestras. El día 60, las muestras se clasificaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar las células GFP+, se expandieron durante 5 días, se extrajo el ADN genómico, y las muestras se prepararon para la secuenciación de los sitios de integración del vector mediante PCR 35 mediada por amplificación lineal no restrictiva. El análisis del sitio de integración agrupado (CLIS) se realizó como se describió anteriormente (Gabriel, R., et al (2011) Nat Biotech. 29(9):816-23) con una ventana CLIS de 500 pares de bases para revelar los sitios de escisión de ZFN. Todos los CLIS se analizaron para determinar el nivel de homología de cada sitio con las secuencias del par ZFN. El porcentaje de homología se definió como el número de pares de bases coincidentes en el sitio para todas las iteraciones de unión de ZFN (homodímeros y heterodímeros) con longitudes de espaciador de hasta 20 nucleótidos. El porcentaje de homología más alto para cada CLIS se da a conocer a continuación en la Tabla 6. Para esta tabla, todos los CLIS identificados se enumeran con su porcentaje más alto de homología con el sitio diana de ZFN dentro de 200 pares de bases de su sitio de integración. Se evaluaron todas las posibles iteraciones de unión a ZFN (heterodímeros y homodímeros), y se analizaron longitudes de espaciador de hasta 20 nt. Los dos sitios de escisión de ZFN están resaltados en negrita. Todos los demás sitios frágiles identificados por CLIS están en cursiva. Chr, cromosoma; CLIS, sitio de integración agrupado; L, monómero de ZFN “izquierdo” (SBS#33488); R, monómero de ZFN “derecho” (SBS#33501); mientras que el número en el dímero de ZFN corresponde al tamaño del espaciador que dio el mayor porcentaje de homología con el sitio diana de ZFN. Se analizaron 20.000 sitios genómicos aleatorios usando este método para determinar el nivel de fondo de homología de ZFN en todo el genoma.
Tabla 6: CLIS y porcentaje de homología con el sitio diana de ZFN
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Como se predijo, el análisis de CLIS reveló atrapamiento en beta-globina y delta-globina (Figura 7, Tabla 6). No se encontraron otros sitios supuestos fuera de la diana en el análisis de CLIS que tuvieran una homología significativa con los sitios de unión de ZFN.
Estos resultados demuestran el alto nivel de especificidad de este par de ZFN para su sitio diana previsto en una escala de todo el genoma.
Ejemplo 6: Diferenciación in v i t r o de HSPC modificadas
Para asegurar que las HSPC con genes modificados fueran capaces de un amplio espectro normal de diferenciación eritroide y mieloide, las células tratadas se ensayaron tanto como células individuales como en cultivo a granel. Las células individuales se monitorizaron para determinar el potencial de formación de colonias en medio de metilcelulosa que contenía citocinas que promueven la diferenciación de las HSPC. Brevemente, un día después de la electroporación, se sembraron en placa 100 y 300 células viables por placa de cultivo celular de 35 mm por duplicado en medio basado en metilcelulosa MethoCult™ Optimum (Stem Cell Technologies). Para los experimentos con donantes de oligonucleótidos, las células se sembraron en placas cinco días después de la electroporación. Después de dos semanas en cultivo a 5% de CO2, 37°C y atmósfera humidificada, los diferentes tipos de colonias se caracterizaron y enumeraron en función de su morfología. Las HSPC tratadas con ZFN solas (par 33488/33501) o tratadas con z Fn y un donante de oligonucleótidos generaron números y patrones similares de clones eritroides y mieloides.
La técnica de diferenciación de eritroides in vitro para muestras de SCD BM se adaptó de Giarratana et al. ((2005) Nat Biotech 23:69-74), y se describió en Romero and Urbinati et al ((2013) J Clin Invest 123(8): 3317-3330). Un día después de la electroporación, las células se colocaron en cultivo de eritroides. Con el fin de obtener un gran número de células para los análisis posteriores, las células se colocaron en cocultivo el día 12 del protocolo en lugar del día 8 para permitir una mayor expansión de eritroides. Las células se recolectaron el día 22 del experimento, se peletizaron, y se sometieron a análisis por HPLC (véase más abajo). El ensayo de ayuste de HBB también se realizó mediante RT-PCR usando 5’acatttgcttctgacacaac-3’ (exón 1, SEQ ID NO:50) y 5’-gaaattggacagcaagaaagc-3’ (exón 3, SEQ ID NO:51), y no se observó omisión de exones o retención de intrones.
El genotipado de colonias de eritroides individuales confirmó la presencia de las ediciones previstas con la frecuencia esperada. Además, se indujo a las HSPC a diferenciarse en glóbulos rojos en cultivo a granel (Giarratana, M. et al. (2011) Blood 118, 5071-9). Se tomaron muestras de células a lo largo de la diferenciación de glóbulos rojos, y se midió la frecuencia de las células editadas mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento. De acuerdo con nuestro análisis unicelular de colonias de eritroides cultivadas en metilcelulosa, esencialmente no se encontró ningún cambio en la frecuencia de células modificadas durante la diferenciación a glóbulos rojos en cultivo a granel independientemente del nivel inicial de modificación de genes en el conjunto (Figura 9A).
Para el análisis de las cadenas de globina, se realizó HPLC (Figura 9B). Para las muestras de SCD BM, se realizó HPLC de especies de hemoglobina (Hb) producidas por células eritroides en etapa terminal como se describe en Wilber, A. et al. ((2011) Blood 117:2817-26), con alguna ligera modificación. Las células eritroides (1-2E+07) se recogieron al final del cultivo de eritroides (día 22), se peletizaron, y se almacenaron congeladas a -80°C hasta la lisis. Tras la descongelación, las células se resuspendieron en 25 ul de reactivo de hemolizado (Helena Laboratories), y se refrigeraron durante la noche antes de centrifugar a 20.800 x g durante 10 minutos a 4°C para eliminar los restos celulares. El sobrenadante aclarado se usó para la caracterización de la producción de Hb por HPLC usando una columna de intercambio catiónico (Ultra2 Variant Resolution Analyzer; Primus Diagnostics) y muestras calibradas para hemoglobinas humanas. Los picos correspondientes a las especies de Hb se identificaron en función del tiempo de retención con el software que acompaña al instrumento de HPLC. El porcentaje relativo de HbA producido para cada muestra se calculó basándose en la suma total de áreas bajo la curva para cada uno de los picos de hemoglobina primarios que incluían hemoglobina fetal acetilada, HbFAc; hemoglobina fetal, HbF; hemoglobina de tipo salvaje, HbA; y hemoglobina falciforme, HbS.
Para las muestras de mPB, las células eritroides se recolectaron el día 18 del cultivo de eritroides. Las células se peletizaron y se lisaron en agua durante 10 min a RT. Después de centrifugar a 20.000g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares, los lisados celulares se almacenaron congelados a -80°C. Tras la descongelación, los lisados celulares se diluyeron 1:10 en la fase móvil A y se caracterizaron por HPLC (Infinity 1260, Agilent) usando una columna de intercambio de catión débil (PolyCAT ATM, PolyLCINC.). Se usó material de referencia FASC (Trinity Biotech) para definir el tiempo de elución de las hemoglobinas comunes (HbF, HbA, HbS, HbC). El análisis y la integración de picos se realizaron usando el software OpenLAB CDS Chemstation. El porcentaje relativo de HbA producido para cada muestra se calculó basándose en la suma total de áreas bajo la curva para cada uno de los picos de hemoglobina que incluían hemoglobina fetal acetilada, HbFAc; hemoglobina fetal, HbF; hemoglobina de tipo salvaje, HbA; y hemoglobina falciforme, HbS.
En un experimento paralelo, convertimos el 14% de los alelos de HBB a la forma falciforme y analizamos por HPLC las cadenas de globina presentes después de 18 días de diferenciación eritroide. Aproximadamente el 18% de la hemoglobina producida por estas células era hemoglobina falciforme, lo que demuestra el impacto del evento de modificación de genes a nivel de proteína (Figura 9B).
Ejemplo 7: Injerto de células modificadas en ratones
Para determinar si las células modificadas con ZFN mantienen su capacidad de repoblación hematopoyética, se xenoinjertaron HSPC derivadas de CB, tratadas con ZFN y donante o tratadas de forma simulada, en ratones NSG inmunodeficientes.
Brevemente, células CB CD34+ recientes de múltiples individuos sanos se preestimularon durante 2 días antes de ser electroporadas con ARNm de ZFN y transducidas con donante IDLV (2E+07TU/ml; MOI=50). Se usó el medio de preestimulación que incluía medio X-VIVO15 (Lonza) que contenía glutamina, penicilina, estreptomicina, 50 ng/ml de SCF, 50 ng/ml de Flt-3, y 50 ng/ml de TPO (Peprotech). Después de un día de recuperación, se trasplantaron 1E+06 células viables en PBS (Corning) con BSA al 0,1% (Sigma) mediante inyección en la vena de la cola en ratones NSG de 6 a 8 semanas de edad (The Jackson Laboratory) después de 250 cGy de irradiación corporal total. Se usaron muestras de control de células CD34+ que se cultivaron en paralelo pero que no se expusieron a ARNm, electroporación, o IDLV (tratadas de forma simulada). Se cultivaron pequeñas alícuotas in vitro para múltiples análisis. Las muestras de mPB se congelaron un día después de la electroporación, se descongelaron en una fecha posterior, y se dejaron un día de recuperación como antes del trasplante.
El injerto de células humanas se evaluó mediante citometría de flujo a las 5 semanas después del trasplante usando anti-CD45 humano conjugado con V450 frente a anti-CD45 murino conjugado con APC. Después de la incubación con los anticuerpos, los glóbulos rojos se lisaron con BD FACS-Lysing Solution (BD Biosciences). El porcentaje de injerto se definió como %huCD45+/(%huCD45+ %muCD45+). El injerto y la distribución del linaje en la sangre periférica y la BM se evaluaron mediante citometría de flujo a las 8 semanas y 16 semanas después del trasplante usando anti-CD45 humano conjugado con V450, anti-CD45 murino conjugado con V500, anti-CD33 humano conjugado con FITC, anti-CD3 humano conjugado con PerCP, anti-CD56 humano conjugado con PE, anti-CD19 humano conjugado con PE-Cy7, y anti-CD34 humano conjugado con APC (todos los anticuerpos proceden de BD Biosciences).
La estadística descriptiva, que incluye la media y la desviación estándar para variables de resultado, se dio a conocer y se presentó gráficamente. Para los resultados cuantitativos relacionados con los niveles de modificación de genes, injertos y linajes, la comparación por pares se realizó mediante una prueba de la t no pareada o dentro del marco de ANOVA de una vía si había más de dos grupos. Se realizó un análisis de dosis-respuesta para evaluar la optimización de la relación de ZFN y donante. Específicamente, usamos un enfoque de modelo lineal mixto, pero tratamos la dosis como un efecto continuo y fijo, y el experimento como un efecto aleatorio. Se evaluó el número de veces de la expansión de las células de la médula ósea del paciente con SCD a lo largo del tiempo mediante ANOVA de medidas repetidas. En nuestra investigación estadística, el ensayo de hipótesis fue bilateral, y se usó un umbral de significancia de 0,05 para el valor de p. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando SAS versión 9.3 (SAS Institute Inc. 2012).
El cultivo paralelo de las células in vitro mostró que las tasas de modificación de genes oscilaron entre 5%-20% según el análisis de qPCR RFLP, con un valor medio de 14,5±6,4% (Figura 10). La secuenciación de alto rendimiento reveló que 10,5±4,0% de los alelos contenían la base intercambiada en la ubicación falciforme, con inserciones o supresiones (indels) observadas en 32,0±9,9%. Además, se evaluó el potencial hematopoyético de estas células en un ensayo in vitro de formación de colonias; las células mantuvieron su capacidad de formación de colonias de amplio espectro en relación con las muestras simuladas no tratadas en todos los linajes analizables.
A las 5 y 8 semanas después de la inyección, se evaluó en los ratones trasplantados el injerto de HSPC humanas medido como el porcentaje de células CD45+ humanas del total de células CD45+, tanto humanas como murinas. Los niveles de injerto de HSPC tratadas con ZFN e IDLV fueron comparables a los de los controles no tratados, con un promedio de 14,8±11,4% en la semana 5, y aumentaron hasta el 45% en la semana 8 (Figura 10C). El análisis de linaje (CD3 para células T, CD33 para células mieloides, CD34 para HSPC, CD19 para células B, y CD56 para células NK) de la sangre periférica de los ratones fue como se esperaba en este modelo (Figura 11). El análisis de las células humanas en ratones que recibieron células tratadas tanto con ZFN como con un donante de oligonucleótidos reveló un espectro de diferenciación de HSPC similar al de las HSPC tratadas con ZFN e IDLV (Figura 10E).
Los ratones se sacrificaron a las 16 semanas después del trasplante para permitir la evaluación del injerto de células humanas y los niveles de modificación de genes. Para los ratones que recibieron células tratadas con ZFN e IDLV, la evaluación de la sangre periférica reveló altos niveles de injerto y distribución de linaje esperada. El análisis del compartimento de la médula ósea (BM) fue similar (Figura 12). Asimismo, en ratones que recibieron células tratadas tanto con ZFN como con oligonucleótidos, los niveles de injerto y la distribución del linaje fueron similares a los observados en la cohorte de ratones que recibieron HSPC tratadas con ZFN e IDLV en sangre periférica y BM.
Para determinar si las células humanas presentes en los ratones eran realmente las manipuladas por los reactivos de ZFN, se aisló el ADN genómico de los tejidos de la BM y el bazo de cada ratón y se interrogó el gen de beta-globina humana. El análisis de HhaI RFLP por qPCR en los tejidos de ratones que recibieron células tratadas con ZFN e IDLV reveló la presencia de modificación de genes en estos ratones, aunque con menor frecuencia (0,14±0,32% y 0,16±0,18% para BM y bazo, respectivamente) que los niveles de modificación de genes del 10,5% observados para las células de entrada (Figura 13). El análisis de secuencia confirmó la modificación de genes en la mutación falciforme en células humanas en la BM y el bazo, con promedios comparables de 0,21±0,39% y 0,27±0,31%, respectivamente (Fig. 13B). El análisis de las inserciones y supresiones (indels) causadas por NHEJ en el sitio de corte reveló niveles más altos de cambios que por HDR, con 4,8±7,8% de todas las lecturas de secuencia en la BM conteniendo indels y 3,8±3,7% en los bazos (Figura 14).
El análisis genómico de la BM y los bazos de ratones que recibieron células tratadas con ZFN y oligonucleótidos que portan una modificación de genes del 17,3% en la base falciforme y del 19,8% de indels en la población en masa antes de la administración también demostró el mantenimiento de la modificación de genes. El ADN de estos tejidos se sometió a secuenciación de alto rendimiento, revelando 0,85±0,81% y 2,11±1,19% de modificación de genes dirigida en la BM y el bazo, respectivamente (Figura 13C). La evaluación de las indels en estos tejidos mostró niveles de 3,34±2,65% en la BM y 5,86±2,30% en el bazo (Figura 14).
Estos resultados demuestran que las células CD34+ que se han sometido a una escisión de ADN específica del sitio mediante ZFN y una modificación de genes dirigida por homología son capaces de injertarse y experimentar diferenciación de múltiples linajes.
Ejemplo 8: Corrección genética en la médula ósea falciforme
Dado que los pacientes con anemia drepanocítica no son candidatos para la movilización de células madre con G-CSF, obtuvimos HSPC CD34+ de aspirados de BM de estos pacientes. La corrección de genes específica del sitio se realizó usando ARNm de ZFN y el donante IDLV. Las células se colocaron en un medio de expansión eritroide y posteriormente se diferenciaron mediante un método establecido (Romero et al, en el mismo lugar, Giarratana et al, en el mismo lugar). Además, se evaluó una parte de las células para determinar su potencial de formación de colonias. Las células tratadas con ZFN+IDLV (par 33488/33501) mostraron una capacidad de formación de colonias modestamente menor (35%) en comparación con las muestras de control simuladas, no electroporadas (Figura 15).
Después de la expansión eritroide inicial (pero antes de la enucleación), se recolectaron las células para análisis genómico. El análisis RFLP por qPCR de estas muestras reveló niveles de modificación de genes que promediaron 20,1±8,8% (Figura 16A). Estos resultados fueron confirmados por secuenciación profunda, mostrando la corrección de la mutación SCD en 18,4±6,7% de las lecturas (Figura 16B). Además, la secuenciación confirmó que la mayoría de los alelos que contienen la corrección de la mutación SCD también contenían un cambio de base en la ubicación HhaI, lo que indica que la mayoría de los eventos impulsados por HDR abarcan al menos la distancia de 22 pb entre esas dos bases. Tras la conclusión del cultivo de eritroides, se recogieron muestras para el análisis de los tetrámeros de globina mediante cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) (Figura 16C).
La presencia de un pico de HbA en las células eritroides derivadas de las muestras tratadas con ZFN e IDLV demuestra que la corrección genética condujo a la conversión funcional del alelo betaS en un alelo betaA. No se observó tal pico en eritrocitos derivados de células tratadas de forma simulada. El pico de HbF mostró un aumento relativo debido a la disminución del pico de HbS en las muestras tratadas con ZFN. La inducción relativa de HbA en muestras tratadas con ZFN e IDLV promedió 5,3±0,02%, con niveles de corrección de proteínas de hasta 10,0% (Figura 16D).
Estos resultados demuestran la capacidad de las ZFN en combinación con un donante de IDLV para corregir el fenotipo de las HSPC de la médula ósea de pacientes con anemia drepanocítica.
Los resultados que se muestran aquí demuestran altos niveles de corrección genética de la mutación de la anemia drepanocítica en células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas usando nucleasas en dedo de zinc in vitro. En el presente estudio, diseñamos pares de ZFN para escindir el locus de la beta-globina. En combinación con un molde de donante homólogo (suministrado como un oligonucleótido o mediante un vector lentivírico defectuoso en integrasa), estas ZFN pueden inducir la reparación dirigida por homología a niveles elevados en las células progenitoras.
El análisis de los sitios de escisión de ZFN reveló que la gran mayoría de la actividad de nucleasa tuvo lugar en el sitio diana del locus de beta-globina, con una fracción más pequeña de escisión en el gen de delta-globina homólogo. Debido al bajo nivel de expresión de delta-globina en células eritroides adultas (<3,5% de toda la globina), es poco probable que la actividad de ZFN en este gen en un subconjunto de células sea perjudicial. Una evaluación imparcial de todo el genoma de los sitios de escisión fuera de la diana de ZFN en las células K562 usando captura final de IDLV demostró la alta especificidad de las ZFN, y solo se observó una integración de fondo en sitios naturalmente frágiles.
Cuando las células tratadas con ZFN y donante se trasplantaron a ratones, el injerto y la distribución del linaje de las células fueron equivalentes entre las muestras tratadas de forma simulada y las tratadas con ZFN y donante. Sin embargo, a pesar de los niveles promedio de modificación de genes del 10-20% en las muestras in vitro antes del trasplante, los niveles de corrección genética en las células humanas en los bazos y BM de los ratones después de 16 semanas de injerto fueron marcadamente inferiores. Estos hallazgos son consistentes con trabajos publicados recientemente en el campo (Genovese et al (2014) Nature 510: 235-240) y puede implicar que mientras que las células progenitoras más maduras se corrigen de manera eficiente, se proporciona un beneficio sostenido (por ejemplo, un beneficio clínico) mediante la modificación de las células madre hematopoyéticas más primitivas.
La eficiencia de la corrección de genes dirigida por homología en HSPC más primitivas en comparación con la eficiencia de la alteración de genes específica del sitio (véase Holt et al (2010) Nat biotech: 839-47 con respecto a la alteración de CCR5) puede deberse a la diferencia en el uso de un molde de donante que contiene las bases correctivas, que se cosuministra, y las rutas de reparación del daño del ADN celular deben resolver la DSB usando HDR en lugar de NHEJ. Como NHEJ se ve favorecido en HSC primitiva, inactiva (véase Mohrin et al (2010) Cell stem cell 7:174-85), un sesgo en la elección de la ruta de reparación podría limitar la corrección genética en las HSC primitivas. De este modo, sin estar ligado a una teoría, es posible que las ZFN estén actuando con una eficiencia similar en las poblaciones de células maduras y primitivas, pero la ruta de reparación activa en cada tipo de célula difiere de tal manera que la HDR es más activa en células más maduras y menos en las HSC primitivas. En particular, las células trasplantadas a ratones mantuvieron sus niveles de entrada de indels en mayor medida que para la modificación de genes (7,4 y 4,3 veces de cambio en las indels en comparación con 43,9 y 11,7 veces de cambio en la modificación de genes para IDLV y experimentos de oligo, respectivamente).
Los experimentos en las células BM CD34+ de pacientes con anemia drepanocítica son prometedores para la traducción clínica. Los niveles de corrección de la mutación falciforme canónica (al menos en las células progenitoras eritroides) promediaron el 18% para estos experimentos, y, tras la diferenciación, estas células produjeron hemoglobina de tipo salvaje (HbA) corregida. Según los datos de los trasplantes alogénicos de células madre hematopoyéticas para la SCD, un quimerismo del donante del 10-30% puede dar como resultado una mejora clínica significativa como resultado de la ventaja selectiva de los glóbulos rojos normales derivados del donante (véanse Andreani et al (2011) Chimerism 2(1 ):21 -22 y Walters et al (2001) Am Soc Blood and Marrow Transpl 7:665-73). Además, los heterocigotos para la mutación SCD normalmente no experimentan síntomas de la enfermedad. Por tanto, corregir solo un alelo en cada HSC puede resultar suficiente para aliviar una gran parte de los síntomas asociados con la SCD.
A pesar de los avances recientes en la terapia génica a base de lentivirus para las hemoglobinopatías, y específicamente la SCD (véanse Romero et al, en el mismo lugar, y Chandrakasan y Malik (2014) Hematol/oncol Clin of North Amer 28:199-216), siguen existiendo posibles complicaciones debido a la necesidad de una expresión duradera y adecuadamente regulada del transgén terapéutico. La corrección específica del sitio usando nucleasas dirigidas de la transversión falciforme canónica que causa la enfermedad A a T en las HSC ofrece la capacidad única de mantener la expresión de la beta-globina bajo su promotor endógeno y la región de control del locus. Además, los reactivos de corrección del genoma solo requieren un tratamiento de las células ex vivo, de una sola vez, transitorio, para dar como resultado una corrección permanente.
En conjunto, estos datos respaldan el desarrollo continuo de la edición del genoma en las HSPC como un tratamiento potencial para la SCD.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una célula genéticamente modificada, que comprende:
- un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en un gen endógeno de beta-hemoglobina (Hbb) humana; y
- una modificación genómica dentro de 1-300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 del gen Hbb después de la ruptura bicatenaria por el par de nucleasas en dedo de zinc,
en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, y en la que la modificación genómica comprende una inserción y/o supresión.
2. Un método in vitro para producir una célula genéticamente manipulada que comprende una inserción y/o supresión dentro de 1 -300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 de un gen endógeno de beta-hemoglobina (Hbb) humana, comprendiendo el método producir una ruptura bicatenaria usando un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en el gen Hbb, comprendiendo el par las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501 ; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1.
3. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 1 o el método de la reivindicación 2, en los que la célula es una célula madre, tal como una célula madre hematopoyética, opcionalmente una célula madre hematopoyética CD34+.
4. Una célula diferenciada modificada genéticamente que desciende de la célula madre modificada genéticamente de la reivindicación 3, en la que opcionalmente la célula diferenciada es un glóbulo rojo (RBC), comprendiendo la célula diferenciada modificada genéticamente:
- un par de nucleasas en dedo de zinc que se unen a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y producen una ruptura bicatenaria en el gen Hbb; y
- una modificación genómica dentro de 1-300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 del gen Hbb después de la ruptura bicatenaria por el par de nucleasas en dedo de zinc,
en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, y en la que la modificación genómica comprende una inserción y/o supresión.
5. La célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1,3 o 4, en la que:
(a) el par de nucleasas comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501, o 47773 y 47817 en la Tabla 1; y/o
(b) uno o más polinucleótidos codifican el par de nucleasas.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en el que:
(a) el par de nucleasas comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501, o 47773 y 47817 en la Tabla 1; y/o
(b) uno o más polinucleótidos que codifican el par de nucleasas se suministran a la célula.
7. La célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-5, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 o 6, en los que la inserción comprende la integración de un polinucleótido donante que codifica un transgén, opcionalmente en los que el polinucleótido donante corrige una mutación de drepanocito.
8. Una composición farmacéutica, que comprende la célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-5 o 7.
9. Una nucleasa en dedo de zinc que comprende una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en la que la proteína en dedo de zinc comprende las regiones de hélice de reconocimiento ordenadas como se muestra en las proteínas designadas como 33488, 47773 o 47817 en la Tabla 1.
10. Una proteína de fusión que comprende la proteína en dedo de zinc como se define en la reivindicación 9 y un semidominio de escisión de tipo salvaje o manipulado.
11. Una nucleasa que comprende un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1.
12. Un polinucleótido que codifica una o más nucleasas en dedo de zinc de la reivindicación 9, una proteína de fusión de la reivindicación 10, o una nucleasa de la reivindicación 11.
13. Una célula aislada que comprende un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en la que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en la que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, opcionalmente en la que la célula es un glóbulo rojo (RBC) o una célula precursora.
14. Un kit que comprende un par de nucleasas en dedo de zinc o un polinucleótido que codifica un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en el que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en el que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1.
15. Un método in vitro para alterar la expresión de Hbb en una célula, comprendiendo el método:
introducir, en la célula, uno o más polinucleótidos que codifican un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo cada nucleasa en dedo de zinc una proteína en dedo de zinc y un dominio de escisión o semidominio de escisión, en el que la proteína en dedo de zinc comprende 5 o 6 dominios en dedo de zinc que comprenden un región de hélice de reconocimiento, en el que el par comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, en condiciones tales que se expresa la una o más proteínas y se altera la expresión del gen Hbb, comprendiendo además opcionalmente la integración de una secuencia donante en el genoma de la célula.
16. El método de la reivindicación 15, en el que la secuencia donante comprende un oligonucleótido que corrige una mutación que altera el sitio donante de ayuste para el procesamiento del ARNm del gen Hbb.
17. La célula modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en el tratamiento de una hemoglobinopatía, tal como la anemia drepanocítica, en la que la célula es una célula madre hematopoyética, un precursor de glóbulos rojos o un glóbulo rojo, y se injerta en un paciente.
18. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 6 o 7, en el que la célula es una célula madre hematopoyética CD34+, el par de nucleasas en dedo de zinc comprende las proteínas en dedo de zinc designadas 47773 y 47817 en la Tabla 1, y la inserción comprende una integración de un polinucleótido donante que corrige una mutación de drepanocito, opcionalmente en el que el polinucleótido donante se suministra por un vector de lentivirus no integrante (IDLV).
19. Una célula genéticamente modificada que comprende una modificación genómica dentro de 1 -300 pares de bases de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24 de un gen endógeno de beta-hemoglobina (Hbb) humana después de la rotura bicatenaria mediante un par de nucleasas en dedo de zinc, comprendiendo el par las proteínas en dedo de zinc designadas 33488 y 33501; 33488 y 47817; 47773 y 33501; o 47773 y 47817 en la Tabla 1, en la que la modificación genómica comprende la integración de un polinucleótido donante que codifica un transgén que corrige una mutación de drepanocito, y en la que la integración del polinucleótido donante introduce una o más mutaciones silenciosas como se muestra en la Figura 4C que bloquea la re-escisión por nucleasa en dedo de zinc.
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