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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Enzymzubereitungen,
die ein Enzym umfassen, das Endoglucanase-Aktivität zeigt,
das eine sehr gute Wirksamkeit bei industriellen Anwendungen, so
wie Waschmittelzusammensetzungen, bei dem Biopolishing von neu hergestellten
Textilien, um Zellulose-Textilerzeugnissen oder -Kleidungsstücken ein
abgenutztes Aussehen zu verleihen, und bei der Behandlung von Papierbrei
zeigt. Außerdem
bezieht sich die Erfindung auf DNA-Konstrukte, die solche Enzyme
kodieren, ein Verfahren zur Bereitstellung eines Gens, das für solche
Enzyme kodiert, ein Verfahren zur Herstellung der Enzyme, Enzymzubereitungen,
die solche Enzyme enthalten, und die Verwendung dieser Enzyme für eine Anzahl
von industriellen Anwendungen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zellulasen
oder zellulytische Enzyme sind Enzyme, die an Hydrolysen von Zellulose
beteiligt sind. Es ist bekannt, dass an der Hydrolyse von nativer
Zellulose drei Haupttypen von Zellulaseenzymen beteiligt sind, nämlich die
Cellobiohydrolyse (1,4-β-D-Glucancellobiohydrolase,
EC 3.2.1.91), die endo-β-1,4-Glucanase
(endo-1,4-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase,
EC 3.2.1.4) und die β-Glucosidase
(EC 3.2.1.21).
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Zellulasen
werden von einer großen
Anzahl von Mikroorganismen, die Pilze, Actinomyceten, Myxobakterien
und echte Bakterien einschließen,
aber auch von Pflanzen synthetisiert. Es wurden besonders Endoglucanasen
mit einer breiten Vielfalt von Spezifitäten identifiziert.
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Eine
sehr wichtige industrielle Anwendung von zellulytischen Enzymen
ist die Verwendung zur Behandlung einer Zellulosetextilie oder -Textilerzeugnisses,
z. B. als Bestandteile in Waschmittelzusammensetzungen oder Textilerzeugnis-Weichmacherzusammensetzungen,
für das
Biopolishing eines neuen Textilerzeugnisses (Ausrüstung von
Kleidungsstücken)
und um ein „stonewashed"-Aussehen eines Zellulose
enthaltendem Textilerzeugnis, speziell Denim, zu erhalten, und es
wurden mehrere Verfahren für
solch eine Behandlung vorgeschlagen, z. B. in GB-A-1 368 599, EP-A-0
307 564 und EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244,
WO 95/24471 und WO 95/26398.
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Eine
weitere wichtige industrielle Anwendung von zellulytischen Enzymen
ist die Verwendung für
die Behandlung von Papierbrei, z. B. für die Verbesserung der Entwässerung
oder des De-inken von wieder verwendetem Papier.
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Speziell
die Endoglucanasen (EC-Nr. 3.2.1.4) bilden eine interessante Gruppe
von Hydrolasen für
die erwähnten
industriellen Anwendungen. Endoglucanasen katalysieren die Endohydrolyse
von 1,4-β-D-glycosidischen
Bindungen in Zellulose, Zellulosederivaten (so wie Carboxymethylzellulose
und Hydroxyethylzellulose), Lichenin, β-1,4-Bindungen in gemischten β-1,3-Glucanen,
so wie Getreide-β-D-Glucanen
oder Xyloglucanen, und anderem Pflanzenmaterial, das Zelluloseteile
enthält.
Der zugelassene Name ist endo-1,4-β-D-Glucan-4-glucanhydrolase,
aber der abgekürzte
Ausdruck Endoglucanase wird in der vorliegenden Anmeldung verwendet.
Als Referenz können
T.-M. Enveri, „Microbial
Zellulases" in W.M.
Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers,
S. 183–224
(1983); Methods in Enzymology, (1988) Bd. 160, S. 200–391 (herausgegeben
von Wood, W.A. und Kellogg, S.T.); Béguin, P., „Molecular
Biology of Cellulose Degradation",
Annu. Rev. Microbiol. (1990), Bd. 44, S. 219–248; Béguin, P. und Aubert, J-P., „The biological
degradation of cellulose",
FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) S. 25–58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction
with cellulose",
Cellulose (1994), Bd. 1, S. 169–196,
zitiert werden.
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Pilzendoglucanasen,
speziell diejenigen, die von Spezies wie z. B. Fusarium oxysporum,
Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Aspergillus aculeatus,
Neocallimastix patriciarum und z. B. von Spezies der Gattungen Piromyces,
Humicola, Myceliophthora, Geotricum, Penicillium, Irpex, Coprinus
abgeleitet sind, wurden in zahlreichen Publikationen beschrieben.
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Pilzendoglucanasen
wurden zum Beispiel in: Sheppard, P.O., et al., "The use of conserved cellulase family-specific
sequences to clone cellulase homologue cDNAs from Fusarium oxysporum,
Gene, (1994), Bd. 15, S. 163–167,
Saloheimo, A., et al., "A
novel, small endoglucanase gene, egI5, from Trichoderma reesei isolated
by expression in yeast",
Molecular Microbiology (1994), Bd. 13(2), S. 219–228; van Arsdell, J. N. et
al., (1987), Cloning, characterization, and expression in Saccharomyces
cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei, Bio/Technology
5:60–64;
Penttilä,
M. et al., (1986), "Homology
between zellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide
sequence of the endoglucanase I gene", Gene 45:253–263, Saloheimo, M. et al.,
(1988), "EGIII,
a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization
of both gene and enzyme",
Gene 63:11–21;
Gonzáles,
R., et al., "Cloning,
sequence analysis and yeast expression of the egll gene from Trichoderma
longibrachiatum",
Appl. Microbiol. Biotechnol., (1992), Bd. 38, S. 370–375; Ooi, T.
et al. "Cloning
and sequence analysis of a cDNA for zellulase (FI-CMCase) from Aspergillus
aculeatus", Curr. Genet.,
(1990), Bd. 18, S. 217–222;
Ooi, T. et al, "Complete
nucleotide sequence of a gene coding for Aspergillus aculeatus zellulase
(FI-CMCase)", Nucleic
Acids Research, (1990), Bd. 18, Nr. 19, S. 5884; Xue, G. et al., "Cloning and expression
of multiple zellulase cDNAs from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix
patriciarum in E. coli",
J. Gen. Microbiol., (1992), Bd. 138, S. 1413–1420; Xue, G. et al., "A novel polysaccharide hydrolase
cDNA (celD) from Neocallimastix patriciarum encoding three multi-functional
catalytical domains with high endoglucanase, cellobiohydrolase and
xylanase activities",
J. Gen. Microbiol., (1992), Bd. 138, S. 2397–2403; Zhou, L. et al., "Intronless celB from
the anaerobic fungus Neocallimastix patriciarum encodes a modular
family A endoglucanase",
Biochem. J., (1994), Bd. 297, S. 359–364; Dalbøge, H. und Heldt-Hansen, H.
P., "A novel method
for efficient expression cloning of fungal enzyme genes", Mol. Gen. Genet.,
(1994), Bd. 243, S. 253–260;
Ali, B. R. S. et al., "Cellulases
and hemicellulases of the anaerobic fungus Piromyces constitute
a multiprotein cellulose-binding complex and are encoded by multigene
families", FEMS
Microbiol. Lett., (1995), Bd. 125, Nr. 1, S. 15–21 beschrieben. Außerdem umfasst
die DNA-Datenbank von Japan (DDBJ-Datenbank, im Internet öffentlich
zugänglich)
zwei aus Penicillium janthinellum klonierte DNA-Sequenzen, die Endoglucanasen
kodieren (von A. Koch bzw. G. Mernitz kloniert) und eine aus Humicola
grisea var.thermoidea klonierte DNA-Sequenz, die eine Endoglucanase
kodiert (von T. Uozumi kloniert). Zwei Endoglucanasen aus Macrophomina
phaseolina wurden kloniert und sequenziert, siehe Wang, H. Y. und
Jones, R. W.: "Cloning, characterization
and functional expression of an endoglucanase-encoding gene from
the phytopathogenic fungus Macrophomina phaseolina" in Gene, 158:125–128, 1995,
und Wang, H. Y. und Jones, R. W.: "A unique endoglucanase-encoding gene
cloned from the phytopathogenic fungus Macrophomina phaseolina" in Applied And Environmental
Microbiology, 61:2004–2006,
1995. Eine dieser Endoglucanasen zeigt eine hohe Homologie zu der
egl3-Endoglucanase
aus dem Pilz Trichoderma reesei, die andere zeigt Homologie zu dem
egl1 aus dem mikrobiellen Phytopathogen Pseudomonas solanacearum,
was darauf hindeutet, das beide Endoglucanasen zu der Familie 5
der Glycosylhydrolasen gehören
(B. Henrissat, Biochem J 280:309–316 (1991)). Die Filament-spezifische
Expression eines Zellulasegens in dem dimorphen Pilz Ustilago maydis
ist in Schauwecker, F. et al. (1995) offenbart.
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WO
91/17243 (Novo Nordisk A/S) offenbart eine Zellulasezubereitung,
die aus einem homogenen Endoglucanase-Bestandteil besteht, der mit
einem Antikörper
immunreaktiv ist, der gegen eine hochgradig gereinigte 43-kDa-Endoglucanase
erzeugt wurde, die von Humicola insolens, DSM 1800, abgeleitet wurde;
WO 91/17244 (Novo Nordisk A/S) offenbart ein neues, (Hemi)Zellulose-abbauendes
Enzym, so wie eine Endoglucanase, eine Cellobiohydrolase oder eine β-Glucosidase,
das von anderen Pilzen als Trichoderma und Phanerochaete abgeleitet
werden kann; WO 93/20193 offenbart eine Endoglucanase, die von Aspergillus
aculeatus ableitbar ist; WO 94/21801 (Genencor Inc.) betrifft ein
Zellulasesystem, das aus Trichoderma longibrachiatum isoliert wurde,
das Endoglucanase-Aktivität zeigt;
WO 94/26880 (Gist Brocades N.V.) offenbart ein isoliertes Gemisch
von Zellulose-abbauenden Enzymen, die vorzugsweise aus Trichoderma,
Aspergillus oder Disporotrichum erhalten werden, das Endoglucanase-,
Cellobiohydrolase- und Xyloglucanase-Aktivität aufweist; und WO 95/02043
(Novo Nordisk A/S) beschreibt ein Enzym mit Endoglucanase-Aktivität, das von
Trichoderma harzianum abgeleitet ist, das für eine Anzahl von Zwecken verwendet
werden kann, die z. B. den Abbau oder die Modifizierung von Pflanzenzellwänden einschließen.
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Es
ist auch bekannt, dass Zellulasen eine Zellulose-Bindungsdomäne (eine
CBD) aufweisen oder nicht aufweisen können. Die CBD verstärkt die
Bindung des Enzyms an eine Zellulose-enthaltende Faser und erhöht die Wirksamkeit
des katalytisch wirksamen Teils des Enzyms.
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Es
besteht ein stets vorhandener Bedarf an der Bereitstellung neuer
Zellulase-Enzymzubereitungen, die
für Anwendungen
verwendet werden können,
in denen eine Zellulase-, vorzugsweise eine Endoglucanase-Aktivität wünschenswert
ist.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Enzymzubereitungen,
die eine erhebliche zellulytische Aktivität unter sauren, neutralen oder
alkalischen Bedingungen und eine verbesserte Wirksamkeit bei der
Verarbeitung von Papierbrei, der Textilbehandlung, in Wäschereiverfahren
oder in Tierfutter aufweisen, vorzugsweise neue Zellulasen, mehr
bevorzugt gut wirksame Endoglucanasen, die mittels rekombinanter Techniken
herstellbar oder hergestellt sein sollen, bereitzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass eine Gruppe von Endoglucanasen, die bestimmte
einzigartige Merkmale aufweisen, bei denjenigen industriellen Anwendungen,
für die
Endonukleasen üblicherweise verwendet
werden, eine sehr gute Wirksamkeit aufweisen. Diese einzigartigen
Merkmale können
als konservierte Regionen der Aminosäuresequenz des Enzymproteins
beschrieben werden, und die Erfinder haben gefunden, dass zellulytische
Enzyme, d. h. Enzyme, die eine zellulytische Aktivität aufweisen,
bestimmte konservierte Regionen aufweisen, die, z. B. bei der Behandlung
von Wäsche,
bei der Behandlung von neu hergestellten Textilien, bei der Behandlung
von Papierherstellungsbrei, sehr wirksam sind.
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Somit
bezieht sich die Erfindung in ihrem ersten Aspekt auf eine Enzymzubereitung,
die im Wesentlichen aus einem Enzym besteht, das zellulytische Aktivität aufweist
und eine wie in der SEQ ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
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Die
Erfinder haben experimentell bestätigt, dass die Kopplung einer
CBD-Region an ein Coreregion-Enzym (das die katalytisch aktive Region
oder Domäne
des Enzyms umfasst) der vorliegenden Erfindung zu einer signifkant
verbesserten Wirksamkeit, z. B. einer 50fach höheren Wirksamkeit, des Enzyms
mit mehreren Domänen
führt.
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Somit
stellt die vorliegende Erfindung neue Zellulasen, speziell Endoglucanasen,
bereit, die eine verbesserte Wirksamkeit bei industriellen Anwendungen,
entweder in ihrer nativen Form, oder in homo- oder heterolog produzierter
Form, aufweisen.
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In
weiteren Aspekten bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue
zellulytische Enzymzubereitungen, die von taxonomisch spezifischen
Familien, Gattungen und Spezies, z. B. von der Familie Chaetomiaceae,
ableitbar sind, speziell auf solche, die im Wesentlichen aus einem
Enzym bestehen, das die wie in SEQ ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist.
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In
noch weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung DNA-Konstrukte
bereit, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein Enzym kodiert, das
Endoglucanase-Aktivität
zeigt, wobei die DNA-Sequenz die in der SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz
oder Analoga davon umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen rekombinanten
Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt umfasst;
auf eine Zelle, die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen
erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektor umfasst; auf ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms,
z. B. eines erfindungsgemäßen rekombinanten
Enzyms; auf ein Verfahren zur Bereitstellung einer Farbklärung von
Wäsche
unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms; auf eine Waschmittelzusammensetzung,
die das erfindungsgemäße Enzym
umfasst; auf Verwendungen des erfindungsgemäßen Enzyms für den Abbau
oder die Modifizierung von Pflanzenmaterial, z. B. Zellwänden, für die Behandlung
eines Textilerzeugnisses, einer Textilie oder von Kleidung, für die Behandlung
von Papierbrei, und auf eine Enzymzubereitung, die mit einem erfindungsgemäßen Enzym
angereichert ist.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In
dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „die 20
natürlicherweise
vorkommenden Aminosäurereste" die 20 Aminosäurereste,
die gewöhnlich
in Proteinen gefunden werden und üblicherweise als Alanin (Ala
oder A), Valin (Val oder V), Leucin (Leu oder L), Isoleucin (Ile
oder I), Prolin (Pro oder P), Phenylalanin (Phe oder F), Tryptophan
(Trp oder W), Methionin (Met oder M), Glycin (Gly oder G), Serin
(Ser oder S), Threonin (Thr oder T), Cystein (Cys oder C), Tyrosin
(Tyr oder Y), Asparagin (Asn oder N), Glutamin (Gln oder Q), Asparaginsäure (Asp
oder D), Glutaminsäure
(Glu oder E), Lysin (Lys oder K), Arginin (Arg oder R) und Histidin
(His oder H) bekannt sind.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden neue, gut wirksame Endoglucanasen bereitgestellt,
die die Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 9 umfassen.
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In
einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel
weist das erfindungsgemäße Enzym
eine erste Sequenz auf, die die Aminosäuresequenz
umfasst.
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In
einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Enzymzubereitung
bereit, die im Wesentlichen aus einem Enzym besteht, das zellulytische
Aktivität
aufweist und die wie in SEQ ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist.
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Das
Enzym ist auch aus einem Stamm erhältlich, der zu der Gattung
Thielavia gehört,
speziell aus einem Stamm, der zu der Spezies Thielavia terrestris
gehört,
spezifischererweise aus Thielavia terrestris, NRRL 8126.
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In
weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt
bereit, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Enzym kodiert, das
Endoglucanase-Aktivität
zeigt, wobei die DNA-Sequenz
- a) die in SEQ
ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces
cerevisiae DSM 10081 erhältliche
DNA-Sequenz umfasst oder
- b) ein Analog der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder
die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche
DNA-Sequenz umfasst, die
- i) homolog mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder
der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältlichen
DNA-Sequenz ist,
- ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde wie die in SEQ ID Nr.
8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces
cerevisiae DSM 10081 erhältliche
DNA-Sequenz hybridisiert,
- iii) ein Polypeptid kodiert, das homolog mit dem Polypeptid
ist, das von einer DNA-Sequenz kodiert ist, die die in SEQ ID Nr.
8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces
cerevisiae DSM 10081 erhältliche
DNA-Sequenz umfasst,
- iv) ein Polypeptid kodiert, das immunologisch reaktiv mit einem
Antikörper
ist, der gegen die gereinigte Endoglucanase erzeugt wurde, die von
der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid
in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältlichen DNA-Sequenz kodiert
ist.
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Escherichia
coli DSM 10571 wurde nach dem Budapester Vertrag am 6. März 1996
bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
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Saccharomyces
cerevisiae DSM 9770 wurde nach dem Budapester Vertrag am 24. Februar
1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
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Saccharomyces
cerevisiae DSM 10082 wurde nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni
1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
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Saccharomyces
cerevisiae DSM 10081 wurde nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni
1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
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Das
erfindungsgemäße DNA-Konstrukt,
das sich auf SEQ ID Nr. 8 bezieht, kann auf der Basis einer DNA-Bibliothek
eines Stamms von Thielavia, insbesondere eines Stammes von Thielavia
terrestris, speziell Thielavia terrestris, NRRL 8126, hergestellt
oder daraus isoliert werden.
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In
dem vorliegenden Zusammenhang soll das „Analog" zu der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz
jede beliebige DNA-Sequenz bezeichnen, die ein Enzym kodiert, das
Endoglucanase-Aktivität
zeigt, das jede beliebige oder alle der Eigenschaften i)-iv) aufweist.
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Die
analoge DNA-Sequenz
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- a) kann aus einem anderen oder verwandten (z.
B. demselben) Organismus, der das Enzym mit Endoglucanase-Aktivität produziert,
auf der Basis der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz, z. B. unter
Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren, isoliert werden;
das Homolog kann eine allelische Variante der DNA-Sequenz, die die
hierin gezeigten DNA-Sequenzen umfasst, d. h. eine alternative Form
eines Gens, die durch Mutation entsteht, sein; die Mutationen können still
(keine Veränderung
in dem kodierten Enzym) sein, oder sie können Enzyme kodieren, die eine
veränderte
Aminosäuresequenz
aufweisen; das Homolog der vorliegenden DNA-Sequenz kann auch ein
Gattungs- oder Spezieshomolog sein, d. h. das ein Enzym mit einer ähnlichen
Aktivität,
das von einer anderen Spezies abgeleitet ist, kodiert,
- b) kann auf der Basis der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz,
z. B. durch Einführen
von Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz
der von der DNA-Sequenz kodierten Enduglucanase führen, aber
die dem Kodongebrauch des Wirtsorganismus entsprechen, der für die Produktion des
Enzyms vorgesehen ist, oder durch Einführen von Nukleotidsubstitionen,
die zur einer anderen Aminosäuresequenz
führen
können,
konstruiert sein. In dem letzteren Fall sind die Aminosäureänderungen
jedoch vorzugsweise von einer untergeordneten Natur, d. h. konservative
Aminosäuresubstitutionen,
die die Faltung oder Aktivität
des Proteins nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen,
typischerweise von einer bis in etwa 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale
Verlängerungen,
so wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid
von bis zu in etwa 20–25
Resten oder eine kleine Verlängerung,
die die Reinigung erleichtert, so wie ein poly-Histidin-Abschnitt,
ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford
et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991.
Beispiele von konservativen Substitutionen finden sich innerhalb
der Gruppe der basischen Aminosäuren
(so wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (so wie Glutaminsäure und
Asparaginsäure),
polaren Aminosäuren
(so wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (so
wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (so
wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (so wie
Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
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Es
wird für
Fachleute offnsichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb
der Regionen, die für die
Funktion des Moleküls
kritisch sind, durchgeführt
werden können und
immernoch zu einem aktiven Polypeptid führen. Aminosäuren, die
essentiell für
die Aktivität
des Polypeptids sind, das von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodiert wird,
und die deshalb vorzugsweise keiner Substitution unterliegen, können mittels
im Stand der Technik bekannter Verfahren, so wie ortsspezifischer
Mutagenese oder Alanin-Scanningmutagenese
(Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085, 1989), identifiziert
werden. Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen bei jedem
Rest in dem Molekül
eingeführt,
und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische
(d. h. Endoglucanase-) Aktivität
getestet, um Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls
kritisch sind. Orte der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch die Analyse
der Kristallstruktur bestimmt werden, die durch Techniken wie kernmagnetische
Resonanz, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt wurde.
Siehe zum Beispiel de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992;
Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al.,
FEBS Lett. 309: 59–64,
1992.
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Die
von der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts kodierte
Endoglucanase kann eine Zellulose-Bindungsdomäne (CBD) umfassen, die als
ein integraler Teil des kodierten Enzyms vorliegt, oder eine CBD
von einem anderen Ursprung kann in das Endoglucanase-Enzym eingeführt werden,
wobei ein Enzymhybrid erzeugt wird. In diesem Zusammenhang soll
der Ausdruck „Zellulose-Bindungsdomäne" so, wie er von Peter
Tomme et al., „Cellulose-Binding
Domains: Classification and Properties" in „Enzymatic Degradation of
Insoluble Carbohydrates",
John N. Saddler und Michael H. Penner (Hrsg.), ACS-Symposium Series,
Nr. 618, 1996, definiert wurde, verstanden werden. Diese Definition
klassifiziert mehr als 120 Zellulose-Bindungsdomänen (CBDs) in l0 Familien (I-X),
und sie zeigt, dass CBDs in verschiedenen Enzymen, so wie Zelluasen, Xylanasen,
Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen,
gefunden werden. CBDs wurden auch in Algen, z. B. der Rotalge Porphyra
purpurea, als ein nichthydrolytisches Polysaccharid-bindendes Protein
gefunden, als Referenz siehe Peter Tomme et al., supra. Jedoch stammen
die meisten CBDs aus Zellulasen und Xylanasen. CBDs werden an den
N- oder C-Termini von Proteinen gefunden oder befinden sich im Inneren.
Enzymhybride sind in der Technik bekannt, siehe z. B. WO 90/00609
und WO 95/16782, und können
hergestellt werden, indem ein DNA-Konstrukt, das wenigstens ein
DNA-Fragment, das die Zellulose-Bindungsdomäne kodiert, die mit oder ohne
einen Linker an eine DNA-Sequenz ligiert ist, die das Enzym von
Interesse kodiert, umfasst, in eine Wirtszelle transformiert wird
und die Wirtszelle zum Wachstum gebracht wird, um das fusionierte
Gen zu exprimieren. Enzymhybride können durch die folgende Formel
beschrieben werden:
CBD-MR-X,
worin CBD die N-terminale
oder die C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die wenigstens
der Zellulose-Bindungsdomäne
entspricht; MR ist die mittlere Region (der Linker) und kann eine
Bindung oder eine kurze Kopplungsgruppe, vorzugsweise von in etwa
2 bis in etwa 100 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt von 2 bis 40
Kohlenstoffatomen, sein, oder besteht vorzugsweise aus in etwa 2
bis in etwa 100 Aminosäuren,
mehr bevorzugt aus von 2 bis 40 Aminosäuren; und X ist eine N-terminale
oder C-terminale Region eines Polypeptids, das von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
kodiert ist.
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Die
in i), oben, genannte Homologie wird als der Grad der Identität zwischen
den beiden Sequenzen bestimmt, der eine Ableitung der ersten Sequenz
von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann zweckmäßigerweise
mittels in der Technik bekannter Computerprogramme, so wie GAP,
das in dem GCG-Programmpaket (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D.,
Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970) bereitgestellt
wird, bestimmt werden. Bei der Verwendung von GAP mit den folgenden
Einstellungen für
den DNA-Sequenzvergleich: GAP-Creation-Penalty von 5,0 und GAP-Extension-Penalty
von 0,3 zeigt die kodierende Region der DNA-Sequenz einen Grad an
Identität
von vorzugsweise wenigstens 60 %, mehr bevorzugt wenigstens 65 %, mehr
bevorzugt wenigstens 70 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 80 %,
besonders wenigstens 90 %, wobei die kodierende Region der DNA-Sequenz
in SEQ ID Nr. 8 gezeigt ist oder die DNA-Sequenz aus dem Plasmid in
Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlich ist.
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Die
in ii), oben, erwähnte
Hybridisierung soll zeigen, dass die analoge DNA-Sequenz unter bestimmten
spezifizierten Bedingungen, die hierin im Einzelnen in dem Abschnitt
Material und Methoden, unten, beschrieben sind, an die gleiche Sonde
bindet wie die DNA-Sequenz,
die das Endoglucanaseenzym kodiert. Die zu verwendende Oligonukleotidsonde
ist die DNA-Sequenz, die dem die Endoglucanase kodierenden Teil
der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz,
die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlich ist,
entspricht.
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Die
in iii), oben, erwähnte
Homologie wird als der Grad der Identität zwischen den beiden Sequenzen bestimmt,
der eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten Sequenz anzeigt.
Die Homologie kann zweckmäßigerweise
mittels in der Technik bekannter Computerprogramme, so wie GAP,
das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt wird (Needleman, S.B.
und Wunsch, C.D., Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970),
bestimmt werden. Bei der Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen
für den Polypeptid-Sequenzvergleich:
GAP-Creation-Penalty von 3,0 und GAP-Extension-Penalty von 0,1,
zeigt das von einer analogen DNA-Sequenz kodierte Polypeptid einen
Grad an Identität
von vorzugsweise wenigstens 55 %, mehr bevorzugt wenigstens 60 %,
mehr bevorzugt wenigstens 65 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 70
%, mehr bevorzugt wenigstens 80 %, besonders wenigstens 90 %, wobei
das Enzym von einem DNA-Konstrukt kodiert
ist, das die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die DNA-Sequenz, die aus
dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlich ist,
umfasst.
-
In
Verbindung mit der Eigenschaft iv), oben, soll eine Endoglucanase,
die von einer DNA-Sequenz
kodiert ist, die aus dem Stamm Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081,
isoliert ist, und in einem Wirtsorganismus produziert wird, der
mit dieser DNA-Sequenz transformiert ist, oder die korrespondierende
Endoglucanase, die natürlicherweise
von Thielavia terrestris produziert wird, angegeben werden. Die
immunologische Reaktivität
kann mittels des in dem Abschnitt Material und Methoden, unten,
beschriebenen Verfahrens bestimmt werden.
-
In
weiteren Aspekten bezieht sich die Erfindung auf einen Expressionsvektor,
der ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt
enthält,
eine Zelle, die das DNA-Konstrukt oder den Expressionsvektor umfasst,
und ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Endoglucanase-Aktivität zeigt,
wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen,
die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus
der Kultur umfasst.
-
In
einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Enzym,
das Endoglucanase-Aktivität zeigt,
wobei das Enzym
- a) von einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt
kodiert ist,
- b) zu wenigstens 70 % homolog zu der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten
Aminosäuresequenz
ist,
- c) durch das erfindungsgemäße Verfahren
hergestellt ist, und/oder
- d) immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen eine gereinigte
Endoglucanase erzeugt wurde, die von der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten
DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae,
DSM 10081, erhältlichen
DNA-Sequenz kodiert ist.
-
Die
in d), oben, erwähnte
Endoglucanase kann von der aus dem Stamm Saccharomyces cerevisiae, DSM
10081, isolierten DNA-Sequenz kodiert und in einem Wirtsorganismus,
der mit der besagten DNA-Sequenz transformiert ist, hergestellt
sein oder kann die natürlicherweise
von Thielavia terrestris hergestellte, korrespondierende Endoglucanase
sein.
-
Im
Allgemeinen wird in dem vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „Enzym" so verstanden, dass er
ein reifes Protein oder eine Vorläuferform davon, sowie ein funktionelles
Fragment davon, dass im Wesentlichen die Aktivität des Enzyms mit der vollen
Länge aufweist,
umfasst. Außerdem
soll der Ausdruck „Enzym" Homologe dieses
Enzyms einschließen.
-
Homologe
des vorliegenden Enzyms können
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen,
-deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Änderungen sind vorzugsweise
von untergeordneter Natur, das heißt konservative Aminosäuresubstitutionen,
die die Faltung oder Aktivität
des Proteins nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen,
typischerweise von einer bis in etwa 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale
Verlängerungen,
so wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid
von bis zu in etwa 20–25
Resten oder eine kleine Verlängerung,
die die Reinigung erleichtert, so wie ein Polyhistidin-Abschnitt, ein
antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford
et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991.
Beispiele von konservativen Substitutionen finden sich innerhalb
der Gruppe von basischen Aminosäuren
(so wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (so wie Glutaminsäure und
Asparaginsäure),
polaren Aminosäuren
(so wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (so
wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (so
wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (so
wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
-
Es
wird für
Fachleute offensichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb
der Regionen, die kritisch für
die Funktion des Moleküls
sind, durchgeführt
werden können
und immernoch zu einem aktiven Enzym führen. Aminosäuren, die
essentiell für
die Aktivität
des erfindungsgemäßen Enzyms
sind, und deshalb vorzugsweise keiner Substitution unterliegen,
können
gemäß Verfahren,
die in der Technik bekannt sind, so wie ortsspezifische Mutagenese
oder Alanin-Scanningmutagenese (Cunningham, 1989), identifiziert
werden. Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen bei jedem
Rest in dem Molekül
eingeführt,
und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf zellulytische
Aktivität
getestet, um die Aminosäurereste
zu identifizieren, die kritisch für die Aktivität des Moleküls sind.
Orte der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen können auch durch Analyse der
Kristallstruktur bestimmt werden, die durch Techniken wie kernmagnetische
Resonanz, Kristallographie oder das Photoaffinitätslabelling bestimmt wurde.
Siehe zum Beispiel de Vos et a., 1992; Smith et al., 1992, Wlodaver
et al., 1992.
-
Das
Homolog kann eine allelische Variante, d. h. eine alternative Form
eines Gens, die durch eine Mutation entsteht, oder ein verändertes
Enzym, das von einem mutierten Gen kodiert ist, aber im Wesentlichen die
gleiche Aktivität
wie das erfindungsgemäße Enzym
aufweist, sein. Somit können
Mutationen still sein (keine Veränderung
in dem kodierten Enzym), oder sie können Enzyme kodieren, die veränderte Aminosäuresequenzen
aufweisen.
-
Das
Homolog des vorliegenden Enzyms kann auch ein Gattungs- oder Spezieshomolog
sein, d. h. ein Enzym mit einer ähnlichen
Aktivität,
das von einer anderen Spezies abgeleitet ist.
-
Ein
Homolog des Enzyms kann unter Verwendung der hierin beschriebenen
Verfahren isoliert werden.
-
Molekulares Screening
und Klonierung mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR)
-
Das
molekulare Screening auf erfindungsgemäße DNA-Sequenzen kann mittels
der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von genomischer
DNA oder von doppelsträngiger
cDNA, die aus einer geeigneten Quelle, so wie jedem beliebigen der
hierin erwähnten
Organismen, isoliert wurde, und von synthetischen Oligonukleotidprimern,
die auf der Basis der hierin offenbarten DNA-Sequenzen oder Aminosäuresequenzen
hergestellt wurden, durchgeführt
werden. Zum Beispiel können
geeignete Oligonukleotidprimer die in dem Abschnitt Material und
Methoden beschriebenen Primer sein.
-
Das
bei dem molekularen Screening erzeugte PCR-Fragment kann in Übereinstimmung
mit wohlbekannten Verfahren isoliert und in einen geeigneten Vektor
subkloniert werden. Das PCR-Fragment kann für das Screenen von DNA-Bibliotheken,
z. B. durch Kolonie- oder
Plaquehybridisierung, verwendet werden.
-
Expressionsklonierung
in Hefe
-
Die
erfindungsgemäße DNA-Sequenz,
die ein Enzym kodiert, das Endoglucanase-Aktivität aufweist, kann durch ein
allgemeines Verfahren isoliert werden, das
- – Klonieren
einer DNA-Bibliothek aus einer geeigneten Quelle, so wie jedem beliebigen
der hierin erwähnten
Organismen, in geeignete Vektoren,
- – Transformieren
geeigneter Hefe-Wirtszellen mit den Vektoren,
- – Kultivieren
der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um jedes beliebige
Enzym von Interesse, das von einem Klon in der DNA-Bibliothek kodiert
ist, zu exprimieren,
- – Screenen
auf positive Klone durch Bestimmen einer möglichen Endoglucanase-Aktivität des von
solchen Klonen produzierten Enzyms, und
- – Isolieren
der das Enzym kodierenden DNA aus solchen Klonen einschließt, isoliert
worden.
-
Das
allgemeine Verfahren ist weiter in WO 94114953 offenbart. Eine detailliertere
Beschreibung des Screeningverfahrens ist in dem Beispiel 1, unten,
angegeben.
-
Die
DNA-Sequenz, die für
das Enzym kodiert, kann zum Beispiel durch Screenen einer cDNA-Bibliothek
von Macrophomina phaseolina, Crinipellis scabella, Sordaria fimicola
oder Volutella colletotrichoides und Selektieren auf Klone, die
die passende Enzymaktivität
(d. h. Endoglucanase-Aktivität)
exprimieren, oder aus Escherichia coli DSM 10512, das nach dem Budapester
Vertrag am 2. Februar 1996 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland)
hinterlegt wurde, oder aus Escherichia coli DSM 10511, das nach
dem Budapester Vertrag am 2. Februar 1996 bei der DSM hinterlegt
wurde, oder aus Escherichia coli DSM 10576, das nach dem Budapester
Vertrag am 12. März
1996 bei der DSM hinterlegt wurde, oder aus Escherichia coli DSM
10571, das nach dem Budapester Vertrag am 6. März 1996 bei der DSM hinterlegt
wurde, oder durch Screenen einer cDNA-Bibliothek von Myceliophthora
thermophila, CBS 117.65, Acremonium sp., CBS 478.94 oder Thielavia
terrestris, NRRL 8126, und Selektieren auf Klone, die die passende
Enzymaktivität
(d. h. Endoglucanase-Aktivität)
exprimieren, oder aus Saccharomyces cerevisiae DSM 9770, das nach
dem Budapester Vertrag am 24. Februar 1995 bei der DSM (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder
Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt wurde, oder
aus Saccharomyces cerevisiae DSM 10082, das nach dem Budapester
Vertrag am 30. Juni 1995 bei der DSM hinterlegt wurde, aus Saccharomyces
cerevisiae DSM 10080, das nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni
1995 hinterlegt wurde, oder aus Saccharomyces cerevisiae DSM 10081,
das nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni 1995 bei der DSM hinterlegt
wurde, isoliert werden. Die passende DNA-Sequenz kann dann aus dem
Klon mittels Standardverfahren, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben,
isoliert werden.
-
Nukleinsäurekonstrukt
-
Wie
hierin verwendet, soll der Ausdruck „Nukleinsäurekonstrukt" jedes beliebige
Nukleinsäuremolekül von cDNA-,
genomische DNA-, synthetische DNA- oder von RNA- Ursprung bezeichnen. Der Ausdruck „Konstrukt" soll ein Nukleinsäuresegment
bezeichnen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann, und das auf
einer vollständigen
oder teilweisen, natürlicherweise
vorkommenden Nukleotidsequenz basiert, die ein Enzym von Interesse
kodiert. Das Konstrukt kann wahlweise andere Nukleinsäuresegmente
enthalten.
-
Das
Nukleinsäurekonstrukt,
das das Enzym von Interesse kodiert, kann zweckmäßigerweise von genomischem
oder cDNA-Ursprung sein, zum Beispiel kann es durch Herstellen einer
genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenen auf DNA-Sequenzen, die für das gesamte
oder einen Teil des Enzyms kodieren, mittels Hybridisierung unter
Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden in Übereinstimmung
mit Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., 1989) gewonnen werden.
-
Das
Nukleinsäurekonstrukt,
das das Enzym kodiert, kann auch auf synthetische Weise mittels
etablierter Standardverfahren, z. B. des von Beaucage und Caruthers
(1981) beschriebenen Phosphoamidit-Verfahrens oder des von Matthes
et al. (1984) beschriebenen Verfahrens hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren
werden Oligonukleotide z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer
synthetisiert, gereinigt, annealiert („annealed"), ligiert und in geeignete Vektoren
kloniert.
-
Außerdem kann
das Nukleinsäurekonstrukt
von gemischt synthetischem und genomischem, gemischt synthetischem
und cDNA- oder gemischt genomischem und cDNA-Ursprung und durch
Ligieren von Fragmenten von synthetischem, genomischem oder cDNA-Ursprung
(wie zutreffend) in Übereinstimmung
mit Standardtechniken hergestellt werden, wobei die Fragmente verschiedenen
Teilen des gesamten Nukleinsäurefragments
entsprechen.
-
Das
Nukleinsäurekonstrukt
kann auch durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer
Primer, zum Beispiel wie in
US
4,683,202 oder Saiki et al. (1988) beschrieben, hergestellt
werden.
-
Das
Nukleinsäurekonstrukt
ist vorzugsweise ein DNA-Konstrukt, wobei dieser Ausdruck in dieser
Beschreibung und den Ansprüchen
ausschließlich
verwendet werden wird.
-
Rekombinanter
Vektor
-
Ein
rekombinanter Vektor, der ein DNA-Konstrukt umfasst, das das erfindungsgemäße Enzym
kodiert, kann jeder beliebige Vektor sein, der zweckmäßigerweise
rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Auswahl
des Vektors wird häufig
von der Wirtszelle abhängen,
in die er eingeführt
werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor,
d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert,
deren Replikation unabhängig
von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid, sein. Alternativ
kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird,
in das Wirtszellgenom integriert wird und gemeinsam mit dem (den)
Chromosom(en), in das (die) er integriert wurde, repliziert wird.
-
Der
Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz,
die das erfindungsgemäße Enzym
kodiert, mit zusätzlichen
Segmenten funktionell verbunden ist, die für die Transkription der DNA erforderlich
sind. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von Plasmid- oder
viraler DNA abgeleitet oder kann Elemente von beiden enthalten.
Der Ausdruck „funktionell
verbunden" zeigt
an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie gemeinsam für ihre beabsichtigten
Zwecke funktionieren, z. B. beginnt die Transkription in einem Promotor
und setzt sich durch die DNA-Sequenz fort, die für das Enzym kodiert.
-
Der
Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die eine transkriptionelle
Aktivität
in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen abgeleitet
sein, die Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog
zu der Wirtszelle sind.
-
Beispiele
geeigneter Promotoren für
die Verwendung in Hefe-Wirtszellen schließen Promotoren der glycolytischen
Gene der Hefe (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073–12080;
Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419–434) oder
der Alkoholdehydrogenasegene der Hefe (Young et al., in Genetic Engineering
of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum
Press, New York, 1982) oder die TPI1- (
US 4,599,311 ) oder ADH2-4c-Promotoren
(Russell et al., Nature 304 (1983), 652–654) ein.
-
Beispiele
geeigneter Promotoren für
die Verwendung in filamentösen
Pilz-Wirtszellen sind zum Beispiel der ADH3-Promotor (McKnight et
al., The EMBO J. 4 (1985), 2093–2099)
oder der tpiA-Promotor. Beispiele anderer nützlicher Promotoren sind diejenigen,
die von dem Gen, das die TAKA-Amylase von A. oryzae, die Aspartatproteinase
von Rhizomucor miehei, die neutrale α-Amylase von A. niger, die säurestabile α-Amylase
von A. niger, die Glucoamylase (gluA) von A. niger oder A. awamori,
die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von A.
oryzae, die Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder die Acetamidase
von A. nidulans kodiert, abgeleitet sind. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase- und gluA-Promotoren.
-
Beispiele
geeigneter Promotoren für
die Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen den
Promotor des Gens der maltogenen Amylase von Bacillus stearothermophilus,
das alpha-Amylase-Gens von Bacillus licheniformis, des Gens der
BAN-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens, des Gens der alkalischen
Protease von Bacillus subtilis oder des Xylosidase-Gens von Bacillus
pumilus, oder die pR- oder pL-Promotoren
des Phagen Lambda oder die lac-, trp- oder tac-Promotoren von E.
coli, ein.
-
Die
DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann auch
nötigenfalls
mit einem geeigneten Terminator funktionell verbunden sein.
-
Der
erfindungsgemäße rekombinante
Vektor kann außerdem
eine DNA-Sequenz umfassen, die den Vektor in die Lage versetzt,
in der betreffenden Wirtszelle zu replizieren.
-
Der
Vektor kann auch einen selektierbaren Marker, z. B. ein Gen, dessen
Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, so wie das
Gen, das für
die Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert, oder das TPI-Gen von Schizosaccharomyces
pombe (beschrieben von P.R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125–130), umfassen.
Für filamentöse Pilze
schließen
selektierbare Macker amdS, pyrG, argB, niaD, sC ein.
-
Um
ein erfindungsgemäßes Enzym
in den sekretorischen Stoffwechselweg der Wirtszelle zu lenken, kann
eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leadersequenz, Präprosequenz
oder Präsequenz
bekannt) in dem rekombinanten Vektor bereitgestellt sein. Die sekretorische
Signalsequenz ist mit der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, in
dem korrekten Leserahmen verbunden. Sekretorische Signalsequenzen
sind häufig 5' zu der DNA-Sequenz,
die das Enzym kodiert, angeordnet. Die sekretorische Signalsequenz
kam diejenige sein, die normalerweise mit dem Enzym verbunden ist,
oder kann von einem Gen stammen, das ein anderes sekretiertes Protein
kodiert.
-
Für die Sekretion
aus Hefezellen kann die sekretorische Signalsequenz jedes beliebige
Signalpeptid kodieren, das ein wirksames Dirigieren des exprimierten
Enzyms in den sekretorischen Stoffwechselweg der Zelle sicherstellt.
Das Signalpeptid kann ein natürlicherweise
vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil davon sein,
oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Es wurde gefunden, dass
geeignete Signalpeptide das α-Faktor-Signalpeptid
(vgl.
US 4,870,008 ),
das Signalpeptid der Speichelamylase aus Maus (vgl. O. Hagenbuchle
et al., Nature 289, 1981, S. 643–646), ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid
(vgl. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, S. 887–897), das Hefe-BAR1-Signalpeptid
(vgl. WO 87/02670) oder das Signalpeptid der Aspartatprotease 3
(YAP3) aus Hefe (vgl. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, S. 127–137) sind.
-
Für die wirksame
Sekretion in Hefe kann eine Sequenz, die ein Leaderpeptid kodiert,
auch stromabwärts
der Signalsequenz und stromaufwärts
der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, insertiert sein. Die Funktion
des Leaderpeptids besteht darin, es dem exprimierten Enzym zu ermöglichen,
aus dem endoplasmatischen Retikulum in den Golgi-Apparat und weiter
in ein sekretorisches Vesikel für
die Sekretion in das Kulturmedium (d. h. den Export des Enzyms über die
Zellwand oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmatischen
Raum der Hefezelle) gelenkt zu werden. Das Leaderpeptid kann der
Hefe-α-Faktor-Leader
sein (dessen Verwendung in z. B.
US
4,546,082 ,
EP 16 201 ,
EP 123 294 ,
EP 123 544 und
EP 163 529 beschrieben ist). Alternativ
kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, das heißt ein Leaderpeptid,
das in der Natur nicht vorkommt. Synthetische Leaderpeptide können, zum
Beispiel wie in WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschrieben, konstruiert
werden.
-
Für die Verwendung
in filamentösen
Pilzen kann das Signalpeptid zweckmäßigerweise von einem Gen, das
eine Amylase oder Glucoamylase von Aspergillus sp. kodiert, einem
Gen, das eine Lipase oder Protease von Rhizomucor miehei, eine Lipase
von Humicola lanuginosa kodiert, abgeleitet sein. Das Signalpeptid ist
vorzugsweise von einem Gen, das die TAKA-Amylase von A. oryzae,
die neutrale α-Amylase
von A. niger, die säurestabile
Amylase von A. niger oder die Glucoamylase von A. niger kodiert,
abgeleitet.
-
Die
Verfahren, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die für das vorliegende
Enzym kodieren, den Promotor und wahlweise den Terminator und/oder
beziehungsweise die sekretorische Signalsequenz zu ligieren, und
sie in geeignete Vektoren zu insertieren, die die notwendige Information
für die
Replikation enthalten, sind Fachleuten wohlbekannt (vgl. zum Beispiel
Sambrook et al., zitiertes Werk).
-
Wirtszellen
-
Die
in die Wirtszelle eingeführte
DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym kodiert, kann entweder homolog
oder heterolog zu dem betreffenden Wirt sein. Falls sie homolog
zu der Wirtszelle, d. h. von der Wirtszelle in der Natur produziert,
ist, wird sie typischerweise mit einer anderen Promotorsequenz,
oder, falls zutreffend, einer anderen sekretorischen Signalsequenz
und/oder Terminatorsequenz funktionell verbunden sein, als sie es
in ihrer natürlichen
Umgebung ist. Der Ausdruck „homolog" soll eine cDNA-Sequenz
einschließen, die
ein Enzym kodiert, das in dem betreffenden Wirtsorganismus beheimatet ist.
Der Ausdruck „heterolog" soll eine DNA-Sequenz
einschließen,
die von der Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Somit
kann die DNA-Sequenz aus einem anderen Organismus stammen, oder
sie kann eine synthetische Sequenz sein.
-
Die
Wirtszellen, in die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder der erfindungsgemäße rekombinante
Vektor eingeführt
wird, kann jede beliebige Zelle sein, die fähig ist, das vorliegende Enzym
zu produzieren, und schließt
Bakterien, Hefe, Pilze und höhere
eukaryontische Zellen ein.
-
Beispiele
von bakteriellen Wirtszellen, die bei der Kultivierung fähig sind,
das erfindungsgemäße Enzym
zu produzieren, sind Gram-positive Bakterien, so wie Stämme von
Bacillus, so wie Stämme
von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus,
B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans,
B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von
Streptomyces, so wie S. lividans oder S. murinus, oder Gram-negative
Bakterien, so wie Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien
kann durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung kompetenter
Zellen in einer an sich bekannten Weise durchgeführt werden (vgl. Sambrook et
al., supra).
-
Bei
der Expression des Enzyms in Bakterien, so wie E. coli, kann das
Enzym im Cytoplasma festgehalten werden, typischerweise als unlösliche Granula
(als Einschlusskörper „inclusion
bodies" bekannt),
oder kann durch eine bakterielle Sekretionssequenz in den periplasmatischen
Raum gelenkt werden. In dem ersten Fall werden die Zellen lysiert,
und die Granula werden gewonnen und denaturiert, wonach das Enzym
durch Verdünnen
des Denaturierungsmittels zurückgefaltet
wird. In letzterem Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen
Raum gewonnen werden, indem die Zellen, z. B. durch Ultraschallbehandlung
oder osmotischen Schock, aufgebrochen werden, um den Inhalt des
periplasmatischen Raums freizusetzen, und das Enzym gewonnen wird.
-
Beispiele
von geeigneten Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces
spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämme von
Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri, ein. Verfahren
zur Transformation von Hefezellen mit heterologer DNA und zur Herstellung
von heterologen Enzymen davon sind z. B. in
US 4,599,311 ,
US 4,931,373 ,
US 4,870,008 , 5,037,743 und
US 4,845,075 beschrieben. Transformierte
Zellen werden mittels eines Phänotyps
selektiert, der durch einen selektierbaren Marker, häufig eine
Arzneimittelresistenz oder die Fähigkeit,
in der Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs, z. B. Leucin, zu
wachsen, bestimmt ist. Ein bevorzugter Vektor für die Verwendung in Hefe ist
der POT1-Vektor, der in
US 4,931,373 offenbart
ist. Der DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann eine
Signalsequenz und wahlweise eine Leadersequenz, z. B. wie oben beschrieben,
vorangehen. Weitere Beispiele von geeigneten Hefezellen sind Stämme von
Kluyveromyces, so wie K. lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha, oder
Pichia, z. B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol.
132, 1986, S. 3459–3465;
US 4,882,279 ).
-
Beispiele
von anderen Pilzzellen sind Zellen von filamentösen Pilzen, z. B. Aspergillus
spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., insbesondere
Stämme
von A. oryzae, A. nidulans, A. niger oder Fusarium graminearum.
Die Verwendung von Aspergillus spp. für die Expression von Proteinen
ist z. B. in
EP 272 277 ,
EP 230 023 beschrieben. Die
Transformation von F. oxysporum kann zum Beispiel wie von Malardier
et al., 1989, Gene 78: 147–156,
beschrieben, durchgeführt
werden.
-
Wenn
ein filamentöser
Pilz als die Wirtszelle verwendet wird, kann er mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt
transformiert werden, zweckmäßiger Weise,
indem das DNA-Konstrukt in das Wirtschromosom integriert wird, um
eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten. Diese Integration wird
im Allgemeinen als ein Vorteil angesehen, da es wahrscheinlicher
ist, dass die DNA-Sequenz stabil in der Zelle bewahrt wird. Die
Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlicher
Verfahren, z. B. mittels homologer oder heterologer Rekombination,
durchgeführt
werden.
-
Die
oben beschriebene, transformierte oder transfizierte Wirtszelle
wird dann in einem geeigneten Nährmedium
unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des vorliegenden
Enzyms erlauben, wonach das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen
wird. Das Medium, das verwendet wird, um die Zellen zu kultivieren,
kann jedes beliebige herkömmliche
Medium sein, das geeignet ist, um die Wirtszellen wachsen zu lassen,
so wie ein Minimal- oder Komplexmedium, das geeignete Supplemente
enthält.
Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern verfügbar oder
können
gemäß veröffentlichter
Rezepte (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection)
hergestellt werden. Das von den Zellen produzierte Enzym kann dann
mittels herkömmlicher
Verfahren aus dem Kulturmedium gewonnen werden, die das Abtrennen
der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration,
das Ausfällen
der Proteinbestandteile aus dem Überstand
oder Filtrat mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, die Reinigung
durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie,
Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen,
abhängig
von dem Typ des betreffenden Enzyms, einschließen.
-
In
einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms,
wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert
ist, die das Enzym kodiert, unter Bedingungen kultiviert wird, die
die Herstellung des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym
aus der Kultur gewonnen wird.
-
Durch die Taxonomie sowie
die Ökologie
angetriebenes Enzymscreening:
-
Ein
wirkungsvolles Werkzeug wie das hierin offenbarte molekulare Screening,
das darauf ausgerichtet ist, den besagten Typ des Enzyms von Interesse
nachzuweisen und zu selektieren, reicht dennoch nicht alleine aus.
Um die Chancen, interessante Entdeckungen zu machen, zu maximieren,
wurde die Herangehensweise des molekularen Screenings in der vorliegenden
Untersuchung mit der sorgfältigen
Auswahl der zu screenenden Pilze kombiniert. Die Auswahl beruhte
auf einem profunden Wissen über
die Identifizierung von Pilzen, die taxonomische Klassifizierung
und die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse.
-
Ein
taxonomischer Hotspot für
die Produktion von zellulytischen Enzymen kann außerdem nur
vollständig
erforscht werden, wenn auch die ökologische
Herangehensweise eingeschlossen wird. Profunde Kenntnisse über die
Anpassung an verschiedene Substrate (speziell der saprotrophe, nekrotrophe
oder biotrophe Abbau von Pflanzenmaterialien) sind Voraussetzungen
für den
Entwurf eines intelligenten Screenings und für die Steuerung einer erfolgreichen
Auswahl von Stämmen
und ökologischen
Nischen, die untersucht werden sollen.
-
Sowohl
die Taxonomie als auch der ökologische
Herangehensweise, die hierin offenbart sind, zielen darauf ab, die
Entdeckung der besagten Enzyme in dem molekularen Screeningprogramm
zu maximieren. Jedoch wurden immer noch mehrere hundert (oder, falls
alle Vorarbeiten einbezogen werden) mehrere tausend Pilze in Kultur
gebracht, um die 53 Treffer des besagten Typs von zellulytischem
Enzym, über
den hier berichtet wird, aufzufinden.
-
Das
Screening und das Klonieren können
unter Verwendung des Folgenden durchgeführt werden:
-
MATERIAL UND
METHODEN
-
Liste der Organismen:
-
- Saccharomyces cerevisiae, DSM 9770, DSM 10082, DSM 10081,
bzw. Escherichia coli, DSM 10571, die das Plasmid, das die DNA-Sequenz
mit der vollen Länge,
die für
die erfindungsgemäße Endoglucanase
kodiert, in dem Shuttlevektor pYES 2.0 enthalten.
-
Acremonium sp
-
- Hinterlegung des Stammes, Zugangs-Nr.: CBS 478.94
- Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.
-
Volutella colletotrichoides
-
- Zugangs-Nr. des Stammes: CBS 400.58
- Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales (unklassifiziert).
-
Thielavia terrestris (Appinis)
Malloch et Cain
-
- Zugangs-Nr. des Stammes: NRRL8126
- Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Sordariales, Chaetomiaceae.
-
Myceliophthora thermophila
(Apinis) Oorschot
-
- Hinterlegung des Stammes, Zugangs-Nr.: CBS 117.65
- Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Sordariales, Chaetomiaceae.
-
Andere Stämme:
-
Escherichia coli MC1061
und DH10B.
-
- Hefestamm: Der verwendete Stamm von Saccharomyces cerevisiae
war W3124 (MATα;
ura 3–52;
leu 2–3, 112;
his 3-D200; pep 4–1137;
prc1::HIS3; prb1::LEU2; cir+).
-
Plasmide:
-
- Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat
des Plasmids p775 (beschrieben in EP
238 023 ). Die Konstruktion von pHD414 ist weiter in WO
93/11249 beschrieben.
-
pYES 2.0 (Invitrogen)
-
- pA2C477, pA2C193, pA2C357, pA2C371, pA2C385, pA2C475, pA2C488,
pA2C502 (siehe Beispiel 1).
-
Isolierung der in SEQ
ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz:
-
Die
DNA-Sequenz mit der vollen Länge,
die die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte cDNA-Sequenz, die für die erfindungsgemäße Endoglucanase
kodiert, umfasst, kann aus dem hinterlegten Organismus S. cerevisiae, DSM
10081, mittels Extraktion von Plasmid-DNA durch in der Technik bekannte
Verfahren (Sambrook et al. (1981) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) gewonnen werden.
-
PCR-Primer für das molekulare
Screening der erfindungsgemäßen Zellulasen:
-
Die
vier degenerierten, Desoxyinosin-enthaltenden Oligonukleotidprimer
(Sinn, s, und Antisense, as1, as2 und as3), die den vier hochkonservierten
Aminosäureregionen
entsprechen, die in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Zellulase
von Thielavia terrestris, der Zellulase von Myceliophthora thermophilum
und zwei Zellulasen von Acremonium sp. gefunden werden. Die Reste
sind gemäß der Sequenz
von Myceliophthora thermophilum nummeriert. Die Desoxyinosine sind
durch ein I in den Primersequenzen dargestellt, und die Restriktionsstellen
sind unterstrichen.
-
-
Molekulares Screening
mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR):
-
In-vitro-Amplifizierung
von genomischer DNA und doppelsträngiger cDNA:
-
Direktionale,
doppelsträngige
cDNA wurde ausgehend von 5 μg
poly(A)+-RNA, wie unten beschrieben, synthetisiert.
Genomische DNA wurde nach Yelton et al. isoliert.
-
Etwa
10 bis 20 ng doppelsträngige,
Zellulase-induzierte cDNA oder 100 bis 200 ng genomische DNA aus
einer Auswahl von Pilzzellen wurde in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM
KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % (gew/vol) Gelatine),
der 200 μM
jedes dNTPs und 100 pmol jedes degenerierten Primers in drei Kombinationen
enthielt, PCR-amplifiziert:
- 1)
Sinn,
5'-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/G A/CC-3'
Antisense
1,
5'-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3'; oder
- 2)
Sinn,
5'-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/G A/CC-3'
Antisense 2,
CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/GICCICCICCIGG-3'; oder
- 3)
Sinn,
5'-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/G A/CC-3'
Antisense 3,
5'-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/G A/TAICG/TCC-3;
ein
DNA-Thermocycler (Landgraf, Deutschland) und 2,5 Units Taq-Polymerase
(Perkin-Elmer, Cetus, USA).
Dreißig
PCR-Zyklen wurden unter Verwendung eines Zyklusprofils von Denaturierung
bei 94 °C
für 1 min,
Annealing bei 64 °C
für 2 min
und Verlängerung
bei 72 °C
für 3 min
durchgefüht.
Zehn-μl-Aliquots des
Amplifikationsprodukts wurden mittels Elektrophorese in 3-%-Agarosegelen
(NuSieve, FMC) mit HaeIII-gespaltener φX174-RF-DNA als Größenmarker
analysiert.
-
Direkte Sequenzierung
der PCR-Produkte.
-
Achtzig-μl-Aliquots
der PCR-Produkte wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Purification
Kits (Qiagen, USA) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Die Nukleotidsequenzen der amplifizierten PCR-Fragmente wurden direkt
an den gereinigten PCR-Produkten mittels des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens
bestimmt, wobei 50-150 ng Vorlage („template"), der Taq-Deoxy-Terminal-Cycle-Sequencing-Kit
(Perkin Elmer, USA), fluoreszierend markierte Terminatoren und 5
pmol des Sinnprimers: 5'-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TT-GC/TTGC/TAAA/G A/CC-3' verwendet wurden.
Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al. durchgeführt.
-
Klonierung mittels der
Polymerasekettenreaktion (PCR):
-
Subklonierung von PCR-Fragmenten.
-
Fünfundzwanzig-μl-Aliquots
der, wie oben beschrieben, erzeugten PCR-Produkte wurden in Gelen
mit 0,8 % Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur (SeaPlaque
GTG, FMC) elektrophoretisiert, die relevanten Fragmente wurden aus
den Gelen ausgeschnitten und durch eine Agarase-Behandlung gewonnen,
wobei 0,1 vol 10× Agarasepuffer
(New England Biolabs) und 2 Units pro 100 μl geschmolzener Agarose zu der
Probe zugegeben wurden, gefolgt von Inkubation bei 45 °C für 1,5 stdn.
Die Probe wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und durch Zugabe
von 2 vol 96 % EtOH und 0,1 von 3 M NaAc, pH 5,2, präzipitiert.
Die PCR-Fragmente wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70 %
EtOH gewaschen, getrocknet und in 20 μl Restriktionsenzympuffer (10
mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1
mM DTT) resuspendiert. Die Fragmente wurden mit HindIII und XbaI
gespalten, mit Phenol und Chloroform extrahiert, durch Ausfällung mit
2 vol von 96 % EtOH und 0,1 von 3 M NaAc, pH 5,2 gewonnen und in
den HindIII/XbaI-geschnittenen
Vektor pYES 2.0 subkloniert.
-
Screenen von cDNA-Bibliotheken
und Charakterisierung der positiven Klone.
-
cDNA-Bibliotheken
in S. cerevisiae oder E. coli, die wie oben konstruiert waren, wurden
mittels Koloniehybridisierung (Sambrook, 1989) unter Verwendung
der entsprechenden, random-geprimten („random-priming") (Feinberg und Vogelstein), 32P-markierten (>1 × 109 cpm/μg)
PCR-Produkten als Sonden gescreent. Die Hybridisierungen wurden
in 2× SSC
(Sambrook, 1989), 5× Denhardtslösung (Sambrook,
1989), 0,5 % (gew/vol) SDS, 100 μg/ml
denaturierter Lachssperma-DNA für
20 stdn bei 65 °C
durchgeführt,
gefolgt von Waschschritten in 5× SSC
bei 25 °C
(2 × 15
min), 2× SSC,
0,5 % SDS bei 65 °C
(30 min), 0,2× SSC,
0,5 % SDS bei 65 °C
(30 min) und schließlich
in 5× SSC
(2 × 15
min) bei 25 °C.
Die positiven cDNA-Klone wurden durch Sequenzieren der Enden der
cDNA-Inserts mit pYES-2.0-Polylinkerprimern (Invitrogen, USA) und
durch Bestimmen der Nukleotidsequenz der längsten cDNA von beiden Strängen mittels
des Didesoxy- Kettenabbruchverfahrens
(Sanger et al.) unter Verwendung fluoreszierend markierter Terminatoren
charakterisiert. Qiagen-gereinigte Plasmid-DNA (Qiagen, USA) wurde
mit dem Taq-Deoxy-Terminal-Cycle-Sequencing-Kit (Perkin Elmer, USA)
und entweder pYES-2.0-Polylinkerprimern (Invitrogen, USA) oder synthetischen
Oligonukleotidprimern sequenziert, wobei ein automatischer Applied-Biosystems-373A-Sequenzer
nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die Analyse
der Sequenzdaten wurden gemäß Devereux
et al. durchgeführt.
-
Die
Extraktion von Gesamt-RNA wurde mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt
von Ultrazentrifugation durch ein 5,7-M-CsCl-Kissen, durchgeführt, und
die Isolierung von poly(A)+-RNA wurde mitels
Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie
unter Verwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Vorgehensweisen durchgeführt.
-
cDNA-Synthese:
-
Doppelsträngige cDNA
wurde aus 5 μg
poly(A)+-RNA mittels des RNase-H-Verfahrens
(Gubler und Hoffman (1983) Gene 25:263–269; Sambrook et al. (1989)
Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab.,
Cold Spring Harbor, NY) unter Verwendung der von F. S. Hagen entwickelten
Haarnadelmodifikation (pers. Mitt.) synthetisiert. Die poly(A)+-RNA (5 μg
in 5 μl
DEPC-behandeltem Wasser) wurde bei 70 °C für 8 min in einem vorsilikonisierten,
RNase-freien Eppendorph-Röhrchen
erhitzt, auf Eis abgekühlt
und in einem Endvolumen von 50 μl
mit Reverse-Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl,
3 mM MgCl2, 10 mM DTT, Bethesda Research
Laboratories), der 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP
(Pharmacia) enthielt, 40 Units humanem plazentalen Ribonukleaseinhibitor
(RNasin, Promega), 1,45 μg
Oligo(dT)18-Not-I-Primer (Pharmacia) und
1000 Units SuperScript-II-Rnase-H-Reverser-Transkriptase (Bethesda Research Laboratories)
zusammengegeben. Die Erststrang-cDNA wurde durch Inkubieren des
Reaktionsgemisches bei 45 °C
für 1 Stunde
synthetisiert. Nach der Synthese wurde das mRNA:cDNA-Hybrid-Gemisch
durch eine MicroSpin-S-400-HR-Zentrifugationssäule (Pharmacia)
nach den Anweisungen des Herstellers gelfiltriert.
-
Nach
der Gelfiltration wurden die Hybride in 250 μl Zweitstrangpuffer (20 mM Tris-Cl,
pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4,
0,16 mM β NAD+) verdünnt,
der 200 μl
jedes dNTPs, 60 Units E. coli-DNA-Polymerase-I (Pharmacia), 5,25
Units RNase H (Promega) und 15 Units E. coli-DNA-Ligase (Boehringer
Mannheim) enthielt. Die Zweitstrang-cDNA-Synthese wurde durch Inkubieren
des Reaktionsröhrchens
bei 16 °C
für 2 Stunden
und zusätzliche
15 min bei 25 °C
durchgeführt.
Die Reaktion wurde Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration
von 20 mM, gefolgt von Phenol- und Chloroform-Extraktionen, abgestoppt.
-
Behandlung mit Mungbohnen-Nuklease:
-
Die
doppelsträngige
cDNA wurde bei –20 °C für 12 Stunden
durch Zugabe von 2 vol 96 % EtOH, 0,2 vol 10 M NH4Ac
gefällt,
durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen, getrocknet
und in 30 μl Mungbohnen-Nuklease-Puffer
(30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO4,
0,35 mM DTT, 2 % Glycerin), der 25 Units Mungbohnen-Nuklease (Pharmacia)
enthielt, resuspendiert. Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wurde durch
Inkubieren der Reaktion bei 30 °C
für 30
min gespalten, gefolgt von der Zugabe von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM
EDTA, Phenolextraktion und Ausfällung
mit 2 vol 96 % EtOH und 0,1 vol 3 mM NaAc, pH 5,2, auf Eis für 30 min.
-
Erzeugen von stumpfen
Enden mit der T4-DNA-Polymerase:
-
Die
doppelsträngigen
cDNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 30 μl T4-DNA-Polymerasepuffer
(20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), der
0,5 mM jedes dNTPs und 5 Units T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs)
enthielt, mit stumpfen Enden versehen, indem das Reaktionsgemisch
bei 16 °C
für 1 Stunde
inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis zu
einem Endvolumen von 20 mM abgestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen
und Fällen
für 12
Stunden bei –20 °C durch Zugabe
von 2 vol 96 % EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2.
-
Adapterligation, Not-I-Spaltung
und Größenauswahl:
-
Nach
der Auffüllreaktion
wurden die cDNAs durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen und
getrocknet. Das cDNA-Sediment wurde in 25 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl,
pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP)
resuspendiert, der 2,5 μg
nicht-palindromische BstXI-Adapter (Invitrogen) und 30 Units T4-Ligase
(Promega) enthielt, und bei 16 °C
für 12
Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 65 °C für 20 min
und dann Abkühlen
auf Eis für
5 min abgestoppt. Die mit Adaptern versehene cDNA wurde mit dem
Restriktionsenzym Not I durch Zugabe von 20 μl Wasser, 5 μl 10× Not-I-Restriktionsenzympuffer
(New England Biolabs) und 50 Units NotI (New England Biolabs), gefolgt
von einer Inkubation für
2,5 Stunden bei 37 °C
gespalten. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 65 °C für 10 min
abgestoppt. Die cDNAs wurden durch Gelelektrophorese auf einem Gel
mit 0,8 % SeaPlaque-GTG-Agarose mit niedriger Schmelztemperatur
(FMC) in 1× TBE,
um nicht ligierte Adapter und kleine cDNAs abzutrennen, der Größe nach
aufgetrennt. Die cDNA wurde mit einem Ausschluss von 0,7 kb ihrer
Größe nach
ausgewählt
und aus dem Gel unter Verwendung von β-Agarase (New England Biolabs)
nach den Anweisungen des Herstellers isoliert und für 12 Stunden
bei –20 °C durch Zugeben
von 2 vol 96 % EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2 gefällt.
-
Konstruktion von Bibliotheken:
-
Die
direktionale cDNA mit ausgewählter
Größe wurde
durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen, getrocknet
und in 30 μl
10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, resuspendiert. Die cDNAs wurden mittels
Gelfiltration durch eine MicroSpin-S-300-HR-Zentrifugationssäule (Pharmacia) nach den Anweisungen des
Herstellers entsalzt. Drei Testligationen wurden in 10 μl Ligationspuffer
(30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10
mM DTT, 0,5 mM ATP) durchgeführt,
der 5 μl
doppelsträngige
cDNA (Reaktionsröhrchen
#1 und #2), 15 Units T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Röhrchen #1),
40 ng (Röhrchen
#2) und 40 ng (Röhrchen
#3, die Vektor-Hintergrundkontrolle) von BstXI-NotI-gespaltenem
Vektor pYES 2,0 enthielt. Die Ligationsreaktionen wurden durch Inkubation
bei 16 °C
für 12
Stunden, Erhitzen bei 70 °C
für 20
min und Zugabe von 10 μl
Wasser zu jedem Röhrchen
durchgeführt.
1 μl jedes
Ligationsgemisches wurde in 40 μl
elektrokompetente E-coli-DH10B-Zellen (Bethesda Research Laboratories),
wie beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor, NY), elektroporiert. Unter Verwendung
der optimalen Bedingungen wurde eine Bibliothek in E. coli etabliert,
die aus Pools bestand. Jeder Pool wurde erzeugt, indem transformierte
E. coli auf LB+Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen wurden, was
15.000–30.000
Kolonien/Platte nach Inkubation bei 37 °C für 24 Stunden ergab. 20 μl LB+Ampicillin
wurden zu der Platte zugegeben, und die Zellen wurden darin suspendiert.
Die Zellsuspension wurde in einem 50-ml-Röhrchen für 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt. Die
Plasmid-DNA wurde aus den Zellen unter Verwendung des QIAGEN-Plasmid-Kits
nach den Anweisungen des Herstellers isoliert und bei –20 °C gelagert.
-
1-μl-Aliquots
gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl)
aus einzelnen Pools wurde in S. cerevisiae W3124 mittels Elektroporation
(Becker und Guarante (1991) Methods Enzymol. 194:182–187) transformiert,
und die Transformanten wurden auf SC-Agar plattiert, der 2 % Glucose
enthielt, und bei 30 °C
inkubiert.
-
Identifizierung positiver
Kolonien:
-
Nach
3–5 Tagen
Wachstum wurden die Agarplatten auf einen Satz von SC + Galactose-Uracil-Agarplatten
replikaplattiert, die 0,1 % AZCL-HE-Zellulose
enthielten. Diese Platten wurden für 3–7 Tage bei 30 °C inkubiert.
Endoglucanase-positive Kolonien wurden als Kolonien identifiziert,
die von einem blauen Hof umgeben waren.
-
Zellen
von Enzym-positiven Kolonien wurden für die Einzelkolonie-Isolierung
auf Agar ausplattiert, und eine Enzym-produzierende Einzelkolonie
wurde für
jede der identifizierten, Endoglucanase-produzierenden Kolonien
ausgewählt.
-
Charakterisierung von
positiven Klonen:
-
Die
positiven Klone wurden als Einzelkolonien erhalten, die cDNA-Inserts
wurden direkt aus der Hefekolonie unter Verwendung biotinylierter
Polylinker-Primer ampliziert, mittels des magnetischen Kugelsystems (Dynabead
M-280, Dynal) gereinigt und einzeln durch Sequenzieren des 5'-Endes jedes cDNA-Klons,
unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al. (1977)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463–5467) und des Sequenase-Systems
(Unites States Biochemical), charakterisiert.
-
Die
Nukleotidsequenz der längsten
cDNA wurde von beiden Strängen
mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al.) bestimmt,
wobei fluoreszierend markierte Terminatoren verwendet wurden. Die Plasmid-DNA
wurde durch Transformation in E. coli, wie unten beschrieben, gerettet.
Qiagen-gereinigte Plasmid-DNA
(Qiagen, USA) wurde mit dem Taq-Deoxy-Terminal-Cycle-Sequencing-Kit
(Perkin Elmer, USA) und entweder pYES-2.0-Polylinkerprimern (Invitrogen,
USA) oder synthetischen Oligonukleotidprimern unter Verwendung eines
automatisierten Applied-Biosystems-373A-Sequencers
nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Analyse der
Sequenzdaten wurde gemäß Devereux
et al. durchgeführt.
-
Isolierung eines cDNA-Gens
für die
Expression in Aspergillus:
-
Eine
Endoglucanase-produzierende Hefekolonie wurde in 20 ml YPD-Brühe in einem
50-ml-Glasreagensröhrchen inokuliert.
Das Röhrchen
wurde für
2 Tage bei 30 °C
geschüttelt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 3.000 upm geerntet.
-
Die
DNA wurde gemäß WO 94/14953
isoliert und in 50 μl
Wasser gelöst.
Die DNA wurde mittels Standardverfahren in E. coli transformiert.
Die Plasmid-DNA wurde aus E. coli unter Verwendung von Standardverfahren
isoliert und mittels Restriktionsenzym-Analyse analysiert. Das cDNA-Insert
wurde unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten
und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
-
Transformation von Aspergillus
oryzae oder Aspergillus niger
-
Protoplasten
können,
wie in WO 95/02042, S. 16, Zeile 21-Seite 17, Zeile 12 beschrieben,
hergestellt werden.
-
100 μl Protoplastensuspension
wird mit 5–25 μg der entsprechenden
DNA in 10 μl
STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2)
gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (einem Plasmid, das das
A. nidulans-amdS-Gen trägt)
gemischt. Das Gemisch wird für
25 min bei Raumtemperatur belassen. 0,2 ml 60 % PEG 4000 (BDH 29576),
10 mM CaCl2 und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,
werden zugegeben und sorgfältig gemischt
(zweimal), und schließlich
werden 0,85 ml der gleichen Lösung
zugegeben und sorgfältig
gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten belassen, bei
2500 g für
15 Minuten zentrifugiert, und das Sediment wird in 2 ml 1,2 M Sorbit
resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten
auf Minimalplatten ausplattiert (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113
(1966) 51–56),
die 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle
und 20 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu inhibieren, enthalten.
Nach einer Inkubation für
4–7 Tage
bei 37 °C
werden die Sporen gepickt und ausgestrichen, um einzelne Kolonien
zu erhalten. Dieses Verfahren wird wiederholt, und die Sporen einer
Einzelkolonie nach der zweiten Reisolierung werden als eine definierte
Transformante aufbewahrt.
-
Test von Transformanten
von A. oryzae
-
Jede
der Transformanten wurde in 10 ml YPM inokuliert und weitergeführt. Nach
2–5 Tagen
der Inkubation bei 37 °C
wurden 10 ml Überstand
entnommen. Die Endoglucanase-Aktivität wurde,
wie oben beschrieben, mittels AZCL-HE-Zellulose identifiziert.
-
Hybridisierungsbedingungen
(die bei der Bewertung der Eigenschaft ii) des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts
verwendet werden sollen):
-
Geeignete
Bedingungen für
die Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde
und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz schließen das Voreinweichen des Filters,
der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5× SSC (Standard-Salinecitrat)
für 10
min und die Prähybridisierung des
Filters in einer Lösung
von 5× SSC
(Sambrook et al. 1989), 5× Denhardtslösung (Sambrook
et al. 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml
denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA (Sambrook
et al. 1989), gefolgt von einer Hybridisierung in der gleichen Lösung, die
eine random-geprimte (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983)
Anal. Biochem. 132: 6–13),
mit 32P-dCTP markierte Sonde (spezifische
Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) enthält, für 12 Stunden
bei ca. 45 °C
ein. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2× SSC, 0,5 %
SDS, bei vorzugsweise nicht höher
als 50 °C,
mehr bevorzugt nicht höher
als 55 °C,
mehr bevorzugt nicht höher
als 60 °C,
mehr bevorzugt nicht höher
als 65 °C,
noch mehr bevorzugt nicht höher
als 70 °C,
besonders nicht höher
als 75 °C,
gewaschen.
-
Die
bei der Hybridisierung zu verwendende Nukleotidsonde ist die DNA-Sequenz,
die dem die Endoglucanase kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten
DNA-Sequenz und/oder der aus dem Plasmid in S. cerevisiae DSM 10081
erhältlichen
DNA-Sequenz entspricht.
-
Immunologische Kreuzreaktivität:
-
Antikörper, die
bei der Bestimmung der immunologischen Kreuzreaktivität verwendet
werden sollen, können
unter Verwendung einer gereinigten Zellulase hergestellt werden.
Genauer gesagt, kann ein Antiserum gegen die erfindungsgemäße Zellulase
erzeugt werden, indem Kaninchen (oder andere Nagetiere) gemäß dem von
N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone
und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific
Publications, 1982 (genauer S. 27–31) beschriebenen Verfahren
immunisiert werden. Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren z. B.
durch Salzfällung
((NH4)2SO4) gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie,
z. B. auf DEAE-Sephadex,
gewonnen werden. Die immunchemische Charakterisierung von Proteinen
kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony
in Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrsg.), Blackwell
Scientific Publications, 1967, S. 655–706), durch Kreuzimmunelektrophorese
(N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4), oder durch Raketenimmunoelektrophorese
(N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
-
Medien
-
- YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O
ad 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20 % Glucose (sterilfiltriert) zugegeben.
- YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O
ad 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20 % Maltodextrin (sterilfiltriert)
zugegeben.
- 10× Basalsalz:
75 g Hefe-Stickstoff-Base, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H2O
ad 1000 ml, sterifiltriert.
- SC-URA: 100 ml 10× Basalsalz,
28 ml 20 % Casamino-Acids ohne Vitamine, 10 ml 1 % Tryptophan, H2O ad 900 ml, autoklaviert, 3.6 ml 5 % Threonin
und 100 ml 20 % Glucose oder 20 % Galactose zugegeben.
- SC-URA-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar zugegeben.
- PD-Agar: 39 g Kartoffel-Dextrose-Agar, DIFCO 0013; entionisiertes
Wasser bis zu 1000 ml zugeben; autoklavieren (121 °C für 15–20 min).
- PC-Agar: Kartoffeln und Karotten (zerrieben, jeweils 20 g) und
Wasser, zugegeben bis zu 1000 ml, werden für 1 std gekocht; Agar (20 g/l
Merck 1614); autoklaviere (121 °C
für 20
min).
- PC-Flüssigbrühe: wie
PC-Agar, aber ohne Agar.
- PD-Flüssigbrühe: 24 g
Kartoffel-Dextrose-Brühe,
Difco 0549, entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml; autoklaviere (121 °C für 15–20 min).
- PC- und PD-Flüssigbrühe ohne
Zellulose: gebe 30 g Solcafloc (Dicacel, erhältlich von Dicalite-Europe-Nord, 9000
Gent, Belgien) je 1000 ml zu.
- PB-9-Flüssigbrühe: 12 g
Rofec (Roquette 101–0441)
und 24 g Glucose warden zu 1000 ml Wasser zugegeben; der pH wird
auf 5,5 eingestellt; 5 ml Mineralöl und 5 g CaCo3 werden
je 1000 ml zugegeben. Autoklaviere (121 °C für 40 min).
- YPG-Flüssigbrühe: 4 g
Hefeextrakt (Difco 0127), 1 g KH2PO4 (Merck 4873), 0,5 g MgSO4 × 7H2O, Merck 5886, 15 g Dextrose, Roquette 101–0441, 0,1
ml Pluronic (101–3088);
entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml; autoklaviere (20 min bei 121 °C).
- Verdünnte
Salzlösung
(DS): Stelle zwei Stammlösungen
her:
- P-Stammlösung:
13,61 g KH2PO4,
13,21 g (NH4)2PO4, 17,42g KH2PO4, entionisiertes Wasser bis zu 100 ml.
- Ca/Mg-Stammlösung:
7,35 g CaCl2 × 2H2O,
10,17 g MgCl2 × 6H2O,
entionisiertes Wasser bis zu 100 ml; pH eingestellt auf 7,0; Autoklavieren
(121 °C,
20 min).
- Mische 0..5 ml P-Stammlösung
mit 0,1 ml Ca/Mg-Stammlösung,
gebe
entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml zu.
- AZCL-HE-Zellulose (Megazyme, Australia).
-
Verwendungen
-
Während des
Waschens und Tragens wird Farbstoff aus gefärbten Textilerzeugnissen oder
Kleidung normalerweise ausbluten, die dann verblasst und getragen
aussieht. Die Entfernung von Oberflächenfasern aus dem Textilerzeugnis
wird die ursprünglichen
Farben und das ursprüngliche
Aussehen des Textilerzeugnisses zum Teil wiederherstellen. Mit dem
Ausdruck „Farbklärung", wie er hierin verwendet
wird, ist die teilweise Wiederherstellung der anfänglichen
Farben des Textilerzeugnisses oder der Kleidung während mehrerer Waschzyklen
gemeint.
-
Der
Ausdruck „Depilling" bezeichnet das Entfernen
von Knötchen
von der Stoffoberfläche.
-
Der
Ausdruck „Einweichflüssigkeit" bezeichnet eine
wässrige
Flüssigkeit,
in die die Wäsche
eingetaucht werden kann, bevor sie einem herkömmlichen Waschverfahren unterzogen
wird. Die Einweichflüssigkeit
kann einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die üblicherweise
in einem Wasch- oder Wäschereiverfahren
verwendet werden.
-
Der
Ausdruck „Waschflüssigkeit" bezeichnet eine
wässrige
Flüssigkeit,
in der die Wäsche
einem Waschverfahren, d. h. normalerweise einer kombinierten chemischen
und mechanischen Einwirkung, entweder manuell oder in einer Waschmaschine,
unterzogen wird. Üblicherweise
ist die Waschflüssigkeit
eine wässrige
Lösung
einer Pulver- oder Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung.
-
Der
Ausdruck „Spülflüssigkeit" bezeichnet eine
wässrige
Flüssigkeit,
in die die Wäsche
eingetaucht und darin behandelt wird, gewöhnlicherweise unmittelbar nachdem
sie einem Waschverfahren unterzogen wurde, um die Wäsche zu
spülen,
d. h. im Wesentlichen die Waschmittellösung aus der Wäsche zu
entfernen. Die Spülflüssigkeit
kann eine Textilerzeugnis-Ausrüstungs-
oder -Weichmacherzusammensetzung enthalten.
-
Die
Wäsche,
die dem erfindungsgemäßen Verfahren
unterzogen wird, kann eine gewöhnliche
waschbare Wäsche
sein. Vorzugsweise besteht der Hauptteil der Wäsche aus genähten oder
ungenähten
Textilerzeugnissen, einschließlich
Strickerzeugnissen, Webwaren, Denims, Garnen und Handtuchstoffen,
die aus Baumwolle, Baumwollgemischen oder natürlichen oder künstlichen
Zellulosematerialien (d. h. die von Xylan-enthaltenden Zellulosefasern,
so wie von Holzschliff, abstammen) oder Mischungen davon hergestellt
sind. Beispiele von Mischungen sind Mischungen von Baumwolle oder
Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien, so wie
Wolle, Kunstfasern (z. B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern,
Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern,
Polyurethanfasern, Polyharnstoff-Fasern,.
Aramidfasern) und Zellulose enthaltende Fasern (z. B. Rayon/Viskose,
Ramie, Flachs/Leinen, Jute, Zelluloseacetatfasern, Lyocell).
-
Waschmittelzusammensetzungen
-
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung können die vorliegenden Endoglucanasen
typischerweise Bestandteile einer Waschmittelzusammensetzung sein.
Als solche können
sie in der Waschmittelzusammensetzung in der Form eines nicht- staubenden Granulats,
einer stabilisierten Flüssigkeit
oder eines geschützten
Enzyms enthalten sein. Nicht-staubende Granulate können, z.
B. wie in
US 4,106,991 und 4,661,452
(beide für
Novo Industri A/S) beschrieben, hergestellt sein und können wahlweise
mittels in der Technik bekannter Verfahren beschichtet sein. Beispiele
von wachsartigen Beschichtungsmaterialien sind Polyethylenoxid-Produkte
(Polyethylenglycol, PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von
1.000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole, die 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten
aufweisen; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12
bis 20 Kohlenstoffatome enthält
und in denen 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten vorliegen; Fettalkohole;
Fettsäuren
und Mono- und Di- und
Triglyceride von Fettsäuren.
Beispiele von filmbildenden Beschichtungsmaterialien, die für die Aufbringung
mittels Flüssigbettverfahren
geeignet sind, sind in dem Patent
GB
1483591 angegeben. Flüssige
Enzymzubereitungen können
zum Beispiel durch das Zugeben eines Polyols, so wie Propylenglycol,
eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierten
Verfahren, stabilisiert sein. Andere Enzymstabilisatoren sind in
der Technik wohlbekannt. Geschützte
Enzyme können
gemäß des in
EP 238,216 offenbarten Verfahrens
hergestellt werden.
-
Die
erfindungsgemäße Waschmittelzusammensetzung
kann in jeder beliebigen zweckmäßigen Form, z.
B. als Pulver, Granula, Paste oder Flüssigkeit, vorliegen. Ein Flüssigwaschmittel
kann wässrig
sein, typischerweise bis zu 70 % Wasser und 0–30 % organisches Lösungsmittel
enthalten, oder nicht-wässrig
sein.
-
Die
Waschmittelzusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, von
denen jedes anionisch, nichtionisch, kationisch oder zwitterionisch
sein kann. Das Waschmittel wird typischerweise 0–50 % anionisches Tensid, so
wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS),
Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkohol-Ethoxysulfat (AEOS
oder AES), sekundäre
Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder
Alkenylbernsteinsäure
oder Seife, enthalten. Es kann auch 0 bis 40 % nichtionisches Tensid,
so wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate,
Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid,
ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid,
Fettsäuremonoethanolamid oder
Polyhydroxyalkylfettsäureamid
(z. B. wie in WO 92/06154 beschrieben), enthalten.
-
Die
Waschmittelzusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere
Enzyme, so wie Amylase, Lipase, Cutinase, Protease, Peroxidase und
Oxidase, z. B. Laccase, enthalten.
-
Das
Waschmittel kann 1–65
% eines Waschmittel-Builders oder Komplexbildners, so wie Zeolith,
Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA),
Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silikate
oder Schichtsilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst), enthalten. Das Waschmittel
kann auch „unbuilt", d. h. im Wesentlichen
frei von Waschmittel-Builder, sein.
-
Das
Waschmittel kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind
Carboxymethylzellulose (CMC), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol
(PEG), Polyvinylalkohol (PVA), Polycarboxylate, so wie Polyacrylate,
Malein-/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
-
Das
Waschmittel kann ein Bleichsystem enthalten, das eine H2O2-Quelle, so wie ein Perborat oder Percarbonat,
enthält,
die mit einem Persäure-bildenden
Bleichaktivator, so wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat
(NOBS), kombiniert sein kann. Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren von
z. B. dem Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
-
Die
Enzyme der erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzung
können
unter Verwendung konventioneller Stabilisierungsmittel, z. B. eines
Polyols, so wie Propylenglykol oder Glycerin, eines Zuckers oder Zuckeralkohols,
von Milchsäure,
Borsäure
oder eines Borsäurederivats,
so wie z. B. eines aromatischen Boratesters, stabilisiert sein,
und die Zusammensetzung kann, wie z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19705
beschrieben, formuliert sein.
-
Das
Waschmittel kann auch andere herkömmliche Waschmittelbestandteile,
so wie z. B. Textilerzeugnis-Ausrüstungen, einschließlich Tonen,
schaumbildenden Zusätzen,
Schaumunterdrückern,
Korrosionsschutzmitteln, Schmutz-Suspendiermitteln, Anti-Schmutzablagerungsmitteln,
Farbstoffen, Bakteriziden, optischen Aufhellern oder Parfum, enthalten.
-
Der
pH (in wässriger
Lösung
bei Gebrauchskonzentration gemessen) wird gewöhnlich neutral oder alkalisch,
z. B. in dem Bereich von 7–11,
sein.
-
Besondere
Formen der Waschmittelzusammensetzungen innerhalb des Umfangs der
Erfindung schließen
ein:
- 1) Eine Waschmittelzusammensetzung, die
als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600
g/l aufweist, umfassend
- 2) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
- 3) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend
- 4) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
- 5) Eine wässrige
Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung,
umfassend
- 6) Eine wässrige,
strukturierte Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung,
umfassend
- 7) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
- 8) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, umfassend
- 9) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, umfassend
- 10) Eine wässrige
Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung,
umfassend
- 11) Eine wässrige
Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung,
umfassend
- 12) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
- 13) Wie in 1)-12) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen,
worin das gesamte oder ein Teil des linearen Alkylbenzolsulfonats
durch C12-C18-Alkylsulfat
ersetzt ist.
- 14) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
- 15) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert
ist, das eine Schüttdichte
von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
- 16) Wie in 1)-15) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen,
die eine stabilisierte oder eingekapselte Persäure entweder als einen zusätzlichen
Bestandteil oder als einen Ersatz für bereits angegebene Bleichsysteme
enthalten.
- 17) Wie in 1), 3), 7), 9) und 12) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen,
worin Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
- 18) Wie in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen,
die zusätzlich
einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z.
B. eine der in „Efficient
manganese catalysts for lowtemperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639 beschriebenen
Verbindungen sein.
- 19) Waschmittelzusammensetzung, die als eine nicht-wässrige Waschmittelflüssigkeit
formuliert ist, die ein flüssiges,
nichtionisches Tensid, so wie z. B. linearen, alkoxylierten, primären Alkohol,
ein Builder-System (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali umfasst. Das
Waschmittel kann auch ein anionisches Tensid und/oder ein Bleichsystem
umfassen.
-
Die
Endoglucanase kann in Konzentrationen enthalten sein, die üblicherweise
in Waschmitteln verwendet werden. Gegenwärtig wird erwartet, dass die
Zellulase in der erfindungsgemäßen Wäschereizusammensetzung
in einer Menge zugesetzt werden kann, die 0,0001–10 mg (berechnet als reines
Enzymprotein) der Zellulase pro Liter Waschflüssigkeit entspricht.
-
Gemäß einem
noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Endoglucanase
typischerweise ein Bestandteil einer Textilerzeugnis-Ausrüstungs-
oder -Weichmacherzusammensetzung sein. Beispiele von üblichen
Weichmacherzusammensetzungen sind z. B. in
EP 0 233 910 offenbart.
-
Textilanwendungen
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase
in dem Biopolishing-Verfahren. Das Biopolishing ist die spezifische Behandlung
der Garnoberfläche,
die die Qualität
des Textilerzeugnisses im Hinblick auf die Handhabung und das Aussehen
ohne Verlust der Benetzbarkeit des Textilerzeugnisses verbessert.
Die wichtigsten Wirkungen des Biopolishings können als weniger Fussel- und
Knötchenbildung,
verstärkter
Glanz/Schimmer, verbesserte Handhabung des Textilprodukts, verbessert
dauerhafte Weichheit und veränderte
Wasseraufnahme charakterisiert werden. Das Biopolishing findet typischerweise
während
der Nassverarbeitung der Herstellung gestrickter und gewebter Textilerzeugnisse
statt. Die Nassverarbeitung umfasst solche Schritte wie z. B. Entschlichten, Spülen, Bleichen,
Waschen, Färben/Drucken
und Ausrüsten.
Während
jedes dieser Schritte wird das Textilerzeugnis in stärkerem oder
geringerem Maße
einer mechanischen Einwirkung unterzogen. Im Allgemeinen wird das
Textilerzeugnis, nachdem die Textilerzeugnisse gestrickt oder gewoben
wurden, einem Entschlichtungsschritt unterzogen, dem ein Spülschritt
folgt, usw.. Das Entschlichten ist der Vorgang, bei dem die Größe der Textilien
verringert wird. Vor dem Weben auf mechanischen Webstühlen werden
Webgarne häufig
mit Schlichtstärke
oder Stärkederivaten
beschichtet, um ihre Zugstärke
zu erhöhen.
Nach dem Weben muss die Schlichtbeschichtung entfernt werden, bevor
das Textilerzeugnis weiter verarbeitet wird, um ein homogenes und waschfestes
Ergebnis sicher zu stellen. Es ist bekannt, dass eine Kombination
einer zellulytischen und mechanischen Einwirkung erforderlich ist,
um die Wirkungen des Biopolishings zu erreichen. Es ist auch bekannt, dass
eine „Superweichheit" erreicht werden
kann, wenn die Behandlung mit einer Zellulase mit einer herkömmlichen
Behandlung mit Weichmachern kombiniert wird. Es wird erwartet, dass
die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase
für das
Biopolishing von Zellulose-Textilerzeugnissen vorteilhaft ist, z.
B. kann ein gründlicheres
Polishing erreicht werden. Das Biopolishing kann erreicht werden,
indem das z. B. in WO 93/20278 beschriebene Verfahren angewendet
wird.
-
Stone-Washing
-
Es
ist bekannt, ein „stonewashed„-Aussehen
(örtliches
Abtragen der Farbe) bei gefärbten
Textilerzeugnissen, speziell bei Denim-Textilerzeugnissen oder Jeans,
durch Waschen von entweder dem Denim oder der aus solche einem Textilerzeugnis
hergestellten Jeans in der Anwesenheit von Bimsstein, um die gewünschte, örtliche
Aufhellung der Farbe des Textilerzeugnisses zu erzeugen, oder durch
enzymatische Behandlung des Textilerzeugnisses, insbesondere mit
zellulytischen Enzymen, bereit zu stellen. Die Behandlung mit einer
erfindungsgemäßen Endoglucanase
kann entweder alleine, so wie in
US
4,832,864 offenbart, gemeinsam mit einer geringeren Menge
an Bimsstein als in dem herkömmlichen
Verfahren erforderlich, oder gemeinsam mit Perlit, so wie in WO
95/09225 offenbart, durchgeführt
werden.
-
Zellstoff-
und Papieranwendungen
-
In
der Papier herstellenden Zellstoffindustrie kann die erfindungsgemäße Endoglucanase
vorteilhafterweise z. B. wie folgt angewendet werden:
- – Für das Entrinden:
die Vorbehandlung mit der Endoglucanase kann die Kambiumschicht
vor dem Entrinden in mechanischen Trommeln abbauen, was zu vorteilhaften
Energieeinsparungen führt.
- – Für den Holzaufschluss:
die Behandlung eines Materials, das Zellulosefasern enthält, mit
der Endoglucanase vor dem Refiner-Mahlen oder dem Mahlen kann zu
einer Verringerung des Energieverbrauchs auf Grund der hydrolysierenden
Wirkung der Zellulase an den Zwischenfaser-Oberflächen führen. Die
Verwendung der Endoglucanase kann zu verbesserten Energieeinsparungen
im Vergleich zu der Verwendung von bekannten Enzymen führen, weil
angenommen wird, dass die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung eine
höhere
Fähigkeit,
die Faserwände
zu durchdringen, besitzen kann.
- – Für die Fasermodifizierung,
d. h. die Verbesserung der Fasereigenschaften, sofern eine teilweise
Hydrolyse über
die Faserwand erforderlich ist, die tiefer eindringende Enzyme erfordert
(z. B. um grobe Fasern flexibler zu machen). Die tiefe Behandlung
von Fasern war bisher für
Hochausbeute-Zellstoffe, z. B. mechanische Zellstoffe oder Mischungen
von recyled-Zellstoffen nicht möglich.
Dies wurde der Natur der Faserwandstruktur zugeschrieben, die den
Durchtritt der Enzymmoleküle
auf Grund der physikalischen Begrenzung der Porenmatrix der Faserwand
verhindert. Es wird erwartet, dass die vorliegende Endoglucanase
fähig ist,
in die Faserwand einzudringen.
- – Für die Verbesserung
der Entwässerung.
Die Entwässerbarkeit
der Papierherstellungs-Zellstoffen kann durch die Behandlung des
Zellstoffs mit hydrolysierenden Enzymen, z. B. Zellulasen, verbessert
werden. Die Verwendung der vorliegenden Endoglucanase kann effektiver
sein, z. B. zu einem höheren
Grad der Lockerung von Bündeln
stark hydratisierter Mikrofibrillen in der Feinanteil-Fraktion (die
aus Fasertrümmern besteht)
führen,
die die Entwässerungsgeschwindigkeit
durch Blockieren der Hohlräume
zwischen den Fasern und dem Drahtnetzgeflecht der Papiermaschine
begrenzt. Der Kanadische Standardmahlgrad (CSF) nimmt zu, und der
Schopper-Riegler-Entwässerungsindex
nimmt ab, wenn der Zellstoff einer Zellulasebehandlung unterzogen
wird, siehe z. B. US-Patent 4,923,565; TAPPI T227, SCAN C19:65.ence.
- – Für die Zwischenfaserbindung.
Hydrolytische Enzyme werden bei der Herstellung von Papierherstellungs-Zellstoffen
für die
Verbesserung der Zwischenfaserbindung eingesetzt. Die Enzyme spülen Verunreinigungen,
z. B. Zellulosetrümmer,
von den Faseroberflächen
ab und vergrößern somit
die Fläche
der exponierten Zellulose, die an der Faserwand anhaftet, wodurch
die Wasserstoffbindungskapazität
zwischen den Fasern verbessert wird. Dieses Verfahren wird auch
als Enthornung („dehornification") bezeichnet. Papier
und Karton, die mit einer Zellulase enthaltenden Enzymzubereitung
hergestellt werden, können
eine verbesserte Stärke
oder ein verringertes Quadratmetergewicht, eine glattere Oberfläche und
eine verbesserte Bedruckbarkeit aufweisen.
- – Für das enzymatische
De-inken. Die teilweise Hydrolyse von wieder gewonnenem Papier während oder nach
dem Holzaufschluss unter Verwendung von hydrolysierenden Enzymen,
sowie Zellulasen, erleichtert bekanntlich das Entfernen und das
Zusammenballen von Tintenpartikeln. Die Verwendung der vorliegenden
Endoglucanase kann auf Grund eines besseren Eindringens der Enzymmoleküle in die
fibrilläre
Matrix der Faserwand, wobei die Oberfläche weicher gemacht wird, wodurch
die Tintenpartikel wirksamer gelöst werden,
zu einer wirksameren Ablösung
der Tinte von der Oberflächenstruktur
führen.
Das Zusammenballen der gelösten
Tintenpartikel wird auf Grund einer wirksameren Hydrolyse von Zellulosefragmenten,
von den gefunden wird, dass sie an Tintenpartikeln anhaften, die
von den Fasern abstammen, ebenfalls verbessert.
-
Die
Behandlung der Lignozellulose-Zellstoff kann z. B. wie in WO 91/14819,
WO 91/14822, WO 92/17573 und WO 92/18688 beschrieben, durchgeführt werden.
-
Abbau von Pflanzenmaterial
-
In
einer noch weiteren Ausführung
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase
und/oder Enzymzubereitung für
den Abbau von Pflanzenmaterial, z. B. Zellwänden.
-
Es
wird erwartet, dass die neue, erfindungsgemäße Endoglucanase und/oder Enzymzubereitung
bei der Herstellung von Wein, Frucht- oder Gemüsesaft nützlich ist, um die Ausbeute
zu erhöhen.
Erfindungsgemäße Endoglucanasen
können
auch für
die enzymatische Hydrolyse verschiedener von Pflanzenzellwänden abgeleiteter
Materialien oder Abfallmaterialien, z. B. landwirtschaftlicher Rückstände, so
wie Weizenstroh, Maiskolben, gesamte Maispflanzen, Nussschalen,
Gras, Pflanzenhüllen,
Bohnenhülsen,
Treber, Zuckerrübenpulpe
und dergleichen, verwendet werden. Das Pflanzenmaterial kann abgebaut
werden, um verschiedene Arten der Verarbeitung zu verbessern, die
Reinigung oder Extraktion von anderen Bestandteilen, wie die Reinigung
von beta-Glucan oder beta-Glucan-Oligomeren
aus Getreiden, zu erleichtern, den Nährwert zu verbessern, die Wasserbindungskapazität zu verringern,
die Abbaubarkeit in Kläranlagen
zu verbessern, die Umwandlung von z. B. Gras und Mais in Silage
zu verbessern, etc.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
-
BEISPIEL 1
-
Zellulytische
Enzyme aus 4 Pilzen, die zu 3 Familien aus zwei Ordnungen innerhalb
der Ascomycetes gehören,
wurden durch Expressionsklonierung entdeckt; entsprechende DNA-Sequenzen
wurden bestimmt; die Enzyme wurden heterolog exprimiert und durch
Flüssigfermentation
produziert, charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass sie in Farbklärungstests
eine gute Wirksamkeit zeigen.
-
Die
Isolate CBS 117.65, CBS 478.94, NRRL 8126 und ATCC 10523 wurden
in Schüttelflaschenkulturen
mit mit Kartoffel-Dextrose-Brühe
angereicherter Zellulose wachsen gelassen, die für 5 Tage bei 26 °C (Schüttelbedingungen
150 upm) inkubiert wurden.
-
A. Klonierung und Expression
einer Endoglucanase von Myceliophthora thermophila, Acremonium sp.
und Thielavia terrestris und Volutella colletotrichoides
-
mRNA
wurde aus Myceliophthora thermophila, Acremonium sp., Thielavia
terrestris bzw. Volutella colletotrichoides isoliert, die in einem
Zellulose enthaltenden Fermentationsmedium unter Bewegung, um eine ausreichende
Belüftung
sicher zu stellen, wachsen gelassen wurden. Die Mycelien wurden
nach 3–5
Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren
und bei –80 °C gelagert.
Bibliotheken von Myceliophthora thermophila, Acremonium sp., Thielavia
terrestris bzw. Volutella colletotrichoides, die jeweils aus in etwa
106 Einzelklonen bestanden, wurden in E.
coli, wie beschrieben, mit einem Vektorhintergrund von 1 % konstruiert.
-
Die
Plasmid-DNA aus einigen der Pools aus jeder Bibliothek wurden in
Hefe transformiert, und 50–100 Platten,
die 25000 Hefekolonien enthielten, wurden aus jedem Pool erhalten.
-
Endoglucanase-positive
Kolonien wurden auf SC-Agar-Platten mit dem AZCL-HE-Zellulosetest identifiziert
und isoliert. Die cDNA-Inserts wurden, wie in dem Abschnitt Material
und Methoden, oben, beschrieben, direkt aus den Hefekolonien amplifiziert
und charakterisiert.
-
Die
DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Myceliophthora thermophia
kodiert, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz
ist ebenfalls in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid
in DSM 9770 erhältlich.
-
Die
DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Acremonium sp. kodiert,
ist in SEQ ID Nr. 4 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID Nr. 5 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM
10082 erhältlich.
-
Die
DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Thielavia terrestris
kodiert, ist in SEQ ID Nr. 8 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID Nr. 9 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM
10081 erhältlich.
-
Die
DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Volutella colletotrichoides
kodiert, ist in SEQ ID Nr. 16 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID Nr. 17 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM
10571 erhältlich.
-
Die
Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert, und die Plasmid-DNA
wurde durch Transformation von E. coli, wie oben beschrieben, gerettet.
Um die Endoglucanase in Aspergillus zu exprimieren, wurde die DNA
mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, der Größe nach
auf einem Gel fraktioniert, und ein Fragment, das dem Endoglucanasegen
von Myceliophthora thermophila, Acremonium sp., Thielavia terrestris
bzw. Volutella colletotrichoides entsprach, wurde gereinigt. Die
Gene wurden nachfolgend an pHD414 ligiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen
gespalten, was zu den Plasmiden pA2C193, pA2C357, pA2C385 bzw. pA2C488
führte.
-
Nach
der Amplifizierung der DNA in E. coli wurden die Plasmide, wie oben
beschrieben, in Aspergillus oryzae transformiert.
-
Test von Transformanten
von A. oryzae
-
Jede
der Transformanten wurde, wie oben beschrieben, auf Endoglucanase-Aktivität getestet.
Einige der Transformanten wiesen eine Endoglucanase-Aktivität auf, die
signifikant höher
als der Hintergrund von Aspergillus oryzae war. Dies zeigte eine
effiziente Expression der Endoglucanasen in Aspergillus oryzae.
Die Transformanten mit der höchsten
Endoglucanase-Aktivität
wurden ausgewählt
und in eine 500-ml-Schüttelflasche
mit YPM-Medien inokuliert. Nach 3–5 Tagen der Fermentation unter
ausreichender Bewegung, um eine gute Belüftung sicherzustellen, wurde
die Kulturbrühe
für 10
min bei 2000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen.
-
B. Bestimmung der Endoglucanase-Aktivität
-
Die
zellulytische Aktivität
der Endoglucanase kann im Vergleich zu einem analytischen Standard
bestimmt und in der Einheit S-CEVU ausgedrückt werden.
-
Zellulytische
Enzyme hydrolysieren CMC, wodurch sie die Viskosität des Inkubationsgemisches
verringern. Die resultierende Abnahme der Viskosität kann mittels
eines Scheibenviskosimeters (z. B. MIVI 3000 von Sofraser, Frankreich)
bestimmt werden.
-
Die
Bestimmung der zellulytischen Aktivität, die als S-CEVU gemessen
wird, kann gemäß des Analyseverfahrens
AF 301.1 bestimmt werden, das von dem Anmelder auf Anfrage erhältlich ist.
-
Der
S-CEVU-Test quantifiziert die Menge der katalytischen Aktivität, die in
der Probe vorhanden ist, wobei die Fähigkeit der Probe, die Viskosität einer
Lösung
von Carboxymethylzellulose (CMC) zu verringern, gemessen wird. Der
Test wird bei 40 °C,
pH 7,5, unter Verwendung eines relativen Enzymstandards für die Verringerung
der Viskosität
des CMC-Substrats durchgeführt.
-
Test für die Bestimmung der Endoglucanase-Aktivität in Form
von SAVI-Einheiten unter Verwendung von in Phosphorsäure geschwollener
Zellulose (PASC):
-
Definition:
-
- 1 SAVI-U ist die Menge an Enzym, die eine Menge an reduzierenden
Kohlenhydraten bildet, die 1 μmol
Glucose pro Minute entspricht.
-
Versuchsbedingung:
-
- Enzymlösung:
0,5 ml
- 4 g/l PASC in 0,1 M Puffer: 2,0 ml
- 20 min., 40 °C
-
Empfindlichkeit:
-
- Max 0,1 SAVIU/ml = in etwa 1 S-CEVU/ml (CMC-Viskosität)
- Min 0,01 SAVIU/ml = in etwa 0,1 S-CEVU/ml
-
Bestimmung der Bildung
von reduzierenden Zuckern:
-
Der
Test auf reduzierende Gruppen wurde nach Lever, M., A new reaction
for colormetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 1972,
Bd. 47 (273–279)
durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde hergestellt, indem 1,5 g p-Hydroxybenzoesäure-Hydrazid
(PHBAH) mit 5 g Natriumtartrat in 100 ml 2 % Natriumhydroxid gemischt
wurden.
-
Substrat:
-
Die
PASC-Stammlösung
wurde auf die folgende Weise hergestellt, wobei eiskaltes Aceton
und Phosphorsäure
verwendet wurden. 5 g Zellulose (Avicel®) wurden
mit Wasser angefeuchtet, und 150 ml eiskalte 85%ige ortho-Phosphorsäure wurden
zugegeben. Die Mischung wurde unter langsamem Rühren für 1 std in ein Eisbad gestellt.
Dann wurden 100 ml eiskaltes Aceton unter Rühren zugegeben. Die Aufschlämmung wurde
in einen Buchnerfilter mit einer gesinterten Pyrexfritte Nr. 3 gegeben
und dann dreimal mit 100 ml eiskaltem Aceton gewaschen und nach
jedem Waschen so trocken wie möglich
gesaugt. Schließlich
wurde der Filterkuchen zweimal mit 500 ml Wasser gewaschen und nach
jedem Waschen so trocken wie möglich
gesaugt. Das PASC wurde mit entionisiertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen
von 300 ml gemischt, bis zur Homogenität (unter Verwendung des Ultra-Turrax-Homogenisators)
gemixt und im Kühlschrank
gelagert (bis zu einem Monat).
- Substratäquilibrierung mit Puffer: 20
g Stammlösung
der in Phosphorsäure
geschwollenen Zellulose, PASC, wurden für 20 min bei 5000 upm zentrifugiert,
der Überstand
wurde abgegossen, das Sediment wurde in 30 ml Puffer resuspendiert
und für
20 min bei 5000 upm zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen,
und das Sediment wurde in Puffer bis zu einem Gesamtgewicht von
60 g resuspendiert, was einer Substratkonzentration von 5 g Zellulose/Liter
entsprach.
- Puffer für
die pH-8,5-Bestimmung: 0,1 M Barbital.
- Puffer für
die pH-10-Bestimmung: 0,1 M Glycin.
-
Verfahren:
-
1. Verdünnung von
Enzymproben
-
Die
Enzymlösung
wird in dem gleichen Puffer wie das Substrat verdünnt.
-
2. Enzymreaktion
-
Die
Lösung
des Substrats in dem Puffer wird für 5 min bei 40 °C erhitzt
(2 ml).
-
Dann
werden 0,5 ml der Enzymlösung
(verdünnt
auf zwischen 0,2 und 1 S-CEVU/ml) zugegeben und für 5 sek.
gemischt. Enzymleerwerte werden erhalten, indem das Stoppreagens
vor der Enzymlösung
zugegeben wird. Für
20 min bei 40 °C
inkubieren. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 2 % NaOH-Lösung und
Mischen für
5 sek abgestoppt.
-
Die
Proben werden für
20 min bei 5000 upm zentrifugiert. 1 ml Überstand wird mit 0,5 ml PHBAH-Reagens
gemischt und für
10 min gekocht. Die Teströhrchen
werden in einem Eiswasserbad abgekühlt.
-
3. Bestimmung von reduzierenden
Endgruppen:
-
Die
dekadische Extinktion bei 410 nm wird unter Verwendung eines Spektralphotometers
gemessen. Leerwerte werden durch Zugabe von Natriumhydroxid vor
der Zugabe der Enzymlösung
hergestellt.
-
Eine
Standard-Glucosekurve wurde unter Verwendung von Glucosekonzentrationen
von 5, 10, 15 und 25 mg/l in dem gleichen Puffer und durch Zugabe
von PHBAH-Reagens vor dem Kochen erhalten. Die Freisetzung von reduzierendem
Glucoseäquivalent
wird unter Verwendung dieser Standardkurve berechnet.
-
4. Berechnung der katalytischen
Aktivität:
-
Messen
der dekadischen Extinktion bei 410 nm
-
- 1) Standardkurve
(Glucose) – (H2O) gegen Konzentration der Glucose
- 2) Enzymprobe
(Probe) – (Leerwert)
-
Berechne
die Glucosekonzentration gemäß einer
Standardkurve
-
-
C. Reinigung und Charakterisierung
der Endoglueanase aus M. thermophila
-
Aspergillus
oryzae, das mit pA2C193 transformiert war, wurde auf YPM-Medium
für 4 Tage
wachsen gelassen. Die Flüssigkeit
wurde dann zentrifugiert und sterilfiltriert.
-
Die
Probe wurde mittels Ultrafiltration in AMICON-Zellen unter Verwendung
einer DOW-Membran GR61PP mit einem Ausschluss von 20 kD konzentriert.
Das Uf-Konzentrat
wurde bezüglich
S-CEVU/ml und SaviU/ml mit dem folgenden Ergebnis analysiert:
-
Reinigung:
-
2
ml des UF-Konzentrats wurde 5fach verdünnt, um die Ionenstärke zu verringern,
und durch einen 0,22-μm-Scheibenfilter
filtriert. Diese Probe wurde auf eine Mono Q® HR5/5
Pharmacia-Säule
aufgetragen, die mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, (Puffer A) und
einem Fluss von 1 ml/min äquilibriert
war. Nach dem Waschen mit dem Puffer A bis zur Grundlinie wurde
die Säule
mit einem Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 1 M NaCl enthielt (Puffer
B) eluiert, der Eluierungsgradient betrug 0–50 % Puffer B in 1 Stunde.
-
Nach
36 min zeigte sich ein Peakkomplex, 1-ml-Fraktionen wurden aufgefangen,
und die ersten 10 Fraktionen zeigten eine Zellulaseaktivität auf CMC/Agarose/Kongorot-Platten.
-
Diese
Fraktionen wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration in AMICON-Zellen,
unter Verwendung einer DOW-Membran GR61PP mit einem Ausschluss von
20 kD auf 3 ml konzentriert.
-
Diese
Probe wurde auf eine HiLoad-26/60-Superdex-75TM-Prep-Grad-Pharmacia-Säule, die
mit 100 mM Na-Acetat-Puffer, pH 6,35, äquilibriert war, und mit einer
Flussrate von 1 ml/min aufgetragen.
-
Nach
82 min zeigte sich ein Peak, 1-ml-Fraktionen wurden aufgefangen,
und die ersten 10 Fraktionen zeigten eine Zellulaseaktivität auf CMC/Agarose/Kongorot-Platten.
-
Diese
Fraktionen wurden vereinigt, und die folgenden Ergebnisse wurden
erhalten:
A280 = 0,15
A280/A260 = 1,62
Mr(SDS) = 22 kD
pI = 3,5–5
Reinheit
in SDS-PAGE = 100 %
S-CEVU/ml = 28,5
S-CEVU/A280 =
188
S-CEVU/mg = 436
Extinktionskoeffizient = 54880 (berechnet)
Mr(berechnet) = 22 kD
-
Der
Extinktionskoeffizient beruht auf dem Gehalt an Tyrosin, Tryptophan
und Cystein, der anhand der beiliegenden SEQ ID Nr. 1 (der Aminosäuresequenz)
berechnet wurde. Die SDS-Page wurde auf vorgegossenen NOVEX-Gelen,
4–20 %
Tris-Glycin-Gel, 1,0 mm × 10
Vertiefungen, durchgeführt.
-
Die
IEF wurde auf der Pharmacia PAGplate pH 3,5–9,5 durchgeführt, die
Aktivität
wurde durch Überschichtung
mit CMC-Kongorot sichtbar gemacht.
Bestimmung von KM & kcat:
km und
kcat wurde in der gleichen Weise wie die
Bestimmung der SAVI-Units bei pH 8,5 mit einer Substratkonzentration
bis zu 8 g/l bestimmt.
-
Die
folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
kcat 38
pro sek,
km 5 g/l,
in Phosphorsäure geschwollene
Zellulose, pH 8,5.
Spezifische Aktivität auf CMC bei pH 7,5:
436
S-CEVU pro mg Protein.
-
D. Bestimmung des pH-
und Temperaturprofils der Endoglucanase von M. thermophila
-
Das
pH-Profil wurde unter den folgenden Bedingungen bestimmt:
Puffer
mit pH-Werten zwischen 2,5 und 10,0 wurden hergestellt, indem 0,1
M Tri-Natriumphosphat
mit 0,1 M Zitronensäure
gemischt wurde. Die gereinigte Endoglucanase wurde verdünnt, um
sicherzustellen, dass die Testantwort sich innerhalb des linearen
Bereichs des Tests befindet. Das Substrat war eine 0,4%ige Suspension
von AZCL-HE-Zellulose
(MegaZyme), die 1:1 mit dem Citrat/Phosphatpuffer bis zu einer Substratendkonzentration
von 0,2 % AZCL-HE-Zellulose gemischt wurde. Zu 1 ml Substrat in
Eppendorf®-1,5-ml-Polypropylenröhrchen wurde
10 μl Enzymlösung zugegeben
und für
15 Minuten in temperaturkontrollierten Thermomixern von Eppendorf® inkubiert,
bevor die Enzyme für
20 Minuten bei 95 °C
in einem separaten Thermomixer hitzeinaktiviert wurden. Die Röhrchen wurden
zentrifugiert, und 200 μl
jedes Überstands
wurden in eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen überführt, und
die OD wurde bei 620 nm in einem ELISA-Reader (Labsystems Multiskan® MCC/340)
gemessen.
-
Für das pH-Optimum
wurden die Inkubationen bei 30 °C
durchgeführt.
Für jeden
pH-Wert wurde zu 3 Röhrchen
Enzym zugegeben, und sie wurden vor der Hitzeinaktivierung inkubiert,
wogegen zu einem Röhrchen
(dem Leerwert) Enzym zugegeben wurde und es sofort hitzeinaktiviert
wurde. Der Durchschnittswert der drei inkubierten Proben wurde berechnet,
und der Leerwert wurde abgezogen.
-
Die
folgenden pH-Profile wurden bestimmt:
-
Es
wird beobachtet, dass die Endoglucanase mehr als 60 % Aktivität zwischen
pH 4,0 und 8,0 und die optimale Aktivität bei pH 5,0–6,0 aufweist.
-
Temperaturprofil:
-
Das
Temperaturoptimum wurde in der gleichen Weise bei pH 5,5 bestimmt.
Die Temperaturen betrugen in dem Bereich von 30 °C bis 80 °C. Für jede Temperatur wurden drei
Inkubation durchgeführt
und der Durchschnitt berechnet. Drei Leerwerte wurden durch sofortige
Hitzeinaktivierung des Enzyms hergestellt, und der Durchschnitt
wurde von den Werten der inkubierten Proben abgezogen.
-
Es
wird beobachtet, dass die Endoglucanase die optimale Aktivität bei 50–70 °C aufweist.
-
-
Die
Temperaturstabilität
wurde in der gleichen Weise bei pH 5,5 und 30 °C bestimmt, und außerdem wurden
die Enzymlösungen
für 1 Stunde
auf die eigentliche Temperatur erhitzt und auf Eis abgekühlt. Die
Restaktivität
ist unten in % der Aktivität
einer nicht vorerhitzten Enzymprobe gezeigt:
E.
Farbklärung
der Myceliophthora-Zellulase (SEQ ID Nr. 1), gemessen als Entfernen
von Oberflächenfibrillen und
-fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Cellulosefasern
enthält
Gerät: | Terg-o-tometer |
Flüssigkeitsvolumen: | 100
ml |
Bewegung: | 150
Bewegungen/min in einem Vertikalrührer |
Spülzeit: | 5
min in Leitungswasser |
Waschtemp.: | 40° |
Waschflüssigkeit: | 0,05
M Phosphatpuffer |
pH: | 7,0 |
Waschzeit: | 30
min |
Wiederholung: | 2 |
Enzyme: | Myceliophthora
SEQ ID Nr. 1B |
Dosierung: | 500
und 2500 S-CEVU/1 |
Textilie: | 2
Musterabschnitte von gealterter, schwarzer 100 % Baumwolle, 5 × 6 cm (0,9
g) |
Trocknung: | Trockenautomat |
Auswertung: | Die
Lichtremission wird mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers
gemessen. Die Remission wird als delta-L gemessen (Hunter Lab-Werte). Wenn die
Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, durch die Zellulare
entfernt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Textilerzeugnisses
als dunkler, und niedrigere L-Werte werden erhalten. |
-
Die
Probe wird mit einer Leerprobe verglichen, d. h. die ohne Enzym
gewaschen wurde:
delta-L-Werte verglichen
mit der Leerprobe.
-
Die
Daten zeigen, dass die Myceliophthora-Zellulase ohne CBD unter den
getesteten Bedingungen eine gute Farbklärung ergibt.
-
F. Konstruktion der Genfusionen
zwischen der Endoglucanase von Myceliophthora thermophila und der 43-kD-Endoglucanase
von Humicola insolens
-
Der
Zweck der beiden Konstrukte war die Herstellung von Derivaten der
Endoglucanase von M. thermophila mit dem Linker und der CBD der
43-kD-Endoglucanase von H. insolens (offenbart in WO 91/17243). Die
native Endoglucanase von M. thermophila weist keinen Linker und/oder
keine Zellulose-Bindungsdomäne, CBD,
auf.
CM1: Das Konstrukt 1 besteht aus der Endoglucanase von
M. thermophila (225 Aminosäuren)
und den 72 C-terminalen Aminosäuren
der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens.
CM2: Das Konstrukt
2 besteht aus der Glucanase von M. thermophila (225 Aminosäuren) und
den 83 C-terminalen Aminosäuren
der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens.
-
Die
cDNA der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens wurde auf solch eine
Weise in pHD414 kloniert, dass das Endoglucanasegen von dem Taka-Promotor
transkribiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde pCaHj418 genannt.
-
Auf
eine ähnliche
Weise wurde die cDNA, die die Endoglucanase von M. thermophila kodiert,
in pHD414 kloniert, und das resultierende Plasmid wurde pA2C193
genannt.
-
Primer:
-
- Primer 1: 5'- CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCAGCTCT
CCGG-3'
- Primer 2: 5'-CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAG
CTCCG-3'
- Primer 3: 5'-CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAACTTCCCT
GCCG-3'
- Primer 4: 5'- CGGCAGGGAAGTTGCCGTCGTCGTTACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGC
TCCG-3'
- Taka-Pro-Primer: 5' CAACATCACATCAAGCTCTCC-3'
- AMG-Term.-Primer: 5' CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3'
-
Die
Endoglucanasefusionen wurden mittels des von Higuchi et al. 1988
beschriebenen PCR-Überlapp-Verlängerungsverfahrens
konstruiert.
-
Konstrukt 1:
-
- Reaktion A: Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde verwendet,
um das Fragment von pCaHj418 zwischen dem Primer 1 und dem AMG-Term.-Primer
zu amplifizieren (den Linker und die CBD der 43-kD-Endoglucanase
von H. insolens).
- Reaktion B: PCR-Amplifizierung des Fragments zwischen dem Taka-Pro.-Primer
und dem Primer 2 in pA2C193, des Endoglucanasegens von M. thermophila.
- Reaktion C: Die beiden gereinigten Fragmente wurden in einer
dritten PCR in der Anwesenheit der Primer, die die Gesamtregion
flankieren, d. h. des Taka-Pro.-Primers und des AMG-Term.-Primers,
verwendet.
-
Konstrukt 2:
-
Das
gleiche Verfahren wurde verwendet, wobei der Primer 3 bzw. der Primer
4 den Primer 1 und den Primer 2 ersetzten.
-
Das
in der Reaktion C amplifizierte Fragment wurde gereinigt und mit
den Restriktionsenzymen XbaI und BsstEII gespalten. Das gereinigte,
gespaltene Fragment wurde in pA2C193 ligiert, das mit den Restriktionsenzymen
XbaI und BsstEII gespalten war.
-
Kompetente
Zellen des Stamms DH5αF' von E. coli (New
England Biolabs.) wurden mit dem ligierten Plasmid transformiert,
und Kolonien, die die Genfusion enthielten, wurden isoliert. Die
Sequenz des klonierten Teils wurde mitels DNA-Sequenzierung bestätigt.
-
Die
Sequenz des Gens in den beiden Konstrukten ist in SEQ ID Nr. 2A
und SEQ ID Nr. 3A gezeigt.
-
Die
Polymerasekettenreaktionen wurden unter Standardbedingungen, wie
von Perkin-Elmer
empfohlen, durchgeführt.
-
Die
Reaktionen A und B begannen mit 2 min bei 94 °C, gefolgt von 20 Zyklen von
(30 sek bei 94 °C, 30
sek bei 50 °C
und 1 min bei 72 °C)
und endeten mit 4 min bei 72 °C.
-
Die
Reaktion C startete mit (2 min bei 94 °C, 1 min bei 52 °C und 2 min
bei 72 °C),
gefolgt von 15 Zyklen von (30 sek bei 94 °C, 30 sek bei 52 °C und 90
sek bei 72 °C)
und endete mit 4 min bei 72 °C.
-
Die
beiden Konstrukte wurden, wie oben beschrieben, in Aspergillus oryzae
transformiert.
-
G. Reinigung und Charakterisierung
von klonierten Zellulasen mit Cellulose-Bindungsdomänen:
-
Das
klonierte Produkt wird nach der Fermentation durch Abtrennen der
extrazellulären
Flüssigkeit
von dem Produktionsorganismus gewonnen. In etwa 1 g Zellulase wird
dann durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung von 150 g Avicel in einer Aufschlämmung mit
20 mm Natriumphosphat, pH 7,5, hochgradig gereinigt.
-
Das
Avicel wird mit der rohen Fermentationsbrühe gemischt, die insgesamt
in etwa 1 g Zellulose enthält.
Nach dem Mischen bei 4 °C
für 20
min wird das Avicel-Enzym in eine Säule mit einer Größe von 50
mal 200 mm (insgesamt in etwa 400 ml) gepackt.
-
Die
Säule wird
mit den 200 ml Puffer gewaschen, anschließend mit 0,5 M NaCl in dem
gleichen Puffer gewaschen, bis kein weiteres Protein eluiert. Dann
wird mit 500 ml 20 mm Tris, pH 8,5, gewaschen. Schließlich wird
das reine Protein mit der vollständigen
Länge mit
1 % Triethylamin, pH 11,8, eluiert.
-
Die
Lösung
des eluierten Enzyms wird auf pH 8 eingestellt und unter Verwendung
einer Amicon-Zelleinheit mit einer DOW-GR6IPP-Membran (Polypropylen
mit einem Ausschluss von 20 KD) auf über 5 mg Protein pro ml konzentriert.
Die gereinigten Zellulasen wurden wie folgt charakterisiert:
-
Die
gereinigten Zellulasen wurden mittels SDS-PAGE bezüglich ihrer
Mr analysiert, und die Mr für die Zellulase
wurde unter Verwendung des Standard-LMW-Protein-Markerkits von Pharmacia
berechnet. Die Mr ist anscheinend höher als
die Mr der Zusammensetzung der kodierenden
Aminosäuren,
und dies auf dem Umstand, dass die Linkerregion Oglycosyliert ist,
was zu dieser höheren
Mr führt.
Der pI wurde unter Verwendung von Pharmacia-Ampholin-PAG-Platten,
pH 3,5 bis 9,5, und erneut unter Verwendung eines Pharmacia-Kits
mit Proteinen mit bekanntem pI bestimmt.
-
Der
molare Extinktionskoeffizient wurde auf der Basis der Aminosäurezusammensetzung
berechnet, wobei die bekannte dekadische Extinktion von Tryptophan,
Tyrosin und Cystein verwendet wurde.
-
Das
pH-Aktivitätsprofil
wurde unter Verwendung von CMC-Substrat, Inkubation für 20 min
bei 40 °C
in einem 0,5-pH-Intervall und Messen der Bildung von reduzierenden
Zuckern erhalten. Die relative Aktivität bei den verschiedenen pHs
wurde berechnet, und die Tabelle enthält das Intervall, in dem mehr
als 50 % relative Aktivität
gemessen wurde.
-
Der
N-Terminus wurde für
die gereinigte Zellulase unter Verwendung eines Applied-Biosystems-Model-473A-Sequencers
bestimmt. Der Proteinsequencer wurde nach den Anweisungen des Herstellers
betrieben.
-
Zwei
der Zellulasen waren blockiert, dies beruht auf dem N-terminalen
Glutamin, das ein Pyroglutamat bildet, das nicht nachgewiesen werden
kann und das die weitere Sequenzierung blockiert. Die DSC-Differentialscanning-Kalorimetrie
wurde bei neutralem pH (7,0) unter Verwendung eines MicroCalc-Inc.-MC-Kalorimeters
mit einer konstanten Scangeschwindigkeit und unter Anhebung der
Temperatur von 20 auf 90 °C
mit einer Rate von 90 °C
pro Stunde durchgeführt.
-
Erzeugung
von Antikörpern.
Die Zellulasen von Myceliophthora, Acremonium und Thielavia wurde
verwendet, um Antikörper
in Kaninchen zu erzeugen. 0,1 mg der gereinigten Zellulase in 0,9
% NaCl-Lösung
wurde unmittelbar vor der Injektion mit Freunds Adjuvans gemischt.
Die Kaninchen wurden 10 Mal in einwöchigen Intervallen immunisiert.
Die Immunglobulin-G-Fraktion (IgG) wurde mittels Ammoniumsulfat-Fällung (25 % Sättigung)
gereinigt. Das Präzipitat
wurde in Wasser gelöst
und dann gründlich
gegen Natriumacetat-Puffer (pH 5,0, 50 mM) und alternierend mit
entionisiertem Wasser dialysiert. Nach der Filtration wurde die
IgG-Fraktion mit Natriumazid (0,01 %) stabilisiert.
-
Bei
der Verwendung der Immundiffusion in Agarplatten bilden alle drei
Zellulasen ein einziges Immunpräzipitat
mit ihrem homologen Antiserum, und kein Präzipitat wurde zwischen den
drei klonierten Zellulasen und den gegen die anderen beiden Zellulasen
erzeugten Seren beobachtet. H-I.
Wirksamkeit der Endoglucanase von Konstrukt 1 (SEQ ID Nr. 2), gemessen
in Puffer als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern,
die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern
enthält
Gerät: | Terg-o-tometer |
Flüssigkeitsvolumen: | 100
ml |
Bewegung: | 150
Bewegungen/min (upm) |
Spülzeit: | 5
min in Leitungswasser |
Waschtemp.: | 40 °C |
Wasserhärte: | 1
mM CaCl2 |
Waschflüssigkeit: | 0,05
M Phosphatpuffer |
pH: | 7,0 |
Waschzeit: | 30
min |
Wiederholungen: | 2 |
Textilie: | 2
Musterabschnitte von gealterter, schwarzer, 100 % Baumwolle, 5 × 6 cm |
Trocknung: | Maschinentrocknung |
-
Auswertung:
-
Die
Lichtremission wurde mittels eines Macbeth-Color-Eye-7000-Remissions-Spektralphotometers gemessen.
Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet. Wenn
die Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, durch die Zellulase
entfernt werden, erschien die Oberfläche als heller, und niedrigere
L-Werte wurden erhalten.
-
-
Die
Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße Enzym unter den getesteten
Bedingungen eine sehr gute Farbklärung ergibt. H-II.
Wirksamkeit der klonierten Endoglucanase von Thielavia terrestris
(SEQ ID Nr. 9), gemessen in Puffer als das Entfernen von Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern
enthält
Gerät: | Terg-o-tometer |
Flüssigkeitsvolumen: | 100
ml |
Bewegung: | 150
Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer |
Spülzeit: | 10
min in Leitungswasser |
Waschtemp.: | 40 °C |
Waschflüssigkeit: | 0,05
M Phosphatpuffer |
pH: | 7,0 |
Waschzeit: | 30
min |
Wiederholungen: | 2 |
Textilie: | 2
Musterabschnitte von gealterter, schwarzer, Baumwolle, 5 × 6 cm (etw.
150 g/m2) |
Trocknung: | Maschinentrocknung |
-
Auswertung:
-
Die
Lichtremission wurde mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers
gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet.
Wenn Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, durch die Zellulase
entfernt wurden, erschien die Oberfläche des schwarzen Textilerzeugnisses
als dunkler und schöner,
und niedrigere L-Werte wurden erhalten.
-
-
Diese
Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße Enzym unter den getesteten
Bedingungen eine gute Farbklärung
ergibt. H-III.
Wirksamkeit der Endoglucanase von Volutella colletrichoides (SEQ
ID Nr. 17), gemessen in Puffer als das Entfernen von Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern
enthält
Gerät: | Terg-o-tometer |
Flüssigkeitsvolumen: | 100
ml |
Bewegung: | 150
Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer |
Spülzeit: | 5
min in Leitungswasser |
Waschtemp.: | 40 °C |
Waschflüssigkeit: | 0,05
M Phosphatpuffer |
pH: | 7,0 |
Waschzeit: | 30
min |
Wiederholungen: | 2 |
Dosierung: | 2,5
S-CEVU/ml |
Textilie: | 2
Musterabschnitte von gealterter, schwarzer, 100 % Baumwolle, 5 × 6 cm (0,9
g) |
Trocknung: | Maschinentrocknung |
-
Auswertung:
-
Die
Lichtremission wurde mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers
gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet.
Wenn die Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, von der Zellulase entfernt
werden, erscheint die Oberfläche
des schwarzen Textilerzeugnisses als dunkler, und niedrigere L-Werte
werden erhalten.
-
Die
Probe wird mit einer Leerprobe, d. h. ohne Enzym gewaschen, verglichen
Keine
Zellulase | Mit
Zellulase |
0,00 | –0,57 |
-
Remissionswerte
delta-L, verglichen mit der Leerprobe.
-
Die
Daten zeigen, dass die Zellulase von Volutella colletrichoides unter
den getesteten Bedingungen eine gute Farbklärung liefert. H-IV.
Wirksamkeit der klonierten Zellulasen von Thielavia terrestris und
Acremonium sp. CBS 478.94 in starkem Waschmittel mit hohem pH, gemessen
als das Entfernen von Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern
enthält
Gerät: | Terg-o-tometer |
Flüssigkeitsvolumen: | 150
ml |
Bewegung: | 150
Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer |
Spülzeit: | 10
min in Leitungswasser |
Waschtemp.: | 35 °C |
Waschflüssigkeit: | 1,0
g/l US-Typ HDG
(Zeolit/Soda-built, Gewichtsverhältnis anionisch/nichtionisch > 2,5) |
pH: | 10,0 |
Härte: | 1,0
mM CaCl2, 0,34mM MgCl2 |
Waschzeit: | 12
min |
Wiederholungen: | 6 |
Textilie: | 2
Musterabschnitte von gealterter, schwarzer Baumwolle, 5 × 6 cm (etw.
150 g/m2)
2 Musterabschnitte schwerer,
gestrickter Baumwolle, 5 × 6
cm (etw. 600 g/m2) |
Trocknung: | Maschinentrocknung |
-
Auswertung:
-
Die
Lichtremission wurde mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers
gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet.
Wenn die Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, von der Zellulase entfernt
werden, erscheint die Oberfläche
der schwarzen Textilie als dunkler und schöner, und niedrigere L-Werte
werden erhalten. Verschiedene Dosierungen von klonierten Zellulasen
aus Thielavia terrestris (SEQ ID Nr. 9) bzw. Acremonium sp. CBS
478.94 (SEQ ID Nr. 5) (mit A bzw. B bezeichnet) wurden getestet.
-
-
Die
Daten zeigen, dass beide Zellulasen unter den getesteten Bedingungen
eine gute Farbklärung
ergeben. H-V.
Wirksamkeit der aus Thielavia terrestris und Acremonium sp. CBS
478.94 klonierten Zellulasen, sowie von Konstrukt 1 (SEQ ID Nr.
2), gemessen als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern,
die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern
enthält
Gerät: | Terg-o-tometer |
Flüssigkeitsvolumen: | 150
ml |
Bewegung: | 150
Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer |
Spülzeit: | 10
min in Leitungswasser |
Waschtemp.: | 35 °C |
Härte: | 1,0
mM CaCl2, 0,34 mM MgCl2 |
Waschflüssigkeit: | 2,0
g/l HDL (neutrales Citrat-built HDL, mit einem Gewichtsverhältnis nichtionisch/ionisch > 0,5) |
pH: | 7,5 |
Waschzeit: | 30
min |
Wiederholungen: | 2 |
Textilerzeugnis: | 2
Musterabschnitte von gealterter, schwarzer Baumwolle, 5 × 6 cm (etw.
150 g/m2)
2 Musterabschnitte von schwerer,
gestrickter Baumwolle, 4 × 7
cm (etw. 600 g/m2) |
Trocknung: | Maschinentrocknung |
-
Auswertung:
-
Die
Lichtremission wird mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers
gemessen. Die Remission wird als delta-L berechnet (CIE-Lab-Werte).
Wenn die Oberflächenfibrillen
und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, von der Zellulase beseitigt
werden, erscheint die Oberfläche
des schwarzen Textilerzeugnisses als dunkler und schöner, und
niedrigere L-Werte werden erhalten. Drei verschiedene Dosierungen von
klonierten Zellulasen aus Thielavia terrestris (SEQ ID Nr. 9), Acremonium
sp. CBS 478.94 (SEQ ID Nr. 5) bzw. des Konstrukts 1 (SEQ ID Nr.
2) (als A, B bzw. C bezeichnet) wurden getestet.
-
-
Die
Daten zeigen, dass alle Zellulasen unter den getesteten Bedingungen
eine sehr gute Farbklärung ergeben.
-
I. Anwendung der Endoglucanasen
von Thielavia terrestris, Acremonium sp. und des Konstrukts 1 (SEQ
ID Nr. 2) bei der Denim-Ausrüstung
-
Experimentell
-
- Gerät:
Waschmaschine Wascator FL 120,
- Flüssigkeitsvolumen:
201,
- Stoff: 1,1 kg Denim-Textilerzeugnis, 14 ½ oz 100 % Baumwolle,
- Entschlichten: 10 min, 55 °C,
pH 7, 50 ml Aquazym 120L, 2,5 g/l Phosphatpuffer,
- Abrag: 2 Stunden;
der pH und die Temperatur variierten
gemäß der folgenden
Tabelle:
-
Enzymaktivität pH/Temp.
Puffersystem
-
- SEQ ID
- Nr. 21400 S-CEVU/g 6/55°C
2,5 g/l Phosphatpuffer
- Nr. 9292 S-CEVU/g 5/65°C
1 g/l Citratpuffer
- Nr. 5782 S-CEVU/g 7/45°C
2,5 g/l Phosphatpuffer
- Inaktivierung: 15 min, 80 °C,
1 g/l Natriumcarbonat
- Spülungen:
Drei Spülzyklen
von 5 min in kaltem Leitungswasser
-
Auswertung:
-
Abtragt
Die Remission des Textilerzeugnisses wurde bei 420 nm unter Verwendung
eines Texflash 2000 als ein Maß für den Abtragsspiegel
bestimmt.
-
Die
Ergebnisse der Behandlung des Denim-Textilerzeugnisses mit verschiedenen
erfindungsgemäßen Endoglucanasen
sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
-
Alle
getesteten Zellulasen zeigen eine hervorragende Wirsamkeit bei der
Denim-Ausrüstung, obwohl jedes
Enzym auf seine eigene Weise einzigartig ist. Wenn das Enzym gemäß SEQ ID
Nr. 2 für
die Denim-Ausrüstung
verwendet wird, ist es möglich,
einen hohen Abtragsspiegel mit einem Minimum an Stärkeverlust
zu erreichen. Wenn Denim mit dem Enzym gemäß SEQ ID Nr. 9 behandelt wird,
kann ein sehr starkes Auswaschen erreicht werden, das dem Stoff
ein fast gebleichtes Aussehen verleiht. Die Denim-Ausrüstung mit
dem Enzym, das SEQ ID Nr. 5 entspricht, ergibt einen hohen Abtragsspiegel
bei einem niedrigen Temperaturoptimum, das es ermöglicht,
die Verarbeitungstemperatur zu verringern und Energie zu sparen.
-
J. Verwendung von klonierten
Zellulasen aus Acremonium sp. und Thielavia terrestris für das Biopolishing
von Lyocellfasern
-
Lyocellfasern,
die unter dem Handelsnamen Tencel verkauft werden, werden aus Holzzellstoff-Zellulose
in einem umweltverträglicheren,
wasserbasierten Lösungsmittel
gesponnen, als im Fall der normalen Viskoseherstellung. Allerdings
weisen die Fasern eine Neigung zum Fibrillieren auf, wenn sie zu
Textilien verarbeitet werden, was auf der Oberfläche sichtbar ist und als „Fusseln" bezeichnet wird.
Durch die Verwendung von Zellulasen ist es möglich, die exponierten und
fusseligen Fasern dauerhaft zu beseitigen und das Aussehen des ausgerüsteten Textilerzeugnisses
signifikant zu verbessern, wobei die Behandlung im Allgemeinen als Biopolishing
bekannt ist. Die Endoglucanasen der vorliegenden Erfindung sind
besonders geeignet für
das Entfernen von Oberflächenfasern
von Lyocell.
-
MATERIAL UND
METHODEN
-
Das
Textilsubstrat war entweder 100 % gewobenes oder auf verschiedene
Weisen als Jersey gestricktes dunkelblaues Tencel. Die dunkle Farbe
und die Jersey-Strickart waren bevorzugt, um die sichtbaren Effekte zu
verstärken,
was die Auswirkung erleichterte. Ein gewebtes 70/30-Tencel/Rayon-Gemisch
wurde ebenfalls in geringerem Umfang verwendet.
-
Die
Tests wurden entweder in einem 200-ml-Maßstab unter Verwendung eines
Launder-o-meters
oder in einem 20-l-Maßstab
unter Verwendung eines Wascators durchgeführt. Die Behandlungszeit betrug
60 min bei 55 °C
in dem Wascator und 60 bis 90 min in dem LOM. Der Puffer war 2g/l
Natriumacetat, das mit Essigsäure
auf pH 5 eingestellt war. Das Textilerzeugnis-zu-Flüssigkeit-Verhältnis betrug
1:10, aber in dem Launder-o-meter wurden 20 Stahlbälle mit
einem Durchmesser von 14 mm (jeweils 11 g) verwendet, um einen ausreichenden
mechanischen Abtrag zu erhalten. Dem Biopolishing folgte unmittelbar
die Inaktivierung unter Verwendung von 2 g/l Natriumcarbonat bei
80 °C für 15 min,
gefolgt von Spülen
in kaltem Wasser.
-
Die
Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Fussel-Notenskala von 1–5 ausgewertet,
wobei 1 einem fibrillierten Aussehen des Ausgangsmaterials entspricht
und 5 einem qualitativ hochwertigen Aussehen ohne sichtbare Fasern
auf der Oberfläche
entspricht. Da die Wirksamkeit der Endozellulasen spezifisch für eine Oberflächenbehandlung
ist, beträgt
der Gewichtsverlust unter 2 % und wird deshalb in der Auswertung nicht
eingeschlossen. Zwei Zellulasen wurden bewertet: die aus Acremonium
sp. (SEQ ID Nr. 5) und aus Thiellavia terrestris (SEQ ID Nr. 9)
klonierten Zellulasen.
-
Die
beiden Zellulasen sind fähig,
sowohl Tencel- als auch mit Tencel gemischte Textilerzeugnisse zu entfibrillieren.
Bei der Verwendung einer erfindungsgemäßen Endoglucanase werden nur
kleine Fibrillen anstelle gesamter Fasern entfernt, wie dies der
Fall ist, wenn saure Zellulasegemische aus Trichoderma verwendet
werden. Der Stärkeverlust
des behandelten Textilerzeugnisses wird deshalb bei einem Minimum
gehalten, wenn die erfindungsgemäßen Endoglucanasen
verwendet werden.
-
Die
folgenden Dosierungen ergaben eine überlegene Entfibrillierung,
d. h. die Fusselnote 4 oder höher:
15
S-CEVU/g-Textilerzeugnis an Zellulase aus Acremonium sp (SEQ ID
Nr. 5) und
10 S-CEVU/g-Textilerzeugnis an Zellulase aus Thielavia
terrestris (SEQ ID Nr.9).
-
-
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-
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-
-
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-
REFERENZEN
-
Hintergrund der Erfindung:
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- GB-A-1368599
- EP-A-0 307 564
- EP-A-0 435 876
- WO 91/17243
- WO 91/10732
- WO 91/17244
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-
ANGABEN
ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel 13
bis PCT)
-
ANGABEN
ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel 13
bis PCT)
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bis PCT)
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bis PCT)
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bis PCT)