DE69729780T2

DE69729780T2 - Protein mit Ethylendiamine-N,N'-Dibarnsteinsäure: Ethylendiamin Lyase Aktivität und dafür kodierendes Gen

Info

Publication number: DE69729780T2
Application number: DE69729780T
Authority: DE
Inventors: Wataru Yokohama-shi Mizunashi
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-27
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2017-11-28
Also published as: EP0845536A3; EP0845536A2; JPH10210984A; US6168940B1; EP0845536B1; DE69729780D1; JP3370545B2; TW505695B

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasewirkung und ein Gen, das für dieses Protein kodiert.
Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäuren sind nicht nur als Zwischenprodukte für die Synthese von Medikamenten und landwirtschaftlichen Chemikalien bedeutend, sondern auch einzigartig im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Schwermetalle zu binden. Da man auch davon ausgeht, dass optische Isomere die Möglichkeit haben, gegenüber biologischem Abbau empfindlich zu sein, wenn sie in die natürliche Umgebung freigesetzt wurden, können diese Verbindungen als Geliermittel, Stoff für Detergenzien etc, verwendet werden.
Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäuren können leicht aus verschiedenen Aminen und Malein- oder Fumarsäuren synthetisiert werden. Im Falle optisch aktiver Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäuren werden jedoch optisch aktive Asparaginsäure oder ähnliche als Ausgangsmaterial für die Organosynthese solcher Verbindungen benötigt. Optisch aktive Diaminoethylen-N,N'-diaminosäuren können z. B. aus L-Asparaginsäure und Dibromethan (John A. Neal et al., Inorganic Chem. 7, 2405 (1968)) hergestellt werden. L-Asparaginsäure und Dibromethan sind jedoch relativ teure Rohstoffe und daher kann ein Produkt, das aus diesen Materialien hergestellt wurde, in verschiedenen Bereichen nicht zu niedrigen Kosten geliefert werden.
Andererseits sind Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäuren in Kulturlösungen einiger Actinomyceten (T. Nishikiori et al., J. Antibiotics 37, 426 (1984)) ebenfalls isoliert und identifiziert worden. Die Produktivität dieser Actinomyceten ist jedoch extrem niedrig und deswegen ist ein Verfahren zum Herstellen einer Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäure unter Verwendung eines solchen Bakteriums in der Industrie nicht praktikabel.
Unter diesen Umständen hat der Erfinder zuvor ein neues Verfahren zum effizienten Herstellen optisch aktiver S,S-Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäuren aus Fumar- oder Maleinsäure und verschiedenen Diaminen unter Verwendung einer katalytischen Wirkung von Mikroorganismen vorgeschlagen (japanische nicht geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 9-140390; EP-0731171A; EP-0805211A).
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die katalytische Wirkung der Mikroorganismen weiter zu verbessern.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfinder hat es geschafft, die Ausbeute einer Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäure in Mikroorganismenzellen durch das Klonieren eines Gens für eine Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyase und das Ermöglichen, dass mittels genetischer Rekombination viele Kopien dieses Gens in Zellen eines Mikroorganismus vorhanden sind, verbessert, um dadurch die katalytische Fähigkeit der Mikroorganismen stark zu verbessern. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung erreicht.
Die Erfindung stellt eine DNA zur Verfügung, die eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für ein Polypeptid mit Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseaktivität kodiert, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 hat, welche eine Deletion, Substitution oder Addition mindestens einer Aminosäure haben kann. Die DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für ein Polypeptid mit Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseaktivität kodiert, kann eine DNA sein, die eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des SEQ ID NO: 1 oder deren Analogon kodiert, welcher aus der Degeneriertheit des genetischen Codes stammt. Die Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid kodiert, kann die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 haben.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt stellt die Erfindung eine DNA zur Verfügung, welche mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder einem Fragment davon hybridisiert, und welcher eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid Mit Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseaktivität kodiert. Beispiele des Fragments für die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 schließen ein Fragment von 326 Basen, welche vom Nukleotid Nr. 176 bis zum Nukleotid Nr. 501 in der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 reicht, ein. Die Hybridisierung kann bei 25 bis 40°C durchgeführt werden und bei einer Formamid-Konzentration von 10 bis 50%. Die Waschbedingungen können entsprechend in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Detektionsverfahren bestimmt werden.
Des weiteren stellt die Erfindung auch ein DNA-Fragment von 200 bis 350 Basenpaaren zur Verfügung, welches mit synthetischen DNA's amplifiziert werden kann, welche aus den Nukleotidsequenzen der SEQ NOS: 4 und 5 bestehen. Dieses DNA-Fragment kann zum Erhalten eines Genanalogons des Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegens oder zum Beurteilen, ob ein Gen, das erhalten wurde, identisch mit dem Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegen ist oder nicht, verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch ein rekombinantes Plasmid bereit, welches die DNA enthält, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, welches Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseaktivität aufweist.
Die Erfindung stellt außerdem einen Wirt bereit, der mit dem rekombinanten Plasmid transformiert ist. Der Wirt kann ein Mikroorganismus wie beispielsweise E. coli sein. Der transformierte Wirt kann verwendet werden, um Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäure herzustellen und deswegen stellt die Erfindung auch ein Verfahren zum Herstellen von Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäure unter Verwendung des transformierten Wirts bereit.
Außerdem stellt die Erfindung ein Polypeptid mit Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseaktivität mit Enzymwirkung bereit, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 hat, welche eine Deletion, Substitution oder Addition von mindestens einer Aminosäure haben kann. Die Deletion, Substitution oder Addition kann mit einer wohlbekannten Technik durchgeführt werden, der ortsspezifischen Mutagenese (siehe z. B. Nucleic Acid Research, Band 10, Nr. 20, Seiten 6487–6500, 1982).
Das klonierte Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseagen kann durch genetische Rekombination in mehrfachen Kopien in Mikroorganismenzellen eingeschleust werden. Auf diese Weise ist es möglich, die katalytische Fähigkeit der Mikroorganismen stark zu verbessern, um dadurch die Ausbeute an Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäure zu verbessern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS001.
2 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS002. Plasmid pEDS002 wurde durch das Insertieren eines ungefähr 3,9 kb Fragments, welches durch das Verdauen des Plasmids pEDS001 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI erhalten wurde, in pUC18.
3 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS003. Das Plasmid pEDS003 ist durch das Insertieren eines ungefähr 2,6 kb Fragmentes in pUC18 erhalten worden, welches durch das Verdauen des Plasmids pEDS001 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI erhalten wurde.
4 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS020. Das Plasmid pEDS020 ist durch das Insertieren eines ungefähr 2,6 kb Fragmentes in pUC18 erhalten worden, welches durch das Verdauen des Plasmids pEDS003 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI erhalten wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Nachfolgend wird die Erfindung detailliert beschrieben.
Das "Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyase" so wie es hier verwendet wird, ist ein generischer Begriff für eine Gruppe an Enzymen, die die Fähigkeit haben, umkehrbar Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure aus Fumarsäure und Ethylendiamin herzustellen. Dieses Enzym kann jedoch Ethylendiamin-N,N'-monobernsteinsäure in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen herstellen. Außerdem weist dieses Enzym auch eine Reaktivität mit den Diaminen auf, die nicht Ethylendiamin sind, um die entsprechenden Diaminoalkylen- N,N'-dibernsteinsäuren herzustellen. Die Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäuren, die so hergestellt werden, sind optisch aktive Verbindungen in vielen Fällen, aber einige Enzyme dieser Gruppe stellen razemische Verbindungen her.
Eine Gruppe an Enzymen, die eine solche Reaktivität aufweisen, sind in den Bakterien gefunden worden, die zu der menge an Genera gehören, die von der natürlichen Welt abgetrennt wurden und durch den Erfinder und die Mitarbeiter identifiziert wurden. Diese Bakterien sind in der japanischen nicht geprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-140390 (entsprechend EP-0731171A, EP-0805211A) supra offenbart.
Die Erfindung betrifft ein Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegen, das aus Brevundimonas sp. TN-3 stammt, das in EP-0805211A offenbart ist.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird unten beschrieben. In den folgenden Schritten können jegliche geeignete Techniken und Materialien, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden.
(1) Herstellung chromosomaler DNA aus dem Stamm TN-3
Chromosomale DNA wird separiert und aus dem Stamm TN-3 hergestellt.
(2) Herstellung eines gereinigten Enzyms
Das Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseprotein wird aus dem Stamm TN-3 gereinigt.
(3) Analyse der Aminosäuresequenz des N-Terminus und eines inneren Peptids des gereinigten Enzyms
Für das gereinigte Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseprotein werden die Aminosäuresequenzen des N-Terminus und eines inneren Peptids analysiert.
(4) Herstellung einer Sonde
Von den Aminosäuresequenzen des N-Terminus und des inneren Peptids werden zwei Nukleotidsequenzen abgeleitet und zwei synthetische DNAs werden hergestellt. Diese synthetischen DNAs werden als Primer verwendet, um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der chromosomalen DNA aus Stamm TN-3 als Matrize durchzuführen. Als Ergebnis wird ein Teil des Enzymgens amplifiziert, um ein DNA-Fragment herzustellen.
(5) Herstellung einer DNA-Bibliothek
Die chromosomale DNA wird mit Restriktionsenzymen verdaut und dann werden die erhaltenen Fragmente in den Plasmidvektor pUC18 inseriert, um eine Bibliothek herzustellen.
(6) Herstellung von E. coli Transformanten und Selektion einer rekombinanten DNA
E. coli Transformanten werden mit der DNA-Bibliothek aus Schritt (5) oben hergestellt. Dann wird eine Transformante, die eine rekombinante DNA Interesse enthält, durch Kolonienhybridisierung unter Verwendung des DNA-Fragments aus Schritt (4) oben als Sonde ausgewählt.
(7) Herstellung eines rekombinanten Plasmids
Ein Plasmid wird von der Transformante, die in Schritt (6) ausgewählt wurde, hergestellt.
(8) Herstellung einer Restriktionskarte und Identifizierung der Enzymgenregion
Von dem rekombinanten Plasmid aus Schritt (7) oben, wird eine Restriktionskarte hergestellt und eine Region, mit der die Sonde hybridisiert wird, spezifiziert.
(9) Bestimmung der Nukleotidsequenzen
Die Nukleotidsequenzen der Regionen um die Regionen, die im Schritt (8) identifiziert wurden, werden bestimmt.
(10) Herstellung von Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure
Eine Region, die das Enzymgen enthält, wird aus dem rekombinanten Plasmid aus Schritt (7) oben ausgeschnitten und in den Vektor pUC119 für E. coli inseriert. Das erhaltene rekombinante Plasmid wird in E. coli Stamm JM109 eingeschleust, und dieser transformierte E. coli wird in einem geeigneten Medium unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert. Zellen werden aus der erhaltenen Kulturlösung abgetrennt, und verwendet, um eine Reaktion aus Fumarsäure und Ethylendiamin als Ausgangsmaterialien durchzuführen. Das Produkt, Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure, das hergestellt wird, wird isoliert/gereinigt.
Stamm TN-3 ist am National Institute of Bioscience and Humantechnology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5886 unter der Bezeichnung Brevundimonas sp. TN-3 hinterlegt worden. Seine bakteriologischen Eigenschaften sind wie folgt.
Bakteriologische Eigenschaften des Stamms TN-3

Morphologie: Bacillus
Gramfärbung: –
Sporen: –
Mobilität: +
Flagellen: polare Flagellierung
Sauerstoffabhängigkeit: aerob
Oxidase: +
Katalase: +
OF-Test: –
Farbton der Kolonien: kein kennzeichnendes Pigment wird erzeugt.
Herstellung von fluoreszierendem Pigment: –
Anhäufung von PHB: +
Auxotrophie: vorhanden
Chinonsystem: Q-10
Reduzierung von Nitraten: +
Produktion von Indol: –
Arginindihydrolase: –
Harnstoffabbau: –
Esculinabbau: –
Gelatineverflüssigung: –
PNPG: –
Assimilierung:
Glucose –
L. Arabinose –
D-Mannose –
D-Mannitol –
N-Acetyl-D-glucosamin –
Maltose –
Kaliumgluconat +
n-Caprylsäure –
Adipinsäure +
d1-Maleinsäure +
Zitronensäure +
Phenylacetat –

Nachfolgend wird die Erfindung in genaueren Details mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Der Erfindungsbereich ist jedoch nicht durch diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1
(1) Herstellung chromosomaler DNA aus dem Stamm TN-3 Der Stamm TN-3 wurde unter Schütteln in 100 ml eines EDDS-Mediums [0,2% Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure, 0,2% Glucose, 0,1% Bacto-Hefeextrakt, 0,05% Polypepton, 0,1% MgSO₄·7H₂O, 2,5% (V/V) Phosphatpuffer (1 M, pH 7,0), einer 0,5% (V/V) Lösung einer Metallsalzmischung (enthaltend 56 g NaSO₄, 8 g MgCl₂·6H₂O, 0,8 g CaCl₂, 0,6 g MgSO₄·4H₂O, 0,12 g FeCl₃·6H₂O und 0,06 g ZnSO₄ je 100 ml)] bei 30°C für 4 Tage kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet und in 4 ml einer Kochsalz-EDTR-Lösung suspendiert (0,1 M EDTA, 15 M NaCl, pH 8,0), gefolgt von der Zugabe von 8 mg Lysozym. Die erhaltene Suspension wurde bei 37°C für eine Stunde geschüttelt und dann eingefroren. Anschließend wurden 10 ml einer Tris-SDS-Lösung (1% SDS, 0,1 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 9,0) vorsichtig unter Schütteln hinzugegeben. Des weiteren wurde ProteinaseK (Merck) hinzugegeben (die Endkonzentration: 1 mg) und für eine Stunde bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurde ein gleiches Volumen an TE-gesättigtem Phenol (TE-10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) zu der Lösung hinzugegeben und gerührt. Dann wurde die erhaltene Lösung zentrifugiert, um die obere Schicht abzunehmen, zu der 2 Volumina Ethanol hinzugegeben wurden. DNA wurde entlang eines Glasstabes aufgewickelt, und das Phenol wurde hiervon durch Waschen mit 80% und 70% Ethanol jeweils entfernt.
Anschließend wurde die DNA in 3 ml TE-Puffer gelöst, zu dem Ribonuklease A-Lösung (hitzebehandelt bei 100°C für 15 Minuten) hinzugegeben, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu ergeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten geschüttelt. Proteinase K wurde weiter zu der Lösung hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten geschüttelt. Dann wurde ein gleiches Volumen an TE-gesättigtem Phenol hier hinzugegeben und zentrifugiert, um dadurch die Lösung in eine obere und eine untere Schicht zu trennen. Das gleiche Verfahren wurde zweimal mit der oberen Schicht wiederholt. Dann wurde das gleiche Volumen einer Chloroformlösung (enthaltend 4% Isoamylalkohol) hinzugegeben, und die gleiche Extraktionsoperation wurde wiederholt (nachfolgend werden diese Verfahren als "Phenolbehandlung" bezeichnet). Danach wurden 2 Volumina Ethanol zur oberen Schicht hinzugegeben, um die DNA durch das Aufwickeln um einen Glasstab zu gewinnen. Auf diese Weise wurde eine chromosomale DNA-Probe erhalten.
(2) Herstellung eines gereinigten Enzyms
Stamm TN-3 wurde unter Schütteln in 2 l eines EDDS-Medium bei 30°C für 4 Tage kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet, in 100 ml eines 10 mM Natriumphosphatpuffers (pH 8,0, enthaltend 1 mM Dithiothreitol) suspendiert und mit einem Ultraschallzerstäuber dispergiert, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 12.000 Upm für 20 Minuten. Zu dem erhaltenen Überstand wurde Ammoniumsulfat hinzugegeben, um eine 30%ige Sättigung zu ergeben, und es wurde für 30 Minuten bei 4°C unberührt gelassen, gefolgt von einer Zentrifugation. Zu dem erhaltenen Überstand wurde Ammoniumsulfat hinzugegeben, um eine 60%ige Sättigung zu ergeben, und für 30 Minuten bei 4°C unberührt stehengelassen, gefolgt von einer Zentrifugierung. Das erhaltene Präzipitat wurde in 10 ml eines 10 mM Natriumphosphatpuffers (pH 8,0, enthaltend 1 mM Dithiothreitol) gelöst, um eine Lösung eines teilgereinigten Enzyms zu ergeben. Diese teilweise gereinigte Enzymlösung wurde weiter durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Kurz gesagt, wurde die Enzymlösung auf eine Säule (Ø 10 mm × 20 cm), welche mit DEAE-Sephacryl (Pharmacia) bepackt war und die mit einem 10 mM Natriumphosphatpuffer äquilibriert war (pH 8,0), enthaltend 1 mM Dithiothreitol, aufgetragen, um eine Adsorption zu erlauben. Nachdem die Säule mit 40 ml des gleichen Puffers gewaschen wurde, wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,6 M KCl eluiert, um in 2 ml Fraktionen zu fraktionieren. Die Fraktionen, die Enzymaktivität aufwiesen, wurden gesammelt, um eine Lösung des gereinigten Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyaseaktivität zu erhalten. Wenn diese Lösung mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert wurde, wurde eine fast homogene Einzelbande von ungefähr 60.000 im Molekulargewicht nachgewiesen.
(3) Analyse der Aminosäuresequenzen des N-Terminus und des inneren Peptids des gereinigten Enzyms
Das gereinigte Enzym, das in Schritt (2) erhalten wurde, wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese direkt oder nach Trypsinverdau unterzogen, um hierdurch Polypeptide zu fraktionieren. Die fraktionierten Polypeptide wurden auf eine PVDF-Membran (Immobilon Psq; Millipore) elektrogeblottet. Die geblottete Membran wurde mit Coomassie Brillant Blue gefärbt. Die gefärbte Bande wurde ausgeschnitten und einer Aminosäuresequenzanalyse unterworfen. Die Analyse der Aminosäure wurde mit einem Shimadzu PSQ-1 Aminosäure-Analysegerät durchgeführt. Die Ergebnisse werden unten gezeigt.

a) N-terminale Aminosäuresequenz des nicht behandelten Enzyms: (Molekulargewicht: ungefähr 60.000) (Met-)Thr-Pro-His-Asn-Pro-Asp-Ala
b) Teilverdau nach Trypsinverdau: (Molekulargewicht ungefähr 50.000) Glu-Ile-Gly-Ser-Val-Gly-Lys-Met-Glu-Ile-Gly-Arg-Xaa-Ala-Asn-Asp-Leu-Arg-Asn-Arg
c) Teilverdau nach Trypsinverdau: (Molekulargewicht: 10.000) Ala-Ser-Gly-Ala-Lys-Ala-Pro-Glu-Phe-Gln-Glu-Leu-Tyr-Asp-Phe-G1u-A1a-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Leu

(Die Molekulargewichte der fraktionierten Peptide werden in Klammern gezeigt. "XAA" stellt eine Aminosäure dar, die nicht in der Analyse identifiziert werden konnte.)
(4) Herstellung der Sonde
Auf der Grundlage der Aminosäuresequenzinformation aus Schritt (3) oben wurden entsprechende synthetische DNAs der SEQ ID NOS: 4 und 5 hergestellt als Primer #1 und #2. Eine PCR wurde mit diesen Primern unter Verwendung chromosomaler DNA des Stammes TN-3 aus Schritt (1) als Matrize durchgeführt.
Kurz gefasst, wurden 1 μl der TN-3 chromosomalen DNA, 10 μl eines 10× Reaktionspuffers, 4 μl 10 mM dNTP, 1 μl (äquivalent 100 pmol) jedes der Primer #1 und #2 und 1 μl von ExTaq (Takara Shuzo) gemischt, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu ergeben. Diese Lösung wurde nacheinander bei 95°C für 30 Sekunden (Denaturierungsschritt), bei 55°C für 30 Sekunden (Anlagerungsschritt) und bei 72°C für 2 Minuten (Verlängerungsschritt) in 30 Zyklen inkubiert. Nach der Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung einer Chloroformextraktion (3mal) und einer Ethanolpräzipitierung unterzogen, um die amplifizierte DNA zu gewinnen. Diese DNA wurde mit einer 1,0%igen Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, um ein DNA-Fragment von ungefähr 300 Basenpaaren zu erhalten, von dem vermutet wird, dass es das Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegen des Stamms TN-3 kodiert. Das DNA-Fragment, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde mit dem DIG DNA Labeling Kit markiert (Boehringer Mannheim K. K.), um eine Sonde herzustellen.
(5) Herstellung einer DNA-Bibliothek
Zu 10 μl der chromosomalen TN-3-DNA wurden 5 μl eines 10× Restriktionsenzyms-Reaktionspuffers, 33 μl sterilisiertes Wasser, 2 μl Restriktionsenzym KpnI hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 16 Stunden bei 37°C umgesetzt. Anschließend wurde die DNA mittels Ethanolpräzipitierung und Agarosegelelektrophorese gewonnen. DNA-Fragmente mit Größen, die von 6,5 kb bis 5,5 kb reichen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit DNA PREP (DIA-IATRON) gewonnen. Diese DNA-Fragmente wurden in die KpnI-Stelle des Vektors pUC18 für E. coli unter Verwendung eines Ligationskits zum Herstellen einer rekombinanten DNA-Bibliothek inseriert.
Das pUC18-Fragment, das in der obigen Ligierung verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt. Zu 2 μl einer Ausgangslösung pUC18 wurden 5 μl eines 10× Restriktionsenzympuffers, 40 μl sterilisiertes Wasser und 3 μl Restriktionsenzym KpnI hinzugegeben und das Gemisch wurde bei 37°C für 2 Stunden umgesetzt. Dann, nach Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNA getrocknet und in 50 μl sterilisiertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde 1 μl alkalische Phosphatase (Takara Shuzo), 10 μl eines 10× Puffers und 39 μl sterilisiertes Wasser hinzugegeben und das Gemisch wurde bei 65°C umgesetzt. Dann wurde eine Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation durchgeführt. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden getrocknet und in sterilisiertem Wasser gelöst.
(6) Herstellung einer E. coli Transformante und Selektion rekombinanter DNA
E. coli Stamm JM109 wurde in 1 ml LB-Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,5% NaCl) inokuliert und bei 37°C für 5 Stunden unter aeroben Bedingungen präkultiviert. 100 ml dieser Kultur wurden zu 40 ml SOB-Medium gegeben (2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM MgCl₂) und für 20 Stunden bei 18°C kultiviert. Diese Kultur wurde zentrifugiert, um Zellen zu ernten. Dann wurden 13 ml einer kalten TF-Lösung [20 mM PIPES-KOH (pH 6,0), 200 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 40 mM MnCl₂] zu den Zellen hinzugegeben und das Gemisch wurde bei 0°C für 10 Minuten stehengelassen. Danach wurde das Gemisch erneut zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden die präzipitierten E. coli-Zellen in 3,2 ml einer kalten TF-Lösung suspendiert, zu der 0,22 ml Dimethylsulfoxid hinzugegeben wurden. Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten bei 0°C stehengelassen. Zu 200 μl der so hergestellten kompetenten Zellen wurden 10 μl der das rekombinante Plasmid-haltigen Lösung (DNA-Bibliothek), welche im Schritt (5) hergestellt wurde, hinzugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde bei 0°C für 30 Minuten stehengelassen. Dann wurde dem Gemisch ein Hitzeschock von 42°C für 30 Sekunden gegeben, und das Gemisch wurde für 2 Minuten auf 0°C abgekühlt. 1 ml eines SOC-Mediums (20 mM Glucose, 2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM MgCl₂) wurden hinzugegeben, und die Zellen wurden unter Schütteln bei 37°C für eine Stunde kultiviert. Diese Kultur wurde in 200 Aliquots in einem LB-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin ausgesät und bei 37°C kultiviert. Die transformierten Kolonien, die sich auf dem Agarmedium gebildet hatten, wurden mittels Kolonie-Hybridisierung untersucht, um die Transformanten herauszuwählen, die das Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegen enthalten. Kurz gesagt, wurden Transformanten, die sich auf dem Agarmedium gebildet hatten, auf eine Nylonmembran transferiert (BIODYNE A: Pall Biosupport). Die DNA wurde auf die Membran durch das Lysieren von Zellen fixiert und mit der Probe (von ungefähr 300 Bp) aus Schritt (4) oben hybridisiert. Dann wurden Kolonien, die die rekombinante DNA von Interesse enthielten, unter Verwendung des DIG-Lumineszenz-Detektionskits (Boehringer Mannheim K. K.) ausgewählt.
(7) Herstellung eines rekombinanten Plasmids
Die In Schritt (6) oben ausgewählte Transformante wurde in 100 ml LB-Medium bei 37°C über Nacht kultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Zu den Zellen wurden 5 ml einer Lösung I [2 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)] und 25 mg an Lysozym hinzugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde bei 0°C für 30 Minuten stehengelassen. Dann wurden 10 ml einer Lösung II (1 N NaOH, 5% SDS) hinzugegeben und das Gemisch wurde für 5 Minuten bei 0°C stehengelassen. Danach wurden 7,5 ml der Lösung III [3 m Natriumacetat (pH 8,4)] hinzugegeben und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 0°C stehengelassen. Dieses Gemisch wurde zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten, zu dem 50 ml Ethanol gegeben wurden. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde verworfen. Zu dem Rest wurden 5 ml einer Lösung IV [10 mM Natriumacetat, 50 mM Tris-HCl (ph 8,0)] und 2,5 μl Ribonukleaselösung A (10 mg/ml) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehengelassen. Dann wurden 12 ml Ethanol hierzu gegeben. Das Plasmid wurde durch Zentrifugieren gewonnen, mit 70% Ethanol gespült, getrocknet und in 0,4 ml sterilisiertem Wasser gelöst. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pEDS001 bezeichnet.
(8) Herstellung der Restriktionskarte und Identifizierung der Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegenregion
Plasmid pEDS001 aus Schritt (7) oben wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, um eine Restriktionskarte herzustellen (1). Außerdem wurde eine Subklonierung auf konventionelle Weise durchgeführt. Kurz gesagt, wurde pEDS001 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut. Die erhaltenen Fragmente wurden in pUC18 ligiert, welche mit den gleichen Enzymen verdaut worden sind. E. coli Stamm JM109 wurde mit der Ligationslösung transformiert, um ein Plasmid hervorzubringen, welches ein ungefähr 3,9 kb Insert trägt (pEDS002) (2) und ein Plasmid mit einer ungefähr 2,6 kb Insertion (pEDS003) (3). Jedes dieser Plasmide wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI, SacI, SacII, etc. verdaut, und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Ein Fragment, mit dem die hybridisiert wurde, wurde durch Southern Hybridisierung selektioniert.
(9) Bestimmung der Nukleotidsequenzen
Nukleotidsequenzen der Region um die Region, die in Schritt (8) identifiziert wurde, wurden mit einem Pharmacia Fluoreszenzsequenzgerät, ALFII bestimmt. Als Ergebnis wurde die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 erhalten, und ein offenes Leseraster mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 wurde hierin gefunden. Die Suche unter Verwendung der Aminosäuresequenzdatenbank NBRF (National Biomedical Research Foundation) zeigte, dass dieses Gen 20 bis 30 o Homologie zu Delta-Kristallingen oder Argininosuccinatlyasegen hat. Diese beiden Enzyme sind dafür bekannt, dass sie eine Aktivität haben, die Kondensierungs- und Zersetzungsreaktion von Fumarsäure und eines Amins (Aminosäure) haben. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserasters ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt.
Beispiel 2
Zu 2 μl des rekombinanten Plasmids pEDS003 aus Schritt (7) in Beispiel 1, welches das Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegen enthält, wurden 2 μl eines 10× eines Restriktionsenzympuffers, 15 μl sterilisiertes Wasser und 1 μl Restriktionsenzym KpnI hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 2 Stunden bei 37°C umgesetzt. Das Plasmid wurde durch Ethanol-Präzipitierung gewonnen und getrocknet. Dann wurden 17 μl sterilisiertes Wasser, 2 μl eines 10× Restriktionsenzympuffers und 1 μl des Restriktionsenzyms BamHI hierzu gegeben und das Gemisch wurde für 2 Stunden bei 37°C umgesetzt. Aus dieser Reaktionslösung wurde ein ungefähr 2,6 kB-Fragment durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt und in den Vektor pUC119 für E. coli inseriert. Unter Verwendung dieser Ligationslösung wurde der E. coli Stamm JM109 transformiert, um ein Plasmid von Interesse hervorzubringen. Das so hergestellte Plasmid wurde als pEDS020 bezeichnet und die Transformanten als JM109/pEDS020.
Der Transformant JM109/pEDS020 wurde in 1 ml LB-Medium, enthaltend 50 mg/l Ampicillin, inokuliert und bei 37°C für 8 Stunden unter Schütteln kultiviert. Dann wurden die Zellen in 40 ml LB-Medium kultiviert (enthaltend 50 mg/l Ampicillin und 1 mM Isopropyl-β-thioglactosid) bei 37°C für 30 Stunden. Die erhaltene Kultur wurde mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen und dann in 2 ml des gleichen Puffers suspendiert. Ein Aliquot der erhaltenen Zellsuspension wurde in 50 ml einer wässrigen Lösung (pH 8,0), enthaltend 342 mM Fumarsäure und 171 mM Ethylendiamin suspendiert und die Suspension wurde für 24 Stunden umgesetzt. Nachdem die Zellen aus der Reaktionslösung mittels Zentrifugation entfernt worden waren, wurde das Vorhandensein von Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure mittels HPLC [WAKOSIL 5C8 von Wako Pure Chemical Industries (Elutionsmittel: 50 mM Phosphorsäurelösung, enthaltend 10 mM Tetra-n-butylammoniumhydroxid und 0,4 mM CuSO₄, pH 2)] bestimmt. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass 50 mM S,S-Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure produziert wurden.
Plasmid pEDS020 (4), enthaltend das Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure:Ethylendiaminlyasegen, ist am National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM BP-6161, als sich in der Transformant E. coli JM109/pEDS020 befindend, hinterlegt worden.
Nachdem die allgemeine Art und die spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurden, wird der richtige erfindungsgemäße Bereich nun insbesondere durch die anhängenden Ansprüche dargestellt.
SEQUENZLISTE

Claims

DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon, hybridisierend bei einer Temperatur von 25 bis 40°C und einer Formamidkonzentration von 10 bis 50% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 und codierend für ein Polypeptid mit einer Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure/Ethylendiaminlyaseaktivität, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist, die eine Deletion, Substitution oder Addition von mindestens einer Aminosäure aufweisen kann.
DNA gemäss Anspruch 1, worin die DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid mit einer Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure/Ethylendiaminlyaseaktivität, eine DNA ist, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1, oder ihr Analog, abgeleitet von der Degeneration der genetisches Codes.
DNA gemäss Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz, codierend für das Polypeptid, die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist.
DNA-Fragment mit 200 bis 350 Bp, codierend für ein Polypeptid mit einer Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure/Ethylendiaminlyaseaktivität, amplifizierbar mit synthetischen DNAs, bestehend aus den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 4 bzw. 5.
Rekombinantes Plasmid, enthaltend die DNA gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4.
Wirt, transformiert mit dem rekombinanten Plasmid gemäss Ansprach 5.
Transformierter Wirt gemäss Anspruch 6, bei dem es sich um einen Mikroorganismus handelt.
Verfahren zur Erzeugung von Diaminoalkylen-N,N'-dibernsteinsäure unter Verwendung des transformierten Wirts gemäss Anspruch 6 oder 7.
Polypeptid mit einer Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure/Ethylendiaminlyaseaktivität, das die Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 1 aufweist, die eine Deletion, Substitution oder Addition von mindestens einer Aminosäure aufweisen kann, worin das Polypeptid durch die Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 1 codiert wird.