DE69631540T2

DE69631540T2 - Materialien und methoden mit bezug zur identifizierung und sequenzierung des krebs-suszeptilitaetsgens brca2 und dessen anwendungen

Info

Publication number: DE69631540T2
Application number: DE69631540T
Authority: DE
Inventors: Phillip Andrew Futreal; Richard Francis Tadworth WOOSTER; Alan Ashworth; Rudolf Michael STRATTON
Original assignee: University of Durham; Cancer Research Technology Ltd; Duke University
Current assignee: University of Durham; Cancer Research Technology Ltd; Duke University
Priority date: 1995-11-23
Filing date: 1996-11-25
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2016-11-26
Also published as: AU707636B2; ATE259378T1; AU707636C; EP0858467B1; DE69631540D1; DK0858467T3; EP0858467A1; WO1997019110A1; AU7635096A; JP2001507563A; CA2238010A1; ES2217328T3; US6045997A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Sequenzierung des BRCA2-Krebs-Anfälligkeitsgens sowie Materialien und Verfahren, die aus diesen Erkenntnissen abgeleitet sind. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die für BRCA2-Polypeptide kodieren, und Allele des BRCA2-Gens, einschließlich solcher mit Mutationen, die mit einer Prädisposition zur Entwicklung von Krebs, insbesondere Brust- und Eierstockkrebs, zusammenhängen, und Polypeptide, für welche diese Nucleinsäure kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verwendungen solch einer BRCA2-Nucleinsäure und solcher BRCA2-Polypeptide, insbesondere bei der diagnostischen, prognostischen oder therapeutischen Behandlung von Krebs.
Hintergrund der Erfindung
Im Laufe ihres Lebens leidet etwa jede 12. Frau einmal an Brustkrebs. Während die meisten dieser Krebsarten als sporadisch betrachtet werden, ist ein Teil der Brustkrebsfälle, der oft mit 5 % angegeben wird, auf eine Prädisposition für die Krankheit zurückzuführen, die als hochpenetrantes autosomales dominantes Merkmal übertragen wird. Dies manifestiert sich üblicherweise in häufigem Auftreten von früh ausbrechendem Brustkrebs innerhalb einer Familie, der häufig auch mit Krebsbefall anderer Organe, vor allem des Eierstocks, zusammenhängt.
Es ist bekannt, dass Anomalien verschiedener Gene Anfälligkeit für Brustkrebs verursachen. Das BRCA1-Gen befindet sich auf dem Chromosom 17q21 (1). BRCA1 kodiert für ein 1863-aa-Protein, das eine RING-Fingerdomäne enthält und wenig andere Homologie zu vorher charakterisierten Proteinen aufweist (3). Keimbahnmutationen von BRCA1 führen normalerweise zu einer Trunkierung oder Abwesenheit des Proteins und somit vermutlich zu einer Inaktivierung einer oder mehrerer seiner entscheidenden Funktionen. BRCA1 ist in etwa einem Drittel der Familien mit ortsspezifischem Brustkrebs die Ursache. Ein kleiner Anteil von familienspezifischen Brustkrebsfällen sind auf Keimbahnmutationen im p53-Gen zurückzuführen, und seltene Ansammlungen von Brustkrebs bei Männern (4) sind Mutationen im Androgenrezeptor zuzuschreiben. Arbeiten in Zusammenhang mit dem BRCA1-Gen, Verfahren zur seiner Isolation und Anwendungen der BRCA1-Nucleinsäure und -Polypeptide sind in der EP-A-0705902 offenbart.
An Familien mit mehreren Fällen von früh ausbrechendem Brustkrebs, die keine Anzeichen für Verbindung mit BRCA1 zeigen, konnten die Erfinder vor kurzem die Existenz einer zweiten wichtigen Brustkrebs-Anfälligkeitsstelle, BRCA2, auf dem Chromosom 13q12-q13 nachweisen (5). Vorläufige Untersuchungen weisen darauf hin, dass Mutationen in BRCA2 ein ähnliches Brustkrebsrisiko mit sich bringen wie in BRCA1. Das Risiko für Eierstockkrebs scheint jedoch geringer zu sein und das Risiko von Brustkrebs bei Männern bedeutend höher. Zusammen sind BRCA1 und BRCA2 in drei Viertel der Familien mit häufigen früh ausbrechenden Brustkrebsfällen die Ursache und in fast allen Familien mit sowohl Brust- als auch Eierstockkrebs.
Berman et al. (Cancer Research 56, 3409-3414 (1996)) wurde nach den zwei frühesten Prioritätsdaten veröffentlicht und identifiziert eine 1-bp-Deletion am Nucleotid 6174 des BRCA2-Gens.
Die EP 0 785 216 A (Myriad Genetics, Inc.) ist nach Art. 54(3) EPÜ für den gegenständlichen Fall zitierbar, gilt aber nicht für die zwei frühesten Prioritätsdaten, und offenbart das BRCA2-Gen und mutierte Allele davon.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz gesagt basiert die in dieser Anmeldung beschriebene Arbeit auf der Identifizierung des BRCA2-Gens und der Offenbarung ihrer Sequenz und der Aminosäuresequenz der entsprechenden BRCA2-Polypeptide. BRCA2-Allele, einschließlich jener mit Mutationen in der normalen Sequenz, sind ebenfalls offenbart.
Die Erfinder haben zuerst einen Anteil von Exon 16 des BRCA2-Gens gefunden und dieses zur Sequenzierung von etwa 10 % der kodierenden Sequenz verwendet. Die BRCA2-cDNA-Sequenz, die diesem Abschnitt des BRCA2-Gens entspricht, ist in 1 zu sehen, die genomische Sequenz der Introns und Exons, die anfangs von den Erfindern sequenziert wurden, ist in 2 zu sehen, während die translatierte Proteinsequenz in 3 zu sehen ist.
In weiteren Arbeiten isolierten die Erfinder unter Verwendung dieser Sequenz und anderer bekannter Verfahren etwa 75 % der für BRC2 kodierenden Sequenz. Das zeigt sich in der cDNA-Sequenz aus 4, wobei die entsprechende translatierte Aminosäuresequenz in 5 zu sehen ist. Außerdem identifizierten die Erfinder zu diesem Zeitpunkt 6 Mutationen im BRCA2-Gen, vor allem eine Mutation an 6174delT, durch die Analyse des Stammbaums von jüdischen aschkenasischen Familien aus Montreal.
Die volle BRCA2-Sequenz, welche die Intron- und Exonstruktur zeigt, ist in 7 zu sehen, wobei die Promotorregion des BRCA2-Orts in 6 dargestellt ist. Primer, die zur Amplifizierung der BRCA2-Sequenz geeignet sind, sind in 8 zu sehen und wurden am 12. 3. 1996 in Nature of Genetics 12, 333–337 (1996), veröffentlicht.
Nach der anfänglichen Sequenzierung des oben beschriebenen BRCA2-Gens und unter Verwendung der in 1 bis 3 enthaltenen Informationen können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung unter Verwendung der im Folgenden im Detail beschriebenen Verfahren leicht die Sequenz des BRCA2-Gens in voller Länge zusammenstellen, die in der Internet-Sequenz enthalten ist.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das aus der in 1 oder 2 dargelegten für Nucleinsäure kodierenden Sequenz oder Allelen davon besteht.
Diese Nucleinsäure kann verwendet werden, um die Sequenz des BRCA2-Gens in voller Länge zu erhalten. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Nucleinsäuremolekül bereit, das aus der kodierenden Sequenz voller Länge oder dem vollständigen BRCA2-Gen besteht, wie durch folgende Schritte erhältlich:

(a) Verwendung der in 1 oder 2 gezeigten Nucleinsäuresequenzen zur Konstruktion von Sonden zum Screenen von cDNA oder genomischen Bibliotheken, Sequenzieren der erhaltenen positiven Klone und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen;
(b) Verwendung der in 1 oder 2 gezeigten Sequenzen, um Oligonucleotide zum Primen von BRCA2-Nucleinsäurefragmenten zu erhalten, wobei diese Oligonucleotide in Verbindung mit Oligonucleotiden verwendet werden, die zum Primen aus einem Klonierungsvektor bestimmt sind, um durch PCR Nucleinsäurefragmente in einer Bibliothek zu amplifizieren, die Fragmente der BRCA2-Sequenz enthält, Sequenzieren der amplifizierten Fragmente, um die BRCA2-Sequenz zwischen bekannten Teilen der Sequenz und des Klonierungsvektors zu erhalten, und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus den so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen; und/oder
(c) Einsatz rascher Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) durch Synthetisieren von cDNAs aus einer Anzahl verschiedener Gewebe-RNAs, wobei die cDNAs an einen Oligonucleotid-Linker ligiert sind, und Amplifizieren durch PCR der BRCA2-cDNAs unter Verwendung eines Primers, der ausgehend von der BRCA2-cDNA-Sequenz aus 1 primt, und eines zweiten Primers, der ausgehend von dem Oligonucleotid-Linker primt, Sequenzieren der amplifizierten Nucleinsäure und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus den so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das aus der in 4 dargelegten Nucleinsäuresequenz oder Allelen davon besteht. Die Nucleinsäure aus 4 kann auf dieselbe Weise verwendet werden wie die in 1 und 2 dargelegte Nucleinsäure, um die kodierende Sequenz des BRCA2-Gens voller Länge zu erhalten.
Die in den 1, 2 und 4 dargelegten Sequenzen scheinen eine seltene alternative Spleißung von BRCA2 sein, welche die Nucleinsäure am 3'-Ende von Exon 16 umfasst, das für zusätzliche 8 Aminosäuren kodiert (ALCDVKAT). Die Sequenz aus 7 zeigt die wahrscheinlich normale Aminosäuresequenz des BRCA2-Polypeptids an dieser Position. Die Gegenwart der alternativen Spleißung hat jedoch keinerlei Wirkung auf die oben dargelegte Vorgehensweise zum Isolieren des BRCA2-Gens voller Länge unter Verwendung der 10-%- und 75-%-Sequenzen, die von den Erfindern zu Beginn isoliert wurden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die für ein BRCA2-Polypeptid kodiert, einschließlich der in 3 oder 5 dargelegten Aminosäuresequenz.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die für ein Fragment oder einen aktiven Abschnitt eines BRCA2-Polypeptids kodiert, einschließlich der in 3 oder 5 dargelegten Aminosäuresequenz.
In weiteren Aspekten umfasst die vorliegende Erfindung replizierbare Vektoren, welche die obige Nucleinsäure umfassen und operabel mit Kontrollsequenzen verbunden sind, um ihre Expression zu steuern, Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind, und Verfahren zur Herstellung eines BRCA2-Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszellen und Gewinnen des produzierten Polypeptids.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die obigen Nucleinsäuremoleküle zur Verwendung bei medizinischen Behandlungsverfahren, vor allem der Diagnose und Therapie von Krebs, bereit. Auch die Verwendung der obigen Nuclein säuremoleküle bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs ist hierin eingeschlossen. Dieser Punkt wird weiter unten genauer erläutert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Substanzen bereit, die Polypeptide umfassen, für welche die obige Nucleinsäure kodiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Anfälligkeit oder Prädisposition für Brustkrebs bei Frauen, Brustkrebs bei Männern, Eierstockkrebs oder Prostatakrebs bei einem Patienten durch Analysieren einer Probe vom Patienten auf das BRCA2-Gen oder das Polypeptid, für das es kodiert, bereit. Dieses könnte beispielsweise folgende Schritte umfassen:

(a) Vergleichen der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls in der Probe mit der BRCA2-Nucleinsäuresequenz, wie in 1, 2 oder 4 dargelegt, um zu bestimmen, ob das Nucleinsäuremolekül in der Probe eine oder mehrere Mutationen enthält; oder
(b) Ermitteln der Gegenwart des Polypeptids, für das das BRCA2-Gen kodiert und das die in 3 oder 5 dargelegte Teilsequenz umfasst, in der Probe und, sofern vorhanden, Ermitteln, ob das Polypeptid ein Polypeptid voller Länge ist und/oder mutiert ist; oder
(c) den Einsatz von PCR unter Beteiligung eines oder mehrerer Primer(s) auf Basis der normalen BRCA2-Gensequenz, wie in 1, 2 oder 4 dargelegt, oder mutierter Formen davon zum Screenen bezüglich normaler oder mutierter BRCA2-Gene in einer Probe von einem Patienten.

Während die diagnostischen Verfahren (a) bis (c) als Beispiele dienen, sind andere Testformen auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich.
Die Detektion von Mutationen im BRCA2-Gen weist auf eine Anfälligkeit für Krebs, vor allem Brustkrebs bei Frauen, Brustkrebs bei Männern, Eierstockkrebs und Prostatakrebs, hin.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Die obigen und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun mithilfe von Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen, die als Beispiele und nicht zur Einschränkung dienen, genauer erläutert. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind weitere Aspekte der Erfindung offensichtlich.
1 zeigt die Teilsequenz des BRCA2-Gens, das von einem cDNA-Klon 14 erhalten wurde.
2(a) – (e) zeigt die Sequenzen der Exons und Introns des Klons 14, wo sie bekannt sind.
3 zeigt die translatierte Aminosäuresequenz der in 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz. Von den 3 möglichen Leserastern ist der für die Translation der in dieser Figur verwendeten Aminosäuresequenz verwendete der wahrscheinlichste Kandidat, da die Nucleinsäure, die erhalten wird, wenn sich der Leseraster an den anderen Positionen befindet, Stoppcodons in der Sequenz enthält.
4 zeigt den zweiten Teil der cDNA-Sequenz des BRCA2-Gens, der von den Erfindern isoliert wurde, einschließlich der cDNA-Sequenz, die in 1 dargelegt ist.
5(a) – (d) zeigt die translatierte Aminosäuresequenz der in 4 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei die dicken Pfeile über der Sequenz auf die Grenzen zwischen den Teilen des Proteins hinweisen, die durch unterschiedliche Exons im Gen kodiert sind.
6 zeigt die Sequenzen der BRCA2-Promotorregion, wobei die Bindungsstellen für mögliche Transkriptionsfaktoren unterstrichen sind und CpG fett gedruckt ist. Die Promotorsequenz kann beim Screenen für Substanzen von Nutzen sein, welche die Expression des BRCA2-Gens zur Verwendung als Therapeutika moduliert.
7 zeigt die Sequenz des BRCA2-Gens, einschließlich der Exon/Intron-Struktur, die durch einen Vergleich der BRCA2-cDNA-Sequenz mit der genomischen Sequenz des Chromosoms 13q zwischen D13S260 und D13S171 definiert ist. Exons sind in Großbuchstaben dargestellt, während die flankierende Intronsequenz in Kleinbuchstaben dargestellt ist. Die Aminosäuresequenz ist unter dem offenen Leseraster von Exon 2 bis 26 zu sehen.
8 zeigt Primer für einzelsträngige Konformationspolymorphismus- (SSCP-) Tests, die auf die Amplifizierung des BRCA2-Gens durch die PCR zur Identifikation von Sequenzveränderungen in genomischer DNA ausgerichtet sind, welche für die Entwicklung von Brustkrebs empfänglich sein können. Die Primer befinden sich in den Intronsequenzen, die jedes der 26 Exons flankieren, die den offenen Leseraster des Gens enthalten. Die amplifizierten Produkte umfassen die Spleißstellen-Consensus-Sequenzen. Zwei oder mehrere Gruppen von Primern wurden für die größeren Exons des Gens entwickelt. Die Primer sind wie folgt markiert: Exonzahl, Unterabschnitt des Exons, vorwärts oder rückwärts. Die PCR-Produkte reichen von 160 bis 360 bp. Die mit CON bezeichnete Spalte enthält die Bedingungen, welche von den Erfindern eingesetzt wurden. Die Primer wurden unter Verwendung einer begrenzten Reihe von Bedingungen getestet, die alle auf Touchdown- (TD-) PCR basierten, worin die Zahlen die erste bzw. letzte Anellierungstemperatur angeben. Wenn Mutationen identifiziert wurden, wurden die PCR-Produkte unter Verwendung der gleichen Primer und fluoreszenten Zyklussequenzierung sequenziert.
9 zeigt die vergleichende Anordnung von Aminosäuremotiven in Exon 11 des BRCA2 von verschiedenen Spezies.
10 zeigt Beispiele für Primer zur Verwendung in PTT-Tests.
11 zeigt eine Immunfällung eines FLAG-markierten BRCA2-Proteins von COS-Zellen, die mit dem Expressionsplasmid p13120 transfiziert wurden. Gesamt-Zelllysate von transfizierten (Bahnen a und b) und untransfizierten (Bahnen c und d) COS-Zellen wurden einer Immunfällung mit einem Anti-FLAG-Antikörper (Bahnen b und d) oder mit einem Vergleichsantikörper gegen ein Golgi-Protein (Bahnen a und c) unterzogen. Ein Anti-FLAG-Antikörper immunfällt ein Protein mit etwa 400 kDa (Pfeil) aus einem transfizierten, nicht jedoch aus einem untransfizierten COS-Zelllysat aus (vergleiche Bahnen d und b). Der Vergleichsantikörper immunfällt dieses Protein nicht aus (siehe Bahn c). Das starke Protein mit hohem Molekulargewicht in den Markerbahnen weist 220 kDa auf.
12 zeigt einen Western-Blot eines FLAG-markierten BRCA2-Proteins. Gesamt-Zelllysate von COS-Zellen (Bahnen a und b) und 293T-Zellen (Bahnen c und d) wurden mit dem Expressionsplasmid p13120 (Bahnen a und c) oder keiner DNA (Bahnen b und d) transfiziert. Ein Anti-FLAG-Antikörper detektiert ein Protein mit etwa 400 kDA (Pfeil) in den transfizierten, nicht jedoch in den untransfizierten Zelllysaten. Das Protein in der Markerbahn weist ein Molekulargewicht von 220 kDa auf.
13 zeigt die Detektion eines FLAG-markierten BRCA2-Proteins durch Immunfluoreszenz. COS-Zellen wurden mit dem Expressionsplasmid p13120 transfiziert, 48 Stunden später mit 4 % Formaldehyd fixiert und schließlich mit 0,4 % Triton-X100 permeabilisiert. Der Anti-FLAG-Antikörper weist eine Variation in der zellulären Lokalisation des FLAG-markierten BRCA2-Proteins auf. Während das BRCA2-Protein in 14 % der Zellen gleichförmig zwischen dem Kern und dem Zytoplasma verteilt ist, ist es in 42 % der Zellen (n=50) vorherrschend nuklear (A) und in 44 % zytoplasmatisch (B). Eine Expression im Zytoplasma erscheint granulär, was auf einen Zusammenhang mit dem endoplasmatischen Retikulum hinweisen kann. In untransfizierten Zellen ist keine Färbung erkennbar.
Detaillierte Beschreibung
Herstellung von BRCA2-Nucleinsäure und Vektoren und Wirtszellen welche die Nucleinsäure inkorporieren
"BRCA2-Region" bezieht sich auf den Anteil des menschlichen Chromosoms 13q12-13, das gemäß Wooster et al. (5) identifiziert wurde und das den BRCA2-Ort enthält.
"BRCA2-Ort" umfasst das BRCA2-Gen, die kodierende Sequenz (Exons) und dazwischenliegenden Sequenzen (Introns) und seine Regulationselemente zur Regelung der Transkription und/oder Translation. Der BRCA2-Ort deckt auch allelische Variationen innerhalb des Orts ab.
Der Begriff "BRCA2-Gen" oder "BRCA2-Nucleinsäure" umfasst normale Allele des BRCA2-Gens, sowohl stumme Allele, die keine Wirkung auf die Aminosäuresequenz des BRCA2-Polypeptids haben, als auch Allele, die zu Aminosäuresequenzvarianten des BRCA2-Polypeptids führen, die seine Funktion im Wesentlichen nicht beeinträchtigen. Diese Begriffe umfassen auch Allele mit einer oder mehreren Mutationen, die mit einer Anfälligkeit für die Entwicklung von Krebs, insbesondere Brustkrebs bei Männern und Frauen oder Eierstockkrebs, zusammenhängen. Eine Mutation kann eine Veränderung in der BRCA2-Nucleinsäuresequenz sein, die eine nachteilige Veränderung in der Aminosäuresequenz des BRCA2-Polypeptids verursacht, was zu einem teilweisen oder kompletten Verlust der BRCA2-Funktion führt, oder sie kann eine Veränderung in der Nucleinsäuresequenz sein, die zu einem Verlust der wirksamen BRCA2-Expression oder zur Bildung von abweichenden Formen des BRCA2-Polypeptids führen. Beispiele für solche Mutationen sind in Tabelle 1 zu sehen. Allele, die solche Mutationen umfassen, sind auf dem Gebiet der Erfindung auch als Anfälligkeitsallele bekannt.
Die BRCA2-Nucleinsäure kann die in den 1, 2 oder 4 dargestellte oder ein oben beschriebenes Allel sein, das sich vom dargestellten durch eine Veränderung unterscheidet, die eine Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden der dargestellten Sequenz ist. Veränderungen an einer Nucleotidsequenz können zu einer Aminosäureveränderung am Proteinniveau führen oder auch nicht, wie durch den genetischen Code bestimmt.
Somit kann die Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung eine Sequenz umfassen, die sich von der in 1, 2 oder 4 dargestellten Sequenz unterscheidet und doch für ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz kodieren. Die in 7 dargestellte Aminosäuresequenz besteht aus 3418 Resten.
Spezielle mutierte Allele der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 1 zusammengefasst, wobei die in (8) vorgeschlagenen Bezeichnungen verwendet werden. Diese Mutationen werden im Allgemeinen mit der Produktion von trunkierten Formen des BRCA2-Genprodukts assoziiert. Wie sich in hierin beschriebenen Versuchen zeigte, hängen diese mit Anfälligkeit für Brustkrebs bei Männern und Frauen und/oder Eierstockkrebs zusammen. Die Auswirkungen auf das Screening, beispielsweise zu diagnostischen oder prognostischen Zwecken, sind im Folgenden erläutert.
Im Allgemeinen ist eine Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung als Isolat, in isolierter und/oder gereinigter Form oder frei oder im Wesentlichen frei von Materialien, mit denen sie von Natur aus verbunden ist, beispielsweise frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure, die das Gen im menschlichen Genom flankiert, möglicherweise mit Ausnahme einer oder mehrerer Regulationssequenzen zur Expression, bereitgestellt. Nucleinsäure kann vollkommen oder teilweise synthetisch sein und genomische DNA, cDNA oder RNA umfassen. Wenn Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung RNA umfasst, sollte eine Referenz auf die dargestellte Sequenz als Referenz auf die äquivalente RNA konstruiert sein, wobei T durch U substituiert wird.
Nucleinsäuresequenzen, die für das gesamte BRCA2-Gen oder einen Teil davon und/oder seine Regulationselemente kodieren, können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung leicht unter Verwendung der hierin angeführten Informationen und Referenzen und der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1992)). Diese Verfahren umfassen (i) die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung von Proben einer solchen Nucleinsäure, beispielsweise von genomischen Quellen, (ii) chemische Synthese oder (iii) die Herstellung von cDNA-Sequenzen. Modifikationen an BRCA2-Sequenzen können beispielsweise unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese vorgenommen werden, um eine Expression eines modifizierten BRCA2-Polypeptids bereitzustellen oder der Codon-Präferenz in den Wirtszellen Rechnung zu tragen, die zur Expression der Nucleinsäure verwendet werden.
Um eine Expression der BRCA2-Nucleinsäuresequenz zu erreichen, können die Sequenzen in einen Vektor inkorporiert werden, der operabel mit der BRCA2-Nucleinsäure verbundene Kontrollsequenzen aufweist, um ihre Expression zu regeln. Die Vektoren können auch andere Sequenzen, wie beispielsweise Promotoren oder Verstärker, um die Expression der insertierten Nucleinsäure zu fördern, Nucleinsäuresequenzen, so dass das BRCA2-Polypeptid als Fusion produziert wird, und/oder für Sekretionssignale kodierende Nucleinsäure, so dass das in der Wirtszelle produzierte Polypeptid von der Zelle sekretiert wird, umfassen. Das BRCA2-Polypeptid kann dann durch Transformation der Vektoren in Wirtszellen, in denen der Vektor funktionell ist, Züchten der Wirtszellen, so dass das BRCA2-Polypeptid produziert wird, und Gewinnen des BRCA2-Polypeptids aus den Wirtszellen oder dem umliegenden Medium erhalten werden. Prokaryotische und eukaryotische Zellen werden auf dem Gebiet der Erfindung zu diesem Zweck verwendet, einschließlich Stämmen von E. coli, Hefe und eukaryotischer Zellen, wie z.B. COS- oder CHO-Zellen. Die Wahl der Wirtszelle kann dazu verwendet werden, um die Eigenschaften des in diesen Zellen exprimierten BRCA2-Polypeptids zu regeln, also beispielsweise zu regeln, wo in der Wirtszelle das Polypeptid abgelagert wird, oder Eigenschaften, wie z.B. die Glykosylierung, zu beeinflussen.
PCR-Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure sind im US-Patent Nr. 4.683.195 beschrieben. Im Allgemeinen erfordern solche Verfahren, dass Sequenzinformation von den Enden der Zielsequenz bekannt ist, um geeignete Vorwärts- und Rückwärts-Oligonucleotidprimer zu entwerfen, die mit der Polynucleotidsequenz, die das Ziel der Amplifikation ist, identisch oder ähnlich sind. PCR umfasst die Schritte der Denaturierung der Matrizennucleinsäure (falls doppelsträngig), Anellierens eines Primers an das Ziel und der Polymerisation. Die sondierte oder als Matrize in der Amplifikationsreaktion verwendete Nucleinsäure kann genomische DNA, cDNA oder RNA sein. Eine PCR kann verwendet werden, um spezifische Sequenzen von genomischer DNA, spezifische RNA-Sequenzen und von mRNA, Bakteriophage oder Plasmidsequenzen transkribierte cDNA zu amplifizieren. Die hierin bereitgestellten BRCA2-Nucleinsäuresequenzen ermöglichen es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung, PCR-Primer zu entwerfen; siehe beispielsweise 8. Verweise zur allgemeinen Verwendung von PCR-Verfahren umfassen Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987), Ehrlich (Hrsg.), PCR technology, Stockton Press,. NY (1989), Ehrlich et al., Science 252, 1643–1650 (1991), PCR protocols; A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Hrsg.), Academic Press, New York (1990).
Außerdem umfasst der Schutzumfang der Erfindung Antisense-Oligonucleotidsequenzen, die auf den hierin beschriebenen BRCA2-Nucleinsäuresequenzen basieren. Antisense-Oligonucleotide können so aufgebaut sein, dass sie an die komplementäre Sequenz einer Nucleinsäure, Prä-mRNA oder reifen mRNA hybridisieren, wodurch sie in die Produktion eines Polypeptids eingreifen, für das eine gegebene DNA-Sequenz kodiert (z.B. entweder ein natives BRCA2-Polypeptid oder eine mutierte Form davon), so dass seine Expression verringert oder ganz verhindert wird. Neben der für BRCA2 kodierenden Sequenz können auch Antisense-Verfahren verwendet werden, um auf die Kontrollsequenzen des BRCA2-Gens abzuzielen, beispielsweise in der 5'-flankierenden Sequenz der für BRCA2 kodierenden Sequenz, wodurch die Antisense-Oligonucleotide BRCA2-Kontrollsequenzen stören können. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen und ihre Verwendung ist in Peyman und Ulman, Chemical Reviews 90, 543–584 (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 32, 329–376 (1992), und Zamecnik und Stephenson, P.N.A.S 75, 280–284 (1974), beschrieben.
Die in 1, 2 und 4 dargelegten Nucleinsäuresequenzen sind nützlich zur Identifikation einer Nucleinsäure von Interesse (die gemäß vorliegender Erfindung sein kann) in einer Testprobe. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalt einer Nucleinsäure von Interesse bereit, wobei das Verfahren die Hybridisierung einer Sonde an die in 1, 2 oder 4 dargelegte Sequenz oder eine komplementäre Sequenz an eine Zielnucleinsäure umfasst.
Auf die Hybridisierung folgt im Allgemeinen die Identifikation einer erfolgreichen Hybridisierung und Isolation von Nucleinsäure, die an die Sonde hybridisiert hat, was einen oder mehrere PCR-Schritte umfassen kann.
Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung kann unter Verwendung einer oder mehrerer Oligonucleotidsonden oder -primer erhalten werden, die auf die Hybridisierung an ein oder mehrere Fragmente der in 1, 2 oder 4 dargelegten Nucleinsäuresequenz, insbesondere Fragmente einer relativ seltenen Sequenz, basierend auf der Codonnutzung oder einer statistischen Analyse, ausgerichtet sind. Ein Primer, der auf die Hybridisierung an ein Fragment der in den obigen Figuren dargestellten Nucleinsäuresequenz ausgerichtet ist, kann zusammen mit einem oder mehreren Oligonucleotiden verwendet werden, die auf die Hybridisierung an eine Sequenz in einem Klonierungsvektor ausgerichtet sind, worin die Zielnucleinsäure kloniert wurde, oder in so genannten "RACE" (rapid amplification of cDNA ends), in denen cDNAs in einer Bibliothek an einen Oligonucleotid-Linker ligiert werden und eine PCR unter Verwendung eines Primers, der an die in 1, 2 oder 4 dargelegte Sequenz hybridisiert, und eines Primers, der an den Oligonucleotid-Linker hybridisiert, durchgeführt wird.
Solche Oligonucleotidsonden oder -primer sowie die Sequenz voller Länge (und Allele, Varianten und Derivate davon) sind auch beim Screenen einer Nucleinsäure ent haltenden Testprobe auf die Gegenwart von Allelen und Varianten, insbesondere solcher, die Anfälligkeit oder Prädisposition für Krebs verleihen, von Nutzen, wobei die Sonden an eine Zielsequenz einer Probe hybridisieren, die von der getesteten Person stammt. Die Hybridisierungsbedingungen können kontrolliert werden, um nichtspezifische Bindung zu minimieren, und bevorzugt werden stringente bis mäßig stringente Bedingungen. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können solche Sonden leicht mithilfe von Leitfäden, wie beispielsweise Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1992), herstellen und markieren und geeignete Bedingungen für die Hybridisierungsreaktionen herstellen.
Die Sonden können nicht nur zur Bestimmung der Gegenwart von Polymorphismen oder Mutationen in der BRCA2-Sequenz verwendet werden, sondern auch zur Bestimmung, ob für BRCA2 kodierende mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist.
Nucleinsäure, die aus einer oder mehreren (z.B. menschlichen) Zellen isoliert und/oder gereinigt wurde, oder eine Nucleinsäurebibliothek, die von einer aus Zellen isolierten und/oder gereinigten Nucleinsäure stammt (z.B. eine cDNA-Bibliothek von aus den Zellen isolierter mRNA), können unter Bedingungen sondiert werden, die für selektive Hybridisierung geeignet sind, und/oder einer spezifischen Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), unterzogen werden.
Im Zusammenhang mit Klonierung mag es notwendig sein, ein oder mehrere Genfragmente zu ligieren, um eine kodierende Sequenz voller Länge herzustellen. Wenn kein kodierendes Nucleinsäuremolekül voller Länge erhalten wurde, kann auch ein kleineres Molekül, das einen Teil des gesamten Moleküls darstellt, verwendet werden, um Klone voller Länge zu erhalten. Inserts können aus teilweisen cDNA-Klonen hergestellt werden und zum Screenen von cDNA-Bibliotheken verwendet werden. Die isolierten Klone voller Länge können in Expressionsvektoren subkloniert werden und durch Transfektion in geeignete Wirtszellen, z.B. mit einem Reporterplasmid, auf ihre Aktivität untersucht werden.
Ein Verfahren kann die Hybridisierung einer oder mehrerer (z.B. zwei) Sonden oder Primer an Zielnucleinsäure umfassen. Wenn die Nucleinsäure doppelsträngige DNA ist, wird vor der Hybridisierung im Allgemeinen eine Denaturierung durchgeführt, um einzelsträngige DNA herzustellen. Die Hybridisierung kann Teil eines PCR-Verfahrens oder Teil eines Sondierungsverfahrens, das keine PCR umfasst, sein. Ein Beispiel für das Verfahren ist eine Kombination aus PCR und Hybridisierung mit niedriger Stringenz. Ein Screening-Verfahren, das aus der großen Anzahl ausgewählt ist, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zur Verfügung stehen, wird verwendet, um erfolgreiche Hybridisierungsvorgänge und isolierte hybridisierte Nucleinsäure zu identifizieren.
Die Bindung einer Sonde an Zielnucleinsäure (z.B. DNA) kann unter Verwendung von beliebigen einer Vielzahl von Verfahren gemessen werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zur Verfügung stehen. Beispielsweise können Sonden radioaktiv, fluoreszent oder enzymatisch markiert werden. Weitere Verfahren, die keine Markierung einer Sonde umfassen, sind eine Untersuchung des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, eine Amplifikation unter Verwendung von PCR, RNAase-Spaltung und Allel-spezifische Oligonucleotidsondierung.
Eine Sondierung kann unter Einsatz des herkömmlichen Southern-Blotting-Verfahrens durchgeführt werden. Beispielsweise kann DNA aus Zellen extrahiert und mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen verdaut werden. Restriktionsfragmente können dann durch Elektrophorese auf einem Agarosegel abgetrennt werden, bevor eine Denaturierung und ein Transfer auf ein Nitrocellulosefilter stattfinden. Eine markierte Sonde kann an die DNA-Fragmente auf dem Filter hybridisiert werden, wonach die Bindung bestimmt wird. DNA für Sondierungen kann aus RNA-Präparaten von Zellen hergestellt werden.
Vorläufige Versuche können durchgeführt werden, indem verschiedene Sonden unter weniger stringenten Bedingungen an Southern-Blots von DNA, die mit Restriktionsenzymen verdaut wurde, hybridisiert werden. Geeignete Bedingungen wären erreicht, wenn eine große Anzahl an Hybridisierungsfragmenten erhalten wurde, während die Hintergrundhybridisierung gering war. Unter Verwendung dieser Bedingungen können Nucleinsäurebibliotheken, z.B. cDNA-Bibliotheken, die für exprimierte Sequenzen repräsentativ sind, durchsucht werden.
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können leicht geeignete Stringenzbedingungen für selektive Hybridisierung herstellen, wenn sie Faktoren, wie beispielsweise die Oligonucleotidlänge und die Basenzusammensetzung, Temperatur usw., in Betracht ziehen.
Ausgehend von der Aminosäuresequenzinformation können Oligonucleotidsonden oder -primer entworfen werden, wobei die Degeneration des genetischen Codes in Betracht gezogen wird, und falls angemessen wird die Codonnutzung des Organismus von der Kandidatennucleinsäure abgeleitet. Ein Oligonucleotid zur Verwendung bei der Nucleinsäureamplifikation kann etwa 10 oder weniger Codons (z.B. 6, 7 oder 8) aufweisen, d.h. etwa 30 Nucleotide lang oder kürzer sein (z.B. 18, 21 oder 24). Im Allgemeinen sind spezifische Primer länger als 14 Nucleotide, aber nicht länger als 18 – 20. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können Primer zur Verwendung in Verfahren, wie beispielsweise PCR, leicht herstellen.
In manchen bevorzugten Ausführungsformen sind Oligonucleotide gemäß vorliegender Erfindung, die Fragmente einer der in 1, 2 oder 4 dargelegten Sequenzen oder ein beliebiges Allel sind, die mit Anfälligkeit für Krebs zusammenhängen, zumindest etwa 10 Nucleotide lang, noch bevorzugter zumindest etwa 15 Nucleotide lang, noch bevorzugter zumindest etwa 20 Nucleotide lang. Solche Fragmente stellen selbst Aspekte der Erfindung dar. Fragmente und andere Oligonucleotide können als Primer oder Sonden verwendet werden, wie sie oben beschrieben sind, können aber auch in Verfahren hergestellt werden (z.B. durch PCR), die mit der Bestimmung der Gegenwart einer Sequenz in einer Testprobe zusammenhängen, die auf Anfälligkeit für Krebs hinweist.
Verfahren, welche die Verwendung von Nucleinsäure in diagnostischem und/oder prognostischem Kontext umfassen, beispielsweise zur Bestimmung von Anfälligkeit für Brustkrebs bei Frauen, Brustkrebs bei Männern, Eierstockkrebs oder Prostatakrebs, sowie andere Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Sequenzen, die auf Anfälligkeit für Krebs hinweisen, sind im Folgenden erläutert.
Ein geeigneter Weg zur Herstellung eines Polypeptids gemäß vorliegender Erfindung besteht in der Expression ausgehend von Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, durch Verwendung der Nucleinsäure in einem Expressionssystem. Die Verwendung von Expressionssystemen ist heute schon sehr ausgereift.
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids (wie offenbart), wobei das Verfahren die Expression ausgehend von Nucleinsäure umfasst, die für das Polypeptid kodiert (im Allgemeinen Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung). Das kann geeigneterweise durch Züchtung einer Wirtszelle in einer Kultur erreicht werden, die solch einen Vektor enthält, und zwar unter geeigneten Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids auslösen oder ermöglichen. Polypeptide können auch in In-vitro-Systemen, wie beispielsweise Retikulozytenlysaten, exprimiert werden.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in einer Vielfalt verschiedener Wirtszellen sind allgemein bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen, wie z.B. Säugetier- und Hefezellen, und Baculovirussysteme. Säugetierzelllinien, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Expression eines heterologen Polypeptids erhältlich sind, umfassen Eizellen vom Chinesischen Hamster, HeLa-Zellen, Baby-Hamsternierenzellen, COS-Zellen u.a.m. Ein weit verbreiteter bevorzugter Wirt ist E. coli.
Geeignete Vektoren, die geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und andere geeignete Sequenzen enthalten, können ausgewählt oder konstruiert werden. Vektoren können, je nach Fall, Plasmide, Viren, z.B. Phage, oder Phagemide sein. Für weitere Details siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Viele bekannte Verfahren und Arbeitsvorschriften zur Manipulation von Nucleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, sowie zur Analyse von Proteinen sind in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992), genauer beschrieben.
Somit besteht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer Wirtszelle, die hierin offenbarte Nucleinsäure enthält. Die Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung kann in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert werden. Die Integration kann, gemäß herkömmlichen Verfahren, durch die Aufnahme von Sequenzen gefördert werden, die eine Rekombination mit dem Genom fördern. Die Nucleinsäure kann sich auf einem extrachromosomalen Vektor in der Zelle befinden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Einführung der Nucleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Die Einführung, die im Allgemeinen (vor allem bei In-vitro-Einführung) ohne Einschränkung als "Transformation" bezeichnet werden kann, kann ein beliebiges bekanntes Verfahren umfassen. Bei eukaryotischen Zellen können geeignete Verfahren Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposom-vermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung eines Retrovirus oder anderen Virus, z.B. Vaccinia oder bei Insektenzellen Baculovirus, umfassen. Bei Bakterienzellen können geeignete Verfahren Calciumchloridtransformation, Elektroporation und Transfektion unter Verwendung eines Bakteriophagen umfassen. Alternativ kann auch eine direkte Injektion der Nucleinsäure eingesetzt werden.
Markergene, wie beispielsweise Antibiotika-Resistenzgene oder -Sensitivitätsgene, können bei der Identifikation von Klonen verwendet werden, die Nucleinsäure von Interesse enthalten, wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist.
Nach der Einführung kann eine Expression ausgehend von der Nucleinsäure, z.B. durch Züchtung von Wirtszellen (die Zellen enthalten können, die tatsächlich transformiert wurden, obwohl die Zellen wahrscheinlich eher von den transformierten Zellen abstammen) unter Bedingungen für die Expression des Gens, verursacht oder ermöglicht werden, so dass das kodierte Polypeptid produziert wird. Wenn das Polypeptid an ein geeignetes Signal-Leader-Peptid gekoppelt exprimiert wird, kann es von der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden. Nach einer Produktion durch Expression kann ein Polypeptid, je nach Fall, von der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium isoliert und/oder gereinigt werden und danach, falls gewünscht, beispielsweise in der Formulierung einer Zusammensetzung verwendet werden, die eine oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten kann, wie beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, Vehikel oder Träger enthält (siehe unten).
Wirtszellen können als Nucleinsäurefabriken verwendet werden, um die Nucleinsäure von Interesse zu replizieren und eine große Menge davon herzustellen. Mehrere Kopien der Nucleinsäure von Interesse können innerhalb einer Zelle produziert werden, wenn sie an ein amplifizierbares Gen, wie z.B. DHFR, gekoppelt ist. Wirtszellen, die mit Nucleinsäure von Interesse transformiert wurden oder die von Wirtszellen stammen, in die Nucleinsäure eingeführt wurde, können unter geeigneten Bedingungen, beispielsweise in einem Fermenter, gezüchtet, aus der Kultur entnommen und einem Processing unterzogen werden, um die Nucleinsäure zu reinigen. Nach der Reinigung können die Nucleinsäure oder ein oder mehrere Fragmente davon nach Belieben verwendet werden, beispielsweise in einem diagnostischen oder prognostischen Test, der an anderer Stelle hierin beschrieben ist.
Herstellung von BRCA2-Polypeptiden
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können die hierin beschriebenen Verfahren und andere auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren zur Herstellung großer Mengen des BRCA2-Polypeptids oder von Fragmenten oder aktiven Abschnitten davon verwenden, die als Pharmazeutika, bei der Entwicklung von Arzneimitteln und in weiteren Untersuchungen ihrer Eigenschaften und Rolle in vivo verwendet werden. Ein Versuch, der die Produktion eines BRCA2-Polypeptids bestätigt, ist im weiter unten beschriebenen Beispiel 3 dargelegt.
Somit stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid bereit, das die in 3 oder 5 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist und in isolierter und/oder gereinigter Form, frei oder im Wesentlichen frei von Materialien, mit denen es von Natur aus zusammenhängt, wie z.B. anderen Polypeptiden oder anderen menschlichen Polypeptiden als dem BRCA2-Poypeptid oder (z.B. wenn durch Expression in einer prokaryotischen Zelle hergestellt) ohne native Glykosylierung, beispielsweise unglykosyliert, vorliegen kann.
Polypeptide, die Varianten, Allele oder Derivate einer Aminosäuresequenz sind, werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Ein Polypeptid, das eine Variante, ein Allel oder ein Derivat ist, kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von der in 3 oder 5 dargelegten durch eine Addition, Substitution, Deletion und/oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren unterscheidet. Bevorzugte solcher Polypeptide weisen BRCA2-Funktion auf, d.h. sie weisen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften auf: immunologische Kreuzreaktivität mit einem Antikörper, der für das Polypeptid reaktiv ist, für welches die Sequenz in 3 oder 5 dargelegt ist, Teilen eines Epitops mit dem Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz in 3 oder 5 dargelegt ist (beispielsweise bestimmt durch immunologische Kreuzreaktivität zwischen den beiden Polypeptiden).
Beispiele für Mutationsvarianten, die repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, sind in Tabelle 1 angeführt. Screening auf das Vorhandensein einer oder mehrerer davon in einer Testprobe dient diagnostischen und/oder prognostischen Zwecken, beispielsweise bei der Bestimmung von Anfälligkeit für Krebs, wie weiter unten beschrieben ist.
Ein Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung kann (z.B. unter Verwendung eines Antikörpers) isoliert und/oder gereinigt werden, beispielsweise nach der Herstellung durch Expression ausgehend von kodierender Nucleinsäure (siehe unten). Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung können auch gänzlich oder teilweise durch chemische Synthese hergestellt werden. Das isolierte und/oder gereinigte Polypeptid kann in der Formulierung einer Zusammensetzung verwendet werden, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst, beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, ein solches Vehikel oder einen solchen Träger umfasst. Eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung umfasst, kann in einer prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung verwendet werden, wie weiter unten beschrieben ist.
Ein Polypeptid, Peptidfragment, Allel oder eine Variante gemäß vorliegender Erfindung kann als Immunogen oder auf andere Weise zum Erhalt von spezifischen Antikörpern verwendet werden. Antikörper sind nützlich bei der Reinigung und anderen Manipulationen von Polypeptiden und Peptiden, bei diagnostischem Screenen und in therapeutischen Kontexten. Auch dieser Punkt ist weiter unten genauer erläutert.
Herstellung von BRCA2-Antikörpern
Eine weitere wichtige Verwendung der BRCA2-Polypeptide besteht in der Aufzucht von Antikörpern, die spezifisch an die BRCA2-Polypeptide oder Fragmente oder aktive Abschnitte davon binden.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Monoklonale Antikörper können DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen werden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Verfahren können die Einführung von für die variable Region eines Immunglobulins kodierender DNA oder der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers in die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise die EP-A-184187, GB-A-2188638 oder EP-A-239400. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper produziert, kann einer genetischen Mutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden, welche die Bindungsspezifität von produzierten Antikörpern verändern können oder auch nicht.
Die Bereitstellung der neuen BRCA2-Polypeptide ermöglicht zum ersten Mal die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch daran binden können. Demgemäß besteht ein weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Antikörpers, der spezifisch an das Polypeptid binden kann, dessen Sequenz in 3 oder 5 dargelegt ist. Solch ein Antikörper kann in dem Sinne spezifisch sein, dass er zwischen dem Polypeptid, an das er binden kann, und anderen menschlichen Polypeptiden, für die er keine oder im Wesentlichen keine Bindungsaffinität besitzt (z.B. eine etwa 1000-mal schlechtere Bindungsaffinität), unterscheiden kann. Spezifische Antikörper binden an ein Epitop auf dem Molekül, das auf anderen Molekülen entweder nicht vorhanden oder nicht zugänglich ist. Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können für das Polypeptid vom Wildtyp spezifisch sein. Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können für eine bestimmte Variante, ein bestimmtes Allel oder ein bestimmtes Derivat eines Polypeptids, wie zwischen diesem Molekül und dem BRCA2-Polypeptid vom Wildtyp, spezifisch sein, so dass sie für diagnostische und prognostische Verfahren nützlich sind, wie im Folgenden beschrieben ist. Antikörper sind auch zum Reinigen des Polypeptids oder der Polypeptide geeignet, an die sie binden, beispielsweise nach einer Produktion durch rekombinante Expression ausgehend von kodierender Nucleinsäure.
Bevorzugte Antikörper gemäß vorliegender Erfindung werden in dem Sinne isoliert, dass sie frei von Kontaminanten, wie z.B. Antikörpern, die an andere Polypeptide binden können, und/oder frei von Serumkomponenten sind. Für manche Zwecke werden monoklonale Antikörper bevorzugte, obwohl polyklonale Antikörper auch innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Antikörper können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung herkömmlichen Verfahren erhalten werden. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen die Immunisierung eines Säugetiers (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können von immunisierten Tieren unter Verwendung einer Vielzahl von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren erhalten und gescreent werden, vorzugsweise unter Verwendung von Bindung eines Antikörpers an ein Antigen von Interesse. Beispielsweise können Western-Blotting-Verfahren oder Immunfällung verwendet werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)). Bei der Isolierung von Antikörpern und/oder Antikörper-produzierende Zellen aus einem Tier muss dieses eventuell getötet werden.
Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers mit einem Polypeptid kann ein Antikörper, der für ein Protein spezifisch ist, aus einer rekombinant hergestellten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen erhalten werden, beispielsweise durch Verwendung eines λ-Bakteriophagen oder Faden-Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-Bindungsdomänen auf ihren Oberflächen aufweisen; siehe beispielsweise die WO92/01047. Die Bibliothek kann naiv sein, d.h. aus Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus erhalten wurden, der nicht mit einem der Proteine (oder Fragmenten davon) immunisiert wurde, oder unter Verwendung von Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus erhalten wurden, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt worden war.
Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können auf verschiedene Arten modifiziert werden. Tatsächlich sollte der Begriff "Antikörper" alle Bindungssubstanzen abdecken, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweisen. Somit deckt die Erfindung auch Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetischer Moleküle und Moleküle, deren Gestalt die eines Antikörper nachahmt, so dass er an ein Antigen oder Epitop binden kann, ab.
Beispiele für Antikörperfragmente, die zur Bindung an ein Antigen oder andere Bindungspartner fähig sind, sind das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, Cl- und CH1-Domänen besteht; das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Gelenksregion gebunden sind. Einkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls eingeschlossen.
Humanisierte Antikörper, in denen CDRs von einer nichtmenschlichen Quelle auf menschliche Gerüstregionen transplantiert wurden, typischerweise einhergehend mit der Veränderung einiger der Gerüstaminosäurereste, um Antikörper bereitzustellen, die weniger immunogen sind als die nichtmenschlichen Elternantikörper, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung produziert, kann Gegenstand genetischer Mutation oder anderer Veränderungen sein. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist offensichtlich, dass ein monoklonaler Antikörper den DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen werden kann, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Verfahren können die Einführung von DNA, die für die variable Immunglobulinregion kodiert, oder der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers in die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise die EP-A-184187, GB-A-2188638 oder EP-A0239400. Die Klonierung und Expression von chimären Antikörpern sind in der EP-A-0120694 und EP-A-0125023 beschrieben.
Hybridome, die zur Produktion eines Antikörpers mit gewünschten Bindungseigenschaften fähig sind, liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, wie auch eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die für Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente) kodierende Nucleinsäure enthalten und zu ihrer Expression fähig sind. Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung der Antikörper bereit, umfassend die Züchtung einer Zelle, die unter Bedingungen, in denen der Antikörper produziert und vorzugsweise sekretiert wird, zur Produktion eines Antikörpers fähig ist.
Die Reaktivitäten der Antikörper auf einer Probe können mithilfe eines beliebigen geeigneten Mittels bestimmt werden. Markieren mit einzelnen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt detektierbare, und vorzugsweise messbare, Signale erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, beispielsweise über eine Peptidbindung, oder nichtkovalent sein. Eine Bindung über eine Peptidbindung kann die Folge einer rekombinanten Expression einer Fusionsgens sein, das für einen Antikörper und ein Reportermolekül kodiert.
Eine bevorzugte Art ist eine kovalente Bindung jedes Antikörpers mit einem einzelnen Fluorchrom-, Phosphor- oder Laserfarbstoff mit spektral isolierten Absorptions- oder Emissionsmerkmalen. Geeignete Fluorchrome umfassen Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texas-Rot. Geeignete chromogene Farbstoffe umfassen Diaminobenzidin.
Weitere Reporter umfassen makromolekulare kolloidale Teilchen oder Materialteilchen, wie beispielsweise Latexkügelchen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Stoffe, die direkt oder indirekt detektierbare Signale auslösen können, die visuell beobachtet, elektronisch detektiert oder auf andere Weise aufgezeichnet werden können. Diese Moleküle können Enzyme sein, die beispielsweise Reaktionen katalysieren, die Farben erzeugen oder verändern, oder Veränderungen der elektrischen Eigenschaften verursachen. Sie können molekular anregbar sein, so dass Elektronenübergänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen spektralen Absorptionen oder Emissionen führen. Sie können chemische Teilchen umfassen, die zusammen mit Biosensoren verwendet werden. für Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin- und alkalische-Phosphatase-Detektionssysteme können verwendet werden.
Die Art zur Bestimmung der Bindung ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung, und Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können geeignete Verfahren je nach Präferenz und allgemeinem Wissen auswählen.
Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können beim Screenen in Bezug auf die Gegenwart eines Polypeptids, beispielsweise in einer Testprobe, die Zellen oder ein Zelllysat enthalten, wie oben erwähnt wurde, verwendet werden, und sie können beim Reinigen und/oder Isolieren eines Polypeptids gemäß vorliegender Erfindung, beispielsweise nach der Produktion des Polypeptids durch Expression ausgehend von dafür kodierender Nucleinsäure, eingesetzt werden. Antikörper können die Aktivität des Polypeptids modulieren, an das sie binden, und so, wenn das Polypeptid in einer Person schädliche Wirkung aufweist, in einem therapeutischen Kontext (der Prophylaxe einschließen kann) von Nutzen sein.
Ein Antikörper kann ein einem Set bereitgestellt werden, das Anleitungen zur Verwendung des Antikörpers, beispielsweise zur Bestimmung der Gegenwart einer bestimmten Substanz in einer Testprobe, enthalten kann. Ein oder mehrere Reagenzien können zugegeben werden, beispielsweise Markierungsmoleküle, Pufferlösungen, Elutionsmittel usw. Reagenzien können in Behältern bereitgestellt werden, die sie vor dem Umfeld schützen, wie beispielsweise in versiegelten Phiolen.
Diagnoseverfahren
Auf dem Gebiet der Erfindung ist eine Reihe von Verfahren zur Analyse von biologischen Proben von Personen bekannt, um zu bestimmten, ob die Person ein BRCA2-Allel trägt, das sie für Krebs, insbesondere Brustkrebs (bei Frauen oder Männern) oder Eierstockkrebs oder Prostatakrebs, anfällig macht. Der Zweck einer solchen Analyse kann für die Diagnose und Prognose verwendet werden und dient dazu, das Vorhandensein eines bestehenden Krebses zu detektieren, bei der Identifikation der Krebsart zu helfen und Ärzte dabei zu unterstützen, die Schwere oder den wahrscheinlichen Verlauf des Krebses zu bestimmen und/oder seine Behandlung zu optimieren. Alternativ dazu können die Verfahren auch zur Detektion von BRCA2-Allelen verwendet werden, die statistisch mit einer zukünftigen Anfälligkeit für Krebs, beispielsweise früh ausbrechendem Brustkrebs, in Verbindung stehen, wodurch Personen identifiziert werden können, die von regelmäßigem Screenen zur Frühdiagnose von Krebs profitieren würden. Beispiele für Screening-Verfahren bezüglich BRCA2-Mutationen sind in Beispiel 5 angeführt.
Im Großen und Ganzen werden die Verfahren in solche zum Screenen bezüglich des Vorhandenseins von BRCA2-Nucleinsäuresequenzen oder Allelen oder Varianten davon und solche zur Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit des BRCA2-Polypeptids eingeteilt. Die Verfahren nutzen biologische Proben von Personen, die vermutlich die Nucleinsäuresequenzen oder das Polypeptid enthalten. Beispiele für biologische Proben umfassen Blut, Plasma, Serum, Gewebeproben, Tumorproben, Speichel und Urin.
Bei den meisten Ausführungsformen zum Screenen bezüglich BRCA2-Anfälligkeitsallelen wird die BRCA2-Nucleinsäure in der Probe zuerst amplifiziert, beispielsweise unter Verwendung von PCR, um die Menge des Analyts in Bezug auf andere in der Probe vorhandene Sequenzen zu erhöhen. So können die Zielsequenzen mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad detektiert werden, wenn sie in der Probe enthalten sind. Dieser erste Schritt kann umgangen werden, indem äußerst empfindliche Reihenverfahren verwendet werden, deren Bedeutung auf dem Gebiet der Erfindung ständig wächst.
Die Identifizierung des BRCA2-Gens und seine Verbindung mit Krebs ebnet den Weg für Aspekte der vorliegenden Erfindung, gemäß denen die Verwendung von Materialien und Verfahren bereitgestellt werden, wie sie oben offenbart und beschrieben sind, um die Gegenwart oder Abwesenheit einer Variante des Gens, insbesondere eines Allels oder einer spezifisch mit Krebs, vor allem Brust- und Eierstockkrebs, assoziierten Variante, in einer Testprobe zu bestimmen. Dies kann zur Diagnose der Prädisposition einer Person für Krebs erfolgen. Es kann aber auch zur Diagnose von Krebs in einem Patienten dienen, der schon an der mit dem Gen zusammenhängenden Krankheit leidet.
Das ermöglicht die Planung einer angemessenen therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung und eine Rationalisierung der Behandlung, um sie an jene Personen zu richten, die am wahrscheinlichsten davon profitieren.
Eine Variante des Gens kann im Vergleich zur Sequenz vom Wildtyp (wie sie in Tabelle 1 dargelegt ist) eine oder mehrere Insertionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen von einem oder mehreren Nucleotiden enthalten, welche die Genfunktion stören können oder auch nicht. Unterschiede im Nucleinsäuregehalt spiegeln sich nicht notwendigerweise in einem Unterschied in der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wider. Eine Mutation oder ein anderer Unterschied in einem Gen kann jedoch zu einer Rasterverschiebung oder einem Stoppcodon, was die Art des produzierten Polypeptids (falls vorhanden) ernsthaft beeinträchtigen kann, oder zu einer Punktmutation oder weitreichenderen Mutation des kodierten Polypeptids, einschließlich Insertion, Deletion, Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren oder Regionen im Polypeptid, führen. Eine Mutation in einer Promotorsequenz oder anderen Regulationsregion kann die Expression vom Gen verhindern oder verringern oder sich auf das Processing oder die Stabilität des mRNA-Transkripts auswirken.
Es gibt verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Testprobe, wie beispielsweise der in 1, 2 oder 4 dargelegten Sequenz oder einer Variante oder einem Allel davon.
Präparate, die genomische DNA, cDNA und/oder mRNA enthalten, können Tests unterzogen werden. Die Durchführung von Tests an cDNA oder mRNA bringt den Vorteil mit sich, dass die Komplexität der Nucleinsäure durch die Abwesenheit von Intronsequenzen verringert wird, aber auch den möglichen Nachteil, dass bei der Herstellung der Präparate mehr Zeit und Anstrengungen erforderlich sind. RNA ist aufgrund der Häufigkeit von RNasen schwerer zu manipulieren als DNA.
Nucleinsäure in einer Testprobe kann sequenziert werden, und die Sequenz kann mit der in 1, 2 oder 4 dargelegten Sequenz verglichen werden, um zu bestimmen, ob ein Unterschied vorhanden ist oder nicht. Wenn das der Fall ist, kann der Unterschied mit bekannten Anfälligkeitsallelen (wie sie beispielsweise in Tabelle 1 zusammengefasst sind) verglichen werden, um zu bestimmen, ob die Testnucleinsäure eine oder mehrere der angeführten Variationen enthält, oder der Unterschied kann auf Verbindung zu Krebs untersucht werden.
Da eine Sequenzierung aller Nucleinsäuren in einer Testprobe oder gar des gesamten BRCA2-Gens im Allgemeinen zu zeit- und arbeitsaufwendig ist, kann eine spezifische Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise PCR, unter Verwendung eines oder mehrerer Primerpaare verwendet werden, um die Region von Interesse in der Nucleinsäure zu amplifizieren, beispielsweise das BRCA2-Gen oder eine bestimmte Region, in der Mutationen in Zusammenhang mit Krebsanfälligkeit stattfinden. Beispiele für Primer, die für diesen Zweck geeignet sind, sind in 8 zu sehen. Die amplifizierte Nucleinsäure kann dann wie oben beschrieben sequenziert und/oder auf andere Weise getestet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Merkmals zu bestimmen. Nucleinsäure zum Testen kann aus Nucleinsäure hergestellt werden, die aus Zellen entfernt wurde, oder in einer Bibliothek unter Verwendung verschiedener anderer Verfahren, wie z.B. Restriktionsenzymverdau und Elektrophorese.
Allel- oder Varianten-spezifische Oligonucleotide können auf ähnliche Weise in einer PCR verwendet werden, um bestimmte Sequenzen spezifisch zu amplifizieren, wenn sie in einer Testprobe vorhanden sind. Die Bewertung, ob eine PCR-Bande eine Genvariante enthält, kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Das PCR-Produkt kann beispielsweise auf eine Weise behandelt werden, welche die Sichtbarmachung der Mutation oder des Polymorphismus auf einem denaturierenden Polyacrylamid-DNA-Sequenzierungsgel ermöglicht, wobei spezifische Banden, die mit den gewählten Genvarianten verbunden sind, ausgewählt werden.
Eine Alternative oder Ergänzung zur Suche nach deren Gegenwart von Variantensequenzen in einer Testprobe besteht in der Suche nach der Gegenwart der normalen Sequenz, beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten spezifischen Oligonucleotidprimers.
Die Gegenwart oder Abwesenheit einer Läsion in einem Promotor oder einer anderen Regulationssequenz kann auch durch die Bestimmung des Grades der mRNA-Produktion durch Transkription oder des Grades der Polypeptidproduktion durch Translation ausgehend von der mRNA bewertet werden.
Eine Nucleinsäure-Testprobe kann beispielsweise durch Extrahieren von Nucleinsäure aus Zellen, beispielsweise in Speichel oder vorzugsweise Blut, oder zum pränatalen Testen aus dem Amnion, der Plazenta oder dem Fötus selbst bereitgestellt werden.
Es gibt verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Polypeptids, wie beispielsweise des Polypeptids mit der in 3 oder 5 dargelegten Aminosäuresequenz oder einer Aminosäuresequenzvariante oder eines Allels davon, in einer Testprobe.
Eine Probe kann auf die Gegenwart eines Bindungspartners für ein spezifisches Bindungselement, wie beispielsweise einen Antikörper (oder ein Gemisch von Antikör pern) getestet werden, das für eine oder mehrere Varianten des in 3 oder 5 dargelegten Polypeptids spezifisch ist.
Eine Probe kann auf die Gegenwart eines Bindungspartners für ein spezifisches Bindungselement, wie beispielsweise einen Antikörper (oder ein Gemisch von Antikörpern) getestet werden, das spezifisch für das in 3 oder 5 dargelegte Polypeptid ist.
In solchen Fällen kann die Probe durch Kontaktieren mit einem spezifischen Bindungselement, wie beispielsweise einem Antikörper, unter geeigneten Bedingungen für eine spezifische Bindung getestet werden, bevor die Bindung bestimmt wird, beispielsweise unter Verwendung eines Reportersystems, wie oben erläutert wurde. Wird eine Gruppe von Antikörpern verwendet, kann für jeden Antikörper eine andere Reportermarkierung verwendet werden, so dass die Bindung jedes einzelnen bestimmt werden kann.
Ein spezifisches Bindungselement, wie beispielsweise ein Antikörper, kann zur Isolierung und/oder Reinigung seines Bindungspartnerpolypeptids aus einer Probe verwendet werden, um eine Sequenz- und/oder biochemische Analyse des Polypeptid zu ermöglichen und zu bestimmen, ob es die Sequenz und/oder die Eigenschaften des Polypeptids aufweist, dessen Sequenz in 3 oder 5 dargelegt ist, oder ob es eine Mutante oder Variante davon ist. Aminosäuresequenzen sind Routine auf dem Gebiet der Erfindung und werden unter Verwendung von automatisierten Sequenzierungsgeräten bestimmt.
Auf dem Gebiet der Diagnose ist ein Trend zur Miniaturisierung solcher Tests zu beobachten, beispielsweise unter Verwendung von Bindemitteln (wie z.B. Antikörper oder Nucleinsäuresequenzen), die an kleinen, diskreten Stellen (Microspots) und/oder als Anordnungen auf festen Träger oder auf Diagnosechips immobilisiert wurden. Diese Ansätze sind sehr wertvoll, weil sie hohe Empfindlichkeit bereitstellen können (vor allem durch die Verwendung von fluoreszent markierten Reagenzien), nur sehr geringe Mengen biologischer Proben von Testpersonen erfordern und die gleichzeitige Durchführung mehrerer getrennter Tests ermöglichen. Der letztere Vorteil kann sehr positiv sein, weil er die Durchführung eines Test für verschiedene Mutationen im BRCA2-Gen oder einem anderen Krebsanfälligkeitsgen (wie z.B. BRCA1, siehe EP-A-705902) in einer einzigen Probe ermöglicht. Beispiele für Verfahren, die eine solche miniaturisierte Technologie ermöglichen, sind in der WO84/01031, WO88/1058, WO89/01157, WO93/8472, WO95/18376, WO95/18377, WO95/24649 und EP-A-0373203 beschrieben. Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Set bereit, das einen Träger oder einen Diagnosechip umfasst, auf dem ein oder mehrere Bindemittel immobilisiert sind, die zur spezifischen Bindung von BRCA2-Nucleinsäure oder -Polypeptiden fähig sind, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Reagenzien (wie z.B. markierten Entwicklungsreagenzien), die zur Durchführung eines Tests erforderlich sind.
Therapeutik
Pharmazeutika und Peptidtherapien
Die BRCA2-Polypeptide, -Antikörper, -Peptide und -Nucleinsäure der Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können neben einer der obigen Substanzen auch einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, enthalten. Solche Materialien sollten nichttoxisch sein und die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht beeinträchtigen. Die genaue Art des Trägers oder anderen Materials hängt von der Verabreichungsart ab, die beispielsweise oral, intravenös, kutan oder subkutan, nasal, intramuskulär oder intraperitoneal sein kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie beispielsweise Gelatine oder ein Adjuvans, enthalten. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger, wie beispielsweise Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Kochsalzlösungen, Dextrose- oder andere Saccharidlösungen oder Glykole, wie beispielsweise Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können ebenfalls enthalten sein.
Zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion oder zur Injektion an der befallenen Stelle liegt der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die pyrogenfrei ist und einen geeigneten pH, geeignete Isotonie und geeignete Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können geeignete Lösungen unter Verwendung von beispielsweise isotonischen Vehikeln, wie z.B. Natriumchloridinjektionen, Ringer-Injektionen, laktierten Ringer-Injektionen, herstellen. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Additive können je nach Bedarf ebenfalls enthalten sein.
Egal ob einer Person ein Polypeptid, Antikörper, Peptid, Nucleinsäuremolekül, kleines Molekül oder eine andere pharmazeutisch nützliche Verbindung gemäß vorliegender Erfindung verabreicht wird, die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirksamen Menge" oder in einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nach Fall, obwohl Prophylaxe als Therapie betrachtet werden kann), die ausreicht, um vorteilhaft für die Person zu sein. Die tatsächlich verabreichte Menge und die Geschwindigkeit und der zeitliche Verlauf der Verabreichung hängen von der Art und Schwere der behandelten Krankheit ab. Die Verschreibung einer Behandlung, beispielsweise Entscheidungen über die Dosis usw., obliegen dem behandelnden praktischen Arzt und anderen Ärzten und richten sich typischerweise nach der zu behandelnden Krankheit, dem Zustand des jeweiligen Patienten, der Verabreichungsstelle, der Verabreichungsart und anderen Ärzten bekannten Faktoren. Beispiele für die obigen Verfahren und Arbeitsvorschriften finden sich in Osol, A., (Hrsg.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg. (1980).
Alternativ dazu können auch Targeting-Therapien verwendet werden, um den Wirkstoff spezifischer in bestimmten Zellarten abzugeben, indem Targeting-Systeme, wie z.B. antikörper- oder zellspezifische Liganden, verwendet werden. Targeting kann aus verschiedenen Gründen wünschenswert sein; beispielsweise wenn der Wirkstoff unannehmbar toxisch ist, wenn sonst eine zu hohe Dosis erforderlich wäre oder wenn der Wirkstoff sonst nicht in die Zielzellen eindringen könnte.
Anstelle der direkten Verabreichung dieser Wirkstoffe könnten sie durch Expression ausgehend von einem kodierenden Gen, das in die Zellen, z.B. einen viralen Vektor, eingeführt wird, in den Zielzellen produziert werden (Variante des VDEPT-Verfahrens – siehe unten). Der Vektor könnte auf die spezifischen Zellen ausgerichtet sein, die behandelt werden sollen, oder er könnte Regulationselemente enthalten, die von den Zielzellen mehr oder weniger selektiv eingeschaltet werden können.
Alternativ dazu kann der Wirkstoff auch in einer Vorläuferform verabreicht werden, um dann durch ein aktivierendes Mittel in die aktive Form übergeführt zu werden, der in der zu behandelnden Zelle produziert wird oder auf diese ausgerichtet ist. Dieser Ansatz wird manchmal als ADEPT oder VDEPT bezeichnet; Ersteres umfasst das Targeting des aktivierenden Mittels auf die Zellen durch Konjugation an einen zellspezifischen Antikörper, während Letzteres die Produktion des Aktivatorwirkstoffs, z.B. eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression ausgehend von kodierender DNA in einem viralen Vektor umfasst (siehe beispielsweise EP-A-415731 und WO90/07936).
Eine Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, und zwar je nach Behandlung entweder gleichzeitig oder nacheinander.
Beispiel 1: Identifizierung des BRCA2-Gens
Nach der Definition des Intervalls D13S289-D13S267, in dem sich das BRCA2-Gen wahrscheinlich befindet (Wooster et al. (1994)), wurde die folgende Verfahrensfolge verwendet, um das Gen selbst zu identifizieren. Eine künstliches Hefechromosom (YAC-) Contig wurde aus YACs konstruiert, die sich wahrscheinlich in der Region der CEPH-Datenbank befinden. Unter Verwendung von Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung wurde der Chimärismus der YACs untersucht. Überlappungen zwischen YACs wurden durch eine Amplifizierung von sequenzmarkierten Stellen (STS), Hybridisierung von STS-PCR-Produkten und alu-PCR-Fingerprinting hergestellt.
Unter Verwendung von Sonden, die am YAC-Contig lokalisiert sind und davon abgeleitet sind, wurde eine künstliche P1-Chromosomen- (PAC-) Bibliothek gescreent, und positive PACs wurden isoliert. PACs wurden an die PAC-Bibliothek rehybridisiert, um Lücken zwischen Klonen aufzufüllen. Dann wurde ein PAC-Contig mit über einer 1-Megabasen-Region assembliert.
Überlappungen zwischen PACs wurden wie folgt identifiziert:

(a) durch Amplifikation von STS;
(b) durch Hybridisierung von Endsonden, die durch lineare PCR hergestellt wurden;
(c) durch HindIII/Sau3A-Fingerprinting.

Zusätzliche polymorphe Marker von der Region wurden durch Screenen von aus PACs hergestellten M13-Bibliotheken identifiziert, mit Oligonucleotiden, die repetitive Sequenzen enthalten, die im Allgemeinen polymorph sind (GTn, GAn, CAGn, GATAn, GAATn). Unter Verwendung von neuen Markern wurde die Region, in der sich BRCA2 wahrscheinlich befindet, weiter eingeengt.
Transkripte der Region wurden unter folgender Verwendung von PAC-DNAs identifiziert:

(a) in Exon-Trapping-Versuchen unter Verwendung eines λ-GET-Vektors;
(b) in einer Hybridselektion zwischen genomischen PAC-DNA- und cDNA-Bibliotheken.

Durch diese Verfahren identifizierte Exons und cDNA-Fragmente wurden sequenziert.
Unter Verwendung von Primern, die aus diesen Sequenzen synthetisiert wurden, als Sonden wurden 15 kb lange genomische Subklone der PACs identifiziert, die alle oder einen Teil der cDNAs und Exons tragen. Diese wurden aus der cDNA-Sequenz heraus in angrenzende flankierende genomische Sequenzen sequenziert.
Unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, die auf der Basis dieser flankierenden genomischen Sequenzen synthetisiert wurden, wurden genomische DNA-Fragmente, die das mögliche Transkript enthielten, amplifiziert und mithilfe der folgenden DNA-Proben auf Mutationen gescreent; DNAs von 46 Familien, die Anzeichen für Verbindungen mit BRCA2 aufwiesen und/oder Anzeichen gegen Verbindungen mit BRCA1 aufwiesen und/oder keine BRCA1-Mutationen aufwiesen und/oder Anzeichen für Brustkrebs bei Männern aufwiesen. Außerdem wurden Krebszelllinien, die homozygot für alle polymorphen Marker waren, durch die BRCA2-Region gescreent; sowie DNAs von 12 primären menschlichen Tumor-DNAs, die Beweise für einen Verlust an Heterozygotie in der BRCA2-Region aufwiesen.
Sequenzvarianten wurden detektiert, indem ³²P-markierte Amplifikationsprodukte

(a) bei Raumtemperatur und bei 4 °C durch nicht denaturierende Polyacrylamidgele;
(b) durch denaturierende Polyacrylamidgele laufen gelassen wurden.

Fragmente, die veränderte Mobilität aufwiesen, wurden unter Verwendung der PCR reamplifiziert und direkt sequenziert. Sequenzen wurden auf einem DNA-Sequenator ABI 377 laufen gelassen.
Im Laufe dieser Arbeit wurden verschiedene Sequenzvarianten detektiert, von denen die meisten wahrscheinlich Polymorphismen sind, die nicht mit der Krankheit zusam menhängen. Es wurde jedoch vorausgesagt, dass eine Anomalie, die in einem Fragment detektiert wurde, in einer Familie, die eine starke Verbindung mit BRCA2 aufweist, eine Spleißstelle zerstören und ein Stoppcodon schaffen würde. Die Variante segregiert das Krankheitschromosom. Das ist genau die Art von Anomalie, die in einem Krebsanfälligkeitsgen erwartet wird, weshalb dieses Fragment ein starker Kandidat für einen Teil des BRCA2-Gens war.
Dieses Fragment wurde dann (a) als Sonde beim Screenen von cDNA-Bibliotheken, (b) aus Ausgangssequenz für PCR-Amplifikationsversuche von cDNAs und cDNA-Bibliotheken verwendet. Positive Klone und Amplifikationsfragmente wurden sequenziert. Diese Ergebnisse sind in 1 und 2 zu sehen.
Ausgehend von der anfänglichen Isolation dieses Teils von Exon 16 des BRCA2-Gens wurde dann eine Reihe von herkömmlichen Verfahren verwendet, um die restlichen Teile der BRCA2-Sequenz zu isolieren. Die 900.000 by lange Sequenz, die im Internet freigegeben wurde (Sanger-Sequenz), unterstütze dieses Verfahren. 4 zeigt etwa 75 % der cDNA-Sequenz, die von den Erfindern isoliert wurde, während die komplette BRCA2-Gensequenz, einschließlich der Exon/Intron-Struktur, in 7 zu sehen ist. Die Promotorregion des Gens ist in 6 zu sehen. Diese Sequenzen können von den ftp-Websites auf einen lokalen Computer heruntergeladen werden. Die Sequenzen können dann unter Verwendung von Programmen, wie beispielsweise BLAST, FASTA, GRAIL oder GeneFinder, analysiert werden, um mögliche kodierende Regionen zu identifizieren. Dann können Oligos für diese vorhergesagten kodierenden Regionen bestimmt werden, und diese werden in einer RT-PCR verwendet, um die kodierenden Regionen zu bestätigen oder zu widerlegen. Die kodierenden Regionen würden also mit der Versuchsergebnissen verglichen, die im hierin dargelegten Verfahren erhalten werden.
Somit könnten Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung, wenn sie einen Teil der BRCA2-Sequenz und ihre Ausrichtung in der Sanger-Sequenz kennen, leicht den Rest der Sequenz unter Verwendung eines herkömmlichen Exon-Vorhersagepro gramms isolieren, um mögliche Exons/offene Leseraster mit derselben Ausrichtung wie der bekannte Abschnitt der BRCA2-Sequenz zu lokalisieren, und dann eine Exon-Verbindung vornehmen, in der mögliche Exons verwendet werden, um Primer zu entwerfen, die in einer möglichen kodierenden Sequenz sitzen. Die Primer könnten so entworfen werden, dass sie einen Primer, der auf einer bekannten BRCA2-Sequenz basiert, und einen unbekannten Primer aufweisen, so dass, wenn diese zum Primen ausgehend von cDNA verwendet werden, ein Produkt produziert wird, das an eine bekannte Sequenz angrenzt, wenn der unbekannte Primer Teil des BRCA2-Gens ist. Dieses Verfahren könnte auf iterative Weise wiederholt werden, wodurch Fachleute leicht die gesamte Sanger-Sequenz durchlaufen können, um die volle BRCA2-Sequenz zu erhalten, wodurch die Intron/Exon-Grenzen als Teil des Verfahrens erhalten werden. Im Falle von BRCA2 ist ein großer Teil der kodierenden Sequenz (etwa 5 kb) in Exon 11, von der sich ein Teil in 10 % der Sequenz befindet, die in 1 und 2 dargelegt ist.
Die oben beschriebenen Verfahren und andere nützliche Verfahren zur Isolation von Genen durch Positionsklonierung sind in Monaco, Curr. Opinion Gen. Devel. 4, 360-365 (1994), beschrieben und in der EP-A-0705902 zusammengefasst.
Zur weiteren Unterstützung ist im Folgenden eine Arbeitsvorschrift zur Isolation der Sequenz voller Länge und des Polypeptids, für welches das BRCA2-Gen kodiert, aus der in 1, 2 und 4 dargelegten Sequenz enthalten, die wiederholt werden könnte, um darauf folgende Teile des BRCA2-Gens zu isolieren.
Screenen von cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung
Derzeit identifizierte cDNA-Fragmente können ³²P-markiert und an verschiedene allgemein erhältliche, auf einer Platte oder einer Membran geordnete cDNA-Bibliotheken hybridisiert sein. Positive Klone können dann isoliert und einer erneuten Ausplattierung und Rehybridisierung unterzogen werden, falls notwendig, bis ein reiner Klon isoliert wurde. DNA kann dann aus reinen Klonen hergestellt werden und wird durch herkömmliche Sanger-Didesoxysequenzierung auf einem DNA-Sequenator ABI 377 sequenziert.
Screenen von cDNA-Bibliotheken durch PCR-Amplifikation
Oligonucleotide, die auf Sequenzen basieren, die zu den hierin offenbarten BRCA2-Sequenzen gehören, können zusammen mit Oligonucleotiden verwendet werden, die in PCR-Amplifikationen von Aliquoten von allgemein erhältlichen cDNA-Bibliotheken zum Primen ausgehend vom Klonierungsvektor verwendet werden. Das ermöglicht die Amplifikation von Fragmenten der BRCA2-cDNA, die zwischen dem derzeit bekannten Fragment und der Klonierungsinsertionsstelle positioniert ist. Produkte der PCR-Amplifikation können dann unter Verwendung von Sanger-Didesoxysequenzierung auf einem Sequenator ABI 377 sequenziert werden.
Rasche Amplifikation von cDNA-Enden (RACE)
Primäre cDNAs, die aus einer Reihe von unterschiedlichen Gewebe-RNAs synthetisiert wurden, können an einen Oligonucleotid-Linker ligiert werden. Nach einer Reinigung können unter Verwendung eines Oligonucleotids, das ausgehend von der derzeitigen BRCA2-cDNA-Sequenz primt, und eines zweiten Oligonucleotids, das ausgehend vom Linker primt, PCR-Amplifikationen durchgeführt werden. Amplifikationsprodukte werden direkt unter Verwendung von Sanger-Didesoxysequenzierung sequenziert. RACE ist in (6) beschrieben.
Die neuen Sequenzen können dann durch die Detektion von Überlappungen mit vorher bekannten Komponenten der Sequenz in die volle Sequenz des Gens integriert werden.
Das Screenen von cDNA oder genomischen Bibliotheken mit ausgewählten Sonden kann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Ausubel et al. und Sambrook et al. (w.o.) beschrieben sind.
Diese Verfahren ermöglichen eine Isolation der gesamten kodierenden Sequenz basierend auf den in 1, 2 und 4 dargelegten Informationen. Die Sequenz voller Länge ist als die Sequenz zwischen einem Translationsstartcodon (ATG) und einem Translationsstoppcodon (TAA, TAG, TGA) definiert, zwischen denen es einen offenen Leseraster gibt. Dieses wiederum kann verwendet werden, um die Intron-Exon-Struktur des Gens zu definieren. Primer können dann so entworfen werden, dass sie jedes Exon flankieren, so dass die gesamte kodierende Sequenz des Gens ausgehend von genomischer DNA amplifiziert werden kann; siehe beispielsweise die in 8 oder in Nature Genetics 12, 333–337 (1996), beschriebenen Primer.
Weitere Fragmente einer kodierenden Sequenz wurden dann ausgehend von genomischer DNA im weiter oben beschriebenen Mutationstestset amplifiziert, um weitere mit einer Erkrankung zusammenhängende Mutationen im BRCA2-Gen zu detektieren.
Beispiel 2: Mutationen im BRCA2-Gen
Identifikation von sechs Mutationen im BRCA2-Gen
In einer ersten Studie fanden die Erfinder durch Vergleich der nativen Sequenz mit Sequenzen von Familien, in denen mehrere Fälle von früh ausbrechendem Brustkrebs aufgetreten sind, eine Reihe von Mutationen in er BRCA2-Sequenz. Die Stellen dieser Mutationen in der Aminosäuresequenz sind durch Einrahmung der Reste in der nativen Sequenz dargestellt, die betroffen sind (siehe 5). Die Mutationen im BRCA2-Gen sind in Tabelle 3 zusammengefasst, in der die Familien in der linken Spalte und die Mutationen im BRCA2-Gen in der rechten Spalte enthalten sind. Die restlichen Spalten in Tabelle 3 von links nach rechts enthalten Folgendes:

Anzahl an FBCs = Anzahl an Brustkrebsfällen bei Frauen in der

Familie.

Anzahl an FBCs<50 = Anzahl an Brustkrebsfällen bei Frauen unter

50 Jahren.

Anzahl an OvCs = Anzahl an Eierstockkrebsfällen in der Familie.

Anzahl an MBCs = Anzahl an Brustkrebsfällen bei Männern.
Die Spalten der LOD-Bewertung für BRCA1 und BRCA2 geben die Wahrscheinlichkeit an, mit der Krebsfälle in einer Familie mit dem BRCA1- oder BRCA2-Gen in Verbindung stehen, wobei ein höherer positiver Wert auf eine größere Wahrscheinlichkeit hinweist. Ein LOD-Wert von +3 weist beispielsweise auf eine starke Verbindung zwischen der Häufigkeit von Krebs und dem gegebenen Gen in dieser Familie hin.
Um BRCA2 zu identifizieren, wurden genomische DNA-Fragmente mit weniger als 300 bp, die mögliche kodierende Sequenzen enthielten, auf Mutationen gescreent. Aus 46 Brustkrebs-Familien wurde jeweils zumindest ein betroffenes Mitglied untersucht. Alle Familien dieser Gruppe wiesen entweder Anzeichen für eine Verbindung mit BRCA2 und/oder Anzeichen für Brustkrebs auf. Bei den meisten, wahrscheinlich jedoch nicht bei allen, dieser Familien ist der erwartete Grund BRCA2-Mutationen.
Krankheitsverbundene Mutationen in den meisten bekannten Krebanfälligkeitsgenen resultieren üblicherweise in der Trunkierung des kodierenden Proteins und Inaktivierung der entscheidenden Funktionen. Im Verlauf des Screenens auf Mutationen der kodierenden Kandidat-Sequenzen der BRCA2-Region wurde die erste detektierte Sequenzvariante, von der vorhergesagt wurde, dass sie die Translation eines kodierenden Proteins unterbricht, in IARC 2932 beobachtet. Diese Familie ist deutlich mit BRCA2 verbunden, und zwar mit einer Mehrpunkt-LOD-Bewertung von 3,01 unter Verwendung von D13S260 und D13S267. Eine Sechs-Basenpaare-Deletion entfernt die letzten fünf Basen des untersuchen Exons (Exon S66), deletiert das konservierte G der 5'-Spleißstelle des Introns und wandelt das Codon TTT für Phenylalanin direkt in das Stoppcodon TAA um. Durch Sequenzieren wurde diese Mutation in Lymphozyten-DNA aus zwei früh ausbrechenden Brustkrebsfällen in dieser Familie detektiert. Die untersuchten Personen teilen nur den Krankheits-verbundenen Haplotyp. Die Mutation fehlt in mehr als 500 Chromosomen von normalen Personen oder in den restlichen Familien und Krebsarten. Dieses Ergebnis identifiziert daher das Kan didat-Gen, von dem durch die hierin beschriebene Arbeit gezeigt wurde , dass es das BRCA2-Gen ist.
Um das BRCA2-Gen weiter zu charakterisieren, wurde Exon S66 verwendet, um eine Reihe von cDNA-Klonen zu isolieren, die Segmente des BRCA2-Kandiation darstellten. Durch eine vergleichende Anordnung der cDNA- und genomischen Sequenzdaten zeigte sich, dass das BRCA2-Kandidatengen in drei Sequenzcontigs vorlag, die auch andere vorher isolierte transkribierte Sequenzen enthielten. Das Exon- und offene Leseraster-Vorhersageprogramm Genmark wurde verwendet, um mögliche zusätzliche 5'-Exons des Gens zu definieren. Eine Angrenzung der Transkriptionseinheit wurde durch RT-PCR an cDNA und Sequenzanalyse bestätigt. Die Verfügbarkeit von umfassenden Sequenzinformationen auf cDNA- und genomischer Ebene ermöglichte eine Mutationsanalyse weiterer kodierender Regionen des möglichen BRCA2-Gens in Proben von Brustkrebsfamilien.
In den Familien CRC B196 und CRC B211 wurde eine TG-Deletion (6819deITG) bzw. eine TT-Deletion (6503delTT) detektiert (Tabelle 1 und 2). In beiden Familien wurden die Mutation durch Sequenzierung anderer Personen mit früh ausbrechendem Brustkrebs detektiert, die nur den Haplotyp von 13q-Mikrosatellitenmarkern gemeinsam haben, der mit der Krankheit segregiert.
Daher befinden sich die Mutationen auf den mit der Krankheit zusammenhängenden Chromosomen. Eine CT-Deletion wurde in der Familie IARC 3594 detektiert. Diese Mutation war innerhalb einer kurzen repetitiven Sequenz aufgetreten (CTCTCT), ein Merkmal, das in vielen Genen charakteristisch für Deletion/Insertion-Mutationen ist und wahrscheinlich auf den Schlupf während einer DNA-Synthese zurückzuführen ist. Schließlich wurde in Montreal 681 und 440 eine T-Deletion (6174delT) bzw. eine AAAC-Deletion gefunden. In beiden Familien gab es Fälle von Brustkrebs bei Männern, und vorherige Analysen haben gezeigt, dass der Großteil solcher Familien BRCA2-Mutationen aufweist. Von allen diesen Mutationen wird vorhergesagt, dass sie Rasterverschiebungen verursachen, die zu vorzeitigen Stoppcodons führen. In Chromosomen von über 500 gesunden Frauen wurde keine der Mutationen gefunden, weshalb es sich wahrscheinlich nicht um Polymorphismen handelt. Die Identifizierung verschiedener Keimbahnmutationen, die das kodierte Protein in Familien mit Brustkrebs, der höchstwahrscheinlich auf BRCA2 zurückzuführen ist, trunkieren, weist stark darauf hin, dass die Erfinder das BRCA2-Gen identifiziert haben. Im Detail wurde die 6174delT-Mutation einer jüdischen aschkenasischen Familie in anderen untersuchten Familien reproduziert und kann so zum Screenen von Personen auf Anfälligkeit für Krebs nützlich sein, vor allem für Brustkrebs bei Männern oder Frauen oder für Eierstockkrebs.
Eine Northern-Analyse zeigte, dass für das BRCA2-Gen ein Transkript aus 10 bis 12 kb kodiert, das in normalen Brust-Epithelzellen, Plazenta und der Brustkrebszelllinie MCF7 vorhanden ist. Das lässt vermuten, dass das vorliegende Contig von cDNAs, das etwa 9 kb abdeckt (einschließlich 1,6 kb einer untranslatierten 3'-Sequenz), nicht die ganze für BRCA2 kodierende Region umfasst. Die bekannte Sequenz aus 2329 Aminosäuren, für die das BRCA2-Gen kodiert, weist keine starke Homologie zu Sequenzen in öffentlich zugänglichen DNA- oder Protein-Datenbanken auf. Die Homologie und Motive von BRCA2, die in einer Analyse der entsprechenden Gene in anderen Spezies gefunden wurden, sind in Beispiel 6 beschrieben. Einige schwache Übereinstimmungen wurden jedoch detektiert, faszinierenderweise auch eine sehr schwache Ähnlichkeit mit dem BRCA1-Protein über eine eingeschränkte Region (Aminosäuren 1394–1474 in BRCA1 und 1783–1863 in dem in 5 dargestellten Abschnitt von BRCA2).
Identifizierung weiterer Mutationen im BRCA2-Gen
Patientenmaterial
Familien, in denen mindestens drei Fälle von Brustkrebs aufgetreten waren und in der DNA-Proben von zumindest einer betroffenen Person verfügbar waren, wurden identifiziert. Durch eine komplette oder partielle Analyse des BRCA1-Gens wurden die Familien mit Keimbahnmutationen identifiziert, die mit der Erkrankung zusam menhängen. In den restlichen Familien wurde die gesamte für BRCA2 kodierende Sequenz auf Keimbahnmutationen analysiert, die in Tabelle 1 der Häufigkeit von Brustkrebs (einschließlich früh ausbrechendem Brustkrebs) und Eierstockkrebs gegenübergestellt wurde. Grenzlinien-Eierstockkrebs war nicht eingeschlossen. Die Diagnose konnte durch pathologische Berichte oder Totenscheine bestätigt werden.
Mutationsanalyse von BRCA2 in Familien mit Eierstockkrebs
Siebenundsiebzig Familien, in denen Verwandte zwei oder mehr Verwandte ersten Grades an Epithel-Eierstockkrebs litten, wurden auf BRCA2-Mutationen untersucht. Ein Mutationsscreening wurde unter Verwendung einer Kombination aus dem Test für trunkierte Proteine (PTT) und der nichtradioaktiven Einzelstrang-Konformations-Analyse/Neteroduplex-Analyse (SSCA/HA) durchgeführt. Der PTT wurde bei Personen, bei denen von Lymphoblastoidzelllinien abgeleitete RNA für die Durchführung einer PCR mit reverser Transkriptase verfügbar war, in allen Fällen ausgehend von genomischer DNA für Exon 11 und für die gesamte kodierende Region durchgeführt. Primer wurden entworfen, um Exon 11 oder die gesamte kodierende Sequenz in überlappenden Fragmenten, deren Größe von 10 bis 1,3 kb reichte, durch PCR zu amplifizieren.
Der PTT wurde unter Verwendung des TNT-Kaninchen-Retikulozytenlysat-Systems (Promega) durchgeführt, das ³⁵S-Methionin (Amersham) zur Proteindetektion umfasste. Proteinprodukte wurden auf 12 – 15 % SDS-Polyacrylamidgelen bei 30 – 60 mA einer 12- bis 16-stündigen Elektrophorese unterzogen. Die SDS-PAGE-Gele wurden in 30 % Methanol/10 % Eisessig fixiert, getrocknet und 16 – 72 Stunden lang einem Kodak X-Omat-Film ausgesetzt. Die ungefähre Position der Sequenzveränderung, die zu trunkierten Proteinvarianten führte, wurde lokalisiert, und die Region wurde sequenziert, um die genaue Nucleotidveränderung zu bestätigen. Eine SSCA/HA wurde auf genomischer DNA für die kodierenden Exons 2 – 10 und 12 – 27 durchgeführt. Die 5'- und 3'-Spleißgrenzen für Exon 11 wurden ebenfalls analysiert. SSCA- und HA-Variantenkonformere wurden wie oben in (3) beschrieben sequenziert, um die genaue Nucleotidveränderung zu charakterisieren. Die Fähigkeit, durch PTT identifizierte Mutationen unter Verwendung von SSCA/HA zu detektieren, konnte unter der Verwendung von SSCA/HA auf Fragmenten mit einer Größe von 300 – 600 bp detektiert werden. Alle Primersequenzen, die für PTT und SSCA/HA entworfen wurden, sind auf Anfrage erhältlich (E-Mail: [email protected]).
Mutationsanalyse von BRCA2 in Brustkrebsfamilien
Statistische Verfahren
Die Erfinder untersuchten die Verbindung zwischen der Mutationsstelle und dem Phänotyp der Krankheit unter Verwendung eines ähnlichen Permutationsarguments, wie es von Gayther et al. (12) verwendet wurde. Die statistischen Verfahren zur Bestimmung des Unterschieds in der Häufigkeit von Eierstockkrebs als Anteil aller Eierstockkrebs- und Brustkrebsfälle, was bestimmt durch Position bestätigt wurde, basierten auf herkömmlichen Chi-Quadrat-Tests. In der Hauptanalyse wurde die Variable X unter Annahme einer alternativen Hypothese berechnet, in der unterschiedliche Häufigkeiten für Mutationen in drei verschiedenen Regionen angewandt wurden, d.h. vor dem Codon n1–n2 und nach n2 (d.h. 2 Freiheitsgrade nach Chi-Quadrat). Die drei möglichen Fehlsinnmutationen wurden in dieser Analyse ignoriert, da ihre Bedeutung unklar ist. Die Variable X wurde über alle möglichen Werte der Trennpunkte n1 und n2 maximiert, was die Variable Xm ergab. Die Signifikanz dieses maximierten Chi-Quadrats wurden dann empirisch berechnet, indem der Wert von Xm in 50.000 Dateneinheiten berechnet wurde, in denen die 26 Mutationen zufällig unter den Familien permutiert wurden. Die Erfinder berechneten außerdem eine Variable, um die Tendenz in der Häufigkeit von Eierstockkrebs im Vergleich zu Brustkrebs entlang des Gens zu bestimmen, und zwar basierend auf einem Chi-Quadrat-Test für eine Tendenz, wie er in (12) beschrieben ist, was jedoch nicht signifikant war.
In einem Versuch, die Verbindung unter Verwendung anderer Daten aus vorher veröffentlichten Berichten zu bestätigen, berechneten die Erfinder die Chi-Quadrat-Variable (zwei Freiheitsgrade) unter Verwendung von Daten aus fünf Studien (9, 10, 15 – 17), wobei die Trennpunkte n1 und n2 bei den besten Werten der Daten aus Groß britannien gehalten wurden. Die Signifikanz dieser Ergebnisse basierte wie oben auf einer Permutation der Mutationen unter den Familien.
Diskussion
BRCA2 ist wahrscheinlich für den Großteil der Familien mit hohem Risiko verantwortlich, für die nicht BRCA1 verantwortlich ist. Die Identifizierung von BRCA2 sollte daher eine umfassendere Bewertung von Familien mit hohem Brustkrebsrisiko ermöglichen. Die Auswirkung von Umwelt-, Lebensweise- oder genetischen Faktoren auf das Krebsrisiko in Genträgern ist jedoch unbekannt, und es werden weitere Studien erforderlich sein, bevor eine routinemäßige Diagnose des Trägerstatus in Betracht gezogen werden kann.
Obwohl viele der in diesen Beispielen beschriebenen Mutationen nicht gleichzeitig in den BRCA2-Genen unterschiedlicher Familien auftreten, können diese Mutationen in Verfahren zur Diagnose oder Detektion einer Prädisposition für Krebs, vor allem Brustkrebs, trotzdem von Nutzen sein. Außerdem kann sich in einer weiteren Routineuntersuchung größerer Familienproben herausstellen, dass eine gegebene Mutation bei einem signifikanten Anteil an Krebsfällen vorhanden ist und so die Basis für einen einfachen Diagnosetest bilden. Auch wenn das nicht der Fall ist, kann es bei der Verringerung der Sequenzierungsarbeit helfen, die für die Durchführung eines Tests an einem Patienten erforderlich wäre, wenn die Position der Mutationen bekannt ist, indem beispielsweise das BRCA2-Gen ganz oder teilweise sequenziert wird, um ein Prädisposition oder Anfälligkeit für Krebs zu bestimmen. Weitere Anwendungen und Zwecke der Mutationen sind im obigen allgemeinen Abschnitt erläutert.
Keimbahnmutationen von BRCA2 sind wahrscheinlich für 35 % der Familien mit mehreren Fällen von früh ausbrechendem Brustkrebs bei Frauen verantwortlich, und sie hängen auch mit einem erhöhten Risiko von Brustkrebs bei Männern, Eierstockkrebs, Prostatakrebs und Pankreaskrebs zusammen (5, 9, 10). Keimbahnmutationen eines zweiten Krebsanfälligkeitsgens BRCA1 (3) hängen mit einer starken Prädisposition für Eierstockkrebs sowie Brustkrebs bei Frauen zusammen (11). Neuere Untersuchungen lassen vermuten, dass der Phänotyp in BRCA1-Familien in Bezug auf das Verhältnis zwischen Brust- und Eierstockkrebs mit der Position der BRCA1-Mutation variiert (12, 13). Um zu bestimmen, ob Keimbahnmutationen in BRCA2 mit einer ähnlichen Veränderung des phänotypischen Risikos zusammenhängen, haben die Erfinder die Verteilung von Mutationen von Familien mit mehreren Fällen von Brust- und/oder Eierstockkrebs aus Großbritannien und Irland analysiert. Die Mehrheit dieser Mutationen führte zu einer verfrühten Trunkierung von BRCA2 als Folge von Rasterverschiebungsdeletionen, Insertionen, Nichtsinnmutationen oder Spleißstellenveränderungen. Eine Analyse der Mutationsverteilung entlang der Länge des Gens weist auf eine signifikante Abhängigkeit zwischen Genotyp und Phänotyp hin. Trunkierungsmutationen in Familien mit dem höchsten Eierstockkrebsrisiko im Vergleich zu Brustkrebs liegen in einer Region von etwa 3,3 kb in Exon 11 (p = 0,0005). Veröffentlichte Daten über Mutationen in 45 anderen Familien mit BRCA2-Verbindungen belegen diese Abhängigkeit.
Die Familien wurden basierend auf entweder drei oder mehr Fällen von Brustkrebs oder zwei oder mehr Verwandten ersten Grades mit Epithel-Eierstockkrebs, der in einem beliebigen Alter diagnostiziert wurde, ausgewählt. Mutationen des BRCA1-Gens wurden dann identifiziert, und genomische DNA von einer einzelnen betroffenen Person aus jeder der verbleibenden Familien wurden verwendet, um die gesamte kodierende Sequenz von BRCA2 unter Verwendung einer Kombination aus Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP) und Tests für trunkierte Proteine (PTT) auf Mutationen zu screenen. Die für BRCA2 kodierende Sequenz besteht aus 10.248 Nucleotiden, die durch 26 Exons kodiert sind (15). Die meisten Exons sind relativ klein, obwohl Exon 10 und 11 etwa 60 % der gesamten kodierenden Region ausmachen. Die gefundenen Mutationen sind in Tabelle 1 und 2 zusammengefasst. Das Mutationsspektrum bestand aus 22 Rasterverschiebungsdeletionen oder -insertionen, 3 Nichtsinnmutationen und einer Spleißstellenveränderung. Diese Mutationen führen wahrscheinlich alle zu einer verfrühten Trunkierung des vorhergesagten BRCA2-Peptids. Drei neue mögliche Fehlsinnmutationen wurden ebenfalls detektiert. Mutationen waren auf dem ganzen Gen verteilt, und nur eine zusätzliche Mutation, 6503delTT, trat wiederholt auf.
BRCA2-Mutationsdaten von Familien außerhalb Großbritanniens, erhalten von vorherigen Berichten, und unveröffentlichte Daten der Laboratorien der Erfinder belegten diese Häufung. BRCA2-Mutationen wurden in 45 solchen Familien identifiziert (9, 10, 15–17). Die 17 Familien mit Mutationen in der OCCR weisen 11 Eierstock- und 45 Brustkrebsfälle auf, im Vergleich zu 22 Eierstock- und 282 Brustkrebsfällen in den restlichen Familien (Wahrscheinlichkeitsverhältnis 22,9; Permutationstest für Unterschiede p = 0,007). Damit übereinstimmend gibt es drei große BRCA2-Familien, für die vernünftige systematische Belege für Krebsrisiken verfügbar sind, nämlich UTAH 107 (15), CRC 186 und die isländische Familie (10). Mutationen in allen drei Familien befinden sich nahe dem 5'- oder 3'-Ende des Gens und scheinen mit einem hohen Lebenszeitrisiko für Brustkrebs zusammenzuhängen, wobei Mutationen in der OCCR mit einem Eierstockkrebsrisiko über dem Durchschnitt oder einem niedrigeren Brustkrebsrisiko oder beidem zusammenhängen. In dieser Hinsicht werden zukünftige Daten über die 6174delT-Mutation von besonderer Bedeutung sein. Diese Mutation, die in der OCCR liegt, tritt bei Aschkenasim-Juden häufig auf, und direkte auf einer Population basierende Schätzungen ihrer Häufigkeit bei Brustkrebs- und Eierstockkrebspatienten sollten möglich sein.
Die beobachtete Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp ist etwas überraschend, da – anders als bei BRCA1 – eine Region in der Mitte des Gens mit einem deutlichen Risiko zusammenzuhängen scheint. Es gibt Präzedenzfälle für Krebsanfälligkeitsgene, wie beispielsweise das adenomatöse Polyposis-Coli-Gen, bei dem Mutationsregionen, die sich innerhalb des Gens ansammeln, mit einer Prädisposition für einen spezifischen Phänotyp zusammenhängen (18, 19). Es ist noch nicht bekannt, warum trunkierende Mutationen in einem zentralen Abschnitt des BRCA2-Gens zu einem erhöhen Eierstockkrebsrisiko führen sollen. Keine Regionen mit funktioneller Homologie zwischen BRCA2 und anderen Genen wurden identifiziert. Vor kurzem wurde eine Reihe von acht inneren Aminosäurewiederholungen in Exon 11 gefunden, aber diese weisen wenig Homologie zu anderen bekannten Genen auf (20). Interessant ist wahrscheinlich, dass alle acht Wiederholungen innerhalb der OCCR zu finden sind. Dass diese Mutationen sich in einem einzigen Exon ansammeln, weist auf eine auf alternativer Spleißung basierende Erklärung hin. Eine komplette oder teilweise Spleißung von Exon 11 kann alternativ gespleißte Formen mit der Fähigkeit, Mutationen im Brust-, nicht aber im Eierstock-Epithel zu "retten", ergeben. Die Ergebnisse der Erfinder lassen vermuten, dass es zwischen Brust- und Eierstock-Epithel interessante Unterschiede in der Struktur oder Funktion von BRCA2 gibt.
Beispiel 3: Expression eines BRCA2-Polypeptids
Konstruktion von cDNA-Klonen voller Länge für menschliches BRCA2
Die etwa 10,5 kb lange cDNA, die für menschliches BRCA2 kodiert, wurde von Fragmenten von cDNA, die durch PCR amplifiziert wurde, und von klonierter genomischer DNA assembliert. Alle Restenummern stammen von der Genbank-Zugangsnummer U43746.
Das 5'-Ende der cDNA (Reste 204 – 2357) wurde durch PCR aus cDNA amplifiziert, die unter Verwendung der Primer aus RNA von MCF7-Zellen hergestellt worden war:
Diese 2,1 kb lange Fragment wurde in pBluescript kloniert, und die Sequenz wurde bestimmt.
Dieses Plasmid (p12302) wurde dann mit Asp718, das im Plasmidpolylinker schneidet, und teilweise mit BamHI, das an den Basen 238 und 792 schneidet, verdaut. Das doppelsträngige Oligonucleotid
wurde dann in das Plasmid ligiert, und Rekombinante, die das an das bei Base 238 verdaute Plasmid ligierte Oligo trugen, wurden selektiert.
Dieses Plasmid wurde mit Ndel, das bei by 1795 schneidet, und mit Smal, das im Polylinker des Plasmids schneidet, verdaut. Dieses wurde in einer Dreiwegeligation an ein PCR-Produkt (1795 – 2280), das mit Ndel und BstY1 verdaut worden war, und die Reste 2280 – 6571 als BstY1-BsiHKAI-Framgment ligiert. Letzteres Fragment besteht aus Exon 11 des BRCA2-Gens und wurde aus einem Plasmid isoliert, das genomische DNA trägt. So wurde das Plasmid p12672 erhalten.
Das 3'-Ende der BRCA2-cDNA wurde durch RT-PCR mit den Primern gebildet:
Dieses Fragment wurde in pBluescript subkloniert, um das Plasmid p12661 zu bilden. Danach wurde dieses Fragment mit einem Primer (GTACTCCAGAACATTTAATATCC Basen 6325 – 6344) und dem T3-Primer von Bluescript amplifiziert.
Dieses Fragment, das mit Bsp1201 verdaut worden war, wurde dann in SnaBI-Notlgeschnittenes p12672 ligiert, um den Klon voller Länge p12806 zu bilden.
Dieses Plasmid wurden danach wie folgt modifiziert, so dass es ein FLAG-Epitop wie folgt enthielt. p12806 wurde mit Asp718 und Sall verdaut und dann an pBlueBac2B ligiert, das mit den gleichen Enzymen verdaut worden war. So wurde das Plasmid p13013 erhalten. Dieses wurde mit SacI und BgIII verdaut und wie folgt an einen Linker, der für eine Consensus-Kozak-Sequenz kodierte, und ein Flag-Epitop ligiert.
Diese BRCA2-cDNA voller Länge wurde in Expressionsvektoren ligiert. Genauer gesagt wurde eine modifizierte Version des Vektors pMTSM verwendet. Dieser Vektor trägt einen späten Haupt-Adenovirus-Promotor und einen SV40-Replikationsursprung.
Expression von BRCA2 in Säugetierzellen
Der BRCA2-Expressionsvektor voller Länge wurde unter Verwendung herkömmlicher Verfahren in COS-Zellen transfiziert. Die Expression des Proteins wurde durch Western-Blotting-Immunfällung und Immunfluoreszenz überwacht. Das zeigte, dass das BRCA2-Protein als Protein mit etwa 400 kDa detektiert werden konnte, was in etwa der durch die Sequenz der cDNA vorhergesagten Größe entspricht. Unter diesen Bedingungen wies das Protein in diesem Zelltyp eine komplexe subzelluläre Lokalisierung auf, die entweder in einem membranähnlichen Kompartiment (wahrscheinlich das endoplasmatische Retikulum) oder im Nucleus oder in beiden lokalisiert ist (siehe 11 bis 13).
Wechselwirkung von BRCA2 mit anderen Proteinen
Diese kann unter Verwendung eines Zwei-Hybrid-Systems von Hefe zur Klonierung von Proteinen bestimmt werden, die mit BRCA2 wechselwirken. Da dieses Verfahren möglicherweise durch die Größe des BRCA2-ORF kompliziert wird, kann der ORF in 5 – 10 Fragmente geteilt werden und separat gescreent werden. Diese Fragmente werden als 'Köder' verwendet, sowohl episomal als auch als Integranten in das Hefegenom, und sie werden zum Screenen von Peptidbibliotheken verwendet, wie beispielsweise die von HeLa-Zellen, menschlichem fötalem Hirn stammenden und eine neue Bibliothek, die von einer normalen menschlichen Brust stammt. Klone, die nachweislich in dem Zwei-Hybrid-System Wechselwirken, werden sowohl in vivo als auch in vitro auf ihre Wechselwirkung untersucht. Bakteriell exprimierte GEX-Fusionsproteine werden in vitro auf direkte Wechselwirkung getestet. Epitopmarkierte Versionen von BRCA2 und die möglichen Interaktionsproteine werden zusammen in Zelllinien mikroinjiziert, und ihre subzelluläre Position wird durch Immunfluoreszenz bestimmt, um eine Colokalisierung zu schaffen. Eine Cotransfektion und Kreuzimmunfällung konnte verwendet werden, um zu zeigen, dass die beiden Proteine in vivo wechselwirken. Zusätzlich zur Identifikation des neuen mit BRCA2 wechselwirkenden Proteins können die obigen Ansätze verwendet werden, um herauszufinden, ob BRCA2 direkt mit BRCA1 dimerisieren oder Wechselwirken kann.
Die Art des mit BRCA2 wechselwirkenden Proteins kann auch direkt durch biochemische Fraktionierung, gefolgt von Massenspektroskopie bestimmt werden. Eine Immunfällung von ³⁵S-markierten Extrakten, gefolgt von einer SDS-Gelelektrophorese kann verwendet werden, um das Molekulargewicht dieser Proteine zu schätzen. Diese würden durch analytische 2D-Gelelektrophorese, gefolgt von MALDI-TOF-Massenspektroskopie und Peptidmassenkartierung genauer analysiert werden (23). Dieses Verfahren ermöglicht die zuverlässige Identifizierung von Proteinen, deren Sequenzen in den Datenbasen vorhanden sind, und die Zuweisung von wahrscheinlichen Familienmitgliedern (>80 % Identität).
Biologische Funktion von BRCA2
Um zu testen, ob eine BRCA2-Expression das Wachstum von Brustkrebs- und Eierstockkrebszelllinien spezifisch blockieren kann, kann ein Versuch durchgeführt werden. Idealerweise werden bei solchen Versuchen Brusttumorzellen verwendet, die BRCA2 nicht exprimieren, was leicht durch Screenen von vorhandenen Brustkrebszelllinien auf die Abwesenheit von BRCA2-Expression bestimmt werden kann. Alternativ dazu können Zelllinien aus Patienten genommen werden, die keine BRCA2 vom Wildtyp aufweisen. Außerdem ist es möglich, dass eine Überexpression von BRCA2 in Krebszellen, die immer noch exprimieren, ebenfalls das Wachstum hemmen.
BRCA2-cDNAs können geeigneterweise unter der Kontrolle von retroviraler LTR (pBABE) oder Elongationsfaktor-1α-Promotoren (die pEFBos-Reihen – (22)) exprimiert werden. Plasmide können mit Arzneimittelresistenzmarkern cotransfiziert werden, und die Anzahl an Kolonien, die im Vergleich zu Vektorkontrollen keimen, wird gezählt. Überlebende Kolonien können expandiert und durch Injektion in Nacktmäuse auf Tumorgenese getestet. In Fällen, in denen die Hemmwirkung der Proteine im relativ langfristigen Koloniewachstumstest nicht detektiert werden kann, da die transfizierten Plasmide nicht stabil exprimieren, kann eine Mikroinjektion von BRCA2-Expressionskontrukten vorgenommen werden, durch die injizierte Zellen durch Immunzytochemie des exogenen Proteins oder durch Coinjektion eines Markerplasmids detektiert werden (21). Außerdem könnte eine Zeitraffervideoaufnahme wie oben beschrieben dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Wachstumshemmwirkung zellautonom ist, d.h. ob die Wirkung parakrin oder autokrin ist. Diese Systeme sind auch zur Detektion einer apoptotischen Wirkung von Nutzen.
Beispiel 5: Verfahren zur Detektion von BRCA2-Mutationen
Migrationsverschiebungstests zur Detektion von BRCA2-Mutationen
DNA-Amplifikation in der PCR
25 ng genomische DNA von jeder Person, die auf Mutationen gescreent werden soll, werden in 35 PCR-Zyklen unter Verwendung der passenden Oligonucleotidprimer (siehe Primerliste) amplifiziert. Vor der Einbringung in die PCR werden beide Oligonucleotidprimer am Ende mit Gamma-³²P unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase radioaktiv markiert. Nach einer Amplifikation in der PCR wird Formamid-ladender Farbstoff zu jeder einzelnen Probe zugesetzt, und die Probe wird 3 Minuten lang bei 94 °C denaturiert. Nach der Denaturierung wird die Probe sofort auf Eis gegeben.
Größenbestimmung des DNA-Fragments
2 μl jeder Probe werden direkt auf einen Well gegeben, der durch einen Haifischzahnkamm mit 40 Schlitzen in herkömmlichem 0,4 mm dickem denaturierendem 6 Polyacrylamidgel gebildet wird. Die Probe wird durch das Gel 2 – 5 Stunden lang bei 90 Watt und Raumtemperatur elektrophoresiert.
SSCP-Heteroduplexanalyse
SSCP ist ein auf PCR basierender Test zum Screenen von DNA-Fragmenten auf Sequenzvarianten/-mutationen. Es umfasst die Amplifizierung von radioaktiv markierten 100 – 300 by langen Fragmenten des BRCA2-Gens, das Verdünnen dieser Produkte und das Denaturieren bei 95 °C. Die Fragmente werden rasch auf Eis abgekühlt, so dass die DNA in einzelsträngiger Form verbleibt. Diese einzelsträngigen Fragmente von BRCA2 werden durch Gele auf Acrylamidbasis laufen gelassen. Unterschiede in der Sequenzzusammensetzung führen dazu, dass die einzelsträngigen Moleküle unterschiedliche Konformationen in dieser Gelmatrix annehmen, wodurch sich ihre Mobilität von den Fragmenten vom Wildtyp unterscheidet und eine Detektion von Mutationen in den analysierten Fragmenten im Vergleich zu einem Kontrollfragment ermöglicht wird, indem das Gel einem Röntgenfilm ausgesetzt wird.
Diese Fragmente mit veränderter Mobilität bzw. veränderten Konformationen werden direkt aus dem Gel herausgeschnitten und direkt für die Mutation sequenziert. Nach einer Denaturierung wird die Probe 10 Minuten lang auf Eis gekühlt, damit sich der Heteroduplex bilden kann. Jede Probe wird mithilfe zwei verschiedener Gelarten elektrophoresiert.
Typische Bedingungen für eine SSCP-Analyse sehen wie folgt aus. 3 μl werden über Nacht bei 4 Watt und Raumtemperatur mithilfe eines 6 % nichtdenaturierenden Polyacrylamidgels mit 10 % Glycerin elektrophoresiert.
3 μl werden vier Stunden lang bei 30 Watt in einem 4 °C kalten Raum mithilfe eines 4,5 % nichtdenaturierenden Polyacrylamidgels ohne Glycerin elektrophoresiert.
Nach der Elektrophorese werden die Gele auf 3-mm-Whatman-Papier getrocknet und bei Raumtemperatur zwei Stunden bis mehrere Tage lang in eine Autoradiographiekassette gegeben.
Nach der Entwicklung des Autoradiographen werden Bandenverschiebungen in einzelnen Proben mit freiem Auge detektiert.
Sequenzierung des PCR-Produkts
Wenn eine Bandenverschiebung in der SSCP-Heteroduplex oder in DNA-Fragment-Größenbestimmungsgelen sichtbar ist, wird das betroffene Fragment ausgehend von der relevanten genomischen Stamm-DNA reamplifiziert und direkt sequenziert. Um ein PCR-Produkt zu sequenzieren, wird das Produkt mit Isopropanol ausgefällt, resuspendiert und unter Verwendung eines TagFS+-Dye-Terminator-Sequenzierungssets sequenziert. Verlängerungsprodukte werden auf einem DNA-Sequenator ABI 377 elektrophoresiert, und die Daten werden unter Verwendung der Software Sequence Navigator analysiert.
BRCA2-PTT-Test
PTT ist ein weiterer auf PCR basierender Screening-Test. Fragmente von BRCA2 werden mit Primern amplifiziert, welche die Consensus-Kozak-Startsequenzen und einen T7-RNA-Polymerasepromotor enthalten. Diese zusätzlichen Sequenzen werden in den 5'-Primer inkorporiert, so dass sie in einem Raster mit der nativen kodierenden Sequenz des analysierten Fragments sind. Diese PCR-Produkte werden in ein gekoppeltes Transkriptions-/Translationssystem eingebracht. Diese Reaktion ermöglicht die Herstellung von BRCA2-RNA aus dem Fragment und die Translation dieser RNA in ein BRCA2-Proteinfragment. PCR-Produkte von Kontrollen ergeben in Bezug auf die Größe des analysierten Fragments ein Proteinprodukt mit der Größe eines Wildtyps. Wenn das analysierte PCR-Produkt eine Rasterverschiebungs- oder Nichtsinnmutation aufweist, ergibt der Test in Bezug auf Kontrollen ein trunkiertes Proteinprodukt. Die Größe des trunkierten Produkts hängt von der Position der Muta tion ab, und die relative Region des BRCA2-Gens von diesem Patienten wird sequenziert, um die Trunkierungsmutation zu identifizieren.
Die folgende Arbeitsvorschrift wurde für einen BRCA2-PTT-Test angepasst. Die PTT-Primer sind in 10 zu sehen.
Jedem PTT-Primer geht die T7/Kozak-Sequenz voraus:

1. Fünfunddreißig Zyklen umfassende primäre PCR-Reaktion in 20 μl. 2. Produktbestätigung durch Elektrophorese auf 2 % Agarosegel.
3. Drei-μl-Aliquotenamplifizierung mit einem verschachtelten PTT-Primer in 15 Zyklen.
4. Produktbestätigung durch Elektrophorese auf 2 % Agarosegel.
5. In-vitro-Transkription/Translation unter Verwendung eines TNT-Sets von Promega (CA), wobei ³⁵S radioaktiv markiertes Methionin inkorporiert wird.
6. Laemmli-Puffer-Reaktionsstopp und Denaturierung.
7. Gelelektrophorese des Produkts auf 15 % Acrylamidgel bei 16 mA.
8. Fixierung, Amplifizierung und Geltrocknung.
9. 2-stündige autoradiographische Exposition.

Diese Ansätze können kombiniert werden, um genaues und effektives Screening bereitzustellen, und zwar in Bezug auf die erhaltenen Ergebnisse, die wirtschaftlichen Kosten und die Dauer bis zur Bereitstellung der Ergebnisse. Eine von den Erfindern verwendete kombinierte Arbeitsvorschrift umfasst beispielsweise Folgendes:

1) DNA-Proben von Familienreferenzfällen (Probanden) werden zuerst durch PTT gescreent. Die Exons 10, 11 und das terminale Exon 27 werden unter Verwendung dieses Verfahrens untersucht. Die Exons 10 und 27 werden in 1 Fragment untersucht, während das größere Exon 11 in 2 Fragmenten untersucht wird. Wenn Proteintrunkierungen auftreten, wird die entsprechende genomische Region des Patienten sequenziert, um die genaue Mutation zu identifizieren. Durch diesen Ansatz können etwa 60 % der kodierenden Region auf rasche Weise gescreent werden.
2) Proben, die beim PTT-Screening negative Ergebnisse brachten, werden dann unter Verwendung von SSCP analysiert. Die gesamte kodierende Region, einschließlich jener Regionen, die schon durch PTT untersucht wurden, werden unter Verwendung von SSCP auf Mutationen gescreent. Die kodierende Sequenz wird ausgehend von genomischer DNA unter Verwendung von Primersätzen amplifiziert, wie in dieser Anmeldung beschrieben ist. Außerdem werden auch für die SSCP-Analyse hergestellte, radioaktiv markierte PCR-Produkte auf denaturierenden Acrylamid-Sequenzierungsgelen laufen gelassen, wodurch kleine Veränderungen in Bezug auf Kontrollfragmente detektiert werden können, die auf Insertionen oder Deletionen hinweisen. Alle gefundenen mutierten Fragmente werden direkt aus den Gelen herausgeschnitten und direkt zusammen mit dem übereinstimmenden genomischen DNA-Fragment sequenziert, um die genaue Mutation zu bestimmen.

Screening-Beispiele, die unter Verwendung dieser Verfahren durchgeführt wurden, sind in der folgenden Tabelle dargelegt.
BRCA2-Screening in Probanden aus Brustkrebsfamilien
Beispiel 6: Ergebnisse einer vergleichenden Sequenzanordnung
Materialien und Verfahren
Von einer grünen Meerkatze (Ceropithecus aethiops), einem Hamster (Critetulus griseus), einem Schwein (Sus scrofa), einem Hund (Canis familiaris), einer Kuh, einem Schimpansen, einem Huhn, einer Schlange, einem Zebrafisch, X. laevis, S. pombe und S. cerevisiae wurde die gesamte genomische DNA entnommen. PCR-Primer wurden aus einer Consensus-Sequenz für das menschliche BRC-Motiv entworfen. Diese umfassen Primer, die eine genaue Entsprechung der menschlichen DNA-Sequenz waren und auf der BRCA2-Proteinsequenz basierende degenerierte Primer. Die Sequenzen waren wie folgt.
Motiv der Vorwärtssatzes 1: reiner Primer -AAAGCTGTGAAACTGTT und ein degenerierter Satz, der einem Gemisch aus gleichen Mengen -AA(AG)GCIIIIAA(AG)CTITT und -AA(AG)GCIIIIAA(AG)TT(AG)TT besteht, worin I Inosin ist.
Motiv des Vorwärtssatzes 2: reiner Primer wie in Satz 1 und ein degenerierter Satz aus -AA(AG)GCIGTIAA(AG)CTITT und -AA(AG)GCIGTIAA(AG)TT(AG)TT.
Motiv des Rückwärtssatzes: reiner Primer -TTCCCACTTGCAGTCTGAAA und ein gemischter Satz aus -TICC(GA)CTIGCIGT(CT)TG(GA)AA und -TTICCIGAIGCIGT(CT)TG(GA)AA.
Weitere Primersätze wurden für eine Region von BRCA2 entworfen, die zwischen Mensch und Maus konserviert ist. Diese waren ein reiner Primer aus AGCAAGCAATTTCAAGG und ein degenerierter Satz aus -TCIAA(AG)CA(AG)TT(TC)GA(AG)GG und -AG(TC)AA(AG)CA(AG)TT(TC)GA(AG)GG. Die PCR wurde unter Verwendung der einzelnen Vorwärtsprimer zusammen mit einem relevanten Rückwärtsprimer durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie in (4) beschrieben, mit der Ausnahme der Kreislaufbedingungen der PCR. Diese umfassen 94 °C 1 min lang, X °C 1 min lang. 72 °C 1 min lang, worin X 65 °C für die ersten beiden Zyklen und dann alle zwei Zyklen um 2 °C weniger betrug, bis entweder 55, 49, 45, 39 oder 35 °C erreicht wurden, wonach X konstant blieb. Weitere 30 Zyklen wurden bei der endgültigen Anellierungstemperatur durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen aufgelöst, und getrennte Banden wurden ausgeschnitten und unter Verwendung einer Arbeitsvorschrift für Taq-Didesoxy-Termination (Perkin-Elmer) sequenziert. Sequenzprodukte wurden auf einem automatisierten DNA-Sequenator ABI377 aufgetrennt.
Alle Sequenzierungsreaktionen wurden zumindest zweimal und auf beiden Matrizensträngen durchgeführt. Speziesspezifische PCR-Primer wurden unter Verwendung der obigen DNA-Sequenz für Exon 11 des BRCA2-Gens entworfen. Diese wurden zusammen mit einem Satz von 52 Paaren von PCR-Primern verwendet, die für das menschliche BRCA2-Gen entworfen wurden, um weiteren Segmente von Exon 11 vom Affen, Hund, Schwein und Hamster zu amplifizieren und zu sequenzieren. Eine menschliche BRCA2-Sonde (Exon 11) wurde verwendet, um einen λ-Klon zu identifizieren, der einen Abschnitt des Maus-BRCA2-Gens enthielt. Dieses wurde verwendet, um eine mäusespezifische BRCA2-Sequenz zu erhalten, die wiederum verwendet wurde, um mäusespezifische PCR-Primer zu entwerten. Diese wurden verwendet, um positive Klone in einer Mäuse-BAC-Bibliothek zu identifizieren. Fragmente von, positiven BACs wurden nach dem Zufallsprinzip kloniert, und jene, die Fragmente von Exon 11 des BRCA2-Gens enthielten, wurden sequenziert.
Sequenzierung der BRC-Motive
Zwei Ansätze wurden verwendet, um die Sequenz des BRCA2-Exons 11 (einschließlich der BRC-Motive) in fünf Säugetierspezies zu erhalten, wobei die Sequenz von menschlichem BRCA2 aus früheren Arbeiten genommen wurde; siehe auch 7. Die Sequenz von Exon 11 im Mäuse-BRCA2-Gen wurde aus einem BAC-Klon erhalten, der durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz mit Fragmenten des menschlichen BRCA2-Gens isoliert wurde. Fragmente von BAC wurden nach dem Zufallsprinzip kloniert, und jene, die Fragmente des BRCA2-Gens enthielten, wurden sequenziert. Dann wurden PCR-Primer für die BRC-Motive und die Regionen, die zwischen Mensch und Maus konserviert wurden, entworfen. Diese wurden verwendet, um Fragmente des BRCA2-Gens in DNAs von 12 Spezies zu amplifizieren (wie unter Materialien und Verfahren beschrieben). Eine Sequenz, die Ähnlichkeit zu menschlichem BRCA2 aufweist, wurde von einer grünen Meerkatze, einem Hamster, einem Schwein, einem Hund, einer Kuh und einem Schimpansen erhalten. Die von einem Huhn, einer Schlange, einem Zebrafisch, Xenopus laevis, Schizosaccharomyces pombe und Saccharomyces cerevisiae erhaltenen Sequenzen wiesen keine Ähnlichkeit zu irgendeiner BRCA2-Sequenz auf. Speziesspezifische PCR-Primer wurden für grüne Meerkatzen, Hamster, Schweine und Hunde entworfen. Diese wurden zusammen mit allen PCR-Primerpaaren verwendet, die verwendet wurden, um menschliches BRCA2-Exon 11 zu amplifizieren, um weitere Segmente des Exons zu amplifizieren. Das Verfahren wurde wiederholt, bis alle Sequenzen zwischen den und einschließlich der BRC-Motive(n) eins und acht für die grüne Meerkatze, den Hamster und den Hund erhalten wurden. Unter Verwendung dieses Ansatzes war es nur möglich, die Sequenz für die Wiederholungen 3 – 8 für das Schwein zu erhalten. Insgesamt wurden 46 BRC-Wiederholungen in sechs verschiedenen Säugetieren (einschließlich des Menschen) sequenziert.
Das BRC-Motiv wird in Säugetierspezies konserviert
Die prozentmäßige Identität der Translation von Exon 11 des BRCA2-Gens (etwa die Hälfte der gesamten kodierenden Sequenz) zwischen den sechs Säugetieren ist in der folgenden Tabelle zu sehen. Insgesamt ist der Konservierungsgrad gering, mit einer 58%igen Identität zwischen den 1602 Resten von Mensch und Maus, 54%iger Identität zwischen Maus oder Hamster und Hund und 49%iger Identität zwischen Schwein und Maus (über 928 Aminosäuren). Sogar zwischen eng verwandten Spezies, wie beispielsweise Mensch und Affe oder Maus und Hamster, beträgt die Aminosäureidentität nur 93 bzw. 72 %. Eine vergleichende Anordnung der Sequenzender sechs untersuchten Säugetiere zeigt jedoch, dass Exon-11-Translationen entlang ihrer gesamten Länge vergleichend angeordnet werden können und dass der Konservierungsgrad variabel ist (9). Es gibt eine Reihe von kurzen Regionen mit hoher Identität. Einige dieser Regionen fallen mit BRC-Motiven zusammen, wie beispielsweise BRC1, 2, 3, 4, 7 und 8 (9). Es gibt andere hochkonservierte Segmente, wie beispielsweise die Aminosäuren 469 – 493 (unter Verwendung der Nummerierung der menschlichen Sequenz aus 9), die keine Ähnlichkeit zu den BRC-Motiven oder anderen Aspekten der Datenbanken aufweisen. Keines der Letzteren wird in BRCA2 wiederholt.
Eine vergleichende Anordnung aller 46 sequenzierten Motive zeigt einen hohen Grad an Interspezies- und Intraspezies-Konservierung zwischen BRC1, 3, 4, 7 und 8. Aus dieser vergleichenden Anordnung haben die Erfinder eine Region aus 26 Aminosäuren identifiziert, die in allen BRC-Motiven konserviert ist (2), wodurch die Erfinder eine BRC-Consensus-Sequenz herstellen konnten. Es ist möglich, einige Reste außerhalb dieser gemeinsamen Region vergleichend anzuordnen; solche ver gleichende Anordnungen sind jedoch störungsempfindlich und sehr empfindlich gegenüber den verwendeten Parametern. Es gibt Motive, welche die gesamte Consensus-Sequenz enthalten, wie beispielsweise BRC4, währende andere, wie beispielsweise BRC6, eine beträchtliche Abweichung vom Consensus aufweisen. Insgesamt weisen 30/46 der BRC-Motive (65 %) 11 oder mehr der 13 Consensus-Reste auf, während 87 % acht oder mehr der Consensus-Sequenzen aufweisen.
Die folgende Tabelle zeigt die prozentmäßige Identität zwischen der Translation von Exon 11 des BRCA2-Gens vom Menschen, Affen, Schwein, Hund, Hamster und von der Maus.
Diskussion
Die geringen Sequenzidentitäten für Exon 11 (siehe obige Tabelle) lassen vermuten, dass sich BRCA2 mit höherer Geschwindigkeit entwickelt als die meisten anderen Krebsanfälligkeits-/Tumorsuppressionsgene. Zwischen Mensch und NF1-Maus besteht beispielsweise eine 98%ige Identität, wobei zwischen Mensch und WT1- bzw. Rb1-Maus 95- bzw. 91 %ige Identität besteht. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist jedoch BRCA1, das nur 58 % Aminosäureidentität zwischen Maus und Mensch aufweist. Daher sind BRCA1 und BRCA2, obwohl sie keine wesentliche Sequenzähnlichkeit aufweisen, aufgrund einer hohen Entwicklungsgeschwindigkeit, einer unüblichen Genstruktur (beide weisen ein großes Exon 11 auf, siehe (3) und (7)) und eines Mangels an somatischen Mutationen in sporadisch auftretenden Krebsen ähnlich.
Ob ein oder mehrere dieser Merkmale mit einer Funktionsübereinstimmung zusammenhängen, bleibt zu klären.
Obwohl die Identität für die Translation von Exon 11 des BRCA2-Gens gering ist, sind die meisten BRC-Motive zwischen den analysierten Spezies hochkonserviert. Dies lässt vermuten, dass Druck bestand, die BRC-Wiederholungen in BRCA2 zu erhalten, und dass ihre Funktion daher wichtig ist. In der vergleichenden Anordnung der Erfinder ist BRC6 jedoch viel weniger konserviert als BRC1, 2, 3, 4, 7 und 8 (31 und 85 % Identität zwischen Mensch- und Mäuse-BRC6 bzw. -BRC7). Außerdem wurde es durch Insertionen oder Deletionen verändert, so dass sich die Länge des Motivs zwischen einzelnen Spezies unterscheidet. BRC3 und BRC5 weisen ebenfalls weniger Konservierung auf als BRC1, 2, 3, 4, 7 und 8 (62 bzw. 58 % Identität zwischen Mensch- und Mäuse-BRC3 bzw. -BRC5). Außerdem weisen beide einen höheren Konservierungsgrad auf als die Exon-11-Translation im Allgemeinen. Die Daten lassen vermuten, dass vor der Säugetierbestrahlung eine Vermehrung des Motivs stattfand. Mehrere Aminosäurereste innerhalb von Motiveinheiten (insbesondere in BRC2) unterscheiden sich beispielsweise von den äquivalenten Resten in anderen Einheiten, sind in Säugetierspezies jedoch hochkonserviert. Außerdem sind die Sequenzen, welche die Motive flankieren, nicht zwischen Wiederholungen konserviert, zwischen Spezies in manchen Fällen aber sehr wohl (beispielsweise BRC1 und 4, 9).
Die PCR-Produkte, welche die Erfinder von Nichtsäugetier-DNA erhielten, wiesen keine Ähnlichkeit zu Säugetier-BRCA2 auf. Dies lässt vermuten, dass entweder BRCA2 auf Säugetiere beschränkt ist oder dass Nichtsäugetier-Orthologe von BRCA2 in solchem Ausmaß abweichen, dass sie durch die Verfahren, welche die Erfinder verwendeten, nicht identifiziert werden können. Es gibt jedoch Beweise für eine schwache Ähnlichkeit zwischen der BRC-Sequenz und einem Caenorhabditis-elegans-Gen (CET07E3_2), was vermuten lässt, dass das BRC-Motiv nicht auf Säugetiere beschränkt ist.
Über die Funktion der BRC-Sequenzen sind wenig Informationen bekannt. Trunkierende Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen, die für eine Prädisposition für die Entwicklung von Brustkrebs verantwortlich sind, sind über die gesamte kodierende Region des Gens verteilt. In vielen Fällen lassen die Mutationen alle BRC-Wiederholungen intakt, was nur wenig über die Beziehung zwischen den Motiven und ihrer Rolle in der normalen Funktion von BRCA2 aussagt. Der Abstand zwischen einzelnen Motiven variiert von –60 bis 300 Aminosäuren, ist aber zwischen Säugetieren relativ gut konserviert. Außerdem gibt es mehrere Elemente mit sekundärer Struktur innerhalb jedes Motivs, die anzeigen können, dass sie globuläre Domänen bilden. Ihre Funktionsweise ist jedoch unklar. Folglich wird eine direkte Erforschung notwendig sein, um die biochemischen Funktionen der BRC-Motive aufzuklären.
Konservierte Regionen, wie beispielsweise die in Exon 11 identifizierten BRC-Motive, stellen wertvolle Hinweise auf Domänen des BRCA2-Polypeptids bereit, die bei der Bestimmung ihrer Aktivität wahrscheinlich von Bedeutung sind. Somit sind diese Motive gute Kandidaten für Screening-Untersuchungen, wie sie oben beschrieben wurden, um Nachahmungen für ein BRCA2-Polypeptid zu bestimmen.
Motive von Exon 11, die zwischen einigen oder allen untersuchten und in 9 enthaltenen Spezies konserviert werden, sind in Tabelle 4 zusammengefasst: Tabelle 4
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Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das aus der in 1 oder 2 dargelegten Nucleinsäure-Kodierungssequenz oder Allelen davon besteht.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das aus der Nucleinsäuresequenz eines oder mehrerer der in 2 dargelegten Exons besteht.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das aus der Kodierungssequenz voller Länge oder dem vollständigen BRCA2-Gen besteht, wie durch folgende Schritte erhältlich: (a) Verwendung der in 1, 2 oder 4 gezeigten Nucleinsäuresequenzen zur Konstruktion von Sonden zum Screenen von cDNA oder genomischen Bibliotheken, Sequenzieren der erhaltenen positiven Klone und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen; (b) Verwendung der in 1, 2 oder 4 gezeigten Sequenzen, um Oligonucleotide zum Primen von BRCA2-Nucleinsäurefragmenten zu erhalten, wobei diese Oligonucleotide in Verbindung mit Oligonucleotiden verwendet werden, die zum Primen aus einem Klonierungsvektor bestimmt sind, um durch PCR Nucleinsäurefragmente in einer Bibliothek zu amplifizieren, die Fragmente der BRCA2-Sequenz enthält, Sequenzieren der amplifizierten Fragmente, um die BRCA2-Sequenz zwischen bekannten Teilen der Sequenz und des Klonierungsvektors zu erhalten, und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus den so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen; und/oder (c) Einsatz rascher Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) durch Synthetisieren von cDNAs aus einer Anzahl verschiedener RNAs, wobei die cDNAs an einen Oligonucleotid-Linker ligiert sind, und Amplifizieren durch PCR der BRCA2-cDNAs unter Verwendung eines Primers, der ausgehend von der BRCA2-cDNA-Sequenz aus 1 oder 4 primt, und eine zweiten Primers, der ausgehend von dem Oligonucleotid-Linker primt, Sequenzieren der amplifizierten Nucleinsäure und Wiederholen dieses Verfah rens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus den so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das aus der Kodierungssequenz voller Länge oder dem vollständigen BRCA2-Gen besteht, wie durch folgende Schritte erhältlich: (a) Verwendung der in 1 oder 2 gezeigten Nucleinsäuresequenzen zur Konstruktion von Sonden zum Screenen von cDNA oder genomischen Bibliotheken, Sequenzieren der erhaltenen positiven Klone und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen; (b) Verwendung der in 1 oder 2 gezeigten Sequenzen, um Oligonucleotide zum Primen von BRCA2-Nucleinsäurefragmenten zu erhalten, wobei diese Oligonucleotide in Verbindung mit Oligonucleotiden verwendet werden, die zum Primen aus einem Klonierungsvektor bestimmt sind, um durch PCR Nucleinsäurefragmente in einer Bibliothek zu amplifizieren, die Fragmente der BRCA2-Sequenz enthält, Sequenzieren der amplifizierten Fragmente, um die BRCA2-Sequenz zwischen bekannten Teilen der Sequenz und des Klonierungsvektors zu erhalten, und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus den so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen; und/oder (c) Einsatz rascher Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) durch Synthetisieren von cDNAs aus einer Anzahl verschiedener RNAs, wobei die cDNAs an einen Oligonucleotid-Linker ligiert sind, und Amplifizieren durch PCR der BRCA2-cDNAs unter Verwendung eines Primers, der ausgehend von der BRCA2-cDNA-Sequenz aus 1 primt, und eines zweiten Primers, der ausgehend von dem Oligonucleotid-Linker primt, Sequenzieren der amplifizierten Nucleinsäure und Wiederholen dieses Verfahrens, um die BRCA2-Sequenz voller Länge aus den so erhaltenen Sequenzen zusammenzustellen.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das aus der in 5 dargelegten Nucleinsäuresequenz oder Allelen davon besteht.
Replizierbarer Vektor, der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst und operabel mit Kontrollsequenzen verbunden ist, um seine Expression zu steuern.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert ist.
Verfahren zum Produzieren eines BRCA2-Polypeptids, umfassend das Kultivieren von Wirtszellen nach Anspruch 7, so dass BRCA2-Polypeptid produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, umfassend den weiteren Schritt des Gewinnens des produzierten Polypeptids.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Substanz, die ein isoliertes BRCA2-Polypeptid ist, für das ein Nucleotid nach Anspruch 3 oder 4 kodiert.
Substanz, die ein isoliertes BRCA2-Polypeptidfragment ist, das aus der in 3 dargelegten Aminosäuresequenz besteht.
Substanz, die ein isoliertes BRCA2-Polypeptidfragment ist, das aus der in 5 dargelegten Aminosäuresequenz besteht.
Substanz nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Antikörper, der sich spezifisch an ein BRCA2-Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13 bindet.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose einer Anfälligkeit oder Neigung für Brustkrebs bei Frauen, Brustkrebs bei Männern, Eierstockkrebs oder Prostatakrebs bei einem Patienten durch Analysieren einer Probe vom Patienten auf das BRCA2-Gen oder das Polypeptid, für das es kodiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Vergleichen der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls in der Probe mit der BRCA2-Nucleinsäuresequenz, wie in den 1, 2 oder 4 dargelegt, um zu bestimmen, ob das Nucleinsäuremolekül in der Probe eine oder mehrere Mutationen enthält; oder (b) Nachweis der Gegenwart des Polypeptids, für das das BRCA2-Gen kodiert und das die in 3 oder 5 dargelegte Teilsequenz umfasst, in der Probe und, sofern vorhanden, das Bestimmen, ob das Polypeptid ein Polypeptid voller Länge ist und/oder mutiert ist; oder (c) den Einsatz von PCR unter Beteiligung eines oder mehrerer Primer(s) auf Basis der normalen BRCA2-Gen-Sequenz, wie in 1, 2 oder 4 dargelegt, oder mutierter Formen davon, zum Screenen bezüglich normaler oder mutierter BRCA2-Gene in einer Probe von einem Patienten.