DE69534351T2 - Motorneuronlebenserhaltungsgen: ein Gen für spinale Muskelatrophie - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Feststellung des humanen Gens für das Überleben von Motorneuronen oder SMN-Gens, welches ein Chromosom-5-SMA (spinale Muskelatrophie) festlegendes Gen ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleotidsequenz, welche das SMN-Gen codiert und die entsprechende Aminosäuresequenz, einen Vektor, welcher das für das SMN-Protein codierende Gen oder eine dem Gen entsprechende DNA-Sequenz enthält, und Transformantenstämme, welche das SMN-Gen oder eine dem Gen entsprechende DNA-Sequenz enthalten.
  • Im Genaueren betrifft die vorliegende Erfindung Mittel und Methoden zum Detektieren von Motorneuron-Krankheiten, welche Symptome einer Muskelschwäche mit oder ohne sensorischen Veränderungen, wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), spinale Muskelatrophie (SMA), primäre Lateralsklerose (PLS), Arthrogryposis multiplex congenita (AMC) und dergleichen aufweisen. Die Verfahren zum Detektieren derartiger Motorneuronen-Krankheiten schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von spezifischen DNA-Primern in der PCR-Technik, die Verwendung von Hybridisierungssonden und die Verwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern ein.
  • Noch genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des humanen SMN-Gens oder eines Teils des Gens, von cDNA, eines Oligonukleotids oder des codierten Proteins oder eines Teils davon in einer Therapie durch Einführung des humanen SMN-Gens oder eines Teils des Gens, von cDNA, eines Oligonukleotids oder des codierten Proteins oder eines Teils davon, falls erforderlich, in gentechnisch manipulierte Viren oder Vektoren, welche als harmlose Träger dienen, um das Gen oder einen Teil des Gens, cDNA, ein Oligonukleotid oder das codierte Protein oder einen Teil davon in die Zellen des Körpers, einschließlich Knochenmarkszellen, zu transportieren.
  • Die Erfindung betrifft ferner Antigen-Sequenzen, welche auf das SMN-Gen gerichtet sind.
  • Um Methoden für die Therapie von Motorneuronen-Krankheiten vorzusehen, betrifft die Erfindung ebenfalls das von dem SMN-Gen codierte Protein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Isolierung des Maus-SMN-Gens, der Nukleotidsequenz, welche das Maus-SMN-Gen codiert, und einer entsprechenden Aminosäuresequenz. Ein transgenes Mausmodell, welches die Gesamtheit oder einen Teil des SMN-Gens überexprimiert, und ein transgenes Mausmodell, welches durch homologe Rekombination mit einem mutierten SMN-Gen erzeugt wird, wird ebenfalls beschrieben.
  • 2. Stand der Technik
  • Degenerative Motorneuronenkrankheiten können in drei Hauptkategorien eingeteilt werden: Amyotrophe Lateralsklerose oder ALS, Motorneuronenkrankheiten wie spinale Muskelatrophie (SMA) und Motorneuronenkrankheiten, welche mit anderen Degenerationserkrankungen assoziiert sind, wie primäre Lateralsklerose (PLS).
  • Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist die am häufigsten angetroffene Form einer progressiven Neuronenkrankheit und ist charakteristischerweise eine Krankheit im mittleren Lebensalter. Die Krankheit ist durch einen fortschreitenden Verlust von Motorneuronen, sowohl im cerebralen Cortex als auch in den anterioren Hörnern des Rückenmarks, zusammen mit ihren Homologen in einigen Motor-Kernen des Hirnstamms, gekennzeichnet. Sie betrifft typischerweise sowohl obere als auch untere Motorneuronen, obwohl Varianten vorwiegend lediglich besondere Untergruppen von Motorneuronen, insbesondere früh im Verlauf der Krankheit, betreffen können.
  • ALS wird durch die Entwicklung einer asymmetrischen Schwäche, mit Ermüdung und Verkrampfung der betroffenen Muskeln, ausgeprägt. Die Schwäche wird von einer sichtbaren Abnutzung begleitet, und eine Atrophie der Muskeln entwickelt sich, und mit der Zeit werden mehr und mehr Muskeln betroffen, bis die Krankheit eine symmetrische Verteilung in allen Regionen einnimmt, einschließlich Muskeln des Kauens, Schluckens und der Bewegung von Gesicht und Zunge. Von 50 Prozent der Patienten mit ALS kann erwartet werden, innerhalb von drei bis fünf Jahren ab dem Ausbruch der Krankheit zu versterben. Derzeitig gibt es keine Behandlung, welche einen Einfluss auf das pathologische Fortschreiten von ALS ausübt.
  • Spinale Muskelatrophien (SMA) sind durch die Degeneration von Zellen des anterioren Horns des Rückenmarks gekennzeichnet, welche zu einer fortschreitenden symmetrischen Glieder- und Rumpfparalyse führt, welche mit der Muskelatrophie assoziiert ist. SMA repräsentiert die zweithäufigste tödliche autosomal-rezessive Krankheit nach Cystischer Fibrose (1 von 6000 Neugeborenen). Kindheits-SMA wird klassischerweise in drei klinische Gruppen auf der Grundlage des Alters beim Ausbruch und des klinischen Verlaufs unterteilt. Die akute Form der Werdnig-Hoffman-Krankheit (Typ I) ist durch eine schwere generalisierte Muskelschwäche und Hypotonie bei der Geburt oder in den 3 Monaten im Anschluss an die Geburt gekennzeichnet. Der Tod aufgrund von Atmungsversagen tritt üblicherweise innerhalb der ersten zwei Jahre ein. Diese Krankheit kann von den intermediären (Typ II) und jugendlichen (Typ III, Kugelberg-Welander-Krankheit) Formen unterschieden werden. Typ II-Kinder waren in der Lage, zu sitzen, aber unfähig, ohne Hilfe zu stehen oder zu gehen, und sie bleiben über 4 Jahre hinaus am Leben. Typ III-Patienten wiesen eine proximale Muskelschwäche auf, welche nach dem Lebensalter von 2 begann. Der zugrundeliegende biochemische Defekt bleibt unbekannt. Darüber hinaus gibt es bekanntermaßen eine sich langsam entwickelnde adulte Form von SMA, welche manchmal als SMA IV bezeichnet wird.
  • Primäre Lateralsklerose (PLS) ist eine Variante von ALS und tritt als eine sporadische Erkrankung des späten Lebensalters auf. Neuropathologisch liegt bei PLS eine Degeneration der corticospinalen (pyramidalen) Bahnen vor, welche auf Hirnstamm-Ebenen nahezu normal erscheinen aber mit ihrem Abstieg durch durch die Wirbelsäule zunehmend atrophisch werden. Die unteren Gliedmaßen werden am frühesten und am schwersten betroffen.
  • Arthrogryposis multiplex congenita (AMC) ist ein häufiges Syndrom, welches durch congenitale Gelenkversteifung (Auftreten bei 1 von 3000 Lebendgeburten) gekennzeichnet ist, die aus verringerten Fötusbewegungen in utero resultiert (Stern, W. G., JAMA, 81: 1507–1510 (1923); Hall, J. G., Clin. Orthop., 194: 44–53 (1985)). AMC ist entweder auf Oligo-Hydramnion oder eine Vielzahl von Krankheiten zurückgeführt worden, welche des Zentralnervensystem, die Skelettmuskeln oder das Rückenmark betreffen. Da neuronale Degeneration und Neuronophagie in den anterioren Hörnern auftreten, ist die Hypothese aufgestellt worden, dass AMC neurogenen Ursprungs in Zusammenhang stehen könnte mit einer akuten spinalen Muskelatrophie, der SMA-Typ I-Werdnig-Hoffman-Krankheit (Banker, B. Q., Hum. Pathol., (1986); 117: 656–672).
  • Die Detektion und klinische Diagnose für ALS, AMC, SMA und PLS ist auf Muskelbiopsien, die klinische Diagnose durch einen Arzt und Elektromyographie (EMG) einigermaßen beschränkt. Zum Beispiel sind die klinischen Kriterien für das Diagnostizieren von SMA im "Clinical Criteria International SMA Consortium" (Munsat, T. L., Neuromuscular Disorders, Band 1, S. 81 (1991)) dargestellt. Aufgrund der Komplikationen der verschiedenen Tests zum Detektieren von Motorneuronen-Krankheiten versucht jedoch der Arzt üblicherweise verschiedene Kategorien anderer Krankheitszustände, wie Strukturschäden, Infektionen, Vergif tungen, Stoffwechselkrankheiten und erbliche biochemische Störungen, vor der Anwendung der oben stehend beschriebenen Testverfahren auszuschließen.
  • Es gibt derzeitig keine Behandlung für jedwede der oben stehend erwähnten Motorneuronen-Krankheiten. Grundlegende Rehabilitationsmaßnahmen, einschließlich mechanischer Hilfen von verschiedener Art, können den Patienten, welche diese Krankheiten aufweisen, dabei helfen, die Auswirkungen ihrer Behinderungen zu überwinden, jedoch sind häufig einengende atmungsunterstützende Systeme notwendig, damit der Patient länger überlebt.
  • Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das SMA-Gen zu charakterisieren, welches für SMA-Krankheiten verantwortlich ist, und das SMA-Gen in einen Vektor, zum Beispiel ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen, einen YAC-Vektor, zu klonieren, welcher in dem Transformationsverfahren verwendet werden kann, um große Mengen des SMN-Gens und SMN-Proteins herzustellen.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung von Primern und Hybridisierungssonden, um Patienten, welche Motorneuronen-Krankheiten, wie AMC, ALS, SMA und PLS aufweisen, zu detektieren und zu diagnostizieren. Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des SMN-Gens oder eines Teils davon, oder von cDNA, Oligonukleotiden, Protein oder einem Teil davon, in der Therapie, um Störungen zu korrigieren, welche zum Beispiel in AMC-, SMA, ALS- und PLS-Patienten vorhanden sind, speziell Gen-Störungen.
  • In noch einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung monoklonale und polyklonale Antikörper zum Nachweisen von SMN-Gendefekten in SMA-Patienten vor.
  • Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung kann die Therapie von Motorneuronen-Krankheiten das Protein beteiligen, welches von dem SMN-Gen codiert wird.
  • Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung, wie verdeutlicht durch die Zusammenfassung der Erfindung, die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und die Patentansprüche, erreicht.
  • Ziele und Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues humanes Gen für das Überleben von Motorneuronen bzw. SMN-Gen, seine DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz vorzusehen.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Vektors, der in der Lage ist, in einem Wirts-Mikroorganismus zu replizieren, um große Mengen des humanen SMN-Proteins vorzusehen.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung spezifischer DNA-Sequenzen, welche verwendet werden können, um spinale Muskelatrophie und andere Motorneuronenkrankheiten zu detektieren und zu diagnostizieren. Diese DNA-Sequenzen können als Primer in der Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, um die SMN-Gensequenz, eine trunkierte oder mutierte Version der SMN-Gensequenz zu amplifizieren und nachzuweisen oder das Fehlen der Sequenz nachzuweisen, was zur Diagnose von SMA, AMC und anderen Motorneuronenkrankheiten führt.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht eine transgene Maus vor, welche die Gesamtheit oder einen Teil des SMN-Gens überexprimiert, oder eine transgene Maus, welche durch homologe Rekombination mit einem mutierten Maus-SMN-Gen Abnormalitäten in dem SMN-Gen erzeugt, wird ebenfalls beschrieben.
  • Die Erfinder haben zwei, als T-BCD541 bzw. C-BCD541 bezeichnete, Gene identifiziert, welche an Motorneuronenkrankheiten beteiligt sind.
  • Das T-BCD541-Gen ist verantwortlich für die Motorneuronenkrankheiten des SMA-Typs, da seine Veränderung entweder durch teilweise oder vollständige Deletion, durch Mutation oder jedwede andere Modifikation ausreichend ist, um zu einem pathologischen Zustand auf klinisch-elektromyographischer oder Muskel-morphologischer Ebene zu führen.
  • Das C-BCD541-Gen ist auf der Ebene der cDNA verschieden von dem T-BCD541-Gen, da zwei Nukleotide modifiziert sind. Dieses C-BCD541-Gen wird nichtsdestoweniger während der Transkription in Kontrollen und Patienten, welche unter Motorneuronenkrankheiten leiden, nicht korrekt prozessiert. Die genomische DNA des C-BCD541-Gens wird während der Transkription nicht korrekt gespleißt, wodurch somit ein abnormales Transkript vorgesehen wird. Der Unterschied zwischen dem Splicing des T-BCD541- und des C-BCD541-Gens resultiert aus Unterschieden in der Sequenz der Introns dieser Gene.
  • Die vorliegende Erfindung charakterisiert somit ferner die Struktur und Organisation des humanen SMN-Gens, von welchem festgestellt wurde, eine Länge von ungefähr 20 kb aufzuweisen und aus 9 Exons, welche von 8 Introns unterbrochen werden, zu bestehen. Die Nukleotidsequenz, Aminosäuresequenz sowie die Exon-Intron-Grenzen des humanen SMN-Gens sind in der 10 dargestellt. Alle Exon-Intron-Grenzen weisen die Konsensus- Sequenz auf, welche in anderen menschlichen Genen gefunden wird. Eine Polyadenylierungs-Konsensusstelle ist etwa 550 bp stromabwärts des Stop-Codons lokalisiert (10). Die vollständige Intron/Exon-Struktur des SMN-Gens gestattet die Charakterisierungen der SMN-Genmutationen bei SMA-Krankheit oder anderen Motorneuronenkrankheiten.
  • Die vorliegende Erfindung definiert ebenfalls Mittel für die Detektion von genomischen Abnormalitäten im Zusammenhang mit Motorneuronenkrankheiten auf der Ebene des T-BCD541-Gens oder auf der Ebene des C-BCD541-Gens.
  • Die Gene der Erfindung können ferner definiert werden, dadurch dass jedes von ihnen intronische Sequenzen umfasst, welche den folgenden Sequenzen entsprechen:
    In dem T-BCD541-Gen
    • – für Intron Nr. 6:
      Figure 00060001
    • – für Intron Nr. 7:
      Figure 00060002
    In dem C-BCD541-Gen:
    • – für Intron Nr. 6:
      Figure 00070001
    • – für Intron Nr. 7:
      Figure 00070002
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Gen der Erfindung in der Lage, bei stringenten Bedingungen mit der Sequenz von 3, welche als Sonde verwendet wird, zu hybridisieren.
  • Wie hierin obenstehend aufgeführt, betrifft die Erfindung fernerhin eine Variante des SMN-Gens, wobei die Variante ein C-BCD541-Gen ist, welches eine cDNA-Sequenz aufweist, die der Sequenz von 2 entspricht.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren cDNA-Sequenzen, wie solche, die von einem der oben stehenden Gene erhalten werden. Solche cDNA-Sequenzen sind in den 2 und 3 beschrieben. Beide dieser cDNA-Sequenzen sind in der Lage, ein Protein zu codieren, welches die in 1 beschriebene Aminosäuresequenz umfasst.
  • Trotz dieses Vermögens, für ein derartiges Protein zu codieren, haben die Erfinder bemerkt, dass das C-BCD541-Gen in der Lage ist, dieses Protein in vivo herzustellen, oder nicht in der Lage ist, es in einer ausreichenden Menge herzustellen, aufgrund des abnormalen Spleißens des Gens während der Transkription. Somit befähigt das Vorhandensein des C-BCD541-Gens nicht dazu, die Defizienz (Deletion, Mutation, ...) des T-BCD541-Gens in vivo zu korrigieren, welche für die Motorneuronenkrankheiten des SMA-Typs oder andere Motorneuronenkrankheiten verantwortlich ist.
  • In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ebenfalls eine Nukleotidsequenz, umfassend die Nukleotide 34 bis 915 der Sequenz von 3, oder eine Sequenz, umfassend die Nukleotide 34 bis 915 der Sequenz von 2.
  • Diese Nukleotidsequenzen entsprechen der codierenden Sequenz des T-BCD541-Gens bzw. C-BCD541-Gens.
  • Die Introns der hierin oben stehend beschriebenen Gene sind ebenfalls in der Patentanmeldung eingeschlossen. Speziell die Introns 6 und 7 besitzen jeweils die folgenden Sequenzen:
    Für das T-BCD541-Gen:
    • – Intron 6:
      Figure 00080001
    • – Intron 7:
      Figure 00080002
    Für das C-BCD541-Gen:
    • – Intron 6:
      Figure 00080003
    • – Intron 7:
      Figure 00090001
  • Die Erfindung beinhaltet ferner eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens etwa 9 Nukleotide umfasst und dass sie innerhalb einer Sequenz enthalten ist, welche oben stehend beschrieben worden ist.
  • Für die Bestimmung der Hybridisierungsbedingungen wird auf die Hybridisierungstechniken für Oligonukleotidsonden Bezug genommen, wie sie offenbart werden in Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, 1989.
  • Die Sequenzen der Erfindung sind entweder DNA (speziell genomische DNA oder cDNA oder synthetische DNA) oder RNA. Sie können als Sonden für die Detektion der T-BCD541- oder C-BCD541-Gene oder als Primer für die Amplifikation von in einer biologischen Probe vorhandener genomischer DNA verwendet werden.
  • Bevorzugte Primer sind diejenigen, welche die folgenden Sequenzen umfassen oder betreffen:
  • Figure 00090002
  • Die oben stehenden Primer sind charakteristisch für das Exon 7 des T-BCD541-Gens.
  • Figure 00090003
  • Die oben stehenden Primer sind charakteristisch für das Exon 8 des T-BCD541-Gens.
  • Die in Paaren verwendeten Primer können Sets für die Amplifikation von genomischer DNA bilden, um Motorenneuronenkrankheiten zu detektieren.
  • Invertierte komplementäre Sequenzen in Hinsicht auf die oben stehenden Primer können ebenfalls verwendet werden.
  • Bevorzugte Sets von Primern sind die Folgenden:
    • – ein Primerpaar, welches enthalten ist in der Sequenz, umfassend die Nukleotide 921 bis 1469 der Sequenz von 3 und/oder
    • – ein Primerpaar, umfassend die folgenden Sequenzen:
      Figure 00100001
  • Ein anderes bevorzugtes Set an Primern umfasst:
    • – ein Primerpaar mit den folgenden Sequenzen:
      Figure 00100002
    • – ein Primerpaar mit den folgenden Sequenzen
      Figure 00100003
  • Von einem allgemeinen Gesichtspunkt für die Detektion von Divergenz im Exon 7 zwischen den Genen T-BCD541 und C-BCD541 können Oligonukleotidprimer in dem Fragment gewählt werden, welches 5' zu der Divergenz und innerhalb von Exon 7 oder Intron 7 liegt.
  • Andere Primer, welche für SSCP-Analyse für diagnostische Zwecke verwendet werden können, werden unter den Nachstehenden ausgewählt:
  • Figure 00100004
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Antisense-DNA oder -RNA, welche zur Hybridisierung mit dem C-BCD541-Gen und insbesondere an die Intronsequenzen in der Lage ist, speziell mit dem Fragment der Introns, welche von dem entsprechenden Teil im T-BCD541-Gen abweichen.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenzen von 1 oder ein Protein, welches die Aminosäuresäuresequenz von 8 aufweist.
  • Das Protein, welches die Sequenz von 1 betrifft, kann in einer Zusammensetzung für die Behandlung von Motorneuronenkrankheiten über orale, intramuskuläre, intravenöse Verabreichung oder über Verabreichung in das Rückenmarkfluid verwendet werden.
  • Die Erfindung sieht ferner ein Kit für die in vitro-Diagnose von Motorneuronenkrankheiten vor, umfassend:
    • – ein Set von Primern, wie oben stehend beschrieben;
    • – Reagenzien für eine Amplifizierungsreaktion; und
    • – eine Sonde für die Detektion des amplifizierten Produkts.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit für die Detektion der Motorneuronenkrankheiten, enthaltend eine Hybridisierungssonde, wie oben stehend beschrieben, vorgesehen.
  • Oligonukleotidsonden, welche den Divergenzen zwischen den Genen entsprechen, können verwendet werden.
  • Die Diagnose kann speziell auf SMA-Motorneuronen-Pathologie gerichtet sein.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Klonierungs- oder Expressionsvektoren, welche eine Nukleotidsequenz wie oben stehend definiert, umfassen. Derartige Vektoren können beispielsweise Plasmide, Cosmide, Phagen, YAC, pYAC und dergleichen sein. Vorzugsweise besitzt ein derartiger Vektor einen Motorneuronen-Tropismus. Speziell für die Absicht der Definierung von Mitteln für die Gentherapie kann er unter Poliovirus-Vektor, Herpesvirus-, Adenovirus-, Retrovirus-Vektoren, synthetischen Vektoren und dergleichen gewählt werden.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante Wirtszellen, d. h. Hefen, CHO-Zellen, Baculovirus, Knochenmarkzellen, E. coli, Fibroblasten-Epithelzellen, welche durch die obigen rekombinanten Sequenzen transformiert sind.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Detektion von Motorneuronenkrankheiten, einschließlich spinaler Muskelatrophie, amyotropher Lateralsklerose und primärer Lateralsklerose, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Extrahieren von DNA aus einer Patientenprobe;
    • (b) Amplifizieren dieser DNA mit Primern, wie sie oben stehend beschrieben wurden;
    • (c) Unterwerfen der amplifizierten DNA einem SSCP bzw. Einzelstrang-Konformationspolymorphismus;
    • (d) Autoradiographieren der Gele; und
    • (e) Detektieren des Vorliegens oder der Abwesenheit der Motorneuronenkrankheit.
  • Die Schritte (c) und (d) können durch einen Schritt des Verdauens mit BsrI-Enzym oder mit jedwedem anderen Enzym, welches in der Lage ist, die Divergenz der Gene oder Fehlpaarungen in den Genen spezifisch zu erkennen, oder durch Sequenzierung ausgetauscht werden.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zur Detektion von spinaler Muskelatrophie, wobei die Methode die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Extrahieren von DNA aus einer Patientenprobe;
    • (b) Hybridisieren dieser DNA mit einer DNA-Sonde, die die gesamte oder einen Teil der cDNA-Sequenz von 3 oder von 2 umfasst, unter stringenten Bedingungen; und
    • (c) Detektieren der möglicherweise gebildeten Hybride.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Detektion von Arthrogryposis multiplex congenita, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Extrahieren von DNA aus einer Patientenprobe;
    • (b) Amplifizieren der DNA mittels PCR unter Verwendung von unmarkierten Primern aus dem Exon 7 und Exon 8 des SMN-Gens;
    • (c) Unterwerfen dieser amplifizierten DNA unter eine Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse;
    • (d) Autoradiographieren der Gele; und
    • (e) Detektieren des Vorliegens von Arthrogryposis multiplex congenita.
  • Noch eine andere Methode zum Detektieren von Arthrogryposis multiplex congenita betrifft eine Dinukleotid-Wiederholungs-Polymorphysmus-Analyse unter Verwendung der Genotypierungs-Marker C272 und C212 nach der PCR-Amplifikation.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner polyklonales Antiserum oder monoklonale Antikörper, welche gegen das Protein von 1, das Protein von 8 oder das Protein von 12 gerichtet sind.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Verwendung der gesamten oder teilweisen Nukleotidsequenz von SMN als Sonde zum Detektieren von SMA sowie zum Identifizieren und Klonieren von Genen, welche mit dem SMN-Motorneuron-Gen zusammenhängen, in Tieren oder Organismen.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des SMA-Proteins zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, wobei diese Antikörper verwendet werden können, um SMA zu detektieren und zu diagnostizieren.
  • In einem anderen Aspekt wurden polyklonale Kaninchenantiseren gegen synthetische Peptide erzeugt, welche der Aminosäuresequenz der 1, 8 und 12, einschließlich des Aminosäureterminus und des Carboxyterminus, entsprachen.
  • Folglich betrifft die vorliegende Erfindung, in einem ihrer Verfahrensaspekte, die Detektion von SMA in Patienten, welche SMA oder verwandte Motorneuronenkrankheiten, wie AMC, ALS und PLS, aufweisen.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, das SMN-Gen, einen Teil davon, cDNA oder Oligonukleotide an Patienten, denen entweder das Gen fehlt oder die ein genetisch defektes Gen aufweisen, als solches oder nach Einbringung in gentechnisch erzeugte Viren oder Vektoren zu verabreichen.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend in den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich erörtert werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1 ist die Aminosäuresequenz der SMN-codierenden Region des Klons T-BCD541.
  • Die 2A ist die Nukleotidsequenz der SMN-codierenden Region sowie der 5'- und 3'-flankierenden Regionen von Klon C-BCD541; die codierende Region ist unterstrichen.
  • Die 2B enthält die Sequenz, beginnend vom Intron 6 bis zu Exon 8 des C-BCD541-Gens. Die unterstrichenen Sequenzen sind diejenigen der Exons 7 und 8. Sequenzen der Introns 6 und 7 können als Oligonukleotide zum Amplifizieren der cDNA-Region gewählt werden, welche die Unterscheidung, innerhalb von Exon 7, zwischen dem T-BCD541-Gen und dem C-BCD541-Gen erlaubt. Die Position der divergenten Nukleotide zwischen der T-BCD541- und C-BCD541-cDNA ist in Kursivdruck angegeben.
  • Die 3A ist die Nukleotidsequenz der SMN-codierenden Region sowie der 5'- und 3'-flankierenden Regionen von Klon T-BCD541. Die codierenden Sequenzen sind unterstrichen. Die Nummern der Exons sind auf der Sequenz angegeben. Asterisken geben den Beginn jedes Exons an. Die Nukleotide, welche in Kursivdruck angegeben sind, sind diejenigen, welche sich zwischen den Genen C-BCD541 und T-BCD541 unterscheiden.
  • Die 3B repräsentiert die Sequenz von Intron 6 bis zum Ende von Exon 8 des T-BCD541-Gens. Die Sequenz der Exons 7 und 8 ist unterstrichen.
  • Die 4 zeigt die Nukleotidsequenzen der Marker C212, C272, C171, AFM157xd10 und C161.
  • Die 5 repräsentiert verschiedene Sonden, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wobei mehrere Loci aufgezeigt werden, an welche die Sonden hybridisierten.
  • 6 repräsentiert das telomerische Element, enthaltend das Überlebens-SMN-Gen.
  • Die 7 repräsentiert die ausgesprochene Verringerung der Gen-Dosis mit der Sonde 132SEII, welche nahe daran kartiert.
  • 8 repräsentiert die Aminosäuresequenz des trunkierten SMN-Proteins.
  • Die 9 ist eine schematische Repräsentation der genomischen Struktur des humanen SMN-Gens. Die Bezeichnungen und Positionen von genomischen Klonen sind überhalb der Figur gezeigt. L-132, L-5 und L-13 kennzeichnen die genomischen Klone, welche das gesamte SMN-Gen abdecken bzw. überspannen, wohingegen L-51 einen Teil von Exon 1 überspannt. Mikrosatelliten und DNA-Marker sind oberhalb der genomischen Karte angegeben. B, H und E bedeuten BglII, HindIII bzw. EcoRI. C212, p322, C272, 132SEII und C171 repräsentieren verschiedene Marker. 1, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 repräsentieren Exons der SMN- und C-BCD541-Gene. Die gesamte Sequenz von L-132 wird durch PCR-Amplifikation von Exon 1 bis Exon 2A erhalten.
  • 10 repräsentiert die Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz des gesamten humanen SMN-Gens, einschließlich der Introns und Exons. Translatierte Nukleotidsequenzen sind in Großbuchstaben gezeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren darunter angegeben sind. Das Polyadenylierungssignal ist in Fettdruck angegeben. Pfeilköpfe geben die Position der Einzelbasen-Unterschiede zwischen SMN- und C-BCD541-Genen in den Introns 6 und 7 und den Exons 7 und 8 an. Kursiv gedruckte Buchstaben geben die Position der Oligonukleotide an, welche für die Detektion von Divergenzen in Intron 7 ausgewählt wurden. (*) gibt die Position des Stop-Codons an.
  • Die 11 repräsentiert die Nukleotidsequenz stromaufwärts der codierenden Region des humanen SMN-Gens und veranschaulicht die Gegenwart von vermeintlichen Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP-2, GH-CSE2, DTF-1, E4FI, HINF-A, H4TF-1, β-IFN und SpI. Fett gedruckte Buchstaben geben die Dinukleotid-Wiederholung (CA) an, welche den C272-Markern entspricht.
  • Die 12 repräsentiert die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Maus-SMN-cDNA. (*) gibt die Position des Stop-Codons an.
  • Die 13 repräsentiert eine Vergleichsanalyse der Aminosäuresequenz von humanem SMN (oben) und Maus-SMN (darunter).
  • Die 14 veranschaulicht die genetische Analyse der Familie 6. Die Spur A zeigt Beweise für eine vererbte mütterliche Deletion, welche mit dem Mikrosatelliten-Marker C272 ersichtlich war, da der Proband lediglich das Allel von dem Vater geerbt hatte. Die Spuren B und C repräsentieren die SSCP-Analyse der PCR-amplifizierten Exons 7 (Spur B) und 8 (Spur C) von SMN (gefüllte Pfeilköpfe) und dessen zentromerischer Kopie (nicht-gefüllte Pfeilköpfe). "F" steht für Vater, "M" für Mutter, und "A" steht für das betroffene Kind.
  • Die 15 veranschaulicht die Banden-Verschiebungen auf einer Einzelstrang-Konformationspolymorphismus(SSCP)-Analyse des PCR-amplifizierten Introns 7 und erlaubte die Identifizierung von SMN (gefüllte Pfeilköpfe) und dessen zentromerischem Gegenstück C-BDC541 (nicht-gefüllte Pfeilköpfe).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Contig" überlappende Nukleotidsequenzen.
  • Frühere Untersuchungen mittels Kopplungs-Analyse haben gezeigt, dass alle drei Formen von spinaler Muskelatrophie auf dem Chromosom 5q11.2-q13.3 kartiert werden (L. M. Brzustowicz et al., Nature, 344, 540 (1990); J. Melki et al., Nature, 345, 823 (1990); J. Melki et al., Lancet, 336, 271 (1990)). Ein Contig aus künstlichen Hefechromosomen (YAC bzw. yeast artificial chromosome) der 5q13-Region, welches den Krankheits-Lokus überspannte, wurde konstruiert, wobei es das Vorliegen von Wiederholungen mit niedriger Kopienzahl in dieser Region aufzeigte. Die Allel-Segregation wurde an den nächstliegenden genetischen Loci, welche durch Marker detektiert wurden, die aus dem YAC-Contig abgeleitet waren (C212, C272 und C161), in 201 SMA-Familien analysiert. Diese Marker enthüllten zwei Loci (C212, C272) oder drei Loci auf der 5q13-Region (C161). Vererbte und de novo-Deletionen wurden in 9 nicht-verwandten SMA-Patienten beobachtet. Darüber hinaus wurden Deletionen in wenigstens 18% der SMA-Typ I-Patienten durch die Beobachtung eines ausgesprochenen Heterozygotie-Mangels für die untersuchten Loci in starkem Maße nahe gelegt. Diese Ergebnisse zeigten, dass Deletionsereignisse statistisch mit der schweren Form von SMA assoziiert sind.
  • Durch Untersuchen aller polymorphen DNA-Marker, welche aus dem YAC-Contig abgeleitet waren, wurde beobachtet, dass das kleinste Rearrangement innerhalb einer Region auftrat, welche durch die von C161 und C212–C272 detektierten Loci eingegrenzt war und vollständig in einem 1,2 Mb großen YAC-Klon 903D1 enthalten war; siehe zum Beispiel französisches Patent FR 2720757 .
  • Die vorliegende Erfindung charakterisierte die kleine geschachtelte kritische SMA-Region von etwa 140 Kb durch eine Kombination aus genetischer und physikalischer Kartierung in SMA-Patienten. Diese Region schlug eine präzise Lokalisierung für das SMA-Gen und deshalb eine begrenzte Region, innerhalb der man nach Kandidatengenen zu suchen hatte, vor. Die vorliegende Erfindung identifizierte ein dupliziertes Gen aus der 5q13-Region. Eines von diesen (das telomerische Gen) ist innerhalb der kritischen Region lokalisiert. Darüber hinaus fehlte dieses Gen in 213 von 230 (92,2%) der SMA-Patienten oder war in 13 von 230 (5,6%) unterbrochen. In Patienten, worin das telomerische Gen nicht fehlt oder unterbrochen ist, zeigten schädliche Mutationen, dass dieses, als Gen für das Motorneuronenüberleben (SMN-, 'survival motorneuron'-Gen) bezeichnete, telomerische Gen das SMA-bestimmende Gen auf Chromosom 5 ist.
  • Das SMN-Gen wurde unter Anwendung eines komplexen Systems von Restriktionskartierung, Unterscheidung des ETel von dem ECen mittels Southern-Blot und Bestimmung der Unterschiede zwischen den ETel in SMA-Patienten durch genetische und physikalische Kartierung gefunden. Nach Bestätigung der Lokalisierung des SMN-Gens wurde ein Phagen-Contig, welches die kritische Region des telomerischen Elements überspannte, konstruiert, um spezifische Klone zu identifizieren, welche das SMN-Gen enthalten.
  • Die Analyse des SMN-Gens in SMA-Patienten, verglichen mit denjenigen von normalen Patienten, enthüllte, dass das SMN-Gen entweder in 98% der SMA-Patienten entweder fehlte oder trunkiert war, oder kombinierte Mutationen aufwies, welche in normalen Kontrollpatienten nicht vorhanden waren.
  • Zur Identifizierung einer großen invertierten Duplikation und einer komplexen genomischen Organisation der 5q13-Region wurde eine Langstrecken-Restriktionskartierung unter Anwendung von Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) des YAC-Contigs durchgeführt.
  • YACs wurden durch Vergleichen ihrer Haplotypen mit denjenigen des menschlichen Spenders an den polymorphen Loci, welche durch die Marker C212, C272, C171 und C161 detektiert werden, geordnet (4).
  • Die Restriktionsenzyme SacII, BssHII, SfiI, EagI und XhoI wurden verwendet, um die YACs, welche die telomerischen Loci, detektiert durch die Marker C212, C272, C171 und C161 (YAC-Klon 595C11), die centromerischen Loci, die durch diese Marker detektiert wurden (YAC-Klone 121B8, 759A3, 278G7) oder beide (YAC-Klone 903D1 und 920C9) enthielten, zu verdauen. Lambda-Phagen-Bibliotheken der YACs 595C11, 121B8 und 903D1 wurden konstruiert, und Subklone aus Phagen, welche die Marker C212 (p322), C272 (132SE11), C161 (He3), AFM157xd10 (131xb4) und CMS1 (p11M1) enthielten, wurden als Sonden für die PFGE-Analyse verwendet. Die 5 zeigt, dass die Sonden 132SE11, 11P1 und p322 zwei Loci enthüllten, und die Sonde He3 vier Loci auf dem YAC-Contig enthüllte, wohingegen die Sonde 131xb4 mehrere Loci auf 5p und 5q13 enthüllte. Die Restriktionskarte (6) zeigte, dass die 5q13-Region eine große invertierte Duplikation eines Elements (E) von mindesten 500 Kb enthielt, welche als ETel bzw. ECen für das telomerische bzw. centromerische Element bezeichnet wurde.
  • Die PFGE-Analyse von SMA- und Kontroll-Individuen zeigte ein hohes Ausmaß an Variabilität der Restriktionsfragmente, welches die Unterscheidung von ETel vom ECen und die Erkennung von abnormalen Restriktionsfragmenten in SMA-Patienten behinderte.
  • Um zwischen dem ETel und dem ECen zu unterscheiden, wurde dann eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt. Der Southern-Blot wurde durch die Verfahren ausgeführt, welche in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben sind.
  • Genauer gesagt, wurde DNA aus YAC-Klonen, Kontrollen und SMA-Patienten mit den Restriktionsenzymen SacI, KpnI, MspI, PstI, PvuII, EcoRI, HindIII, BglII und XbaI für das Southern-Blotting verdaut und mit den Klonen 132SE11, 11p1, He3, 131xb4 und p322 als Sonden hybridisiert. Keine der Sonden, außer einer (He3) detektierte einen Unterschied zwischen den zwei duplizierten Elementen. Drei HindIII-Restriktionsfragmente von 12, 11 und 3,7 Kb wurden durch die Sonde He3 nachgewiesen. Ein 12 Kb großes HindIII-Restriktionsfragment wurde in den YAC-Klonen 754H5 und 759A3 detektiert, was anzeigt, dass dieses Fragment dem am meisten centromerisch liegenden Locus in dem ECen entsprach. Umgekehrt wurde ein 11-Kb-HindIII-Fragment in den YAC-Klonen 595C11, 903D1 und 920C9 detektiert, was anzeigt, dass dieses Fragment einem Einzel-Locus auf dem ETel entsprach. Schließlich wurde ein 3,7 Kb großes HindIII-Fragment in nicht-überlappenden YACs bemerkt, welche entweder ETel oder ECen enthielten, was anzeigte, dass dieses Fragment zwei unterschiedlichen Loci entsprach. Ähnliche Ergebnisse wurden mit SacI und KpnI erhalten. Die drei Restriktionsfragmente, welche von He3 detektiert wurden, wurden auf dem monochromosomalen Hybrid HHW105 (Carlock, L. R., et al., Am. J. of Human Genet., 1985, Band 37, S. 839) und in 30 unverwandten gesunden Individuen beobachtet, was bestätigt, dass diese Fragmente nicht auf Polymorphismen zurückzuführen waren. Die Southern-Analyse-Ergebnisse gestatteten, ETel von dem ECen sowohl in Kontrollen als auch SMA-Patienten zu unterscheiden.
  • Sobald das ETel von dem ECen unterschieden worden war, war es daher notwendig, die Unterschiede zwischen den ETel in SMA-Patienten und denjenigen der normalen Kontrolle zu ermitteln. Dies wurde durch Anwenden von genetischer und physikalischer Kartierung bewerkstelligt. Diese genetische und physikalische Kartierung identifizierte Genom-Rearrangements in dem telomerischen Element ETel von SMA-Patienten.
  • Es ist früher gezeigt worden, dass 9 von 201 (9/201) SMA-Patienten Deletionen von großem Ausmaß aufwiesen, welche entweder einen oder die zwei Loci einschlossen, welche durch die Marker C212 und C272 auf einem mutanten Chromosom detektiert wurden (J. Melki et al., Science, 264, 1474 (1994)). Andererseits waren 22 von 30 (22/30) Patienten, die als Kinder von blutsverwandten Eltern geboren wurden, einschließlich 13 von 14 (13/14) Typ I- und 9 von 10 (9/10) Typ III-SMA, durch die Abstammung homozygot hinsichtlich der nähest-flankierenden polymorphen Marker.
  • Die genomische DNA der 9 Patienten, welche Deletionen von großem Ausmaß beinhalteten, und der 22 Blutsverwandtschaft-Patienten, welche eine Abstammungs-Homozygotie aufzeigten, wurde mit HindIII zum Southern-Blotting verdaut und mit der Sonde He3 hybridisiert. Das 11 Kb große Fragment, welches von Sonde He3 offenbart wurde, war in 12 von 13 (12/13) Blutsverwandtschafts-Typ I-Patienten abwesend. In 2 von 12 (2/12) betraf die Deletion auch das 3,7 Kb große Fragment. Im Gegensatz dazu war das 11 Kb große Fragment nur in 1 von 8 (1/8) Blutsverwandtschaft-Typ III-Patienten abwesend. In konsistenter Weise war das 11-Kb-HindIII-Fragment in 4 von 9 (4/9) Patienten abwesend, welche Deletionen großen Ausmaßes auf einem mutanten Chromosom beinhalteten. Von besonderem Interesse war die Abwesenheit des 11-Kb-Fragments in dem Patienten, welcher eine Deletion von einem der zwei Loci beinhaltete, welche durch die Marker C212 und C272 detektiert werden.
  • Bei gemeinsamer Analyse lieferten diese Beobachtungen Beweise für genomische Rearrangements von ETel in SMA-Patienten und unterstützten die Lokalisierung des SMA-Gens in centromerischer Lage zu dem Locus, der durch das 11 Kb große HindIII-Fragment enthüllt worden war, weil alle Blutsverwandschaft-Typ III-Patienten, außer einem, hinsichtlich dieses Locus keine Deletion aufwiesen.
  • Um die centromerische Grenze des Genom-Rearrangements in der Krankheit zu charakterisieren, wurde die Allel-Segregation an Loci, die durch den Marker C272 in Blutverwandtschafts-SMA-Patienten detektiert wurden, analysiert. Alle Blutsverwandtschaft-SMA-Typ I-Patienten wiesen ein einzelnes PCR-Amplifikationsprodukt auf, verglichen mit 0 von 60 Kontrollen. Dieser ausgesprochene Heterozygotie-Mangel beruhte auf der Deletion von einem der zwei Loci, welche von C272 detektiert werden, wie durch die ausgesprochene Verringerung der Gen-Dosis mit der Sonde 132SE11, welche nah an diesem Marker kartiert, angezeigt wird. Im Gegensatz dazu waren bei 7 von 9 (7/9) Blutsverwandtschaft-Typ III-SMA-Patienten zwei C272-Amplifikationsprodukte von beiden Eltern ererbt worden, was eine Homozygotie an jedem von Marker C272 detektierten Locus anzeigt. Darüber hinaus wurde kein Gen-Dosis-Effekt mit der Sonde 132SE11 beobachtet, was die Abwesenheit von Deletion, welche den von C272 detektierten Locus betrifft, in Typ III-Blutsverwandtschaft-Patienten zeigt.
  • Unter der Annahme, dass der gleiche Locus bei allen drei Typen von SMA beteiligt ist, zeigen diese Ergebnisse, dass das krankheitserzeugende Gen distal zum telomerischen Locus, der von C272 detektiert wird, liegt.
  • Diese Untersuchungen plazieren das SMA-Gen innerhalb des telomerischen Elements ETel, zwischen den telomerischen Loci, welche von den Markern C272 und He3 detektiert werden (11 kb großes HindIII-Fragment). Basierend auf Langstrecken-Restriktionskartierung unter Anwendung von PGFE des YAC-Contigs, ist diese kritische Region in einem 140 Kb großen SacII-Fragment des YAC-Klons 903D1 (oder 150-Kb-SacII-Fragment von YAC-Klon 920D9) vollständig enthalten.
  • Nach der Bestätigung, dass das SMN-Gen auf einem 140-Kb-SacII-Fragment lokalisiert war, wurde ein Phagen-Contig, welches die kritische Region des telomerischen Elements überspannte, konstruiert, um das SMN-Gen zu identifizieren und zu charakterisieren.
  • Phagen-Klone, welche die Marker C212, C272, C171 und C161 enthielten, wurden aus den λ-Phagen-Bibliotheken, die aus den YAC-Klonen 595C11 und 903D1 konstruiert worden waren, isoliert und als ein Ausgangspunkt für ein bidirektionales "Walking" verwendet. Ein Pha gen-Contig (60 Kb), welches die Marker C212, C272 und C171 umgab, wurde auf Grundlage der Restriktionskarte der Phagenklone konstruiert (6).
  • Um Gene in dem Contig zu identifizieren, wurden die folgenden drei Strategien angewandt:
    • 1) eine Suche nach zwischen Spezies konservierten Sequenzen wurde durchgeführt;
    • 2) ein Exon-Trapping-Verfahren wurde ausgeführt; und
    • 3) eine direkte cDNA-Selektion wurde ausgeführt.
  • Die genomische Sonde 132SE11, welche aus dem Phagen abgeleitet war, der den Marker C272 enthielt, ergab positive Hybridisierungssignale mit Hamster-DNA, was die Gegenwart von zwischen Spezies konservierten Sequenzen anzeigte. Das Screening einer humanen fötalen Gehirn-cDNA-λgt10-Bibliothek mit der Sonde 132SE11 führte zur Selektion von 7 überlappenden λ-Klonen, welche 1,6 kbp überspannten. Die Sequenzanalyse der Klone enthüllte ein offenes Leseraster (ORF) von 882 bp und eine 580 bp große nicht-codierende Region. Ein 1,5 kbp großer Klon (BCD541) enthielt die gesamte codierende Sequenz und den Großteil der 3'-nicht-codierenden Region. Das 3'-Ende der cDNA zusammen mit ihrem Poly(A)+-Schwanz wurde durch PCR-Amplifikation einer Lymphoblastoid-Zelllinien-cDNA-Bibliothek erhalten.
  • Den zwei cDNA-Klonen fehlten die Nukleotide 661 bis 755, was nahelegt, dass ein alternatives Splicing stattgefunden haben könnte. Die Northern-Blot-Analyse von Poly(A)+-RNA aus verschiedenen Geweben, einschließlich Herz, Hirn, Leber, Muskel, Lunge, Niere und Bauchspeicheldrüse, enthüllte das Vorhandensein eines weithin exprimierten 1,7 kb großen Transkripts. Der ORF codiert ein vermutliches Protein von 294 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 32 Kd.
  • Eine Homologiesuche unter Anwendung der FASTA- und BLAST-Netzwerke versagte darin, irgendeine Homologie entweder auf der Nukleotid- oder der Aminosäure-Ebene zu detektieren.
  • Um weiter zu erkunden, ob es irgendeine Duplikation des BCD541-Gens in der 5q13-Region gab, wurde BCD541-cDNA als eine Sonde für Southern-Blot- und PFGE-Analyse von YAC-Klonen, welche den Krankheitslocus überspannten, verwendet.
  • Die spezifische Hybridisierung mit nicht-überlappenden YACs, welche entweder nur das ECen enthielten (YAC-Klone 759A3, 121B8 und 278G7) oder nur das ETel enthielten (YAC-Klon 595C11), lieferte Beweise für die Duplikation des BCD541-Gens. Jedes Gen überspannte ungefähr 20 kb und zeigte ein identisches Restriktionsmuster. Beweise für die Kopf-an-Kopf- Orientierung der zwei Gene wurden abgeleitet aus der Lokalisation der SacII- und EagI-Restriktionsstellen der nicht-überlappenden YAC-Klone, welche entweder ECen oder ETel enthielten, im Anschluss an Hybridisierungsexperimente mit den Sonden BCD541 und p322, welche die SacII- und EagI-Stellen jedes Elements flankieren.
  • In der Absicht, nach Divergenzen in den zwei Kopien des BCD541-Gens zu suchen, wurde die Organisation des telomerischen Gens charakterisiert und mit jener des zentromerischen Gegenstücks verglichen. Eine Analyse der genomischen Sequenz enthüllte, dass das telomerische BDC541-Gen aus 8 Exons aufgebaut ist (3). Es ist jedoch nun bekannt, dass das früher bekannte Exon 2 aus zwei Exons aufgebaut ist, welche durch ein zusätzliches Intron getrennt sind, wie es in der 10 dargestellt wird, und deshalb ist das SMN-Gen aus 9 Exons aufgebaut.
  • Beginnend entweder von den centromerischen oder telomerischen Gen-Loci (in den YAC-Klonen 121B8 bzw. 595C11) enthüllte die PCR-Amplifikation und die Sequenz jedes Exons und ihrer flankierenden Regionen fünf Diskrepanzen zwischen den centromerischen und den telomerischen BDC541-Genen. Die erste ist eine konservative Substitution im Exon 7 (Codon 280), welche spezifisch für das telomerische (TTC) oder das centromerische BCD541-Gen (TTT) ist. Die zweite, welche in der 3'-nicht-codierenden Region (Exon 8, Nukleotid Nr. 1155) lokalisiert ist, ist spezifisch für das telomerische (TGG) oder das centromerische (TGA) BCD541-Gen. Drei andere Einzelbasen-Substitutionen wurden im sechsten und siebten Intron beobachtet.
  • Die Beobachtung beider Versionen jedes Exons (Exon 7 und 8) auf entweder den YAC-Klonen, welche beide Gen-Loci enthielten (YAC-Klon 920C9), oder dem monochromosomalen Hybrid HHW105 zeigte, dass diese Substitutionen weder allelisch sind noch auf Polymorphismen zurückzuführen sind. Bandenverschiebungen auf der SSCP-Analyse der amplifizierten Exons 7 und 8 ermöglichten eine einfache Unterscheidung der telomerischen (T-BCD541) und centromerischen Gene (C-BCD541) sowohl in Kontrollen als auch SMA-Patienten. Alle unverwandten, gesunden, getesteten Kontrollen (n = 75) beinhalteten das T-BCD541-Gen, wie ermittelt durch SSCP-Analyse der Exons 7 und 8 (100%). Die meisten von ihnen (89,3%) beinhalteten ebenfalls das C-BCD541-Gen, aber bei 8 von 75 (8/75) (10,7%) fehlte das C-BCD541.
  • Insgesamt 230 SMA-Patienten wurden hinsichtlich Einzelbasen-Substitutionen getestet, welche in den Exons 7 und 8 mittels SSCP-Verfahren nach PCR-Amplifikation von genomischer DNA detektiert wurden. Unter ihnen gehörten 103 dem Typ I, 91 dem Typ II und 36 dem Typ III an. Interessanterweise fehlte bei 213 von 230 SMA-Patienten (92,6%) das T-BCD541-Gen auf beiden mutanten Chromosomen, verglichen mit 0 von 75 Kontrollen (0%). Darüber hinaus fehlte bei 13 von 230 SMA-Patienten (5,6%) das T-BCD541-Gen für Exon 7 auf beiden mutanten Chromosomen, aber das T-BCD541-Gen für Exon 8 war beibehalten, verglichen mit 0 von 75 Kontrollen (0%). Schließlich enthielten nur 4 von 230 SMA-Patienten (1,7%) das T-BCD541-Gen, wie durch SSCP-Analyse der Exons 7 und 8 bestimmt wurde.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass des T-BCD541-Gen bei 98% der SMA-Patienten entweder fehlt oder trunkiert ist. Darüber hinaus unterstützen diese Daten die Ansicht, dass das Krankheitsgen zwischen dem telomerischen Locus, der durch C272 detektiert wird, und dem Exon 8 des T-BCD541-Gens lokalisiert ist. Gemäß der überlappenden Restriktionskarte des Phagen-Contig ist die kritische Region deshalb vollständig in 20 kb enthalten, was nahe legt, dass das telomerische BCD541-Gen das SMA-bestimmende Gen des Chromosoms 5 ist.
  • Um aufzuzeigen, dass das T-BCD541-Gen für SMA verantwortlich ist, wurden Punktmutationen in den 4 SMA-Patienten, in denen kein Rearrangement des T-BCD541-Gens beobachtet worden war, gesucht. Die direkte Sequenzierung von PCR-Amplifikationsprodukten von jedem Exon mit deren flankierenden Regionen wurde bei den 4 Patienten durchgeführt.
  • Eine 7 bp große Deletion in der 3'-Splice-Akzeptorstelle von Intron 6 (Polypyrimidin-Trakt) wurde in dem Patienten SA gefunden. Die Sequenzanalyse von Exon 7, welches das deletierte Intron flankiert, erkannte die für das T-BCD541-Gen spezifische Sequenz. Weiterhin beinhaltete das der gleichen Region entsprechende, nicht-deletierte PCR-Produkt die für das C-BCD541 spezifische Sequenz, was nahelegte, dass dem anderen mutanten Allel das T-BCD541-Gen fehlte.
  • In dem Patienten BI wurde eine 4 bp große Deletion in der 5'-Konsensus-Splice-Donorstelle von Intron 7 gefunden. Diese Deletion trat auf dem T-BCD541-Gen auf, wie durch Sequenzanalyse des flankierenden Exons 7 bestimmt wurde.
  • In Patient HU wurde eine Punktmutation in Codon 272 (TAT → TGT) gefunden. Diese Mutation änderte ein Tyrosin zu Cystein. Der Patient war hinsichtlich der Mutation heterozygot, wobei er vermutlich eine andere SMA-Mutation auf dem anderen Allel trug. Alle drei Mutationen, welche in den Patienten SA, HU und BI beobachtet wurden, wurden in 100 normalen Chromosomen nicht detektiert, wodurch seltene Polymorphismen ausgeschlossen wurden.
  • Ein verschiedenes Splicing von Exon 7 unterschied das C-BCD541- von dem T-BCD541-Gen bei Verwendung von auf reverser Transkription basierender PCR. Elf SMA-Patienten wurden für die Analyse ihrer Transkripte mittels Northern-Blot oder auf reverser Transkription basie render PCR-Amplifikation ausgewählt. Acht von ihnen gehörten dem Typ I, einer dem Typ II und zwei dem Typ III an. Eine SSCP-Analyse von genomischer DNA zeigte eine Abwesenheit des T-BCD541-Gens in 10 Patienten, und ein Patient (SA) hatte C-BCD541- und T-BCD541-Gene für beide Exons 7 und 8. Sechs nicht-verwandte Kontrollen, welche sowohl C-BCD541- als auch T-BCD541-Gene beinhalteten, und 2 Kontrollen mit nur dem T-BCD541-Gen wurden in die vorliegende Untersuchung eingeschlossen.
  • Die Expression dieses Gens in Lymphoblasten ermöglichte es, die BCD541-Transkripte in Zelllinien, welche aus Kontrollen und SMA-Patienten abgeleitet worden waren, zu analysieren. Die Northern-Blot-Analyse von RNA aus Lymphoblastoid-Zelllinien zeigte die Gegenwart einer 1,7 kb großen mRNA in allen Proben. Keiner der SMA-Patienten zeigte ein Transkript von veränderter Größe. Es wurde beobachtet, dass ein reduzierter Spiegel von Transkripten erhalten wurde, wenn mit der Expression des β-Actin-Gens verglichen wurde, und zwar in 3 von 4 Typ I-SMA-Patienten. Normale mRNA-Spiegel wurden für die anderen SMA-Probanden gefunden.
  • Da die Northern-Blot-Analyse die Gegenwart eines Transkripts in SMA-Patienten enthüllte, welche das C-BCD541-Gen lediglich für sowohl Exon 7 als auch 8 aufwiesen, wie bestimmt durch SSCP-Analyse, zeigten diese Ergebnisse, dass sowohl die C-BCD541- als auch T-BCD541-Gene exprimiert wurden. Um Beweise zu erhalten, ob beide BCD541-Gene exprimiert wurden, wurde die RT-basierende PCR-Amplifikation von RNA, welche aus den Lymphoblastoid-Zelllinien aus Kontrollen und SMA-Patienten isoliert worden war, eingesetzt. Die direkte Sequenzierung von PCR-Produkten, welche die Exons 7 und 8 flankierten, enthüllte, dass Patienten, welche C-BCD541 aufwiesen, lediglich die für das C-BCD541-Gen spezifische Sequenz aufwiesen. Kontrollen, welche sowohl das T-BCD541- als auch C-BCD541-Gen aufwiesen, besaßen zwei Typen von Transkripten, welche beiden BCD541-Genen entsprachen. Diese Ergebnisse bestätigten, dass beide Gene exprimiert wurden. Darüber hinaus wurden 2 alternative Splicings, welche Exon 5 oder Exon 7 betrafen, beobachtet, welche zu unterschiedlichen Transkripten führten. Das alternative Splicing von Exon 5 bestätigte frühere Sequenzdaten über die cDNA-Klone.
  • Die Analyse der RT-PCR-Amplifikationsprodukte, welche die Exons 6 bis 8 überspannten, zeigten, dass das gesplicte Transkript, welches Exon 7 behält, in Kontrollen, welche sowohl C-BCD541- als auch T-BCD541-Gene aufwiesen, oder Kontrollen, welche lediglich das T-BCD541-Gen aufwiesen, vorhanden war. Umgekehrt wurde das alternativ gesplicte Transkript, dem das Exon 7 fehlte, in Kontrollen beobachtet, welche beide Gene aufwiesen, aber nicht in Kontrollen, welche nur das T-BCD541-Gen aufwiesen. Diese Ergebnisse zeig ten, dass das alternativ gesplicte Transkript, dem das Exon 7 fehlt, nur von dem C-BCD541-Gen abgeleitet wurde.
  • Die Transkript-Analyse von Patient SA, welcher eine 7 bp-Deletion der 3'-Splice-Akzeptorstelle von Intron 6 des T-BCD541-Gens beinhaltete, enthüllte die Gegenwart von sowohl dem gesplicten Transkript, welches Exon 7 behielt, als auch dem alternativ gesplicten Transkript, welchem das Exon 7 fehlte. Darüber hinaus zeigte die Sequenzanalyse von Amplifikationsprodukten von dem gesplicten Transkript, welches das Exon 7 beibehielt, eine für das C-BCD541-Gen spezifische Sequenz (2). Diese Ergebnisse zeigten, dass die 7 bp-Deletion von Intron 6, welche in dem Patient SA beobachtet wurde, abträglich nur für das korrekte Splicen des Exons 7 des T-BCD541-Gens war. Weil ein unterschiedliches Splicen von Exon 7 dazu in die Lage versetzte, die zwei BCD541-Gene zu unterscheiden, wurde dieser Unterschied darüber hinaus unter Kontrollen und SMA-Patienten, einschließlich des Patienten SA, analysiert. In den Kontrollen war die Menge an alternativ gesplicten Transkript, welchem das Exon 7 fehlte, weniger häufig als jene des gesplicten Produkts, welches das Exon 7 beibehielt. Umgekehrt war in den SMA-Patienten die Menge an alternativ gesplicten Transkript, welchem das Exon 7 fehlte, gleich oder häufiger als jene des gesplicten Produkts, welches das Exon 7 behielt.
  • Diese Ergebnisse liefern Beweise für einen Unterschied zwischen den Kontrollen und den SMA-Patienten auf der Ebene der Transkription dieser Gene. Das alternativ gesplicte Transkript, welchem das Exon 7 fehlt, führte zu einem kürzeren ORF mit einem verschiedenen C-Terminus-Protein, was Effekte auf die Proteinfunktion aufweisen könnte.
  • Um die gesamte Struktur und Organisation des humanen SMN-Gens weiter zu charakterisieren, wurden drei genomische Klone aus einer FIX II-Phagen-Bibliothek, welche aus dem YAC-Klon 595C11 abgeleitet wurde, isoliert und mit der Volllängen-BCD541-cDNA (2A) als Sonde gescreent. Nach Auswählen mehrerer Klone, welche an die Sonde hybridisierten, zeigten Restriktionskartierung und Southern-Blot-Analyse, dass die Phagen L-132, L-5 und L-13 das gesamte SMN-Gen überspannten.
  • Die drei Phagenklone wurden weiter einer Sequenzierung unterworfen, wobei die Sequenzierungsverfahren nach Maxam-Gilbert oder Sanger et al. angewandt wurden, welche in Sambrook et al., siehe oben, offenbart werden.
  • Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des gesamten SMN-Gens, einschließlich Exons und Introns, ist in der 10 dargestellt. Das humane Gen ist ungefähr 20 kb lang und besteht aus neun (9) Exons, welche von 8 Introns unterbrochen sind, wie gezeigt in der 10. Das humane SMN-Gen besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 32 kDA.
  • Obwohl angenommen wurde, dass nur ein Exon 2 in dem SMN-Gen vorhanden wäre (siehe Lefebvre et al., Cell, 80: 155–165 (1995)) erbrachten die Sequenzierungsdaten abweichende Beweise, und das früher erwähnte Exon 2 in Lefebvre et al., siehe oben, ist eigentlich aus zwei Exons aufgebaut, welche durch ein zusätzliches Intron getrennt werden, wie es in den 9 und 10 veranschaulicht wird. Um eine Verwirrung bei der erneuten Nummerierung der Exons zu vermeiden, werden die zwei Exons im Exon 2 nun als Exon 2a und Exon 2b bezeichnet.
  • Alle Exon-Intron-Grenzen wiesen die Konsensus-Sequenz auf, welche in anderen menschlichen Genen gefunden wird, und eine Polyadenylisierungs-Konsensusstelle ist 550 bp stromabwärts des Stop-Codons lokalisiert (10).
  • Beginnend von entweder YAC-Klon 121B8 oder 595C11 (welche die C-BCD541- bzw. SMN-Gene enthalten; siehe Lefebvre et al., siehe oben) zeigten PCR-Amplifikation und Sequenzanalyse der Introns drei Unterschiede zwischen SMN und C-BCD541 zusätzlich zu denjenigen, welche früher beschrieben wurden (durch Lefebvre et al., siehe oben). Diese schlossen einen Basenaustausch in Intron 6 (–45 bp/Exon 7, atgt, telomerisch; atat, centromerisch) und zwei Austausche im Intron 7 (+100 bp/Exon 7, ttaa, telomerisch; ttag, centromerisch; und an Position +214 bp/Exon 7, ttat telomerisch; ttgt, centromerisch, 10) ein. Das Vorhandensein von beiden Versionen in einem YAC-Klon, der beide Gene enthielt (YAC 920C9), und in der Kontrollpopulation zeigte, dass diese Substitutionen eher locusspezifisch als auf Polymorphismus beruhend sind. Bandenverschiebungen auf der Einzelstrang-Konformationspolymorphismus(SSCP)-Analyse des PCR-amplifizierten Introns 7 gestatteten, dass man SMN und sein centromerisches Gegenstück (C-BCD541) ohne Weiteres unterscheiden kann (siehe 15).
  • Um potentiell für die Promotorfunktion wichtige Sequenzen zu identifizieren, wurde die Organisation der das Exon 1 der SMN- und C-BCD541-Gene umgebenden Region charakterisiert. Basierend auf Restriktionskartierung, Southern-Blot-Hybridisierung und PCR-Amplifikation wurden das Exon 1 und der C272-Marker (D5F150S1, D5F150S2) im selben BglII-EcoRI-Restriktionsfragment des L-132-Phagen lokalisiert (9). Die PCR-Amplifikation unter Verwendung des C272f-Primers und eines Rückwärts-Primers, der im Exon 1 gewählt wurde, wurde durchgeführt und das amplifizierte Produkt wurde direkt sequenziert. Die Sequenzanalyse zeigte, dass die (CA)-Wiederholung, welche dem C272-Marker entspricht, 463 bp stromaufwärts von der vermutlichen ATG-Translations-Startstelle lokalisiert ist (11). Vergleichende Sequenzanalysen zeigten keine Diskrepanz zwischen den 5'-Enden des SMN-Gens und seines centromerischen Gegenstücks (C-BCD541). Darüber hinaus zeigte die Sequenzanalyse die Gegenwart von vermutlichen Bindungsstellen für die folgenden Transkriptionsfaktoren: AP-2, GH-CSE2, DTF-1, E4F1, HiNF-A, H4TF-1, β-IFN, Sp1 (11; Faisst et al., Nucleic Acids Res., 20: 3–26 (1992)).
  • Neben der Isolierung und Charakterisierung des humanen SMN-Gens wurde auch das Maus-Homolog des SMN-Gens kloniert. Die speziesübergreifende Konservierung des humanen SMN-Gens mit Nagetieren ist in Lefebvre et al., siehe oben, aufgezeigt worden, und diente zum Isolieren des Maus-SMN-Gens. Das Screening einer fötalen Maus-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von humaner SMN-cDNA als Sonde erlaubte die Isolierung von 2 überlappenden Maus-cDNA-Klonen. Die Sequenzanalyse der Klone enthüllte ein 864 bp großes offenes Leseraster (ORF) (12). Das ORF codiert ein vermutliches Protein von 288 Aminosäuren (12) mit einer Homologie von 83% zu der humanen SMN-Aminosäuresequenz (13).
  • Entweder das isolierte humane oder das Maus-SMN-Gen kann in verschiedene Plasmide, wie pUC18, pBr322, pUC100, λgHI, λ18-23, λZAP, λORF8 und dergleichen, inseriert werden. Die Verfahren zum Inserieren von Genen in verschiedene Plasmidvektoren werden von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben. Verschiedene Mikroorganismen können verwendet werden, um den Vektor zur Herstellung des SMN-Gen zu transformieren. Zum Beispiel schließen Wirts-Mikroorganismen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Hefe, CHO-Zellen, E. coli, Bacillus subtilis und dergleichen ein.
  • Sobald es rekombinant erzeugt wurde, kann das humane SMN-Protein oder das Maus-SMN-Protein aus der Wirtskultur durch im Fachgebiet bekannte Verfahren weiter gereinigt werden.
  • Neben der rekombinanten Herstellung des SMN-Proteins betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern. Diese Verfahren sind im Fachgebiet bekannt, wie veranschaulicht von Sambrook et al., siehe oben. Der monoklonale Antikörper kann durch das Vorgehen von Kohler und Milstein, Nature, 256: 495 (1975); Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976), oder Harlow und Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988), erhalten werden und kann zum Beispiel beim Diagnostizieren von SMA sowie anderen Motorneuronenkrankheiten verwendet werden.
  • Polyklonale Kaninchen-Antiseren können auch gegen synthetische Peptide erzeugt werden, welche einem beliebigen Teil der SMN-Aminosäuresequenz entsprechen, einschließlich des Aminoterminus und Carboxyterminus. Genauer gesagt wurden die folgenden Peptide, basierend auf der in 1 dargelegten Aminosäuresequenz, synthetisiert:
  • Figure 00290001
  • Das synthetische Peptid kann an ein Trägerprotein wie Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke (KLH) gekoppelt werden über einen künstlichen Amino- oder Carboxy-Cysteinrest, welcher synthetisch an die gewünschte Sequenz angefügt werden kann. Der Cysteinrest wird als ein Linker verwendet, um das synthetische Peptid an das Trägerprotein zu koppeln. Das zum Koppeln von synthetischen Peptiden an KLH angewandte Vorgehen wird von Green et al., Cell, 28: 477 (1982), beschrieben.
  • Ungefähr 50–100 μg, vorzugsweise 100 μg synthetisches Antigen wird in Puffer gelöst und mit einem gleichen Volumen an Freund'schem vollständigen Adjuvans emulgiert. Etwa 0,025 ml bis 0,5 ml des emulgierten Antigen-Adjuvans können intramuskulär oder intradermal in ein Kaninchen injiziert werden. Vier bis sechs Wochen später wird das Kaninchen geboostert, und 20–40 ml Blut werden 7–10 Tage nach jeder Booster-Injektion entnommen. Das Serum wird dann auf die Gegenwart von Antigen unter Anwendung von RIA, ELISA oder Immunpräzipitation getestet. Die positiven Antikörperfraktionen können dann gereinigt werden, zum Beispiel durch Absorption an Protein A, unter Befolgung des Verfahrens von Goudswaald et al., Scand. J. Immunol., 8: 21 (1978).
  • Genauer gesagt werden etwa 20 bis 50 μg Antigen, welches entweder durch die oben stehend dargestellten rekombinanten Techniken hergestellt wurde oder synthetisch hergestelltes Antigen ist, in etwa 100 μl Puffer verdünnt und mit einer gleichen Menge an Freund'schem vollständigem Adjuvans emulgiert. Etwa 30–60, vorzugsweise 50 μl des emulgierten Antigen-Adjuvans wird subkutan an vier Stellen in Mäuse injiziert. Vier bis sechs Wochen später erhalten die Mäuse eine Booster-Dosis mit einer intraperitonealen Injektion von etwa 100 μl, enthaltend 5–10 μg an Antigen, welches in Puffer solubilisiert ist. Den Mäusen werden aus der mittleren Schwanzvene 7–10 Tage nach der Booster-Injektion Blutproben entnommen, und das Serum wird hinsichtlich Antikörper unter Anwendung von Standardverfahren getestet. Blut wird dann alle 3–4 Tage entnommen, bis der Antikörpertiter abfällt.
  • Gewebe, Plasma, Serum, Cerebrospinal-Fluid und dergleichen können eingesetzt werden, um die SMA-Krankheit unter Verwendung der oben stehend beschriebenen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper mittels Western-Blot (1- oder 2-dimensional) oder ELISA zu detek tieren. Diese Verfahren sind im Fachgebiet bekannt, wie von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben wird.
  • Ein Verfahren zum Detektieren von SMA sowie in ALS-, ACM- und PLS-Patienten, welche möglicherweise diese Motorneuronen-Krankheiten aufweisen, ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten. Dieses Verfahren beinhaltet das Extrahieren von DNA aus einer Probe aus einem Patienten, der vermutlich SMA aufweist. Diese Probe kann Seren, Plasma, Cerebrospinalfluid und dergleichen einschließen. Nach Extrahieren der DNA durch im Fachgebiet bekannte Verfahren, werden Primer, welche aus den Exons 7 und 8 des SMN-Gens abgeleitet werden, verwendet, um die DNA zu amplifizieren.
  • Nach der Amplifikation mit dem Primer wird das amplifizierte Produkt einem SSCP (Einzelstrang-Konformationspolymorphismus) unterzogen.
  • Die Gele werden dann einer Autoradiografie unterworfen, um zu bestimmen, ob SMA in der Probe vorhanden ist.
  • Genauer gesagt, ist es kürzlich festgestellt worden, dass in zwölf Fällen von Arthrogryposis multiplex congenita (AMC), welche mit SMA assoziiert ist, das SMN-Gen bei 6 von 12 Patienten fehlte.
  • Insgesamt zwölf nicht verwandte Patienten, einschließlich acht männlichen und vier weiblichen, aus verschiedener geografischer Herkunft wurden für die Untersuchung ausgewählt. Die Patienten wurden auf Grundlage der Kriterien, welche diese Patienten aufwiesen, gewählt:
    • (1) Kongenitale Gelenkkontrakturen von mindestens zwei Regionen des Körpers (siehe Stern, JAMA, 81: 1507–1510 (1923));
    • (2) Generalisierte Muskelschwäche mit Muskelatrophie und Reflexlosigkeit ohne extraokuläre Beteiligung;
    • (3) Elektromyographische Untersuchungen zeigten eine Denervierung und eine verringerte Motor-Aktionspotential-Amplitude; und
    • (4) Muskelbiopsien, welche konsistent mit Denervierung sind, mit keinem Hinweis auf Speichermaterial oder anderen strukturellen Abnormalitäten (siehe Munsat, Neuromuscular Disorders, 1: 81 (1991)).
  • Die Untersuchung bestand aus Dinukleotid-Wiederholungs-Polymorphismus-Analyse und SMN-Genanalyse (siehe Beispiele), basierend auf DNA, welche aus peripheren Blut- Leukocyten, lymphoblastoiden Zelllinien oder Muskelgewebe in allen zwölf Patienten extrahiert worden war.
  • Die Daten aus dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Die Diagnose wurde bei der Geburt mit einem einheitlichen Phänotyp erstellt, welcher durch eine schwere Hypotonie, Abwesenheit von Bewegungen, außer extraokulärer Mobilität, und Kontrakturen von mindestens zwei Gelenken gekennzeichnet war. Die Anzahl betroffener Gelenke und die Schwere der Lage-Defekte variierten von Kind zu Kind, wie es in der Tabelle 1 dargestellt wird. Verringerte Fötusbewegungen wurden in 7 von 12 (7/12) Patienten bemerkt. Neugeborenen-Atemnot wurde bei 9 von 12 (9/12) Patienten beobachtet, und eine Gesichtsbeteiligung, welche mit Mikrognathie assoziiert war, wurde in 4 von 12 (4/12) Patienten beobachtet. Der Großteil der Fälle, 8 von 12 (8/12), verstarb innerhalb des ersten Lebensmonats. Vier Kinder sind noch am Leben. Es wurde keine Familienvorgeschichte bemerkt, außer in der Familie 12, in welcher sowohl die Tochter als auch ihr Vater betroffen waren, was eine autosomal-dominante Form von AMC nahe legte.
  • Die Tabelle 1 zeigt, dass das SMN-Gen auf beiden mutanten Chromosomen in 6 von 12 (6/12) Patienten (Fälle 1–6) fehlte. Unter ihnen hatten 3 von 6 (3/6) Patienten eine große ererbte Deletion, welche beide Loci betraf, welche durch die Marker C212 und C272 auf einem parentalen Allel detektiert wurden, wobei das andere parentale Allel lediglich einen Locus anstelle der erwarteten zwei trug, wie gezeigt in der 14.
  • Die Analyse von SMN-Exons zeigte keine intragenischen Mutationen in den Patienten, deren SMN-Gen keine Deletionen zeigte (Fälle 7–12). Eine genetische Analyse zeigte, dass das Krankheitsgen in einer Familie (Fall 9) nicht an das Chromosom 5q13 gekoppelt war, da sowohl die betroffenen als auch die gesunden Geschwister denselben 5q13-Haplotyp trugen. Diese Daten legen in starkem Maße nahe, dass die Patienten, deren SMN-Gen keine Deletionen zeigte, nicht mit dem 5q13-SMA-Locus gekoppelt waren (Fälle 7–12).
  • Bisher wurde Arthrogryposis als ein Ausschlusskriterium für SMA angesehen (siehe Munsat, siehe oben). Jedoch weist die Beobachtung der SMN-Gen-Deletion in 6 von 12 (6/12) Patienten (50%) in starkem Maße darauf hin, dass Arthrogryposis von neurogenem Ursprung mit SMA in Zusammenhang steht, und dass diese Untergruppe und SMA allelische Krankheiten sind. Dennoch ist AMC von neurogenem Ursprung ein genetisch heterogener Zustand, da das Krankheitsgen in 6 von 12 (6/12) Patienten nicht an den SMN-Locus gekoppelt war. Der Ausschluss von Chromosom 5q ist ebenfalls in einer Familie mit zwei AMC-SMA-Patienten ge zeigt worden, wie es von Lunt et al., J. Med. Genet., 29: 273 (Zusammenfassung) (1992) beschrieben wurde.
  • Somit kann, durch Dinukleotid-Wiederholungs-Polymorphismus-Analyse und SMN-Gen-Analyse, eine klinische Diagnose von AMC durch die Abwesenheit oder Unterbrechung des SMN-Gens bestätigt werden. Die vorliegende Erfindung sieht nun Verfahren zum Detektieren von AMC entweder in lebenden Patienten oder in utero vor.
  • Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Detektion von SMA unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidsonden, welche auf der Nukleotidsequenz basieren, die in den 3, 10 oder für Maus-SMA in der 12 dargestellt ist. Wenn einem Patienten das SMN-Gen vollständig fehlt, wird keine Hybridisierung an die spezifische Sonde stattfinden. Die Hybridisierungsbedingungen können abhängig vom Typ der verwendeten Probe variieren. Es wird bevorzugt, eine derartige Hybridisierungsanalyse unter stringenten Bedingungen durchzuführen, welche im Fachgebiet bekannt und in Sambrook et al., siehe oben, definiert sind. Die Oligonukleotidsonden können auf eine beliebige Weise markiert sein, wie mit Enzymen, Radioaktivität und dergleichen. Es wird bevorzugt, radioaktiv markierte Sonden zu verwenden.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das humane SMN-Gen in Verbindung mit einem viralen oder nicht-viralen Vektor verwendet werden für eine Verabreichung in vivo direkt an die Patienten, welche unter SMA oder verwandten Motorneuronenkrankheiten leiden, oder durch Verabreichung in vitro in Knochenmarkszellen, Epithelzellen oder Fibroblasten, gefolgt von Verabreichung an den Patienten, siehe zum Beispiel Resenfeld et al., Science (1991) 252, S. 431 bis 434.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zum Detektieren von SMN-Gendefekten oder des völligen Fehlens des SMN-Gens in einem Fötus vor. Aus der schwangeren Frau entnommene Amnion-Flüssigkeit wird einer SSCP-Analyse gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen.
  • Um die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile weiter zu veranschaulichen, werden die folgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei es sich versteht, das sie lediglich als Veranschaulichung und in keiner Weise als einschränkend beabsichtigt sind.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Konstruktion von Phagen-Bibliotheken aus YAC-Klon 121B8, 595C11 und 903D1
  • Gesamt-Hefe-DNA aus dem YAC-Klon 595C11, enthaltend die telomerischen Loci, welche durch C212, C272 und C161 detektiert werden, oder dem YAC-Klon 121B8, enthaltend die centromerischen Loci, welche durch die gleichen Marker detektiert wurden, oder dem YAC-Klon 903D1, enthaltend beide Loci, wurde gereinigt und mit Sau3A partiell verdaut. DNA im Größenbereich von 12 bis 23 kb wurde nach einer 0,5% "Seaplaque"-GTG-Agarose-Gelelektrophorese ausgeschnitten und nach β-Agarase-Verdau mit Ethanol gefällt. Nach einem teilweisen Auffüllen der Sau3A-Stelle wurde DNA an der partiell aufgefüllten XhoI-Stelle des Bacteriophagen FIXIII (Stratagene) subkloniert. Klone von λ, enthaltend die Microsatelliten-DNA-Marker C212 (L-51), C272 (L-51, L-132); C171 (L-5, L-13), C161 (595B1), 11M1 (L-11), AFM157xd10 (L-131), wurden entweder mit EcoRI oder HindIII oder beidem verdaut und in pUC18-Plasmidvektoren subkloniert. Subklone aus Phagen, welche die Marker C212 (p322), C272 (132SE11), C161 (He3), AFM157xd10 (131xb4) und CMS1 (p11M1) enthielten, wurden als Sonden verwendet.
  • Beispiel 2
  • Pulsfeld-Gelelektrophorese-Analyse
  • Hochmolekulargewichts-DNA wurde in Agarose-Pfropfen aus mit Epstein-Barr-Virus transformierten Lymphoblastoid-Zelllinien, welche aus Kontrollen und Patienten begründet worden waren, oder aus einem YAC-Klon, wie beschrieben, isoliert. Die Pfropfen wurden zweimal jeweils 30 Minuten lang in 10–20 Min.-Vol. TE gespült. Die Pfropfen wurden 30 Sekunden lang bei 4°C mit 0,3 ml des passenden Restriktionsenzym-Puffers, welcher 0,1 mg/ml BSA (Pharmacia) enthielt, äquilibriert. Überschüssiger Puffer wurde dann entfernt, und die Pfropfen wurden bei der passenden Temperatur 16 Stunden lang mit 40 U Restriktionsenzym je Reaktion inkubiert. DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BssHII, EagI, SfiI, SacI, KpnI, SacII, SpeI verdaut. Die Trennung von DNA-Fragmenten wurde unter Anwendung eines CHEF-III-DR-PFGE-Gerätes (Biorad) durchgeführt. Fragmente von 50 bis 1200 kb wurden mittels Elektrophorese durch 1% Agarose 'Seakem' bei 200 V während 24 Stunden bei 14°C in 0,5 × TBE-Laufpuffer unter Verwendung einer 30- bis 70-sekündigen Rampen-Pulszeit getrennt. Die Trennung von Fragmenten von 5 bis 100 kb wurde mittels Elektrophorese bei 200 V während 19 Stunden bei 14°C in 0,5 × TBE-Puffer unter Verwendung einer 5 bis 20 Sekunden langen Rampen-Pulszeit durchgeführt. Nach 20 Minuten langer Behandlung mit 0,25 N HCl wurden die Pulsfeld-Gele 20 Stunden lang auf Hybond-N+-Nylonmembran (Amersham) in 0,4 N NaOH, 0,4 M NaCl geblottet. Die Sonden wurden sukzessiv an die gleichen Filter hybridisiert, um exakte Daten zu gewährleisten. Die Hybridisierungen wurden durchgeführt, wie beschrieben.
  • Beispiel 3
  • YAC-Bibliothek-Screening
  • YAC-Bibliotheken aus CEPH wurden durch PCR mit den Mikrosatelliten C212, C272, C171, CMS1 und C161 gescreent. Die YAC-Genotypen wurden durch Elektrophorese von PCR-Produkten auf denaturierenden Polyacrylamidgelen ermittelt. Die YAC-Größe wurde durch Pulsfeld-Gelelektrophorese eingeschätzt.
  • Beispiel 4
  • Southern-Blot-Analyse
  • DNA-Proben wurden entweder aus peripheren Blut-Leukozyten oder Lymphoblastoid-Zelllinien extrahiert. DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, HindIII, BglII, XbaI, PvuII, XmnI, RsaI, PstI, BamHI verdaut, durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel für das Southern-Blotting getrennt und mit radioaktiv markierten Sonden hybridisiert.
  • Beispiel 5
  • Dinukleotid-Wiederholungs-Polymorphismen
  • Genotypische Daten wurden für die C212-(D5F149S1, -S2), C272-(D5F150S1, -S2) und C161-(D5F153S1, -S2)-Dinukleotidwiederholung erhalten. Die Amplifizierungsbedingungen waren wie folgend: Denaturierung bei 94°C, Annealing bei 55°C und Verlängerung bei 72°C, jeweils 1 Minute, während 30 Zyklen. Das zur Detektion von Dinukleotid-Wiederholungs-Polymorphismen angewandte Vorgehen ist an anderer Stelle beschrieben worden.
  • Beispiel 6
  • cDNA-Klon und DNA-Sequenzierung
  • Zwei Millionen Rekombinanten einer λgt10-Bibliothek von menschlichem fötalem Gehirn wurden gemäß dem Hersteller (Clontech) ausplattiert. Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden in 10% Dextransulfat-Natrium, 1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,005 M EDTA und 1% SDS mit 200 mg/ml gescherter humaner Plazenta-DNA (Sigma) 16 Stunden lang bei 65°C durchgeführt. Die Filter wurden in 0,1 × SSEP – 0,1% SDS bei 65°C gewaschen, und Autoradiographien wurden 24 Stunden lang vorgenommen. Die DNA von positiven cDNA-Klonen wurde gereinigt, mit EcoRI verdaut und in M13-Bakteriophagen subkloniert. Einzelstrang-DNAs wurden unter Verwendung des Protokolls des DyeDeoxyTM Terminator-Cycle- bzw. "Kettenabbruch-Zyklus"-Sequenzierkits, welches von Applied Biosystems, Inc., geliefert wurde, sequenziert und auf einem automatischen DNA-Sequenzierer vom Modell ABI 373A analysiert. Um das 3'-Ende der cDNA zusammen mit ihrem Poly(A)+-Schwanz zu erhalten, wurde eine PCR-Amplifikation einer Lymphoblastoid-Zelllinien-cDNA-Bibliothek durchgeführt, wobei spezifischer Primer, der komplementär zum 3'-Ende der Klone war, und Primer, der für die Vektoren-Arme der cDNA-Bibliothek spezifisch war, verwendet wurden, wie früher beschrieben (Fournier, B., Saudubray, J. M., Benichou, B., et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 526–531). Spezifische PCR-Produkte wurden direkt mit beiden Primern unter Anwendung des Protokolls des DyeDeoxyTM "Kettenabbruch-Zyklus"-Sequenzierkits, welches von Applied Biosystems, Inc., geliefert wurde, sequenziert und auf einem automatischen DNA-Sequenzierer vom Modell ABI 373A analysiert.
  • Beispiel 7
  • Isolierung von RNA und Northern-Blot-Analyse
  • mRNA aus Lymphoblasten-Zelllinien von Kontrollen und SMA-Patienten wurde mit dem QuickPrep-mRNA-Reinigungskit (Pharmacia) gemäß der Prozedur des Herstellers isoliert. Gesamt-RNA wurde unter Befolgen des Einzelschritt-RNA-Isolierungsverfahrens präpariert, welches von Chomczynski und Sacchi (Analytic Biochemistry, 162: 156–159 (1987)) beschrieben wurde. Die Gesamt-RNA-Präparation wurde mit RQ1-DNAse (Promega) behandelt, um jedwede kontaminierende genomische DNA zu entfernen. Northern-Blots wurden von mRNA und Gesamt-RNA mittels Elektrolyse durch 1,5% 'Seakem'-Agarosegel, welches Methylquecksilber(II)-hydroxid enthielt, angefertigt und auf eine positiv geladene Membran in 20 × SSC überführt und 2 Stunden lang bei 80°C erwärmt. 32P-radiomarkierte DNA-Sonden wurden durch ein statistisches Priming-Verfahren gemäß dem Hersteller (Boehringer) synthetisiert und in einer Lösung, welche 5 × SSEP, 1% SDS, 5 × Denhardt's enthielt, während 16 Stunden bei 65°C hybridisiert. Die Membranen wurden zu einer Endstringenz von 0,1 × SSEP, 0,1% SDS, bei 65°C während 10 Minuten gewaschen. Die Audioradiografie erfolgte bei –80°C mit Verstärkerfolien und Kodak-XAR-Filmen während 2 bis 10 Tagen. Die Menge an mRNA wurde mit einer b-Actin-cDNA-Sonde normiert. Die Autoradiografien wurden bei 600 nm in einem Computer-Densitometer (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco) abgetastet. Ein Northern-Blot mit PolyA+-RNA aus mehreren menschlichen Geweben wurde von Clontech bezogen.
  • Beispiel 8
  • Reverse Transkriptase-basierende PCR-Amplifikation und Sequenzierung
  • Jede PCR-Amplifikation wurde in einem Endvolumen von 20 ml auf einzelsträngigen cDNAs durchgeführt, welche aus der mit statistischen Hexameren geprimten reversen Transkription synthetisiert worden waren (Promega). Die PCR-Reaktionen schlossen 2 Picomol Vorwärts- und Rückwärts-Primer und 1 Unit Taq-Polymerase in dem von Perkin Elmer/Cetus empfohlenen Reaktionspuffer ein. Die Parameter für die PCR-Amplifikation bestanden in 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C während 30 Zyklen, gefolgt von einer Endverlängerungs-Dauer von 10 Minuten bei 72°C. Die Parameter für die PCR-Amplifikation bestanden in 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C während 30 während 30 Zyklen, gefolgt von einer Endverlängerungs-Dauer von 10 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden aus Acrylamid-Gel geschnitten und in 100 ml TE-Puffer eluiert. Die verdünnten Fragmente wurden vor einer direkten Sequenzierung erneut mit den gleichen Primern amplifiziert. Die PCR-Amplifikationsprodukte wurden aus Acrylamid-Gel ausgeschnitten und in 100 ml TE-Puffer eluiert. Die verdünnten Fragmente wurden erneut mit beiden Primern amplifiziert vor der direkten Sequenzierung unter Verwendung des DyeDeoxyTM "Kettenabbruch-Zyklus"-Sequenzierungskit-Protokolls, geliefert von Applied Biosystems, Inc., und Analyse auf einem automatischen DNA-Sequenzierer vom Modell ABI 373A. Sechs Sets an Primern wurden zusammen mit der cDNA-Sequenz verwendet, um DNA-Produkte für die Sequenzanalyse zu amplifizieren.
  • Beispiel 9
  • Computer-unterstützte Analyse
  • Eine Sequenz-Homologie-Analyse sowohl mit Nukleotid- als auch Proteinsequenzen von 541C wurde unter Verwendung von FASTA und BLAST durch das CITI2-French-Netzwerk durchgeführt (Dessen, P., Fondrat, C., Velencien, C., Mugnoer, C., 1990, CABIOS; 6: 355–356).
  • Beispiel 10
  • SSCP-Analyse
  • Für eine Einzelstrang-Konformationspolymorphismus(SSCP)-Analyse wurde DNA aus peripheren Leukozyten (200 ng) einer PCR-Amplifikation unterzogen, wobei unmarkierte Primer (20 μM) in 25 μl Amplifikationsmischung, enthaltend 200 μM dNTPs, 1 Unit von Taq-Polymerase (Gibco-BRL) und 0,1 μl eines 32P-dCTP (10 mCi/ml, NEN), verwendet wurden. Amplifizierte DNA wurde mit einem gleichen Volumen an Formamid-Auftragfarbstoff (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylencyanol) vermischt. Die Proben (5 μl) wurden 10 Minuten lang bei 95°C denaturiert und auf ein Polyacrylamid-Gel (Hydroling MED, Bioprobe) aufgetragen und bei 4°C 18 bis 24 Stunden lang bei 4 W elektrophoretisch behandelt. Die Gele wurden auf 3 MM Whatman-Papier überführt, getrocknet und mit Kodak X-OMAT-Filmen 24 Stunden lang autoradiografiert. Um die DNA-Sequenz zu amplifizieren, welche die Divergenz von Exon 7 enthält, wurden die Oligonukleotide R111 (5' AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA 3') und 541C770 (5'°°TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC 3') verwendet. Um die DNA-Sequenz zu amplifizieren, welche die Divergenz von Exon 8 enthält, wurden die Oligonukleotide 541C960 (5' GTAATAACCAAATGCAATGTGAA 3') und 541C1120 (5' CTACAACACCCTTCTCACAG 3') verwendet.
  • Beispiel 11
  • Klonierung des humanen SMN-Gens
  • Gesamt-Hefe-DNA aus YAC-Klon 595C11 wurde über das Verfahren von Sambrook et al., siehe oben, gereinigt und partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut. DNA im Größenbereich von 12–23 kD wurde nach 0,5% 'Sea Plague'-GTG-Agarose-Gelelektrophorese ausgeschnitten und nach β-Agarase-Verdau mit Ethanol gefällt. Nach partieller Auffüllung der Sau3A-Stelle wurde DNA an die partiell aufgefüllte XhoI-Stelle des Bacteriophagen FIXII (Stratagene) subkloniert.
  • Die Volllängen-BCD541-cDNA wurde als eine Sonde verwendet, um die FIXII-Phagen-Bibliothek unter Bedingungen zu screenen, welche in Sambrook et al., siehe oben, dargestellt werden.
  • Diese Phagen, welche M-132, L-5 und L-13 genannt wurden, überspannten das gesamte SMN-Gen, wie durch Restriktionskartierung unter Verwendung von HindIII, EcoRI und BglII (siehe 9) und durch Southern-Blot-Analyse bestätigt wurde.
  • Die Phagen wurden dann sequenziert, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist. Sobald das Gen sequenziert war, wurde es danach in einen pUC18-Vektor kloniert und rekombinant in großen Mengen reproduziert, welche für die weitere Verwendung gereinigt wurden.
  • Beispiel 12
  • Klonierung des Maus-SMN-Gens
  • Eine fötale Maus-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung der codierenden Sequenz der humanen SMN-cDNA als Sonde gemäß Sambrook et al., siehe oben, gescreent.
  • Zwei überlappende Maus-cDNA-Klone wurden gefunden, welche die gesamte Sequenz von Maus-SMN aufwiesen, wie durch in Beispiel 8 beschriebene Sequenzierverfahren nach Klonieren in einen pUC18-Vektor und M13-Vektoren gezeigt wurde.
  • Beispiel 13
  • Transgene Mäuse
  • Transgene Mäuse, welche mehrere normale SMN-Gene ODER SMN-Gene, denen Exon 7 fehlte, enthielten, werden durch die Verfahren gemäß Lee et al., Neuron, 13: 978–988 (1994), hergestellt. Die transgenen Tiere werden dann getestet und hinsichtlich der Überexpression des SMN-Gens oder des SMN-Gens, dem Exon 7 fehlt, mittels Southern- und/oder Northern-Blots unter Verwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sonden oder durch Screenen mit in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikörpern in einem Western-Blot selektiert.
  • Transgene Mäuse, welche abnormale SMN-Gene enthielten, werden erhalten durch homologe Rekombinations-Methoden unter Verwendung mutierter SMN-Gene, wie beschrieben von Kühn et al., Science, 269; 1427–1429 (1995), und Bradley, Current Opinion in Biotechnology, 2; 823–829 (1991). Die transgenen Tiere werden dann getestet und hinsichtlich der Überexpression des SMN-Gens mittels Southern- und/oder Northern-Blots unter Verwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sonden oder durch Screenen mit in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikörpern in einem Western-Blot hinsichtlich des abnormalen SMN-Gens selektiert.
  • Beispiel 14
  • Polyklonale Antikörper
  • 100 μg eines synthetischen Antigens mit der Sequenz:
    Figure 00380001
    wurden in Puffer gelöst und mit einem gleichen Volumen an Freund'schem vollständigem Adjuvans emulgiert. 0,5 ml des emulgierten synthetischen Antigen-Adjuvans wurden intramusklär in ein Kaninchen injiziert. Fünf Wochen später erhielt das Kaninchen eine Booster-Dosis und 20–40 ml Blut wurden 8 Tage nach jeder Booster-Injektion entnommen. Das Serum wurde dann unter Anwendung eines RIA auf die Gegenwart von Antigen getestet.
  • Polyklonale Antikörper wurden ebenfalls durch die gleichen Verfahren unter Verwendung der folgenden synthetischen Antigene hergestellt:
  • Figure 00380002
  • Beispiel 15
  • Gentherapie
  • Unter Verwendung des Adenovirus-Konstrukts, welches von Ragot et al., Nature, Band 361 (1993) beschrieben wurde, wurde das normale SMN-Gen darin inseriert und intramuskuklär in einen Patienten injiziert, dem dieses Gen fehlte. Der Patient wird unter Anwendung von SSCP-Analyse, wie beschrieben im obenstehenden Beispiel 10, überwacht.
  • Es ist beabsichtigt, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch den Umfang der nachstehenden Patentansprüche begrenzt ist. Tabelle I
    Figure 00390001
    Abkürzungen: + vorhanden; – abwesend; AoCo.: Aorten-Isthmusstenose; Fract: Knochenbruch; Facial microg.: Gesicht betroffen von Mikrognathie; nd: nicht durchgeführt. * Sowohl die Tochter als auch ihr Vater waren betroffen.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
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  • Figure 00500001
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  • Figure 00700001
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  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Figure 00790001

Claims (29)

  1. Isoliertes humanes SMN-Gen T-BCD541 mit der cDNA-Sequenz, die in der 3A unterstrichen ist (Nukleotide 34 bis 915).
  2. Isoliertes SMN-Gen gemäß Anspruch 1, das Intronsequenzen mit den folgenden Sequenzen umfasst: – für Intron Nr. 6:
    Figure 00800001
    – für Intron Nr. 7:
    Figure 00800002
  3. Isolierte Variante des SMN-Gens, wobei die Variante ein C-BDC541-Gen mit der cDNA-Sequenz ist, die in der 2A unterstrichen ist (Nukleotide 34 bis 915).
  4. Isolierte Nukleotidsequenz, bei der es sich um die cDNA-Sequenz eines SMN-Gens gemäß Anspruch 1 oder 2 handelt, wobei die cDNA die Sequenz aufweist, die in der 3A unterstrichen ist (Nukleotide 34 bis 915).
  5. Codierende Sequenz des SMN-Gens gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz die Nukleotide 34 bis 915 der Sequenz aus der 3A umfasst.
  6. Codierende Sequenz der Variante des SMN-Gens gemäß Anspruch 3, wobei die Sequenz die Nukleotide 34 bis 915 der Sequenz aus der 2A umfasst.
  7. Intronsequenz des SMN-Gens gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz die folgenden Sequenzen aufweist: – Intron 6:
    Figure 00810001
    – Intron 7:
    Figure 00810002
  8. Isolierte DNA-Sequenz, die für ein Protein für das Überleben der Motorneurone (survival motor neuron, SMN) gemäß 1 oder 8 codiert.
  9. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß 11.
  10. Oligonukleotid, ausgewählt aus den folgenden Sequenzen:
    Figure 00820001
  11. Set von Oligonukleotiden, umfassend ein erstes Oligonukleotid, enthaltend mindestens 9 Nukleotide, das innerhalb einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 enthalten ist, mit der Maßgabe, dass das erste Oligonukleotid nicht die Sequenz p(dT)8dAdA oder p(dT)8dA enthält, und ein zweites Oligonukleotid, enthaltend mindestens 9 Nukleotide, das innerhalb der Sequenz enthalten ist, ausgewählt aus der Gruppe: Nukleotide 921 bis 1469 der Sequenz aus der 3A, Intron 7 mit der folgenden Sequenz:
    Figure 00820002
    und Nukleotidsequenz von Exon 7 in der 3A.
  12. Set von Primern umfassend: – ein Paar von Primern mit den folgenden Sequenzen:
    Figure 00820003
    – ein Paar von Primern mit den folgenden Sequenzen:
    Figure 00830001
    – ein Paar von Primern mit den folgenden Sequenzen:
    Figure 00830002
    Figure 00840001
  13. Antisense-Nukleotidsequenz, bei der es sich um eine invertierte komplementäre Sequenz einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 handelt.
  14. Isoliertes humanes Protein für das Überleben der Motorneurone (SMN), umfassend die Aminosäuresequenz aus der 1.
  15. Protein gemäß Anspruch 13, das trunkiert ist und das die Sequenz gemäß 8 umfasst.
  16. Kit für die in vitro Detektion einer Trunkierung, einer Deletion oder einer Mutation eines Gens für das Überleben der Motorneurone (SMN), das auf spinale Muskelatrophie oder amyotrophe Lateralsklerose hinweist, umfassend: – ein Set von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 11; – Reagenzien für eine Amplifizierungsreaktion; und – eine Sonde für die Detektion des amplifizierten Produkts, wobei es sich bei der Sonde um ein Fragment einer Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 handelt, wobei das Fragment mindestens 9 Nukleotide umfasst.
  17. Klonierungs- oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
  18. Vektor gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Poliovirus, einen Adenovirus oder einen Herpesvirus handelt.
  19. Vektor gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Retrovirus-Vektor handelt.
  20. Isolierte Wirtszelle, beispielsweise Knochenmarkzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 transformiert ist.
  21. In vitro-Methode zur Detektion des Vorliegens, der Abwesenheit oder der Trunkierung eines Gens für das Überleben der Motorneurone (SMN), das auf eine spinale Muskelatrophie oder eine amyotrophe Lateralsklerose hinweist, wobei die Methode die Schritte umfasst: (a) Extrahieren von DNA aus einer Patientenprobe; (b) Amplifizieren dieser DNA mit Primern gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12; (c) Unterwerfen der amplifizierten DNA einem Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, wobei die Analyse den Vergleich eines Musters von DNA-Fragmenten, die aus einer Patientenprobe erhalten wurden, mit einem Muster von DNA-Proben, die aus einer Kontrollprobe erhalten wurden, umfasst, um eine Trunkierung, eine Deletion oder eine Mutation im Gen des Patienten zu detektieren; und (d) Detektieren des Vorliegens einer Trunkierung, einer Deletion oder einer Mutation im Patientengen in dem Gen für das Überleben der Motorneurone, das auf eine spinale Muskelatrophie oder eine amyotrophe Lateralsklerose hindeutet.
  22. Methode gemäß Anspruch 21, wobei die Schritte (c) und (d) gegen einen Schritt eines Verdaus mit einem BsrI-Enzym ausgetauscht werden.
  23. In vitro Methode zur Detektion von spinaler Muskelatrophie, wobei die Methode die Schritte umfasst: (a) Extrahieren von DNA aus einer Patientenprobe; (b) Hybridisieren dieser DNA mit einer DNA-Sonde, die die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz aus der 3 umfasst, unter stringenten Bedingungen; und (c) Detektieren der möglicherweise gebildeten Hybride, wobei wenn keine Hybridisierung auftritt, die Patientenprobe kein Gen für das Überleben der Motorneurone, das auf eine spinale Muskelatrophie hindeutet, enthält.
  24. Methode gemäß Anspruch 23, wobei die Sonde radioaktiv markiert ist.
  25. Monoklonaler Antikörper oder polyklonales Antiserum, der, bzw. das spezifisch an das SMN-Protein aus der 1 oder das Protein aus der 8 bindet.
  26. In vitro-Methode zur Detektion der Abwesenheit oder der Unterbrechung des Gens für das Überleben der Motorneurone, das auf eine Arthrogryposis multiplex congenita (AMC) hinweist, wobei die Methode die Schritte umfasst: (a) Extrahieren von DNA aus einer Patientenprobe; (b) Amplifizieren der DNA mittels PCR unter Verwendung von unmarkierten Primern aus dem Exon 7 und Exon 8 des SMN-Gens; (c) Unterwerfen dieser amplifizierten DNA einer Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse, wobei die Analyse den Vergleich eines Musters von DNA-Fragmenten, die aus der Patientenprobe erhalten wurden, mit einem Muster von DNA-Fragmenten, die aus einer Kontrollprobe erhalten wurden, umfasst, um die Abwesenheit oder Unterbrechung in dem Gen des Patienten zu detektieren; und (d) Detektieren der Abwesenheit oder der Unterbrechung eines Gens für das Überleben der Motorneurone, das auf eine Arthrogryposis multiplex congenita hinweist.
  27. Transgene Maus, die das humane SMN-Protein der 1 oder ein trunkiertes Protein der 8 exprimiert.
  28. Transgene Maus gemäß Anspruch 27, die durch homologe Rekombination erhalten ist.
  29. Transgene Maus, die ein mutiertes SMN-Protein der 1 exprimiert.
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